ES2514316T3 - Partículas similares a virus (VLPs) de Norovirus y Sapovirus - Google Patents

Partículas similares a virus (VLPs) de Norovirus y Sapovirus Download PDF

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ES2514316T3 ES10192453.8T ES10192453T ES2514316T3 ES 2514316 T3 ES2514316 T3 ES 2514316T3 ES 10192453 T ES10192453 T ES 10192453T ES 2514316 T3 ES2514316 T3 ES 2514316T3
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Abstract

Un método para producir partículas similares a virus (VLPs), el método comprende: a) transformar una célula de levadura con un vector de expresión que comprende un polinucleótido recombinante ligado operativamente a un promotor híbrido ADH2/GAPDH en donde el polinucleótido es seleccionado del grupo consistente de: i) un polinucleótido que comprende la secuencia de la SEQ ID NO:1; ii) un polinucleótido que comprende la secuencia de la SEQ ID NO:2; y iii) un polinucleótido que muestra al menos un 80-100% de identidad de secuencia con las secuencias de la SEQ ID NO:1 o la SEQ ID NO:2 b) cultivar la célula huésped transformada bajo condiciones por las que las proteínas de la cápside se expresan y ensamblan en VLPs.

Description

REFERENCIAS CRUZADAS A SOLICIRUDES RELACIONADAS
Esta solicitud reivindica el beneficio de la solicitud provisional de Estados Unidos número de serie 60/739217, presentada el 22 de noviembre de 2005.
CAMPO TECNICO
La presente invención se refiere a un método para producir partículas similares a virus (VLPs) de Norovirus.
ANTECEDENTES
Los Norovirus (también conocidos como virus tipo Norwalk o virus de Norwalk) y los Sapovirus (también conocidos como virus tipo Sapporo) son agentes etiológicos de gastroenteritis aguda en adultos y niños (Green y otros, Infect. Dis. 181 (Suppl 2):S322-330). Los Norovirus y los Sapovirus son miembros de la familia Caliciviridae de virus sin envoltura, pequeños, de 27-35 nm de diámetro, que contienen una única cadena de ARN genómico de sentido positivo. Actualmente, los Norovirus y los Sapovirus son los únicos dos géneros de la familia Caliviridae que se conoce que causan enfermedad humana.
Los Norovirus causan más del 90% de los brotes de gastroenteritis no bacteriana y una estimación de 23 millones de casos de gastroenteritis en los Estados Unidos por año. (Fankhauser y otros (2002) J. Infect. Dis. 186:17; MMWR Morb. Mortal Weekly Rep. (2000) 49:207-211). Aunque la cepa Norwalk de Norovirus fue la primera descubierta, ahora es evidente que el virus Norwalk causa menos del 10% de los casos de gastroenteritis, mientras que otros miembros de la familia de los Norovirus, como el virus Lordsdale, virus de Toronto, y virus de la Montaña Nevada, pueden causar el 90% de los casos (Fankhauser y otros (1998) J. Infect. Dis. 178:1571-1578; Nishida y otros (2003) Appl. Environ. Microbiol. 69(10):5782-6).
Los síntomas de la infección por Norovirus incluyen diarrea y vómitos simultáneos así como fiebre, dolores de cabeza, escalofríos y dolores de estomago. La causa de tales síntomas puede estar relacionada con el enlace de los Norovirus con los receptores de carbohidratos de las células epiteliales intestinales, lo que resulta en un desequilibrio en la transferencia de iones (Marionneau y otros (2002) Gastroenterology 122:1967-1977; Hutson y otros (2003) J. Virol. 77:405-415). Extremadamente contagiosos, los Norovirus pueden causar infección con tan poco como 10 viriones. Aunque, personas por lo demás sanas infectadas con Norovirus puede recuperarse dentro de 2-4 días, aún pueden propagar el virus durante 2 semanas después del inicio de los síntomas; por lo tanto, los individuos infectados deberían ser puestos en cuarentena durante hasta dos semanas. Aproximadamente el 30-40% de las personas infectadas pueden permanecer libres de síntomas, aunque pueden propagar la infección diseminando virus a otros que pueden ser más susceptibles a la infección (Hutson y otros Trends Microbiol. 2004 Jun;12(6):279-287).
Por el contrario, los Sapovirus son menos prevalentes en los brotes de gastroenteritis e infectan mayoritariamente a bebes y niños, aunque ocasionalmente a adultos (Zintz y otros (2005) Infect. Genet. Evol. 5:281290; Johansson y otros (2005) Scand. J. Infect. Dis. 37:200-204; Rockx y otros (2002) Clin. Infect. Dis. 35:246-253). Los Sapovirus pueden también causar diarrea y vómitos y propagar la infección a través de diseminación viral, que puede durar hasta 2 semanas.
La US2003/129588 y Ball y otros ((1996) Archives of Virology, vol 12 pp. 2430249) describen la expresión de las proteínas de la cápside del virus Norwalk en células de insecto. La WO05/032457 describe la expresión de las proteínas de la cápside del virus Norwalk en células de insecto. Boga y otros ((1997) Journal of General Biology, Vol 78(9) pp. 2315-2318) describen la expresión de la proteína de la cápside principal (VP60) del virus hemorrágico de conejo en células de insecto y levadura, e informa que la expresión de estas VLPs fue menor usando levadura que cuando se usaron células de insecto.
RESUMEN
La presente invención proporciona un método para producir VLPs. En particular, la invención proporciona un método para producir partículas similares a virus (VLPs), el método comprendiendo:
a) transformar una célula de levadura con un vector de expresión que comprende un polinucleótido recombinante ligado operativamente con un promotor híbrido ADH2/GAPDH en donde el polinucleótido es seleccionado del grupo consistente de:
(i)
un polinucleótido que comprende la secuencia de la SEQ ID NO:1;
(ii)
un polinucleótido que comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 2; y
(iii) un polinucleótido que muestra al menos un 80-100% de identidad de secuencia con las SEQ ID NO:1 o SEQ ID NO:2;
b) cultivar la célula huésped transformada bajo condiciones por las que las proteínas de la cápside se expresan y ensamblan en VLPs.
También se describen métodos para producir Norovirus y opcionalmente antígenos de fusión de múltiples epítopos derivados de Sapovirus o antígenos de fusión de poliproteínas. Las VLPS pueden ser también mezcladas o co-expresadas con adyuvantes (por ejemplo, mutantes desintoxicados de toxinas lábiles al calor (LT) de E.coli como LT-K63 o LT-R72).
1. Un método para producir partículas similares a virus (VLPs), el método comprendiendo:
a) transformar una célula huésped con un vector de expresión que comprende un polinucleótido recombinante ligado operativamente con un promotor híbrido ADH2/GAPDH en donde el polinucleótido es seleccionado del grupo consistente de:
(i)
un polinucleótido que comprende la secuencia de la SEQ ID NO:1;
(ii)
un polinucleótido que comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 2; y
(iii) un polinucleótido que muestra al menos un 80-100% de identidad de secuencia con las SEQ ID NO:1 o SEQ ID NO:2;
b) cultivar la célula huésped transformada bajo condiciones por las que las proteínas de la cápside se expresan y ensamblan en VLPs.
2.
El método de la realización 1, en donde uno o más de los vectores de expresión comprenden secuencias que codifican proteínas de la cápside de más de un aislado de Norovirus o Sapovirus.
3.
El método de la realización 1 o la realización 2, comprendiendo además transformar las mencionadas células huésped con una o más secuencias que codifican una proteína estructura de un Norovirus o Sapovirus.
4.
El método de cualquiera de las realizaciones 1 a 3, en donde el mencionado vector de expresión comprende una o más secuencias codificantes de ORF1 y/o ORF3 de un Norovirus o Sapovirus.
5.
El método de cualquiera de las realizaciones 1 a 4, comprendiendo además transformar una célula huésped con un vector de expresión que comprende una secuencia que codifica un adyuvante.
6.
El método de cualquiera de las realizaciones anteriores, en donde la célula de levadura es Saccharomyces cerevisiae.
7.
El método de cualquiera de las realizaciones anteriores en donde el polinucleótido recombinante comprende además una secuencia que codifica un adyuvante.
8.
El método de cualquiera de las realizaciones anteriores en donde el adyuvante es un mutante desintoxicado de una toxina lábil calor (LT) de E.coli seleccionada del grupo consistente de LT-K63 y LT-R72.
9.
El método de la realización 8 en donde el polinucleótido recombinante es seleccionado del grupo consistente de:
a) un polinucleótido que comprende la SEQ ID NO:1; b) un polinucleótido que comprende una secuencia al menos 90% idéntica a la SEQ ID NO:1 que es capaz
de producir partículas similares a virus; c) un polinucleótido que comprende la SEQ ID NO;2; d) un polinucleótido que comprende una secuencia al menos 90% idéntica a la SEQ ID NO:2 que es capaz
de producir partículas similares a virus; e) un polinucleótido que codifica un polipéptido que comprende al secuencia de la SEQ ID NO:3; f) un polinucleótido que codifica un polipéptido que comprende una secuencia al menos 90% idéntica a la
secuencia de la SEQ ID NO:3 que es capaz de provocar una respuesta inmune contra la proteína de la
cápside principal del virus Norwalk; g) un polinucleótido que codifica un polipéptido que comprende la secuencia de la SEQ ID NO:4; h) un polinucleótido que codifica un polipéptido que comprende una secuencia al menos 90% idéntica a la
secuencia de la SEQ ID NO:4 que es capaz de provocar una respuesta inmune contra la proteína de la cápside principal del virus Norwalk; i) un polinucleótido que codifica un polipéptido que comprende al menos una secuencia seleccionada del grupo consistente de las SEQ ID NOS: 3-4;
j) un polinucleótido que codifica un polipéptido que comprende una secuencia al menos 90% idéntica a la secuencia seleccionada del grupo consistente de las SEQ ID NO:3-4 que es capaz de provocar una respuesta inmune contra un Norovirus o un Sapovirus; y
k) un polinucleótido que codifica un fragmento de un polipéptido de i) que es capaz de provocar una respuesta inmune contra un Norovirus o un Sapovirus.
10.
El método de cualquiera de las realizaciones anteriores, en donde se ensambla una VLP mosaico que comprende proteínas de la cápside de al menos dos cepas virales de Norovirus.
11.
El método de cualquiera de las realizaciones anteriores, en donde el vector de expresión es un vector alfavirus.
12.
El método de cualquiera de las realizaciones anteriores en donde el polinucleótido recombinante comprende además un terminador del factor alfa.
13.
El método de cualquiera de las realizaciones anteriores que comprende un paso de purificar la VLP.
Estas y otras realizaciones de la presente invención se les ocurrirán fácilmente a los expertos en la técnica en vista de la presente descripción.
BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS
Las Figuras 1A-1C representen un alineamiento de la secuencia de nucleótidos del virus Norwalk, incluyendo las regiones orf2 y orf3 (Acceso GenBank Nº M87661, 26 de Marzo de 1997) y la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO:2 (NV.orf2+3), comprendiendo las secuencias orf2 y orf3 modificadas. Las posiciones de las modificaciones de secuencia en la SEQ ID NO:2 están resaltadas. Las Figuras 2A-2F representan una traducción de la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO:2. Las Figuras 2A-2D muestran la secuencia de aminoácidos traducidos codificada por orf2 (SEQ ID NO:3) y las Figuras 2E-2F muestran la secuencia de aminoácidos traducida codificada por orf3 (SEQ ID NO:4). La Figura 3 recoge un diagrama esquemático que ilustra la generación de fragmentos de oligonucleótidos para el ensamblaje de los constructos NV.orf2 y NV.orf2+3. La secuencia de la SEQ ID NO:2 se dividió en cuatro dominios como se describe en el Ejemplo 1. Los oligonucleótidos para cada uno de los cuatro dominios fueron diseñados para incluir sitios EcoR1 y Sall en sus extremos 5' y 3' y ligados en un corte del vector de subclonación pUC19 con los enzimas de restricción EcoR1 y Sall. Digestiones adicionales con los enzimas de restricción indicados produjeron los fragmentos de oligonucleótidos como se muestra. La Figura 4 representa un diagrama esquemático que ilustra el ensamblaje del constructo NV.orf2 de los fragmentos de oligonucleótidos. El constructo NV.orf2 de longitud completa se ensambló de cuatro fragmentos de oligonucleótidos producidos de una serie de digestiones con enzimas de restricción como se muestra. Los cuatro fragmentos fueron purificados en gel y ligados en el corte del vector pSP72 con los enzimas de restricción HindIII y Sall, para crear un inserto Hindlll-Sall de 1613 pares de base (bp) para la secuencia codificante de NV.orf2. La Figura 5 representa un diagrama esquemático que ilustra el ensamblaje del constructo NV.orf2+3 de los fragmentos de oligonucleótidos. El constructo NV.orf2+3 de longitud completa se ensambló ligando los fragmentos HindIII/XbaI, XbaI/PciI, y PciI/AseI mostrados con un fragmento purificado en gel de 595 bp obtenido de la digestión de pUC19.NV.3p #22 con Asel y BspE1, y un fragmento BspEl/Sall purificado en gel de 715 bp, obtenido de pUC19.NV.orf3 #31, en el vector pSP72 HindIII/SaLI (ver Ejemplo 1). La Figura 6 representa un diagrama esquemático que ilustra la subclonación del pSP72.NV.orf2 #1 de longitud completa en el vector pBS24.1 para producir el constructo pd.NV.orf2#1 para la expresión en levadura. Un fragmento NV.orf2 de 1613 bp, obtenido por digestión con los enzimas de restricción HindIII y Sall, fue aislado en gel y purificado. Este fragmento fue ligado con el promotor híbrido de levadura BamHI/HindIII ADH2/GAPDH de 1366 bp en el vector de expresión de levadura pBS24.1 BamHI/SalI como se describe en el Ejemplo 1. La Figura 8 representa los resultados de la expresión de antígenos de virus Norwalk recombinantes en levadura. Los plásmidos de expresión pd.NV.orf2 #1 y pd.NV.orf2+3 #12, se expresaron en la cepa de S.cerevisiae AD3 [mat
leu2 , trp1, ura3-52, prb-1122, pep4-3, prc1-407, cir°, trp+, ::DM15[GAP/ADR]. Los lisados celulares fueron sometidos a sedimentación por gradiente de sacarosa, y las proteínas recombinantes en fracciones recogidas fueron detectadas usando el inmunoensayo de Norovirus RIDASCREEN (SciMedx Corporation). La Figura 9 muestra una micrografía electrónica de partículas de Norovirus recombinantes producidas por la expresión de NV.orf2+3#12 en levadura. La Figura 10 representa un diagrama esquemático que ilustra la subclonación de NV.orf2 y NV.orf2+3 de longitud completa en el vector lanzadera PCET906A. Un fragmento KpnI/SalI NV.orf2 de 1534 bp y un fragmento KpnI/SalI NV.orf2+3 de 2235 bp fueron aislados digiriendo pSP72.NV.orf2 #1 y pSP72.NV.orf2+3 #16,, respectivamente, con Kpnl y Sall. Los fragmentos de KpnI/SalI NV.orf2 y KpnI/SalI NV.orf2+3 purificados en gel fueron ligados con un oligo sintético de 63 bp que incluía un sitio Nhel en el comienzo, una
secuencia que codifica los aminoácidos 1-21 de la proteína de la cápside, y un sitio Kpnl en el extremo y clonado en el vector lanzadera PCET906A NheI/SalI v. (ML LAbs). La Figura 11 representa un diagrama esquemático que ilustra la subclonación de NV.orf2 y NV.orf2+3 de longitud completa en el vector de expresión de baculovirus PBLUEBAC4.5. Los clones pCET906A.TPAL.orf2 #21 y pCET906A.TPAL.orf2+3 #34 fueron digeridos con Nhel y Sall para aislar en gel un fragmento de 1602 bp que codifica para NV.orf2 y un fragmento de 2303 bp que codifica para NV.orf2+3, respectivamente. Cada uno de los fragmentos orf2 y orf2+3 NheI/SalI fue ligado en el vector de expresión de células de insecto PBLUEBAC4.5 NheI/SalI (Invitrogen), creando los plásmidos PBLUEBAC4.5.NV.orf2 #2 y PBLUEBAC4.5.NV.orf2+3 #12. La Figura 12 representa los resultados de la expresión de antígenos de virus Norwalk recombinante en células de insecto SF9 infectadas con baculovirus. Los lisados celulares fueron sometidos a sedimentación por gradiente de sacarosa, y las proteínas recombinantes en fracciones recogidas fueron detectadas usando el inmunoensayo de Norovirus RIDASCREEN (SciMedx Corporation). La Figura 13 muestra una micrografía electrónica de partículas de Norovirus recombinantes producidas por la expresión de PBLUEBAC4.5.NV.orf2+3 #12 en células de insecto SF9. Las Figuras 14A y 14B muestran la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO:1 (NV.orf2). Las Figuras 15A y 15B muestran la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO:2 (NV.orf2+3). Las Figuras 16A-16A muestran la secuencia de codificación ORF1 para la poliproteína del Novirus MD145-12 y los límites del domino de la poliproteína. Las Figuras 17A-17C muestran la secuencia de codificación ORF2 para la proteína de la cápside principal del Novirus MD145-12. Las Figuras 18A y 18B muestran la secuencia de codificación para la proteína estructural menor del Novirus MD145-12.
DESCRIPCION DETALLADA
La práctica de la presente invención empleará, a menos que se indique lo contrario, métodos convencionales de farmacología, la química, bioquímica, técnicas de ADN recombinante e inmunología, dentro del estado de la técnica. Tales técnicas están explicadas completamente en la bibliografía. Ver, por ejemplo, Handbook of Experimental Immunology, Vols. I-IV (D.M. Weir and C.C. Blackwell eds., Blackwell Scientific Publications); A.L. Lehninger, Biochemistry (Worth Publishers, Inc., current addition); Sambrook, y otros, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd Edition, 1989); Methods In Enzymology (S. Colowick and N. Kaplan eds., Academic Press, Inc.).
I. DEFINICIONES
Todos los términos científicos y técnicos usados en esta solicitud tienen significados usados comúnmente en la técnica a menos que se especifique lo contrario. Como se usan en esta solicitud, las siguientes palabras o frases tienen los significados especificados.
Debe tenerse en cuenta que, como se usa en esta especificación y en las reivindicaciones añadidas, las formas singulares "un" y "el" incluyen referencias plurales a menos que el contenido indique claramente lo contrario. Por lo tanto, por ejemplo, la referencia a "un polinucleótido" incluye una mezcla de dos o más de dichos polinucleótidos, y similares.
El término "comprende" significa "incluye" así como "consiste", por ejemplo una composición que "comprende" X puede consistir exclusivamente de X o puede incluir algo adicional, por ejemplo X+Y.
El término "alrededor" en relación a un valor numérico X significa, por ejemplo, x±10%.
Como se usan en la presente, los términos "Norovirus" y "virus tipo Norwalk" se refieren a miembros del género Norovirus de la familia Caliciviridae de virus de sentido positivo, ARN monocatenario, sin envoltura (Green y otros, Human Caliciviruses, in Fields Virology Vol. 1, pp. 841-874 (Knipe and Howley, editors-in-chief, 4th ed., Lippincott Williams & Wilkins 2001)). El término Norovirus incluye cepas en todos los genogrupos del virus. Actualmente, las cepas de Norovirus están divididas en cuatro genogrupos (GI-GIV), que están subdivididos en al menos 20 grupos genéticos. En particular, el término Norovirus incluye, pero no está limitado a , las especies de Virus Norwalk (NV), virus Lordsdale (LV), virus e México (MV), virus de Hawaii (HV), virus de la Montaña de Nieve (SMV), virus del Escudo del Desierto (DSV), y el virus de Southhampton (SV). Un gran número de aislados de Norovirus han sido parcialmente o completamente secuenciados. Ver, por ejemplo la Base de Datos de Secuencias de Calicivirus (iah.bbsrc.ac.uk/virus/Caliciviridae/database.htm), la Base de Datos de Norovirus (hpa.org.uk/srmd/bioinformatics/norwalk/norovirus.htm) y la base de datos GenBank (ncbi.nlm.nih.gov). El término Norovirus también incluye aislados no caracterizados en el momento de la presentación.
Como se usan en la presente, los términos "Sapovirus" y "virus tipo Sapporo" se refieren a miembros del género Sapovirus de la familia Caliciviridae de virus de sentido positivo, ARN monocatenario, sin envoltura (Green y otros, anteriormente). El término Sapovirus incluye cepas en todos los genogrupos del virus. Actualmente, las cepas
de Sapovirus están divididas en cinco genogrupos (GI-GV) en base a sus secuencias de la cápside (VP1). En particular, el término Sapovirus incluye, pero no está limitado a, las especies Virus Sapporo, virus Londres / 29845, virus de Manchester, virus Houston /86, virus Houston/90, y virus de Parkville. Un gran número de aislados de Sapovirus han sido parcial o completamente secuenciados. Ver por ejemplo, la Base de Datos de Secuencias de Calicivirus (iah.bbsrc.ac.uk/virus/Caliciviridae/database.htm) y la base de datos GenBank (ncbi.nlm.nih.gov). ). El término Sapovirus también incluye aislados no caracterizados en el momento de la presentación.
Los términos "polipéptido" y "proteína" se refieren a un polímero de residuos de aminoácidos y no están limitados a una longitud mínima del producto. Por lo tanto, los péptidos, oligopéptidos, dímeros, multímeros, y similares están incluidos dentro de la definición. Tanto las proteínas de longitud completa como los fragmentos de las mismas están englobados por la definición. Los términos también incluyen las modificaciones de post-expresión del polipéptido, por ejemplo, glicosilación, acetilación, fosforilación y similares. Además, para propósitos de la presente invención, un "polipéptido" se refiere a una proteína que incluye modificaciones, como deleciones, adiciones y sustituciones (generalmente de naturaleza conservadora), a la secuencia nativa, siempre que la proteína mantenga la actividad deseada. Estas modificaciones pueden ser deliberadas, como a través de mutagénesis dirigida al sitio, o pueden ser accidentales, como a través de mutaciones de los huéspedes que producen las proteínas o errores debidos a amplificación por PCR.
"Sustancialmente purificado" se refiere de forma general al aislamiento de una sustancia (compuesto, polinucleótido, proteína, polipéptido, composición de polipéptidos) de tal forma que la sustancia comprende la mayoría del porcentaje de la muestra en la que reside. Típicamente en una muestra, un componente sustancialmente purificado comprende el 50%, preferiblemente el 80%-85%, más preferiblemente el 90-95% de la muestra. Las técnicas para purificar polinucleótidos y polipéptidos de interés son bien conocidas en la técnica e incluyen, por ejemplo, cromatografía de intercambio de iones, cromatografía de afinidad y sedimentación de acuerdo con la densidad.
Por "aislado" se entiende, cuando se hace referencia a un polipéptido, que la molécula indicada está separada y discreta del organismo completo con el que la molécula se encuentra en la naturaleza o está presente en la ausencia sustancial de otros macro-moléculas biológicas del mismo tipo. El término "aislado" con respecto a un polinucleótido es una molécula de ácido nucleico vacía, totalmente o en parte, de secuencias normalmente asociadas con ella en la naturaleza; o una secuencia, como existe en la naturaleza, pero que tiene secuencias heterólogas en asociación con ella; o una molécula disociada del cromosoma.
"Homología" se refiere al porcentaje de identidad entre fracciones de dos polinucleótidos o dos polipéptidos. Dos ácidos nucleicos, o dos secuencias de polipéptidos son "sustancialmente homólogas" entre sí cuando las secuencias muestran al menos alrededor de un 50% de identidad de secuencia, preferiblemente al menos alrededor del 75% de identidad de secuencia, más preferiblemente al menos alrededor del 80%-85% de identidad de secuencia, más preferiblemente al menos alrededor del 90% de identidad de secuencia, y más preferiblemente al menos alrededor del 95%-98% de identidad de secuencia sobre una longitud definida de las moléculas. Como se usa en la presente, sustancialmente homólogo también se refiere a secuencias que muestran identidad completa con la secuencia especificada.
En general, "identidad" se refiere a una correspondencia nucleótido a nucleótido o aminoácido a aminoácido exacta de dos secuencias de polinucleótidos o polipéptidos, respectivamente. El porcentaje de identidad puede ser determinado por una comparación directa de la información de la secuencia entre dos moléculas por alineamiento de las secuencias, contando el número exacto de coincidencias entre las dos secuencias alineadas, dividiendo por la longitud de la secuencia más corta, y multiplicando el resultado por 100. Se pueden usar programas informáticos fácilmente disponibles para ayudar en el análisis, como el ALIGN, Dayhoff, M.O. en Atlas of Protein Sequence and Structure M.O. Dayhoff ed., 5 Suppl. 3:353-358, National biomedical Research Foundation, Washington, DC, que adapta el algoritmo de homología local de Smith y Waterman Advances in Appl. Math. 2:482489, 1981 para el análisis de péptidos. Los programas para determinar la secuencia de nucleótidos están disponibles en el Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 (disponible de Genetics Computer Group, Madison, WI) por ejemplo, los programas BESTFIT, FASTA y GAP, que también se basan en el algoritmo de Smith y Waterman. Estos programas son utilizados fácilmente con los parámetros predeterminados recomendados por el fabricante y descritos en el Wisconsin Sequence Analysis Package referido anteriormente. Por ejemplo, el porcentaje de identidad de una secuencia de nucleótidos particular con una secuencia de referencia puede ser determinada usando el algoritmo de homología de Smith y Waterman con una tabla de puntuación predeterminada y una penalización por hueco de seis posiciones de nucleótidos.
Otro método de establecer el porcentaje de identidad en el contexto de la presente invención es usar el paquete MPSRCH de programas con copyright de la Universidad de Edimburgo, desarrollado por John F. Collins y Shane S. Sturrok, y distribuido por IntelliGenetics, Inc. (Mountain View, CA). Desde este conjunto de paquetes se puede emplear el algoritmo Smith-Waterman donde los parámetros predeterminados se usan para la tabla de puntuación (por ejemplo, penalización por abertura de hueco de 12, penalización por extensión de hueco de uno, y un hueco de seis). De los datos generados el valor "Concordancia" refleja la "identidad de secuencia". Otros programas adecuados para calcular el porcentaje de identidad o similitud entre secuencias son conocidos
generalmente en la técnica, por ejemplo, otro programa de alineamiento es el BLAST, usado con parámetros predeterminados. Por ejemplo, el BLASTN y BLASTP pueden ser usados usando los siguientes parámetros predeterminados: código genético = estándar; filtro = ninguno; cadena = ambas; corte = 60; espera = 10; Matriz = BLOSUM62; Descripciones = 50 secuencias; ordenar por = PUNTUACION MAS ALTA; Bases de Datos = no redundantes, GenBank + EMBL + DDBJ + PDB + traducciones CDS GenBank + proteína Suiza + Spupdate + PIR. Los detalles de estos programas son fácilmente accesibles.
Alternativamente, la homología puede ser determinada por hibridación de polinucleótidos bajo condiciones que forman dúplex estables entre regiones homólogas, seguido por la digestión con nucleasa(s) específicas de cadena sencilla, y determinación del tamaño de los fragmentos digeridos. Las secuencias de ADN que son sustancialmente homólogas pueden ser identificadas en un experimento de hibridación Southern bajo, por ejemplo, condiciones rigurosas, como se defina para ese sistema particular. El definir las condiciones de hibridación apropiadas está dentro de la experiencia de la técnica. Ver, por ejemplo, Sambrook y otros, supra; DNA Cloning, supra; Nucleic Acid Hybridization, supra.
"Recombinante" como se usa en la presente para describir una molécula de ácido nucleico significa un polinucleótido de origen genómico, viral de ADNc, semisintético o sintético que, por virtud de su origen o manipulación, no está asociado con todo o una porción del polinucleótido con el que está asociado en la naturaleza. El término "recombinante" como se usa con respecto a una proteína o polipéptido significa un polipéptido producido por la expresión de un polinucleótido recombinante. En general, el gen de interés es clonado y después expresado en organismos transformados, como se describe con más detalle a continuación. El organismo huésped expresa el gen extraño para producir la proteína bajo condiciones de expresión.
El término "transformación" se refiere a la inserción de una polinucleótido exógeno en una célula huésped, independientemente del método usado para la inserción. Por ejemplo, están incluidos absorción directa, transducción o f-apareamiento. El polinucleótido exógeno puede ser mantenido como un vector no integrado, por ejemplo, un plásmido, o alternativamente puede ser integrado en el genoma huésped.
"Células huésped recombinantes", "células huésped", "células", "líneas celulares", "cultivos celulares" y otros términos que denotan microorganismos o líneas celulares eucariotas superiores cultivadas como entidades unicelulares se refieren a células que pueden ser, o han sido, usadas como recipientes para vector recombinante y otro ADN transferido, e incluyen la progenie original de la célula original que ha sido transfectada.
Una "secuencia de codificación" o una secuencia que "codifica" un polipéptido seleccionado, es una molécula de ácido nucleico que es trancrita (en el caso de ADN) y traducida (en el caso de ARNm) en un polipéptido in vivo cuando se coloca bajo el control de secuencias reguladoras apropiadas (o "elementos de control"). Los límites de la secuencia de codificación pueden ser determinados por un codón de inicio en el término 5' (amino) y un codón de parada de traducción en el término 3' (carboxi). Una secuencia de codificación puede incluir, pero no está limitada a, ADNc de ARNm viral, procariota o eucariota, secuencias de ADN genómico procedentes de ADN viral o procariótico, e incluso secuencias de ADN sintéticas. Una secuencia de terminación de transcripción puede estar localizada 3' a la secuencia de codificación.
Los "elementos de control" típicos incluyen, pero no están limitados a, promotores de transcripción, elementos potenciadores de la transcripción, señales de terminación de la transcripción, secuencias de poliadenilación (localizadas 3' al codón de parada de traducción), las secuencias para la optimización del inicio de la traducción (localizadas a 5' a la secuencia de codificación), y las secuencias de terminación de la traducción.
El término "ácido nucleico" incluye ADN y ARN, y también sus análogos, como los que contienen cadenas principales modificadas (por ejemplo fosforotioatos, etc.), y también ácidos nucleicos de péptidos (ANP), etc. La invención incluye ácidos nucleicos que comprenden secuencias complementarias a las descritas anteriormente (por ejemplo, antisentido o para propósitos de sondeo).
"Ligado operativamente" se refiere a una disposición de elementos en donde los componentes así descritos están configurados para realizar su función habitual. Por lo tanto, un promotor dado ligado operativamente a una secuencia de codificación es capaz de efectuar la expresión de la secuencia de codificación cuando están presentes los enzimas apropiados. El promotor no necesita ser contiguo a la secuencia de codificación, con tal de que funcione para dirigir la expresión de la misma. Por lo tanto, por ejemplo, pueden estar presentes secuencias no traducidas intervinientes pero transcritas entre la secuencia promotora y la secuencia de codificación y la secuencia promotora puede ser todavía considerada "ligada operativamente" a la secuencia de codificación.
"Codificado por" se refiere a una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una secuencia de polipéptidos, en la que la secuencia de polipéptidos o una porción de la misma contiene una secuencia de aminoácidos de al menos 3 a 5 aminoácidos, más preferiblemente al menos 8 a 10 aminoácidos, e incluso más preferiblemente al menos 15 a 20 aminoácidos de un polipéptido codificado por la secuencia de ácidos nucleicos.
"Casete de expresión" o "constructo de expresión" se refiere a un ensamblaje que es capaz de dirigir la expresión de la(s) secuencia(s) o gen(es) de interés. Un casete de expresión incluye generalmente elementos de control, como se ha descrito anteriormente, como un promotor que está ligado operativamente a (para dirigir la transcripción de) la(s) secuencia(s) o gen(es) de interés, y a menudo incluye también una secuencia de poliadenilación. En ciertas realizaciones de la invención, el casete de expresión descrito en la presente puede estar contenido dentro de un constructo plásmido. Además de los componentes del casete de expresión, el constructo plásmido puede también incluir, uno o más marcadores seleccionables, una señal que permite al constructo plásmido existir como ADN monocatenario (por ejemplo, un origen M13 de replicación), al menos un sitio de clonación múltiple, y un origen "mamífero" de replicación (por ejemplo, un origen SV40 o de adenovirus de replicación).
"Polinucleótido purificado" se refiere a un polinucleótido de interés o fragmento del mismo que es esencialmente libre, por ejemplo, contiene menos de alrededor del 50%, preferiblemente menos de alrededor del 70%, y más preferiblemente menos de alrededor del 90% de la proteína con la que el polinucleótido está asociada de forma natural. Las técnicas para purificar polinucleótidos de interés son bien conocidas en la técnica e incluyen, por ejemplo, interrupción de la célula que contiene el polinucleótido con un agente caotrópico y separación de los polinucleótidos y proteínas mediante cromatografía de intercambio de iones, cromatografía de afinidad y sedimentación según la densidad.
El término "transfección" se usa para referirse a la absorción de ADN extraño por una célula. Una célula ha sido "transfectada" cuando el ADN exógeno ha sido introducido dentro de la membrana celular. Se conocen generalmente en la técnica un número de técnicas de transfección, Ver, por ejemplo, Graham y otros (1973) Virology, 52:456, Sambrook y otros (1989) Molecular Cloning, a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratories, New York, Davis y otros. (1986) Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier, y Chu y otros (1981) Gene 13:197. Tales técnicas pueden ser usadas para introducir una o más fracciones de ADN exógeno en células huésped adecuadas. El término se refiere a tanto absorción estable como transitoria del material genético, e incluye la absorción de ADNs ligados a péptidos o anticuerpos.
Un "vector" es capaz de transferir secuencias de ácido nucleico a células objetivo (por ejemplo, vectores virales, vectores no virales, portadores particulados y liposomas). Típicamente, "constructo de vector", "vector de expresión" y "vector de transferencia de genes" significa cualquier constructo de ácido nucleico capaz de dirigir la expresión de un ácido nucleico de interés y que puede transferir secuencias de ácidos nucleicos a células objetivo. Por lo tanto, el término incluye vehículos de clonación y expresión, así como vectores virales.
"ADHII" se refiere a alcohol deshidrogenasa II reprimible por glucosa de levadura, particularmente Saccharomyces, y en particular S. cerevisiae. "ADH2" se refiere al gen de levadura que codifica a ADHII, así como sus secuencias reguladoras asociadas. Ver por ejemplo Russell y otros (1983) J. Biol. Chem. 258:2674-2682.
"UAS" es un término reconocido en la técnica para las secuencias de activación secuencia arriba o regiones potenciadoras, que son habitualmente cortas, secuencias de ADN repetitivas colocadas secuencia arriba de una caja TATA del promotor. En esta invención es de particular interés la ADH" UAS, que es una repetición invertida perfecta de 22 bp localizada secuencia arriba de la caja ADH2 TATA. Ver Shuster y otros (1986) Mol. Cell. Biol. 6:1894-1902.
"ADR1" se refiere a un gen regulador positivo de levadura requerido para la expresión de ADH II: Ver por ejemplo Denis y otros. (1983) Mol. Cell. Biol. 3:360-370. La proteína codificada por el gen ADR1 es referida en la presente como "ADR I".
Por "fragmento" se entiende una molécula que consiste de sólo una parte de la secuencia y estructura de longitud completa intacta. Un fragmento de un polipéptido puede incluir una deleción C-terminal, una deleción Nterminal, y/o una deleción interna del polipéptido nativo. Un fragmento de un polipéptido incluirá generalmente al menos alrededor de 5-10 residuos de aminoácidos contiguos de la molécula de longitud completa, preferiblemente al menos alrededor de 15-25 residuos de aminoácidos contiguos de la molécula de longitud completa, u más preferiblemente al menos alrededor de 20-50 o más residuos de aminoácidos contiguos de la molécula de longitud completa, o cualquier entero entre 5 aminoácidos y el número de aminoácidos en la secuencia de longitud completa, siempre que el fragmento en cuestión conserve la capacidad de provocar la respuesta biológica deseada. Un fragmento de un ácido nucleico puede incluir una deleción 5', una deleción 3' y/o una deleción interna de un ácido nucleico. Los fragmentos de ácidos nucleicos incluirán generalmente al menos alrededor de 5-1000 bases de nucleótidos contiguas de la molécula de longitud completa y pueden incluir al menos 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 75, 100, 150, 250 o al menos 500 nucleótidos contiguos de la molécula de longitud completa, o cualquier entero entre 5 nucleótidos y el número de nucleótidos en la secuencia de longitud completa. Tales fragmentos pueden ser útiles en la hibridación, amplificación, producción de fragmentos inmunogénicos, o inmunización del ácido nucleico.
Por "fragmento inmunogénico" se entiende un fragmento de un inmunógeno que incluye uno o más epítopos y por lo tanto puede modular una respuesta inmune o puede actuar como un adyuvante para un antígeno co-administrado. Tales fragmentos pueden ser identificados usando cualquier número de técnicas de mapeo de epítopos, bien conocidas en la técnica. Ver por ejemplo Epitope Mapping Protocols en Methods in Molecular Biology,
Vol. 66 (Glenn E. Morris, Ed., 1996) Humana Press, Totowa, New Jersey. Por ejemplo, los epítopos lineales pueden ser determinados por, por ejemplo, sintetizando concurrentemente grandes números de péptidos en soportes sólidos, los péptidos correspondientes a porciones de la molécula de proteína, y reaccionando los péptidos con anticuerpos mientras los péptidos están todavía unidos a los soportes. Dichas técnicas son conocidas en la técnica y se describen en, por ejemplo, Patente U.S. Nº 4,708,871; Geysen y otros (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:39984002; Geysen y otros (1986) Molec. Immunol. 23:709-715. De manera similar los epítopos conformacionales son identificados fácilmente determinando la conformación espacial de los aminoácidos como por, por ejemplo, cristalografía de rayos X y resonancia magnética nuclear de 2 dimensiones. Ver por ejemplo Epitope Mapping Protocols, supra. Las regiones antigénicas de las proteínas pueden ser también identificadas usando antigenicidad estándar y gráficos de hidropatía, como los calculados usando, por ejemplo el programa de software Omiga versión
1.0 disponible de Oxford Molecular Group. Este programa informático emplea el método Hopp/Woods, Hopp y otros, Proc. Natl. Acad. Sci USA (1981) 78:3824-3828, para determinar los perfiles de antigenicidad, y la técnica Kyte-Doolitle, Kyte y otros, J. Mol. Biol. (1982) 157:105-132 para gráficos de hidropatía.
Los fragmentos inmunogénicos, para propósitos de la presente invención, serán habitualmente al menos de alrededor de 2 aminoácidos de longitud, más preferiblemente de alrededor de 5 aminoácidos de longitud, y más preferiblemente de al menos alrededor de 10 a alrededor de 15 aminoácidos de longitud. No hay un límite superior crítico a la longitud del fragmento, que podría comprender casi la longitud completa de la secuencia de la proteína, o incluso una proteína de fusión que comprenda dos o más epítopos.
Como se usa en la presente, el término "epítopo" se refiere generalmente al sitio en un antígeno que es reconocido por un receptor de células T yo un anticuerpo. Preferiblemente es un péptido corto derivado de o como parte de un antígeno proteico. Sin embargo el término también se pretende que incluya péptidos con glicopéptidos y epítopos de carbohidratos. Varios péptidos diferentes pueden ser llevados por una única molécula antigénica. El término "epítopo" también incluye secuencias modificadas de aminoácidos o carbohidratos que estimulan respuestas que reconocen el organismo completo. Es ventajoso si el epítopo seleccionado es un epítopo de un agente infeccioso, que causa una enfermedad infecciosa.
El epítopo puede ser generado del conocimiento del aminoácido y las secuencias de ADN correspondientes del péptido o polipéptido, así como de la naturaleza de aminoácidos particulares (por ejemplo tamaño, carga, etc.) y el diccionario de codones, sin experimentación indebida. Ver por ejemplo, Ivan Roitt, Essential Immunology, 1988; Kendrew, supra; Janis Kuby, Immunology, 1992 e.g., pp. 79-81. Algunas directrices para determinar si un ó a proteína estimulará una respuesta incluyen: Longitud del péptido-preferiblemente el péptido es de alrededor de 8 ó 9 aminoácidos de largo para ajustar en el complejo de clase I MHC y de alrededor de 13-25 aminoácidos de largo para ajustar en un complejo MCH de clase II. Esta longitud es un mínimo para que el péptido enlace con el complejo MHC. Se prefiere que los péptidos sean más largos que estas longitudes porque las células pueden cortar péptidos. El péptido puede contener un motivo de anclaje apropiado que le permitirá enlazar con las varias moléculas de clase I o clase II con especificidad suficientemente alta para generar una respuesta inmune (ver Bocchia, M. y otros, Specific Binding of Leukemia Oncogene Fusion Protein Pentides to HLA Class I Molecules, Blood 85:2680-2684; Englehard, VH, Structure of peptides associated with class I and class II MHC molecules Ann. Rev. Immunol. 12:181 (1994)). Esto se puede hacer, sin experimentación indebida, comparando la secuencia de la proteína de interés con estructuras publicadas de péptidos asociados con las moléculas HMC. Por lo tanto, el experto en la técnica puede determinar un epítopo de interés comparando la secuencia de la proteína con secuencias enumeradas en la base de datos de proteínas. Para una descripción de varios epítopos de la cápside de Norovirus, ver por ejemplo, Hardy y otros, Publicación de Solicitud de Patente U.S. Nº 2005/0152911.
En particular, Hardy y otros han identificado epítopos de la proteína de la cápside del virus Norwalk en los residuos 133-137 y de la proteína de la cápside del virus de la Montaña Nevada en los residuos 319-327, que comprenden las secuencias siguientes: WTRGSHNL, WTRGGHGL, WTRGQHQL, o WLPAPIDKL. Los polipéptidos inmunogénicos que comprende tales epítopos y ácidos nucleicos de la cápside que los codifican pueden ser usados en la práctica de la invención.
Como se usa en la presente, el término "epítopo de células T" se refiere generalmente a aquellas características de una estructura péptida que son capaces de inducir una respuesta de células T y un "epítopo de células B" se refiere generalmente a aquellas características de una estructura péptida que son capaces de inducir una respuesta de células B.
Una "respuesta inmunológica" a un antígeno o composición es el desarrollo en un sujeto de una respuesta inmune humoral y/o celular a un antígeno presente en la composición de interés. Para propósitos de la presente invención, una "respuesta inmune humoral" se refiere a una respuesta inmune mediada por moléculas de anticuerpos, mientras que una "respuesta inmune celular" es una mediada por linfocitos T y/o otras células blancas de la sangre. Un aspecto importante de la inmunidad celular implica una respuesta específica del antígeno por células T citolíticas ("CLT"s). Las CTLs tienen especificidad para antígenos de péptidos que son presentados en asociación con proteínas codificadas por el complejo de histocompatibilidad principal (MHC) y expresadas en las superficies de las células. Las CLTs ayudan a inducir y promover la destrucción de microbios intracelulares, o la lisis de células infectadas con tales microbios. Otro aspecto de la inmunidad celular implica una respuesta específica del
antígeno por las células T auxiliares. Las células T auxiliares actúan para ayudar a estimular la función, y enfocar la actividad de, células efectoras no específicas contra células que muestran los antígenos de péptidos en asociación con moléculas MHC en su superficie. Una "respuesta inmune celular" también se refiere a la producción de citocinas, quimioquinas y otras de dichas moléculas producidas por células T activadas y/o otras células blancas de la sangre, incluyendo las derivadas de células T CD4+ y CD8+.
Una composición o vacuna que provoca una respuesta inmune celular puede servir para sensibilizar a un sujeto vertebrado por la presentación del antígeno en asociación con moléculas HMC en la superficie celular. La respuesta inmune mediada por células está dirigida a, o cerca de, células que presentan antígeno en su superficie. Además, los linfocitos T específicos de antígenos pueden ser generados para permitir la protección futura de un huésped inmunizado.
La capacidad de un antígeno particular de estimular una respuesta inmunológica mediada por células puede ser determinada por un número de ensayos, como por ensayos de linfoproliferación (activación de linfocitos), ensayos celulares citotóxicos de CTL o por ensayo de linfocitos T específicos para el antígeno en un sujeto sensibilizado. Tales ensayos son bien conocidos en la técnica. Ver por ejemplo Erickson y otros, J. Immunol. (1993) 151:4189-4199; Doe y otros, Eur. J. Immunol. (1994) 24:2369-2376. Los métodos recientes para medir la respuesta inmune mediada por células incluyen la medición de citocinas intracelulares o la secreción de citocinas por poblaciones de células T, o por la medición de células T específicas de epítopos (por ejemplo, por la técnica tetrámero) (revisada por McMichael, A.J., y O’Callaghan, C.A., J. Exp. Med. 187(9)1367-1371, 1998; Mcheyzer-Williams, M.G., y otros Immunol. Rev. 150:5-21, 1996; Lalvani, A., y otros, J. Exp. Med. 186:859-865, 1997).
Por lo tanto, una respuesta inmunológica como se usa en la presente puede ser una que estimula la producción de anticuerpos (por ejemplo, anticuerpos neutralizantes que bloquean toxinas bacterianas y patógenos como virus que entran en las células y se replican enlazando con toxinas y patógenos, típicamente protegiendo las células de la infección y la destrucción). El antígeno de interés puede también provocar la producción de CTLs. Por lo tanto, una respuesta inmunológica puede incluir uno o más de los efectos siguientes: la producción de anticuerpos por células B; y/o la activación de células T supresoras y/o células T de memoria/efectoras dirigidas específicamente a un antígeno o antígenos presentes en la composición de la vacuna de interés. Estas respuestas pueden servir para neutralizar la infectividad, y/o mediar el complemento de anticuerpos, o la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) para proporcionar protección a un huésped inmunizado. Tales respuestas pueden ser determinadas usando inmunoensayos estándar y ensayos de neutralización, bien conocidos en la técnica. (ver por ejemplo, Montefiori y otros (1988) J. Clin Microbiol. 26:231-235; Dreyer y otros, (1999) AIDS Res Hum Retroviruses (1999) 15(17):1563-1571). El sistema inmune innato de los mamíferos también reconoce y responde a características moleculares de organismos patogénicos por la activación de receptores tipo Toll y moléculas receptoras similares en células inmunes. En el momento de la activación del sistema inmune, varias células re respuesta inmune no adaptativas se activan para, por ejemplo, producir varias citocinas, linfoquinas y quimioquinas. Las células activadas por una respuesta inmune innata incluyen células Dendríticas maduras e inmaduras del linaje de monocitos y plasmacitoide (MDC, PDC), así como Células T gamma, delta, alfa y beta y células B y similares. Así, la presente invención también contempla una respuesta inmune en donde la respuesta inmune implica tanto respuesta innata como adaptativa.
Una "composición inmunogénica" es una composición que comprende una molécula antigénica donde la administración de la composición a un sujeto resulta en un desarrollo en el sujeto de respuesta inmune humoral y/o celular a la molécula antigénica de interés.
Los términos proteína o polipéptido "inmunogénico" se refieren a una secuencia de aminoácidos que provoca una respuesta inmunológica como se ha descrito anteriormente. Una proteína o polipéptido "inmunogénico" como se usa en la presente incluye la secuencia de longitud completa de la proteína en cuestión, incluyendo las formas precursora y madura, análogos de las mismas, o fragmentos inmunogénicos de las mismas.
El término "derivado de" es usado en la presente para identificar la fuente original de una molécula pero no significa que limite el método por el que la molécula se hace que puede ser, por ejemplo, por síntesis química o medios recombinantes.
Generalmente, un polipéptido viral está "derivado de" un polipéptido particular de un virus (polipéptido viral) si está (i) codificado por un marco de lectura abierto de un polinucleótido de ese virus (polinucleótido viral), o (ii) muestra una identidad de secuencia con polipéptidos de ese virus como se ha descrito anteriormente.
Un polinucleótido "derivado de" una secuencia designada se refiere a una secuencia de polinucleótido que comprende una secuencia contigua de aproximadamente al menos alrededor de 6 nucleótidos, preferiblemente al menos alrededor de 8 nucleótidos, más preferiblemente al menos alrededor de 10-12 nucleótidos, e incluso más preferiblemente al menos alrededor de 15-20 nucleótidos correspondientes, es decir, idénticos o complementarios a, una región de la secuencia de nucleótidos designada. El polinucleótido derivado no estará necesariamente derivado de la secuencia de nucleótidos de interés, pero puede ser generado de cualquier manera, incluyendo, pero no limitado a, síntesis química, replicación, transcripción inversa o transcripción, que esté basada en la información
proporcionada por la secuencia de bases en la(s) región(es) de las que el polinucleótido está derivado. Como tal, puede representar una orientación en el sentido u antisentido del polinucleótido original.
Un polinucleótido, oligonucleótido, ácido nucleico, proteína, polipéptido, o péptido de Norovirus o Sapovirus, como se ha definido anteriormente, es una molécula derivada de un Norovirus o Sapovirus, respectivamente, incluyendo, sin limitación, cualquiera de los varios asilados de Norovirus o Sapovirus. La molécula no necesita estar derivada físicamente del aislado particular en cuestión, si no que puede ser producida de forma sintética o recombinante.
Se conocen las secuencias de ácidos nucleicos y proteínas par aun número de aislados de Norovirus. Las secuencias de Norovirus representativas se presentan en las Figuras 1A-1C, 2A-2D, 14A-14B, y 15A-15B, y las SEQ ID NOS:1-9 y las SEQ ID NOS:13-17. Secuencias representativas adicionales, incluyendo las secuencias de ORF1, ORF2, ORF· y sus polipéptidos codificados de aislados de Norovirus están enumeradas en la base de datos del National Center for Biotechnology Information (NCBI). Secuencias adicionales de Norovirus se describen en las siguientes solicitudes de patente: WO 05/030806, WO 00/79280, JP2002020399, US2003129588, US6572862, WO 94/05700 y WO 05/032457. Ver también Green y otros, (2000) J. Infect. Dis. 181(Suppl. 2):S322-330; Wang y otros (1994) J. Virol. 68:5982-5990; Chen y otros (2004) J. Virol. 78: 6469-6479; Chakravarty y otros (2005) J. Virol. 79: 554-568; and Fankhauser y otros (1998) J. Infect. Dis. 178:1571-1578; para comparaciones de secuencias y una discusión de la diversidad genética y análisis filogenético de los Norovirus.
También se conocen las secuencias de ácidos nucleicos y proteínas par aun número de aislados de Sapovirus. Las secuencias de Sapovirus representativas se presentan en las SEQ ID NOS: 10-13. Secuencias representativas adicionales, incluyendo las secuencias de ORF! y ORF2, y sus polipéptidos codificados de aislados de SApovirus se enumeran en la base de datos del National Center for Biotechnology Information (NCBI).
Ver también Schuffenecker y otros (2001) Arch Virol.;146(11):2115-2132; Zintz y otros (2005) Infect. Genet. Evol. 5:281-290; Farkas y otros (2004) Arch. Virol. 149:1309-1323; para comparaciones de secuencias y una discusión de la diversidad genética y análisis filogenético de los Sapovirus.
Como se usan en la presente, los términos "proteína de la cápside principal" o "polipéptido de la cápside principal" o "VP1" en referencia a un Norovirus se refieren a un polipéptido que comprende una secuencia homóloga
o idéntica al polipéptido codificado ORF2 de un Norovirus, e incluye las secuencias que muestran al menos alrededor de un 80-100% de identidad de secuencia con él, incluyendo cualquier porcentaje de identidad dentro de estos intervalos, como 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100% de identidad de secuencia con él.
Como se usa en la presente, los términos "proteína estructural menor" o "polipéptido estructural menor" o "VP2" o "proteína básica pequeña" en referencia a un Norovirus se refieren a un polipéptido que comprende una secuencia homóloga o idéntica al polipéptido codificado ORF3 de un Norovirus, e incluyen las secuencias que muestran al menos alrededor de un 80-100% de identidad de secuencia con él, incluyendo cualquier porcentaje de identidad dentro de estos intervalos, como 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100% de identidad de secuencia con él.
Como se usan en la presente, los términos "proteína de la cápside" o "polipéptido de la cápside" o "VP1" en referencia a un Sapovirus se refieren a un polipéptido que comprende una secuencia homóloga o idéntica al polipéptido de la cápside de un Sapovirus, e incluyen las secuencias que muestran al menos alrededor de un 80100% de identidad de secuencia con él, incluyendo cualquier porcentaje de identidad dentro de estos intervalos, como 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100% de identidad de secuencia con él. El polipéptido de la cápside puede estar codificado por ORF! o ORF2 en cepas diferentes de Sapovirus. En algunas cepas, el Sapovirus tiene dos marcos de lectura abiertos: la proteína de la cápside está codificada por ORF1 como parte de una poliproteína y una proteína estructural menor (VP10) está codificada por ORF3". En otras cepas, el Sapovirus tiene tres marcos de lectura abiertos: un codón de parada precede a la región codificante para la proteína de la cápside, que está codificada por ORF", y una proteína estructural menor (VP10) está codificada por ORF3.
Como se usan en la presente, los términos "proteína estructural menor" o "polipéptido estructural menor" o "VP10" en referencia a Sapovirus se refieren a un polipéptido que comprende una secuencia homóloga o idéntica al polipéptido codificado por el marco de lectura abierto que sigue a la región codificante para la proteína de la cápside en el genoma del Sapovirus (ya sea ORF2 o ORF3 dependiendo de la cepa), e incluyen secuencias que muestran al menos alrededor de un 80-100% de identidad de secuencia con él, incluyendo cualquier porcentaje de identidad dentro de estos intervalos, como 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100% de identidad de secuencia con él.
Como se usa en la presente, el término "poliproteína de Norovirus" se refiere a una poliproteína que comprende una secuencia homóloga o idéntica a la poliproteína codificada por ORF1 de un Norovirus, e incluye secuencias que muestran al menos alrededor de un 80-100% de identidad de secuencia con él, incluyendo cualquier
porcentaje de identidad dentro de estos intervalos, como 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100% de identidad de secuencia con él.
Como se usa en la presente "poliproteína de Sapovirus" se refiere a una poliproteína que comprende una secuencia homóloga o idéntica a la poliproteína codificada por ORF! de un Sapovirus, e incluye secuencias que muestran al menos alrededor de un 80-100% de identidad de secuencia con él, incluyendo cualquier porcentaje de identidad dentro de estos intervalos, como 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100% de identidad de secuencia con él.
Como se usa en la presente, el término "partícula similar a virus" o "VLP" se refiere a una cáscara viral, no replicante, derivada de cualquiera de los varios virus tratados a continuación. Una partícula similar a virus de acuerdo con la invención es no replicante y no infecciosa ya que carece de todo o parte del genoma viral, en particular los componentes replicantes e infecciosos del genoma viral. Las VLPS están generalmente compuestas de una o más proteínas virales, como, pero no limitado a las proteínas referidas como proteínas de la cápside, recubrimiento, cáscara, superficie, estructurales (por ejemplo, VP1, VP2) o polipéptidos que forman partículas derivados de estas proteínas, incluyendo las proteínas descritas en la presente. Las VLPS pueden formarse espontáneamente en el momento de la expresión recombinante de proteínas de la cápside en un sistema de expresión apropiado. Los métodos para producir VLPS particulares son conocidos en la técnica y tratados más completamente más adelante. La presencia de VLPS después de la expresión recombinante de proteínas virales puede ser detectada usando técnicas convencionales conocidas en la técnica, como microscopía electrónica, caracterización biofísica y similares. Por ejemplo, las VLPS pueden ser aisladas por centrifugación en gradiente de densidad y/o identificadas por bandas de densidad característica. Alternativamente, se puede realizar microscopía crioelectrónica en muestras acuosas vitrificadas de la preparación de VLP en cuestión, y en imágenes grabadas bajo las condiciones de exposición apropiadas.
Como se usa en la presente, el término "VLP mosaico" se refiere a una VLP que comprende proteínas de la cápside de más de un tipo de virus. Se incluyen las VLPs que resultan de la asociación intra-y/o inter-capsomérica de las proteínas.
Por "polipéptido formador de partículas" derivado de una proteína viral particular se entiende una proteína viral de longitud completa o casi de longitud completa, así como un fragmento de la misma, o una proteína viral con deleciones internas, que tiene la capacidad de formar VLPS bajo condiciones que favorecen la formación de VLP, así como análogos y formas precursoras de la molécula de referencia. El término por lo tanto pretende deleciones, adiciones y sustituciones de la secuencia, siempre que el polipéptido conserve la capacidad de formar una VLP. Así, el término incluye variaciones naturales del polipéptido especificado ya que a menudo tienen lugar variaciones en las proteínas de la cubierta entre aislados virales. El término también incluye deleciones, adiciones y sustituciones que no tienen lugar de forma natural en la proteína de referencia, siempre que la proteína conserve la capacidad de formar una VLP. Las sustituciones preferidas son aquellas que son conservadoras en naturaleza, es decir, aquellas sustituciones que tienen lugar dentro de una familia de aminoácidos que están relacionados en sus cadenas laterales. Específicamente, los aminoácidos son divididos generalmente en cuatro familias; (1) ácidos-aspartato y glutamato; (2) básicos--lisina, arginina, histidina; (3) no polares-alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano; y (4) polares sin carga-glicina, asparagina, glutamina, cistina, serina, treonina, tirosina. La fenilalanina, el triptófano y la tirosina son clasificados algunas veces como aminoácidos aromáticos.
Un "antígeno" se refiere a una molécula que contiene uno o más epítopos (ya sean lineales conformacionales o ambos) que estimularán un sistema inmune del huésped para hacer una respuesta específica del antígeno humoral y/o celular. El término se usa intercambiablemente con el término "inmunógeno". Normalmente un epítopo de células B incluirá al menos alrededor de 5 aminoácidos pero puede ser tan pequeña como de 3-4 aminoácidos. Un epítopo de células T como un epítopo de CTL, incluirá al menos 7-9 aminoácidos, y un epítopo de células T auxiliares al menos alrededor de 12-20 aminoácidos. Normalmente, un epítopo incluirá entre alrededor de 7 y 15 aminoácidos, como 9, 10, 12 ó 15 aminoácidos. El término "antígeno" denota tanto antígenos de subunidades (es decir, antígenos que están separados y discretos de un organismo completo con el que el antígeno está asociado en la naturaleza), así como bacterias destruidas, atenuadas o inactivadas, virus, hongos, parásitos u otros microbios. Los anticuerpos como anticuerpos anti-idiotipo, o fragmentos de los mismos, y mimotipos de péptidos sintéticos, que pueden imitar un antígeno o determinante antigénico, también se capturan en la definición de antígeno como se usa en la presente. De forma similar, un oligonucleótido o polinucleótido que expresa un antígeno
o determinante antigénico in vivo, como en terapia génica y aplicaciones de inmunización de ADN, también está incluido en la definición de antígeno en la presente.
El término "anticuerpo" engloba preparaciones de anticuerpos policlonales y monoclonales, así como preparaciones que incluyen anticuerpos híbridos, anticuerpos alterados, anticuerpos quiméricos y anticuerpos humanizados, así como: moléculas de anticuerpos híbridas (quiméricas) (ver por ejemplo, Winter y otros (1991) Nature 349:293-299; y la Patente U.S. Nº. 4,816,567); fragmentos de F(ab')2 y F(ab); moléculas Fv (heterodímeros no covalentes, ver por ejemplo, Inbar y otros (1972) Proc Natl Acad Sci USA 69:2659-2662; y Ehrlich y otros (1980) Biochem 19:4091-4096); moléculas Fv de cadena sencilla (sFv) (ver por ejemplo, Huston y otros (1988) Proc Natl Acad Sci USA 85:5879-5883); constructos de fragmentos de anticuerpos diméricos y triméricos; minicuepos (ver por
ejemplo, Pack y otros (1992) Biochem 31:1579-1584; Cumber y otros (1992) J Immunology 149B:120-126); moléculas de anticuerpos humanizadas (ver por ejemplo, Riechmann y otros (1988) Nature 332:323-327; Verhoeyan y otros (1988) Science 239:1534-1536; y la Publicación de Patente UK Nº GB 2.276.169 publicada el 21 de Septiembre de 1994); y cualquier fragmento funcional obtenido de tales moléculas, en donde tales fragmentos conservan las propiedades de enlace específicas de la molécula de anticuerpo madre.
Los términos "hibridar" e "hibridación" se refieren a la formación de complejos entre secuencias de nucleótidos que son lo suficientemente complementarias para formar complejos por el apareamiento de bases Watson-Crick. Cuando un cebador "hibrida" con el objetivo (plantilla), dichos complejos (o híbridos) son los suficientemente estables para servir a la función de cebado requerida por, por ejemplo, la polimerasa de ADN para iniciar la síntesis de ADN.
Los términos "variante" y "análogo" se refieren a derivados biológicamente activos de la molécula de referencia que conserva la actividad deseada, como actividad antigénica el inducir una respuesta inmune contra Norovirus y Sapovirus. En general, los términos "variante" y "análogo" se refieren a compuestos que tienen una secuencia y estructura de polipéptidos nativa con una o más adiciones, sustituciones (generalmente conservadoras en naturaleza) y /o deleciones de aminoácidos, en relación a la molécula nativa, siempre que las modificaciones no destruyan la actividad biológica y que sean "sustancialmente homólogas" con la molécula de referencia como se define a continuación. En general, las secuencias de aminoácidos de tales análogos tendrán un alto grado de homología de secuencia con la secuencia de referencia, por ejemplo homología de secuencia de aminoácidos de más del 50%, generalmente más del 60%-70%, incluso más particularmente 80%-85% o más, como al menos 90%95% o más, cuando las dos secuencias son alineadas. A menudo, los análogos incluirán el mismo número de aminoácidos pero incluirán sustituciones, como se explica en la presente.
Como se ha explicado anteriormente, los análogos generalmente incluyen sustituciones que son conservadoras en naturaleza, es decir, aquellas sustituciones que tienen lugar dentro de una familia de aminoácidos que están relacionados en sus cadenas laterales. Específicamente, los aminoácidos se dividen generalmente en cuatro familias: (1) ácidos-aspartato y glutamato; (2) básicos--lisina, arginina, histidina; (3) no polares-alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano; y (4) polares sin carga-glicina, asparagina, glutamina, cistina, serina, treonina, tirosina. La fenilalanina, el triptófano y la tirosina son clasificados algunas veces como aminoácidos aromáticos. Por ejemplo, es razonablemente predecible que un reemplazo aislado de leucina con isoleucina o valina, un aspartato con un glutamato, una treonina con una serina, o un reemplazo conservador similar de un aminoácido con un aminoácido estructuralmente relacionado, no tendrá un efecto mayor en la actividad biológica. Por ejemplo, el polipéptido de interés puede incluir hasta alrededor de 5-10 sustituciones de aminoácidos conservadoras o no conservadoras, o incluso hasta alrededor de 15-25 sustituciones de aminoácidos conservadoras
o no conservadoras, o cualquier entero entre 5-25, siempre que la función deseada de la molécula permanezca intacta. Alguien experto en la técnica puede determinar fácilmente regiones de la molécula de interés que pueden tolerar el cambio por referencia a gráficos Hopp/Woods y Kyte-Doolitle, bien conocidos en la técnica.
El término "antígeno de fusión de múltiples epítopos" o "proteína de fusión de múltiples epítopos" como se usa en la presente significa un polipéptido en el que múltiples antígenos de Norovirus y opcionalmente Sapovirus son parte de una cadena continua, simple de aminoácidos, dicha cadena no se da en la naturaleza. Los antígenos de Norovirus y Sapovirus opcionales pueden estar conectados directamente entre sí por enlaces peptídicos o pueden estar separadas interviniendo secuencias de aminoácidos. Los antígenos de fusión pueden contener polipéptidos codificados por ORF1, codificados por ORF2 y/o codificados por ORF3 o fragmentos de los mismos, incluyendo, por ejemplo, VP1, VP2 y; y/o secuencias de polipéptidos de Sapovirus, como proteína N-terminal, p11, p28, NTPasa, p32, VPg, proteasa, polimerasa, VP1, y VP10. Los antígenos de fusión pueden también contener secuencias exógenas al Norovirus o Sapovirus. Además, las secuencias presentes pueden ser de múltiples genotipos y/o asilados de Norovirus y Sapovirus.
Como se usa en la presente "desintoxicado" se refiere a tanto mutantes completamente no tóxicos como con bajo residuo tóxico de la toxina en cuestión. Los antígenos de proteínas tóxicos pueden ser desintoxicados cuando sea necesario, por ejemplo, la desintoxicación de la toxina de la tosferina por medios químicos y/o genéticos se conoce en la técnica. Preferiblemente, la proteína desintoxicada conserva una toxicidad de menos del 0,01% de la contrapartida de la toxina de origen natural, más preferiblemente menos del 0,001% e incluso más preferiblemente, menos del 0,0001% de toxicidad de la contrapartida de la toxina de origen natural. La toxicidad puede ser medida en células CHO de ratón o preferiblemente por la evaluación de los cambios morfológicos inducidos en células Y1. En particular, las células Y1 son células epiteliales de tumores adrenales que se vuelven marcadamente más redondas cuando se tratan con una solución que contiene CT o LT (Ysamure y otros, Cancer RES. (1966) 26:529-535). La toxicidad de CT y LT está correlacionada con la transición morfológica. Así, las toxinas mutantes pueden ser incubadas con células Y1 y los cambios morfológicos de las células evaluadas.
II. MODOS DE LLEVAR A CABO LA INVENCION
Antes de describir al presente invención con detalle, se debe entender que está invención no está limitada a moléculas particularmente ejemplificadas o parámetros del proceso ya que pueden , por supuesto, variar. También
se debe entender que la terminología usada en la presente es con el propósito de describir realizaciones particulares de la invención solamente, y no se pretende que sea limitativa. Además, la práctica de la presente invención emplearán a menos que se indique lo contrario, métodos convencionales de virología, microbiología, biología molecular, técnicas de ADN recombinantes e inmunología todas de las cuales están dentro de la habilidad corriente en la técnica. Tales técnicas se explican completamente en la bibliografía. Ver por ejemplo, Sambrook, y otros, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd Edition, 1989); DNA Cloning: A Practical Approach, vol. I & II (D. Glover, ed.); Oligonucleotide Synthesis (N. Gait, ed., 1984); A Practical Guide to Molecular Cloning (1984); y Fundamental Virology, 2nd Edition, vol. I & II (B.N. Fields and D.M. Knipe, eds.). Aunque se pueden usar un número de métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en la presente en la práctica de la presente invención, los materiales y métodos preferidos se describen en la presente.
La presente invención incluye métodos para producir VLPs. La descripción proporciona composiciones inmunogénicas que comprenden VLPs derivadas de una o más cepas de Norovirus. Tales VLPs son útiles como vehículos para la presentación de antígenos y la estimulación de una respuesta inmune en un sujeto al que se le han administrado VLPs o ácidos nucleicos que codifican tales VLPS. Las composiciones inmunogénicas pueden comprender uno o más adyuvantes o ácidos nucleicos que codifican adyuvantes, cuando las VLPS están mezcladas
o co-expresadas con adyuvantes. Las composiciones inmunogénicas pueden también comprender antígenos adicionales que nos sean antígenos de Norovirus, como antígenos que pueden ser usados en la inmunización contra patógenos que causan enfermedades de diarrea.
Con el fin de comprender más completamente la invención, se proporciona a continuación una discusión referente a la producción de ácidos nucleicos, polipéptidos, y VLPs para su uso en composiciones inmunogénicas y métodos de uso de tales composición en el tratamiento o prevención de infecciones por Norovirus o Sapovirus.
A. Polipéptidos
Polipéptidos Estructurales, Polipéptidos No Estructurales, y Poliproteínas
Las composiciones inmunogénicas descritas en la presente pueden comprender uno o más polipéptidos producidos de acuerdo con la invención.
Los genomas de cepas de Norovirus contienen tres marcos de lectura abiertos: ORF1, que comprende aproximadamente de 5000 a 5500 nucleótidos, es transcrito en una poliproteína de 200 kDa. ORF2, que comprende aproximadamente de 1550 a 1650 nucleótidos, es transcrito en la proteína de la cápside principal de 60 kDa VP1. ORF3, que comprende aproximadamente de 1550 a 1650 nucleótidos, es transcrita en la proteína estructural menor VP2.
La poliproteína de Norovirus experimenta escisión por una proteasa tipo 3C para producir al menos seis productos distintos, una proteína N-terminal (Nterm), una nucleósido trifosfatasa tipo 2C (NTPasa), p 20 o p22 (dependiendo del genogrupo), proteínas de virus ligadas al genoma (VPg), una cisteína proteasa tipo 3C (Pro) y una polimerasa de ARN dependiente del ARN (Pol). Ver Belliot y otros (2003) J. Virol. 77:10957-10974. La poliproteína es inicialmente escindida en los tres fragmentos, Nterm, NTPasa y un complejo p20VPgProPol, por la proteasa tipo 3C. Procesamiento proteolítico adicional produce fragmentos de ProPol, P20VPgPro, Pol, P20VPg, VPgPro, p20 y Pro. La finalización de la maduración de la poliproteína, catalizada por la cisteína proteasa tipo 3C, produce todos los polipéptidos separados. La poliproteína de 200 kDa comprende estos polipéptidos en el orden de H2-Nterm-NTPasa-p20/p22-VPg-Pro-Pol-COOH. Los límites del dominio aproximados dentro de al poliproteína del Norovirus y las posiciones de nucleótidos correspondientes de la secuencia de codificación de ORF! se presentan en la Tabla 1.
Tabla 1: Poliproteína de Norovirus
Dominio
Posiciones de los Aminoácidos de los límites del Dominio de la Poliproteína* Posiciones de Nucleótidos de la Secuencia de codificación de ORF1
Nterm
1-330 5-994
NTPasa
331-696 995-2092
P20
697-875 2093-2629
VPg
876-1008 2630-3028
Proteasa
1009-1189 3029-3271
polimerasa
1190-1699 3272-5101
* Numerado en relación a la cepa de Norovirus MD145-12 (SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, Acceso GenBank Nº AAK50354). Ver Belliot y otros 2003) J. Virol. 77:10957-10974.
Los genomas de las cepas de Sapovirus contienen o dos o tres marcos de lectura abiertos. En las cepas de Sapovirus que tienen dos marcos de lectura abiertos, el ORF1 codifica una poliproteína que comprende tanto la proteína estructural como la no estructural. La proteína VP1 de la cápside está codificada por ORF1 como un componente de la poliproteína de Sapovirus, y la proteína VP10 estructural menor está codificada por ORF2. En cepas de Sapovirus que tienen tres marcos de lectura abiertos, un codón deparada precede a la región codificante para la proteína de la cápside. Una poliproteína que no incluye la proteína de la cápside está codificada por ORF1, la proteína VP1 de la cápside está codificada por ORF2, y la proteína VP10 estructural menor está codificada por ORF3.
La escisión de la poliproteína de la cepa Mc10 de Sapovirus (SEQ ID NO:19, Acceso Genbank Nº AY237420) por una proteasa tipo 3C produce al menos diez productos distintos, p11, p28, p35 (NTPasa), p32, p14 (VPg), p70 (Pro-Pol), p60(VP1). Ver Oka y otros (2005) J. Virol. 79:7283-7290. El procesamiento proteolítico inicial produce fragmentos de p66 (p28-p35), p46 (p32-p14), y p120 (p32-p14-p70). La poliproteína comprende los polipéptidos en el orden de NH2-p11-p28-NTPase-p32-VPg-p70(Pro-Pol)-VP1-COOH. La región p70 (Pro-Pol) de la poliproteína reside en los residuos 1056-1720, y la región VP1 de la poliproteína reside en los residuos 1721-2278 (numerados en relación a la cepa Mc10 de Sapovirus (SEQ ID NO:19, Acceso GenBank Nº AY237420; ver Oka y otros (2005) J. Virol. 79:7283-7290 y Oka y otros (2005) Arch. Virol.,1 de Agosto publicación electrónica).
Se han determinados las secuencias de ácidos nucleicos y aminoácidos de un número de cepas y aislados de Norovirus, incluyendo las secuencias de ácidos nucleicos y aminoácidos de las proteínas estructurales Vp1 y VP2 y las varias regiones de Poliproteínas de Norovirus, incluyendo los genes y polipéptidos de Nterm, NTPasa, p20/p22, VPg, Pro, y Pol. Por ejemplo, el virus Norwalk se describe en Jiang y otros(1993) Virology 195:51-61 y Hardy y Estes (1996) Virus Genes 12:287-290. El virus de la Montaña Nevada se describe en Lochridge y Hardy (2003) Virus Genes 26:71-82; King y Green (1997) Virus Genes 15:5-7 ; Wang y otros(1994) J. Virol. 68, 5982-5990. El Virus de Hawái se describe en Lew y otros(1994) J. Infect. Dis. 170:535-542.
Las secuencias de aminoácidos y ácidos nucleicos de un número de cepas y aislados de Sapovirus, incluyendo secuencias de ácidos nucleicos y aminoácidos de proteínas estructurales VP1 y VP10 y las varias regiones de poliproteínas de Sapovirus, incluyendo los genes y polipéptidos p11, p28, NTPasa, p32, VPg, p70(Pro-Pol), VP1 también se han determinado. Por ejemplo el virus de Sapporo se describe en Numata y otros (1997) Arch. Virol. 142:1537-1552. El virus London/29845, el virus Houston/86, y el virus Houston/90 se describen en Jiang y otros(1997) Arch. Virol. 142:1813-1827. El virus de Parkville se describe en Noel y otros (1997) J. Med. Virol. 52:173
178.
Las VLPs producidas por la presente invención pueden ser preparadas como una proteína de fusión GST y/o una proteína de fusión His-etiquetada.
Proteínas de Fusión Multiepítopo
Las VLPs producidas por la invención pueden ser expresadas como proteínas de fusión de múltiples epítopos. Ver por ejemplo Publicación Internacional Nº WO97/44469, Patente U.S. Nº 6.632.601, Patente U.S. Nº 6.630.298, Patente U.S. Nº 6.514.731 y Patente U.S. Nº 6.797.809. Dichas proteínas de fusión incluyen múltiples epítopos derivados de dos o más polipéptidos virales de uno o más genotipos y/o aislados de Norovirus y Sapovirus. Las proteínas de fusión de múltiples epítopos ofrecen dos ventajas principales: primero, un polipéptido que puede ser inestable o pobremente expresado por si mismo puede ser asistido añadiendo un compañero híbrido adecuado que supera el problema; segundo, la fabricación comercial es simplificada ya que sólo se necesita emplear una expresión y una purificación para producir dos polipéptidos que son ambos antigénicamente útiles.
B. Ácidos Nucleicos
Los ácidos nucleicos para su uso en la invención comprenden un polinucleótido seleccionado del grupo consistente de: i) un polinucleótido que comprende la secuencia de la SEQ ID NO:1; ii) un polinucleótido que comprende la secuencia de la SEQ ID NO:2; y iii) un polinucleótido que muestra al menos un 80-100% de identidad de secuencia con las secuencias de las SEQ ID NO:1 o SEQ ID NO:2. Las secuencias representativas de aislados de Norovirus y Sapovirus se enumeran en la presente.
Las secuencias representativas de Norovirus se conocen y se presentan en las Figuras 1A-1C, 2A-2D, 14A14B y 15A-15B, y las SEQ ID NOS:1-9 y SEQ ID NOS:13-17. Secuencias de Norovirus representativas adicionales son el Virus Norwalk, acceso GenBank Nº M87661, virus de la Montaña Nevada, Acceso GenBank Nº U70059, virus de la Montaña Nevada Acceso GenBank Nº AY134748, virus de Hawái ; Acceso GenBank Nº U07611 y secuencias descritas en las siguientes publicaciones de patente: WO 05/030806, WO 00/79280, JP2002020399, US2003129588, US6572862, WO 94/05700, y WO 05/032457. Ver también Green y otros (2000) J. Infect. Dis. 181(Suppl. 2):5322-330; Wang y otros (1994) J. Virol. 68:5982-5990; Chen y otros (2004) J. Virol. 78: 6469-6479; Chakravarty y otros (2005) J. Virol. 79: 554-568; y Fankhauser y otros (1998) J. Infect. Dis. 178:1571-1578; para comparaciones de secuencias de diferentes cepas de Norovirus.
Las secuencias representativas de Sapovirus también son conocidas y se presentan en las SEQ ID NOS: 10-12, 18 y 19. Secuencias de Sapovirus representativas adicionales son el virus de Sapporo-London/29845, Acceso GenBank Nº U95645, virus de Parkville, Acceso GenBank Nº AF294739; y virus de Sapporo-Houston/86, Acceso Genbank Nº U95643. Ver también Schuffenecker y otros (2001) Arch Virol.;146(11):2115-2132; Zintz y otros (2005) Infect. Genet. Evol. 5:281-290; Farkas y otros (2004) Arch. Virol. 149:1309-1323; ; para comparaciones de secuencias de diferentes cepas de Sapovirus.
Así, los polinucleótidos usados en la invención incluyen variantes de las secuencias anteriores que muestran al menos alrededor del 80-100% de identidad de secuencia con las mismas, incluyendo cualquier porcentaje de identidad dentro de estos intervalos como 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100% de identidad de secuencia con las mismas. Polinucleótidos que codifican fragmentos inmunogénicos de un Norovirus y opcionalmente polipéptido de Sapovirus derivados de cualquiera de las secuencias anteriores o una variante de las mismas. Los polinucleótidos pueden también comprender secuencias de codificación para polipéptidos de origen natural o pueden ser secuencias artificiales que no son de origen natural.
Los polinucleótidos pueden contener menos de un genoma completo de Norovirus y opcionalmente Sapovirus, o alternativamente pueden incluir la secuencia de un ARN genómico viral completo. Por ejemplo, los polinucleótidos pueden comprender una o más secuencias de las regiones ORF1, ORF2 y ORF3 de un Norovirus y opcionalmente genoma de Sapovirus. Los polinucleótidos pueden también comprender el ARN genómico viral completo o menos del ARN genómico viral completo de múltiples genotipos y/o aislados de Norovirus y opcionalmente Sapovirus.
En ciertas realizaciones, los polinucleótidos comprenden una secuencia ORF! que codifica para la poliproteína de longitud completa de un Norovirus y opcionalmente un Sapovirus. En otras realizaciones, los polinucleótidos comprenden una o más porciones de la secuencia ORF1 de un Norovirus o Sapovirus, por ejemplo, los polinucleótidos pueden comprender secuencias que codifican uno o más polipéptidos codificados por ORF1 de Norovirus, como la proteína N-terminal, NTPasa, p20, VPg, proteasa, polimerasa, VP1 y VP2, o uno o más polipéptidos de Sapovirus, como la proteína N-terminal, p11, p28, NTPasa, p32, VPg, proteasa, polimerasa y VP1; o fragmentos de las mismas.
Por ejemplo, un polinucleótido puede comprender una secuencia de nucleótidos de ORF1 seleccionada del grupo consistente de: a) una secuencia que comprende nucleótidos contiguos 5-994 de ORF1, b) una secuencia que comprende nucleótidos contiguos 995-2092 de ORF1, c) una secuencia que comprende nucleótidos contiguos 20932629 de ORF1, d) una secuencia que comprende nucleótidos contiguos 2630-3028 de ORF1, e) una secuencia que comprende nucleótidos contiguos 3029-3271 de ORF1, y f) una secuencia que comprende nucleótidos contiguos 3272-5101 de ORF1. La numeración anterior está relacionada con la secuencia de nucleótidos de ORF1 de la cepa de Norovirus MD145-12 (SEQ ID NO: 13), y se debe entender que las posiciones de nucleótidos correspondientes en las secuencias de ORF1 obtenidas de otros genotipos y aislados de Norovirus y Sapovirus también se pretende que estén englobadas por la presente invención.
En otro ejemplo, un polinucleótido puede comprender una secuencia de nucleótidos que codifica una porción de un Norovirus y opcionalmente poliproteína de Sapovirus. En ciertas realizaciones, el polinucleótido es seleccionado del grupo consistente de: a) un polinucleótido que codifica una secuencia de aminoácidos que comprende aminoácidos contiguos 1-330 de una poliproteína codificada por ORF1, b) un polinucleótido que codifica una secuencia de aminoácidos que comprende aminoácidos contiguos 331-696 de una poliproteína codificada por ORF1, c) un polinucleótido que codifica una secuencia de aminoácidos que comprende aminoácidos contiguos 697875 de una poliproteína codificada por ORF1, d) un polinucleótido que codifica una secuencia de aminoácidos que
comprende aminoácidos contiguos 876-1008 de una poliproteína codificada por ORF1, e) un polinucleótido que codifica una secuencia de aminoácidos que comprende aminoácidos contiguos 1009-1189 de una poliproteína codificada por ORF1 y f) un polinucleótido que codifica una secuencia de aminoácidos que comprende aminoácidos contiguos 1090-1699 de una poliproteína codificada por ORF1. La numeración anterior está relacionada con la secuencia de aminoácidos de poliproteínas de la cepa de Norovirus MD145-12 (SEQ ID NO: 14), y se debe entender que las posiciones de aminoácidos correspondientes en las secuencias de poliproteínas obtenidas de otros genotipos y aislados de Norovirus y Sapovirus también se pretende que estén englobadas por la presente invención.
En ciertas realizaciones, los polinucleótidos comprenden secuencias que codifican una o más proteínas de la cápside de un Norovirus y opcionalmente Sapovirus. Por ejemplo, los polinucleótidos pueden comprender una o más secuencias que codifican proteínas estructurales (por ejemplo VP1, VP2, VP10) de un Norovirus y opcionalmente Sapovirus. En ciertas realizaciones, el polinucleótido es seleccionado del grupo consistente de: a) un polinucleótido que comprende los nucleótidos contiguos 5085-6701 de un ácido nucleico genómico de Norovirus numerado en relación a la cepa de Norovirus MD145-12 (SEQ ID NO:13), b) un polinucleótido que comprende nucleótidos contiguos 6704-7507 de un ácido nucleico genómico de Norovirus numerado en relación a la cepa de Norovirus MD145-12 (SEQ ID NO:13), c) un polinucleótido que comprende nucleótidos contiguos 5174-6847 de un ácido nucleico genómico de Sapovirus numerado en relación a la cepa de Sapovirus Mc10 (SEQ ID NO:18) y d) un polinucleótido que comprende nucleótidos contiguos 6856-7350 de un ácido nucleico genómico de Sapovirus numerado en relación a la cepa de Sapovirus Mc10 (SEQ ID NO:18). En ciertas realizaciones, los polinucleótidos comprenden secuencias que codifican al menos dos proteínas de la cápside de múltiples genotipos y/o aislados de Norovirus y Sapovirus.
En ciertas realizaciones, los polinucleótidos comprenden una o más secuencias de ORF2 y ORF· de Norovirus de uno o más aislados de Norovirus. En una realización, los polinucleótidos comprenden una secuencia de ORF2 que codifica la proteína de la cápside principal (VP1) de un Norovirus. En otra realización, los polinucleótidos comprenden una secuencia de ORF3 que codifica la proteína estructural menor (VP2) de un Norovirus. En otra realización, los polinucleótidos comprenden tanto una secuencia que codifica la proteína de la cápside principal como una secuencia que codifica la proteína estructural menor de un Norovirus.
En ciertas realizaciones, los polinucleótidos comprenden una o más secuencias de Sapovirus que codifican las proteínas de la cápside de uno o más aislados de Sapovirus. en ciertas realizaciones, los polinucleótidos comprenden una o más secuencias que codifican las proteínas de la cápside de uno o más aislados de Sapovirus y una o más secuencias de ORF2 y/o ORF3 de Norovirus de uno o más aislados de Norovirus.
En ciertas realizaciones, la invención usa polinucleótidos que codifican una proteína de fusión multiepítopo como se describe en la presente. Las proteínas de fusión multiepítopo pueden comprender secuencias de uno o más genotipos y/o aislados de Norovirus y opcionalmente Sapovirus. En dichas realizaciones, los polinucleótidos codifican antígenos de fusión que comprenden polipéptidos codificados por ORF2 y/o codificados por ORF3 y opcionalmente codificados por ORF1 o fragmentos de los mismos, incluyendo por ejemplo, secuencias de polipéptidos de Norovirus, como proteína N-terminal, NTPasa, p20, proteasa, polimerasa, VP1 y VP2; y/o secuencias de polipéptidos de Sapovirus, como proteína N-terminal, p11, p28, NTPasa, p32, VPg, proteasa, polimerasa, VP! y VP10. Las secuencias pueden estar derivadas de múltiples genotipos y/o aislados de Norovirus y opcionalmente Sapovirus. Los polinucleótidos pueden codificar también antígenos de fusión que comprenden secuencias exógenas a los Norovirus o Sapovirus. Un polinucleótido que codifica una proteína de fusión puede ser construido de múltiples oligonucleótidos que comprenden secuencias que codifican fragmentos de la proteína de fusión ligando los oligonucleótidos para formar una secuencia de codificación para la proteína de fusión de longitud completa usando técnicas de biología molecular estándar. Ver por ejemplo, Patente U.S. Nº 6.632.601 y Patente U.S. Nº 6.630.298.
En ciertas realizaciones, el polinucleótido que codifica la proteína de fusión multiepítopo comprende una secuencia de ORF2 de Norovirus que codifica la proteína de la cápside principal de un Norovirus y al menos otra secuencia que codifica una proteína de la cápside de un aislado diferente de Norovirus o Sapovirus. En ciertas realizaciones, el polinucleótido que codifica la proteína de fusión multiepítopo comprende una secuencia de ORF2 de Norovirus que codifica la proteína de la cápside principal de un Norovirus y al menos otra secuencia de una región diferente del genoma del Norovirus, como una secuencia de ORF1 o ORF3 del mismo aislado o un aislado diferente de Norovirus o Sapovirus. En ciertas realizaciones, el polinucleótido que codifica la proteína de fusión multiepítopo comprende una o más de las secuencias de la región ORF1 de un Norovirus o Sapovirus. Por ejemplo, los polinucleótidos pueden comprender secuencias que codifican uno o más polipéptidos codificados por ORF1 de Norovirus, como la proteína N-terminal, NTPasa, p20, VPg, proteasa, polimerasa, VP1 y VP2, o uno o más polipéptidos de Sapovirus, como la proteína N-terminal, p11, p28, NTPasa, p32, VPg, proteasa, polimerasa y VP1; o fragmentos de las mismas. En ciertas realizaciones, el polinucleótido que codifica la proteína de fusión multiepítopo comprende una o más de las secuencias de la región ORf1 de un Norovirus y opcionalmente Sapovirus y una o más secuencias de las regiones ORF" o ORF3 del mismo o un aislado diferente de Norovirus y opcionalmente Sapovirus. Los polinucleótidos usados en la invención pueden también comprender otras secuencias de nucleótidos, como las secuencias que codifican conectores, secuencias señal, o ligandos útiles en la purificación de proteínas como la glutatión-S-transferasa y la proteína estafilocócica A.
Los ácidos nucleicos pueden ser preparados de muchas maneras (por ejemplo por síntesis química, de bibliotecas de ADNc o genómicas, del mismo organismo, etc.) y pueden tomar varias formas (por ejemplo, monocatenario, bicatenario, vectores, sondas, etc.). Preferiblemente, los ácidos nucleicos se preparan en forma sustancialmente pura (es decir, sustancialmente libre de otras células huésped o ácidos nucleicos de células no huésped).
Por ejemplo, los ácidos nucleicos pueden ser obtenidos cribando ADNc y/o bibliotecas genómicas de células infectadas con virus, o derivando el gen de un vector conocido para incluir el mismo. Por ejemplo, los polinucleótidos de interés pueden ser aislados de una biblioteca genómica derivada de ARN viral presente en, por ejemplo, muestras de heces o vómito de un individuo infectado. Alternativamente, los ácidos nucleicos de Norovirus y opcionalmente Sapovirus pueden ser aislados de humanos u otros mamíferos infectados o de muestras de heces o vómito recogidas de individuos infectados como se describe en, por ejemplo Estes y otros Patente U.S. Nº 6,942,86; Guntapong y otros (2004) Jpn J. Infect. Dis. 57:276-278; Harrington y otros (2004) J. Virol. 78:3035-3045; Fankhauser y otros (1998) J. Infect. Dis. 178:1571-1578; y Dolin y otros (1971) J. Infect. Dis. 123:307-312. Los virus pueden ser desarrollados en células LLC-PK en presencia de fluido intestinal que contiene ácidso biliares (Chang y otros (2004) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101:8733-8738). Un método de amplificación como el PCR puede ser usado para amplificar los polinucleótidos de ARN o ADNc de Norovirus o Sapovirus que lo codifica. Alternativamente, los polinucleótidos pueden ser sintetizados en laboratorio, por ejemplo, usando un sintetizados automático. La secuencia de nucleótidos puede ser designada con los codones apropiados para la secuencia de aminoácidos particular deseada. La secuencia de nucleótidos puede ser designada con los codones apropiados para la secuencia de aminoácidos particular deseada. En general, se seleccionará los codones preferidos para el huésped pretendido en la que la secuencia será expresado. La secuencia completa del polinucleótido de interés puede ser ensamblada de oligonucleótidos superpuestos preparados por métodos estándar y ensamblados en una secuencia de codificación completa. Ver por ejemplo, Edge (1981) Nature 292:756; Nambair y otros (1984) Science 223:1299; Jay y otros (1984) J. Biol. Chem. 259:6311; Stemmer y otros (1995) Gene 164:49-53. Los polinucleótidos pueden ser ARN o ADN mono- o bi-catenario. Preferiblemente, los polinucleótidos se aíslan libres de otros componentes, como proteínas y lípidos.
Así, las secuencias de nucleótidos particulares se pueden obtener de vectores que albergan las secuencias deseadas o sintetizadas completamente o en parte usando varias técnicas de síntesis de oligonucleótidos conocidas en la técnica, como técnicas de mutagénesis dirigida al sitio y reacción de cadena de polimerasa (PCR) cuando sea apropiado. Ver por ejemplo, Sambrook, supra. En particular, un método para obtener secuencias de nucleótidos que codifican las secuencias deseadas es hibridando conjuntos complementarios de oligonucleótidos sintéticos superpuestos producidos en un sintetizados de polinucleótidos automático convencional, seguido por ligación con una ligasa de ADN apropiada y amplificación de la secuencia de nucleótidos ligada por PCR. Ver por ejemplo, Jayaraman y otros (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:4084-4088. Adicionalmente, síntesis dirigida a los oligonucleótidos (Jones y otros. (1986) Nature 54:75-82), mutagénesis dirigida a los oligonucleótidos de regiones de nucleótidos pre-existentes (Riechmann y otros (1988) Nature 332:323-327 y Verhoeyen y otros (1988) Science 239:1534-1536), y llenado enzimático de oligonucleótidos con huecos usando T4 ADN polimerasa (Queen y otros, (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:10029-10033) se pueden usar para proporcionar moléculas que tienen capacidades de enlace con antígenos alteradas o potenciadas, y/o inmunogenicidad reducida.
C. Producción de Polipéptidos Inmunogénicos
Los polipéptidos producidos por métodos de la invención son preparados preferiblemente en forma sustancialmente pura (es decir, sustancialmente libre de otras células huésped o proteínas de células no huésped).
Los polipéptidos, poliproteínas y proteínas de fusión multiepítopo inmunogénicos descritos anteriormente son producidos de forma recombinante. Una vez que las secuencias de codificación para las proteínas deseadas han sido aisladas o sintetizadas, pueden ser clonadas en cualquier vector o replicón adecuado para la expresión. Se conocen numerosos vectores de clonación por los expertos en la técnica, y la selección de un vector de clonación apropiado es una cuestión de elección. Una variedad de sistemas de expresión bacterianos, de levadura, vegetales, mamíferos y de insecto están disponibles en la técnica. La invención usa el sistema de expresión de levadura (ver Ejemplos 1 y 2 para la construcción de casetes de expresión para la expresión en células de levadura e insectos, respectivamente).
Los ejemplos de vectores de ADN recombinantes para clonación y células huésped que pueden transformar incluyen el bacteriófago
(E.coli), pBR322 (E. coli), pACYC177 (E. coli), pKT230 (bacterias gram-negativas), pGV1106 (bacterias gram-negativas), pLAFR1 (bacterias gram-negativas), pME290 (bacterias gram-negativas no de E coli), pHV14 (E. coli y Bacillus subtilis), pBD9 (Bacillus), pIJ61 (Streptomyces), pUC6 (Streptomyces), YIp5 (Saccharomyces), YCp19 (Saccharomyces) y virus del papiloma bovino (células de mamífero). ver generalmente Clonación de ADN: Vols. I & II; Sambrook y otros, supra; B.Perbal, supra.
Los sistemas de expresión de células de insectos, como los sistemas de baculovirus son conocidos por los expertos en la técnica y descritos en, por ejemplo Summers y Smith, Texas Agricultural Experiment Station Bulletin No. 1555 (1987). Los materiales y métodos para sistemas de expresión celulares de baculovirus/insecto están
comercialmente disponibles en forma de kit de, entre otros, Invitrogen, San Diego Calif. (kit "MaxBac").
También se pueden usar sistemas de expresión vegetales y virales
El gen puede ser colocado bajo el control de un promotor ADH2/GAPDH, de tal forma que la secuencia de ADN que codifica el polipéptido inmunogénico deseado es transcrito en el ARN en la célula huésped transformada por un vector que contiene esta construcción de la expresión. La secuencia de codificación puede o puede no contener un péptido señal o secuencia líder. Con la presente invención, se pueden usar tanto los péptidos señal de origen natural como secuencias heterólogas. Las secuencias líder pueden ser eliminadas por el huésped en el procesamiento post-traslacional. Ver por ejemplo Patentes U.S. Nº 4.431.739; 4.425.437, 4.338.397. Tales secuencias incluyen, pero no están limitadas a, el líder tpa, así como la secuencia señal de la melitina de miel de abeja.
También pueden ser deseables otras secuencias reguladoras que permiten la regulación de la expresión de las secuencias de proteínas en relación al crecimiento de la célula huésped. Tales secuencias reguladoras son conocidas por los expertos en la técnica, y los ejemplos incluyen aquellas que causan que la expresión de un gen sea encendida o apagada en respuesta a un estímulo físico o químico, incluyendo la presencia de un compuesto regulador. También puede haber presentes otros tipos de elementos reguladores en el vector, por ejemplo, secuencias potenciadoras.
Las secuencias de control y otras secuencias reguladoras pueden estar ligadas a la secuencia de codificación antes de la inserción en un vector. Alternativamente, la secuencia de codificación puede ser clonada directamente en un vector de expresión que ya contiene las secuencias de control y un sitio de restricción apropiado.
En algunos casos puede ser necesario modificar la secuencia de codificación de tal forma que pueda ser unida a las secuencias de control con la orientación apropiada, es decir, para mantener el marco de lectura apropiado. También puede ser deseable producir mutantes o análogos de los polipéptidos inmunogénicos. Los mutantes o análogos pueden ser preparados por la deleción de una porción de la secuencia que codifica la proteína, por la inserción de una secuencia, yo por la sustitución de uno o más nucleótidos dentro de la secuencia. Las técnicas para modificar secuencias de nucleótidos, como mutagénesis dirigida al sitio, son bien conocidas por los expertos en la técnica. Ver por ejemplo, Sambrook y otros, supra; DNA Cloning, Vols. I and II, supra; Nucleic Acid Hybridization, supra.
El vector de expresión es después utilizado para transformar una célula de levadura. Los huéspedes de levadura útiles en la presente invención incluyen, entre otros, Saccharomyces cerevisiae, Candida albicans, Candida maltosa, Hansenula polymorpha, Kluyveromyces fragilis, Kluyveromyces lactis, Pichia guillerimondii, Pichia pastoris, Schizosaccharomyces pombe and Yarrowia lipolytica.
Las proteínas de la presente invención se producen desarrollando células huésped transformadas por un vector de expresión descrito anteriormente bajo condiciones por las que la proteína de interés es expresada. La selección de las condiciones de crecimiento apropiadas está dentro del conocimiento de la técnica. Las células son después interrumpidas, usando medios químicos, físicos o mecánicos, que lisan las células y todavía mantienen los polipéptidos de Norovirus y opcionalmente Sapovirus sustancialmente intactos. Las proteínas intracelulares también pueden ser obtenidas eliminando componentes de la pared o membrana celular , por ejemplo, por el uso de detergentes o solventes orgánicos, de tal forma que tiene lugar la filtración de polipéptidos inmunogénicos. Tales métodos son conocidos por los expertos en la técnica y se describen en, por ejemplo, Protein Purification Applications: A Practical Approach, (E. L. V. Harris and S. Angal, Eds., 1990).
Por ejemplo, los métodos de interrumpir células para su uso con la presente invención incluyen, pero no están limitados a: sonicación o ultrasonicación; agitación; extrusión líquida o sólida; tratamiento térmico; congelación y descongelación; desecación; descompresión explosiva; choque osmótico; tratamiento con enzimas líticas incluyendo proteasas como la tripsina, neuraminidasa y lisozima; tratamiento con álcali; y el uso de detergentes y solventes como sales biliares, dodecilsulfato sódico, Tritón, NP40 y CHAPS. La técnica particular usada para interrumpir células es principalmente una cuestión de elección y dependerá del tupo de célula en la que el polipéptido es expresado, condiciones de cultivo y cualquier pre-tratamiento usado.
Después de la interrupción de las células, se elimina el desecho celular, generalmente por centrifugación, y los polipéptidos inmunogénicos de Norovirus y opcionalmente Sapovirus producidos intracelularmente son purificados adicionalmente, usando técnicas de purificación estándar como, pero no limitado a, cromatografía en columna, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de exclusión por tamaño, electroforesis, HPLC, técnicas de inmunoadsorción, cromatografía de afinidad, inmunoprecipitación, y similares.
Por ejemplo, un método para obtener los polipéptidos inmunogénicos de Norovirus y/o Sapovirus intracelulares de la presente invención implica la purificación por afinidad, como por cromatografía por inmunoafinidad usando anticuerpos específicos. La elección de una resina de afinidad adecuada está dentro de los conocimientos de la técnica. Después de la purificación por afinidad, los polipéptidos inmunogénicos pueden ser
purificados adicionalmente usando técnicas convencionales bien conocidas en la técnica, como por cualquiera de las técnicas descritas anteriormente.
Puede ser deseable producir múltiples polipéptidos simultáneamente (por ejemplo proteínas estructurales y/o no estructurales de una o más cepas virales o polipéptidos virales en combinación con adyuvantes de polipéptidos). La producción de dos o más polipéptidos diferentes se puede conseguir fácilmente por, por ejemplo, co-transfección de células huésped con constructos que codifican los diferentes polipéptidos. La co-transfección puede ser conseguida o en trans o cis, es decir, usando vectores separados o usando un único vector que codifica al polipéptidos. Si se usa un sólo vector, la expresión de los polipéptidos puede ser conducida por un único conjunto de elementos de control o, alternativamente, las secuencias que codifican para los polipéptidos pueden estar presentes en el vector en casetes de expresión individuales, regulados por elementos de control individuales.
E. Producción de Partículas similares a Virus
La proteína de la cápside de Norovirus y Sapovirus se auto-ensambla en partículas similares avirus (VLP) no infecciosas cuando se expresan en varias células eucariotas Taube y otros (2005) Arch Virol. 150:1425-1431; Ball y otros (1998) J. Virol. 72:1345-1353; Green y otros (1997) J. Clin. Microbiol. 35:1909-1914; Huang y otros (2005) Vaccine 23:1851-1858; Hansman y otros (2005) Arch. Virol. 150:21-36. Las VLPs se forman espontáneamente cuando un polipéptido formador de partículas de interés, por ejemplo, un polipéptido de VP1 de Norovirus o una variante o fragmento del mismo capaz de producir VLPs, es expresado de forma recombinante en una célula de levadura.
Los vectores de expresión que comprenden secuencias de codificación de la cápside de Norovirus y opcionalmente Sapovirus son preparados convenientemente usando técnicas recombinantes. Como se discute a continuación, los vectores de expresión que codifican polipéptidos de VP1 de la presente invención pueden incluir otras secuencias que de codificación de polipéptidos de interés, por ejemplo, proteínas no estructurales codificadas por ORF1 (por ejemplo, Nterm, NTPasa, p20, p22, VPg, Pro y Pol de Norovirus; y p11, p28, NTPasa, p32, VPg, Pro y Pol de Sapovirus) y proteínas estructurales menores, como VP2 de Norovirus y VP10 de Sapovirus. Tales vectores de expresión pueden producir VLPs que comprenden VP1, así como cualquier polipéptido adicional de interés.
En ciertas realizaciones, los vectores de expresión pueden codificar una o más proteínas estructurales de uno o más genotipos y/o aislados de Norovirus y Sapovirus. Por ejemplo, los vectores de expresión capaces de producir VLPs pueden comprender una o más proteínas de la cápside de VP1 de uno o más aislados y/o genotipos de Norovirus y Sapovirus. Además, los vectores de expresión pueden comprender adicionalmente secuencias de codificación para una o más proteínas estructurales menores (por ejemplo, VP2, VP10) de uno o más aislados y/o genotipos de Norovirus y Sapovirus. Una vez que las secuencias de codificación para los polipéptidos formadores de partículas deseados han sido aisladas o sintetizadas, pueden ser clonadas en cualquier vector o replicón adecuado para la expresión. Se conocen numerosos vectores de clonación por los expertos en la técnica, y la selección de un vector de clonación apropiado es una cuestión de elección. Ver generalmente Ausubel y otros, supra o Sambrook y otros, supra. El vector es entonces usado para transformar una célula de levadura.
Las células huésped útiles en la presente invención incluyen, entre otras, Saccharomyces cerevisiae, Candida albicans, Candida maltosa, Hansenula polymorpha, Kluyveromyces fragilis, Kluyveromyces lactis, Pichia guillerimondii, Pichia pastoris, Schizosaccharomyces pombe y Yarrowia lipolytica. Ver por ejemplo, Shuster y otros Patente U.S. Nº 6.183.985. Ver también el Ejemplo 1, que describe la expresión de las proteínas estructurales de VP1 y VP2 del virus Norwalk y la producción de partículas virales en Saccharomyces cerevisiae. El Ejemplo 2 describe la expresión de proteínas estructurales de VP1 y VP2 de virus Norwalk y la producción de partículas virales en células SF9. Las VLPs son producidas desarrollando células de levadura transformadas por un vector de expresión bajo condiciones por las que el polipéptido formador de partículas se expresa y las VLPs pueden ser formadas. La selección de las condiciones de crecimiento apropiadas está dentro de los conocimientos de la técnica.
Si las VLPs se forman de forma intracelular, las células son entonces interrumpidas, usando medios químicos, físicos o mecánicas, que lisan las células y mantienen las VLPs sustancialmente intactas. Tales métodos son conocidos por los expertos en la técnica y se describen en, por ejemplo, Protein Purification Applications: A Practical Approach, (E. L. V. Harris and S. Angal, Eds., 1990).
Las partículas son después aisladas (o sustancialmente purificadas) usando métodos que conservan la integridad de las mismas, como por centrifugación en gradiente de densidad, por ejemplo gradientes de sacarosa, precipitación por PEG, sedimentación, y similares (ver por ejemplo, Kirnbauer y otros, J. Virol. (1993) 67:6929-6936), así como técnicas de purificación estándar incluyendo, por ejemplo cromatografía de filtración en gel e intercambio iónico. Los polipéptidos de la cápside pueden ser expresados en una cepa diploide de S.cerevisiae producida emparejando dos cepas haploides , que expresan cada una proteínas de la cápside diferentes. Ver por ejemplo, Publicación de Patente Internacional WO00/09699, que describe la producción de VLPS mosaico en levadura por la expresión de múltiples polipéptidos de la cápside usando el vector de expresión episomal pBS24.1 que comprende un promotor híbrido reprimible por glucosa ADH2/GAPD.
Las VLPS producidas por la presente invención pueden ser usadas para provocar una respuesta inmune cuando se administran a un sujeto. Como se ha mencionado anteriormente, las VLPs pueden comprender una variedad de antígenos además de los polipéptidos de VP1 (por ejemplo, proteínas estructurales menores y proteínas no estructurales). Las VLPs purificadas pueden ser administradas a un sujeto vertebrado, habitualmente en la forma de composiciones inmunogénicas, como composiciones de vacunas. También se pueden usar vacunas de combinación cuando tales composiciones inmunogénicas contienen, por ejemplo, otras proteínas derivadas de Norovirus, Sapovirus u otros organismos o ácidos nucleicos que codifican tales antígenos. La administración puede tener lugar usando las VLPs formuladas solas o formuladas con otros antígenos. Además, las VLPs pueden ser administradas antes de, concurrentes con, o posteriormente a, la administración de casetes de expresión para la inmunización de ácidos nucleicos (ver a continuación) y/o la administración de otras vacunas. También, el sitio de administración de la VLP puede ser el mismo o diferente que otras composiciones inmunogénicas que se están administrando.
F. Composiciones inmunogénicas
Las composiciones descritas en la presente comprenden VLPs producidas por la presente invención y opcionalmente uno o más de los ácidos nucleicos, polipéptidos, poliproteínas y/o proteínas de fusión multiepítopo de inmunogénicas descritas en la presente. Diferentes polipéptidos, poliproteínas, y proteínas de fusión de múltiples epítopos pueden ser mezcladas juntas en una formulación individual. Dentro de tales combinaciones, un antígeno de la composición inmunogénica puede estar presente en más de un polipéptido, o polipéptido de múltiples epítopos o poliproteína.
Las composiciones inmunogénicas pueden comprender una mezcla de polipéptidos y ácidos nucleicos, que a su vez pueden ser administrados usando los mismos o vehículos diferentes.
Los antígenos pueden ser administrados individualmente o en combinación en, por ejemplo composiciones inmunogénicas profilácticas (es decir, para prevenir la infección) o terapéuticas (para tratar la infección). La composición inmunogénica puede ser dada más de una vez (por ejemplo, una administración "principal" seguida por uno o más "refuerzos") para conseguir los efectos deseados. La misma composición puede ser administrada en uno
o más pasos de sensibilización y uno o más de refuerzo. Alternativamente, composiciones diferentes pueden ser usadas para sensibilizar y reforzar.
Las composiciones inmunogénicas incluirán generalmente uno o más "excipientes o vehículos farmacéuticamente aceptables" como agua, solución salina, glicerol, etanol, etc. Adicionalmente pueden estar presentes en tales vehículos, sustancias auxiliares como agentes humectantes o emulsionantes, sustancias de tamponamiento del pH, y similares.
Las composiciones inmunogénicas comprenderán, además de los componentes mencionados anteriormente, uno o más "portadores farmacéuticamente aceptables". Estos incluyen cualquier portador que no induce por sí mismo la producción de anticuerpos dañinos para el individuo que recibe la composición. Los portadores adecuados son típicamente macromoléculas grandes, metabolizadas lentamente como proteínas, polisacáridos, ácidos polilácticos, ácidos poliglicólicos, aminoácidos poliméricos, copolímeros de aminoácidos y agregados de lípidos (tales como gotitas de aceite o liposomas). Tales portadores son bien conocidos por los expertos en la técnica. Una composición puede contener un diluyente, como agua, solución salina, glicerol, etc. Adicionalmente puede estar presente, una sustancia auxiliar, como un agente humectante o emulsionante, sustancia de tamponamiento del pH, y similares. Un debate a fondo de componentes farmacéuticamente aceptables está disponible en Gennaro (2000) Remington: The Science and Practice of Pharmacy. 20th ed., ISBN: 0683306472.
También se pueden usar sales farmacéuticamente aceptables en las composiciones, por ejemplo, sales minerales como clorhidratos, bromhidratos, fosfatos, o sulfatos, así como sales de ácidos orgánicos tales como acetatos, propionatos, malonatos, o benzoatos. Sustratos de proteínas especialmente útiles son albúminas séricas, hemocianina de lapa californiana, moléculas de inmunoglobulina, tiroglobulina, ovoalbúmina, toxoide tetánico y otras proteínas bien conocidas por los expertos en la técnica. Las composiciones también pueden contener líquidos o excipientes, como agua, solución salina, dextrosa, etanol o similares, individualmente o en combinación, así como sustancias como agentes humectantes, agentes emulsionantes, o agentes de tamponamiento del pH. Los antígenos también pueden ser adsorbidos a, atrapados dentro o asociados de otra manera con liposomas y portadores particulados como PLG.
Los antígenos pueden ser conjugados a una proteína portadora para mejorar la inmunogenicidad. Esto es particularmente útil en composiciones en las que se usa un antígeno de sacárido o carbohidrato. Ver Ramsay y otros (2001) Lancet 357(9251):195-196; Lindberg (1999) Vaccines 17 Suppl 2:S28-36; Buttery & Moxon (2000) J R Coll Physicians Lond 34:163-168; Ahmad & Chapnick (1999) Infect Dis Clin North Am 13:113-133, vii; Goldblatt (1998) J. Med. Microbiol. 47:563-567; Patente Europea 0 477 508; Patente US Nº 5,306,492; WO98/42721; Conjugate Vaccines (eds. Cruse y otros) ISBN 3805549326, particularmente vol. 10:48-114; Hermanson (1996) Bioconjugate Techniques ISBN: 0123423368 o 012342335X.
Las proteínas portadoras preferidas son toxinas o toxoides bacterianos, como toxoides tetánicos o de difteria. Se prefiere particularmente el toxoide de difteria CRM197. Otros polipéptidos portadores incluyen la proteína de la membrana externa de N.meningitidis (EP-A-0372501), péptidos sintéticos (EP-A-0378881 y EP-A-0427347), proteínas de choque térmico (WO 93/17712 y WO 94/03208), proteínas de tosferina (WO 98/58668 y EP-A0471177), proteína d de H.influenzae (WO 00/56360), citocinas (WO 91/01146), linfocinas, hormonas, factores de crecimiento, toxina A o B de C. difficile (WO 00/61761), proteínas de captación de hierro, como de transferencia (WO 01/72337), etc. Cuando una mezcla comprende sacárido capsular de ambos serigrafías A y C, se puede preferir que la relación (p/p) de sacárido MenA:sacárido MenC sea mayor de 1 (por ejemplo, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 10:1 o superior). Diferentes sacáridos pueden ser conjugados al mismo o diferente tipo de proteína portadora. Se puede usar cualquier reacción conjugación adecuada, con cualquier conector adecuado cuando sea necesario.
Las composiciones inmunogénicas, preferiblemente vacunas pueden ser administradas en conjunción con otros agentes inmunoreguladores. Por ejemplo, una vacuna puede incluir un adyuvante. Los adyuvantes preferidos incluyen, pero no están limitados a, uno o más de los siguientes tipos de adyuvantes descritos a continuación.
A. Composiciones que contienen Minerales
Las composiciones que contienen minerales adecuadas para su uso como adyuvantes incluyen sales minerales, como sales de aluminio y sales de calcio.
B. Emulsiones de Aceite
Las composiciones de emulsiones de aceite adecuadas para su uso como adyuvantes incluyen emulsiones de escualeno-agua, como MF59 (5% Escualeno, 0.5% Tween 80, y 0.5% Span 85,) formuladas en partículas submicrométricas usando un microfluidizador). Ver la WO90/14837. Ver también, Podda "The adjuvanted influenza vaccines with novel adjuvants: experience with the MF59-adjuvanted vaccine", Vaccine (2001) 19: 2673-2680; Frey y otros, "Comparison of the safety, tolerability, and immunogenicity of a MF59-adjuvanted influenza vaccine and a nonadjuvanted influenza vaccine in non-elderly adults", Vaccine (2003) 21:4234-4237. La MF59 se usa como el adyuvante para la vacuna de subunidad del virus de la gripe trivalente FLUAD™.
Los adyuvantes particularmente preferidos para su uso en composiciones son emulsiones de aceite en agua submicrométricas.
También se pueden usar como adyuvantes en la invención el adyuvante Completo de Freund (CFA) y el adyuvante incompleto de Freund (IFA).
C. Formulaciones de Saponina
Las formulaciones de saponina también se pueden usar como adyuvantes.
D. Virosomas y Partículas Similares a Virus (VLPs)
También se pueden usar como adyuvantes Virosomas y Partículas Similares a Virus (VLPs). Estas estructuras contienen generalmente una o más proteínas de un virus opcionalmente combinadas o formuladas con un fosfolípido. Son generalmente no patogénicas, no replicantes y generalmente no contienen nada del genoma viral nativo. Las proteínas virales pueden ser producidas o aisladas de forma recombinante de virus completos. Estas proteínas virales adecuadas para su uso en virosomas o VLPs incluyen proteínas derivadas de virus de la gripe (como HA o NA), Virus de la hepatitis B (como proteínas del núcleo o de la cápside), virus de la hepatitis E, virus del sarampión, virus Sindbis, Rotavirus, virus de Fiebre Aftosa, Retrovirus, virus Norwalk, virus de papiloma humano, VIH, ARN-fagos, Q -fago (como proteínas de la cubierta), GA-fago, fr-fago, fago AP205 y Ty (como proteína p1 del retrotransposón Ty). Las VLPs se analizan con más detalle en in la WO03/024480, WO03/024481, y Niikura y otros, "Chimeric Recombinant Hepatitis E Virus-Like Particles as an Oral Vaccine Vehicle Presenting Foreign Epitopes", Virology (2002) 293:273-280; Lenz y otros, "Papillomarivurs-Like Particles Induce Acute Activation of Dendritic Cells", Journal of Immunology (2001) 5246-5355; Pinto, y otros, "Cellular Immune Responses to Human Papillomavirus (HPV)-16 L1 Healthy Volunteers Immunized with Recombinant HPV-16 L1 Virus-Like Particles", Journal of Infectious Diseases (2003) 188:327-338; and Gerber y otros, "Human Papillomavrisu Virus-Like Particles Are Efficient Oral Immunogens when Coadministered with Escherichia coli Heat-Labile Entertoxin Mutant R192G or CpG", Journal of Virology (2001) 75(10):4752-4760. Los virosomas se tratan adicionalmente en, por ejemplo, Gluck y otros, "New Technology Platforms in the Development of Vaccines for the Future",
E. Derivados Bacterianos y Microbianos
Los adyuvantes adecuados para el uso incluyen derivados bacterianos y microbianos como:
(1) Derivados no tóxicos de lipopolisacárido enterobacteriano (LPS)
Tales derivados incluyen Monofosforil lípido A (MPL) y MPL 3-O-desacetilado (3dMPL). El ·dMPL es una mezcla de 3 De-O-acilado monofosforil lípido A con 4, 5 ó 6 cadenas aciladas. Una forma de "partícula pequeña" preferida de 3 De-O-acilado monofosforil lípido A se describe en la EP 0689454. Dichas "partículas pequeñas" de 3dMPL son lo suficientemente pequeñas para ser filtradas de forma estéril a través de una membrana de 0,22 micras (ver EP 0689454). Otros derivados de LPS no tóxicos incluyen imitadores de monofosforil lípido A, como derivados de aminoalquilo fosfato glucosaminida, por ejemplo RC-529. Ver Johnson y otros, (1999) Bioorg Med Chem Lett 9:2273-2278.
(2)
Derivados de Lípido A
Los derivados de lípido A incluyen derivados de lípido A de la Escherichia coli como el OM-174. El OM-174 se describe por ejemplo en Meraldi y otros, OM-174, a New Adjuvant with a Potential for Human Use, Induces a Protective Response with Administered with the Synthetic C-Terminal Fragment 242-310 from the circumsporozoite protein of Plasmodium berghei", Vaccine (2003) 21:2485-2491; y Pajak, y otros, "The Adjuvant OM-174 induces both the migration and maturation of murine dendritic cells in vivo", Vaccine (2003) 21:836-842.
(3)
Oligonucleótidos inmunoestimuladores
Los oligonucleótidos inmunoestimuladores adecuados para su uso como adyuvantes incluyen secuencias de nucleótidos que contienen un motivo CpG (una secuencia que contiene una citosina no metilada seguida por guanosina y ligada por un enlace de fosfato). El ARN de cadena doble bacteriano o los oligonucleótidos que contienen secuencias palindrómicas o poli(dG) también han mostrado ser inmunoestimuladores.
Los CpG pueden incluir modificaciones/análogos de nucleótidos como modificaciones de fosforotioato y pueden ser de cadena doble o monocatenarios. Ppcionalmente, la guanosina puede ser reemplazada con un análogo como 2'-deoxi-7-deazaguanosina. Ver Kandimalla y otros, "Divergent synthetic nucleotide motif recognition pattern: design and development of potent immunomodulatory oligodeoxyribonucleotide agents with distinct cytokine induction profiles", Nucleic Acids Research (2003) 31(9): 2393-2400; WO02/26757 y WO99/62923 para ejemplos de posibles sustituciones de análogos. El efecto adyuvante de los oligonuclótidos de CpG se trata con más detalle en Krieg, "CpG motifs: the active ingredient in bacterial extracts?", Nature Medicine (2003) 9(7): 831-835; McCluskie, y otros, "Parenteral and mucosal prime-boost immunization strategies in mice with hepatitis B surface antigen and CpG DNA", FEMS Immunology and Medical Microbiology (2002) 32:179-185; WO98/40100; Patente U.S. No. 6,207,646; Patente U.S. No. 6,239,116 y Patente U.S. No. 6,429,199.
La secuencia de Cpg puede ser dirigida a TLR9, como el motivo GTCGTT o TTCGTT. Ver See Kandimalla, y otros, "Toll-like receptor 9: modulation of recognition and cytokine induction by novel synthetic CpG DNAs", Biochemical SocietyTransactions (2003) 31 (part 3): 654-658. La secuencia de CpG puede ser específica para inducir una respuesta inmune de Th1, como una CpG-A ODN, o puede ser más específica para inducir una respuesta de células B, como una Cpg-B ODN. Las CpG-A y CpG-B ODNs se tratan en Blackwell, y otros, "CpG-A-Induced Monocyte IFN-gamma-Inducible Protein-10 Production is Regulated by Plasmacytoid Dendritic Cell Derived IFN-alpha", J. Immunol. (2003) 170(8):4061-4068; Krieg, "From A to Z on CpG", TRENDS in Immunology (2002) 23(2): 64-65 y la WO01/95935. Preferiblemente la CpG es una CpG-A ODN.
Preferiblemente, el oligonucleótido de CpG es construido de tal forma que el extremo 5' es accesible para el reconocimiento del receptor. Opcionalmente, dos secuencias de oligonucleótidos de Cpg se pueden unir en sus extremos 3' para formar "inmunómeros". Ver, por ejemplo, Kandimalla, y otros, "Secondary structures in CpG oligonucleotides affect immunostimulatory activity", BBRC (2003) 306:948-953; Kandimalla, y otros, "Toll-like receptor 9: modulation of recognition and cytokine induction by novel synthetic GpG DNAs", Biochemical Society Transactions (2003) 31(part 3):664-658; Bhagat y otros, "CpG penta-and hexadeoxyribonucleotides as potent immunomodulatory agents" BBRC (2003) 300:853-861 y la WO03/035836.
(4) Toxinas de ribosilación de ADP y derivados desintoxicados de las mismas.
Las toxinas de ribosilación de ADP bacterianas y los derivados desintoxicados de las mismas pueden ser usados como adyuvantes. Preferiblemente, la proteína está derivada de E.coli (es decir, la enterotoxina lábil al calor de E.coli "LT"), cólera ("CT"), o tosferina ("PT"). El uso de toxinas de ribosilación de APD desintoxicadas como adyuvantes mucosales se describe en la WO95/1721 y como adyuvantes parenterales en l aWO98/42375. Preferiblemente, el adyuvante es un mutante LT desintoxicado como LT-K63, LT-R72 y LTR192G. El uso de toxinas de ribosilación de ADP y derivados desintoxicados de las mismas, particularmente LT-K63 y LT-R72, como adyuvantes se puede encontrar en las siguientes referencias: Beignon, y otros, "The LTR72 Mutant of Heat-Labile Enterotoxin of Escherichia coli Enahnces the Ability of Peptide Antigens to Elicit CD4+ T Cells and Secrete Gamma Interferon after Coapplication onto Bare Skin", Infection and Immunity (2002) 70(6):3012-3019; Pizza, y otros, "Mucosal vaccines: non toxic derivatives of LT and CT as mucosal adjuvants", Vaccine (2001) 19:2534-2541; Pizza, y otros, "LTK63 and LTR72, two mucosal adjuvants ready for clinical trials" Int. J. Med. Microbiol (2000) 290(45):455-461; Scharton-Kersten y otros, "Transcutaneous Immunization with Bacterial ADP-Ribosylating Exotoxins,
Subunits and Unrelated Adjuvants", Infection and Immunity (2000) 68(9):5306-5313; Ryan y otros, "Mutants of Escherichia coli Heat-Labile Toxin Act as Effective Mucosal Adjuvants for Nasal Delivery of an Acellular Pertussis Vaccine: Differential Effects of the Nontoxic AB Complex and Enzyme Activity on Th1 and Th2 Cells" Infection and Immunity (1999) 67(12):6270-6280; Partidos y otros, "Heat-labile enterotoxin of Escherichia coli and its site-directed mutant LT-K63 enhance the proliferative and cytotoxic T-cell responses to intranasally co-immunized synthetic peptides", Immunol. Lett. (1999) 67(3):209-216; Peppoloni y otros, "Mutants of the Escherichia coli heat-labile enterotoxin as safe and strong adjuvants for intranasal delivery of vaccines", Vaccines (2003) 2(2):285-293; y Pine y otros, (2002) "Intranasal immunization with influenza vaccine and a detoxified mutant of heat labile enterotoxin from Escherichia coli (LTK63)" J. Control Release (2002) 85(1-3):263-270. La referencia numérica para las sustituciones de aminoácidos se basa preferiblemente en los alineamientos de las subunidades A y B de toxinas de ribosilación de ADP enunciadas en Domenighini y otros, Mol. Microbiol (1995) 15(6):1165-1167.
F. Bioadhesivos y Mucoadhesivos Los bioadhesivos y los mucoadhesivos también se pueden usar como adyuvantes.
G. Micropartículas Las micropartículas también se pueden usar como adyuvantes.
H. Liposomas
Ejemplos de formulaciones de liposomas adecuadas para su uso como adyuvantes se describen en la Patente US Nº 6.090.406, Patente US Nº 5.916.588 y EP0626169.
I. Formulaciones de éter de polioxietileno y éster de polioxietileno Los adyuvantes adecuados para el uso incluyen éteres de polioxietileno y esteres de polioxietileno.
K. Péptidos de muramilo
Ejemplos de péptidos de muramilo adecuados para su uso como adyuvantes incluyen N-acetil-muramil-Ltreonil-D-isoglutamina (thr-MDP), N-acetil-normuramil-1-alanil-D-isoglutamina (nor-MDP), y N-acetilmuramil-1-alanilD-isoglutaminil-1-alanina-2-(1'-2'-dipalmitoil-sn-glicero-3-hidroxifosforiloxi) etilamina MTP-PE).
L. Compuestos de imidazoquinolina.
Ejemplos de compuestos de imidazoquinolina adecuados para su uso como adyuvantes incluyen Imiquimod y sus análogos descritos adicionalmente en Stanley, "Imiquimod and the imidazoquinolines: mechanism of action and therapeutic potential" Clin Exp Dermatol (2002) 27(7):571-577; Jones, "Resiquimod 3M", Curr Opin Investig Drugs (2003) 4(2):214-218; and las Patentes U.S. Nº 4,689,338, 5,389,640, 5,268,376, 4,929,624, 5,266,575, 5,352,784, 5,494,916, 5,482,936, 5,346,905, 5,395,937, 5,238,944, y 5,525,612.
M. Compuestos de tiosemicarbazona
Ejemplos de compuestos de tiosemicarbazona, así como métodos para formular, fabricar y cribar compuestos adecuados para su uso como adyuvantes incluyen los descritos en la WO04/60308.
N. Compuestos de triptantrina.
Ejemplos de compuestos de triptantrina, así como métodos para formular, fabricar y cribar compuestos adecuados para su uso como adyuvantes incluyen los descritos en la WO04/64759.
O. Inmunomoduladores humanos
Los inmunomoduladores humanos adecuados para su uso como adyuvantes incluyen citocinas, como interleucinas (por ejemplo, IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-12, etc.), interferones (por ejemplo interferón ), factor estimulante de las colonias de macrófagos, y factor de necrosis tumoral.
Antígenos Adicionales
Las composiciones pueden comprender uno o más antígenos de polipéptidos adicionales que no están derivados de proteínas de Norovirus o Sapovirus. Tales antígenos incluyen antígenos bacterianos, virales o parasitarios.
III. Experimental
A continuación hay ejemplos de realizaciones específicas para llevar a cabo la presente invención. Los ejemplos son ofrecidos sólo con propósitos ilustrativos, y no se pretende que limiten el ámbito de la presente invención de ninguna manera.
Se han hecho esfuerzos para asegurar la precisión con respecto a los números usados (por ejemplo cantidades, temperaturas, etc.), pero, por supuesto, se debería permitir algún error y desviación experimental.
Ejemplo 1
Expresión de Proteína de la Cápside del Virus Norwalk en Levadura
Los constructos para la producción de VLPs de virus Norwalk (NV) en Saccharomyces cerevisiae se crearon clonando secuencias que codifican proteínas de la cápside virales en el vector de expresión de levadura PBS24.1. El vector PBS24.1 se describe con detalle en Solicitud de Patente U.S. de propiedad común Nº de serie 382.805, presentada el 19 de Julio de 1989. El vector pBS24.1 contiene la secuencia 2µ para la replicación autónoma en levadura y los genes de levadura leu2d y URA3 como marcadores seleccionables. El gen
-lactamasa y el origen de replicación Col1E, requeridos para la replicación de plásmidos en bacterias también están presentes en el vector de expresión. La regulación de la expresión se puso bajo el control de un promotor híbrido ADH2/GAPDH (descrito en la Patente U.S. Nº 6.183.985) y el terminador del factor alfa.
Los constructos creados y utilizados para la expresión de las proteínas de la cápside NV incluyeron: NV.or2 que comprende una secuencia de polinucleótidos modificada de orf2 (SEQ ID NO:1) y NV.orf2+3 que comprende secuencias de polinucleótidos modificadas de orf2 y orf3 (SEQ ID NO:2). Las secuencias de codificación para orf2 (gen de la cápside principal) y orf2+3 se generaron usando oligonucleótidos sintéticos, basados en la secuencia de ADN del número de acceso de GenBank M87661. Se introdujeron un número de mutaciones silenciosas en orf2 y orf3 para facilitar la clonación de NV.orf2 y NV.orf2+3 en el vector de expresión (Figura 1).
La codificación de orf2+3 de longitud completa y la secuencia 3'UTR se dividió en cuatro dominios de la manera siguiente (Figura 2):
El dominio 1 ("5p") codifica un sitio de clonación Hindlll seguido por la secuencia ACAAAACAAA, el iniciador ATG, y los primeros 154 aminoácidos de la proteína de la cápside, finalizando con un sitio de clonación Xbal único. El dominio 2 ("mid") codifica los siguientes 175 aminoácidos, desde el sitio Xbal a un sitio de clonación Asel único. El dominio 2 ("3p") codifica los 200 aminoácidos finales para orf2, desde ASel a un sitio Bspe1 único cerca del final de la secuencia de codificación orf2, seguido después por dos codones de parada y un sitio de clonación Sall. El dominio 4 ("orf3") incluye lo siguiente: un sitio BspE1 único, un codón de parada , un codón de marco de lectura/reinicio que posteriormente empieza la traducción de orf3 (212 aminoácidos), 66 bp de 3' UTR, y finalmente un sitio de clonación Sall.
Los oligonucleótidos para cada dominio se diseñaron para incluir sitios EcoR1 y Sall en los extremos 5' y 3', flanqueando los sitios de clonación únicos descritos anteriormente. Después, los oligos hibridados quinasados fueron ligados en un vector de subclonación pUC 19 EcoRl/Sall (Figura 3). Después de la transformación en células competentes HB101 (comercialmente disponibles), análisis minipantalla y verificación de secuencias, los clones con la secuencia correcta se identificaron como sigue y se amplificaron:
pUC19.NV.5p #4
pUC19.NV.mid #11 and #13
pUC19.NV.3p #22
pUC19.NV.orf3 #31
Para ensamblar el NV.orf2 de longitud completa como un fragmento Hindlll/Sall, se realizaron una serie de digestiones: pUC19.NV.5p #13 se digirió con Hindlll y Xbal para aislar un fragmento de 478 bp; pUC19.NV.mid #13 se digirió con Xbal y Pcil para aislar un fragmento de 393 bp; pUC19.NV.mid #11 se digirió con Pcil y Asel para aislar un fragmento de 133 bp; y pUC19.NV.3p #22 se digirió con Asel y Sall para aislar un fragmento de 609 bp. Los cuatro fragmentos se purificaron en gel y se ligaron en el vector pSP72 Hindlll/Sall, para crear un inserto Hindlll-Sall de 1613 bp para la secuencia de codificación de NV.orf2 (Figuras 3 y 4).
La secuencia de codificación NV.orf2+3 de longitud completa se ensambló ligando los fragmentos HindIII/XbaI, XbaI/PciI, y PciI/AseI (descritos anteriormente) con un fragmento purificado en gel de 595 bp obtenido de digerir pUC19.NV.3p #22 con AseI y BspE1, y un fragmento BspEl/Sall purificado en gel de 715 bp, obtenido de pUC19.NV.orf3 #31, en el vector pSP72Hindlll/Sall (Figura 5). Después de la transformación en HB101 y análisis minipantalla, se obtuvieron los subclones de longitud completa pSP72.NV.orf2 #1 y pSP72.NV.orf2+3 #16. El
fragmento HindIII/SalI NV.orf2 de 1613 bp y el fragmento NV.orf2+3 de 2314 bp fueron aislados en gel y purificados después de la digestión de restricción de los subclones pSP72 respectivos. Cada fragmento Hinflll-Sall se ligó con un promotor híbrido de levadura BamHI/HindIII ADH2/GAPDH de 1366 bp en el vector de expresión de levadura pBS24.1 BamHI/SalI, conteniendo los elementos descritos anteriormente. Después de la transformación de HB101 y el análisis minipantalla, se identificaron y amplificaron los siguientes plásmidos de expresión de levadura: pd.NV.orf2 #1 y pd.NV.orf2+3 #12 (Figuras 6 y 7).
La cepa AD3 de S.cerevisiae [mat , leu2 , trp1, ura3-52, prb-1122, pep4-3, prc1-407, cir°, trp+, ::DM15[GAP/ADR] se transformó con los plásmidos de expresión pd.NV.orf2 #1 y pd.NV.orf2+3 #12 usando el protocolo de acetato de litio (Invitrogen EasyComp). Después de la transformación, varios transformantes Ura se sembraron en placas de glucosa al 8% Ura para obtener colonias individuales. Las colonias individuales fueron posteriormente parcheadas en placas de glucosa al 8% Leu para aumentar el número de copias de plásmidos. Los cultivos iniciadores Leu se cultivaron durante 24 horas a 30º C y después se diluyeron a 1:20 en medio YEPD (extracto de levadura bactopeptona 2% de glucosa): Las células se cultivaron durante 48 horas a 30º C para permitir la disminución de la glucosa en el medio y después se recogieron. Después las alícuotas de las células de levadura se lisaron con cuentas de cristal en tampón de lisis (10mM de NaP04 pH7.5 0.1% Triton X-100). Los lisados fueron aclarados por centrifugación en 4º de microfuga. Las proteínas recombinantes fueron detectas en el lisado aclarado con cuentas de cristal usando el Inmunoensayo de Norovirus RIDASCREEN disponible comercialmente (SciMedx Corporation) (Figura 8). Los lisados fueron sometidos a sedimentación por gradiente de sacarosa, y las fracciones fueron analizadas usando el kit de Norovirus para determinar si la expresión de la proteína de la cápside en S.cerivisiae resultó en el auto-ensamblaje de partículas similares a virus vacías de NV recombinantes. Los resultados preliminares de microscopía electrónica indicaron la formación de partículas similares a virus en las fracciones de los picos de los gradientes de sacarosa (Figura 9).
Ejemplo 2
Expresión de Proteína de la Cápside del Virus Norwalk en Células de Insectos
Para la expresión de orf2 de la cápside NV y prf2+3 de la cápside de NV en el sistema celular de insecto, se realizaron las siguientes manipulaciones para crear un fragmento Nhel/Sall que podría se clonado en el vector de expresión de baculovirus PBLUEBAC4.5. Primero, el extremo 5' de los fragmentos Hindlll/Sall de orf2 y orf2+3 se modificaron para reemplazar el sitio de restricción Hindlll con un sitio de restricción Nhel. Esto se consiguió con un oligo sintético de 63 bp que incluía el sitio Nhel en el comienzo, una secuencia que codificaba los aminoácidos 1-21 de la proteína de la cápside, y un sitio Kpnl en el extremo. Después, se aislaron un fragmento KpnI/SalI NV.orf2 de 1534 bp y un fragmento KpnI/SalI NV.orf2+3 de 2235 bp digiriendo pSP72.NV.orf2 #1 y pSP72.NV.orf2+3 #16, respectivamente, con Kpnl y Sall seguido por separación electroforética en gel y purificación de las bandas aisladas. Los oligos NheI/KpnI y los fragmentos KpnI/SalI se ligaron en el vector lanzadera PCET906A (ML Labs). El HB101 competente se transformó con la mezcla de ligación y se puso en placas de Luria-ampicilina. Después de análisis de minipreparación, identificación de los clones deseados, y confirmación de las secuencias, se amplificaron los plásmidos pCET906A.TPAL.orf2 #21 y pCET906A.TPAL.orf2+3 #34 (Figura 10).
Después se digirieron pCET906A.TPAL.orf2 #21 and pCET906A.TPAL.orf2+3 #34 con Nhel y Sall para aislar en gel un fragmento de 1602 bp que codifica para NV.orf2 y un fragmento de 2303 bp que codifica para NV.orf2+3, respectivamente. Cada uno de los fragmentos Nhel/Sall de orf2 y orf2+3 se ligó en el vector de expresión de células de insecto Nhel/Sall PBLUEBAC4.5 (Invitrogen), crenado los plásmidos PBLUEBAC4.5.NV.orf2 #2 y PBLUEBAC4.5.NV.orf2+3 #12 (Figura 11).
Las secuencias que codifican NV.orf2 o orf2+3 fueron recombinadas en el baculovirus Autographa californica (AC-NPV) a través del vector de transferencia PBLUEBAC4.5 con-trasnfectando 2µg de vector de transferencia con 0,5 µg de ADN viral del tipo salvaje linealizado en células SF9 como se ha descrito (Kitts y otros, 1991). El baculovirus recombinante se aisló por purificación en placa (Smith y otros, 1983). Los cultivos en suspensión de 1,5x106 células SF9 por ml se recolectaron 48 horas después de la infección con el baculovirus relevante a una multiplicidad de infección (moi) de 2-10 en medio libre de suero (Maiorella y otros, 1988). Las proteínas recombinantes fueron detectadas en el medio usando el inmunoensayo de Norovirus RIDASCREEN comercialmente disponible (SciMedx Corporation) (Figura 12). Las VLPs fueron purificadas del medio por sedimentación por gradiente de sacarosa (ver por ejemplo, Kirnbauer y otros, J. Virol. (1993) 67:6929-6936), y la presencia de VLPs en las fracciones de los picos se confirmó por microscopía electrónica (Figura 13).
Ejemplo 3
Producción de una Proteína de Fusión Múltiple
Se aísla de un Norovirus un polinucleótido que codifica una fusión Nterm-NTPasa, comprendiendo aproximadamente los aminoácidos 1 a 696, numerados en relación al Norovirus MD145-12 (SEQ ID NO:13). Este constructo se fusiona con un polinucleótido que codifica un polipéptido de polimerasa que incluye aproximadamente los aminoácidos 1190-1699 de la poliproteína numerada en relación al Norovirus MD145-12. La secuencia de
polinucleótidos que codifica la polimerasa se fusiona secuencia abajo desde la porción que codifica Nterm-NTPasa del constructo de tal forma que la proteína de fusión resultante incluye el polipéptido de polimerasa en su término C. El constructo es clonado en vectores de plásmido, virus vaccinia, adenovirus, alfavirus, y levadura. Adicionalmente, el constructo es insertado en un vector de expresión recombinante y usado para transformar células huésped para producir la proteína de fusión Nterm-NTPasa-Pol.
Ejemplo 4
Activación de Células T CD8+
Ensayo de Liberación de 51Cr. Se usa un ensayo de liberación 51Cr para medir la capacidad de las células T de lisar células objetivo que muestran un epítopo de Norovirus o Sapovirus. Se agruparon las células del bazo de los animales inmunizados. Estas células se estimulan in vitro durante 6 días con un Péptido epitópico de CTL, derivado de un Norovirus o Sapovirus, en presencia de IL-2. Las células del bazo se ensayaron para determinar la actividad citotóxica en un ensayo de liberación de 51Cr estándar contra células objetivo sensibilizadas con péptidos (L929) que expresan moléculas MHC de la clase I, pero no de la clase II, como se describe en Weiss (1980) J. Biol. Chem. 255:9912-9917. Se probaron las proporciones de efector (células T) a objetivo (células B) de 60:1, 20:1 y 7:1. El porcentaje de lisis específico se calcula para cada proporción de efector a objetivo.
Ejemplo 5
Activación de Células T CD8+ Específicas de Norovirus y Sapovirus que Expresan IFN-
Tinción intracelular para interferón-gamma (IFN-). La tinción intracelular para interferón-gamma (IFN- ) se usa para identificar las células T CD8+ que secretan IFN- después de estimulación in vitro con un antígeno de Norovirus y/o Sapovirus. Las células del bazo de animales inmunizados individuales son re-estimuladas in vitro o con una composición inmunogénica descrita en la presente o con un péptido no específico durante 6-12 horas en presencia de IL-2 y monensina. Las células son entonces teñidas para las CD8 de superficie y para IFN- intracelular y analizadas por citometría de flujo. Se calcula entonces el porcentaje de células T CD8+ que son positivas para IFN
.
Ejemplo 6
Proliferación de Células T CD4+ Específicas de Norovirus y Sapovirus
Ensayo de linfoproliferación. Las células del bazo de los animales inmunizados se vaciaron de células T CD8+ usando cuentas magnéticas y se cultivaron por triplicado con o una composición inmunogénica descrita en la presente, o sólo en medio. Después de 72 horas, las células se pulsaron con 1 µCi por pocillo de 3H-timidina y se recolectaron 6-8 horas después. La incorporación de radioactividad se midió después de la recolección. se calculó el cpm medio.
Ejemplo 7
Capacidad de VP1-VP2 que codifican Formulaciones de Vacunas de ADN para cebar CLTs
Los animales se inmunizan con 10-250 µg de ADN plásmido que codifica VP1 y VP2 como se describe en el ejemplo 1 y ADN plásmido que codifica la proteína de fusión Nterm-NTPasa-Pol como se describe en el Ejemplo
3. El ADN es administrado o usando ADN PLG-ligado (ver a continuación), o por electroporación (ver por ejemplo, publicación Internacional Nº WO/0045823 para esta técnica de administración). Las inmunizaciones son seguidas por una inyección de refuerzo 6 semanas después de ADN plásmido que codifica Nterm-NTPasa-Pol y ADN plásmido que codifica VP1 y VP2.
ADN administrado por PLG. Los polímeros de polilactida-co-glicolida (PLG) se obtienen de Boehringer Ingelheim, U.S.A. El polímero de PLG es RG505, que tiene una proporción de copolímero de 50/50 y un peso molecular de 65 kDa (datos del fabricante). Se preparan micropartículas catiónicas con ADN adsorbido usando un proceso de evaporación de solvente modificado, esencialmente como se describe en Singh y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2000) 97:811-816. Brevemente, las micropartículas se preparan emulsificando 10 ml de una solución de polímero al 5% p/v en cloruro de metileno con 1 ml de PBS a alta velocidad usando un homogeneizador IKA. La emulsión primaria es entonces añadida a 50 ml de agua destilada que contiene bromuro de cetil trimetil amonio (CTAB) (0,5% p/v). Esto resulta en la formación de una emulsión p/o/p que se agita a 6000 rpm durante 12 horas a temperatura ambiente, permitiendo que el cloruro de metileno se evapore. Las micropartículas resultantes se lavan dos veces en agua destilada por centrifugación a 10.000 g y se secan por congelación. Después de la preparación, el lavado y la recogida, el ADN es adsorbido en micropartículas incubando 100 mg de micropartículas catiónicas en una solución de 1 mg/ml de ADN a 4º C durante 6 horas. Las micropartículas son entonces separadas por centrifugación, el sedimento lavado con tampón TE y las micropartículas se secan por congelación.
La actividad de CTL y la expresión de IFN- se mide por ensayo de liberación de 51CR o tinción intracelular como se describe en los ejemplos anteriores.
Ejemplo 8
Rutas de Inmunización y las partículas de replicón SINCR (DC+) de codificación para VP1 y VP2
Las partículas de replicones de alfavirus, por ejemplo SINCR (DC+) se preparan como se describe en Polo y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1999) 96:4598-4603. Los animales se inyectan con 5x106 IU de partículas de replicones SINCR (DC+) que codifican VP1 y VP2 de Norovirus intramuscularmente (IM), o subcutáneamente (S/C) en la base de la cola (BoT) y la almohadilla de la pata (FP), o con una combinación de 2/3 del ADN administrado por administración IM y 1/3 por una vía BoT. Las inmunizaciones se siguen con una inyección de refuerzo de virus vaccinia que codifica VP1. La expresión de IFN- se mide por tinción intracelular como se describe en el Ejemplo 5.
Ejemplo 9
Cebado de Replicones de Alfavirus, Seguido por Varios Regímenes de Refuerzo
Se prepararon partículas de replicones de alfavirus, por ejemplo SINCR (DC+) como se describe en Polo y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1999) 96:4598-4603. Los animales se estimulan con SINCR (DC+), 1,5x106 IU de partículas de replicones que codifican VP1 y VP2 de Norovirus, por inyección intramuscular en el tibial anterior, seguido por un refuerzo de o 10-100 µg de ADN plásmido que codifica para VP1, 1010 partículas de adenovirus que codifican VP1 y VP2, 1,5x106 IU de partículas de replicones SINCR (DC+) que codifican VP1 y VP2, o 107 pfu de virus de vaccinia que codifica VP1 al de 6 semanas. La expresión de IFN
se mide por tinción intracelular como se describe en el Ejemplo 5.
Ejemplo 10
Alfavirus que Expresan VP1 y VP2
Se prepararon partículas de replicones de alfavirus, por ejemplo SINCR (DC+) y SINCR (LP) como se describe en Polo y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1999) 96:4598-4603. Los animales se inmunizan con 1x102 a 1x106 IU de replicones SINCR (DC+) que codifican VP1 y VP2 a través de una combinación de vías de administración (2/3 IM y 1/3 S/C) así como por S/C solamente, o con 1x102 a 1x106 IU de partículas de replicones SINCR (LP) que codifican VP1 y VP2 a través de una combinación de vías de administración (2/3 IM y 1/3 S/C) así como por S/C solamente. Las inmunizaciones son seguidas por una inyección de refuerzo de 107 pfu de virus vaccinia que codifica VP1 al de 6 semanas. La expresión de IFN
se mide por tinción intracelular como se describe en el Ejemplo 5.
Ejemplo 11
Inmunización con Combinaciones de Antígenos de Norovirus y Adyuvantes
El siguiente ejemplo ilustra la inmunización con varias combinaciones de antígenos de NV, SMV y HV en un modelo de ratón. Los antígenos de NV, SMV y HV se preparan y caracterizan como se describe en la presente. Los ratones CD1 se dividen en nueve grupos y se inmunizan de la manera siguiente:
Tabla 3: Programa de vacunación
Grupo
Composiciones de Inmunización Vía de Adminsitración
1
Mezcla de antígenos de NV, SMV, HV (5 µg/cada uno) + CFA Intra-peritoneal o intra-nasal o mucosal (oral) seguido por parenteral (admin. intra-muscular)
2
Mezcla de antígenos de NV, SMV, HV (5 µg/cada uno) + AIOH (200µg) Intra-peritoneal o intra-nasal o mucosal (oral) seguido por parenteral (admin. intra-muscular)
3
Mezcla de antígenos de NV, SMV, HV (5 µg/cada uno) + CpG (10µg) Intra-peritoneal o intra-nasal o mucosal (oral) seguido por parenteral (admin. intra-muscular)
4
Mezcla de antígenos de NV, SMV, HV (5 µg/cada uno) + AIOH (200µg) + CpG (10µg) Intra-peritoneal o intra-nasal o mucosal (oral) seguido por parenteral (admin. intra-muscular)
5
Adyuvante completo de Freund (CFA) Intra-peritoneal o intra-nasal o mucosal (oral) seguido por parenteral (admin. intra-muscular)
6
Mezcla of NV, SMV, HV (5 µg/cada uno) + LTKb3 (5µg) Intra-peritoneal o intra-nasal o mucosal (oral) seguido por parenteral (admin. intra-muscular)
7
AIOH (200µg) + CpG (10µg) Intra-peritoneal o intra-nasal o mucosal (oral) seguido por parenteral (admin. intra-muscular)
8
CpG (10µg) Intra-peritoneal o intra-nasal o mucosal (oral) seguido por parenteral (admin. intra-muscular)
9
LTK63 (5µg) Intra-peritoneal o intra-nasal o mucosal (oral) seguido por parenteral (admin. intra-muscular)
Los ratones son inmunizados en intervalos de dos semanas. Dos semanas después de la última inmunización, todos los ratones se expusieron con la cepa apropiada. Cuando se usa inmunización mucosal (por ejemplo, intra-nasal(in)), el modelo animal también se expone mucosalmente a la prueba del efecto protector del inmunógeno mucosal.
35 Listado de Secuencias
LISTADO DE SECUENCIAS
<110> Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc.
<120> NOROVIRUS AND SAPOVIRUS ANTIGENS
<130> P055109EP 45
<140> EP
<141> 2006-11-22
<150> 60/739,217
<151> 2005-11-22
<160> 27
<170> PatentIn version 3.5 55 <210> 1
<211> 1608
<212> DNA
<213> Norwalk virus
<400> 1
55 <210> 2
<211> 2319
<212> DNA
<213> Norwalk virus
<400> 2
25
<210> 3
<211> 530
<212> PRT
<213> Norwalk virus
<400> 3
35
45
55
<210> 4
<211> 212
<212> PRT
<213> Norwalk virus
<400> 4
35
<210> 5 <211> 542 <212> PRT <213> Snow Mountain virus <300> <308> GenBank/U70059 <309> 2000-10-02 <313> (1)..(542) <400> 5
45
55
<210> 6
<211> 542
<212> PRT 35 <213> snow Mountain virus
<300>
<308> GenBank/AY134748
<309> 2004-07-01
<313> (1)..(542)
<400> 6
<210> 7
<211> 259
<212> PRT
<213> Snow Mountain virus
<300>
<308> GenBank/AY134748
<309> 2004-07-01 55 <313> (1)..(259)
<400> 7
<210> 8
<211> 535
<212> PRT
<213> Hawaii virus 5
<300>
<308> GenBank/U07611
<309> 2000-09-05
<313> (1)..(535)
<400> 8
<211> 259
<212> PRT
<213> Hawaii virus
65 <300>
<308> GenBank/U07611
<309> 2000-09-05
<313> (1)..(259)
<400> 9
<210> 10
<211> 849
<212> PRT
<213> London/29845 Sapovirus
<300>
<308> GenBank/U95645
<309> 2005-07-12
<313> (1)..(849)
<400> 10
35
<210> 11 <211> 853 <212> PRT <213> Houston/86 Sapovirus <300> <308> GenBank/U95643 <309> 2005-07-12 <313> (1)..(853) <400> 11
45
55
<210> 12
<211> 856
<212> PRT 55 <213> Parkville virus
<300>
<308> GenBank/AF294739
<309> 2000-08-20
<313> (1)..(856)
<400> 12
5 15
<210> 13 <211> 7556 <212> DNA <213> Norovirus MD145-12 <300> <308> GenBank/AY032605 <309> 2002-01-29 <313> (1)..(7556) <400> 13
25
35
45
55
<210> 14
<211> 1699
<212> PRT
<213> Norovirus MD145-12
<300>
<308> GenBank/AAK50354
<309> 2002-01-29
<313> (1)..(1699)
<400> 14
<210> 15
<211> 1789
<212> PRT
<213> Norwalk virus
<300>
<308> GenBank/M87661
<309> 1997-03-26
<313> (1)..(1789)
<400> 15
<210> 16
<211> 1699
<212> PRT
<213> snow Mountain virus
<300>
<308> GenBank/AY134748
<309> 2004-07-01
<313> (1)..(1699)
<400> 16
<210> 17
<211> 1699
<212> PRT
<213> Hawaii virus
<300>
<308> GenBank/U07611
<309> 2000-09-05
<313> (1)..(1699)
<400> 17
<210> 18
<211> 7458
<212> DNA
<213> Sapovirus Mc10
<300>
<308> GenBank/AY237420
<309> 2005-06-06
<313> (1)..(7458)
<400> 18
<210> 19
<211> 2278
<212> PRT
<213> Sapovirus Mc10
<300>
<308> GenBank/AY237420
<309> 2005-06-06
<313> (1)..(2278)
<400> 19
<210> 20
<211> 2294
<212> DNA
<213> Norwalk virus
<400> 20
<210> 21
<211> 539
<212> PRT
<213> Norovirus
<400> 21
<210> 22
<211> 268
<212> PRT
<213> Norovirus
<400> 22
<210> 23
<211> 8
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Péptido sintético
<400> 23
<210> 24
<211> 8
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Péptido sintético
<400> 24
<210> 25
<211> 8
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Péptido sintético
<400> 25
<210> 26
<211> 9
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Péptido sintético
<400> 26
<210> 27
<211> 10
<212> DNA
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Oligonucleótido sintético
<400> 27 acaaaacaaa 10

Claims (13)

  1. Reivindicaciones
    1. Un método para producir partículas similares a virus (VLPs), el método comprende:
    a) transformar una célula de levadura con un vector de expresión que comprende un polinucleótido recombinante ligado operativamente a un promotor híbrido ADH2/GAPDH en donde el polinucleótido es seleccionado del grupo consistente de:
    i) un polinucleótido que comprende la secuencia de la SEQ ID NO:1; ii) un polinucleótido que comprende la secuencia de la SEQ ID NO:2; y iii) un polinucleótido que muestra al menos un 80-100% de identidad de secuencia con las secuencias de la SEQ ID NO:1 o la SEQ ID NO:2
    b) cultivar la célula huésped transformada bajo condiciones por las que las proteínas de la cápside se expresan y ensamblan en VLPs.
  2. 2.
    El método de la reivindicación 1, en donde uno o más de los vectores de expresión comprenden secuencias que codifican proteínas de la cápside de más de un aislado de Norovirus o Sapovirus.
  3. 3.
    El método de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, que comprende además transformar la mencionada célula huésped con una o más secuencias que codifican una proteína estructural de un Norovirus o Sapovirus.
  4. 4.
    El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde el mencionado vector de expresión comprende uno o más de las secuencias de codificación de ORF1-y/o ORF3-de un Norovirus o Sapovirus.
  5. 5.
    El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que comprende además transformar una célula huésped con un vector de expresión que comprende una secuencia que codifica un adyuvante.
  6. 6.
    El método de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la célula de levadura es Saccharomyces cerevisiae.
  7. 7.
    El método de cualquiera de las reivindicaciones anteriores en donde el polinucleótido recombinante comprende además una secuencia que codifica un adyuvante.
  8. 8.
    El método de cualquiera de las reivindicaciones anteriores en donde el adyuvante es un mutante desintoxicado de una toxina lábil al calor (LT) de E. coli seleccionada del grupo consistente de LT-K63 y LT-R72.
  9. 9.
    El método de la reivindicación 8 en donde el polinucleótido recombinante es seleccionado del grupo consistente de:
    a) un polinucleótido que comprende la SEQ ID NO:1; b) un polinucleótido que comprende una secuencia al menos 90% idéntica a la SEQ ID NO:1 que es capaz
    de producir partículas similares a virus; c) un polinucleótido que comprende la SEQ ID NO:2; d) un polinucleótido que comprende una secuencia al menos 90% idéntica a la SEQ ID NO:2 que es capaz
    de producir partículas similares a virus; e) un polinucleótido que codifica un polipéptido que comprende al secuencia de la SEQ ID NO:3; f) un polinucleótido que codifica un polipéptido que comprende una secuencia al menos 90% idéntica a la
    secuencia de la SEQ ID NO:3 que es capaz de provocar una respuesta inmune contra la proteína de la
    cápside principal del virus Norwalk; g) un polinucleótido que codifica un polipéptido que comprende la secuencia de la SEQ ID NO:4; h) un polinucleótido que codifica un polipéptido que comprende una secuencia al menos 90% idéntica a la
    secuencia de la SEQ ID NO:4 que es capaz de provocar una respuesta inmune contra la proteína de la cápside principal del virus Norwalk; i) un polinucleótido que codifica un polipéptido que comprende al menos una secuencia seleccionada del grupo consistente de las SEQ ID NOS: 3-4;
    j) un polinucleótido que codifica un polipéptido que comprende una secuencia al menos 90% idéntica a la secuencia seleccionada del grupo consistente de las SEQ ID NO:3-4 que es capaz de provocar una respuesta inmune contra un Norovirus o un Sapovirus; y
    k) un polinucleótido que codifica un fragmento de un polipéptido de i) que es capaz de provocar una respuesta inmune contra un Norovirus o un Sapovirus.
  10. 10.
    El método de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde se ensambla una VLP mosaico que comprende proteínas de la cápside de al menos dos cepas virales de Norovirus.
  11. 11.
    El método de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el vector de expresión es un vector alfavirus.
  12. 12.
    El método de cualquiera de las reivindicaciones anteriores en donde el polinucleótido recombinante comprende además un terminador del factor alfa.
  13. 13.
    El método de cualquiera de las reivindicaciones anteriores que comprende un paso de purificar la VLP.
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