BRPI0720724A2 - Composições e métodos para o tratamento de infecções e tumores - Google Patents

Description

“COMPOSIÇÕES E MÉTODOS PAFRA O TRATAMENTO DE INFECÇÕES E TUMORES”

Reivindicação de prioridade

O presente pedido reivindica o benefício do pedido provisional US número 60/877.518, depositado em 27 de dezembro de 2006, que é incorporado aqui a título de re- ferência.

Pedidos relacionados

A matéria revelada também se refere à matéria do pedido provisional US número 60/688.872 depositado em 8 de junho de 2005, pedido de Utilidade US número 11/449.919, depositado em 8 de junho de 2006, e pedido PCT número PCT/US2006/22423. Esses pedi- dos anteriores são também incorporados aqui a título de referência na íntegra.

Declaração de apoio do Governo

A presente invenção foi feita com apoio do Governo Norte-americano sob conces- sões NIH AI39671 e CA84500. O governo possui certos direitos em relação à invenção.

Campo

O presente pedido refere-se ao uso de antagonistas, especificamente ao uso de an- tagonistas PD-1 para o tratamento de tumores e infecções persistentes.

Antecedentes

Imunossupressão de uma resposta imune de hospedeiro desempenha um papel em imunossupressão de tumor e infecção persistente. Infecções persistentes são infecções nas quais o vírus não é eliminado porém permanece em células específicas de indivíduos infec- tados. Infecções persistentes envolvem, frequentemente, estágios de infecção tanto silen- ciosa quanto produtiva sem exterminar rapidamente ou mesmo produzir dano excessivo às células hospedeiras. Há três tipos de interação de hospedeiro-vírus persistente: infecção latente, crônica e lenta. Infecção latente é caracterizada pela ausência de vírus infeccioso demonstrável entre episódios de doença recorrente. Infecção crônica é caracterizada pela presença contínua de vírus infeccioso após a infecção primária e pode incluir doença crôni- ca ou recorrente. Infecção lenta é caracterizada por um período de incubação prolongado seguido por doença progressiva. Ao contrário de infecções latente e crônica, a infecção len- ta pode não ter início com um período agudo de multiplicação viral. Durante infecções per- sistentes, o genoma viral pode ser estavelmente integrado no DNA celular ou mantido de forma epissomal. Infecção persistente ocorre com vírus como vírus de leucemia de célula-T humana, vírus de Epstein-Barr, citomegalovírus, vírus de herpes, vírus de varicela-zoster, sarampo, papovavírus, priônios, vírus de hepatite, adenovírus, parvovírus e papilomavírus.

Os mecanismos pelos quais as infecções persistentes são mantidas podem envol- ver modulação de vírus e expressão de gene celular e modificação da resposta imune do hospedeiro. A reativação de uma infecção latente pode ser desencadeada por vários estí- mulos, incluindo alterações em fisiologia de célula, superinfecção por outro vírus, e trauma ou tensão física. Imunossupressão de hospedeiro é associada, frequentemente, à reativa- ção de diversas infecções por vírus persistentes.

Muitos estudos mostram respostas imunes defeituosas em pacientes diagnostica- dos com câncer. Diversos antígenos de tumor foram identificados que são associados a cânceres específicos. Muitos antígenos de tumor foram definidos em termos de múltiplos tumores sólidos: MAGE 1, 2 & 3, definido por imunidade; MART-1/Melan-A, gp100, antígeno carcinoembriônico (CEA), HER-2, mucins (isto é, MUC-1), antígeno específico de próstata (PSA) e fosfatase de ácido prostático (PAP). Além disso, mostrou-s que proteínas virais co- mo hepatite B (HBV), Epstein-Barr (EBV) e papiloma humano (HPV) são importantes no desenvolvimento de carcinoma hepatocelular, Iinfoma e câncer cervical, respectivamente. Entretanto, devido à imunossupressão de pacientes diagnosticados com câncer, o sistema imune inato desses pacientes frequentemente falha em responder aos antígenos de tumor.

A imunoterapia tanto passiva como ativa foi proposta para ser usada no tratamento de tumores. A imunidade passiva fornece um componente da resposta imune, como anticor- pos ou células T citotóxicas ao sujeito de interesse. A imunoterapia ativa utiliza um agente terapêutico, como uma citocina, anticorpo ou composto químico para ativar uma resposta imune endógena, onde o sistema imune é iniciado para reconhecer o tumor como estranho. A indução de imunidade tanto passiva como ativa tem sido bem sucedida no tratamento de tipos específicos de cânceres.

Em geral, existe a necessidade de fornecer métodos terapêuticos seguros e efica- zes para tratar doença, por exemplo, doenças autoimunes, distúrbios inflamatórios, alergias, rejeição de transplante, câncer, imunodeficiência e outros distúrbios relacionados a sistema imune.

Sumário

É revelado aqui que células T CD8+ específicas de antígeno se tornam funcional- mente tolerantes (‘esgotados’) ao agente infeccioso ou um antígeno de tumor após a indu- ção do polipeptídeo de Morte programada-1 (PD-1). Por conseguinte, por reduzir a expres- são ou atividade de PD-1, uma resposta imune específica para o agente infeccioso ou a cé- lulas de tumor pode ser intensificada. Sujeitos com infecções, como infecções persistentes podem ser tratados utilizando antagonistas de PD-1. Sujeitos com tumores também podem ser tratados utilizando antagonistas de PD-1. Adicionalmente, sujeitos podem ser tratados por transplantar uma quantidade terapeuticamente eficaz de células T ativadas que reco- nhecem um antígeno de interesse em combinação com uma quantidade terapeuticamente eficaz de um antagonista de PD-1.

Em várias modalidades, são revelados métodos para induzir uma resposta imune a um antígeno de interesse em um sujeito mamífero. O método inclui administrar ao sujeito uma quantidade terapeuticamente eficaz de células T ativadas, onde as células T reconhe- cem especificamente o antígeno de interesse e uma quantidade terapeuticamente eficaz de um antagonista de Morte programada (PD)-1. O sujeito pode ser qualquer sujeito de interes- se, incluindo um sujeito com uma infecção viral, como uma infecção viral persistente, ou um 5 sujeito com um tumor.

Em modalidades adicionais, são revelados métodos para induzir uma resposta imu- ne a um antígeno de interesse em um receptor mamífero. Os métodos incluem contatar uma população de células doadoras a partir da mesma espécie de mamífero compreendendo células T com células apresentadoras de antígeno (APCs) e um antígeno de interesse, pré- 10 selecionado, onde o antígeno pré-selecionado é apresentado pelas APCs para as células T produzirem uma população de células T ativadas doadoras na presença de um antagonista de PD-1. Uma quantidade terapeuticamente eficaz da população de células T ativadas doa- doras é transplantada para o receptor. O receptor também é uma quantidade terapeutica- mente eficaz de um antagonista de PD-1.

Em algumas modalidades, são revelados métodos para tratar um sujeito infectado

com um patógeno, como para o tratamento de uma infecção persistente. Os métodos inclu- em administrar ao sujeito uma quantidade terapeuticamente eficaz de um antagonista de Morte programada (PD-1) e uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma molécula anti- gênica a partir do patógeno. Patógenos exemplares incluem patógenos virais e fúngicos.

Em modalidades adicionais, são revelados métodos para tratar um sujeito com um

tumor. Os métodos incluem administrar ao sujeito uma quantidade terapeuticamente eficaz de um antagonista de Morte programada (PD-1) e uma quantidade terapeuticamente eficaz de um antígeno de tumor ou um ácido nucléico que codifica o antígeno de tumor.

As características e vantagens acima e outras se tornarão mais evidentes a partir da seguinte descrição detalhada de várias modalidades, que procede com referência às fi- guras em anexo.

Breve descrição das figuras

A figura 1A é um gráfico de barras que mostra os níveis de PD-1 mRNA em células T específicas de DbGP33-41 e/ou DbGP276-286 a partir de camundongos transgênicos sim- 30 pies, camundongos infectados (aproximadamente 30 dias pós-infecção) imune Armstrong com vírus de coriomeningite linfocitária (LCMV) , ou camundongos infectados com LCMV- C1-13 sem CD4 (aproximadamente 30 dias pós-infecção), como medido por análise de con- junto de genes. A figura 1B é uma série de imagens de um experimento de citometria de fluxo mostrando expressão superficial de PD-1 em células T tetrâmero+ CD8+ em camun- 35 dongos infectados com LCMV-C1-13 sem CD4 e imune Armstrong LCMV aproximadamente 60 dias pós-infecção. Células T CD8+ anergic expressam níveis elevados de polipeptídeo de PD-1 na superfície da célula aproximadamente 60 dias após infecção crônica com vírus de LCMV-C1-13 (rotulado “crônico”), porém células T CD8+específicas de vírus não expressam polipeptídeo PD-1 após eliminação de uma infecção Amstrong LCMV aguda (rotulada “imu- ne”). A figura 1C é uma série de imagens de um experimento de citometria de fluxo que de- monstra a presença de PD-L1 em esplenócitos a partir de camundongos não infectados e 5 infectados cronicamente. Demonstra que a expressão de PD-L1 é a mais elevada nos es- plenócitos que são infectados pelo vírus.

A figura 2A é uma série de scatter plots que mostram que quando camundongos in- fectados com C1-13 são tratados do 23 até 37 pós-infecção houve aproximadamente um aumento de 3 vezes número de células T CD8+ específicas de DbGP33-41 e específicas de 10 DbNP396-404 em comparação com os controles não tratados. Para determinar quaisquer alterações em função IFN-γ e TNF-α a produção foi medida em resposta a 8 epítopos LCMV diferentes. A figura 2 é um scatter plot que mostra que quando todas as especificidades de célula T CD8+ conhecidas são medidas há um aumento de 2,3 vezes em número total de células T CD8+ específicas de LCMV. A figura 2C é uma série de gráficos de citometria de 15 fluxo que mostram a produção de IFN-γ e TNF-α em resposta a oito epítopos de LCMV dife- rentes. A figura 2D é um scatter plot que mostram que uma quantidade maior de células T CD8+ específicas de vírus em camundongos tratados têm a capacidade de produzir TNF-a. A figura 2E é uma série de gráficos de barras que mostram que bloqueio de PD-L1 também resultou em controle viral aumentado no baço, fígado, pulmão e soro.

A figura 3A é um gráfico que demonstra o aumento em células T CD8+ específicas

de DbGP33-41 e DbGP276-286 (rotuladas “GP33” e “GP276”) em camundongos infectados com C1-13 sem CD4 tratados com anti-PD-L1 (rotulado “aPD-L1”) do dia 46 ao dia 60 pós- infecção versus controle (rotulado “untx”), que demonstra que camundongos tratados com anti-PD-L1 continham aproximadamente 7 vezes mais de células T CD8+ esplênicas especí- 25 ficas de DbGP276-286 e aproximadamente 4 vezes mais de células T CD8+ esplênicas es- pecíficas de DbGP33-41 do que camundongos não tratados. A figura 3B é uma série de i- magens de um experimento de citometria de fluxo que demonstram a frequência aumentada de células T CD8+ específicas de FbGP33-41 e DbGP276-286 no baço de camundongos infectados com C1-13 sem CD4 tratados com anti-PD-L1 (rotulado “aPD-Li Tx”) a partir do 30 dia 46 até o dia 60 pós-infecção versus controle (rotulado “untx”). A figura 3C é uma série de imagens de um experimento de citometria de fluxo que demonstra proliferação aumentada de células T CD8+ específicas de DbGP276-286 em camundongos tratados com anti-PD-L1, como medido por incorporação de BrdU e expressão de Ki67. A figura 3D é um gráfico que mostra que camundongos tendo níveis elevados de expansão de célula T CD8+ demons- 35 tram uma resposta apreciável em células mononucleares de sangue periférico (PBMC), co- mo mostrado por comparar células T CD8+ específicas de DbGP276-286 na PBMC em comparação com células T CD8+ específicas de DbGP276-286 no baço. A figura 4A é uma série de gráficos que demonstram o aumento em células T CD8+ específicas de DbGP33-41 e DbGP276-286 que produzem IFN^y em camundongos tratados com anti-PD-L1, em comparação com controles. Frequências mais elevadas de células T CD8+ específicas de DbNP396-404, KbNP205-212, DbNPI 66-175 e DbGP92-101 foram também detectadas em camundongos tratados com anti-PD-L1. A figura 4B é um gráfico que demonstra que em camundongos tratados com anti-PD-L1, 50% de células T CD8+ específicas de DbGP276-286 produzem IFN-γ em comparação com 20% de células T CD8+ específicas de DbGP276-286 em camundongos de controle. A figura 4C é uma série de i- magens de um experimento de citometria de fluxo que demonstra que camundongos infec- tados cronicamente tratados com anti-PD-L1 produzem níveis mais elevados de TNF-α do que camundongos infectados cronicamente não tratados, porém ainda produzem níveis mais baixos de TNF-α do que camundongos imunes infectados com vírus Armstrong LCMV. A figura 4D é um gráfico que demonstra que o tratamento de camundongos infectados com LCMV-C1-13 com anti-PD-L1 renova atividade lítica ex vivo das células T específicas de vírus, em comparação com camundongos infectados não tratados, medida utilizando um ensaio de liberação 51Cr. A figura 4E é uma série de gráficos que demonstram a redução de títulos virais em vários órgãos após tratamento de camundongos infectados com LCMV-C1- 13 com <x-PD-L1. Títulos virais diminuíram aproximadamente 3 vezes no baço, 4 vezes no fígado, 2 vezes no pulmão e 2 vezes em soro após 2 semanas de tratamento anti-PD-LI, em comparação com camundongos não tratados.

A figura 5A é uma série de imagens de um experimento de citometria de fluxo que mostra expressão superficial de PD-1 utilizando 10 tetrâmeros de HIV específicos para epí- topos dominantes alvejados em infecção de HIV C clade crônica. As percentagens indicam a percentagem de células de tetrâmero+ que são PD-1+. A figura 5B é uma série de gráficos 25 que demonstra que a percentagem e MFI de PD-1 são significativamente reguladas ascen- dentemente nas células T CD8+ específicas de HIV em comparação com a população total de células T CD8+ (p<0,0001) em indivíduos simples em terapia anti-retroviral, e PD-1 é aumentado nas populações totais de células T CD8+ em controles infectados por HIV versus soronegativos para HIV (p=0,0033 e p>0,0001, respectivamente) 120 cores de tetrâmetro 30 HIV a partir de 65 indivíduos infectados por HIV e 11 controles soronegativos para HIV fo- ram incluídos na análise. A figura 5C é uma série de gráficos que mostra a percentagem mediana e MFI de expressão de PD-1 em células de tetrâmero+ por especificidade de epí- topo. A figura 5D é um gráfico que representa a variação na percentagem de células PD-1 + em diferentes populações específicas de epítopo em indivíduos com múltiplas respostas 35 detectáveis. Barras horizontais indicam a percentagem mediana de células de tetrâmero+ HIV PD-1+ em cada indivíduo.

A figura 6A é uma série de gráficos que demonstra que não há correlação entre o número de células T CD8+ específicas de HIV1 como medido por coloração de tetrâmero, e carga viral de plasma, ao passo que há uma correlação positiva entre a percentagem e MFI de PD-1 em células de tetrâmero+ e carga viral de plasma (p=0,0013 e p<0,0001, respecti- vamente). A figura 6B é uma série de gráficos que mostra que não há correlação entre o 5 número de células de tetrâmero+ HIV e contagem CD4, ao passo que há uma correlação inversa entre a percentagem e MFI de PD-1 em células de tetrâmero+ HIV e contagem CD4 (p=0,0046 e p=0,0150, respectivamente). A figura 6C é uma série de gráficos que demons- tram que a percentagem e MFI de PD-1 na população total de células T CD8+ correlaciona positivamente com a carga viral de plasma (p=0,0021 e p<0,0001, respectivamente). A figu- 10 ra 6D é uma série de gráficos que representa a percentagem e MFI de expressão de PD-1 na população total de células T CD8+ é inversamente correlacionada com a contagem CD4 (p=0,0049 e p=0,0006, respectivamente).

A figura 7 A é uma série de imagens de um experimento de citometria de fluxo que mostra coloração fenotípica representativa de células T CD8+ específicas de TL-8 B*4201 a 15 partir do sujeito SK222 no qual 98% de células T CD8+ específicas de TL9 B*402 são PD- 1+. A figura 7B é um gráfico que ilustra um sumário de dados fenotípicos a partir de pessoas nas quais >95% de células T CD8+ específicas de HIV são PD-1+. Sete a 19 amostras fo- ram analisadas para cada um dos marcadores fenotípicos indicados. A barra horizontal indi- ca percentagem média de células PD-1+ tetrâmero+ que eram positivos para o marcador 20 indicado.

A figura 8A é uma série de imagens de um experimento de citometria de fluxo que mostra os dados de ensaio de proliferação representativos de um sujeito positivo B*4201. Após uma estimulação por 6 dias com peptídeo, a percentagem de células T CD8+ específi- cas de TL9 B*4201 aumentou de 5,7% para 12,4% na presença de anticorpo de bloqueio 25 anti-PD-L1. A figura 8B é um gráfico de linha que representa os dados de ensaio de prolife- ração em sumário indicando um aumento significativo em proliferação de células T CD8+ específicas de HIV na presença de anticorpo de bloqueio anti-PD-L1 (n=28, p=0,0006, teste- t emparelhado). A figura 8C é um gráfico de barras que mostra os efeitos diferenciais de bloqueio de PD-1/PD-L1 sobre a proliferação de células T CD8+ específicas de HIV em uma 30 base de paciente individual. Barras brancas indicam aumento de dobro de células de tetrâ- mero+ na presença de peptídeo individualmente barras pretas indicam o aumento de dobro de células de tetrâmero+ na presença de peptídeo mais anticorpo de bloqueio anti-PD-L1. Indivíduos nos quais os ensaios de CFSE foram realizados por mais de um epítopo são indi- cados por símbolos de asterisco, quadrado ou triângulo.

As figuras 9A-9A são um diagrama e um conjunto de gráficos que mostram o efeito

sinergista de vacina terapêutica combinada com bloqueio de PD-L1 sobre frequência de célula T CD8 específica de antígeno e título viral em camundongos infectados de modo crô- nico. A figura 9A é um diagrama esquemático de um protocolo experimental. Camundongos infectados com LCMV clone-13 (CL-13) foram vacinados com vírus de vacínia do tipo selva- gem (W/WT) ou vírus de vacínia que expressa epítopo LCMV GP33-41 (W/GP33) em 4 (semanas) pós-infecção. Ao mesmo tempo, os camundongos foram tratados 5 vezes em 5 cada três dias com ou sem anti-PD-L1. A figura 9B é uma série de imagens de um experi- mento de citometria de fluxo que mostra a frequência de células CD8-T específicas de GP- 33 e GP276 em PBMC em 1 semana pós-terapia. O número representa frequência de célu- las de tetrâmero positivo por células CD8-T. Os dados são representativos de três experi- mentos. As figuras 9C-9D são gráficos da frequência de células CD8-T específicas de GP- 10 33 e GP276 (figura 9C) e títulos virais (figura 9D) no sangue pós-terapia. As alterações nos números de células CD8-T de tetrâmero positivo e os títulos virais foram monitorados no sangue por coloração de tetrâmero e ensaio de placa, respectivamente, nos pontos de tem- po indicados. Os números de células CD8-T de tetrâmero positivo e títulos virais são mos- trados para camundongos individuais (quatro painéis superiores) e múltiplos (painel inferior) 15 após infecção com W/WT ou V/GP33 (linha reta) e tratamento com anti-PD-L1 (região sombreada). Linhas tracejadas representam limite de detecção de vírus. Os resultados são agrupados a partir de três experimentos.

As figuras 10A-10D são gráficos e imagens digitais que mostram células CD8-T es- pecíficas de antígeno aumentado e controle viral aumentado em tecidos diferentes dos ca- mundongos que receberam vacina terapêutica combinada com bloqueio de PD-L1. A figura 10A é uma série de imagens de um experimento de citometria de fluxo que mostra a fre- quência de células CD8-T específicas de GP33 em tecidos diferentes em 4 semanas pós- terapia. O número representa frequência de células de tetrâmero positivo GP33 por células CD8-T. Os dados são representativos de dois experimentos. A figura 10B é um gráfico de números de célula T CD8 específicos de GP 33 em tecidos diferentes em 4 semanas pós- terapia. A figura 10C é um conjunto de gráficos de barra que mostra títulos virais nos tecidos indicados em 2 (cheio) e 4 (vazio) semanas após terapia. Linhas tracejadas representam limite de detecção de vírus. N=6 camundongos por grupo. Os resultados são agrupados a partir de dois experimentos. A figura 10D é uma imagem digital de imunocoloração de baço com antígenos aLCMV (vermelho) em 2 semanas após a terapia. Ampliação, x20.

As figuras 11A-11D são gráficos que mostram recuperação aumentada de função em células CD8-T esgotadas por vacina terapêutica combinada com bloqueio de PD-L1. A figura 11A é uma série de imagens de um experimento de citometria de fluxo que mostra produção de IFN-γ e desgranulação por esplenócitos dos camundongos vacinados em 4 35 semanas após a terapia. Os esplenócitos foram estimulados com os peptídeos indicados na presença de anticorpos aCD107a/b e então coloridos em conjunto para IFN-γ. Os gráficos mostrados são gated em células CD8-T e são representativos de dois experimentos inde- pendentes. A figura 11B é um gráfico que mostra a percentagem de células IFN-y+CD107+ por células CD8-T específicas para cada um dos peptídeos de LCMV a partir da figura 11A são resumidos para múltiplos camundongos (n=6 para cada resposta). Os resultados são agrupados a partir de dois experimentos. A figura 11C é um conjunto de gráficos que mostra 5 produção de TNF-α a partir de células CD8-T capazes de produzir IFN-γ nos camundongos vacinados. Após estimulação de esplenócitos com peptídeo de GP33-41 ou GP276-286, células CD8-T que produzem IFN-γ foram gated e então traçadas por IFN-γ (eixo geométrico x) versus TNF-α (eixo geométrico y). Os números superior e inferior em gráficos indicam frequência de células TNF-α+ entre células IFN-γ+ e intensidade fluorescente média (MFI) 10 de células IFN-γ+, respectivamente. Os dados são representativos de dois experimentos independentes. Afigura 11D é um gráfico que mostra a percentagem de células TNF-α+ por células IFN-γ+ para peptídeo GP33-41 ou GP276-286 a partir da figura 11C são resumidos para múltiplo camundongo (n=6 para cada resposta).

As figuras 12A-12B são um conjunto de gráficos que mostra o efeito de uma vacina terapêutica combinada com fenótipo de alteração de bloqueio de PD-L1 de células CD8-T específicas de antígeno de camundongos infectados de forma crônica. A figura 12A é um conjunto de gráficos que mostra o fenótipo de células CD8-T específicas de tetrâmero GP33 em PBMC nos tempos indicados pós-terapia. Histogramas foram gated em células CD8-T GP33+. A frequência de população expressando nível elevado de CD27 ou CD127 é indica- da por porcentagem nos gráficos. Os números em histogramas de Granzima B representam MFI de expressão. Os dados são representativos de três experimentos independentes. A figura 12B é um conjunto de gráficos que mostra alterações fenotípicas de células CD8-T específicas de tetrâmero GP33 em diferentes tecidos em 4 semanas pós-terapia. Histogra- mas foram gated em células CD8-T GP33+. A frequência de população que expressa nível elevado de CD127 ou PD-1 é indicada pela percentagem em gráficos. Os números em his- togramas de Granzima B e Bel-2 representam MFI de expressão. Os dados são representa- tivos de dois experimentos independentes.

As figuras 13A-13E são um diagrama esquemático, traçados e gráficos que mos- tram o efeito sinergista de vacina terapêutica combinada com bloqueio de P-L1 na recupera- 30 ção de função em células T CD8 esgotadas ‘inúteis’. A figura 13A é um diagrama esquemá- tico do protocolo. Os camundongos tiveram as células T CD4 esgotadas e então infectados com LCMV clone-13. Alguns camundongos foram vacinados com vírus de vacínia do tipo selvagem (W/WT) ou vírus de vacínia que expressa epítopo GP33-41 de LCMV (W/GP33) em 7 semanas pós-infecção. Ao mesmo tempo, os camundongos foram tratados 5 vezes a 35 cada três dias com ccPD-L1 ou seu isotipo. Duas semanas após tratamento inicial de anti- corpos, os camundongos foram sacrificados para análise. A figura 13B é uma série de ima- gens de um experimento de citometria de fluxo e um gráfico de barras que mostra a fre- quência de células CD8-T específicas de GP33 nos tecidos indicados em 4 semanas pós- terapia. O número representa a frequência de células de tetrâmero-positivo GP33 por célu- las CD8-T. A frequência de células específicas de GP33 por células T CD* em diferentes tecidos em 2 semanas pós-terapia também é resumida. A figura 13C é uma série de ima- 5 gens de um experimento de citometria de fluxo que mostra os resultados a partir de experi- mentos onde esplenócitos estimulados com peptídeo GP33 na presença de anticorpos aCD107a/b e então coloridos em conjunto para IFN-γ. Os gráficos mostrados são gated nas células CD8-T. A percentagem de células ‘CD107’ IFN-γ por células CD8-T específicas para peptídeo GP33 é resumida por múltiplos camundongos. A figura 13D é um gráfico de barras 10 da percentagem de células IFN-γ+ após estimulação com peptídeo GP33 por células positi- vas para tetrâmetro GP33-41 restrito por Db, é resumido para múltiplos camundongos. A figura 13E é um gráfico de barras de títulos virais nos tecidos indicados em 2 semanas após terapia. Todos os gráficos são representativos de dois experimentos e todos os resultados resumidos são agrupados a partir de dois experimentos (n=6 camundongos por grupo).

As figuras 14A-14B são um conjunto de traçados e gráficos que mostram o bloqueio

da via de sinalização PD1/PD-L1 aumenta o número total de células T específicas de antí- geno após transferência adotiva para camundongos portadores congênitos. Esplenócitos inteiros foram transferidos de forma adotiva para camundongos portadores congênitos com ou sem terapia com anti-PD-L1. A figura 14A é um conjunto de gráficos de citometria de flu- 20 xo representativo a partir de pontos de tempo específicos gated nas células CD8+T. A figura 14B são gráficos que mostram a cinética de expansão de células T CD8 específicas de Db GP33 em sangue periférico a partir de dois experimentos independentes (n=4 animais por grupo).

As figuras 15A-15E são traçados e gráficos que mostram o bloqueio da via PD- 25 1/PD-L1 após imunoterapia de célula T adotiva aumentar a produção de citocina em células T CD8 específicas de antígeno. Esplenócitos foram isolados no dia 17 após transferência e analisados para expressão de citocina após estimulação com peptídeo antigênico. A figura 15A é um conjunto de gráficos de fluxo representativos que são mostrados para a expressão de ΙΡΝγ avaliados por coloração de citocina intracelular após 5 horas de estimulação com 30 epítopos CD8 definidos ou controles sem peptídeo. As figuras 15B e 15D são gráficos re- presentativos mostrados para a expressão dual de TNFa ou 107ab e IFNy (stats de qua- drante são percentagem de gate CD8). As figuras 15C e 15E são gráficos da percentagem de células que produzem IFNyy também produzindo TNFa ou 170ab (n=3 animais por gru- po).

As figuras 16A-16B são um gráfico e traçados que mostram níveis aumentados de

células de secretar anticorpo em camundongos infectados com LCMV Clone 13. Níveis to- tais de ASC foram medidos em camundongos infectados com LCMV crônico após tratamen- to com aPD-L1 por ELISPOT e coloração de CD138. A figura 16A é um gráfico do número total de ASC esplênico, sumário de resultados a partir de três experimentos independentes. A figura 16B é um conjunto de gráficos que mostra que um aumento em células de secretar anticorpo (ASC) no baço pode ser medido pelo marcador CD138. Mostrando um gráfico representativo, ASC são CD138+ e B220 baixo/intermediário (gated em linfócitos).

A figura 17 é um gráfico que mostra que o tratamento de camundongos infectados com LCMV crônico com anti-PD-L1 não leva a níveis elevados de ASC de medula óssea. Números totais de ASC foram enumerados a partir do baço e medula óssea de camundon- gos infectados com LCMV crônico 14 dias pós-tratamento anti(a)PD-L1 por ELISPOT. A linha representa média geométrica no grupo.

A figura 18 é um gráfico que mostra que a co-administração de aPD-L1 e aCTLA-4 leva a aumentos sinergistas em ASC esplênico. Camundongos infectados com LCMV crôni- co receberam aPD-L1, aCTLA-4 ou ambos por 14 dias e ASC no baço foi enumerado por ELISPOT. A linha representa média geométrica no grupo de tratamento.

As figuras 19A-19B são gráficos que mostram proliferação de célula T CD4 e célula

B aumentada e atividade de centro germinal em camundongos tratados com aPD-L1. A figu- ra 19A é um gráfico de análise citométrica de fluxo de células T CD4 e células B que mostra níveis de Ki-67 elevados após tratamento com aPD-L1. Os resultados são gated em células B ou CD4 como listado acima de cada coluna. A figura 19B é um conjunto de gráficos que 20 mostra uma frequência aumentada de células B que expressam PNA e níveis elevados de FAS1 que indicam atividade aumentada de centro germinal em camundongos tratados com aPD-L1. Os traçados são um gráfico representativo que resume os resultados de dois expe- rimentos separados.

As figuras 20A-20C são traçados e gráficos que mostram expressão de PD-1 em 25 subconjuntos de células T CD8 e CD4. A figura 20A é uma série de imagens de experimento de citometria de fluxo que mostra co-expressão de PD-1 e vários marcadores fenotípicos entre linfócitos CD8+/CD3+ no sangue. A figura 20B é um conjunto de gráficos da percenta- gem de vários subconjuntos de células T CD8+/CD3+ e (D) CD4+/CD3+ que expressam PD- 1. Barras horizontais indicam percentagem média de PD-1 em células T que são positivas 30 (círculos ocos) e negativas (triângulos sólidos) para o marcador indicativo. A figura 20C é um conjunto de gráficos que representa os dados fenotípicos de PD-1 expressando células T CD4+ a partir de um sujeito.

As figuras 21A-B são traçados e gráficos que demonstram que PD-1 é mais alta- mente expresso entre células T CD8 específicas para infecções crônicas. A figura 21A é uma série de imagens de um experimento de citometria de fluxo que mostra coloração PD-1 representativa de células T CD8 específicas de vírus de Epstein Barr (EBV), citomegalovírus (CMV), influenza e vírus de vacínia. A intensidade de fluorescência média geométrica (GMFI) de expressão de PD-1 entre células de tetrâmero+ é indicada. A figura 21B é um gráfico que mostra um sumário de PD-1, GMFI em células T CD8 específicas de vírus de EBV1 CMV1 influenza e vacínia a partir de voluntários saudáveis (n=35).

As figuras 22A-C são traçados e gráficos que demonstram que o bloqueio anti-PD- 5 L1 aumenta proliferação in vitro de células T CD8 específicas para infecções crônicas. A figura 22A é uma série de imagens de um experimento de citometria de fluxo que mostra linfócitos que foram rotulados com CFSE, a seguir cultivados por 6 dias sob as condições indicadas. As imagens mostram coloração representativa a partir de sujeitos positivos de EBV e CMV. A figura 22B é um gráfico de barras de respostas específicas de antígeno de 10 vírus de EBV, CMV, influenza e vacínia após bloqueio com anticorpo de bloqueio anti-PD- L1. As barras indicam aumento de dobro de células de tetrâmero+ na presença de peptídeo mais anticorpo de bloqueio anti-PD-L1 em comparação com peptídeo sozinho. A figura 22C é um gráfico de linha que mostra a relação entre o aumento de dobro em células de tetrâme- ro+ após bloqueio de anticorpo anti-PD-L1 e expressão de PD-1 (antes da cultura).

As figuras 23B-23C são traçados e gráficos que mostram células T CD8+ específi-

cas de vírus de hepatite C (HCV) que expressam PD-1 em infecção por HCV crônica huma- na. A figura 23A é um gráfico representativo a partir de cinco pacientes com infecção por HCV crônica mostrando a expressão de PD-1 em células T CD8+ específicas de HCV. Os números em negrito identificam a frequência de expressão de PD-1 (eixo geométrico x) em 20 células T CD8+ específicas de HCV (eixo geométrico y). Os números em itálico nos gráficos identificam a frequência de células de tetrâmero positivo entre células T CD8+ totais. No eixo geométrico y, 1073 e 1406 identificam a especificidade de epítopo de HCV do tetrâme- ro. Os pacientes são identificados por “Pt” seguido pelo número do paciente. As células fo- ram gated em linfócitos CD8+. Os gráficos estão em uma escala logarítmica. A figura 23B é 25 uma comparação de expressão de PD-1 em células T CD8+ a partir de doadores saudáveis (CD8 Saudáveis), pacientes infectados com HCV (CD8 HCV) e em células T específicas de HCV CD8+ (HCV tet+). A figura 23C é um gráfico de expressão de PD-1 em células T CD8+ específicas para vírus de influenza (Flu tet+) a partir de doadores infectados com HCV (HCV+) e saudáveis (Saudáveis) em comparação com a expressão de PD-1 em células T 30 CD8+ específicas para HCV (HCV tet+). Um teste t não emparelhado foi utilizado para com- parar diferenças em expressão de PD-1 no mesmo paciente no total de células T CD8+ ver- sus células T CD8+ específicas de HCV.

As figuras 24A-24D são traçados e gráficos que mostram que a frequência de célu- las T CD8+ que expressam PD-1 a partir do fígado é maior do que o sangue periférico. A figura 24A é um gráfico representativo de cinco pacientes com infecção por HCV crônica mostrando a expressão de PD-1 em total de células T CD8+ a partir do sangue periférico versus o fígado. Os números em negrito nos gráficos identificam a frequência de células com expressão de PD-1 entre o total de células T CD8+ no gate de linfócito. Os gráficos estão em uma escala logarítmica. A figura 24B é uma comparação de expressão de PD-1 em células T CD8+ a partir de sangue periférico versus fígado em pacientes infectados de forma crônica por HCV. Um teste t emparelhado foi utilizado para comparar a diferença em 5 expressão de PD-1 nos mesmos pacientes. A figura 24C é uma comparação de expressão de PD-1 nas células de Memória efetora CD8+ (TEm) a partir de sangue periférico versus o fígado. Subconjuntos de memória foram identificados por expressão diferencial de CD62L e CD45RA. Números em negrito nos gráficos superiores representam a frequência de células em cada quadrante. As células foram gated em linfócitos CD8+. O subconjunto TEm foi gated 10 (quadros) e a expressão de PD-1 é mostrada nos gráficos de histograma abaixo. A linha pontilhada mostra expressão de PD-1 em células T CD8+ simples (utilizado como a popula- ção negativa). Os números nos gráficos de histograma representam a frequência de células que expressam PD-1. A comparação da frequência de expressão de PD-1 em células TEm CD8+ a partir do sangue periférico versus o fígado no mesmo paciente. A figura 24D é um 15 gráfico representativo de dois pacientes com infecção HCV crônico mostrando a diferença em expressão CD127 em total de células T CD8+ a partir do sangue periférico versus o fí- gado. Os números em negrito identificam a frequência de expressão de CD127 no total de células T CD8+. As células foram gated em linfócitos CD8+. Os gráficos estão em uma es- cala logarítmica. Um sumário da comparação de expressão de CD127 em total de células T 20 CD8+ no sangue periférico versus o fígado é mostrado abaixo dos gráficos FACS. Um teste t emparelhado foi utilizado para análise estatística.

A figura 25 é um conjunto de gráficos e traçados que mostra células T CD8+ espe- cíficas de HCV no fígado que expressam um fenótipo esgotado. Gráficos representativos de expressão de CD127 e PD-1 em células T CD8+ específicas de HCV a partir do sangue pe- 25 riférico e fígado de dois pacientes com infecção por HCV crônica. A primeira linha dos gráfi- cos identifica a população de tetrâmero positivo de HCV (quadros). Os números acima dos quadros representam a frequência de células de tetrâmero positivo entre linfócitos CD3+. A especificidade de epítopo do tetrâmero HCV é identificado no eixo geométrico y (1073). A segunda e terceira linhas de gráficos mostram expressão de CD127 e PD-1 em células T 30 CD8+ específicas de HCV a partir do sangue periférico e fígado de dois pacientes com in- fecção por HCV crônica. Os números em negrito representam a frequência de expressão de CD127 ou PD-1 em células T CD8+ específicas de HCV. Os gráficos estão em uma escala logarítmica e gated em linfócitos CD3+ CD8+. Abaixo dos gráficos de FACS, um sumário da comparação de expressão de PD-1 (esquerda) e expressão de CD127 (direita) em total de 35 células T CD8 versus células T específicas de HCV CD8+ a partir de periferia (HCV tet+ PBMC) versus células T CD8+ específicas de HCV a partir do fígado (HCV tet+ Fígado) é mostrado. Testes t emparelhados foram utilizados para comparar expressão no mesmo pa- ciente.

A figura 26 é um conjunto de gráficos que mostra que bloqueio da via de PD-1/PD- L1 aumenta a expansão de células T específicas de HCV estimuladas por antígeno. PBMCs rotulados com CFSE a partir de dois pacientes de HLA-A2 separados foram estimulados 5 utilizando o antígeno de peptídeo cognato por 6 dias na presença de IL-2 e anticorpo anti- PD-L1 (painel superior) ou anticorpo anti-PD-1 (painel inferior). Um controle não estimulado também é mostrado. A percentagem de células T CD8+ HLA-A2 específicas de HCV eleva- do em CFSE e baixo em CFSE em proliferação é mostrada em cada quadrante.

As figuras 27A-27D são gráficos e traçados que mostram expressão de PD-1 ele- vada em células T CD8 específicas de vírus de imunodeficiência de símio (SIV) após infec- ção com SIV239. A figura 27A é um gráfico que mostra expressão de PD-1 em total de célu- las T CD8 a partir de um macaco normal. A figura 27B é um gráfico que mostra expressão de PD-1 em células T CD8 específicas de gag SIV e total em um macaco infectado com SIV239. A análise foi feita em PBMC em 12 semanas após infecção com SIV. A figura 12C é um gráfico que fornece um sumário de células positivas de PD-1 em células T CD8 específi- cas de SIV e total a partir de macacos infectados com SIV e normais. Os dados para maca- cos infectados com SIV representam 12 semanas após infecção. A figura 27D (último painel) é um gráfico que fornece um sumário de intensidade de fluorescência média (MFI) de ex- pressão de PD-1 em células T CD8 específicas de SIV e total a partir de macacos infectados com SIV e normais.

As figuras 28A-28B são um traçado e um gráfico, respectivamente, que mostram que o bloqueio in vitro de PD-1 resulta em expansão aumentada de células T CD8 específi- cas de SIV. PBMC a partir de macacos positivos A*01 que foram infectados com SHIV89.6P foram estimulados com peptídeo P11C (0,1 ug/ml) na ausência e presença de Ab de blo- queio anti-PD-1 (10ug/ml) por seis dias. Após três dias de estimulação, IL-2 (50 unida- des/ml) foi adicionado. Ao término de estimulação as células foram coloridas na superfície para CD3, CD8 e Gag-CM9 tetrâmero. Células não estimuladas (nostim) serviram como controles negativos. As células foram gated em linfócitos com base em dispersão a seguir em CD3 e analisadas para a expressão de CD8 e tetrâmero. A figura 28A é um gráfico FACS representativo. Os números no gráfico representam a frequência de células de tetrâ- mero positivo como percentagem de total de células T CD8. A figura 28B é um gráfico que fornece um sumário de dados a partir de seis macacos. As análises foram realizadas utili- zando células obtidas em 12 semanas após infecção. O aumento de dobro foi calculado co- mo uma razão da frequência de células de tetrâmero positivo em culturas estimuladas por P11C e células não estimuladas.

A figura 29 é um conjunto de gráficos que mostra a cinética de expressão de PD- L1, PD-L2 e PD-1 em diferentes tipos de células após infecção por LCMV. Os camundongos foram infectados com 2x106 pfu de clone-13 (CL-13). A expressão de PD-L1, PD-L2 e PD-1 em diferentes tipos de células foi mostrada como um histograma nos pontos de tempo indi- cados após infecção. A intensidade de fluorescência média (MFI) de expressão de PD-1 no tipo indicado de células é mostrada.

Listagem de seqüências

As seqüências de aminoácidos e nucléicas listadas na listagem de seqüências em anexo são mostradas utilizando abreviaturas de letra padrão para bases de nucleotídeo, e código de três letras para aminoácidos, como definido em 37 C.F.R. 1.822. Somente uma fita de cada seqüência de ácido nucléico é mostrada, porém a fita complementar é entendi- do como incluído por qualquer referência à fita exibida. Na listagem de seqüência em anexo: SEQ ID NO: 1 é uma seqüência de aminoácidos exemplar de PD-1 humano.

SEQ ID NO: 2 é uma seqüência de aminoácidos exemplar de PD-1 de camundon-

go.

SEQ ID NO: 3 é uma seqüência de aminoácidos exemplar de PD-L1 humano.

SEQ ID NO: 4 é uma seqüência de aminoácidos exemplar de PD-L2 humano.

SEQ ID Nos: 5-12 são seqüências de aminoácidos exemplares de regiões de es- queleto humano.

SEQ ID Nos: 13-35 são seqüências de aminoácido exemplares de peptídeos anti-

gênicos.

SEQ ID Nos: 36-43 são as seqüências de aminoácidos de peptídeos de histocom-

patibilidade principal.

SEQ ID NO: 44 e SEQ ID NO: 45 são a seqüência de aminoácido de epítopos de

célula T.

SEQ ID NO: 46 é uma seqüência de aminoácidos exemplar de um PD-L2 humano

variante.

SEQ ID Nos: 47-52 são seqüências de aminoácido exemplares de peptídeos anti-

gênicos.

Descrição detalhada

A presente revelação refere-se ao uso de antagonistas de PD-1 para a indução de uma resposta imune, como para um tumor ou uma infecção viral persistente.

Termos

A menos que indicado de outro modo, termos técnicos são utilizados de acordo com uso convencional. Definições de termos comuns em biologia molecular podem ser encontra- das em Benjamin Lewin, Genes V, publicado por Oxford University Press, 1994 (ISBN 0-19- 854287-9); Kendrew e outros, (eds.), The Encydopedia of Molecular Biology, publicado por Blackwell Science Ltd., 1994 (ISBN 0-632-02182-9); e Robert A. Meyers (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, publicado por VCH Publish- ers, Inc., 1995 (ISBN 1-56081-569-8).

Para facilitar o exame das várias modalidades dessa revelação, as seguintes expli- cações de termos específicos são fornecidas:

Alteração de nível de produção ou expressão: alterar, por aumentar ou diminuir, o ní-

vel de produção ou expressão de uma seqüência de ácidos nucléicos ou uma seqüência de aminoácidos (por exemplo, um polipeptídeo, um siRNA, um miRNA, um mRNA, um gene) como comparado com um nível de controle de produção ou expressão.

Anti-sentido, sentido e antigene: DNA tem duas fitas antiparalelas, uma fita de 5’ -> 10 3’, mencionada como a fita mais,e uma fita 3’ -> 5’, mencionada como a fita menos. Como polimerase RNA adiciona ácidos nucléicos em uma direção 5’ -> 3’, a fita menos do DNA serve como o gabarito para o RNA durante transcrição. Desse modo, um transcrito de RNA terá uma seqüência complementar à fita menos, e idêntica à fita mais (exceto que U é subs- tituído por T).

Moléculas anti-sentido são moléculas que são especificamente hibridizáveis ou es-

pecificamente complementares a RNA ou a fita mais de DNA. Moléculas de sentido são mo- léculas que são especificamente hibridizáveis ou especificamente complementares à fita menos de DNA. Moléculas de antígeno são moléculas de anti-sentido ou sentido dirigidas a um alvo de DNA. Um RNA anti-sentido (asRNA) é uma molécula de RNA complementar a uma molécula de ácido nucléico de sentido (codificação).

Amplificação: quando utilizado com referência a um ácido nucléico, isso se refere a técnicas que aumentam o número de cópias de uma molécula de ácido nucléico em uma amostra ou espécime. Um exemplo de amplificação é a reação de cadeia de polimerase, na qual uma amostra biológica coletada a partir de um sujeito é contatada com um par de inici- 25 adores de oligonucleotídeos, sob condições que permitem a hibridização dos iniciadores ao gabarito de ácido nucléico na amostra. Os iniciadores são estendidos sob condições apro- priadas, dissociados do gabarito, e então re-temperados, estendidos e dissociados para am- plificar o número de cópias do ácido nucléico. O produto de amplificação in vitro pode ser caracterizado por eletroforese, padrões de clivagem de endonuclease de restrição, hibridiza- 30 ção de oligonucleotídeo ou ligação, e/ou sequenciamento de ácido nucléico, utilizando técni- cas padrão. Outros exemplos de técnicas de amplificação in vitro incluem amplificação de deslocamento de fita (vide a patente US número 5.744.311); amplificação isotérmica isenta de transcrição (vide a patente US número 6.033.881); amplificação de reação de cadeia de reparo (vide WO 90/01069); amplificação de reação de cadeia de Iigase (vide E0-A-320 35 308); amplificação de reação de cadeia de Iigase de preencher lacuna (vide a patente US número 5.427.930); detecção de Iigase acoplado e PCR (vide a patente US número 6.027.889); e amplificação isenta de transcrição de RNA NASBA™ (vide a patente US núme- ro 6.025.134).

Anticorpo: um ligando de polipeptídeo que compreende pelo menos uma região vari- ável de imunoglobulina de cadeia leve ou cadeia pesada que reconhece especificamente e liga um epítopo (por exemplo, um antígeno, como um tumor ou antígeno viral ou um frag- mento do mesmo). Isso inclui imunoglobulinas intactas e as variantes e porções das mes- mas bem conhecidas na técnica, como fragmentos Fab’, fragmentos F(ab)’2, proteínas Fv de cadeia única (“scFv”), e proteínas Fv estabilizadas por dissulfeto (“dsFv”). Uma proteína scFv é uma proteína de fusão na qual uma região variável de cadeia leve de uma imunoglo- bulina e uma região variável de cadeia pesada de uma imunoglobulina são ligadas por um ligador, enquanto em dsFvs, as cadeias foram mudadas para introduzir uma ligação de dis- sulfeto para estabilizar a associação das cadeias. O termo também inclui formas genetica- mente construídas como anticorpos quiméricos (por exemplo, anticorpos de murino humani- zado), anticorpos heteroconjugados (por exemplo, anticorpos biespecíficos). Vide, também, Pierce Catalog and Handbook, 1994-1995 (Pierce Chemical Co., Rockford, IL); Kuby, J., Immunology, 3a edição, W.H. Freeman & Co., Nova York, 1997.

Tipicamente, uma imunoglobulina tem uma cadeia pesada e leve. Cada cadeia pesa- da e leve contém uma região constante e uma região variável, (as regiões são também co- nhecidas como “domínios”). Em combinação, as regiões variáveis de cadeia pesada e leve 20 ligam especificamente o antígeno. Regiões variáveis de cadeia leve e pesada contêm uma região de “esqueleto” interrompida por três regiões hipervariáveis, também chamadas “regi- ões de determinar complementaridade” ou “CDRs”. A extensão da região de esqueleto e CDRs foi definida (vide, Kabat e outros, Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Department of Health and Human Services, 1991, que é pelo presente incorporado a 25 título de referência). O banco de dados de Kabat é agora mantido on-line. As seqüências das regiões de esqueleto de cadeias leve e pesada diferentes são relativamente conserva- das em uma espécie. A região de esqueleto de um anticorpo, que são as regiões de esque- leto combinadas das cadeias leve e pesada constituintes, serve para posicionar e alinhar as CDRs em espaço tridimensional.

As CDRs são responsáveis principalmente por ligar-se a um epítopo de um antígeno.

As CDRs de cada cadeia são tipicamente mencionadas como CDR1, CDR2 e CDR3, nume- radas seqüencialmente iniciando a partir da extremidade-N, e são também identificadas tipi- camente pela cadeia na qual a CDR específica está localizada. Desse modo, uma CDR3 Vh é localizada no domínio variável da cadeia pesada do anticorpo no qual se encontra, ao pas- 35 so que uma CDR1 Cl é a CDR1 a partir do domínio variável da cadeia leve do anticorpo no qual se encontra. Referências a “VH” ou “VH” se referem à região variável de uma cadeia pesada de imunoglobulina, incluindo aquela de uma Fv, scFv, dsFv ou Fab. Referências a “VL” ou “VL” se referem à região variável de uma cadeia leve de imunoglobulina, incluindo aquela de um Fv, scFv, dsFv ou Fab.

Um “anticorpo monoclonal” é um anticorpo produzido por um clone único de B-

linfócitos ou por uma célula na qual os genes de cadeia leve e pesada de um único anticorpo foram transfectados. Anticorpos monoclonais são produzidos por métodos conhecidos por aqueles versados na técnica, por exemplo por fazer células formadoras de anticorpo híbridas a partir de uma fusão de células de mieloma com células imunes de baço. Anticorpos mono- clonais incluem anticorpos monoclonais humanizados.

Uma imunoglobulina “humanizada” é uma imunoglobulina incluindo uma região de esqueleto humano e uma ou mais CDRs a partir de uma imunoglobulina não humana (como camundongo, rato ou sintética). A imunoglobulina não humana que fornece as CDRs é de- nominada uma “doadora”, e a imunoglobulina humana que fornece o esqueleto é denomina- da um “aceptor”. Em uma modalidade, todas as CDRs são da imunoglobulina doadora em uma imunoglobulina humanizada. Regiões constantes não necessitam estar presentes, po- rém se estiverem, devem ser substancialmente idênticas a regiões constantes de imunoglo- bulina humana, isto é, pelo menos aproximadamente 85-90%, como aproximadamente 95% ou mais idênticas. Consequentemente, todas as partes de uma imunoglobulina humanizada, exceto possivelmente as CDRs, são substancialmente idênticas a partes correspondentes de seqüências de imunoglobulina humana natural. Um “anticorpo humanizado” é um anticor- po que compreende uma cadeia leve humanizada e uma imunoglobulina de cadeia pesada humanizada. Um anticorpo humanizado se liga ao mesmo antígeno que o anticorpo doador que provê as CDRs. O esqueleto aceptor de uma imunoglobulina humanizada ou anticorpo pode ter um número limitado de substituições por aminoácidos tirados do esqueleto doador. Anticorpos humanizados ou outros anticorpos monoclonais podem ter substituições de ami- noácido conservativas adicionais que não têm substancialmente efeito sobre a ligação de antígeno ou outras funções de imunoglobulina. Imunoglobulinas humanizadas podem ser construídas por meio de engenharia genética (por exemplo, vide a patente US número 5.585.089).

Um “anticorpo de neutralização” é um anticorpo que interfere em quaisquer das ativi- dades biológicas de um polipeptídeo, como um polipeptídeo PD-1. Por exemplo, um anticor- po de neutralização pode interferir na capacidade de um polipeptídeo PD-1 reduzir uma res- posta imune como a citotoxicidade de células T. Em vários exemplos, o anticorpo de neutra- 35 lização pode reduzir a capacidade de um polipeptídeo PD-1 reduzir uma resposta imune em aproximadamente 50%, aproximadamente 70%, aproximadamente 90% ou mais. Qualquer ensaio padrão para medir respostas imunes, incluindo aqueles descritos aqui, pode ser utili- zado para avaliar anticorpos potencialmente neutralizantes.

Antígeno: um composto, composição, ou substância que pode estimular a produção de anticorpos ou uma resposta de célula T em um animal, incluindo composições que são 5 injetadas ou absorvidas em um animal. Um antígeno reage com os produtos de imunidade humoral ou celular específica, incluindo aqueles induzidos por imunógenos heterólogos. O termo “antígeno” inclui todos os epítopos antigênicos relacionados. “Epítopo” ou “determi- nante antigênico” se refere a um sítio em um antígeno ao qual células B e/ou T respondem. Em uma modalidade, células T respondem ao epítopo, quando o epítopo é apresentado em 10 combinação com uma molécula MHC. Epítopos podem ser formados tanto de aminoácidos contíguos ou aminoácidos não contíguos justapostos por dobra terciária de uma proteína. Epítopos formados de aminoácidos contíguos são tipicamente retidos em exposição a sol- ventes de desnaturar ao passo que epítopos formados por dobra terciária são tipicamente perdidos em tratamento com solventes de desnaturar. Um epítopo inclui, tipicamente, pelo 15 menos 3, e mais normalmente, pelo menos 5, aproximadamente 9 ou aproximadamente 8- 10 aminoácidos em uma conformação espacial exclusiva. Métodos de determinar conforma- ção espacial de epítopos incluem, por exemplo, cristalografia de raios-x e ressonância mag- nética nuclear bidimensional.

Um antígeno pode ser um antígeno específico de tecido, ou um antígeno específico de doença. Esses termos não são exclusivos, visto que um antígeno específico de tecido pode ser também um antígeno específico de doença. Um antígeno específico de tecido é expresso em um número limitado de tecidos, como um tecido único. Exemplos não limitado- res específicos de um antígeno específico de tecido são um antígeno específico de próstata, um antígeno específico uterino, e/ou um antígeno específico de testículos. Um antígeno es- pecífico de tecido pode ser expresso por mais de um tecido, como, porém não limitado a, um antígeno que é expresso em mais de um tecido reprodutivo, como em tecido tanto de prósta- ta como uterino. Um antígeno específico de doença é expresso de forma coincidente com um processo de doença. Exemplos não limitadores específicos de um antígeno específico de doença são um antígeno cuja expressão correlaciona com, ou é preditivo de, formação de tumor. Um antígeno específico de doença pode ser um antígeno reconhecido por células T ou células B.

Célula apresentadora de antígeno (APC): uma célula que pode apresentar antígeno ligado a moléculas de classe I ou classe Il MHC a células T. APCs incluem, porém não são limitadas a, monócitos, macrófagos, células dendríticas, células B, células T e células Lan- gherans. Uma célula T que pode apresentar antígeno a outras células T (células T CD4+ e/ou CD8+) é uma célula T apresentadora de antígeno (T-APC). Ligação ou ligação estável (oligonucleotídeo): um oligonucleotídeo se liga ou se liga estavelmente a um ácido nucléico alvo se uma quantidade suficiente do oligonucleotídeo formar pares base ou for hibridizado ao seu ácido nucléico alvo, para permitir detecção da- quela ligação. A ligação pode ser detectada por propriedades físicas ou funcionais do com- 5 plexo de oligonucleotídeo alvo. A ligação entre um alvo e um oligonucleotídeo pode ser de- tectada por qualquer procedimento conhecido por uma pessoa versada na técnica, incluindo ensaios de ligação tanto funcionais como físicos. Por exemplo, a ligação pode ser detectada funcionalmente por determinar se a ligação tem um efeito observável sobre um processo biossintético como expressão de um gene, replicação de DNA, transcrição, translação e si- 10 milar.

Métodos físicos de detectar a ligação de fitas complementares de DNA ou RNA são bem conhecidos na técnica, e incluem tais métodos como DNase I ou footprinting químico, deslocamento de gel e ensaios de clivagem por afinidade, Northern blotting, dot blotting e procedimentos de detecção por absorção de luz. Por exemplo, um método que é amplamen- 15 te utilizado porque é simples e seguro, envolve a observação de uma alteração em absorção de Iuz de uma solução contendo um oligonucleotídeo (ou um análogo) e um ácido nucléico alvo em 220 a 300 nm à medida que a temperatura é lentamente aumentada. Se o oligonu- cleotídeo ou análogo se ligou ao seu alvo, há um súbito aumento em absorção em uma tem- peratura característica à medida que o oligonucleotídeo (ou análogo) e o alvo dissociam um 20 do outro, ou fundem.

A ligação entre um oligômero e seu ácido nucléico alvo é frequentemente caracteri- zada pela temperatura (Tm) na qual 50% do oligômero é fundido a partir de seu alvo. Um (Tm) mais elevado significa um complexo mais forte ou mais estável em relação a um com- plexo com uma (Tm) inferior.

Câncer ou tumor: um neoplasma maligno que foi submetido a anaplasia característi-

ca com perda de diferenciação, aumenta taxa de crescimento, invasão de tecido circundante e é capaz de metástase. Um câncer reprodutivo é um câncer que tem sua origem primária em um tecido reprodutivo, como no útero, testículos, ovário, próstata, tuba de falópio ou pê- nis. Por exemplo, câncer de próstata é um neoplasma maligno que se origina em ou a partir 30 do tecido de próstata, e câncer uterino é um neoplasma maligno que se origina em ou a par- tir do tecido uterino, e câncer testicular é um neoplasma maligno que se origina nos testícu- los. Câncer residual é câncer que permanece em um sujeito após qualquer forma de trata- mento dada ao sujeito para reduzir ou erradicar câncer de tireóide. Câncer metastático é um câncer em um ou mais sítios no corpo diferente do sítio de origem do câncer original (primá- 35 rio) a partir do qual o câncer metastático é derivado.

Quimioterapia: agentes quimioterapêuticos: como utilizado aqui, qualquer agente químico com utilidade terapêutica no tratamento de doenças caracterizadas por crescimento anormal de células. Tais doenças incluem tumores, neoplasmas e câncer bem como doen- ças caracterizadas por crescimento hiperplásico como psoríase. Em uma modalidade, um agente quimioterapêutico é um agente de uso no tratamento de neoplasma como tumores sólidos. Uma pessoa versada na técnica pode facilmente identificar um agente quimiotera- 5 pêutico de uso (por exemplo, Slapak e Kufe1 Principies of Cancer Therapy, Capítulo 86 em Harrison's Principies of Internai Medicine, 14a edição; Perry e outros, Chemotherapy, Ch. 17 em Abeloff, Clinicai Oncology 2a ed., © 2000 Churchill Livingstone, lnc; Baltzer L, Berkery R (eds): Oncology Pocket Guide to Chemotherapy, 2a ed. St. Louis, Mosby-Year Book, 1995; Fischer DS, Knobf MF1 Durivage HJ (eds): The Cancer Chemotherapy Handbook, 4a ed. St. 10 Louis, Mosby-Year Book, 1993). Os polipeptídeos imunogênicos revelados aqui podem ser utilizados em combinação com agentes quimioterapêuticos adicionais.

Níveis de controle: o nível de uma molécula, como um polipeptídeo ou ácido nucléi- co, normalmente encontrado na natureza sob uma certa condição e/ou em um fundo genéti- co específico. Em certas modalidades, um nível de controle de uma molécula pode ser me- 15 dido em uma célula ou espécie que não foi submetido, direta ou indiretamente, a um trata- mento. Em alguns exemplos, um nível de controle pode ser o nível em uma célula não con- tatado com o agente, como antagonista de PD-1. Em exemplos adicionais, um nível de con- trole pode ser o nível em um sujeito que não recebeu antagonista de PD-1.

DNA (ácido desoxirribonucléico): DNA é um polímero de cadeia longa que compre- 20 ende o material genético da maioria de organismos vivos (alguns vírus têm genes que com- preendem ácido ribonucléico (RNA)). As unidades de repetição em polímeros de DNA são quatro nucleotídeos diferentes, cada um dos quais compreende uma das quatro bases, ade- nina, guanina, citosina e timina ligada a um açúcar de desoxirribose ao qual um grupo de fosfato é fixado. Tripletos de nucleotídeos (mencionados como códons) codificam para cada 25 aminoácido em um polipeptídeo, ou para um sinal de parar. O termo códon também é utili- zado para as seqüências correspondentes (e complementares) de três nucleotídeos no mR- NA no qual a seqüência de DNA é transcrita.

A menos que de outro modo especificado, qualquer referência a uma molécula de DNA pretende incluir o complemento reverso daquela molécula de DNA. Exceto onde forma- ção de fita única é exigida pelo texto da presente invenção, moléculas de DNA, embora es- critas para representar somente uma única fita, abrangem as duas fitas de uma molécula de DNA de fita dupla.

Codificar: Diz-se que um polinucleotídeo codifica um polipeptídeo se, em seu estado nativo ou quando manipulado por métodos bem conhecidos por aqueles versados na arte, pode ser transcrito e/ou traduzido para produzir o mRNA para e/ou o polipeptídeo ou um fragmento do mesmo. A fita de anti-sentido é o complemento de um tal ácido nucléico, e a seqüência de codificação pode ser deduzida a partir da mesma. Expressão: o processo pelo qual informações codificadas de um gene são converti- das nas estruturas presentes e operando na célula. Genes expressos incluem aqueles que são transcritos em mRNA e então traduzidos em proteína e aqueles que são transcritos em RNA porém não traduzidos em proteína (por exemplo, siRNA, RNA de transferência e RNA 5 ribossomal). Desse modo, a expressão de uma seqüência alvo, como um gene ou uma regi- ão de promotor de um gene, pode resultar na expressão de um mRNA, uma proteína, ou ambos. A expressão da seqüência alvo pode ser inibida ou intensificada (diminuída ou au- mentada).

seqüências de controle de expressão: Seqüências de ácido nucléico que regulam a expressão de uma seqüência de ácido nucléico heterólogo ao qual é operativamente ligado. Seqüências de controle de expressão são operativamente ligadas a uma seqüência de ácido nucléico quando as seqüências de controle de expressão controlam e regulam a transcrição e, como apropriado, tradução da seqüência de ácido nucléico. Desse modo, as seqüências de controle de expressão podem incluir promotores apropriados, intensificadores, terminado- res de transcrição, um códon de partida (isto é, ATG) na frente de um gene de codificar pro- teína, sinais de junção, elemento para a manutenção do quadro de leitura correta daquele gene para permitir tradução adequada de mRNA, e códons de parar. O termo “seqüências de controle” pretende incluir, em um mínimo, componente cuja presença pode influenciar a expressão, e também podem incluir componentes adicionais cuja presença é vantajosa, por exemplo, seqüências líderes e seqüências de partner de fusão. Seqüências de controle de expressão podem incluir um promotor.

Um promotor é uma seqüência mínima suficiente para orientar a transcrição. São também incluídos aqueles elementos promotores que são suficientes para tornar a expres- são de gene dependente de promotor controlável específica do tipo de célula, específica de tecido ou induzível por sinais ou agentes externos; tais elementos podem ser localizados nas regiões 5’ ou 3’ do gene. Os promotores tanto constitutivo como induzível são incluídos (vide por exemplo, Bitter e outros, Methods in Enzymology 153:516-544, 1987). Por exemplo, ao clonar sistemas bacterianos, promotores induzíveis como pL de bacteriófago lambda, plac, ptrp, ptac (promotor híbrido ptrp-lac) e similar podem ser utilizados. Em uma modalidade, ao clonar sistemas de células de mamíferos, promotores derivados do genoma de células de mamífero (como o promotor de metalotioneína) ou de vírus de mamífero (como a repetição terminal longa de retrovírus; o promotor tardio de adenovírus, o promotor 7.5K de vírus de vacínia) podem ser utilizados. Promotores produzidos por DNA recombinante ou técnicas sintéticas também podem ser utilizados para fornecer transcrição das seqüências de ácido nucléico. Heteróloga: originando das espécies ou fontes genéticas separadas. Genericamente, um anticorpo que se liga especificamente a uma proteína de interesse não se ligará especifi- camente a uma proteína heteróloga.

Células hospedeiras: células nas quais um vetor pode ser propagado e seu DNA ex- 5 presso. A célula pode ser procariótica ou eucariótica. A célula pode ser mamífera, como uma célula humana. O termo também inclui qualquer progênie da célula hospedeira do sujeito. Entende-se que toda progênie pode não ser idêntica à célula parental uma vez que pode haver mutações que ocorrem durante replicação. Entretanto, tal progênie é incluída quando o termo “célula hospedeira” é utilizado.

Resposta imune: uma resposta de uma célula do sistema imune, como uma célula B,

célula T, ou monócito, a um estímulo. Em uma modalidade, a resposta é específica para um antígeno em particular (uma “resposta específica de antígeno”). Em uma modalidade, uma resposta imune é uma resposta de célula T, como uma resposta CD4+ ou uma resposta CD8+. Em outra modalidade, a resposta é uma resposta de célula B, e resulta na produção de anticorpos específicos.

“não resposta” com relação a células imunes inclui refratividade de células imunes à estimulação, como estimulação através de um receptor de ativação ou uma citocina. não resposta pode ocorrer, por exemplo, devido à exposição a imunossupressores ou exposição a doses elevadas de antígeno. Como utilizado aqui, o termo “anergia” ou “tolerância” inclui 20 refratividade a estimulação mediada por receptor de ativação. Tal refratividade é generica- mente específica a antígeno e persiste após cessar a exposição ao antígeno de tolerância. Por exemplo, anergia em células T (ao contrário de não resposta) é caracterizada por au- sência de produção de citocina (como IL-2). Anergia de célula T ocorre quando as células T são expostas a antígeno e recebem um primeiro sinal (um receptor de células T ou sinal 25 mediado por CD-3) na ausência de um segundo sinal (um sinal co-estimulador). Sob essas condições, a exposição novamente das células ao mesmo antígeno (mesmo se a exposição ocorrer na presença de uma molécula co-estimuladora) resulta em falha em produzir citoci- nas e, desse modo, falha em proliferar. Células T anérgicas podem, entretanto, montar res- postas a antígenos não relacionados e podem proliferar se cultivadas com citocinas (como 30 IL-2). Por exemplo, anergia de célula T pode ser também observada pela falta de produção de IL-2 por linfócitos T, como medido por ELISA ou por um ensaio de proliferação utilizando uma linhagem de células indicadora. Alternativamente, uma construção de gene repórter pode ser utilizada. Por exemplo, células T anérgicas não iniciam a transcrição de gene IL-2 induzida por um promotor heterólogo sob o controle do intensificador de gene 5’IL-2 ou por 35 um multímero da seqüência de API que pode ser encontrado no intensificador (Kang e ou- tros, Science 257:1134, 1992). Células T específicas de antígeno anérgicas podem ter uma redução de pelo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%", 95% ou mesmo 100% em atividade citotóxica em relação a uma célula T específica de antígeno de controle correspondente.

Peptídeo imunogênico: um peptídeo que compreende um motivo específico de alelo ou outra seqüência de tal modo que o peptídeo ligará uma molécula MHC e induzirá uma resposta de linfócito T citotóxico (“CTL”), ou uma resposta de célula B (por exemplo, produ- ção de anticorpo) contra o antígeno a partir do qual o peptídeo imunogênico é derivado.

Em uma modalidade, peptídeos imunogênicos são identificados utilizando motivos de seqüência ou outros métodos, como rede neural ou determinações polinomiais, conhecidas na técnica. Tipicamente, algoritmos são utilizados para determinar o “limite de ligação” de 10 peptídeos para selecionar aqueles com marcações que dão aos mesmos elevada probabili- dade de ligação em uma certa afinidade e serão imunogênicos. Os algoritmos são baseados nos efeitos em ligação MHC de um aminoácido específico em uma posição específica, os efeitos sobre ligação de anticorpo de um aminoácido específico em uma posição específica, ou os efeitos sobre ligação de uma substituição específica em um peptídeo contendo motivo. 15 No contexto de um peptídeo imunogênico, um “resíduo conservado” é um que aparece em uma freqüência significativamente mais elevada do quer seria esperado por distribuição ale- atória em uma posição particular em um peptídeo. Em uma modalidade, um resíduo conser- vado é um onde a estrutura de MHC pode fornecer um ponto de contato com o peptídeo imunogênico.

Peptídeos imunogênicos também podem ser identificados por medir sua ligação a

uma proteína MHC específica (por exemplo, HLA-A02.01) e por sua capacidade em estimu- lar CD4 e/ou CD8 quando apresentado no contexto da proteína de MHC.

Composição imunogênica: uma composição compreendendo um polipeptídeo imu- nogênico ou um ácido nucléico codificando o polipeptídeo imunogênico que induz uma res- posta CTL mensurável contra células que expressam o polipeptídeo, ou induz uma resposta de célula B mensurável (como produção de anticorpos que ligam especificamente o polipep- tídeo) contra o polipeptídeo. Para uso in vitro, a composição imunogênica pode consistir no ácido nucléico isolado, vetor incluindo o ácido nucléico / ou peptídeo imunogênico. Para uso in vivo, a composição imunogênica compreenderá tipicamente o ácido nucléico, vetor inclu- indo o ácido nucléico e ou polipeptídeo imunogênico, em veículos farmaceuticamente acei- táveis, e/ou outros agentes. Uma composição imunogênica pode incluir opcionalmente um adjuvante, um antagonista de PD-1, uma molécula co-estimuladora, ou um ácido nucléico que codifica uma molécula co-estimuladora. Um polipeptídeo, ou ácido nucléico que codifica o polipeptídeo, pode ser facilmente testado em relação a sua capacidade de induzir um CTL por ensaios reconhecidos na técnica.

Inibir ou tratar uma doença: Inibir uma doença, como crescimento de tumor ou uma infecção persistente, se refere à inibição do desenvolvimento total de uma doença ou dimi- nuição dos efeitos fisiológicos do processo de doença. Em vários exemplos, a inibição ou tratamento de uma doença se refere à diminuição de sintomas de um tumor ou uma infecção com um patógeno. Por exemplo, tratamento de câncer pode evitar o desenvolvimento de síndrome paraneoplásica em uma pessoa que se sabe ter câncer, ou diminuir um sinal ou 5 sintoma do tumor. Em outra modalidade, o tratamento de uma infecção pode se referir à ini- bição do desenvolvimento ou diminuição de um sintoma da infecção. “Tratamento” se refere a uma intervenção terapêutica que melhora um sinal ou sintoma de uma doença ou condição patológica relacionada à doença. Vacinação terapêutica se refere à administração de um agente a um sujeito já infectado com um patógeno. O sujeito pode ser assintomático, de 10 modo que o tratamento evita o desenvolvimento de um sintoma. A vacina terapêutica pode reduzir também a gravidade de um ou mais sintomas existentes, ou reduzir carga de pató- geno.

Doença infecciosa: qualquer doença causada por um agente infeccioso. Os exem- plos de patógenos infecciosos incluem, porém não são limitados a: vírus, bactéria, mico- 15 plasma e fungos. Em um exemplo específico, é uma doença causada por pelo menos um tipo de patógeno infeccioso. Em outro exemplo, é uma doença causada por pelo menos dois tipos diferentes de patógenos infecciosos. Doenças infecciosas podem afetar qualquer sis- tema do corpo, ser agudas (de curta atuação) ou crônicas/persistentes (de longa atuação), ocorrer com ou sem febre, atingir qualquer faixa etária e sobrepor-se mutuamente.

Doenças virais ocorrem, comumente após imunossupressão devido à reativação de

vírus já presentes no receptor. Exemplos específicos de infecções virais persistentes inclu- em, porém não são limitadas a, citomegalovírus (CMV) pneumonia, enterite e retinite; vírus de Epstein-Barr (EBV) doença linfoproliferativa; catapora/herpes zoster (causada por vírus de varicela zoster, VZH); mucosite HSV-1 e -2; encefalite HSV-6, cistite hemorrágica de ví- 25 rus BK; influenza viral; pneumonia a partir do vírus sincicial respiratório (RSV); AIDS (causa- da por HIV); e hepatite A, B ou C.

Exemplos adicionais de vírus infeccioso incluem: Retroviridae; Picornaviridae (por exemplo, vírus de pólio, vírus de hepatite A; enterovírus, vírus Coxsackie humano, rinovírus, ecovírus); Caiciviridae (como cepas que causam gastroenterite); Togaviridae (por exemplo, 30 vírus de encefalite equina, vírus de rubéola); Fiaviridae (por exemplo, vírus da dengue, vírus de encefalite, vírus de febre amarela); Coronaviridae (por exemplo, coronavírus); Rhabdovi- ridae (por exemplo, vírus de estomatite vesicular, vírus da raiva); Filoviridae (por exemplo, vírus ebola); Paramyxoviridae (por exemplo, vírus de parainfluenza, vírus de caxumba, vírus de sarampo, vírus sincicial respiratório); Orthomyxoviridae (por exemplo, vírus de influenza); 35 Bungaviridae (por exemplo, vírus Hantaan, vírus bunga, flebovírus e vírus Nairo); Arena viri- dae (vírus de febre hemorrágica); Reoviridae (por exemplo, reovírus, orbivírus e rotavírus); Birnaviridae; Hepadnaviridae (vírus de Hepatite B); Parvoviridae (parvovírus); Papovaviridae (vírus de papiloma, vírus de polioma); Adenoviridae (a maioria dos adenovírus); Herpesviri- dae (vírus de herpes simplex (HSV) 1 e HSV-2, vírus de varicela zoster, citomegalovírus (CMV), vírus de herpes); Poxviridae (vírus de varíola, vírus de vacínia, vírus de pox); e Irido- viridae (com vírus de febre suína Africana); e vírus não classificados (por exemplo, os agen- 5 tes etiológicos de encefalopatias espongiformes, o agente de hepatite delta (considerado como um satélite defeituoso de vírus de hepatite B), os agentes de hepatite não A, não B (classe 1 = internamente transmitidos, classe 2 = parenteralmente transmitidos (isto é, hepa- tite C); Norwalk e vírus relacionados, e astrovírus)).

Os exemplos de infecções por fungos incluem, porém não são limitadas a: aspergil- losis; afta (causado por Candida aibicans); criptococose (causado por Cryptococcus)\ e his- toplasmose. Desse modo, os exemplos de fungos infecciosos incluem,porém não são limi- tados a, Cryptococcus neoformans, Histoplasma eapsulatum, Coceidioides immitis, Blas- tomyees dermatitidis, Chlamydia trachomatis, Candida aibicans.

Os exemplos de bactérias infecciosas incluem: Helicobaeter pyloris, Borelia burgdor- feri, Legionella pneumophilia, Myeobaeteria sps (como M. tubereulosis, M. avium, M. intra- eellulare, M. kansaii, M. gordonae), Staphylococcus aureus, Neisseria gonorrhoeae, Neisse- ria meningitidis, Listeria monoeytogenes, Streptoeoceus pyogenes (Streptococcus do grupo A), Streptoeoceus agalactiae (Streptococus do grupo B), Streptoeoceus (grupo viridans), Streptoeoceus faecalis, Streptoeoceus bovis, Streptococcus (anaerobic sps.), Streptoeoceus pneumoniae, pathogenic Campylobacter sp., Enterococcus sp., Haemophilus influenzae, Bacillus anthracis, corynebacterium diphtheriae, corynebacterium sp., Erysipelothrix rhusio- pathiae, Clostridium perfringers, Clostridium tetani, Enterobacter aerogenes, Klebsiella pneumoniae, Pasturella multocida, Bacteroides sp., Fusobacterium nucleatum, Streptobacil- Ius moniliformis, Treponema pallidium, Treponema pertenue, Leptospira, and Actinomyces israelli. Outros organismos infecciosos (como protistas) incluem: Plasmodium falciparum e Toxoplasma gondii.

Uma “infecção persistente” é uma infecção na qual o agente infeccioso (como um ví- rus, micoplasma, bactéria, parasita, ou fungo) não é depurado ou eliminado do hospedeiro infectado, mesmo após a indução de uma resposta imune. Infecções persistentes podem ser 30 infecções crônicas, infecções latentes, ou infecções lentas. Infecção latente é caracterizada pela falta de vírus infeccioso demonstrável entre episódios de doença recorrente. Infecção crônica é caracterizada pela presença contínua de vírus infeccioso após a infecção primária e pode incluir doença recorrente ou crônica. Infecção lenta é caracterizada por um período de incubação prolongado seguido por doença progressiva. Ao contrário de infecções Iaten- 35 tes e crônicas, a infecção lenta pode não iniciar com um período agudo de multiplicação viral. Embora infecções agudas sejam relativamente breves (durando alguns dias até algu- mas semanas) e resolvidas do corpo pelo sistema imune, infecções persistentes podem du- rar, por exemplo, meses, anos ou mesmo uma vida inteira. Essas infecções também podem recorrer frequentemente durante um período longo de tempo, envolvendo estágios de infec- ção silenciosa e produtiva sem matar células ou mesmo produzir dano excessivo às células hospedeiras. Infecções persistentes frequentemente envolvem estágios de infecção tanto 5 silenciosa como produtiva sem matar rapidamente ou mesmo produzir dano excessivo às células hospedeiras. Durante infecções virais persistentes, o genoma viral pode ser esta- velmente integrado no DNA celular ou mantido de forma epissomal. Infecção persistente ocorre com vírus como vírus de leucemia de célula-T humana, vírus Epstein-Barr, citomega- lovírus, vírus de herpes, vírus de varicela-zoster, sarampo, papovavírus, priônios, vírus de 10 hepatite, adenovírus, parvovírus e vírus de papiloma.

Os agentes infecciosos causativos também podem ser detectados no hospedeiro (como dentro de células específicas de indivíduos infectados) mesmo após a resposta imu- ne ter resolvido, utilizando técnicas padrão. Mamíferos são diagnosticados como tendo uma infecção persistente de acordo com qualquer método padrão conhecido na técnica e descri- 15 to, por exemplo, nas patentes US números 6.368.832, 6.579.854, e 6.808.710 e publicação de pedido de patente US números 20040137577, 20030232323, 20030166531, 20030064380, 20030044768, 20030039653, 20020164600, 20020160000, 20020110836, 20020107363, e 20020106730, todos quais são pelo presente incorporados a título de refe- rência.

“Aliviar um sintoma de uma infecção persistente” é melhorar qualquer condição ou

sintoma associado à infecção persistente. Alternativamente, aliviar um sintoma de uma in- fecção persistente pode envolver reduzir a carga microbiana infecciosa (como viral, bacteri- ana, por fungo ou parasita) no sujeito em relação a tal carga em um controle não tratado. Como comparado com um controle não tratado equivalente, tal redução ou grau de preven- 25 ção é pelo menos 5%, 10%, 20%, 40%, 50%, 60%, 80%, 90%, 95%, ou 100% como medido por qualquer técnica padrão. De forma desejável, a infecção persistente é totalmente elimi- nada como detectado por qualquer método padrão conhecido na técnica, em cujo caso a infecção persistente é considerada como tendo sido tratada. Um paciente que está sendo tratado por uma infecção persistente é um que um médico diagnosticou como tendo uma tal 30 condição. O diagnostico pode ser por qualquer meio apropriado. O diagnóstico e monitora- ção podem envolver, por exemplo, detectar o nível de carga microbiana em uma amostra biológica (por exemplo, uma biópsia de tecido, teste de sangue, ou teste de urina), detectar o nível de um marcador substituto da infecção microbiana em uma amostra biológica, detec- tar sintomas associados a infecções persistentes, ou detectar células imunes envolvidas na 35 resposta imune típica de infecções persistentes (por exemplo, detecção de células T especí- ficas de antígeno que são anérgicas e/ou funcionalmente prejudicadas). Um paciente no qual o desenvolvimento de uma infecção persistente está sendo evitado pode ou não ter recebido um tal diagnóstico. Uma pessoa na técnica entenderá que esses pacientes podem ter sido submetidos aos mesmos testes padrão, como descrito acima, ou podem ter sido identificados, sem exame, como uma pessoa em risco elevado devido à presença de um ou mais fatores de risco (como histórico familiar ou exposição a agente infeccioso).

Isolado: um componente biológico “isolado” (como um ácido nucléico ou proteína ou organela) foi substancialmente separado ou purificado distante de outros componentes bio- lógicos na célula do organismo no qual o componente naturalmente ocorre, isto é, outro DNA e RNA cromossômico e extracromossômico, proteínas e organelas. Ácidos nucléicos e proteínas que foram “isolados” incluem ácidos nucléicos e proteínas purificadas por métodos de purificação padrão. O termo também abrange ácidos nucléicos e proteínas preparadas por expressão recombinante em uma célula hospedeira bem como ácidos nucléicos quimi- camente sintetizados.

Um “anticorpo purificado” é pelo menos 60% em peso isento de proteínas e molécu- las orgânicas de ocorrência natural com as quais é naturalmente associado. Em alguns e- xemplos a preparação é pelo menos aproximadamente 75%, pelo menos aproximadamente 80%, pelo menos aproximadamente 90%, pelo menos aproximadamente 95%, ou pelo me- nos aproximadamente 99%, em peso de anticorpo, como um anticorpo específico de PD-1, PD-L1 ou PD-L2. Um anticorpo purificado pode ser obtido, por exemplo, por cromatografia de afinidade utilizando proteína produzida de forma recombinante ou peptídeos de motivo conservado e técnicas padrão.

Rótulo: um composto ou composição detectável que é conjugado direta ou indireta- mente com outra molécula para facilitar a detecção daquela molécula. Exemplos não limita- dores, específicos, de rótulos incluem traçadores fluorescentes, ligações enzimáticas e isó- topos radioativos.

Linfócitos: um tipo de leucócito que está envolvido nas defesas imunes do corpo. Há dois tipos principais de linfócitos: células B e células T.

Complexo de histocompatibilidade principal (MHC): uma designação genérica que pretende abranger os sistemas de antígeno de histocompatibilidade descritos em diferentes espécies, incluindo os antígenos de leucócito humano (“HLA”).

Mamífero: esse termo inclui mamíferos tanto humanos como não humanos. Similar- mente, o termo “sujeito” inclui sujeitos tanto humanos como veterinários.

Neoplasma: uma proliferação celular anormal, que inclui tumores benignos e malig- nos, bem como outros distúrbios proliferativos.

Oligonucleotídeo: uma seqüência de polinucleotídeo linear de até aproximadamente 100 bases de nucleotídeo em comprimento. Quadro de leitura aberta (ORF): uma série de tripletos de nucleotideo (códons) codi- ficando para aminoácidos sem nenhum códon de terminação interna. Essas seqüências são normalmente traduzíveis em um peptídeo.

Operavelmente ligado: uma primeira seqüência de ácidos nucléicos é operavelmente ligada a uma segunda seqüência de ácidos nucléicos quando a primeira seqüência de áci- dos nucléicos é colocada em uma relação funcional com a segunda seqüência de ácidos nucléicos. Por exemplo, um promotor é operavelmente ligado a uma seqüência de codifica- ção se o promotor afetar a transcrição ou expressão da seqüência de codificação. Generi- camente, seqüências de DNA operavelmente ligados são contíguas e, onde necessário para unir duas regiões de codificação de proteína, no mesmo quadro de leitura.

Veículos farmaceuticamente aceitáveis: os veículos farmaceuticamente aceitáveis de uso são convencionais. Remington’s Pharmaceutical Sciences, por E.W. Martin, Mack Publi- shing Co., Easton, PA, 15a edição (1975), descreve composições e formulações apropriadas para distribuição farmacêutica das proteínas de fusão aqui reveladas.

Em geral, a natureza do veículo dependerá do modo de administração específico sendo empregado. Por exemplo, formulações parenterais normalmente compreendem flui- dos injetáveis que incluem fluidos farmacêutica e fisiologicamente aceitáveis como água, solução salina fisiológica, soluções de sal balanceadas, dextrose aquosa, glicerol ou similar como veículo. Para composições sólidas (como formas de pó, pílula, comprimido ou cápsu- la), veículos sólidos não tóxicos convencionais podem incluir, por exemplo, tipos farmacêuti- cos de manitol, lactose, amido ou estearato de magnésio. Além de veículos biologicamente neutros, composições farmacêuticas a serem administradas podem conter quantidades me- nores de substâncias auxiliares não tóxicas, como agentes umectantes ou emulsificantes, preservativos, e agentes de tamponamento de pH e similar, por exemplo, acetato de sódio ou monolaurato de sorbitano.

Uma “quantidade terapeuticamente eficaz” é uma quantidade de uma composição ou uma célula para obter um efeito desejado em um sujeito em tratamento. Por exemplo, essa pode ser a quantidade de um antagonista de PD-1 necessário para induzir uma resposta imune, inibir crescimento de tumor ou alterar de forma mensurável sintomas visíveis de um tumor ou infecção persistente. Quando administrado a um sujeito, uma dosagem será gene- ricamente utilizada que obterá concentrações de tecido alvo (por exemplo, em linfócitos) que foi mostrada como obtendo um efeito in vitro.

Polinucleotídeo: O termo polinucleotídeo ou seqüência de ácidos nucléicos se refere a uma forma polimérica de nucleotideo com pelo menos 10 bases em comprimento. Um polinucleotídeo recombinante inclui um polinucleotídeo que não está imediatamente contí- guo a ambas as seqüências de codificação com as quais está imediatamente contíguo (uma na extremidade 5’ e uma na extremidade 3’) no genoma de ocorrência natural do organismo a partir do qual é derivado. O termo, portanto, inclui, por exemplo, um DNA recombinante que é incorporado em um vetor, em um vírus ou plasmídeo de replicação autônoma, ou no DNA genômico de um procariota ou eucariota, ou que existe como uma molécula separada (por exemplo, um cDNA) independente de outras seqüências. Os nucleotídeos podem ser 5 ribonucleotídeos, desoxirribonucleotídeos ou formas modificadas de qualquer nucleotideo. O termo inclui formas de fita única e dupla de DNA.

Polipeptídeo: qualquer cadeia de aminoácidos, independente de comprimento ou modificação pós-translação (por exemplo, glicosilação ou fosforilação). Um polipeptídeo po- de estar entre 3 e 30 aminoácidos de comprimento. Em uma modalidade, um polipeptídeo 10 tem de aproximadamente 7 a aproximadamente 25 aminoácidos em comprimento. Ainda em outra modalidade, um polipeptídeo tem de aproximadamente 8 a aproximadamente 10 ami- noácidos em comprimento. Ainda em outra modalidade, um peptídeo tem aproximadamente

9 aminoácidos em comprimento. Com relação a polipeptídeos, “compreende” indica que seqüência de aminoácidos adicional ou outras moléculas podem ser incluídas na molécula, 15 “consiste essencialmente em” indica que seqüências de aminoácidos adicionais não são incluídas na molécula, porém que outros agentes (como rótulos ou compostos químicos) podem ser incluídos, e “consiste em” indica que seqüências de aminoácidos adicionais e agentes adicionais não são incluídos na molécula.

Morte programada (PD)-I: uma proteína que forma um complexo com proteína PD- 20 L1 ou PD-L2 e está envolvida em uma resposta imune, como a co-estimulação de células T. Genericamente, proteínas PD-1 são substancialmente idênticas a PD-1 de ocorrência natu- ral (tipo selvagem) (vide, por exemplo, Ishida e outros. EMBO J. 11:3887-3895, 1992, Shi- nohara e outros. Genomics 23:704-706, 1994; e patente US No. 5.698.520, todas incorpora- das a título de referência na íntegra). Em vários exemplos, sinalização de PD-1 reduz, por 25 exemplo, citotoxicidade de célula T CD8+ por reduzir proliferação de células T, produção de citocina ou eliminação viral. Desse modo, um polipeptídeo PD-1 pode reduzir atividade cito- tóxica de célula T CD8+ em pelo menos 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, ou mais de 100%, abaixo de níveis de controle como medido por qualquer método padrão.

Como utilizado aqui, o termo “atividade” com relação a uma proteína ou polipeptídeo

PD-1 inclui qualquer atividade que é inerente à proteína PD-1 de ocorrência natural, como a capacidade de modular um sinal inibidor em uma célula imune ativada, como por engajar um ligando natural em uma célula apresentadora de antígeno. Tal modulação de um sinal inibi- dor em uma célula imune resulta em modulação de proliferação e/ou sobrevivência de uma 35 célula imune e/ou secreção de citocina por uma célula imune. Proteína PD-1 também pode modular um sinal co-estimulador por competir com um receptor co-estimulador para ligação de uma molécula B7. Desse modo, o termo “atividade PD-1” inclui a capacidade de um poli- peptídeo ou proteína PD-1 de ligar seu(s) ligando(s) natural(is), capacidade de modular si- nais inibidores ou co-estimuladores de célula imune, e a capacidade de modular a resposta imune.

“Reduzir a expressão ou atividade de PD-1” se refere a uma diminuição no nível ou 5 atividade biológica de PD-1 em relação ao nível ou atividade biológica de proteína PD-1 em um controle, como uma amostra ou sujeito não tratado. Em exemplos específicos, o nível ou atividade é reduzido em pelo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, ou ainda mais do que 100%, em relação a um controle não tratado. Por exemplo, a atividade biológica de proteína PD-1 é reduzida se a ligação de proteína PD-1 a PD-L1, PD- 10 L2 ou ambos for reduzida, desse modo resultando em uma redução em sinalização de PD-1 e, portanto, resultando em um aumento em citotoxicidade de células T CD8+.

Um “gene PD-1” é um ácido nucléico que codifica uma proteína PD-1. Um “gene de fusão PD-1” é uma região de codificação PD-1 operavelmente ligada a uma segunda se- qüência de ácidos nucléicos heteróloga. Um gene de fusão PD-1 pode incluir um promotor 15 PF-1, ou pode incluir um promotor heterólogo. Em algumas modalidades, a segunda se- qüência de ácido nucléico heterólogo é um gene repórter, isto é, um gene cuja expressão pode ser ensaiada; genes repórteres incluem, sem limitação, aqueles que codificam glucu- ronidase (GUS), luciferase, cloramfenicol transacetilase (CAT), proteína fluorescente verde (GFP), fosfatase alcalina e beta-galactosidase.

Agente de ligação específica; um agente que se liga substancialmente somente a um

alvo definido. Desse modo um agente de ligação específica de PD-1 é um agente que se liga substancialmente a um polipeptídeo de PD-1 e não polipeptídeos não relacionados. Em uma modalidade, o agente de ligação específica é um anticorpo monoclonal ou policlonal que liga especificamente o polipeptídeo PD-1, PD-L1 ou PD-L2.

O termo “liga especificamente” se refere, com relação a um antígeno como PD-1, à

associação preferencial de um anticorpo ou outro ligando, integral ou em parte, com uma célula ou tecido que contém aquele antígeno e não a células ou tecidos que não têm aquele antígeno. Evidentemente, é reconhecido que um certo grau de interação não específica po- de ocorrer entre uma molécula e um tecido ou célula não alvo. Não obstante, ligação especí- 30 fica pode ser distinguida como mediada através de reconhecimento específico do antígeno. Embora anticorpos seletivamente reativos liguem antígeno, podem fazer isso com baixa afi- nidade. Ligação específica resulta em uma associação muito mais forte entre o anticorpo (ou outro ligando) e células que contêm o antígeno do que entre o anticorpo (ou outro ligando) e células que não tem o antígeno. Ligação específica resulta tipicamente em aumento maior 35 do que 2 vezes, como maior do que 5 vezes, maior do que 10 vezes ou maior do que 100 vezes em quantidade de anticorpo ligado ou outro ligando (por tempo unitário) a uma célula ou tecido que contém o polipeptídeo PD-1 em comparação com uma célula ou tecido que não tem o polipeptídeo. A ligação específica a uma proteína sob tais condições requer um anticorpo que é selecionado por sua especificidade para uma proteína específica. Uma vari- edade de formatos de imunoensaio é apropriada para selecionar anticorpos ou outros Iigan- dos especificamente imunorreativos com uma proteína específica. Por exemplo, imunoen- 5 saios ELISA de fase sólida são rotineiramente utilizados para selecionar anticorpos mono- clonais especificamente imunorreativos com uma proteína. Vide Harlow & Lane1 Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Publications, Nova York (1988), para uma descri- ção de formatos de imunoensaio e condições que podem ser utilizadas para determinar i- munorreatividade específica.

Célula T: um leucócito crítico para a resposta imune. Células T incluem,porém não

são limitadas a células T CD4+ e células T CD*+. Um linfócito T CD4+ é uma célula imune que contém um marcador em sua superfície conhecido como “cluster de diferenciação 4" (CD4). Essas células, também conhecidas como células T auxiliares, ajudam a orquestrar a resposta imune, incluindo respostas de anticorpo bem como respostas de célula T extermi- 15 nadora. Células T CD8+ contêm o marcador “cluster de diferenciação 8” (CD8). Em uma modalidade, uma célula T CD8+ é um linfócito T citotóxico. Em outra modalidade, uma célu- la CD8+ é uma célula T supressora. Uma célula T é “ativada” quando pode responder a um antígeno de interesse específico apresentado em células apresentadoras de antígeno.

Transduzido/transfectado: uma célula transduzida é uma célula na qual foi introduzi- 20 da uma molécula de ácido nucléico por técnicas de biologia molecular. Como utilizado aqui, o termo transdução abrange todas as técnicas pelas quais uma molécula de ácido nucléico poderia ser introduzida em uma tal célula, incluindo transfecção com vetores virais, trans- formação com vetores de plasmídeo, e introdução de DNA exposto por eletroporação, Iipo- fecção e aceleração de pistola de partícula.

Vetor: uma molécula de ácido nucléico, como introduzido em uma célula hospedeira,

desse modo produzindo uma célula hospedeira transformada. Um vetor pode incluir se- qüências de ácido nucléico que permitem ao mesmo replicar em uma célula hospedeira, como uma origem de replicação. Um vetor pode incluir também um ou mais ácidos nucléicos que codificam um marcador selecionável e outros elementos genéticos conhecidos na técni- 30 ca. Vetores incluem vetores de plasmídeo, incluindo plasmídeos para expressão em células bacterianas gram negativas e gram positivas. Vetores exemplares incluem aqueles para expressão em E. coli e Salmonella. Vetores também incluem vetores virais, como, porém não são limitados a, retrovírus, orthopox, avipox, epitelioma contagioso, varíola de cabra, varíola de suíno, adenoviral, vírus de herpes, vírus alfa, baculovírus, vírus Sindbis, vírus de 35 vacínia e vetores de poliovírus.

A menos que de outro modo explicado, todos termos técnicos e científicos utilizados aqui têm o mesmo significado como comumente entendido por uma pessoa com conheci- mentos comuns na técnica à qual essa revelação pertence. Os termos singulares “um”, “u- ma” e “o, a” incluem referentes plurais a menos que o contexto claramente indique de outro modo. Similarmente, a palavra "ou” pretende incluir “e” a menos que o contexto claramente indique de outro modo. Deve ser adicionalmente entendido que todos os tamanhos de base 5 ou tamanhos de aminoácido, e todos valores de peso molecular ou massa molecular, dados para ácidos nucléicos ou polipeptídeos são aproximados, e são fornecidos para descrição. Embora métodos e materiais similares ou equivalentes àqueles descritos aqui possam ser utilizados na prática ou teste da presente revelação, métodos e materiais apropriados são descritos abaixo. O termo “compreende” significa “inclui”. Todas as publicações, pedidos de 10 patente, patentes e outras referências mencionadas aqui são incorporadas a título de refe- rência na íntegra. No caso de conflito, o presente relatório descritivo, incluindo explicações de termos, controlará. Além disso, os materiais, métodos e exemplos são somente ilustrati- vos e não pretendem ser limitadores.

Antagonistas de PD-1

Os métodos revelados aqui envolvem o uso de inibidores da via PD-1 (antagonistas

PD-1). Moléculas PD-1 são membros da superfamília de gene de imunoglobulina. A PDF-1 humana tem uma região extracelular que contém domínio de superfamília de imunoglobuli- na, um domínio de transmembrana, e uma região intracelular incluindo um motivo inibidor baseado em tirosina imunorreceptor (ITIM) (Ishida e outros, EMBO J. 11:3887, 1992; Shino- 20 hara e outros, Genomics 23:704, 1994; patente US No. 5.698.520). Essas características também definem uma família de moléculas maior, chamada receptores imunoinibidores, que também inclui gp49B, PIR-B, e os receptores inibidores exterminadores (KIRs) (Vivier e Daeron (1997) Immunol. Today 18:286). Sem ser limitado por teoria, acredita-se que o motivo ITIM fosforilado por tirosila desses receptores interage com domínio S112 que con- 25 tém fosfatase, que leva a sinais inibidores. Um subconjunto desses receptores imuno- inibidores se liga a moléculas de complexo de histocompatibilidade principal (MHC), como KIRs, e CTLA4 se liga a B7-1 e B7-2.

Em seres humanos, PD-1 é um receptor de transmembrana do tipo I de 50-55 kDa que foi originalmente identificado em uma linhagem de células T sendo submetida a apopto- se induzida por ativação. PD-1 é expresso em células T, células B e macrófagos. Os Iigan- dos para PD-1 são os membros de família B7 Iigando-PD 1 (PD-L1, também conhecido co- mo B7-H1) e PD-L2 (também conhecido como B7-DC).

In vivo, PD-1 é expresso em células T ativadas, células B e monócitos. Dados expe- rimentais envolvem as interações de PD-1 com seus Iigandos em regulação descendente de respostas imunes centrais e periféricas. Em particular, proliferação em células T do tipo sel- vagem porém não em células T deficientes em PD-1 é inibida na presença de PD-L1. Adi- cionalmente, camundongos com deficiência de PD-1 apresentam um fenótipo autoimune. Uma seqüência de aminoácidos exemplar de PD-1 humano é exposta abaixo (vide

também Ishida e outros, EMBO J. 11:3887, 1992; Shinohara e outros. Genomics

23:704,1994; patente US No. 5.698.520):

mqipqapwpv vwavlqlgwr pgwfldspdr pwnpptffpa Ilwtegdna tftcsfsnts esfvlnwyrm spsnqtdkla

afpedrsqpg qdcrfrvtql pngrdfhmsv vrarrndsgt ylcgaislap kaqikeslra elrvterrae vptahpspsp rpagqfqtlv vgwggllgs Ivllvwvlav icsraargti garrtgqplk edpsavpvfs vdygeldfqw rektpeppvp cvpeqteyat ivfpsgmgts sparrgsadg prsaqplrpe

dghcswpl (SEQ ID NO: 1)

Uma seqüência de aminoácidos exemplar de PD-1 de camundongo é exposta abaixo:

mwvrqvpwsf twavlqlswq sgwllevpng pwrsltfypa wltvsegana tftcslsnws edlmlnwnrl spsnqtekqa afcnglsqpv qdarfqiiql pnrhdfhmni Idtrrndsgi

ylcgaislhp kakieespga elwterile tstrypspsp kpegrfqgmv igimsalvgi pvllllawal avfcstsmse argagskddt Ikeepsaapv psvayeeldf qgrektpelp tacvhteyat ivfteglgas amgrrgsadg Iqgprpprhe dghcswpl (SEQ ID NO: 2)

Seqüências de aminoácidos adicionais são reveladas na patente US número 6.808.710 e publicação de pedido de patente US números 2004/0137577, 2003/0232323, 2003/0166531, 2003/0064380, 2003/0044768, 2003/0039653, 2002/0164600, 2002/0160000, 2002/0110836, 2002/0107363, e 2002/0106730, que são incorporadas aqui 25 a título de referência. PD-1 é um membro da superfamília de imunoglobulinas (Ig) que con- tém um único domínio semelhante à Ig V em sua região extracelular. O domínio citoplásmico PD-1 contém duas tirosinas, com a tirosina mais proximal a membrana (VAYEEL (vide ami- noácidos 223-228 da SEQ ID NO: 2) em PD-1 de camundongo) localizado em um ITIM (mo- tivo inibidor baseado em tirosina imuno-receptor). A presença de um ITIM em PD-1 indica 30 que essa molécula funciona para atenuar sinalização de receptor de antígeno por recruta- mento de fosfatases citoplásmicas. Proteínas de PD-1 humana e de murino compartilham aproximadamente 60% de identidade de aminoácidos com conservação de quatro sítios de N-glicosilação em potencial, e resíduos que definem o domínio Ig-V. O ITIM na região cito- plásmica e o motivo semelhante a ITIM que circundam a tirosina carboxi-terminal (TEYVATI 35 (vide aminoácidos 166-181 da SEQ ID NO: 2) em humano e camundongo, respectivamente) são também conservadas entre ortólogos humano e de murino.

PD-1 é um membro da família de moléculas CD28/CTLA-4 baseada em sua capaci- dade de ligar-se a PD-L1. In vivo, como CTLA4, PD-1 é rapidamente induzido na superfície de células-T em resposta a anti-CD3 (Agata e outros, Int. Immunol. 8: 765, 1996). Ao contrá- 40 rio de CTLA4, entretanto, PD-1 também é induzido na superfície de células-B (em resposta a anti-lgM). PD-1 também é expresso em um subconjunto de timócitos e células mielóide (Agata e outros (1996), supra; Nishimura e outros (1996) Int. Immunol. 8: 773).

A energia de células T é concomitante com uma indução em expressão de PD-1. É revelado aqui que a citotoxicidade de células T pode ser aumentada pelo contato de uma 5 célula T com um agente que reduz a expressão ou atividade de PD-1. Mais especificamente, é revelado aqui que um agente que reduz a expressão ou atividade de PD-1 pode ser utili- zado para aumentar uma resposta imune, como a um antígeno viral ou um antígeno de tu- mor.

Sem ser limitado por teoria, a redução de expressão ou atividade de PD-1 resulta em um aumento em atividade de células T citotóxica, aumentando a resposta imune específica ao agente infeccioso. Para que as células T respondam a proteínas estranhas, dois sinais devem ser fornecidos por células apresentadoras de antígeno (APCs) para linfócitos T em repouso. O primeiro sinal, que confere especificidade à resposta imune, é transduzido atra- vés do receptor de célula T (TCR) após reconhecimento de peptídeo antigênico estranho apresentado no contexto do complexo de histocompatibilidade principal (MHC). O segundo sinal, denominado co-estimulação, induz células T a proliferarem e se tornarem funcionais. Co-estimulação não é específica a antígeno, nem limitada a MHC e é fornecida por um ou mais polipeptídeos de superfície de célula distintos expresso por APCs. Se as células T fo- rem somente estimuladas através do receptor de células T, sem receber um sinal co- estimulador adicional, se tornam não responsivas, anérgicas ou morrem, resultando em mo- dulação descendente da resposta imune.

As proteínas CD80 (B7-1) e CD86 (B7-2), expressas em APCs, são polipeptídeos co- estimuladores críticos. Embora B7-2 desempenhe um papel predominante durante respos- tas imunes primárias, B7-1 é regulado ascendentemente posteriormente no curso de uma resposta imune para prolongar respostas de células T primárias ou co-estimulando respos- tas de células T secundárias. Polipeptídeos B7 são capazes de fornecer sinais co- estimuladores ou inibidores a células imunes para promover ou inibir respostas de células imunes. Por exemplo, quando ligado a um receptor co-estimulador, PD-L1 (B7-4) induz co- estimulação de células imunes ou inibe co-estimulação de células imunes quando presente em uma forma solúvel. Quando limitado a um receptor inibidor, moléculas PD-L1 podem transmitir um sinal inibidor a uma célula imune. Membros de família B7 exemplares incluem B&-1, B7-2, B7-3 (reconhecidos pelo anticorpo BB-1), B7H (PD-L1) e B7-4 e fragmentos solúveis ou derivados dos mesmos. Membros de família B7 se ligam a um ou mais recepto- res em uma célula imune, como CTLA4, CD28, ICOS, PD-1 e/ou outros receptores, e de- pendendo do receptor, têm a capacidade de transmitir um sinal inibidor ou um sinal co- estimulador para uma célula imune. CD28 é um receptor que é expresso constitutivamente em células T em repouso. Após sinalizar através do receptor de células T, a ligação de CD28 e transdução de um sinal coestimulador induz células T a proliferarem e secretarem IL-2. CDLA4 (CD152), um recep- tor homólogo a CD28, está ausente em células T em repouso porém sua expressão é indu- zida após ativação de células T. CTLA4 desempenha um papel em regulação negativa de respostas de célula T. ICOS, um polipeptídeo relacionado a CD28 e CTLA-4, é envolvido em produção de IL-10. PD-1, o receptor ao qual PD-L1 e PD-L2 se ligam, também é induzido rapidamente na superfície de células-T. PD-1 também é expresso na superfície de células-B (em resposta a anti-lgM) e em um subconjunto de timócitos e células mielóides.

O envolvimento de PD-1 (por exemplo por reticulação ou por agregação), leva à transmissão de um sinal inibidor em uma célula imune, resultando em uma redução de res- postas imunes concomitantes com um aumento em anergia de células imunes. Membros da família PD-1 se ligam a um ou mais receptores, como PD-L1 e PD-L2 em células apresenta- doras de antígeno. PD-L1 e PD-L2, os quais são ambos polipeptídeos de ligando de PD-1 humano, são membros da família B7 de polipeptídeos (vide acima). Cada ligando PD-1 con- tém uma seqüência de sinais, um domínio IgV, um domínio IgC1 um domínio de transmem- brana, e uma cauda citoplásmica curta. In vivo, esses Iigandos foram mostrados como sen- do expressos em placenta, baço, linfonodos, timo e coração. PD-L2 também é expresso no pâncreas, pulmão e fígado, enquanto PD-L1 é expresso em fígado fetal, células-T ativadas e células endoteliais. Os dois Iigandos PD-1 são regulados ascendentemente em monócitos ativados e células dendríticas.

Uma seqüência de aminoácidos exemplar para PD-L1 (GENBANK® No. de acessão. AAG18508, como disponível em 4 de outubro de 2000) é exposta abaixo:

mrifavfifm tywhllnaft vtvpkdlyw eygsnmtiec kfpvekqldl aalivyweme dkniiqfvhg eedlkvqhss yrqrarllkd qlslgnaalq itdvklqdag vyrcmisygg adykritvkv napynkinqr ilwdpvtse heltcqaegy pkaeviwtss dhqvlsgktt ttnskreekl fnvtstlrin tttneifyct frrldpeenh taelvipelp Iahppnerth Ivilgaillc Igvaltfifr Irkgrmmdvk kcgiqdtnsk kqsdthleet (SEQ ID NO: 3)

Uma seqüência de aminoácidos precursora PD-L2 exemplar (Número de acessão

GENBANK® AAK15370, como disponível em 8 de abril de 2002) é exposta abaixo:

miflllmlsl elqlhqiaal ftvtvpkely iiehgsnvtl ecnfdtgshv nlgaitaslq kvendtsphr eratlleeql plgkasfhip qvqvrdegqy qciiiygvaw dykyltlkvk asyrkinthi Ikvpetdeve Itcqatgypl aevswpnvsv pantshsrtp eglyqvtsvl rlkpppgrnf scvfwnthvr eltlasidlq sqmeprthpt wllhifipsc iiafifiatv ialrkqlcqk Iysskdttkr pvtttkrevn sai (SEQ ID NO: 4) Uma seqüência de aminoácidos precursora PD-L2 variante, exemplar (Número de acessão GENBANK® Q9BQ51, como disponível em 12 de dezembro de 2006), é exposta abaixo:

miflllmlsl elqlhqiaal ftvtvpkely iiehgsnvtl ecnfdtgshv nlgaitaslq kvendtsphr eratlleeql

plgkasfhip qvqvrdegqy qciiiygvaw dykyltlkvk asyrkinthi Ikvpetdeve Itcqatgypl aevswpnvsv pantshsrtp eglyqvtsvl rlkpppgrnf scvfwnthvr eltlasidlq sqmeprthpt wllhifipfc iiafifiatv ialrkqlcqk Iysskdttkr pvtttkrevn sai (SEQ ID NO:46)

Antagonistas de PD-1 incluem agentes que reduzem a expressão ou atividade de um ligando PD 1 (PD-L1) ou um ligando PD 2 (PD-L2) ou reduz a interação entre PD-1 e PD-L2 ou a interação entre PD-1 e PD-L2. Compostos exemplares incluem anticorpos (como um anticorpo anti-PD-1, um anticorpo anti-PD-L1, e um anticorpo anti-PD-L2), moléculas de 15 RNAi (como moléculas RNAi anti-PD-1, RNAi anti-PD-L1 e RNAi anti-PD-L2), moléculas anti-sentido (como um RNA anti-sentido anti-PD-1, RNA anti-sentido anti-PD-L1, e RNA anti- sentido anti-PD-L2), proteínas negativas dominantes (como uma proteína PD-1 negativa dominante, uma proteína PD-L1 negativa dominante e uma proteína PD-L2 negativa domi- nante) e inibidores de molécula pequena.

Um antagonista de PD-1 é qualquer agente tendo a capacidade de reduzir a expres-

são ou a atividade de PD-1 em uma célula. A atividade ou expressão de PD-1 é reduzida em pelo menos aproximadamente 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou 100% em comparação com tal expressão ou atividade em um controle. Reduções exemplares em atividade são pelo menos aproximadamente 50%, pelo menos aproximadamente 60%, pelo 25 menos aproximadamente 70%, pelo menos aproximadamente 80%, pelo menos aproxima- damente 90%, pelo menos aproximadamente 95%, ou uma ausência completa de atividade detectável. Em um exemplo, o controle é uma célula que não foi tratada com o antagonista PD-1. Em outro exemplo, o controle é um valor padrão, ou uma célula contatada com um agente, como um veículo, conhecido por não afetar a atividade de PD-1. A atividade ou ex- 30 pressão de PD-1 pode ser determinada por qualquer método padrão na técnica, incluindo aqueles descritos aqui. Opcionalmente, o antagonista PD-1 inibe ou reduz a ligação de PD-1 a PD-L1, PD-L2 ou ambos.

A. Anticorpos

Anticorpos que ligam especificamente PD-1, PD-L1 ou PD-L2 (ou uma combinação 35 dos mesmos) são de uso nos métodos revelados aqui. Anticorpos incluem anticorpos mono- clonais, anticorpos humanizados, anticorpos não imunizados e proteínas de fusão de imu- noglobulina (Ig). Anticorpos anti-PD-1, anti-PDL1 ou PD-L2 policlonais podem ser prepara- dos por uma pessoa versada na técnica, como por imunizar um sujeito apropriado (como um sujeito veterinário) com um ligando PD-1 ou imunógeno PD-1. O título de anticorpo anti-PD- 1, anti-PD-L1 ou anti-PD-L2 no sujeito imunizado pode ser monitorado com o passar do tempo por técnicas padrão, como com um ensaio imunossorvente ligado por enzima (ELISA) utilizando um polipeptídeo PD-1 ou ligando PD-1 imobilizado.

Em um exemplo, as moléculas de anticorpo que ligam especificamente PD-1, PD-L1 5 ou PD-L2 (ou combinações dos mesmos) podem ser isoladas a partir do mamífero (como a partir de soro) e adicionalmente purificadas por técnicas conhecidas por uma pessoa versa- da na arte. Por exemplo, anticorpos podem ser purificados utilizando cromatografia de prote- ína A para isolar anticorpos IgG.

Células que produzem anticorpos podem ser obtidas a partir do sujeito e utilizadas para preparar anticorpos monoclonais por técnicas padrão (vide Kohler e Milstein Nature 256:495 49, 1995; Brown e outros, J. Immunol. 127:539 46, 1981; Cole e outros, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pág. 77 96, 1985; Gefter, M. L. e outros. (1977) Somatic Cell Genet. 3:231 36; Kenneth, R. H. em Monoclonal Antibodies: A New Di- mension In Biological Analyses. Plenum Publishing Corp., New York, N.Y. (1980); Kozbor e outros. Immunol. Today 4:72, 1983; Lerner, E. A. (1981) Yale J. Biol. Med. 54:387 402; Yeh e outros, Proc. Natl. Acad. Sei. 76:2927 31, 1976). Em um exemplo, uma linhagem de célula imortal (tipicamente um mieloma) é fundido com linfócitos (tipicamente esplenócitos) a partir de um mamífero imunizado com PD-1, PD-L1 ou PD-L2, e os sobrenadantes de cultura das células de hibridoma resultantes são classificados para identificar um hibridoma que produz um anticorpo monoclonal que se liga especificamente ao polipeptídeo de interesse.

Em uma modalidade, para produzir um hibridoma, uma linhagem de célula imortal (como uma linhagem de célula de mieloma) é derivada da mesma espécie mamífera que os linfócitos. Por exemplo, hibridomas de murino podem ser feitos por fusão de linfócitos a par- tir de um camundongo imunizado com um peptídeo PD-1, PD-L1 ou PD-L2 com uma Iinha- 25 gem de célula de camundongo imortalizada. Em um exemplo, uma linhagem de célula de mieloma de camundongo é utilizada que é sensível ao meio de cultura contendo hipoxanti- na, aminopterina e timidina (“meio de HAT”), qualquer de um número de linhagens de célu- las de mieloma pode ser utilizado como partner de fusão, de acordo com técnicas padrão, incluindo por exemplo, linhagens de mieloma P3-NS1/1-Ag4-1, P3-x63-Ag8.653 ou Sp2/0- 30 Ag14 que são disponíveis a partir da American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, Md. Células de mieloma de camundongo sensíveis a HAT podem ser fundidas com esple- nócitos de camundongo utilizando polietileno glicol (“PEG”). Células de hibridoma que resul- tam da fusão são então selecionadas utilizando meio HAT, que mata células de mieloma não fundidas (e fundidas de forma não produtiva). Células de hibridoma que produzem um 35 anticorpo monoclonal de interesse podem ser detectadas, por exemplo, por classificar os sobrenadantes de cultura de hibridoma para os anticorpos de produção que ligam uma mo- lécula PD-1, PD-L1 ou PD-L2, como pelo uso de um ensaio imunológico (como um ensaio imunossorvente ligado por enzima (ELISA) ou radioimunoensaio (RIA)).

Como uma alternativa para preparar hibridomas de secretar anticorpo monoclonal, um anticorpo monoclonal que liga especificamente PD-1, PD-L1 ou PD-L2 pode ser identifi- cado e isolado por classificar uma biblioteca de imunoglobulina combinatória recombinante (como uma biblioteca de exibição de fago de anticorpo) com PD-1, PD-L1 ou PD-L2 para isolar membros da biblioteca de imunoglobulina que ligam especificamente o polipeptídeo, Kits para gerar e classificar bibliotecas de exibição de fago são comercialmente disponíveis (como, porém não limitados a, Pharmacia e Stratagene). Os exemplos de métodos e rea- gentes particularmente sensíveis a uso na geração e classificação de biblioteca de exibição de anticorpo podem ser encontrados, por exemplo, na patente US número 5.223.409; publi- cação PCT número WO 90/02809; publicação PCT número 91/17271; publicação PCT nú- mero WO 92/18619; publicação PCT número 92/20791; publicação PCT número 93/01288; publicação PCT número WO 92/09690; Barbas e outros, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88:7978 7982, 1991; Hoogenboom e outros, NucIeicAcids Res. 19:4133 4137, 1991.

A seqüência de aminoácidos de anticorpos que ligam PD-1 é revelada, por exemplo, na publicação de patente US número 2006/0210567, que é incorporada aqui a título de refe- rência. Anticorpos que ligam PD-1 são também revelados na publicação de patente US nú- mero 2006/0034826, que também é incorporada aqui a título de referência. Em vários e- 20 xemplos, o anticorpo liga especificamente PD-1 ou um ligando PD-1 ou PD-2 com uma constante de afinidade de pelo menos 107 M'1, como pelo menos 108 M'1 pelo menos 5 x 108 M'1 ou pelo menos 109 M'1.

Em um exemplo a seqüência das regiões que determinam especificidade de cada CDR é determinada. Resíduos estão fora de SDR (sítios que não contatam ligando) são substituídos. Por exemplo, em qualquer uma das seqüências CDR como na tabela acima, no máximo um, dois ou três aminoácidos podem ser substituídos. A produção de anticorpos quiméricos, que inclui uma região de esqueleto a partir de um anticorpo e as CDRs a partir de um anticorpo diferente, é bem conhecida na arte. Por exemplo, anticorpos humanizados podem ser rotineiramente produzidos. O anticorpo ou fragmento de anticorpo pode ser uma imunoglobulina humanizada tendo regiões que determinam complementaridade (CDRs) a partir de um anticorpo monoclonal doador que liga PD-1, PD-L1 ou PD-L2, e esqueletos de região variável de cadeia leve e pesada e imunoglobulina a partir de esqueletos de cadeia leve e pesada de imunoglobulina aceptora humana. Genericamente, a imunoglobulina hu- manizada se liga especificamente a PD-1, PD-L1 ou PD-L2 com uma constante de afinidade de pelo menos 107 M'1, como pelo menos 108 M'1 pelo menos 5 x 108 M'1 ou pelo menos 109 M'1. Anticorpos monoclonais humanizados podem ser produzidos por transferir regiões que determinam complementaridade doadoras (CDRs) a partir das cadeias variáveis pesada e leve da imunoglobulina de camundongo doador (como PD-1, PD-L1 ou PD-L2) para um domínio variável humano, e então substituindo resíduos humanos nas regiões de esqueleto quando necessário para reter afinidade. O uso de componentes de anticorpo derivados de anticorpos monoclonais humanizados evita problemas em potencial associados à imunoge- nicidade das regiões constantes do anticorpo doador. Técnicas para produzir anticorpos monoclonais humanizados são descritas, por exemplo, por Jones e outros, Nature 321:522, 1986; Riechmann e outros, Nature 332:323, 1988; Verhoeyen e outros, Science 239:1534, 1988; Carter e outros, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 89:4285, 1992; Sandhu, Crit. Rev. Biote- ch. 12:437, 1992; e Singer e outros, J. Immunol. 150:2844, 1993. O anticorpo pode ser de qualquer isotipo, porém em várias modalidades o anticorpo é um IgG, incluindo porém não limitado a, IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4.

Em uma modalidade, a seqüência do esqueleto de região variável de cadeia pesada de imunoglobulina humanizada pode ser pelo menos aproximadamente 65% idêntica à se- qüência do esqueleto de região variável de cadeia pesada de imunoglobulina doadora. Des- se modo, a seqüência do esqueleto de região variável de cadeia pesada de imunoglobulina humanizada pode ser pelo menos aproximadamente 75%, pelo menos aproximadamente 85%, pelo menos aproximadamente 99% ou pelo menos aproximadamente 95%, idêntica à seqüência do esqueleto de região variável de cadeia pesada de imunoglobulina doadora. Regiões de esqueleto humano, e mutações que podem ser feitas em regiões de esqueleto de anticorpo humanizado, são conhecidas na técnica (vide, por exemplo, na patente US número 5.585.089, que é incorporado aqui a título de referência).

Anticorpos humanos exemplares são LEN e 21/28 CL. As seqüências dos esqueletos de cadeia pesada e leve são conhecidas na técnica. Esqueletos de cadeia leve exemplar de LEN MAb humano têm as seguintes seqüências:

FR1: DIVMTQS PDSLAVSLGERATINC (SEQ ID NO: 5)

FR2: WYQQKPGQPPLLIY (SEQ ID NO: 6)

FR3: GVPDRPFGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYC (SEQ ID NO: 7)

FR4: FGQGQTKLEIK (SEQ ID NO: 8)

Esqueletos de cadeia pesada exemplares de 21/28’ CL MAb humano têm as seguin- tes seqüências:

FR1: QVQLVQSGAEVKKPQASVKVSCKASQYTFT (SEQ ID NO: 9)

FR2: WVRQAPGQRLEWMG (SEQ ID NO: 10)

FR3: RVTITRDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCAR (SEQ ID NO: 11)

FR4: WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 12).

Anticorpos, como anticorpos monoclonais de murino, anticorpos quiméricos e anti- corpos humanizados, incluem moléculas de comprimento total bem como fragmentos das mesmas, como Fab, F(ab’)2 e Fv que incluem uma região variável de cadeia pesada e ca- deia leve e são capazes de ligarem determinantes de epítopo específico. Esses fragmentos de anticorpo retêm um pouco de capacidade de seletivamente ligarem com seu antígeno ou receptor. Esses fragmentos incluem:

(1) Fab, o fragmento que contém um fragmento de ligação de antígeno monovalen- te de uma molécula de anticorpo, pode ser produzido por digestão de anticorpo inteiro com a enzima papaína para fornecer uma cadeia leve intacta e uma porção de uma cadeia pesada;

(2) Fab’, o fragmento de uma molécula de anticorpo pode ser obtido por tratar anti- corpo inteiro com pepsina, seguido por redução, para fornecer uma cadeia leve intacta e

uma porção da cadeia pesada; dois fragmentos Fab’ são obtidos por molécula de anticorpo;

(3) (Fab’)2, o fragmento do anticorpo que pode ser obtido por tratar anticorpo inteiro com a enzima pepsina sem redução subsequente; F(ab’)2 é um dímero de dois fragmentos Fab’ retidos juntos por duas ligações de dissulfeto;

(4) Fv, um fragmento geneticamente construído que contém a região variável da

cadeia leve e a região variável da cadeia pesada expressa como duas cadeias; e

(5) anticorpo de cadeia única (como scFv), definido como uma molécula genetica- mente construída que contém a região variável da cadeia leve, a região variável da cadeia pesada, ligada por um Iigador de polipeptídeo apropriado como uma molécula de cadeia única geneticamente fundida.

Os métodos de fazer esses fragmentos são conhecidos na técnica (vide, pro exem- plo, Harlow e Lane, Antibodies: A Laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Nova York, 1988). Em vários exemplos, a região variável inclui a região variável da cadeia leve e a região variável da cadeia pesada expressa como polipeptídeos individuais. Anticorpos Fv 25 são tipicamente aproximadamente 25 kDa e contêm um sítio de ligação de antígeno comple- to com três CDRs por cada cadeia pesada e cada cadeia leve. Para produzir esses anticor- pos, Vh e Vl podem ser expressos a partir de duas construções de ácido nucléico individuais em uma célula hospedeira. Se Vh e Vl forem expressos de forma não contígua, as cadeias do anticorpo Fv são tipicamente retidas juntas por interações não covalentes. Entretanto, 30 essas cadeias tendem a dissociar após diluição, desse modo métodos foram desenvolvidos para reticular as cadeias através de glutaraldeído, dissulfetos intermoleculares ou um Iigador de peptídeo. Desse modo, em um exemplo, o Fv pode ser um Fv estabilizado por dissulfeto (dsFv), onde a região variável de cadeia pesada e a região variável de cadeia leve são qui- micamente ligadas por ligações de dissulfeto.

Em um exemplo adicional, os fragmentos Fv compreendem cadeias Ch e Vl conec-

tadas por um Iigador de peptídeo. Essas proteínas de ligação de antígeno de cadeia única (scFv) são preparadas por construção de um gene estrutural que compreende seqüências de DNA codificando os domínios Vh e Vl conectados por um oligonucleotídeo. O gene estru- tural é inserido em um vetor de expressão, que é subseqüentemente introduzido em uma célula hospedeira como E.coli. As células hospedeiras recombinantes sintetizam uma única cadeia de polipeptídeo com um peptídeo Iigador unindo os dois domínios V. Os métodos 5 para produzir scFvs são conhecidos na técnica (vide Whitlow e outros., Methods: a Compa- nion to Methods in Enzymology, Vol. 2, página 97, 1991; Bird e outros, Science 242:423, 1988; patente US No. 4.946.778; Pack e outros, Bio/Technology 11:1271, 1993; e Sandhu, supra).

Fragmentos de anticorpo podem ser preparados por hidrólise proteolítica do anticor- po ou por expressão em E.coli de DNA que codifica o fragmento. Fragmentos de anticorpo podem ser obtidos por digestão de papaína ou pepsina de anticorpos inteiros por métodos convencionais. Por exemplo, fragmentos de anticorpo podem ser produzidos por clivagem enzimática de anticorpos com pepsina para fornecer um fragmento 5S indicado F(ab’)2. Esse fragmento pode ser adicionalmente clivado utilizando um agente redutor de tiol, e opcional- mente um grupo de bloqueio para os grupos de sulfidrila resultando da clivagem de ligações de dissulfeto, para produzir fragmentos monovalentes Fab’ 3.5S. Alternativamente, uma cli- vagem enzimática utilizando pepsina produz dois fragmentos Fab’ monovalentes e um frag- mento Fc diretamente (vide a patente US número 4.036.945 e patente US número 4.331.647, e referências contidas nas mesmas; Nisonhoff e outros., Arch. Biochem. Bio- phys. 89:230, 1960; Porter, Biochem. J. 73:119, 1959; Edelman e outros, Methods in Enzy- moiogy, Vol. 1, página 422, Academic Press, 1967; e Coligan e outros nas seções 2.8.1- 2.8.10 e 2.10.1-2.10.4).

Outros métodos de clivar anticorpos, como separação de cadeias pesadas para for- mar fragmentos de cadeia pesada-leve monovalentes, clivagem adicional de fragmentos, ou outras técnicas enzimáticas, química ou genética também podem ser utilizados, desde que os fragmentos se liguem ao antígeno que é reconhecido pelo anticorpo intacto.

Uma pessoa versada perceberá que variantes conservativos dos anticorpos podem ser produzidos. Tais variantes conservativos empregados em fragmentos de anticorpo, co- mo fragmentos dsFv ou em fragmentos scFv, reterão resíduos de aminoácido críticos ne- 30 cessários para dobra e estabilização corretos entre as regiões Vh e VL, e reterão as caracte- rísticas de carga dos resíduos para preservar o pl baixo e baixa toxicidade das moléculas. Substituições de aminoácidos (como no máximo um, no máximo dois, no máximo três, no máximo quatro, ou no máximo cinco substituições de aminoácidos) podem ser feitas nas regiões Vh e Vl para aumentar rendimento. Tabelas de substituição de aminoácido conser- 35 vativas que fornecem aminoácidos funcionalmente similares são bem conhecidas por uma pessoa com conhecimentos comuns na técnica. Os seis grupos a seguir são exemplos de aminoácidos que são considerados como sendo substituições conservativas entre si: 1) Alanina (A)1 Serina (S)1 Treonina (T);

2) ácido aspártico (D)1 ácido glutâmico (E);

3) Asparagina (N)1 Glutamina (Q);

4) Arginina (R)1 Lisina (K);

5 5) Isoleucina (I), Leucina (L), Metionina (M)1 Valina (V); e 6) Fenil alanina (F)1 Tirosina (Y)1 Triptofano (W).

Desse modo, uma pessoa versada na técnica pode prontamente examinar a seqüência de aminoácidos de um anticorpo de interesse, localizar um ou mais dos aminoácidos na breve tabela acima, identificar uma substituição conservativa e produzir a variante conservativa utilizando técnicas moleculares bem conhecidas.

Moléculas efetoras, como frações terapêutica, de diagnóstico ou detecção podem ser ligadas a um anticorpo que liga especificamente PD-1, PD-L1 ou PD-L2, utilizando qual- quer número de meios conhecidos por aqueles versados na técnica. Meios de fixação tanto covalente como não covalente podem ser utilizados. O procedimento para fixar uma molécu- 15 Ia efetora a um anticorpo varia de acordo com a estrutura química do efetor. Polipeptídeos contêm, tipicamente, uma variedade de grupos funcionais; como grupos de ácido carboxílico (COOH), amina livre (-NH2) ou sulfidrila (-SH), que são disponíveis para reação com um grupo funcional apropriado em um anticorpo para resultar na ligação da molécula efetora. Alternativamente, o anticorpo é derivado para expor ou fixar grupos funcionais reativos adi- 20 cionais. A derivação pode envolver fixação de qualquer de um número de moléculas Iigado- ras como aquelas disponíveis da Pierce Chemical Company, Rockford, IL. O Iigador pode ser qualquer molécula utilizada para unir o anticorpo à molécula efetora. O Iigador é capaz de formar ligações covalentes tanto ao anticorpo como à molécula efetora. Ligadores apro- priados são bem conhecidos por aqueles versados na técnica e incluem, porém não são 25 limitados a, Iigadores de carbono de cadeia reta ou ramificada, Iigadores de carbono hetero- cíclico, ou Iigadores de peptídeo. Onde o anticorpo e a molécula efetora são polipeptídeos, os Iigadores podem ser unidos aos aminoácidos constituintes através de seus grupos late- rais (como através de uma ligação de dissulfeto a cisteína) ou aos grupos carboxila e amino de carbono alfa dos aminoácidos terminais.

Seqüências de ácido nucléico que codificam os anticorpos podem ser preparadas

por qualquer método apropriado incluindo, por exemplo, clonagem de seqüências apropria- das ou por síntese química direta por métodos como método de fosfotriéster de Narang e outros, Meth. Enzymol. 68:90-99, 1979; o método de fosfodiéster de Brown e outros, Meth. EnzymoL 68:109-151, 1979; o método de dietil fosforamidita de Beaucage e outros, Tetra. 35 Lett. 22:1859-1862, 1981; o método de fosforamidita triéster de fase sólida descrito por Be- aucage & Caruthers, Tetra. Letts. 22(20): 1859-1862, 1981, por exemplo, utilizando um sinte- tizador automatizado como descrito, por exemplo, em Needham-VanDevanter e outros, Nu- Cl. Acids Res. 12:6159-6168, 1984; e o método de suporte sólido da patente US número 4.458.066. A síntese química produz um oligonucleotídeo de fita única. Esse pode ser con- vertido em DNA de fita dupla por hibridização com uma seqüência complementar, ou por polimerização com um polimerase de DNA utilizando a fita única como gabarito. Uma pes- soa versada na técnica reconheceria que embora síntese química de DNA seja generica- mente limitada a seqüências de aproximadamente 100 bases, seqüências mais longas po- dem ser obtidas pela ligação de seqüências mais curtas.

Ácidos nucléicos exemplares que codificam seqüências que codificam um anticorpo que liga especificamente PD-1, PD-L1 ou PD-L2 podem ser preparados por técnicas de clo- nagem. Os exemplos de técnicas de sequenciamento e clonagem apropriadas, e instruções suficientes para orientar as pessoas versadas através de muitos exercícios de clonagem são encontrados em Sambrook e outros., supra, Berger e Kimmel (eds.), supra, e Ausubel, su- pra. Informações de produtos a partir de fabricantes de reagentes biológicos e equipamento experimental também fornecem informações úteis. Tais fabricantes incluem SIGMA Chemi- cal Company (Saint Louis, MO), R&D Systems (Minneapolis, MN), Pharmacia Amersham (Piscataway, NJ), CLONTECH Laboratories, Inc. (Paio Alto, CA), Chem Genes Corp., Aldri- ch Chemical Company (Milwaukee, Wl), Glen Research, Inc., GIBCO BRL Life Technologi- es, Inc. (Gaithersburg, MD), Fluka Chemica-Biochemika Analytika (Fluka Chemie AG, Bu- chs, Suíça), Invitrogen (San Diego, CA), e Applied Biosystems (Foster City, CA), bem como outras fontes comerciais conhecidas por uma pessoa versada.

Ácidos nucléicos também podem ser preparados por métodos de amplificação. Mé- todos de amplificação incluem reação de cadeia de polimerase (PCR), reação de cadeia de Iigase (LCR), sistema de amplificação baseada em transcrição (TAS), sistema de replicação de seqüência independente (3SR). Uma ampla variedade de métodos de clonagem, células hospedeiras, e metodologias de amplificação in vitro são bem conhecidas por pessoas ver- sadas na técnica.

Em um exemplo, um anticorpo de uso é preparado por inserção do cDNA que codi- fica uma região variável a partir de um anticorpo que liga especificamente PD-1, PD-L1 ou PD-L2 em um vetor que compreende o cDNA codificando uma molécula efetora (EM). A inserção é feita de modo que a região variável e a EM sejam lidas em quadro de modo que um polipeptídeo contínuo é produzido. Desse modo, o polipeptídeo codificado contém uma região Fv funcional e uma região EM funcional. Em uma modalidade, cDNA codificando um marcador detectável (como uma enzima) é ligado a um scFv de modo que o marcador seja localizado na extremidade carboxila do scFv. Em outro exemplo, um marcador detectável é localizado na extremidade amino do scFv. Em um exemplo adicional, cDNA codificando um marcador detectável é ligado a uma região variável de cadeia pesada de um anticorpo que liga especificamente PD-1, PD-L1 ou PD-L2, de modo que o marcador seja localizado na extremidade carboxila da região variável de cadeia pesada. A região variável de cadeia pe- sada pode ser subsequentemente ligada a uma região variável de cadeia leve do anticorpo que liga especificamente PD-1, PD-L1 ou PD-L2 utilizando ligações de dissulfeto. Ainda em outro exemplo, cDNA codificando um marcador é ligado a uma região variável de cadeia 5 leve de um anticorpo que liga PD-1, PD-L1 ou PD-L2, de modo que o marcador é localizado na extremidade carboxila da região variável de cadeia leve. A região variável de cadeia leve pode ser subsequentemente ligada a uma região variável de cadeia pesada do anticorpo que especificamente liga PD-1, PD-L2 ou PD-L2 utilizando ligações de dissulfeto.

Após os ácidos nucléicos que codificam o anticorpo ou fragmento funcional do 10 mesmo serem isolados e clonados, a proteína pode ser expressa em uma célula construída de forma recombinante como bactérias, planta, levedura, células de insetos e mamífero. Uma ou mais seqüências de DNA que codificam o anticorpo ou fragmento funcional do mesmo podem ser expressas in vitro por transferência de DNA em uma célula hospedeira apropriada. A célula pode ser procariótica ou eucariótica. O termo também inclui qualquer 15 progênie da célula hospedeira de sujeito. Entende-se que toda progênie pode não ser idên- tica à célula parental uma vez que pode haver mutações que ocorrem durante replicação. Os métodos de transferência estável, significando que o DNA estranho é continuamente mantido no hospedeiro, são conhecidos na técnica.

Seqüências de polinucleotídeo que codificam o anticorpo ou fragmento funcional do 20 mesmo podem ser ligadas operativamente a seqüências de controle de expressão. Uma seqüência de controle de expressão ligada operativamente a uma seqüência de codificação é ligada de tal modo que expressão da seqüência de codificação é obtida sob condições compatíveis com as seqüências de controle de expressão. As seqüências de controle de expressão incluem, porém não são limitadas a promotores apropriados, intensificadores, 25 terminadores de transcrição, um códon de partida (isto é, ATG) na frente de um gene que codifica proteína, sinal de junção para introns, manutenção do quadro de leitura correto da- quele gene para permitir tradução adequada de mRNA, e códons de parar.

As seqüências de polinucleotídeos que codificam o anticorpo ou fragmento funcio- nal do mesmo podem ser inseridas em um vetor de expressão que inclui, porém não é Iimi- 30 tado a um plasmídeo, vírus ou outro veículo que pode ser manipulado para permitir inserção ou incorporação de seqüências e pode ser expresso em procariotas ou eucariotas. Hospe- deiros podem incluir organismos microbianos, levedura, de inseto e mamífero. Os métodos de expressar seqüências de DNA tendo seqüências eucarióticas ou virais em procariotas são bem conhecidos na técnica. Vetores de DNA de plasmídeo e viral biologicamente fun- 35 cional capazes de expressão e replicação em um hospedeiro são conhecidos na técnica.

A transformação de uma célula hospedeira com DNA recombinante pode ser reali- zada por técnicas convencionais como bem conhecidas por aqueles versados na técnica. Onde o hospedeiro é procariótico, como E.coli, células competentes que são capazes de absorção de DNA podem ser preparadas de células colhidas após fase de crescimento ex- ponencial e subsequentemente tratadas pelo método CaCI2 utilizando procedimentos bem conhecidos na técnica. Alternativamente, MgCI2 ou RbCI pode ser utilizado. A transformação 5 pode ser também executada após formar um protoplasto da célula hospedeira se desejado, ou por eletroporação.

Quando o hospedeiro é um eucariota, tais métodos de transfecção de DNA como coprecipitados de fosfato de cálcio, procedimentos mecânicos convencionais como microin- jeção, eletroporação, inserção de um plasmídeo encerrado em lipossomas, ou vetores de 10 vírus podem ser utilizados. Células eucarióticas também podem ser co-transformadas com seqüências de polinucleotídeo que codificam o anticorpo de fragmento funcional do mesmo e uma segunda molécula de DNA estranha que codifica um fenótipo selecionável, como o gene de timidina cinase de herpes simplex. Outro método é utilizar um vetor viral eucarióti- co, como vírus de símio 40 (SV40) ou vírus de papiloma bovino, para infectar de forma tran- 15 siente ou transformar células eucarióticas e expressar a proteína (vide, por exemplo, Eukar- yotic viral vectors, Cold Spring Harbor Laboratory, Gluzman ed., 1982). Uma pessoa versada na técnica pode prontamente utilizar sistemas de expressão como plasmídeos e vetores de uso na produção de proteínas em células incluindo células eucarióticas mais elevadas como COS, CHO, HeLa e linhagens de células de mieloma.

O isolamento e purificação de polipeptídeo expresso de forma recombinante podem

ser realizados por meios convencionais incluindo separações imunológicas e cromatografia preparativa. Após expressão, os anticorpos recombinantes podem ser purificados de acordo com procedimentos padrão da técnica, incluindo precipitação de sulfato de amônio, colunas de afinidade, cromatografia de coluna, e similar (vide, genericamente, R. Scopes, Proteing 25 Purification, Springer-Verlag, N.Y., 1982). Composições substancialmente puras de pelo menos aproximadamente 90 a 95% de homogeneidade são reveladas aqui, e 98 a 99% ou mais de homogeneidade podem ser utilizados para fins farmacêuticos. Após purificação, parcialmente ou até homogeneidade como desejado, se for para ser utilizado de forma tera- pêutica, os polipeptídeos devem ser substancialmente isentos de endotoxina.

Os métodos para expressão de anticorpos de cadeia única e/ou redobrar em uma

forma ativa apropriada, incluindo anticorpos de cadeia única, a partir de bactérias como E. coli foram descritos e são bem conhecidos e são aplicáveis aos anticorpos revelados aqui. Vide Buchner e outros, Anal. Biochem. 205:263-270, 1992; Pluckthun, Biotechnology 9:545, 1991; Huse e outros, Science 246: 1275, 1989 e Ward e outros, Nature 341:544, 1989, to- dos incorporados a título de referência aqui.

Frequentemente, proteínas heterólogas funcionais de E. coli ou outras bactérias são isoladas de corpos de inclusão e exigem solubilização utilizando agentes de desnatura for- tes e redobra subsequente. Durante a etapa de solubilização, como é bem sabido na técni- ca, um agente de redução deve estar presente para separar ligações de dissulfeto. Um tam- pão exemplar com um agente de redução é: 0.1 M Tris pH 8, 6 M guanidina, 2 mM EDTA1 0.3 M DTE (ditioeritritol). A reoxidação das ligações de dissulfeto pode ocorrer na presença 5 de reagentes de tiol com baixo peso molecular em forma reduzida e oxidada, como descrito em Saxena e outros, Biochemistry 9: 5015-5021, 1970, incorporada a título de referência aqui, e especialmente como descrito por Buchner e outros, supra.

A renaturação é tipicamente realizada por diluição (por exemplo, 100 vezes) da pro- teína desnaturada e reduzida em tampão de redobrar. Um tampão exemplar é 0.1 M Tris,

pH 8,0, 0.5 M L-arginina, 8 mM de glutationa oxidada (GSSG) e 2 mM EDTA.

Como modificação no protocolo de purificação de anticorpo de duas cadeias, as re- giões de cadeia pesada e leve são separadamente solubilizadas e reduzidas e então combi- nadas na solução de redobrar. Um rendimento exemplar é obtido quando essas duas prote- ínas são misturadas em uma razão molar de tal modo que um excesso molar de 5 vezes de 15 uma proteína em relação à outra não é excedido. É desejável adicionar glutationa oxidada em excesso ou outros compostos de oxidação com baixo peso molecular à solução de re- dobrar após conclusão de redox-shuffling.

Além dos métodos recombinantes, os anticorpos e fragmentos funcionais dos mes- mos que são revelados aqui também podem ser construídos totalmente ou em parte utili- zando síntese de peptídeo padrão. A síntese de fase sólida dos polipeptídeos com menos de aproximadamente 50 aminoácidos em comprimento pode ser realizada por fixar o amino- ácido terminal-C da seqüência a um suporte insolúvel seguido por adição seqüencial dos aminoácidos restantes na seqüência. Técnicas para síntese de fase sólida são descritas por Barany & Merrifield, The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology. Vol. 2: Special Methods in Peptide Synthesis, Parte A. pág. 3-284; Merrifield e outros, J. Am. Chem. Soc. 85:2149- 2156, 1963, e Stewart e outros., Solid Phase Peptide Synthesis, 2a ed., Pierce Chem. Co., Rockford, Ill., 1984. As proteínas de comprimento maior podem ser sintetizadas por con- densação das extremidades de carboxila e amino de fragmentos mais curtos. Os métodos de formar ligações de peptídeo por ativação de uma extremidade terminal de carboxila (co- mo pelo uso do reagente de acoplamento Ν,Ν’-dicicloexil carbodiimida) são bem conhecidos na técnica.

B. Ácidos nucléicos inibidores

Ácidos nucléicos inibidores que diminuem a expressão e/ou atividade de PD-1, PD- L1 ou PD-L2 também podem ser utilizados nos métodos revelados aqui. Uma modalidade é um RNA inibidor pequeno (siRNA) para interferência ou inibição de expressão de um gene alvo. seqüências de ácido nucléico que codificam PD-1, PD-L1 e PD-L2 são reveladas nos Números de acessão do GENBANK® NM_005018, AF344424, NP_079515 e NP_054862. Genericamente, siRNAs são gerados pela clivagem de moléculas de RNA de fita du- pla, relativamente longas por enzimas DCL ou Dicer (Zamore, Science, 296:1265-1269, 2002; Bernstein e outros., Nature, 409:363-366, 2001). Em animais e plantas, siRNAs são montados em RISC e guiam a atividade ribonucleolítica específica de seqüência de RISC, 5 desse modo resultando na clivagem de mRNAs ou outras moléculas alvo de RNA no cito- plasma. No núcleo, siRNAs também guiam histona associada a heterocromatina e metilação de DNA, resultando em silêncio de transcrição de genes individuais ou grandes domínios de cromatina. SiRNAs de PD-1 são comercialmente disponíveis, como da Santa Cruz Biotech- nology, Inc.

A presente revelação provê RNA apropriado para interferência ou inibição de ex-

pressão de um gene alvo, cujo RNA inclui RNA de fita dupla de aproximadamente 15 a a- proximadamente 40 nucleotídeos contendo uma projeção de 0 a 5 nucleotídeos 3’ e/ou 5’ em cada fita. A seqüência do RNA é substancialmente idêntica a uma porção de um mRNA ou transcrito de um gene alvo, como PD-1, PD-L1 ou PD-L2 para o qual se deseja interfe- 15 rência ou inibição de expressão. Para fins dessa revelação, uma seqüência do RNA “subs- tancialmente idêntica” a uma porção específica do mRNA ou transcrito do gene alvo para o qual interferência ou inibição de expressão é desejável difere em não mais do que aproxi- madamente 30 por cento, e em algumas modalidades não mais do que aproixmadamentelO por cento, a partir da porção específica do mRNA ou transcrito do gene alvo. Em modalida- 20 des específicas, a seqüência do RNA é exatamente idêntica a uma porção específica do mRNA ou transcrito do gene alvo.

Desse modo, siRNAs revelados aqui incluem RNA de fita dupla de aproximadamente 15 a aproximadamente 40 nucleotídeos em comprimento e uma projeção de 3’ ou 5’ tendo um comprimento de 0 a 5 nucleotídeos em cada fita, onde a seqüência do RNA de fita dupla 25 é substancialmente idêntico a (vide acima) uma porção de um mRNA ou transcrito de um ácido nucléico codificando PD-1, PD-L1 ou PD-L2. Em exemplos específicos, o RNA de fita dupla contém aproximadamente 19 a aproximadamente 25 nucleotídeos, por exemplo, 20, 21 ou 22 nucleotídeos substancialmente idênticos a um ácido nucléico que codifica PD-1, PD-L1 ou PD-L2. Em exemplos adicionais, o RNA de fita dupla contém aproximadamente 19 30 a aproximadamente 25 nucleotídeos 100% idênticos a um ácido nucléico codificando PD-1, PD-L1 ou PD-L2. Deve ser observado que nesse contexto “aproximadamente” se refere so- mente a quantidades inteiras. Em um exemplo, “aproximadamente” 20 nucleotídeos se refe- re a um nucleotídeo de 19 a 21 nucleotídeos em comprimento.

Com relação a uma projeção no RNA de fita dupla, o comprimento da projeção é in- dependente entre as duas fitas, em que o comprimento de uma projeção não depende do comprimento da projeção na outra fita. Em exemplos específicos, o comprimento da proje- ção 3’ ou 5’ é de O-nucleotídeo em pelo menos uma fita, e em alguns casos é O-nucleotídeo nas duas fitas (desse modo, um dsRNA cego). Em outros exemplos, o comprimento da pro- jeção 3’ ou 5’ é de 1-nucleotídeo a 5-nucleotídeos pelo menos em uma fita. Mais particular- mente, em alguns exemplos o comprimento da projeção 3’ ou 5’ é 2-nucleotídeos pelo me- nos em uma fita, ou 2-nucleotídeos nas duas fitas. Em exemplos específicos, a molécula de dsRNA tem projeções de 3’ de 2-nucleotídeos nas duas fitas.

Desse modo, em uma modalidade de RNA específica, fornecida, o RNA de fita dupla contém 20, 21 ou 22 nucleotídeos, e o comprimento da projeção 3’ é de 2 nucleotídeos nas duas fitas. Em modalidades dos RNAs fornecidos aqui, o RNA de fita dupla contém aproxi- madamente 40-60% de adenina+uracil (AU) e aproximadamente 60-40% de guani- 10 na+citosina (GC). Mais particularmente, em exemplos específicos o RNA de fita dupla con- tém aproximadamente 50% AU e aproximadamente 50% GC.

São também descritos aqui RNAs que incluem ainda pelo menos um ribonucleotídeo modificado, por exemplo na fita de sentido do RNA de fita dupla. Em exemplos específicos,

o ribonucleotídeo modificado está na projeção 3’ de pelo menos uma fita, ou mais particu- 15 Iarmente na projeção 3’ da fita de sentido. É particularmente considerado que exemplos de ribonucleotídeos modificados incluem ribonucleotídeos que incluem um rótulo detectável (por exemplo, um fluóroforo, como rodamina ou FITC), um análogo de nucleotídeo de tiofos- fato, um desoxinucleotídeo (considerado modificado porque a molécula de base é acido ri- bonucléico), um 2’-fluorouracil, um 2’-aminouracil, um 2’-aminocitidina, um 4-tiouracil, um 5- 20 bromouracil, um 5-iodouracil, um 5-(3-aminoalila)-uracila, um inosina, ou um análogo de nu- cleotídeo-2’0-Me.

Moléculas de ribozima e anti-sentido para PD-1, PD-L1 e PD-L2 são também de uso no método revelado aqui. Ácidos nucléicos de anti-sentido são moléculas de RNA ou DNA que são complementares a pelo menos uma porção de uma molécula de mRNA específica 25 (Weintraub, Scientific American 262:40, 1990). Na célula, os ácidos nucléicos de anti-sentido hibridizam com o mRNA correspondente, formando uma molécula de fita dupla. Os ácidos nucléicos de anti-sentido interferem na translação do mRNA, uma vez que a célula não tra- duzirá um mRNA que é de fita dupla. Oligômeros anti-sentido de aproximadamente 15 nu- cleotídeos são preferidos, uma vez que são facilmente sintetizados e são menos prováveis 30 de causar problemas do que moléculas maiores quando introduzidas na célula alvo que pro- duz PD-1, PD-L1 ou PD-L2. O uso de métodos anti-sentido para inibir tradução in vitro de genes é bem conhecido na técnica (vide, por exemplo, Marcus-Sakura, Anal. Biochem. 172: 289, 1988).

Um oligonucleotídeo anti-sentido pode ter, por exemplo, aproximadamente 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 ou 50 nucleotídeos em comprimento. Um ácido nucléico anti-sentido pode ser construído utilizando reações de síntese química e ligação enzimática utilizando procedimentos conhecidos na técnica. Por exemplo, uma molécula de ácido nucléico anti- sentido pode ser quimicamente sintetizada utilizando nucleotídeos de ocorrência natural ou nucleotídeos modificados de forma variada projetados para aumentar a estabilidade biológi- ca das moléculas ou aumentar a estabilidade física do duplex formado entre os ácidos nu- cléicos de anti-sentido e sentido, como derivados de fosforotioato e nucleotídeos substituí- 5 dos por acridina podem ser utilizados. Os exemplos de nucleotídeos modificados que podem ser utilizados para gerar o ácido nucléico anti-sentido incluem 5-fluorouracil, 5-bromouracil, 5-clorouracil, 5-iodouracil, hipoxantina, xantina, 4-acetil citosina, 5-(carboxi hidroxil metila) uracila, 5-carbóxi metil amino metíl-2-tiouridina-e, 5-carbóxi metil amino metil uracila, diidrou- racila, beta-D-galactosilqueosina, inosina entre outros.

O uso de um oligonucleotídeo para parar transcrição é conhecido como a estratégia

tripla uma vez que o Iaminador enrola em torno de DNA duplo-helicoidal, formando uma hé- lice de três fitas. Portanto, esses compostos triplos podem ser projetados para reconhecer um sítio exclusivo em um gene escolhido (Maher e outros, Antisense Res. And Dev. 1(3): 227, 1991; Helene, C., Anticancer Drug design 6(6): 569), 1991. Esse tipo de oligonucleotí- deo inibidor é também de uso nos métodos revelados aqui.

Ribozimas, que são moléculas de RNA possuindo a capacidade de clivar especifi- camente outro RNA de fita única em um modo análogo a endonucleases de restrição de DNA, são também de uso. Através da modificação de seqüências de nucleotídeo que codifi- cam esses RNAs, é possível construir moléculas que reconhecem seqüências de nucleotí- 20 deo específicas em uma molécula de RNA e clivar a mesma (Cech, J. Amer. Med. Assn. 260:3030, 1988). Uma principal vantagem dessa abordagem é que, devido a serem especí- ficas de seqüência, somente mRNAs com seqüências específicas são inativadas.

Há dois tipos básicos de ribozimas a saber, tipo tetrahymena (Hasselhoff, Nature 334:585, 1988) e tipo “cabeça de martelo”. Ribozimas do tipo tetrahymena reconhecem se- 25 quências que têm quatro bases em comprimento, enquanto ribozimas do tipo “cabeça de martelo” reconhecem seqüências base com 11-18 bases em comprimento. Quanto mais longa a seqüência de reconhecimento, maior a probabilidade de que a seqüência ocorrerá exclusivamente na espécie mRNA alvo. Conseqüentemente, ribozimas do tipo cabeça de martelo são preferíveis às ribozimas do tipo tetrahymena para inativar uma espécie de mR- 30 NA específica e seqüências de reconhecimento de 18 bases são preferíveis em relação a seqüências de reconhecimento mais curtas.

Vários sistemas de distribuição são conhecidos e podem ser utilizados para adminis- trar os siRNAs e outras moléculas de ácido nucléico inibidoras como agentes terapêuticos. Tais sistemas incluem, por exemplo, encapsulação em lipossomas, micropartículas, micro- 35 cápsulas, nanopartículas, células recombinantes capazes de expressar a(s) molécula(s) terapêutica(s) (vide, por exemplo, Wu e outros, J. Biol. Chem. 262, 4429, 1987), construção de um ácido nucléico terapêutico como parte de um retroviral ou outro vetor, e similar. C. Inibidores de molécula pequena

Antagonistas de PD-1 incluem moléculas que são identificadas a partir de bibliotecas grandes de extratos tanto de produto natural como sintético (ou semi-sintético) ou bibliote- cas químicas de acordo com métodos conhecidos na técnica. Os métodos de classificação 5 que detectam diminuições em atividade de PD-1 (como detecção de morte de células) são úteis para identificar compostos a partir de uma variedade de fontes para atividade. As clas- sificações iniciais podem ser executadas utilizando uma biblioteca diversa de compostos, uma variedade de outros compostos e bibliotecas de compostos. Desse modo, moléculas que ligam PD-1, PD-L1 ou PD-L2, moléculas que inibem a expressão de PD-1, PD-L1 e/ou 10 PD-L2, e moléculas que inibem a atividade de PD-1, PD-L1 e/ou PD-L2 podem ser identifi- cadas. Essas moléculas pequenas podem ser identificadas a partir de bibliotecas combina- tórias, bibliotecas de produto natural, ou outras bibliotecas de molécula pequena. Além dis- so, o antagonista de PD-1 pode ser identificado como compostos a partir de fontes comerci- ais, bem como análogos comercialmente disponíveis de inibidores identificadores.

A fonte precisa de extratos de teste ou compostos não é crítica para a identificação

de antagonistas de PD-1. Por conseguinte, antagonistas de PD-1 podem ser identificados virtualmente de qualquer número de compostos ou extratos químicos. Os exemplos de tais extratos ou compostos que podem ser antagonistas de PD-1 incluem, porém não são limita- dos a, extratos à base de plantas, fungos, procarióticos ou animais, caldos de fermentação e 20 compostos sintéticos, bem como modificação de compostos existentes. Inúmeros métodos são também disponíveis para gerar síntese aleatória ou dirigida (por exemplo, semi-síntese ou síntese total) de qualquer número de compostos químicos, incluindo, porém não limitado a compostos à base de sacarídeo, lipídeo, peptídeo e ácido nucléico. Bibliotecas de compos- to sintético são comercialmente disponíveis a partir de Brandon Associates (Merrimack, 25 N.H.) e Aldrich Chemical (Milwaukee, Wis.). Antagonistas de PD-1 podem ser identificados a partir de bibliotecas de compostos sintéticos que são comercialmente disponíveis a partir de diversas companhias incluindo Maybridge Chemical Co. (Trevillet, Cornwall, UK), Comgenex (Princeton, N. J.), Brandon Associates (Merrimack, N.H.) e Microsource (New Milford, Conn.). Antagonistas de PD-1 podem ser identificados a partir de uma biblioteca química 30 rara, como a biblioteca que é disponível a partir de Aldrich (Milwaukee, Wis.). Antagonistas de PD-1 podem ser identificados em bibliotecas de compostos naturais na forma de extratos bacterianos, de fungos, plantas e animais são comercialmente disponíveis a partir de diver- sas fontes, incluindo Biotics (Sussex, UK), Xenova (Slough, UK), Harbor Branch Oceangra- phics Institute (Ft. Pierce, Fia.) e PharmaMar, U.S.A. (Cambridge, Mass.). Compostos e bi- 35 bliotecas produzidas de forma natural e sintética são facilmente modificados através de mei- os químico, físico e bioquímico convencionais. Compostos úteis podem ser encontrados em inúmeras classes químicas, embora se- jam tipicamente compostos orgânicos, incluindo compostos orgânicos pequenos. Compostos orgânicos pequenos têm um peso molecular maior do que 50 ainda assim menor do que aproximadamente 2.500 daltons, como menos do que aproximadamente 750 ou menos do 5 que aproximadamente 350 daltons podem ser utilizados nos métodos revelados aqui. Clas- ses exemplares incluem heterociclos, peptídeos, sacarídeos, esteróides e similar. Os com- postos podem ser modificados para intensificar eficácia, estabilidade, compatibilidade farma- cêutica e similar. Em várias modalidades, os compostos de uso têm um Kd para PD-1, PD- L1 ou PD-L2 menor do que 1 mM, menor do que 10 nm, menor do que 1 μΜ, menor do que 10 10 μΜ, ou menor do que 1 mM.

D. Variantes de peptídeo PD-1 como antagonistas

Em uma modalidade, variantes de uma proteína de PD-1 que funcionam como um antagonista, podem ser identificados por classificação de bibliotecas combinatórias de mu- tantes, como mutantes de ponto ou mutantes de truncamento, de uma proteína de PD-1 pa- ra identificar proteínas com atividade antagonista. Em um exemplo, o antagonista é uma proteína de PD-I solúvel.

Desse modo, uma biblioteca de variantes PD-1 pode ser gerada por mutagênese combinatória no nível de ácido nucléico e é codificada por uma biblioteca de genes variega- dos. Uma biblioteca de variantes PD-1 pode ser produzida, por exemplo, por ligar enzimati- 20 camente uma mistura de oligonucleotídeos sintéticos em seqüências de gene de tal modo que um conjunto degenerado de seqüências de PD-1 em potencial é expressivo como poli- peptídeos individuais, ou alternativamente, como um conjunto de proteínas de fusão maiores (como para exibição de fagos) contendo o conjunto de seqüências de PD-1.

Há uma variedade de métodos que pode ser utilizada para produzir bibliotecas de va- 25 riantes de PD-1 em potencial a partir de uma seqüência de oligonucleotídeo degenerada. A síntese química de uma seqüência de gene degenerada pode ser executada em um sinteti- zador de DNA automático, e o gene sintético então ligado em um vetor de expressão apro- priada. O uso de um conjunto degenerado de genes permite a provisão, em uma mistura, de todas as seqüências que codificam o conjunto desejado de seqüências de antagonista de 30 PD-1 em potencial. Os métodos para sintetizar oligonucleotídeos degenerados são conheci- dos na técnica (vide, por exemplo, Narang e outros, Tetrahedron 39:3, 1983; Itakura e outros Annu. Rev. Biochem. 53:323, 1984; Itakura e outros Science 198: 1056, 1984).

Além disso, bibliotecas de fragmentos de uma seqüência de codificação de proteína de PD-1 podem ser utilizadas para gerar uma população de fragmentos de PD-1 para classi- ficação e seleção subsequente de variantes de um antagonista de PD-1. Em uma modalida- de, uma biblioteca de fragmentos de seqüência de codificação pode ser gerada por tratar um fragmento de PCR de fita dupla de uma seqüência de codificação de PD-1 com uma nuclea- se sob condições onde corte ocorre somente aproximadamente uma vez por molécula, des- naturando o RNA de fita dupla, naturando novamente o DNA para formar DNA de fita dupla que pode incluir pares de sentido/anti-sentido a partir de diferentes produtos cortados, remo- vendo porções de fita única a partir de duplex reformados por tratamento com S1 nuclear, e 5 ligando a biblioteca de fragmentos resultante em um vetor de expressão. Por esse método, uma biblioteca de expressão pode ser derivada que codifica fragmentos de terminal-N, ter- minal-C e internos de vários tamanhos de PD-1.

Várias técnicas são conhecidas na arte para classificar produtos de gene de bibliote- cas de combinação feitas por mutações de ponto ou truncamento, e para classificar bibliote- cas de cDNA para produtos de gene tendo uma propriedade selecionada. Tais técnicas são adaptáveis para classificação rápida das bibliotecas de gene geradas pela mutagênese combinatória de proteínas de PD-1. As técnicas mais amplamente utilizadas, que são sensí- veis à análise de rendimento direto, para classificar as bibliotecas de gene grandes incluem, tipicamente, clonagem da biblioteca de genes em vetores de expressão replicáveis, trans- formação de células apropriadas com a biblioteca de vetores resultante, e expressão dos genes combinatórios sob condições nas quais a detecção de uma atividade desejada facilita isolamento do vetor que codifica o gene cujo produto foi detectado. Mutagênese ensemble recursiva (REM) pode ser utilizada em combinação com os ensaios de classificação para identificar antagonistas de PD-1 (Arkin e Youvan, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89:7811 7815, 1992; Delagrave e outros, Protein Eng. 6(3):327 331, 1993).

Em uma modalidade, ensaios à base de células podem ser explorados para analisar uma biblioteca de variantes de PD-1. Por exemplo, uma biblioteca de vetores de expressão pode ser transfectada em uma linhagem de células que sintetiza, comumente e secreta PD- 1. As células transfectadas são então cultivadas de tal modo que PD-1 e uma variante de PD-1 específica são secretadas. O efeito de expressão do mutante sobre a atividade de PD-

1 em sobrenadantes de células pode ser detectado, como por qualquer de um ensaio fun- cional. DNA de plasmídeo pode ser então recuperado a partir das células onde a atividade endógena de PD-1 é inibida, e os clones individuais adicionalmente caracterizados.

Peptidomimética também pode ser utilizado como antagonistas de PD-1. Análogos 30 de peptídeo são comumente utilizados na indústria farmacêutica como drogas não peptídeo com propriedades análogas àquelas do peptídeo gabarito. Esses tipos de compostos não peptídeo são normalmente desenvolvidos com o auxílio de modelagem molecular computa- dorizada. Mimética de peptídeo que é estruturalmente similar a peptídeos terapeuticamente úteis pode ser utilizada para produzir um efeito terapêutico ou profilático equivalente. Gene- 35 ricamente, peptidomiméticas são estruturalmente similares a um polipeptídeo paradigma (por exemplo, polipeptídeo que tem uma atividade biológica de PD-1), porém tem uma ou mais ligações de peptídeo opcionalmente substituída por uma ligação -CH2NH--, --CH2S--, -- CH2--CH2--, --CH.=.CH-- (cis e trans), -COCH2-, -CH(OH)CH2-- e -CH2SO—. Essas liga- ções de peptídeo podem ser substituídas por métodos conhecidos na técnica (vide, por e- xemplo, Morley, Trends Pharm. Sei. pág. 463 468, 1980; Hudson e outros. Int. J. Pept. Prot. Res. 14:177 185, 1979; Spatola, Life Sei. 38:1243 1249, 1986; Holladay, e outros. Tetrahe- 5 dron Lett. 24:4401 4404, 1983). Miméticas de peptídeo podem ser obtidos economicamente, ser estáveis e podem ter meia-vida ou absorção aumentada. A rotulação de peptidomimética envolve normalmente fixação covalente de um ou mais rótulos, diretamente ou através de um espaçador (como por um grupo de amida) a posição(ões) não interferente(s) na pepti- domimética que são previstas por dados de atividade estrutura quantitativa e/ou modelagem 10 molecular. Tais posições não interferentes são genericamente posições que não formam contatos diretos com a(s) macromolécula(s) às quais a peptidomimética se liga para produzir o efeito terapêutico. Derivação de peptidomimética não deve interferir substancialmente com a atividade biológica ou farmacológica desejada da peptidomimética.

Uma proteína negativa dominante ou um ácido nucléico que codifica uma proteína 15 negativa dominante que interfere na atividade biológica de PD-1 (isto é, ligação de PD-1 a PD-L1, PD-L2 ou ambos) também pode ser utilizada nos métodos revelados aqui. Uma pro- teína negativa dominante é qualquer molécula de aminoácido tendo uma seqüência que tem pelo menos 50%, 70%, 80%, 90%, 95% ou mesmo 99% de identidade de seqüência para pelo menos 10, 20, 35, 50, 100 ou mais de 150 aminoácidos da proteína do tipo selvagem à 20 qual a proteína negativa dominante corresponde. Por exemplo, um PD-L1 negativo- dominante tem mutação de tal modo que liga PD-1 mais apertadamente do que PD-1 (tipo selvagem) nativo porém não ativa nenhuma sinalização celular através de PD-1.

A proteína negativa dominante pode ser administrada como um vetor de expressão. O vetor de expressão pode ser um vetor não viral ou um vetor viral (por exemplo, retrovírus, 25 vírus adeno-associado recombinante, ou um vetor adenoviral recombinante). Alternativa- mente, a proteína negativa dominante pode ser diretamente administrada como uma proteí- na recombinante sistemicamente ou à área infectada utilizando, por exemplo, técnicas de microinjeção.

Antagonistas de polipeptídeo podem ser produzidos em células hospedeiras proca- 30 riótica ou eucariótica por expressão de polinucleotídeos que codificam a seqüência de ami- noácido, freqüentemente como parte de um polipeptídeo maior (uma proteína de fusão, co- mo com ras ou uma enzima). Alternativamente, tais peptídeos podem ser sintetizados por métodos químicos. Os métodos para expressão de proteínas heterólogas em hospedeiros recombinantes, síntese química de polipeptídeos, e tradução in vitro são bem conhecidos na 35 técnica (vide Maniatis e outros. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1989), 2a Ed., Cold Spring Harbor, N.Y.; Berger e Kimmel, Methods in Enzymology, Volume 152, Guide to Mo- lecular Cloning Techniques (1987), Academic Press, Inc., San Diego, Calif.; Kaiser e outros, Science 243:187, 1989; Merrifield, Science 232:342, 1986; Kent, Annu. Rev. Biochem. 57:957, 1988).

Peptídeos podem ser produzidos, como por síntese química direta, e utilizados como antagonistas de uma interação PD-1 com um ligando. Peptídeos podem ser produzidos co- mo peptídeos modificados, com frações não peptídeo fixadas por ligação covalente à extre- midade-N e/ou extremidade-C. Em certas modalidades preferidas, a extremidade-carbóxi ou a extremidade-amino, ou ambos, são quimicamente modificadas. As modificações mais co- muns dos grupos de amino e carboxila terminais são acetilação e amidação, respectivamen- te. Modificações terminais-amino como acilação (por exemplo, acetilação) ou alquilação (por exemplo, metilação) e modificações terminais-carbóxi como amidação, bem como outras modificações terminais, incluindo ciclização, podem ser incorporadas em várias modalida- des. Certas modificações terminais-amino e/ou terminais carbóxi e/ou extensões de peptídeo para a seqüência de núcleo podem fornecer propriedades físicas, químicas, bioquímicas e farmacológicas vantajosas, como : estabilidade aumentada, potência aumentada e/ou eficá- cia, resistência a proteases de soro, propriedades farmacocinéticas desejáveis e outras.

Método de tratamento: administração de um antagonista de PD-1 a um sujeito

São fornecidos aqui métodos para tratar uma variedade de infecções e cânceres. Nesses métodos, a infecção ou câncer é tratado, evitado ou um sintoma é aliviado por admi- nistrar a um sujeito uma quantidade terapeuticamente eficaz de um antagonista de PD-1. O 20 sujeito pode ser qualquer mamífero como humano, um primata, camundongo, rato, cão, ga- to, vaca, cavalo e porco. Em vários exemplos, o sujeito é um primata, como um humano. Em exemplos adicionais, o sujeito é um sujeito murino, como um camundongo.

Em várias modalidades, o sujeito está em risco de desenvolver infecção. Um sujeito em risco de desenvolver infecção é um sujeito que não tem ainda a infecção, porém pode 25 ser infectado pelo agente infeccioso de interesse. Em exemplos adicionais, o sujeito tem uma infecção, como uma infecção persistente. Um sujeito com uma infecção persistente pode ser identificado por métodos padrão apropriados por uma pessoa versada na técnica, como um médico.

Em vários exemplos, o sujeito tem uma infecção persistente com uma bactéria, vírus, 30 fungo ou parasita. Genericamente, infecções persistentes, ao contrário de infecções agudas não são eficazmente eliminadas pela indução de uma resposta imune hospedeira. O agente infeccioso e a resposta imune atingem equilíbrio de tal modo que o sujeito infectado perma- nece infeccioso durante um período longo de tempo sem expressar necessariamente os sin- tomas. Infecções persistentes incluem por exemplo, infecções latentes, crônicas e lentas. 35 Infecções persistentes ocorrem com vírus como vírus de leucemia de célula-T humana, vírus de Epstein-Barr, citomegalovírus, vírus de herpes, vírus de varicela-zoster, sarampo, papo- vavírus, priônios, vírus de hepatite, adenovírus, parvovírus e vírus de papilomavírus. Em uma infecção crônica, o agente infeccioso pode ser detectado no corpo durante todo o tempo. Entretanto, os sinais e sintomas da doença podem estar presentes ou ausen- tes por um período prolongado de tempo. Os exemplos de infecção crônica incluem hepatite B (causada por vírus de hepatite B (HBV)) e hepatite C (causada por vírus de hepatite C 5 (HCV)) adenovírus, citomegalovírus, vírus de Epstein-Barr, vírus de herpes simplex 1, vírus de herpes simplex 2, vírus de herpes humano 6, vírus de varicela-zoster, vírus de hepatite B, vírus de hepatite D, vírus de papiloma, parvovírus B19, poliomavírus BK, poliomavírus JC, vírus de sarampo, vírus de rubéola, vírus de imunodeficiência humana (HIV), vírus de leu- cemia de célula T humana I, e vírus de leucemia de célula T humana II. Infecções persisten- 10 tes parasíticas podem se originar como resultado de infecção por Leishmania, Toxoplasma, Tripanossomo, Plasmódio, Esquistossomo e Encefalitozoon.

Em uma infecção latente, o agente infeccioso (como um vírus) está aparentemente inativo e dormente de tal modo que o sujeito sempre apresenta sinais ou sintomas. Em uma infecção viral latente, o vírus permanece em equilíbrio com o hospedeiro por períodos longos 15 de tempo antes dos sintomas aparecerem novamente; entretanto, os vírus efetivos não po- dem ser detectados até que a reativação da doença ocorra. Os exemplos de infecções laten- tes incluem infecções causadas por vírus de herpes simplex (HSV)-I (vesículas febris), HSV-2 (herpes genital) e vírus de varicela zoster VZV (catapora-herpes zoster).

Em uma infecção lenta, os agentes infecciosos aumentam gradualmente em número durante um período muito longo de tempo durante o qual nenhum sinal ou sintoma significa- tivo é observado. Os exemplos de infecções lentas incluem AIDS (causada por HIV-1 e HIV- 2), Ientivirus que causam tumores em animais e priônios.

Além disso, infecções persistentes se originam frequentemente como complicações tardias de infecções agudas. Por exemplo, panencefalite esclerosante subaguda (SSPE) pode ocorrer após uma infecção aguda de sarampo ou encefalite regressiva pode ocorrer como resultado de uma infecção de rubéola.

Em um exemplo não limitador, um sujeito pode ser diagnosticado como tendo uma infecção Clamidial persistente após a detecção de espécie de Clamídia em uma amostra biológica a partir desse indivíduo utilizando análise PCR. Mamíferos não necessitam ter sido 30 diagnosticados com uma infecção persistente a ser tratada de acordo com essa revelação. Agentes microbianos capazes de estabelecer uma infecção persistente incluem vírus (como vírus de papiloma, vírus de hepatite, vírus de imunodeficiência humana e vírus de herpes), bactérias (como Escherichia coli e Chlamydia spp.), parasitas, (como Leishmania spp., S- chistosoma spp., Trypanosoma spp., Toxoplasma spp.) e fungos.

Além do composto que reduz expressão ou atividade de PD-1, o sujeito sendo trata-

do também pode receber uma vacina. Em um exemplo, a vacina pode incluir um adjuvante. Em outro exemplo, a vacina pode incluir uma imunização de reforço iniciador. A vacina pode ser uma vacina exterminada por calor, uma vacina atenuada ou uma vacina de sub-unidade. Um sujeito já infectado com um patógeno pode ser tratado com uma vacina terapêutica, co- mo um antagonista de PD-1 e um antígeno. O sujeito pode ser assintomático, de modo que o tratamento evita o desenvolvimento de um sintoma. A vacina terapêutica também pode reduzir a gravidade de um ou mais sintomas existentes, ou reduzir a carga de patógeno.

Em vários exemplos de métodos de tratamento, administra-se ao sujeito uma quanti- dade terapeuticamente eficaz de um antagonista de PD-1 em combinação com um antígeno viral. Exemplos não limitadores de antígenos virais apropriados incluem: antígenos de influ- enza HA, NA, M, NP e NS; HIV p24, pol, gp41 e gp120; Metapneumovírus (hMNV) proteínas 10 FG; vírus de Hepatite C (HCV) proteínas E1, E2 e de núcleo; vírus da Dengue (DEN1-4) proteínas E1, E2 e de núcleo; Proteína L1 de Vírus de papiloma humano; vírus de Epstein Barr gp220/350 e peptídeo EBNA-3A; Citomegalovírus (CMV) glicoproteína gB, glicoproteína gH, pp65, IE1 (exon 4) e pp150; vírus de Varicela Zoster (VZV) peptídeo IE62 e epítopos de glicoproteína E; vírus de Herpes Simplex epítopos de glicoproteína D entre muitos outros. 15 Os polipeptídeos antigênicos podem corresponder a polipeptídeos de isolados virais animais ou humanos de ocorrência natural, ou podem ser construídos para incorporar uma ou mais substituições de aminoácidos em comparação com um isolado natural (patogênico ou não patogênico). Antígenos exemplares são listados abaixo:

Tabela 1: antígenos exemplares de interesse (antígenos alvo)

Antígenos virais Seqüências de antígenos exemplares a SEQ ID partir de antígenos de interesse NO: BK TLYKKM EQ DVKVAH Q 13 GNLPLMRKA YLRKCK 14 TFSRM KYNICMGKCI 15 JC SITEVECFL 16 Epstein-Barr (EBV) QPRAPIRPI 17 citomegalovírus (CMV) NLVPMVATV 18 HPV YMLDLQPET(T) 19 Influenza A GILGFVFTL 20 Antígeno fúngico Blastomyces dermatiti- CELDNSHEDYNWNLWFKWCSGHGR 47 dis TGHGKH FYDCDWDPSHGDYSWYLW 48 DPSHGDYSWYLWDYLCGNGHHPYD 49 DYLCGNGHHPYDCELDNSHEDYSW 50 DPYNCDWDPYHEKYDWDLWNKWCN 51 KYDWDLWNKWCNKDPYNCDWDPYH 52 Em modalidades adicionais, o sujeito tem um tumor. O método inclui administrar ao

sujeito uma quantidade terapeuticamente eficaz de um antagonista de PD-1, desse modo tratando o tumor. Em vários exemplos, uma quantidade terapeuticamente eficaz de um antí- geno de tumor, ou um nucleotídeo codificando o antígeno de tumor, também é administrado ao sujeito. O antagonista de PD-1 e o antígeno de tumor, ou nucleotídeo codificando o antí- geno de tumor, pode ser administrado simultânea ou seqüencialmente. A administração do antagonista de PD-1 resulta em uma diminuição em tamanho, prevalência ou potencial metastático de um tumor em um sujeito. A avaliação de câncer é feita utilizando protocolos clínicos padrão. A eficácia é determinada em associação a qual- quer método conhecido para diagnosticar ou tratar o tumor específico.

Tumores (também denominados “cânceres”) incluem tumores sólidos e leucemias.

Tumores exemplares incluem aqueles listados na tabela 2 (juntamente com antígenos de tumor conhecidos associados a esses cânceres).

Tabela 2: tumores exemplares e seus antígenos de tumor_

Tumor Antígenos de tumor Leucemia mielógena aguda tumor Wilms 1 (WT1), antígeno de melanoma preferencialmente expresso (PRAME)1 PR1, pro- teinase 3, elastase, catepsina G Leucemia mielógena crônica WT1, PRAME, PR1, proteinase 3, elastase, ca¬ tepsina G Síndrome mielodisplástica WT1, PRAME, PR1, proteinase 3, elastase, ca¬ tepsina G Leucemia linfoblástica aguda PRAME Leucemia linfocítica crônica Survivin Linfoma não Hodgkin Survivin Mieloma múltiplo New York esofágeo 1 (NY-EsoI) Melanoma maligno MAGE, MART, Tirosinase, PRAME, GP100 Câncer de mama WT1, herceptina Câncer de pulmão WT1 Câncer de próstata Antígeno específico de próstata (PSA) Câncer de cólon Antígeno carcinoembriônico (CEA) Carcinoma de célula renal Fator de crescimento de fibroblasto 5 (FGF-5) (RCC) Antígenos de tumor exemplares de interesse incluem aqueles listados abaixo na ta-

bela 3:

Tabela 3: antígenos e seus peptí¬ deos derivados PRAME LYVDSLFFL 21 WT1 RMFPNAPYL 22 Survivin ELTLGEFLKL 23 AFP GVALQTM KQ 24 ELF2M ETVSEQSNV 25 proteinase 3 e seu peptídeo PR1 VLQELNVTV 26 Elastase de neutrófilo VLQELNVTV 27 MAGE EADPTGHSY 28 MART AAGIGILTV 29 tirosinase RHRPLQEVYPEANAPIGHNRE 30 GP100 WNRQLYPEWTEAQRLD 31 NY-Eso-1 VLLKEFTVSG 32 Herceptin KIFGSLAFL 33 Antígeno carcinoembriônico (CEA) HLFGYSWYK 34 PSA FLTPKKLQCV 35 Exemplos não limitadores específicos são Iinfoma angioimunoblástico ou Iinfoma Hodgkin predominante em linfócitos nodulares. Linfoma angioimunoblástico (AIL) é um tipo agressivo (que avança rapidamente) de Iinfoma não Hodgkin de célula T marcado por Iinfo- nodos aumentados e hipergamaglobulinemia (anticorpos aumentados no sangue). Outros sintomas podem incluem exantema na pele, febre, perda de peso, teste positivo de Coomb ou suores noturnos. Essa malignidade ocorre normalmente em adultos. Pacientes são nor- 5 malmente de 40-90 anos (média em torno de 65) e são mais frequentemente do sexo mas- culino. À medida que AIL avança, hepatosplenomegalia, anemia hemolítica e hipergamaglo- bulinemia policlonal podem desenvolver. A pele está envolvida em aproximadamente 40- 50% dos pacientes.

Linfoma Hodgkin predominante em linfócitos nodulares é um neoplasma de célula B 10 que parece ser derivado de células B de centro germinal com genes de imunoglobulina não funcionais, mudados. Similar à Iinfoma angioimunoblástico, células neoplásicas são associ- adas a uma rede de células dendríticas foliculares. A expressão de PD-1 é vista em células T estreitamente associadas a célula CD20+ neoplástica em Iinfoma Hodgkin predominante em linfócitos nodulares, em um padrão similar àquele visto para células T CD57+. CD57 foi 15 identificado como outro marcador de células T associadas ao centro germinal, juntamente com CXCR5, descobertas que apóiam a conclusão de que as células neoplásicas em Iinfo- ma Hodgkin predominante em linfócitos nodulares têm uma estreita associação com células T associadas ao centro germinal.

A expressão de um antígeno de tumor de interesse pode ser determinada no nível de 20 ácido nucléico ou proteína utilizando qualquer método conhecido na arte. Por exemplo, aná- lise de hibridização Northern utilizando sondas que reconhecem especificamente uma ou mais dessas seqüências pode ser utilizada para determinar expressão de gene. Alternati- vamente, a expressão é medida utilizando ensaios de PCR baseados em transcrição inver- sa, como utilizando iniciadores específicos para a seqüência de genes diferencialmente ex- 25 pressa. A expressão também é determinada no nível de proteína, como por medir os níveis de peptídeos codificados pelos produtos de gene descritos aqui, ou atividades dos mesmos. Tais métodos são bem conhecidos na técnica e incluem, por exemplo, imunoensaios basea- dos em anticorpos para proteínas codificadas pelos genes, qualquer material biológico pode ser utilizado para a detecção/quantificação da proteína ou atividade.

Em um exemplo, o sujeito foi anteriormente diagnosticado como tendo câncer. Em

exemplos adicionais, o sujeito se submeteu a tratamento anterior para o câncer. Entretanto, em alguns exemplos, o sujeito não foi previamente diagnosticado como tendo câncer. O diagnóstico de um tumor sólido pode ser feito através da identificação de uma massa em um exame, embora possa ser também através de outro meio como um diagnóstico radiológico, 35 ou ultra-som. O tratamento de câncer pode incluir cirurgia, ou pode incluir o uso de agentes quimioterapêuticos como docetaxel, vinorelbina gemcitabina, capecitabina ou combinações de ciclofosfamida, metotrexato e fluorouracil; ciclofosfamida, doxorubicin, e fluorouracil; do- xorubicin e ciclofosfamida; doxorubicin e ciclofosfamida com paclitaxel; doxorubicin seguido por CMF (ciclofosfamida, epirubicin e fluorouracil). Além disso, o tratamento pode incluir o uso de radiação.

Em vários exemplos, uma quantidade terapeuticamente eficaz de um antagonista de 5 PD-1 é administrada ao sujeito. Uma quantidade terapeuticamente eficaz de um antígeno de tumor, ou um ácido nucléico codificando o antígeno, também é administrada ao sujeito. A administração pode ser simultânea ou pode ser seqüencial.

Para o tratamento de um sujeito com um infecção persistente ou um tumor, uma quantidade terapeuticamente eficaz de um antagonista de PD-1 é administrada ao sujeito de interesse. Em um exemplo, uma quantidade terapeuticamente eficaz de um antagonista de PD-1 é uma dose biologicamente ativa, como uma dose que induzirá um aumento em ativi- dade citotóxica de célula T CD8+ do aumento na resposta imune específica ao agente infec- cioso. De forma desejável, o antagonista de PD-1 tem a capacidade de reduzir a expressão ou atividade de PD-1 em células imunes específicas de antígeno (por exemplo, células T como células T CD8+) em pelo menos 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, ou mais de 100% abaixo de níveis de controle não tratados. Os níveis ou atividade de PD-1 em células imunes são medidos por qualquer método conhecido na técnica, incluindo por exemplo, análise de Western Blot, imunoistoquímica, ELISA e análise de Northern Blot. Alternativamente, a atividade biológica de PD-1 é medida por avaliar a ligação de PD-1 a PD-L1, PD-L2 ou ambos. A atividade biológica de PD-1 é determinada de acordo com sua capacidade de aumentar citotoxicidade de célula T CD8+ incluindo, por exemplo, produção de citocina, eliminação do agente infeccioso, e proliferação de células T CD8+ específicas de antígeno. Preferivelmente, o agente que reduz a expressão ou atividade de PD-1 pode aumentar a resposta imune específica ao agente infeccioso ou tumor em pelo menos 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou mais de 100% acima de níveis de controle não tratados. O agente da presente invenção é portanto qualquer agente tendo qualquer uma ou mais dessas atividades. Embora o agente seja preferivelmente expresso em células T CD8+, entende-se que qualquer célula que possa influenciar a resposta imune a infecções persistentes também é sensível aos métodos da invenção e incluem, por exem- pio, células B.

Opcionalmente, o sujeito recebe um ou mais agentes terapêuticos adicionais. Agen- tes terapêuticos adicionais incluem, por exemplo, compostos antivirais (por exemplo, vida- rabina, aciclovir, ganciclovir, valganciclovir, inibidor de transcriptase reversa de análogo de nucleosídeo (NRTI) (por exemplo, AZT (Zidovudina), ddl (Didanosina), ddC (Zalcitabina), 35 d4T (Stavudina), ou 3TC (Lamivudina)), inibidor de transcriptase reversa não nucleosídeo (NNRTI) (por exemplo, nevirapina ou delavirdina), inibidor de protease (saquinavir, ritonavir, indinavir, ou nelfinavir), ribavirin, ou interferon), compostos antibacterianos, compostos anti- fúngicos, compostos antiparasitas, compostos antiinflamatórios, agente anti-neoplásicos (quimioterapêuticos) ou analgésicos.

O agente terapêutico adicional é administrado antes de, concomitantemente, ou sub- sequente à administração do antagonista de PD-1. Por exemplo, o antagonista de PD-1 e o 5 agente adicional são administrados em formulações separadas em pelo menos 1, 2, 4, 6, 10, 12, 18 ou mais de 24 horas de separação. Opcionalmente, o agente adicional é formula- do juntamente com o antagonista de PD-1. Quando o agente adicional está presente em uma composição diferente, vias de administração diferentes podem ser utilizadas. O agente é administrado em doses conhecidas como sendo eficazes para tal agente para tratar, redu- 10 zir ou evitar uma infecção.

Concentrações do antagonista de PD-1 e agente adicional dependem de diferentes fatores, incluindo meio de administração, sítio alvo, estado fisiológico do mamífero e outra medicação administrada. Desse modo, as dosagens de tratamento podem ser tituladas para otimizar segurança e eficácia e está compreendido nos conhecimentos de um técnico. A 15 determinação da dosagem adequada e regime de administração para uma situação especí- fica está compreendida nos conhecimentos da arte.

Opcionalmente, administra-se adicionalmente ao sujeito uma vacina que elicia uma resposta imune protetora contra o agente infeccioso que causa uma infecção persistente. Por exemplo, o sujeito recebe uma vacina que elicia uma resposta imune contra vírus de 20 imunodeficiência humana (HIV), tuberculose, influenza ou hepatite C. Vacinas exemplares são descritas, por exemplo, em Berzofsky e outros (J. Clin. Invest. 114:456-462, 2004). Se desejado, a vacina é administrada com uma injeção de reforço iniciador ou com adjuvantes. A vacina também pode ser uma vacina para tumor, como uma quantidade terapeuticamente eficaz de um antígeno de tumor. Em várias modalidades, uma quantidade terapeuticamente 25 eficaz de um polipeptídeo antigênico, como um antígeno viral ou de tumor, é administrada ao sujeito.

Uma quantidade terapeuticamente eficaz do antígeno de tumor, ou um ácido nucléi- co que codifica o antígeno de tumor pode ser administrado ao sujeito. Os polinucleotídeos incluem um DNA recombinante que é incorporado em um vetor em um plasmídeo de repli- 30 cação autônoma ou vírus ou no DNA genômico de um procariota ou eucariota, ou que existe como uma molécula separada (como um cDNA) independente de outras seqüências. Os nucleotídeos são ribonucleotídeos, desoxirribonucleotídeos ou formas modificadas de qual- quer nucleotídeo. O termo inclui formas única e dupla de DNA.

Um número de vetores virais foi construído, incluindo polioma, isto é, SV40 (Madzak e outros, 1992, J. Gen. Virol., 73:15331536), adenovírus (Berkner, 1992, Cur. Top. Microbiol. Immunol., 158:39-6; Berlinere outros, 1988, Bio Techniques, 6:616-629; Gorziglia e outros, 1992, J. Virol., 66:4407-4412; Quantin e outros, 1992, Proc. Nad. Acad. Sei. USA, 89:2581- 2584; Rosenfeld e outros, 1992, Cell, 68:143-155; Wilkinson e outros, 1992, Nucl. Acids Res., 20:2233-2239; Stratford-Perricaudet e outros, 1990, Hum. Gene Ther., 1:241-256), vírus de vacínia (Mackett e outros, 1992, Biotechnology, 24:495-499), vírus adeno-associado (Muzyczka, 1992, Curr. Top. Microbiol. Immunol., 158:91-123; On e outros, 1990, Gene, 5 89:279-282), vírus de herpes incluindo HSV e EBV (Margolskee, 1992, Curr. Top. Microbiol. Immunol., 158:67-90; Johnson e outros, 1992, J. Virol., 66:29522965; Fink e outros, 1992, Hum. Gene Ther. 3:11-19; Breakfield e outros, 1987, Mol. Neurobiol., 1:337-371; Fresse e outros, 1990, Biochem. Pharmacol., 40:2189-2199), vírus Sindbis (H. Herweijer e outros, 1995, Human Gene Therapy 6:1161-1167; patente US Nos. 5.091.309 e 5.2217.879), vírus 10 alfa (S. Schlesinger, 1993, Trends Biotechnol. 11:18-22; I. Frolov e outros, 1996, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 93:11371-11377) e retrovírus de ave (Brandyopadhyay e outros, 1984, Mol. Cell Biol., 4:749-754; Petropouplos e outros, 1992, J. Virol., 66:3391-3397), murino (Miller, 1992, Curr. Top. Microbiol. Immunol., 158:1-24; Miller e outros, 1985, Mol. Cell Biol., 5:431- 437; Sorge e outros, 1984, Mol. Cell Biol., 4:1730-1737; Mann e outros, 1985, J. Virol., 15 54:401-407), e origem humana (Page e outros, 1990, J. Virol., 64:5370-5276; Buchschalcher e outros, 1992, J. Virol., 66:2731-2739). Vetores de baculovírus (vírus de poliedrose multinuclear Autographa californica; AeMNPV) são também conhecidos na técnica, e podem ser obtidos a partir de fontes comerciais (como PharMingen, San Diego, Calif.; Protein Sciences Corp., Meriden, Conn.; Stratagene, La Jolla, Calif.).

Em uma modalidade, o polinucleotídeo que codifica um antígeno de tumor ou um an-

tígeno viral é incluído em um vetor viral. Vetores apropriados incluem vetores de retrovírus, vetores de orthopox, vetores de avipox, vetores de epitelioma contagioso, vetores de varíola de suíno, vetores de varíola de cabra, vetores adenovirais, vetores de vírus de herpes, veto- res de vírus alfa, vetores de baculovírus, vetores de vírus Sindbi, vetores de vírus de vacínia 25 e vetores de poliovírus. Vetores exemplares específicos são vetores de poxvirus como vírus de vacínia, vírus de epitelioma contagioso e um vírus de vacínia altamente atenuado (MVA), adenovírus, baculovírus e similar.

Vírus de pox de uso incluem orthopox, varíola de suino, avipox e vírus de varíola de cabra. Orthopox inclui vacínia, ectromelia e varíola de guaxinim. Um exemplo de um ortho- 30 pox de uso é vacínia. Avipox inclui epitelioma contagioso, varíola dos canários e varíola dos pombos. Varíola de cabra inclui pox de cabra e pox de carneiro. Em um exemplo, a varíola de suíno é pox de suíno. Os exemplos de vetores virais de pox para expressão como dese- jado por exemplo, na patente US número 6.165.460, que é incorporado aqui a título de refe- rência. Outros vetores virais que podem ser utilizados incluem outros vírus de DNA como 35 vírus de herpes de adenovírus, e vírus de RNA como retrovírus e pólio.

Em várias modalidades, antagonistas de PD-1 são administrados em uma quantida- de suficiente para aumentar citotoxicidade de célula T, como célula T CD8+. Um aumento em citotoxicidade de célula T resulta em uma resposta imune aumentada e uma redução na infecção persistente, ou uma redução em um sinal ou um sintoma de um tumor. Uma res- posta imune aumentada pode ser medida, por exemplo, por um aumento em proliferação de célula imune, como proliferação de célula T ou célula B, um aumento em produção de cito- 5 cina, e um aumento na eliminação de um agente infeccioso ou uma redução em carga de tumor. Desse modo, o método pode resultar em alívio de um ou mais dos sintomas associa- dos a tumor ou infecção persistente. Desse modo, a administração do antagonista de PD-1 reduz a infecção persistente, inibe o crescimento/tamanho de um tumor, ou alivia um ou mais sintomas associados à infecção persistente ou tumor em pelo menos 10%, 20%, 30%, 10 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou 100% em comparação com um sujeito não tratado.

O tratamento é eficaz se o tratamento levar a benefício clínico como uma redução da carga do agente infeccioso ou uma redução de carga de tumor no sujeito. Quando tratamen- to é aplicado de forma profilática, “eficaz” significa que o tratamento retarda ou evita forma- ção de uma infecção. Eficácia pode ser determinada utilizando qualquer método conhecido para diagnosticar ou tratar o tumor ou infecção específica.

Desse modo, os métodos incluem administrar a um sujeito uma composição farma- cêutica que inclui uma quantidade terapeuticamente eficaz de um antagonista de PD-1. Uma quantidade eficaz de um composto terapêutico, como um anticorpo, pode ser por exemplo de aproximadamente 0,1 mg/kg a aproximadamente 150 mg/kg. Doses eficazes variam, co- 20 mo reconhecido por aqueles versados na técnica, dependendo da via de administração, uso de excipiente, e co-administração com outros tratamentos terapêuticos incluindo uso de ou- tros agentes anti-infecção ou agentes terapêuticos para tratar, evitar ou aliviar um sintoma de uma infecção específica ou câncer. Um regime terapêutico é utilizado para um paciente humano que sofre de (ou em risco de desenvolver) uma infecção ou câncer, utilizando mé- 25 todos padrão.

O antagonista de PD-1 é administrado a um tal indivíduo utilizando métodos conhe- cidos na técnica. Qualquer antagonista de PD-1 pode ser utilizado, como aqueles revelados aqui. Além disso, mais de um antagonista de PD-1 pode ser utilizado. Um antagonista de PD-1 pode ser administrado localmente ou sistemicamente. Por exemplo, o antagonista de 30 PD-1 é administrado por via oral, retal, nasal, tópica, parenteral, subcutânea, intraperitoneal, intramuscular, e intravenosa. O antagonista de PD-1 pode ser administrado profilaticamente, ou após a detecção de uma infecção ou tumor. O antagonista de PD-1 é opcionalmente for- mulado como um componente de um coquetel de drogas terapêuticas para tratar infecção. Os exemplos de formulações apropriadas para administração parenteral incluem soluções 35 aquosas do agente ativo em uma solução salina isotônica, uma solução de glicose a 5%, ou outro excipiente farmaceuticamente aceitável padrão. Agentes de solubilização padrão como PVP ou ciclodextrinas são também utilizados como excipientes farmacêuticos para distribui- ção dos compostos terapêuticos.

Os compostos terapêuticos descritos aqui são formulados em composições para ou- tras vias de administração utilizando métodos convencionais. Por exemplo, antagonista de 5 PD-1 é formulado em uma cápsula ou um comprimido para adestração oral. Cápsulas po- dem conter quaisquer materiais farmaceuticamente aceitáveis padrão como gelatina ou ce- lulose. Comprimidos podem ser formulados de acordo com procedimentos convencionais por comprimir misturas de um composto terapêutico com um veículo sólido e um lubrificante. Os exemplos de veículos sólidos incluem amido e bentonita de açúcar. O antagonista de 10 PD-1 pode ser administrado na forma de um comprimido de invólucro duro ou uma cápsula contendo um aglutinante, como Iactose ou manitol, um material de enchimento convencio- nal, e um agente de formar comprimido. Outras formulações incluem um unguento, supositó- rio, pasta, pulverização, adesivo, creme, gel, esponja reabsorvível ou espuma. Tais formula- ções são produzidas utilizando métodos bem conhecidos na arte.

Adicionalmente, antagonistas de PD-1 podem ser administrados por implante (dire-

tamente em um órgão (por exemplo, intestino ou fígado) ou por via subcutânea) de um sóli- do ou matriz reabsorvível que lentamente libera o composto nos tecidos adjacentes e cir- cundantes do sujeito. Por exemplo, para o tratamento de infecção gastrointestinal, o com- posto pode ser administrado sistemicamente (por exemplo, por via intravenosa, retal ou oral) 20 ou localmente (por exemplo, diretamente no tecido gástrico). Alternativamente, uma esponja reabsorvível ou pastilha impregnada de antagonista de PD-1 é colocada em contato direto com tecido gástrico. O antagonista de PD-1 é lentamente liberado in vivo por difusão da droga a partir da pastilha e erosão da matriz de polímero. Como outro exemplo, infecção do fígado (isto é, hepatite) é tratada por infusão na vasculatura do fígado de uma solução con- 25 tendo o antagonista de PD-1.

Onde o composto terapêutico é um ácido nucléico que codifica um antagonista de PD-1, o ácido nucléico pode ser administrado in vivo para promover expressão da proteína codificada, por construir o mesmo como parte de um vetor de expressão de ácido nucléico apropriada e administrar o mesmo de modo que se torna intracelular (como pelo uso de um 30 vetor retroviral, por injeção direta, pelo uso de bombardeio de micropartículas, por revesti- mento com lipídeos ou receptores de superfície de célula ou agentes de transfecção), ou por administração do mesmo em ligação com um peptídeo semelhante a homeobox que é co- nhecido por entrar no núcleo (vide, por exemplo, Joliot, e outros, Proc Natl Acad Sci USA 88:1864-1868, 1991), e similar. Alternativamente, um agente terapêutico de ácido nucléico é 35 introduzido de forma intracelular e incorporado no DNA de célula hospedeira para expres- são, por recombinação homóloga ou permanece epissomal. Para administração local de DNA, vetores de terapia de gene padrão podem ser utili- zados. Tais vetores incluem vetores virais, incluindo aqueles derivados de vírus de hepatite com defeito de replicação (como HBV e HCV), retrovírus (vide a publicação PCT número WO 89/07136; Rosenberg e outros, N. Eng. J. Med. 323(9):570-578, 1990, adenovírus (vide Morsey e outros, J. Cell. Biochem., Supp. 17E, 1993), vírus adeno-associado (Kotin e ou- tros, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 87:2211-2215, 1990), vírus de herpes simplex com defeito em replicação (HSV; Lu e outros, Abstract, página 66, Abstracts of the Meeting on Gene Therapy, 22-26 de setembro, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1992), e quaisquer versões modificadas desses vetores. Qualquer outro sistema de distribu- ição pode ser utilizado que realiza transferência in vivo de ácidos nucléicos em células euca- rióticas. Por exemplo, os ácidos nucléicos podem ser embalados em lipossomas, como Ii- possomas catiônicos (Lipofectin), sistemas de distribuição mediados por receptor, vetores baseados em ácido nucléico não virais, fantasmas de eritrócito, ou microesferas (como mi- cropartículas; vide, por exemplo, a patente US número 4.789.734; patente US número 4.925.673; patente US número 3.625.214). DNA exposto também pode ser administrado.

Com relação a inibidores de ácido nucléico, uma quantidade terapeuticamente eficaz é uma quantidade que é capaz de produzir um resultado medicamente desejável, por exem- plo, uma diminuição de um produto de gene de PD-1 em um animal tratado. Uma tal quanti- dade pode ser determinada por uma pessoa com conhecimentos comuns na arte. A dosa- 20 gem para qualquer paciente dado depende de muitos fatores, incluindo o tamanho do paci- ente, área superficial do corpo, idade, composto específico a ser administrado, sexo, horário e via de administração, saúde em geral, e outras drogas sendo administradas simultanea- mente. As dosagens podem variar, porém uma dosagem preferida para administração intra- venosa de DNA é aproximadamente 106 a 1022 cópias da molécula de DNA.

Tipicamente, plasmídeos são administrados a um mamífero em uma quantidade de

aproximadamente 1 nanograma a aproximadamente 5000 microgramas de DNA. De forma desejável, composições contêm aproximadamente 5 nanogramas a 1000 microgramas de DNA, 10 nanogramas a 800 microgramas de DNA1 0,1 micrograma a 500 microgramas de DNA, 1 micrograma a 350 microgramas de DNA, 25 microgramas a 250 microgramas de 30 DNA, ou 100 microgramas a 200 microgramas de DNA. Alternativamente, a administração de vetores adenovirais recombinantes que codificam o antagonista de PD-1 em um mamífe- ro pode ser administrada em uma concentração de pelo menos 105, 106, 107, 108, 109, 1010 ou 1011 unidades de formação de placas (pfu).

Em algumas modalidades, para o tratamento de infecções neurológicas, o antagonis- ta de PD-1 pode ser administrado por via intravenosa ou intratecal (por exemplo, por infusão direta no fluido cerebrospinal). Para administração local, uma pastilha impregnada de com- posto ou esponja reabsorvível é colocada em contato direto com o tecido do sistema nervo- so central (CNS). 0 composto ou mistura de compostos é lentamente liberada in vivo por difusão da droga a partir da pastilha e erosão da matriz de polímero, alternativamente, o composto é infundido no cérebro ou fluido cerebrospinal utilizando métodos padrão. Por e- xemplo, um anel de furo de rebarba com um cateter para uso como um orifício de injeção é 5 posicionado para envolver o crânio em um furo de rebarba perfurado no crânio. Um reserva- tório de fluido conectado ao cateter é acessado por uma agulha ou estilete inserido através de um septo posicionado sobre o topo do anel de furo de rebarba. Uma montagem de cate- ter (descrita, por exemplo, na patente US número 5.954.687) provê uma trajetória de fluxo de fluido apropriada para a transferência de fluidos para ou a partir do local selecionado em, 10 perto ou dentro do cérebro para permitir administração da droga durante um período de tempo.

Em modalidades adicionais, para infecções cardíacas, o antagonista de PD-1 pode ser distribuído, por exemplo, ao tecido cardíaco (como o miocárdio, pericárdio, ou endocár- dio) por injeção intracoronária direta através da parede do tórax ou utilizando métodos ba- 15 seados em cateter percutâneo padrão sob orientação fluoroscópica. Desse modo, o antago- nista de PD-1 pode ser diretamente injetado no tecido ou pode ser infundido a partir de um stent ou cateter que é inserido em um lúmen corporal. Qualquer variedade de cateter coro- nário ou cateter de perfusão pode ser utilizada para administrar o composto. Alternativamen- te, o antagonista de PD-1 é revestido ou impregnado em um stent que é colocado em um 20 vaso coronário.

Infecções pulmonares podem ser tratadas, por exemplo, por administrar o antagonis- ta de PD-1 por inalação. Os compostos são distribuídos na forma de uma pulverização de aerossol a partir de um recipiente pressurizado ou dispensador que contém um propelente apropriado, como um gás como dióxido de carbono ou um nebuiizador.

Uma pessoa versada na técnica entenderá que os pacientes tratados podem ter sido

submetidos aos mesmos testes para diagnosticar um sujeito persistentemente infectado ou pode podem ter sido identificadas, sem exame, como uma pessoa em alto risco devido à presença de um ou mais fatores de risco (como exposição ao agente infeccioso, exposição a sujeito infectado; predisposição genética, ou ter uma condição patológica que predispõe a 30 infecções secundárias). A redução de sintomas de infecção persistente ou dano pode incluir, também, porém não é limitado a, alívio de sintomas, diminuição de extensão de doença, estabilização (não piora) do estado de doença, retardo ou diminuição do avanço da doença, e melhora ou paliação do estado de doença. O tratamento pode ocorrer em casa com su- pervisão estreita pelo provedor de tratamento de saúde, ou pode ocorrer em uma instalação 35 para tratamento de saúde.

Os métodos para medir a resposta imune após tratamento utilizando os métodos re- velados aqui são bem conhecidos na técnica. A atividade de células T pode ser avaliada, por exemplo, por ensaios que detectam produção de citocina, ensaios que medem prolifera- ção de células T, ensaios que medem a eliminação do agente microbiano, e ensaios que medem citotoxicidade de célula T CD8+. Esses ensaios são descritos, por exemplo, na pa- tente US número 6.808.710 e publicação de pedido de patente US números 20040137577, 5 20030232323, 20030166531, 20030064380, 20030044768, 20030039653, 20020164600, 20020160000, 20020110836, 20020107363, e 20020106730, todos os quais são pelo pre- sente incorporados a título de referência.

Opcionalmente, a capacidade de um antagonista de PD-1 de aumentar a citotoxici- dade de célula T CD8+ é avaliada por ensaios que medem a proliferação de células T CD8+ 10 (por exemplo, incorporação de timidina, ensaios de BrdU, e coloração com marcadores de ciclo de célula (por exemplo, Ki67 e CFSE)), descritos por exemplo, por Dong e outros (Na- ture 5:1365-1369, 1999). Em um exemplo, a proliferação de células T é monitorada por culti- var as células T purificadas que expressam PD-1 com um antagonista de PD-1, um sinal de ativação primária como descrito acima, e 3H-timidina. O nível de proliferação de célula-T é 15 determinado por medir incorporação de timidina.

A citotoxicidade de célula T CD8+ também pode ser avaliada por ensaios de Iise (como ensaios de liberação 51Cr ou ensaios que detectam a liberação de perforin ou granzi- ma), ensaios que detectam ativação de caspase, ou ensaios que medem a eliminação do agente microbiano a partir do sujeito infectado. Por exemplo, a carga viral em uma amostra 20 biológica a partir do sujeito infectado (por exemplo, soro, baço, fígado, pulmão ou tecido ao qual o vírus é trópico) pode ser medida antes e após tratamento.

A produção de citocinas como IFNy, TNF-α e IL-2 também pode ser medida. Por e- xemplo, células T purificadas são cultivadas na presença de antagonista de proteína PD-1 e um sinal de ativação primário. O nível de várias citocinas no sobrenadante pode ser deter- minado por ensaios imunossorventes ligados por enzima de encaixe ou outros ensaios con- vencionais descritos, por exemplo, em Dong e outros (Nature 5:1365-1369, 1999).

Se desejado, a eficácia do antagonista de PD-1 é avaliada por sua capacidade em induzir co-estimulação de células T. Por exemplo, um método para co-estimulação de célu- la-T in vitro envolve o fornecimento de células-T purificadas que expressam PD-1 com um 30 primeiro sinal de ativação ou sinal de ativação primário por anticorpo monoclonal anti-CD3 ou éster de forbol, ou por antígeno em associação a MHC classe II. A capacidade de um agente composto candidato reduzir a atividade ou expressão de PD-1 e portanto fornecer o sinal co-estimulador ou secundário necessário para modular função imune a essas células-T pode ser então ensaiada por qualquer um dos vários ensaios convencionais bem conheci- 35 dos na arte. A resposta de célula B ao antagonista de PD-1 pode ser avaliada por ELISA especí- fico de LCMV, ELISPOT de célula de plasma, ensaio de célula-B de memória, fenotipagem de célula B, e análise de centros germinais por imunoistoquímica.

Métodos de tratamento: imunoterapia adotiva 5 São revelados aqui métodos para o tratamento de um sujeito de interesse, como um

sujeito com uma infecção viral persistente ou um tumor. Os métodos incluem a administra- ção de uma quantidade terapeuticamente eficaz de células T citotóxicas específicas para um antígeno de interesse, como um antígeno viral ou um antígeno de tumor, e uma quantidade terapeuticamente eficaz de um antagonista de PD-1.

São revelados aqui métodos para aumentar a resposta imune, como intensificar o

sistema imune em um sujeito. A administração das células T específicas de antígeno purifi- cado e PD-1, como revelado aqui, aumentará a capacidade de um sujeito de superar condi- ções patológicas, como uma doença infecciosa ou um tumor, por direcionar uma resposta imune contra um patógeno (como vírus ou fungo) ou neoplasma. Portanto, por purificar e 15 gerar uma população purificada de células T específicas de antígeno selecionado a partir de um sujeito ex vivo e introduzir uma quantidade terapêutica dessas células, a resposta imune do sujeito receptor é intensificada. A administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um antagonista de PD-1 também intensifica a resposta imune do receptor.

Métodos de induzir uma resposta imune a um antígeno de interesse em um receptor são fornecidos aqui. O receptor pode ser qualquer sujeito de interesse, incluindo um sujeito com uma infecção crônica, como uma infecção viral ou por fungos, ou um sujeito com um tumor. Essas infecções são descritas acima.

Infecções em pessoas imunodeficientes são um problema comum e receptores de célula-tronco de aloenxerto e em receptores de transplante de órgãos permanentemente 25 imunossuprimidos. As infecções de deficiência de células T resultantes nesses sujeitos são normalmente de reativação de vírus já presente no receptor. Por exemplo, depois de adqui- rido, a maioria dos vírus do grupo de herpes (como CMV, EBV, VZV, HSV) são dormentes, e mantidos suprimidos por células T. Entretanto, quando pacientes são imunossuprimidos por regimes de condicionamento, vírus dormentes podem ser reativados. Por exemplo, reativa- 30 ção de CMV, reativação de vírus Epstein Barr (EBV) que causa um tumor em células B (do- ença Iinfoproliferativa de EBV), e reativação de vírus BK que causa cistite hemorrágica, po- dem ocorrer após imunossupressão. Além disso, infecção por HIV e imunodeficiência con- gênita são outros exemplos de imunodeficiência de células T. Essas infecções virais e reati- vações podem ser um problema em sujeitos imunossuprimidos.

Em várias modalidades, uma resposta imune contra um tumor é fornecida ao recep-

tor de um transplante de medula óssea. Imunidade antitumor pode ser fornecida a um sujei- to por administração de células T específicas de antígeno que reconhecem um antígeno de tumor. Tal administração a um receptor aumentará a resposta imune do receptor ao tumor pela provisão de células T que são direcionadas a, reconhecem e imunorreagem com um antígeno de tumor, de interesse.

Em um exemplo, o método inclui isolar a partir do doador uma população de células doadoras incluindo células T (como células mononucleares de sangue periférico) e contatar uma população de células doadoras que compreende células T com uma população de cé- lulas apresentadoras de antígeno (APCs) a partir do doador que estão apresentando um antígeno de interesse, opcionalmente na presença de PD-1, desse modo produzindo uma população de células doadoras compreendendo células T CD4+ e/ou CD8+ doadoras ativa- das esgotadas em relação a células T alorreativas que reconhecem um antígeno de interes- se. Uma quantidade terapeuticamente eficaz da população de células CD4+ e/ou CD8+ ati- vadas doadoras no receptor, desse modo produzindo uma resposta imune ao antígeno de interesse no receptor. A administração das células T específicas de antígeno purificadas pode aumentar a capacidade de um sujeito de superar condições patológicas, como uma doença infecciosa ou um tumor, por direcionar uma resposta imune contra um patógeno (como um vírus ou fungo) ou neoplasma. Desse modo, uma resposta imune é produzida no receptor contra o antígeno de interesse.

Em várias modalidades o método também inclui administrar uma quantidade tera- peuticamente eficaz de um antagonista de PD-1 ao sujeito. A administração de antagonistas de PD-1 é descrita em detalhe acima.

Qualquer peptídeo antigênico (como um fragmento imunogênico) a partir de um antí- geno de interesse pode ser utilizado para gerar uma população de células T específicas pa- ra aquele antígeno de interesse. Inúmeros desses peptídeos antigênicos são conhecidos na técnica, como antígenos de tumor e viral (vide, por exemplo, as Tabelas 1-2). Essa revela- 25 ção não é limitada ao uso de peptídeos de antígeno específicos. Exemplos específicos de peptídeos antigênicos a partir de antígenos de interesse, incluem, porém não são limitados àqueles antígenos que são virais, fungos e antígenos de tumor, como aqueles mostrados na tabela 1. Peptídeos antigênicos adicionais são conhecidos na técnica (por exemplo, vide Novellino e outros, Cancer Immunol. Immunother. 54(3): 187-207, 2005, e Cheng e outros, 30 Cytotherapy, 4:41-8, 2002; ambos aqui incorporados a título de referência).

Embora a Tabela 1 revele fragmentos específicos de antígenos de comprimento to- tal, de interesse, uma pessoa versada na técnica reconhecerá que outros fragmentos ou a proteína de comprimento total também podem ser utilizados nos métodos revelados aqui. Em um exemplo, um antígeno de interesse é um “fragmento imunogênico” de uma sequên- 35 cia de antígeno de comprimento total. Um “fragmento imunogênico” se refere a uma porção de uma proteína que, quando apresentada por uma célula no contexto de uma molécula do MHC, pode em um ensaio de ativação de célula-T, ativar uma célula-T contra uma célula que expressa a proteína. Tipicamente, tais fragmentos que se ligam a moléculas de classe I MHC são 8 a 12 aminoácidos contíguos de um antígeno de comprimento total, embora fragmentos mais longos possam, evidentemente, também ser usados. Em alguns exemplos, o fragmento imunogênico é um que pode ligar-se especificamente a uma molécula de MHC 5 na superfície de uma APC, sem processamento adicional da seqüência de epítopo. Em e- xemplos específicos, o fragmento imunogênico é 8-50 aminoácidos contíguos a partir de uma seqüência de antígeno de comprimento total, como 8-20 aminoácidos, 8-15 aminoáci- dos, 8-12 aminoácidos, 8-10 aminoácidos ou 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ou 20 aminoácidos contíguos a partir de uma seqüência de antígeno de comprimento total. Em alguns exem- 10 pios, APCs são incubadas com o fragmento imunogênico sob condições suficientes para o fragmento imunogênico ligar-se especificamente a moléculas de MHC na superfície da APC, sem a necessidade de processamento intracelular.

Em um exemplo, um antígeno inclui um peptídeo a partir do antígeno de interesse com uma seqüência de aminoácidos contendo um motivo de ligação para uma molécula de HLA do sujeito. Esses motivos são bem conhecidos na técnica. Por exemplo, HLA-A2 é um alelo comum na população humana. O motivo de ligação para essa molécula inclui peptí- deos com 9 ou 10 aminoácidos tendo Ieucina ou metionina na segunda posição e valina ou Ieucina nas últimas posições (vide os exemplos acima). Peptídeos que incluem esses moti- vos podem ser preparados por qualquer método conhecido na arte (como de forma recom- binante, quimicamente, etc.). Com conhecimento de uma seqüência de aminoácidos de um antígeno de interesse, seqüências de fragmento imunogênico previstas para ligarem a um MHC podem ser determinados utilizando programas disponíveis ao público. Por exemplo, um programa de motivo de ligação HLA na Internet (Bioinformatics and Molecular Analysis Section-BIMAS) pode ser utilizado para prever epítopos de qualquer antígeno associado a tumor, viral ou fúngico, utilizando métodos de rotina. Antígenos de interesse (proteínas de comprimento total ou um fragmento imunogênico das mesmas) podem ser então produzidos e purificados utilizando técnicas padrão. Por exemplo, antígenos de comprimento total ou epítopo de interesse podem ser produzidos de forma recombinante ou quimicamente sinteti- zados por métodos padrão. Uma preparação de peptídeo substancialmente pura fornecerá uma única faixa principal em um gel de poliacrilamida não redutor. Em outros exemplos, o antígeno de interesse inclui um Iisado viral bruto.

Em um exemplo, o antígeno de interesse é um antígeno associado a tumor e as se- qüências de aminoácidos que contêm motivos de ligação HLA são aquelas que codificam epítopos crípticos ou subdominantes. Aqueles epítopos podem ser identificados por uma afinidade de ligação comparativa inferior para a molécula HLA com relação a outros epíto- pos na molécula ou comparados com outras moléculas que se ligam à molécula HLA. Através do estudo de análogos de antígeno substituídos por aminoácidos únicos e o sequenciamento de peptídeos processados naturalmente, ligados de forma endógena, resí- duos críticos que correspondem a motivos necessários para ligação específica a moléculas de antígeno HLA foram identificados (vide, por exemplo, Southwood e outros., J. Immunol.

5 160:3363, 1998; Rammensee e outros, Immunogenetics 41:178, 1995; Rammensee e outros, J. Curr. Opin. Immunol. 10:478, 1998; Engelhard, Curr. Opin. Immunol. 6:13, 1994; Sette e Grey, Curr. Opin. Immunol. 4:79, 1992). Além disso, a análise cristalográfica por raios-X de complexos de peptídeo-HLA revelou cavidades na fenda de ligação de peptídeo de moléculas HLA que acomodam, em um modo específico de alelo, resíduos carregados 10 por Iigandos de peptídeo; esses resíduos, por sua vez, determinam a capacidade de ligação de HLA dos peptídeos nos quais estão presentes (vide, por exemplo, Madden, Annu. Rev. Immunol. 13:587, 1995; Smith e outros, Immunity 4:203, 1996; Fremont e outros, Immunity 8:305, 1998; Stern e outros, Structure 2:245, 1994; Jones, Curr. Opin. Immunol. 9:75, 1997; Brown e outros, Nature 364:33,1993.)

O antígeno de interesse é selecionado com base no sujeito a ser tratado. Por exem-

plo, se o sujeito está necessitando de imunidade antiviral ou antifúngica aumentada um ou mais antígenos associados a fungo ou viral alvo são selecionados. Antígenos exemplares de interesse a partir de vírus incluem antígenos a partir de vírus de Epstein Bar (EBV), vírus de hepatite C (HCV), citomegalovírus (CMV), vírus de herpes simplex (HSV), vírus BK, vírus 20 JC1 e vírus de imunodeficiência humana (HIV) entre outros. Antígenos exemplares de inte- resse a partir de fungos incluem antígenos a partir de Candida albicans, Cryptococcus, Blas- tomyces e Histoplasma, ou outro agente infeccioso. Em outro exemplo, o sujeito necessita de imunidade antitumor aumentada. Antígenos exemplares de interesse a partir de tumores incluem WT1, PSA, PRAME. Antígenos exemplares de interesse são listados nas tabelas 1 25 e 2. Em alguns exemplos, o antígeno de interesse inclui tanto um antígeno viral como um antígeno de tumor, tanto um antígeno de fungo como um antígeno de tumor, ou um antígeno viral, um antígeno de fungo e um antígeno de tumor.

Para o tratamento de um sujeito com um tumor, o antígeno de tumor de interesse é escolhido com base na expressão da proteína pelo tumor do receptor. Por exemplo, se o 30 receptor tiver um tumor de mama, um antígeno de tumor de mama é selecionado, e se o receptor tiver um tumor de próstata, um antígeno de tumor de próstata é selecionado, e as- sim por diante. A tabela 2 lista tumores exemplares e antígenos associados a tumor, respec- tivos, que podem ser utilizados para gerar células T específicas de antígeno purificadas que podem ser administradas a um sujeito tendo aquele tumor específico. Entretanto, uma pes- 35 soa versada na técnica reconhecerá que tumores iguais e outros podem ser tratados utili- zando antígenos de tumor adicionais. Em um exemplo, células T específicas de antígeno que reconhecem um antígeno de tumor são administradas em uma quantidade terapeuticamente eficaz a um sujeito que teve, ou receberá um autoenxerto ou aloenxerto de célula-tronco, ou que foi vacinado com o antí- geno de tumor. Por exemplo, uma quantidade terapêutica de células T específicas de antí- 5 geno pode ser administrada que reconhecem um ou mais antígenos associados a tumor, por exemplo, pelo menos um dos antígenos de interesse listados nas tabelas 1 ou 2.

Em exemplos específicos onde o receptor tem um tumor e tem ou receberá um alo- enxerto de célula-tronco, células T específicas de antígeno de tumor doadoras e uma quan- tidade terapeuticamente eficaz após o aloenxerto de célula-tronco para evitar, diminuir ou 10 retardar recorrência de tumor, ou tratar um relapso maligno. As células T específicas de an- tígeno purificadas podem ser introduzidas de volta no sujeito após diminuir o volume. Ainda em outro exemplo, o receptor é vacinado com o antígeno de tumor de interesse, células T específicas de antígeno purificadas, purificadas a partir do receptor e então reintroduzidas no receptor com uma quantidade terapeuticamente eficaz de um antagonista de PD-1 para 15 aumentar o sistema imune do receptor contra o tumor.

A administração de uma quantidade terapêutica de células T específicas de antígeno de tumor e uma quantidade terapeuticamente eficaz de um antagonista de PD-1 pode ser utilizada de forma profilática para evitar recorrência do tumor no receptor, ou tratar um re- lapso do tumor. Tais células T específicas de antígeno podem matar células que contêm o antígeno associado a tumor ou auxiliar outras células imunes.

Em um exemplo específico, um receptor tem um tumor e tem ou receberá um aloen- xerto de célula tronco para reconstituir imunidade. Após irradiação de medula óssea ou ad- ministração de uma droga citotóxica que removeu ou de outro modo comprometeu a função da medula óssea, pelo menos dois tipos de células T específicas de antígeno doadoras são 25 administradas em uma quantidade terapeuticamente eficaz, células T específicas de antíge- no que reconhecem especificamente um antígeno associado a vírus (ou um antígeno asso- ciado a fungo) e células T específicas de antígeno que especificamente reconhecem um antígeno associado a tumor. Além disso, uma quantidade terapeuticamente eficaz de um antagonista de PD-1 é administrada ao sujeito. Tal administração pode ser utilizada para 30 induzir um efeito antitumor e um efeito antiviral (como um efeito antiviral).

Para produzir uma população de células T específicas de antígeno para administra- ção a um sujeito de interesse, uma população de células incluindo células T pode ser conta- tada com células apresentadoras de antígeno (APCs), como células dendríticas ou T-APCs1 para apresentar o antígeno de interesse. Em algumas modalidades, as células T que res- 35 pondem (como linfócitos ou PBMCs) são tratadas com um antagonista de PD-1 e são adi- cionadas às PACs que apresentam um ou mais antígenos de interesse, e incubadas sob condições suficientes para permitir a interação entre as APCs que apresentam antígeno e as células T para produzir células T específicas de antígeno. O tratamento das células T que respondem com o antagonista de PD-1 pode ser simultaneamente com o contato das APCs. O tratamento com o antagonista de PD-1 pode ser também imediatamente antes ao contato com as APCs.

5 Desse modo, métodos são fornecidos aqui para produzir uma população enriquecida

de células T específicas de antígeno. Genericamente, T-APCs apresentam antígenos a célu- las T e induzem uma resposta limitada a MHC em um modo restrito de classe I (células T CD8+) e classe Il (células T CD4+). A resposta de célula T típica é ativação e proliferação. Desse modo, uma população é produzida que inclui células T que reconhecem especifica- 10 mente um antígeno de interesse. Desse modo uma quantidade terapeuticamente eficaz dessa população de células pode ser administrada a um sujeito para produzir uma resposta imune, como um sujeito com uma infecção crônica ou um tumor.

Genericamente, as APCs e as células T são autólogas. Em exemplos não limitadores específicos, as APCs e as células T que respondem são a partir do mesmo indivíduo. Entre- 15 tanto, as APCs e as células T que respondem podem ser singeneicas. A APC pode ser utili- zada para apresentar qualquer antígeno a uma população de células T autólogas. Uma pes- soa versada na técnica reconhecerá que peptídeos antigênicos que se ligam a moléculas classe I e Il MHC podem ser gerados ex vivo (por exemplo, em vez de serem processados a partir de uma proteína de comprimento total em uma célula) e deixados interagir com (como 20 ligar) moléculas MHC I e Il em uma superfície de célula. Genericamente, APCs apresentam antígeno no contexto de MHC classe I e II.

Em um exemplo, o antígeno de interesse incubado com as APCs é uma proteína de fusão que inclui uma seqüência de aminoácidos a partir do antígeno de interesse (como 8- 50 aminoácidos contíguos, por exemplo 8-15 ou 8-12 aminoácidos contíguos a partir do an- 25 tígeno de interesse). Desse modo, uma série de epítopos de ligação MHC pode ser incluída em um único peptídeo antigênico, ou um trímero de cadeia única pode ser utilizado, onde cada trímero tem uma molécula MHC classe I, uma microglobulina b2, e um peptídeo anti- gênico de interesse (vide Nature 2005; vol. 436, pág. 578). Em alguns exemplos, somente um único antígeno é utilizado, porém em outras modalidades, mais de um antígeno é utiliza- 30 do, como pelo menos 2 antígenos diferentes, pelo menos 3 antígenos diferentes, pelo me- nos 4 antígenos diferentes, pelo menos 5 antígenos diferentes, pelo menos 10 antígenos diferentes, pelo menos 15 antígenos diferentes, pelo menos 20 antígenos diferentes, ou mesmo pelo menos 50 antígenos diferentes.

Ainda em outros exemplos, um antígeno de interesse é uma seqüência de aminoáci- dos de antígeno de comprimento total (como um antígeno fúngico de comprimento total, antígeno de tumor, ou antígeno viral, por exemplo, um Iisado viral ou catepsina de compri- mento total G). Em exemplos adicionais, um ou mais antígenos a partir de qualquer agente infeccioso podem ser utilizados. Em alguns exemplos, o antígeno de comprimento total de interesse é expresso pela APC.

APCs podem ser produzidas utilizando métodos conhecidos por uma pessoa versa- da na técnica (vide Melenhorst e outros, Cytotherapy 7, supp. 1, 2005; Melenhorst e outros, 5 Blood 106: 671a, 2005; Gagliardi e outros, Int. Immunol. 7: 1741-52, 1995, aqui incorporados a título de referência). Em um exemplo, para produzir T-APCs, monócitos de sangue perifé- rico doadores são ativados utilizando IL-2 e um anticorpo que liga especificamente CD3 (como OKT3) por aproximadamente três ou mais dias, como aproximadamente uma a duas semanas, como por aproximadamente sete a dez dias.

Foi observado que na presença de antígeno apresentador, células T que reconhe-

cem o antígeno se ligam a células apresentadoras de antígeno (APCs) que apresentam um antígeno de interesse mais fortemente do que o fazem células T que não são específicas para o antígeno (e desse modo não estão ligando em um modo específico de antígeno). Em um exemplo específico, células T específicas de antígeno são selecionadas por expor APCs 15 a um antígeno de peptídeo alvo (como um antígeno associado a tumor ou viral alvo) contra o qual células T desejadas devem ser direcionadas na presença de um antagonista de PD-

1, de tal modo que a APC apresenta o antígeno em associação a complexo de histocompa- tibilidade principal (MHC) classe I e/ou classe II. Por exemplo, APCs podem ser expostas a uma quantidade suficiente de um antígeno de interesse para ocupar suficientemente molé- 20 cuias de MHC na superfície da APC (por exemplo, pelo menos 1% das moléculas de MHC são ocupadas, como pelo menos 5%, pelo menos 7,5%, ou pelo menos 10%) e estimulam ligação preferencial de células T alvo na presença de um antagonista de PD-1 às APCs que apresentam o antígeno de interesse (em comparação com APCs que não apresentam o antígeno de interesse). Uma população de células T, como população que foi iniciada para o 25 antígeno de interesse, é então incubada com as APCs, opcionalmente na presença de um antagonista de PD-1, como um anticorpo que especificamente liga PD-1, para preferencial- mente ativar as células, desse modo produzindo uma população de células enriquecidas com as células T desejadas que reconhecem o antígeno de interesse.

Células T como aqueles presentes em uma população de PBMCs ou linfócitos, po- 30 dem ser incubadas com um ou mais antígenos de interesse, opcionalmente na presença de um antagonista de PD-1 para gerar uma população de células T que é iniciada para um ou mais antígenos de interesse. Células T podem ser iniciadas utilizando qualquer método co- nhecido na arte. Em exemplos específicos, PBMCs ou linfócitos são incubados na presença de um antígeno de peptídeo alvo purificado, opcionalmente na presença de um antagonista 35 de PD-1. Em alguns exemplos, o antígeno de interesse é um antígeno de tumor ou viral, como, porém não limitado a, um ou mais dos antígenos de interesse listados na tabela 1. O antígeno de interesse pode estar em uma forma purificada, como um peptídeo quimicamen- te sintetizado. Em outros exemplos, o antígeno de interesse está presente em uma forma não purificada, como em um Iisado bruto, por exemplo, um Iisado viral.

A quantidade de antígeno utilizada para iniciar células T pode ser prontamente de- terminada utilizando métodos conhecidos na arte. Genericamente, se o antígeno for utilizado 5 em uma forma purificada, aproximadamente 1-10 μg/ml de peptídeo é utilizado. Quando um Iisado viral é utilizado, aproximadamente 0,1 — 100 μΙ de lisado, como aproximadamente 75 μΙ, pode ser utilizado. Quando T-APCs são utilizados, aproximadamente 4-6 milhão de T- APCs que apresentam o antígeno de interesse podem ser utilizados para cada 40-60 milhão de células T (ou linfócitos ou PBMCs).

Em um exemplo específico, linfócitos são iniciados in vitro por incubar os mesmos

com antígeno solúvel ou lisado viral por 5-7 dias sob condições que permitem iniciação de células T. Células T viáveis são recuperadas, por exemplo por centrifugação Ficoll-Hypaque, desse modo gerando células T iniciadas. Se desejado, as células T iniciadas viáveis podem ser iniciadas novamente uma ou mais vezes, por exemplo por incubação com o antígeno por 15 outro período de 5-7 dias sob as mesmas condições que aquelas utilizadas para a primeira iniciação, e células T viáveis recuperadas.

Em outro exemplo, linfócitos são iniciados in vivo por inocular um sujeito com o antí- geno, por exemplo na forma de uma vacina. Nesse exemplo, células T obtidas a partir do sujeito após imunização já são iniciadas. Por exemplo, linfócitos ou PBMC obtidos a partir de um sujeito são então incubados com APCs na presença de um antagonista de PD-1 co- mo descrito aqui, sem a necessidade de iniciação adicional.

O método pode incluir ainda geração das APCs que apresentam o antígeno de inte- resse. Por exemplo, APCs podem ser incubadas com uma quantidade suficiente de um ou mais antígenos de peptídeo diferentes, sob condições suficientes para o(s) peptídeo(s) alvo 25 a serem apresentados na superfície das APCs. Isso gera uma população de APCs que a- presentam o antígeno de interesse em moléculas MHC na superfície da APC. Os métodos revelados não são limitados a métodos específicos de apresentar o antígeno de interesse na superfície de uma APC.

Antígenos também podem ser expressos pela APC quer naturalmente ou devido à 30 inserção de um gene que contém a seqüência de DNA codificando a proteína alvo (antíge- no). Um ácido nucléico que codifica o antígeno de interesse pode ser introduzido nas células T como RNA mensageiro, ou utilizando um vetor, como vetor de expressão de mamífero ou um vetor viral (por exemplo, vetores de adenovírus, poxvírus ou retrovírus). Os polinucleotí- deos que codificam um antígeno de interesse incluem um DNA recombinante que é um vírus 35 ou plasmídeo de replicação autônoma, ou que é incorporado no DNA genômico de um euca- riota, ou que existe como uma molécula separada independente de outras seqüências. Um ácido nucléico codificando um antígeno de interesse pode ser também introduzido utilizando eletroporação, lipofecção ou transfecção baseada em fosfato de cálcio.

Diversos vetores virais foram construídos, incluindo, polioma, isto é, SV40 (Madzak e outros, 1992, J. Gen. Virol., 73:15331536), adenovírus (Berkner, 1992, Cur. Top. Microbiol.

Immunol., 158:39-6; Berliner e outros, 1988, Bio Techniques, 6:616-629; Gorziglia e outros, 1992, J. Virol., 66:4407-4412; Quantin e outros, 1992, Proc. Nad. Acad. Sei. USA, 89:2581- 2584; Rosenfeld e outros, 1992, Cell, 68:143-155; Wilkinson e outros, 1992, Nucl. Acids Res., 20:2233-2239; Stratford-Perricaudet e outros, 1990, Hum. Gene Ther., 1:241-256), vírus de vacínia (Mackett e outros, 1992, Biotechnology, 24:495-499), vírus adeno-associado 10 (Muzyczka, 1992, Curr. Top. Microbiol. Immunol., 158:91-123; On e outros, 1990, Gene, 89:279-282), vírus de herpes incluindo HSV, CNV e EBV (Margolskee, 1992, Curr. Top. Microbiol. Immunol., 158:67-90; Johnson e outros, 1992, J. Virol., 66:29522965; Fink e outros, 1992, Hum. Gene Ther. 3:11-19; Breakfield e outros, 1987, Mol. Neurobiol., 1:337- 371; Fresse e outros, 1990, Biochem. Pharmacol., 40:2189-2199), vírus Sindbis (H. Herwei- 15 jer e outros, 1995, Human Gene Therapy 6:1161-1167; patente US Nos. 5.091.309 e 5.2217.879), vírus alfa (S. Schlesinger, 1993, Trends Biotechnol. 11:18-22; I. Frolov e ou- tros, 1996, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 93:11371-11377) e retrovírus de ave (Brandyopadh- yay e outros, 1984, Mol. Cell Biol., 4:749-754; Petropouplos e outros, 1992, J. Virol., 66:3391-3397), murino (Miller, 1992, Curr. Top. Microbiol. Immunol., 158:1-24; Miller e 20 outros, 1985, Mol. Cell Biol., 5:431-437; Sorge e outros, 1984, Mol. Cell Biol., 4:1730-1737; Mann e outros, 1985, J. Virol., 54:401-407), e origem humana (Page e outros, 1990, J. Virol., 64:5370-5276; Buchschalcher e outros, 1992, J. Virol., 66:2731-2739). Vetores de baculovírus (vírus de poliedrose multinuclear Autographa californica; AcMNPV) são também conhecidos na técnica, e podem ser obtidos a partir de fontes comerciais (como 25 PharMingen, San Diego, Calif.; Protein Sciences Corp., Meriden, Conn.; Stratagene, La Jolla, Calif.).

Em uma modalidade, o polinucleotídeo que codifica um antígeno de interesse é in- cluído em um vetor viral para transferência para APC. Vetores apropriados incluem vetores de retrovírus, vetores de orthopox, vetores de avipox, vetores de epitelioma contagioso, ve- 30 tores de varíola de cabra, vetores de varíola de suíno, vetores adenovirais, vetores de vírus de herpes, vetores de vírus alfa, vetores de baculovírus, vetores de vírus Sindbi, vetores de vírus de vacínia e vetores de poliovírus. Vetores exemplares específicos são vetores de poxvírus como vírus de vacínia, vírus de epitelioma contagioso e um vírus de vacínia alta- mente atenuado (MVA), adenovírus, baculovírus e similar.

Vírus de pox de uso incluem vírus de orthopox, varíola de suíno, avipox e varíola de

cabra. Orthopox inclui vacínia, ectromelia e varíola de guaxinim. Um exemplo de um ortho- pox de uso é vacínia. Avipox inclui epitelioma contagioso, varíola dos canários e varíola dos pombos. Varíola de cabra inclui pox de cabra e pox de carneiro. Em um exemplo, a varíola de suíno é pox de suíno. Os exemplos de vetores virais de pox para expressão como dese- jado por exemplo, na patente US número 6.165.460, que é incorporada aqui a título de refe- rência. Outros vetores virais que podem ser utilizados incluem outros vírus de DNA como vírus de herpes e adenovírus, e vírus de RNA como retrovírus e pólio.

Vetores apropriados são revelados, por exemplo, na patente US número 6.998.252, que é incorporada aqui a título de referência. Em um exemplo, um vírus pox recombinante, como um vírus de vacínia recombinante é modificado sinteticamente por inserção de um gene quimérico contendo seqüências reguladoras de vacínia ou seqüências de DNA funcio- nalmente equivalentes às mesmas flanqueando seqüências de DNA que para a natureza não estão contíguos com as seqüências de DNA reguladoras de vacínia de flanquear que codificam um antígeno de interesse. O vírus recombinante contendo um tal gene quimérico é eficaz para expressar o antígeno.Em um exemplo, o vetor viral de vacina compreende (A) um segmento compreendido de (i) uma primeira seqüência de DNA codificando um antígeno e (ii) um promotor de vírus de pox, onde o promotor de vírus de pox é adjacente a e exerce controle de transcrição sobre a seqüência de DNA que codifica um polipeptídeo de antígeno; e flanqueando o segmento, (B) DNA a partir de uma região não essencial de um genoma de vírus de pox. O vetor viral pode codificar um marcador selecionável. Em um exemplo, o vírus de pox inclui, por exemplo, um gene de timidina cinase (vide a patente US número 6.998.252, que é incorporada aqui a título de referência).

A população de APCs que apresenta uma densidade suficiente do(s) antígeno(s) é incubada com células T (como linfócitos ou PBMCs), opcionalmente na presença de uma quantidade eficaz de um antagonista de PD-1, sob condições suficientes para permitir liga- ção entre as APCs que apresentam o antígeno e as células T que podem imunorreagir es- 25 pecificamente com o antígeno (células T específicas de antígeno). Um número suficiente de APCs que expressam uma densidade suficiente de antígeno em combinação com MHC para estimular ligação intensificada de uma célula T alvo a APC, é utilizado. Em exemplos espe- cíficos, pelo menos 20% das APCs estão apresentando o antígeno desejado em moléculas MHC na superfície de APC, como pelo menos 30% das APCs, pelo menos 40% das APCs, 30 pelo menos 50% das APCs, ou pelo menos 60% das APCs. A quantidade ótima de células T adicionadas pode variar dependendo da quantidade de APCs utilizadas. Em alguns exem- plos, uma razão de célula T:APC de pelo menos 6:1 é utilizada, como pelo menos 8:1, pelo menos 10:1, pelo menos 12:1, pelo menos 15:1, pelo menos 16:1, pelo menos 20:1 ou mesmo pelo menos 50:1.

Para aumentar o número de células T específicas de antígeno, proliferação das célu-

las pode ser estimulada,por exemplo por incubação na presença de uma citocina, como IL-

2, IL-7, IL-12 e IL-15. A quantidade de citocina adicionada é suficiente para estimular produ- ção e proliferação de células T, e pode ser determinada utilizando métodos de rotina. Em alguns exemplos, a quantidade de IL-2, IL-7, IL-12 ou IL-15 adicionado é aproximadamente 0,1 - 100 lU/mL, como pelo menos 1 lU/mL, pelo menos 10 lU/mL ou pelo menos 20 lll/mL.

Após uma quantidade suficiente de ligação das células T específicas de antígeno as 5 APCs, células T que reconhecem especificamente o antígeno de interesse são produzidas. Isso gera uma população de células T específicas de antígeno enriquecidas (como purifica- das) que são específicas para o antígeno de interesse. Em alguns exemplos, a população resultante de células T que são específicas para o antígeno de interesse é pelo menos 30% pura, como pelo menos 40% pura ou mesmo pelo menos 50% pura. A pureza da população 10 de células T específicas de antígeno pode ser avaliada utilizando métodos conhecidos por uma pessoa versada na arte.

Em um exemplo, durante estimulação de proliferação de células T específicas de an- tígeno, as células podem ser contadas para determinar o número de células. Quando o nú- mero desejado de células é obtido, a pureza é determinada. Pureza pode ser determinada, 15 por exemplo, utilizando marcadores presentes na superfície das células T específicas de antígeno concomitante com a avaliação de produção de citocina após reconhecimento de antígeno, como interferon (IFN)y , fator de necrose de tumor (TNF)a, interleucina (IL)-2, IL- 10, fator de crescimento de transformação (TGF)p1, ou IL-4. Genericamente, células T es- pecíficas de antígeno são positivas para o marcador CD3, juntamente com o marcador CD4 20 ou CD8, e IFN-γ (que é específico para células T ativadas). Por exemplo, separação de célu- la ativada por fluorescência (FACS) pode ser utilizada para identificar (e separar, se deseja- do) populações de células que são positivas para CD3, CD4 ou CD8, e IFN-γ por utilizar an- ti-CD3, anti-CD4, anti-CD8 e anti-IFN-γ de cor diferente. Resumidamente, células específi- cas de antígeno T estimuladas são incubadas na presença de anti-CD3, anti-CD4, anti-CD8 25 e anti-IFN-γ (cada um tendo um fluóroforo diferente fixado), por um tempo suficiente para que o anticorpo se ligue às células. Após remover anticorpo não ligado, células são analisa- das por FACS utilizando métodos de rotina. Células T específicas de antígeno são aquelas que são INF-γ positiva e CD8 positiva ou CD4 positiva. Em exemplos específicos, a popula- ção resultante de células T antigênicas é pelo menos 30% pura em relação à população 30 total de células CD4+ ou CD8+ positivas, como pelo menos 40% pura, pelo menos 50% pu- ra, pelo menos 60% pura, ou mesmo pelo menos 70% pura em relação à população total de células CD4 positiva ou CD8 positiva.

Em outro exemplo, o método inclui ainda determinar a citotoxicidade das células T específicas de antígeno. Os métodos para determinar citotoxicidade são conhecidos na téc- nica, por exemplo, um ensaio de liberação 51Cr (por exemplo, vide Walker e outros. Nature 328:345-8, 1987; Qin e outros. Acta PharmacoL Sin. 23(6):534-8, 2002; todos incorporados aqui a título de referência). As células T específicas de antígeno podem ser submetidas a um ou mais cursos de seleção para aumentar a pureza das células T específicas de antígeno. Por exemplo, as células T específicas de antígeno purificadas geradas acima são novamente incubadas com APCs que apresentam o antígeno de interesse na presença de um antagonista de PD-1 sob condições suficientes para permitir ligação entre as APCs e as células T específicas de antí- geno purificadas. As células T específicas de antígeno resultantes podem ser estimuladas para proliferar, por exemplo com IL-2. Genericamente, as células T específicas de antígeno resultantes que imunorreagem especificamente com o antígeno de interesse são mais puras após estimulações sucessivas com APCs do que com somente um curso de seleção. Em um exemplo, a população de células T específicas de antígeno purificadas produzidas é pelo menos 90% pura em relação a todas as células CD3+ presentes, como pelo menos 95% pura ou pelo menos 98% pura. Em um exemplo específico, a população de células T específicas de antígeno purificadas produzidas é pelo menos 95% pura em relação a todas as células CD4+ presentes, como pelo menos 98% pura. Em outro exemplo, a população de células T específicas de antígeno purificadas produzidas é pelo menos 90% pura em relação a todas as células CD3+ presentes, como pelo menos 93% pura.

A presente revelação também provê composições terapêuticas que incluem as célu- las T específicas de antígeno enriquecidas (como purificadas) e um antagonista de PD-1. Em exemplos específicos, a população de células T específicas de antígeno enriquecidas resultante (específica para o antígeno de interesse) é colocada em uma forma de dose tera- pêutica para administração a um sujeito necessitando das mesmas. O antagonista de PD-1 também está presente em uma forma de dose terapêutica para administração a um sujeito necessitando de tratamento.

Em um exemplo, a população de células T específicas de antígeno purificadas pro- duzida é pelo menos 30% pura em relação a todas as células CD3+ presentes, como pelo menos 40% pura, pelo menos 50% pura, pelo menos 80% pura, ou mesmo pelo menos 90% pura. Em um exemplo específico, a população de células T específicas de antígeno purifica- das produzida é pelo menos 30% pura em relação a todas as células CD3+ presentes, como pelo menos 40% pura, pelo menos 50% pura, pelo menos 80% pura, pelo menos 90% pura, pelo menos 95% pura, ou mesmo pelo menos 98% pura. Em outro exemplo, a população de células T específicas de antígeno purificadas produzida é pelo menos 50% pura em relação a todas as células CD3+ presentes, como pelo menos 60% pura, pelo menos 75% pura, pelo menos 80% pura, pelo menos 90% pura, ou mesmo pelo menos 93% pura. Células T específicas de antígeno expandidas e selecionadas podem ser testadas em relação a mi- coplasma, esterilidade, endotoxina e qualidade controlada para função e pureza antes de criopreservação ou antes da infusão no receptor. Uma quantidade terapeuticamente eficaz de células T específicas de antígeno é ad- ministrada ao sujeito. Exemplos não limitadores específicos de uma quantidade terapeuti- camente eficaz de células T específicas de antígeno purificadas incluem células T específi- cas de antígeno purificadas administradas em uma dose de aproximadamente 1 x 105 célu- las por quilograma de sujeito a aproximadamente 1 x 109 células por quilograma de sujeito, como de aproximadamente 1 x 106 células por quilograma a aproximadamente 1x10® célu- las por quilograma, como de aproximadamente 5 x 106 células por quilograma a aproxima- damente 75 x 106 células por quilograma, como em aproximadamente 25 x 106 células por quilograma, ou aproximadamente 50 x 106 células por quilograma.

Células T específicas de antígeno purificadas podem ser administradas em doses ú- nica ou múltipla, como determinado por um médico. Por exemplo, as células podem ser ad- ministradas em intervalos de aproximadamente duas semanas dependendo da resposta desejada e da resposta obtida. Em alguns exemplos, após obtenção da resposta desejada, nenhuma célula T específica de antígeno adicional é administrada. Entretanto, se o receptor exibir um ou mais sintomas associados à infecção ou a presença ou crescimento de um tu- mor, uma quantidade terapeuticamente eficaz de células T específicas de antígeno pode ser administrada nesse momento. A administração pode ser local ou sistêmica.

As células T específicas de antígeno purificadas reveladas na presente invenção po- dem ser administradas com um veículo farmaceuticamente aceitável, como solução salina. O antagonista de PD-1 pode ser também formulado em um veículo farmaceuticamente acei- tável, como descrito acima. Em alguns exemplos, outros agentes terapêuticos são adminis- trados com as células T específicas de antígeno e antagonista de PD-1. Outros agentes te- rapêuticos podem ser administrados antes, durante ou após administração das células T específicas de antígeno, dependendo do efeito desejado. Agentes terapêuticos exemplares incluem, porém não são limitados a, agentes antimicrobianos, estimulantes imunes como interferon-alfa, agentes quimioterapêuticos ou vacinas de peptídeo do mesmo antígeno utili- zado para estimular células T in vitro. Em um exemplo específico, composições contendo células T específicas de antígeno também incluem um ou mais agentes terapêuticos.

A revelação é ilustrada pelos seguintes exemplos não limitadores.

EXEMPLOS

Exemplo 1: inibição da via de PD-1 em camundongos infectados cronicamente utili- zando anticorpos anti-PD-L1

Camundongos infectados com várias cepas do vírus de coriomeningite linfocitária (LCMV) foram utilizados para estudar o efeito de infecção viral crônica em função de célula T CD8+. A cepa de Armstrong LCMV causa uma infecção aguda que é eliminada em 8 dias, deixando para trás uma população de vida longa de células T CD8+ de memória em repou- so, altamente funcional. A cepa C1-13 de LCMV, ao contrário, estabelece uma infecção per- sistente no hospedeiro, caracterizada por uma viremia que dura até 3 meses. O vírus per- manece em alguns tecidos indefinidamente e células T CD8+ específicas de antígeno se tornam funcionalmente prejudicadas. Células T CD8+ DbNP396-404 são fisicamente elimi- nadas, enquanto células T CD8+ DbGB33-41 e DbGP276-286 persistem porém perdem a capacidade de proliferar ou secretar citocinas antivirais, como IFN-γ e TNF-a.

Camundongos V57BL/6 foram adquiridos do National Cancer Institute (Frederick, MD). Os camundongos foram infectados por via intravenosa (i.v.) com 2 x106 pfu de LCMV- C1-13. Depleções de CD4 foram executadas por injetar 500 μg de GK1.5 em PBS no dia de infecção e no dia após a infecção. Camundongos imunes a LCMV são gerados por infectar camundongos i.p. com 2x105 pfu LCMV Armstrong.

A análise de conjunto de genes foi realizada em células T CD8+ transgênicas P14 específicas para DbGP33-41 simples, purificadas por FACS, células T de CD8+ de memória específica para DbGP33-41 derivadas de camundongos imunes a LCMV Armstrong, e célu- las T CD8+ específicas a DbGP33-41 ou DbGP276-286 derivadas de camundongos infecta- 15 dos com LCMV C1-13 sem CD4+. A análise de conjunto de genes e o isolamento de RNA foram realizadas como descrito em Kaech e outros (Cell 111:837-51, 2002). mRNA de PD-1 foi altamente expresso em células T CD8+ esgotadas em relação a células T CD8+ de me- mória (figura 1A). Além disso, PD-2 foi expresso na superfície das células T CD8+ em ca- mundongos infectados com LCMV C1-13, porém não estava presente na superfície de célu- 20 Ias T CD8+ após eliminação de LCMV Armstrong (figura 1B). Camundongos cronicamente infectados também expressaram níveis mais elevados de um dos Iigandos de PD-1, PD-L1, na maioria dos linfócitos e APC em comparação com camundongos não infectados. Desse modo, a persistência de antígeno viral e o esgotamento de célula T CD8+ são concomitan- tes com uma indução de expressão de PD-1.

Para testar a hipótese de que o bloqueio da via PD-1/PD-L1 pode recuperar a fun-

ção de célula T e intensificar o controle viral durante infecção por LCMV crônica, a via de co- inibição de PD-1/PD-L1 foi rompida durante infecção por LCMV crônica utilizando anticorpos de bloqueio de aPD-L1. Um anticorpo monoclonal de bloqueio contra PD-L1 foi administrado por via intraperitoneal (i.p.) cada terceiro dia a camundongos infectados com LCMV C1-13 30 (200 μg de anticorpos monoclonais lgG2b PD-L1 anticamundongo de rato (clone 10F.5C5 ou 10F.9G2)) do dia 23 até o dia 37 pós-infecção. No dia 37, havia aproximadamente 2,5 vezes mais células T CD8+ específicas de DbNP396-404 e 3 vezes mais células T CD8+ específicas de DbGP33-41 em camundongos tratados em relação aos controles não trata- dos (figura 2A). A indução em proliferação foi específica para células T CD8+ uma vez que o 35 número de células T CD8+ no baço era aproximadamente igual em camundongos tratados e camundongos não tratados (~6x 104 labGP61-80 de células T CD4+ por baço). Além de um aumento em proliferação de células T CD8+, a inibição de sinalização de PD-1 também resultou em uma produção aumentada de citocinas antivirais em células T CD8+ específicas de vírus. A produção de IFN^y e TNF-α por células T CD8+ para oito epí- topos CTL diferentes foi determinada. A resposta combinada era 2,3 vezes mais elevada em 5 camundongos tratados em comparação com camundongos não tratados (figuras 2B e 2C). Um aumento de 2 vezes na frequência de células que produzem TNF-α foi também obser- vado após tratamento (figura 2D). Eliminação viral foi também acelerada à medida que o vírus foi eliminado do soro, baço e fígado de camundongos tratados. Títulos virais reduzidos foram observados no pulmão e rim (-10 vezes) no dia 37 após infecção (14 dias após início 10 de tratamento) em camundongos tratados. Camundongos não tratados, entretanto, exibiram níveis significativos de vírus em todos esses tecidos (figura 2E). Títulos virais em homoge- neizados de tecido e soro foram determinados utilizando células Vero, como descrito em Ahmed e outros (J. Virol. 51:34-41, 1984). Os resultados que mostram que um antagonista de PD-1 aumenta a proliferação de células T CD8+ e eliminação viral indicam, portanto, que 15 a inibição de sinalização de PD-1 recupera a função de células T CD8+. Além disso, a inibi- ção de sinalização de PD-1 também aumentou as respostas de célula B à medida que o número de células de secretar anticorpo específico de LCMV no baço foi também aumenta- da (>10 vezes) após o tratamento.

Células T CD4+ desempenham um papel chave na geração e manutenção de res- 20 postas de células T CD8+. A esse respeito, células T CD8+ iniciadas na ausência de célula T CD4+ (denominadas células T CD8+ “inúteis”) são incapazes de montar respostas imunes normais. Além disso, infecção por LCMV crônica é mais severa na ausência de células T CD4+. Por conseguinte, células T inúteis geradas durante infecção por LCMV-C1-13 apre- sentam um dano funcional ainda mais profundo do que as células T geradas na presença de 25 células T CD4+. Células T CD8+ específicas de DbNP396-404 são eliminadas a níveis não detectáveis, e células T CD8+ DbGP33-41 e DbGP276-286 perdem totalmente a capacidade de secretar IFN-γ e TNF-a.

Células T CD4+ foram esgotadas no momento de infecção por LCMV C1-13 e os camundongos foram tratados com tratamento de anticorpos anti-PD-L1 a partir do dia 46 até 30 dia 60 após infecção. Após tratamento, camundongos tratados tinham aproximadamente 7 vezes mais de células T CD8+ DbGP276-286 e 4 vezes mais células T CD8+ DbGP33-41 em seu baço do que camundongos de controle não tratados (figura 3A). O número de célu- las T CD8+ específicas de vírus no baço também foi aumentado (figura 3B). Esse aumento em células T CD8+ específicas de vírus em camundongos tratados foi atribuído a um au- 35 mento em proliferação, como detectado por incorporação BrdU. 43% de células T CD8+ DbGP276-286 incorporaram níveis intermediários de BrdU e 2% incorporaram níveis eleva- dos de BrdU em camundongos não tratados, enquanto 50% de células T CD8+ DbGP276- 286 incorporaram níveis intermediários de BrdU e 37% incorporaram níveis elevados de BrdU em camundongos tratados. A análise de BrdU foi executada pela introdução de 1 mg/ml de BrdU na água potável durante tratamento e coloração foi executada de acordo com o protocolo do fabricante (BD Biosciences, San Diego1 CA). Além disso, camundongos tratados continham uma percentagem mais elevada de células T CD8+ que expressam a proteína associada a ciclo de células Ki67 (60% versus 19% em camundongos não tratados, figura 3C). A resposta ao tratamento em células T CD8+ na PBMC foi limitada a camundon- gos tendo níveis elevados de expansão de célula T CD8+.

A inibição de PD-1 também aumentou a produção de citocina antiviral em células T CD8+ específicas de vírus esgotado inúteis. Após o tratamento, o número de células T CD8+ DbGP33-41 e DbGP276-286 que produzem IFN-γ foi acentuadamente aumentado (figura 4A), embora números mais elevados de células T CD8+ específicas de DbNP396- 404, KbNP205-212, DbNPI 66-175 e DbGPI 92-101 foram também detectados em camun- dongos tratados (figura 4A). 50% de células T CD8+ específicas de DbGP276-286 a partir de camundongos tratados podem produzir IFN^y em comparação com 20% de células T CD8+ específicas de DbGP276-286 em camundongos de controle não tratados, (figura 4B). Os níveis de IFN-γ e TNF-α produzidos por células T CD8+ específicas de DbGP276-286 a partir de camundongos tratados, entretanto, eram mais baixos do que células de memória específicas de DbGP276-286 totalmente funcionais (figura 4C).

A inibição de PD-1 também aumentou a atividade lítica de células T CD8+ específi- cas de vírus esgotadas, inúteis. A atividade lítica ex vivo de células T CD8+ específicas de vírus foi detectada após tratamento utilizando um ensaio de liberação 51Cr (Wherry e outros, 2003. J. Virol. 77:4911-27). Títulos virais foram reduzidos em aproximadamente 3 vezes no baço, 4 vezes no fígado, 2 vezes no pulmão e 2 vezes no soro após 2 semanas de trata- mento em relação a camundongos não tratados (figura 4E).

Esses resultados demonstram, portanto, que o bloqueio da via PD-1 rompe a tole- rância periférica de CTL a uma infecção viral crônica, e que células T CD8+ esgotadas isen- tas de ajuda de célula T CD4+ não são irreversivelmente inativadas.

Exemplo 2: administração de vacina antiviral e antagonista de PD-1

Uma abordagem para reforçar respostas de célula T durante uma infecção persisten- te é a vacinação terapêutica. O fundamento para essa abordagem é que antígenos endóge- nos podem não ser apresentados em um modo ótimo ou imunogênico durante infecção viral crônica e que a provisão de antígeno na forma de uma vacina pode fornecer um estímulo mais eficaz para células TeB específicas de vírus. Utilizando o modelo LCMV crônico, ad- ministrou-se nos camundongos um vírus de vacínia recombinante que expressa o epítopo GP33 LCMV como uma vacina terapêutica (WGP33), que resultou em uma intensificação modesta de respostas de células T CD8+ em alguns camundongos infectados cronicamente. Quatro de nove camundongos cronicamente infectados que receberam a vacina terapêutica mostraram uma resposta positiva enquanto nenhum dos camundongos de controle teve au- mento significativo na resposta imune contra GP33. Quando essa vacinação terapêutica foi combinada com um inibidor de PD-L1, respostas de célula T específicas de LCMV foram 5 reforçadas a um nível maior do que em comparação com qualquer tratamento individual- mente e o efeito de tratamento combinado foi mais do que aditivo.

Exemplo 3: inibição da via de PD-1 em camundongos cronicamente infectados utili- zando RNAi de PD-1

Interferência de RNA (RNAi) é capaz de silenciar expressão de gene em células de 10 mamíferos. RNAS de fita dupla longa (dsRNAs) são introduzidos em células e são proces- sados a seguir em RNAs de silêncio, menores (siRNAs) que direcionam moléculas mRNA específicas ou um pequeno grupo de mRNAs. Essa tecnologia é particularmente útil em si- tuações onde anticorpos não são funcionais. Por exemplo, RNAi pode ser empregado em uma situação na qual variantes de junção exclusivas produzem formas solúveis de PD-1 e 15 CTLA-4.

RNAs silenciosos PD-1 são inseridos em um vetor de expressão siRNA comercial- mente disponível, como vetores de expressão pSilencer™ ou vetores adenovirais (Ambion, Austin, TX). Esses vetores são então contatados com células T esgotadas alvo in vivo ou ex vivo (vide o exemplo 4 abaixo).

Exemplo 4: rejuvenescimento ex vivo de células T esgotadas

Células T CD8+ esgotadas específicas de vírus são isoladas de camundongos croni- camente infectados LCMV-C1-13 utilizando microesferas magnéticas ou centrifugação de densidade. Células T CD8+ transfectadas são contatadas com um anticorpo monoclonal que direciona PD-L1, PD-L2 ou PD-1. Como descrito no exemplo 1, inibição da via PD-1 resulta 25 no rejuvenescimento das células T CD8+. Por conseguinte, há um aumento em proliferação de células T CD8+ e produção de citocina, por exemplo. Essas células T CD8+ rejuvenated são reintroduzidas nos camundongos infectados e carga viral é medida como descrito no exemplo 1.

Exemplo 5: classificação in vitro de compostos rejuvenescedores de células T CD8+

novos

Compostos que modulam a via PD-1 podem ser identificados em ensaios de classifi- cação in vivo e ex vivo com base em sua capacidade de reverter esgotamento de células T CD8+ resultando de infecção viral crônica.

Células T CD8+ esgotadas são derivadas de camundongos cronicamente infectados com LCMV-C1-13 e a seguir contatadas com um composto de teste. A quantidade de citoci- nas antivirais (por exemplo, IFN-γ ou TNF-α) liberadas da célula T contatada é medida, por exemplo, por ELISA ou outro método quantitativo, e comparada com a quantidade, caso haja, da citocina antiviral liberada a partir da célula T esgotada não contatada com o com- posto de teste. Um aumento na quantidade de citocina antiviral liberada por células tratadas em relação a tal quantidade em células não tratadas identifica o composto como um antago- nista de PD-1, útil para modular a atividade de célula T.

Exemplo 6: classificação in vivo de compostos rejuvenescedores de células T CD8+

novos

Células T CD8+ esgotadas são derivadas a partir de camundongos cronicamente in- fectadas com LCMV-C1-13. Um composto de teste é administrado por via intravenosa aos camundongos infectados. A quantidade de citocinas antivirais (como IFN-γ ou TNF-α) que é 10 liberada no soro de camundongos tratados e não tratados é medida, por exemplo, por ELISA ou outro método quantitativo, e comparada. Um aumento na quantidade de citocina antiviral encontrada no soro em camundongos tratados em relação a uma tal quantidade em camundongos não tratados identifica o composto de teste como um antagonista de PD-1. Alternativamente, o título viral (por exemplo, título viral de soro) pode ser determinado antes 15 e subseqüente ao tratamento do composto de teste.

Exemplo 7: chimpanzés como modelo para imunoterapia de infecção por HCV per- sistente

Chimpanzés fornecem um modelo de persistência de HCV em seres humanos. De- feitos em imunidade de célula T que levam a persistência de vírus de vida longa tanto inclu- em um déficit em células auxiliares T CD4+ específicas de HCV como atividade de célula efetora T CD8+ prejudicada ou alterada. Chimpanzés persistentemente infectados são trata- dos com anticorpos contra CTLA-4, PD-1, ou uma combinação dos dois. A eficácia de blo- queio das vias de inibição, combinada com vacinação utilizando proteínas de HCV estrutural e não estrutural recombinantes, e se tais estratégias podem aumentar a frequência e Ionge- vidade de células T de memória específicas de vírus são determinadas. O defeito em imuni- dade de célula T é exclusivamente específico de HCV em chimpanzés e seres humanos persistentemente infectados. O sangue e o fígado de chimpanzés infectados são examina- dos em relação à expressão de CTLA-4, PD-1, BTLA e seus Iigandos e em relação à pre- sença de células Treg. A atividade antiviral pode ser então recuperada por fornecer aos chimpanzés anticorpos monoclonais humanizados que bloqueiam a sinalização através des- sas moléculas.

Chimpanzés persistentemente infectados são tratados com anticorpos aCTLA-4 hu- manizados (MDX-010, Medarex) ou anticorpos aPD-1. A dose inicial de MDX-010 é 0,3 mg/kg seguido 2 semanas após por 1,0 mg/kg e então 3, 10, 30 mg/kg em intervalos de três 35 semanas. Após tratamento com anticorpos em moléculas de co-inibição, as respostas imu- nescelular e humoral bem como a carga de RNA HCV serão determinadas. Amostras são coletadas nas semanas 1, 2, 3, 5 e 8 e então em intervalos mensais. As amostras incluem: 1) soro para análise de transaminases, autoanticorpos, anticorpos de neutralização a HCV, e respostas de citocina, 2) plasma para carga viral e evolução de genoma, 3) PBMC para medições in vitro de imunidade, funções e expressão de receptor co-estimulador/inibidor, 4) fígado fresco (não fixado) para isolamento de linfócitos intra-hepáticos e RNA1 e 5) fígado fixado (embebido em formalina/parafina) para histologia e análise imunoistoquímica. Linfo- nodos regionais são também coletados em 2 ou 3 pontos de tempo para avaliar a expressão de moléculas de co-inibição e variantes de junção por imunoistoquímica e técnicas molecu- lares. Os ensaios para avaliar a eficácia e segurança dessas terapias serão realizados como descrito aqui.

Para determinar se a vacinação com antígenos de HCV potência o efeito terapêutico de anticorpos a PD-1, os chimpanzés são tratados como a seguir: 1) imunização intramus- cular com glicoproteínas de envoltório recombinantes E1 e E2 (em adjuvante MF59) e outras proteínas (núcleo mais NS 3, 4 e 5 formuladas com ISCOMS) nas semanas 0, 4 e 24; 2) imunização intramuscular com a vacina utilizada em 1) porém co-administrada com anticor- pos aCTLA-4 (30 mg de cada/kg de peso corpóreo, por via intravenosa nas semanas 0, 4 e

24 quando a vacina é dada; 3) idêntico a 2) exceto que anticorpos aPD-1 (ou BTLA) são substituídos pelos anticorpos CTLA-4; 4) idêntico aos grupos 2 e 3 exceto que uma combi- nação de anticorpos CTLA-4 e PD-1 (ou BTLA) são utilizados além da vacina. Respostas de células BeT específicas de HCV são monitoradas em intervalos mensais após imunização por um período de 1 ano.

Marcadores examinados em células T totais e HCV-tetrâmero+ nessa análise inclu- em marcadores de diferenciação (por exemplo, CD45RA/RO, CD62L, CCR7 e CD27), ativa- ção (Por exemplo, CD25, CD69, CD38 e HLA-DR), sobrevivência/proliferação (por exemplo, bcl-2 e Ki67), potencial citotóxico (por exemplo, granzimas e perforin) e receptores de citoci- na (CD122 e CD127). Uma correlação interessante existe entre os níveis pré-terapia da quimiocina IP-10 e resposta a PEG-IFNy/ribavirin. Os níveis IP-10 são medidos para investi- gar uma correlação potencial entre vias reguladoras negativas ou respostas de célula T es- pecíficas de HCV e níveis de IP-10. A expressão de receptores inibidores e Iigandos em PBMC é executada por citometria de fluxo.

Exemplo 8: imunocoloração de PD-1 em tecido linfóide reativo

O material do caso foi obtido do Brigham & Women’s Hospital, Boston, MA, de acor- do com programas institucionais. Todos os diagnósticos foram baseados nas características histológicas e imunofenotípicas descritas no sistema de Classificação de Linfomas da Orga- nização Mundial da Saúde (Jaffe ES, e outros 2001) e em todos os casos o material de di- agnóstico foi examinado por um hematopatologista.

A imunocoloração para PD-1 foi executada em seções de tecido embebidas em pa- rafina fixada-formalina após recuperação de antígeno por micro-onda em 10 mM tampão de citrato, pH 6,0 com um anticorpo monoclonal PD-1 anti-humano anteriormente descrito (2H7; 5), utilizando um método de peroxidase de raiz forte de biotina-avidina indireto, padrão e desenvolvimento de cor de diaminobenzidina, como anteriormente descrito (Jones D. e ou- tros, 1999; Dorfman DM, e outros 2003). Os casos foram considerados como imunorreativos 5 para PD-1 se pelo menos 25% de células neoplásticas apresentaram coloração positiva. A coloração PD-1 foi comparada com aquela de anticorpo de controle de isotipo IgG de ca- mundongo diluída à concentração de proteína idêntica para todos os casos estudados, para confirmar especificidade de coloração.

O anticorpo monoclonal 2H7 para PD-1 foi utilizado para colorir espécimes embebi- 10 dos em parafina fixada-formalina de tecido linfóide reativo, timo e uma gama de casos de distúrbios Iinfoproliferativos de célula T e célula B. Em espécimes de tonsila que apresentam alterações reativas, incluindo hiperplasia folicular, um subconjunto de linfócitos predominan- temente pequenos nos centros germinais apresentou coloração citoplásmica para PD-1, com células positivas para PD-1 não freqüentes vistas nas zonas de célula T interfolicular. O 15 padrão de coloração de PD-1 em centros germinais foi virtualmente idêntico àquele visto com um anticorpo para CD3, um marcador de célula T-pan, ao passo que um anticorpo para CD20, um marcador de célula B-pan, coloriu a grande maioria de células B de centro germi- nal. Resultados similares foram vistos em seções histológicas de Iinfonodo reativo e baço. Nenhuma coloração de PD-1 foi observada em timo de adulto.

Exemplo 9: Imunocoloração de PD-1 em seções de tecido embebidas em parafina de

distúrbios Iinfoproliferativos de célula T e célula B

Uma gama de distúrbios Iinfoproliferativos de célula T e célula B para expressão de PD-1 foi estudada; os resultados são resumidos na tabela 1. Quarenta e dois casos de dis- túrbios Iinfoproliferativos de célula B foram examinados em relação à expressão de PD-1, 25 incluindo casos representativos de Iinfoma linfoblástica/leucemia linfoblástica B precursora, bem como uma gama de distúrbios Iinfoproliferativos de células B maduras, incluindo um número de Iinfomas não Hodgkin de célula B de origem folicular, incluindo 6 casos de Iinfo- ma folicular e 7 casos de Iinfoma Burkitt. Nenhum dos distúrbios Iinfoproliferativos de célula B mostrou coloração para PD-1. Em alguns casos, tecido linfóide reativo não neoplásico 30 estava presente, e mostrou um padrão de coloração de PD-1 como visto em tonsila e outro tecido linfóide reativo mencionado acima.

Similarmente, em 25 casos de Iinfoma de Hodgkin, incluindo 11 casos de Iinfoma de Hodgkin clássico e 14 casos de Iinfoma de Hodgkin predominante em linfócitos, as células neoplásicas não apresentaram coloração para PD-1. De forma interessante, em todos os 14 35 casos de Iinfoma de Hodgkin predominante em linfócitos, as células T que circundam células L&H CD-20 positivas neoplásicas eram imunorreativas para PD-1, similar ao padrão de colo- ração observado para células T CD57+ em Iinfoma de Hodgkin predominante em linfócitos. Essas células positivas de PD-1 eram um subconjunto da população de células T CD3+ total presente.

Uma gama de distúrbios Iinfoproliferativos de célula T foi estudada em relação à ex- pressão de pD-1; os resultados são resumidos na tabela 1. Os casos de Iinfoma linfoblásti- 5 ca/leucemia linfoblástica de célula T precursora, um neoplasma de células T imaturas foram negativos para PD-1, como foram neoplasmas de células T pós-tímicas, periféricas, incluin- do casos de leucemia prolinfocítica de célula T, Iinfoma de célula T periférica, Iinfoma de célula grande anaplástica, não especificado, e linfoma/leucemia de células T de adulto. Ao contrário, todos os 19 casos de Iinfoma angioimunoblástico continham focos de células posi- 10 tivas-PD1 que também eram imunorreativos para marcadores de célula T-pan como CD3. Células positivas-PD-1 foram compativelmente encontradas em focos de redes de células dendríticas foliculares (FDC) CD21+ expandidas, um aspecto característico de Iinfoma angi- oimunoblástico.

Tabela 4. Imunocoloração de PD-1 em distúrbios Iinfoproliferativos

Imunocoloração de PD-1 B cell LPDs 0/42* B-LL/LL 0/3 CLL 0/4 MCL 0/4 FL 0/6 MZL 0/3 HCL 0/3 DLBCL 0/6 BL 0/7 LPL 0/3 MM 0/3 Linfoma de Hodgkin 0/25 Clássico 0/11 Predominante em linfócito nodular 0/14** LPDs de célula T 18/55 T-LL/LL 0/5 T-PLL 0/3 AIL 19/19 PTCL, não especificado 0/14 ALCL 0/12 ATLL 0/3 Abreviaturas: B-LL/LL - leucemia linfoblástica/linfoma linfoblástica de célula B precursora; CLL - leucemia linfocítica crônica; MCL - Iinfoma de célula de manto; FL - Iinfoma folicular; MZL - Iinfoma de zona marginal; HCL - leucemia de célula pilosa; DLBCL - Iinfoma de célu- la B grande difusa; BL - Iinfoma Burkitt; LPL - Iinfoma linfoplasmacítico; MM - mieloma múl- tiplo; T-LL/L - Iinfoma linfoblástico/leucemia linfoblástico T precursor; T-LPLL- leucemia pro- 20 linfocítica de célula T; AIL - Iinfoma angioimunoblástico; PTCL - Iinfoma de célula T periféri- ca, não especificado; ALCL - Iinfoma de célula grande anaplástica; ATLL - linfoma/leucemia de célula T de adulto.

* número de casos imunorreativos/número total de casos

** células positivas de PD-1 forma rosetas em torno de células L&H neoplásicas em 14/14 casos

Exemplo 10; Métodos gerais para estudar expressão de PD-1 em células T CD8+ específicas de HIV

Os seguintes métodos foram utilizados para executar os experimentos detalhados nos exemplos 11-14.

Sujeitos: participantes do estudo com infecção HIV-1 C clade crônica foram recruta- dos de clínicas de pacientes externos no McCord Hospital, Durban, África do Sul e St. Mary’s Hospital, Mariannhill, África do Sul. Sangue periférico foi obtido de 65 sujeitos nesse cohort, todos os quais estavam em terapia anti-retroviral simples no momento da análise. Os sujeitos foram selecionados para inclusão com base em seus alelos de HLA expressos ca- sando com os dez tetrâmeros de classe I que foram construídos (vide abaixo). A carga viral mediana do cohort foi de 42.800 cópias de RNA HIV-1 / ml de plasma (faixa de 163 - 750.000), e a contagem de CD4 média absoluta foi de 362 (faixa de 129 - 1179). Informa- ções referentes à duração de infecção não eram disponíveis. Todos os sujeitos forneceram consentimento por escrito para o estudo, que foi aprovado por conselhos de exame institu- cionais locais.

Construção de anticorpos PD-1 e PD-L1: anticorpos monoclonais a PD-L1 humano (29E.2A3, lgG2 de camundongo) e PD-1 (EH12, IgGI de camundongo) foram preparados como anteriormente descrito e foram mostrados como bloqueando a interação PD-1 :PD-L1.

Tetrâmeros de MHC classe I: dez tetrâmeros de MHC classe de HIV, sintetizados como anteriormente descrito (Altman JD, e outros, 1996), foram utilizados para esse estudo: A*0205 GL9 (p24, GAFDLSFFL; SEQ ID NO:1), A*3002 KIY9 (Integrase, KIQNFRVYY; SEQ ID NO:2), B*0801 DI8 (p24, DIYKRWII; SEQ ID NO:3), B*0801 FL8 (Nef, FLKEKGGL; SEQ ID NO:4), B*4201 RM9 (Nef, RPQVPLRPM; SEQ ID NO:5), B*4201 TL9 (p24, TPQDLNTML; SEQ ID NO:6), B*4201 TL10 (Nef, TPGPGVRYPL; SEQ ID NO:7), B*4201 YL9 (RT, YPGIKVKQL; SEQ ID NO:8), B*8101 TL9 (p24, TPQDLNTML; SEQ ID NO:9), e Cw0304 YL9 (p24, YVDRFFKTL; SEQ ID NO: 10).

Coloração de tetrâmero HLA classe I e análise fenotípica: células mononucleares de sangue periférico recentemente isoladas (PBMC, 0,5 milhão) foram coloridas com tetrâ- mero por 20 minutos a 37°C. As células foram então lavadas uma vez com solução salina tamponada com fosfato (PBS), formadas em pelotas e coloridas diretamente com anti-CD8 conjugado com isotiocianato de fluoresceína (FITC) (Becton Dickinson), anti-PD-1 conjuga- do com ficoeritrina (clone EH12) e ViaProbe (Becton Dickinson). As células foram incubadas por 20 minutos em temperatura ambiente, lavadas uma vez em PBS1 e suspensas nova- mente em 200 μΙ de PBS com 1% de paraformaldeído e adquiridas em um separador de células ativadas por fluorescência (FACSCalibur™, Becton Dickinson). Um mínimo de 100.000 eventos foi adquirido no FACSCalibur™.

5 Ensaios de proliferação de CFSE: um milhão de PBMC recentemente isolado foi la-

vado duas vezes em PBSm, formado em pelotas e suspenso novamente em 1 ml de 0.5 μΜ de diacetato de fluoresceína-carbóxi, éster de succinimida (CFSE, Molecular Probes) por 7 minutos a 37°C. As células foram lavadas duas vezes em PBS, suspensas novamente em 1 ml de meio R10 (RPMI 1640 suplementado com glutiationa, penicilina, estreptomicina, e 10 soro de vitelo fetal a 10% [FCS]), e revestidas em uma cavidade de uma placa com 24 cavi- dades. Estudos iniciais revelaram que uma concentração final de 0,2 μg/ml de peptídeo for- neceu respostas proliferativas ótimas, portanto essa foi a concentração final de peptídeo na cavidade utilizada para cada ensaio. Cavidades de controle negativo consistiram em PBMC em meio sozinho, ou PBMC em meio com anti-PD-L1 purificado (10 μg/ml), e cavidades de 15 controle positivo foram estimuladas com 10 μg/ml de fitoemaglutinína (PHA). Após 6 dias de incubação em um incubador a 37°c, as células foram lavadas com 2 ml de PBS e coloridas com tetrâmeros de MHC classe I conjugados com PE, ViaProbe (Becton Dickinson), e anti- corpos anti-CD8-APC. As células foram adquiridas em um FACSCalibur e analisadas por software CelIQuest® (Becton Dickinson). As células foram gated em linfócitos CD8+- Via- 20 Probe. O aumento de dobro em células de tetrâmero+ foi calculado dividindo a percentagem de células de tetrâmero+ CD8+ na presença de peptídeo pela percentagem de células de tetrâmero+ CD8+ na ausência de estimulação de peptídeo.

Análise estatística: correlação Spearman, teste Mann-Whitney, e análises de teste-t emparelhado foram executadas utilizando GraphPad Prism Versão 4.0a. Todos testes foram de 2-caudas e valores p de <0,05 foram considerados significativos.

Exemplo 11: expressão de PD-1 em células T CD8+ específicas de HIV Um painel de 10 tetrâmeros de MHC classe I específicos para epítopos de célula T CD8+ de vírus C clade HIV-1 dominantes foi sintetizado, com base em alelos de HLA preva- Ientes e epítopos frequentemente direcionados em Gag, Nef, Integrase e RT após visualiza- ção direta de expressão de PD-1 superficial nessas células. Tipagem de HLA de alta resolu- ção foi executada no cohort inteiro, e um subconjunto de 65 pessoas simples em terapia anti-retroviral foi selecionado para estudo com base em expressão de alelos HLA relevantes. Um total de 120 epítopos individuais foi examinado, e coloração ex vivo representativa de PD-1 em células de tetrâmero+ HIV é mostrado na figura 5A. A expressão de PD-1 era pron- tamente evidente nessas células de tetrâmero+, e era significativamente mais elevada do que na população de células T CD8 total a partir dos mesmos indivíduos (p<0,0001); por sua vez, a expressão de PD-1 tanto em células T CD8+ de tetrâmero+ como população de célu- Ias T CD8+ total era significativamente mais elevada do que em controles HlV-soronegativos (figura 5B). Para oito dos dez tetrâmeros testados pelo menos uma pessoa foi identificada na qual o nível de expressão em células CD8+ específicas de antígeno era de 100% (figura 5C). PBMC de 3 a 25 indivíduos foram coloridos para cada resposta de tetrâmero de HIV, 5 com níveis de expressão de PD-1 médios variando de 68% a 94% de células de tetrâmero+ (figura 5C). Essas descobertas foram adicionalmente confirmadas por análise da intensida- de média de fluorescência (MFI) de PD-1 tanto em células de tetrâmero+ como na popula- ção total de células T CD8+ (figura 5B, C).

Foi determinado a seguir se havia evidência para diferenças específicas de epítopo 10 em termos de níveis de expressão de PD-1 em pessoas com múltiplas respostas detectá- veis. Das 65 pessoas examinadas, 16 indivíduos tinham entre 3 e 5 respostas positivas para tetrâmero cada. A expressão de PD-1 era quase idêntica e se aproxima de 100% para cada resposta analisada para três dos dezesseis sujeitos; resultado de infecção por HIV crônica em expressão aumentada de PD-1 em células T CD8+, e são compatíveis com dados de 15 murino em infecção por LCMV crônica, na qual a expressão PD-1 é associada a esgotamen- to funcional de células T CD8+ (Barber DL, e outros, 2005). Além disso, fornecem a primeira associação clara, em um grande estudo que inclui análise de múltiplos epítopos, entre célu- las T CD8+ específicas de HIV e carga viral ou contagem de CD4.

Exemplo 13; a relação entre expressão de PD-1 e função e estado de memória de célula T CD8

A expressão de PD-1 foi analisada a seguir no contexto de diversos marcadores fe- notípicos adicionais associados à função e estado de memória de célula T CD8+, incluindo CD27, CD28, CE45RA, CD57, CD62L, CD127, CCR7, perfin, granzima B e Ki67 (figura 7). Colorações representativas para esses marcadores em células de tetrâmero+ TL9 B*4201 a 25 partir de um indivíduo são mostradas na figura 7A, e dados agregados para 13 sujeitos são mostrados na figura 7B. Esses estudos foram limitados àquelas respostas de tetrâmero que eram maiores do que 95% de PD-1 positivo, visto que citometria de fluxo de multiparâmetros de mais de 4 cores não era disponível em KwaZuIu Natal. As células PD-1+ de tetrâmero+ de HIV expressam níveis elevados de CD27 e granzima B, níveis muito baixos de CD28, 30 CCR7, e Ki67 intracelular, níveis baixos de CD45RA e perforin, e níveis intermediários de CD57 e CD62L (figura 7B). Esses dados indicam que células T PD-1 específicas de HIV exibem um fenótipo de memória efetor/efetor, e são compatíveis com relatórios anteriores de maturação assimétrica de células T CD8+ específicas de HIV. Além disso, sequencia- mento de vírus foi executado para determinar se essas células estavam acionando escapa- 35 mento imune. De 45 dessas respostas positivas para tetrâmero avaliadas, os epítopos virais em somente 4 foram diferentes da seqüência de consenso de clade C da África do Sul, indi- cando que essas células exercem pouca pressão de seleção in vivo. Experimentos anteriores em camundongos utilizando o modelo LCMV mostraram que bloqueio in vivo de interação de PD-1/PD-L1 por infusão de anticorpo de bloqueio anti- PD-L1 resulta em funcionalidade aumentada de células T CD8+ específicas de LCMV como medido por produção de citocina, capacidade de extermínio, capacidade de proliferação, e 5 mais surpreendentemente, redução em carga viral. A estimulação específica de antígeno in vivo de curta duração (12 horas) de PBMC recentemente isolado de 15 sujeitos com HIV+, na presença ou ausência de 1 μg/ml de anticorpo anti-PD-L1 purificado, falhou em aumentar a produção de IFN-γ, TNF-α ou IL-2.

Exemplo 14: efeito de bloqueio da via de PD-1/PD-L1 em proliferação de células T CD8+específicas de HIV

Como as células T CD8+ específicas de HIV também apresentam capacidade proli- ferativa prejudicada (2004), foi determinado se o bloqueio de PD-1/PD-L1 pode intensificar essa função in vitro. Dados representativos a partir de um indivíduo positivo para B*4201 são mostrados na figura 8A. A incubação de PBMC rotulado com CFSE recentemente isola- do com meio somente, ou meio com anticorpo anti-PD-L1, resultou na manutenção de uma população de células T CD8+ específicas de B*4201-TL9 (1,2% de células T CD8+) que permaneceu CFSEhi após seis dias em cultura. A simulação de PBMC rotulado com CFSE por 6 dias com peptídeo TL9 sozinho resultou em uma expansão de 4,8 vezes de células de tetrâmero+ TL9 B*4201 CFSEIo, ao passo que a estimulação de PBMC rotulado com CFSE com peptídeo TL9 na presença de anticorpo de bloqueio de anti-PD-L1 aumentou ainda mais a proliferação de células específicas de TL9, resultando em um aumento de 10,3 vezes em células de tetrâmero+. Ensaios de proliferação de CFSE foram executados em 28 amos- tras na presença e ausência de anticorpo de bloqueio de PD-L1 anti-humano purificado. Um aumento significativo na proliferação de células T CD8+ específicas de HIV foi observado na presença de peptídeo mais anticorpo de bloqueio anti-PD-L1 em comparação com a quanti- dade de proliferação após estimulação com peptídeo sozinho (figura 8B; p=0,0006, teste-t emparelhado). O aumento de dobro de células de tetrâmero+ na presença de anticorpo de bloqueio anti-PD-L1 variou por indivíduo e por epítopo em um indivíduo dado (figura 8C), novamente sugerindo diferenças específicas de epítopo no grau de esgotamento funcional dessas respostas.

Exemplo 15: vacinação terapêutica em combinação com bloqueio de via de inibição de PD-1 melhora de forma sinergisticamente o controle imune de infecção viral crônica: um estudo de conceito de vacina terapêutica combinatória

O dano funcional de células T incluindo proliferação de citocina, citólise, e prolifera- ção de células T específicas de antígeno, é uma característica de definição de muitas infec- ções crônicas. A resposta imune de célula T inativada é observada durante um variedade de infecções de patógeno persistente diferentes, incluindo HIV, HBV, HCV e TB em seres hu- manos. Inativação de célula T durante infecção crônica pode correlacionar com a magnitude e persistência da carga de antígeno e originam de sinais receptores de célula T próximos rompidos, regulação ascendente de proteínas de inibição ou regulação descendente de pro- teínas co-estimuladoras, e feitos em sinais de citocina e acessório. O defeito em células T 5 esgotadas é um motivo principal para a incapacidade do hospedeiro de eliminar o patógeno persistente. Durante infecção crônica, células T CD8 específicas de vírus esgotadas regu- lam ascendentemente duas proteínas de inibição chave: PD-1 e CTLA-4. Um bloqueio in vivo de PD-1 aumenta o número e função de células T CD8 específicas de vírus e resulta em carga viral diminuída.

Há várias desvantagens de estratégias atuais de vacinação para infecções virais

crônicas. Especificamente, o reforço eficaz de respostas de célula T CD8 antiviral não é ob- servado após vacinação terapêutica. Além disso, uma carga viral elevada e o potencial proli- ferativo baixo de resposta de células T durante infecção crônica provavelmente limitam a eficácia de vacinação terapêutica. Desse modo, é importante desenvolver estratégia de va- 15 cina terapêutica para reforçar eficazmente as respostas de célula T endógena para controlar a infecção crônica.

Um modelo de infecção crônica bem conhecido induzido por infecção de Clone-13 de LCMV foi utilizado para determinar a eficácia de utilizar um antagonista de PD-1 em combinação com uma vacina terapêutica. Um vírus de vacínia que expressa epítopo GP33 20 de LCMV foi utilizado como uma vacina terapêutica para monitorar uma resposta imune de célula T CD8 específica de epítopo. Uma vacina terapêutica foi combinada com anticorpo anti-PD-L1 para bloquear uma via de inibição para pesquisar o efeito sinergista em relação a uma proliferação de células T CD8 específicas de antígeno e uma resolução de vírus persis- tente.

Os seguintes métodos foram utilizados nesses experimentos:

Camundongos e infecções: camundongos C57BL/6 (fêmeas com 4 a 6 semanas de idade) eram do The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME). Os camundongos foram mantidos em um viveiro isento de patógeno de acordo com as diretrizes de NIH Animal Care. Para a iniciação de infecções crônicas, os camundongos foram infectados com 2x106 PFU de clo- 30 ne-13 de LCMV (CL-13) como descrito anteriormente. Os ensaios de placa e crescimento viral para determinar títulos virais foram descritos anteriormente.

Bloqueio de anticorpo in vivo e vacinação terapêutica: duzentos microgramas de PD-L1 anticamundongo de rato (10F:9G2) foram administrados por via intraperitoneal em cada terceiro dia a partir de 4 semanas após infecção com CL-13. No ponto de tempo do 35 primeiro tratamento de anti-PD-L1, 2x106 PFU de vírus de vacínia recombinante expressan- do o epítopo GP33-41 (W/GP33) como vacina terapêutica ou vírus de vacínia do tipo selva- gem (W/WT) como vacina de controle foram dados por via intraperitoneal. Isolamento de linfócito: linfócitos foram isolados de tecidos e sangue como anteri- ormente descrito. Fígado e pulmão foram perfundidos com PBS gelado antes da remoção para isolamento de linfócitos.

Citometria de fluxo: tetrâmetros de peptídeo de MHC classe I foram gerados e utili- 5 zados como anteriormente descrito. Todos os anticorpos foram obtidos da BD Pharmingen exceto por granzima B (Caltag), Bcl-2 (R&D Systems) e CD 127 (eBioscience). Toda colora- ção de citocina superficial e intracelular foi executada como descrito (Barber e outros, Natu- re 439:682, 2006). Para detectar desgranulação, esplenócitos foram estimulados por 5 h na presença de brefeldin, monensin, anti-CD107a-FITC e anti-CD107b-FITC.

Microscopia confocal: baços foram removidos de camundongos e congelados em

OCT (TissueTek). A partir desses blocos, seções de cryostat de 10-20 mm foram cortadas e fixadas em acetona gelada por 10 minutos. Para imunofluorescência, seções foram colori- das com os seguintes anticorpos: ER-TR7 para detectar células reticulares (Biogenesis, Kingston, NH) e soro de cobaia anti-LCMV policlonal. Colorações foram visualizadas com Ig 15 de anti-cobaia de cabra Alexa Fluor-568 e anti-rato de cabra Alexa Fluor-488 (Molecular Probes) e analisadas por microscopia confocal (Leica Microsystems AG, Alemanha). As i- magens foram preparadas utilizando ImageJ (National Institutes of health) e Photoshop (A- dobe Systems Inc.).

Os resultados demonstraram que uma combinação de vacina terapêutica e anticor- po anti-PD-L1 exibe um efeito sinergista sobre a proliferação de células T CD8 específicas de antígeno e resolução de vírus persistente. Vacina terapêutica poderia reforçar eficazmen- te uma população de células T CD8 recuperada funcionalmente por bloqueio de via de inibi- ção de PD-1/PD-L1. A proliferação aumentada de células T CD8 específicas de antígeno e controle viral acelerado foi sistematicamente obtida por vacinação terapêutica combinatória (figuras 9A-9D e figuras 10A-10D). A vacina terapêutica combinatória guia para um aumento dramático de células T CD8 funcionalmente ativas (figura 11A-D). Além disso, a vacina tera- pêutica utilizando vetor que expressa epítopo específico durante bloqueio de via PD-1/PD- L1 intensifica uma proliferação de célula T CD8 específica para epítopo codificado em vetor (figura 9 e 11). O nível de expressão aumentada de CD127 visto em células T CD8 específi- cas de antígeno no grupo tratado com a vacina combinatória reflete a geração de respostas de célula T de memória a longo prazo, enquanto níveis de expressão diminuídos de PD-1 e Granzima B correlacionam com a resolução de vírus persistente (figuras 12A-12B).

Houve um efeito sinergista de vacina terapêutica combinada com bloqueio de PD- L1 na recuperação de função em células T CD8 esgotadas ‘inúteis’ (vide a figura 13A-13E). Os camundongos foram esgotados de células T CD4 e então infectados com LCMV clone- 13. Alguns camundongos foram vacinados com vírus de vacínia do tipo selvagem (W/WT) ou vírus de vacínia que expressa epítopo GP33-41 LCMV (W/GP33) 7 semanas após in- fecção. Ao mesmo tempo, os camundongos foram tratados 5 vezes a cada três dias com aPD-L1 ou seu isotipo. Duas semanas após tratamento inicial de anticorpos, os camundon- gos foram sacrificados para análise. Os resultados são mostrados na figura 13A. A frequên- cia de células T CD8 específicas de GP33 também foi examinada (figura 13B). Esplenócitos 5 foram estimulados com peptídeo GP33 na presença de anticorpos aCD107a/b e então colo- ridos em conjunto para IFN-γ. Os gráficos mostrados são gated em células T CD8 (figura 13C). A percentagem de células de IFN-γ após estimulação com peptídeo GP33 por células positivas para tetrâmero GP33-451 restrito por DB foi também determinada (figura 13D), como foi o título viral (figura 13E). Os resultados demonstram o efeito sinergista de uma va- 10 cina combinada com bloqueio de PD-1.

Esses resultados mostram que combinações de bloqueio de via reguladora negativa e reforço de células T CD8 durante infecção crônica podem ser utilizadas no desenvolvimen- to de vacinas terapêuticas para melhorar as respostas de célula T em pacientes com infec- ções crônicas ou malignidades. Intervenções terapêuticas, como o uso de um antagonista 15 de PD-1, que reforçam respostas de célula-T e diminuem a carga viral poderiam aumentar a sobrevivência livre de doença e diminuir a transmissão do vírus. Vacinação terapêutica efi- caz pode ser utilizada para infecções virais crônicas e infecções parasíticas, bacterianas persistentes. Essa estratégia também é de uso para o tratamento de malignidades.

Exemplo 16: intensificação de imunoterapia de célula T através de bloqueio da via PD1/PDL1

É importante desenvolver estratégias para tratar e eliminar infecções virais crônicas como o vírus de Imunodeficiência humana e Hepatite C. O CDC relatou recentemente que mais de um milhão de americanos estão vivendo com HIV, exemplificando a necessidade de terapias mais eficazes. É importante determinar como a sinalização de inibição para linfóci- 25 tos pode contribuir para a capacidade de um patógeno de evadir persistentemente a respos- ta imune de hospedeiro.

O PD-1 imunorreceptor de inibição (um membro da família B7/CD28 de receptores co-estimuladores) e seu ligando (PD-L1) foram mostrados como sendo acentuadamente regulados ascendentemente durante estados de infecção crônica com vírus de coriomenin- 30 gite linfocitária (LCMV). Estudos adicionais utilizando o modelo LCMV demonstraram que o bloqueio da via PD1/PDL1 aumenta significativamente a resposta de célula T CD8 antiviral endógena durante as fases tardias de infecção crônica quando células T CD8 estão esgota- das. Células T esgotadas são funcionalmente comprometidas e não preparam respostas imunes eficazes após encontro de antígeno. Entretanto, o bloqueio da via PD1/PD-L1 pare- 35 ce reverter o esgotamento e recuperar sua capacidade funcional. Os dados sugerem que esses efeitos persistem bem além do período imediato de tratamento anti-PDL1. Os seguintes experimentos foram realizados para (1) avaliar a capacidade de anti- PDL1 de intensificar a proliferação e sobrevivência de células T CD8 antivirais após transfe- rência adotiva de esplenócitos imunes (memória) para camundongos infectados de forma congênita (veículo), (2) avaliar a funcionalidade de células T CD8 de memória específicas de 5 vírus que expandiram na presença de bloqueio de PD1/PDL1, e (3) determinar a expressão de vários marcadores de diferenciação em células T CD8 específicas de vírus que expandi- ram na presença de bloqueio de PD1/PDL1.

O papel da via PD-1 foi avaliado em um modelo de terapia cito-imune, bem desen- volvido, para infecção viral crônica. O modelo descrito aqui é um paralelo daquele de terapia cito-imune de células T para tumores em relação às barreiras imunológicas que limitam a aplicabilidade dessas terapias (como respostas antitumor/célula T suprimidas ou corrompi- das). Camundongos infectados de forma neonatal ou in utero com LCMV não preparam res- postas imunes específicas de LCMV endógenas e continuam a ter níveis elevados de LCMV infeccioso em sangue e todos os tecidos durante todas as suas vidas. Esses animais são portadores congênitos e são essencialmente tolerantes ao patógeno. Quando esplenócitos a partir de um camundongo imune a LCMV são transferidos de forma adotiva para um porta- dor congênito as células de memória imune transferidas são submetidas rapidamente à ex- pansão e estabelecem uma resposta imune vigorosa contra o vírus. Aproximadamente 2/3 dos animais que recebem terapia cito-imune adotiva continuam a eliminar totalmente a in- fecção quando doses elevadas de esplenócitos são transferidas.

Os seguintes materiais e métodos foram utilizados nesses experimentos.

Camundongos e infecções: camundongos B57BL/6 fêmeas com 4-6 semanas de idade foram adquiridos do Jackson Laboratory (Bar Harbor, Maine). Infecção aguda foi inici- ada por injeção intraperitoneal de 2x105 PFU LCMV Amstrong. Camundongos portadores

congênitos foram criados em Emory University (Atlanta, GA) a partir de colônias derivadas de camundongos infectados de forma neonatal (104 PFU LCMV clone-13, intracerebral).

Imunoterapia adotiva e bloqueio de anticorpo in vivo. 40x106 esplenócitos inteiros a partir de camundongos imunes a LCMV (dia 30-90 pós-infecção) foram isolados e transferi- dos de modo intravenoso para camundongos portadores de LCMV com 6-12 semanas de idade. 200 microgramas de PD-L1 anticamundongo-rato (10F.9G2) foram administrados em cada 3o dia por 15 dias após imunoterapia adotiva.

Citometria de fluxo e coloração de tetrâmero. Tetrâmeros de MHC classe I de H- 2Db complexados com LCMV GP33^1 foram gerados como anteriormente descrito. Todos os anticorpos foram adquiridos da BD/Pharmingen (San Diego, CA). Células mononucleares de 35 sangue periférico e esplenócitos foram isolados e coloridos como anteriormente descrito. Os dados foram adquiridos utilizando um citômetro de fluxo FACSCalibur™ (BD) e analisados utilizando software FIowJoe (Tree Star Inc. Ashland, OR). Coloração de citocina intracelular. Para coloração de citocina intracelular 106 esple- nócitos foram cultivados na presença ou ausência do peptídeo indicado (0,2 μρΛηΙ) e brefel- din A por 5-6 horas a 37°C. Após coloração para marcadores superficiais, as células foram permeabilizadas e coloridas para citocinas intracelulares utilizando a preparação Cyto- 5 perm/Cytofix (BD/Pharmigen).

Os seguintes resultados foram obtidos:

Terapia anti-PD-L1 aumenta o número de células T CD8 específicas de vírus: célu- las mononucleares de sangue periférico (PBMCs) foram isoladas de animais tratados ou não tratados nos dias 7, 11, 15, 22 e 35. Células específicas para o epítopo GP33 Db foram ava- 10 liadas por coloração de tetrâmero. Em dois experimentos independentes verificou-se que animais tratados com terapia anti-PD-L1 durante os 15 primeiros dias após transferência adotiva desenvolveram números significativamente maiores de células T CD8 específicas de LCMV quando normalizadas ao número de células positivas GP33 Db por milhão de PBMCs (figura 14). Esses dados apoiam o papel da via PD-1/PD-L1 em conferir algum grau de su- 15 pressão proliferativa em células T de memória normais. Além disso, esses resultados suge- rem que a inibição terapêutica dessa via poderia aumentar o desenvolvimento e manuten- ção da resposta imune secundária gerada após transferência adotiva em um cenário de in- fecção crônica com elevada carga de antígeno.

Bloqueio de PD-1/PD-L1 aumenta a funcionalidade de células T CD8 específicas de antígeno: esplenócitos foram isolados a partir de animais tratados e não tratados no dia 17 pós-transferência adotiva e analisados em relação à expressão de citocinas inflamatórias (IFN-gama e TNF alfa) ou CD107ab (proteína de membrana associada lissomal, LAMP). Através de todos os epítopos CD8 definidos, verificou-se que a expressão de IFN gama é intensificada em animais que recebem bloqueio anti-PD-L1 em comparação com animais não tratados (figura 15a). Adicionalmente, a co-expressão de IFN gama e TNF alfa e CD107ab foi também aumentada após terapia anti-PD-L1 (figuras 15B-15E). Essas desco- bertas indicam que esplenócitos de memória transferidos de forma adotiva que expandem na presença de bloqueio de PD-L1 são funcionalmente superiores, em termos de produção de citocina inflamatória e liberação de grânulos citolíticos, em comparação com esplenócitos a partir de animais não tratados.

Exemplo 17: respostas de célula B de murino durante bloqueio de PD-1

Os seguintes experimentos foram realizados para determinar se o bloqueio de PD-1 aumenta as respostas de célula B durante infecção de LCMV crônica. As respostas tanto de célula B como célula T são críticas no controle de infecção de LCMV crônica, desse modo a melhora das respostas de célula B em camundongos infectados com LCMV crônico pode ajudar a diminuir a carga viral e aumentar a função de célula T.

O seguinte material e métodos foram utilizados nesses experimentos: Camundongos e vírus: camundongos C57B1/6 fêmeas com quatro a seis semanas de idade foram adquiridos de Jackson Laboratory (Bar Harbor, Maine). Antes da infecção, camundongos com LCMV tiveram as células T CD4 esgotadas por administração de anti- corpo gk1.5. Dados anteriores demonstram que a administração de 500ug de gk1.5 dias -2 5 e O antes de desafio viral resulta em 95-99% de diminuição no número de células T CD4 no baço e Iinfonodo com os números de células T CD4 lentamente recuperando em 2 a 4 se- manas. Os camundongos que receberam 2x106 PFU da cepa Clone-13 de LCMV por meio intravenoso no dia O iniciam infecção crônica. Os títulos de vírus foram determinados por um ensaio de placa de 6 dias em células Vero.

Detecção de ASC por ELISPOT: suspensões de célula única de medula óssea e

baço tiveram as hemácias esgotadas por 0,84% de tratamento de NH4CL e resuspensas em RMI suplementado com 5% FCS. Células de secretar anticorpo foram detectadas por reves- timento das células sobre placas de filtração de Multiscreen HA com 96 cavidades de fundo de nitrocelulose (Millipore). As placas foram anteriormente revestidas com 100ul de 5ug/ml 15 de IgG+IgM+lgA anticamundongo de cabra (Caltag/lnvitrogen) durante a noite a 4°C. As placas foram então lavadas 3x com PBS/0,2"tween, seguido por 1x com PBS e bloqueadas por 2 horas com RPMI +10% FCS para evitar ligação não específica. O meio de bloqueio foi substituído com 100ul de RPMI 5% FCS e 50ul de 1x107 células/ml foi revestido em dilui- ções de três vezes em série através da placa. Placas foram incubadas por 6 horas a 37°C e 20 5% CO2. As células foram removidas e as placas foram lavadas 3x com PBS e 3x com PBS/0,2% tween. As cavidades foram então revestidas com IgG anticamundongo de cabra biotinilado (Caltag/lnvitrogen) diluído 1/1000 em PBS/0,2%tween/1%FCS e incubadas du- rante a noite a 4°C. O anticorpo secundário foi removido e placas foram lavadas 3x com PBS/0,2% tween. Avidina-D HRP (Vector) diluído 1/1000 em PBS/0,2%tween/1 % FCS foi 25 incubado por uma hora em RT. As placas foram lavadas 3x com PBS/0,2%tween e 3x com PBS e a detecção foi realizada por adicionar 100 ml de substrato de Cromogeno-H2O2- pero- xidase de raiz forte. O substrato foi preparado por adicionar 150 ul de uma solução AEC recentemente feita (10 mg de 3-amino-9-etil carbazol (ICN) por ml dissolvido em dimetil for- mamida (Sigma) a 10 ml de 0.1 M de tampão de acetato de sódio pH 4,8), filtrando o mesmo 30 através de uma membrana com 0,2 mm de tamanho de poro, e imediatamente antes do uso adicionando 150 ml de 3% H2O2. Pontos vermelhos granulares apareceram e 3 a 5 minutos, e a reação foi terminada por enxágüe completo com água de torneira. Os pontos foram e- numerados com um estereomicroscópio equipado com uma Iuz branca vertical.

Determinação de células totais de medula óssea: para cálculo da resposta total de ASC em medula óssea, a resposta foi multiplicada pelas células de medula de dois fêmures por um coeficiente de 7,9, uma vez que estudos de distribuição de 59Fe mostraram que 12,6% de medula óssea total de camundongo são localizados nos dois fêmures combina- dos. Nenhuma diferença foi detectada entre as atividades de ASC de células de medula ós- sea a partir do fêmur, tíbia, úmero, costela ou esterno. Tipicamente, dois fêmures de adultos fornecem 2,0x107 a 2,5x107 de células totais de medula óssea.

Citometria de fluxo: anticorpos diretamente conjugados foram adquiridos de Phar- 5 mingen (anti-B220, anti-CD4, anti-CD138 anti-CD95, anti-Ki67, anti-lgD biotinilado) ou Vec- tor Iabs (PNA). Estrepavidina-APC foi adquirido de Molecular Probes. Toda coloração foi realizada a 4°C em PBS suplementado com 1% FCS e 0,1% de azida de sódio. As células foram então fixadas em 2% de formaldeído (em PBS) e analisadas em um FACS Calibur utilizando software CeIIQuest (BD Biosciences).

Análise estatística: os testes foram realizados utilizando Prism 4.0 (GraphPad, San

Diego, CA). As estatísticas foram feitas utilizando teste T não emparelhado de duas caudas com 95% de limites de confiança.

Números totais de células que secretam anticorpo no baço são aumentados após bloqueio de PD-1 in vivo: camundongos infectados com LCMV clone-13 foram tratados com anti (a) PD-L1 aproximadamente 60 dias pós-infecção. Os camundongos receberam 200ug de aPD-L1 em cada terceiro dia por duas semanas. No dia 14 de tratamento com aPD-L1, os camundongos foram sacrificados e o número de células que secretam anticorpo no baço foi medido por ELISPOT e coloração citométrica de fluxo. Em três experimentos separados, camundongos tratados com aPD-L1 mostraram níveis significativamente aumentados de células que secretam anticorpo (ASC) no baço (p=0,011) em comparação com camundon- gos não tratados (figura 16a). ASC pode ser diferenciado a partir das células B no baço por sua regulação descendente do marcador de célula B B220 e por expressão de CD138 (syn- decam-1). De acordo com os resultados de ELISPOT, números aumentados de células CD138+ B220low/Int foram vistos em camundongos infectados tratados com aPD-L1 (figura 16b).

Tratamento de camundongos infectados com LCMV crônico com <xPD-L1 não leva a níveis elevados de ASC de medula óssea. Foi determinado se as células que secretam anticorpo na medula óssea foram também intensificados durante tratamento com aPD-L1. A maioria das células de plasma de vida longa reside na medula óssea, e essas células de 30 plasma são críticas para manutenção a longo prazo de níveis de anticorpo de soro. Camun- dongos infectados com LCMV crônico foram tratados com aPD-L1 aproximadamente 60 dias após infecção. No dia 14 de tratamento com aPD-L1, os níveis de ASC de medula ós- sea e baço foram medidos por ELISPOT. Embora houvesse números elevados de ASC no baço duas semanas após o tratamento, não houve alteração nos números de ASC na medu- 35 Ia óssea nesse ponto de tempo (figura 17).

O Co-tratamento de camundongos infectados com LCMV crônico com aPD-L1 e 118aCTLA-4 resulta em aumentos sinergistas em níveis ASC esplênicos: foi adicionalmente pesquisado se o bloqueio de sinalização com outra molécula reguladora negativa, CDLA-4, aumentaria o efeito visto durante o bloqueio de PD-1. Pensa-se que a ligação de CTLA-4 a B7 tanto compete com a molécula co-estimuladora positiva CD28 e/ou fornece sinais de TCR que antagonizam diretamente. Os camundongos infectados com LCMV Clone-13 foram 5 tratados com aPD-L1, aCTLA-4, ambos ou deixados não tratados, e duas semanas pós- tratamento os níveis de células que secretam anticorpo foram medidos por ELISPOT. Embo- ra o tratamento com aCTLA-4 não mostrasse impacto sobre os níveis de ASC, o co- tratamento de aPD-L1 com aCTL-4 levou a um aumento sinergista em ASC acima daquele visto com o tratamento de aPD-L1 sozinho (figura 18).

Proliferação de células T CD4 e Célula B intensificada e atividade de centro germi-

nal em camundongos tratados com aPD-L1: a análise citométrica de fluxo de populações de baço em camundongos crônicos tratados com aPD-L1 mostrou níveis aumentados de proli- feração por coloração Ki-67 aumentada tanto em células T CD4 como células B. Células B na reação de centro germinal podem ser identificadas no baço por níveis elevados de PNA e 15 coloração FAS. Após tratamento com aPD-L1, houve um grande aumento na frequência de células PNA+FAS+B em comparação com os controles não tratados (figuras 19a-19b).

Exemplo 17: expressão de PD-1 em células T humanas

Células T CD8 são essenciais para o controle de muitas infecções crônicas. Como revelado aqui, essas células T CD8 se tornam esgotadas após estimulação antigênica crôni- 20 ca, que é caracterizada pela indução de um estado hipoproliferativo e perda da capacidade de produzir citocinas antivirais. Células T esgotadas têm elevada expressão de morte pro- gramada-1 (PD-1) e também PD-1 é regulado ascendentemente por ativação de célula T e pode ser desencadeado pelos Iigandos de PD-1, PD-L1 e PD-L2. É revelado aqui que a via de inibição de PD-1 é m mediador importante de esgotamento de célula T CD8 durante uma 25 infecção viral crônica em camundongos. Células T CD8 específicas de vírus mantiveram níveis elevados de expressão de PD-1 em resposta a uma infecção crônica, porém não em resposta a uma infecção que é eliminada com sucesso. O bloqueio da interação de intera- ção de PD-1/PD-L1 resultou em proliferação aumentada de células T CD8, produção de ci- tocinas antivirais e uma redução e carga viral.

Foi avaliado se células T CD8 específicas para infecções crônicas em humanos ex-

pressam PD-1, e se o bloqueio de PD-1 aumenta as respostas de células T CD8. Esse es- tudo (1) determinou o padrão de expressão de PD-1 em subconjuntos de células mononu- cleares de sangue periférico humano (PBMC): CD4, CD8, célula B, NK, monócitos, DC; (2) determinou o fenótipo de células T CD8 e CD4 que expressam PD-1; (3) determinou a ex- 35 pressão de PD-1 em antígeno persistente crônico [vírus Epstein-Barr (EBV) e citomegaloví- rus (CMV)] e células específicas de antígeno resolvido agudo (influenza e vacínia) ; e (4) determinou o efeito de bloquear interação de PD-1/PD-L1 sobre a proliferação de células específicas de antígeno.

Os seguintes materiais e métodos foram utilizados nesses estudos:

Amostras de sangue: amostras de sangue periférico foram obtidas de 36 indivíduos

5 saudáveis que eram soropositivos para vírus de EBV1 CMV1 influenza ou vacínia. Esses su- jeitos foram selecionados com base em sua expressão de alelo HLA casando tetrâmeros HLA classe I específicos para proteínas de vírus de vacínia, influenza, CMV ou EBZ. PBMC foi isolado a partir das amostras de sangue sobre o meio de separação de linfócito (Cellgro, Herndon, VA).

Anticorpos, peptídeos e tetrâmeros: PD-1 anti-humano conjugado com ficoeritrina

(EH12, IgGI de camundongo) e PD-L1 humano não conjugado (29E.2A3, lgG2b de camun- dongo) foram obtidos. Anticorpos conjugados de forma direta foram obtidos de Beckman Coulter, San Diego, CA (anti-CD3, CD11a, CD27, CD28, CD38, CD45RA, CD57, CED62L e granzima-B), BD Pharmingen, San Diego, CA (CD8, CD95, CD195, HLA-DR, Ki-67 e perfo- 15 rin) e R&D Systems, Minneapolis, MA (CCR7). Peptídeos foram feitos no lab. de síntese de peptídeo na Emory University1 Atlanta, GA. As construções de plasmídeo que expressam HLA-A2, -B7 e -B8 foram gentilmente fornecidas pelo NIH Tetramer Core Facility, Atlanta, GA e tetrâmeros de peptídeo/MHC classe I rotulados com APC contendo epítopos CTL de EBV (HLA-A2-GLCTLVAML (SEQ ID NO: 36), HLA-B8-RAKFKQLL (SEQ ID NO: 37) e 20 FLRGRAYGL (SEQ ID NO: 38)), CMV(HLA-A2-NLVPMVATV (SEQ ID NO: 39), HLA-B7- TPRVTGGGAM (SEQ ID NO: 40)), influenza (HLA-A2-GILGFVFTL (SEQ ID NO: 41)) e va- cínia (HLA-A2-CLTEYILWV (SEQ ID NO: 42) e KVDDTFYYV (SEQ ID NO: 43)).

Imunofenotipagem e proliferação de CFSE: Amostras de sangue integral humanas heparinizadas (200ul) foram coloridas com anticorpos ou tetrâmetros e então analisadas (Ibegbu e outros, J Immunol.174: 6088-6094, 2005) em um FACS Calibur utilizando software CeIIQuest software ou em um citômetro de fluxo LSRII utilizando software FACSDiva (BD Immunocytometry Systems). Para ensaios CFSE, PBMC (2x106/ml) foram lavados comple- tamente e rotulados com 3uM carbóxi-diacetato de fluoresceína, éter de succinimidil (CFSE, Molecular Probes) em temperatura ambiente no escuro por 5 min. (vide, por exemplo, Wes- ton and Parish, J Immunol Methods 133:87-97, 1990). As PBMC rotuladas com CFSE foram estimuladas com peptídeo individualmente (1ug/ml) ou peptídeo com anticorpo anti-PD-L1 (10ug/ml). Culturas de controle consistiram em PBMC individualmente PBMC com anticorpo anti-PD-L1 ou PBMC com um anticorpo de controle de isotipo (lgG2b; 10μg/ml). Após uma incubação de 6 dias a 37°C, as células foram lavadas e coloridas com tetrâmero juntamente com anticorpos anti-CD3 e anti-CD8 extracelularmente.

Os seguintes resultados foram obtidos: Padrão de expressão de PD-1 em subconjuntos de PBMC: a expressão de PD-1 foi examinada em subconjuntos de PBMC em indivíduos saudáveis. Foi observado que células T CD8+, células T CD4+ e monócitos (CD14+) expressam níveis elevados de PD-1, células B (CD20+) expressam níveis baixos de PD-1 e células NK (CD56+) e DC (CD11c+) não ex- 5 pressamPD-1.

PD-1 é preferencialmente expresso entre células T CD4 e CD8 de memória efetora: células T CD8 a partir de indivíduos normais saudáveis foram examinadas em relação a co- expressão de PD-1 com vários marcadores fenotípicos associados a estado de diferencia- ção e função (figura 20A). Em resumo, células T CD8 de fenótipo de memória central e sim- 10 pies somente expressaram níveis baixos de PD-1, ao passo que células T CD8 que expres- saram vários marcadores associados a efetor/memória efetora/ ou fenótipo esgotado tam- bém expressaram níveis elevados de PD-1 (figura 20B). Esses dados sugeriram que PD-1 era preferencialmente expresso entre células T CD8 de memória efetora. Quando as células T CD4 foram examinadas, os requerentes encontraram tendência similar (figura 20C).

PD-1 é regulado ascendentemente em células T CD8 de memória específicas de an-

tígeno persistente: para avaliar se as células T CD8 específicas para infecções crônicas em humanos mostram expressão aumentada de PD-1 expressão de PD-1 em células T CD8 de memória específicas para vírus persistente crônico (EBV e CMV) foi comparada com células T especificas de vírus agudo (influenza e vacínia), em 36 indivíduos saudáveis por colora- 20 ção com tetrâmeros específicos de vírus de EBV, CMV, influenza e vacínia (figuras 21A- 21B). A figura 21A mostra PD-1 GMFI representativo de células T CD8 específicas de vírus de EBV, CMV, influenza e vacínia. Verificou-se que a expressão de PD-1 aumentou em cé- lulas T CD8 específicas de EBV do que células T CD8 específicas de vírus de influenza (p=0,0035) e vacínia (p=0,0036) (figuras 21A-21B). Similarmente, células T CD8 específicas 25 de CMV expressaram mais frequentemente PD-1 do que influenza (p=0,0431) e vacínia (p=0,019) (figuras 21A-21B). Esses resultados sugerem uma correlação entre expressão de PD-1 e experiência de antígeno.

O bloqueio Anti-PD-LI aumenta a proliferação de células T CD8 específicas de vírus persistente crônico: foi avaliado se o bloqueio de PD-1 aumenta as respostas de célula T CD8 específicas de antígeno persistente similares aos resultados observados em camun- dongos. Células rotuladas com CFSE foram estimuladas com peptídeos específicos de vírus de EBV, CMV, influenza ou vacínia na presença ou ausência de anticorpos anti-PD-L1. Após

6 dias, a percentagem de células CFSEl0 de tetrâmero+ e células CFSEl0 CD8+ foi compa- rada entre culturas que eram estimuladas com peptídeo individualmente e culturas que eram estimuladas com peptídeo e subsequentemente bloqueadas com anti-PD-L1. Gráficos de citometria de fluxo representativos com proliferação de células T CD8 específicas de EBV e CMV são mostrados na figura 22A. Dados agregados a partir de indivíduos soropositivos de CMV (n=5), EBV (η=6), influenza (η=2) e vacínia (η=2) são mostrados na figura 22B. O blo- queio da interação de PD-1/PD-L1 com anticorpo anti-PD-L1 resultou em proliferação au- mentada de células T CD8 específicas de CMV e EBV ao passo que células T CD8 específi- cas de vírus de influenza e vacínia não mostraram proliferação após bloqueio com anti-PD- 5 L1. Esses resultados mostram que na presença de peptídeo mais anticorpo de bloqueio anti- PD-L1, há um aumento de até 3,5 vezes na frequência de células T CD8 específicas de CMV ou EBV em comparação com estimulação com o peptídeo individualmente. Foi avalia- do se a proliferação de células T CD8 específicas de antígeno após bloqueio de anticorpo anti-PD-L1 é relacionada à expressão de PD-1 por essas células. Os dados indicam uma 10 correlação positiva entre expressão de PD-1 e proliferação de células T CD8 específicas de antígeno (p=0,0083) (figura 22C).

Exemplo 18: linfócitos que infiltram no fígado em infecção de HCV humana crônica exibem um fenótipo esgotado com expressão de PD-1 elevada e CD127 baixa

Os experimentos descritos abaixo documentam que células T específicas de HCV 15 periférico, de infecção por HCV crônica, expressam níveis elevados de PD-1 e que o blo- queio da interação de PD-1/PD-L1 levou a uma capacidade proliferativa aumentada. De mo- do importante, células T específicas de HCV intra-hepática não somente expressam níveis elevados de PD-1 como também IL-7 receptor alfa diminuído (CD127), um fenótipo esgota- do que era específico de antígeno de HCV e dividido em compartimentos com o fígado, o 20 sítio de replicação viral.

Atualmente, nenhuma vacina existe para evitar infecção por HCV e a única terapia li- cenciada, alfa interferon (IFNa), quer individualmente ou em combinação com o análogo de nucleosídeo ribavirin é caro, associado a, no máximo, somente uma taxa de eliminação de 50% para o genótipo mais prevalente (genótipo 1) e complicado por efeitos colaterais signifi- 25 cativos. A escassez de opções terapêuticas anti-HCV eficazes destaca a necessidade de intervenções eficazes direcionadas a aumentar ou suplementar a resposta imune natural que, individualmente ou em combinação com terapia de droga antiviral, pode evitar as con- seqüências prejudiciais de infecção por HCV.

Atualmente, pouco se sabe sobre a expressão de PD1 e seu papel em esgotamento de células T em infecção por HCV crônica, particularmente no sítio de infecção ativa, o fíga- do. O presente estudo foi realizado para entender de forma melhor o fenótipo de célula T na infecção por HCV por medir a expressão de PD-1 em células T CD8+ específicas de antíge- no tanto no fígado como no sangue periférico de pacientes com infecção por HCV crônica.

Os seguintes materiais e métodos foram utilizados nesses estudos:

Sujeitos: dezessete pacientes com infecção por HCV crônica (anticorpo HCV e HCV

PCR positivo) e negativo para HIV por classificação de anticorpo foram inscritos no estudo. Todos os pacientes eram simples para terapias antivirais de HCV antes da inscrição. Sete de quinze pacientes eram positivos para HLA-A2 por análise de FACS. As características dos pacientes são resumidas na tabela 1.

Tabela 1. Dados clínicos e demográficos de cohort de pacientes

Identificação sexo idade HLA-A2 Genótipo Carga viral de ALT do paciente de HCV linha de base (lU/ml) 153 HCV* M 43 + 2b 7.340.000 25 178 HCV* F 48 + 2 18.330.000 62 179 HCV M 54 - 1a 197.000 197 183 HCV F 56 + 1a 1.170.000 45 190 HCV M 52 - 1a 5.990.000 27 193 HCV M 66 + 1a 16.120.000 30 601 HCV M 60 - 1b 4.690.000 25 602 HCV M 48 - 1a 586.000 80 603 HCV M 58 + 1a 1.820.000 36 604 HCV M 58 - 1a 2.850.000 57 605 HCV F 30 - 1 819.000 57 606 HCV M 50 - 1b 591.000 18 607 HCV M 59 + 3a 343.000 31 608 HCV M 57 - 1b 395.000 16 609 HCV M 55 + 1a 833.000 67 611 HCV M 53 - 1a 1.220.000 88 613 HCV M 59 - 1b 6.160.000 40 5 Teste de anticorpo de HCV, determinação de carga viral e genotipagem: Teste de

anticorpo de HCV por ELISA foi executado utilizando um kit de acordo com as instruções do

fabricante (Abbott Diagnostics, Abbott Park, III; Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). A

quantificação de carga viral de HCV foi executada utilizando um ensaio RT-PCR em tempo

real (Roche Molecular Systems, Alameda CA). A genotipagem de HCV foi executada utili-

zando um ensaio de RT-PCR em tempo real (Abott Diagnostics, Abbott Park, III) e utilizando

um ensaio de sonda de linha (LIPA) (Bayer Diagnostics, Research Triangle Park, NC).

Células mononucleares de sangue periférico: sangue anticoagulado com heparina e

EDTA (50-70 ml) foi coletado a partir de cada paciente e utilizado diretamente para colora-

ção de FACS ou para isolamento de PBMC. PBMCs foram isolados utilizando gradiente de

densidade PLUS Ficoll-Paque (Amersham, Oslo, Noruega), lavados duas vezes em PBS, e

analisados imediatamente ou criopreservados em meios contendo 90% de soro de vitelo

fetal (HycIone) e 10% de sulfóxido de dimetila (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO).

Biópsia de fígado: o tecido de fígado foi obtido por biópsia de agulha guiada por ul-

tra-som ou através de técnica fluoroscópica transjugular e imediatamente colocado em meio

RPMI-1640 (Gibco) contendo 10% de soro de vitelo fetal (Hyclone, Logan, UT) para ensaios imunológicos. Outro fragmento foi fixado em formalina para exame histológico.

Isolamento de célula T intra-hepática: a amostra de biópsia de fígado obtida em meio RPMI-1640 (Gibco, Carlsbad, CA) contendo 10% de soro de vitelo fetal (Hyclone, Logan, UT) foi lavada três vezes com o mesmo meio para remover resíduos de células e RBCs. O isolamento de linfócitos que infiltram em fígado foi executado utilizando um sistema de de- sagregação mecânico, automatizado (Medimachine, Becton Dickinson1 San Jose, CA). A amostra foi inserida em um Medicon de 50 um e inserida no Medimachine e passada por 15 5 segundos. Células desagregadas foram removidas utilizando uma seringa no orifício de se- ringa. O Medicon foi enxaguado duas vezes com meio RPMI (Gibco, Carlsbad, CA) conten- do 10% de soro de vitelo fetal (Hyclone, Logan, UT) para assegurar recuperação máxima de células. As células foram utilizadas imediatamente para coloração FACS.

Anticorpos, tetrâmeros de HLA-A2 e citometria de fluxo: as células foram coloridas com FITC1 PE, PerCP e anticorpos monoclonais rotulados com APC ou tetrâmeros de acor- do com as instruções dos fabricantes e a citometria de fluxo executada utilizando FACS Ca- Iibur (Becton Dickinson, San Jose, CA). Os dados de FACS foram analisados com software FIowJo (Treestar). Os seguintes anticorpos monoclonais a partir de BD Pharmingen (BD Biosciences, San Jose, CA) foram utilizados: Anti-CD8 PerCP e anti-CD45RA APC. Anti- CD62L FITC, CD3 FITC e CD127 PE foram obtidos da Beckman Coulter (Fullerton, CA). Anticorpo conjugado anti-PD-1 PE (clone EH12) foi gerado como descrito (Dorfman e outros, Am. J. Surg. Pathol. 30:802-810, 2006). Tetrâmeros de HLA-A2 foram específicos para os seguintes epítopos de célula T CD8+: HCV 1073: CINGVCWTV (SEQ ID NO: 44); HCV- 1406: KLVALGINAV (SEQ ID NO: 45). A coleta citométrica de fluxo foi executada em um FACSCaliber™ (BD Biosciences, San Jose, CA) e a análise executada utilizando software FIowJo software (v8.1.1).

Rotulação de CFSE e bloqueio de anticorpo: 10xO6 PBMCs foram lavados com PBS e rotulados com 3 uM CFSE (Molecular Probes). As células foram ajustadas para 1x106 cé- lulas/ml e cultivadas na presença de 2ug/ml de peptídeo de A2-HCV 1073 (CINGVCWTV, 25 SEQ ID NO: 44). 10U/ml de IL-2 foram adicionados no dia 3 pós-estimulação. Um controle não estimulado foi incluído em cada ensaio. Anticorpos de bloqueio (anti- PD-L1; clone # 29E e anti-PD-1; clone # EH12 (Dofman e outros, supra) foram adicionados a culturas de células em uma concentração de 10pg/ml no momento de estimulação. As células foram incubadas por 6 dias, colhidas e coloridas com anticorpos de superfície e tetrâmeros e ana- 30 Iisadas por citometria de fluxo.

Análise estatística: os resultados foram formados em gráfico e analisados utilizando GraphPad Prism (v4). As comparações feitas no mesmo paciente foram executadas utili- zando testes t emparelhados. As comparações feitas entre pacientes foram feitas utilizando testes t não emparelhados.

Os seguintes resultados foram obtidos:

Expressão de PD-1 em células T CD8+ específicas de antígeno HCV: dezessete pa- cientes com infecção por HCV (todos HIV negativos) foram estudados (tabela 1). Quinze pacientes foram submetidos à amostragem tanto de sangue como de fígado para fenotipa- gem por análise citométrica de fluxo, e nenhum deles era tratado com terapia antiviral far- macológica antes da inscrição no estudo.Sete pacientes no cohort eram HLA-A2 positivos e demonstraram uma população de células T CD8+ específicas de HCV na periferia de colo- 5 ração de tetrâmero de HLA (tabela 1). Essas células T CD8+ específicas de HCV foram ava- liadas em relação à expressão de PD-1 (figura 23A). O nível de expressão de PD-1 sobre células T CD8+ totais no sangue periférico de doadores saudáveis não era significativamen- te diferente daquele do grupo total de células T CD8+ periféricas a partir de pacientes infec- tados com HCV (figura 23B). Ao contrário, a maioria das células T CD8+ positivas de tetrâ- 10 mero positivo específicas para HCV amostradas a partir do sangue periférica era PD-1 posi- tiva (média 85%, SEM 3,6) (figura 23A) com expressão significativamente mais elevada do que aquela da população total de células t CD8+ (p<0,0001) (figura 23B). A expressão de moléculas de função de diferenciação, co-estimuladora, de tráfego e efetora sobre células T CD8+ específicas de antígeno também foi pesquisada. As células de tetrâmero positivo es- 15 pecíficas de HCV apresentam um fenótipo de memória (CD11a elevado, CD45RA baixo), marcadores de diferenciação prematura (CD27 elevado, CD28 elevado, expressão interme- diária de CCR7 e CD62L) e baixos níveis de mediadores de função efetora de granzima B e perforin. De modo interessante, essas células T de tetrâmero positivo de HCV no sangue periférico expressaram níveis elevados de CD127 (cadeia α de receptor IL-7), um marcador 20 fenotípico que quando expresso em baixos níveis identifica diferenciação de célula T de memória prejudicada.

Para determinar se o fenótipo de células T CD8+ era diferente na definição de infec- ção não crônica, células T específicas de gripe foram examinadas em cinco doadores de HLA-A2+ saudáveis que não eram infectados com HCV. A percentagem de células T CD8+ 25 tetrâmero+ de gripe periférico que expressaram PD-1 era 49% (SEM 14.1) (figura 23C). Cin- co dos sete pacientes de HCV crônico HLA-A2 positivo foram também identificados por aná- lise de tetrâmero como tendo células T CD8+ específicas de gripe. A percentagem de célu- las T específicas de gripe que expressam PD-1 nesses pacientes com HCV infectados de forma crônica não era significativamente diferente da mesma população em doadores sau- 30 dáveis (figura 23C). De forma importante, como cinco dos sete pacientes com HCV HLA- A2+ tinham também células T CD8+ específicas de gripe detectáveis, uma comparação po- de ser feita, em cada paciente, de PD-1 para células T específicas para uma infecção não crônica (gripe) e crônica (HCV). A diferença entre expressão de célula T específica de HCV e específica de gripe de expressão de PD-1 era significativa (figura 23C). A percentagem de 35 células T CD8+ específicas de HCV que expressam PD-1 (média 83%, SAEM 6.4) foi maior do que a percentagem de células T CD8+ específicas de PD-1+Gripe (49%, SEM 12,3) (p=0,048) (figura 23C). Expressão de PD-1 em sangue periférico humano e linfócitos que infiltram no fígado: biópsias de fígado e sangue periférico foram analisadas em relação à expressão de PD-1 a partir de quinze pacientes cronicamente infectados com HCV. A análise citométrica de fluxo representativa a partir de cinco pacientes é mostrada na figura 24A. Embora no sangue peri- 5 férico, 27% (SEM 3.4) de células T CD8+ eram PD-1+, a frequência de tais células foi au- mentada duas vezes (57%, SEM 3.6) no fígado (figura 24B). Consequentemente, o fígado é enriquecido em células que expressam níveis elevados de PD-1. Embora células simples devam expressar níveis elevados tanto de CD26L como CD45RA, no fígado a maioria das células T CD8+ era CD26L baixo/CD45RA baixo compatível com um fenótipo de memória 10 (figura 24C). A análise especificamente dessa população de memória tanto no fígado como no sangue periférico mostrou que a expressão de PD-1 foi elevada no fígado em compara- ção com o sangue periférico (figura 24C). Esses dados sugerem que o aumento na percen- tagem de células que expressam PD-1 nas células T intra-hepáticas não é meramente devi- do à ausência da população simples nesse compartimento. Em vez disso, há um enriqueci- 15 mento preferencial de células de memória efetora (CD2L baixo/CD45RA baixo) T PD1+CD8+ no fígado em comparação com o sangue periférico (figura 23C).

Expressão de CD127 em sangue periférico humano e linfócitos que infiltram no fíga- do. IL-7 é necessário para manutenção de células T CD8+ de memória (Kaech e outros, Nat Immunol 4:1191-8, 2003) e a cadeia alfa de seu receptor, CD127, é regulada descendente- mente em células T específicas de antígeno em infecções de vírus de herpes gama e LCMV persistentes (vide, por exemplo, Fuller e outros, J. Immunol. 174:5926-30, 2005). Essa perda de CD127 durante infecção crônica correlaciona com produção de citocina prejudica, susce- tibilidade aumentada a apoptose, e uma redução na capacidade das células T CD8+ especí- ficas de vírus de memória persistirem no hospedeiro. Por conseguinte, a resolução de infec- ção de vírus de hepatite B (HBV) aguda correlaciona com a regulação ascendente de ex- pressão de CD127 e perda concomitante de expressão de PD-1 (Boettler e outros, J. Virol. 80:3532-40, 2006). De modo interessante, nos pacientes com HCV crônicos, somente 20% (SEM 4.8) do total de células T CD8+ periféricas eram CD127 negativas, porém nos infiltra- dos de célula T CD8+ hepáticos, essa percentagem aumentou significativamente para 58% (SEM 4.4) (figura 24D). Consequentemente, o fígado é enriquecido em células que expres- sam um fenótipo esgotado com predominância de células com baixo CD127 e alto PD-1. Esses dados sugerem que células T CD8+ que infiltram no fígado em pacientes com HCV crônica não espelham de forma fenotípica a população de células T CD8+ periféricas. No cenário de infecção por HIV onde o vírus infecta células T e monócitos no sangue periférico, níveis baixos de CD127 são associados a defeitos de célula T de memória ou funcional (Boutboul e outros, Aids 19; 1981-6, 2006). Nesse estudo, a divisão em compartimentos, hepática, das células que mostram esse fenótipo esgotado sugere que o fenótipo está inti- mamente ligado ao sítio de replicaçâo viral persistente.

Expressão de CD127 e PD-1 em células T CD8+ específicas de antígeno de HCV no fígado. Dois dos pacientes de HLA-A2 no cohort tiveram também uma população específica de HCV identificável por coloração de tetrâmero no fígado (figura 25). A expressão de PD-1 e CD127 foi diretamente comparada em células T CD8+ de tetrâmetro positivo específicas de HCV no fígado versus periferia desses indivíduos. Células T CD8+ específicas de HCV a partir da periferia eram principalmente PD-1 positivas (média 85%, SEM 3.6) e CD127 posi- tivas (média 84%, SEM 4.0), enquanto as células T CD8+ específicas de HCV hepáticas eram na maioria PD-1 positivas (média 92%) porém somente raramente CD127 positivas (média 13%) (figura 25). No sítio de replicaçâo viral, pareceu haver uma expansão de célu- las CD127 negativas que expressam níveis elevados de PD-1. As células T CD8+ específi- cas de antígeno periféricas expressam diferencialmente CD127 em comparação com o compartimento intra-hepático poderia ser relacionado ao nível ou timing de exposição de antígeno necessário para causar regulação descendente de CD127. Em infecção de ca- mundongos por LCMV, a exposição à carga de antígeno persistente com infecção crônica, CD127 foi persistentemente regulado descendentemente ao passo que exposição de curta duração a antígeno de LCMV utilizando GP33 somente suprimiu temporariamente a expres- são de CD127 e falhou em induzir esgotamento de células T (Lang e outros, Eur J Immunol 35:738-45, 2005). A dependência na disponibilidade de antígeno e o tempo de exposição também foram observados como afetando a expressão de CD26L e CD127, ao passo que antígeno persistente levou à regulação descendente persistente tanto de CD62L como CD127 (Bachmann e outros, J. Immunol. 175: 4686-96, 2005). Sem se limitar à teoria, em infecção por HCV crônica, as poucas células T CD8+ específicas de HCV detectadas na periferia podem não ser continuamente expostas a antígeno suficiente para manter baixos níveis de CD127. Desse modo, as células T podem “acreditar” que os vírus foram elimina- dos.

Bloqueio de PD-1/PD-L1 leva à expansão aumentada de células T CD8+ de tetrâme- ro positivo específicas de HCV. A evidência a partir da população de pacientes sugere que o 30 bloqueio da interação de PD-1/PD-L2 com anticorpo anti-PD-L1 ou anti-PD1 aumenta a ca- pacidade proliferativa de células T específicas de HCV (figura 26). A adição de anticorpos de bloqueio na presença de peptídeo específico de HCV e IL-2 resultou em um aumento de quatro vezes em expansão das células T específicas de HCV, como demonstrado por moni- toração da frequência de células T CD8+ rotuladas com tetrâmetro de éster de succinimidil 35 carboxi fluoresceína (CFSE)lowapós estimulação com peptídeo cognato por 6 dias.

Os resultados mostram que no sítio de infecção, o fígado, a frequência de células T CD8+ específicas de HCV que expressam PD-1 é elevada. Em segundo lugar, a maioria das células T CD8+ específicas de HCV a partir do sangue periférico de pacientes com infecção por HCV crônica expressa níveis elevados de CD127. O fenótipo de células T em infecção por HCV crônica foi caracterizado por estudo da expressão da molécula de PD-1 ligada à função efetora prejudicada e esgotamento de célula T. Os resultados mostram que a maioria 5 de células T especificas de HCV no compartimento intra-hepático expressam PD-1 porém não tem CD 127, um fenótipo compatível com esgotamento de células T. Desse modo, anta- gonistas de PD-1 são de uso como agentes terapêuticos para o tratamento de infecção por HCV.

Exemplo 19: bloqueio de PD1 induz expansão de células CD8 específicas de SIV in

vitro

Células T CD8 antivirais desempenham um papel crítico no controle de infecções por HIV/SIV. Um papel central para as células T CD8 foi mostrado por re-emergência viral du- rante depleções in vivo transientes em macacos infectados com SIV. Compatível com isso, estratégias de vacina contemporâneas projetadas para eliciar freqüências elevadas de célu- 15 Ias T CD8 antivirais continham desafios de SIV e SHIV patogênicos em macacos (vide, por exemplo, Barouch e outros, Science 290, 486-92 (2000); Casimiro e outros, J. Virol. 79, 15547-55 (2005)).

Tanto a função como a frequência de células T CD8 antivirais são cruciais para o controle de infecções virais crônicas como HIV (Migueles e outros Nat Immunol. 3, 1061-8, 20 2002) e vírus de coriomeningite linfocitária (LCMV). Células T CD8 antivirais efetivas possu- em um número de propriedades funcionais que incluem a capacidade de produzir citocinas diferentes, potencial citotóxico e potencial proliferativo elevado e apoptose baixa. Em infec- ções virais crônicas as células T CD8 específicas de vírus são submetidas a esgotamento que é associado à perda de muitas dessas funções (Zajac e outros, J. Exp. Med. 188, 2205- 25 13, 1998). Similarmente, células T CD8 específicas de HIV a partir de indivíduos com doen- ça progressiva foram mostradas como sendo prejudicadas em relação à sua função. Essas células T CD8 podem produzir citocinas como IFN-γ porém são prejudicadas em relação à produção de IL-2, uma citocina que é crítica para a proliferação de células T e sobrevivên- cia, expressão de perforin (Appay e outros, J Exp. Med. 192, 63-75, 2000), uma molécula 30 que é crítica para função citolítica, e capacidade proliferativa, uma propriedade que foi indi- cada como sendo crítica para o controle de HIV (vide, por exemplo, Harari e outros, Blood 103, 966-72, 2004) e SIV. Células T específicas de HIV expressam níveis elevados de PD-1 e essa expressão é diretamente proporcional ao nível de viremia. Um bloqueio transiente de interação entre PD-1 e PD-L1 in vitro recupera a função de célula T específica de HIV.

A expressão de PD-1 em células T CD8 específicas de SIV após infecção com um

SIV239 patogênico em macacos foi pesquisada. Os resultados demonstram que células T CD8 específicas de SIV expressam níveis elevados de PD-1 e bloqueio de via de PD-1:PDL- 1 in vitro resulta em expansão aumentada dessas células. Os seguintes resultados foram obtidos:

Expressão de PD-1 elevado em células T CD8 específicas de SIV após infecção por SIV239: o nível de expressão de PD-1 em células T CD8 a partir de macacos saudáveis normais e infectadas com SIV foi pesquisada para entender o papel de expressão de PD-1 e sua relação com o controle de infecção por SIV. Uma proporção significativa (40-50%) de células T CD8 totais a partir de macacos saudáveis normais expressou PD-1 (figura 27A). A expressão de PD-1 foi predominantemente limitada a células de memória e estava ausente em células T CD8 simples. Um padrão de expressão de PD-1 similar foi também observado para células T CD8 totais a partir de macacos infectados com SIVmac239 (figuras 27B e C). Entretanto, a maioria (>95%) de células T CD8 específicas de CM9 Gag SIV foi positiva para expressão de PD-1 e uma proporção significativa dessas células regulou ascendentemente adicionalmente a expressão de PD-1 (MFI de 580) em comparação com o total de células T CD8 (MFI de 220) (figura 27D). De forma coletiva, esses resultados demonstram que uma proporção significativa de células T CD8 de memória a partir de macacos normais e infecta- dos com SIV expressam PD-1 e o nível de expressão de PD-1 é adicionalmente elevado nas células T CD8 específicas de SIV.

bloqueio in vitro de PD-1 resulta em expansão aumentada de células T CD8 especí- ficas de SIV: para estudar o efeito de bloqueio de PD-1 sobre a função de células T CD8 específicas de SIV, ensaios de proliferação foram conduzidos na presença e ausência de um anticorpo de bloqueio à molécula de PD-1 humana que é reativo cruzado para PD-1 de macaco. PBMC a partir de macacos rhesus Mamu A*01 positivos que foram infectados com um vírus de imunodeficiência humana e de símio patogênico 89.6P (SHIV 89.6P) foram es- timulados com peptídeo P11C (epítopo Gag-CM9) na ausência e presença de Ab de blo- queio anti-PD-1 por seis dias. A frequência de células positivas de tetrâmero Gag CM-9 foi avaliada no final da estimulação. Células não estimuladas serviram como controles negati- vos. Como pode ser visto nas figuras 28A-28B, a estimulação com peptídeo P11C resultou em um aumento de aproximadamente 4-80 vezes na frequência de células de tetrâmero positivo. Além disso, em quatro de seis macacos testados, estimulações com peptídeo P11C na presença de Ab de bloqueio anti-PD-1 resultou em aproximadamente 2-4 vezes aumento adicional na frequência de células de tetrâmero positivo em relação a estimulações com peptídeo P11C na ausência de anticorpo de bloqueio.

Esses resultados demonstram que o bloqueio de PD-1 aumenta a capacidade proli- ferativa de células T CD8 específicas de SIV em macacos infectados com SIV.

Exemplo 20: papel de PD-L2

Dois Iigandos de PD-1 diferem em seus padrões de expressão: PD-L1 é expresso de modo constitutivo e regulado ascendentemente em quantidades mais elevadas em células hematopoiéticas e não hematopoiéticas, ao passo que PD-L2 é somente expresso de forma induzível em células dendríticas (DCs) e macrófagos. Embora alguns estudos para avaliar o papel que PD-L2 desempenha em ativação de célula T tenham demonstrado função inibido- ra para PD-L2, outros estudos relataram que PD-L2 estimula a proliferação de células T e 5 produção de citocina. Para delinear o papel de PD-L2 em resposta imune de célula T1 a ci- nética de expressão de PD-L2 em diferentes tipos de células ex-vivo foi examinada após infecção por LCMV Armstrong (figura 29). Ao contrário da expressão de PD-L1, a expressão de PD-L2 foi expressa de forma limitada em DC durante um tempo muito curto (dia 1-4 pós- infecção). Esse resultado sugere que a expressão de PD-L2 está estreitamente relacionada 10 à regulação de DC e resulta em regulação de ativação de células T.

Exemplo 21: PD-1 é expresso pela maioria de células T CD8 de memória efetora no sangue de seres humanos saudáveis

A expressão de PD-1 em células T CD3+/CD8+ a partir do sangue de adultos huma- nos saudáveis foi pesquisada. Em sangue humano 20-60% de células T CD8 expressaram 15 PD-1. A relação entre o estado de diferenciação de células T e expressão de PD-1 foi exa- minada. Células T CD3+/CD8+ foram delineados em subconjuntos de memória central sim- ples (Tcn), memória efetora (TEm) e efetor diferenciado de forma terminal (TEMra) com base em padrões de expressão de CD45RA e CCR7. PD-1 não foi expresso por células T sim- ples, e por aproximadamente um terço de TCm e Temra. Ao contrário, 60% de TEm expressa- 20 ram PD-1. Esses dados demonstram que a maioria de Tem isolado a partir do sangue de adultos humanos saudáveis expressa PD-1.

Com base nessas análises, células T foram subdivididas em múltiplas populações com base em expressões de CD45RA e CCR7. Uma relação adicional foi encontrada entre expressão de CD45RA e PD-1. especificamente, células CCR7-/CD8+ T com a expressão 25 CD45RA mais baixa continham a proporção mais elevada de células PD-1+. Concluindo, PD-2 foi predominantemente expresso por TEM, a um ponto menor por Temra eTCM,e não foi expresso entre células T CD8 simples. Esses dados ilustram que uma grande proporção de células T CD8 Tem expressam PD-1 entre adultos humanos saudáveis.

Para caracterizar as propriedades de células T CD8 PD-1+ adicionalmente, a co- expressão de PD-1 e vários marcadores de diferenciação de célula T foram examinados. A maioria das células T CD8 PD-1+ tinha marcadores associados à experiência de antígeno e diferenciação de memória efetora/efetor. Por exemplo, células CD11a+/CCR7-/CD62L- /CD45RA-/KLRG1+/granzima B+/perforin+ CD8 T foram enriquecidas em expressão de PD-

1. Ao contrário, células (CD11a-/CCR7+/CD62L+/CD45RA+/KLRG1-) CD* de fenótipo sim- pies expressaram níveis baixos de PD-1. Desse modo, PD-1 foi preferencialmente expresso em células T CD8 experientes em antígeno com qualidades de memória efetora/efetor. Exemplo 22: PD-1 é expresso pela maioria de células T CD4 de memória efetora em sangue de seres humanos saudáveis

A expressão de PD-1 entre células CD3+ CD4+ T foi então pesquisada. Trinta por cento de células T CD4 expressaram PD-1 no sangue de adultos saudáveis. Similar a célu- las T CD8, células T CD4 expressaram pouco PD-1. Embora uma minoria de células T CD4 TCm expressassem PD-1, a expressão de PD-1 foi preferencialmente enriquecida entre célu- las T CD4 Tem (50%).

Para caracterizar adicionalmente as propriedades de células T CD4 que expressa- ram PD, células T CD4+/CD3+ foram ensaiadas a partir do sangue de indivíduos saudáveis para a co-expressão de PD-1 e vários marcadores de diferenciação de célula T. Similar a células T CD8, a expressão de PD-1 foi enriquecida em células T CD4 com um fenótipo de memória efetora/efetor, incluindo células CD62L, CD95+, CD45RA-, CCR7-, e CCR5+.

Exemplo 23: PD-1 é mais altamente expresso em células T CD8 específicas para in- fecções por CMV e EBV em seres humanos

Para testar se a expressão de PD-1 é correlacionada com persistência de antígeno viral, a expressão de PD-1 foi comparada em células T CD8 específicas de vírus de EBV, CMV, influenza e vacínia. Células T CD8 específicas de EBV e CMV expressaram níveis elevados de PD-1. Ao contrário, células T CD8 de memória específicas de vírus de influenza expressam níveis intermediários de PD-1 e células T CD8 específicas de vírus de vacínia expressam níveis baixos de PD-1. Consequentemente as células T CD8 de memória especí- ficas para infecções crônicas (EBV e CMV) expressaram níveis mais elevados de PD-1 do que infecções agudas (influenza e vacínia). Esses resultados mostram que células T CD8 específicas para infecções crônicas (EBV e CMV) expressaram níveis mais elevados de PD-

1 do que infecções agudas (vírus de influenza e vacínia). Células T CD8 específicas para infecções crônicas muito comuns podem expressar níveis elevados de PD-1.

Exemplo 24: bloqueio anti-PD-L1 aumenta a proliferação de células T CD8 específi- cas para infecções por EBV e CMV em seres humanos

O bloqueio da via inibidora de PD-1 resulta em expansão clonal aumentada de célu- las T CD8 específicas de HICV após estimulação in vitro. Como as células T CD8 específi- cas para infecção crônica comum também expressam PD-1, foi testado se o bloqueio da via PD-1/PD-L1 pode aumentar a proliferação de células T CD8 específicas para EBV, CMV e também vírus de vacínia (uma infecção aguda que resulta em células T CD8 de memória PD-1). Linfócitos foram isolados a partir do sangue de indivíduos contendo células T CD8 específicas para CMV, EBV ou W foram rotulados com CFSE e cultivados por 6 dias sob várias condições, como esperado, a incubação de células mononucleares de sangue perifé- rico recentemente isolado (PBMC) com meio sozinho, ou meio com anticorpo anti-PD-L1, não induziu a proliferação de células T CD8 específicas de vírus. A estimulação de PBMC por 6 dias com peptídeos derivados de vírus resultou em divisão de células T CD8 de tetrâ- mero+. Entretanto, a estimulação de peptídeo de PBMC na presença de anticorpo de blo- queio anti-PD-L1 aumentou ainda mais a divisão de células T CD8 específicas de CMV e EBV, resultando em uma expansão maior do que peptídeo sozinho. A divisão aumentada 5 induzida por anticorpo de bloqueio anti-PD-L1 variou entre indivíduos e mesmo entre dife- rentes epítopos em um dado indivíduo. Além disso, o bloqueio de PD-1 não resultou em ex- pansão aumentada de células T CD8 específicas de vacínia ou influenza. O grau de divisão aumentada induzida por bloqueio de PD-L1 em cultura pode ser relacionado à quantidade de PD-1 expresso por células T CD8 específicas de antígeno antes da estimulação. Esses 10 dados sugerem que a expressão de PD-1 em células T CD8 específicas para infecções crô- nicas inibe sua capacidade proliferativa após estimulação antigênica.

Exemplo 25: bloqueio de PD-L1 controlado aumenta ainda mais a proliferação de cé- lulas T CD8 específicas para infecções crônicas

Após estimulação in vitro, a adição de anticorpo de bloqueio de PD-L1 levou à divi- são aumentada entre células T CD8 específicas para EBV e CMV. mAb anti-PD-L1 foi adi- cionado uma vez (dia 0), e a proliferação foi avaliada ao término do período de cultura de seis dias. O tratamento anti-PD-L1 in vitro em camundongos envolveu múltiplas injeções de anticorpo de bloqueio. Além disso, nesses estudos com murino, o bloqueio de PD-L1 in vivo resultou em uma regulação ascendente rápida de expressão de PD-1 entre células T CD8 específicas para antígeno viral crônico. Por esses motivos, foi testado se adições repetidas de anti-PD-L1 estimularam as culturas de células T aumentariam adicionalmente a prolifera- ção. Essa adição de mAb a-PD-L1 nos dias 0, 2 e 4 de cultura resultou em um acúmulo ain- da maior de células T CD8 específicas de EBV do que uma única adição de mAb no dia 0. Dados similares foram observados para células T CD8 específicas de CMV. Esses dados sugerem que o bloqueio contínuo de sinalização de PD-1 pode otimizar a capacidade de aumentar os números de células T CD8 específicas para antígenos crônicos.

Será evidente que os detalhes precisos dos métodos ou composições descritos po- dem ser variados ou modificados sem se afastar do espírito da invenção descrita. Os reque- rentes reivindicam todas essas modificações e variações que estão compreendidas no es- copo e espírito das reivindicações abaixo.

Claims (64)

1. Método para induzir uma resposta imune a um antígeno de interesse em um su- jeito mamífero, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende administrar ao sujeito uma quantidade terapeuticamente eficaz de células T ativadas, em que as células T reconhecem especificamente o antígeno de interesse e uma quantidade terapeuticamente eficaz de um antagonista de PD-1, desse modo induzindo a resposta imune ao antígeno de interesse.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o sujeito tem uma infecção viral.

3. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o sujeito tem uma infecção viral persistente.

4. Método, de acordo com a reivindicação 3, CARACTERIZADO pelo fato de que o antígeno de interesse é um antígeno viral.

5. Método, de acordo com a reivindicação 4, CARACTERIZADO pelo fato de que o antígeno viral é um antígeno viral de hepatite.

6. Método, de acordo com a reivindicação 5, CARACTERIZADO pelo fato de que o antígeno viral de hepatite é gp33.

7. Método, de acordo com a reivindicação 3, CARACTERIZADO pelo fato de que a infecção viral é uma infecção viral de imunodeficiência humana.

8. Método, de acordo com a reivindicação 7, CARACTERIZADO pelo fato de que o antígeno de interesse é gp120.

9. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o sujeito mamífero é humano.

10. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o sujeito mamífero está imunocomprometido.

11. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a infecção viral é uma infecção viral com um vírus de hepatite, um vírus de imunodeficiência humana (HIV), um vírus T-linfotrófico humano (HTLV), um vírus de herpes, um vírus de Eps- tein-Barr, ou um vírus de papiloma humano.

12. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o receptor tem um tumor.

13. Método, de acordo com a reivindicação 12, CARACTERIZADO pelo fato de que o antígeno de interesse é um antígeno de tumor.

14. Método, de acordo com a reivindicação 13, CARACTERIZADO pelo fato de que o antígeno associado a tumor é PRAME, WTI, Survivin1 ciclina D, ciclina E, proteinase 3 e seu peptídeo PR1, elastase de neutrófilo, catepsina G, MAGE, MART, tirosinase, GP100, NY-Eso-1, herceptina, antígeno carcinoembriônico (CEA) ou antígeno específico de próstata (PSA).

15. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o antagonista de PD-1 é um anticorpo que liga especificamente PD-1, um anticorpo que liga especificamente Ligando de Morte programada 1 (PD-L1) ou um anticorpo que liga especifi- camente o Ligando de Morte programada 2 (PD-L2) ou combinações dos mesmos.

16. Método, de acordo com a reivindicação 32, CARACTERIZADO pelo fato de que o antígeno de interesse é um antígeno fúngico.

17. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o antagonista de PD-1 é um anticorpo anti-PD-1, um anticorpo anti-PD-L1, um anticorpo anti-PD-L2, um RNAi anti-PD-01 inibidor pequeno, um RNA anti-PD-L1 inibidor pequeno, um RNAi anti-PD-L2 inibidor pequeno, um RNA anti-sentido anti-PD-1, um RNA anti-sentido anti-PD-L1, um RNA anti-sentido anti-PD-L2, uma proteína PD-1 negativa dominante, uma proteína PD-L1 negativa dominante, uma proteína PD-L2 negativa dominante, ou combina- ções dos mesmos.

18. Método, de acordo com a reivindicação 15, CARACTERIZADO pelo fato de que o anticorpo que liga especificamente PD-1 é (1) um anticorpo monoclonal ou um fragmento funcional do mesmo, (2) um anticorpo humanizado ou um fragmento funcional do mesmo, ou (3) uma proteína de fusão de imunoglobulina.

19. Método, de acordo com a reivindicação 18, CARACTERIZADO pelo fato de que o anticorpo que liga PD-L1 é (1) um anticorpo monoclonal ou um fragmento funcional do mesmo, (2) um anticorpo humanizado ou um fragmento funcional do mesmo, ou (3) uma proteína de fusão de imunoglobulina.

20. Método, de acordo com a reivindicação 18, CARACTERIZADO pelo fato de que o anticorpo que liga PD-L2 é (1) um anticorpo monoclonal ou um fragmento funcional do mesmo, (2) um anticorpo humanizado ou um fragmento funcional do mesmo, ou (3) uma proteína de fusão de imunoglobulina.

21. Método de induzir uma resposta imune a um antígeno de interesse em um re- ceptor mamífero, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende: contatar uma população de células doadoras a partir da mesma espécie mamífera compreendendo células T com células apresentadoras de antígeno (APCs) e um antígeno de interesse pré-selecionado, onde o antígeno pré-selecionado é apresentado pelas APCs às células T que produzem uma população de células T ativadas por doador na presença de um antagonista de PD-1, e transplantar uma quantidade terapeuticamente eficaz da população de células T a- tivadas por doador para o receptor; e administrar ao receptor uma quantidade terapeuticamente eficaz de um antagonista de PD-1, desse modo produzir uma resposta imune ao antígeno de interesse no receptor mamífero.

22. Método, de acordo com a reivindicação 21, CARACTERIZADO pelo fato de que o receptor tem uma infecção viral.

23. Método, de acordo com a reivindicação 22, CARACTERIZADO pelo fato de que o receptor tem uma infecção viral persistente.

24. Método, de acordo com a reivindicação 22, CARACTERIZADO pelo fato de que o antígeno de interesse é antígeno viral.

25. Método, de acordo com a reivindicação 24, CARACTERIZADO pelo fato de que o antígeno viral é um antígeno viral de hepatite.

26. Método, de acordo com a reivindicação 25, CARACTERIZADO pelo fato de que o antígeno viral de hepatite é gp33.

27. Método, de acordo com a reivindicação 23, CARACTERIZADO pelo fato de que a infecção viral é uma infecção viral de imunodeficiência humana.

28. Método, de acordo com a reivindicação 27, CARACTERIZADO pelo fato de que o antígeno de interesse é gp120.

29. Método, de acordo com a reivindicação 21, CARACTERIZADO pelo fato de que o doador e o receptor são humanos.

30. Método, de acordo com a reivindicação 23, CARACTERIZADO pelo fato de que o doador e o receptor são o mesmo sujeito humano.

31. Método, de acordo com a reivindicação 23, CARACTERIZADO pelo fato de que o receptor é imunocomprometido.

32. Método, de acordo com a reivindicação 24, CARACTERIZADO pelo fato de que a infecção viral é uma infecção viral com um vírus de hepatite, um vírus de imunodeficiência humana (HIV), um vírus de T-linfotrófico humano (HTLV), um vírus de herpes, um vírus de Epstein-Barr, ou um vírus de papiloma humano.

33. Método, de acordo com a reivindicação 23, CARACTERIZADO pelo fato de que o receptor tem um tumor.

34. Método, de acordo com a reivindicação 33, CARACTERIZADO pelo fato de que o antígeno de interesse é um antígeno de tumor.

35. Método, de acordo com a reivindicação 34, CARACTERIZADO pelo fato de que o antígeno associado a tumor é PRAME, WTI, Survivin, ciclina D, ciclina E, proteinase 3 e seu peptídeo PR1, elastase de neutrófilo, catepsina G, MAGE, MART, tirosinase, GP100, NY-Eso-1, herceptina, antígeno carcinoembriônico (CEA) ou antígeno específico de próstata (PSA).

36. Método, de acordo com a reivindicação 23, CARACTERIZADO pelo fato de que o antagonista de PD-1 é um anticorpo que liga especificamente PD-1, um anticorpo que liga especificamente Ligando de Morte programada 1 (PD-L1) ou um anticorpo que liga especifi- camente o Ligando de Morte programada 2 (PD-L2) ou combinações dos mesmos.

37. Método, de acordo com a reivindicação 23, CARACTERIZADO pelo fato de que o patógeno é um fungo e o antígeno é um antígeno fúngico.

38. Método, de acordo com a reivindicação 23, CARACTERIZADO pelo fato de que o antagonista de PD-1 é um anticorpo anti-PD-1, um anticorpo anti-PD-L1, um anticorpo anti-PD-L2, um RNAi anti-PD-01 inibidor pequeno, um RNA anti-PD-L1 inibidor pequeno, um RNAi anti-PD-L2 inibidor pequeno, um RNA anti-sentido anti-PD-1, um RNA anti-sentido anti-PD-L1, um RNA anti-sentido anti-PD-L2, uma proteína PD-1 negativa dominante, uma proteína PD-L1 negativa dominante, uma proteína PD-L2 negativa dominante, ou combina- ções dos mesmos.

39. Método, de acordo com a reivindicação 36, CARACTERIZADO pelo fato de que o anticorpo que liga especificamente PD-1 é (1) um anticorpo monoclonal ou um fragmento funcional do mesmo, (2) um anticorpo humanizado ou um fragmento funcional do mesmo, ou (3) uma proteína de fusão de imunoglobulina.

40. Método, de acordo com a reivindicação 36, CARACTERIZADO pelo fato de que o anticorpo que liga PD-L1 é (1) um anticorpo monoclonal ou um fragmento funcional do mesmo, (2) um anticorpo humanizado ou um fragmento funcional do mesmo, ou (3) uma proteína de fusão de imunoglobulina.

41. Método, de acordo com a reivindicação 36, CARACTERIZADO pelo fato de que o anticorpo que liga PD-L2 é (1) um anticorpo monoclonal ou um fragmento funcional do mesmo, (2) um anticorpo humanizado ou um fragmento funcional do mesmo, ou (3) uma proteína de fusão de imunoglobulina.

42. Método, de acordo com a reivindicação 23, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende transfectar as APCs com um vetor de expressão que compreende um ácido nucléico codificando o antígeno de interesse ante de conter a população de células que compreende células T com as APCs.

43. Método, de acordo com a reivindicação 23, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende ainda administrar ao sujeito uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto adicional.

44. Método, de acordo com a reivindicação 43, CARACTERIZADO pelo fato de que o segundo composto é um composto antiviral, um composto antibacteriano, um composto antifúngico, um composto antiparasítico, um composto antiinflamatório ou um analgésico.

45. Método de tratar um sujeito com uma infecção persistente de um patógeno, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende administrar ao sujeito uma quantidade terapeuticamente eficaz de um antagonista de Morte programada (PD-1) e uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma molécula de antígeno a partir do patógeno, desse modo tratando a infecção persistente no sujeito.

46. Método, de acordo com a reivindicação 45, CARACTERIZADO pelo fato de que o patógeno é um vírus, e em que o sujeito tem uma infecção viral persistente.

47. Método, de acordo com a reivindicação 45, CARACTERIZADO pelo fato de que a molécula antigênica é um peptídeo antigênico viral ou um ácido nucléico que codifica o peptídeo antigênico viral.

48. Método, de acordo com a reivindicação 45, CARACTERIZADO pelo fato de que o antagonista de PD-1 é um anticorpo que liga especificamente PD-1, um anticorpo que liga especificamente Ligando de Morte programada 1 (PD-L1) ou Ligando de Morte programada (PD-L2) ou uma combinação dos mesmos.

49. Método, de acordo com a reivindicação 45, CARACTERIZADO pelo fato de que o sujeito tem imunossupressão.

50. Método, de acordo com a reivindicação 45, CARACTERIZADO pelo fato de que o antagonista de PD-1 é um anticorpo anti-PD-1, um anticorpo anti-PD-L1, um anticorpo anti-PD-L2, um RNAi anti-PD-01 inibidor pequeno, um RNA anti-PD-L1 inibidor pequeno, um RNAi anti-PD-L2 inibidor pequeno, um RNA anti-sentido anti-PD-1, um RNA anti-sentido anti-PD-L1, um RNA anti-sentido anti-PD-L2, uma proteína PD-1 negativa dominante, uma proteína PD-L1 negativa dominante ou uma proteína PD-L2 negativa dominante.

51. Método, de acordo com a reivindicação 48, CARACTERIZADO pelo fato de que o anticorpo que liga especificamente PD-1 é (1) um anticorpo monoclonal ou um fragmento funcional do mesmo, (2) um anticorpo humanizado ou um fragmento funcional do mesmo, ou (3) uma proteína de fusão de imunoglobulina.

52. Método, de acordo com a reivindicação 48, CARACTERIZADO pelo fato de que o anticorpo que liga PD-L1 é (1) um anticorpo monoclonal ou um fragmento funcional do mesmo, (2) um anticorpo humanizado ou um fragmento funcional do mesmo, ou (3) uma proteína de fusão de imunoglobulina.

53. Método, de acordo com a reivindicação 48, CARACTERIZADO pelo fato de que o anticorpo que liga PD-L2 é (1) um anticorpo monoclonal ou um fragmento funcional do mesmo, (2) um anticorpo humanizado ou um fragmento funcional do mesmo, ou (3) uma proteína de fusão de imunoglobulina.

54. Método, de acordo com a reivindicação 45, CARACTERIZADO pelo fato de que o antagonista de PD-1 é uma molécula pequena.

55. Método, de acordo com a reivindicação 21, CARACTERIZADO pelo fato de que o sujeito é assintomático.

56. Método de tratar um sujeito com um tumor, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende administrar ao sujeito uma quantidade terapeuticamente eficaz de um antago- nista de Morte programada (PD-1) e uma quantidade terapeuticamente eficaz de um antíge- no de tumor ou um ácido nucléico que codifica o antígeno de tumor, desse modo tratando o sujeito.

57. Método, de acordo com a reivindicação 56, CARACTERIZADO pelo fato de que o antagonista de PD-1 é um anticorpo que liga especificamente PD-1, um anticorpo que liga especificamente Ligando de Morte programada 1 (PD-L1) ou Ligando de Morte programada2 (PD-L2) ou uma combinação dos mesmos.

58. Método, de acordo com a reivindicação 56, CARACTERIZADO pelo fato de que o sujeito tem imunossupressão.

59. Método, de acordo com a reivindicação 56, CARACTERIZADO pelo fato de que o antagonista de PD-1 é um anticorpo anti-PD-1, um anticorpo anti-PD-L1, um anticorpo anti-PD-L2, um RNAi anti-PD-01 inibidor pequeno, um RNA anti-PD-L1 inibidor pequeno, um RNAi anti-PD-L2 inibidor pequeno, um RNA anti-sentido anti-PD-1, um RNA anti-sentido anti-PD-L1, um RNA anti-sentido anti-PD-L2, uma proteína PD-1 negativa dominante, uma proteína PD-L1 negativa dominante ou uma proteína PD-L2 negativa dominante.

60. Método, de acordo com a reivindicação 57, CARACTERIZADO pelo fato de que o anticorpo que liga especificamente PD-1 é (1) um anticorpo monoclonal ou um fragmento funcional do mesmo, (2) um anticorpo humanizado ou um fragmento funcional do mesmo, ou (3) uma proteína de fusão de imunoglobulina.

61. Método, de acordo com a reivindicação 57, CARACTERIZADO pelo fato de que o anticorpo que liga PD-L1 é (1) um anticorpo monoclonal ou um fragmento funcional do mesmo, (2) um anticorpo humanizado ou um fragmento funcional do mesmo, ou (3) uma proteína de fusão de imunoglobulina.

62. Método, de acordo com a reivindicação 57, CARACTERIZADO pelo fato de que o anticorpo que liga PD-L2 é (1) um anticorpo monoclonal ou um fragmento funcional do mesmo, (2) um anticorpo humanizado ou um fragmento funcional do mesmo, ou (3) uma proteína de fusão de imunoglobulina.

63. Método, de acordo com a reivindicação 57, CARACTERIZADO pelo fato de que o antagonista de PD-1 é uma molécula pequena.

64. Método, de acordo com a reivindicação 56, CARACTERIZADO pelo fato de que o antígeno de tumor é PRAME, WTI, Survivin, ciclina D, ciclina E, proteinase 3 e seu peptídeo PR1, elastase de neutrófilo, catepsina G, MAGE, MART, tirosinase, GP100, NY- Eso-1, herceptina, antígeno carcinoembriônico (CEA) ou antígeno específico de próstata (PSA). <table>table see original document page 120</column></row><table> <table>table see original document page 121</column></row><table> <table>table see original document page 122</column></row><table> <table>table see original document page 123</column></row><table> <table>table see original document page 124</column></row><table> His Val Asn Leu Gly Ala He Thr Ala Ser Leu Gln Lys Val Glu Asn Asp Thr Ser Pro His Arg Glu Arg Ala Thr Leu Leu Glu Glu Gln Leu Pro Leu Gly Lys Ala Ser Phe His He Pro Gln Val Gln Val Arg Asp Glu Gly Gln Tyr Gln Cys He He He Tyr Gly Val Ala Trp Asp Tyr Lys Tyr Leu Thr Leu Lys Val Lys Ala Ser Tyr Arg Lys He Asn Thr His He Leu Lys Val 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