ES2714708T3 - Procedimientos para el tratamiento de cáncer en pacientes con niveles elevados de Bim - Google Patents

Procedimientos para el tratamiento de cáncer en pacientes con niveles elevados de Bim Download PDF

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Abstract

Composición que comprende un anticuerpo anti-B7-H1, un anticuerpo anti-PD-1, un anticuerpo anti-CD80, una proteína de fusión que comprende una porción de PD-1 unida a una secuencia Fc de inmunoglobulina, o una proteína de fusión que comprende una porción de CD80 unida a una secuencia Fc de inmunoglobulina para su uso en un procedimiento para tratar a un mamífero que padece cáncer, en la que dicho procedimiento comprende (i) determinar el nivel de Bim en una muestra de sangre periférica de dicho mamífero y certificar que dicho mamífero contiene un nivel elevado de Bim, en el que dicho nivel elevado de Bim se basa en niveles de proteína Bim, en el que dicho nivel elevado de Bim se refiere a un nivel que es al menos un 50% mayor que un nivel de referencia de Bim, en el que dicho nivel de referencia se refiere al nivel de Bim que se observa normalmente en mamíferos correspondientes sanos sin cáncer, y (ii) administrar dicha composición a dicho mamífero en condiciones en las que la interacción de B7-H1 de origen natural con PD-1 o CD80 en dicho mamífero se reduce después de administrar dicha composición a dicho mamífero.

Description

DESCRIPCION
Procedimientos para el tratamiento de cancer en pacientes con niveles elevados de Bim
Campo tecnico
El presente documento se refiere a materiales y procedimientos para el tratamiento de cancer, y mas particularmente a materiales y procedimientos para el tratamiento de cancer en pacientes que se ha determinado que presentan niveles elevados de Bim.
Antecedentes
La diseminacion metastasica de celulas tumorales es la causa principal de mortalidad relacionada con cancer, lo que indica la necesidad de enfoques terapeuticos capaces de controlar o prevenir la metastasis (Gibbons et al. (2012) OncoImmunology 1 (7): 1061-1073; y Grivennikov et al. (2010) Cell 140: 883-899). La presencia de celulas T efectoras y de memoria infiltrantes de tumores se correlaciona con una reduccion de la diseminacion metastasica, consecuente con el papel de las celulas T en la prevencion de la metastasis de tumores primarios.
El B7-H1 (tambien denominado PD-L1) es un polipeptido expresado por una diversidad de celulas tumorales. Tambien se expresa de forma constitutiva por macrofagos y celulas dendriticas, y su expresion esta regulada al alza tras la activacion celular. El PD-1 se expresa en la superficie de celulas T activadas, celulas B activadas y macrofagos activados, y es un receptor para B7-H1. El CD80 se encuentra en celulas B activadas y monocitos activados, y proporciona una senal coestimuladora necesaria para la activacion y la supervivencia de las celulas T; el CD80 tambien se une al B7-H1.
Topalian SL et al. describen en The New England Journal of Medicine, vol. 366, N° 26, 28 de junio de 2012, en las paginas 2443-2454, la seguridad, la actividad y las correlaciones inmunologicas de un anticuerpo anti-PD-1 en cancer. El documento WO 2013/090552 A1 describe composiciones y procedimientos para la intervencion terapeutica de la senalizacion a traves de EP2 y EP4, en combinacion con la intervencion terapeutica de la senalizacion a traves de PD-1, mediante la inhibicion de al menos uno de EP2, EP4, PGE2, o combinaciones de los mismos, en combinacion con la inhibicion de al menos uno de PD-1, PD-L1, PD-L2 y combinaciones de los mismos. Berrien-Elliot MM et al. describen en Cancer Research, vol. 73, N° 2, 15 de enero de 2013, paginas 605-616, una inmunoterapia adoptiva de larga duracion para leucemia producida mediante la manipulacion de multiples rutas reguladoras de tolerancia de celulas T CD8+.
Gibbons RM et al. describen en Oncoimmunology vol. 1, N° 7, 1 de octubre de 2012, en las paginas 1061 -1073, que el B7-H1 limita la entrada de celulas T CD8+ efectoras a la agrupacion de memoria mediante la regulacion al alza de Bim.
Sumario
La presente invencion se define por medio de la reivindic inadceiópenndiente 1. Las reivindicaciones dependientes representan otras formas de realización de la invencion.
El presente documento proporciona, entre otras cosas, un procedimiento para determinar si el PD-1 de las celulas T se ha acoplado a su ligando, B7-H1. El procedimiento se basa en parte en el descubrimiento de que el acoplamiento de PD-1 con B7-H1 tiene como consecuencia una regulacion al alza de Bim, una molecula proapoptotica, y se correlaciona con la muerte de celulas T mediada por B7-H1. Este descubrimiento sugiere que los niveles intracelulares de Bim entre celulas positivas a PD-1 es un barometro del grado en el que el PD-1 ha sido activado por B7-H1, puesto que niveles reducidos de Bim identifican celulas T positivas a PD-1 activadas cuyas moleculas PD-1 aun no se han acoplado ampliamente, y niveles elevados de Bim reflejan un acoplamiento cronico de PD-1 con B7-H1. La estratificacion de niveles de Bim entre las celulas T CD8 positivas a PD-1 puede ser un biomarcador para evaluar (1) si las moleculas de PD-1 de celulas T CD8 se han acoplado con ligandos asociados al tumor B7-H1; y (2) la eficacia de un regimen de bloqueo anti-PD-1 o anti-B7-H1 para reducir el acoplamiento de PD-1. Por lo tanto, utilizando Bim como un biomarcador de senalizacion para la funcion PD-1, puede ser posible seleccionar pacientes que tengan mas probabilidades de beneficiarse del tratamiento de bloqueo del punto de control y determinar la programacion terapeutica optima y las agendas de dosificacion.
En un aspecto, el presente documento presenta una composicion para su uso en un procedimiento para tratar un mamifero que padece cancer, en la que dicho procedimiento comprende: (a) determinar que dicho mamifero contiene un nivel elevado de Bim, y (b) administrar a dicho mamifero un anticuerpo anti-B7-H1, un anticuerpo anti-PD-1, un anticuerpo anti-CD80, una proteina de fusion que comprende una porcion de PD-1 unida a una secuencia Fc de inmunoglobulina, o una proteina de fusion que comprende una porcion de CD80 unida a una secuencia Fc de Ig, en condiciones en las que la interaccion de B7-H1 de origen natural con PD-1 o CD80 en dicho mamifero se reduce despues de dicha administracion. El mamifero puede ser un ser humano. El cancer puede ser un cancer de melanoma, un cancer de mama, un cancer de pulmon, un carcinoma de celulas renales, un cancer de pancreas, un cancer de prostata, un cancer de colon, un cancer de cerebro, un cancer de hfgado o un cancer de ovarios.
A menos que se definan de otra forma, todos los terminos tecnicos y cientfficos utilizados en el presente documento tienen el mismo significado que entiende comunmente un experto en la tecnica a la que se refiere la presente invencion. Aunque se pueden utilizar procedimientos y materiales similares o equivalentes a los descritos en el presente documento para poner en practica la invencion, a continuacion se describen procedimientos y materiales adecuados. En caso de conflicto, regira la presente especificacion, incluidas las definiciones. Ademas, los materiales, procedimientos y ejemplos son solo ilustrativos y no pretenden ser limitantes.
Los detalles de una o mas formas de realización de la invencion se exponen en los dibujos adjuntos y en la descripción siguiente. Otras caracterfsticas, objetos y ventajas de la invencion seran evidentes a partir de la descripción y los dibujos, y a partir de las reivindicaciones.
Descripcion de los dibujos
La figura 1 contiene un par de graficos que representan la cinetica de respuestas de celulas T CD8+ a la estimulacion con antfgeno. Se inmunizaron (i.p.) ratones de tipo silvestre (WT) y deficientes (KO) en B7-H1 con OVA mas poli I:C y se utilizo tetramero Kb/OVA para identificar celulas T CD8+ especfficas de antfgeno en el bazo (panel superior) y el hfgado (panel inferior) en los puntos temporales indicados despues de la inmunizacion. Los datos muestran el porcentaje de celulas T CD8+ tetramero+ (media ± SD de tres ratones por punto temporal). Se muestra uno de los dos experimentos independientes. * p < 0,05 en comparacion con ratones WT.
Las figuras 2A-2D contiene una serie de exploraciones por FACS y graficos que muestran una poblacion de celulas T CD8+ de memoria potenciada en ausencia de B7-H1. Los ratones se inmunizaron con OVA mas poli I:C y se reestimularon con OVA el dfa 40 despues de la inmunizacion. El dfa 4 despues de la reestimulacion, se aislaron celulas del bazo de ratones WT y deficientes en B7-H1 sin tratamiento previo o inmunizados para su analisis. Figura 2A: exploraciones por FACS que muestran el porcentaje de celulas T CD8+ tetramero+ especfficas de OVA; * p < 0,05 en comparacion con ratones WT. Figura 2B: grafico que representa la cantidad absoluta de celulas T CD8+ tetramero+ especfficas de OVA (media ± SD, n = 3). Figura 2C: analisis por FACS de la produccion intracelular de citocinas en celulas T CD8+ de ratones inmunizados (media ± SD, n = 3). Figura 2D: graficos que representan la actividad citolftica in vivo en ratones inmunizados. Se marcaron celulas diana (esplenocitos singenicos) pulsadas con peptido OVA o peptido de control con una dosis alta o baja de CFSE (5 pM para celulas pulsadas con peptido OVA; 0,5 pM para celulas pulsadas con peptido de control) y se mezclaron (1:1,2,5 x 106 de cada uno) y se inyectaron i.v. en ratones WT o deficientes en B7-H1. Las graficas de histograma (izquierda) muestran el porcentaje de celulas diana remanentes en el bazo 4 horas despues de la transferencia de celulas diana. El grafico de barras (derecha) muestra el porcentaje de lisis especffica en el bazo (media ± SD, n = 3).
Las figuras 3A y 3B contienen exploraciones por FACS y graficos que muestran respuestas de recuerdo de celulas T CD8+ de memoria mejoradas y una inmunidad antitumoral mejorada en el pulmon en ausencia de B7-H1. El dfa 35 despues de la inmunizacion, se inyectaron (i.v.) a ratones WT y deficientes en B7-H1 inmunizados o sin tratamiento previo 5 x 105 celulas tumorales B16-OVA. Figura 3A: porcentaje y cantidades absolutas de celulas T IFNy+ CD8+ en el pulmon de ratones inmunizados (media ± SD, n = 3) el dfa 4 despues de la inyeccion tumoral. * p < 0,01 en comparacion con ratones WT. Figura 3B: se identificaron focos de tumores metastasicos en el tejido pulmonar y se realizo un recuento de los mismos el dfa 20 despues de la inyeccion tumoral (media ± SD, n = 5). N.S.: no significativo.
Las figuras 4A-4D contiene una serie de exploraciones por FACS y un grafico que muestra que las celulas T CD8+ CD11aalto representan celulas T efectoras estimuladas con antfgeno. Se analizaron celulas del bazo de ratones WT y deficientes en B7-H1 sin tratamiento previo o inmunizados mediante tincion conjunta con anti-CD11a y tetramero Kb/OVA o marcadores funcionales. Figura 4A: exploraciones por FACS que muestran el porcentaje de celulas T CD8+ CD11aalto de ratones inmunizados WT y deficientes en B7-H1. Figura 4B: grafico que representa el porcentaje promedio de celulas T CD8+ CD11aalto de ratones inmunizados WT y deficientes en B7-H1 (media ± SD, n = 4). Figura 4C, exploraciones por FACS que muestran el porcentaje de celulas (Kb/OVA-tet) tetramero+ especfficas de antfgeno en una poblacion de celulas T CD8+ CD11aalto y CD11abajo. Figura 4D: exploraciones por FACS que muestran el ensayo funcional CTL de celulas T CD8+ CD11aalto y CD11abajo despues de una breve reestimulacion in vitro. La desgranulacion de los CTL se analizo mediante movilizacion de CD107a, seguida de tincion intracelular para IPNy. Los numeros indican porcentajes de areas seleccionadas.
Las figuras 5A-5D contienen una serie de exploraciones por FACS y un grafico que muestra menos celulas T CD8+ estimuladas con antfgeno apoptoticas en ratones deficientes en B7-H1. El dfa 7 despues de la inmunizacion, se analizaron celulas del bazo para determinar la proliferacion y la apoptosis. Figuras 5A y 5B: exploraciones por FACS que muestran la expresion de Ki67 y la incorporacion de BrdU, respectivamente, analizadas en celulas T CD8+ CD11 aalto o CD11 abajo. Los numeros son porcentajes de area seleccionada en el total de celulas T CD8+. Figura 5C: exploraciones por FACS de celulas apoptoticas TMREbajo anexina V+ medidas en celulas T CD8+ CD11aalto y CD11abajo. Figura 5D, grafico que representa el porcentaje de celulas apoptoticas (TMREbajo anexina V+) en celulas T CD8+ CD11 aalto (media ± SD, n = 4).
Las figuras 6A-6D contienen una serie de histogramas y una grafica que muestra niveles mas bajos de Bim en celulas T CD8+ estimuladas con antigeno en ratones deficientes en B7-H1. Figura 6A: ensayo por citometria de flujo de la expresion intracelular de Bim, Bcl-2 y Bcl-xL en celulas T CD8+ CD11aalr° seleccionadas en el bazo de ratones WT (rojo) y deficientes en B7-H1 (azul) el dia 7 despues de la inmunizacion. Los numeros son la intensidad de fluorescencia media (MFI) de la expresion de Bim. Figura 6B: grafico que muestra la MFI promedio de Bim expresado por celulas T CD8+ CD11 aalto (media ± SD, n = 9). Figura 6C: expresion intracelular de Bim en celulas T CD8+ CD11 aalto en el higado de ratones inmunizados. Los numeros son MFI. Figura 6D: expresion de Bim en celulas T CD8+ totales en el bazo de ratones WT (rojo) y deficientes en B7-H1 (azul) sin tratamiento previo.
La figura 7 contiene una serie de histogramas que muestran el papel extrinseco de B7-H1 en la regulacion de Bim. Se transfirieron celulas T CD8+ OT-1 WT (Thy1.1+) a ratones huesped WT (rojo) o deficientes en B7-H1 (azul) un dia antes de la inmunizacion con OVA mas poli I:C. El dia 7 despues de la inmunizacion, se identificaron las celulas T CD8+ OT-1 en el bazo y el higado mediante el marcador Thy1.1 y se analizaron para determinar la expresion intracelular de Bim. Los numeros son MFI.
Las figuras 8A-8F muestran que la coestimulacion con B7-H1 induce la regulacion al alza de los niveles de proteina Bim en celulas T activadas. Se incubaron celulas T CD8+ preactivadas con B7-H1 unido a placa o proteina de fusion (Fc) de control durante 48 horas en presencia de anti-CD3. Figura 8A: inmunotransferencia Western que muestra la expresion de la isoforma de Bim en celulas T CD8+. Figura 8B: histograma que muestra la expresion de Bim total en celulas T CD8+ coestimuladas con B7-H1 (azul) o proteina de control (rojo). Los numeros son MFI. Figura 8C: grafico que representa la MFI promedio de Bim expresado por celulas T CD8+ activadas (media ± SD, n = 5). Figura 8D: grafico que representa el porcentaje de celulas T CD8+ vivas (exclusivas al azul de tripano) en cultivo (media ± SD, n = 5). Figura 8E: exploraciones por FACS que indican apoptosis de celulas T CD8+ aisladas de ratones WT, deficientes en Bim y transgenicos Bcl-2 (Tg). Los numeros muestran el porcentaje de celulas T apoptoticas TMREbajo anexina V+ en celulas T CD8+ totales. Figura 8F: grafico que representa la MFI promedio de Bim expresado por celulas T CD8+ en cultivo con Ab (anticuerpo) anti-B7-H1 (10B5, que bloquea la union de B7-H1 a PD-1 y CD80; 43H12, que bloquea la union de b7-H1 a CD80 solamente), Ab anti-PD-1 (G4), o Ab de control (10 pg/ml de cada uno) (media ± SD, n = 3).
Las figuras 9A-9C contienen una serie de graficos que muestran que la coestimulacion con B7-H1 inhibe la activacion de Akt. Se estimularon celulas T CD8+ preactivadas con B7-H1 unido a placa o con proteina de fusion (Fc) de control. Despues de 24 horas de estimulacion, las celulas T CD8+ se recogieron y se utilizaron para el analisis. Figura 9A: grafico que representa el analisis de niveles de transcripto Bcl2l11 por qPCR en tiempo real utilizando el procedimiento de CT comparativo. GAPDH sirvio como el gen de control interno. La grafica muestra el cambio en el numero de veces (media ± SD, n = 4). Figura 9B: histogramas que representan la fosforilacion de Akt (izquierda) y mTOR (derecha), analizada mediante tincion intracelular de celulas T CD8+ con Ab anti-fosfo-Akt y antifosfo-mTOR. Los numeros muestran el porcentaje de celulas tenidas positivas. Figura 9C: grafico de barras que representa la MFI promedio de la expresion de fosfo-Akt y fosfo-mTOR (media ± SD, n = 3). N.S.: no significativo.
La figura 10 contiene secuencias representativas de acidos nucleicos (parte superior) y aminoacidos (parte inferior) para B7-H1 humano (SEQ ID NO: 1 y 2, respectivamente).
La figura 11 contiene secuencias representativas de acidos nucleicos (parte superior) y aminoacidos (parte inferior) para PD-1 humano (SEQ ID NO: 3 y 4, respectivamente).
Las figuras 12A y 12B contienen secuencias representativas de acidos nucleicos (12A) y aminoacidos (12B) para CD80 humano (SEQ ID NO: 5 y 6, respectivamente).
La figura 13 contiene una grafica (izquierda) que muestra la identificacion de celulas T CD8+ en funcion de su expresion de CD11aalto y PD-1+ (panel izquierdo). Se tineron linfocitos con CD8, CD11a y PD-1, operacion seguida de tincion intracelular para Bim. La figura 13 tambien contiene un histograma que representa la expresion de Bim por subconjuntos de celulas T CD8+ (Tn: celulas T indiferenciadas; PD-1-, celulas estimuladas negativas a PD-1; PD-1+, celulas estimuladas positivas a PD-1). Solo las celulas CD8+ estimuladas con PD-1+ expresaron altos niveles de Bim.
La figura 14 es un par de graficos que representan el nivel de expresion de Bim en celulas T CD8+ PD-1+ CD11 aalto reactivas a tumores en la sangre periferica de 26 pacientes con melanoma en comparacion con 11 controles normales, sanos (panel izquierdo, P = 0,007 mediante la prueba T de Student modificada) y en celulas T CD8+ PD-1+ CD11 aalto reactivas a tumores en la sangre periferica de 11 pacientes con cancer de prostata en comparacion con 11 controles normales, sanos (panel derecho, P = 0,001 mediante la prueba T de Student modificada).
La figura 15 es un par de graficos que representan la expresion de Bim en celulas T CD8+ PD-1 negativas (PD-1 -) y PD-1 positivas (PD-1+) CD11aalto de pacientes con melanoma (izquierda) y controles sanos (derecha). Bim aumento significativamente en las poblaciones PD-1+ (p = 0,0081) en pacientes con melanoma.
La figura 16 es un par de graficos que representan el nivel de expresion de Bim en celulas T CD8+ PD-1+ CD11aalto reactivas a tumores en la sangre periferica de 26 pacientes con melanoma en comparacion con 11 controles normales, sanos (panel izquierdo, que indica las muestras "Bim bajo" y "Bim alto"), y representan la tasa de supervivencia para pacientes de "Bim bajo" frente a pacientes de "Bim alto" (panel derecho).
La figura 17A es un par de graficos que muestran que la proteina B7-H1 indujo la expresion de Bim en celulas T CD8+ preactivadas humanas. La figura 17B es una imagen de una inmunotransferencia Western que muestra niveles de Bim en las celulas.
La figura 18 es un par de graficos que muestran que un anticuerpo anti-PD-1 bloqueo significativamente la regulacion al alza de Bim inducida por B7-H1 de una forma dependiente de la dosis (panel izquierdo), y que los efectos de bloqueo del anticuerpo anti-PD-1 se correlacionaron inversamente con los niveles mas altos de Bim inducidos por B7-H1 (panel derecho).
La figura 19 es un par de graficos que muestran que la frecuencia de celulas T CD8+ Bim+ PD-1+ fue significativamente mayor en la sangre periferica de pacientes con melanoma antes del tratamiento que en un grupo de control sano (panel izquierdo), y que despues del tratamiento anti-PD-1 con anticuerpos, aproximadamente el 67% de los pacientes con melanoma mostraron una reduccion significativa en la frecuencia de celulas T CD8+ Bim+ PD-1+ (panel derecho).
La figura 20 es un par de graficos que muestran que B7-H1 expresado por celulas tumorales indujo la regulacion al alza de celulas T CD8 Bim preactivadas humanas.
La figura 21 es un par de fotografias (izquierda) y un grafico (derecha) que muestra que la expresion de Bim se asocio con la expresion de B7-H1 en el carcinoma de celulas renales (RCC) humanas. En particular, el grafico del panel derecho muestra que los linfocitos infiltrantes de tumores (TIL) Bim+ aumentaron en tejidos tumorales positivos a B7-H1. Puntuaciones de reactividad Bim: 0, ausencia; 1, focal; 2, moderada; 3, marcada. Analisis de contingencia utilizando la prueba exacta de Fisher (p < 0,01).
La figura 22 es un par de graficos que muestran que la expresion de Bim se correlaciono con Granzyme B y T-bet (un factor de transcripcion de celulas T efectoras) expresados por celulas T CD8+ PD-1+ CD11 aalto relacionadas con cancer, lo que sugiere que la expresion de Bim esta asociada con la diferenciacion de celulas T CD8+ efectoras. La figura 23 es un par de graficos que muestran que la expresion de Bim se redujo en celulas T CD8+ PD-1 CD11aalto despues de radioterapia en algunos pacientes con cancer de melanoma (panel izquierdo) y prostata (panel derecho).
Descripcion detallada
El presente documento proporciona materiales y procedimientos para identificar pacientes que tengan mas probabilidades de beneficiarse del tratamiento de bloqueo del punto de control, materiales y procedimientos para determinar la programacion terapeutica optima y las agendas de dosificacion, y procedimientos y materiales para el tratamiento del cancer. Por ejemplo, el presente documento proporciona procedimientos y materiales para determinar que un mamifero (por ejemplo, un ser humano) tiene un nivel elevado de Bim, y tratar al mamifero con una molecula que puede interferir con la interaccion entre B7-H1 y PD-1, y/o la interaccion entre B7-H1 y CD80 (por ejemplo, un anticuerpo contra B7-H1, PD-1 o CD80, o con una proteina de fusion que contiene una porcion de PD-1 o una porcion de CD80 fusionada con un dominio Fc de inmunoglobulina (Ig)). Tal como se describe en el presente documento, niveles elevados de Bim pueden relacionarse con un aumento de la apoptosis de celulas T CD8+ estimuladas con antigeno, pero la inhibicion de la interaccion de B7-H1 con PD-1 o CD80 puede conducir a niveles reducidos de Bim y a una reduccion de la apoptosis de celulas T.
La expresion "nivel elevado", tal como se usa en el presente documento con respecto a un nivel de Bim, se refiere a un nivel que es superior (por ejemplo, el 50% superior, 2 veces superior, 3 veces superior o mas de 3 veces superior) que un nivel de referencia de Bim. La expresion "nivel de referenda", tal como se usa en el presente documento con respecto al Bim, se refiere al nivel de Bim que se observa normalmente en mamiferos sanos sin cancer. Por ejemplo, un nivel de referencia de Bim puede ser el nivel promedio de Bim presente en muestras obtenidas de un muestreo aleatorio de 50 humanos que no padecen cancer.
La presencia de un nivel elevado de Bim puede determinarse midiendo, por ejemplo, niveles de proteina o niveles de acido nucleico. Por ejemplo, el nivel de proteina Bim puede medirse en una muestra de sangre (por ejemplo, una muestra de sangre periferica) u otro fluido corporal de un mamifero con cancer o de un mamifero de control, utilizando tincion de celulas, inmunotransferencia Western u otras tecnicas inmunologicas. El nivel de expresion de Bim tambien puede medirse a nivel de acidos nucleicos, utilizando inmunotransferencia Northern o cualquier otro procedimiento adecuado para determinar los niveles de ARNm de Bcl211, que codifica la proteina Bim. En algunos casos, los niveles de proteina Bim o de acido nucleico se pueden medir en muestras de tejido tumoral, muestras de ascitis o muestras de organos linfoides. Se apreciara que se utilizan niveles de muestras comparables cuando se determina si un nivel particular es un nivel elevado o no.
Un ejemplo representativo de un acido nucleico B7-H1 humano tiene la secuencia expuesta en GENBANK® con el N° de acceso AF177937 (GI N° 6708118) (SEQ ID NO: 1; figura 10), y un polipeptido B7-H1 humano representativo tiene la secuencia expuesta en GENBANK® con el N° de acceso AAF25807 (GI N° 6708119) (SEQ ID NO: 2; figura 10).
Un ejemplo representativo de un acido nucleico PD-1 humano puede tener la secuencia expuesta en GENBANK® con el N° de acceso BC074740.2 (GI N° 50960296) (SEQ ID NO: 3; figura 11), y un ejemplo representativo de un polipeptido PD-1 humano tiene la secuencia expuesta en GENBANK® con el N° de acceso AAH74740.1 (GI N° 49902307) (SEQ ID NO: 4; figura 11).
Un ejemplo representativo de un acido nucleico CD80 humano tiene la secuencia expuesta en NCBI con el N° de referencia NM_005191.3 (GI N° 113722122) (SEQ ID NO: 5; figura 12A), y un ejemplo representativo de un polipeptido CD80 humano tiene la secuencia expuesta en NCBI con el N° de referencia NP_005182.1 (GI N° 4885123) (SEQ ID NO: 6; figura 12B).
Una vez que se determina el nivel de Bim dentro de una muestra de un mamifero, el nivel puede compararse con un nivel de referencia y utilizarse para clasificar al mamifero como que tiene o como que carece de un nivel elevado de Bim.
Una vez que se ha determinado que un mamifero tiene un nivel elevado de Bim tal como se describe en el presente documento, se puede administrar al mamifero una molecula que inhibe la interaccion entre B7-H1 y PD-1 y/o la interaccion entre B7-H1 y CD80. Los ejemplos de dichas moleculas incluyen, sin limitacion, anticuerpos (por ejemplo, anticuerpos anti-B7-H1, anticuerpos anti-PD-1 o anticuerpos anti-CD80) y proteinas de fusion (por ejemplo, proteinas de fusion PD-1 o proteinas de fusion CD80). Dichas proteinas de fusion pueden contener, por ejemplo, el dominio extracelular de PD-1 fusionado con un dominio Fc de IgG, o el dominio extracelular de CD80 fusionado con un dominio Fc de IgG. Despues de la administracion, el/los anticuerpo(s) o la(s) proteina(s) de fusion pueden unirse a B7-H1, reduciendo o bloqueando asi la accion de B7-H1 en la induccion de la regulacion al alza de Bim.
El termino "anticuerpo" incluye anticuerpos monoclonales, anticuerpos policlonales, anticuerpos recombinantes, anticuerpos humanizados (Jones et al. (1986) Nature 321: 522-525; Riechmann et al. (1988) Nature 332: 323-329; y Presta (1992) Curr. Op. Struct Biol. 2: 593-596), anticuerpos quimericos (Morrison et al. (1984) Proc. Natl Acad Sci. USA 81: 6851-6855), anticuerpos multiespecificos (por ejemplo, anticuerpos biespecificos) formados a partir de al menos dos anticuerpos, y fragmentos de anticuerpos. La expresion "fragmento de anticuerpo" comprende cualquier porcion de los anticuerpos mencionados anteriormente, tales como sus regiones de union a antigeno o variables. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpos incluyen fragmentos Fab, fragmentos Fab', fragmentos F(ab')2, fragmentos Fv, diacuerpos (Hollinger et al. (1993) Proc. Natl Acad Sci. USA 90: 6444-6448), moleculas de anticuerpo monocatenarias (Pluckthun en: The Pharmacology of Monoclonal Antibodies 113, Rosenburg y Moore, eds., Springer Verlag, N.Y. (1994), 269-315) y otros fragmentos siempre que muestren la capacidad de union a B7-H1, PD-1 o CD80 deseada.
Los ejemplos de anticuerpos anti-B7-H1 humanos incluyen, sin limitacion, anticuerpos anti-B7-H1 humano disponibles comercialmente de Biolegend (por ejemplo, N° de catalogo 329701 o 329702; San Diego, CA) o eBioscience (por ejemplo, N° de catalogo 14-5983-80 o 14-5983-82).
Los ejemplos de anticuerpos anti-PD-1 humanos incluyen, sin limitacion, anticuerpos anti-PD-1 humano disponibles en el mercado de Biolegend (por ejemplo, N° de catalogo 329904 o 329905) o eBioscience (N° de catalogo 12-2799­ 42; San Diego, CA).
Los ejemplos de anticuerpos anti-CD80 humanos incluyen, sin limitacion, anticuerpos anti-CD8 humano disponibles comercialmente de Biolegend (por ejemplo, N° de catalogo 305201 o 305202) o eBioscience (por ejemplo, N° de catalogo 14-0809-80 o 14-0809-82).
El termino "anticuerpo", tal como se usa en el presente documento, tambien incluye moleculas similares a anticuerpos que contienen subdominios manipulados geneticamente de anticuerpos o variantes de anticuerpos de origen natural. Estas moleculas similares a anticuerpos pueden ser anticuerpos de un unico dominio, tales como dominios de unicamente VH o de unicamente VL derivados o bien de fuentes naturales tales como camelidos (Muyldermans et al. (2001) Rev. Mol. Biotecnol. 74: 277-302) o bien a traves de una representacion in vitro de bibliotecas de seres humanos, camelidos u otras especies (Holt et al. (2003) Trends Biotechnol. 21: 484-90). En determinadas formas de realizacion, la estructura polipeptidica de las proteinas de union a antigeno puede estar basada en anticuerpos, que incluyen, pero sin limitacion, minicuerpos, anticuerpos sinteticos (a veces denominados "mimeticos de anticuerpos"), anticuerpos humanos, fusiones de anticuerpos (a veces denominadas "conjugados de anticuerpos"), y fragmentos de los mismos, respectivamente.
Un "fragmento Fv" es el fragmento de anticuerpo minimo que contiene un sitio completo de reconocimiento y de union a antigeno. Esta region consiste en un dimero de un dominio variable de cadena pesada y un dominio variable de cadena ligera en asociacion estrecha y no covalente. Es en esta configuracion que las tres CDR de cada dominio variable interactuan para definir un sitio de union a antigeno en la superficie del dimero VH-VL. En conjunto, las seis CDR confieren especificidad de union al antigeno al anticuerpo. No obstante, incluso un unico dominio variable (o la mitad de un Fv que comprende solo tres CDR especificas para un antigeno) tiene la capacidad de reconocer y unirse al antigeno, aunque habitualmente con una afinidad menor que la totalidad del sitio de union. El "fragmento Fab" tambien contiene el dominio constante de la cadena ligera y el primer dominio constante (CH1) de la cadena pesada. El "fragmento Fab" se diferencia del "fragmento Fab'" en la adicion de unos pocos residuos en el extremo carboxi del dominio Ch1 de la cadena pesada, que incluye una o mas cisteinas a partir de la region bisagra del anticuerpo. El "fragmento F(ab')2" se produce originariamente como un par de "fragmentos Fab" que tienen cisteinas de bisagra entre los mismos. Los procedimientos para preparar dichos fragmentos de anticuerpos, tales como digestion con papaina o pepsina, son conocidos por los expertos en la tecnica.
Un anticuerpo puede ser del tipo IgA, IgD, IgE, IgG o IgM, incluidos los tipos IgG o IgM, tales como, sin limitacion, los tipos IgG 1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM1 e IgM2. Por ejemplo, en algunos casos, el anticuerpo es del tipo IgG1, IgG2 o IgG4.
En algunas formas de realizacion, los anticuerpos, tal como se usan en los procedimientos descritos en el presente documento, pueden ser anticuerpos completamente humanos o humanizados. Los anticuerpos humanos pueden evitar determinados problemas asociados con anticuerpos xenogenicos, tales como anticuerpos que poseen regiones constantes y/o variables murinas o de rata. En primer lugar, debido a que la porcion efectora es humana, puede interactuar mejor con otras partes del sistema inmunitario humano, por ejemplo, para destruir celulas diana de forma mas eficaz mediante citotoxicidad dependiente del complemento o citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo. En segundo lugar, el sistema inmunitario humano no deberia reconocer el anticuerpo como extrano. En tercer lugar, la semivida en la circulacion humana sera similar a los anticuerpos humanos de origen natural, permitiendo que se administren dosis mas pequenas y menos frecuentes. Los procedimientos para preparar anticuerpos humanos son conocidos en la tecnica.
Ademas de los anticuerpos humanos, los anticuerpos "humanizados" pueden tener muchas ventajas. Los anticuerpos humanizados generalmente son anticuerpos monoclonales quimericos o mutantes de raton, rata, hamster, conejo u otras especies, que poseen dominios de region constante y/o variable humanos o cambios especificos. Las tecnicas para generar anticuerpos humanizados son bien conocidas por los expertos en la tecnica. Por ejemplo, se puede utilizar la reorganizacion controlada de dominios de anticuerpos unidos a traves de enlaces disulfuro de proteinas para formar nuevas moleculas de proteinas artificiales o anticuerpos "quimericos" (Konieczny et al. (1981) Haematologia (Budap.) 14:95). Se puede utilizar la tecnologia de ADN recombinante para construir fusiones geneticas entre secuencias de ADN que codifican dominios variables de cadena ligera y pesada de anticuerpos de raton y dominios constantes de cadena ligera y pesada de anticuerpos humanos (Morrison et al. (1984) Proc. Natl Acad Sci. USA 81:6851).
Las secuencias de ADN que codifican porciones de union al antigeno o regiones determinantes de la complementariedad (CDR) de anticuerpos monoclonales murinos pueden injertarse por medios moleculares en secuencias de ADN que codifican marcos estructurales de cadenas pesadas y ligeras de anticuerpos humanos (Jones et al. (1986) Nature 321:522; Riechmann et al. (1988) Nature 332:323). Los productos recombinantes expresados se denominan anticuerpos "remodelados" o humanizados, y comprenden el marco estructural de una cadena ligera o pesada de anticuerpo humano y porciones de reconocimiento de antigeno, CDR, de un anticuerpo monoclonal murino.
Otros procedimientos para disenar cadenas pesadas y ligeras y para producir anticuerpos humanizados se describen, por ejemplo, en las patentes de Estados Unidos N° 5.530.101, 5.565.332, 5.585.089, 5.639.641, 5.693.761, 5.693.762 y 5.733.743. No obstante, se describen procedimientos adicionales para humanizar anticuerpos en las patentes de Estados Unidos N° 4.816.567, 4.935.496, 5.502.167, 5.558.864, 5.693.493, 5.698.417, 5.705.154, 5.750.078 y 5.770.403, por ejemplo.
Pueden incorporarse moleculas que interfieren con la interaccion entre B7-H1 y PD-1, y/o la interaccion entre B7-H1 y CD80, tal como se describe en el presente documento (por ejemplo, anticuerpos contra B7-H1, PD-1 y CD80, asi como proteinas de fusion que contienen porciones de PD-1 o CD80 unidas a un dominio Fc de Ig) en composiciones farmaceuticas para el tratamiento del cancer. Por lo tanto, el presente documento tambien proporciona el uso de dichas moleculas en la fabricacion de medicamentos para el tratamiento del cancer. Las composiciones pueden incluir ademas uno o mas vehiculos, diluyentes y/o coadyuvantes farmaceuticamente aceptables. La potencia de las composiciones farmaceuticas proporcionadas en el presente documento se basa normalmente en la union del anticuerpo o proteina de fusion a B7-H1.
Un "vehiculo farmaceuticamente aceptable" (tambien denominado "excipiente" o "vehiculo") es un disolvente, agente de suspension, agente estabilizante o cualquier otro vehiculo farmacologicamente inerte para la administracion de uno o mas compuestos terapeuticos a un sujeto que no es toxico para la celula o el mamifero que se expone al mismo a las dosis y las concentraciones empleadas. Los vehiculos farmaceuticamente aceptables pueden ser liquidos o solidos, y pueden seleccionarse considerando la forma de administracion planificada para proporcionar el volumen masico deseado, la consistencia y otras propiedades quimicas y de transporte pertinentes, cuando se combinan con uno o mas de los compuestos terapeuticos y cualesquiera otros componentes de una composicion farmaceutica dada. Los vehiculos farmaceuticamente aceptables tipicos que no reaccionan de forma perjudicial con aminoacidos incluyen, a modo de ejemplo y sin limitacion: agua, solucion salina, agentes aglutinantes (por ejemplo, polivinilpirrolidona o hidroxipropilmetilcelulosa), materiales de carga (por ejemplo, lactosa y otros azucares, gelatina o sulfato de calcio), lubricantes (por ejemplo, almidon, polietilenglicol o acetato de sodio), disgregantes (por ejemplo, almidon o almidon-glicolato de sodio) y agentes humectantes (por ejemplo, laurilsulfato de sodio). Los vehiculos farmaceuticamente aceptables tambien incluyen soluciones acuosas con pH tamponado o liposomas (vesiculas pequenas compuestas por varios tipos de lipidos, fosfolipidos y/o tensioactivos que son utiles para la administracion de un farmaco a un mamifero). Otros ejemplos de vehiculos farmaceuticamente aceptables incluyen tampones tales como fosfato, citrato y otros acidos organicos, antioxidantes tales como acido ascorbico, polipeptidos de bajo peso molecular (menos de aproximadamente 10 residuos), proteinas tales como seroalbumina, gelatina o inmunoglobulinas, polimeros hidrofilos tales como polivinilpirrolidona, aminoacidos tales como glicina, glutamina, asparagina, arginina o lisina, monosacaridos, disacaridos y otros carbohidratos que incluyen glucosa, manosa o dextrinas, agentes quelantes tales como EDTA, alcoholes de azucar tales como manitol o sorbitol, contraiones salinos tales como sodio y/o tensioactivos no ionicos tales como TWEEN™, polietilenglicol (PEG) y PLURONICS™.
Las composiciones farmaceuticas pueden formularse mezclando uno o mas agentes activos con uno o mas vehiculos, diluyentes y/o coadyuvantes fisiologicamente aceptables, y opcionalmente otros agentes que normalmente se incorporan en formulaciones para proporcionar unas mejores transferencia, administracion, tolerancia y similares. Se puede formular una composicion farmaceutica, por ejemplo, en formulaciones liofilizadas, soluciones acuosas, dispersiones o preparaciones solidas, tales como comprimidos, grageas o capsulas. Se puede encontrar una pluralidad de formulaciones apropiadas en el formulario conocido por todos los quimicos farmaceuticos: Remington's Pharmaceutical Sciences (18s ed., Mack Publishing Company, Easton, PA (1990)), particularmente en el capitulo 87 por Block, Lawrence, en el mismo. Estas formulaciones incluyen, por ejemplo, polvos, pastas, pomadas, jaleas, ceras, aceites, lipidos, vesiculas que contienen lipidos (cationicos o anionicos) (tales como LIPOFECTIN™), conjugados de ADN, pastas de absorcion anhidras, emulsiones de aceite en agua y de agua en aceite, emulsiones de carbowax (polietilenglicoles de diversos pesos moleculares), geles semisolidos y mezclas semisolidas que contienen carbowax. Cualquiera de las mezclas anteriores puede ser apropiada en tratamientos y terapias tal como se describen en el presente documento, siempre que el agente activo de la formulacion no se inactive por la formulacion y la formulacion sea fisiologicamente compatible y tolerable con la via de administracion. Vease tambien, Baldrick (2000) Regul. Toxicol. Pharmacol. 32: 210-218; Wang (2000) Int. J. Pharm. 203: 1-60; Charman (2000) J. Pharm. Sci. 89: 967-978; y Powell et al. (1998) PDA J. Pharm. Sci. Tecnol. 52: 238-311), y citas de los mismos para obtener información adicional relacionada con formulaciones, excipientes y vehiculos bien conocidos por los quimicos farmaceuticos.
Las composiciones farmaceuticas incluyen, sin limitacion, soluciones, emulsiones, suspensiones acuosas y formulaciones que contienen liposomas. Estas composiciones pueden generarse a partir de una diversidad de componentes que incluyen, por ejemplo, liquidos preformados, solidos autoemulsionables y semisolidos autoemulsionables. Las emulsiones son, a menudo, sistemas bifasicos que comprenden dos fases liquidas no miscibles intimamente mezcladas y dispersadas entre si; en general, las emulsiones son de la variedad de agua en aceite (w/o) o de aceite en agua (o/w). Las formulaciones en emulsion se han utilizado ampliamente para la administracion oral de productos terapeuticos debido a su facilidad de formulacion y su eficacia de solubilizacion, absorcion y biodisponibilidad.
Las composiciones y formulaciones pueden incluir soluciones acuosas esteriles, que tambien pueden contener tampones, diluyentes y otros aditivos adecuados (por ejemplo, potenciadores de la penetracion, compuestos vehiculo y otros vehiculos farmaceuticamente aceptables). Las composiciones pueden contener adicionalmente otros componentes adjuntos que se encuentran convencionalmente en composiciones farmaceuticas. Por lo tanto, las composiciones pueden incluir tambien materiales farmaceuticamente activos compatibles, tales como, por ejemplo, antipruriticos, astringentes, anestesicos locales o agentes antiinflamatorios, o materiales adicionales utiles para formular fisicamente diversas formas de dosificacion de las composiciones proporcionadas en el presente documento, tales como tintes, agentes aromatizantes, conservantes, antioxidantes, opacificantes, agentes espesantes y estabilizantes. Ademas, la composicion se puede mezclar con agentes auxiliares, por ejemplo, lubricantes, conservantes, estabilizantes, agentes humectantes, emulsionantes, sales para influir en la presion osmotica, tampones, colorantes, saborizantes y sustancias aromaticas. No obstante, cuando se anaden, dichos materiales no deben interferir indebidamente con las actividades biologicas de los componentes polipeptidicos dentro de las composiciones proporcionadas en el presente documento. Si se desea, las formulaciones pueden esterilizarse.
En algunas formas de realizacion, una composicion que contiene un anticuerpo o proteina de fusion tal como se proporciona en el presente documento (por ejemplo, un anticuerpo anti-B7-H7, anti-PD-1 o anti-CD80, o una proteina de fusion PD-1 Fc o CD80 Fc) puede encontrarse en forma de una solucion o polvo con o sin un diluyente para producir una suspension inyectable. La composicion puede contener ingredientes adicionales que incluyen, sin limitacion, vehiculos farmaceuticamente aceptables, tales como solucion salina, agua, acido lactico, manitol o combinaciones de los mismos, por ejemplo.
Se puede utilizar cualquier procedimiento apropiado para administrar una molecula tal como se describe en el presente documento a un mamifero. La administracion puede realizarse, por ejemplo, por via parenteral (por ejemplo, mediante inyeccion subcutanea, intratecal, intraventricular, intramuscular o intraperitoneal, o por goteo intravenoso). La administracion puede ser rapida (por ejemplo, mediante inyeccion) o puede producirse durante un periodo de tiempo (por ejemplo, mediante infusion lenta o la administracion de formulaciones de liberacion lenta). En algunas formas de realizacion, la administracion puede ser topica (por ejemplo, transdermica, sublingual, oftalmica o intranasal), pulmonar (por ejemplo, por inhalacion o insuflacion de polvos o aerosoles) u oral. Ademas, una composicion que contiene un anticuerpo o proteina de fusion tal como se describe en el presente documento puede administrarse antes, despues o en lugar de la reseccion quirurgica de un tumor.
Una composicion que contiene un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo anti-B7-H1, un anticuerpo anti-PD-1 o un anticuerpo anti-CD80) o una proteina de fusion (por ejemplo, una fusion PD-1 Fc o una fusion CD80 Fc) puede administrarse a un mamifero en cualquier cantidad apropiada, a cualquier frecuencia apropiada, y durante cualquier periodo de tiempo apropiado eficaz para lograr un resultado deseado (por ejemplo, para aumentar la supervivencia libre de progresion). En algunos casos, una composicion que contiene un anticuerpo o una proteina de fusion tal como se describe en el presente documento puede administrarse a un mamifero que tiene cancer para reducir la velocidad de progresion del cancer en el 5, 10, 25, 50, 75, 100 o mas por ciento. Por ejemplo, la velocidad de progresion puede reducirse de forma que no se detecte una progresion adicional del cancer. Se puede utilizar cualquier procedimiento apropiado para determinar si se reduce o no la velocidad de progresion del cancer. Para el cancer de piel (por ejemplo, el melanoma), por ejemplo, la velocidad de progresion puede evaluarse tomando imágenes de tejido en diferentes puntos temporales y determinando la cantidad de celulas cancerosas presentes. Las cantidades de celulas cancerosas determinadas dentro del tejido en diferentes momentos se pueden comparar para determinar la velocidad de progresion. Despues del tratamiento tal como se describe en el presente documento, la velocidad de progresion puede determinarse nuevamente en otro intervalo de tiempo. En algunos casos, se puede determinar el estadio del cancer despues del tratamiento y compararlo con el de la etapa antes del tratamiento para determinar si la velocidad de progresion se ha reducido o no.
En algunos casos, una composicion que contiene un anticuerpo o una proteina de fusion tal como se describe en el presente documento se puede administrar a un mamifero que tiene cancer en condiciones en las que la supervivencia libre de progresion aumenta (por ejemplo, en el 5, 10, 25, 50, 75, 100 o mas por ciento) en comparacion con la mediana de la supervivencia libre de progresion de los mamiferos correspondientes que tienen cancer sin tratar o la mediana de la supervivencia libre de progresion de los mamiferos correspondientes que tienen cancer y se han tratado por medio de otros tratamientos (por ejemplo, agentes quimioterapeuticos). La supervivencia libre de progresion se puede medir en cualquier periodo de tiempo (por ejemplo, un mes, dos meses, tres meses, cuatro meses, cinco meses, seis meses o un periodo mas prolongado).
La administracion a un mamifero de una molecula como se establece en el presente documento puede producir un aumento en el numero de celulas T CD8+ reactivas al tumor de origen natural, que pueden ejercer efectos anticancerosos contra las celulas cancerosas presentes en el mamifero.
Una cantidad eficaz de una composicion que contiene una molecula tal como se proporciona en el presente documento puede ser cualquier cantidad que reduzca la velocidad de progresion del cancer, aumente la tasa de supervivencia libre de progresion o aumente la mediana del tiempo de progresion sin producir una toxicidad significativa para el mamifero. Las dosis optimas pueden variar dependiendo de la potencia relativa de los polipeptidos individuales (por ejemplo, anticuerpos y proteinas de fusion), y generalmente pueden estimarse basandose en la CE50 que se ha descubierto que es eficaz en modelos animales in vitro e in vivo. Generalmente, la dosis es de 0,01 gg a 100 g por kg de peso corporal. Por ejemplo, una cantidad eficaz de un anticuerpo o proteina de fusion puede ser de aproximadamente 1 mg/kg a aproximadamente 100 mg/kg (por ejemplo, aproximadamente 5 mg/kg, aproximadamente 10 mg/kg, aproximadamente 20 mg/kg, aproximadamente 50 mg/kg, o aproximadamente 75 mg/kg). Si un mamifero particular no responde a una cantidad particular, entonces la cantidad del anticuerpo o la proteina de fusion se puede aumentar, por ejemplo, dos veces. Despues de recibir esta concentracion mas alta, se puede realizar un seguimiento al mamifero para determinar su capacidad de respuesta al tratamiento y los sintomas de toxicidad, y se pueden realizar los ajustes correspondientes. La cantidad eficaz puede permanecer constante o puede ajustarse como una escala movil o una dosis variable dependiendo de la respuesta del mamifero al tratamiento. Pueden influir diversos factores en la cantidad eficaz real utilizada para una aplicacion particular. Por ejemplo, la frecuencia de administracion, la duracion del tratamiento, el uso de multiples agentes de tratamiento, la via de administracion y la gravedad del cancer pueden requerir un aumento o una reduccion de la cantidad eficaz real administrada.
La frecuencia de administracion puede ser cualquier frecuencia que reduzca la velocidad de progresion del cancer, aumente la tasa de supervivencia libre de progresion o aumente la mediana del tiempo de progresion sin producir una toxicidad significativa para el mamifero. Por ejemplo, la frecuencia de administracion puede ser de una vez o mas de forma diaria, quincenal, semanal, mensual, o incluso menor. La frecuencia de administracion puede permanecer constante o puede variar durante la duracion del tratamiento. Un curso de tratamiento puede incluir periodos de descanso. Por ejemplo, una composicion que contiene un anticuerpo o una proteina de fusion tal como se proporciona en el presente documento puede administrarse durante un periodo de dos semanas, seguido de un periodo de descanso de dos semanas, y dicho regimen se puede repetir varias veces. Al igual que con la cantidad eficaz, pueden influir diversos factores en la frecuencia real de administracion utilizada para una aplicacion particular. Por ejemplo, la cantidad eficaz, la duracion del tratamiento, el uso de multiples agentes de tratamiento, la via de administracion y la gravedad del cancer pueden requerir un aumento o una reduccion de la frecuencia de administracion.
Una duracion eficaz para administrar una composicion proporcionada en el presente documento puede ser cualquier duracion que reduzca la velocidad de progresion del cancer, aumente la tasa de supervivencia libre de progresion o aumente la mediana del tiempo de progresion sin producir una toxicidad significativa para el mamifero. Por lo tanto, la duracion eficaz puede variar de varios dias a varias semanas, meses o anos. En general, la duracion eficaz del tratamiento del cancer puede variar entre varias semanas y varios meses. En algunos casos, una duracion eficaz puede durar mientras un mamifero individual este vivo. Pueden influir diversos factores en la duracion eficaz real utilizada para un tratamiento en particular. Por ejemplo, una duracion eficaz puede variar con la frecuencia de administracion, la cantidad eficaz, el uso de multiples agentes de tratamiento, la via de administracion y la gravedad del cancer.
Despues de administrar una composicion proporcionada en el presente documento a un mamifero, se puede realizar un seguimiento del mamifero para determinar si se ha tratado o no el cancer. Por ejemplo, un mamifero puede evaluarse despues del tratamiento para determinar si la velocidad de progresion del cancer se ha reducido o no (por ejemplo, se ha detenido). Puede usarse cualquier procedimiento, incluidos los que son estandar en la tecnica, para evaluar la progresion y las tasas de supervivencia.
La invencion se describira adicionalmente en los siguientes ejemplos, que no limitan el alcance de la invencion descrita en las reivindicaciones.
EJEMPLOS
Ejemplo 1: Materiales y procedimientos
Ratones, lineas celulares y reactivos: Se adquirieron ratones CD45.2+ C57BL/6 hembra de Taconic Farms y se adquirieron ratones C57BL/6-Ly5.1 congenicos CD45.1+ de National Cancer Institute. Se suministraron ratones transgenicos OT-1 TCR (Thy 1.1+) por T. Tian (Harvard University, Boston, MA). Se suministraron ratones C57BL/6 deficientes en B7-H1 por L. Chen (Universidad de Yale, New Haven, CT; Dong et al., Immunity 20: 327-336, 2004). Se adquirieron ratones Bcl211-/- y ratones Cd80-/- de Jackson Laboratory. Se cruzaron ratones Cd80-/- con ratones OT-1 WT y produjeron ratones Cd80-/- OT-1. Se suministraron ratones transgenicos Bcl-2 por V. Shapiro (Mayo Clinic, Rochester). Los ratones se mantuvieron en condiciones exentas de patogenos y se utilizaron a las 8-12 semanas de edad. Se suministraron celulas de melanoma murino B16-OVA por R. Vile (Mayo Clinic, Rochester, MN) y se cultivaron en medio RPMI 1640 (Cellgro) con FBS al 10% (Life Technologies), 1 U/ml de penicilina, 1 pg/ml de estreptomicina y 20 mM de tampon HEPES (todos de Mediatech). Se obtuvo mAb (anticuerpo monoclonal) de hamster anti-B7-H1 de raton (10B5) y PD-1 (G4) a partir de celulas de hibridoma suministradas por L. Chen. Se suministro mAb anti-B7-H1 de raton (43H12) de hamster por K. Tamada (John Hopkins University).
Analisis por citometria de flujo: Se adquirieron tetramero MHC de clase I (peptido KbOVA SIINFEKL; SEQ ID NO: 1) y tetramero de control negativo de Beckman Coulter. Se adquirieron Ab conjugados a fluorocromo contra CD8, CD11a, Fas (CD95), ligando Fas, CD90.1 (Thy 1.1), CD90.2 (Thy 1.2), CD107a, IPNy, IL-2 y TNFa de BD Biosciences, BioLegend, o eBiosciences. Para detectar los niveles de citocinas intracelulares, las celulas se incubaron con GolgiPlug (BD Biosciences) durante 4 horas antes del analisis. Las celulas se tineron para detectar antigenos de superficie y despues se incubaron en tampon de fijacion (BioLegend) durante 20 minutos a temperatura ambiente, operacion seguida de permeabilizacion en tampon de lavado de permeabilizacion (BioLegend). Despues se tineron celulas fijas y permeabilizadas con Ab durante 20 minutos a temperatura ambiente. Se adquirieron Ab para Akt, Bcl-xL, Bcl-2, Bim y mTOR y Ab secundarios conjugados a fluorocromo de Cell Signaling (Danvers, MA). Para detectar los niveles intracelulares de Akt, Bcl-xL, Bcl-2, Bim y mTOR, se tineron en primer lugar celulas T para detectar antigenos de superficie, despues se fijaron con paraformaldehido al 2% durante 10 minutos a 37 °C, operacion seguida de permeabilizacion con metanol enfriado con hielo durante 30 minutos. Despues de bloquear con suero de rata al 15% durante 15 minutos, las celulas se tineron con Ab durante 1 hora a temperatura ambiente. Despues de la tincion, las celulas se lavaron tres veces con tampon de incubacion antes del analisis. Al menos 100.000 celulas viables se clasificaron en vivo en instrumentos FACScan o FACSCailbur (BD Biosciences). El analisis por citometria de flujo se realizo utilizando el programa informatico FlowJo (T ree Star).
Inmunizacion, activacion, ensayo de apoptosis y ensayo de proliferacion de celulas T: Se inmunizaron ratones mediante inyeccion i.p. 0,5 mg de ovoalbumina (OVA, de Sigma-Aldrich) y 50 pg de poli (I:C) (Sigma Aldrich). Para la activacion y el ensayo de apoptosis in vitro de celulas T, se marcaron celulas T CD8+ purificadas con CFSE (Invitrogen-Molecular Probes) y se incubaron con peptido OVA257-264 (Instalaciones Principales de la Mayo Clinic) a 0,2 pg/ml durante 72 horas. La apoptosis de celulas T CD8+ se analizo mediante tincion utilizando anexina V (BD Biosciences) y TMRE (ester etflico de tetrametilrodamina, Invitrogen/Molecular Probes T-669). Tambien se midio la proliferacion mediante deteccion de la incorporacion de BrdU y tincion con Ki67. A los ratones inmunizados se les inyecto i.p. 0,8 mg/ml de BrdU (BD Biosciences) los dfas 4 a 6 despues de la inmunizacion. El dfa 7 despues de la inmunizacion, la incorporacion de BrdU se determino mediante tincion intranuclear con anti-BrdU (B9285, Sigma-Aldrich) y anti-Ki67 (556027, BD Biosciences).
Ensayo de CTL in vivo. Para el ensayo de CTL in vivo, se marcaron celulas de bazo pulsadas con peptido OVA257-264 o pulsadas con peptido de control (como celulas diana) de ratones singenicos con una dosis alta de CFSE (5 pM) o una dosis baja de CFSE (0,5 pM), se mezclaron a 1:1 (2,5 x 106 de cada uno) antes de la inyeccion. Las celulas diana se inyectaron i.v. a ratones inmunizados el dfa 4 despues de la reprovocacion con protefna antfgeno cognado. La actividad de CTL se determino 4 horas despues de la transferencia de celulas diana. La lisis especffica se calcula utilizando las formulas siguientes:
proporcion = (% de CFSE alta/% de CFSE baja), % de lisis especffica = [1 - (proporcion estimulada/proporcion sin estimular)] x 100%
Estudios de tumores: A los ratones se les inoculo i.v. 5 x 105 celulas tumorales B16-OVA el dfa 25 despues de la inmunizacion. El dfa 21 despues de la inyeccion del tumor, los ratones se sacrificaron y el tejido pulmonar se perfundio con PBS. Se realizo un recuento del numero de focos tumorales en el tejido pulmonar.
Experimentos de transferencia de celulas T: Se inyectaron i.v. celulas T CD8+ purificadas (1 x 106) de ratones transgenicos Thy1.1 OT-1 en ratones Thy 1.2+ WT o deficientes en B7-H1, operacion seguida de inmunizacion con OVA mas poli I:C. El dfa 7 despues de la inmunizacion, las celulas T CD8+ transferidas se identificaron por su expresion de Thy1.1 y se usaron para la deteccion de la expresion intracelular de Bim, Bcl-2 y Bcl-xL. Se inyectaron cantidades iguales de celulas T CD8+ OT-1 Cd80-/- (CD45.2+) y WT (Thy1.1+, CD45.2+) (106 de cada uno) en ratones CD45.1+, operacion seguida de la inmunizacion de OVA y poli I:C. Las celulas T CD8+ OT-1 transferidas en el bazo se identificaron mediante citometrfa de flujo.
Activacion de celulas T in vitro y cultivo con protefnas de fusion: Se recogieron celulas de bazo de ratones sin tratamiento previo y se preactivaron con ConA (5 pg/ml, L7647, Sigma-Aldrich) durante 48 horas. Despues de la activacion, las celulas T CD8+ se purificaron (kit de seleccion negativa de celulas T CD8+ EasySep, Stem Cell Technologies) y se incubaron con anti-CD3 unida a placa (BD Biosciences) y protefna de fusion B7-H1 Fc o protefna Fc de control (R&D Systems). Los cultivos se mantuvieron durante los perfodos de tiempo indicados y despues las celulas se recogieron para el analisis.
Inmunotransferencia Western: Se lisaron celulas con tampon NETN (NP40 al 0,5%, NaCl 150 mM, Tris 50 mM y EDTA 1 mM). Los lisados celulares se llevaron a ebullicion y se procesaron en geles de SDS-PAGE (BioRad), se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa (Millipore) y se inmunotransfirieron utilizando procedimientos estandar.
RT-PCR cuantitativa: Se aislo ARN total a partir de celulas T CD8+ purificadas (RNeasy Kit, Qiagen), y se transcribio de forma inversa (kit de sfntesis de iScriptcDNA, BioRad). Las muestras se analizaron para determinar los niveles de transcripto Bim utilizando cebadores Bcl211 (Qiagen) y QuantiFast SYBR Green PCR Master Mix (Qiagen) en un iCycler (BioRad). Los niveles de GAPDH se utilizaron para normalizar los datos mediante el procedimiento de TC comparativa.
Analisis estadistico: Se utilizo una prueba t de Student bilateral, desapareada o apareada para evaluar diferencias estadfsticas en grupos experimentales. Un valor de p < 0,05 se considero estadfsticamente significativo.
Ejemplo 2: Se generan mas celulas T de memoria en ausencia de B7-H1
La cinetica de las respuestas de las celulas T CD8+ en el bazo y el hfgado de ratones C57BL/6 WT y deficientes en B7-H1 se comparo despues de la inmunizacion con protefna ovoalbumina (OVA) y acido poliinosmico:policitidflico (poli (I:C)) como coadyuvante. Se observo un mayor numero de celulas T CD8+ en el maximo de la respuesta inmunitaria (dfa 7 despues de la inmunizacion) en el bazo y el hfgado de ratones deficientes en B7-H1 en comparacion con ratones WT. Durante la fase de contraccion (dfas 7 a 14 despues de la inmunizacion) hubo un retardo significativo en la reduccion de las celulas T CD8+ especfficas de antfgeno en el bazo y el hfgado de ratones deficientes en B7-H1 en comparacion con ratones WT. El dfa 40 despues de la inmunizacion, se detectaron mas celulas T CD8+ de memoria especfficas de antfgeno en ratones deficientes en B7-H1 en comparacion con ratones WT (figura 1). Estos datos sugirieron que el B7-H1 huesped puede regular el grado de expansion y contraccion de celulas T CD8+ efectoras, influyendo asf en el tamano del conjunto de celulas T CD8+ de memoria tanto en los tejidos linfoides como en los no linfoides.
Se realizaron estudios para examinar hasta que grado regula B7-H1 la generacion de celulas T CD8+ de memoria en ratones inmunizados, utilizando tetramero KbOVA257-264 (KbOVA-tet) para detectar celulas T CD8+ de memoria estimuladas con antigeno en el bazo el dia 4 despues de reestimulacion in vivo (proteina OVA, administrada el dia 40 despues de la inmunizacion primaria). El dia 4 se selecciono para el analisis porque en ese punto temporal es posible distinguir una respuesta de recuperació dne la respuesta primaria (que tarda 7 dias en establecerse). Por lo tanto, los ratones sin tratamiento previo no mostraron un aumento significativo de celulas T CD8+ especificas de antigeno el dia 4 despues de la inmunizacion (figura 2A). La frecuencia de celulas T CD8+ KbOVA-tet+ aumento mas de 2 veces en ratones inmunizados deficientes en B7-H1 (0,38%) en comparacion con ratones WT (0,16%; p < 0,05; figura 2A). Este aumento se reflejo en las numeros de celulas absolutos (p = 0,001; figura 2B). Ademas de tener un mayor numero de celulas T CD8+ de memoria, se detecto un porcentaje aumentado de celulas T CD8+ de memoria capaces de producir multiples citocinas en el bazo de ratones deficientes en B7-H1 (0,73% de IFNY+/TNFa+, 0,17% de IFNy+/IL-2+) en comparacion con ratones WT (0,24% de IFNY+/TNFa+, 0,07% de IFNy+/IL-2+; p < 0,05; figura 2C). Tambien se realizo un ensayo CTL in vivo para medir la actividad citolitica de las celulas T CD8+ de memoria. El dia 4 despues de la reestimulacion in vivo se inyectaron celulas diana (esplenocitos singenicos marcados con CFSE alto o bajo) pulsadas con peptidos OVA o peptido de control en ratones inmunizados WT y deficientes en B7-H1. Cuatro horas despues de la inyeccion de celulas, se analizaron las celulas positivas a CFSE remanentes en el bazo. Las celulas T CD8+ de memoria en los ratones deficientes en B7-H1 lisaron mas celulas diana pulsadas con peptido OVA (33,5%) que las de ratones WT (9,3%, p < 0,01; figura 2D). En conjunto, estos datos sugieren que B7-H1 regula negativamente la generacion de celulas T CD8+ de memoria en ratones inmunizados.
Una caracteristica distintiva de las celulas T CD8+ de memoria es su rapida respuesta de recuerdo a antigenos cognados, por lo que se realizaron estudios para determinar si el aumento del conjunto de memoria en ratones deficientes en B7-H1 conduciria a una respuesta de recuerdo mas protectora. Se inyectaron celulas tumorales de melanoma B16-OVA (manipuladas genetica para que expresen OVA) en ratones inmunizados WT y deficientes en B7-H1. Las celulas tumorales B16-OVA inyectadas por via intravenosa forman metastasis en el pulmon y se puede realizar un seguimiento de la inmunidad antitumoral realizando un recuento del numero de focos tumorales. El dia 4 despues de la inyeccion intravenosa de 5 x 105 celulas tumorales B16-OVA, la frecuencia de las celulas T CD8+ de memoria funcionales en los pulmones de ratones WT y deficientes en B7-H1 se determino mediante tincion intracelular para IFNy. Se detectaron aproximadamente 4 a 5 veces mas celulas T CD8+ IFNy+ en los pulmones de ratones deficientes en B7-H1 en comparacion con ratones WT (p < 0,01; figura 3A). El dia 21 posterior a la inyeccion tumoral, el numero de metastasis tumorales en los pulmones de ratones deficientes en B7-H1 sin tratamiento previo fue comparable al de los ratones WT sin tratamiento previo (p = 0,43; figura 3B). Se formaron menos metastasis tumorales en los pulmones de ratones WT inmunizados en comparacion con ratones WT sin tratamiento previo (p = 0,001). Significativamente, las metastasis tumorales se descartaron completamente en los pulmones de ratones deficientes en B7-H1 inmunizados (figura 3B), lo que sugiere que se establece una poblacion de memoria de celulas T CD8+ mas eficaz en ausencia de B7-H1.
Ejemplo 3: La expresion de Bim se reduce en celulas T CD8+ estimuladas con antigeno en ausencia de B7-H1
Se realizaron estudios para determinar que mecanismos podrian ser responsables del aumento de la poblacion de celulas T CD8+ de memoria en ratones deficientes en B7-H1 mediante el examen de la proliferacion y apoptosis de celulas T CD8+ estimuladas con antigeno despues de la inmunizacion. Se utilizo CD11a como marcador de activacion sustituto. Una ventaja de este procedimiento es que las celulas T CD8+ CD11aalto representan celulas T CD8+ estimuladas con antigeno que responden a epitopes de antigenos no definidos no reconocidos por tetrameros. Se detectaron celulas T CD8+ CD11aalto a niveles bajos en los bazos de ratones sin tratamiento previo WT y deficientes en B7-H1 (figura 4A). El dia 7 despues de la inmunizacion, el porcentaje de celulas T CD8+ CD11aalto aumento mas de 2 veces en el bazo de ratones deficientes en B7-H1 (41,5%) en comparacion con ratones WT inmunizados (17,2%; p < 0,01; figuras 4A y 4B), lo que era consecuente con los resultados obtenidos mediante la tincion del tetramero (figura 1). Del siete a 15% de celulas T CD8+ CD11aalto de ratones WT y deficientes en B7-H1 fueron especificas para el epitope de OVA257-264 restringido por H-2Kb conocido basandose en la tincion del tetramero y las celulas T CD8+ CD11abajo no contenian celulas tetramero+ (figura 4C), lo que sugiere que todas las celulas T CD8+ especificas de antigeno se encuentran en la poblacion de celulas T CD8+ CD11aalto Ademas, la poblacion de CD8+ CD11 aalto tanto de ratones WT y como de ratones deficientes en B7-H1, pero no la poblacion de celulas T CD8+ CD11abajo, produjo IFNy y experimento desgranulacion (indicada por la expresion en superficie de CD107a) despues de reestimulacion ex vivo (figura 4D). Como las respuestas de las celulas T frente a diversos epitopes se regulan de forma coordinada, estos datos apoyan aun mas el concepto de que la poblacion de celulas T CD8+ CD11aa"° representa celulas T c D8+ especificas de OVA verdaderas. Casi el 80-90% de celulas T CD8+ CD11aalto inducidas por OVA eran reactivas contra epitopes de antigenos no definidos de la proteina OVA (figura 4C). Por lo tanto, la poblacion de celulas T CD8+ CD11aalto podria utilizarse para representar a la mayor parte de las celulas T CD8+ estimuladas con antigeno durante las respuestas de celulas T primarias. En los estudios siguientes, se utilizo CD11 aalto como marcador para rastrear celulas T CD8+ especificas de antigeno.
La proliferacion de celulas T CD8+ efectoras despues de la inmunizacion se examino mediante tincion de celulas para Ki67, una proteina nuclear asociada con la proliferacion celular (Gerdes et al. (1984) J. Immunol. 133: 1710­ 1715). El porcentaje de celulas Ki67+ aumento en celulas T CD8+ CD11aalto de ratones deficientes en B7-H1 (9,32%) en comparacion con ratones WT (7,5%), pero este aumento no fue estadisticamente significativo (figura 5A). Tambien se realizo un seguimiento de la proliferacion realizando un ensayo de incorporacion de BrdU para medir la proliferacion en curso de celulas T CD8+ despues de la inmunizacion. En este ensayo, el porcentaje de celulas T CD8+ CD11aalto BrdU+ tambien fue similar entre WT (6,05%) y ratones deficientes en B7-H1 (5,59%; figura 5B). Las celulas Ki67+ o BrdU+ se detectaron principalmente en las celulas T CD8+ CD11aalto pero no en celulas T CD8+ CD11abajo, lo que sugiere que las celulas T CD8+ CD11aalto se encuentran en proliferacion despues de la estimulacion con antigeno (figuras 5A y 5B). Estos resultados sugirieron que el aumento en la poblacion de celulas T CD8+ estimuladas con antigeno en ratones deficientes en B7-H1 no es debido a una mayor proliferacion de este compartimiento celular, comparado con los ratones WT.
Despues se realizaron estudios para evaluar si la reduccion de la apoptosis de las celulas T CD8+ estimuladas con antigeno podria contribuir al aumento observado de la poblacion de celulas T CD8+ estimuladas con antigeno en ratones deficientes en B7-H1 inmunizados. Tal como se ha discutido anteriormente, la ruta del receptor de muerte del ligando Fas/Fas esta implicada en la regulacion de la contraccion de las celulas T, por lo que se midieron los niveles de expresion superficial del ligando Fas y Fas en las celulas T CD8+ efectoras el dia 7 despues de la inmunizacion. La expresion del ligando Fas y Fas se detecto a niveles similares en ratones WT y deficientes en B7-H1. Estos resultados sugieren que el aumento observado en la poblacion de celulas T CD8+ efectoras no es debido a un cambio en la apoptosis inducida por Fas en ratones deficientes en B7-H1. La ruta mitocondrial para la apoptosis se investigo mediante el analisis de niveles de anexina V y tincion con ester etilico de tetrametilrodamina (TMRE). El TMRE es un marcador fluorescente que se incorpora a las mitocondrias intactas, y las celulas que experimentan apoptosis muestran una tincion de TMRE reducida en comparacion con las celulas vivas (Jayaraman, J. Immunol. Methods 306: 68-79, 2005). Estos estudios revelaron que menos celulas T CD8+ CD11aalto estimuladas con antigeno estaban experimentando apoptosis (TMREbajo anexina V+) en ratones deficientes en B7-H1 (3,4%) en comparacion con ratones WT (6,7%, p < 0,05; figuras 5C y 5D). Estos resultados sugirieron que los niveles reducidos de apoptosis mitocondrial pueden contribuir al aumento observado de celulas T CD8+ estimuladas con antigeno en ratones deficientes en B7-H1.
Se realizaron experimentos para buscar alteraciones en la expresion de moleculas reguladoras de la apoptosis en celulas T CD8+ efectoras. Se midieron los niveles intracelulares de la molecula proapoptotica Bim y las moleculas antiapoptoticas Bcl-2 y BcI-xl en celulas T CD8+ CD11aalto recien aisladas del bazo el dia 7 despues de la inmunizacion de ratones sin tratamiento previo. Se observaron niveles de expresion intracelular mas bajos de Bim en celulas T CD8+ CD11aalto de ratones deficientes en B7-H1 que en las mismas celulas obtenidas de ratones WT (p < 0,001; figuras 6A y 6B), mientras que los niveles de expresion de Bcl-2 y BcI-xl fueron comparables en ratones WT y deficientes en B7-H1 (figura 6A). La expresion de Bim, Bcl-2 y Bcl-x.L fue comparable en celulas T CD8+ CD11aalt° de ratones deficientes en B7-H1 y WT (figura 6A). Tambien se analizaron niveles de expresion intracelular de Bim en celulas T CD8+ CD11aalto aisladas del higado el dia 7 despues de la inmunizacion de ratones sin tratamiento previo. Nuevamente, se observaron niveles de expresion intracelular mas bajos de Bim en celulas T CD8+ CD11aalto de ratones deficientes en B7-H1 en comparacion con ratones WT (figura 6C). Finalmente, se examinaron niveles de expresion intracelular de estas proteinas en celulas T CD8+ CD11aalto aisladas del bazo de ratones sin tratamiento previo, y no se observaron diferencias significativas en ratones deficientes en B7-H1 frente a ratones WT en los niveles de expresion de Bim (figura 6D), Bcl-2 o BcI-xl. Estos datos sugirieron que la regulacion a la baja de la molecula proapoptotica Bim puede contribuir al aumento observado de celulas T CD8+ efectoras estimuladas con antigeno en ratones deficientes en B7-H1.
Para excluir la posibilidad de que la regulacion a la baja de Bim en ratones deficientes en B7-H1 fuera debido a un cambio intrinseco en las celulas T deficientes en B7-H1, se realizaron experimentos de transferencia en los que se inyectaron celulas T CD8+ OT-1 indiferenciadas (Thy1.1+) en ratones WT o deficientes en B7-H1 (Thy1.2+). Tras la transferencia de las celulas T CD8+ OT-1, los ratones huesped se inmunizaron con OVA mas poli I:C. El dia 7 despues de la inmunizacion se midieron los niveles intracelulares de Bim, Bcl-2 y BcI-xl en celulas T CD8+ OT-1 transferidas recien aisladas del bazo y el higado. Las celulas T CD8+ OT-1 transferidas a huespedes deficientes en B7-H1 expresaron niveles mas reducidos de Bim tanto en el bazo como en el higado en comparacion con las celulas T CD8+ OT-1 transferidas a huespedes WT (figura 7). La expresion de Bcl-2 y Bcl-xL en celulas T CD8+ OT-1 transferidas a ratones WT o deficientes en B7-H1 fueron comparables (figura 7). Estos datos sugirieron que la regulacion a la baja de Bim en ratones deficientes en B7-H1 no se debe a un cambio intrinseco en las celulas T deficientes en B7-H1, sino mas bien al huesped B7-H1 que interactua con uno de sus asociados de union en celulas T CD8+.
A continuacion, se utilizaron anticuerpos que bloquean la interaccion entre B7-H1 y PD-1 o entre B7-H1 y CD80 para examinar si el bloqueo de cualquiera de estas rutas tendria un efecto sobre los niveles de expresion de Bim. Los dias 1 y 3 despues de la inmunizacion de ratones WT con OVA mas poli I:C, se inyecto un anticuerpo anti-PD-1 (G4) que solo bloquea la union de PD-1 a B7-H1 (Hirano et al. (2005) Cancer Res. 65: 1089-1096) o un anticuerpo anti-B7-H1 (43H12) que solo bloquea la union de B7-H1 a c D80 (Park et al. (2010) Blood 116: 1291-1298). El dia 7 despues de la inmunizacion, los niveles de expresion de Bim en celulas T CD8+ CD11aalto se compararon entre grupos con o sin bloqueo por anticuerpos. Los anticuerpos que bloquean la interaccion entre B7-H1 y PD-1 o entre B7-H1 y CD80 redujeron la expresion de Bim en celulas T CD8+ estimuladas en comparacion con los anticuerpos de control, mientras que la expresion de Bcl-2 y BcI-xl no se vio afectada. Estos resultados sugirieron que la regulacion a la baja de Bim en ratones deficientes en B7-H1 podria deberse a una falta de interaccion entre B7-H1 y sus asociados de union, PD-1 y CD80.
Despues de una infeccion virica aguda, se acumulan mas celulas T de memoria centrales en los organos linfoides de ratones deficientes en PD-1 en comparacion con ratones WT, lo que indica que la senalizacion de PD-1 regula de forma negativa la generacion de celulas T de memoria (Allie et al. (2011) J. Immunol. 186: 6280-6286). La relevancia de la senalizacion de CD80 en la regulacion de la generacion de memoria se abordo mediante la transferencia de cantidades iguales de celulas T CD8+ indiferenciadas OT-1 deficientes en CD80 y OT-1 WT a ratones CD45.1+. Un dia despues de la transferencia de celulas T, los ratones huesped se inmunizaron con OVA mas poli I:C. El dia 21 despues de la inmunizacion se analizaron la frecuencia y el fenotipo de las celulas T CD8+ OT-1 deficientes en CD80 y WT transferidas. El dia 21 despues de la inmunizacion, se detecto en el bazo un porcentaje 2 veces superior de celulas T CD8+ OT-1 deficientes en CD80 en comparacion con celulas T CD8+ OT-1 WT, lo que indica que las celulas T CD80+ OT-1 deficientes en CD80 transferidas generaron mas celulas T de memoria en comparacion con celulas T CD8+ OT-1 WT. La tincion de superficie confirmo que estas celulas tenian un fenotipo de memoria central (CD44alto CD62Lalto). La respuesta de recuerdo de la poblacion de memoria generada a partir de celulas transferidas se investigo inyectando a los huespedes OVA mas poli I:C el dia 30 despues de la inmunizacion inicial, y 3 dias despues se analizo la frecuencia y el fenotipo de las celulas transferidas. Se detecto un porcentaje aumentado de celulas T CD8+ OT-1 deficientes en CD80 en comparacion con celulas T CD8+ OT-1 WT en el bazo (p = 0,013). La tincion de superficie confirmo que estas celulas tenian un fenotipo de memoria efectora (CD44alto CD62Lbajo). En conjunto, estos datos demostraron que las celulas T CD8+ OT-1 Cd80-/- generaron mas celulas T de memoria en comparacion con sus homologos WT, lo que indica que el CD80 expresado por celulas T CD8+ puede regular negativamente la generacion de celulas T de memoria.
Ejemplo 4: El B7-H1 mejora la expresion de Bim en celulas T CD8+ activadas
Se realizaron estudios para investigar como podria regular B7-H1 los niveles de Bim en celulas T CD8+ activadas. Se incubaron celulas T CD8+ WT preactivadas con proteina de fusion B7-H1 unida a la placa durante 48 horas en presencia de estimulacion con TCR (anticuerpo anti-CD3). La expresion de Bim se analizo mediante inmunotransferencia Western, y se observaron niveles de expresion aumentados en celulas T CD8+ cultivadas en presencia de proteina de fusion B7-H1, en comparacion con una proteina de fusion de control (figura 8A). La expresion de Bim tambien se analizo por citometria de flujo intracelular, revelando que la proteina de fusion B7-H1 aumento drasticamente los niveles de proteina Bim en celulas T CD8+ en comparacion con una proteina de fusion de control (p < 0,02; figuras 8B y 8C). En ausencia de anticuerpos anti-CD3, los niveles de Bim no aumentaron tras la incubacion con proteina de fusion B7-H1, lo que sugiere que B7-H1 proporciona una senal coestimuladora para la regulacion al alza de Bim. Por consiguiente, el numero absoluto de celulas vivas tambien se redujo en celulas T CD8+ cultivadas en presencia de proteina de fusion B7-H1 en comparacion con una proteina de control (p < 0,01; figura 8D). Se observo un aumento de los niveles de celulas que experimentan apoptosis (TMREbajo anexina V+) en cultivos de celulas T CD8+ activadas expuestas a la proteina de fusion B7-H1 y anti-CD3 (12,4%) en comparacion con las celulas cultivadas con proteina de fusion de control y anti-CD3 (4,1%, figura 8E). La induccion de apoptosis por la proteina de fusion B7-H1 desaparecio en celulas T CD8+ aisladas de ratones deficientes en Bim y ratones transgenicos Bcl-2 (figura 8E), lo que sugiere que la apoptosis de celulas T inducida por B7-H1 puede depender de la ruta mitocondrial mediada por Bim de la apoptosis.
Para examinar que receptor de B7-H1 esta implicado en la mediacion de la regulacion al alza de Bim, se incubaron celulas T CD8+ WT preactivadas con proteina de fusion B7-H1 unida a placa previamente bloqueada con anticuerpos anti-B7-H1 (10B5 o 43H12) o anti- PDl (G4). El anticuerpo 10B5 bloquea la interaccion de B7-H1 con PD-1 y CD80. Tanto el anticuerpo 10B5 como el anticuerpo G4 bloquearon completamente la regulacion al alza de Bim inducida por la proteina de fusion B7-H1, mientras que el 43H12 solo hizo lo mismo parcialmente, pero de forma significativa (figura 8F). Ninguno de los anticuerpos utilizados en este experimento tuvo efectos sobre los niveles de expresion de Bim en celulas cultivadas con proteina de fusion de control, lo que indica que su efecto sobre los niveles de expresion de Bim es debido a que bloquea la interaccion entre B7-H1/PD-1 o B7-H1/CD80 y no debido a un efecto no especifico. Estos resultados sugieren que B7-H1 puede utilizar PD-1 o CD80 en celulas T CD8+ para administrar senales coestimuladoras para la regulacion al alza de Bim.
Posteriormente se examino el mecanismo por el que B7-H1 regula los niveles de expresion de Bim. Se examinaron niveles de ARNm de Bcl211, que codifica la proteina Bim, mediante analisis por PCR cuantitativa en tiempo real utilizando ARNm aislado de celulas T CD8+ preactivadas que se expusieron a la proteina de fusion B7-H1 o a una proteina de fusion de control y anti-CD3 durante 24 horas. La incubacion de celulas T CD8+ preactivadas con proteina de fusion B7-H1 no aumento los niveles de Bcl211 (figura 9A), lo que indica que la regulacion al alza de Bim mediada por B7-H1 no es resultado de una regulacion transcripcional. La degradacion de Bim esta estrechamente regulada, al menos en parte, por la activacion de Akt seguida de la fosforilacion y la degradacion de Bim mediada por Akt (Qi et al. (2006) J. Biol. Chem. 281: 813-823). El nivel de activacion de Akt en celulas T CD8+ despues del acoplamiento de B7-H1 se midio mediante citometria de flujo intracelular para Akt fosforilado (Ser473). Las celulas T CD8+ cultivadas con proteina de fusion B7-H1 mostraron niveles reducidos de Akt fosforilado en comparacion con celulas T CD8+ cultivadas con una proteina de fusion de control (p < 0,01; figuras 9B y 9C). Como la fosforilacion de Akt en Ser473 esta regulada por la activacion de mTOR (Sarbassov et al. (2005) Science 307: 1098-1101; y Jacinto et al. (2006) Cell 127: 125-137), se realizaron estudios para examinar si B7-H1 regula la fosforilacion de mTOR in vitro. Inesperadamente, no hubo diferencia en niveles de fosfo-mTOR en celulas T CD8+ cultivadas con proteina de fusion B7-H1 y celulas cultivadas con proteina de fusion de control (figuras 9B y 9C). Estos resultados sugieren que el acoplamiento de celulas T CD8+ con B7-H1 inhibe la activacion de Akt, lo que da como resultado una reduccion de la degradacion de Bim.
Ejemplo 5: Bim aumenta en celulas T CD8+ reactivas a tumores en sangre periferica de pacientes con melanoma y cancer de prostata
Se aislaron linfocitos de sangre periferica de 26 pacientes con melanoma en estadio IV (avanzado) y de 11 donantes de sangre sanos. Los linfocitos se tineron con CD8, CD11a y PD-1, operacion seguida de tincion intracelular para Bim. La alta expresion de CD11 a por celulas T CD8 se utilizo para identificar celulas T estimuladas con antigeno. Se definieron celulas T CD8+ reactivas al tumor por su expresion de CD11aalto y PD-1+ (figura 13, panel izquierdo). Los histogramas mostrados en el panel derecho de la figura 13 indican la expresion de Bim por subconjuntos de celulas T CD8+ (Tn: celulas T indiferenciadas; PD-1-: celulas estimuladas negativas a PD-1, PD-1 : celulas estimuladas positivas a PD-1). Cabe senalar que solo las celulas T CD8+ estimuladas con PD-1+ (reactivas al tumor) expresaron altos niveles de Bim. La expresion de Bim aumento en las celulas T CD8+ reactivas al tumor en la sangre periferica de los pacientes con melanoma en comparacion con los controles sanos, y tambien aumento en las celulas T CD8+ reactivas al tumor en la sangre periferica de los pacientes con cancer de prostata en comparacion con los controles sanos (figura 14). La regulacion al alza de Bim en pacientes con melanoma dependia de PD-1, tal como se muestra en la figura 15. Cuando se compararon los niveles de Bim entre celulas T CD8+ CD11 aalto negativas a PD-1 (PD-1 -) y positivas a PD-1 (PD-1+) se encontro que el Bim aumento significativamente en las poblaciones de PD-1+ (p = 0,0081) en pacientes con melanoma. Por el contrario, la expresion de Bim no aumento en las celulas T PD-1+ en donantes sanos, lo que sugiere que la regulacion al alza de Bim depende de la expresion de PD-1 y esta relacionada con el cancer.
Ademas, cuando los pacientes con melanoma se dividieron en las categorias "Bim bajo" frente a "Bim alto" segun el nivel de expresion de Bim en celulas T CD8+ CD11aalto PD-1+ reactivas al tumor en la sangre periferica (figura 16, panel izquierdo), la tasa de supervivencia de los pacientes con celulas T CD8+ PD-1+ Bimalto se redujo en comparacion con la tasa de supervivencia de los pacientes con celulas T CD8+ PD-1+ Bimbajo (figura 16, panel derecho).
Ejemplo 6: La proteina B7-H1 induce una alta expresion de Bim en celulas T CD8+ preactivadas humanas
Dado que la regulacion al alza de Bim es una consecuencia de la interaccion entre B7-H1 y PD-1, se realizaron experimentos para evaluar si un anticuerpo de bloqueo anti-PD-1 puede reducir la regulacion al alza de Bim inducida por B7-H1 en celulas T. Se establecio un sistema in vitro en el que se incubaron celulas T CD8+ primarias humanas preactivadas con una proteina de fusion B7-H1/PD-L1 para inducir la regulacion al alza de Bim. Tal como se muestra en la figura 17A (panel derecho), se indujo una regulacion al alza significativa de Bim (presentado como MFI) por la fusion B7-H1/PD-L1 (P < 0,05, n = 6). El aumento de la expresion de Bim se demuestra adicionalmente mediante un histograma de citometria de flujo (figura 17A, panel izquierdo) y un ensayo de inmunotransferencia Western (figura 17B).
Utilizando este sistema, se cribaron varios anticuerpos anti-PD-1 humanos disponibles comercialmente por sus efectos de bloqueo, y se identifico un anticuerpo anti-PD-1 (clon MIH4) que bloqueo significativamente la regulacion al alza de Bim inducida por B7-H1 en una forma dependiente de la dosis (figura 18, panel izquierdo). Dado que B7-H1 indujo diferentes grados de regulacion al alza de Bim en donantes sanos individuales, se realizaron experimentos para examinar si los diferentes grados de regulacion al alza de Bim afectarian los efectos de bloqueo del anticuerpo anti-PD-1. Curiosamente, se observo que los niveles mas altos de Bim inducidos por B7-H1 tenian una correlacion negativa con la reduccion de Bim por el anticuerpo de bloqueo anti-PD-1 (figura 18, panel derecho; Pearson R = -0,71, n = 12, P < 0,05). Estos resultados sugieren que los niveles de Bim preexistentes en las celulas T CD8+ podrian afectar a la eficacia del bloqueo anti-PD-1. Por lo tanto, medir los niveles de Bim antes del tratamiento podria ayudar a determinar el grado al que un anticuerpo anti-PD-1 podria bloquear el efecto de las senales de PD-1 sobre las respuestas de las celulas T antitumorales.
Ejemplo 7: El tratamiento anti-PD-1 redujo la frecuencia de celulas T CD8 Bim+ PD-1+ reactivas a tumores
A continuacion, se realizaron estudios para evaluar el efecto del anticuerpo anti-PD-1 en la expresion de Bim por celulas T CD8 reactivas al tumor en pacientes con cancer. Se recogieron linfocitos de sangre periferica de pacientes con melanoma avanzado (estadio IV) antes y 12 semanas despues del tratamiento con anti-PD-1. Se identificaron celulas T CD8 reactivas al tumor por su alta expresion de CD11a y expresion de PD-1. La expresion de Bim se analizo mediante tincion intracelular. El porcentaje de Bim+PD-1+ en celulas T CD8+ CD11aalto se comparo entre personas sanas y pacientes con melanoma, y entre pacientes con melanoma antes y despues del tratamiento con anticuerpo anti-PD-1. Tal como se muestra en la figura 19, la frecuencia de celulas T CD8 Bim+ PD-1+ en la sangre periferica de pacientes con melanoma (antes del tratamiento, n = 29) fue significativamente superior que en el grupo de control sano (p = 0,0012, n = 14), lo que sugiere que mas celulas T CD8 PD-1+ se encuentran bajo la influencia de la interaccion PD-1/B7-H1 que conduce a la regulacion al alza de Bim. Es importante indicar que doce semanas despues del tratamiento con anticuerpos anti-PD-1 (2 mg/kg, un ciclo), aproximadamente el 67% (6/9) de los pacientes con melanoma mostraron una reduccion significativa en la frecuencia de celulas T CD8 Bim+PD-1+ (p = 0,023, n = 6). Estos resultados indicaron que la medicion de Bim expresada por celulas T CD8 PD-1+ podrfa usarse para supervisar las respuestas de los pacientes con cancer al tratamiento anti-PD-1, que puede bloquear la regulacion al alza de Bim inducida por B7-H1. Se puede utilizar una frecuencia o nivel reducido de Bim expresado por celulas T CD8 PD-1+ en pacientes con cancer despues del tratamiento con anti-PD-1 para evaluar que pacientes responden al tratamiento.
Ejemplo 8: B7-H1 expresado por celulas tumorales induce la regulacion al alza de Bim en celulas T CD8 preactivadas humanas
Dado que la mayor parte de las celulas tumorales solidas humanas expresan niveles elevados de B7-H1, se examino la funcion de B7-H1 expresada en celulas tumorales en la expresion de Bim de celulas T. Se incubaron celulas T CD8 primarias humanas previamente activadas con celulas de una lfnea de melanoma humano (624mel) que se transfectaron con ADNc de B7-H1 o con ADNc simulado de control, durante 24 horas. Tal como se muestra en la figura 20, la expresion intracelular de Bim aumento drasticamente en las celulas T CD8 cultivadas con celulas B7-H1/624mel, en comparacion con celulas simuladas/624mel (p < 0,01). Este resultado sugiere que B7-H1 expresado por celulas tumorales humanas tiene el potencial de regular al alza el Bim en celulas T CD8 preactivadas.
Ejemplo 9: La expresion BIM esta asociada con la expresion de B7-H1 en RCC humano
La capacidad de B7-H1 para regular al alza Bim en celulas T CD8+ preactivadas, pero no nuevamente activadas, implicaba que la reactivacion de celulas T CD8+ reactivas al tumor en sitios tumorales podrfa reducirse utilizando este mecanismo mediante celulas tumorales positivas a B7-H1. Para analizar esta posibilidad, se evaluaron tejidos de cancer humano tenidos para B7-H1 y Bim. La hipotesis era que los tejidos de cancer humanos positivos a B7-H1 se asociarfan con mas linfocitos infiltrantes de tumores (TIL) positivos a Bim. Tal como se muestra en la figura 21 (panel izquierdo), se tineron tejidos de carcinoma de celulas renales humanas con anticuerpos anti-B7-H1 y anti-Bim en ensayos de inmunohistoqufmica. La reactividad de B7-H1 se identifico en la superficie de las celulas cancerosas, mientras que la tincion positiva a Bim se identifico en celulas cancerosas y tambien en TIL (figura 21, panel izquierdo). La reactividad de Bim se determino mediante un sistema de puntuacion arbitrario: 0 (ausencia), 1 (focal), 2 (moderada) y 3 (marcada). La asociacion entre tumores positivos o negativos a B7-H1 y la frecuencia de reactividad de Bim a diferentes niveles se muestran en el panel derecho de la figura 21, y se analizaron utilizando la prueba exacta de Fisher. En general, se encontro que los tumores positivos a B7-H1 tienen un mayor grado (puntuaciones de 2-3) de TIL positivos a Bim que los tumores negativos a B7-H1 (prueba exacta de Fisher, p < 0,01). Estos resultados sugieren que los tumores positivos a B7-H1 pueden inducir mas muerte en celulas T reactivas al tumor en sitios tumorales a traves de la regulacion al alza de Bim cuando estas celulas T se reactivan con la estimulacion de antfgeno tumoral.
Ejemplo 10: La expresion de Bim se correlaciona con granzima B y T-bet expresadas por celulas T CD8+ CD11aalto PD-1+ relacionadas con cancer
Para examinar si la regulacion al alza de Bim esta asociada con celulas T efectoras, se midieron los niveles de granzima B (una molecula ejecutiva de linfocitos T citotoxicos, CTL) y T-bet (un factor de transcripcion de CTL) en celulas T CD8 CD11aalto PD-1+ de sangre de pacientes con melanoma y se analizo su correlacion con niveles de Bim. Tal como se muestra en la figura 22, se observaron correlaciones positivas entre los niveles de Bim y granzima B (panel izquierdo; r = 0,51, p < 0,05) y entre los niveles de Bim y T-bet (panel derecho; r = 0,62, p < 0,01). Estos resultados sugirieron que los niveles mas altos de expresion de Bim estan asociados con la funcion o diferenciacion de celulas T efectoras. Estos datos tambien implican que la regulacion al alza de Bim puede utilizarse por celulas tumorales positivas a B7-H1 para inducir la apoptosis de celulas T CD8 reactivas a tumores, especialmente de celulas T CD8 con funcion efectora.
Ejemplo 11: La expresion de Bim disminuye en celulas T CD8 PD-1+ CD11aalto despues de la radioterapia en algunos pacientes con cancer
Para observar como los niveles de Bim en las celulas T CD8 reactivas al tumor responden al tratamiento, los niveles de Bim se midieron en celulas T CD8 CD11aalto PD-1+ de la sangre periferica de pacientes con melanoma y cancer de prostata antes y despues de la radioterapia. Como se muestra en la figura 23 (panel izquierdo), se observaron niveles reducidos de Bim en pacientes con melanoma despues de la radioterapia. Por el contrario, se observaron mayores niveles de Bim en pacientes con cancer de prostata despues de la radioterapia (panel derecho). Debido a la cantidad limitada de pacientes en este estudio, estos cambios no alcanzaron significancia estadfstica. No obstante, estos cambios en los niveles de Bim despues del tratamiento citotoxico del tumor sugirieron que la destruccion de los tejidos tumorales podrfa alterar la estimulacion del antfgeno y la expresion de B7-H1, lo que tendrfa como consecuencia alteraciones en la expresion de Bim, que depende tanto de la estimulacion del antfgeno como del acoplamiento de B7-H1 con celulas T CD8 PD-1. Tomados en conjunto, estos estudios indican que la medicion de niveles de Bim en celulas T CD8 PD-1+ reactivas al tumor podrfa usarse como biomarcador para supervisar respuestas de celulas T a antfgenos y ligandos PD-1 (por ejemplo, B7-H1) expresados por celulas tumorales humanas.

Claims (3)

REIVINDICACIONES
1. Composicion que comprende
un anticuerpo anti-B7-H1, un anticuerpo anti-PD-1, un anticuerpo anti-CD80, una proteina de fusion que comprende una porcion de PD-1 unida a una secuencia Fc de inmunoglobulina, o una proteina de fusion que comprende una porcion de CD80 unida a una secuencia Fc de inmunoglobulina
para su uso en un procedimiento para tratar a un mamifero que padece cancer,
en la que dicho procedimiento comprende
(i) determinar el nivel de Bim en una muestra de sangre periferica de dicho mamifero y certificar que dicho mamifero contiene un nivel elevado de Bim, en el que dicho nivel elevado de Bim se basa en niveles de proteina Bim,
en el que dicho nivel elevado de Bim se refiere a un nivel que es al menos un 50% mayor que un nivel de referencia de Bim, en el que dicho nivel de referencia se refiere al nivel de Bim que se observa normalmente en mamiferos correspondientes sanos sin cancer, y
(ii) administrar dicha composicion a dicho mamifero en condiciones en las que la interaccion de B7-H1 de origen natural con PD-1 o CD80 en dicho mamifero se reduce despues de administrar dicha composicion a dicho mamifero.
2. Composicion para su uso la reiv siengdúicnacion 1, en la que dicho mamifero es un ser humano.
3. Composicion para su uso la rei sveingdúincacion 1, en la que dicho cancer es un cancer de melanoma, un cancer de mama, un cancer de pulmon, un carcinoma de celulas renales, un cancer de pancreas, un cancer de prostata, un cancer de colon, un cancer de cerebro, un cancer de higado o un cancer de ovario.
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