BRPI0721097A2 - Formulação parenteral de anticorpo abeta - Google Patents

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Robert Mueller
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Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "FORMULAÇÃO PARENTERAL DE ANTICORPO ABETA"
A presente invenção refere-se a uma formulação parenteral farmacêutica estável de um anticorpo, molécula de anticorpo, uma mistura de anticorpos e/ou uma mistura de moléculas de anticorpo contra o peptídeo beta amilóide (Abeta) e um processo para a preparação dos mesmos. Além dos mesmos, usos correspondentes são descritos.
Em um primeiro aspecto, a presente invenção refere-se a uma formulação farmacêutica de anticorpo Abeta parenteral estável compreendendo:
- cerca de 1 a cerca de 250 mg/mL de anticorpo Abeta;
- cerca de 0,001 a cerca de 1% de pelo menos um tensoativo;
- cerca de 1 a cerca de 100 mM de um tampão;
- opcionalmente cerca de 10 a cerca de 500 mM de um estabilizador e/ou cerca de 5 a cerca de 500 mM de um agente de tonicidade;
- em um pH de cerca de 4,0 a cerca de 7,0.
Em particular, a presente invenção refere-se a uma formulação de anticorpo Abeta em que os anticorpos Abeta compreendidos (ou misturas dos mesmos) são capazes de especificamente ligar o peptídeo beta amilói20 de. Anticorpos que especificamente ligam Abeta são conhecidos na técnica. Exemplos específicos de anticorpo Abeta que podem ser usados na formulação de acordo com a invenção foram descritos no pedido de patente PCT publicado WO 03/070760 e especialmente nas reivindicações, o conteúdo do qual está aqui incorporado por referência.
O peptídeo beta amilóde, que é da mesma forma chamado "ami
lóde β", "Αβ", "Αβ4" ou "β-Α4" e, em particular no contexto desta invenção "Abeta", é um componente principal das placas neuríticas extracelulares que estão associadas a doenças amiloidogênicas tal como doença de Alzheimer; veja Selkoe (1994), Ann. Rev. Cell Biol. 10, 373-403, Koo (1999), PNAS Vol. 30 96, pp. 9989-9990, US 4.666.829 ou Glenner (1984), BBRC 12, 1131. Este β-amilóide é derivado de "proteína precursora de Alzheimer/proteína precursora β-amilóide" (APP). APPs são glicoproteínas de membrana integral (veja Sisodia (1992), PNAS Vol. 89, pp. 6075) e são endoproteoliticamente clivadas dentro da seqüência de Abeta por uma protease de membrana plasmática, α-secretase (veja Sisodia (1992), loc. cit.). Além disso, outra atividade secretase, em particular atividade β-secretase e γ-secretase leva à liberação 5 extracelular de β-amilóide (Αβ) compreendendo 39 aminoácidos (Αβ39), 40 aminoácidos (Αβ40), 42 aminoácidos (Αβ42) ou 43 aminoácidos (Αβ43); veja Sinha (1999), PNAS 96, 11094-1053; Price (1998), Science 282, 1078 a 1083; WO 00/72880 ou Hardy (1997), TINS 20, 154.
Αβ tem várias formas de ocorrência natural, por meio do qual as 10 formas humanas são referidas como os Αβ39, Αβ40, Αβ41, Αβ42 e Αβ43 supracitados. A forma mais proeminente, Αβ42, tem a seqüência de aminoácido (começando de N-terminal): DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGWIA (SEQ ID NO: 3). Em Αβ41, Αβ40, Αβ39, os aminoácidos C-termínais I, IA e VIA são ausentes, respectivamente. Na for15 ma Αβ43, um resíduo de treonina adicional é compreendido no C-terminal da seqüência descrita acima (SEQ ID NO: 3).
Moléculas de anticorpo, como parte do grupo de farmacêuticos de proteína, são muito suscetíveis à degradação física e química, tal como desnaturação e agregação, desamidação, oxidação e hidrólise. Estabilidade 20 proteína é influenciada pelas características da própria proteína, por exemplo, a seqüência de aminoácido, e por influências externas, tais como temperatura, pH de solvente, excipientes, interfaces, ou taxas de cisalhamento. Desse modo, é importante definir as condições de formulação ideais para proteger a proteína contra reações de degradação durante a fabricação, ar25 mazenamento e administração. (Manning, M. C., K. Patel, e outros (1989). "Stability of protein pharmaceuticals". Pharm Res 6(11): 903-18., Zheng, J. Y. e L. J. Janis (2005). "Influence of pH, buffer species, and storage temperature on physicochemical stability of a humanized monoclonal antibody LA298." Int J Pharm.)
Administração de anticorpos por rotina subcutânea ou intramus
cular requer a concentração de proteína alta na formulação final devido às doses altas frequentemente requeridas e aos volumes de administração Iimitados. (Shire, S. J., Z. Shahrokh, e outros (2004). "Challenges in the deveIopment of high protein concentration formulations." J Pharm Sci 93(6): 1390- 402., Roskos, L. K., C. G. Davis, e outros (2004). "The clinicai pharmacology of therapeutic monoclonal antibodies." Drug Development Research 61(3): 5 108-120.) A fabricação em larga escala de concentração pode ser obtida através de processo de ultrafiltração, processo de secagem, tal como processo de liofilização ou secagem por pulverização e processo de precipitação. (Shire, S. J., Z. Shahrokh, e outros (2004). "Challenges in the development of high protein concentration formulations." J Pharm Sci 93(6): 1390- 10 402.)
Andya e outros (Patente US 6.267.958, Patente US 6.85.940) descreve uma formulação Iiofilizada estável de um anticorpo que é reconstituído com um volume diluente adequado para alcançar a concentração exigida. A formulação compreende um lioprotetor, um tampão e um tensoativo. Liu e outros (Liu, J., M. D. Nguyen, e outros (2005). "Reversible
self-association increases the viscosity of a concentrated monoclonal antibody in aqueous solution." J Pharm Sci 94(9): 1928-40.) examinou o comportamento de viscosidade formulações de anticorpo de concentração alta. Três anticorpos monoclonais, construídos a partir da estrutura de IgGI idêntica, 20 foram examinados quanto a sua autoassociação em concentração de proteína alta. Os três anticorpos não demonstraram nenhum perfil de viscosidade consistente e mostraram diferenças significantes no seu comportamento de autoassociação.
Um objetivo da presente invenção é fornecer uma formulação de 25 um anticorpo Abeta ou de misturas de tais anticorpos, que é/são concentrados à concentração requerida por reconstituição de uma formulação Iiofilizada com um volume adequado ou removendo-se o solvente por um processo de ultrafiltração. A formulação demonstra a estabilidade suficiente durante a fabricação, armazenamento e administração. Como demonstrado por Liu e 30 outro, os anticorpos demonstram um perfil imprevisível de viscosidadeconcentração. (Liu, J., M. D. Nguyen, e outros (2005). "Reversible selfassociation increases the viscosity of a concentrated monoclonal antibody in aqueous solution." J Pharm Sci 94(9): 1928-40.) Em comparação às patentes US 6.267.958 e US 6.685.940, a formulação apresentada fornece a estabilidade igual ou melhor de um anticorpo humano Abeta durante o armazenamento e tem uma viscosidade, que é adequado para a rotina de admi5 nistração subcutânea ou intramuscular.
Exemplos de anticorpos Abeta que são úteis na presente invenção são moléculas de imunoglobulina, por exemplo, moléculas de IgG. IgGs são caracterizados compreendendo duas cadeias pesadas e duas leves (iIustradas por exemplo na Figura 1) e estas moléculas compreendem dois 10 sítios de ligação de antígeno. Os referidos sítios de ligação de antígeno compreendem "regiões variáveis" que consistem em partes das cadeias pesadas (VH) e partes das cadeias leves (VL). Os sítios de ligação de antígeno são formados pela justaposição dos domínios de VH e VL. Para informação geral sobre moléculas de anticorpo ou moléculas de imunoglobulina obser15 vam da mesma forma livros didáticos comuns, como Abbas "Celular and Molecular Immunology", W.B. Sounders Company (2003).
Em uma modalidade, a formulação parenteral da presente invenção compreende anticorpo Abeta (ou mistura de tais anticorpos) em que pelo menos uma das regiões variáveis na cadeia pesada dos referidos anti20 corpos compreende uma N-glicosilação. A asparagina glicosilada (Asn) na região variável de cadeia pesada (VH) pode estar na região de determinação de complementaridade 2 (região CDR2), a referida asparagina glicosilada (Asn) pode estar na posição 52 na região variável de cadeia pesada (VH) como mostrado na SEQ ID NO: 1.
O termo "anticorpo monoglicosilado" refere-se a uma molécula
de anticorpo que compreende uma N-glicosilação em uma região (Vh) de uma molécula de anticorpo individual"; veja da mesma forma figura 1. O termo "anticorpo de dupla-glicosilação" define uma molécula de anticorpo que é N-glicosilada em ambas as regiões variáveis da cadeia pesada" (figura 1). 30 Moléculas de anticorpo que necessitam de um N-glicosilação em ambos domínios de (Vh) de cadeia pesada são nomeados "anticorpos nãoglicosilados (figura 1). O anticorpo monoglicosilado, o anticorpo duploglicosilado e o anticorpo não-glicosilado pode compreender as seqüências de aminoácido idênticas ou seqüências de aminoácido diferentes.
O anticorpo monoglicosilado e o anticorpo duplo-glicosilado são aqui chamados como "isoformas de anticorpo glicosiladas". Uma molécula 5 de anticorpo purificada caracterizada pelo fato de que pelo menos um sítio de ligação de antígeno compreende uma glicosilação na região variável de cadeia pesada (VH) é um anticorpo monoglicosilado que é livre de ou em uma extensão muito baixa associada a uma isoforma selecionada a partir de um anticorpo duplo-glicosilado e um anticorpo não-glicosilado, isto é, um 10 "anticorpo monoglicosilado purificado". Um anticorpo duplo-glicosilado em contexto desta invenção é livre de ou em uma extensão muito baixa associada a uma isoforma selecionada a partir de um anticorpo monoglicosilado e um anticorpo não-glicosilado, isto é, um "anticorpo duplo-glicosilado purificado".
As formulações de acordo com esta invenção podem conter an
ticorpos monoglicosilados ou duplo-glicosilados ou anticorpos nãoglicosilados, ou misturas especificamente definidas dos mesmos. As misturas de anticorpo ou pools de anticorpo fornecidas aqui podem compreender 50% de anticorpos monoglicosilados e 50% duplo-glicosilado como definido 20 aqui. Entratnto, da mesma forma considerados são as relações de 30/70 a 70/30. Até aqui, a pessoa versada na técnica está atento que da mesma forma outras relações são consideradas nas misturas de anticorpo desta invenção. Por exemplo, da mesma forma 10/90 ou 90/10, 20/80 ou 80/20 bem como 40/60 ou 60/40 podem ser empregadas no contexto desta inven25 ção. Uma relação útil particular nas misturas de anticorpo compreendida na formulação da invenção que compreende anticorpo duplo-glicosilado e anticorpo monoglicosilado como definido aqui acima é uma relação de 40/60 a 45/55.
O termo "que é livre de ou a uma extensão muito baixa" denota a ausência completa das respectivas outras (glicosilação) isoformas ou uma presença de outra (glicosilada) isoforma em uma concentração de no máximo 10%, por exemplo, no máximo 5%, por exemplo, no máximo 4%, por exemplo no máximo 3%, por exemplo, no máximo 2%, por exemplo no máximo 1%, por exemplo no máximo 0,5%, por exemplo no máximo 0,3%, por exemplo, no máximo 0,2%.
O termo "anticorpo(s)" é aqui usado sinonimamente com o termo "molécula(s) de anticorpo" e compreende, no contexto da presente invenção, molécula(s) de anticorpo como moléculas de imunoglobulina completas, por exemplo, IgMs, IgDs, IgEs, IgAs or IgGs, como IgGI, lgG2, lgG2b, lgG3 ou lgG4 bem como em partes de tais moléculas de imunoglobulina, como fragmentos Fab, fragmentos Fab’, fragmentos F(ab)2, fragmentos F(ab)2 quiméricos ou Fab’ quiméricos, fragmentos Fab quiméricos ou regiões VH ou CDR isoladas (as referidas regiões VH ou CDR isoladas sendo, por exemplo, integradas ou criadas na(s) "estrutura(s)" correspondente(s)). Adequadamente, o termo "anticorpo" da mesma forma compreende isoformas conhecidas e modificações de imunoglobulinas, como anticorpos de cadeia única ou fragmentos Fv de cadeia única (scAB/scFv) ou construções de anticorpo biespecíficas, as referidas isoformas e modificações sendo caracterizadas como compreendendo pelo menos uma região VH glicosilada como definido aqui. Um exemplo específico de uma tal isoforma ou modificação pode ser um anticorpo sc (cadeia única) no formato VH-VL ou VL-VH, em que o referido VH compreende a glicosilação aqui descrita. Da mesma forma, scFvs biespecíficos são considerados, por exemplo no formato VH-VL-VH-VL, VLVH-VH-VL, VH-VL-VL-VH. Da mesma forma compreendido no termo "anticorpo" é diacorpos e moléculas que compreendem um domínio Fc de anticorpo como um veículo ligado a pelo menos um peptídeo/porção de ligação de antígeno, por exemplo, pepticorpos como descrito em WO 00/24782. É evidente a partir dos anteriores que a presente invenção da mesma forma refere-se às formulações parenterais de anticorpos Abeta que compreendem "misturas" de moléculas de anticorpos/anticorpo. Uma "mistura" particular dos referidos anticorpos é descrita acima, isto é uma mistura de anticorpos "mono" e "duplo"-glicosilados direcionados contra Abeta.
"Fragmentos de anticorpo" da mesma forma compreendem tais fragmentos que por si não podem fornecer função efetora (ADCC/CDC) porém fornece esta função de uma maneira de acordo com a invenção depois de ser combinada com domínio(s) de constante de anticorpo apropriado(s).
O(s) anticorpo(s) Abeta que pode(m) ser compreendido(s) na(s) formulação(ões) são, inter alia, anticorpo(s) Abeta recombinantemente pro5 duzido(s). Estes podem ser produzidos em um sistema de cultura de célula de mamífero, por exemplo em células CHO. Tais sistemas de cultura de célula de mamífero são particularmente úteis na preparação de anticorpos Abeta ou anticorpos Abeta/ moléculas de anticorpo que são glicosilados como o anticorpo Abeta exemplificado aqui específico que compreende uma N10 glicosilação na região variável. As moléculas de anticorpo podem ser também purificadas por uma seqüência de etapas cromatográficas e de filtração, por exemplo, a fim de purificar as isoformas de anticorpo glicosiladas específicas como descrito aqui abaixo.
Os termos "anticorpo monoclonal" ou "composição de anticorpo 15 monoclonal" como usado aqui refere-se a uma preparação de moléculas de anticorpo de uma única composição de aminoácido. Consequentemente, o termo "anticorpo monoclonal humano" refere-se a anticorpos que exibem uma única especificidade ligação que tem regiões constantes e variáveis derivadas das seqüências de imunoglobulina de linha germinativa humanas. 20 Em uma modalidade, os anticorpos monoclonais humanos são produzidos por um hibridoma que inclui uma célula B obtida a partir de um animal não humano transgênico, por exemplo, um camundongo transgênico, tendo um genoma compreendendo um transgene de cadeia pesada humano e um transgene de cadeia humana leve fundidos a uma célula imortalizada.
O termo "anticorpo quimérico" refere-se a um anticorpo mono
clonal que compreende uma região variável, isto é, região de ligação, a partir de uma fonte ou espécie e pelo menos uma porção de uma região constante derivada de uma espécie ou fonte diferente, normalmente preparada por técnicas de DNA recombinantes. Anticorpos quiméricos que compreendem 30 uma região variável de murino e uma região constante humana são especialmente preferidos. Tais anticorpos quiméricos de humano/murino são o produto de genes de imunoglobulina expressos que compreendem os segmentos de DNA que codificam as regiões variáveis de imunoglobulina de murino e segmentos de DNA que codificam as regiões constantes de imunoglobulina humana. Outras formas de "anticorpos quiméricos" abrangidas pela presente invenção são aquelas em que a classe ou subclasse foi modifi5 cada ou mudada a partir daquela do anticorpo original. Tais anticorpos "quiméricos" são da mesmam forma referidos como "anticorpos mudados por classe". Métodos para produzir anticorpos quiméricos envolvem técnicas de transfecção de gene e DNA recombinante convencionais agora bem conhecidas na técnica. Veja, por exemplo, Morrison, S.L., e outros, Proc. Natl. A10 cad Sei. USA 81 (1984) 6851-6855; Patente US N25 5.202.238 e 5.204.244.
O termo "anticorpo humanizado" refere-se a anticorpos em que a estrutura ou "regiões de determinação de complementaridade" (CDR) foram modificados para compreender a CDR de uma imunoglobulina de especificidade diferente quando comparada àquela da imunoglobulina de origem. Em 15 uma modalidade preferida, uma CDR de murino é enxertado na região de estrutura de um anticorpo humano para preparar o "anticorpo humanizado". Veja, por exemplo, Riechmann, L., e outros, Nature 332 (1988) 323-327; e Neuberger, M.S., e outros, Nature 314 (1985) 268-270. CDRs particularmente preferidas correspondem àquelas que representam seqüências que reco20 nhecem os antígenos notados acima para anticorpos bifuncionais e quiméricos.
O termo "anticorpo humano", como usado aqui, é pretendido incluir anticorpos que têm regiões constantes e variáveis derivadas de seqüências de imunoglobulina de linha germinativa humanas. A cadeia pesada 25 variável é preferivelmente derivada de seqüência de linha germinativa DP 50 (GenBank L06618) e a cadeia leve variável é preferivelmente derivada de seqüência de linha germinativa L6 (GenBank X01668). As regiões constantes do anticorpo são regiões constantes de tipo IgGI humano. Tais regiões podem ser alotípicas e são descritas por, por exemplo, Johnson, G., e Wu, 30 T.T., Nucleic Acids Res. 28 (2000) 214-218 e as bases de dados referenciadas nisto e são úteis contanto que as propriedades de indução de ADCC e preferivelmente CDC de acordo com a invenção sejam retidas. O termo "anticorpo humano recombinante", como usado aqui, é pretendido incluir todos os anticorpos humanos que são preparados, expressos, criados ou isolados por meios recombinantes, tais como anticorpos isolados a partir de uma célula hospedeira tal como uma célula SP2-0, NSO ou 5 CHO (como CHO K1) ou de um animal (por exemplo, um camundongo) que é transgênica para anticorpos ou genes de imunoglobulina humana expressos usando um vetor de expressão recombinante transfectado em uma célula hospedeira. Tais anticorpos humanos recombinantes têm regiões constantes e variáveis derivadas de seqüências de imunoglobulina de linha germina10 tiva humanas em uma forma rearranjada. Os anticorpos humanos recombinantes de acordo com a invenção foram submetidos a hipermutação somática in vivo. Desse modo, as seqüências de aminoácido das regiões VH e VL dos anticorpos recombinantes são seqüências que, enquanto derivadas de e relacionadas às seqüências de VH e VL de linha germinativa humanos, po15 dem não existir naturalmente dentro do repertório de linha germinativa de anticorpo humano in vivo.
Como aqui usado, "ligação" refere-se ao anticorpo que liga-se ao Abeta com uma afinidade cerca de 10'13 a 10'8 M (KD), preferivelmente de cerca de 10'13 a 10'9 M.
Os "domínios constantes" não estão diretamente envolvidos na
ligação do anticorpo a um antígeno porém estão envolvidos nas funções efetoras (ADCC, ligação de complemento, e CDC). O domínio constante de um anticorpo de acordo com a invenção é do tipo lgG1. Domínios constantes humanos têm estas características são descritos em detalhes por Kabat e 25 outro, Kabat e outro, Sequences of Proteins of ImmunoIogicaI Interest, 5a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991), and by Bruggemann, M., e outros, J. Exp. Med. 166 (1987) 1351-1361; Love, T.W., e outros, Methods Enzymol. 178 (1989) 515-527. Exemplos são mostrados em SEQ ID NOs: 5 a 8 em WO 2005/005635. Outros domínios cons30 tantes úteis e preferidos são os domínios constantes dos anticorpos obteníveis das linhagens celulares de hibridoma depositadas com depósitos como DSMZ ou ATCC. Os domínios constantes podem fornecer ligação de complemento. ADCC e opcionalmente CDC são fornecidos pela combinação de variável e domínios constantes.
A "região variável" (região variável de uma cadeia leve (VL), região variável de uma cadeia pesada (VH)) como usado aqui denota cada par de cadeias leve e pesada que está diretamente envolvido na ligação do anticorpo ao antígeno. Os domínios de cadeias pesada e leve humanas variáveis têm a mesma estrutura geral e cada domínio compreende quatro regiões de estrutura (FR) cujas seqüências são amplamente conservadas, conectadas por três "regiões hipervariáveis" (ou regiões de determinação de complementaridade, CDRs). As regiões de estrutura adotam uma conformação de folha β e as CDRs podem formar alças que conectam-se à estrutura de folha β. As CDRs em cada cadeia são sustentadas em um estrutura tridimensional pelas regiões de estrutura e formam-se juntas com as CDRs a partir da outra cadeia o sítio de ligação de antígeno. As regiões de CDR3 de cadeia leve e pesada de anticorpo desempenham um papel particularmente importante na afinidade/ especificidade ligação dos anticorpos de acordo com a invenção e, portanto, fornecem um outro objetivo da invenção.
Os termos "região hipervariável" ou porção de ligação de antígeno de um anticorpo" quando usados aqui referem-se aos resíduos de aminoácido de um anticorpo que são responsáveis para ligação de antígeno. A região hipervariável compreende resíduos de aminoácido a partir das "regiões de determinação de complementaridade" ou "CDRs". Regiões de "estrutura" ou "FR" são aqueles regiões de domínio variáveis diferentes de resíduos de região hipervariável como aqui definido. Portanto, as cadeias leve e pesada de um anticorpo compreendem de N- ao C-terminal, os domínios FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, e FR4. Especialmente, CDR3 da cadeia pesada é a região que contribui mais para a ligação de antígeno. Regiões CDR e FR são determinadas de acordo com a definição padrão de Kabat e outro, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)) e/ou aqueles resíduos de uma "alça hipervariável".
A formulação desta invenção pode, inter alia, compreender "estabilizadores", "lioprotetores", "açúcares", "aminoácidos", "polióis", "antioxidantes", "conservantes", "tensoativos", "tampões" e/ou "agentes de tonicidade".
O termo "estabilizador" denota um excipiente aceitável farmacêutico, que protege o ingrediente farmacêutico ativo e/ou a formulação de degradação química e/ou física durante a fabricação, armazenamento e aplicação. Séries de reações de degradação química e física de farmacêuticos de proteína são revisadas por Cleland, J. L., M. F. Powell, e outros (1993). "The development of stable protein formulations: a close Iook at protein aggregation, deamidation, and oxidation." Crit Rev Ther Drug Carrier Syst 10(4): 307-77, Wang, W. (1999). "Instability, stabilization, and formulation of Iiquid protein pharmaceuticals." Int J Pharm 185(2): 129-88., Wang, W. (2000). "Lyophilization and development of solid protein pharmaceuticals." Int J Pharm 203(1-2): 1-60 e Chi, E. Y., S. Krishnan, e outros (2003). "Physical stability of proteins in aqueous solution: mechanism and driving forces in nonnative protein aggregation." Pharm Res 20(9): 1325-36. Estabilizadores incluem porém não são limitados a açúcares, aminoácidos, polióis, tensoativos, antioxidantes, conservantes, cíclodextrinas, por exemplo, hidroxipropilβ-ciclodextrina, sulfobutiletil-p-ciclodextrina, β-Ciclodextrina, polietilenoglicóis, por exemplo, PEG 3000, 3350, 4000, 6000, albumina, por exemplo, albumina de soro humano (HSA), albumina de soro bovino (BSA), sais, por exemplo, cloreto de sódio, cloreto de magnésio, cloreto de cálcio, queladores, por exemplo EDTA como definido em seguida. Como mencionado acima, estabilizadores podem estar presentes na formulação em uma quantidade cerca de 10 a cerca de 500 mM, preferivelmente em uma quantidade cerca de 10 a cerca de 300 mM e mais preferivelmente em uma quantidade cerca de 100 mM a cerca de 300 mM.
O termo "lioprotetor" denota excipientes aceitáveis farmacêuticos, que protege o ingrediente ativo lábil (por exemplo, uma proteína) contra as condições de desestabilização durante o processo de liofilização, armazenagem subsequente e reconstituição. Lioprotetores compreendem porém não são limitados ao grupo que consiste em açúcares, polióis (tal como, por exemplo, álcoois de açúcar) e aminoácidos. Lioprotetores preferidos podem ser selecionados a partir do grupo que consiste em: açúcares tais como sacarose, trehalox, lactose, glicose, manose, maltose, galactose, frutose, sorbose, e ácido neuramínico de rafinose e galactosamina, açúcares de amino 5 tais como glicosamina, N-Metilglicosamina ("Meglumina"), polióis tal como manitol, e aminoácidos tal como arginina. Lioprotetores são geralmente usados em uma quantidade cerca de 10 a 500 mM, preferivelmente em uma quantidade cerca de 10 a cerca de 300 mM e mais preferivelmente em uma quantidade cerca de 100 a cerca de 300 mM.
O termo "açúcar" como usado aqui denota um carboidrato far
maceuticamente aceitável geralmente usado em uma quantidade cerca de 10 mM a cerca de 500 mM, preferivelmente em uma quantidade cerca de 10 a cerca de 300 mM e mais preferivelmente em uma quantidade cerca de 100 a cerca de 300 mM. Açúcares adequados compreendem porém não são Iimi15 tados a trehalox, sacarose, lactose, glicose, manose, maltose, galactose, frutose, sorbose, rafinose, glicosamina, N-Metilglicosamina (denominado "Meglumina"), galactosamine e ácido neuramínico. Açúcares preferidos são sacarose e trehalox e mais preferivelmente sacarose.
O termo "aminoácido" como usado aqui no contexto da formula20 ção parenteral farmacêutica denota uma molécula orgânica aceitável farmacêutica que possui uma porção de amino localizada na α-posição em um grupo carboxílico. Aminoácidos compreendem porém não limitados a arginina, glicina, ornitina, lisina, histidina, ácido glutâmico, ácido aspártico, isoleucina, leucina, alanina, fenilalanina, tirosina, triptofano, metionina, serina, pro25 Iina e combinações dos mesmos. Aminoácidos são geralmente usados em uma quantidade cerca de 10 a 500 mM, preferivelmente em uma quantidade cerca de 10 a cerca de 300 mM e mais preferivelmente em uma quantidade cerca de 100 a cerca de 300 mM.
O termo "polióis" como usado aqui denota álcoois farmaceuticamente aceitáveis com mais de um grupo hidróxi. Polióis podem ser usados em uma quantidade cerca de 10 mM a cerca de 500 mM, preferivelmente em uma quantidade cerca de 10 a cerca de 300 e mais preferivelmente em uma quantidade cerca de 100 a cerca de 300 mM. Polióis adequados compreendem porém não são limitados a manitol, sorbitol, glicerina, dextrana, glicerol, arabitol, propileno glicol, polietileno glicol, e combinações dos mesmos.
O termo "antioxidante" denota excipientes farmaceuticamente 5 aceitáveis que impedem a oxidação do ingrediente farmacêutico ativo. Antioxidantes podem ser usados em uma quantidade cerca de 1 a cerca de 100 mM, preferivelmente em uma quantidade cerca de 5 a cerca de 50 mM e mais preferivelmente em uma quantidade cerca de 5 a cerca de 20 mM. Antioxidantes compreendem porém não são limitados a ácido ascórbico, gluta10 tiona, cisteína, metionina, ácido cítrico, EDTA, e combinações dos mesmos.
O termo "conservante" denota excipientes farmaceuticamente aceitáveis que impedem o crescimento de microorganismo na formulação. Por exemplo, a adição de um conservante para uma formulação de múltiplas doses protege a formulação contra a contaminação microbiana. Conservan15 tes são geralmente usados em uma quantidade cerca de 0,001 a cerca de 2% (p/v). Conservantes compreendem porém não são limitados a etanol, álcool benzílico, fenol, m-cresol, p-clor-m-cresol, metil ou propil parabenos, cloreto de benzalcônio e combinações dos mesmos.
O termo "tensoativo" como usado aqui denota um tensoativo farmaceuticamente aceitável. Na formulação da invenção, a quantidade tensoativo é descrita como uma porcentagem expressa em percentual em peso/volume (% em p/v). Tensoativos farmaceuticamente aceitáveis adequados compreendem porém não são limitados a grupo de ésteres de ácido graxo de polioxietilenossorbitano (Tween), polioxietileno alquil éteres (Brij), alquilfenilpolioxietileno éteres (Triton-X), copolímero de polioxietilenopolioxipropileno (Poloxamer, Pluronic)., e dodecil sulfato de sódio (SDS). Ésteres de ácido graxo-polioxietilenossorbitano preferidos são polissorbato 20, (vendido sob o nome comercial Tween 20™) e polissorbato 80 (vendido sob o nome comercial Tween 80™). Copolímeros de polietileno-polipropileno preferidos são aqueles vendidos sob os nomes Pluronic® F68 ou Poloxamer 188™. Polioxietileno alquil éteres preferidos são aqueles vendidos sob o nome comercial Brij™. Alquilfenolpolioxietileno éteres preferidos são vendidos sob o nome comercial Triton-X. Quando o polissorbato 20 (Tween 20™) e polissorbato 80 (Tween 80™) são usados, eles são geralmente usados em uma faixa de concentração de cerca de 0,001 a cerca de 1%, preferivelmente de cerca de 0,005 a cerca de 0,1% e ainda preferivelmente cerca de 5 0,01% a cerca de 0,04% em p/v.
O termo "tampão" como usado aqui denota um excipiente farmaceuticamente aceitável, que estabiliza o pH de uma preparação farmacêutica. Tampões adequados são bem conhecidos na técnica e podem ser encontrados na literatura. Tampões farmaceuticamente aceitáveis preferidos 10 compreendem porém não são limitados a tampões de histidina, tampões de citrato, tampões de succinato e tampões de fosfato. Tampões ainda preferidos compreendem L-histidina ou misturas de L-histidina e cloridrato de Lhistidina com ajuste de pH com um ácido ou uma base conhecida na técnica. Os tampões de histidina acima mencionados são geralmente usados em 15 uma quantidade cerca de 1 mM a cerca de 100 mM, preferivelmente de cerca de 5 mM a cerca de 50 mM e ainda mais preferivelmente de cerca de 10- 20 mm. Independentemente do tampão usado, o pH pode ser ajustado em um valor que compreende cerca de 4,0 a cerca de 7,0 e preferivelmente cerca de 5,0 a cerca de 6,0 e ainda preferivelmente cerca de 5,5 com um ácido 20 ou uma base conhecida na técnica, por exemplo, ácido clorídrico, ácido acético, ácido fosfórico, ácido sulfúrico e ácido cítrico, hidróxido de sódio e hidróxido de potássio.
O termo "agentes de tonicidade" como usado aqui denota agentes de tonicidade farmaceuticamente aceitáveis. Os agentes de tonicidade 25 são usados para modular a tonicidade da formulação. A formulação pode ser hipotônica, isotônica ou hipertônica. Isotonicidade geralmente refere-se à pressão osmótica relativa de uma solução normalmente relativa àquela de soro de sangue humano. A formulação de acordo com a invenção pode ser hipotônica, isotônica ou hipertônica porém será preferivelmente isotônica. 30 Em uma preocupação quanto à clareza, é enfatizado mais uma vez que uma formulação isotônica é líquida ou líquido reconstituído de uma forma sólida, por exemplo, de uma forma Iiofilizada e denota uma solução tendo a mesma tonicidade como alguma outra solução com a qual é comparada, tal como solução salina fisiológica e o soro de sangue. Os agentes de isotonicidade adequados compreendem, porém não são limitados a cloreto de sódio, cloreto de potássio, glicerina e qualquer componente a partir do grupo de ami5 noácidos, açúcares, em particular glicose como definido aqui bem como combinações dos mesmos. Agentes de tonicidade são usados em uma quantidade cerca de 5 mM a cerca de 500 mm.
O termo "líquido" como aqui usado com relação à formulação de acordo com a invenção denota uma formulação que é líquida em uma temperatura de pelo menos cerca de 2 a cerca de 8 0C sob a pressão padrão.
O termo "liofilizado" como aqui usado com relação à formulação de acordo com a invenção denota uma formulação que é fabricada por métodos de secagem por congelamento conhecidos na técnica por si. O solvente (por exemplo, água) é removido congelando-se depois da sublimação sob 15 vácuo e desabsorção de água residual em temperatura elevada. No campo farmacêutico, o liofilizado tem usualmente uma umidade residual de cerca de 0,1 a 5% (p/p) e está presente como um pó ou uma massa estável física. O liofilizado é caracterizado por uma dissolução rápida após a adição de um meio de reconstituição.
O termo "formulação reconstituída" como aqui usado com rela
ção à formulação de acordo com a invenção denota uma formulação que é Iiofilizada e re-dissolvida por adição do meio de reconstituição. O meio de reconstituição compreende, porém, não está limitado à água para injeção (WFI), água bacteriostática para injeção (BWFI), soluções de cloreto de só25 dio (por exemplo NaCI a 0,9% (p/v)), soluções de glicose (por exemplo, glicose a 5%), soluções contendo tensoativo (por exemplo, polissorbato 20 a 0,01%), uma solução tamponada por pH (por exemplo, soluções tamponadas por fosfato) e combinações dos mesmos.
O termo "formulação estável" quando aqui usado com relação à formulação de acordo com a invenção denota uma formulação que preserva sua integridade física e química durante a fabricação, armazenamento e aplicação. Várias técnicas analíticas para avaliar a estabilidade da proteína estão disponíveis e revisadas em Reubsaet, J. L., J. H. Beijnen1 e outros (1998). "Analytical techniques used to study the degradation of proteins and peptides: chemical instability". J Pharm Biomed Anal 17(6-7): 955-78 e Wang, W. (1999). "Instability, stabilization, and formulation of Iiquid protein 5 pharmaceuticals." Int J Pharm 185(2): 129-88. Estabilidade pode ser avaliada por armazenamento em condições de clima selecionadas durante um período de tempo selecionado, aplicando-se estresse mecânico tal como agitação em uma frequência de agitação selecionada durante um período de tempo selecionado, por irradiação com uma intensidade leve selecionada 10 durante um período selecionado de tempo, ou por congelamento repetitivo e desconcongelamento em temperaturas selecionadas.
O termo "farmaceuticamente aceitável" quando aqui usado com relação à formulação de acordo com a invenção denota uma formulação que está em complacência com as exigências reguladoras internacionais atuais 15 para farmacêuticos. Uma formulação farmacêutica aceitável contém excipientes que são geralmente reconhecidos quanto a uma rotina antecipada de aplicação e faixa de concentração quando segura. Além disso, deveria fornecer estabilidade suficiente durante a fabricação, armazenamento e aplicação. Especialmente uma formulação para uma rotina parenteral de aplicação 20 deve cumprir as exigências isotonicidade e pH euídrico em comparação à composição de sangue humano.
Como mencionado acima, em um aspecto, a invenção refere-se a formulação de anticorpo Abeta parenteral farmacêutica estável compreendendo:
- cerca de 1 a cerca de 250 mg/mL de anticorpo Abeta;
- cerca de 0,001 a cerca de 1% de pelo menos um tensoativo;
- cerca de 1 a cerca de 100 mM de um tampão;
- opcionalmente cerca de 10 a cerca de 500 mM de um estabilizador e/ou cerca de 5 a cerca de 500 mM de um agente de tonicidade
- em um pH de cerca de 4,0 a cerca de 7,0.
A concentração de anticorpo Abeta varia a partir de cerca de 1 a cerca de 250 mg/mL, preferivelmente a partir de cerca de 50 mg/mL a cerca de 200 mg/mL e mais preferivelmente a partir de cerca de 150 mg/mL a cerca de 200 mg/mL. Por razões de claridade, é enfatizado que as concentrações como indicadas aqui referem-se à concentração em um líquido ou em um líquido que é precisamente reconstituído a partir de uma forma sólida.
5 Desta maneira, as formulações Iiofilizadas como descrito aqui podem ser reconstituídas a partir de um liofilizado de uma tal maneira que a fórmula reconstituída resultante compreende os componentes respectivos nas concentrações descritas aqui.
Entretanto, é evidente para a pessoa versada que os Iiofilizados 10 estáveis como descrito aqui podem da mesma forma ser reconstituídos usando uma tal quantidade meio de reconstituição que a formulação reconstituída resultante é mais concentrada ou menos concentrada. Por exemplo, o liofilizado de "Formulação A" como descrito aqui na Tabela 2 pode ser reconstituído de tal maneira que a formulação reconstituída resultante é tam15 bém diluída para compreender, por exemplo, 20mg/mL de anticorpo Abeta, 5,3 mM de L-histidina, 66,7 mM de Sacarose e 0,011% de polissorbato 20; veja Formulação R da Tabela 2.
A formulação de acordo com a invenção pode estar em uma forma líquida, uma forma Iiofilizada ou em uma forma líquida reconstituída a partir de uma forma liofilizada.
Nos casos onde a formulação da invenção está em uma forma liofilizada ou em uma forma líquida reconstituída a partir de uma forma liofilizada, pode compreender pelo menos um Iioprotetor como estabilizador.
A formulação de acordo com a invenção pode ser administrada por meios de administração intravenosa (i.v.), subcutânea (s.c.) ou qualquer outros parenterais tais como aqueles conhecidos na técnica farmacêutica. A formulação de acordo com a invenção é preferivelmente administrada por maneiras subcutâneas.
A formulação de acordo com a invenção pode ser preparada por métodos conhecidos na técnica, tal como ultrafiltração-diafiltração, diálise, adição e mistura, liofilização, reconstituição, e combinações dos mesmos. Exemplos de preparações de formulações de acordo com a invenção podem ser encontrados em seguida.
Em uma modalidade preferida, o anticorpo Abeta compreendido na formulação parenteral farmacêutica da presente invenção pode compreender ou ter a região variável como definido em SEQ ID NO: 1:
QVELVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVS AINASGTRTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGK GNTHKPYGYVRYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAA LGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSS LGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLF 10 PPKPKDTLMISRTPEVTCWVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPRE EQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPR EPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTP PVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP GK (SEQ ID NO: 1)
Esta seqüência é da mesma forma descrita aqui abaixo e as re
giões CDRs, CH, regiões pesadas bem como dois sítios de N-glicosilação (Asn 52 e Asn 306) são indicadas:
QVELVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS|GFTFSSYAMS|WVRQAPGKGLEWV
S
Al NASGTRTYYADSVKG RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR
GKGNTHKPYGYVRYFDVlWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGG TAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVP SSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCPKrHrCPPCPAPELLGGPSV FLFPPKPKDTLMISRTPEVTCWVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVH NAKTKP 25 REEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQ P.REP.Q.VYILPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWE^ IJPPVLD§p.(3§fF!TY§KUTyRJ<§RW.QQfiMF§fi§yMHMIndWHYJ.QKSLS.lI SPGK (SEQ ID NO: 1)
traçado|:CDR1, 2, 3
sublinhado: CH1 itálicos: articulação sublinhado duas vezes: CH2 RPr.tilhado.subNnhado: CH3
negrito N: sítios de glicosilação ligados a N
O anticorpo Abeta exemplificado compreendendo SEQ ID NO: 1 como descrito aqui pode da mesma forma compreender uma cadeia leve, a 5 referida cadeia leve pode compreender ou pode ter a seguinte seqüência de aminoácido:
DIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYG ASSRATGVPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFATYYCLQIYNMPITFGQGT KVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNAL QSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSP VTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 2)
O termo "anticorpo Abeta A", quando aqui usado, refere-se ao anticorpo Abeta exemplificado compreendendo uma cadeia pesada como definido em SEQ ID NO: 1 e uma cadeia leve como definido em SEQ ID NO: 2.
O termo "anticopo(s) monoglicosilado(s)", quando aqui usado, refere-se a moléculas de anticorpo compreendendo uma N-glicosilação em uma região (VH) de uma molécula de anticorpo individual, por exemplo de uma imunoglobulina, por exemplo um IgG, por exemplo de um IgGI. Por 20 exemplo, a referida "forma mono-glicosilada" compreende uma glicosilação em uma região variável de cadeia pesada, por exemplo, na posição asparagina "Asn 52" do "anticorpo Abeta A" descrito aqui. Esta "forma de IgGI mono-glicosilada ou isoforma mono-glicosilada" pode da mesma forma compreender, como ilustrado aqui, a glicosilação no sítio de glicosilação bem con25 servado na parte Fe, por exemplo asparagina Asn 306 na parte Fc não variável do "anticorpo Abeta A" exemplificado aqui.
O termo "anticorpo(s) duplo(s)-glicosilado(s)" no significado desta invenção compreende a glicosilação definida aqui em ambas as regiões variáveis da região (VH) de cadeia pesada. Novamente, esta "forma dupla30 glicosilada", compreende uma glicosilação na região variável de ambas as cadeias pesadas, por exemplo na posição asparagina Asn 52 do "anticorpo Abeta A" exemplificado aqui. Esta "forma de IgGI dupla-glicosilada ou isoforma dupla-glicosilada" pode da mesma forma compreender, quando ilustrado aqui, a glicosilação no sítio de glicosilação bem conservado na parte Fc não variável/constante, em particular na posição 306 do "anticorpo Abeta A" exemplificado. Figura 1 anexa ilustra moléculas de anticorpo correspondentes.
Anticorpos destituídos de uma tal modificação pós-translacional na região variável, por exemplo em ambas as regiões variáveis da cadeia pesada (ambas regiões (VH)) são, no contexto desta invenção, considerados como uma forma "não-glicosilada", compreendendo nenhuma glicosilação na 10 região variável da cadeia pesada. Ainda, esta "forma não-glicosilada" pode não obstante compreender (a) glicosilação(ões) na região constante (região C) do anticorpo, por exemplo, e mais geralmente no sítio de glicosilação bem conservado da parte Fe, em particular a asparagina (Asn) 306 na parte Fc não-variável/constante como definido aqui; veja da mesma forma SEQ ID 15 NO: 1.
As formulações parenterais farmacêuticas da invenção podem compreender o "anticorpo Abeta A" exemplar como definido aqui acima e como ilustrado nos exemplos anexos. Desta maneira, as referidas formulações parenterais farmacêuticas compreendendo anticorpo Abeta A podem 20 compreender anticorpo Abeta A monoglicosilado ou anticorpo Abeta A duploglicosilado ou anticorpo Abeta A não-glicosilado ou misturas dos mesmos como definido acima.
Purificação de isoformas de glicosilação de moléculas de anticorpo Abeta recombinantemente expressas podem compreender as etapas de:
(1) purificação de coluna de proteína A;
(2) purificação de coluna de troca iônica, por exemplo, uma cromatografia de troca catiônica; e, opcionalmente,
(3) purificação de coluna de exclusão de tamanho.
O protocolo de purificação pode compreender outras etapas,
como outras etapas de concentração, por exemplo, diafiltração ou etapas analíticas, por exemplo, envolvendo colunas analíticas. É, da mesma forma, considerado e possível que certas etapas particulares são repetidas (por exemplo, duas etapas de cromatografia de troca iônica podem ser realizadas) ou que certas etapas (por exemplo, cromatografia de exclusão de tamanho) podem ser omitidas.
5 Proteína A é um Iigante específico de grupo que liga-se à região
Fc da maioria dos isótipos de lgG1. É sintetizado por algumas cepas de Staphylococcus aureus e pode ser isolada a partir deste e acoplada em contas cromatográficas. Vários tipos de preparações em gel estão comercialmente disponíveis. Um exemplo para uma coluna A de proteína que pode ser usa10 da é uma coluna MabSeIect (Marca registrada). Idealmente, a coluna é equilibrada com 25 mM de Tris/HCI, 25 mM de NaCI1 5 mM de EDTA, o sobrenadante de cultura celular é carregado sobre a coluna, a coluna é lavada com 1 M de Tris/HCI pH 7,2 e o anticorpo é eluído em pH 3,2 usando 100 mM de ácido acético.
Cromatografia de troca catiônica explora interações entre grupos
positivamente carregados em uma fase estacionária e a amostra que está na fase móvel. Quando um trocador catiônico fraco (por exemplo, CM Toyopearl 650®) é usado, as seguintes etapas cromatográficas são realizadas: Depois de pré-equilíbrio com 100 mM de ácido acético pH 4, carregamento de eluí20 do de Proteína A e lavagem com 100 mM de ácido acético pH 4, o anticorpo é eluído e fracionado aplicando-se etapas de 250 mM de acetato de sódio (pH 7,8 - 8,5) e 500 mM de acetato de sódio (pH 7,8 - 8,5). Com a primeira etapa, uma mistura de fração de isoforma dupla-glicosilada e fração de isoforma mono-glicosilada é normalmente eluída, usando a segunda a etapa a 25 fração de isoforma não-glicosilada é normalmente eluída.
A partir de um trocador catiônico forte (por exemplo, SP Toyopearl 650) o anticorpo pode ser eluído por etapas de sal: depois do equilíbrio da coluna com 50 mM de ácido acético pH 5,0, carregar o eluído de Proteína A com pH 4, a primeira etapa de eluição usando 50 mM de ácido acético e 30 210 mM de Cloreto de sódio é realizada. Em seguida, uma segunda etapa de eluição de 50 mM de ácido acético e 350 mM de Cloreto de sódio é aplicada. Pela primeira etapa de sal, uma mistura da fração de isoforma duplaglicosilada e fração de isoforma mono-glicosilada é normalmente eluída, pela segunda etapa de sal a isoforma não-glicosilada é normalmente eluída.
Além disso, o anticorpo pode da mesma forma ser eluído a partir de uma coluna de trocador de cátion forte (por exemplo, SP-Sepharose®) 5 por um gradiente de sal: depois do pré-equilíbrio, carregamento e lavagem da coluna em pH 4,5, um gradiente de sal é aplicado a partir de 50 mM de MES pH 5,8 em 50 mM de MES /1 M de Cloreto de sódio pH 5,8. Aqui, a isoforma dupla-glicosilado, isoforma mono-glicosilada e frações de isoforma não-glicosiladas são normalmente eluídas separadamente. No seguinte, a 10 fração de isoforma dupla-glicosilada e fração de isoforma mono-glicosilada podem ser agrupadas para resultar no pool de produto e/ou em uma mistura de anticorpo desejada.
Outra purificação da mistura de moléculas de anticorpo dupla e mono-glicosiladas, por exemplo imunoglobulinas, pode ser realizada por 15 cromatografia de exclusão de tamanho. Um exemplo de uma coluna útil é uma coluna Superdex 200®. Exemplos de tampões fluentes incluem cloreto de histidina/sódio, por exemplo, 10 mM de histidina/125 mM de Cloreto de sódio /pH 6, e solução salina tamponada por fosfato (PBS).
Cromatografia de troca aniônica no modo de fluxo total seguido 20 por uma concentração/diafiltração é uma etapa de purificação alternativa. Q Sepharose® é um exemplo para uma resina para a etapa de troca aniônica. Por exemplo, o eluído a partir da cromatografia de SP pode ser diluído três vezes com 37,5 mM de Tris/HCI pH 7,9 e passado sobre uma coluna QSepharose pré-equilibrada com 25 mM de Tris/83 mM de acetato de sódio. 25 O fluxo total é coletado, ajustado em pH 5,5 e concentrado por uItrafiItração usando por exemplo uma membrana Hydrosart 30 kD®. No seguinte, o concentrado pode ser diafiltrado contra por exemplo 10 volumes de 20 mM de histidina/HCI pH 5,5.
Como definido acima, isoformas de anticorpo podem da mesma forma compreender (a) outra(s) glicosilação(ões) na parte constante/nãovariável das moléculas de anticorpo, por exemplo, na parte Fe de um IgG, por exemplo, na parte Fe em um IgGI. A referida glicosilação na parte Fc refere-se a uma glicosilação bem conservada, sendo caracterizada e localizada na posição Asn306 da cadeia pesada, por exemplo, de acordo com a SEQ ID NO: 1 definida aqui.
A região de IgG-Fc dos anticorpos compreendida nas formula5 ções desta invenção pode ser um homodímero compreendido em regiões de articulação ligadas ao dissulfeto de inter-cadeia, domínios de CH2 glicosilados, suportando oligossacarídeos ligados a N em asparagina 306 (Asn-306) dos domínios CH2 e CH3 não-covalentemente emparelhados. O oligossacarídeo da glicosilação em Asn-306 é do tipo biantenário complexo e pode 10 compreender uma estrutura de heptassacarídeo de núcleo com a adição variável de açúcares de ramificação exterior.
O oligossacarídeo influencia ou determina a função e estrutura Fc (Jefferis (1998) Immunol Rev. 163, 50-76). Funções efetoras, interações de Iigante efetor/lgG-Fc específico particulares de numeração foram discuti15 das (Jefferis (2002) Immunol Lett. 82(1-2), 57-65 e Krapp (2003) J Mol Biol. 325(5), 979-89). Esta posição Fc conservada Asn-306 corresponde a "Asn297" no sistema Kabat (Kabat (1991) Sequences of Proteins de Immunological Interest, 5a Ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda MD.)
Em uma certa modalidade, a formulação da invenção é uma
formulação líquida ou Iiofilizada compreendendo:
- cerca de 1 a cerca de 200 mg/mL de anticorpo Abeta,
- 0,04% em p/v de Tween 20,
- 20 mM de L-histidina,
- 250 mM de Sacarose,
- em pH 5,5
Em outra modalidade, a formulação de acordo com a invenção da mesma forma compreende uma formulação Iiofilizada compreendendo:
- 75 mg/mL de anticorpo Abeta - 0,04% em p/v de Tween 20,
- 20 mM de L-histidina,
- 250 mM de Sacarose, - em pH 5,5.
Em outra modalidade, a formulação de acordo com a invenção da mesma forma compreende uma formulação Iiofilizada compreendendo:
- 75 mg/mL de anticorpo Abeta,
- 0,04% em p/v de Tween 20,
- 20 mM de L-histidina,
- 250 mM de Sacarose,
- em pH 5,5. ou
- 75 mg/mL de anticorpo Abeta,
- 0,02% em p/v de Tween 20,
- 20 mM de L-histidina,
- 250 mM de Sacarose,
- em pH 5,5.
Em ainda outra modalidade, a formulação de acordo com a in
venção da mesma forma compreende uma formulação líquida compreendendo:
- 37,5 mg/mL de anticorpo Abeta,
- 0,02% em p/v de Tween 20,
- 10 mM de L-histidina,
-125 mM de Sacarose,
- em pH 5,5. ou
- 37,5 mg/mL de anticorpo Abeta,
- 0,01 % em p/v de Tween 20,
-10 mM de L-histidina,
- 125 mM de Sacarose,
- em pH 5,5.
Em ainda outra modalidade, a formulação de acordo com a invenção compreende da mesma forma uma formulação Iiofilizada compreendendo:
- 15 mg/mL de anticorpo Abeta, - 0,04% em p/v de Tween 20,
- 20 mM de L-histidina,
- 250 mM de Sacarose,
- em pH 5,5.
Em ainda outra modalidade, a formulação de acordo com a in
venção compreende da mesma forma uma formulação Iiofilizada compreendendo:
- 20 mg/mL de anticorpo Abeta,
- 0,011 % em p/v de Tween 20,
- 5,3 mM de L-histidina,
- 66,7 mM de Sacarose,
- em pH 5,5.
Em ainda outra modalidade, a formulação de acordo com a invenção da mesma forma compreende uma formulação líquida compreendendo:
- 7,5 mg/mL de anticorpo Abeta,
- 0,04% em p/v de Tween 20,
- 20 mM de L-histidina,
- 250 mM de Sacarose,
- em pH 5,5;
ou
- 7,5 mg/mL de anticorpo Abeta,
- 0,02% em p/v de Tween 20,
- 10 mM de L-histidina,
- 125 mM de Sacarose,
- em pH 5,5.
Em uma modalidade adicional, a formulação de acordo com a invenção da mesma forma compreende uma formulação Iiofilizada compreendendo:
- 75 mg/mL de anticorpo Abeta,
- 0,04% em p/v de Tween 20,
- 20 mM de L-histidina, - 250 mM de Trehalox,
- em pH 5,5. ou
- 75 mg/mL de anticorpo Abeta,
- 0,02% em p/v de Tween 20,
- 20 mM de L-histidina,
- 250 mM de Trehalox,
- em pH 5,5.
Em ainda outra modalidade, a formulação de acordo com a invenção da mesma forma compreende uma formulação líquida compreendendo:
- 37,5 mg/mL de anticorpo Abeta,
- 0,02% em p/v de Tween 20,
- 10 mM de L-histidina,
- 125 mM de Trehalox,
- em pH 5,5. ou
- 37,5 mg/mL de anticorpo Abeta,
- 0,01% em p/v de Tween 20,
-10 mM de L-histidina,
- 125 mM de Trehalox,
- em pH 5,5.
Em ainda outra modalidade, a formulação de acordo com a invenção da mesma forma compreende uma formulação líquida compreendendo:
- 75 mg/mL de anticorpo Abeta,
- 0,02% em p/v de Tween 20,
- 20 mM de L-histidina,
- 250 mM de Trehalox,
-em pH5,5.
ou
- 75 mg/mL de anticorpo Abeta, - 0,02% em p/v de Tween 20,
- 20 mM de L-histidina,
- 250 mM de Manitol,
- em pH 5,5.
ou
- 75 mg/mL de anticorpo Abeta,
- 0,02% em p/v de Tween 20,
- 20 mM de L-histidina,
-140 mM de Cloreto de sódio,
- em pH 5,5. ou
-150 mg/mL de anticorpo Abeta,
- 0,02% em p/v de Tween 20,
- 20 mM de L-histidina,
- 250 mM de Trehalox,
- em pH 5,5. ou
-150 mg/mL de anticorpo Abeta,
- 0,02% em p/v de Tween 20,
- 20 mM de L-histidina,
- 250 mM de Manitol,
- em pH 5,5. ou
-150 mg/mL de anticorpo Abeta, - 0,02% em p/v de Tween 20,
- 20 mM de L-histidina,
-140 mM de Cloreto de sódio,
- em pH 5,5. ou
-10 mg/mL de anticorpo Abeta,
- 0,01% em p/v de Tween 20,
- 20 mM de L-histidina, -140 mM de Cloreto de sódio,
- em pH 5,5
Em uma modalidade preferida, a formulação de acordo com a invenção da mesma forma compreende uma formulação líquida compreendendo:
- 10 mg/mL de anticorpo Abeta,
- 0,01% em p/v de Tween 20,
- 20 mM de L-histidina,
-140 mM de Cloreto de sódio,
- em pH 5,5
Em outra modalidade preferida, a formulação de acordo com a invenção compreende da mesma forma uma formulação Iiofilizada compreendendo:
- 75 mg/mL de anticorpo Abeta,
- 0,04% em p/v de Tween 20,
- 20 mM de L-histidina,
- 250 mM de Sacarose,
- em pH 5,5
Em outra modalidade preferida, a formulação de acordo com a invenção compreende da mesma forma uma formulação Iiofilizada compreendendo:
- 20 mg/mL de anticorpo Abeta,
- 0,011 % em p/v de Tween 20,
- 5,3 mM de L-histidina,
- 66,7 mM de Sacarose
- em pH 5,5 LEGENDAS DAS FIGURAS
Figura 1 Esquema de moléculas de anticorpo dupla, mono e não-glicosilada (imunoglobulinas).
Figura 2 Teor de monômero como determinado por cromatogra
fia de exclusão de tamanho de formulações A de anticorpo Abeta depois do início e incubação a 5°C, 25°C/60%rh e 40°C/75%rh durante até 6 meses. Preparações de anticorpo são secads por congelamento e reconstituídas em concentração nominal de 75mg/ml_.
Figura 3 Teor de monômero como determinado por cromatografia de exclusão de tamanho de formulações de anticorpo Abeta depois do 5 início e incubação a 5°C, 25°C/60%rh e 40°C/75%rh durante 3 meses. Preparações de anticorpo K, L e N são formulados em 75mg/mL, considerando que preparações O, P e Q são formuladas em 150mg/mL.
EXEMPLOS
Formulações de produto de fármaco Iifilizadas e líquidas para administração subcutânea de acordo com a invenção foram desenvolvidas como segue:
Preparação de formulações líquidas
Anticorpo Abeta compreendendo uma cadeia pesada como definido em SEQ ID NO: 1 e uma cadeia leve como definido em SEQ ID NO: 2 15 ("anticorpo Abeta A" no contexto da presente invenção) foi preparado e obtido como descrito em WO 03/070760 e foi concentrado por ultrafiltração em uma concentração de aproximadamente 40 a cerca de 200 mg/mL em um tampão de 20 mM de histidina em um pH de aproximadamente 5,5. A solução concentrada foi em seguida diluída com o tampão de formulação (con20 tendo açúcar (respectivamente sal ou poliol), tensoativo e tampão em um pH de aproximadamente pH 5,5) resultando a concentração de anticorpo antecipada de aproximadamente 7,5mg/mL, 37,5 mg/mL, 75 mg/mL ou 150mg/mL formulada na composição de volume final (por exemplo, 10 mM de L-histidina, 125 mM de Sacarose, 0,02% de Tween 20, em pH 5,5).
Alternativamente, anticorpo Abeta A foi trocado por tampão con
tra um tampão de diafiltração que contém o tampão antecipado e composição de açúcar e concentrado em uma concentração de anticorpo igual a ou mais alta que a concentração final de aproximadamente 37,5mg/mL. O tensoativo foi adicionado depois da conclusão da operação de ultrafiltração co30 mo uma solução de matéria-prima de 100 a 200 vezes à solução de anticorpo. A solução de anticorpo concentrada foi ajustada com um tampão de formulação que contém a composição de excipiente idêntica à concentração de anticorpo Abeta A final de aproximadamente 37,5 mg/mL.
Todas as formulações foram filtradas estéreis através de filtros de ligação de proteína baixa de 0,22 pm e assepticamente preenchidos sob atmosfera de nitrogênio em frasconetes de vidro de 6 mL estéreis fechados 5 com tampões de borracha revestidos com ETFE (Copolímero de etileno e tetrafluoroetileno) e tampas alucrimp. O volume de carga foi de aproximadamente 2,4 mL. Estas formulações foram armazenadas em condições de clima diferentes para intervalos diferentes de tempo e submetidas ao estresse por agitação (1 semana em uma frequência de agitação de 200 min'1 a 10 5°C) e métodos de estresse de congelamento-descongelamento. As amostras foram analisadas antes e depois de aplicar os testes de estresse pelos métodos analíticos 1) espectrofotometria de UV, 2) Cromatografia de Exclusão de Tamanho (SEC) e 3) nefelometria para determinar a turvação da solução.
Preparação de formulações Iiofilizadas e formulações líquidas reconstituídas a partir de tais formulações Iiofilizadas
Soluções de aproximadamente 37,5 mg/ml de "anticorpo Abeta A" foram preparadas como descrito acima para formulações líquidas. Qualquer método de liofilização conhecido na técnica é pretendido estar dentro 20 do escopo da invenção. Por exemplo, o processo de liofilização usado para este estudo incluiu o resfriamento da formulação a partir da temperatura ambiente em aprox 5°C (pré-resfriamento) e uma etapa de congelamento a 40°C em uma taxa de resfriamento de placa de aproximadamente 1°C/min, seguido por uma etapa de manutenção a -40°C durante cerca de 2 horas. A 25 primeira etapa de secagem foi realizada em uma temperatura de placa de aproximadamente -25°C e uma pressão de câmara de aproximadamente 0,008KPa (80 pbar) durante cerca de 62 horas. Subsequentemente, a segunda etapa de secagem começou com um aumento de temperatura de 0,2°C/min de -25°C a 25°C, seguido por uma etapa de manutenção a 25°C 30 durante pelo menos 5 horas em uma pressão de câmara de aproximadamente 0,008 KPa (80 pbar) (o horário de secagem aplicado é apresentado na Tabela 1.) A liofilização foi realizada em um secador por congelamento Usifroid SMH-90 LN2 (Usifroid, Maurepas, France). Todas as massas Iiofilizadas neste estudo teve um teor de água residual de cerca de 0,1 a 1,0% como determinado pelo método de Karl-Fischer. As amostras secas por conge5 lamento foram incubadas em temperaturas diferentes para intervalos diferentes de tempo.
As formulações Iiofilizadas foram reconstituídas em um volume final de 1,2 mL com água para injeção (WFI) produzindo uma formulação isotônica com uma concentração de anticorpo de aproximadamente 10 75 mg/mL e uma viscosidade menor que 3 mPa-s. O tempo da reconstituição das massas secas por congelamento foi de cerca de 2 a 4 min. A análise das amostras reconstituídas foi realizadas imediatamente após a reconstituição, ou após um período de incubação de 24 horas da amostra líquida reconstituída a 25°C.
As amostras foram analisadas por 1) espectrofotometria de UV,
2) determinação do tempo da reconstituição, 3) Cromatografia de Exclusão de Tamanho (SEC) e 4) método de nefelometria para determinar a turvação da solução.
Cromatografia de Exclusão de Tamanho (SEC) foi usada para 20 detectar espécies de peso molecular alto solúveis (agregados) e produtos de hidrólise de peso molecular baixos (LMW) nas formulações. O método foi realizado em um instrumento de HPLC Merck Hitachi 7000 equipado com uma coluna Tosohaas TSK G3000 SWXL. Monômero intato, agregados e produtos de hidrólise são separados por um perfil de eluição isocrático, u25 sando 0,2M de K2HP04/0,25M de KCL, pH 7,0 como fase móvel, e foram detectados em um comprimento de onda de 280nm.
Espectroscopia de UV, usada para determinação do teor de proteína, foi realizada em um espectrofotômetro de UV Varian Cary Bio em 280 nm. Amostras de proteína limpas foram diluídas em aproximadamente 0,5 mg/mL com 20 mM de L-histidina, pH 5,5. A concentração de proteína foi calculada de acordo com a equação 1. „ ^4(280) — Α(320) χ Fator de diluição Equaçaol: Teor de proteína =——j^
A concentração de proteína foi medida com uma precisão de ±10%. A absorção de Iuz UV a 280 nm foi corrigida quanto a dispersão de Iuz em 320 nm e multiplicada com o fator de diluição, que foi determinado a 5 partir das massas pesadas e densidades da amostra limpa e o tampão de diluição. O numerator foi dividido pelo produto do comprimento da série de reação de cubeta e o coeficiente de extinção (.
A clareza e o grau de opalescência foram medidos como Unidades de Turvação de Formazina (FTU) pelo método de nefelometria. A amostra limpa foi transferida em um tubo de vidro claro de 11 mm de diâmetro e colocada em um turbidímetro HACH 2100AN.
Tabela 1 Ciclo de secagem por congelamento tipo I
Etapa Temperatura Taxa de Tempo de Ponto fixo de vida de elevação sustentação do vácuo prateleira (0C) (°C/min) (min) (pbar) Pré- 5°C 0,0 60 resfriamento Congelamento -40°C 1,0 150 Secagem pri¬ -25°C 0,5 3700 80 mária Secagem se¬ +25°C 0,2 300 80 cundária Tabela 2 Composições de formulações de produto de fármaco de "anticorpo Abeta A" acordo com a invenção
Formulação Composição (Dados de estabilidade na Tabela) Formulações Liofilizadas Formulação A 75 mg/mL de anticorpo Abeta A, 20 mM de L-histidina, 250 mM de Sacarose, 0,04% de polissorbato 20, em pH 5,5 Pontode Cone. de pro- Exclusão de Tamanho - Turvação tempo teína depois HPLC depois da HMW Monômero LMW (%) (%) (%) Inicial 72,8 1,9 96,1 2,0 5,4 24 h a 25°C 74,8 1,9 96,0 2,1 5,3 depois da recosntituição 1 mês a 2-8°C 74,5 1,7 95,8 2,5 5,4 3 meses a 2- 74,2 2,0 95,9 2,1 5,6 8°C 6 meses a 2- n.d. 2,0 96,0 2,0 n.d. 8°C 6 meses a n.d 2,3 95,7 2,0 n.d 25°C/60%rh 6 meses a n.d. 3,2 94,8 2,0 n.d. 40°C/75%rh Formulação B 75 mg/mL de anticorpo Abeta A, 20 mM de L-histidina, 250 mM de Sacarose, 0,02% de polissorbato 20, em pH 5,5 Ponto de tem- Cone. de pro¬ Exclusão de Tamanho - Turvação po teína depois HPLC depois da HMW Monômero LMW (%) (%) (%) Inicial 74,9 1,9 96,1 2,0 5,3 24 h a 25°C 73,8 1,9 96,1 2,0 5,2 depois da recosntituição 1 mês a 2-8°C 74,3 1,7 95,9 2,4 5,4 3 meses a 2- 73,9 2,0 95,9 2,1 6,0 8°C 6 meses a 2- n.d. 2,0 96,0 2,0 n.d. 8°C 6 meses a n,d 2,3 95,7 2,0 n.d. 25°C/60%rh 6 meses a n.d. 3,2 94,8 2,0 n.d. 40°C/75%rh Formulação C 75 mg/mL de anticorpo Abeta A, 20 mM de L-histidina, 250 mM de Trehalox, 0,04% de polissorbato 20, em pH 5,5 Ponto de tem- Cone. de prote¬ Exclusão de Tamanho - Turvação po ína depois da HPLC depois da HMW Monôme- LMW (%) ro (%) (%) Inicial 74,4 2,0 96,1 2,0 5,3 24 h a 25°C 73,6 2,0 96,0 2,1 5,1 depois da recosntituição 1 mês a 2-8°C 72,7 1,7 95,7-95,9 2,4 5,3 3 meses a 2- 72,5 2,0 95,9 2,1 5,2 8°C 6 meses a 2- n.d. 2,0 96,0 2,0 n.d. 8°C 6 meses a n.d 2,6 95,4 2,0 n.d 25°C/60%rh 6 meses a n.d. 4,2 93,8 2,0 n.d. 40°C/75%rh Formulação D 75 mg/mL de anticorpo Abeta A, 20 mM de L-histidina, 250 mM de Trehalox, 0,02% de polissorbato 20, em pH 5,5 Ponto de tem- Cone. de pro¬ Exclusão de Tamanho - Turvação po teína depois da HPLC depois da HMW Monôme- LMW (%) ro (%) (%) Inicial 73,6 2,0 96,1 2,0 5,2 24 h a 25°C 72,8 2,0 96,0 2,0 5,6 depois da re¬ cosntituição 1 mês a 2-8°C 72,9 1,8 95,8 2,4 5,1 3 meses a 2- 73,4 2,0 95,9 2,1 5,5 8°C Formulação D 75 mg/mL de anticorpo Abeta A, 20 mM de L-histidina, 250 mM de Trehalox, 0,02% de polissorbato 20, em pH 5,5 Ponto de tem- Cone. de pro¬ Exclusão de Tamanho - Turvação po teína depois da HPLC depois da HMW Monôme- LMW (%) ro (%) (%) 6 meses a 2- n.d. 2,0 96,0 2,0 n.d. 8°C 6 meses a n.d 2,6 95,4 2,0 n.d. 25°C/60%rh 6 meses a n.d. 4,2 93,8 2,0 n.d. 40°C/75%rh Formulação E 15 mg/mL de anticorpo Abeta A, 20 mM de L-histidina, 250 mM de Sacarose, 0,04% de polissorbato 20, em pH 5,5 (*) levando em conta a precisão analítica e variabilidade leve da reconstitui
ção.
Formulações líquidas Formulação F 37,5mg/mL de anticorpo Abeta A, Armazenamento a 2- 8°C 10 mM de L-histidina, 125 mM de Sacarose, 0,02% de polissorbato 20, em pH 5,5 Ponto de Cone. proteí¬ Exclusão de Tamanho - HPLC Turvação HMW Monômero LMW (%) (%) (%) Inicial 36,7 1,8 96,2 2,0 3,5 1 semana 36,8 1,8 96,2 2,0 3,6 de agitação 3 meses 37,8 1,8 96,1 2,1 3,4 Formulação G 37,5mg/mL de anticorpo Abeta Armazenamento a 2- 8°C A, 10 mM de L-histidina, 125 mM de Sacarose, 0,01% de polissorbato 20, em pH 5,5 Ponto de Cone. de pro¬ Exclusão de Tamanho - H- Turvação tempo teína (mg/mL) PLC (FTU) HMW Monômero LMW (%) (%) (%) Inicial 36,8 1,8 96,2 2,0 3,3 1 semana 36,8 1,8 96,3 1,9 3,6 de agitação 3 meses 37,8 1,8 96,1 2,1 3,9 Formulação H 37,5mg/mL de anticorpo Abeta A, Armazenamento a 2- 8°C 10 mM de L-histidina, 125 mM de Trehalox, 0,02% de polissorbato 20, em pH 5,5 Ponto de Cone. de pro¬ Exclusão de Tamanho - H- Turvação tempo teína (mg/mL) PLC (FTU) HMW Monômero LMW (%) (%) (%) Inicial 36,6 1,8 96,2 2,0 3,6 1 semana 36,6 1,8 96,2 2,0 3,4 de agitação 3 meses 37,7 1,8 96,1 2,1 4,2 Formulação I 37,5mg/mL de anticorpo Abeta A, 10 Armazenamento a 2-8°C mM de L-histidina, 125 mM de Trehalox, 0,01% de po¬ lissorbato 20, em pH 5,5 Ponto de Cone. de pro¬ Exclusão de Tamanho - H- Turvação tempo teína (mg/mL) PLC (FTU) HMW Monômero LMW (%) (%) (%) Inicial 36,6 1,8 96,2 2,0 3,5 Formulação I 37,5mg/mL de anticorpo Abeta A, 10 Armazenamento a 2-8°C mM de L-histidina, 125 mM de Trehalox, 0,01% de po¬ lissorbato 20, em pH 5,5 Ponto de Cone. de pro¬ Exclusão de Tamanho - H- Turvação tempo teína (mg/mL) PLC (FTU) HMW Monômero LMW (%) (%) (%) 1 semana 36,4 1,8 96,2 2,0 3,5 de agita¬ ção 3 meses 37,8 1,8 96,1 2,1 3,7 Formulação J 7,5 mg/mL de anticorpo Abeta A, 10 mM de L-histidina, 125 mM de Saca¬ rose, 0,02% de polissorbato 20, em pH 5,5 Formulação K 75mg/mL de anticorpo Abeta A, 20 mM de L-histidina, 250 mM de Trehalox, 0,02% de polissorbato 20, em pH 5,5 Ponto de tempo Cone. de Exclusão de Tamanho - H- Turvação proteína PLC (FTU) HMW Monômero LMW (%) (%) (%) Inicial 75,3 0,9 98,5 0,6 5,0 1 semana de 77,0 0,8 98,6 0,6 4,9 agitação a 2- 8°C 3 meses a 2- 70,5 0,8 98,6 0,6 5,2 8°C 3 meses a 72,0 0,9 98,3 0,8 8,1 25°C/60%rh 3 meses a 69,1 1,5 95,7 2,9 6,9 40°C/75%rh Formulação L 75mg/mL de anticorpo Abeta A, 20 mM de L-histidina, 250 mM de Manitol, 0,02% de polissorbato 20, em pH 5,5 Ponto de tempo Cone. de Exclusão de Tamanho - H- Turvação proteína PLC (FTU) HMW Monômero LMW (%) (%) (%) Inicial 76,6 0,9 98,5 0,6 5,7 1 semana de 77,4 0,8 98,6 0,6 5,5 agitação a 2- 8°C 3 meses a 2- 81,1 0,8 98,6 0,6 5,7 8°C 3 meses a 72,0 0,9 98,3 0,8 8,4 25°C/60%rh 3 meses a 72,9 1,4 95,8 2,8 8,6 40°C/75%rh Formulação M 10mg/mL de anticorpo Abeta A, 20 Armazenamento a 2- 8°C mM de L-histidina, 140 mM de Cloreto de sódio, 0,01% de polissorbato 20, em pH 5,5 Exclusão de Tamanho - HPLC Turvação Ponto de Cone. de pro¬ HMW Monômero LMW tempo teína (mg/mL) (%) (%) (%) Inicial 9,7 0,7 98,1 1,2 3,7 1 semana 9,7 0,7 98,0 1,3 3,8 de agitação 3 meses 9,6 0,7 98,0 1,3 3,7 Formulação N 75mg/mL de anticorpo Abeta A, 20 mM de L-histidina, 140 mM de Cloreto de sódio, 0,02% de polissorbato 20, em pH 5,5 Ponto de tempo Cone. de Exclusão de Tamanho - H- Turvação proteína PLC (FTU) HMW Monômero LMW (%) (%) (%) Inicial 73,9 1,0 98,5 0,6 17,5 1 semana de 80,0 0,9 98,5 0,6 18,7 agitação a 2- 8°C 3 meses a 2- 74,5 1,0 98,5 0,6 18,6 8°C 3 meses a 72,1 1,1 98,1 0,8 19,4 25°C/60%rh 3 meses a 70,4 2,1 94,9 3,0 n.d. 40°C/75%rh Formulação O 150mg/mL de anticorpo Abeta A, 20 mM de L-histidina, 250 mM de Trehalox, 0,02% de polis¬ sorbato 20, em pH 5,5 Ponto de Cone. de Exclusão de Tamanho - Turvação (FTU) tempo proteína HPLC HMW Monômero LMW (%) (%) (%) Inicial 143,7 1,0 98,5 0,6 5,7 1 semana de 151,9 1,0 98,5 0,6 5,0 agitação a 2- 8°C 3 meses a 2- 138,1 1,1 98,3 0,6 5,5 8°C 3 meses a 134,5 1,5 97,8 0,8 7,3 25°C/60%rh 3 meses a 141,7 3,0 94,3 2,8 6,2 Formulação O 150mg/mL de anticorpo Abeta A, 20 mM de L-histidina, 250 mM de Trehalox, 0,02% de polis¬ sorbato 20, em pH 5,5 40°C/75%rh Formulação P 150mg/mL de anticorpo Abeta A, 20 mM de L-histidina, e, 250 mM de Manitol, 0,02% de po¬ lissorbato 20,0 em pH 5,5 5 Ponto de tem- Cone. de pro¬ Exclusão de Tamanho - H- Turvação po teína PLC (FTU) HMW Monômero LMW (%) (%) (%) Initial 146,4 1,0 98,5 0,6 5,8 1 semana de 153,4 1,0 98,5 0,6 5,3 agitação a 2-8°C 3 meses 141,1 1,1 98,4 0,6 5,9 a 2-8°C 3 meses a 146,7 1,5 97,8 0,8 7,1 25°C/60%rh 3 meses a 138,1 2,8 94,4 2,8 7,1 40°C/75%rh Formulação Q 150mg/mL de anticorpo Abeta A, 20 mM de L-histidina, 140 mM de Cloreto de Sódio, 0,02% de polissorbato 20, em pH 5,5 Ponto de tem- Cone. de Pro¬ Exclusão de Tamanho - H- Turvação po teína PLC (FTU) HMW Monômero LMW (%) (%) (%) Initial 150,8 1,0 98,5 0,6 18,0

Claims (41)

1. Formulação de anticorpo Abeta parenteral farmacêutica estável, caracterizada pelo fato de que compreende: - cerca de 1 a cerca de 250 mg/mL de anticorpo Abeta; - cerca de 0,001 a cerca de 1% de pelo menos um tensoativo; - cerca de 1 a cerca de 100 mM de um tampão; - opcionalmente cerca de 10 a cerca de 500 mM de um estabilizador e/ou cerca de 5 a cerca de 500 mM de um agente de tonicidade; - em um pH de cerca de 4,0 a cerca de 7,0.
2. Formulação de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que é uma formulação líquida.
3. Formulação de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que é uma formulação liofilizada.
4. Formulação de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que é uma formulação líquida reconstituída a partir de uma formulação liofilizada.
5. Formulação de acordo com qualquer uma das reivindicações1 a 4, caracterizada pelo fato de que a concentração do anticorpo Abeta é de cerca de 1 a cerca de 200 mg/mL.
6. Formulação de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelo fato de que a concentração do anticorpo Abeta é de cerca de 50 mg/mL a cerca de 200 mg/mL.
7. Formulação de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo fato de que a concentração do anticorpo Abeta é de cerca de 150 mg/mL a cerca de 200 mg/mL.
8. Formulação de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizada pelo fato de que o estabilizador está presente na formulação em uma quantidade cerca de 10 a cerca de 300 mM.
9. Formulação de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizada pelo fato de que o estabilizador está presente na formulação em uma quantidade cerca de 100 a cerca de 300 mM.
10. Formulação de acordo com qualquer uma das reivindicações .1 a 9, caracterizada pelo fato de que o estabilizador é selecionado a partir do grupo consistindo em açúcares, aminoácidos, polióis, tensoativos, antioxidantes, conservantes, ciclodextrinas, em particular hidroxipropil-βciclodextrina, sulfobutiletil-P-ciclodextrina e β-ciclodextrina, polietilenoglicóis, PEG 3000, 3350, em particular 4000 e 6000, albumina, albumina de soro humano (HSA), albumina de soro bovino (BSA), sais em particular cloreto de sódio, cloreto de magnésio, cloreto de cálcio e queladores, em particular EDTA.
11. Formulação de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizada pelo fato de que o estabilizador é um lioprotetor.
12. Formulação de acordo com a reivindicação 11, caracterizada pelo fato de que o lioprotetor é selecionado a partir do grupo consistindo em açúcares, aminoácidos, polióis e álcoois de açúcar.
13. Formulação de acordo com a reivindicação 12, caracterizada pelo fato de que o lioprotetor é selecionado a partir do grupo consistindo em Trehalox, sacarose, manitol, lactose, glicose, manose, maltose, galactose, frutose, sorbose, rafinose, glicosamina, N-Metilglicosamina ("Meglumina"), galactosamina, ácido neuramínico e arginina.
14. Formulação de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizada pelo fato de que o tensoativo está presente na formulação em uma quantidade cerca de 0,005 a cerca de 0,1% em p/v.
15. Formulação de acordo com a reivindicação 14, caracterizada pelo fato de que o tensoativo está presente na formulação em uma quantidade cerca de 0,01% a cerca de 0,04% em p/v.
16. Formulação de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15, caracterizada pelo fato de que o tensoativo é selecionado a partir do grupo consistindo em ésteres de ácido graxo de polioxietilenossorbitano, polioxietileno alquil éteres, alquilfenilpolioxietileno éteres, copolímero de polioxietileno-polioxipropileno e dodecil sulfato de sódio.
17. Formulação de acordo com a reivindicação 16, caracterizada pelo fato de que o tensoativo é selecionado a partir do grupo de monolaureato de polioxietileno sorbitano e mono-oleato de polioxietileno sorbitano, poloxâmero 124, poloxâmero 188, poloxâmero 237, poloxâmero 338 e poloxâmero 407, polioxietileno (23) Iauril éter, polioxietileno (20) cetil éter, polioxietileno (10) oleil éter e polioxietileno (20) oleil éter, e etoxilato de octil (7.5), etoxiIato de octil (9.5), e etoxilato de octil (102).
18. Formulação de acordo com a reivindicação 17, caracterizada pelo fato de que o tensoativo é selecionado a partir do grupo que contém monolaureato de polioxietileno sorbitano e mono-oleato de polioxietileno sorbitano.
19. Formulação de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 18, em que o tampão está presente na formulação em uma quantidade cerca de 1 mM a cerca de 100 mm.
20. Formulação de acordo com a reivindicação 15, caracterizada pelo fato de que o tampão está presente na formulação em uma quantidade cerca de 5 mM a cerca de 50 mm.
21. Formulação de acordo com a reivindicação 20, caracterizada pelo fato de que o tampão está presente na formulação em uma quantidade cerca de 10 a cerca de 20 mm.
22. Formulação de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 21, caracterizada pelo fato de que o tampão é selecionado a partir do grupo consistindo em tampões de histidina, tampões de citrato, tampões de succinato, tampões de acetato e tampões de fosfato.
23. Formulação de acordo com a reivindicação 22, caracterizada pelo fato de que o tampão compreende L-histidina ou misturas de L-histidina com cloridrato de L-histidina.
24. Formulação de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 23, caracterizada pelo fato de que o pH é cerca de 4,0 a cerca de 7,0.
25. Formulação de acordo com a reivindicação 24, caracterizada pelo fato de que o pH é cerca de 5,0 a cerca de 6,0.
26. Formulação de acordo com a reivindicação 25, caracterizada pelo fato de que o pH é cerca de 5,5.
27. Formulação de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 26, que compreende um ou mais agentes de tonicidade.
28. Formulação de acordo com qualquer uma das reivindicações1 a 27, caracterizada pelo fato de que o agente de tonicidade está presente na formulação em uma quantidade cerca de 5 mM a cerca de 500 mm.
29. Formulação de acordo com qualquer uma das reivindicações1 a 28, caracterizada pelo fato de que os agentes de tonicidade são selecionados a partir do grupo consistindo em cloreto de sódio, cloreto de potássio, glicerina, aminoácidos, açúcares, bem como combinações dos mesmos.
30. Formulação de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 29, caracterizada pelo fato de que pode ser administrada por administração intravenosa (i.v.) ou subcutânea (s.c.) ou qualquer outra administração parenteral.
31. Formulação líquida de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que compreende: - cerca de 1 a cerca de 200 mg/mL de anticorpo Abeta, - 0,04% em p/v de Tween 20, - 20 mM de L-histidina, - 250 mM de Sacarose, - em pH 5,5; ou - 37,5 mg/mL de anticorpo Abeta, - 0,02% em p/v de Tween 20, -10 mM de L-histidina, -125 mM de Sacarose, - em pH 5,5; ou - 37,5 mg/mL de anticorpo Abeta, - 0,01% em p/v de Tween 20, - 10 mM de L-histidina, -125 mM de Sacarose, - em pH 5,5; ou - 7,5 mg/mL de anticorpo Abeta, - 0,04% em p/v de Tween 20, - 20 mM de L-histidina, - 250 mM de Sacarose, - em pH 5,5; ou - 7,5 mg/mL de anticorpo Abeta, - 0,02% em p/v de Tween 20, - 10 mM de L-histidina, -125 mM de Sacarose, - em pH 5,5; ou - 37,5 mg/mL de anticorpo Abeta, - 0,02% em p/v de Tween 20, -10 mM de L-histidina, - 125 mM de Trehalox, - em pH 5,5; ou - 37,5 mg/mL de anticorpo Abeta, - 0,01% em p/v de Tween 20, - 10 mM de L-histidina, - 125 mM de Trehalox, - em pH 5,5. ou - 75 mg/mL de anticorpo Abeta, - 0,02% em p/v de Tween 20, - 20 mM de L-histidina, - 250 mM de Trehalox, - em pH 5,5. ou - 75 mg/mL de anticorpo Abeta, - 0,02% em p/v de Tween 20, - 20 mM de L-histidina, - 250 mM de Manitol, - em pH 5,5. ou - 75 mg/mL de anticorpo Abeta, - 0,02% em p/v de Tween 20, - 20 mM de L-histidina, - 140 mM de Cloreto de sódio, - em pH 5,5. ou - 150 mg/mL de anticorpo Abeta, - 0,02% em p/v de Tween 20, - 20 mM de L-histidina, - 250 mM de Trehalox, - em pH 5,5. ou - 150 mg/mL de anticorpo Abeta, - 0,02% em p/v de Tween 20, - 20 mM de L-histidina, - 250 mM de Manitol, - em pH 5,5. ou - 150 mg/mL de anticorpo Abeta, - 0,02% em p/v de Tween 20, - 20 mM de L-histidina, - 140 mM de Cloreto de sódio, - em pH 5,5; ou -10 mg/mL de anticorpo Abeta, - 0,01% em p/v de Tween 20, - 20 mM de L-histidina, - 140 mM de Cloreto de sódio, - em pH 5,5.
32. Formulação liofilizada de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo fato de que compreende: - cerca de 1 a cerca de 200 mg/mL de anticorpo Abeta, - 0,04% em p/v de Tween 20, - 20 mM de L-histidina, - 250 mM de Sacarose, - em pH 5,5; ou - 75 mg/mL de anticorpo Abeta, - 0,04% em p/v de Tween 20, - 20 mM de L-histidina, - 250 mM de Sacarose, - em pH 5,5; ou - 75 mg/mL de anticorpo Abeta, - 0,02% em p/v de Tween 20, - 20 mM de L-histidina, - 250 mM de Sacarose, - em pH 5,5; ou - 15 mg/mL de anticorpo Abeta, - 0,04% em p/v de Tween 20, - 20 mM de L-histidina, - 250 mM de Sacarose, - em pH 5,5; ou - 75 mg/mL de anticorpo Abeta, - 0,04% em p/v de Tween 20, - 20 mM de L-histidina, - 250 mM de Trehalox, - em pH 5,5. ou - 75 mg/mL de anticorpo Abeta, - 0,02% em p/v de Tween 20, - 20 mM de L-histidina, - 250 mM de Trehalox, - em pH 5,5 ou - 20 mg/mL de anticorpo Abeta, - 0,011 % em p/v de Tween 20, - 5,3 mM de L-histidina, - 66,7 mM de Sacarose, - em pH 5,5.
33. Formulação líquida de acordo com a reivindicação 2 ou 31, caracterizada pelo fato de que compreende: - 10 mg/mL de anticorpo Abeta, - 0,01 % em p/v de Tween 20, - 20 mM de L-histidina, -140 mM de Cloreto de sódio, - em pH 5,5.
34. Formulação liofilizada de acordo com a reivindicação 3 ou 32, caracterizada pelo fato de que compreende: - 75 mg/mL de anticorpo Abeta, - 0,04% em p/v de Tween 20, - 20 mM de L-histidina, - 250 mM de Sacarose, - em pH 5,5.
35. Formulação liofilizada de acordo com a reivindicação 3 ou 32, caracterizada pelo fato de que compreende: - 20 mg/mL de anticorpo Abeta, - 0,011 % em p/v de Tween 20, - 5,3 mM de L-histidina, - 66,7 mM de Sacarose, - em pH 5,5.
36. Formulação de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 35, caracterizada pelo fato de que o anticorpo Abeta compreende pelo menos um sítio de ligação de antigeno que compreende uma asparagina glicosilada (Asn) na região variável de cadeia pesada (VH).
37. Formulação de acordo com qualquer uma das reivindicações1 a 36, caracterizada pelo fato de que o anticorpo Abeta é uma mistura definida de (a) anticorpo Abeta, em que um dos sítios de ligação de antigeno compreendem uma asparagina glicosilada (Asn) na região variável de cadeia pesada (VH); e (b) anticorpo Abeta, em que ambos sítios de ligação de antigeno compreendem uma asparagina glicosilada (Asn) na região variável de cadeia pesada (VH); e que está livre de ou compreende um anticorpo Abeta de extensão muito baixa, em que nenhum dos sítios de ligação de antigeno compreende uma asparagina glicosilada (Asn) na região variável de cadeia pesada (VH).
38. Formulação de acordo com a reivindicação 36 ou 37, caracterizada pelo fato de que a asparagina glicosilada (Asn) na região variável de cadeia pesada (VH) é uma asparagina glicosilada (Asn) na região CDR-2 de cadeia pesada (VH).
39. Formulação de acordo com qualquer uma das reivindicações1 a 38, caracterizada pelo fato de que o anticorpo Abeta compreende uma cadeia pesada como definida em SEQ ID NO: 1 e uma cadeia leve como definido em SEQ ID NO: 2.
40. Uso de uma formulação como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 39, caracterizado pelo fato de ser para a preparação de um medicamento útil para tratar doença de Alzheimer.
41. Invenção como anteriormente descrita.
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