BRPI0720371A2 - Biomarcadores de câncer. - Google Patents

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "BIOMARCA- DORES DE CÂNCER".

A presente invenção refere-se ao uso de um fator de transcrição contendo ao menos um homeodomínio, tais como peptídeo HOX ou peptí- deo EN-2, como biomarcador para câncer de próstata.

Câncer de próstata é atualmente a principal causa de óbito por câncer em homens, matando 10.000 homens a cada ano somente no Reino Unido. No entanto, a disponibilidade atual de biomarcadores para a detecção não invasiva de câncer de próstata limita-se essencialmente ao Antígeno Prostático Específico (PSA). Níveis séricos de PSA estão significativamente elevados em pacientes com câncer de próstata, e o teste do PSA é utilizado atualmente para acompanhar a evolução da doença e sua resposta ao tra- tamento.

Infelizmente, há algumas desvantagens significativas com o tes- te do PSA. Como níveis de PSA estão também significativamente elevados em outras condições não cancerosas da próstata, como na prostatite e hi- pertrofia benigna, nem sempre é certo que a detecção de níveis aumentados de PSA seja efetivamente indicativa de câncer de próstata em um paciente. Além disso, níveis de PSA não se correlacionam necessariamente com o volume da doença ou ao desenvolvimento de metástase nodular ou óssea.

Tentativas recentes para utilizar indícios como a razão entre PSA livre e o total e a "velocidade do PSA" provaram ser, em grande parte, mal-sucedidas em decorrência ao nível muito alto de falsos positivos, resul- tando em grande número de biopsias invasivas desnecessárias. De fato, acredita-se que os níveis do PSA elevem-se somente

muito lentamente no câncer de próstata, de modo que a doença está fre- qüentemente em fase bem avançada quando um resultado positivo é obtido ao serem medidos níveis de PSA. Ademais, níveis de PSA requerem norma- lização uma vez que podem variar em função da idade e tamanho da prósta- ta.

Existem também alguns possíveis marcadores químicos adicio- nais de câncer de próstata, incluindo as calicreínas e, mais recentemente, fragmentos de 80 kDa da e-cadherina (Kuefer et al., 2005). Novamente, es- ses biomarcadores tendem a exibirem muitas das desvantagens importantes discutidas acima em relação ao PSA.

Dessa forma, há necessidade na técnica por um biomarcador confiável de câncer de próstata.

Surpreendentemente, os requerentes constataram que um fator de transcrição homeótico, HOXC4, é secretado por tumores da próstata e que sua concentração sérica está significativamente elevada em pacientes com câncer de próstata. Portanto, a presença de HOXC4 em líquidos do corpo, como o soro, é um indicador útil de câncer de próstata tanto em está- gio precoce como em tardio.

Os requerentes constataram também que uma segunda proteína HOX, HOXB6, e uma terceira proteína HOXB5 exibem também resultados semelhantes. HOXA3 e HOXD9 são também consideradas úteis como bio- marcadores.

Os requerentes identificaram ãíhda que o fator de transcrição, contendo o homeodomínio Engrailed 2 (EN-2) é expresso, em nível do RNA e protéico, na linhagem de células derivadas de câncer de próstata LNCaP e PC3, e também em células primárias de câncer de próstata. Além disso, a proteína EN-2 pode ser secretada no meio circundante das células.

Surpreendentemente, níveis aumentados de todos estes marca- dores de câncer podiam ser detectados também em pacientes de câncer de próstata, mesmo quando os níveis encontrados do PSA são normais. Esse dado ilustra ainda mais que os marcadores da presente invenção são mais confiáveis no diagnóstico de câncer de próstata quando comparados a ou- tros marcadores, tais como PSA.

Portanto, em uma primeira característica, a presente invenção provê o uso de um fator de transcrição contendo ao menos um homeodomí- nio, ou um fragmento deste, como biomarcador para câncer de próstata. E- xemplos de fatores de transcrição contendo homeodomínio incluem os pep- tídeos HOX e EN-2. A invenção refere-se também a um método para diag- nóstico da doença câncer de próstata, compreendendo a detecção de um fator de transcrição contendo ao menos um homeodomínio em amostra pro- veniente de um paciente.

É especialmente preferido que o, ao menos único, peptídeo HOX ou EN-2, ou fragmento destes, possa ser detectado em um líquido corporal.

De preferência, o biomarcador é apenas H0XC4. É também pre-

ferido que o biomarcador seja apenas H0XB5 ou, mais preferivelmente, a- penas H0XB6. É também preferido que o biomarcador seja apenas EN-2. É também preferido que o biomarcador seja apenas H0XA3. É também prefe- rido que o biomarcador seja apenas H0XD9. No entanto, combinações são também preferidas. Estas combinações incluem H0XC4 e H0XB5; H0XC4 e H0XB6; H0XB5 e H0XB6; H0XC4, H0XB5 e H0XB6; EN-2 e H0XC4; EN-2 e H0XB5; EN-2 e H0XB6; EN-2, H0XC4 e H0XB5; EN-2, H0XC4 e HOXB6; EN-2, H0XB5 e H0XB6; EN-2, H0XC4, H0XB5 e H0XB6. Estas combinações podem compreender ainda um ou ambos entre HOXA3 e/ou HOXD9. Combinações adicionais incluem HOXA3 e H0XD9; HOXA3 e HOXC4; H0XA3 e H0XB5; H0XA3 e H0XB6; HOXA3 e EN-2; HOXD9 e H0XC4; HOXD9 e H0XB5; H0XD9 e H0XB6; H0XD9 e EN-2. Uma combi- nação especialmente preferida de marcadores compreende um ou mais, de preferência, todos, entre H0XC4, H0XB5, H0XB6 e EN-2. De preferência, o líquido corporal é o soro ou urina. Outros líqui-

dos corporais preferidos são discutidos abaixo.

Os genes HOX constituem uma família de fatores de transcrição contendo homeodomínio que determina a identidade de células e tecidos durante a fase inicial de desenvolvimento (revisado por Morgan, 2006). Pu- blicações recentes, incluindo por Miller et al 2003, identificaram efetivamente cada proteína isolada que é expressa, e retida no meio intracelular, em célu- la tumoral do câncer de próstata. Evidentemente, isso seguida que um total em torno de 10.000 a 12.000 proteínas, incluindo os peptídeos HOX, foram identificadas.

No entanto, os requerentes descobriram surpreendentemente

que, dentre esses milhares de proteínas expressas em células do câncer de próstata, a proteína HOXC4, por exemplo, é encontrada em meio extracelu- lar e é um excelente biomarcador para câncer de próstata.

Esse dado é surpreendente por alguns motivos. Em primeiro lugar, HOXC4 é um fator de transcrição e, por conseguinte, não seria espe- rado que fosse encontrado no soro. Em segundo lugar, embora outros bio- marcadores para câncer de próstata sejam conhecidos, a descoberta de um biomarcador confiável permanece imprecisa, vide, por exemplo, as questões descritas acima em relação ao PSA. De fato, HOXC4 é um biomarcador de estágio inicial e, especialmente, de estágio tardio, conforme apresentado na Figura 1.

Desse modo, esta proteína não foi identificada antes como bio-

marcador para câncer de próstata, embora se saiba que esteja expressa em células de câncer de próstata, juntamente com milhares de outras proteínas, muitas das quais não poderiam ser descritas como biomarcadores para cân- cer de próstata. O mesmo se aplica também a outros peptídeos HOX, inclu- indo HOXB5 e HOXB6.

Da mesma forma que os peptídeos HOX, as proteínas Engrailed (En) são também fatores de transcrição contendo homeodomínio que exi- bem grau muito alto de conservação funcional durante o desenvolvimento (revisado por Morgan, 2006). O gene En original foi caracterizado em drosó- fila, onde o En mutante não consegue formar uma borda entre a asa anterior e a posterior (Garcia-Bellido e Santamaria, 1972). Homólogos vertebrados de En desempenham da mesma forma papéis reguladores durante o desen- volvimento, os quais incluem desenvolvimento de membros e a especifica- ção inicial e migrações axonais subseqüentes do sistema nervoso (Morgan 2006).

Além de regulação da transcrição, as proteínas EN exibem al- gumas outras propriedades, aparentemente não relacionadas, que são fun- cionalmente importantes. A primeira destas é a capacidade de serem secre- tadas de células e de serem internalizadas por outras (Cosgaya et al., 1998; Joliot et al., 1998, revisado por Morgan, 2006). O mecanismo básico exato para esse fenômeno é desconhecido, embora esteja claro que dependa de uma seqüência conservada de exportação nuclear, localizada no homeodo- mínio (Maizel et ai, 1999; Chatelin et ai, 1996; Derossi et ai, 1996; Joliot et ai, 1997).

Além de seu papel no desenvolvimento, recentemente EN-2 de- monstrou ser um possível oncogene em câncer de mama (Martin et ai, 2005). Linhagens de células mamárias murinas não tumorogênicas forçadas a expressarem EN-2, exibem subseqüentemente algumas características malignas, incluindo encurtamento do ciclo celular e perda do contato célula a célula. Ademais, o silenciamento de EN-2 pelo RNAi indica que este é ne- cessário para a manutenção do fenótipo transformado em uma linhagem de células de câncer de mama.

Os requerentes descobriram que EN-2 é superexpressado e se- cretado da linhagem de células LNCaP derivadas de câncer de próstata e em amostras de tecido humano de adenocarcinoma prostático. Além disso, EN-2 é secretado de células ductais e tumores do tipo adenocarcinoma, e está presente na urina de pacientes com câncer de próstata. Esta é a primei- ra vez que EN-2 foi sugerido como marcador de câncer de próstata.

De preferência, é detectada a presença ou ausência do fator de transcrição contendo pelo menos um homeodomínio, como peptídeo HOX ou peptídeo EN-2, ou fragmento destes. De preferência, pelo menos único peptídeo HOX é selecionado

entre qualquer peptídeo HOX, conforme listados abaixo, desde que o peptí- deo HOX, ou fragmento deste, possa ser detectado em um líquido corporal, como soro ou urina.

De preferência, pelo menos único peptídeo HOX, ou fragmento deste, pertence à subfamília HOXA, a HOXB, a HOXC ou a HOXD. Se mais de um peptídeo HOX for utilizado, nesse caso, estes poderão ser da mesma família ou de uma combinação de família. Combinações de fragmentos são também contemplados, quer fragmentos da mesma proteína ou fragmentos de proteínas diferentes. Combinações de peptídeos diferentes podem forne- cer diagnósticos mais acurados. É preferível que o peptídeo HOX não seja H0XA4, H0XA1, H0XA7, H0XB3 ou H0XB9.

É especialmente preferido que o peptídeo HOX seja o peptídeo H0XC4 e/ou o peptídeo HOXB6 e/ou o peptídeo HOXB5 e/ou o peptídeo HOXA3 e/ou o peptídeo HOXD9 ou fragmentos destes.

De preferência, o peptídeo HOXC4 é aquele fornecido na Se- qüência ID NO. 1 (N0. de acesso NCBI P09017, gi: 123279), ou um fragmen- to deste. De preferência, o peptídeo HOXB6 é aquele fornecido na Seqüên- cia ID NO. 2 (N0. de acesso NCBI P17509, gi:116242515), ou um fragmento deste. De preferência, o peptídeo HOXB5 é aquele fornecido na Seqüência ID NO. 3 (N0. de acesso NCBI P09067, gi:400000), ou um fragmento deste. De preferência, o peptídeo EN-2 é aquele fornecido na Seqüência ID NO. 4 (N0. de acesso NCBI P19622, gi:21903415) ou um fragmento deste. De pre- ferência, o peptídeo HOXA3 é aquele fornecido na Seqüência ID NO.5 (N0. de acesso NCBI do mRNA NM_030661, gi: 84043946), ou um fragmento deste. De preferência, o peptídeo HOXD9 é aquele fornecido na Seqüência ID NO. 6 (N0. de acesso NCBI do mRNA NM_014213, gi: 23397673), ou um fragmento deste.

Embora seja feita referência a HOXC4, o peptídeo HOXC4 ou a um fragmento deste, será entendido que esses termos podem ser utilizados alternadamente, a não ser se evidente de outra forma. O mesmo segue para outros peptídeos HOX e EN-2. Além disso, onde for feita referência, nesta exposição, a HOXC4,

HOXB6, HOXB5, HOXA3 ou HOXD9, esta se aplica também a outros peptí- deos HOX, ou combinações destes, a não ser se evidente de outra forma.

Igualmente, onde for feita referência, nesta exposição, a uma seqüência em particular, tal como uma seqüência de referência ou uma Se- quência ID NO, esta se aplica a todas as Seqüências ID NOs. e a quaisquer das seqüências fornecidas abaixo, a não ser se evidente de outra forma.

De preferência, o fragmento compreende pelo menos 80% de homologia de seqüência à seqüência de referência (por exemplo, HOXC4, HOXB6, HOXB5, HOXA3, HOXD9 ou EN-2), mais preferivelmente 85%, mais preferivelmente 90%, mais preferivelmente 95%, mais preferivelmente 97%, mais preferivelmente 99% e, o mais preferível, 99,9% de homologia de seqüência à seqüência de referência ou tão próximo à mesma quanto for apropriado. Métodos adequados para estabelecimento de homologia de se- qüência incluem o programa BLAST.

De preferência, o fragmento compreende pelo menos 80% de identidade de seqüência à seqüência de referência (por exemplo, HOXC4, HOXB6, HOXB5, HOXA3, HOXD9 ou EN-2), mais preferivelmente 85%, mais preferivelmente 90%, mais preferivelmente 95%, mais preferivelmente 97%, mais preferivelmente 99% e, o mais preferível, 99,9% de identidade de seqüência à seqüência de referência ou tão próximo à mesma quanto for apropriado. Métodos adequados para estabelecimento de identidade de se- quência incluem o programa BLAST.

Dois polipeptídeos são ditos "homólogos", conforme o termo é utilizado nesta exposição, se a seqüência de um dos polipeptídeos possuir grau elevado suficiente de identidade ou similaridade à seqüência do outro polipeptídeo. "Identidade" indica que, em qualquer posição em particular nas seqüências alinhadas, o resíduo de aminoácido for idêntico entre as seqüên- cias. "Similaridade" indica que, em qualquer posição em particular nas se- qüências alinhadas, o resíduo de aminoácido é de tipo similar entre as se- qüências. Graus de identidade e similaridade podem ser calculados rapida- mente (Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing. Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part 1, Griffin, A.M., and Griffin, H.G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; e Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Deve- reux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991). Percentual de identidade, conforme referido nesta exposição, é conforme determinado pelo programa BLAST versão 2.1.3 utilizando os parâmetros padrão especificados pelo NCBI (o National Center for Biotechnology Information; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) [Blosum 62 matrix; penalidade por abertura de lacuna = 11 e penalidade por extensão de lacuna = 1].

De preferência, o fragmento compreende pelo menos quatro a- minoácidos consecutivos da seqüência de referência, mais preferivelmente pelo menos 5, mais preferivelmente pelo menos 6, mais preferivelmente pelo menos 7, mais preferivelmente pelo menos 8 aminoácidos consecutivos da seqüência de referência, tal como a Seqüência ID NO. 1, 2, 3, 4, 5 ou 6, em- bora fragmentos mais longos com pelo menos 10, 15, 20, 25, 30, 50, 75, 100, 150, 200, 225 e até pelo menos 250 aminoácidos sejam também prefe- ridas. Fragmentos incluem também peptídeos truncados que possuem χ a- minoácidos excluídos do N-terminal e/ou C-terminal. Nessas trucagens, χ pode ser 1 ou mais (ou seja, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 ou mais), porém, de preferência, menos de 150. Sem estar preso pela teoria, acredita-se que HOXC4 seja secre-

tado por uma via não clássica, sem requerer seqüência de sinalização. A seqüência fornecida na Seqüência ID NO. 1 é, por conseguinte, suposta- mente a mesma da proteína encontrada no soro. Esse fato é corroborado pela observação de que a banda detectada é de tamanho correspondente (Mw) ao tamanho predito com base na seqüência gênica. As proteínas HOX podem sair das células através de outros mecanismos, por exemplo, Iise celular.

O termo "biomarcador" é utilizado por toda a técnica e significa um indicador biológico distinto ou biologicamente derivado de um processo, evento ou condição. Em outras palavras, um biomarcador é indicativo de certo estado biológico, tal como a presença de tecido canceroso. Em alguns casos, formas diferentes de biomarcadores podem ser indicativas de certos estados de doença, porém, sem estar preso pela teoria, acredita-se que a mera presença de níveis elevados de um peptídeo HOXC4, ou de fragmen- tos deste, em líquidos corporais, tais como soro, é indicativo de câncer de próstata. Embora não seja atualmente contemplado que glicoformas diferen- tes, por exemplo, do peptídeo HOXC4, sejam secretadas, estas são não obstante abrangidas pela presente invenção. Por exemplo, glicoformas dife- rentes, tais como estrutura ou teor de açúcar alterado de glicoformas, podem ser ainda determinadas para HOXC4, porém estas são abrangidas e podem até mesmo ser indicativas da evolução do câncer de próstata. Trucagens, mutações ou deleções ou ligações ao peptídeo HOXC4, ou fragmentos des- te, são também contemplados. No entanto, a principal descoberta que fundamenta a presente invenção é a de que há um aumento significativo no nível de H0XC4 que pode ser detectado em líquidos corporais, tais como o soro. Acredita-se que H0XC4 seja secretada, porém é também contemplado que possa ser devido a extravasamento de proteína H0XC4 de células que estão morrendo. I- gualmente, EN-2 pode ser secretada ou pode ser detectável em líquidos corporais devido a extravasamento de células danificadas ou mortas. Estes níveis aumentados são indicativos de câncer de próstata em estágio inicial e tardio. Enquanto que há uma elevação significativa entre níveis de controle e normais e câncer de próstata em estágio inicial, há também um aumento bem significativo entre câncer de próstata em estágio inicial e o em estágio tardio. Em termos gerais, uma vantagem da presente invenção é a de que a substância e também o estado do câncer de próstata podem ser detectados. Isso auxilia no prognóstico e administração de terapias adequadas.

Uma outra vantagem da presente invenção é a de ser capaz de distinguir condições como hiperplasia benigna da próstata (HBP). Estas con- dições que levam ao alargamento da glândula prostática podem ser errone- amente interpretadas como câncer de próstata, utilizando técnicas estabele- cidas para determinação da presença de câncer de próstata, tais como E- xame de Toque Retal (ETR). É uma outra vantagem da presente invenção que um diagnóstico acurado possa ser provido sem utilizar-se de procedi- mentos invasivos desagradáveis e potencialmente prejudiciais, os quais po- dem ser também inexatos. Além disso, a presente invenção é especialmente sensível. De preferência, os métodos da presente invenção podem detectar o início de câncer de próstata antes que qualquer outro método de detecção e antes que tenham inicio os sintomas evidentes de câncer de próstata. Dessa forma, o câncer pode ser tratado em estágio inicial quando é mais suscetível a este tratamento e que tenha menos possivelmente iniciado o estágio metastático.

Tipos diferentes de câncer de próstata são conhecidos. O mais comum inicia nas células da glândula prostática e é conhecido como adeno- carcinoma de próstata. No entanto, existem outras formas de câncer de próstata, como sarcomas, carcinomas de células pequenas e carcinomas de células transicionais. Os métodos da invenção podem ser utilizados para detectar o início de qualquer um destes tipos de câncer, embora a detecção de adenocarcinoma seja preferida.

A progressão do câncer é monitorada por um processo de esta- diamento. Este processo indica o nível de desenvolvimento do câncer e se já se disseminou. O escore é de um a quatro, com o prognóstico tornando-se progressivamente pior a cada estágio. Estágio I: As células malignas estão circunscritas à próstata; não se disse- minaram para os Iinfonodos ou outros órgãos; os escores de Gleason são entre dois e quatro, e menos de cinco por cento da próstata é composta por crescimento tumoral.

Estágio II: Escores de Gleason são cinco ou mais altos, ou mais de cinco por cento da glândula exibe crescimento anormal; o câncer ainda está restrito à próstata.

Estágio III: Células malignas disseminaram-se para as vesículas seminais, porém não para os Iinfonodos ou outros órgãos.

Estágio IV: Os linfonodos, tecido pélvico ou órgãos mais distantes estão afe- tados.

De preferência, os métodos da invenção detectam o início de câncer de próstata antes ou durante o estágio I ou estágio II, mais preferi- velmente estágio I.

Os biomarcadores peptídicos da presente invenção podem ser utilizados em métodos de diagnóstico, por exemplo, investigação clínica, e em métodos de avaliação de prognóstico, monitoramento dos resultados de terapia, identificação de pacientes que mais possivelmente responderão um tratamento terapêutico em particular, seleção de fármaco e desenvolvimento. Além disso, os biomarcadores da presente invenção e usos dos mesmos são de valor para identificação de novos tratamentos de fármacos e para descoberta de novos alvos para tratamento de fármaco.

Dessa forma, em uma outra característica, a invenção provê um método de diagnóstico ou monitoramento da progressão de câncer de prós- tata, compreendendo a detecção e/ou quantificação de um fator de transcri- ção contendo pelo menos um homeodomínio, como um peptídeo HOX ou peptídeo EN-2, ou fragmentos destes. De preferência, o peptídeo compre- ende ou consiste na seqüência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO 1, 2, 3, 4, 5 ou 6. De preferência, pelo menos um peptídeo HOX, o peptídeo EN-2 ou um fragmento destes está presente em uma amostra biológica pro- veniente de um sujeito em teste. A referida amostra biológica sendo, de pre- ferência, uma amostra de líquido corporal.

O líquido corporal pode ser qualquer líquido corporal humano, incluindo líquido celular, líquido cefalorraquidiano (LCR), sêmen, urina, san- gue, Iinfa ou saliva. No entanto, é especialmente preferido que o líquido cor- poral seja sangue total, especialmente soro sangüíneo, ou urina. É também preferido que o líquido corporal seja substancial ou completamente livre de células inteiras/intactas. De preferência, o líquido corporal não contém pla- quetas ou resíduos celulares (como os produzidos na Iise de células). De preferência, o líquido corporal não contém células procarióticas e eucarióti- cas.

Estes líquidos podem ser obtidos por quaisquer números de meios conhecidos na técnica, conforme será evidente para o técnico especi- alizado. Por exemplo, uma amostra de urina é facilmente obtida, enquanto que amostras de sangue ou soro podem ser obtidas por via parenteral com uma agulha e seringa, por exemplo. Amostras livres ou substancialmente livres de células podem ser obtidas, submetendo-se o líquido corporal a vá- rias técnicas conhecidas daqueles especializados na técnica, as quais inclu- em, entre outras, centrifugação efiltração.

Embora seja de modo geral preferido que não sejam utilizadas técnicas invasivas para obter a amostra, pode ainda ser preferível obter a- mostras como homogenatos de tecidos, cortes de tecidos e espécimes de biopsia.

Métodos de monitoramento da presente invenção podem ser utilizados para detectar o início, progressão, estabilização, melhora e/ou re- missão de câncer de próstata. Dessa forma, a detecção do pelo menos um peptídeo HOX1 peptídeo EN-2, ou de um fragmento destes, pode ser utiliza- da para determinar a progressão da doença com objetivo de orientar um médico para um tratamento em particular.

De preferência, pelo menos duas etapas de detecção e/ou quantificação são fornecidas, preferivelmente com intervalo temporal entre as mesmas, por exemplo, alguns dias, semanas, anos ou, mais preferivelmente, meses para determinar se os níveis de pelo menos um peptídeo HOX ou peptídeo EN-2, ou um fragmento destes, alteraram-se, indicando dessa forma se houve uma alteração na progressão do câncer. O mesmo possibilita serem feitas com- parações entre um nível do biomarcador em amostras coletadas em duas ou mais ocasiões, uma vez que aumento no nível do peptídeo sobre o tempo é indicativo do início ou progressão do câncer, enquanto que diminuição no nível do peptídeo pode indicar melhora e/ou remissão do câncer. De preferência, um método de diagnóstico ou de monitoramento

de acordo com a presente invenção compreende a comparação do nível do peptídeo presente em uma amostra em teste, com o nível em um ou mais controles. De preferência, os controles podem ser provenientes do mesmo paciente de uma amostra prévia para assim monitorar o início ou progres- são. No entanto, é preferido também que os controles possam ser normali- zados para uma população, especialmente uma população saudável ou normal, onde não há câncer de próstata. Em outras palavras, o controle po- de consistir no nível de um biomarcador encontrado em amostra de controle normal proveniente de um sujeito normal. Portanto, é provido um método de diagnóstico de câncer de

próstata, compreendendo a quantificação ou detecção da quantidade de pe- lo menos um peptídeo HOX, o peptídeo EN-2 ou de um fragmento destes, e a comparação da quantidade do referido peptídeo na referida amostra em teste com a quantidade presente em uma amostra biológica de controle, pro- veniente de um sujeito normal ou do mesmo sujeito bem anterior à incidên- cia de doença. Se um aumento significativo no nível de pelo menos um pep- tídeo HOX, o peptídeo EN-2 ou de um fragmento destes for encontrado na amostra em teste, nesse caso, este é indicativo de que a doença está em progressão ou iniciou.

Conforme notado acima, este método de detecção de pelo me- nos um peptídeo HOX, o peptídeo EN-2 ou de um fragmento destes é espe- cialmente útil para detectar câncer de próstata em estágio inicial e é mais sensível do que o teste tradicional de detecção de níveis de PSA. Dessa forma, os métodos da invenção são especialmente úteis para confirmar cân- cer quando um paciente apresentar teste negativo com métodos convencio- nais, tais como a detecção de PSA. Em geral, o nível de secreção do pelo menos um peptídeo HOX

ou do peptídeo EN-2 nos líquidos corporais está incluído nas variações des- critas abaixo.

Será entendido que os termos "peptídeo" e "proteína" podem ser alternados, conforme utilizados nesta exposição, a não ser se evidente de outra forma.

A Tabela 1 e Figura 1, por exemplo, exibem um aumento de ta- manho bem considerável em concentrações séricas da proteína HOXC4. A Tabela 2 e Figura 2 exibem resultados semelhantes para HOXB6. Os reque- rentes mostraram também que H0XB6 é um biomarcador para câncer de próstata em estágio tardio (dados não apresentados). HOXB5 é também um biomarcador, porém menos preferido que HOXB6 ou HOXC4 (Tabela 3 e Figura 7). Biomarcadores alternativos incluem HOXA3 e HOXD9 (vide Figura 8).

De preferência, o aumento é estatisticamente significativo, de- terminado por métodos padrões, tais como "teste-t" fornecendo intervalos de confiança, de preferência, de pelo menos 80%, mais preferivelmente pelo menos 85%, mais preferivelmente pelo menos 90%, mais preferivelmente pelo menos 95%, mais preferivelmente pelo menos 97%, mais preferivel- mente pelo menos 99%, mais preferivelmente pelo menos 99,5%, mais pre- ferivelmente pelo menos 99,95% e, o mais preferível, pelo menos 99,99%.

De preferência, o aumento entre o controle e uma amostra indi- cativo de câncer de próstata em estágio inicial é em tomo de entre 110- 200%, mais preferivelmente em torno de entre 120-180%, mais preferivel- mente em torno de entre 130-160%, mais preferivelmente em torno de entre 140-150%, mais preferivelmente em torno de entre 110-140%, mais preferi- velmente em torno de entre 115-130%, mais preferivelmente em torno de entre 120-130%, mais preferivelmente em torno de entre 120-140% e, o mais preferível, em torno de 125%. Outras combinações dos pontos finais acima são também contempladas.

Em relação à determinação de câncer em estágio tardio ou a- vançado, o aumento entre o controle e uma amostra indicativo do referido câncer de próstata em estágio tardio é em torno de entre 400-800%, mais preferivelmente em torno de entre 450-750%, mais preferivelmente em torno de entre 500-700%, mais preferivelmente em torno de entre 520-680%, mais preferivelmente em torno de entre 540-640%, mais preferivelmente em torno de entre 550-620%, mais preferivelmente em torno de entre 560-600%, mais preferivelmente em torno de entre 570-590% e, o mais preferível, em torno de 580%. O aumento pode estar também no intervalo de 550-800% ou de 400-600%. Outras combinações dos pontos finais acima são também con- templadas.

Um aumento entre câncer em estágio inicial e tardio pode ser medido em relação a um controle normal (ou seja, livre de câncer) ou a uma amostra de estágio inicial ou de controle no mesmo paciente. Em relação a uma amostra de estágio inicial, um aumento em torno de entre 100% e 300%, mais preferivelmente em torno de entre 150% e 250%, mais preferi- velmente em torno de entre 175% e 225%, mais preferivelmente em torno de entre 185% e 215%, mais preferivelmente em torno de entre 100% e 220%, mais preferivelmente em torno de entre 170% e 300% e, o mais preferível, em torno de 200% é preferido.

Como mencionado acima, onde for feita referência, nesta expo- sição, a um peptídeo contendo pelo menos um homeodomínio, esta se apli- ca aos peptídeos HOX, tais como HOXC4, HOXB6, HOXB5, HOXA3 e HOXD9, e ao peptídeo EN-2, a não ser se evidente de outra forma.

Onde for feita referência, nesta exposição, a pelo menos um peptídeo HOX ou peptídeos HOX1 esta se aplica a H0XC4, H0XB6, H0XB5, H0XA3 e H0XD9, em particular, bem como aos outros peptídeos HOX lista- dos abaixo, a não ser se evidente de outra forma.

Em termos de quantidades absolutas de pelo menos uma prote- ína HOX ou EN-2 por ml de líquido corporal, estas são preferivelmente em torno de entre 0,5-1,5 ng/ml, mais preferivelmente em torno de entre 0,75- 1,25 ng/ml e, o mais preferível, em torno de 1,0 ng/ml para amostras de con- trole. Para amostras de câncer em estágio inicial, os intervalos preferidos são em torno de entre 2,0-5,0 ng/ml, mais preferivelmente em torno de entre 2,5-4,5 ng/ml, mais preferivelmente em torno de entre 2,5-4,0 ng/ml, mais preferivelmente em torno de entre 2,75-3,5 ng/ml, mais preferivelmente em torno de entre 2,75-3,0 ng/ml, mais preferivelmente em torno de entre 2,0- 3,5 ng/ml, mais preferivelmente em torno de entre 2,0-3,0 ng/ml e, o mais preferível, em torno de 3,0 ng/ml. Para amostras de câncer em estágio tardio, os intervalos prefe-

ridos são em torno de entre 6,0-20 ng/ml, mais preferivelmente em torno de entre 8,0-15 ng/ml, mais preferivelmente em torno de entre 8,5-13 ng/ml, mais preferivelmente em tomo de entre 9,0-12 ng/ml, mais preferivelmente em torno de entre 9,5-11 ng/ml, mais preferivelmente em torno de entre 7-13 ng/ml mais preferivelmente em torno de entre 8,5-16 ng/ml e, o mais preferí- vel, em torno de 10 ng/ml.

O termo "diagnóstico" abrange identificação, confirmação e/ou caracterização da presença ou ausência de câncer de próstata, juntamente com o estágio de desenvolvimento do mesmo, tais como estágio inicial ou tardio, ou câncer de próstata benigno ou metastático.

Será apreciado que a natureza de "estágio inicial" e de "estágio tardio" dos estados de doença cancerosa pode ser determinada por um mé- dico. É também contemplado que possam referir-se a não-metastática e me- tastática, respectivamente. A invenção provê também um método de monitoramento da efi-

cácia de um tratamento para câncer de próstata, compreendendo a detecção e/ou quantificação de pelo menos um peptídeo HOX, peptídeo EN-2 ou de um fragmento destes, presente em uma amostra biológica de um sujeito. Conforme acima, pode ser preferível obter duas amostras, separadas tempo- ralmente, por exemplo, por alguns meses, a fim de determinar se houve qualquer progresso no tratamento, em outras palavras, se os níveis de pelo menos um peptídeo HOX, peptídeo EN-2, ou um fragmento destes, aumen- taram ou diminuíram. Uma diminuição nos níveis do referido pelo menos um peptídeo HOX ou peptídeo EN-2 indica que a doença está regredindo e, por- tanto, que o regime de tratamento é bem sucedido. Este monitoramento de uma doença revelará rapidamente se um paciente está respondendo a um tratamento ou se é refratário a um tratamento. Se o último, então um trata- mento alternativo pode ser fornecido. Este método, portanto, oferece uma indicação rápida se um regime de tratamento é eficaz, e permite que o médi- co altere este regime até ser observado efeito no paciente.

No método da presente invenção, o preferido é que a quantidade do peptídeo, ou de um fragmento deste, em uma amostra em teste seja comparada à quantidade presente em um ou mais controles e/ou uma ou mais amostras prévias em teste, coletadas em tempo anterior do referido mesmo sujeito em teste. A extensão de tempo entre a amostra mais precoce e a mais tardia pode ser de somente alguns dias, porém pode ser de até vá- rios meses ou até mesmo vários anos, e será determinada pelo médico, com base na progressão da doença e o histórico médico do paciente. Alternati- vamente, o controle pode ser uma amostra em teste de um paciente livre de doença.

O peptídeo, ou um fragmento deste, é detectado pela confirma- ção da presença do referido biomarcador. A quantificação da quantidade do biomarcador presente em uma amostra inclui, de preferência, a determina- ção da concentração do biomarcador peptídico na amostra. As etapas de detecção e/ou quantificação podem ser conduzidas diretamente na amostra, ou indiretamente em um extrato da mesma ou diluição da mesma. A presente invenção refere-se a biomarcadores, e será aprecia-

do que estes requeiram ser detectáveis no líquido corporal. Alguns membros da família HOX não podem ser detectados em líquido corporal e não são, portanto, biomarcadores de acordo com a presente invenção.

Níveis detectáveis do pelo menos um peptídeo HOX, o peptídeo EN-2 ou fragmentos destes são discutidos em outros locais no presente, po- rém será apreciado que poderá haver alguns motivos porque um peptídeo HOX1 o peptídeo EN-2 ou fragmentos destes não são detectáveis. Sem estar preso por teoria, um motivo pode ser que o peptídeo é degradado no líquido corporal, ou seja, não é "estável".

Dessa forma, é preferido que pelo menos um peptídeo HOX, o peptídeo EN-2 ou fragmentos destes não sejam substancialmente degrada- dos e/ou que sejam ainda detectáveis (isto é, estejam presentes em concen- trações detectáveis) na periferia corporal, isto é, uma veia próxima à superfí- cie da pele, de preferência, o braço, onde possam ser simplesmente coleta- dos.

O peptídeo pode ser liberado no líquido corporal, quer por rom- pimento ou extravasamento celular ou por secreção.

A detecção e/ou quantificação de pelo menos um peptídeo HOX ou o peptídeo EN-2, ou fragmentos destes, pode ser efetuada por qualquer método adequado para detectar a presença e/o quantidade de uma proteína ou peptídeo específico em uma amostra biológica. O mesmo pode ser por detecção direta do biomarcador, por exemplo, por MALDI-TOF ou SELDI.

No entanto, é preferido também que pelo menos um peptídeo HOX ou o peptídeo EN-2, ou fragmento deste, seja detectado direta ou indi- retamente por intermédio de interação com um ou mais ligantes. Estes Iigan- tes podem incluir um anticorpo anti-HOX ou anti-EN-2 ou um fragmento de ligação a estes, um aptâmero ou um oligonucleotídeo. Será apreciado que estes ligantes deverão ser capazes de se ligarem especificamente ao peptí- deo HOX ou peptídeo EN-2, ou a um fragmento destes. Estes poderão ser adequadamente marcados e compreenderem uma etiqueta de afinidade. Marcações adequadas podem ser fluorescentes, radioativas ou Iuminescen- tes. As marcações podem ser unidas ao anticorpo diretamente ou por inter- médio de um agente de ligação.

Por exemplo, a detecção e/ou quantificação podem ser realiza- das por um ou mais métodos selecionados do grupo constituído por: MALDI- TOF1 SELDI, sistemas de análises à base de gel em 1-D ou 2-D, cromato- grafia líquida e técnicas que combinam cromatografia líquida e espectrome- tria de massa. As últimas podem incluir, de preferência, ICAT® ou iTRAQ® (ambos disponibilizados pela Applied Biosystems, EUA).

Técnicas de cromatografia líquida podem incluir HPLC (croma- tografia líquida de alto desempenho) ou até mesmo cromatografia líquida de baixa pressão. Além disso, métodos como cromatografia em camada delga- da, espectroscopia NMR e qualquer outro método descrito nesta exposição são também preferidos.

O peptídeo, ou um fragmento deste, pode ser detectado e/ou quantificado por métodos imunológicos, tais como imunoensaios do tipo sanduíche, por exemplo, ensaio imunoenzimático de absorção (ELISA), ra- dio-imunoensaios (RAI), ensaios imunoenzimáticos (EIA)1 Western Blotting, imunoprecipitação. Também preferidos são imunoensaios à base de partícu- las, os quais podem incluir, por exemplo, o uso de partículas de ouro, prata ou látex, partículas magnéticas ou Q-dots. Estes métodos podem ser reali- zados, por exemplo, em placa de microtitulação ou em formato de faixa ou sobre um chip.

Especialmente preferidos são ensaios do tipo ELISA compreen- dendo anticorpos específicos para o pelo menos um peptídeo HOX ou o peptídeo EN-2. O anticorpo ou anticorpos anti-HOX ou anti-EN-2 são liga- dos, de preferência, indiretamente ou por intermédio de um agente de liga- ção, a uma molécula repórter, como um radioisótopo, uma molécula fluores- cente, uma molécula Iuminescente ou uma enzima. Um exemplo de uma enzima preferida é fosfatase alcalina, disponibilizada pela Invitrogen, Reino Unido, embora outros repórteres sejam conhecidos na técnica.

Um exemplo e anticorpo anti-H0XC4 humano é disponibilizado pela Abcam, Reino Unido, n°. de catálogo ab24338. Este é um anticorpo an- ti-H0XC4 humano de Coelho e, por conseguinte, pode ser preferível utilizar um anticorpo secundário anti-lgG de Coelho ligado a um repórter, tal como fosfatase alcalina, para detectar o complexo HOXC4-anticorpo. Um exemplo de anticorpo anti-HOXB6 é fornecido pela Abcam, n°. de catálogo ab26077. Um exemplo de anticorpo anti-HOXB5 é fornecido pela Abcam, n°. de catá- logo ab26079. Um exemplo de anticorpo anti-HOXA3 é fornecido pela Ab- cam, n°. de catálogo ab28771. Um exemplo de anticorpo anti-HOXD9 é for- necido pela Abcam, n°. de catálogo ab60708. Exemplos de outros anticorpos anti-HOX são conhecidos. Um exemplo de anticorpo anti-EN-2 é fornecido pela Abcam, n°. de catálogo ab45867.

Métodos de Western blotting são preferidos também, especial- mente os que são capazes de fornecer dados de densitometria.

Níveis adequados para comparação da presença do pelo menos um peptídeo HOX ou peptídeo EN-2, suficientes para distinguir entre o con- trole, cânceres em estágio inicial e em estágio tardio, ou combinações des- tes, são discutidos acima.

Onde utilizados, os anticorpos podem ser policlonais, monoclo- nais, biespecíficos, humanizados ou quiméricos. Podem consistir em uma única cadeia, mas, de preferência, consistiriam de pelo menos uma cadeia leve ou uma cadeia pesada, porém, será apreciado que é necessária pelo menos uma Região Determinadora de Complementaridade para que ocorra ligação a um epítopo de HOX ou epítopo de EN-2.

Evidentemente, será apreciado também que o epítopo ou epíto- pos deverão estar disponíveis para ligação ou reconhecimento pelo ligante, tais como um anticorpo. Anticorpos anti-HOX e anti-EN-2 já são conhecidos, porém se anticorpos ou Iigantes adicionais para ligação, com especificidades diferentes forem necessários, então, estes poderiam ser obtidos. Métodos para produção de anticorpos são conhecidos na técnica. Por exemplo, se anticorpos policlonais forem desejados, um mamífero pode ser selecionado nesse caso, tal como camundongo, coelho, cabra ou cavalo, e imunizado com o antígeno de escolha, como HOX ou EN-2 humano. O soro do animal imunizado é coletado, em seguida, e tratado para ser obtido o anticorpo, por exemplo, por cromatografia por imunoafinidade. HOX ou EN-2 humano po- deria, por exemplo, ser injetado em coelhos desencadeando uma resposta imune do coelho e sendo cultivados anticorpos anti-HOX ou anti-EN-2, os quais podem ser isolados em conseqüência, utilizando métodos convencio- nais.

Evidentemente, anticorpos monoclonais poderiam ser produzi- dos por métodos conhecidos na técnica e são, de modo geral, preferidos. A metodologia geral para produção de anticorpos monoclonais utilizando tec- nologia de hibridoma é bem conhecida (vide, por exemplo, Kohler, G. e Mils- tein, C., Nature 256: 495-497 (1975); Kozbor et ai, Immunology Today 4: 72 (1983); Cole et ai, 77-96 em Monoclonal Antibodies and Câncer Therapy,

Alan R. Liss, Inc. (1985)).

Por conseguinte, anticorpo, conforme referido nesta exposição,

deverá consistir em uma região epítopo-ligação, tal como CDR. Conforme utilizado nesta exposição, o termo "anticorpo" refere-se a moléculas intactas, bem como a fragmentos destas, como Fab, Fab', F(ab')2 e Fv, os quais são capazes de se ligarem a epítopo. De preferência, o anticorpo compreende

também uma porção efetora, como a região Fc.

O anticorpo pode ser de qualquer classe adequada, incluindo IgE, IgM, IgD, IgA e, em particular, IgG. As várias subclasses destes anticor- pos são contempladas também.

Dessa forma, é preferido também que um biossensor seja para detector pelo menos um biomarcador peptídico, ou um fragmento deste. O biossensor pode incorporar um método imunológico, conforme descrito aci- ma, por exemplo, para detecção do biomarcador, ou meios ou tecnologias elétricas, térmicas, magnética ou óptica, por exemplo, um holograma, ou acústicos. Utilizando estes biossensores, é contemplado que o biomarcador seja detectado e/ou quantificado. Portanto, em uma outra característica, a presente invenção provê o uso de um biossensor para detectar e/ou quantifi- car o peptídeo ou um fragmento deste.

De preferência, pelo menos um biomarcador HOX ou EN-2 pode

ser detectado utilizando um biossensor, fundamentado no uso de hologra- mas "inteligentes", ou sistemas acústicos de alta freqüência, especialmente uma vez que estes sistemas são sensíveis a configurações de arranjos. Por exemplo, com sensores de hologramas inteligentes, disponibilizados pela Smart Holograms Limited, Cambridge, Reino Unido, uma imagem holográfi- ca é armazenada em filme polimérico fino que é sensibilizado para reagir especificamente com o biomarcador. Na exposição, o biomarcador reage com o polímero levando a uma alteração na imagem exibida pelo holograma.

A leitura do resultado do teste pode observar uma alteração na luminosidade óptica, imagem, cor e/ou na posição da imagem. Esta alteração pode ser lida até mesmo a olho nu.

Será apreciado que é preferido que os biossensores capazes de detectar e/ou quantificar pelo menos um biomarcador HOX ou EN-2 combi- nam reconhecimento biomolecular com recursos apropriados para converter a detecção da presença, ou a quantificação, do referido biomarcador em uma amostra em sinal detectável. Por exemplo, elementos impressos de reconhecimento, tecnologia do transistor em filme fino, dispositivo com res- sonadores acústicos magnéticos e outros novos sistemas acústico-elétricos podem ser preferivelmente empregados no presente biossensor para detec- ção e/ou quantificação de pelo menos um biomarcador HOX ou EN-2. De preferência, um biossensor de acordo com a invenção detectará um ou mais, de preferência, dois, três, quatro, cinco ou todos os seis entre H0XC4, H0XB5, H0XB6, H0XA3, H0XD9 e EN-2. Biossensores ainda mais preferi- dos podem detectar ainda outros biomarcadores HOX conforme referidos acima.

De preferência, o biossensor inclui um Iigante e/ou um anticorpo, conforme discutido acima. O biossensor pode ser fornecido em um arranjo adequado ou chip, de modo que o biossensor seja capaz de ligação especí- fica ao pelo menos um peptídeo HOX, o peptídeo EN-2, ou um fragmentos destes, e um meio de detecção é fornecido. Meios adequados de detecção são discutidos acima, porém podem incluir sistemas de repórter, como fosfa- tase alcalina, ou hologramas inteligentes capazes de fornecer um sinal de- tectável para o usuário de modo a indicar que ligação específica ao pelo menos um peptídeo HOX ou peptídeo EN-2, ou a um fragmento destes, foi alcançada e, de preferência, uma indicação da concentração de HOX ou EN- 2 ou do número de eventos de ligação específica que ocorreram no referido arranjo ou chip.

A presente invenção provê ainda kits para a referida detecção e/ou quantificação. Estes kits são úteis no diagnóstico e/ou monitoramento de câncer de próstata. Dessa forma, estes kits compreenderão de preferên- cia um biossensor como um ligante, de preferência um anticorpo, capaz de ligar-se especificamente a pelo menos um peptídeo ou um fragmento deste, e meios para indicar a referida ligação específica para o usuário, por exem- plo, utilizando um sistema de repórter conforme descrito nesta exposição. Os kits especialmente referidos incluem um arranjo ou um chip.

Em uma outra característica, a invenção provê o uso de um bi-

ossensor, de preferência um ligante e, o mais preferível, um anticorpo, capaz de ligação específica e reconhecimento do pelo menos um peptídeo HOX ou EN-2, ou um fragmento destes, para identificar uma substância capaz de suprimir a geração do pelo menos um peptídeo HOX ou o peptídeo EN-2, ou

um fragmento destes. De preferência, esta substância é capaz de suprimir a produção do biomarcador pelo câncer de próstata. Em outras palavras, o ligante pode ser utilizado para determinar a eficácia ou não de um suposto tratamento ou estabelecido contra câncer de próstata.

Por conseguinte, um método para detecção da eficácia de um

suposto tratamento contra câncer pode incluir as etapas de:

(a) incubação de uma célula inteira que expressa um peptídeo HOX ou um peptídeo EN-2, e detecção da quantidade liberada de peptídeo HOX ou de peptídeo EN-2,

(b) tratamento da célula com um suposto tratamento contra cân-

cer,

(c) detecção da quantidade liberada de peptídeo HOX ou de peptídeo EN-2 após o tratamento, e

(d) comparação da quantidade liberada de peptídeo HOX ou de peptídeo EN-2, antes e depois do tratamento, para observar se o suposto

tratamento contra câncer possui efeito sobre a quantidade liberada de peptí- deo.

Alternativamente, um método pode compreender as etapas de: (a) incubação de um Iigante marcado com uma célula inteira que expresse peptídeo HOX ou peptídeo EN-2 sobre a superfície celular, ou uma membrana celular contendo um peptídeo HOX ou um peptídeo EN-2;

(b) medição da quantidade de Iigante marcado ligado à célula inteira ou à membrana celular;

(c) adição de um suposto agente anticâncer à mistura de Iigante marcado e a célula inteira ou a membrana celular da etapa (a) e permitir que a mistura atinja equilíbrio;

(d) medição da quantidade de Iigante marcado ligado à célula inteira ou a membrana celular após a etapa (c); e

(e) comparação da diferença no Iigante marcado ligado na etapa (b) e (d), de modo que o composto que causa a redução em ligação na eta- pa (d) é considerado inibidor da expressão de HOX ou EN-2 e, por conse- guinte, um agente anticâncer.

Por exemplo, uma linhagem de células como a linhagem de cé-

lulas LNCaP de carcinoma de próstata poderia ser utilizada neste ensaio. As células LNCaP poderiam ser cultivadas na presença ou ausência de um su- posto ou estabelecido agente anti-cancer, e ser comparada a expressão re- lativa de EN-2. Um nível mais baixo de expressão de EN-2 indicaria melhor atividade anticâncer. Os níveis de expressão poderiam ser detectados pela detecção da proteína produzida (ou seja, o produto final) ou pela detecção do RNA produzido (ou seja, um produto intermediário). Métodos de detecção da proteína produzida são discutidos acima. O RNA pode ser detectado utili- zando, por exemplo, PCR quantitativa ou arranjo de oligonucleotídeos. O precedente refere-se também aos métodos e kits da presente

invenção.

Outros métodos ou kits a serem utilizados de acordo com a pre- sente invenção serão evidentes para o versado na técnica. Estes podem incluir, por exemplo, sistemas de detecção de biomarcadores que são ex- postos em US-2006-014301, US-2004-063216, WO 01/92879 e WO 02/054936.

Portanto, a presente invenção pode ser utilizada para identificar novos tratamentos contra câncer de próstata, em que os níveis de pelo me- nos um peptídeo HOX ou EN-2, ou um fragmento destes, são detectados e/ou quantificados na presença ou ausência do suposto agente anticâncer, a fim de determinar a eficácia deste. A presente invenção pode ser utilizada também em um método com tecnologia de seleção de alto rendimento, por exemplo, em formato de arranjo configurado, como sobre um chip ou em arranjo de multicavidades.

Uma vez que câncer de próstata é uma doença relacionada ao sexo masculino, será apreciado que o sujeito ou paciente pertence ao sexo masculino.

Descrição das Figuras

Figura 1: Exemplo do aspecto pela técnica de westem blotting da proteína HOXC4 no soro. Os resultados foram analisados também por densitometria e são apresentados como a média de todas as seis amostras de cada grupo. Barras de erro mostram o erro padrão da média. Esses dados indicam que HOXC4 é potencialmente um marcador diagnóstico específico e preciso para câncer de próstata, nos estágios inicial e tardio da doença. Figura 2: Detecção de HOXB6 em seis pacientes com câncer de próstata em estágio inicial, onde os tumores são pequenos e circunscritos à próstata, e de seis controles de idades correspondentes.

Figura 3: (a) Análise por RT-QPCR da expressão de EN-2 em células LN- CaP e primárias do tumor (nível de transcrito, em proporção a β-actina). (b,c) Biopsia de núcleo de adenocarcinoma de próstata corado com anticorpo an- ti-En2. Coloração positiva para En2 (marrom) presente no citoplasma de cé- lulas tumorais, com coloração mais forte na borda luminar (1). Bolsas positi- vas para EN-2 visíveis, presas à borda luminar (2) ou livres no interior do lúmen (3). Os núcleos estão corados em azul. Aumento: (a) x100, (b) x60. Figura 4: Cortes através de biopsia de núcleo em TMA de (a) tecido prostáti- co normal, (b) hipertrofia benigna da próstata e (c e d) tumor maligno de próstata. Coloração de EN-2 (marrom) presente nas células estromais (seta preenchida de branco) e nas glândulas com coloração mais forte aparente na borda luminar (pontas preenchidas de setas). Os núcleos estão corados em azul. Aumento: (a-c) x60, (d) x100.

Figura 5: Detecção por Western blotting de proteína EN-2 em meio de cultu- ra.

Figura 6: Proteína EN-2 na urina. A urina foi coletada de pessoas que esta- vam sendo examinadas e exibiam sintomas compatíveis com câncer de próstata e que eram investigadas quanto à presença da proteína EN-2. A presença de ausência de câncer foi testada por biopsia. O MW predito de EN-2 é de 30 kDa, porém uma segunda banda de 33 kDa é detectada tam- bém no controle positivo (extrato de cerebelo de camundongo). A banda de 30 kDa está presente exclusivamente na urina de 50% dos pacientes que apresentavam células de câncer de próstata em suas biopsias (C Pa), não estando presente em pacientes com biopsias negativas ou com hipertrofia benigna da próstata (BHP) ou neoplasia intraepitelial prostática de alto grau (HGPIN).

Figura 7: Detecção de HOXB5 em três pacientes com câncer de próstata em estágio inicial, onde os tumores são pequenos e circunscritos à próstata, três pacientes com câncer de próstata em estágio tardio e de três controles de idades correspondentes.

Figura 8: Níveis de expressão de vários genes HOXA e HOXD em tecido tumoral comparado a tecido normal adjacente. DU145 e PC3 são linhagens de células derivadas de tumores de próstata. Exemplo 1 HOXC4

Foi obtido soro de seis pacientes com câncer de próstata refratá- rio a hormônio em estágio avançado, seis pacientes com câncer de próstata em estágio inicial onde tumores são pequenos e circunscritos à próstata e de seis controles com idades correspondentes. O soro foi dessalgado e fracio- nado pelo método de PAGE/SDS em gel a 12,5%. A proteína HOXC4 huma- na (UniProtKB / Swiss-Prot número de registro P09017) foi detectada pela técnica de Western Blotting com anticorpo de coelho anti-HOXC4 humana (Abcam, Reino Unido, número de catálogo ab24338), juntamente com um anticorpo secundário anti-lgG de coelho ligado à fosfatase alcalina (Invitro- 10

gen, Reino Unido). Com este método, foram detectados altos níveis da pro- teína HOXC4 no soro de todos os pacientes com câncer de próstata, porém somente níveis muito baixos em soro de controles de idades corresponden- tes (Figura 1).

Os resultados são apresentados abaixo na Tabela 1. HOXC4 poderia ser utilizada como base para teste diagnóstico e/ou prog- nóstico de câncer de próstata, utilizando uma técnica padrão de ensaio co- mo a de ELISA. O procedimento envolveria o uso de um anticorpo anti- HOXC4 ligado a um repórter, como fosfatase alcalina, de modo a ser quanti- ficada a proteína HOXC4 presente em amostras do soro do paciente. Outras metodologias poderiam também ser utilizadas, incluindo a técnica de Wes- tern Blotting. A quantidade da proteína HOXC4 forneceria uma indicação se a doença estaria presente e qual estágio teria atingido.

Nome do gel: HoxC4 blot 131006 (Imagem bruta em 1-D)

índice Nome Paciente Diagnóstico Volume OD*mm2 Vol. Adj. OD*mm2 % Vol. Adj. 1 U1 HR29 Câncer 6,844796 0,272431 24,320686 2 Ul HR28 Câncer 6,460027 0,092836 8,2877258 3 U3 HR27 Câncer 9,731784 0,393355 35,115964 4 U4 SR5 Câncer em estágio inicial 6,108735 0,086538 7,7255409 U5 SR2 Câncer em estágio inicial 6,26387 0,01121 1,0007083 6 U6 SR1 Câncer em estágio inicial 8,427193 0,15222 13,589161 7 U7 VR30 Saudável 6,459172 0,045458 4,0581642 8 U8 VR23 Saudável 9,760506 0,062926 5,6175668 9 U9 VR21 Saudável 6,740683 0,003187 0,2844833

Nota: Membranas sondadas com anticorpo primário por somente 1 hora.

% aumento

Controle

Câncer em estágio inicial

Câncer em

Valores médios DP

0,037190112 0,030716 0,08332277 0,07056

0,252873795 0,151211

sem

0,0177548 0,0407864

0,0874053

0

124,0455 579,949 Valores médios % aumento

estágio tardio Tabela 1 SEQ ID NO. 1:

HOXC4 Número de acesso do NCBI: P09017

1 MIMSSYLMDS NYIDPKFPPC EEYSQNSYIP EHSPEYYGRT RESGFQ- HHHQ ELYPPPPPRP

61 SYPERQYSCT SLQGPGNSRG HGPAQAGHHH PEKSQSLCEP APLS- GASASP SPAPPACSQP

121 APDHPSSAAS KQPIVYPWMK KIHVSTVNPN YNGGEPKRSR AAY- TRQQVLE LEKEFHYNRY 181 LTRRRRIEIA HSLCLSERQI KIWFQNRRMK WKKDHRLPNT KVRSAP- PAGA APSTLSAATP 241 GTSEDHSQSA TPPEQQRAED ITRL Exemplo 2 HOXB6

A detecção de HOXB6 nestas amostras foi efetuada exatamente

conforme para HOXC4, exceto que o anticorpo primário foi o anticorpo de coelho anti-HOXB6 humana (da Abcam, N0. de catálogo ab26077). Os valo- res relativos para a proteína H0XB6 foram avaliados por densitometria do filme de raios-x (usando as bandas localizadas em seu peso molecular predi- to). A densidade óptica da banda, em relação àquela do fundo local, é repre- sentada por estes valores. Por conseguinte, será apreciado que um valor de densitometria comparativo negativo é possível, conforme mostrado pelos Controles de Idades Correspondentes (AMCs), embora deva ser apreciado que o mesmo não traduza uma quantidade negativa da proteína HOXB6. Esses dados são apresentados graficamente na Figura 2.

Tabela 2

HOXB6 no soro

Os valores representam as densidades ópticas relativas de bandas

Média DP sem

AMC1 -0,02671 AMC -0,09016 0,064043 0,036977

AMC2 -0,08899 Câncer em 0,261033 0,076253 0,044026 ΗΟΧΒ6 no soro estágio inicial

AMC3 -0,15478 Inicial 1 0,182775 Inicial 2 0,33511 Inicial 3 0,265214

SEQ ID NO. 2: HOXB6 Número de acesso do NCBI: P17509 1 MSSYFVNSTF PVTLASGQES FLGQLPLYSS GYADPLRHYP APYGPGPGQD KGFATSSYYP

61 PAGGGYGRAA PCDYGPAPAF YREKESACAL SGADEQPPFH PE- PRKSDCAQ DKSVFGETEE

121 QKCSTPVYPW MQRMNSCNSS SFGPSGRRGR QTYTRYQTLE LE- KEFHYNRY LTRRRRIEIA

181 HALCLTERQI KIWFQNRRMK WKKESKLLSA SQLSAEEEEE KQAE Exemplo 3 EN-2

Os níveis de expressão de EN-2 foram testados, utilizando PCR quantitativa (QPCR), na linhagem de células LNCaP de carcinoma de prós- tata humano (Horoszewicz et ai, 1983). Esta linhagem é de células deriva- das de uma lesão metastática de adenocarcinoma de próstata humano e amplamente utilizada como modelo in vitro desse tipo de câncer. Além disso, a expressão de EN-2 foi testada em tecido obtido de biopsias de tumores da próstata. Ambas as amostras expressaram EN-2. As células primárias do tumor expressaram também EN-2 como proteína. Esse fato pode ser detec- tado em cortes de adenocarcinomas prostáticos (Figura 3a). A coloração de EN-2, nestes cortes, está presente no compartimento citoplasmático e no nuclear, porém é mais intensa nas bordas luminares e em bolsas secretoras que penetram o lúmen (Figura 3b,c).

A fim de examinar mais detalhadamente a extensão que EN-2 está presente em tecido normal, hipertrofia benigna e em tumores malignos da próstata, foi efetuada a coloração com anticorpo anti-EN-2 de um microarranjo de tecidos (TMA) contendo cortes representativos de cada um destes. O procedimento confirmou alto nível de expressão de EN-2 em glândulas malignas, especi- almente nas bordas luminares (Figura 4), embora ocorra algum nível de co- loração em glândulas de tecido normal e hipertrófico. Todos os tecidos exibi- ram também coloração de EN-2 nas células estromais (Figura 4). A fim de quantificar a coloração nas glândulas, cada tecido foi pontuado de 0 a 3, on- de 0 representa ausência de coloração, e 3 a coloração mais forte. Com es- sa base, as glândulas de tecido normal (Figura 4a) exibiram pontuação em valor médio de 0,5 (n = 10, DP = 0,52), as com hiperplasia benigna (Figura 4b) 0,67 (n = 6, DP = 0,51), e as com tumores malignos (Figura 4c e d) 2,3 (n = 6, DP = 0,52).

Esses dados demonstram claramente que EN-2 está expressa

nestas células de câncer de próstata. Exemplo 4

O meio circundante de células LNCaP e de tumor primário de próstata foi examinado para estabelecer se EN-2 pode ser secretada a partir destas células. O meio, utilizado para cultivar ambos os tipos de células por duas horas, foi dessalgado e concentrado. As proteínas contidas nesse con- centrado foram em seguida definidas por resolução em gel de acrilamida. A análise por Western blotting revelou a presença de bandas específicas de EN-2 no meio que circundava ambos os tipos de células (Figura 5), e a quantificação utilizando quantidades padrão de proteína EN-2 transcrita in vitro indicou que a quantidade de EN-2 no meio utilizado para cultura de cé- lulas LNCaP era de 3ng/ml, enquanto células do tumor primário produziram 1,75ng/ml em 48 horas. Exemplo 5

Foram obtidas amostras de urina de 17 indivíduos que haviam

se submetido recentemente a biopsia e massagem da próstata. Dentre estes indivíduos, foi constatado que 10 apresentavam câncer na biopsia. Dentre os outros, dois eram portadores de neoplasia intraepitelial prostática de alto grau, (HGPIN), três exibiam sinais de hipertrofia benigna e dois não possuí- am células cancerosas no corte da biopsia. Cinco dos pacientes diagnosti- cados com câncer apresentavam grandes quantidades de EN-2 na urina, enquanto nenhuma das amostras de urina dos indivíduos não diagnostica- dos com câncer continha quantidade significativa da proteína EN-2 (Figura 6).

Exemplo 6 HOXB5

A detecção de HOXB5 nestas amostras foi efetuada exatamente

conforme para HOXC4 e HOXB6, exceto que o anticorpo primário foi o anti- corpo de coelho anti-HOXB5 humana (da Abcam, n°. de catálogo ab26079). Os valores relativos para proteína HOXB5 foram avaliados por densitometria do filme de raios χ (utilizando as bandas localizadas em seu peso molecular predito). A densidade óptica da banda, em relação àquela do fundo local é representada por estes valores. Tabela 3

Valores médios % aumento

DP sem

Controle 0,006597 0,005948 0,003438 0

Câncer em estágio 0,244012 0,055004 0,031794 3598,808 inicial

Câncer em estágio 0,471597 0,154221 0,089145 7048,621 tardio

Esses dados são representados graficamente na Figura 7.

Exemplo 7

Foram obtidas amostras de urina de 17 indivíduos com suspeita

de câncer de próstata e que foram diagnosticados subseqüentemente com a doença. Os níveis protéicos de EN-2, nas amostras de urina, foram avalia- dos conforme descrito acima. As amostras de urina de 8 (47%) destes indi- víduos exibiram níveis elevados de EN-2. Por outro lado, em amostras de urina obtidas de 15 pacientes com suspeita de câncer de próstata, porém nos quais o câncer não foi confirmado subseqüentemente, nenhuma (0%) apresentava níveis elevados de EM-2. Cabe observar que 3 dos pacientes diagnosticados com câncer de próstata que exibiam níveis elevados de EN2 em suas amostras de urina, não apresentavam níveis elevados de PSA. Es- se dado ilustra que os métodos da invenção são capazes de detectar câncer onde métodos convencionais de detecção não o conseguiram. Exemplo 8

moral.

Detecção da expressão de genes HOX em tecido normal e tu-

Extração de RNA: Foi adquirido RNA de tecido adjacente tumo- ral e normal da Ambion, EUA. RNA de culturas de células foi extraído com o mini Kit RNeasy (Qiagen, Reino Unido).

Síntese de cDNA: O RNA foi inicialmente desnaturado por aque- cimento até 65 0C por cinco minutos. 1-5 mg de RNA foram incubados em volume de 50 ml a 37 0C por uma hora com concentrações finais de DTT a 10 mM, dNTPmix a 1 mM, bem como 100 mg/ml de primers polyT, 200 uni- dades de transcriptase reversa (Invitrogen, EUA) e 40 unidades de RNASE- out (Invitrogen, EUA). A reação de síntese de cDNA foi finalizada colocando- se os tubos a 65 0C por cinco minutos.

PCR em tempo real: RT-PCR semiquantitativa foi realizada utili- zando a máquina MX4000 da Stratagene MX4000 de PCR em Tempo Real. A máquina MX4000 da Stratagene mede o produto da PCR que se acumula durante a fase exponencial da reação, antes que a amplificação se torne vulnerável à limitação de reagentes e variabilidade dos ciclos. A fluorescên- cia aumenta de acordo com níveis crescentes do produto da PCR. A quanti- dade relativa de cada transcrito foi determinada em termos de razão com a quantidade do transcrito de Beta-actina em cada amostra.

Os primers utilizados estão listados na Tabela 4 abaixo.

Gene Primer forward

HOXA1 CTGGCCCTGGCTACGTATAA (SEQ ID NO:7)

HOXA2 TTCAGCAAAATGCCCTCTCT (SEQ ID NO:9)

HOXA3 ACCTGTGATAGTGGGCTTGG (SEQ ID NO:11)

HOXA4 CCCTGGATGAAGAAGATCCA (SEQ ID NO: 13)

HOXA5 CCGGAGAATGAAGTGGAAAA (SEQ ID NO:15)

Primer reverse

TCCA- _

ACTTTCCCTGTTTTGG (SEQ ID NO:8)

TAGGCCAGCTCCA- CAGTTCT (SEQ ID NO: 10)

ATACAGCCATTCCAGCA- ACC (SEQ ID NO:12)

AATTGGAGGATCG- CATCTTG (SEQ ID NO:14)

ACGAGAACAGGGCTTCTT- CA (SEQ ID NO:16) Gene Primer forward

HOXA6 AAAGCACTCCATGACGAAGG (SEQ ID N0:17)

H0XA7 TGGTGTAAATCTGGGGGTGT (SEQ ID N0:19)

H0XA9 AATAACCCAGCAGCCAACTG (SEQ ID NO:21)

HO- ACACTGGAGCTGGAGAAGGA XA10 (SEQ ID NO:23)

HO- CGCTGCCCCTATACCAAGTA XA11 (SEQ ID NO:25)

HO- GGATATCAGCCACGACGAAT XA13 (SEQ ID NO:27)

HOXD1 TTCAGCACCAAGCAACTGAC (SEQ ID NO:29)

H0XD3 CAGCCTCCTGGTCTGAACTC (SEQ ID NO:31)

HOXD4 TCAAATGTGCCATAGCAAGC (SEQ ID NO:33)

H0XD8 TCAAATGTTTCCGTGGATGA (SEQ ID NO:35)

H0XD9 TCCCCCATGTTTCTGAAAAG (SEQ ID NO:37)

H0XD1 GCTCCTTCACCACCAACATT

0 (SEQ ID NO:39)

HOXD1 GGGGCTACGCTCCCTACTAC

1 (SEQ ID N0:41)

HOXD1 CGCTTCCCCCTATCTCCTAC

2 (SEQ ID NO:43)

HOXD1 GGGGATGTGGCTCTAAATCA

3 (SEQ ID NO:45)

Os resultados são apresentados todo, H0XA3 e H0XD9 foram identificadas para câncer de próstata, uma vez que estes expressados em amostras de tecido tumoral. Seqüência ID NO. 5 (polipeptídeo H0XA3)

Primer reverse

TCCTTCTCCAGCTC- CAGTGT (SEQ ID NO: 18)

TCTGATAA-

AGGGGGCTGTTG (SEQ ID N0:20)

ATTTT-

CATCCTGCGGTTCTG (SEQ ID NO:22)

GATCCGGTTTTCTCGATT- CA (SEQ ID NO:24)

GTCAAGGGCAAAATCTG- CAT (SEQ ID NO:26)

ATTATCTGGGCAAAGCA- ACG (SEQ ID NO:28)

TAGTGGGGGTTGTTCCA- GAG (SEQ ID N0:30)

ATCCAGGGGAA- GATCTGCTT (SEQ ID NO:32)

TCCATAGGGCCCTCC- TACTT (SEQ ID NO:34)

GCTCTTGGGCTTCCTTTTT C (SEQ ID NO:36)

GGGCTCCTCTAAGCCT- CACT (SEQ ID NO:38)

AAATATCCAGGGACGG- GAAC (SEQ ID N0:40)

GCTGCCTCGTAGA- ACTGGTC (SEQ ID NO:42)

CTTCGGGCGCATAGAACT- TA (SEQ ID NO:44)

AACCTGGACCACATCAG- GAG (SEQ ID NO:46)

na Figura 8. Utilizando este mé- como possíveis biomarcadores genes estão claramente super- MQKATYYDSSAIYGGYPYQAANGFAYNANQQPYPASAALGADGE

YHRPACSLQSPSSAGGHPKAHELSEACLRTLSAPPSQPPSLGEPPLHPPPPQAAPPAP QPPQPAPQPPAPTPAAPPPPSSASPPQNASNNPTPANAAKSPLLNSPTVAKQIFPWMK ESRQNTKQKTSSSSSGESCAGDKSPPGQASSKRARTAYTSAQLVELEKEFHFNRYLCR PRRVEMANLLNLTERQIKIWFQNRRMKYKKDQKGKGMLTSSGGQSPSRSPVPPGAGGY LNSMHSLVNSVPYEPQSPPPFSKPPQGTYGLPPASYPASLPSCAPPPPPQKR YTAAGA GAGGTPDYDPHAHGLQGNGSYGTPHIQGSPVFVGGSYVEPMSNSGPALFGLTHLPHAA SGAMDYGGAGPLGSGHHHGPGPGEPHPTYTDLTGHHPSQGRIQEAPKLTHL Seqüência ID N0.6 (Polipeptideo HOXD9) MSSSGTLSNYYVDSLIGHEGDEVFAARFGPPGPGAQGRPAGVAD

GPAAT AAEF ASCSF APRSAVFSASWSAVPSQPPAAAAMSGLYHPYVPPPPLAASASEP GRYVRSWMEPLPGFPGGAGGGGGGGGGGPGRGPSPGPSGPANGRHYGIKPETRAAPAP ATAASTTSSSSTSLSSSSKRTECSVARESQGSSGPEFSCNSFLQEKAAAATGGTGPGA GIGAATGTGGSSEPSACSDHPIPGCSLKEEEKQHSQPQQQQLDPNNPAANWIHARSTR KKRCPYTKYQTLELEKEFLFNMYLTRDRRYEVARILNLTERQVKIWFQNRRMKMKKMS

KEKCPKGD

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Het Ile Met Ser Ser Tyr Leu Met Asp Ser Asn Tyr Ile Asp Pro Lys 10 15

Phe Pxo Pro Cys Glu Glu Tyr Ser Gln Asn Ser Tyr Ile Pro Glu Hls 25 30

Ser Pro Glu Tyr Tyr Gly Arg Thr Arg Glu Ser Gly Phe Gln His His 40 45

His Gln Glu Leu Tyr Pro Pro Pro Pro Pro Arg Pro Ser Tyr Pro Glu 50 55 60

Arg Gln Tyr Ser Cys Thr Ser Leu Gln Gly Pro Gly Asn Ser Arg Gly 65 70 75 80

His Gly Pro Ala Gln Ala Gly His His His Pro Glu Lys Ser Gln Ser 85 90 95

Leu Cys Glu Pro Ala Pro Leu Ser Gly Ala Ser Ala Ser Pro Ser Pro 100 105 110

Ala Pro Pro Ala Cys Ser Gln Pro Ala Pro Asp His Pro Ser Ser Ala 115 120 125

Ala Ser Lys Gln Pro Ile Val Tyr Pro Trp Met Lys Lys Ile His Val 130 135 140

Ser Thr Val Asn Pro Asn Tyr Asn Gly Gly Glu Pro Lys Arg Ser Arg 145 150 155 160

Ala Ala Tyr Thr Arg Gln Gln Val Leu Glu Leu Glu Lys Glu Phe His 165 170 175 Tyr Asn Arg Tyr 180 Leu Thr Arg Arg Arg 185 Arg Ile Glu Ile Ala 190 His Leu Cys Leu 195 Ser Glu Arg Gln Ile 200 Lys Ile Trp Phe Gln 205 Asn Arg Met Lys 210 Trp Lys Lys Asp His 215 Arg Leu Pro Asn Thr 220 Lys Val Arg Ala Pro 225 Pro Ala Gly Ala 230 Ala Pro Ser Thr Leu 235 Ser Ala Al 3 Thr Gly Thr Ser Glu Asp 245 His Ser Gln Ser Ala 250 Thr Pro Pro Glu Gln 255 Arg Ala Glu Asp 260 Ile Thr Arg Leu <210> <211> <212> <213> 2 224 PRT Homo sapiens <40Q> Met Ser 1 2 Ser Tyr Phe 5 Vai Asn Ser Thr Phe 10 Pro Val Thr Leu Ala 15 Gly Glri Glu Ser 20 Phe Leu Gly Gln Leu 25 Pro Leu Tyr Ser Ser 30 Gly Ala Asp Pro 35 Leu Arg His Tyr Pro 40 Ala Pro Tyr Gly Pro 45 Gly Pro Gln Asp 50 Lys Gly Phe Ala Thr 55 Ser Ser Tyr Tyr Pro 60 Pro Ala Gly Gly Tyr 65 Giy Arg Ala Ala 70 Pro Cys Asp Tyr Gly 75 Pro Ala Pro Ala Tyr Arg Glu Glu 85 Ser ifVXd Cys Ala Leu 90 Ser Gly Ala Asp Glu 95

240

fne 80

Pro Pro Phe His Pro Glu Pro Arg Lys Ser Asp Cys Ala Gln Asp Lys 100 105 110

Ser Val Phe Gly Glu Thr Glu Glu Gln Lys Cys Ser Thr Pro Val Tyr 115 120 125

Pro Trp Met Gln Arg Met Asn Ser Cys Asn Ser Ser Ser Phe Gly Pro 130 135 140

Ser Gly Arg Arg Gly Arg Gln Thr Tyr Thr Arg Tyr Gln Thr Leu Glu

145 150 155 160

Leu Glu Lys Glu Phe His Tyr Asn Arg Tyr Leu Thr Arg Arg Arg Arg 165 170 175 Ile Glu Ile Ala His Ala Leu Cys 180

Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys 195 200

Ser Ala Ser Gln Leu Ser Ala Glu 210 215

Leu Thr Glu Arg Gln Ile Lys Ile 185 ISO

Trp Lys Lys Glu Ser Lys Leu Leu 205

Glu Glu Glu Glu Lys Gln AIa Glu 220

<21ü> 3

<211> 269

<212> PR7

<213> Homo sapiens

<400> Met Ser 1

Pro Asp

Ser Tyr

Tyr Asn 50

His Phe 65

Glrx Glu

Pro Glu

Ser Ala

Asn Phe 130

Ala Ala .145

Pro Met Phe Pro Asp Gly

Leu Glu

210

3

Ser Tyr

Tyr Gln 20

Arg Asp 35

GIy Met Gly Ala Pro Arg

Ser Leu

100

Ser Ser 115

Thr Glu

Ser Gln

Ala Thr

Trp Met 180

Lys Arg 195

Lys Glu

Phe Val 5

Leu Leu

Pro Ala

Asp Leu

Val Gly 7 0

Phe Arg

85

Pro Cys

Pro Ser

Ile Asp

Leu Ser 150

Ser Thr

165

Arg Lys Ala Arg Phe His

Asn Ser

Asn Tyr

Ala Met 40

Ser Val 55

Glu Ser

Gln Ala

Thr Asn

Asp Gln 120

GlU Ala 135

Ser Pro

Ala Ala

Leu His

Thr Ala 200

Phe Asn

<2IS

Phe Ser 10

Gly Ser

25

His Thr

Asn Arg

Ser Arg

Ala Ser 90

Gly Asp

105

Ala Thr

Ser Ala

Ser Leu

Pro Glu 170

Ile Ser 185

Tyr Thr Arg Tyr

Gly Arg

Gly Ser

Gly Ser

Ser Ser 60

Ala Phe 75

Ser Cys

Ser His

Ser AIa

Ser Ser

140

Ala Arg 155

Gly Gln His Asp Arg Tyr

Leu Thr

220

Tyr Pro

Ser Leu 30

Tyr Gly 45

Ala Ser

Pro Ala

Ser Leu

Gly Ala 110

Ser Ser 125

Glu Pro

Ala Gln

Thr Pro

Met Thr 190

Gln Thr 205

Arg Arg

Asn Gly 15

Ser Gly Tyr Asn S^JC 5 Θ ir

Pro AIa

80

Ser Ser 95

Lys Pro

Ser Ala

Glu Glu

Pro Glu 160

Gln Ile 175

Gly Pro Leu Glu Arg Arg Ile Glu Ile Ala His Ala Leu Cys Leu Ser Glu Arg Gln Ile Lys Ile

225 230 235 240

Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys Asp Asn Lys Leu Lys 245 250 255

Ser Met Ser Leu Ala Thr Ala Gly Ser Ala Phe Gln Pro 260 265

<21Q> 4

<211> 333

<212> PRT

<213> Horoo sapiens

<40Q> 4

Met Glu Glu Asn Asp Pro Lys Pro Gly Glu Ala Ala Ala Ala Val Glu 10 15

Gly Gln Arg Gln Pro Glu Ser Ser Pro Gly Gly Gly Ser Gly Glv Gly 25 30

Gly Gly Ser Ser Pro Gly Glu Ala Asp Thr Gly Arg Arg Arg Ala Leu 40 45

Ket Leu Pro Ala. Val Leu Gln Ala Pro Gly Asn His Gln His Pro His 50 55 60

Arg Ile Thr Asn Phe Phe lie Asp Asn Ile Leu Arq Pro Glu Phe Gly 65 70 75 80

Arg Arg Lys Asp Ala Gly Thr Cys Cys Ala Gly Ala Gly Gly Gly Arg 85 90 95

Gly Gly Gly Ala Gly Gly Giu Gly Gly Ma Ser Gly Ala Glu Gly Gly 100 105 110

Gly Gly Ala Gly Gly Ser Glu Gln Leu Leu Gly Ser Glv Ser Arg Glu 115 120 125

Pro Arg Gln. Asn Pro Pxo Cys Ala Pro Gly Ala Gly Gly Pro Leu Pro 130 135 140

Ala Ala Gly Ser Asp Ser Pro Gly Asp Gly Glu Gly Gly Ser Lys Thr 145 150 155 160

Leu Ser Leu His Gly Gly Ala Lys Lys Gly Gly Asp Pro Gly Gly Pro 165 170 175

Leu Asp Gly Ser Leu Lys Ala Arg Gly Leu Gly Gly Gly Asp Leu Ser 180 185 190

Val Ser Ser Asp Ser Asp Ser Ser Gln Ala Gly Ala Asn Leu Gly Ala 195 200 205

Gln Pro Met Leu Trp Pro Ala Trp Val Tyr Cys Thr Arg Tyr Ser Asp

210 215 220 Arg Pro Ser Ser Gly Pro Arg Ser Arg Lys Pro Lys Lys Lys Asn Pro

225 230 235 240

Asn Lys Glu Asp Lys Arg Pro Arc Thr Ala Phe Thr Ala Glu Gln Leu 245 250 255

Glii Arg Leu Lys Ala Glu Phe Gln Thr Asn Arg Tyr Leu Thr Glu Gln 2 60 265 270

Arg Arg Gln 27 5 Ser Leu Ala Gln Glu 280 Leu Ser Leu Asn Glu 285 Ser Gln Lys Ile 290 Trp Phe Gln Asn Lys 295 Arg Ala Lys Ile Lys 300 Lys Ala Thr Asn Lys 305 Asn Thr Leu Ala 310 Val His Leu Met Ala 315 Gln Gly Leu Tyr His Ser Thr Thr Ala 325 Lys Glu Gly Lys Ser 330 Asp Ser Glu <210> <211> <212> <213> 5 443 PRT Homo sapiens <400> Met Gln 1 5 Lys Ala Thr 5 Tyr Tyr Asp Ser Ser Ala Tyr Gly Gly 15 Pro Tyr Gln Ala 20 Ala Asn Gly Phe Ala 25 Tyr Asn Ala Asn Gln 30 Gln Tyr Pro Ala 35 Sei: Ala Ala Leu Gly Ala 40 Asp Gly Glu Tyr 45 His Arg Ala Cys 50 Ser Leu Gln Ser Pro 55 Ser Ser Ala Gly Gly 60 His Pro Lys His GlU 65 Leu Ser Glu Ala 70 Cys Leu Arg Thr Leu 75 Ser Ala Pro Pro Gln Pro Pro Ser Leu 85 Gly Glu Pro Pro Leu 90 His Pro Pro Pro Pro 95 Ala Ala Pro Pro 100 Ala Pro Gln Pro Pro 105 Gln Pro Ala Pro Gln 110 Pro Ala Pro Thr 115 Pro Ala Ala Pro Pro 120 Pro Pro Ser Ser Ala 125 Ser Pro Gln Asn 130 Ala Ser Asn Asn Pro 135 Thr Pro Ala Asn Ala 14 0 Ala Lys Ser Leu Leu Asn Ser Pro Thr Val Ala Lys Gln Ile Phe Pro Trp Het

320

80

145

150 155 3-60 Glu Ser Arg Gln Asn Thx Lys Gln Lys Thr Ser Ser Ser Ser Ser Gly 165 170 175

Glu Ser Cys Ma Gly Asp Lys Ser Pro Pro Gly Gln Ala Ser Ser Lys 180 185 190

Arg Ala Arg Thr Ala Tyr Tiir Ser Ala Gln Leu Val Glu Leu Glu Lys 195 200 205

Glu Phe His Phe Asn Arg Tyr Leu Cys Arg Pro Arg Arg Val Glu Met 210 215 220

Ala Asn Leu Leu Asn Leu Thr Gln Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln

225 230 235 240

Asn Arg Arg Met Lys Tyr Lys Lys Asp Gln Lys Gly Lys Gly Met Leu 245 250 255

Thr Ser Ser Gly Gly Gln Ser Pro Ser Arg Ser Pro Val Pro Pro Gly 260 265 270

Ala Gly Gly Tyr Leu Asn Ser Met His Ser Leu Val Asn Ser Val Pro 275 280 285

Tyr Glu Pro Gln Ser Pro Pro Pro Phe Ser Lys Pro Pro Gln Gly Thr

290 295 300

Tyr Gly Leu Pro Pro Ala Ser Tyr Pro Ala Ser Leu Pro Ser Cys Ala 305 310 315 320

Pro Pro Pro Pro Pro Gln Lys Arg Tyr Thr Ala Ala Gly Ala Gly Ala 325 330 335

Gly Gly Thr Pro Asp Tyr Asp Pro His Ala His Gly Leu Gln Gly Asn 340 345 350

Gly Ser Tyr Gly Thr Pro His Ile Gln Gly Ser Pro Val Phe Val Gly 355 360 365

Gly Ser Tyr Val Glu Pro Met Ser Asn Ser Gly Pro Ala Leu Phe Gly

370 375 380

Leu Thr His Leu Pro His Ala Ala Ser Gly Ala Met Asp Tyr Gly Gly 385 390 395 400

Ala Gly Pro Leu Gly Ser Gly His His Hxs Gly Pro Gly Pro Gly Glu 405 410 415

Pro Kis Pro Thr Tyr Thr Asp Leu Thr Gly His His Pro Ser Gln Gly 420 425 430

Arg lie Gln Glu Ala Pro Lys Leu Thr His Leu 435 440

<210> 6 <21i> 342 <212> PRT

<213> Horao sapiens

<400> 6

Met Ser Ser Ser Gly Thr Leu Ser Asn Tyr Tyr Val Asp Ser Leu Ile

1 5 10 15

Gly His Glu Gly Asp Glu Val Phe Ala Ala Arg Phe Gly Pxo Pro Gly 25 30

Pro Gly Ala Gln Gly Arg Pro Ala Gly Val Ala Asp Gly Pro Ala Ala 40 45

Thr Ala Ala Glu Phe AIa Ser Cys Ser Phe Ala Pro Arg Ser Ala Val

50 55 60

Phe Ser Ala Ser Trp Ser Ala Val Pro Ser Gln Pro Pro Ala Ala Ala 65 70 75 80

Ala Met Ser Gly Leu Tyr His Pro Tyr Val Pro Pro Pro Pro Leu Ala 85 90 95

Ala Ser Ala Ser Glu Pro Glv Arg Tyr Val Arg Ser Trp Met Glu Pro

100 105 110

Leu Pro Gly Phe Pro Gly Gly Ala Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly 115 120 125

Gly Gly Pro Gly Arg GXy Pro Ser Pro Gly Pro Ser Gly Pro Ala Asn 130 135 140

Gly Arg His Tyr Gly Ile Lys Pro Glu Thr Arg Ala Ala Pro Ala Pro 14 5 150 155 160

Ala Thr Ala Ala Ser Thr Thr Ser Ser Ser Ser Thr Ser Leu Ser Ser 165 170 17 5

Ser Ser Lys Arg Thr Glu Cys Ser Val Ala Arg Glu Ser Gln Gly Ser 180 185 190

Ser Gly Pro Glu Phe Ser Cvs Asn Ser Phe Leu Gln Glu Lys Ala Ala 195 " 200 205

Ala Ala Thr Gly Gly Thr Gly Pro Gly Ala Gly Ile Gly Ala Ala Thr 210 215 220

Gly Thr Gly Gly Ser Ser Glu Pro Ser Ala Cys Ser Asp His Pro Ile 225 230 235 240

Pro Gly Cys Ser Leu Lys Glu Glu Glu Lys Gln His Ser Gln Pro Gln 245 250 255

Gln Gln Gln Leu Asp Pro Asn Asn Pro Ala Ala Asn Trp Ile His Ala 260 265 270

Arg Ser Thr Arg Lys Lys Arg Cys Pro Tyr Thr Lys Tyr Gin Thr Leu

275 280 285 Glu Leu Glu Lys Glu Phe Leu Phe Asn Met Tyr Leu Thr Arg Asp Arg 290 295 300

Arg Tyr Glu Val Ala Arg Ile Leu Asn Leu Thr Glu Arg Glrt Val Lys 305 310 315 320

Tle Trp Phe Gln Asn Arg Arg Ket Lys Met Lys Lys Met Ser Lys Glu 325 330 335

Lys Cys Pro Lys Gly Asp 340

<210> 7 <2ll> 20 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Primer forward de HOXAl

<400> 7

ctggccctgg ctacgtataa

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Primer forward de HOXAl

<400> 8

u CC 3,9 0111C cctgttttgg

<210> 9 <2.11> 20 <212> DNA <213> Seqüência Artificial <220> <22 3> Primer forward de H0XA2 <400> 9

ttcagcaaaa tgccctctct

<210> 10

<211> 20 <212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Primer forward de HOXA2

<400> 10

taggccagct ccacagttct

20 <210> 11 <211> 20 <212> DMA <213> Seqüência Artificial <22 0> <22 3 > Primer forwards de HOXA3 <400> 11 acctgtgata gtgggcttgg <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Seqüência Artificial <220> <223> Primer reverse de HOXA3 <400> 12 atacagccat tccagcaacc <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Seqüência Artificial <220> <223> Primer forwards de HOXA4 <400> 13 ccctggatga agaagatcca <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Seqüência Artificial <220> <223> Primer reverse de HOXA4 <4GQ> 14

aattggagga tcgcatcttg

<210> 15

<21 i> 20

<212 > DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Primer forward de H0XA5

<400> 15

ccggagaatg aagtggaaaa

<210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Seqüência Artificial <220>

<223> Primer reverse de HOXA5

<400> IS

acgagaacag ggcttcttca

<210> 17 <211> 20 <212 > DNA <213> Seqüência Artificial <220> <223> Primer forwards de HOXA6 <4 00> 17

aaageac.tcc atgacgaagg

<210> IB

<211> 20

<212> PNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Primer reverse de H0XA6

<400> IB

tccttctcca gctccagtgt

<210> 19

<211> 20

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Primer forward de HOXA7

<400> 19

tggtgtaaat ctgggggtgt

<2i0> 20

<211> 20

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Primer reverse de HOXA7

<400> 20

tctgataaag ggggctgttg

<210> 21

<211> 2.0

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220> <223> Primer forwards de HOXA9 <400> 21 aataacccag cagccaactg <210> 22 <211> 20 <212> DKA <213> Seqüência Artificial <220> <223> Primer reverse de HOXA9 <400> 22 atttLcatcc tgcggttctg <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> Seqüência Artificial <220> <223> Primer forwards de HOXAlO <400> 23 acactgg age tggagaagga <210> 24 <211> 20 <212> DNA <213> Seqüência Artificial

<220>

<223> Primer reverse de HOXAlO

<400> 24

gatccggttt tctcgattca

<2X0> 25

<211> 20

<212> DMA

<213> Seqüência Artificial <22Q>

<223> Primer forwards de HOXAll <4G0> 25

cgctgcccct ataccaagta

<210> 26

<211> 20

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220> <223> Primer reverse de HOXAll

<400> 26

gtcaagggca aaatctgcat

<210> 27

<211> 20

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Primer forwards de HOXAl3

<400> 27

ggatatcagc cacgacgaat

<210> 28

<211> 20

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Primer reverse de HOXA13

<400> 28

attatctggg caaagcaaeg 20

<210> 29

<211> 20

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Primer forwards de HOXDl

<400> 29

ttcagcacca agcaactgac

<210> 30 <211> 20 <212> DNA <213> Seqüência Artificial <220> <223> Primer reverse de HOXDl

<400> 30

tagtgggggt tgttccagag

<210> 31

<211> 20

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> Primer forwards de HOXD3 <40ϋ> 31

cagectcctg gtctgaactc

<210> 32 <211> 20 <212> DNA <213> Seqüência Artificial <220> <223> Primer reverse de HOXD3 <40Q> 32

atccagggga agatctgctt

<21G> 33

<211> 20

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Primer forwards de H0XD4

<400> 33

tcaaatgtgc catagcaagc

<210> 34

<211> 20

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial <22G>

<223> Primer reverse de HOXD4

<400> 34

tccatagggc cctcctactt

<210> 35

<211> 20

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Primer forwards de HOXD8

<400> 35

tcaaatgttt ccgtggatga

<210> 36

<211> 20

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Primer reverse de HOXD8

<4Q0> 36

gctcttgggc ttcctttttc <210> 37 <211> 20 <212> DNA <213> Seqüência Artificial <220> <223> Primer forwards de HOXD9 <400> 37

tcccccatgt ttctgaaaag

<210> 38

<211> 20

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Primer reverse de HOXD9

<400> 38

gggctcctct aagcctcact

<210> 39 <211> 20 <212> DMA <213> Seqüência Artificial <220> <223> Primer forwards de HOXDlO <400> 3S gctccttcac caccaacatL <210> 40 <211> 20 <212> DNA <213> Seqüência Artificial <220> <223> Primer reverse de HOXDlO <400> 40 aaatat ccag ggacgggaac <210> 41 <211> 20 <212> DNA <213> Seqüência Artificial <220> <223> Primer forwards de HOXDll <4G0> 41 ggggctacgc tccctactac

<210> 42 <211> 20

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Prímer reverse de HOXDll

<400> 42

gctgcctcgt agaactggtc

<210> 43

<211> 20

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> primer forwards de HOXD12

<400> 4 3

cgcttccccc tatctcctac

<210> 44

<211> 20

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Primer reverse de HOXD12

< 4 Q Q > 44

cttcgggcgc atagaactta

<210> 45

<211> 20

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Primer forwards de HOXD13

<400> 45

ggggatgtgg ctctaaatca

<210> 46 <211> 20 <212> DNA <213> Seqüência Artificial <22C> <223> Primer reverse de HOXDl3 <4 00> 4 6

aacctggacc acatcaggag

Claims (38)

1. Método de diagnóstico ou monitoramento da progressão de câncer de próstata, compreendendo a detecção e/ou quantificação de um fator de transcrição contendo ao menos um homeodomínio, ou um fragmen- to deste, em líquido corporal.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o fator de transcrição contendo o homeodomínio é um peptídeo HOX ou um peptídeo EN-2.

3. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, em que o pep- tídeo, ou fragmento deste, é ou é derivado de H0XC4, HOXB5, H0XB6, H0XA3, H0XD9 e/ou EN-2.

4. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, em que o pep- tídeo, ou fragmento deste, é ou é derivado de H0XC4, H0XB5, HOXB6 e/ou EN-2.

5. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, em que o peptídeo, ou fragmento deste, é ou é derivado da SEQ ID NO. 1, SEQ ID NO. 2, SEQ ID NO. 3, SEQ ID NO. 4, SEQ ID NO. 5 e/ou SEQ ID NO. 6.

6. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, em que o peptídeo, ou fragmento deste, é ou é derivado da SEQ ID NO. 1, SEQ ID NO. 2, SEQ ID NO. 3 e/ou SEQ ID NO. 4.

7. Método de acordo com a reivindicação 5 ou reivindicação 6, em que o fragmento possui pelo menos 80% de homologia de seqüência com a referida Seqüência ID NO., mais preferivelmente 85%, mais preferi- velmente 90%, mais preferivelmente 95%, mais preferivelmente 97%, mais preferivelmente 99% e, o mais preferivelmente, 99,9% de homologia de se- qüência com a referida Seqüência ID NO.

8. Método de acordo com qualquer entre a reivindicação 5 ou reivindicação 7, em que o fragmento compreende pelo menos quatro amino- ácidos consecutivos da referida Seqüência ID NO.

9. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 3 a 8, em que pelo menos único peptídeo HOX, peptídeo EN-2 ou um fragmento destes está presente em uma amostra biológica de um sujeito em teste.

10. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, em que o líquido corporal é líquido celular, líquido cefalorraqui- diano (LCR), sêmen, urina, sangue ou saliva.

11. Método de acordo com a reivindicação 10, em que o líquido corporal é sangue ou soro.

12. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes para detectar o início, progressão, estabilização, melhora e/ou remissão de câncer de próstata.

13. Método de acordo com a reivindicação 12, em que são pro- vidas pelo menos duas etapas da detecção e/ou quantificação, espaçadas por intervalo temporal.

14. Método de acordo com a reivindicação 13, em que as pelo menos duas etapas são espaçadas por intervalo de alguns dias, semanas, anos ou meses, para determinar se os níveis de pelo menos um único peptí- deo HOX, ou fragmento deste, alteraram, indicando dessa forma se houve alteração na progressão do câncer, possibilitando a comparação entre um nível do biomarcador em amostras coletadas em duas ou mais ocasiões, uma vez que aumento no nível de pelo menos único peptídeo em relação ao tempo é indicativo do início ou progressão do câncer, enquanto diminuição no nível de pelo menos único peptídeo pode indicar melhora e/ou remissão do câncer.

15. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, compreendendo a comparação do nível do peptídeo presente em uma amostra em teste com o nível em um ou mais controles.

16. Método de diagnóstico de câncer de próstata compreenden- do a quantificação ou detecção da quantidade de fator de transcrição con- tendo pelo menos um homeodomínio, tal como peptídeo HOX ou peptídeo EN-2, ou fragmento destes, detectável em líquido corporal, e comparação da quantidade do referido pelo menos único peptídeo na referida amostra em teste com a quantidade presente em uma amostra biológica normal de con- trole de um sujeito normal sem câncer, onde aumento no nível do fator de transcrição contendo pelo menos único homeodomínio, ou fragmento deste, encontrado na amostra em teste é indicativo de que a doença está progre- dindo ou teve início.

17. Método de acordo com a reivindicação 16, em que o aumen- to é estatisticamente significativo, determinado pelo uso de "teste-t" com in- tervalos de confiança preferivelmente de pelo menos 80%, mais preferivel- mente de pelo menos 85%, mais preferivelmente de pelo menos 90%, mais preferivelmente de pelo menos 95%, mais preferivelmente de pelo menos 99 mais preferivelmente de pelo menos 99,5%, mais preferivelmente de pelo menos 99,95% e, o mais preferível, de pelo menos 99,99%.

18. Método de acordo com a reivindicação 16 ou 17, em que um aumento entre o controle e uma amostra indicativo de câncer de próstata em estágio inicial é em torno de entre 110-200% e, o mais preferível, em torno de 125%.

19. Método de acordo com a reivindicação 16 ou 17, em que um aumento entre o controle e uma amostra indicativo do referido câncer de próstata em estágio tardio é em torno de entre 550-620%, mais preferivel- mente em torno de entre 560-600%, mais preferivelmente em torno de entre 570-590% e, o mais preferível, em torno de 580%.

20. Método de acordo com a reivindicação 16 ou 17, em que um aumento, relativo a uma amostra de estágio inicial ou de controle, em torno de entre 100% e 300% e, de preferência, em torno de 200% é indicativo de progressão do câncer da doença em estágio inicial para tardio.

21. Método de monitoramento da eficácia de um tratamento para câncer de próstata, compreendendo a quantificação ou detecção da quanti- dade de fator de transcrição contendo pelo menos um homeodomínio, tal como peptídeo HOX ou peptídeo EN-2, ou fragmento destes, presente em uma amostra biológica de um sujeito.

22. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 21, em que a detecção e/ou quantificação de fator de transcrição contendo pelo menos um homeodomínio, tal como peptídeo HOX ou peptídeo EN-2, ou fragmento destes, detectável em líquido corporal é por um ou mais méto- dos compreendidos no grupo constituído por: MALDI-TOF, SELDI, por inter- médio de interação com um Iigante ou ligantes, sistemas de análise à base de gel em 1-D ou 2-D, Cromatografia Líquida combinando técnicas de cro- matografia líquida e de espectrometria de massa, incluindo ICAT® ou i- TRAQ®, cromatografia em camada delgada e espectroscopia NMR.

23. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, em que a detecção e/ou quantificação de fator de transcrição contendo pelo menos um homeodomínio, tal como peptídeo HOX ou peptí- deo EN-2, ou fragmento destes, é por um ou mais métodos compreendidos no grupo constituído por: imunoensaios do tipo sanduíche, ensaios imuno- enzimáticos de absorção (ELISAs), radio-imunoensaios (RAI), ensaios imu- noenzimáticos (EIA), Western Blotting, imunoprecipitação e imunoensaios à base de partículas, incluindo com uso de ouro, prata ou partículas de látex, partículas magnéticas ou Q-dots.

24. Método de acordo com a reivindicação 23, em que a detec- ção e/ou quantificação de fator de transcrição contendo pelo menos um ho- meodomínio, tal como peptídeo HOX ou peptídeo EN-2, ou fragmento des- tes, é realizada em placa de microtitulação, formato de faixa, arranjo ou so- bre chip.

25. Método de acordo com a reivindicação 24, em que a detec- ção e/ou quantificação de fator de transcrição contendo pelo menos um ho- meodomínio, tal como peptídeo HOX ou peptídeo EN-2, ou fragmento des- tes, é pela técnica ELISA compreendendo anticorpos específicos para o pelo menos único peptídeo HOX, peptídeo EN-2, ou fragmento destes, de prefe- rência ligado a um repórter.

26. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, em que a detecção e/ou quantificação de pelo menos único peptídeo HOX, peptídeo EN-2, ou fragmentos destes, é por um biossensor.

27. Uso de fator de transcrição contendo pelo menos um home- odomínio, tal como peptídeo HOX ou peptídeo EN-2, ou fragmento destes, detectável em líquido corporal, como biomarcador para câncer de próstata.

28. Uso de acordo com a reivindicação 27, em que o peptídeo, ou fragmento deste, é ou é derivado de H0XC4, H0XB5, H0XB6, HOXA3, HOXD9 e/ou EN-2.

29. Uso de acordo com a reivindicação 28, em que o peptídeo, ou fragmento deste, é ou é derivado da SEQ ID NO. 1, SEQ ID NO. 2, SEQ ID NO. 3, SEQ ID NO. 4, SEQ ID NO. 5 e/ou SEQ ID NO. 6.

30. Uso de acordo com a reivindicação 27, em que o peptídeo, ou fragmento deste, é ou é derivado de HOXC4, HOXB5, HOXB6 e/ou EN-2.

31. Uso de acordo com a reivindicação 30, em que o peptídeo, ou fragmento deste, é ou é derivado da SEQ ID NO. 1, SEQ ID NO. 2, SEQ ID NO. 3 e/ou SEQ ID NO. 4.

32. Uso de acordo com qualquer uma entre a reivindicação 29 ou reivindicação 31, em que o fragmento possui pelo menos 80% de homo- Iogia de seqüência com a referida Seqüência ID NO., mais preferivelmente85%, mais preferivelmente 90%, mais preferivelmente 95%, mais preferivel- mente 97%, mais preferivelmente 99% e, o mais preferível, 99,9% de homo- Iogia de seqüência com a referida Seqüência ID NO.

33. Uso de acordo com a reivindicação 29, 31 ou reivindicação32, em que o fragmento compreende pelo menos quatro aminoácidos con- secutivos da referida Seqüência ID NO.

34. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações de 27 a33, em que o referido uso está incluído em um método selecionado do grupo constituído por: investigação clínica, métodos de avaliação de prognóstico, monitoramento dos resultados de terapia, método para identificar pacientes com mais possibilidade de responderem a um tratamento terapêutico em particular e seleção e desenvolvimento de fármacos.

35. Kit para uso de acordo com qualquer reivindicação prece- dente, compreendendo um Iigante capaz de ligar-se ou de reconhecer espe- cificamente pelo menos um peptídeo HOX, peptídeo EN-2 ou um fragmento destes, detectável em líquido corporal e por meio de repórter.

36. Kit de acordo com a reivindicação 35, sendo este um arranjo ou chip.

37. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a .10, em que a amostra de líquido corporal está substancialmente livre de cé- lulas.

38. Uso de acordo com a reivindicação 34, em que os referidos pacientes foram previamente diagnosticados como negativos para câncer utilizando um ensaio que detecta PSA.