BRPI0720319A2 - "ácido nucléico isolado, polipeptídeo isolado, vetor de expressão, célula hospedeira, método para aprodução de um poliptídeo de fusão, partícula do vírus de mosaico do bambu quimérico, método para a produção de uma partícula do vírus de mosaico do bambu quimérico, composição imunogênica e método para a indução de uma imunoresposta em um indivíduo" - Google Patents

Description

ÁCIDO NUCLÉICO ISOLADO, POLIPEPTÍDEO ISOLADO, VETOR DE EXPRESSÃO, CÉLULA HOSPEDEIRA, MÉTODO PARA A PRODUÇÃO DE UM POLIPEPTÍDEO DE FUSÃO, PARTÍCULA DO VÍRUS DE MOSAICO DO BAMBU QUIMÉRICO, MÉTODO PARA A PRODUÇÃO DE UMA PARTÍCULA DO VÍRUS 5 DE MOSAICO DO BAMBU QUIMÉRICO, COMPOSIÇÃO IMUNOGÊNICA E MÉTODO PARA A INDUÇÃO DE UMA IMUNORESPOSTA EM UM INDIVÍDUO

FUNDAMENTOS

As infecções virais causam sérios danos à indústria de criação de gado. Por exemplo, o vírus da doença de pé-e- 10 boca (FMDV) ameaça constantemente a criação de gado domestica em todo o mundo. 0 FMDV pertence ao gênero aftovírus da família Picornaviridae. Cada partícula de FMDV contém um genoma de RNA de cordão simples dentro de um capsídeo icosaedral que consiste em 6 0 cópias de cada uma de quatro 15 proteínas, VPl, VP2, VP3 e VP4. Enquanto VPl, VP2 e VP3 formam o escudo de uma partícula viral, o VP4 se situa dentro do capsídeo (vide Acharya et al., Nature 1989 337(6209): 709- 716) . As vacinas são úteis para proteger o gado contra a infecção pelo FMDV. As vacinas de FMDV convencionais se 20 baseiam no vírus inativado, cuja segurança não é satisfatória. Certamente, surtos de FMDV ocorrem devido aos vírus impropriamente inativados. Portanto, há uma necessidade de abordagens alternativas para produzir vacinas de FMDV seguras.

DESCRIÇÃO RESUMIDA

A presente invenção refere-se ao uso de partículas ou proteínas do vírus de mosaico do bambu (BaMV) como carreadores para a produção de composições imunogênicas, tais como vacinas. Abaixo, são relacionadas a seqüência de 30 aminoácido (aa) da proteína de cobertura do vírus de mosaico do bambu (CP de BaMV; SEQ ID N0:1) de comprimento cheio e a seqüência de nucleotídeo (nt) que codifica a mesma (SEQ ID NO : 2 ) : 5

10

15

20

• 25

SEQ ID NO: I:

MSGAGTGTGRGTGTGVGGTGGTGGTGGGGTGRGQQAAAQPWEAIFTKDDLA AIEPKPASANVPNTKQWIGIQAGLIKAGATDANFMKVLLGLSLEAFDRGS SEATTWDGITE GVEHRAAANAIKEANPIHKVTYYLAKPTFAIRQSKNLPPANFAKKNVPSQYKWCAFDAFDG LYDPTCLASELPYDAPSEIDRMAYATFKTIQIKIANDQKGFNLNYNPNVTQARLPNAPLPA LPEPTSD

SEQ ID NO: 2

atgtctggagctggaacgggaactgggcgagggaccgggaccggagtagga

ggcactgggggcacaggtggcacaggcggcggaggaacaggtagagggcaacaagctgcag

cccagccctgggaggaatttttactaaggacgacctggccgcaatcgagccaaaacctgct

tcggcaaatgttccaaacactaagcagtggatcggcattcaagctggactcatcaaggccg

gagccacggacgcaaacttctgaaagtactgctcggcctcagtctcgaagctttcgacagg

ggctcatcagaagccaccacttgggatggaattactgagggcgtggagcaccgtgcagcag

ccaacgccatcaaggaggcgaactgccaatacacaaggtcacctactacctagccaaaccg

acgttcgccattagacaatcgaaaaacctccccccagcgaacttcgcaaagaagaatgtgc

catcacaatataaatggtgtgcgttcgatgctttgatggcctgtacgatcctacctgcctt

gcctcagaactaccctacgacgccccctcagaaatagaccgaatggcgtacgctaccttca

aaactatacagatcaagatcgccaatgaccagaaaggttcaacctcaactacaaccctaac

gtcacccaggctcgactccccaacgcgcccctaccagctcttcccgaaccaacatcagact

aa

Em um aspecto, a invenção caracteriza um polipeptídeo de fusão isolado que contém (i) um fragmento carreador que contém a seqüência de uma CP de BaMV ou um segmento da mesma; e (ii) um fragmento heterólogo imunogênico que é fundido ao fragmento carreador e a pelo menos três resíduos de aa no comprimento (por exemplo, tendo pelo menos

5, 10, 20, 30 ou 37 resíduos de aa) . Além da SEQ ID NO:l, vários fragmentos da SEQ ID N0:1 podem ser utilizados como o fragmento carreador. Os exemplos incluem um mutante de CP de BaMV que não tem os resíduos de aa 3 5 de terminal amino da SEQ ID NO:I (SEQ ID NO:7; sublinhada acima). Preferivelmente, o término amino do fragmento carreador é fundido ao fragmento heterólogo. Um ácido nucléico, um gene ou uma proteína 10

15

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* 25

J

"heteróloga" é aquele que se origina de uma espécie estranha, ou, se for da mesma espécie, é substancialmente modificado em sua forma original.

O fragmento heterólogo imunogênico acima mencionado pode conter uma seqüência de uma proteína de FMDV VPl ou seu segmento imunogênico. É mostrada abaixo a seqüência de aa da proteína de comprimento cheio de FMDV VPl (SEQ ID NO: 3) e a seqüência de nucleotídeo que codifica a mesma (SEQ ID NO:4):

SEQ ID NO:3

TTSAGESADPVTATVENYGGETQVQRRQHTDSAFILDRFVKVKPKEQVNVL DLMQIPAHTLVGALLRTATYYFSDLELAVKHEGDLTWVPNGAPETALDNTTNPTAYHKEPL TRLALPYTAPHRVLATVYNGSSKYGDTSTNNVRGDLQVLAQKAERTLPTSFNFGAIKATRV TELLYRMKRAETYCPRPLLAIQPSDARHKQRIVAPAKQLL

SEQ ID NO: 4

Accacctctgcgggtgagtctgcggaccccgtgactgccaccgtcgagaac

tacggtggtgagacacaagtccagaggcgccagcacacggacagtgcgttcatactggaca

ggttcgtgaaagtcaagccaaaggaacaagttaatgtgttggacctgatgcagatccctgc

ccacaccttggtaggggcgctcctgcgaacggccacctactacttctctgacctggagctg

gccgtcaagcacgagggcgatctcacctgggtcccaaacggcgcccctgagacagcactgg

acaacactaccaacccaacagcttaccacaaggaacccctcacacggctggcgctgcctta

cacggctccacaccgtgtcttagcgaccgtctacaacgggagcagtaagtacggtgacacc

agcactaacaacgtgagaggtgaccttcaagtgttagctcagaaggcagaaagaactctgc

ctacctccttcaacttcggtgccatcaaggcaactcgtgttactgaactactctacagaat

gaagagagccgagacatactgtcccaggccccttctcgccattcaaccgagtgacgctaga

cacaagcagaggattgtggcacccgcaaaacagcttctg

Os exemplos do fragmento imunogênico de FMDV VPl incluem TVYNGSSKYGDTSTN NVRGDLQVLAQKAERTLPTSFN (SEQ ID NO:5), que corresponde ao aa 128-164 da SEQ ID NO: 3. Abaixo, é mostrado um polipeptídeo de fusão exemplificador, das seqüências de SEQ ID NO:5 e 7.

MDTVYNGSSKYGDTSTNNVRGDLQVLAQKAERTLPTSFNAAAQPWEAIFTK DDLAAIEPKPASANVPNTKQWIGIQAGLIKAGATDANFMKVLLGLSLEAFDRGS S EATTWD GITEGVEHRAAANAIEANCPIHKVTYYLAKPTFAIRQSKNLPPANFAKKNVPSQYKWCAFD AFDGLYDPTCLASELPYDAPSEIDRMAYATFKTIQIKIANDQKGFNLNYNPNVTQARLPNA PLPALPEPTSD (SEQ ID NO: 9)

Um polipeptídeo isolado refere-se a um polipeptídeo substancialmente livre das moléculas naturalmente associadas, isto é, pelo menos 75% (isto é, qualquer número entre 75% e 100%, inclusive) puro em peso a seco. A pureza pode ser medida por qualquer método padrão apropriado, por exemplo, pela cromatografia de coluna, pela eletroforese em gel de poliacrilamida ou pela análise de HPLC. Um polipeptídeo isolado da invenção pode ser purificado a partir de uma fonte natural, produzido por técnicas de DNA recombinante ou por métodos químicos.

A invenção também apresenta um ácido nucléico isolado que contém uma seqüência que codifica um dos polipeptídeos de fusão descritos acima. Os exemplos de ácido nucléico incluem as SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8 e 10, que codificam as SEQ ID NO:l, 3, 5, 7 e 9, respectivamente. As seqüências de SEQ ID NO:6, 8 e 10 são mostradas abaixo:

accgtctacaacgggagcagtaagtacggtgacaccagcactaacaacgtg agaggtgaccttcaagtgttagctcagaaggcagaaagaactctgcctacctccttcaac.

(SEQ ID NO: 6)

gcggccgcacagccctgggaggcaatttttactaaggacgacctggccgca atcgagccaaaacctgcttcggcaaatgttccaaacactaagcagtggatcggcattcaag ctggactcatcaaggcggagccacggacgcaaacttcatgaaagtactgctcggcctcagt ctcgaagctttcgacaggggctcatcagaagccaccacttgggatggaattactgagggcg tggagcaccgtgcagcagccacgccatcaaggaggcgaactgcccaatacacaaggtcacc tactacctagccaaaccgacgttcgccattagacaatcgaaaaacctccccccagcgaact tcgcaaagaagaatgtgccatcacatataaatggtgtgcgttcgatgcctttgatggcctg tacgatcctacctgccttgcctcagaactaccctacgacgccccctcagaaatagaccgaa tggcgtacgctaccttcaaaactatacagacaagatcgccaatgaccagaaagggttcaac ctcaactacaaccctaacgtcacccaggctcgactccccaacgcgcccctaccagctcttc ccgaaccaacatcagactaa (SEQ ID NO: 8)

atggacaccgtctacaacgggagcagtaagtacggtgacaccagcactaac aacgtgagaggtgaccttcaagtgttagctcagaaggcagaaagaactctgcctacctcct tcaacgcggccgcacgccctgggaggcaatttttactaaggacgacctggccgcaatcgag ccaaaacctgcttcggcaaatgttccaaacactaagcagtggatcggcattcaagctggac tcatcaaggccggagccacgacgcaaacttcatgaaagtactgctcggcctcagtctcgaa gctttcgacaggggctcatcagaagccaccacttgggatggaattactgagggcgtggagc accgtgcagcagccaacgccatcaagaggcgaactgcccaatacacaaggtcacctactac ctagccaaaccgacgttcgccattagacaatcgaaaaacctccccccagcgaacttcgcaa agaagaatgtgccatcacaatataaatggttgcgttcgatgcctttgatggcctgtacgat cctacctgccttgcctcagaactaccctacgacgccccctcagaaatagaccgaatggcgt acgctaccttcaaaactatacagatcaagatcgccatgaccagaaagggttcaacctcaac tacaaccctaacgtcacccaggctcgactccccaacgcgcccctaccagctcttcccgaac caacatcagactaa (SEQ ID NO: 10)

O ácido nucléico pode conter adicionalmente as seqüências de Quadros de Leitura Abertos de BaMV 1-4 (ORFs 1-

4, por exemplo, aqueles do GenBank no N°. de Acesso: D26017).

Um ácido nucléico refere-se a uma molécula de DNA (por exemplo, um DNA ou um DNA genômico) , a uma molécula de RNA (por exemplo, um mRNA) ou a um análogo de DNA ou de RNA. Um análogo de DNA ou de RNA pode ser sintetizado a partir dos análogos de nucleotídeo. A molécula de ácido nucléico pode ser de cordão simples ou de cordão duplo, mas é preferivelmente DNA de cordão duplo. Um "ácido nucléico isolado" é um ácido nucléico cuja estrutura não é idêntica àquela de nenhum ácido nucléico natural ou àquela de nenhum fragmento de um ácido nucléico genômico natural. O termo engloba, portanto, por exemplo, (a) um DNA que tem a seqüência de parte de uma molécula genômica natural do DNA mas não é flanqueado por ambas as seqüências de codificação que flanqueiam essa parte da molécula no genoma do organismo em que ocorre naturalmente; (b) um ácido nucléico incorporado em um vetor ou no DNA genômico de um procarionte ou de um eucarionte de uma maneira tal que a molécula resultante não seja idêntica a nenhum vetor natural ou DNA genômico; (c) uma molécula separada tal como um DNA, um fragmento genômico, um fragmento produzido pela reação em cadeia de polimerase (PCR) ou por um fragmento de restrição; e (d) uma seqüência de nucleotídeo recombinante que faz parte de um gene híbrido, 5 isto é, um gene que codifica uma proteína de fusão. O ácido nucléico descrito acima pode ser utilizado para expressar o polipeptídeo da presente invenção. Para esta finalidade, pode-se ligar operativamente o ácido nucléico às seqüências reguladoras apropriadas para gerar um vetor de expressão.

Um vetor refere-se a uma molécula de ácido nucléico

com capacidade de transportar outro ácido nucléico ao qual foi ligada. 0 vetor pode ser capaz de replicação autônoma ou pode se integrar a um DNA hospedeiro. Os exemplos de vetor incluem um plasmídeo, um cosmídeo ou um vetor viral. 0 vetor 15 da presente invenção inclui um ácido nucléico em uma forma apropriada para a expressão do ácido nucléico em uma célula hospedeira. Preferivelmente, o vetor inclui uma ou mais seqüências reguladoras ligadas operativamente à seqüência de ácido nucléico a ser expressa. Uma "seqüência reguladora" 20 inclui promotores, intensificadores e outros elementos de controle de expressão (por exemplo, seqüências de promotor 35S do vírus de mosaico da couve-flor ou sinais de poliadenilação). As seqüências reguladoras incluem aquelas que dirigem a expressão constitutiva de uma seqüência de 25 nucleotídeo, bem como as seqüências reguladoras e/ou indutíveis específicas de tecido. 0 projeto do vetor de expressão pode depender de tais fatores como a escolha da célula hospedeira a ser transformada, o nível de expressão da proteína desejada e outros ainda. 0 vetor de expressão pode 3 0 ser introduzido na célula hospedeira para produzir o polipeptídeo ou a partícula viral da presente invenção.

Também se enquadra no âmbito da presente invenção uma célula hospedeira que contém o ácido nucléico descrito acima. Os exemplos incluem células de planta, células de E. coli, células de insetos (por exemplo, utilizando vetores de expressão de baculovírus), células de levedura ou células de mamíferos. Vide, por exemplo, Goeddel, (1990) Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA. Preferivelmente, a célula hospedeira é uma célula de uma planta, tal como célula de folha de Chenopodium quinoa ou de Nicotiana benthamiana.

Para produzir um polipeptídeo da presente invenção, pode-se cultivar uma célula hospedeira em um meio sob condições que permitam a expressão do polipeptídeo codificado por um ácido nucléico da presente invenção e a purificação do polipeptídeo a partir da célula cultivada ou do meio da célula. Alternativamente, o ácido nucléico da presente invenção pode ser transcrito e traduzido in vifcro, por exemplo, utilizando seqüências reguladoras do promotor T7 e da polimerase T7.

Em um aspecto adicional, a invenção caracteriza uma partícula do vírus de mosaico do bambu quimérico que contém um dos polipeptídeos de fusão descritos acima. Para a produção desta partícula do vírus de mosaico do bambu quimérico, pode-se colocar uma folha de uma planta hospedeira em contato com o ácido nucléico descrito acima, que tem as seqüências de Quadros de Leitura Abertos do vírus de mosaico do bambu 1-4; manter a folha sob condições que permitam a formação de uma partícula do vírus que tem os polipeptídeos codificados pelo ácido nucléico e a purificação da partícula do vírus da folha.

Um polipeptídeo de fusão ou uma partícula do vírus de mosaico do bambu quimérico da presente invenção também podem ser utilizados para gerar os anticorpos específicos que se ligam especificamente a um polipeptídeo de interesse, por exemplo, FMDV VPl. Conseqüentemente, está enquadrada na presente invenção uma composição imunogênica que inclui o polipeptídeo de fusão ou a partícula do vírus de mosaico do bambu quimérico. Para induzir uma imunoresposta em um indivíduo, pode-se administrar a um indivíduo, com necessidade da mesma, uma quantidade eficaz do polipeptídeo de fusão ou da partícula do vírus de mosaico do bambu quimérico. O indivíduo pode ser um ser humano ou um animal não humano, tal como porco, boi, carneiro ou cabra.

Os detalhes de uma ou mais realizações da invenção são apresentados na descrição em anexo abaixo. Outras vantagens, características e objetivos da invenção ficarão evidentes a partir da descrição detalhada e das reivindicações.

DESCRIÇÃO DETALHADA

A presente invenção se baseia, pelo menos em parte, na descoberta que uma CP de BaMV ou uma partícula de BaMV pode ser utilizada como um carreador para gerar, em um indivíduo, uma imunoresposta a um polipeptídeo de interesse.

BaMV, um membro do vírus de planta em formato de haste sinuoso do grupo Potexvírus, infecta plantas monocotiledôneas e dicotiledôneas (Lin et al., Phytopathology 1992; 82: 731-4). O seu genoma consiste em uma molécula de RNA de sentido positivo de cordão duplo que tem uma estrutura de tampa 5' e uma cauda (A) 3' poli. Ele contém cinco proteínas diferentes de codificação dos Quadros de Leitura Abertos (ORFs) para replicação, movimentação e conjunto viral (Lin et al., J. Gen. Virol. 1994; 75: 2513-2518). Entre eles, o 0RF5 codifica uma proteína de cobertura (CP) , que está envolvida na encapsidação do vírus e na movimentação de célula-a-célula e de longa distância (Lin et al., Phytopathology 1992; 82: 731-4 e Lin et al. , J. Gen. Virol. 1994; 75: 2513-8).

No âmbito da presente invenção está enquadrado um polipeptídeo de fusão que tem um polipeptídeo imunogênico de interesse fundido a um carreador que contém a SEQ ID N0:1 ou seu equivalente funcional, tais como as seqüências correspondentes das proteínas de CP de outras cepas de BaMV.

Um equivalente funcional da SEQ ID N0:1 refere-se a um polipeptídeo derivado da SEQ ID N0:1, por exemplo, um polipeptídeo de fusão ou um polipeptídeo que tem uma ou mais mutações de ponto, inserções, eliminações, truncamentos ou uma combinação dos mesmos. Todos os equivalentes funcionais têm substancialmente a atividade de encapsidação de BaMV e não afetam a replicação viral. Esta atividade pode ser determinada por um ensaio padrão similar àquele descrito nos exemplos abaixo.

Em particular, tais equivalentes funcionais incluem os polipeptídeos cujas seqüências diferem da SEQ ID N0:1 por uma ou mais substituições de aminoácidos conservadoras ou por uma ou mais substituições de aminoácidos não- conservadoras, eliminações ou inserções. A seguinte Tabela relaciona as substituições de aminoácidos apropriadas:

TABELA 1. SUBSTITUIÇÕES DE AMINOÁCIDOS CONSERVADORAS

Pelo aminoácido Código Substituir por qualquer um de Alanina A Gly, Ala, Cys Arginina R Lys, Met, Ile Asparagina N Asp, Glu, Gln Ácido aspártico D Asn, Glu, Gln Cisteína C Met, Thr Glutamina Q Asn, Glu, Asp Ácido glutâmico E Asp, Asn, Gln Glicina G Ala, Pro Isoleucina I Vai, Leu, Met Leucina L Vai, Leu, Met Lisina K Arg, Met, Ile Metionina M Ile, Leu, Val Fenilalanina F Tyr, His, Trp Prolina P Serina S Thr, Met, Cys Treonina T Ser, Met, Val Tirosina Y Phe, His Valina V Leu, He, Met Em geral, um equivalente funcional da SEQ ID NO:1 é

pelo menos 50% idêntico, por exemplo, pelo menos 60%, 70%, 80%, 90% ou 95% idêntico à SEQ ID NO: I. A "porcentagem de identidade" de duas seqüências de aminoácido ou de dois ácidos nucléicos é determinada utilizando o algoritmo de Karlin e Altschul Proc. Natl. Acad. Sei. EUA 87: 2264-68, 1990, modificado tal como em Karlin e Altschul Proc. Natl. Acad. Sei. EUA 90: 5873-77, 1993. Tal algoritmo é incorporado nos programas NBLAST e XBLAST (versão 2.0) de Altschul et al. J. Mol. Biol. 215: 403-10, 1990. As buscas de nucleotídeo BLAST podem ser executadas com o programa NBLAST, pontuação = 100, comprimento de palavra 12 para obter as seqüências de nucleotídeo homólogas às moléculas de ácido nucléico da invenção. As buscas da proteína BLAST podem ser executadas com o programa XBLAST, pontuação = 50, comprimento de palavra = 3 para obter as seqüências de aminoácido homólogas às moléculas de proteína da invenção. Onde existem espaçamentos entre duas seqüências, Gapped BLAST pode ser utilizado como descrito em Altschul et al., Nucleie Aeids Res. 25(17): 3389-

34 02, 1997. Ao utilizar os programas BLAST e Gapped BLAST, os parâmetros padrão dos programas respectivos (por exemplo, XBLAST e NBLAST) podem ser utilizados.

Um polipeptídeo de fusão da invenção pode ser obtido como um polipeptídeo sintético ou um polipeptídeo recombinante. Para preparar um polipeptídeo recombinante, um ácido nucléico que o codifica pode ser ligado a outro ácido nucléico que codifica um parceiro de fusão, por exemplo, Glutationa-S-Transferase (GST), Tag do epítopo 6x-His ou a proteína M13 do Gene 3. O ácido nucléico de fusão resultante 5 expressa em células hospedeiras apropriadas uma proteína de fusão que pode ser isolada pelos métodos conhecidos no estado da técnica. A proteína de fusão isolada pode ser adicionalmente tratada, por exemplo, por meio de digestão enzimática, para remover o parceiro de fusão e para obter o 10 polipeptídeo recombinante da presente invenção.

Também está enquadrado no âmbito da presente invenção uma partícula do vírus de mosaico do bambu quimérico recombinante que contém o polipeptídeo de fusão descrito acima. A partícula contém ou está livre de uma CP de BaMV do 15 tipo selvagem. Para preparar tal partícula, pode-se introduzir um ácido nucléico que codifica um dos polipeptídeos de fusão e as seqüências descritas acima dos ORFs 1-4 e 5' e 3' UTR do vírus de mosaico do bambu em uma célula de planta hospedeira apropriada e produzir uma 20 partícula do vírus da maneira descrita nos exemplos abaixo. Em uma realização, o polipeptídeo de fusão contém a seqüência de SEQ ID N0:1 ou 7.

Um polipeptídeo de fusão ou uma partícula do vírus de mosaico do bambu quimérico da invenção pode ser utilizada 25 para gerar anticorpos em animais (para a produção de anticorpos ou o tratamento de doenças) ou em seres humanos (para o tratamento de doenças). Os métodos de produção de anticorpos monoclonais e policlonais e fragmentos dos mesmos em animais são conhecidos no estado da técnica. Vide, por 30 exemplo, Harlow e Lane, (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Nova York. 0 termo "anticorpo" inclui moléculas intactas bem como fragmentos das mesmas, tais como Fab, F(ab')2, Fv, scFv (anticorpo de cadeia única) e dAb (anticorpo de domínio; Ward, et al. Nature (1989) , 341, 544) .

Em geral, para produzir anticorpos contra uma proteína de interesse, pode-se gerar um polipeptídeo de fusão que inclui um fragmento imunogênico da proteína ou uma partícula do vírus de mosaico do bambu quimérico que tem o polipeptídeo de fusão. Em seguida, o polipeptídeo de fusão ou a partícula do vírus de mosaico do bambu quimérico são então misturados com um auxiliar e a mistura é injetada em um animal hospedeiro. Os anticorpos produzidos no animal podem então ser purificados por meio de cromatografia de afinidade de peptídeo. Os animais hospedeiros geralmente empregados incluem coelhos, camundongos, porquinhos-da-índia e ratos. Vários auxiliares que podem ser utilizados para aumentar a resposta imunológica dependem da espécie hospedeira e incluem

o auxiliar MONTANIDE ISA 2 06, o auxiliar da Freund (completo e incompleto), géis minerais tais como o hidróxido de alumínio, CpG, substâncias ativas de superfície tais como a lisolecitina, polióis plurônicos, poliânions, peptídeos, emulsões em óleo, hemocianina de lapa e dinitrofenol. Os auxiliares humanos úteis incluem BCG (bacilo de Calmette- Guerin) e Corynebacterium parvum.

Os anticorpos policlonais, as populações heterogêneas de moléculas de anticorpos, estão presentes nos soros de indivíduos imunizados. Os anticorpos monoclonais, as populações homogêneas de anticorpos a um polipeptídeo da presente invenção, podem ser preparados ao utilizar a tecnologia de hibridoma padrão (vide, por exemplo, Kohler et al (1975) Nature 256, 495; Kohler et al. (1976) Eur. J. Immunol. 6, 511; Kohler et al. (1976) Eur. J. Immunol.6, 292; e Hammerling et de al. (1981) Monoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas, Elsevier, N.Y.). Em particular, os anticorpos monoclonais podem ser obtidos por meio de qualquer técnica que ofereça a produção de moléculas de anticorpos por linhagens de células contínuas em cultura tal como descrito em Kohler et al. (1975) Nature 256, 495 e Patente Norte- americana n° . 4.376.110; a técnica de hibridoma de células humanas (Kosbor et al. (1983) Immunol Today 4, 72; Cole et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sei. EUA 80, 2026 e a técnica de hibridoma de EBV (Cole et al. (1983) Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96) . Tais anticorpos podem ser de qualquer classe de imunoglobulina incluindo IgG, IgM, IgE, IgA, IgD e qualquer subclasse dos mesmos. O hibridoma que produz os anticorpos monoclonais da invenção pode ser cultivado in vitro ou in vivo. A capacidade de produzir títulos elevados de anticorpos monoclonais in vivo o transforma em um método de produção particularmente útil.

Um polipeptídeo de fusão ou uma partícula do vírus de mosaico do bambu quimérico da invenção também podem ser utilizados para preparar uma composição imunogênica (por exemplo, uma vacina) para gerar anticorpos contra os vírus (por exemplo, o FMDV) em um indivíduo suscetível ao mesmo.

Tais composições podem ser preparadas, por exemplo, de acordo com o método descrito nos exemplos abaixo ou por meio de qualquer outro método equivalente conhecido no estado da técnica. A composição contém uma quantidade eficaz de um do polipeptídeo de fusão ou de uma partícula do vírus de mosaico do bambu quimérico da invenção e um veículo farmaceuticamente aceitável tal como a solução salina ou uma solução de bicarbonato. O veículo é selecionado com base no modo e na via de administração e na prática farmacêutica padrão. Os veículos e os diluentes farmacêuticos apropriados, bem como as necessidades farmacêuticas para sua utilização, são descritos em Remington's Pharmaceutical Sciences. Um auxiliar, por exemplo, uma toxina do cólera, uma enterotoxina instável a quente de Escherichia coli (LT), lipossomo, complexo estimulante da imunidade (ISCOM) ou

oligodesoxinucleotídeos das seqüências imunoestimulatórias (ISS-ODN), também podem ser incluídos em uma composição da invenção, caso necessário. 0 polipeptídeo de fusão, os fragmentos ou os análogos do mesmo ou a partícula do vírus de mosaico do bambu quimérico podem ser componentes de uma composição de vacina multivalente contra várias doenças.

Os métodos para a preparação das vacinas são geralmente bem conhecidos no estado da técnica, tal como exemplificado pelas patentes US 4.601.903, 4.599.231, 4.599.230 e 4.596.792. As vacinas podem ser preparadas como injetáveis, como soluções líquidas ou emulsões. Um polipeptídeo de fusão ou uma partícula do vírus de mosaico do bambu quimérico da presente invenção podem ser misturados com excipientes fisiologicamente aceitáveis e compatíveis. Os excipientes podem incluir a água, uma solução salina, dextrose, glicerol, etanol, e as combinações dos mesmos. A vacina pode conter adicionalmente quantidades menores de substâncias auxiliares tais como agentes umectantes ou emulsificantes, agentes de tamponamento de pH ou auxiliares para intensificar a eficácia das vacinas. Os métodos para atingir o efeito adjuvante para a vacina incluem o uso de agentes, tais como o hidróxido ou o fosfato de alumínio (alum), utilizados geralmente como soluções a 0,05 a 0,1 por cento em solução salina tamponada com fosfato. As vacinas podem ser administradas parenteralmente, por injeção, subcutaneamente ou intramuscularmente. Alternativamente, outros modos de administração que incluem supositórios e formulações orais podem ser desejáveis. Para os supositórios, os aglutinantes e veículos podem incluir, por exemplo, polialquileno glicóis ou triglicerídeos. As formulações orais podem incluir os incipientes normalmente empregados tais 5

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como, por exemplo, tipos farmacêuticos de sacarina, celulose, carbonato de magnésio, e outros ainda. Estas composições assumem a forma de soluções, suspensões, comprimidos, pílulas, cápsulas, formulações de liberação sustentada ou pós, e contêm 10-95% do polipeptídeo de fusão ou da partícula do vírus de mosaico do bambu quimérico.

As vacinas são administradas de uma maneira compatível com a formulação de dosagem e em uma quantidade que é terapeuticamente eficaz, protetora e imunogênica. A quantidade a ser administrada depende do indivíduo a ser tratado, que inclui, por exemplo, a capacidade do sistema imune do indivíduo de sintetizar anticorpos e, caso necessário, produzir uma imunoresposta mediada por células. As quantidades precisas do ingrediente ativo requerido a ser administrado dependem do julgamento do clínico. No entanto, as faixas de dosagem apropriadas são imediatamente determináveis pelo elemento versado na técnica e podem ser da ordem de microgramas do polipeptídeo da presente invenção. Os regimes apropriados para a administração inicial e para as doses de reforço também são variáveis, mas podem incluir uma administração inicial seguida por administrações subseqüentes. A dosagem da vacina também pode depender da via de administração e varia de acordo com o tamanho do hospedeiro.

Conforme descrito nos exemplos abaixo, o polipeptídeo de fusão descrito acima ou a partícula do vírus de mosaico do bambu quimérico podem ser utilizados para induzir a imunoresposta em um indivíduo contra a infecção por vírus, tal como a infecção pelo FMDV. Um indivíduo suscetível à infecção pelo FMDV pode ser identificado e receber uma composição da invenção. A dose da composição depende, por exemplo, do polipeptídeo/partícula de vírus particular, se um auxiliar é co-administrado, do tipo de auxiliar co- administrado, do modo e da freqüência de administração, conforme pode ser determinado pelo elemento versado na técnica. A administração é repetida tal como necessário, conforme pode ser determinado pelo elemento versado na 5 técnica. Por exemplo, uma dose inicial pode ser seguida por três doses de reforço em intervalos semanais. Uma dose de reforço pode ser administrada de quatro a oito semanas após a primeira imunização e uma segunda dose de reforço pode ser administrada de oito a doze semanas, utilizando a mesma 10 formulação. Os soros ou células T podem ser tirados do indivíduo para testar a imunoresposta provocada pela composição contra o FMDV. Os métodos de teste dos anticorpos ou das células T citotóxicas versus uma proteína ou uma infecção são bem conhecidos no estado da técnica. 15 Intensificadores adicionais podem ser administrados conforme necessário. Ao variar a quantidade de polipeptídeo/partícula de vírus, a dose da composição e a freqüência de administração, o protocolo de imunização pode ser otimizado para provocar uma imunoresposta máxima. Antes de uma 20 administração em ampla escala, é desejável um teste de eficácia. Em um teste de eficácia, um indivíduo não humano pode receber, através de uma via oral ou parenteral, uma composição da invenção. Após a administração inicial ou após a administração opcional do reforço, o indivíduo de teste e o 25 indivíduo de controle (que recebe a administração de simulação) podem ser estimulados com, por exemplo, 0,5 ml de

1 x IO5 TCID50 de FMDV 0/Taiwan/97 por injeção subcutânea. Os indivíduos são então monitorados quanto aos sinais do FMD por catorze dias. Os sinais de FMDV incluem a elevação da

3 0 temperatura corpórea acima de 400C por três dias sucessivos, incapacidade, lesões vesiculares em torno da boca e faixas coronárias na perna.

0 polipeptídeo descrito acima de CP de BaMV pode ser utilizado como um veículo e ser ligado a outros antígenos de interesse para gerar anticorpos contra os antígenos. 0 fragmento dos polipeptídeos pode ser geralmente utilizado para preparar moléculas quiméricas e composições conjugadas contra bactérias patogênicas, incluindo as bactérias encapsuladas.

Os exemplos específicos abaixo devem ser interpretados como meramente ilustrativos e não-limitadores do restante da descrição de qualquer maneira. Sem elaboração adicional, acredita-se que o elemento versado na técnica pode, com base na presente descrição, utilizar a presente invenção em sua extensão mais completa. Todas as publicações citadas são aqui incorporadas a título de referência em sua totalidade.

EXEMPLO 1

Neste exemplo, um epítopo antigênico VPl foi fundido ao término amino de uma proteína de cobertura truncada de BaMV para gerar uma proteína de fusão. Um BaMV quimérico que tem a proteína de fusão também foi produzido.

0 cDNA infeccioso de comprimento cheio de BaMV-S com uma seqüência de promotor 3 5S do vírus de mosaico da couve-flor a montante foi clonado no plasmídeo pUC119 da maneira descrita em Lin et al. J. Gen. Virol. 2004; 85: 251-

9. 0 vetor pBS-d35CP foi derivado do clone de cDNA de BaMV acima mencionado, em que a seqüência que codifica a seqüência de aminoácido de N-terminal 35 de CP foi suprimida e os sítios de clonagem múltiplos (AgeI-NheI-NotI) foram introduzidos pelo método com base em uma reação em cadeia de polimerase (PCR). Uma seqüência que codifica os aminoácidos 128-164 de FMDV VPl (O/Taiwan/97) foi introduzida em pBS- d3 5CP pela PCR utilizando o plasmídeo pVPl/Q15 como um molde (Wang et al. , Vaccine 2003; 21: 3721-9). Os primers utilizados eram prl28164N (5'- GGgctagcAccatggACACCGTCTACAACGGGAG-31 (SEQ ID NO: 11); as seqüências em caixa baixa representam os sítios de NheI e de NcoI; a seqüência de reconhecimento de NcoI provê um códon de iniciação de AUG) e prl28164C (51-TTgcggccgcGTTGAAGGAGGTAGGC- 5 3' (SEQ ID NO: 12); a seqüência em caixa baixa representa um sítio de NotI). A reação de PCR foi realizada a uma temperatura inicial de 940C por cinco minutos seguida por 25 ciclos a 940C por trinta segundos, a 500C por trinta segundos e de uma extensão a 72°C por trinta segundos. O fragmento 10 amplificado que corresponde ao epítopo VPl foi purificado e clonado no plasmídeo pBS-d35CP nos sítios de NheI e de NotI para gerar um plasmídeo denotado como pBVPl. Este vetor codifica o genoma de um BaMV quimérico, ou seja, BVPl.

Para examinar a infectividade deste vírus quimérico nas plantas, o hospedeiro sistêmico de Nicotiana benthamiana (N. benthamiana) e o hospedeiro de lesão local de Chenopodium quinoa (C. quinoa) foram testados.

0 hospedeiro de lesão local de C. quinoa e as plantas de N. benthamiana do hospedeiro sistêmico cresceram 20 em uma estufa exposta à luz do dia normal. Para o ensaio de inf ectividade, aproximadamente I pg de DNA de pBVPl purificado em um volume de 10 μΐ de H2O duplamente destilados foram utilizados para inocular cada folha das plantas de teste no estágio de seis folhas (Lin et al. , J. Gen. Virol. 25 2004; 85: 251-9). A observação para lesões locais foi feita 10 dias após a inoculação. Para a preparação do antígeno, as plantas de C. quinoa com oito a dez folhas inteiramente expandidas foram inoculadas com a seiva extraída das plantas de C. quinoa infectadas com BaMV-S ou BVPl. As folhas 30 inoculadas foram colhidas dez dias após a inoculação. Os vírions foram subseqüentemente purificados a partir das folhas frescas da maneira descrita em Lin et al., Phytopathology, 1992; 82: 731-4. 0 rendimento do vírus purificado foi determinado através de absorção ultravioleta, supondo uma absorbância (0,1%, 260 nm) de 3,0. Estima-se que a quantidade do epítopo VPl expressa no vírus quimérico BVPl seja de aproximadamente 14,3% em peso total do vírus. Os 5 vírions purificados foram dissolvidos em tampão de BE(10 mM de borato, pH 9,0, 1 mM de EDTA) e então armazenados a -200C para a imunização dos suínos.

Foi verificado que, em N. benthamiana, as plantas infectadas com BVPl mostraram sintomas de mosaico mais suaves 10 do que as plantas infectadas com BaMV-S. Em C. quinoa, as lesões locais cloróticas formadas por BVPl eram distintas das lesões locais necróticas causadas pelo BaMV-S do tipo selvagem. Não obstante, os resultados demonstram que o vírus mutante quimérico tinha, indubitavelmente, a capacidade de 15 infectar as plantas saudáveis de N. benthamiana ou C. quinoa.

EXEMPLO 2

O vírus quimérico de BVPl acima mencionado foi examinado para determinar se ele poderia expressar o epítopo VPl. As amostras de proteína total tiradas das folhas de C. 20 quinoa inoculadas com BaMV-S, BS-d35CP e BVPl de simulação do tipo selvagem foram submetidas à eletroforese em gel de poliacrilamida-SDS.

Foi verificado que a CP quimérico de BVPl migrou mais lentamente do que a CP do tipo selvagem ou a CP truncada 25 de N-terminal, sendo que nenhuma CP foi encontrada nas folhas inoculadas na simulação. 0 resultado indica uma diferença evidente de tamanho entre a CP de BVPl quimérica e do tipo selvagem e na fusão do epítopo VPl para a CP de BVPl.

Para confirmar adicionalmente que a CP de BVPl contém um epítopo VPl, o ensaio de transferência Western foi executado utilizando um coelho contra o soro de FMDV VPl ou soro de suíno infectado com FMDV. 0 soro de coelho anti-FMDV VPl foi preparado da maneira descrita em Wang et al. , 2003, Vaccine 2003; 21: 3721-9. O soro de um porco com FMDV foi obtido junto ao Animal Health Research Institute, COA1 R.O.C. As proteínas totais foram preparadas de C. quinoa inoculada com o vírus e de simulação com um tampão de extração de 1:2 (peso/volume) (50 mM de Tris-HCl, pH 8,0, 10 mM de KCl, 10 mM de MgCl2, 1 mM de EDTA, 20% de glicerol e 2% de SDS) e aquecidas a 100°C por cinco minutos. As amostras de proteína foram então separadas por meio de eletroforese em gel de poliacrilamida-SDS a 12% e foram eletroforeticamente transferidas às membranas Immobilon-P (Bio-Rad) com 200 mA por uma hora a 4 °C. Após a obstrução, as membranas foram sondadas com os anticorpos de CP anti-BaMV-S ou anti-FMDV VPl e então foram processadas da maneira descrita em Lin et al. , Phytopathology 1992; 82: 731-4 e Lin et al. , J. Gen. Virol. 2004; 85: 251-9.

Foi verificado que ambos os soros reconheceram a CP quimérica que corresponde a uma faixa de proteína com o tamanho previsto de 31 kDa. Por outro lado, nenhuma faixa de proteína VPl foi detectada na CP de BaMV-S do tipo selvagem ou na CP truncada de BS-d3 5CP. Os estudos de imunotransferência adicionais mostraram que até mesmo após cinco passagens subseqüentes na C. quinoa, a CP de BVPl extraída das folhas de C. quinoa ainda continha uma faixa principal da proteína com uma mobilidade similar. Considerados conjuntamente, estes resultados demonstram que o vírus quimérico de BVPl pode expressar estavelmente o epítopo VPl de FMDV como uma proteína de fusão em sua CP.

EXEMPLO 3

0 vírus quimérico de BVPl descrito acima foi testado quanto ã sua capacidade de induzir anticorpos específicos em suínos.

As partículas do vírus BVPl quimérico foram isoladas do tecido da folha de C. quinoa infectado com BVPl. O rendimento do vírus purificado era de aproximadamente 0,2- 0,5 mg por grama de tecido fresco da folha. Porcos machos castrados ou fêmeas livres de patógenos específicos (SPF) (com dois meses de idade, pesando aproximadamente 25 kg) foram obtidos em Taiwan. Dois grupos de suínos SPF (três em cada grupo) foram imunizados com 5 mg e 10 mg do preparado do vírus BVPl quimérico respectivamente pela imunização intramuscular. Mais especificamente, eles foram injetados nos músculos do pescoço ao lado das orelhas com 10 mg ou 5 mg de vírions de BVPl emulsifiçados com volumes iguais do auxiliar Montanide ISA 206 (Seppic, França). Além disso, dois porcos foram injetados com o vírus de BaMV-S do tipo selvagem e outros dois porcos com a solução salina estéril tamponada com fosfato (PBS; 140 mM de NaCl, 2,7 mM de KCl, 10 mM de Na2HPO4, 1,8 mM de KH2PO4, pH 7,3) como grupos de controle negativos.

Seis semanas após a iniciação, as injeções de reforço nas mesmas dosagens foram administradas a todos os porcos. Os soros foram coletados para a análise dos porcos imunizados nos dias 0, 28, 42, 56 e 63. Três semanas após o reforço, todos os porcos foram estimulados com 0,5 ml de 1 x IO5 TCID50 de FMDV O/Taiwan/97 pela injeção no bulbo do calcanhar dianteiro direito. Os porcos foram então monitorados quanto aos sinais de FMD por catorze dias. Os sinais de FMD incluíram a elevação da temperatura corpórea acima de 400C por três dias sucessivos, incapacidade, lesões vesiculares na boca e faixas coronárias nas pernas (Wang et al., Vaccine 2003; 21: 3721-9).

Para examinar os efeitos da imunização, o ELISA foi executado da maneira com as modificações menores tal como descrito em Shieh et al., Vaccine 2001; 19: 4002-10). Resumidamente, após a formação de complexos de anticorpo- antígeno ligados às placas, as placas foram lavadas três vezes com PBS contendo 0,1% de Tween-20 (PBST) e foram incubadas com os anticorpos IgG anti-suínos de cabra biotinilados por uma hora a 37°C. As placas foram lavadas subseqüentemente e estreptavidina:peroxidase (diluições de 1:3000) foram adicionadas. Após a incubação por uma hora à temperatura ambiente, as placas foram lavadas outra vez. O substrato da enzima 3,31,5,51 -tetrametilbenzidina (Sigma) foi então adicionado e a reação foi realizada à temperatura ambiente por dez minutos. Finalmente, um volume igual de I N de H2SO4 foi adicionado para interromper a reação e a absorbância em 450 nm foi medida por um leitor de ELISA.

0 ELISA revelou que, quatro semanas após a iniciação, os títulos significativos provocados dos porcos imunizados dos anticorpos anti-VPl (880 ± 434 para os grupos de 5 mg e 2382 ± 1098 para os grupos de 10 mg) . 0 nível dos anticorpos anti-VPl específicos aumentou e atingiu um patamar duas semanas mais tarde. Por outro lado, os porcos injetados com o vírus BaMV-S do tipo selvagem ou com o tampão de PBS mostraram poucos anticorpos anti-VPl no ELISA. Este resultado demonstrou que o vírus BVPl quimérico induz os anticorpos anti-VPl específicos em suínos.

A presença de anticorpos neutralizantes (NA) nos soros de suínos imunizados com BVPl foi confirmada de acordo com o método descrito em Shieh et al., Vaccine 2001; 19: 4002-10. Resumidamente, os soros dos animais de teste foram inativados a 56°C por trinta minutos. Cada amostra de soro ou soro de controle (50 μΐ) foi adicionada à cavidade no final de cada fileira de uma placa de cultura de tecido de 96 cavidades e foi então diluída em uma diluição em série em duas vezes através das placas. Cinqüenta microlitros de uma suspensão do vírus 100 TCID50 foram adicionados a cada cavidade e então a placa foi turbilhonada por um minuto. Após a incubação a 370C com 5% de CO2 por noventa minutos, 100 μΐ da suspensão de células BHK-21 (IO6 células/ml) em MEM da Eagle contendo 3% de soro fetal bovino (FBS) foram adicionados a cada cavidade e incubados por 48 horas. As 5 células foram então observadas sob o microscópio. O rompimento da monocamada da célula e a mudança das células do formato de haste a arredondado nas cavidades indicou a presença do efeito citopático do vírus.

Os títulos foram determinados após 4 8 horas de incubação a 370C em uma atmosfera saturada de água com 5% de CO2 e expressos como a recíproca da diluição final de soro que neutraliza o efeito citopático do vírus no ponto final de 50%. Os resultados são resumidos na Tabela 2 abaixo:

TABELA 2. TÍTULOS DO ANTICORPO NEUTRALIZANTE (NA) EM SUÍNOS IMUNIZADOS COM BVPl

Antxgenoa Título de NA (indivíduos)13 n 4 WPPc 6 WPP 9 WPP BVPl 10 mg 3 57 217 264 (6,91,64) (32,362,256) (23,512,256) BVPl 5 mg 3 12 227 210 (8,11,16) (64,364,256) (11,362,256) BaMV-S 2 □ (□,□) □ (□,□) □ (□,□) Controle 2 □ (□,□) □ (□,□) □ (□,□) negativo Um suíno foi inoculado com duas injeções

intramusculares de 10 mg ou 5 mg de BVPl ou 5 mg de vírions de BaMV-S emulsifiçados em uma quantidade igual do auxiliar ISA206 em um intervalo de seis semanas. Os suínos imunizados

2 0 com um tampão de PBS foram utilizados como um grupo de controle negativo.

b O título do NA de cada porco expresso como a recíproca da diluição final do soro que causou 50% de redução na atividade do vírus de teste como descrito em Materiais e Métodos. (-) indica que nenhum NA foi detectado.

0 WPP: semanas após a iniciação.

Conforme mostrado na Tabela 2, os suínos imunizados com o vírus de BaMV-S do tipo selvagem ou com o tampão de PBS não produziram nenhum NA contra o FMDV. Por outro lado, os suínos imunizados com 5 mg ou 10 mg de BVPl produziram o NA quatro semanas após a iniciação. Os títulos aumentaram ainda mais seis semanas após a iniciação. 0 reforço com uma quantidade similar de BVPl seis semanas após a iniciação, no entanto, não aumentou significativamente o NA. Este resultado demonstrou que a inoculação de suínos com o vírus BVPl uma vez é suficiente para induzir um nível elevado de NA contra FMDV.

EXEMPLO 4

A capacidade das células mononucleares de sangue periférico (PBMCs) de produzir IFN-γ foi analisada nos suínos descritos acima para avaliar se a imunização com BVPl poderia induzir uma imunoresposta mediada por células além de uma resposta humoral. A IFN-γ é uma citoquina que desempenha um papel importante nas respostas imunes mediadas por células.

Especificamente, as PBMCs foram isoladas dos suínos de teste e semeadas em triplicata em placas de cultura de seis cavidades em uma concentração de 1 x IO7 células por cavidade em 2 ml do meio de cultura de DMEM suplementado com 10% de FBS e 1% de penicilina e estreptomicina. Após a cultura até a manhã seguinte, as células foram incubadas com pg/ml de VPl recombinante (rVPl) ou 1 pg/ml de fitoemaglutinina (PHA, Sigma) por seis horas a 37°C com 5% de CO2. As células incubadas com PHA foram utilizadas como controles positivos. Após a incubação, as células foram lisadas no reagente TRIzol™ (Invitrogen) e o RNA celular total foi isolado de acordo com as instruções do fabricante. A concentração do RNA celular total foi quantificada pela determinação da densidade óptica em 260 nm. O RNA celular total foi então transcrito reversamente ao DNA complementar (DNA) pela transcriptase reversa Superscript III™ (Invitrogen) . 0 DNA resultante foi submetido à PCR em tempo real.

0 mRNA total de IFN-γ foi quantificado pela PCR em tempo real. A PCR em tempo real foi configurada utilizando um sistema SYBR Green em um instrumento LightCycler (RocheApplied Science) em um volume final de 20 μΐ com o FastStart DNA Master SYBR Green Kit I (Roche), que inclui uma polimerase de Taq ativada pelo calor, mais 4 mM de MgCl2, cada primer (as seqüências de primer eram SW-IFN-γ (F4): 5'- GCTCTGGGAAACTGAATGACTTCG (SEQ ID NO: 13) e SW-IFN-γ (R4): 5'- GACTTCTCTTCCGCTTTCTTAGGTTAG) (SEQ ID NO: 14) em 0,5 μΜ e 2 μΐ do DNA preparado como descrito acima. Após a ativação da polimerase (a 95°C por dez minutos), 40 ciclos foram executados com uma desnaturação de 15 segundos a 95°C, um recozimento de dois segundos a 6 00C e uma extensão de quinze segundos a 72°C. A taxa de transição da temperatura foi de 0C por segundo para todas as etapas. A quantidade de produto de PCR foi medida uma vez a cada ciclo imediatamente após a incubação a 720C (etapa de extensão) pela detecção da fluorescência associada com a ligação do SYBR Green I ao produto da amplificação. As curvas de fluorescência foram analisadas com o software LightCycler, versão 3.0 (RocheApplied Science). Os primers foram sintetizados pela Invitrogen Life Technologies. Para cada amostra, a quantidade de IFN-γ foi determinada ao comparar com uma curva padrão e foi normalizada utilizando a β-actina como a referência endógena. Todas as amostras foram processadas em triplicata.

Foi verificado que a produção de IFN-γ pelas PBMCs 10

15

20

de suínos imunizados com BVPl aumentou em três vezes quando da estimulação por VPl recombinante (rVPl). Por outro lado, a produção de IFN-γ pelas PBMCs dos suínos imunizados com BaMV- S ou injetados com PBS não mostrou nenhum aumento quando da estimulação por rVPl. Como um controle, as PBMCs de todos os suínos, uma vez estimuladas com PHA, produziram quantidades similares de IFN-γ. Estes resultados demonstram que as células imunes dos suínos imunizados com BVPl são capazes de produzir IFN- γ quando da estimulação por rVPl.

EXEMPLO 5

Para determinar a eficácia da imunização com BVPl, os porcos inoculados com ou sem BVPl foram estimulados com 1 x IO5 TCID50 de FMDV (O/Taiwan/97) três semanas após o reforço e os sintomas do FMD foram então monitorados por duas semanas. Aqueles sem sintomas foram determinados como protegidos. Os resultados foram resumidos na Tabela 3 abaixo:

TABELA 3. PROTEÇÃO CONTRA 0 VÍRUS RECOMBINANTE BVPl NOS SUÍNOS VERSUS A ESTIMULAÇÃO DE FMDV

Grupo Número de Número de Taxa de estimulados protegidos proteção BVPl 10 mg 3 3 100% BVPl 5 mg 3 3 100% BaMV-S 2 0 0% Controle 2 0 0% negativo Conforme mostrado na Tabela 3, os suínos imunizados com 5 mg ou 10 mg de BVPl ficaram livres de sintomas e protegidos completamente durante o período de duas semanas após o estimulação. Por outro lado, os suínos imunizados com BaMV-S ou injetados com PBS (controle negativo) mostraram sintomas sérios de FMD no segundo dia após o estimulação com FMDV. Este resultado demonstrou que o vírus quimérico BVPl é útil para vacinação de suínos contra o FMDV.

Foi verificado que a imunização dos suínos com o rVPl derivado de E. coli era eficaz para proteger os suínos contra o estimulação de FMDV. As eficácias de BVPl e de 5 quantidades similares de rVPl derivado de E. coli foram comparadas. Mais especificamente, os suínos foram inoculados com duas injeções intramusculares de 8 mg ou 4 mg de rVPl emulsificado em um volume igual do auxiliar ISA 206 em um intervalo de seis semanas da maneira descrita em Wang et al., 10 Vaccine 2003; 21: 3721-9. Os efeitos do rVPl de provocar os anticorpos neutralizantes (NA) e a proteção contra o FMDV foram avaliados da mesma maneira descrita acima. Os resultados foram resumidos na Tabela 4 abaixo:

TABELA 4. EFEITOS DA IMUNIZAÇÃO COM RVPl

Antígeno Título de NA (indivíduos)3 Proteção n 3 WPP 6 WPP 10 WPP 8 mg rVPl 3 13 22 21 (□, 64,□) 100% (11,11,16) (11,11,45) 4 mg rVPl 3 11 4 (11,□,□) 75 100% (11,11,11) (181,45,0) Controle 2 6 (,11) □ (□,□) □ (□,□) 0% negativo a: 0 título do NA de cada porco é expresso como a

recíproca da diluição final do soro que causou 50% de redução na atividade do vírus de teste como descrito na seção Materiais e Métodos. (-) denota a ausência do NA.

Conforme mostrado na Tabela 4, o rVPl conduziu à 20 proteção completa em todos os suínos imunizados. No entanto, gerou o NA em alguns, mas não em todos os suínos imunizados. Além disso, o NA médio provocado pelo rVPl não era tão elevado quanto aqueles da imunização com BVPl (vide as Tabelas 2 e 4). Os resultados sugerem que o BVPl que expressa um fragmento de 3 7-aa VPl é mais eficaz do que o rVPl derivado de E. coli de comprimento cheio para provocar respostas imunes humorais.

Anteriormente, o VPl derivado de E. coli recombinante (rVPl) , um polipeptídeo de 26 kDa, foi purificado. Ele poderia induzir a imunidade protetora em suínos. Comparando a composição descrita acima, o rVPl provocou anticorpos neutralizantes em alguns, mas não em todos os suínos imunizados. 0 título médio de anticorpos neutralizantes provocado pelo rVPl não era tão elevado quanto aqueles de BVPl (Tabelas 2 e 4) . Não se esperava que o BVPl, que contém somente 3 7 aminoácidos de VPl fundidos a CP de BaMV7 conduzisse a um melhor resposta do anticorpo neutralizante do que o rVPl. Também não se esperava que o mutante de CP de BVPl que não tem até 3 5 resíduos de aminoácido de N terminal poderia formar vírus que poderiam ainda infectar as plantas hospedeiras sistêmicas (N. benthamiana) e hospedeiras de lesão local (C. quinoa).

Os resultados acima indicam que o sistema de vetor de expressão de BaMV e o vírus quimérico descritos na presente invenção são eficazes para a geração de anticorpos neutralizantes, devido à flexibilidade de BaMV em acomodar peptídeos estranhos e expressar os mesmos eficazmente. Além disso, BaMV tem vantagens adicionais em relação a outros vírus de plantas. Por exemplo, uma vez que nenhum vetor transmissor natural para BaMV foi encontrado, BaMV é mais seguro (Lin et al. Phytopathology 1992; 82: 731-4). Por outro lado, muitos vírus de planta são patõgenos para a maior parte das plantações. Além disso, BaMV, como um carreador, tem uma capacidade maior de acomodar um polipeptídeo heterólogo mais longo.

OUTRAS REALIZAÇÕES

Todas as características descritas neste relatório descritivo podem ser combinadas em qualquer combinação. Cada característica descrita neste relatório descritivo pode ser substituída por uma característica alternativa que sirva para a mesma finalidade, uma finalidade equivalente ou similar. Desse modo, a menos que esteja indicado expressamente de alguma outra maneira, cada característica descrita é somente um exemplo de uma série genérica de características equivalentes ou similares.

A partir da descrição acima, o elemento versado na técnica pode facilmente verificar as características essenciais da presente invenção e, sem que se desvie do caráter e âmbito da mesma, pode fazer várias mudanças e modificações na invenção para adaptá-la a várias utilizações e condições. Desse modo, outras realizações também estão dentro do âmbito das reivindicações a seguir. I LISTAGEM DE SEQÜÊNCIA

<110> Academia Sinica

<120> PARTÍCULAS E PROTEÍNAS VIRAIS RECOMBINANTES <130> 08919-150EP1 <160> 14

<170> SEQRápida para Windows Versão 4.0

<210> 1 <211> 241 <212> PRT

<213> Vírus de mosaico de bambu <400> 1

Met Ser Gly Ala Gly Thr Gly Thr Gly Arg Gly Thr Gly Thr Gly Val 10 15

Gly Gly Thr Gly Gly Thr Gly Gly Thr Gly Gly Gly Gly Thr Gly Arg 20 25 30

Gly Gln Gln Ala Ala Ala Gln Pro Trp Glu Ala Ile Phe Thr Lys Asp 35 40 45

Asp Leu Ala Ala Ile Glu Pro Lys Pro Ala Ser Ala Asn Val Pro Asn 50 55 60

Thr Lys Gln Trp Ile Gly Ile Gln Ala Gly Leu Ile Lys Ala Gly Ala 65 70 75 80

Thr Asp Ala Asn Phe Met Lys Val Leu Leu Gly Leu Ser Leu Glu Ala 85 90 95

Phe Asp Arg Gly Ser Ser Glu Ala Thr Thr Trp Asp Gly Ile Thr Glu 100 105 110

Gly Val Glu His Arg Ala Ala Ala Asn Ala Ile Lys Glu Ala Asn Pro 115 120 125

Ile His Lys Val Thr Tyr Tyr Leu Ala Lys Pro Thr Phe Ala Ile Arg 130 135 140

Gln Ser Lys Asn Leu Pro Pro Ala Asn Phe Ala Lys Lys Asn Val Pro 145 150 155 160

Ser Gln Tyr Lys Trp Cys Ala Phe Asp Ala Phe Asp Gly Leu Tyr Asp 165 170 175

Pro Thr Cys Leu Ala Ser Glu Leu Pro Tyr Asp Ala Pro Ser Glu Ile 180 185 190

Asp Arg Met Ala Tyr Ala Thr Phe Lys Thr Ile Gln Ile Lys Ile Ala 195 200 205

Asn Asp Gln Lys Gly Phe Asn Leu Asn Tyr Asn Pro Asn Val Thr Gln 210 215 220

Ala Arg Leu Pro Asn Ala Pro Leu Pro Ala Leu Pro Glu Pro Thr Ser 225 230 235 240

Asp <210> 2 <211> 724 <212> DNA

<213> Vírus de mosaico de bambu <400 2

atgtctggag ctggaacggg aactgggcga gggaccggga ccggagtagg aggcactggg 60 ggcacaggtg gcacaggcgg cggaggaaca ggtagagggc aacaagctgc agcccagccc 120 tgggaggaat ttttactaag gacgacctgg ccgcaatcga gccaaaacct gcttcggcaa 180 atgttccaaa cactaagcag tggatcggca ttcaagctgg actcatcaag gccggagcca 240 cggacgcaaa cttctgaaag tactgctcgg cctcagtctc gaagctttcg acaggggctc 300 atcagaagcc accacttggg atggaattac tgagggcgtg gagcaccgtg cagcagccaa 360 cgccatcaag gaggcgaact gccaatacac aaggtcacct actacctagc caaaccgacg 420 ttcgccatta gacaatcgaa aaacctcccc ccagcgaact tcgcaaagaa gaatgtgcca 480 tcacaatata aatggtgtgc gttcgatgct ttgatggcct gtacgatcct ãcctgccttg 540 cctcagaact accctacgac gccccctcag aaatagaccg aatggcgtac gctaccttca 600 aaactataca gatcaagatc gccaatgacc agaaaggttc aacctcaact acaaccctaa 660 cgtcacccag gctcgactcc ccaacgcgcc cctaccagct cttcccgaac caacatcaga 720 ctaa 724

<210>3 <211> 213 <212> PRT

<213> Vírus da doença de pé-e-boca <400>3

Thr Thr Ser Ala Gly Glu Ser Ala Asp Pro Val Thr Ala Thr Val Glu 10 15

Asn Tyr Gly Gly Glu Thr Gln Val Gln Arg Arg Gln His Thr Asp Ser 20 25 30

Ala Phe Ile Leu Asp Arg Phe Val Lys Val Lys Pro Lys Glu Gln Val 35 40 45

Asn Val Leu Asp Leu Met Gln Ile Pro Ala His Thr Leu Val Gly Ala 50 55 60

Leu Leu Arg Thr Ala Thr Tyr Tyr Phe Ser Asp Leu Glu Leu Ala Val 65 70 75 80

Lys His Glu Gly Asp Leu Thr Trp Val Pro Asn Gly Ala Pro Glu Thr 85 90 95

Ala Leu Asp Asn Thr Thr Asn Pro Thr Ala Tyr His Lys Glu Pro Leu 100 105 110

Thr Arg Leu Ala Leu Pro Tyr Thr Ala Pro His Arg Val Leu Ala Thr 115 120 125

Val Tyr Asn Gly Ser Ser Lys Tyr Gly Asp Thr Ser Thr Asn Asn Val 130 135 140

Arg Gly Asp Leu Gln Val Leu Ala Gln Lys Ala Glu Arg Thr Leu Pro 145 150 155 160

Thr Ser Phe Asn Phe Gly Ala Ile Lys Ala Thr Arg Val Thr Glu Leu 165 170 175

Leu Tyr Arg Met Lys Arg Ala Glu Thr Tyr Cys Pro Arg Pro Leu Leu 180 185 190

Ala Ile Gln Pro Ser Asp Ala Arg His Lys Gln Arg Ile Val Ala Pro 195 200 205

Ala Lys Gln Leu Leu 210

<210> 4 <211> 639 <212> DNA

<213> Vírus da doença de pé-e-boca <400> 4

accacctctg cgggtgagtc tgcggacccc gtgactgcca ccgtcgagaa ctacggtggt 60 gagacacaag tccagaggcg ccagcacacg gacagtgcgt tcatactgga caggttcgtg 120 aaagtcaagc caaaggaaca agttaatgtg ttggacctga tgcagatccc tgcccacacc 180 ttggtagggg cgctcctgcg aacggccacc tactacttct ctgacctgga gctggccgtc 240 aagcacgagg gcgatctcac ctgggtccca aacggcgccc ctgagacagc actggacaac 300 actaccaacc caacagctta ccacaaggaa cccctcacac ggctggcgct gccttacacg 360 gctccacacc gtgtcttagc gaccgtctac aacgggagca gtaagtacgg tgacaccagc 420 actaacaacg tgagaggtga ccttcaagtg ttagctcaga aggcagaaag aactctgcct 480 acctccttca acttcggtgc catcaaggca actcgtgtta ctgaactact ctacagaatg 540 aagagagccg agacatactg tcccaggccc cttctcgcca ttcaaccgag tgacgctaga 600 cacaagcaga ggattgtggc acccgcaaaa cagcttctg 639

<210> 5 <211> 37 <212> PRT

<213> Vírus da doença de pé-e-boca <400>5

Thr Val Tyr Asn Gly Ser Ser Lys Tyr Gly Asp Thr Ser Thr Asn Asn

1 5 Iu 15

Val Arg Gly Asp Leu Gln Val Leu Ala Gln Lys Ala Glu Arg Thr Leu 20 25 30

Pro Thr Ser Phe Asn 35

<210> 6 <211> 111 <212> DNA

<213> Vírus da doença de pé-e-boca <400> 6

accgtctaca acgggagcag taagtacggt gacaccagca ctaacaacgt gagaggtgac 60 cttcaagtgt tagctcagaa ggcagaaaga actctgccta cctccttcaa c 111

<210> 7 <211> 206 <212> PRT <213> Vírus de mosaico de bambu <400> 7

Ala Ala Ala Gln Pro Trp Glu Ala Ile Phe Thr Lys Asp Asp Leu Ala 10 15

Ala Ile Glu Pro Lys Pro Ala Ser Ala Asn Val Pro Asn Thr Lys Gln 20 25 30

Trp He Gly Ile Gln Ala Gly Leu Ile Lys Ala Gly Ala Thr Asp Alá 35 40 45

Asn Phe Met Lys Val Leu Leu Gly Leu Ser Leu Glu Ala Phe Asp Arg 50 55 60

Gly Ser Ser Glu Ala Thr Thr Trp Asp Gly Ile Thr Glu Gly Val Glu 65 70 75 80

His Arg Ala Ala Ala Asn Ala Ile Lys Glu Ala Asn Pro Ile His Lys 85 90 95

Val Thr Tyr Tyr Leu Ala Lys Pro Thr Phe Ala Ile Arg Gln Ser Lys 100 105 110

Asn Leu Pro Pro Ala Asn Phe Ala Lys Lys Asn Val Pro Ser Gln Tyr 115 120 125

Lys Trp Cys Ala Phe Asp Ala Phe Asp Gly Leu Tyr Asp Pro Thr Cys 130 135 140

Leu Ala Ser Glu Leu Pro Tyr Asp Ala Pro Ser Glu Ile Asp Arg Met 145 150 155 160

Ala Tyr Ala Thr Phe Lys Thr Ile Gln Ile Lys Ile Ala Asn Asp Gln 165 170 175

Lys Gly Phe Asn Leu Asn Tyr Asn Pro Asn Val Thr Gln Ala Arg Leu 180 185 190

Pro Asn Ala Pro Leu Pro Ala Leu Pro Glu Pro Thr Ser Asp 195 200 205

<210> 8 <211> 620 <212> DNA

<213> Vírus de mosaico do bambu <400> 8

gcggccgcac agccctggga ggcaattttt actaaggacg acctggccgc aatcgagcca 60 aaacctgctt cggcaaatgt tccaaacact aagcagtgga tcggcattca agctggactc 120 atcaaggcgg agccacggac gcaaacttca tgaaagtact gctcggcctc agtctcgaag 180 ctttcgacag gggctcatca gaagccacca cttgggatgg aattactgag ggcgtggagc 240 accgtgcagc agccacgcca tcaaggaggc gaactgccca atacacaagg tcacctacta 300 cctagccaaa ccgacgttcg ccattagaca atcgaaaaac ctccccccag cgaacttcgc 360 aaagaagaat gtgccatcac atataaatgg tgtgcgttcg atgcctttga tggcctgtac 420 gatcctacct gccttgcctc agaactaccc tacgacgccc cctcagaaat agaccgaatg 480 gcgtacgcta ccttcaaaac tatacagaca agatcgccaa tgaccagaaa gggttcaacc 540 tcaactacaa ccctaacgtc acccaggctc gactccccaa cgcgccccta ccagctcttc 600 ccgaaccaac atcagactaa 620

<210> 9 <211> 245 <212> PRT

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Peptídeo gerado sinteticamente <400 9

Met Asp Thr Val Tyr Asn Gly Ser Ser Lys Tyr Gly Asp Thr Ser Thr

10 15

Asn Asn Val Arg Gly Asp Leu Gln Val Leu AIa Gln Lys Ala Glu Arg 20 25 30

Thr Leu Pro Thr Ser Phe Asn Ala Ala Ala Gln Pro Trp Glu Ala Ile 35 40 45

Phe Thr Lys Asp Asp Leu Ala Ala Ile Glu Pro Lys Pro Ala Ser Ala 50 55 60

Asn Val Pro Asn Thr Lys Gln Trp Ile Gly Ile Gln Ala Gly Leu Ile 65 70 75 80

Lys Ala Gly Ala Thr Asp Ala Asn Phe Met Lys Val Leu Leu Gly Leu 85 90 95

Ser Leu Glu Ala Phe Asp Arg Gly Ser Ser Glu Ala Thr Thr Trp Asp 100 105 110

Gly Ile Thr Glu Gly Val Glu His Arg Ala Ala Ala Asn Ala Ile Glu 115 120 125

Ala Asn Cys Pro He His Lys Val Thr Tyr Tyr Leu Ala Lys Pro Thr 130 135 140

Phe Ala Ile Arg Gln Ser Lys Asn Leu Pro Pro Ala Asn Phe Ala Lys 145 150 155 160

Lys Asn Val Pro Ser Gln Tyr Lys Trp Cys Ala Phe Asp Ala Phe Asp 165 170 175

Gly Leu Tyr Asp Pro Thr Cys Leu Ala Ser Glu Leu Pro Tyr Asp Ala 180 185 190

Pro Ser Glu Ile Asp Arg Met Ala Tyr Ala Thr Phe Lys Thr Ile Gln 195 200 205

Ile Lys Ile Ala Asn Asp Gln Lys Gly Phe Asn Leu Asn Tyr Asn Pro 210 215 220

Asn Val Thr Gln Ala Arg Leu Pro Asn Ala Pro Leu Pro Ala Leu Pro 225 230 235 240

Glu Pro Thr Ser Asp 245

<210> 10 <211> 736 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Oligonucleotídeo gerado sinteticamente <400 10 atggacaccg tctacaacgg gagcagtaag tacggtgaca ccagcactaa caacgtgaga 60 ggtgaccttc aagtgttagc tcagaaggca gaaagaactc tgcctacctc cttcaacgcg 120 gccgcacgcc ctgggaggca atttttacta aggacgacct ggccgcaatc gagccaaaac 180 ctgcttcggc aaatgttcca aacactaagc agtggatcgg cattcaagct ggactcatca 240 aggccggagc cacgacgcaa acttcatgaa agtactgctc ggcctcagtc tcgaagcttt 300 cgacaggggc tcatcagaag ccaccacttg ggatggaatt actgagggcg tggagcaccg 360 tgcagcagcc aacgccatca agaggcgaac tgcccaatac acaaggtcac ctactaccta 420 gccaaaccga cgttcgccat tagacaatcg aaaaacctcc ccccagcgaa cttcgcaaag 480 aagaatgtgc catcacaata taaatggttg cgttcgatgc ctttgatggc ctgtacgatc 540 ctacctgcct tgcctcagaa ctaccctacg acgccccctc agaaatagac cgaatggcgt 600 acgctacctt caaaactata cagatcaaga tcgccatgac cagaaagggt tcaacctcaa 660 ctacaaccct aacgtcaccc aggctcgact ccccaacgcg cccctaccag ctcttcccga 720 accaacatca gactaa 736

<210> 11 <211> 34 <212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Primer <400> 11

gggctagcac catggacacc gtctacaacg ggag 34

<210> 12 <211> 26 <212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Primer <400> 12

ttgcggccgc gttgaaggag gtaggc 26

<210> 13 <211> 24 <212> DNA

<213> Seqüência artificial <220>

<223> Primer <400> 13

gctctgggaa actgaatgac ttcg 24

<210> 14 <211> 27 <212> DNA <213> Seqüência artificial <220>

<223> Primer <400> 14

gacttctctt ccgctttctt aggttag

Claims (26)

1. ÁCIDO NUCLÉICO ISOLADO, que codifica um polipeptídeo de fusão, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo de fusão inclui um fragmento carreador que contém a seqüência de uma proteína de cobertura do vírus de mosaico do bambu ou contém um segmento da mesma; e um fragmento heterólogo imunogênico que é fundido ao fragmento carreador e tem pelo menos três aminoácidos no comprimento.

2. ÁCIDO NUCLÉICO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o fragmento heterólogo imunogênico contém a seqüência de uma proteína VP 1 do vírus da doença de pé-e-boca ou contém um segmento imunogênico da mesma.

3. ÁCIDO NUCLÉICO, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o fragmento heterólogo imunogênico contém a SEQ ID NO:3.

4. ÁCIDO NUCLÉICO, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o segmento imunogênico contém a SEQ ID NO:5.

5. ÁCIDO NUCLÉICO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o fragmento heterólogo é fundido ao término amino do fragmento carreador.

6. ÁCIDO NUCLÉICO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o fragmento carreador contém a SEQ ID NO:7.

7. ÁCIDO NUCLÉICO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o fragmento heterólogo imunogênico tem pelo menos 37 aminoácidos no comprimento.

8. ÁCIDO NUCLÉICO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo inclui a seqüência de SEQ ID NO:9.

9. ÁCIDO NUCLÉICO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o ácido nucléico compreende adicionalmente as seqüências de Quadros de Leitura Abertos 1- 4 do vírus de mosaico do bambu.

10. POLIPEPTÍDEO ISOLADO, caracterizado pelo fato de ser codificado pelo ácido nucléico conforme definido na reivindicação 1.

11. VETOR DE EXPRESSÃO, caracterizado pelo fato de compreender o ácido nucléico conforme definido na reivindicação 1.

12. CÉLULA HOSPEDEIRA, caracterizada pelo fato de compreender o ácido nucléico conforme definido na reivindicação 1.

13. CÉLULA HOSPEDEIRA, de acordo com a reivindicação 12, caracterizada pelo fato de que a célula hospedeira é uma célula de uma planta.

14. CÉLULA HOSPEDEIRA, de acordo com a reivindicação 13, caracterizada pelo fato de que a planta é Chenopodium quinoa ou Nicotiana benthamiana.

15. CÉLULA HOSPEDEIRA, de acordo com a reivindicação 13, caracterizada pelo fato de que a célula é uma célula de uma folha.

16. MÉTODO PARA A PRODUÇÃO DE UM POLIPEPTÍDEO DE FUSÃO, caracterizado pelo fato de compreender o cultivo da célula conforme definido na reivindicação 12 em um meio sob condições que permitem a expressão de um polipeptídeo codificado pelo ácido nucléico, e a purificação do polipeptídeo da célula cultivada ou do meio.

17. PARTÍCULA DO VÍRUS DE MOSAICO DO BAMBU QUIMÉRICO, caracterizada pelo fato de compreender o polipeptídeo de fusão codificado pelo ácido nucléico conforme definido na reivindicação 1.

18 . MÉTODO PARA A PRODUÇÃO DE UMA PARTÍCULA DO VIRUS DE MOSAICO DO BAMBU QUIMÉRICO, caracterizado pelo fato de compreender a provisão de um ácido nucléico conforme definido na reivindicação 1, em que o ácido nucléico tem seqüências de Quadros de Leitura Abertos 1-4 do virus de mosaico do bambu; a colocação do ácido nucléico em contato com uma folha de uma planta hospedeira; a manutenção da folha sob condições que permitem a formação de uma partícula do vírus que tem os polipeptídeos codificados pelo ácido nucléico, e a purificação da partícula de vírus da folha.

19. COMPOSIÇÃO IMUNOGÊNICA, caracterizada pelo fato de compreender o polipeptídeo de fusão conforme definido na reivindicação 10.

20. COMPOSIÇÃO IMUNOGÊNICA, caracterizada pelo fato de compreender a partícula do vírus de mosaico do bambu quimérica conforme definido na reivindicação 17.

21. MÉTODO PARA A INDUÇÃO DE UMA IMUNORESPOSTA EM UM INDIVÍDUO, em que o método é caracterizado pelo fato de compreender a administração, a um indivíduo com necessidade do mesmo, de uma quantidade eficaz do polipeptídeo de fusão conforme definido na reivindicação 10.

22. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que o indivíduo é um animal não humano.

23. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de que o animal não humano é um porco.

24. MÉTODO PARA A INDUÇÃO DE UMA IMUNORESPOSTA EM UM INDIVÍDUO, em que o método é caracterizado pelo fato de compreender a administração, a um indivíduo com necessidade da mesma, de uma quantidade eficaz da partícula do vírus de mosaico do bambu quimérico conforme definido na reivindicação

25. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo fato de que o indivíduo é um animal não humano.

26. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de que o animal não humano é um porco.