BRPI0720389A2 - Método para manejo de resistência em um terreno de culturas de plantas resistentes a praga - Google Patents

Description

MÉTODO PARA MANEJO DE RESISTÊNCIA EM UM TERRENO DE CULTURAS DE PLANTAS RESISTENTES A PRAGA

REFERÊNCIA PARA PEDIDOS RELACIONADOS 5 Este pedido reivindica prioridade do Pedido Provisório

Norte-Americano No. 60/871.671, depositado em 22 de dezembro de 2006, cujo conteúdo é incorporado por referência, na sua totalidade.

CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção diz respeito a métodos de manejo da resistência em um terreno de cultivo de plantas resistentes a praga.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

Insetos, nematóides, artrópodes e afins destroem anualmente um número estimado de 15% das culturas agrícolas nos Estados Unidos e ainda mais do que nos países em desenvolvimento. Anualmente, essas pragas causam mais de 10 0 2 0 bilhões de dólares em danos às culturas dos EUA sozinho. Além disso, a competição com ervas daninhas e plantas parasitas e saprófitas representam perdas de produtividade em potencial ainda maiores.

Alguns destes danos ocorrem no solo quando patógenos de 2 5 plantas, insetos e outras pragas suportadas no solo atacam as sementes após o plantio. Na produção de milho, por exemplo, grande parte do dano é causada por lagartas de raiz {rootworms) , insetos-praga que se alimentam em, ou danificam, de outra forma raízes da planta, e por lagartas de corte 30 (cutworms), broca de milho europeu, e outras pragas que se alimentam em, ou danificam, as partes da planta acima do solo. A descrição geral do tipo e mecanismos de ataque de pragas em culturas agrícolas é fornecida por, e.g., Metcalf (1962), in Destructive and Useful Insects, 4th ed. (McGraw-Hill Book Co., 5 NY); e Agrios (1988), in Plant Pathologyf 3d ed. (Academic Press, NY).

Em uma batalha sazonal em curso, os agricultores devem aplicar bilhões de galões de pesticidas sintéticos para combater estas pragas. No entanto, pesticidas sintéticos 10 colocam muitos problemas. Eles são caros, custando aos agricultores americanos sozinhos quase 8 bilhões de dólares por ano. Eles forçam o aparecimento de pragas resistentes ao inseticida, e que podem prejudicar o ambiente.

Devido à preocupação com o impacto dos pesticidas sobre a 15 saúde pública e a saúde do meio ambiente, importantes esforços têm sido feitos para encontrar maneiras de reduzir a quantidade de pesticidas químicos que são utilizados. Recentemente, grande parte deste esforço tem-se centrado sobre o desenvolvimento de plantas transgênicas que são projetadas para expressar agentes

2 0 tóxicos para insetos derivados de microrganismos. Por exemplo, Patente US No. 5,877,012 para Estruch et al. divulga a clonagem e expressão de proteínas a partir de organismos, tais como Bacillus, Pseudomonas, Clavibaeter e Rhizobium em plantas para se obter plantas transgênicas com resistência a pragas, tais 25 como lagartas de rosca, lagartas militares, várias brocas e outras pragas. Publicação WO/EP97/07089 por Privalle et al. ensina a transformação de monocotiledôneas, tais como o milho, com uma seqüência de DNA recombinante codificando peroxidase para a proteção da planta contra a alimentação de brocas de 30 milho, lagartas de espiga e lagartas de corte. Jansens et al. (1997) Crop Sci., 37(5): 1616-1624, relataram a produção de milho transgênico contendo um gene que codifica para uma proteína cristalina de Bt que controlava ambas as gerações de brocas do milho europeu (ECB). Patente US nos. 5,625,136 e 5 5,859,336 para Koziel et al. informou que a transformação do milho com um gene de Bt que codifica para uma δ-endotoxina provem uma melhor resistência do milho transgênico ao ECB. Um relatório completo das triagens de campo de milhos transgênicos que expressam uma proteína inseticida de Bacillus thuringiensis 010 (Bt) foi fornecida por Armstrong et al. , em Crop Science, 35(2)

:550-557 (1995) .

Uma abordagem ecologicamente amigável para controlar pragas é a utilização de proteínas cristalizadas pesticidas derivadas da bactéria do solo Bacillus thuringiensis (Bt) ,

15 vulgarmente designadas por "proteínas Cry" ou "peptídeo Cry" . As proteínas Cry são moléculas de proteínas globulares que acumulam como protoxinas na forma cristalina durante a fase tardia da esporulação de Bt. Após a inmanejo pela praga, os cristais são solubilizados para liberar protoxinas no meio ^^20 alcalino do intestino médio das larvas. Protoxinas (~ 130 kDa) são convertidas em fragmentos tóxicos (~ 66 kDa da região N terminal) por proteases do intestino. Muitas dessas proteínas são muito tóxicas para insetos-alvo específicos, mas inofensivas para as plantas e outros organismos não-alvo.

2 5 Algumas proteínas Cry foram expressas de forma recombinante em

plantas cultivadas para fornecer plantas transgênicas resistentes à praga. Entre essas, algodão e milho Bt- transgênicos têm sido amplamente cultivados.

Um grande número de proteínas Cry foi isolado,

3 0 caracterizado e classificado com base em homologia de seqüência de aminoácidos (Crickmore et al. , 1998, Microbiol. Mol. Biol. Rev., 62: 807-813). Este sistema de classificação oferece um mecanismo sistemático para nomear e categorizar proteínas Cry recém-descobertas. A classificação Cryl é a mais conhecida e 5 contém o maior número de genes cry, que atualmente totaliza mais de 13 0.

Um biótipo ocidental da vaquinha (western corn rootworm, WCRW) , que deposita seus ovos em soja e possivelmente outras culturas, é agora capaz de causar danos significativos para o milho de primeiro ano (ou seja, o milho que não tenha seguido sistematicamente milho). Esse biotipo é comumente chamado de vaquinha de primeiro ano ou vaquinha rotação-resistente. Milho de primeiro ano também pode ser suscetível a lesão de vaquinha quando os ovos permanecem no solo por mais de um ano. Nesta situação, os ovos depositados no ponto permanecem latentes durante todo o ano seguinte e, então, eclodem no próximo ano, quando o milho pode voltar a ser plantado em um ciclo de rotação de dois anos. Essa atividade da vaquinha é denominada sistema radicular diapausa prorrogada e é comumente associada à 2 0 vaquinha do norte {northern corn rootworm, NCRW), especialmente na região noroeste do cinturão do minho (Corn Belt) .

Além disso, a maioria dos países, incluindo os Estados Unidos, exige a implementação de um plano de manejo de insetos resistentes (IRM) quando culturas transgênicas são 25 comercializadas de forma a minimizar o desenvolvimento de parasitas resistentes e, assim, prolongam a vida útil de bioinseticidas conhecidos. Um dos componentes mais comuns de um plano IRM é um refúgio onde numa determinada cultura, 80% das sementes transgênicas plantadas pode conter um evento que mata 30 uma praga alvo (tal como WCRW) , mas 20% das sementes transgênicas não devem conter um evento transgênico com atividade contra a praga alvo. 0 objetivo dessa estratégia de refúgio é impedir pragas alvo de desenvolver resistência a um determinado biopesticida produzido pela cultura transgênica.

5 Devido ao fato de que os insetos alvo que atingem a maturidade na área 80% transgênica poderiam ser, mais provavelmente, portadores de genes de resistência ao biopesticida usado lá, o refúgio permite desenvolver insetos adultos WCRW que não são resistentes ao biopesticida utilizado nas sementes 10 transgênicas. Como resultado, os insetos não-resistentes cruzam com os insetos resistentes e, devido ao fato de que o gene de resistência ser tipicamente recessivo elimina-se grande parte da resistência na próxima geração de insetos. 0 problema desta estratégia de refúgio é que, a fim de se produzir insetos 15 suscetíveis, algumas das culturas plantadas devem ser sensíveis às pragas, reduzindo assim a produtividade.

Como indicado acima, uma preocupação é que ECB, WCRW, ou outras pragas resistentes surgirão. Uma estratégia para combater o desenvolvimento de resistência é a de selecionar um 20 evento de milho recombinante que expressa altos níveis da proteína inseticida tais que uma ou algumas mordidas de uma planta milho transgênico provocaria, pelo menos, cessação total da alimentação e posterior morte da praga, mesmo se a praga é heterozigótica para a resistência característica (ou seja, a 25 praga é o resultado do acasalamento de uma praga resistente com uma praga não-resistente) .

Outra estratégia seria a de combinar uma segunda proteína inseticida específica para ECB ou WCRW sob a forma de um evento recombinante na mesma planta ou em uma planta adjacente, por 3 0 exemplo, outra proteína Cry inseticida ou, em alternativa, outra proteína recombinante, tais como uma lipídio acil hidrolase ou inseticida variante desta. Ver, por exemplo, WO 01/49834. Preferencialmente, a segunda toxina ou complexo de toxinas teria um modo de ação diferente da primeira toxina, e 5 de preferência, se receptores estiverem envolvidos na toxicidade do inseto com a proteína recombinante, os receptores para cada uma das duas ou mais proteínas inseticidas em uma mesma planta ou numa planta adjacente seriam diferentes, para que se uma mudança de função de um receptor ou uma perda de ^^10 função de um receptor se desenvolvesse como a causa da resistência a uma proteína inseticida particular, então ela não deveria e provavelmente não iria afetar a atividade inseticida da toxina restante que ligaria-se a um receptor diferente do receptor causador da perda de função de uma das duas proteínas 15 inseticidas clonadas em uma planta. Assim, o primeiro um ou mais transgenes e o segundo um ou mais transgenes são inseticidas preferenciais ao mesmo inseto-alvo e se ligam sem competição a diferentes sítios na membrana intestinal do inseto-alvo.

^^20 Outra estratégia ainda seria combinar um pesticida químico

com uma proteína pesticida expressa em uma planta transgênica. Este poder vir a assumir a forma de um tratamento químico de sementes recombinantes que permitiria a dispersão em uma zona em torno da raiz de uma quantidade pesticida controle de 25 pesticidas químicos, que protegem os tecidos da raiz de infestação de pragas-alvo, por tanto tempo quanto o produto químico persista, ou o tecido da raiz se mantenha dentro da zona de dispersão do pesticida no solo.

Outra alternativa para as formas convencionais de 3 0 aplicação de pesticidas é o tratamento de sementes de plantas com pesticidas. O uso de fungicidas e nematicidas para proteger as sementes, raízes jovens, brotos do ataque após o plantio e germinação, bem como a utilização de baixos níveis de inseticidas para a proteção, por exemplo, de sementes de milho 5 contra larva-arame, têm sido utilizadas há algum tempo. Tratamento de sementes com pesticidas tem a vantagem de proporcionar a proteção das sementes, enquanto minimiza a quantidade de pesticida necessária e limita a quantidade de contato com o pesticida e o número de diferentes aplicações 10 necessárias para se alcançar o controle de pragas no campo.

Outros exemplos de controle de pragas através da aplicação de inseticidas diretamente em sementes plantadas são fornecidos, por exemplo, Patente US No. 5,696,144, que divulga que ECB causou menos danos de alimentação em milho cultivado a partir de sementes tratadas com o composto 1-arilpirazole a uma taxa de 5 00 g por quintal de sementes do que em plantas controle crescidas a partir de sementes não tratadas. Além disso, Patente US No. 5876739 para Turnblad et al. (e a patente para o pedido original, Patente US No. 5849320) divulga um método de controle de insetos nascidos no solo que envolve o tratamento das sementes com um revestimento contendo um ou mais ligantes poliméricos e um inseticida. Esta referência fornece uma lista de inseticidas que se identificam como candidatos para serem utilizados neste revestimento e também nomeia um número de potenciais insetos-alvo.

Embora os desenvolvimentos recentes da engenharia genética de plantas têm melhorado a capacidade de proteger as plantas de pragas sem usar pesticidas químicos, e enquanto tais técnicas, tais como o tratamento de sementes com pesticidas têm reduzido os efeitos nocivos dos pesticidas no ambiente, muitos problemas subsistentes limitam o êxito da aplicação destes métodos em reais condições de campo.

Manejo de insetos resistentes (do inglês, IRM) é o termo usado para descrever práticas destinadas a reduzir o potencial de insetos-praga de se tornar resistentes a um pesticida. Manutenção de Bt IRM é de grande importância devido à ameaça que os insetos resistentes representam para o futuro uso de Bt protetores plantas-incorporados e tecnologia Bt como um todo. Estratégias IRM específicas, tais como a estratégia de dose elevada/refúgio estruturado, mitigam a resistência de insetos a proteínas Bt específicas produzidas em milho, algodão e batata. No entanto, essas estratégias resultam em terrenos de culturas de milho deixadas suscetíveis a uma ou mais pragas, a fim de garantir que insetos não resistentes se desenvolvam e tornem-se disponíveis para acasalamento com qualquer parasita resistente produzido em culturas protegidas. Assim, da perspectiva de um agricultor/produtor, é altamente desejável se ter um refúgio tão pequeno quanto possível, e ainda gerir resistência de insetos, a fim de que o maior rendimento seja obtido, enquanto ainda se mantêm a eficácia do método antiparasitas utilizado, quer Bt, químicos, outro método, ou combinações dos mesmos.

As estratégias IRM mais freqüentemente utilizadas atualmente são uma dose elevada e a plantação de um refúgio (uma parte do total da área plantada com sementes não-St), como

2 5 é comumente-acreditado que isso irá atrasar o desenvolvimento da resistência dos insetos a culturas Bt pela manutenção da suscetibilidade do inseto. A estratégia de dose mais elevada / refúgio assume que a resistência ao Bt é recessiva e é conferida por um único lócus com dois alelos, resultando em 30 três genótipos: homozigotos suscetíveis (SS), heterozigotos (RS) , e homozigotos resistentes (RR) . Ele também pressupõe que haverá uma baixa frequência inicial do alelo resistente e que haverá um extenso acasalamento aleatório entre adultos resistentes e suscetíveis. Sob circunstâncias ideais, apenas 5 raros indivíduos RR irão sobreviver a uma dose elevada de Bt produzida pela cultura. Ambas os indivíduos SS e RS serão suscetíveis à toxina Bt. Um refúgio estruturado não-Bt é uma porção do campo ou conjunto de campos de um agricultor que prevê a produção de espécies de insetos sensíveis (SS) que 10 podem copular aleatoriamente com os raros insetos resistente (RR) sobreviventes a Bt para a produção de culturas suscetíveis RS heterozigotas que irão ser mortas pela cultura Bt. Isto irá remover alelos resistentes (R) das populações de inseto e atrasar a evolução da resistência. MON8IO, BTll e TC1507 são 15 produtos que se acredita ser de "dose elevada" contra ECB atualmente à disposição.

A estratégia de dose mais elevada/refúgio é a estratégia preferida atualmente para IRM. Estratégias de dose não-alta são atualmente utilizadas em uma estratégia IRM aumentando o

2 0 tamanho do refúgio. 0 refúgio é aumentado, porque a falta de

uma dose elevada pode permitir a sobrevivência de resistentes parciais (ou seja, insetos heterozigotos com um alelo de resistência), aumentando a freqüência dos genes de resistência em uma população de insetos. Por esta razão, muitos 25 pesquisadores e grupos de peritos IRM têm concordado em que dose não elevada de expressão Bt apresenta um risco substancial de resistência em relação à dose elevada de expressão (Roush 1994, Gould 1998, Onstad & Gould 1998, SAP 1998, ILSI 1998, UCS 1998, SAP 2001). No entanto, essas estratégias de dose não

3 0 elevada são normalmente inaceitáveis para o agricultor, uma vez que o maior tamanho do refúgio resulta em novas perdas de rendimento.

Atualmente, o tamanho, localização e manejo do refúgio são considerados críticas para o sucesso da estratégia de alta dose/refúgio estruturado para mitigar a resistência de inseto as proteínas Bt produzidas no milho, algodão e batata. Refúgios estruturados são geralmente necessários para incluir todas as plantas não Bt hospedeiras susceptíveis para uma praga-alvo que são plantadas e geridas por pessoas. Estes refúgios poderiam ser plantados para oferecer refúgios, ao mesmo tempo em que as culturas Bt estão disponíveis para as pestes ou nos momentos em que as culturas Bt não estão disponíveis. Os problemas com esses tipos de refúgios incluem a garantia do cumprimento dos requisitos por agricultores individuais. Devido à diminuição da produtividade em áreas de plantação refúgio, alguns agricultores optam por se afastar dos requisitos do refúgio, e outros não seguem os requisitos de tamanho e/ou colocação. Estas questões de não-cumprimento resultam tanto em ausência de refúgio ou em refúgios menos eficazes, e um correspondente aumento no desenvolvimento de pragas resistentes.

Broca de milho Européia (do inglês, ECB)

ECB é uma das principais pragas do milho ao longo da maior parte dos Estados Unidos. A praga tem 1-4 gerações por ano, com 25 univoltina (isto é, uma geração por ano) em populações do extremo norte (isto é, todo o North Dakota, norte do South Dakota, no norte de Minnesota, e norte de Wisconsin), bivoltine (ou seja, duas gerações por ano) a maioria das populações em todo o Cinturão do Milho (Corn Belt), e multivoltina (3-4 30 gerações) as populações do Sul (Mason et al. 1996). Um resumo dos principais aspectos da biologia do ECB que se relacionem com a IRM é apresentado abaixo:

Movimento Larval Larvas ECB são capazes de significativa circulação planta- a-planta nos campos de milho. Pesquisas conduzidas em milho não-transgênico demonstraram que a grande maioria das larvas não se move mais do que duas plantas consecutivas dentro da fileira (Ross & Ostlie 1990). No entanto, no milho transgênico, dados não publicados (usado no trabalho de modelagem) de F. f 10 Gould (citados em Onstad & Gould 1998) indicam que aproximadamente 98% dos neonatos suscetíveis a ECB se afastam das plantas contendo Bt. Em estudo de múltiplos-anos recente de Hellmich (1996, 1997, 1998) tentou-se quantificar a extensão do movimento larval planta-a-planta.

Observou-se que a 4a larva instar era capaz de circular em

até seis plantas de milho dentro de uma linha e seis plantas de milho através das linhas a partir de um ponto de libertação. 0 movimento dentro de uma linha era muito mais provável do que movimento através da linha (não é surpreendente, devido ao fato de que as plantas que estão na fila são mais susceptíveis de ser "tocadas" em oposição aquelas através das linhas). Na verdade, a grande maioria dos movimentos através das fileiras foi limitada a uma planta. Este tipo de informação tem implicações óbvias para ótimo desenho do refúgio. 0 deslocamento das larvas ao longo dos milhos Bt e não-Bt podem ser expostos a doses sub-letais de proteína, aumentando a probabilidade de resistência (Mallet & Porter 1992). Dada a amplitude do movimento do ECB larval entre plantas, a crença predominante é que sementes mistas são uma opção de refúgio inferior (Mallet & Porter 1992, SAP 1998, Onstad & Gould 1998). Movimento Adulto

Informações sobre o movimento de adultos ECB (pós-eclosão pupal) é necessário para se determinar as orientações de proximidade adequadas para refúgios. Refúgios devem ser 5 estabelecidos dentro da gama de vôo de adultos recentemente emergidos para ajudar a garantir o potencial de acasalamento aleatório. Um amplo projeto, múltiplo-ano para investigar dispersão de adultos ECB foi realizado pela Universidade de Nebraska (Hunt et al. 1997, 1998a). Os resultados de marcação e 10 recaptura desses estudos (com os adultos recém-emergidos, pré- acasalados) mostrou que a maioria dos adultos ECB não se dispersa longe dos seus sítios de emergência. A percentagem recapturada era muito baixa (<1%) e a maioria dos que foram recapturados foram capturados dentro de 1500 pés do sítio de 15 lançamento. Poucas mariposas foram capturadas fora dos 2 000 pés. Estes resultados têm conduzido especificamente às recomendações e orientações para proximidade e implantação de refúgio.

Comportamento de acasalamento Além dos padrões de circulação dos adultos ECB, o

comportamento de acasalamento é uma consideração importante para assegurar acasalamento ao acaso entre mariposas potencialmente sensíveis e resistentes. Em particular, é importante se determinar onde as fêmeas recém-emergidas

2 5 acasalam (ou seja, perto do local da emergência ou após alguma

dispersão). Está bem estabelecido que muitos ECB aproveitam os sítios de agregação (geralmente agrupamentos das plantas daninhas ou gramíneas), perto de campos de milho para acasalamento. Fêmeas geralmente acasalam na segunda noite após

3 0 eclosão pupal (Mason et al. 1996) . Um estudo recente sugere que é possível manipular as agregações locais para aumentar a probabilidade de cruzamento ao acaso entre ECB potencialmente sensíveis e resistentes (Hellmich et al. 1998). Outro estudo recente (estudos de marcação/recaptura com ECB recém-eclodidos) realizado pela Universidade de Nebraska revelou que relativamente poucas fêmeas não acasaladas saíram dos campos de milho a partir do qual surgiram como adultos (Hunt et al. 1998b) . Isso foi especialmente verdadeiro nos campos de milho irrigados (isto é, atrativos). Além disso, uma percentagem relativamente elevada de fêmeas capturadas perto do ponto de lançamento (dentro de 10 pés) tinha acasalado. Este trabalho sugere que as fêmeas acasalam muito perto do ponto de emergência e que os refúgios podem precisar ser colocados muito perto dos campos Bt (ou como refúgios no campo) para maximizar a probabilidade de acasalamento ao acaso.

Em termos de comportamento masculino no acasalamento, um estudo realizado por Showers et al. (2001) olhou para a dispersão masculina para localizar companheiras. O estudo foi realizado utilizando técnicas de marcação-recaptura com 20 armadilhas de ferormônio-iscados colocadas a 200, 800, 3200 e 6400m de um ponto de libertação. Os resultados mostraram que os machos em busca de companheiras foram capturados com mais freqüência nas armadilhas colocadas a 200m a partir do sítio de liberação. No entanto, números significativos também foram 25 capturados a 800m ou superior a partir do sítio de liberação (Showers et al. 2001). Semelhante à Hunt et al. , este trabalho sugere que os refúgios podem precisar ser colocados relativamente perto dos campos Bt para maximizar o acasalamento ao acaso. Comportamento de Qviposição

O comportamento de oviposição de ECB (postura de ovos) também é importante para a concepção do refúgio. Por exemplo, se uma postura dentro de campo milho não é aleatória, certos 5 tipos de refúgio (isto é, em linhas de campo) podem não ser eficazes. Após o acasalamento, que ocorre principalmente nos locais de agregação, as fêmeas deslocam-se para encontrar milhos hospedeiros aptos para a oviposição. A maioria das fêmeas irá pôr ovos em campos de milho perto dos sítios de 10 agregação, desde que sejam milhos hospedeiros aceitáveis. As desovas começam após o acasalamento e ocorrem principalmente durante a noite. Os ovos são estabelecidos em grupos de até sessenta ovos (um ou mais grupos são depositados por noite) (Mason et al. 1996).

Sabe-se que as fêmeas preferem geralmente campos de milho

mais altos e mais vigorosos para a oviposição (Beck 1987) . Isto tem implicações para a concepção do refúgio. Para evitar potencial discriminação de hospedeiro dentre as fêmeas ovipositoras, o milho híbrido não Bt selecionado para refúgio

2 0 deve ser semelhante ao milho híbrido Bt em termos de crescimento, maturidade, rendimento e práticas de manejo (ou seja, data de plantação, manejo de plantas daninhas, e de irrigação). Deve-se notar que a investigação não demonstrou nenhuma diferença significativa nas preferências de oviposição 25 entre milho Bt e não-fít (derivado da mesma linhagem), quando as características fenológicas e de manejo são semelhantes (Landis Sc Orr 1997, Hellmich et al. 1999) . Dentro de um campo de milho adequado para postura de ovos, pensa-se que a oviposição seja aleatória e não restrita as linhas de fronteira perto dos 30 locais de agregação (Shelton et al. 1986, Calvin 1998). Gama de Hospedeiro

ECB é uma praga polífaga que infesta sabidamente mais de 2 00 espécies de plantas. Entre as plantas hospedeiras do ECB estão um número de espécies de plantas daninhas comuns, o que 5 levou alguns a especular que pode ser possível que as ervas daninhas sirvam como um refúgio de ECB para milho Btl um conceito comumente referido como "refúgio desestruturado". Em resposta a isso, uma série de projetos de investigação recentes têm investigado a viabilidade de ervas daninhas como refúgio.

Estudos conduzidos pela Hellmich (1996, 1997, 1998) demonstraram que as plantas daninhas são capazes de produzir ECB, embora os números eram variáveis e demasiado inconsistente para ser uma fonte confiável do refúgio ECB. Esta conclusão foi também atingida pelo SAP Subpanel em IRM de 1998. Além de

plantas daninhas, um número de culturas de grãos (por exemplo, trigo, sorgo, aveia) tem sido investigado como um potencial refúgio de ECB para o milho Bt (Hellmich 1996, 1997, 1998, Mason et al. 1998). Nestes estudos, culturas de grãos pequenos geralmente produziram menos ECB do que milho (milho pipoca ou

2 0 de campo) e foram considerados, portanto, improváveis para produzir insetos adultos suscetíveis o suficiente para ser um refúgio aceitável. Portanto, com base no atual estado da técnica, uma melhoria em relação ao IRM ECB é necessária.

2 5 Lagarta de Espiga de Milho (do inglês, CEW)

Tal como acontece com ECB, o SAP de 1998 identificou um conjunto de domínios de investigação que necessitam de mais trabalhos com CEW. Além de aumentar o conhecimento quanto ao movimento de larvas / adultos, comportamento de acasalamento e

3 0 comportamento de oviposição, uma melhor compreensão da circulação entre milho/algodão e migração de longa distância, também é necessária (SAP 1998). Investigações adicionais relativas à biologia de CEW têm ocorrido desde 1998. Estes dados foram apresentados como parte dos relatórios anuais de 5 investigação exigida como condição para a matrícula de tais culturas Bt antes que o uso comercial seja permitido. A Agência analisou estes dados e concluiu que as informações adicionais seriam úteis para melhorias de longo prazo eficazes das estratégias IRM para mitigar a resistência de CEW.

Gama de Hospedeiro e Movimento em Milho e Algodão

CEW é um inseto polífaga (3-4 gerações por ano) , que se alimentam de um número de grãos e hortaliças, além de ervas daninhas e outros hospedeiros selvagens. Normalmente, pensa-se que CEW se alimenta de hospedeiros selvagens e / ou milho por duas gerações (primeira geração, em fase de verticilo de milho, segunda geração, em fase de espiga milho). Depois da senescência do milho, CEW move-se para outros hospedeiros, notavelmente, algodão, por mais 2-3 gerações adicionais. Ao utilizar múltiplos anfitriões dentro do mesmo período vegetativo, CEW apresenta um desafio ao manejo de resistência Bt uma vez que existe o potencial para dupla exposição à proteína Bt em ambos os milho Bt e algodão Bt (potencialmente até cinco gerações de exposição em algumas regiões). Comportamento durante invernada CEW são conhecidos por passar o inverno em fase pupal.

Embora se saiba que CEW migra em direção ao norte durante a época de crescimento para as regiões de cultivo de milho (ou seja, os cinturões de milho (Corn Bel t) do U.S e Canadá), tipicamente CEW não são capazes de passar o inverno nestas regiões. Pelo contrário, CEW são conhecidos por passar o inverno no sul do país, muitas vezes em campos de algodão. Pensa-se que as práticas de cultivo, temperatura, umidade, todas representam algum papel na sobrevivência de CEW durante o inverno (Caprio & Benedict 1996).

5 0 período invernal é uma consideração importante para

insetos IRM-resistentes que devem sobreviver ao inverno para passar os seus genes de resistência às gerações futuras. No Corn Belt, por exemplo, CEW incapaz de passar o inverno não deve representar uma ameaça de resistência. Dado que diferentes 10 estratégias de refúgio podem ser desenvolvidas com base em onde CEW é uma ameaça de resistência, dados de amostragem precisos podem contribuir para prever com precisão as áreas adequadas de CEW durante o inverno.

Movimentação e Migração de Adultos CEW é conhecido por ser uma praga altamente móvel, capaz

de significativa movimentação de longa distância. Estudos de marcação/recaptura têm mostrado que mariposas CEW são capazes de dispersar distâncias variando de 0,5 km (0,3 mi.) a 160 km (99 mi.); Algumas migrações de até 750 km (466 mi.), também 20 foram anotadas (Caprio & Bento 1996) . 0 padrão geral de migração é um movimento em direção ao norte, seguindo os padrões predominantes dos ventos, com mariposas originárias em sítios de invernada no sul se deslocando para regiões de cultivo de milho no norte dos EUA e Canadá.

Tem-se assumido que a migração de CEW procede

progressivamente em direção ao norte ao longo do decurso da temporada de crescimento. No entanto, as observações feitas pelo Dr. Fred Gould (NC State University) indicam que CEW pode também mover-se das regiões de cultivo de milho em direção ao

3 0 sul, de volta as regiões de algodão do Sul (descrito em observações feitas no Workshop da EPA / USDA em 1999 sobre manejamento de Resistência a Milho Bt em algodão, Memphis, TN, 26/8/99). Se isso for verdade, o resultado pode ser exposição adicional de CEW a culturas Bt. Além disso, os pressupostos 5 relativos à invernada de CEW podem necessitar de ser revisitados - mariposas que se pensava serem incapazes de sobreviver ao inverno (e, portanto, não eram uma ameaça de resistência) podem no entanto se deslocarem para sul, até encontrar sítios adequados para passar o inverno. φΐΟ A maioria dos movimentos de vôo de CEW é local, e não

migratórios. Mariposas Heliothine movem-se principalmente à noite, com mariposas pós-eclosão voando normalmente distâncias curtas e inferiores a 200 m (Caprio & Benedict 1996) . No entanto, como foi indicado pela SAP 1998, investigações 15 adicionais seriam úteis, particularmente no que se refere à CEW e desenho de refúgio ótimo. Por outro lado, dado os movimentos de longa distância típicos de CEW e a falta de alta dose em híbridos de milho Bt, a SAP 2 000 constatou que a colocação do refúgio para essa praga é de menor importância do que para (1^20 outras pragas (por exemplo, ECB) (PEA 2001).

Comportamento de acasalamento / Oviposição

0 Dr. Michael Caprio (entomólogo, Mississippi State University), indicou que existe um acasalamento localizado significativo entre as fêmeas (ou seja, dentro de 600 metros 25 (1969 pés) da eclosão pupal), normalmente com machos que apareceram nas proximidades ou moveram-se antes da eclosão das fêmeas (Caprio 1999). Fêmeas CEW normalmente depositam os ovos isoladamente nos hospedeiros. Um recente estudo (realizado em campos de algodão) constatou que 20% dos ovos encontrados a

3 0 partir de fêmeas CEW liberadas estavam dentro de 50-100 m (164- 328 ft) do ponto de libertação, indicando alguma oviposição localizada. No entanto, os machos mostraram-se capazes de se movimentar por mais de 350 m (1148 pés) para copular com as fêmeas (Caprio 2 000). Estes dados indicam que, em termos de 5 CEW, refúgios podem não ter de ser incorporados ou estar imediatamente adjacentes a um campo Bt para serem eficazes (embora os dados não excluam estas opções). Investigações adicionais com comportamento de acasalamento e oviposição iram fornecer informações úteis para IFlM de CEW.

Movimento Larval

Larvas CEW, especialmente depois de ínstares, são capazes de movimento de planta para planta. Na recomendação do SAP (1998), a EPA eliminou a mistura de sementes como uma opção viável de refúgio para CEW para algodão Bt. Assim, uma estratégia para melhorar IRM de CEW também é necessária.

Brocas de Milho do Sudoeste (do inglês SWCB)

Alguns dados da biologia das pragas SWCB foram fornecidos à EPA como parte dos relatórios anuais de investigação exigida

2 0 como uma condição de inscrição. No entanto, ainda há relativamente pouca informação disponível. A SAP de 1998 notou a relativa falta de informação para SWCB, concluindo que uma pesquisa crítica é necessária para a SWCB, incluindo: movimento de curto-prazo, migração de longa distância, acasalamento e

2 5 comportamento em relação à circulação (ou seja, saber se o acasalamento ocorre antes ou depois da migração). Devido a isso, no atual estado da técnica, desconhece-se se as estratégias concebidas para IRM de ECB (outra peste perfurante de milho) também irão funcionar otimamente para SWCB. SWCB é uma praga de milho econômica em algumas áreas (por exemplo, Kansas PB, SE Colorado, Norte do Texas, Oklahoma ocidental) e pode exigir manejo regular. Como ECB, SWCB tem 2/4 gerações e comportamento alimentar semelhante. A primeira 5 geração de larvas se alimenta no tecido verticilo antes de perfurar túneis nos caules antes da pupação, enquanto as gerações futuras se alimentam de tecido de espiga antes de perfurar túneis nos caules. Fêmeas geralmente acasalam na noite de emergência e podem depositar 250-350 ovos (Davis 2000).

A pesquisa para investigação dos padrões de circulação de

SWCB foi iniciada (Buschman et al. 1999) . Neste estudo de marcação/recaptura, as seguintes observações foram feitas em relação à SWCB dos dados de 1999: 1) foram capturados mais machos que fêmeas em grandes distâncias a partir do ponto lançamento (semelhante ao ECB) ; 2) a maioria das SWCB foram recapturas de 100 pés do local de libertação, embora alguns, também se verificaram em 12 00 pés, e 3) os padrões de circulação das mariposas ECB e SWCB parece ser semelhantes em relação à maioria. Perante estes resultados, é provável que esta parte da estratégia IRM (diretrizes de proximidade de refúgio estabelecidas para ECB) também será aplicável aos SWCB. No entanto, os resultados de 1999 foram dificultados pelo baixo número de SWCB disponíveis para os ensaios e os autores indicaram que esse trabalho vai continuar durante a temporada 2000.

Investigação para outras pragas secundárias (por exemplo, BCW, FAW, SCSB, outros) também é inexistente e poderia ser útil para regiões específicas em que estes parasitas podem representar uma preocupação adicional. No entanto, a SAP 1998 indicou que CEW e SWCB devem ter a mais alta prioridade para as pesquisas biológicas entre as pragas de milho secundárias.

Com base nestas características e comportamento de pragas agrícolas, a estratégia de refúgio mais comumente utilizada é 5 conhecida como um refúgio "bloco" ou refúgio de "tira". O grupo NF-2 05 recomendou três opções de posicionamento de refúgio em relação a milho Bt·. blocos plantados adjacentes aos campos, blocos plantados dentro do campo, ou tiras plantadas dentro dos campos (Ostlie et al. 1997). Em geral, os refúgios podem ser

utilizados como blocos externos nas bordas ou cabeceiras de campos ou como tiras dentro do campo de milho Bt. A investigação demonstrou que larvas ECB são capazes de passar até seis plantas de milho dentro ou entre as fileiras com a maioria dos movimentos ocorrendo dentro de uma única fileira.

instar ECB posterior (4a e 5a) são mais susceptíveis de circular na linha do que entre as linhas (Hellmich 1998) . Este é um motivo de preocupação porque as larvas ECB heterozigotas (parcialmente resistente) podem começar a se alimentar de plantas Bt e, em seguida, passar para plantas não-Bt (se

2 0 plantadas nas proximidades) para completar o desenvolvimento,

frustrando assim a estratégia de alta dose e aumentando o risco de resistência. Por esta razão, a mistura de sementes (refúgio criado pela mistura de sementes na tremonha) não são refúgios normalmente recomendados (Mallet & Porter 1992, Buschman et al.

1997) .

Buschman et al. (1997) sugeriram que o refúgio no campo é a estratégia ideal para um programa IRM. Dado que as larvas ECB

1 ondem a se deslocar dentro de linhas, os autores sugerem linhas de milho intactas como um refúgio aceitável. Tiras

3 0 estreitas (preenchendo uma ou duas caixas de plantas com sementes de milho não-Bt) ou largas (enchendo toda a caixa de planta com sementes não-Bt) podem ser usadas como refúgios no campo. Os dados indicam que, tiras no campo podem fornecer a melhor oportunidade para o ECB produzido no milho Bt em copular 5 com ECB proveniente de milho não-Bt. Uma vez que os dados preliminares sugerem que o refúgio deve ser de 100 linhas do milho Bt, Buschman et al. (1997) recomendou alternar tiras de 96 linhas de milho não-Bt e 192 linhas de milho Bt. Isso resultaria em um refúgio de 33% que está dentro de 100 linhas φΐΟ do milho Bt.

Atualmente, tiras no campo (plantadas como linhas completas) devem estender o comprimento total da área e incluir um mínimo de seis linhas cultivadas com milho não Bt alternando com um milho híbrido Bt. NF-2 05 tem recomendado plantar seis a 15 12 linhas de milho não-Bt, quando se está implementando estratégia de refúgio de faixa no terreno (NF 2 05 Suplemento

1998). A SAP 2000 também concordou que, devido à circulação larval, tiras de refúgio maiores são superiores às tiras mais estreitas, embora os tamanhos das caixas de plantio possam

^^2 0 restringir os tamanhos da tira para alguns pequenos produtores (PAS 2001). Tiras no campo podem oferecer o maior potencial para garantir acasalamento ao acaso entre adultos suscetíveis e resistentes, pois podem maximizar mistura gênica de adultos. Modelagens indicam que, pelo menos, seis faixas de linhas 25 largas são tão eficazes para o IRM de ECB como blocos adjacentes quando um refúgio de 2 0% é usado (Onstad & Guse

1999) . No entanto, faixas que são apenas duas fileiras de largura podem ser tão eficazes como blocos, mas podem ser mais arriscadas do que tanto blocos ou faixas largas, dada a nossa compreensão incompleta das diferenças na sobrevivência entre brocas suscetíveis e heterozigotas (Onstad & Gould 1998).

Dadas as preocupações atuais com a circulação de larvas e a necessidade de acasalamento ao acaso, tanto blocos externos, 5 ou tiras no campo (ao longo de todo o campo, pelo menos 6 linhas de largura) são os desenhos de refúgio que podem proporcionar a maior redução no risco de desenvolvimento de resistência. Pesquisas indicam que acasalamento ao acaso é mais provável de ocorrer no campo de tiras. Contudo, tal como φΐΟ referido anteriormente, esta estratégia IRM apresenta problemas tanto da perspectiva de danos às culturas como de cumprimento por parte do agricultor.

Além disso, baseado no conhecimento científico existente, refúgios devem ser localizados atualmente de modo que o potencial de acasalamento aleatório entre mariposas suscetíveis (provenientes do refúgio) com possíveis sobreviventes resistentes (provenientes do campo Bt) é maximizado. Portanto, o comportamento de vôo de uma praga é uma variável crítica a se considerar quando se fala de proximidade de refúgio. Refúgios ^^2 0 plantados como externas devem ser blocos adjacentes ou nas proximidades do campo de milho Bt (Onstad & Gould 1998, Ostlie et al. 1997b) . NF-205 recomendou inicialmente que os refúgios devem ser plantados dentro de secções 1A (320 acres) (NC-205 Suplemento 1998). Posteriormente, a recomendação foi revista para especificar que refúgios de milho não-Bt devem ser colocados dentro de 1A milha do campo Bt (1A de milhas seria ainda melhor) (Ortman 1999).

Hunt et al. (1997) concluíram um estudo que sugere que a maioria dos ECB não dispersam muito longe de seus locais de 30 emergência pupal. De acordo com este estudo de marcação- recaptura, a maioria dos ECB não pode dispersar mais de 1500 a 2000 pés. A maioria (70-98%), dos ECB recapturados foi presa dentro de 15 00 pés do ponto de libertação. No entanto, num adendo do estudo de 1997, os autores atentam que a distância de 5 1500 pés não representa necessariamente a distância máxima de dispersão do ECB (Hunt et al. 1998a).

Outro projeto de marcação-recaptura de ECB foi dedicado à circulação do ECB emergente dentro de campo (em particular fêmeas não acasaladas) (Hunt et al. 1998b). Relativamente 10 poucas fêmeas não acasaladas foram recapturadas (10 durante todo o experimento), no entanto, a maioria destas foi encontrada dentro de 85 pés do ponto de libertação. Isto sugere que as fêmeas não acasaladas podem não dispersar muito longe do ponto de eclosão pupal (isto é especialmente verdade no campo 15 irrigado). Além disso, uma percentagem relativamente elevada de fêmeas acasaladas (31%) em campos irrigados foi capturada dentro de 10 pés do ponto de libertação, sugerindo que o acasalamento ocorreu muito próximo ao ponto de emergência. Ambas estas observações indicam que muitas fêmeas ECB

2 0 emergentes não podem dispersar fora da sua área de origem. No que diz respeito ao manejo da resistência e proximidade de refúgio, estes resultados sugerem que refúgios deverão ser colocados na proximidade de campos de milho Bt (ou como refúgios no campo) para aumentar a chance de acasalamento ao

2 5 acaso (em especial para as áreas irrigadas).

Em termos de dispersão de ECB do sexo masculino, outro estudo de marcação e recaptura de Showers et al. (2001) mostrou que os machos que dispersam em busca de parceiras podem deslocar-se a distâncias significativas (> 800m). No entanto,

3 0 uma maior percentagem de machos foi capturada em distâncias próximas (200m) do ponto de libertação. Com base nesta pesquisa, os autores sugerem que, em termos de circulação de machos, as orientações de proximidade dos refúgios atuais de 1A milha, devem ser suficientes para garantir acasalamento entre 5 mariposas suscetíveis e quaisquer sobreviventes resistentes do campo Bt.

Embora seja claro que a dispersão de ECB diminui ainda mais a partir de pontos de emergência pupal, o comportamento da dispersão quantitativa ECB não foi totalmente determinado. No IlO entanto, em termos de posicionamento ótimo de refúgio, sob as normas atualmente aceitas, é considerado crítico que a proximidade do refúgio seja selecionada para maximizar o potencial de acasalamento aleatório. Baseado em dados de Hunt et al. , quão mais perto o refúgio está do milho Bt, menor o risco de resistência. Uma vez que o maior número de ECB foi capturado dentro dos 1.500 pés do campo e que a maioria das fêmeas deve copular dentro dos dez pés do campo, colocar os refúgios o mais perto possível dos campos Bt deve aumentar a probabilidade de acasalamento ao acaso e diminuir o risco de resistência. Atualmente, a exigência de proximidade de milho Bt é de xA milhas [1A milha em áreas onde inseticidas têm sido historicamente utilizado para tratar do ECB e do SWCB) (carta EPA para milho Bt registrados, 31/1/00). O SAP 2000 concordou com essa orientação, afirmando que o refúgio deve ser localizado a não mais do que meia milha (se possível dentro de 1A de milhas) a partir do campo de milho Bt (SAP 2 001) .

Evidentemente, cada uma destas opções de refúgio (blocos, tiras, e semelhantes) apresenta desafios adicionais na sua execução. Como observado anteriormente, esses métodos deixam

3 0 porções do campo de um agricultor suscetíveis à infestação por insetos, a fim de assegurar que espécies de insetos sensíveis se desenvolvam e estejam disponíveis para acasalar com quaisquer pragas resistentes no campo. Isso resulta em uma perda substancial de rendimento, como atualmente tais refúgios devem abranger pelo menos 2 0% do campo. Devido à diminuição da produtividade associada à porção de refúgio das culturas transgênicas resistentes a pragas, existem também problemas com o cumprimento por parte do agricultor para com os requisitos de refúgio como se referiu anteriormente.

Refúgio Temporal e Espacial

A utilização de mosaicos temporais e espaciais tem recebido alguma atenção como estratégias alternativas para refúgios estruturados para se atrasar resistência. Um refúgio temporal, em teoria, poderia manipular o ciclo de vida do ECB, tendo a porção das culturas Bt plantadas numa altura em que seria mais atrativo ao ECB. Por exemplo, campos de milho Bt seriam plantados várias semanas antes do milho convencional. Por se esperar que ECB ponha ovos preferencialmente em plantas de milho mais altas, a esperança é que os milhos Bt serão infestados, em vez dos milhos convencionais, mais curtos e menos atraentes. No entanto, há indicações de peritos no campo que, refúgios temporais são uma alternativa inferior aos refúgios estruturados (SAP 1998). A investigação demonstrou que a data de plantio não pode ser usada para prever com precisão e manipular taxas de oviposição de ECB (Calvin et al. 1997, Rice et al. 1997, Ostlie et al. 1997b, Calvin 1998). Efeitos climáticos locais na fenologia de milho fazem da data de plantio uma variável difícil de manipular para gerir ECB. Estudos adicionais terão de ser conduzidas no âmbito de um vasto leque de condições para responder plenamente esta pergunta. Além disso, um mosaico temporal pode levar a um acasalamento não aleatório, onde mariposas Bt resistentes da cultura acasalam umas com as outras porque o seu tempo de 5 desenvolvimento difere do das mariposas suscetíveis emergentes do refúgio (Gould 1994).

Mosaicos espaciais envolvem o plantio de dois eventos distintos de milho Bt, com diferentes modos de ação. A idéia é que a populações de insetos será exposta a várias proteínas, #10 reduzindo a probabilidade de resistência a qualquer uma das proteínas. No entanto, atualmente, produtos registrados expressam apenas uma proteína e as principais pragas de milho (ECB, CEW, SWCB) geralmente permanecem na mesma planta em todos os estágios de alimentação larval, insetos individuais serão

15 expostos a apenas uma das proteínas. Na ausência de refúgios estruturados produzindo insetos suscetíveis, a resistência ainda pode ter o potencial de se desenvolver em tal sistema, como teria em uma monocultura de proteína única. Como resultado, a visão aceita atualmente ensina afastada dos tipos ^^2 0 de estratégias de refúgio divulgadas aqui.

Sabe-se que, durante o período vegetativo CEW move-se em direção ao norte a partir dos sítios de invernada do sul para as regiões de crescimento de milho, no Cinturão do Milho (Corn Belt) . No entanto, as observações de migração norte-sul de CEW

2 5 (a partir de regiões de cultivo de milho para regiões

produtoras de algodão), foram anotadas. Embora mais pesquisas sejam necessárias para a confirmação, este fenômeno pode resultar em exposição adicional a culturas de milho Bt e aumentar a pressão seletiva para resistência de CEW. Este

3 0 efeito é agravado pelo fato de que nem o algodão Bt ou qualquer evento de milho Bt registrado contém uma dose elevada para CEW. Como tal, pode ser necessário se considerar outras medidas de mitigação CEW.

Ao considerar esta questão, a SAP 2000 indicou que o 5 refúgio CEW é mais bem considerado em uma escala regional (em vez de um refúgio estruturado na base de uma fazenda individual), devido aos movimentos de longa distância típicos dessa praga (ou seja, a proximidade de refúgio não é tão importante para CEW) . Segundo a SAP, um refúgio de 2 0% (por 10 exploração) seria suficiente para CEW, desde que a quantidade de milho Bt na região não exceda 50% do total da cultura de milho. Se a cultura de milho Bt regional for superior a 50%, todavia, mais refúgios estruturados podem ser necessários (SAP

2 001) . No entanto, o SAP não definiu o que uma "região" deve ser (ou seja, município, estado ou outra divisão).

Com base nos últimos dados de superfície disponíveis para milho Bt, é de salientar que uma série de municípios no Cinturão do Milho (Corn Belt) ultrapassa o limiar de 50% reconhecido pela SAP 2 000. Devido a isto, pode haver riscos 20 adicionais para a resistência CEW. Estes riscos podem ser atenuados com mais refúgios estruturados em regiões com mais de 50% de milho Bt. No entanto, pesquisas adicionais serão provavelmente necessárias para se determinar o risco da circulação norte-sul de CEW por completo e as medidas adequadas 25 de mitigação. Opções de Refúgio Aceitas-Atualmente

Eventos de Alta Dose; MON 810, BTll, e TC1507 (Campos de Milho)

Regiões sem Algodão que não Borrifam Inseticidas numa Base 5 Regular

Esta região engloba a maior parte do leste do Cinturão de Milho do High Plains. As recomendações originais de refúgio USDA NF-2 05 incluíram 2 0-30% de refúgio estruturado não tratado ou um refúgio de 4 0% que poderia ser tratado com inseticidas não-Bt (Ostlie et al. 1997a). No caso do ECB, a principal praga do milho para a maioria dos os U.S., sabe-se que, em média, menos de 10% dos produtores utilizam tratamentos com inseticidas para controlar esta praga (Centro Nacional para Política de Alimentação e Agricultura, 1999) . Uma vez que muitos produtores não tratam regularmente para ECB, NC-2 05 modificou a sua posição em uma carta ao Dr. Janet Andersen (Diretor, BPPD), em 24 de maio de 1999. Nesta carta, NC-205 altera a sua recomendação para refúgios de 20% de milho não-Bt que podem ser tratados com inseticidas e deverão ser implantados dentro de 1A milha (1A milha é melhor) do milho Bt. As recomendações específicas da carta foram: 1) o tratamento de refúgios com inseticida deve ser baseado em aferição e aceite dos limiares econômicos, 2) o tratamento deve ser com um produto que não contenha a toxina Bt ou Cry, 3) devem ser mantidos registros dos refúgios tratados e estes devem ser partilhados com o EPA, 4) o impacto potencial dos refúgios pulverizados deve ser acompanhado de perto e avaliado Cinualmente, e 5) a monitoração de resistência deve ser mais intensa em áreas de risco mais elevado, por exemplo, onde os refúgios são tratados com inseticidas (Ortman 1999). Dado que a maioria dos produtores não trata tipicamente o milho de campo com inseticidas para controle de ECB, um refúgio de 2 0%, de um milho não-Bt que pode ser borrifado com inseticidas não-Bt se as densidades de ECB excederem o limiar 5 econômico deve ser viável para o Cinturão do Milho. Refúgios podem ser tratados conforme necessário para controlar insetos lepidópteros brocas de espiga com inseticidas não-Bt, ou outras práticas IPM adequadas. O uso de inseticida deve ser baseado na aferição utilizando-se os limiares econômicos como parte de um 10 programa IPM.

Alguns estudos de laboratório demonstraram que a proteína Cry2Ab isolada e as proteínas Cry2Ab + CrylAc, conforme expressas na Bollgard II, produzem uma "alta dose" funcional para o controlo da CBW em algodão Bollgard II, TBW e PBW. Estes 15 estudos serão discutidos a baixo. A EPA concluiu previamente que uma dose de CrylAc moderada, não-alta, é produzida nas linhagens de Bollgard atuais para controle de CBW e uma dose alta de CrylAc é produzida para controlar TBW e PBW (USEPA 1998, 2001) .

A tabela a seguir irá ajudar o leitor com as siglas para

as pragas. Note que a tabela lista as pragas mais comuns que são alvo das estratégias de resistência a praga transgênica, mas a invenção não se limita apenas a esses parasitas.

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Tabela 1

Sigla Nome Coimun Nome Científico Cultura BCW Lagarta-rosca Agrotis ipsilon Milho (Hufnagel) CBW Lagarta de capulho de Helicoverpa zea (Boddie) Algodão algodão CEW Lagarta de espiga de Helicoverpa zea (Boddie) Milho milho CPB Besouro de batata do Leptinotarsa decemlineata Batata Colorado (Say) CSB Broca comum de espiga Papaipema nebris (Guenee) Milho ECB Broca de milho europeu Ostrinia nubilalis Milho (Huebner) FAW Lagarta militar de Spodoptera frugiperda (JE Milho outono Smith) PBW Lagarta rosa de Pectinophora gossypiella Algodão capulho (Saunders) SCSB Broca de espiga de Diatraea crambidoides Milho milho do sul (Grote) SWCB Broca de milho do Diatraea grandiosella Milho sudoeste (Dyar) TBW Lagarta de broto de Heliothis virescens Algodão tabaco (Fabricius) Assim, continua a haver uma necessidade de métodos para manejo de resistência de pragas em um terreno de cultivo de plantas resistentes a pragas. Seria útil se fornecer um método de melhoramento da proteção das plantas, especialmente plantas de milho, de danos causados por alimentação de pragas. Seria particularmente útil se tal método reduzisse a taxa de aplicação requerida de pesticidas químicos convencionais, e também se este limitasse o número de operações de campos separados que foram necessários para o cultivo e plantio das culturas. Além disso, seria útil ter um método de posicionar estrategicamente um refúgio transgênico requerido pelas agências regulatórias em um campo de cultivos transgênicos em vez de perifericamente ao campo de cultivo de cultivos trangênicos.

BREVE RESUMO DA INVENÇÃO

É fornecido um método para manejo de pragas resistentes em um terreno de cultivo de plantas resistentes a praga. O método inclui cultivar uma primeira cultura de planta resistente a yraga em um terreno em um ciclo de plantio, e sucessivamente cultivar, no ciclo de plantio seguinte, uma segunda cultura de planta resistente a praga no mesmo terreno, em que a primeira e a segunda cultura de plantas resistentes a praga são pesticidas para a mesma praga alvo, mas através de diferentes modos de ação pesticida.

5 Utilizando os métodos da invenção, um agricultor pode,

agora, plantar uma cultura de milho em um terreno no ciclo de plantio seguinte ao cultivo de milho no mesmo terreno. Antes da invenção, isto não era recomendável devido ao risco de dano à cultura por lagarta de raiz. Além disso, uma vez que 10 recentemente houve atividade de lagarta de raiz em outras culturas, os métodos fornecem um meio de controlar a disseminação de lagarta de raiz e uma estratégia de manejo de resistência para lagartas de raiz.

Lagartas de raiz de milho nesta invenção incluem, por 15 exemplo, Diabrotica virgifera virgifera (LeConte), Diabrotica barbieri (Smith e Lawrence) , Diabrotica undecimpunctata howardi (Barber) e Diabrotiea virgifera zeae (Krysan e Smith). A invenção utiliza diferentes modos de ação pesticida. Resistência a lagartas de raiz pode ser introduzida na cultura

2 0 de plantas por qualquer método conhecido no estado da técnica.

Em algumas concretizações, os diferentes modos de ação pesticida incluem ligação de toxina a diferentes sítios de ligação na membrana do intestino das lagartas de raiz de milho. Transgenes da presente invenção úteis contra lagartas de raiz 25 incluem, mas não estão limitados a, estes que codificam as proteínas Bt Cry3A, Cry3Bb e Cry34Abl/Cry3 5Abl. Outros transgenes apropriados para outras pragas são discutidos neste documento.

Em algumas concretizações, um ou ambos os cultivos de

3 0 plantas resistentes a praga são, adiciionalmente, tratados com um agente pesticida selecionado do grupo constituído por: piretrinas e piretrinas sintéticas, oxadizinas,

cloronicotinilos, nitroguanidinas, triazóis, organofosfatos, pirrols, pirazoles, fenol pirazoles, diacilhidrazinas, produtos 5 biológicos/de fermentação, carbamatos e combinações destes. Em outras concretizações, um ou ambos os cultivos de plantas resistentes a praga contém, ainda, um gene de resistência a herbicida selecionado do grupo constituído por: glifosato N-acetiltransferase (GAT) , 5-enolpiruvilshikimato-3-fosfato 10 sintase (EPSPS), fosfinotricina N-acetiltranferase (PAT), e combinações destes.

Embora a invenção seja descrita no contexto de lagartas de raiz, os conceitos fundamentais descritos neste documento podem também ser aplicados a campos onde manejo de resistência é 15 necessário no contexto de outras pragas, incluindo broca do milho européia (ECB) (Ostrinia nubilalis), broca de milho do sudoeste (SWCB) (Diatrea granáiosella), lagarta de espiga de milho (CEW) (Helicoverpa zea), lagarta de corte ocidental (WBCW) (Loxagrotis albicosta), lagarta militar de outono (FAW) 20 (Spodoptera frugiperda) ou lagarta de corte de feijão preto (BCW) (Agrotis ipsilon) . A invenção também pode ser usada em combinação, de forma que múltiplas pragas possam ser controladas durante a aplicação do método, por meios transgênicos ou de outra forma.

25

DESCRIÇÃO DETALHADA DA CONCRETIZAÇÃO PREFERIDA

A presente invenção proporciona um método direcionado ao manejo de resistência em um terreno de cultivo de plantas resistentes a praga. Especificamente, o método inclui cultivar

3 0 uma primeira cultura de planta resistente a praga em um terreno em um ciclo de plantio e sucessivamente cultivar, no ciclo de plantio seguinte, uma segunda cultura de planta resistente a praga no mesmo terreno, em que a primeira e a segunda cultura de plantas resistentes a praga são pesticidas a lagarta de raiz 5 de milho, mas através de um modo de ação pesticida diferente. Reconhece-se que uma característica de resistência pode ser introduzida na cultura através da transformação (i.e., transgênicos) ou métodos tradicionais de cruzamento.

Por "pesticida" entende-se um efeito tóxico contra uma praga (por exemplo, CRW) e inclui atividade de ou um pesticida suprido externamente e/ou um agente que é produzido pelas plantas cultivadas, ou ambos. Como utilizado neste documento, o termo "modo de ação pesticida diferente" inclui os efeitos pesticidas de uma ou mais características de resistência, seja introduzidos na cultura por transformação seja por métodos de cruzamento tradicionais, tais como ligação de uma toxina pesticida, produzida pela planta cultivada, a diferentes sítios de ligação (i.e., diferentes receptores de toxinas e/ou diferentes sítios no mesmo receptor de toxinas) nas membranas do intestino das lagartas de raiz de milho.

Conforme utilizado aqui, o termo "cultura de planta transgênica resistente a praga", significa uma planta ou progênie desta (incluindo sementes) derivada de uma célula vegetal transformada ou protoplasto, onde o DNA da planta 25 contém uma molécula de DNA heteróloga introduzida, não inicialmente presente em uma planta nativa, não-transgênica, da mesma estirpe, que confere resistência a uma ou mais lagartas de raiz de milho. 0 termo refere-se ao transformante original e a progênie do transformante que incluem o DNA heterólogo. 0

3 0 termo também se refere a progênie produzida por um cruzamento sexual entre os transformantes e uma outra variedade que inclui o DNA heterólogo. É também para se entender que duas diferentes plantas transgênicas também podem acasalar para produzir descendentes que contenham dois ou mais genes heterólogos 5 acrescentados por segregação independente. A autopolinização da progênie adequada pode produzir plantas que são homozigotas para ambos genes heterólogos acrescentados. Retro cruzamento com uma planta parental e cruzamento externo com uma planta não-transgênica também são contemplados, como é a propagação 10 vegetativa. Descrições de outros métodos de reprodução que são comumente usados para diferentes características e plantas de cultivo podem ser encontrados em uma das várias referências, por exemplo, Fehr (1987), na Breeding Methods for Cultivar Development, ed. J. Wilcox (American Society of Agronomy, 15 Madison, WI), cada uma das quais é incorporada neste documento por referência. Métodos de reprodução também podem ser usados para transferir qualquer gene de resistência natural em plantas de cultivo.

Por "planta" entende-se as principais culturas de 2 0 alimentos e fibras, incluindo milho, sorgo, trigo, girassol, algodão, arroz, soja, cevada, colza e batata, por exemplo. Conforme utilizado aqui, o termo "milho" significa Zea mays ou milho, e inclui todas as variedades vegetais que podem ser criadas com o milho, incluindo as espécies selvagens de milho.

2 5 Em uma concretização, os métodos divulgados são úteis para o

manejo de resistência em um terreno de milhos resistentes a pragas, quando é sistematicamente seguido pelo milho (ou seja, milho contínuo) . Em outra concretização, os métodos são úteis para o manejo da resistência em um terreno de milho resistentes

3 0 a pragas de primeiro ano, que é, onde o milho é seguido por outra cultura (por exemplo, soja) , em um ciclo de rotação de dois anos. Outros ciclos de rotação são também contemplados no contexto da invenção, por exemplo, onde o milho é seguido por vários anos por uma ou várias outras culturas, de modo a 5 prevenir resistência para outras extensões de pragas diapausa que podem desenvolver-se ao longo do tempo.

Métodos para introdução estável de seqüências de nucleotídeos em plantas e para expressão de uma proteína codificada nela são bem conhecidas no estado da técnica. 10 "Introduzir" significa por em contato com a planta a seqüência de nucleotídeos de maneira tal que a seqüência tenha acesso ao interior da célula da planta. Os métodos da invenção não dependem de um método particular para introdução de uma seqüência de nucleotídeos em uma planta, apenas que uma 15 seqüência de nucleotídeos tenha acesso ao interior das células da planta. Protocolos de transformação, bem como protocolos para introdução de seqüências de nucleotídeos em plantas podem variar dependendo do tipo de planta ou célula vegetal (i.e. monocotiledônea ou dicotiledônea) que seja alvo da

2 0 transformação.

Por exemplo, métodos adequados de introdução de seqüências de nucleotídeos em plantas incluem microinjeção (Crossway et al. (1986) Biotechniques 4:320-334), eletroporação (Riggs et al. (1986) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 83:5602 5606), 25 transformação medidada por Agrobacterium (Patente US Nos. 5,563,055 e 5,981,840, ambas incorporadas neste documento por referência), transferência genética direta (Paszkowski et al. (1984) EMBO J. 3:2717 2722), aceleração balística de partícula (ver, e.g., Patente US Nos. 4,945,050; 5,879,918; 5,886,244; e 30 5,932,782 (cada uma das quais incorporadas neste documento por referência); e Tomes et al. (1995) "Direct DNA Transfer into Intact Plant Cells via Microprojectile Bombardment," in Plant Cell, Tissue, and Organ Culture: Fundamental Methods, ed. Gamborg and Phillips (Springer-Verlag, Berlim); MeCabe et al.

5 (1988) Biotechnology 6:923 926), e Leel transformation (ver, e.g., WO 00/28058). Ver também Weissinger et al. (1988) Ann. Rev. Genet. 22:421 477; Sanford et al. (1987) Particulate Science and Technology 5:27 37 (cebola); Christou et al. (1988) Plant Physiol. 87:671 674 (soja); McCabe et al. (1988) 10 Bio/Technology 6:923 926 (soja); Finer e McMullen (1991) In Vitro Cell Dev. Biol. 27P:175-182 (soja); Singh et al. (1998) Theor. Appl. Genet. 96:319-324 (soja); Datta et al. (1990) Bioteehnology 8:736 740 (arroz); Klein et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85:4305 4309 (milho); Klein et al. (1988) 15 Biotechnology 6:559 563 (milho); Patente US Nos. 5,240,855; 5,322,783; e 5,324,646 (cada uma das quais incorporadas neste documento por referência); Klein et al. (1988) Plant Physiol. 91:440 444 (milho); Fromm et al. (1990) Biotechnology 8:833 839 (milho); Hooykaas-Van Slogteren et al. (1984) Nature (Londres) 20 311:763-764; Patente US No. 5,736,369 (cereais); Bytebier et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 84:5345-5349 (Liliaceae); De Wet et al. (1985) in The Experimental Manipulation of Ovule Tissues, ed. Chapman et al. (Longman, New York), pp. 197-209 (pólen); Kaeppler et al. (1990) Plant Cell Reports 9:415-418 e 25 Kaeppler et al. (1992) Theor. Appl. Genet. 84:560-566 (whisker- mediated transformation); D1Halluin et al. (1992) Plant Cell 4:1495-1505 (eletroporação); Li et al. (1993) Plant Cell 7Ieports 12:250-255; Christou e Ford (1995) Annals of Botany 75:407-413 (arroz); e Osjoda et al. (1996) Nature Bioteehnology 30 14:745-750 (milho via Agrohacterium tumefaciens). Em outras concretizações, a seqüência de nucleotídeos pode ser introduzida nas plantas pelo contato das plantas com um virus ou ácidos nucléicos virais. Geralmente, tais métodos envolvem incorporar a seqüência de nucleotídeos dentro de uma 5 molécula de DNA ou RNA viral. Reconhece-se que a seqüência de nucleotídeos pode ser inicialmente sintetizada como parte de uma poliproteína viral, a qual, mais tarde, pode ser processada por proteólise in vivo ou in vitro, para produzir a proteína recombinante desejada. Métodos para a introdução de seqüências 10 de nucleotídeos em plantas e para expressão de uma proteína codificada nelas, envolvendo moléculas de DNA ou RNA virais, são conhecidos no estado da técnica. Ver, por exemplo, Patente US Nos. 5,889,191; 5,889,190; 5,866,785; 5,589,367; e 5,316,931 (cada uma das quais é incorporada neste documento por 15 referência); e Porta et al. (1996) Molecular Biotechnology 5:209-221.

Métodos são conhecidos no estado da técnica para inserção dirigida de uma seqüência de nucleotídeos em um local específico no genoma da planta. Em uma concretização, a

2 0 inserção da seqüência de nucleotídeos em um local genômico

desejado é conseguida utilizando-se um sistema de recombinação sítio-específica. Ver, por exemplo, WO 99/25821, WO 99/25854, WO 99/25840, WO 99/25855, e WO 99/25853. Brevemente, a seqüência de nucleotídeos pode estar contida em um cassete de 25 transferência flanqueado por dois sítios de recombinação não recombinogênicos. 0 cassete de transferência é introduzido em uma planta tendo incorporado em seu genoma, de maneira estável, ικη sítio alvo que é flanqueado por dois sítios de recombinação não recombinogênicos que correspondem aos sítios do cassete de

3 0 tranferência. Uma recombinase apropriada é providenciada e o cassete de transferência é integrado ao sítio alvo. A seqüência de nucleotídeos de interesse é, desta forma, integrada em uma posição cromossomal específica no genoma da planta.

Conforme utilizado aqui, o termo "diferente modo de ação pesticida" inclui os efeitos pesticidas de uma ou mais características resistentes, introduzida dentro das plantas cultivadas seja por transformação ou por métodos tradicionais de reprodução, tais como a ligação de uma toxina pesticida produzida pela cultura de plantas a diferentes sítios de ligação (ou seja, diferentes receptores de toxina e / ou diferentes sítios na mesma toxina receptora) nas membranas intestinais de lagartas de raiz de milho. No que diz respeito aos modos de ação pesticida, os compostos pesticidas se ligam "competitivamente", se eles tiverem sítios de ligação idênticos na praga sem sítios de ligação em que um composto irá se ligar e o outro não irá se ligar. Por exemplo, se o composto A utiliza apenas os sítios de ligação 1 e 2, e o composto B também utiliza apenas os sítios de ligação 1 e 2, os compostos A e B se ligam de forma "competitiva". Compostos pesticidas se ligam "semi-competitivamente" se tiverem, pelo menos, um sítio de ligação em comum na praga, mas também pelo menos, um sítio de ligação diferente (não em comum). Por exemplo, se o compostos C utiliza os sítios de ligação 3 e 4, e compostos D utiliza somente o sítios de ligação 3, os compostos C e D se ligam de forma "semi-competitiva". Compostos pesticidas se ligam de forma "não-competitiva" se eles não têm nenhum sitio de ligação em comum na praga. Por exemplo, se o composto E utiliza os sítios de ligação 5 e 6, e composto F utiliza o sítio de ligação 7, os compostos E e F se ligam de forma "não- competitiva" . Em algumas concretizações, o diferente modo de ação pesticida é proporcionado via expressão de um gene heterólogo derivado de uma linhagem de Bacillus thuringiensis, por exemplo, uma que codifique uma δ-endotoxina derivada de Bt, 5 onde o gene foi introduzido de maneira estável nas plantas transgênicas. Tais δ-endotoxinas são descritas, por exemplo, em Crickmore et al. (1998) Micro. Mol. Bio. Rev. 62:807-813; Patente US Nos. 5,691,308; 5,188,960; 6,180,774; 5,689,052 (cada uma das quais é incorporada neste documento por φ*10 referência); WO 99/24581; e WO 99/31248, e incluem, por exemplo, genes codificando as proteínas Cry CrylA, CrylA(a), CrylA(b), CryIA(c), CrylC, CrylD, CrylE, CrylF, Cry2A, Cry3Bb, Cry9C e variantes destas. Reconhece-se que variantes e fragmentos destas seqüências de nucleotídeos podem ser usadas, 15 contanto que codifiquem um polipeptídeo Cry tendo atividade pesticida.

As δ-endotoxinas Bt são sintetizadas como protoxinas e cristalizam como inclusões parasporais. Quando ingerida por uma praga inseto, a estrutura microcristalina é dissolvida pelo pH 4P2 0 alcalino do instestino intermediário do inseto, e a protoxina é clivada pelas proteases do intestino do inseto para gerar a toxina ativa. A toxina Bt ativada se liga aos receptores no epitélio do intestino do inseto, levando a lesões na membrana e, asssociados, inchaço e Iise do intestino do inseto. A morte

2 5 do inseto resulta de inanição e septicemia. Ver, por exemplo, Li et al. (1991) Nature 353:815-821; Aronson (2002) Cell Mol. Life Sei. 59 (3): 417-425; Schnepf et al. (1998) Micro. Mol. Biol. Rev. 62:775-806.

Em outras concretizações, o gene heterólogo é derivado de 30 uma variante Bt (e.g., Bt var. israelensis) em que a toxina não está relacionada à família Cry e possui um modo de ação pesticida diferente das δ-endotoxinas. Toxinas exemplares incluem a toxina CytA e as proteínas inseticidas vegetativas (VIPs) . As VIPs (por exemplo, os membros das classes VIPl,

5 VIP2, ou VIP3) são proteínas secretadas que sofrem processamentos proteolíticos por fluidos no intestino intermediário dos insetos. Elas têm atividade pesticida contra um amplo espectro de insetos Lepidópteros. Ver, por exemplo, Patente US No. 5,877,012 (neste documento incorporada por φΙΟ referência) .

Em concretizações adicionais, o diferente modo de ação pesticida é porporcionado via expressão de um gene heterólogo codificando uma lipase pesticida, onde o gene foi introduzido de maneira estável nas plantas transgênicas. Qualquer seqüência 15 de nucleotídeos codificando um polipeptídeo lipase que possua atividade pesticida pode ser usado para praticar os métodos da invenção. 0 termo "lipase pesticida" inclui qualquer membro da família de lipídio acil hidrolases que possuem efeitos inibitórios ou tóxicos em pragas de insetos. Lipases são bem ^^2 0 conhecidas no estado da técnica. Uma classe de lipase é a classe lipídio acil hidrolase, também conhecida como triacilglicerol acilhidrolases ou triacilglicerol lipases (chamadas enzimas EC 3.1.1.3 sob o sistema de nomenclatura IUBMB). Estas enzimas catalisam a reação de hidrólise: 25 triacilglicerol + H2O = diacilglicerol + um carboxilato. Todas as lipídio acil hidrolases compartilham uma região estrutural comum, conservada e seccionável, chamada tríade catalítica. A tríade catalítica consiste em um motivo glicina-aminoácido X- serina-aminoácido X-glicina (GxSxG). Foi demonstrado que a

3 0 substituição de aminoácidos nesta região acaba com a atividade enzimática. A ação enzimática destas lipídio acil hidrolases também estão correlacionadas com atividade inseticida significativa. Ver, por exemplo, as lipases inseticidas descritas nas Patentes US Nos. 6,657,046 e 5,743,477 (ambas 5 incorporadas neste documento por referência).

Outras proteínas pesticidas para uso na prática dos métodos da invenção incluem, mas não se limitam a: toxinas binárias, tais como as proteínas de cristal Bt das classes Cry34 e Cry35 (ver, por exemplo, Schnepf et al. (2005) Appl. ^^10 Environ. Microbiol. 71:1765-1774), bem como as colesterol oxidases de Streptomyces, e proteínas pesticidas derivadas de espécies de bactérias Xenorhabdus e Photorhabdus, espécies de Baeillus laterosporous, e espécies de Baeillus sphearieus. Também está prevista a utilização de toxinas quiméricas 15 (híbridas) (ver, por exemplo Bosch et al. (1994) Bio/Technology 12:915-918).

A presente invenção também inclui plantas transgênicas tendo mais de um gene heterólogo (i.e., uma combinação de genes heterólogos é introduzida de maneira estável nas plantas). Tais ^^20 transformantes podem conter transgenes que são obtidos a partir da mesma classe de toxinas (por exemplo, mais de uma δ- endotoxina, mais de uma lipase pesticida, mais de uma toxina binária, e similares) , ou os transgenes podem ser provenientes de diferentes classes de toxinas (por exemplo, uma δ-endotoxina 25 em combinação com uma lipase pesticida ou uma toxina binária). Por exemplo, uma planta com a capacidade de expressar uma δ- endotoxina inseticida derivada de Bt (como CrylF), também tem a capacidade de expressar, pelo menos, outra δ-endotoxina que é diferente da proteína CrylF, tais como, por exemplo, uma

3 0 proteína CrylA (b) . Do mesmo modo, uma planta com a capacidade de expressar uma δ-endotoxina inseticida derivada de Bt (como CrylF), também tem a capacidade de expressar uma lipase pesticida, como, por exemplo, uma lipídio acil hidrolase. Da mesma forma, uma planta tendo a habilidade de expressar uma toxina binária (tal como proteína Cry34/3 5) também possui a habilidade de expressar pelo menos uma outra proteína pesticida que é diferente da proteína Cry34/3 5, tal como, por exemplo, uma δ-endotoxina (e.g., uma proteína Cry3Bb).

Efeitos tóxicos e inibitórios das toxinas Bt e lipases pesticidas incluem, mas não estão limitados a, atraso do crescimento larval, extermínio de ovos ou larvas, redução da alimentação na fase adulta ou juvenil em plantas transgênicas em relação à observada em plantas de tipo selvagem, e indução de comportamento de rejeição em um inseto com relação à alimentação, nidificação ou acasalamento.

Em certas concretizações, as seqüências de nucleotídeos usadas nos métodos da presente invenção podem ser empilhadas com qualquer combinação de seqüências de nucleotídeos de interesse com o objetivo de criar plantas com uma característica desejada. Uma "característica", como utilizado neste documento, refere-se ao fenótipo derivado de uma seqüência particular ou de grupos de seqüências. Um único cassete de expressão pode conter ambos um nucleotídeo codificando uma proteína pesticida de interesse e pelo menos um gene adicional, tal como um gene empregado para aumentar ou melhorar uma qualidade desejada da planta transgênica. Alternativamente, o(s) gene(s) adicional(is) pode(m) ser fornecido(s) em múltiplos cassetes de expressão. Estas combinações de empilhamentos podem ser criadas por qualquer meio, incluindo, mas não se limitando a, reproduções-cruzada de plantas por qualquer metodologia convencional ou TopCross, ou a transformação genética. Se as seqüências são empilhadas através de transformação genética das plantas, as seqüências nucleotídicas de interesse podem ser combinadas em qualquer 5 momento e em qualquer ordem. Por exemplo, uma planta transgênica compreendendo uma ou mais características desejadas (e.g., produção de uma toxina pesticida) pode ser usada como alvo para introdução de novas características por transformação subseqüente. As características podem ser introduzidas 10 simultaneamente em um protocolo de co-transformação com os seqüências nucleotídicas de interesse providos em qualquer combinação de cassetes de transformação. Por exemplo, se duas seqüências serão introduzidas, as duas seqüências podem estar contidas em cassetes de transformação separados (trans) ou 15 contidas no mesmo cassete de transformação (cis). A expressão das seqüências pode ser conduzida pelo mesmo promotor ou por diferentes promotores. É ainda reconhecido que genes podem ser empilhados em uma localização genômica desejada utilizando-se um sistema de recombinação sítio-específica. Ver, por exemplo, 20 WO 99/25821, WO 99/25854, WO 99/25840, WO 99/25855 e WO 99/25853 .

Na prática, certas combinações dos vários Bt e outros eventos transgênicos descritos anteriormente são melhor adaptados para certas pragas, baseado na natureza da ação 25 pesticida e na suscetibilidade de certas pragas a certas toxinas. Por exemplo, algumas combinações transgênicas são particularmente apropriadas para uso contra vários tipos de CRW 'Jncluindo WCRW, NCRW, MCRW e NCRW). Estas combinações incluem Cry34/35 e Cry3A; e Cry34/35 e Cry3B. Como anteriormente descrito, empilhamentos de genes também podem ser usados neste contexto.

Outras combinações também são conhecidas para outras pragas. Por exemplo, combinações apropriadas para uso contra ECB e/ou SWCB incluem CrylAb e CrylF, CrylAb e Cry2, CrylAb e Cry9, CrylAb e empilhamento Cry2/Vip3A, CrylAb e empilhamento CrylF/Vip3A, CrylF e Cry2, CrylF e Cry9, bem como CrylF e empilhamento Cry2/Vip3A. Combinações apropriadas para uso contra CEW incluem CrylAb e Cry2, CrylF e Cry2, CrylAb e ^^10 empilhamento Cry2/Vip3A, CrylAb e empilhamento CrylF/Vip3A, bem como CrylF e empilhamento Cry2/Vip3A. Combinações apropriadas para uso contra FAW, BCW, e/ou WBCW incluem CrylAb e empilhamento Cry2/Vip3A, CrylAb e empilhamento CrylF/Vip3A, bem como CrylF e empilhamento Cry2/Vip3A. Além disso, estas várias combinações podem ser combinadas a fim de proporcionar manejo de resistência a múltiplas pragas.

Em outras concretizações, a primeira e/ou segunda cultura de planta resistente a praga é, opcionalmente, tratada com um agente inseticida ou pesticida. Por "agente pesticida" entende- ^^2 0 se um pesticida químico que é fornecido externamente à cultura de plantas, ou das sementes de uma das culturas vegetal. 0 termo "agente inseticida" tem o mesmo significado que agente pesticida, exceto pelo fato que seu uso é destinado para aqueles casos onde a praga é um inseto. Pesticidas adequados 25 para a utilização da invenção incluem piretrinas e piretróides sintéticos; derivados de oxadizina; cloronicotinilos; derivados de nitroguanidina; triazóis; organofosforados; pirroles, pirazoles, fenilpirazoles; diacilhidrazinas; produtos

biológicos/de fermentação; e carbamatos. Pesticidas conhecidos

3 0 dentro dessas categorias são indicados em, por exemplo, The Pesticide Manual, 11- Ed., ed. CDS Tomlin (British Crop Protection Conselho, Farnham, Surry, UK, 1997).

Inseticidas que são derivados de oxadiazina são úteis para o método em questão. Derivados de oxadizina exemplares para uso 5 na presente invenção incluem aqueles que são identificados na Patente US No. 5,852,012 (incorporada neste documento por referência). Inseticidas cloronicotinilos também são úteis para o método em questão. Cloronicotinilos exemplares para um neste método são descritos na Patente US No. 5,952,358 (incorporada 10 neste documento por referência). Inseticidas nitroguanidinas também são úteis no presente método. Tais nitroguanidinas podem incluir aquelas descritas nas Patentes US Nos. 5,633,375; 5,034,404 e 5,245,040 (todas elas incorporadas neste documento por referência). Inseticidas pirrol, pirazol e fenilpirazol que 15 são úteis para o presente método incluem aqueles que estão descritos na Patente US No. 5,952,358 (incorporada neste documento por referência). Quando um inseticida é descrito aqui, é para ser entendido que a descrição se destina a incluir formas de sal do inseticida, assim como qualquer forma

2 0 isomérica e/ou tautomérica do inseticida que apresente a mesma atividade inseticida como a forma do inseticida que é descrita. Os inseticidas que são úteis no presente método podem ser de qualquer grau ou pureza que passa no comércio como tais inseticidas.

Em outras concretizações ainda, a primeira e/ou segunda

cultura de planta resistente a praga é, opcionalmente, tratada com acaricidas, nematicidas, fungicidas, bactericidas, herbicidas, e suas combinações.

Em concretizações adicionais, a primeira e/ou segunda cultura de planta resistente a praga contém, ainda, um gene de resistência a herbicida que proporciona tolerância a herbicida, como por exemplo, a glifosato-N-(phosphonometil) glicina (incluindo a forma de sal de isopropilamina de tal herbicida). Genes de resistência a herbicida exemplares incluem glifosato 5 N-acetiltransferase (GAT) e 5-enolpiruvilshikimato-3-fosfato sintase (EPSPS). Genes de resistência a herbicida geralmente codificam um proteína alvo modificada insensível ao herbicida ou uma enzima que degrada ou destoxifica o herbicida na planta antes que ele possa agir. Ver, DeBlock et al. (1987) EMBO J. 010 6:2513; DeBlock et al. (1989) Plant Physiol. 91:691; Fromm et al. (1990) BioTechnology 8:833; Gordon-Kamm et al. (1990) Plant Cell 2:603; e Frisch et al. (1995) Plant Mol. Biol. 27:405-9. Por exemplo, resistência aos herbicidas glifosato ou sulfoniluréia foi obtida usando genes codificantes das enzimas 15 alvo mutantes, 5-enolpiruvilshikimato-3-fosfato sintase e acetolactato sintase (ALS) . Resistência a glufosinato amônio, boromoxinil e 2,4-diclorofenoxiacetato (2,4-D) foi obtida pelo uso de genes bacterianos codificando fosfinotricina acetiltransf erase, uma nitrilase, ou uma 2,4-

^^2 0 diclorofenoxiacetato monooxigenase, os quais destoxificam os respectivos herbicidas.

Todas as publicações e pedidos de patente mencionados no relatório descritivo são indicativos do nível daqueles versados na técnica aos quais esta invenção se dirige. Todas as 25 publicações e pedidos de patente são incorporados neste documento por referência como se cada publicação ou pedido de patente individualmente fosse especificamente e individualmente ;ndicado para ser incorporado por referência.

Apesar de a invenção exposta ter sido descrita com algum 30 pormenor, a título de ilustração e de exemplo para fins de clareza de entendimento, será evidente que algumas modificações e alterações podem ser praticadas no âmbito das reivindicações anexas.

Claims (16)

1. Método para manejo de resistência em um terreno de culturas de plantas resistentes a praga caracterizado por compreender as etapas de: a) cultivar uma primeira cultura de planta resistente a praga em um terreno em um ciclo de cultivo; e b) cultivar, em um segundo ciclo de cultivo, uma segunda cultura de planta resistente a praga no mesmo terreno, em que dita primeira e dita segunda culturas de plantas resistentes a praga são pesticidas à mesma praga, mas através de um modo de ação pesticida diferente.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que dita primeira e dita segunda culturas de plantas resistentes a praga são da mesma espécie.

3. Método de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a referida espécie é milho.

4. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a referida praga é selecionada do grupo constituído por: vaquinha ocidental, vaquinha do norte, vaquinha mexicana, vaquinha do sul e combinações destas.

5. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a referida praga é vaquinha ocidental.

6. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que dita primeira e dita segunda culturas de plantas resistentes a praga são culturas de plantas transgênicas resistentes a praga.

7. Método de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que dito diferente modo de ação pesticida compreende a produção de proteínas de ligação semi-competitiva ou não- competitiva a membrana do intestino da referida praga.

8. Método de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que dita primeira cultura de planta transgênica resistente a praga produz uma proteína Cry34/35 e dita segunda cultura de planta transgênica resistente a praga produz uma proteína Cry3A.

9. Método de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que dita primeira cultura de planta transgênica resistente a praga produz uma proteína Cry34/35 e dita segunda cultura de planta transgênica resistente a praga produz uma proteína Cry3B.

10. Método de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que dita primeira cultura de planta transgênica resistente a praga produz uma proteína CrylA(b) e dita segunda cultura de planta transgênica resistente a praga produz uma proteína CrylF.

11. Método de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que dita primeira cultura de planta transgênica resistente a praga produz uma proteína CrylA(b) e dita segunda cultura de planta transgênica resistente a praga produz uma proteína Cry9.

12. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por compreender, ainda, tratar dita primeira cultura de planta resistente a praga e/ou dita segunda cultura de planta resistente a praga com um agente pesticida.

13. Método de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que o referido agente pesticida é selecionado do grupo constituído por: inseticidas, acaricidas, nematicidas, fungicidas, bactericidas, herbicidas e combinações destes.

14. Método de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que o referido agente pesticida é um inseticida.

15. Método de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que o referido inseticida é selecionado do grupo constituído por: piretrinas e piretrinas sintéticas, oxadizinas, cloronicotinilos, nitroguanidinas, triazóis, organofosfatos, prirróis, pirazoles, fenol pirazoles, diacilhidrazinas, produtos biológicos/de fermentação, carbamatos e combinações destes.

16. Método de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que dita primeira cultura de planta transgênica resistente a praga ou dita segunda cultura de planta transgênica resistente a praga contém, ainda, um gene de resistência a herbicida selecionado do grupo consistindo em glifosato N-acetiltransferase (GAT), 5-enolpiruvilshikimato-3- fosfato sintase (EPSPS), fosfinotricina N-acetiltransferase (PAT) e combinações destes.