BRPI0720734A2

BRPI0720734A2 - Preparação da romidepsina

Info

Publication number: BRPI0720734A2
Application number: BRPI0720734-4A
Authority: BR
Inventors: Gregory L Verdine; Nicholas H Vrolijk
Original assignee: Gloucester Pharmaceuticals Inc
Priority date: 2006-12-29
Filing date: 2007-12-28
Publication date: 2014-01-07
Also published as: US20130236928A1; JP2010514802A; JP5775114B2; AU2007342030A1; EP2815761A1; AU2007342030B2; EP2124990A1; CA2674313A1; CN101687010A; EP2450049A1; MX2009006966A; CN103497238A; WO2008083290A1; EP2124990A4; JP2013240332A; EP2556838A1; US20100093610A1

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "PREPARA- ÇÃO DA ROMIDEPSINA".

Pedidos de Patente Relacionados

O presente pedido de patente reivindica prioridade sob a 35 5 U.S.C. § 119(e) Para o Pedido de Patente U.S. Provisório, U.S.S.N. 60/882.712, depositado em 20 de dezembro de 2006, o qual é incorporado aqui, por referência.

Antecedentes da Invenção

A Romidepsina é um produto natural que foi isolado a partir da Chromobacterium violaceum pela Fujisawa Pharmaceuticals. VerPedido de Patente Japonesa Publicado Hei 7 (1995)-64872; Patente U.S. 4.977.138, concedida em 11 de dezembro de 1990, cada uma das quais fica incorpora- da aqui, por referência. Ela é um peptídio bicíclico que consiste em quatro resíduos de amino-ácidos (D-valina, D-cisteína, deidrobutirina, e L-valina) e um novo ácido (ácido 3-hidróxi-7-mercapto-4-heptenóico). A Romidepsina é um depsipeptídio que contém ambas as ligações de amido e de éster. Além da produção de C. violaceum com a utilização de fermentação, a Romidep- sina também pode ser preparada através de meios sintéticos ou semissinté- ticos. A síntese total da Romidepsina relatada por Kahn et ai envolve 14 etapas e produz a Romidepsina em um rendimento total de 18%. J. Am. Chem. Soe. 118:7237-7238, 1996. A estrutura da romidepsina é mostrada abaixo:

A Romidepsina tem mostrado ter atividades antimicrobianas, imunossupressoras e anti tumor. A romidepsina está correntemente sendo testada, por exemplo, para ser usada no tratamento de pacientes com ma- Iignidades hematológicas (por exemplo, Iinfoma de célula T cutânea (CTCL), Iinfoma de célula T periférica (PTCL), mieloma múltiplo, etc.) e em tumores sólidos (por exemplo, câncer da próstata, câncer pancreático, etc.). Ela é imaginada como atuando através da inibição seletiva das desacetilases (por 5 exemplo, desacetilase histona, desacetilase tubulina), prometendo novos alvos para relação ao desenvolvimento de uma nova classe de terapias anti- câncer. Nakajima et ai, Experimental Cell Res. 241: 126 a 133, 1998. Um modo de ação envolve a inibição de uma ou mais classes de desacetilases de histonas (HDAC).

A desacetilase de histona é uma enzima de metalodesacetilação

que tem zinco em seu sítio ativo. Finnin et ai, Nature, 401: 188 a 193, 1999. Esta enzima é imaginada como regulando a expressão de determinados ge- nes através da modulação da afinidade das histonas acetiladas com relação ao DNA. A acetilação de histonas é controlada através do equilíbrio entre a 15 acetilação e a desacetilação. A acetilação das histonas ocorre em um resí- duo de Iisina da proteína histona. A acetilação do resíduo de Iisina faz com que a proteína perca um pouco de sua carga positiva, diminuindo, por meio disso, a interação da mesma com o DNA. A romidepsina foi descoberta como ocasionando a acetilação crescente das histonas e outras proteínas 20 reguladoras em células tratadas. Isso afeta o controle de transcrição dos diversos genes envolvidos no controle, diferenciação e apoptose no ciclo da célula. Mais recentemente, os inibidores de HDCA tem sido implicados no controle da autofagia.

Além da romidepsina, vários derivados têm sido preparados e estudados. A patente e os pedidos de patente que se seguem descrevem vários derivados da romidepsina: Patente U.S. 6.548.479; WO 05/0209134; WO 05/058298; e WO 06/129105; cada um dos quais é incorporado aqui, por referência.

Dado ao interesse na romidepsina como um agente farmacêuti- co, continua a existir uma necessidade com relação à preparação de gran- des quantidades de material altamente purificado em uma maneira de custo eficiente. Diversos relatórios com relação à purificação da romidepsina a par- tir de uma calda de fermentação tem sido relatados. A Patente U. S. 4.977.138; Pedido de Patente Internacional PCTWO 02/20817; cada um dos quais é incorporado aqui, por referência. Por exemplo, a WO 02/20817 des- creve o aumento da produção da romidepsina a partir de um processo de 5 fermentação através da adição de amino-ácidos específicos tais como a L- cisteína ao meio de cultura. Embora essas descobertas tenham proporcio- nado produções aumentadas da romidepsina através da fermentação, conti- nua existindo uma necessidade com relação a melhores maneiras para a preparação de grandes quantidades de romidepsina pura para uso em pes- 10 quisa e em medicina.

Resumo da Invenção

A presente invenção é baseada no reconhecimento de que os procedimentos publicados para o isolamento da romidepsina não produzem de modo reproduzível a romidepsina pura, especificamente, a romidepsina 15 isenta de contaminantes tais como a romidepsina dimerizada, oligomerizada ou polimerizada. Com base nesse reconhecimento, a presente invenção proporciona um sistema para preparar de forma reproduzível a romidepsina sob condições que reduzem os níveis desses produtos secundários conta- minantes. Produzindo, purificando, e/ou armazenando a romidepsina em um 20 pH aparente de menos do que aproximadamente 6,5, mais preferivelmente menos do que aproximadamente 6,0 foi descoberto como impedindo a for- mação de romidepsina dimerizada, oligomerizada ou polimerizada. Esse me- lhoramento no processo de purificação da romidepsina permite rendimentos mais elevados de romidepsina e/ou romidepsina de pureza mais alta do que 25 aquela provida através de processos conhecidos. Esse melhoramento é es- pecificamente útila para a preparação de romidepsina de qualidade farma- cêutica para ser usada em seres humanos.

A romidepsina é tipicamente produzida através da purificação da mesma a partir de uma cultura de um micro-organismo (por exemplo, Chro- mobacterium violaceum) que produz o produto natural. A presente invenção demonstra que é necessário manter um pH baixo durante pelo menos algu- mas das etapas de purificação com a finalidade de eliminar ou reduzir a for- mação da romidepsina reduzida que pode em seguida se dimerizar, oligome- rizar, ou polimerizar para a formação de contaminantes indesejáveis.

Uma ou mais das etapas de purificação são executadas em um pH aparente de menos do que 6,5 ou mesmo em um pH aparente de menos 5 do que 6,0. Em determinadas modalidades, uma ou mais das etapas de puri- ficação são executadas em um pH aparente variando a partir de 4,0 até 6,0. Em determinadas modalidades, todas as etapas de purificação são executa- das em um pH aparente de aproximadamente até 4,0 até aproximadamente

6,0. Com a finalidade de evitar a formação de contaminantes indesejáveis, o 10 pH aparente de uma solução que contém a romidepsina não é deixado che- gar a um pH aparente acima de aproximadamente 7,0, ou mais preferen- cialmente acima de aproximadamente 6,0. O pH aparente de todos os pro- cessos da purificação é monitorado de preferência e em seguida ajustado, se necessário, para ser um pH aparente abaixo de aproximadamente 6,0. 15 Em determinadas modalidades, ele é mantido dentro de uma faixa de pH aparente de aproximadamente 4,0 até aproximadamente 6,0. O controle do pH aparente nas etapas de purificação com relação ao final do processo ou etapas que usam soluções aquosas tem sido considerado como sendo es- pecificamente útila na diminuição ou na eliminação da formação de contami- 20 nantes indesejáveis. Qualquer ácido ou tampão pode ser usado para o con- trole do pH. Em determinadas modalidades, um acido orgânico como o ácido acético ou o ácido fórmico é usado para o controle do pH em uma ou mais das etapas de purificação. Em determinadas modalidades, um ácido inorgâ- nico tal como o ácido fosfórico ou o ácido clorídrico é usado.

Qualquer procedimento para a purificação da romidepsina, seja

a partir de fermentação, semissíntese ou síntese total, pode ser modificado com base na presente invenção para impedir a formação de produtos colate- rais indesejados através da monitoração do pH aparente e da redução do pH aparente se necessária.

Em um aspecto, a invenção proporciona um processo para a

preparação da romidepsina a partir de uma cultura de Chromobacterium vio- laceum. A calda de fermentação é acidificada com a finalidade de inativar ou matar os micro-organismos na cultura. A calda de fermentação acidificada é preliminarmente purificada através de cromatografia em batelada ou de co- luna. Em seguida, podem ser usadas múltiplas etapas de cromatografia de coluna para alcançar o nível de pureza desejado. Em determinadas modali- dades, a primeira cromatografia usa Sepabeads SP850, uma resina de ad- sorção não-iônica. A romidepsina pode ser ainda purificada através de eta- pas de cromatografia de coluna adicionais. Em determinadas modalidades, a romidepsina é em seguida purificada através de cromatografia de coluna com a utilização da resina Diaion HP20SS, seguida por cromatografia de coluna com a utilização da resina Diaion HP20, e finalmente através de cro- matografia de coluna sobre alumina. Em determinadas modalidades, a cro- matografia de coluna é realizada em um pH aparente que varia a partir de aproximadamente 4 até aproximadamente 6. Em determinadas modalidades específicas, a segunda etapa de cromatografia de coluna é realizada em um pH aparente reduzido (por exemplo, um pH aparente de aproximadamente 4 a 6). A romidepsina é opcionalmente ainda mais purificada através de crista- lização. Uma ou mais etapas de cristalização podem ser realizadas. Em de- terminadas modalidades, a romidepsina é primeiro cristalizada com a utiliza- ção de metanol e em seguida cristalizada com a utilização de acetona aquo- sa a 85%. A romidepsina resultante é em seguida opcionalmente filtrada, lavada, e seca. Em determinadas modalidades, as etapas de cristalização ou quaisquer etapas subsequentes são realizadas em um pH aparente reduzido que varia a partir de aproximadamente 4,0 até aproximadamente 6,0. É de importância específica que as etapas finais sejam realizadas em um pH apa- rente reduzido uma vez que nenhuma etapa de purificação está disponível para a remoção dos contaminantes não desejados. Qualquer equipamento (por exemplo, tubulação, bombas, filtros, secores, etc.), usado nos proces- sos de fermentação e/ou purificação é lavado com água ou uma solução á- cida (por exemplo, ácido acético) para a remoção ou a neutralização de qualquer resíduo alcalino no equipamento.

Além do mais, a preparação de formas de dosagem farmacêuti- cas da romidepsina, incluindo a composição com excipientes, solventes, cossolventes e/ou outros agentes usados para aumentar a atividade farma- cológica da romidepsina, pode ser executada em um pH aparente reduzido (por exemplo, um pH aparente de menos do que aproximadamente 4,0) com a finalidade de minimizar a formação da romidepsina dimerizada, oligomeri- zada ou polimerizada.

Em outro aspecto, a invenção proporciona uma composição de romidepsina substancialmente isenta de romidepsina dimerizada, oligomeri- zada ou polimerizada. A romidepsina proporcionada pela presente invenção é mais do que 98% monomérica, mais do que 99% monomérica, ainda maior 10 do que 99,95% monomérica, ou mais do que 99,9% monomérica. Em algu- mas modalidades, a romidepsina é de preferência mais do que 98% pura, mais do que 99% pura, mais do que 99,95% pura ou mais do que 99,9% pu- ra com relação a todos os contaminantes. Em determinadas modalidades, a romidepsina inclui menos do que 1.0%, menos do que 0,5%, menos do que 15 0,2% ou menos do que 0,1% do total de outros desconhecidos. A composi- ção da romidepsina inclui de preferência nenhum material detectável dimeri- zado, oligomerizado ou polimerizado. A pureza da romidepsina é tipicamente determinada através de cromatografia liquida de alto desempenho (HPLC), espectroscopia infravermelha, análise de difração de raios X sobre pó 20 (XRPD), cromatografia gasosa (GC), rotação específica, ou espectroscopia RMN. Em determinadas modalidades, a pureza é determinada através da medição da rotação específica de uma solução de romidepsina em clorofór- mio. A invenção também proporciona preparações tamponadas de romidep- sina que mantêm o pH aparente da preparação abaixo de aproximadamente 25 6,0, de preferência entre aproximadamente 4,0 e aproximadamente 6,0. Es- sas preparações têm tipicamente um tempo de prateleira prolongado. Definições

As definições de grupos funcionais específicos e termos quími- cos estão descritos em mais detalhes abaixo. Para as finalidades da inven- ção, os elementos químicos são identificados de acordo com a Tabela Peri- ódica de elementos, versão CAS, Handbook of Chemistry and Physics, 75a Ed. capa interna, e grupos funcionais específicos são em geral definidos como descritos no mesmo. Além disso, os princípios gerais de química or- gânica, bem como as porções funcionais específicas e a reatividade, estão descritos em Organic Chemistry, Thomas Sorrell, University Science Books, Sausalito, 1999, o conteúdo total do qual são incorporado aqui, por referên- 5 cia.

Determinados compostos da presente invenção podem existir em formas específicas geométricas ou estereoisoméricas. A presente inven- ção contempla todos esses compostos, incluindo os isômeros cis e trans, isômeros E- e Z-, enantiômeros R- e S-, diastereômeros, isômeros (D), isô- 10 meros(L), isômeros (-) e (+), misturas racêmicas dos mesmos e outras mis- turas dos mesmos, como estando dentro do âmbito da invenção. Os átomos de carbono assimétricos adicionais podem estar presentes em um substituin- te como um grupo alifático (por exemplo, alquila) ou heteroalifático. Todos esses isômeros, bem como as misturas dos mesmos, são considerados com 15 estando dentro desta invenção.

As misturas isoméricas que contenham qualquer uma de uma variedade de proporções de isômeros podem ser utilizadas de acordo com a presente invenção. Por exemplo, quando somente dois isômeros estão com- binados, as misturas que contenham 50:50, 60:40, 70:30, 80:20, 90:10, 95:5, 20 96:4, 97:3, 98:2, 99:1, ou 100:0 proporções de isômeros são todas contem- pladas pela presente invenção. Aquelas pessoas versados na técnica irão observar com facilidade que as proporções análogas são contempladas com relação às misturas de isômeros mais complexas.

Será observado que os compostos, como descritos aqui, , po- 25 dem ser substituídos com qualquer número de substituintes ou porções fun- cionais. Em geral, o termo "substituído", seja precedido pelo termo "opcio- nalmente" ou não, e os substituintes contidos nas fórmulas desta invenção, se referem à substituição de radicais hidrogênio em uma determinada estru- tura, como radical de um substituinte específico. Em determinadas modali- 30 dades, somente o radical hidrogênio em uma determinada estrutura é substi- tuído com o radical de um substituinte específico. Em outras modalidades, um, dois, ou três radicais de hidrogênio em uma determinada estrutura são substituídos com o mesmo radical ou com um radical diferente de um substi- tuinte específico. Quando mais do que uma posição em qualquer estrutura dada pode ser substituída com um ou mais do que um substituinte selecio- nado a partir de um grupo especificado, o substituinte pode ser tanto o

5 mesmo como diferente em todas as posições. Na forma usada aqui, o termo "substituído" é contemplado como incluindo todos os substituintes permissí- veis de compostos orgânicos. Em um aspecto amplo, os substituintes per- missíveis incluem substituintes de compostos orgânicos acíclicos e cíclicos, ramificados ou não-ramificados, carbocíclicos ou heterocíclicos, aromáticos 10 e mão aromáticos. Para as finalidades desta invenção, os heteroátomos tais como o nitrogênio, podem ter substituintes de hidrogênio e/ou quaisquer substituintes permissíveis de compostos orgânicos descritos aqui, que satis- façam as valências dos heteroátomos. Além do mais, esta invenção não está destinada a ser limitada de qualquer maneira pelos substituintes permissí- 15 veis dos compostos orgânicos. As combinações de substituintes e variáveis imaginadas por esta invenção são de preferência aquelas que resultem na formação de compostos estáveis úteis para o tratamento de, por exemplo, doenças proliferativas, tais como o câncer. O termo "estável", na forma usa- da aqui, se refere a compostos que possuam estabilidade suficiente para 20 permitir a fabricação e que mantenham a integridade do composto durante um período de tempo suficiente para ser detectado e de preferência durante um período de tempo suficiente para ser utilizável para as finalidades deta- lhadas aqui,.

O termo "alifático, na forma usada aqui, inclui ambos os hidro- 25 carbonetos alifáticos, saturados ou não-saturados, de cadeia linear (por e- xemplo, não-ramificada), ramificada, acíclica, cíclica ou policíclica, que são opcionalmente substituídos com um ou mais grupos funcionais. Como será observado por uma pessoa versada na técnica, "alifático" está destinado aqui, a incluir, porém não está limitado a porções de alquila, alquenila, alqui- 30 nila, cicloalquila, cicloalquenila e cicloalquinila.

Desse modo, na forma usada aqui, o termo "alquila" inclui gru- pos de alquila lineares, ramificados e cíclicos. Uma convenção análoga se aplica a outros termos genéricos tais como "alquenila", "alquinila" e simila- res. Além disso, na forma usada aqui, os termos "alquila", "alquenila", "alqui- nila" e similares englobam ambos os grupos substituídos e não-substituídos. Em determinadas modalidades, na forma usada aqui, "alquila inferior" é usa-

5 do para indicar aqueles grupos de alquila (cíclicos, acíclicos, substituídos, não-substituídos, ramificados ou não-ramificados) que tenham de 1 a 6 áto- mos de carbono.

Em determinadas modalidades, os grupos alquila, alquenila e alquinila empregados na invenção contêm de 1 a 20 átomos de carbono ali- 10 fáticos. Em determinadas outras modalidades, os grupos alquila, alquenila e alquinila empregados na invenção contêm de 1 a 10 átomos de carbono ali- fáticos. Em ainda outras modalidades, os grupos alquila, alquenila e alquinila empregados na invenção contêm de 1 a 8 átomos de carbono alifáticos. Em ainda outras modalidades, os grupos alquila, alquenila e alquinila emprega- 15 dos na invenção contêm de 1 a 6 átomos de carbono alifáticos. Em outras modalidades adicionais, os grupos alquila, alquenila e alquinila empregados na invenção contêm de 1 a 4 átomos de carbono. Desse modo, os grupos alifáticos ilustrativos incluem, porém não estão limitados a, por exemplo, a porções de metila, etila, n-propila, isopropila, ciclopropila, -CH2-ciclopropila, 20 vinila, alila, n-butila, sec-butila, isobutila, terc-butila, ciclobutila, -CH2- ciclobutila, n-pentila, sec-pentila, isopentila, terc-pentila, ciclopentila, -CH2- ciclopentila, n-hexila, sec-hexila, ciclo-hexila, -CH2-ciclo-hexila e similares, que de novo podem conter um ou mais substituintes. Os grupos alquenila incluem, porém não estão limitados a, por exemplo, etenila, propenila, bute-

nila, 1-metila-2-buten-1-ila, e similares. Os representativos dos grupos alqui- nila incluem porém não estão limitados a, etinila, 2-propinila (propargila), 1- propinila, e similares.

Alguns exemplos de substituintes das porções alifáticas (e ou- tras) acima descritas dos compostos da invénção incluem, porém não estão limitados a alifáticos; heteroalifáticos; arila; heteroarila; arilalquila; heteroari- lalquila; alcóxi; arilóxi; heteroalcóxi; heteroarilóxi; alquiltio; ariltio; heteroal- quiltio; heteroariltio; F; Cl; Br; I; -OH; -NO2; -CN; -CF3; -CH2CF3; -CHCI2; - CH2OH; -CH2CH2OH; -CH2NH2; -CH2SO2CH3; -C(O)Rx; -CO2(Rx); - CON(Rx)2; -OC(O)Rx; -OCO2Rx; -OCON(Rx)2; -N(Rx)2; -S(O)2Rx; -NRx(CO)Rx em que cada ocorrência de Rx inclui, independentemente, porém não estão limitados a, alifáticos, heteroalifáticos, arila, heteroarila, arilalquila, ou hete-

5 roarilalquila, em que cada um dos substituintes alifáticos, heteroalifáticos, arilalquila, ou heteroarilalquila descrito acima e aqui pode ser substituído ou não-substituído, ramificado ou não-ramificado, cíclico ou acíclico, e em que qualquer um dos substituintes de arila ou heteroarila descrito acima e aqui pode ser substituído ou não-substituídos. Os exemplos adicionais de substi- 10 tuintes aplicáveis em geral estão ilustrados através das modalidades especí- ficas mostradas nos exemplos e que estão descritas aqui.

Em geral, os termos "arila" e "heteroarila", na forma usada a- qui,neste pedido de patente, se referem a porções mono- ou poli- cíclicas, heterocíclicas, policíclicas e poli-heterocíclicas não-saturadas que tenham de 15 preferência de 3 a 14 átomos de carbono, cada uma das quais pode ser substituída ou não-substituída. Os substituintes incluem, porém não estão limitados a qualquer um dos substituintes previamente mencionados, isto é, os substituintes relacionados para as porções alifáticas, ou com relação a outras porções como as descritas aqui,neste pedido de patente, e que resul- 20 tam na formação de um composto estável. Em determinadas modalidades da presente invenção, "arila" se refere a um sistema de anel carboxílico mo- no- ou bi-cíclico, que tenha um ou dois anéis aromáticos, incluindo porém não limitados a, fenila, naftila, tetra-hidronaftila, indenila, indenila, e simila- res. Em determinadas modalidades da presente invenção, o termo "heteroa-

rila", na forma usada aqui, se refere a um radical aromático cíclico que tem a partir de cinco até dez átomos no anel, dos quais um dos átomos do anel é selecionado a partir de S, O e N; zero, um ou dois átomos do anel são hete- roátomos adicionais selecionados independentemente a partir de S, O e N, e os restante átomos do anel é carbono, o radical estando junto ao restante da 30 molécula através de qualquer dos átomos do anel, tais como, por exemplo, piridila, pirazinila, pirimidila, pirrolila, pirazolila, imidazolila, tiazolila, oxazolila, isoxazolila, tíodiazolila, oxadiazolila, tiofenila, furanila, quinolinila, isoquinoli- nila, e similares.

Será observado que os grupos arila e heteroarila podem ser não-substituídos ou substituídos, em que a substituição inclui a substituição de um, dois, três ou mais dos átomos de hidrogênio no mesmo de forma in- 5 dependente com qualquer uma ou mais porções que se seguem, incluindo, porém não limitadas a, alifáticos; heteroalifáticos; arila; heteroarila; arilalqui- la; heteroarilalquila; alcóxi; arilóxi; heteroalcóxi; heteroarilóxi; alquiltio; ariltio; heteroalquiltio; heteroariltio; F; Cl; Br; I; -OH; -NO2; -CN; -CF3; -CH2CF3; - CHCI2; -CH2OH; -CH2CH2OH; -CH2NH2; -CH2SO2CH3; -C(O)Rx; -CO2(Rx); - 10 CON(Rx)2; -OC(O)Rx; -OCO2Rx; -OCON(Rx)2; -N(Rx)2; -S(O)2Rx; -NRx(CO)Rx, em que cada ocorrência de Rx inclui, independentemente, porém não está limitada a alifáticos, heteroalifáticos, arila, heteroarila, arilalquila, ou heteroa- rilalquila, em que cada um dos substituintes alifáticos, heteroalifáticos, arilal- quila, ou heteroarilalquila descrito acima e aqui, pode ser substituído ou não- 15 substituídos, ramificado ou não-ramificado, cíclicos ou acíclicos, e em que qualquer um dos substituintes de arila ou heteroarila descrito acima e aqui, pode ser substituído ou não-substituído. Os exemplos adicionais de substitu- intes aplicáveis em geral estão ilustrados através das modalidades específi- cas mostradas nos exemplos e que estão descritas aqui,.

O termo "heteroalifático", na forma usada aqui, se refere às por-

ções alifáticas que contem um ou mais átomos de oxigênio, enxofre, nitrogê- nio, fósforo ou sílica, por exemplo, no lugar de átomos de carbono. As por- ções heteroalifáticas podem ser ramificadas, não-ramificadas, cíclicas ou acíclicas e incluem heteróciclos saturados ou não-saturados tais como mor- 25 folino, pirrolidinila, etc. Em determinadas modalidades, as porções heteroali- fáticas são substituídas por substituintes independentes de um ou mais dos átomos de hidrogênio nos mesmos com uma ou mais porções incluindo, po- rém não limitadas a, alifáticos; hetero alifáticos; arila; heteroarila; arilalquila; heteroarilalquila; alcóxi; arilóxi; heteroalcóxi; heteroarilóxi; alquiltio; ariltio; 30 heteroalquiltio; heteroariltio; -F; -Cl; -Br; -I; -OH; -NO2; -CN; -CF3; -CH2CF3; - CHCI2; -CH2OH; -CH2CH2OH; -CH2NH2; -CH2SO2CH3; -C(O)Rx; -CO2(Rx); - CON(Rx)2; -OC(O)Rx; -OCO2Rx; -OCON(Rx)2; -N(Rx)2; -S(O)2Rx; -NRx(CO)Rx, em que cada ocorrência de Rx inclui, independentemente, porém não está limitada a alifático, heteroalifático, arila, heteroarila, arilalquila, ou heteroari- lalquila, em que cada um do substituintes alifático, heteroalifático, arilalquila, ou heteroarilalquila descrito acima e aqui, podem ser substituído ou não- 5 substituído, ramificado ou não-ramificado, cíclico ou acíclico, e em que, qualquer um do substituintes de arila ou heteroarila descrito acima e aqui, podem ser substituído ou não-substituído. Os exemplos adicionais de substi- tuintes aplicáveis em geral estão ilustrados através das modalidades especí- ficas mostradas nos exemplos e que estão descritas aqui,.

Os termos "halo" ou "halogênio" na forma usada aqui, se referem

a um átomo selecionado a partir de flúor, cloro, bromo ou iodo.

"Selecionados independentemente": o termo "selecionados in- dependentemente" na forma usada aqui, indicam que os grupos R podem ser idênticos ou diferentes.

As definições de outros termos usados através de todo o relató-

rio descritivo incluem:

"Ácido": O termo "ácido" na forma usada aqui, se refere a ácidos inorgânicos e orgânicos. Os exemplos de ácidos inorgânicos incluem, porém não são limitados a, ácido clorídrico, ácido bromídrico, ácido (hidroiódico), 20 ácido nítrico, ácido sulfúrico e ácido fosfórico. Os exemplos de ácidos orgâ- nicos incluem porém não estão limitados ao ácido fórmico, ácido acético, ácido trifluoracético, ácido fumárico, ácido oxálico, ácido tartárico, ácido ma- leico, ácido cítrico, ácido succínico, ácido málico, ácido metano sulfônico, ácido benzenossulfônico e ácido p-toluenossulfônico. Qualquer ácido pode 25 ser usado para o ajuste do pH dos tampões ou soluções de romidepsina ou aqueles usados na purificação da romidepsina. Em determinadas modalida- des é usado o ácido acético. Em determinadas modalidades é usado o ácido clorídrico, Em determinadas modalidades é usado o ácido cítrico. Em deter- minadas modalidades, é usado o ácido sulfúrico.

"Depsipeptidio": o termo "depsipeptídio", na forma usada aqui, se

refere aos polipeptídios que contêm ambas as ligações de éster e de amida. Os depsipeptídios de ocorrência natural são usualmente cíclicos. Alguns dos depsipeptídios tem mostrado ter uma atividade antibiótica potente. Os e- xemplos de desipeptídios incluem a actinomicina, eniatinas, valinomicina e romidepsina.

"Peptídio" ou "proteína": de acordo com a presente invenção, um "peptídio" ou "proteína" compreende uma fita de pelo menos três amino- ácidos ligados em conjunto através de ligações de peptídio. Os termos "pep- tídio" e "proteína" podem ser usados de forma intercambiável. Os peptídios contem de preferência somente amino-ácidos naturais, embora amino- ácidos não-naturais (isto é, compostos que não ocorrem na natureza, porém que podem ser incorporados dentro de uma cadeia de polipeptídio) e/ou análogos de amino-ácidos, como são conhecidos na técnica, possam ser alternativamente empregados. Também, um ou mais dos amino-ácidos em um peptídio pode ser modificado, por exemplo, através da adição de uma entidade química tal como um grupo de carboidrato, um grupo de fosfato, um grupo de farnesila, um grupo de isofarnesila, um grupo de ácido graxo, um Iigante para conjugação, funcionalização, ou outra modificação, etc. Em de- terminadas modalidades, as modificações do peptídio levam a um peptídio mais estável (por exemplo, uma maior meia -vida in vivo). Essas modifica- ções podem incluir a ciclização do peptídio, a incorporação de amino-ácidos D, etc. Nenhuma das modificações devem substancialmente interferir com a atividade biológica desejada do peptídio. Em determinadas modalidades, o peptídio se refere ao depsipeptídio.

"Romidepsina": o termo "romidepsina" se refere a um produto natural da estrutura química: A romidepsina é um inibidor potente HDAC e também é conhe- cida na técnica pelos nomes de FK228, FR901228, NSC630176, ou depsi- peptideo. A preparação e a identificação da romidepsina estão descritas na Patente U.S. 4.977.138, que fica incorporada aqui, por referência. A fórmula 5 molecular é C24H36N4O6S2; e o peso molecular é 540,71. A Romidepsina tem o nome químico, (1S,4S,10S,16E,21R)-7-[(2Z)-etilideno]-4,21-diisopropila-2- oxa-12,13-ditia-5,8,20,23-tetra-azabiciclo[8.7.6]tricos-16-eno-3,6,9,19,22- pentanona. A romidepsina teve atribuído o número CAS 128517-07-7. Na forma cristalina, a romidepsina é tipicamente um cristal ou um pó cristalino 10 de cor branca a amarela-clara. O termo "romidepsina" engloba este compos- to e quaisquer formas de sais farmaceuticamente aceitáveis do mesmo. Em determinadas modalidades, o termo "romidepsina" também pode incluir pro- fármacos, ésteres, formas protegidas e derivados da mesma.

Breve Descrição Resumida dos Desenhos A figura 1 mostra um fluxograma para a purificação da romidep-

sina a partir de uma cultura de Chromobacterium violaceum.

Descrição Detalhada de Determinadas Modalidades da Invenção

A presente invenção proporciona um sistema aperfeiçoado para a preparação da romidepsina, um inibidor conhecido da histona desacetilase 20 (HDAC) útila para o tratamento de câncer. Infelizmente, os métodos publica- dos para a preparação da romidepsina não produzem de modo reproduzível a romidepsina monomérica pura. Surpreendentemente, o controle do pH du- rante o processo de purificação foi descoberto como provendo a romidepsina monomérica pura de forma reproduzível. Especificamente, executando pelo 25 menos determinadas porções do processo de purificação em um pH aparen- te reduzido (por exemplo, um pH aparente variando a partir de 4 até 6), re- sulta na produção mais elevada de romidepsina monomérica purificada sem os produtos colaterais contaminantes dimerizados, oligomerizados ou poli- merizados.

A romidepsina é um depsipeptídio cíclico que tem uma ligação

de dissulfeto. A presente invenção é baseada na descoberta de que a expo- sição da romidepsina a condições básicas (por exemplo, maiores do que um pH aparente de ~ 7) facilita a redução dessa ligação de dissulfeto. A romi- depsina reduzida com os seus tióis livres foi descoberta como sendo susce- tível à dimerização, oligomerização ou polimerização. Esses adutos são tipi- camente insolúveis e difíceis de serem removidos a partir da romidepsina purificada. Em determinadas modalidades, esses adutos contaminantes im- pedem uma preparação da romidepsina de satisfazer as especificações de- sejadas (por exemplo, solubilidade, grau de pureza, rotação ótica, etc.). Nas composições farmacêuticas, esses adutos diminuem a pureza do agente ativo, a romidepsina. Uma vez que a romidepsina está sendo usada como um agente farmacêutico em seres humanos, é importante que a romidepsina monomérica pura, estável seja obtida de forma reproduzível a partir de uma fermentação de Chromobacterium violaceum. A presente invenção aparece a partir do reconhecimento de que condições alcalinas ocasionem a forma- ção de tais adutos indesejáveis da romidepsina e proporciona uma nova so- lução para esse problema.

O sistema da invenção também é útila para a preparação de de- rivados da romidepsina, especificamente de derivados que contenham uma ligação de dissulfeto. Em determinadas modalidades, o derivado da romi- depsina tem a fórmula (I):

na qual

m é 1, 2, 3 ou 4; n é 0, 1, 2 ou 3;

p e q são independentemente 1 ou 2;

X é O, NH, ou NR8;

Ri, R2, e R3 são independentemente hidrogênio; alifáticos não- substituídos ou substituídos, ramificados ou não-ramificados, cíclicos ou ací- clicos; heteroalifáticos não-substituídos ou substituídos, ramificados ou não- ramificados, cíclicos ou acíclicos; arila não-substituída ou substituída; ou he- teroarila não-substituída ou substituída;

R4, R5, R6 , Rre R8 são independentemente hidrogênio; ou alifá-

ticos substituídos ou não-substituídos, ramificados ou não-ramificados, cícli- cos ou acíclicos; e os sais farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos. Em determinadas modalidades, m é 1. Em determinadas modalidades, n é 1. Em determinadas modalidades, p é 1. Em determinadas modalidades, q é 1. Em 10 determinadas modalidades, X é O. Em determinadas modalidades, Ri, R2, e R3 são alifáticos acíclicos não-substituídos, ou substituídos, ramificados ou não-ramificados. Em determinadas modalidades, R4, Rs, R6, e R7 são todos hidrogênio.

Em determinadas modalidades, o derivado da romidepsina é da

fórmula (II):

em que

m é 1, 2, 3 ou 4;

n é 0, 1, 2 ou 3; ] q é 2 ou 3;

X é O, NH1 ou NR8;

Y é OU8, ou SR8;

R2 e R3 são independentemente hidrogênio; alifáticos não- substituídos ou substituídos, ramificados ou não-ramificados, cíclicos ou ací- clicos; heteroalifáticos não-substituídos ou substituídos, ramificados ou não- ramificados, cíclicos ou acíclicos; arila não-substituída ou substituída; ou he- teroarila não-substituída ou substituída;

R4, Rs, R6 . R7 and Re são independentemente selecionados a partir de hidrogênio; ou alifático substituídos ou não-substituídos, ramificados 5 ou não-ramificados, cíclicos ou acíclicos; e os sais farmaceuticamente acei- táveis do mesmo. Em determinadas modalidades, m é 1. Em determinadas modalidades, n é 1. Em determinadas modalidades, q é 2. Em determinadas modalidades, X é O. Em outras modalidades, X é NH. Em determinadas mo- dalidades, R2 e R3 são alifáticos acíclicos não-substituídos ou substituídos, 10 ramificados ou não-ramificados. Em determinadas modalidades, R4, R5, R6, e R7 são todos hidrogênio.

Em determinadas modalidades, o derivado da romidepsina é da

fórmula (III):

na qual A é uma porção que é clivada sob condições fisiológicas

para dar um grupo tiol e inclui, por exemplo, uma porção acila alifática ou aromática (para a formação de uma ligação de tioéster); um tióxi alifático ou aromático (para a formação de uma ligação de dissulfeto); ou similares; e racematos, enantiômeros, isômeros, tautômeros, sais, ésteres, e pró- 20 fármacos dos mesmos. Esses grupos alifáticos ou aromáticos podem incluir um grupo alifático substituído ou não-substituído, ramificado ou não- ramificado, cíclico ou acíclico; um grupo aromático substituído ou não- substituído; um grupo heteroaromático substituído ou não-substituído; ou um grupo heterocíclico substituído ou não-substituído. A pode ser, por exemplo, 25 -COR1, -SC(=0)-0-Ri, ou -SR2. Ri é independentemente hidrogênio; ami- no substituído ou não-substituído; alifáticos substituídos ou não-substituídos, ramificados ou não-ramificados, cíclicos ou acíclicos; um grupo aromático substituído ou não-substituído; um grupo heteroaromático substituído ou não-substituído; ou um grupo heterocíclico substituído ou não-substituído. Em determinada modalidade, Ri é hidrogênio, metila, etila, n-propila, isopro- 5 pila, n-butila, isobutila, benzila, ou bromobenzila. R2 é um grupo alifático substituído ou não-substituído, ramificado ou não-ramificado, cíclico ou ací- clico; um grupo aromático substituído ou não-substituído; um grupo heteroa- romático substituído ou não-substituídos; ou um grupo heterocíclico substitu- ído ou não-substituído. Em determinadas modalidades, R2 é metila, etila, 2- 10 hidroxietila, isobutila, ácidos graxos, um benzila substituída ou não- substituída, uma arila, cisteína, homocisteína, ou glutationa substituída ou não-substituída.

Em determinadas modalidades, o derivado da romidepsina é das

fórmulas (IV ou IV'):

O

15

(IV)

O

(IV')

nas quais Ri, R2, R3, e R4 são o mesmo ou diferentes e representam uma porção de cadeia lateral de amino-ácido, cada R6 é o mesmo ou é diferente e representa hidrogênio ou CrC4 alquila, e Pr1 e Pr2 são o mesmo ou são diferentes e representam hidrogênio ou um grupo de proteção de tiol. Em determinadas modalidades, as porções de cadeia lateral de amino-ácidos são aqueles derivados a partir de amino-ácidos naturais. Em outras modali- dades, as porções laterais da cadeia de amino-ácidos são aqueles derivados 5 a partir de amino-ácidos não-naturais. Em determinadas modalidades, cada cadeia lateral de amino acido é uma porção selecionada a partir de -H, -Cr C6 alquila, -C2-C6 alquenila, -L-O-C(O)-R', -L-C(O)-O-R", -L-A, -L-NR"R", -L- Het-C(O)-Het-R", e -L-Het-R", nas quais L é um grupo de CrC6 alquileno, A é fenila ou um grupo de heteroarila de 5- ou 6- elementos, cada um de R' é o 10 mesmo ou é diferente e representa C1-C4 alquila, cada um de R" é o mesmo ou é diferente e representa H ou CrC6 alquila, cada um de -Het- é o mesmo ou é diferente e é um espaçador de heteroátomo selecionado a partir de -O-, -N(R"’)-, e -S-, e cada um de R"' é o mesmo ou é diferente e representa H ou CrC4 alquila. Em determinadas modalidades, R6 é -H. Em determinadas 15 modalidades, Pr1 e Pr2 são os mesmos ou são diferentes e são selecionados a partir de hidrogênio e de um grupo de proteção selecionado a partir de um grupo benzila, o qual é opcionalmente substituído com CrC6 alcóxi, Ci-C6 acilóxi, hidróxi, nitro, picolila, picolila-N-óxido, antrilmetila, difenilmetila, fenila, t-butila, adamantila, CrC6 aciloximetila, CrC6 alcóximetila, tetra- 20 hidropiranila, benziltiometila, fenilltiometila, tiazolidina, acetamidemetila, ben- zamidometila, butoxicarbonila terciário (BOC), acetila e os derivados do mesmo, benzoila e os derivados do mesmo, carbamoila, fenilcarbamoila, e CrC6 alquilacarbamoíla. Em determinadas modalidades, Pr1 e Pr2 são hi- drogênio. Diversos derivados da Romidepsina das fórmulas (IV) e (IV) estão 25 descritos no Pedido de Patente PCT WO 2006/129105, publicado em 7 de dezembro de 2006; que fica incorporado aqui, por referência.

A presente invenção também é útila para a preparação de outros produtos naturais que contenham uma ligação de dissulfeto. A invenção po- de ser usada para a preparação de peptídios cíclicos ou acíclicos. Em de- 30 terminadas modalidades, os peptídios cíclicos que contêm uma ligação de dissulfeto são purificados com a utilização do sistema da invenção. Em de- terminadas modalidades, outros depsipeptídios, além da romidepsina, são purificados com base na presente invenção com a utilização de uma redução do pH aparente para limitar ou eliminar a redução de uma ligação intramole- cuIar de dissulfeto.

De acordo com a invenção, a formação de adutos indesejáveis da romidepsina ou de um derivado da romidepsina pode ser evitada através de não permitir que a romidepsina seja preparada ou purificada sob condi- ções maiores do que um pH aparente de -7,0, mais preferêncialmente maio- res do que um pH aparente de -6,5, ou de maior preferência maior do que um pH aparente de -6,0. A preparação e a purificação é tipicamente mantida entre aproximadamente um pH aparente de 4,0 e um pH aparente de 6,0. Em determinadas modalidades, um pH aparente ainda mais baixo pode ser usado. Esse reconhecimento pode ser aplicado a qualquer método de pro- dução ou de purificação para a preparação da romidepsina. Em determina- das modalidades, a romidepsina é purificada a partir de uma fermentação. Em outras modalidades, a romidepsina é preparada através da semissíntese ou da síntese total. Esta descoberta também pode ser aplicada com relação à preparação e/ou a produção de análogos ou derivados da romidepsina (por exemplo, sais, ésteres, pró-fármacos, isômeros, enantiômeros, tautôme- ros, formas protegidas, produtos derivatizados, etc.). Determinados deriva- dos da romidepsina estão descritos aqui,.

Os processos para a preparação da romidepsina são conhecidos na técnica. Ver, por exemplo, Ueda et ai, J. Antibiot. (Tokyo) 47: 301 310, 1994; Nakajima et ai, Exp. Cell Res. 241: 126 133, 1998; WO 02/20817; Pa- tente U.S. 4.977.138; cada uma das quais fica incorporada aqui, por referên- cia.

Uma vez que a romidepsina é um produto natural, ela é prepa- rada tipicamente através do isolamento da mesma a partir de uma fermenta- ção de um micro-organismo que produz a mesma. Em determinadas modali- dades o micro-organismo pertence ao gênero Chromobacterium. Um micro- 30 organismo de exemplo que é conhecido para a produção da romidepsina é o Chromobacterium violaceum. Qualquer variante natural ou feita pelo homem do Chromobacterium violaceum pode ser usada para isolar a romidepsina com a utilização do sistema da invenção. Em determinadas modalidades, a cepa de Chromobacterium violaceum é a Chromobacterium violaceum WB968. Em determinadas modalidades, a cepa da Chromobacterium viola- ceum é uma cepa mutante da Chromobacterium violaceum WB968. Em de- 5 terminadas modalidades, o micro-organismo é geneticamente manipulado para a produção da romidepsina. Por exemplo, os genes responsáveis com relação ao mecanismo celular que produz a romidepsina podem ser coloca- dos dentro de outros micro-organismos, tais como bactérias ou fungos.

O organismo é cultivado sob condições adequadas para a sua 10 produção de romidepsina. De preferência, as condições de cultura são otimi- zadas para a produção de um nível elevado de romidepsina com níveis mí- nimos de adutos de contaminação ou de degradantes. O meio de cultura inclui, de preferência, uma fonte de carbono e de nitrogênio e quaisquer vi- taminas e minerais essenciais. A cultura é tipicamente cultivada sob condi- 15 ções aeróbicas. O tamanho da cultura pode variar a partir de 10 ml até 10.000 I ou ainda maior. Em determinadas modalidades, o volume da cultura é maior do que 500 I. Em outras modalidades, o volume é maior do que 1000

I. Em ainda outras modalidades, o volume é maior do que 2000 litros. Em outras modalidades, o volume é maior do que 3000 litros. Em outras modali- 20 dades, o volume é maior do que 5000 litros. Em outras modalidades, o vo- lume é maior do que 6000 litros. Em outras modalidades, o volume é maior do que 7000 litros. Em outras modalidades, o volume é maior do que 8000 litros. Em outras modalidades, o volume é maior do que 9000 litros. Em de- terminadas modalidades, o volume da cultura varia aproximadamente de 25 5000 litros até aproximadamente 10000 litros. Frascos de agitação, fermen- tadores, bio reatores ou qualquer outra aparelhagem útila para a fermenta- ção de micro-organismos pode ser usada. Na forma apropriada, as culturas de semente e culturas de pequenos fermentadores são usadas para semear culturas maiores.

Em determinadas modalidades, um agente de antiformação de

espuma (por exemplo, o antiformador de espuma de polialquileno glicol (A- dekanol LG-109)) é usado em culturas maiores. Outros agentes de anti- formação de espuma comercialmente disponíveis também podem ser usa- dos. Os agentes anti-formação de espuma são especificamente úteis quan- do é usado um fermentador para a produção da romidepsina.

A fonte de carbono no meio de cultura pode ser qualquer carboi- drato. Em determinadas modalidades, a fonte de carbono é um monossaca- rídio ou um dissacarídio (por exemplo, a glicose). Em determinadas modali- dades específicas, a fonte de carbono é a glicose ou a maltodextrina. Outros carboidratos tais como o amido, maltose, frutose ou glicerina podem ser u- sados em determinadas modalidades. Em determinadas modalidades, a fon- te de nitrogênio é um sal de amônio tal como o sulfato de amônio, nitrato de amônio, fosfato de amônio, etc. Em outras modalidades, a fonte de nitrogê- nio é uma peptona vegetal (por exemplo, a polipeptona NS, água de mace- ração de milho, Hinute R). Outras fontes de nitrogênio que podem ser usa- das incluem caldo ("bouillon"), extrato de fermento, peptona de soja, farelo de glúten, farinha de sementes de algodão, farelo de soja, fermento seco e germe de trigo. Em determinadas modalidades, a fonte de nitrogênio éau- réia ou amino-ácidos. Em determinadas modalidades, a fonte de nitrogênio é uma molécula orgânica pequena que contenha nitrogênio. Em determinadas modalidades, o meio é suplementado com aminoácidos. Por exemplo, o meio pode ser suplementado com L-arginina, L-histidina ou L-cisteína. Em determinadas modalidades, o meio é suplementado com L-cisteína. Ver a WO 02/20817; incorporada aqui, por referência. Em determinadas modalida- des o meio é suplementado com L-cisteína e L-valina. Essa suplementação é considerada como aumentando a quantidade de romidepsina produzida na fermentação, e/ou reduzindo a quantidade de substâncias relacionadas e/ou degradantes. O meio de cultura pode incluir minerais tais como o magnésio (por exemplo, o sulfato de magnésio) e fosfato (por exemplo, o di- hidrogenofosfato de potássio, hidrogêniofosfato de dissódio). Em determina- das modalidades, o meio de cultura inclui glicose, peptona vegetal (polipep- tona NS) ou água de maceração de milho (CSL), sulfato de magnésio e á- gua. Em determinadas modalidades, o meio de cultura inclui glicose, poli- peptona (polipeptoina NS), sulfato de magnésio, um agente anti-formação de espuma, e água. Em determinadas modalidades, o meio de cultura inclui glicose (0,45 a 1,0%), peptona vegetal (polipeptona NS) ou CSL (0,9 a 4,0%), sulfato de magnésio (0,0054 a 0,010%), um agente anti-formação de espuma (0,09% a 0,11%) e água (o restante). Em determinadas modalida- des, o meio de cultura inclui glicose, amido oxidado (por exemplo, Pinodex # 100) ou maltodextrina, peptona de soja (por exemplo, Hinute R), sulfato de amônio, sulfato de magnésio, di-hidrogeno fosfato de potássio, hidrogeno fosfato de dissódio, agente anti-formação de espuma (por exemplo, Adeka- nol LG-109), L-cisteína, L-valina, e água. Em determinadas modalidades, o meio de cultura inclui glicose (2 a 10%), amido oxidado (por exemplo, Pino- dex # 100) ou maltodextrina (1 a 15%), peptona de soja (por exemplo, Hinute R)(1 a 6%), sulfato de amônio (0 a 0,5%), sulfato de magnésio (0 a 2%),di- hidrogeno fosfato de potássio (0,275 a 1,65%, hidrogeno fosfato de dissódio) (0,18 a 1,8%), agente anti-formação de espuma (por exemplo, Adekanol LG- 109) (0,2 a 0,66%), L-cisteína (0,30 mM), L-valina (0 a 15 mM), e água.

A cultura é tipicamente cultivada sob condições (por exemplo, temperatura, pH, concentração de oxigênio, etc.), adequadas para a cultura do organismo. Em determinadas modalidades, o pH da cultura é monitorado e/ou ajustado. O pH da cultura pode variar a partir de um pH de 5,0 até 7,5. 20 Qualquer organismo para a produção da romidepsina terá uma temperatura de preferência para crescimento dependendo das condições sob as quais a cultura é cultivada. Em determinadas modalidades, a cultura é cultivada em uma temperatura que varia a partir de 15°C até 37°C, de preferência a partir de 23°C até 32°C. Em determinadas modalidades, a cultura é cultivada em 25 uma temperatura entre 18°C até 27°C. Em determinadas modalidades, a cultura é cultivada em uma temperatura de aproximadamente 18 0C. Em de- terminadas modalidades, a cultura é cultivada em uma temperatura de apro- ximadamente 19 0C. Em determinadas modalidades, a cultura é cultivada em uma temperatura de aproximadamente 20 0C. Em determinadas modalida- 30 des, a cultura é cultivada em uma temperatura de aproximadamente 21 0C. Em determinadas modalidades, a cultura é cultivada em uma temperatura de aproximadamente 22 0C. Em determinadas modalidades, a cultura é cultiva- da em uma temperatura de aproximadamente 23 0C. Em determinadas mo- dalidades, a cultura é cultivada em uma temperatura de aproximadamente

24 0C. Em determinadas modalidades, a cultura é cultivada em uma tempe- ratura de aproximadamente 25 0C. Em determinadas modalidades, a cultura 5 é cultivada em uma temperatura de aproximadamente 26 0C. Em determina- das modalidades, a cultura é cultivada em uma temperatura de aproxima- damente 27 0C. Em determinadas modalidades, a cultura é cultivada em uma temperatura de aproximadamente 28 0C. Em determinadas modalida- des, a cultura é cultivada em uma temperatura de aproximadamente 29 0C. 10 Em determinadas modalidades, a cultura é cultivada em uma temperatura de aproximadamente 30 0C. Em determinadas modalidades, a cultura é cultiva- da em uma temperatura de aproximadamente 31 0C. Em determinadas mo- dalidades, a cultura é cultivada em uma temperatura de aproximadamente 32 0C.

A concentração de oxigênio na cultura é mantida em um nível

que varia a partir de 10 a 50%. Em determinadas modalidades, a concentra- ção de oxigênio é mantida acima de 20%. O nível de oxigênio é mantido a- través de aeração, pressão e/ou agitação.

A cultura resultante é tipicamente cultivada durante aproxima- damente de 10 até 100 horas. A cultura pode ser colhida depois de 20, 30,

40, 50, 60, 70 ou 80 horas. Em determinadas modalidades, a cultura é colhi- da depois de aproximadamente 30, 35, 40, 45 ou 50 horas. Em determina- das modalidades, a cultura é colhida em aproximadamente 36 horas. Em determinadas modalidades, a cultura é colhida em aproximadamente 50 ho- 25 ras. Tipicamente a cultura é cultivada até a saturação. Uma vez que a romi- depsina é um metabólito secundário, os rendimentos máximos são derivados a partir das últimas etapas da cultura. Em algumas modalidades, a cultura é colhida em fase log. Como poderá ser apreciada por uma pessoa versada na técnica, a cultura é tipicamente colhida antes que quantidades significativas 30 de degradantes sejam formadas. O tempo da colheita pode ser determinado de forma empírica através da análise de uma amostra da fermentação para a produção da romidepsina. Em determinadas modalidades, a cultura é co- Ihida quando a titulação da romidepsina atinge entre 0,5 e 1,5 kg. Em deter- minadas modalidades, a cultura é colhida quando a titulação atinge pelo me- nos 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, ou 1,1 g/kg. Em determinadas modalidades, a cul- tura é colhida quando a titulação atinge pelo menos 0,8 g/kg. A amostra 5 também pode ser analisada com relação a substâncias relacionadas ou de- gradantes, e a cultura colhida quando um nível desejado de romidepsina, nível desejado de substâncias relacionadas ou degradantes ou uma propor- ção das duas é alcançado. O tempo da colheita também pode ser determi- nado com base no consumo de um componente no meio tal como a glicose. 10 Em outras modalidades, o tempo de colheita é baseado sobre a produção de um metabólito. O tempo da colheita pode ser determinado com base sobre uma combinação dos critérios acima.

Depois que a cultura é cultivada durante uma quantidade de tempo suficiente, a cultura é colhida. A romidepsina desejada pode ser en- 15 contrada no meio de cultura bem como nas células da cultura. As células são opcionalmente mortas e/ou Iisadas antes da purificação. Em determina- das modalidades, as células são mortas com a adição de um ácido tal como o ácido sulfúrico. Em determinadas modalidades, o pH é abaixado para a- proximadamente o pH 2,0 a 3,0.

O material resultante é em seguida opcionalmente reduzido em

volume. A romidepsina é purificada através de qualquer técnica de purifica- ção conhecida na técnica para a purificação de peptídios, produtos naturais e/ou moléculas orgânicas. As técnicas de purificação de exemplo incluem a cromatografia em batelada, cromatografia de coluna e cristalização. O pro- 25 cesso de purificação pode incluir uma ou mais etapas com a finalidade de alcançar o grau de purificação desejado. Em determinadas modalidades o material extraído é purificado com a utilização de uma resina de absorção não-iônica. Em determinadas modalidades, é usada uma resina de fase re- versa na etapa de fracionamento. Em determinadas modalidades específi- 30 cas, são usadas etapas múltiplas de cromatografia de coluna com a utiliza- ção de uma resina de fase reversa. As resinas úteis para o processo de puri- ficação, a título de exemplo, incluem alumina, sílica-gel, Sepabeads SP850, Diaion HP20SS, and Diaion HP20. Em determinadas modalidades, a Diaion HP20SS e/ou a Diaion HP20 são obtidas da Mitsubishi Chemical Corporati- on. Em determinadas modalidades, a alumina é usada como o material da coluna. Em determinadas modalidades, o sílica-gel é usado como a resina.

5 Em determinadas modalidades, uma ou mais etapas da cromatografia de coluna são executadas em um pH aparente de menos do que 6,0. Em de- terminadas modalidades, uma ou mais dessas etapas é executada em um pH aparente entre 4,0 e 6,0. Em determinadas modalidades, todas as etapas da cromatografia de coluna são executadas em um pH aparente de menos 10 do que 6,0. Em determinadas modalidades, todas as etapas da cromatogra- fia de coluna são executadas em um pH aparente que varia a partir de 4,0 até 6,0.

Em determinadas modalidades, a purificação da romidepsina envolve a purificação do material extraído com a utilização de mais do que uma etapa de cromatografia em batelada ou de coluna. Em determinadas modalidades, uma etapa de cromatografia em batelada é seguida por etapas de cromatografia de coluna. Em determinadas modalidades, o material extra- ído é purificado através de cromatografia em batelada com Sepabeads SP850, seguida por uma coluna empacotada com Diaion HP20SS, seguida por uma coluna empacotada com Diaion HP20, e finalmente por uma coluna empacotada com alumina. Todas essas etapas de cromatografia são execu- tadas de preferência em um pH aparente variando a partir de 4,0 até 6,0. Em outras modalidades, o material extraído é purificado com a utilização de uma coluna empacotada com Diaion HP20, seguida por uma coluna empacotada com Diaion HP20SS, e finalmente seguida por outra coluna empacotada com Diaion HP20. Nesse processo alternativo de purificação, todas as eta- pas da cromatografia de coluna são executadas de preferência em um pH aparente variando a partir de 4,0 até 6,0. Cada uma das colunas é opcio- nalmente lavada com água ou com outra solução aquosa seguida pela elui- ção da romidepsina com a utilização de uma solução aquosa de um solvente orgânico (por exemplo, a acetona). Em determinadas modalidades, o mate- rial extraído é purificado com a utilização de sílica-gel. A cromatografia sobre sílica-gel também pode ser usada como uma etapa adicional de purificação em conjunto com cromatografia usando outras resinas ou materiais de em- pacotamente. Em determinadas modalidades, o material extraído é purifica- do com a utilização de alumina. A cromatografia com alumina também pode 5 ser usada como uma etapa adicional de purificação em conjunto com a cro- matografia utilizando outras resinas ou materiais de empacotamento.

Em determinadas modalidades, o material com a romidepsina bruta é empacotado sobre uma matriz pré-equilibrada em um pH aparente de menos do que 6,0, de preferência com um pH aparente variando a partir 10 de 4,0 até 6,0. A matriz é em seguida lavada para a remoção das impurezas. Tipicamente, a lavagem da matriz é feita com uma solução mais polar (isto é, uma percentagem maior de água) do que a da eluição da romidepsina. Por exemplo, a matriz pode ser lavada com até de 25 a 50% de acetona a- quosa seguida pela eluição da romidepsina com 50 até 100% de acetona 15 aquosa. Como poderá ser apreciado por aquelas pessoas versadas na téc- nica, os solventes de lavagem e de eluição são determinados pela matriz usada e a polaridade do composto.

Em determinadas modalidades, uma ou mais das etapas da cromatografia (incluindo a carga, lavagem e eluição da resina) são executa- das em um pH aparente de menos do que 6,0. Em determinadas modalida- des específicas, as etapas da cromatografia são executadas em um pH apa- rente que varia a partir de 3,0 até 6,0. Em outras determinadas modalidades, as etapas da cromatografia são executadas em um pH aparente que varia a partir de 4,0 até 6,0. O pH aparente da solução empacotada sobre a matriz pode ser ajustado para o pH aparente desejado com a adição de um ácido. Qualquer um dos ácidos descritos aqui, pode ser usado para o abaixamento do pH aparente da solução. O pH aparente das soluções de lavagem e de eluição,também pode ser ajustado para o pH aparente desejado. Em deter- minadas modalidades, o pH aparente de todas as soluções que contenham a romidepsina é mantido abaixo de um pH aparente de aproximadamente

6,0, impedindo, por meio disso, a formação de adutos indesejáveis. Em de- terminadas modalidades, o pH aparente da solução é tamponado em um pH aparente que varia a partir de aproximadamente 4,0 até aproximadamente

6,0. Em determinadas modalidades, o pH aparente das soluções de acetona e água é ajustado para o pH aparente desejado com a utilização de ácido acético, ácido clorídrico, tampão de acetato de amônia, ou ácido cítrico. Em 5 determinadas modalidades, é usado um sistema de tamponamento de ace- tato.

A romidepsina pode alternativamente ou adicionalmente ser puri- ficada através de cristalização. A purificação por cristalização pode ser usa- da em conjunto com outros métodos de purificação incluindo a cromatografia 10 de coluna e/ou em batelada. Em determinadas modalidades, a cristalização é usada depois da purificação por cromatografia de coluna e/ou em batela- da. Em determinadas modalidades específicas, a cristalização é realizada depois da purificação através de cromatografia de coluna e/ou em batelada, como descrito acima. A cristalização pode ter lugar em qualquer solvente 15 adequado. A romidepsina é, de preferência, minimamente solúvel no solven- te. Em determinadas modalidades, o solvente de cristalização é um álcool. Em determinadas modalidades, o solvente de cristalização é o metanol. Em determinadas modalidades, o solvente de cristalização é o etanol. Em de- terminadas modalidades, é usado um sistema de solventes misto. O solven- 20 te de cristalização pode ser uma mistura de álcool e água. Em outras moda- lidades, o solvente de cristalização é uma mistura de acetona e água. Em determinadas modalidades específicas, a romidepsina é dissolvida em uma solução aquosa de acetona (por exemplo, 85% de acetona) e precipitada através da adição lenta de água. Em determinadas modalidades, a romidep- 25 sina é dissolvida em um solvente (por exemplo, metanol), e a solução resul- tante é concentrada, fazendo com que a romidepsina se cristalize. Em outras modalidades, a romidepsina é dissolvida em uma mistura de água e um sol- vente orgânico (por exemplo, acetona aquosa à 85%), e a romidepsina é precipitada através da adição de água. Os cristais obtidos a partir da etapa 30 de cristalização são tipicamente coletados por filtragem e opcionalmente la- vados e secos. Em determinadas modalidades, o pH aparente dos solventes de cristalização é abaixo de 6,0. Em determinadas modalidades específicas, o pH aparente do solvente fica entre 4,0 e 6,0. Qualquer lavagem dos cris- tais resultantes também é executada em um pH aparente reduzido (por e- xemplo, entre um pH aparente de 4,0 e 6,0).

Alternativamente ou adicionalmente, o armazenamento ou o 5 tempo de retenção da romidepsina durante o processo de cristalização é de menos do que cerca de 20 horas. Em determinadas modalidades, o armaze- namento ou o tempo de retenção é de menos do que 5 horas. Em determi- nadas modalidades específicas, o processo de cristalização é realizado ime- diatamente quando da formação da solução de cristalização.

A invenção proporciona a romidepsina purificada isenta ou subs-

tancialmente isenta de adutos indesejáveis. Em determinadas modalidades, a romidepsina é pelo menos 98% isenta de adutos contaminantes, pelo me- nos 99% isenta de adutos contaminantes, ou pelo menos 99,5% isenta de adutos. Em determinadas modalidades, a romidepsina é pelo menos 98% 15 monomérica, pelo menos 99% monomérica, ou pelo menos 99,5% monomé- rica. Em determinadas modalidades, a romidepsina é pelo menos 99,9% monomérica. Em determinadas modalidades, a romidepsina é pelo menos 99,95% monomérica. Em determinadas modalidades, a romidepsina não inclui romidepsina dimerizada, oligomerizada ou polimerizada que possa ser 20 detectada.

Em determinadas modalidades, a romidepsina é pelo menos 98% pura, pelo menos 99% pura ou pelo menos 99,5% pura. Em determina- das modalidades, a romidepsina é pelo menos 99,7% pura. Em determina- das modalidades, a romidepsina é pelo menos 99,8% pura. Em determina- 25 das modalidades, a romidepsina é pelo menos 99,9% pura. Em determina- das modalidades, a romidepsina é pelo menos 99,95% pura. Em determina- das modalidades específicas, a romidepsina contem menos do que 0,2% de "outras desconhecidas". Em determinadas modalidades específicas, a romi- depsina contem menos do que 0,1% de impurezas denominadas de "outras 30 desconhecidas". Essa romidepsina altamente purificada é útila para a prepa- ração de composições farmacêuticas. Essas composições são especifica- mente úteis para o tratamento do câncer e de outras doenças proliferativas. A composição também pode ser usada em outras doenças que podem ser tratadas através da inibição da atividade da desacetilase histona. A compo- sição também pode ser usada em outras doenças que podem ser tratadas através da inibição da atividade de desacetilase tubulina. A composição 5 também pode ser usada em outras doenças que podem ser tratadas através da inibição da atividade de desacetilase. A romidepsina purificada da inven- ção também é útila para as finalidades de pesquisa.

A pureza da romidepsina pode ser avaliada com a utilização de qualquer método conhecido na técnica. Os métodos para a avaliação da pu- 10 reza incluem a aparência, HPLC, rotação específica, espectroscopia RMN1 espectroscopia IV espectroscopia UV visível, análise por difração de raios X sobre pó (XRPD), análise de elementos, espectroscopia de massa LC, e es- pectroscopia de massa. Em determinadas modalidades, a pureza é avaliada através de HPLC, que tem um limite de detecção de impurezas de aproxi- 15 madamente 0,05%. Em determinadas modalidades, a pureza é avaliada a- través de espectroscopia RMN. Em determinadas modalidades, a pureza é avaliada através de espectroscopia IV Em determinadas modalidades, a pu- reza é avaliada através de espectroscopia de UV visível. Em determinadas modalidades, a pureza é avaliada através de análise por XRPD.

Em determinadas modalidades, a pureza é avaliada através de

rotação específica em um solvente apropriado. Em determinadas modalida- des o solvente usado para a rotação específica é o clorofórmio (CHCL3). Em outras modalidades, o solvente usado é um álcool tal como o metanol ou etanol. Em ainda outras modalidades, o solvente usado é a água ou uma 25 solução de água e álcool. Em determinadas modalidades, a rotação especí- fica é verificada com a utilização de um método de compêndio tal como a- quele descrito nas U.S. Pharmacopeia, European Pharmacopeia, JP Phar- macopeia, or British Pharmacopeia. Em determinadas modalidades, a rota- ção específica é executada com a utilização de uma solução de romidepsina 30 em clorofórmio. A concentração da solução pode variar a partir de 5 mg/ml até 30 mg/ml. Em determinadas modalidades, a concentração é de aproxi- madamente 20 mg/ml. A rotação da romidepsina varia a partir de ± 38° até ± 47°. Em determinadas modalidades, a rotação específica varia a partir de ± 39° até ± 41°. Em determinadas modalidades, a rotação específica varia a partir de ± 40,0° até ± 40,5°. Em determinadas modalidades específicas, a rotação específica é de aproximadamente ± 40°. Foi descoberto que a pre- 5 sença adutos contaminantes resulta em um precipitado quando a romidepsi- na é dissolvida em clorofórmio.

Quando em solução, a romidepsina é armazenada de preferên- cia em um pH aparente abaixo de aproximadamente 6,0. Em determinadas modalidades, o pH aparente varia a partir de aproximadamente 4,0 até apro- 10 ximadamente 6,0. Em determinadas modalidades, uma formulação ou pre- paração de romidepsina é tamponada para impedir que o pH aparente se eleve acima de 7,0, mais preferêncialmente acima de 6,0. Em determinadas modalidades, a formulação ou preparação é tamponada para um pH aparen- te variando a partir de aproximadamente 4,0 até aproximadamente 6,0.

Usos

A romidepsina preparada como descrito aqui, pode ser usada in vitro ou in vivo. A romidepsina é especificamente útila para o tratamento de neoplasmas in vivo. No entanto, a combinação também pode ser usada in vitro para finalidades de pesquisa ou clínicas (por exemplo, para a determi- 20 nação da suscetibilidade da doença de um paciente com relação à romidep- sina). Em determinadas modalidades, o neoplasma é um neoplasma benig- no. Em outras modalidades, o neoplasma é um neoplasma maligno. Qual- quer câncer pode ser tratado com a utilização da romidepsina de forma iso- lada ou em combinação com outro agente farmacêutico.

Em determinadas modalidades, a malignidade é uma malignida-

de hematológica. As malignidades hematológicas são tipos de cânceres que afetam o sangue, a medula óssea, e/ou os nódulos linfáticos. Os exemplos de malignidades hematológicas que podem ser tratadas com a romidepsina incluem porém não estão limitados a leucemia linfoblástica aguda (ALL), Ieu- 30 cemia mielogênica aguda (AML), leucemia mielogênica crônica (CML), leu- cemia linfócita aguda (CLL), leucemia de célula de cabelo, Iinfoma Hodgkin, Iinfoma não Hodgkin, Iinfoma de célula T cutânea (CTCL), Iinfoma de célula T periférica (PTCL), mieloma múltiplo e síndrome mielodisplásica. Em de- terminadas modalidades, a combinação da invenção é usada para o trata- mento mieloma múltiplo. Em determinadas modalidades, o câncer é um mie- loma múltiplo relapso e/ou refratário. Em outras modalidades, a combinação da invenção é usada para o tratamento da leucemia linfócita crônica (CLL). Em determinadas modalidades específicas, o câncer é a CLL relapsa e/ou refratária. Em outras modalidades, a combinação da invenção é usada para o tratamento da leucemia mielogênica crônica (CML). Em determinadas mo- dalidades, a combinação da invenção é usada para o tratamento da Ieuce- mia linfoblástica aguda (ALL). Em determinadas modalidades, a combinação da invenção é usada para o tratamento da leucemia mielogênica aguda (A- ML). Em determinadas modalidades, o câncer é o Iinfoma da célula T cutâ- nea (CTCL). Em outras modalidades, o câncer é o Iinfoma da célula T perifé- rica (PTCL). Em determinadas modalidades, o câncer é uma síndrome mie- lodisplásica.

Outros cânceres além das malignidades hematológicas também podem ser tratados com a utilização da romidepsina. Em determinadas mo- dalidades, o câncer é um tumor sólido. Os cânceres que podem ser tratados, a título de exemplo, com a utilização da terapia de combinação incluem o 20 câncer do cólon, câncer do pulmão, câncer ósseo, câncer pancreático, cân- cer do estômago, câncer de esôfago, câncer de pele, câncer do cérebro, câncer do fígado, câncer do ovário, câncer cervical, câncer do útero, câncer do testículo, câncer da próstata, câncer da bexiga urinária, câncer do rim, câncer neuroendócrino, etc. Em determinadas modalidades, a romidepsina é 25 usada para o tratamento do câncer pancreático. Em determinadas modali- dades, a romidepsina é usada para o tratamento do câncer da próstata. Em determinadas modalidades específicas, o câncer da próstata é refratário ao hormônio do câncer da próstata.

No tratamento de neoplasmas tais como o câncer em um sujeito, a romidepsina é tipicamente dosada a 1 a 28 mg/m2. Em determinadas mo- dalidades, Romidepsina é dosada a 1 a 15 mg/m2. Em determinadas moda- lidades, Romidepsina é dosada a 5 a 14 mg/m2. Em determinadas modali- dades específicas, a romidepsina é dosada a 8, 10, 12 ou 14 mg/m2. A romi- depsina é tipicamente administrada em um ciclo de 28 dias com a romidep- sina sendo administrada nos dias 1, 8 e 15. Em determinadas modalidades, a romidepsina é administrada nos dias 1 e 15 com o dia 8 sendo pulado.

5 Como será notado por uma pessoa versada na técnica, a dosagem e a sin- cronização da administração de uma dosagem de romidepsina podem variar dependendo do paciente que está sendo tratado. Por exemplo, efeitos cola- terais adversos podem ser considerados para o abaixamento da dosagem da romidepsina administrada.

A romidepsina também pode ser usada para tratar e/ou matar

células in vitro. Em determinadas modalidades, uma concentração citotóxica de romidepsina é posta em contato com células com a finalidade de matar as mesmas. Em determinadas modalidades, a concentração da romidepsina varia a partir de 0,01 nM até 100 nM. Em determinadas modalidades, a con- 15 centração da romidepsina varia a partir de 0,1 nM até 50 nM. Em determina- das modalidades, a concentração da romidepsina varia a partir de 1 nM até 10 nM.

Qualquer tipo de célula pode ser testado ou morto com a romi- depsina. As células podem ser derivadas a partir de uma fonte animal, vege- tal, bacteriana ou de fungos. Em determinadas modalidades, as células são células de animais. Em determinadas modalidades as células são células de mamíferos. Em determinadas modalidades, as células são células de seres humanos. As células podem ser derivadas de um ser humano macho ou fê- mea em qualquer estágio de desenvolvimento. Em determinadas modalida- des, as células são células de primatas. Em determinadas modalidades, as células são derivadas a partir de um roedor (por exemplo, camundongo, rato, porquinho da índia, hamster, gerbo). Em determinadas modalidades, as cé- lulas podem ser derivadas a partir de um animal doméstico tal como um cão, gato, vaca, cabra, porco, etc. As células também podem ser derivadas a par- tir de um animal ou vegetal geneticamente manipulado, tal como um camun- dongo transgênico.

As células usadas podem ser do tipo natural ou células mutan- tes. As células podem ser geneticamente manipuladas. Em determinadas modalidades, as células são células normais. Em determinadas modalida- des, as células são células neoplásicas. Em determinadas modalidades, as células são células de câncer. Em determinadas modalidades, as células 5 são derivadas a partir de uma malignidade hematológica. Em outras modali- dades, as células são derivadas a partir de um tumor sólido. Por exemplo, as células podem ser derivadas a partir de um tumor do paciente (por exemplo, a partir de uma biopsia ou de uma excisão cirúrgica). Esses testes com rela- ção a citotoxidez podem ser úteis para a determinação de se um paciente irá 10 responder a uma terapia de combinação específica. Esse teste pode ser útila na determinação da dosagem necessária para o tratamento da malignidade. Esse teste da susceptibilidade de um câncer de um paciente com relação a romidepsina poderá evitar a administração não necessária de fármacos sem nenhum efeito para o paciente. O teste também pode permitir o uso de do- 15 ses mais baixas de um ou de ambos os fármacos se o câncer do paciente for especificamente suscetível à romidepsina.

Em outras modalidades, as células são derivadas a partir de li- nhagens dé células de câncer. Em determinadas modalidades, as células são a partir de malignidades hematológicas tais como aquelas discutidas 20 aqui,. As linhagens de células da leucemia humana incluem as U937, HL-60, THP-1, Raji, CCRF-CEM, e Jurkat. As linhagens de células CLL a título de exemplo, incluem JVM-3 e MEC-2. As linhagens de células de mieloma, a título de exemplo, incluem MM1.S, MM1.R (resistentes à dexametasona), RPMI8226, NCI-H929, e U266. As linhagens de células de linfoma, a título 25 de exemplo, incluem Karpas, SUDH-6, SUDH-16, L428, KMH2, e a linhagem de células de linfoma de manto Granta. Em determinadas modalidades, as células são células AML ou células de mieloma múltiplo (CD138+). Em de- terminadas modalidades, as células são células-tronco hematopoiéticas ou células progenitoras. Por exemplo, em determinadas modalidades, as célu- 30 Ias são células progenitoras hematopoiéticas tais como as células CD34+ da medula óssea. Em determinadas modalidades, as linhagens de células são resistentes a um agente quimioterapêutico específico. Em outras modalida- des, a linhagem de células é resistente a esteróides (por exemplo, resisten- tes à dexametazona). Em determinadas modalidades específicas, as células são células de mieloma múltiplo humano resistentes a esteróides. Composições Farmacêuticas 5 Esta invenção também proporciona composições farmacêuticas

que compreendem a romidepsina preparada na forma descrita aqui,. Em determinadas modalidades, as composições exibem atividade citostática ou citotóxica contra células neoplásicas tais como as das malignidades hemato- lógicas. A dosagem de exemplo da romidepsina está descrita acima. Em 10 determinadas modalidades, a composição farmacêutica irá incluir a quanti- dade de romidepsina para uma dose do fármaco. Outras composições far- macêuticas da invenção podem incluir doses múltiplas de romidepsina, tais como o número total de doses necessárias para completar um ciclo de tra- tamento ou um regime total de tratamento. Em determinadas modalidades, a 15 quantidade de romidepsina administrada é suficiente para alcançar níveis citotóxicos (por exemplo, em níveis nanomolares) na corrente sanguínea do sujeito. Em determinadas modalidades, a quantidade administrada é sufici- ente para chegar a concentrações citotóxicas (por exemplo, em níveisnano molares) se romidepsina no local do câncer do sujeito.

As preparações farmacêuticas da invenção também podem in-

cluir outros agentes farmacêuticos de tal forma que a romidepsina e o outro agente possam ser administrados em conjunto. Essas preparações incluem quantidades de cada um dos agentes apropriadas para a administração de ambos. Em determinadas modalidades, a romidepsina é administrada em 25 combinação com um ou mais agentes terapêuticos adicionais, por exemplo, outro agente citotóxico. Os agentes citotóxicos de exemplo que podem ser administrados em combinação com a romidepsina incluem a gencitabina, decitabina, e flavopiridol. Em outras modalidades, a romidepsina é adminis- trada em combinação com um agente anti-inflamatório, tal como a aspirina, 30 ibuprofeno, acetaminofeno, etc., medicação para alívio da dor, anti náusea, ou antipirética. Em outras modalidades determinadas, a romidepsina é ad- ministrada em combinação com um agente esteróide (por exemplo, a dexa- metasona). Em determinadas modalidades, a romidepsina é administrada em combinação com um agente para o tratamento de distúrbios gastrointes- tinais tais como a náusea, vômito e diarréia. Esses agentes adicionais po- dem incluir antieméticos, antidiarreicos, recomposição de fluido, recomposi- 5 ção de eletrólito, etc. Em outras modalidades, a romidepsina é administrada em combinação com uma recomposição ou suplementação de eletrólitos, tais como o potássio, magnésio e cálcio, especificamente potássio e magné- sio. Em determinadas modalidades, a romidepsina é administrada em com- binação com um agente antiarrítmico. Em determinadas modalidades, a ro- 10 midepsina é administrada em combinação com um concentrado de plaque- tas, por exemplo, um agente que aumente a produção de plaquetas. Em de- terminadas modalidades, a romidepsina é administrada em combinação com um agente para aumentar a produção de células do sangue tal como a eri- tropoietina. Em determinadas modalidades, a romidepsina é administrada 15 em combinação com um agente para prevenir a hiperglicemia. Em determi- nadas modalidades, a romidepsina, que possui uma atividade de inibição de HADC, não é administrada com outro inibidor de HDAC.

Também será observado que a romidepsina pode existir na for- ma livre para o tratamento, ou quando apropriado, como uma forma farma- 20 ceuticamente aceitável da mesma. De acordo com a presente invenção, uma forma farmaceuticamente aceitável inclui porém não está limitada a sais far- maceuticamente aceitáveis, ésteres, sais de tais ésteres, ou qualquer outro aduto ou derivado que, quando da administração a um paciente que esteja necessitando seja capaz de prover, diretamente ou indiretamente a romidep- 25 sina, ou um metabólito ou resíduo da mesma, por exemplo, um pró-fármaco.

Na forma usada aqui, o termo "sal farmaceuticamente aceitável" se refere à aqueles sais que estão, dento do âmbito de um julgamento médi- co acertado, adequados para ser usados em contato com os tecidos de se- res humanos e de animais inferiores sem toxidez indevida, irritação, resposta 30 alérgica e similares, e são comensurados com uma proporção ris- co/benefício razoável. Os sais farmaceuticamente aceitáveis são bem- conhecidos na técnica. Por exemplo, S. M. Berge, et ai descreve os sais farmaceuticamente aceitáveis em detalhe no J. Pharmaceutical Sciences, 66: 1 a 19, 1977; incorporado aqui, por referência. Os sais podem ser prepa- rados in situ durante o isolamento final e a purificação da romidepsina, ou de modo separado através da reação da funcionalidade de base livre com um 5 ácido orgânico ou inorgânico adequado. Os exemplos de sais de adição áci- dos não-tóxicos, farmaceuticamente aceitáveis, são os sais de um grupo amino formado com ácidos inorgânicos tais como o ácido clorídrico, ácido bromídrico, ácido fosfórico, ácido sulfúrico e ácido perclórico, ou com ácidos orgânicos tais como o ácido acético, ácido oxálico, ácido maleico, ácido tar- 10 tárico, ácido cítrico, ácido succínico, ou ácido malônico ou através da utiliza- ção de outros métodos usados na técnica tais como a troca de íons. Os ou- tros sais farmaceuticamente aceitáveis incluem sais de adipato, alginato, ascorbato, aspartato, benzenossulfonato, benzoato, bissulfato, borato, buti- rato, canforato, canforsulfonato, citrato, ciclopentanopropionato, digluconato, 15 dodecilsulfato, etanossulfonato, formiato, fumarato, glucoheptonato, glicero- fosfato, gluconato, hernissulfato, heptanoato, hexanoato, hidroiodeto, 2- hidróxi-etanossulfonato, lactobionato, lactato, laurato, sulfato de laurila, ma- lato, maleato, malonato, metanossulfonato, 2-naftalenossulfonato, nicotinato, nitrato, oleato, oxalato, palmitato, pamoato, pectinato, persulfato, 3- 20 fenilpropionato, fosfato, picrato, pivalato, propionato, estearato, succinato, sulfato, tartarato, tiocianato, p-toluenossulfonato, undecanoato, valerato, e similares. Os sais representativos de metal alcalino ou alcalino-terroso inclu- em os sais de sódio, lítio, potássio, cálcio, magnésio, e similares. Outros sais farmaceuticamente aceitáveis incluem, quando apropriado, cátions de amô- 25 nio não-tóxico, amônio quaternário e de aminas formados com a utilização de contra íons tais como halogeneto, hidróxido, carboxilato, sulfato, fosfato, nitrato, sulfonato de alquila inferior e sulfonato de arila.

Além disso, na forma usada aqui, o termo "éster farmaceutica- mente aceitável" se refere a ésteres que de preferência se hidrolisam in vivo e incluem aqueles que se quebram com facilidade no corpo humano para deixar o composto de origem (por exemplo, a romidepsina) ou um sal do mesmo. Os grupos de ésteres adequados incluem, por exemplo, aqueles derivados a partir de ácidos carboxílicos alifáticos farmaceuticamente aceitá- veis, especificamente os ácidos alcanoicos, alquenoicos, cicloalcanoicos e alcanodióicos, nos quais cada porção de alquila ou de alquenila não tenha vantajosamente não mais do que 6 átomos de carbono.

5 Os exemplos de ésteres específicos incluem os formiatos, acetatos, propio- natos, butiratos, acrilatos e etilsucinatos. Em determinadas modalidades, os ésteres são clivados por enzimas tais como as esterases.

Além dessa, o termo "profármacos farmaceuticamente aceitá- veis", na forma usada aqui, se refere aqueles profármacos da romidepsina que são, dentro do âmbito do julgamento médico fundamentado, adequados para serem usados em contato com os tecidos de seres humanos e animais inferiores, sem toxidez indevida, irritação, resposta alérgica e similares, e são comensurados com uma proporção risco/benefício razoáveis e eficazes com relação ao uso pretendido para os mesmos, bem como as formas zwit- teriônicas, quando possível, da romidepsina ou de derivados da mesma. O termo "profármaco" se refere a compostos que são transformados de forma rápida in vivo para dar o composto de origem, por exemplo, através de hidró- Iise no sangue. Uma discussão completa está provida em T. Higuchi and V. Stella, Pro-drugs as Novel Delivery Systems, Vol. 14 of the A.C.S. Symposi- um Series, e em Edward B. Roche, ed., Bioreversible Carriers in Drug De- sign, American Pharmaceutical Association and Pergamon Press, 1987, am- bos os quais ficam incorporados aqui, por referência.

Como descrito acima, as composições farmacêuticas da presen- te invenção compreendem, além disso, um veículo farmaceuticamente acei- 25 tável, o qual, na forma usada aqui, inclui qualquer e todos os solventes, dilu- entes e outros veículos líquidos, auxiliares de dispersão ou de suspensão, agentes ativos de superfície, agentes isotônicos, agentes de espessamento ou de emulsificação, conservantes, aglutinantes sólidos, lubrificantes, e simi- lares, na medida em que adequados para a forma de dosagem específica 30 desejada. O Remington1S Pharmaceutical Sciences, Fifteenth Edition, E. W. Martin (Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1975) descreve os diversos veícu- los usados na formulação de composições farmacêuticas e as técnicas co- nhecidas para a preparação dos mesmos. Exceto se qualquer meio de veí- culo convencional for incompatível com a romidepsina, tal como através da produção de qualquer efeito biológico indesejável ou de outra forma interaja de uma maneira deletéria com qualquer um de outro(s) componente(s) da 5 composição farmacêutica, o uso dos mesmos é contemplado como estando dentro do âmbito desta invenção. Alguns exemplos de materiais que podem servir como veículos farmaceuticamente aceitáveis incluem, porém não es- tão limitados a açúcares tais como a lactose, glicose e sacarose; amidos tais como o amido de milho e amido de batata; celulose e derivados tais como 10 carboximetila celulose de sódio, etila celulose e acetato de celulose; goma tragacanto em pó; malte; gelatina; talco; Cremophor; Solutol; excipientes tais como manteiga de cacau e ceras para supositórios; óleos tais como o óleo de amendoim; óleo de sementes de algodão, óleo de açafrão; óleo de gerge- lim; óleo de oliva; óleo de milho e óleo de soja; glicóis, tais como o prolileno 15 glicol; ésteres tais como o oleato de etila e o Iaurato de etila; agar; agentes de tamponamento tais como o hidróxido de magnésio e o hidróxido de alu- mínio; ácido algínico; água isenta de pirogênio; solução salina isotônica; so- lução de Ringer; álcool de etila, e soluções de tampão de fosfato, bem como outros lubrificantes compatíveis não-tóxicos tais como o Iaurila sulfato de 20 sódio, e estearato de magnésio; bem como agentes de coloração, agentes de liberação, agentes de revestimento, agentes edulcorantes aromatizantes e de perfume, conservantes e antioxidantes também podem estar presentes na composição, de acordo com o julgamento do formulador.

Esses e outros aspectos da presente invenção serão também apreciados quando da consideração dos Exemplos que se seguem, que es- tão destinados a ilustrar determinadas modalidades específicas da invenção porém não pretendem limitar o âmbito da mesma, como definido através das reivindicações.

Exemplos

Exemplo 1 - Purificação da Romidepsina

Purificação da romidepsina por resina de adsorção.

O caldo de cultura de Chromobacterium violaceum contendo cerca de 400 g of Romidepsina (cerca de 600 I; ajustado para o pH 2,5 com H2SO4) é extraído, e o caldo da extração é aplicado a uma coluna empacotada com Sepabeads SP850, uma resina de adsorção não-iônica. A Romidepsina (não mais do que 6 g de Romidepsina/resina L) é ligada à resina com uma veloci- 5 dade de fluxo de não mais do que sv = 6. Depois da lavagem com água de bica (cerca de 3 vezes o volume de resina) e acetona aquosa à 25% (cerca de 5 vezes o volume de resina), a eluição é executada com cerca de 65% acetona aquosa a 65% e uma velocidade de fluxo de não mais do que sv =

4.

Purificação da romidepsina por cromatografia de HP20SS

O material da eluição é diluído com água para produzir uma so- lução aquosa (cerca de 75% de conteúdo de água). Esta solução é aplicada a uma coluna Diaion HP20SS. Essa resina de adsorção não-iônica adsorve a Romidepsina (cerca de 10 g de Romidepsina/Resina L) em uma velocida- 15 de de fluxo de não mais do que sv = 5. Depois da lavagem com acetona a- quosa a 25% (cerca de 0,5 vez o o volume de resina) e acetona aquosa a 40% (cerca de 4 vezes volume de resina a), eluição é executada com aceto- na aquosa a 47%. O resíduo da eluição é analisado por HPLC de fase rever- sa (RP-HPLC). As frações ativas são combinadas em um tanque de reten- 20 ção intermediário.

Substituição do solvente aquoso com solvente não-aquoso com a resina de adsorção.

O resíduo da eluição obtido a partir da coluna HP20SS é diluído com água para a produção de uma solução aquosa (cerca de 80% de teor 25 de água). Esta solução é aplicada a uma coluna Diaion HP20. Depois da lavagem com acetona aquosa a 20%, a eluição é executada com acetona. O resíduo da eluição é concentrado in vacuo. Depois da adição do acetato de etila do concentrado, o concentrado é ainda mais concentrado in vacuo. Esta etapa é executada repetidamente.

Purificação da Romidepsina com alumina

O concentrado resultante é dissolvido em acetato de etila (cerca de 6 mg/ml) e aplicado a uma coluna de resina de alumina (cerca de 75 g de Romidepsina/Resina L). A coluna é revelada com acetato de etila (cerca de 2 vezes o volume da alumina) e uma mistura de acetona e acetato de etila (0,5 - 2,0 v/v, cerca de 8 vezes o volume da alumina). Depois da adição da acetona ao concentrado, a solução resultante é ainda mais concentrada.

Cristalização 1 (metanol)

O concentrado obtido a partir da etapa anterior é diluído com metanol e concentrado in vacuo para a produção de cristais de Romidepsina bruta. Os cristais precipitados são recolhidos através de filtragem. Cristalização 2 (acetona/água)

Os cristais de Romidepsina bruta são dissolvidos em acetona

aquosa a 85% (cerca de 13 l/kg de cristais de Romidepsina bruta), e precipi- tados através da adição lenta de água purificada (cerca de 65 l/kg de cristais de romidepsina bruta) com agitação. Os cristais precipitados são recolhidos através de filtragem e lavados com acetona aquosa a 15% (cerca de 5 l/kg de romidepsina bruta), os cristais molhados são secos sob vácuo á < - 70°C.

Equivalentes e Âmbito

Anteriormente exposto foi uma descrição de determinadas mo- dalidades não-limitativas da invenção. Aquelas pessoas versadas na técnica irão reconhecer, ou serão capazes de determinar usando não mais do que a 20 experimentação de rotina, muitos equivalentes com relação às modalidades específicas da invenção descrita aqui. Aquelas pessoas versadas na técnica irão apreciar que várias mudanças e modificações a esta descrição podem ser feitas sem que se afastem do espírito e do âmbito da presente invenção, na forma em que é definida nas reivindicações em anexo.

Nas reivindicações, os artigos tais como "um", "uma" e

"o(s)/a(s)" significam um ou mais do que um, a não ser que indicado ao con- trário ou evidente de outra forma a partir do contexto. As reivindicações ou as descrições que incluam "ou" entre um ou mais membros de um grupo são consideradas satisfeitas se um, mais do que um, ou todos os membros do 30 grupo estejam presentes no, empregados no ou relevantes de outro modo com relação a um determinado produto ou processo, a não ser que indicado ao contrário ou evidente de outra forma a partir do contexto. A invenção in- clui modalidades nas quais exatamente um membro do grupo está presente no, empregado no, ou relevante de outro modo com relação a um determi- nado produto ou processo. A invenção inclui modalidades nas quais mais do que um ou todos os membros do grupo estão presentes no, empregados no, 5 ou relevantes de outro modo com relação a um determinado produto ou pro- cesso. Além disso, deve ser entendido que a invenção engloba todas as va- riações, combinações e permutações nas quais uma ou mais limitações, e- lementos, cláusulas, termos descritivos, etc., a partir de uma ou mais das reivindicações ou a partir de porções relevantes da descrição são introduzi- 10 dos(as) em outra reivindicação. Por exemplo, qualquer reivindicação que seja dependente de outra reivindicação pode ser modificada para a inclusão de uma ou mais limitações encontradas em qualquer outra reivindicação que seja dependente da mesma reivindicação base. Além disso, quando as rei- vindicações descrevem uma composição, deve ser entendido que os méto- 15 dos para a utilização da composição para qualquer uma das finalidades des- critas aqui, e métodos para a fabricação da composição de acordo com qualquer um dos métodos para a fabricação descritos aqui, ou outros méto- dos conhecidos na técnica sejam incluídos, a não ser que indicado, ou a não ser que se torne evidente a uma pessoa versada na técnica que uma con- 20 tradição ou uma inconsistência poderia ser levantada. Além disso, a inven- ção engloba composições feitas de acordo com qualquer um dos métodos para a preparação de composições descritas aqui.

Quando elementos estão presentes como listas, por exemplo, no formiato do grupo Markush, deve ser entendido que cada subgrupo dos ele- 25 mentos também está descrito, e que qualquer elemento(s) pode(m) ser re- movido(s) a partir do grupo. Também é notado que o termo "compreenden- do" está destinado a ser aberto e permite a inclusão de elementos ou etapas adicionais. Deve ser entendido que, em geral, quando a invenção ou aspec- tos da invenção é/são referidos como compreendendo elementos, caracte- 30 rísticas, etapas, etc., específicos, determinadas modalidades da invenção ou aspectos da invenção consistem, ou consistem essencialmente em tais ele- mentos, características, etapas, etc. Para finalidades de simplicidade, aque- Ias modalidades não foram especificamente mostradas in haec verba aqui,. Desse modo, para cada uma das modalidades da invenção que compreen- dem um ou mais elementos, características, etapas, etc., a invenção tam- bém proporciona modalidades que consistem ou consistem essencialmente 5 naqueles elementos, características, etapas, etc.

Quando são dadas faixas, os pontos finais estão incluídos. Além do mais, deve ser entendido que, a não ser que indicado de outro modo ou evidente de outra forma a partir do contexto e/ou do entendimento de uma pessoa versada na técnica, os valores que estão expressos como faixas po- 10 dem assumir qualquer valor específico dentro das faixas estabelecidas nas diferentes modalidades da invenção, até o décimo da unidade do limite mais baixo da faixa, a não ser que o contexto indique claramente de outra forma. Também deve ser entendido que, a não ser que indicado de outro modo ou evidente de outra forma a partir do contexto e/ou do entendimento de uma 15 pessoa versada na técnica, os valores que estão expressos como faixas po- dem assumir qualquer uma faixa dentro da faixa determinada, na qual os pontos finais da subfaixa são expressos no mesmo grau de exatidão como o décimo da unidade do limite mais baixo da faixa.

Além disso, deve ser entendido que qualquer modalidade específica 20 da presente invenção pode ser explicitamente excluída a partir de qualquer uma de uma ou mais das reivindicações. Qualquer modalidade, elemento, característica, aplicação ou aspecto das composições e/ou dos métodos da invenção pode ser excluído de qualquer de uma ou mais reivindicações. Com a finalidade de sumarizar, as modalidades nas quais um ou mais dos 25 elementos, características, finalidades ou aspectos forem excluídos não es- tão descritas explicitamente aqui.

Claims

1. Composição farmacêutica compreendendo: romidepsina, em que pelo menos 98% da romidepsina é mono- mérica; e um excipiente farmaceuticamente aceitável.

2. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 1, em que pelo menos 99% da romidepsina é monomérica.

3. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 1, em que pelo menos 99,5% da romidepsina é monomérica.

4. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 1, em que pelo menos 99,95% of da romidepsina é monomérica.

5. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 1, em que a composição está substancialmente isenta de romidepsina dimeri- zada, oligomerizada, ou polimerizada.

6. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 1, em que a composição inclui menos do que ou igual a 1,0% do total de impu- rezas e menos do que ou igual a 0,2% de impurezas individuais.

7. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 1, em que a composição inclui uma quantidade de romidepsina eficaz para o tratamento de um neoplasma.

8. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 7, em que o neoplasma é o câncer.

9. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 7, em que o neoplasma é uma malignidade hematológica.

10. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 7, em que o neoplasma é uma leucemia ou linfoma.

11. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 7, em que o neoplasma é o linfoma de Hodgkin.

12. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 7, em que o neoplasma não é o linfoma de Hodgkin.

13. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 7, em que o neoplasma é o mieloma múltiplo.

14. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 7, em que o neoplasma é um linfoma da célula T cutânea.

15. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 7, em que o neoplasma um linfoma da célula T periférica.

16. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 7, em que o neoplasma is leucemia linfócita crônica. (CLL).

17. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 7, em que o neoplasma é a leucemia mielóide crônica (CML).

18. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 7, em que o neoplasma leucemia mielóide aguda (AML).

19. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 7, em que o neoplasma é uma síndrome mielodisplásica.

20. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 7, em que o neoplasma é o câncer pancreático.

21. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 7, em que o neoplasma é o câncer da próstata.

22. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 1, em que a composição inclui 1 a 56 mg de romidepsina.

23. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 1, formulada para a administração oral.

24. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 1, formulada para a administração parenteral.

25. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 1, formulada para a administração intravenosa.

26. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 1, compreendendo também outro agente citotóxico.

27. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 26, em que o agente citotóxico é a is gemcitabina ou a decitabina.

28. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 26, em que o agente citotóxico é flavopiridol.

29. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 1, compreendendo também um agente antiinflamatório.

30. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 1, compreendendo também um aliviador de dor.

31. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 1, compreendendo também um agente anti náusea.

32. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 1, compreendendo também um agente antipirético.

33. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 1, compreendendo também uma suplementação de eletrólito.

34. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 1, compreendendo também a suplementação de potássio.

35. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 1, compreendendo também a suplementação de magnésio.

36. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 1, compreendendo também um agente anti arrítmico.

37. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 1, compreendendo também um concentrado de plaquetas.

38. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 1, compreendendo também a eritropoietina.

39. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 1, compreendendo também um agente anti-hiperglicêmico.

40. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 1, compreendendo também um agente esteróide.

41. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 40, em que o agente esteróide é a dexametazona.

42. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 1, em que a composição não inclui outro inibidor de HDAC alem da romidepsi-na.

43. Método para a preparação de uma composição farmacêutica de romidepsina que compreende a combinação de uma composição de ro-midepsina pelo menos 98% pura com um excipiente farmaceuticamente a-ceitável.

44. Kit compreendendo pelo menos uma composição farmacêutica como definida em qualquer uma das reivindicações de 1 a 42 e instru- ções para a administração de uma composição.