BRPI0721141A2 - Vacinasdo vírus west nile (wnv) produzidas por plantas, vetores e sequências otimizadas de códons de plantas. - Google Patents

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "VACINAS DO VÍRUS WEST NILE (WNV) PRODUZIDAS POR PLANTAS, VETORES E SEQÜÊNCIAS OTIMIZADAS DE CÓDONS DE PLANTAS".

DESCRIÇÃO

REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDO RELACIONADO

Este pedido reivindica o benefício do Pedido Provisório dos Es- tados Unidos Série N0 60/871.518, depositado em 22 de dezembro de 2006, cuja descrição é por este incorporada por meio de referência em sua totali- dade, incluindo todas as figuras, tabelas e seqüências de aminoácido ou á- cido nucleico.

Esta invenção foi preparada com suporte governamental segun- do USDA-ARS CRADA Acordo N0 58-3K95-M-1040. O governo tem alguns direitos na invenção.

ANTECEDENTE DA INVENÇÃO

O entendimento da neutralização do vírus West Nile (WNV) por anticorpos vem do estudo de WNV e seus parentes próximos o vírus da en- cefalite de Saint Louis, o vírus da encefalite de Murray Valley (MVEV), e o vírus da encefalite de Japonesa, bem como parentes mais distantes tais co- mo o vírus da dengue, o vírus da febre amarela, e o vírus da encefalite transmitida pelo carrapato (TBEV). Fortes similaridades na seqüência das proteínas do envelope do flavivírus e a posição quase idêntica das cisteínas que formam ligações intramoleculares dentro das proteínas do envelope (Nowak et ai, 1987) sugerem que as proteínas do envelope de todos os fla- vivírus devem ter estruturas muito similares. Portanto, informações sobre qualquer flavivírus geralmente é aplicável aos outros.

Heinz e Kunz (1982, 1977) mostraram que flavivírus contêm so- mente três proteínas, a proteína do envelope (E)1 a proteína de membrana (M), e a proteína do capsídeo (C). Recentes estudos estruturais do vírus da dengue (Kuhn et ai, 2002) confirmaram isto e mostraram a relação física destas proteínas no vírion. Somente a proteína E é exposta sobre a superfí- cie do vírion (Kuhn et ai, 2002). Até o momento, foram resolvidas as estrutu- ras tridimensionais das proteínas E para WNV, TBEV, e dengue (Kuhn et ai, 2002; Mukhopadhyah et al., 2003; Rey et ai, 1995). Estas têm uma estrutura semelhante a dedo com três domínios claramente distintos, o domínio I es- tando no meio entre os domínios Il e III. Moléculas individuais de proteína E se estendem lisas através da superfície do vírion com pares de moléculas 5 estendidos ao lado uns dos outros em orientação oposta e três pares esten- didos lado a lado.

A proteína E de flavivírus é sintetizada como parte de uma poli- proteína de extensão do genoma que inclui todas as proteínas virais. Em seguida é liberada da poliproteína por clivagem proteolítica. Clivagens pre- 10 coces dentro da poliproteína liberam a proteína E ainda fixada a pré- membrana (pr) e proteínas M, a combinação das proteínas pr e M sendo conhecida como a proteína "prM". A proteína prM-E resultante é inserida na membrana do retículo endoplasmático onde começa a dobrar em sua con- formação madura. O vírus é agrupado em compartimentos intracelulares 15 com a prM-E sobre a superfície. Clivagens subsequentes separam as prote- ínas E e prM e clivam a prM produzindo a proteína M madura. O fragmento pr não é incorportado em vírions. A proteína E pode ter ou não seqüências de glicosilação e portanto pode ser ou não glicosilada (Hanna, et ai, 2005).

Flavivírus infectam células ligação à membrana celular, prova- velmente através de uma interação entre a seqüência RGD de proteína E domínio Ill e integrina da superfície celular (Lee et ai, 2000), e penetrando através do endossomas. Quando o endossoma acidifica, as proteínas do envelope do vírion sofrem alterações caras e irreversíveis em sua conforma- ção intra- e intermolecular. As 180 moléculas de proteína E individuais de- sassociam de seus dímeros, reorientam seus domínios e ligam para formar 60 picos triméricos que se projetam da membrana do vírion, inserem a ponta dos picos dentro da membrana endossômica, e agregam em 12 anéis pen- taméricos de picos triméricos que fundem a membrana de vírions com a membrana endossômica, deste modo permitindo que o capsídeo penetre no citoplasma da célula e inicie replicação (Bressanelli et ai, 2004). Está claro que a solubilização dos dímeros da superfície do vírion remove por ablação alguns epítopos relacionados com neutralização (Heinz et ai, 1991) mas não está claro como a redisposição e a trimerização altera sítios antigênicos de proteína E (Stiasny etal., 1996).

Como somente a proteína E é exposta sobre a superfície do ví- rion, anticorpos que ligam a e neutralizam vírions infecciosos intactos devem 5 ligar à proteína E. Isto foi comprovado mostrando o desenvolvimento de an- ticorpos neutralizantes em animais imunizados com proteínas purificadas a partir de vírus (Heinz et al., 1990) e proteínas virais produzidos em sistemas recombinantes (Bray et al., 1989; Heinz et al., 1986; Heinz et al., 1982; Jan et al., 1993; Konishi etal., 1992; Mason et al., 1991; Men etal., 1991; Pincus 10 et al., 1992; Schlesinger et al., 1992), e por experimentos de proteção passi- va com anticorpos monoclonais dirigidos contra a proteína E (revisado em Heinz etal., 1977, 1986; Roehrig 1986).

Se esperaria que anticorpos que ligam algumas áreas sobre a proteína E neutralizassem o vírus e anticorpos que ligam outras áreas não podem. De modo a discriminar entre a atividade de neutralização de anticor- pos que ligam a seqüência de aminoácidos primária daqueles que ligam a estrutura secundária e terciária da proteína E adequadamente dobrada, Wengler e Wengler (1989) mostraram que a redução de ligações dissulfeto para destruir a estrutura secundária e terciária da proteína removeu por a- blação a capacidade da proteína E de WNV de produzir anticorpos neutrali- zantes. Este experimento sugeriu fortemente que anticorpos neutralizantes ligam à estrutura conformacional secundária e terciária da proteína E ao in- vés da estrutura linear. Para confirmar isto, Roehrig et al. (1989) produziram peptídeos a partir de epítopos previstos de proteína E de MVEV e descobri- ram que somente um produziu anticorpos neutralizantes e somente em um nível baixo. Na verdade, estudos subsequentes mostraram que anticorpos monoclonais geralmente ligam ou proteína E nativa ou proteína E desnatu- rada e seus peptídeos (Guirakhoo et al., 1989; Holzmann et al., 1993; Roe- hrig et al., 1989). Somente anticorpos que ligam a estrutura nativa neutrali- zam o vírus.

Para mostrar exatamente quais áreas da proteína E são ataca- das por anticorpos neutralizantes, mutações em vírus que escaparam de neutralização por anticorpos monoclonais foram sequenciadas e mapeadas sobre a superfície da proteína E (revisado em Heinz etal., 1983; Heinz etal., 1990; Roehrig 1986). Estes dados permitiram a produção de modelos estru- turais brutos (Cammack et al., 1986; Kolaskar et al., 1999; Mandl et al., 5 1989; Roehrig et al., 1989; Roehrig et al.; 1983) que foram subsequentemen- te refinados paa mostrar que mutações mapeadas para todos os três domí- nios estruturais definidos por métodos cristalográicos de raios x (Cecilia et al., 1991; Gao et al., 1994; Hasegawa et al., 1992; Holzmann et al., 1997; Holzmann etal., 1993; Jiang etal., 1993; Lin et al., 1994; Mandl etal., 1989). 10 Isto sugere fortemente que anticorpos podem neutralizar flavivírus por liga- ção a qualquer um dos três domínios. Não obstante, a maioria dos estudos se focalizaram sobre o domínio Ill onde ocorrem muitas mutações que esca- pam de anticorpos monoclonais neutralizantes (Beasley et al., 2002). O do- mínio Ill também é o sítio de ligação para alguns anticorpos não- 15 neutralizantes (Sanchez et al., 2005). O domínio Ill pode ser isolado de ví- rions purificados como um fragmento resistente à tripsina (Winkler et al., 1987) ou gerados como uma proteína recombinante (Mason et al. 1989) na sua reatividade com anticorpos monoclonais neutralizantes é dependente da manutenção de sua estrutura conformacional por sua única ligação dissulfe- 20 to. Vários anticorpos parecem neutralizar WNV por ligação a um peptídeo que é exposto sobre o domínio I somente durante a transição de fusão de membrana (Kanai et al., 2006) ou um sítio que interfere com alterações es- truturais no domínio Ill (Nybakken etal., 2005).

BREVE SUMÁRIO DA INVENÇÃO O presente pedido proporciona várias composições de substân-

cias dirigidas para polipeptídeos do vírus West Nile (WNV) e fragmentos dos mesmos e polinucleotídeos, vetores e células hospedeiras transformadas que codificam, dirigem a expressão de, ou produzem polipeptídeos de WNV conforme determinado aqui, neste pedido de patente. Métodos para usar os 30 polipeptídeos e polinucleotídeos para a produção de reações imunes em indivíduos ou detectar a presença de WNV específica ou anticorpos neutrali- zantes também são proporcionados aqui, neste pedido de patente. BREVE DESCRICÁO DOS DESENHOS

A Figura 1 representa o plasmídeo pDAB2406 o qual contém o promotor do vírus do mosaico da veia da mandioca (CsVMV) descrito na publicação de patente internacional WO N0 97/48819 e uma região não tra- 5 duzida 3’ de estrutura de leitura aberta, ORF23 3'UTR (GenBank número de acesso X00493) v1. Localizados entre o promotor CsVMV e ORF23 3'UTR v1 são sítios únicos, Ncol e Saci, os quais foram usados para inserir o gene de interesse.

A Figura 2 representa o vetor pDAB2418. pDAB2418 contém a região de fixação de matriz RB7 (MAR) (Patente dos Estados Unidos n° 5.773.689; Patente dos Estados Unidos n° 5.773.695; Patente dos Estados Unidos n° 6.239.328, publicação de patente internacional WO N0 94/07902, e publicação de patente internacional WO N0 97/27207) e a unidade de trans- crição de planta onde o marcador de seleção vegetal fosfinotricin acetil transferase (PAT) (Patentes dos Estados Unidos Nos: 5.879.903; 5.637.489; 5.276.268; e 5.273.894) é dirigido pelo promotor AtUbiIO (Sun C.-W. et al., 1997; Norris, S.R. et al., 1993; Callis, J. et al, 1995) e flanqueado, a jusante por AtuORFI 3' UTR v3 (Patente dos Estados Unidos n° 5.428.147; Barker, R.F., et al., 1983; GenBank número de acesso X00493). Um único sítio Notl, localizado entre o gene RB7 MAR e o promotor vegetal AtUbiI 0, foi usado para clonar fragmentos genéticos de pDAB2406 contendo o promotor CsVMV1 gene de interesse, e ORF23 3’UTR v1.

A Figura 3 ilustra um vetor binário básico modificado, pDAB2407. Este vetor binário foi construído adicionando um Iigante Agel no único sítio BamHI de pBBV (Vetor Binário Básico) possibilitando ligação A- gel/Agel do antígeno de WNV e cassetes de expressão de marcadores sele- cionáveis entre as bordas de T-DNA.

A Figura 4 é uma representação do vetor binário de dicot do Ví- rus West Nile pDAB2475 o qual codifica uma proteína quimérica consistindo em membrana e peptídeo do envelope do Vírus West Nile com propensão para códon de tabaco (versão 2) com ER tendo por alvo os sinais de reten- ção v2 e v3 KDEL (SEQ ID NO: 12). A Figura 5 representa um vetor binário de dicot (pDAB2478) co- dificando uma proteína quimérica consistindo dos peptídeos v2 pré- membrana, de membrana e de envelope v2 do Vírus West Nile com propen- são para códon de tabaco com ER tendo por alvo os sinais de retenção v2 e v3 KDEL (SEQ ID NO: 8).

A Figura 6 refere-se a um vetor binário de dicot, pDAB2481, co- dificando uma proteína quimérica consistindo dos peptídeos do Vírus West Nile com propensão para códon de tabaco pré-membrana v2, de membrana v2, e de envelope com um sítio de N-glicosilação mutado (versão 4) com ER tendo por alvo os sinais de retenção v2 e KDEL v3 (SEQ ID NO: 10).

As Figuras 7 a 11 representam um vetor de destinação, pDAB3736 (Figura 7), e quatro vetores doadores, pDAB3912 (Figura 8), pDAB3914 (Figura 9), pDAB3916 (Figura 10), e pDAB3724 (Figura 11) usa- dos para contruir nove constructos binários com a tecnologia Gateway®.

A Figura 12 representa vetor binário da Gateway® WNV ME,

pDAB3920. pDAB3920 codifica T-DNA Borda B / RB7 MAR v3 / CsVMV promotor v2 / WNV ME v2 / Atu ORF23 3’ UTR v1 / AtUbiIO promotor v2 / PAT v3 / Atu ORF1 3’ UTR v3 / Múltiplo T-DNA Borda A.

A Figura 13 ilustra vetor binário da Gateway®, pDAB3922. pDAB3922 contém os seguintes elementos: T-DNA Borda B / RB7 MAR v3 / AtuMAS 40CS promotor v4 / zeína de 15 kDa ER v2-WNV ME v2-KDELv3 / Atu ORF23 3' UTR v1 / AtUbiIO promotor v2 / PAT v3 / Atu ORF1 3' UTR v3 / Múltiplo T-DNA Borda A.

A Figura 14 representa vetor binário do Vírus West Nile da Ga- 25 teway™, pDAB3924. O vetor pDAB3924 contém os seguintes elementos: T- DNA Borda B / RB7 MAR v3 / At UbiIO promotor (Genbank Acesso n° L05363) v2 / zeína de 15 kDa ER v2-WNV ME v2-KDEL v3 / Atu ORF23 3' UTR v1 / AtUbiIO promotor v2 / PAT v3 / Atu ORF1 3' UTR v3 / Múltiplo T- DNA Borda A.

A Figura 15 se refere a um vetor binário da Gateway®,

pDAB3927 contendo os seguintes elementos: T-DNA Borda B / RB7 MAR v3 / CsVMV promotor v2 / zeína de 15 kDa ER sinal v2-WNV ME v2 / Atu ORF23 3' UTR ν1 / AtUbiIO promotor ν2 / PAT v3 / Atu ORF1 3' UTR v3 / Múltiplo T-DNA Borda A.

A Figura 16 proporciona vetor binário da Gateway®, pDAB3929. pDAB3929 contém T-DNA Borda B / RB7 MAR v3 / CsVMV promotor v2 / Nt osm 5' UTR v3 / zeína de 15 kDa ER v2-WNV ME v2-KDEL v3 / Nt osm 3' UTR v3 / Atu ORF23 3' UTR v1 / AtUbiIO promotor v2 / PAT v3 / Atu ORF1 3’ UTR v3 / Múltiplo T-DNA Borda A.

A Figura 17 é vetor binário da Gateway®, pDAB3934. Este vetor contém os seguintes elementos: T-DNA Borda B / RB7 MAR v3 / ORF25 / 26 10 3’UTR / KDELv3 / WNV ME v3 / zeína de 15 kDa ER signal v2 (SEQ ID NO: 14) / AtuMAS 40CS promotor v4 / zeína de 15 kD ER sinal v2- WNV ME v2- KDELv3 / Atu ORF23 3' UTR v1 / AtUbiIO promotor v2 / PAT v3 / Atu ORF1 3' UTR v3 / Múltiplo T-DNA Borda A.

A Figura 18 proporciona uma representação do vetor binário da 15 Gateway®, pDAB3941. pDAB3941 contém os seguintes componentes: T- DNA Borda B / RB7 MAR v3 / CsVMV promotor v2 / zeína de 15 kD ER v2- WNV ME V2-KDEL v3 / Atu ORF23 3'UTR v1 / AtUbi3 promotor v2 / zeína de 15 kD ER v2-WNV ME v3-KDELv3 / Atu ORF23 3’ UTR v1 / AtUbiIO promo- tor v2 / PAT v3 / Atu ORF1 3' UTR v3 / Múltiplo T-DNA Borda A.

A Figura 19 proporciona vetor binário da Gateway®, pDAB3943.

Este vetor contém os seguintes elementos: T-DNA Borda B / RB7 MAR v3 / CsVMVv2 / WNV M v2 E com sítio de glicosilação modificado (v5) / Atu ORF23 3’ UTR v1 / AtUbiIO promotor v2 / PAT v3 / Atu ORF1 3’ UTR v3 / Múltiplo T-DNA Borda A.

A Figura 20 proporciona expressão de proteína E de eventos de

calo do Dia 14 transformados com pDAB2475 (dirigido para ER, ME Versão 2, KDEL), conforme detectado por ELISA.

A Figura 21 proporciona expressão de proteína E de eventos de calo do Dia 14 transformados com pDAB2478 (dirigido para ER, prME Ver- são 2, KDEL) conforme detectado por ELISA.

A Figura 22 proporciona expressão de proteína E de eventos de calo do Dia 14 transformados com pDAB2481 (dirigido para ER, prME com δ sítio de glicosilação modificado (Versão 4), KDEL) conforme detectado por ELISA.

A Figura 23 compara os níveis de expressão entre eventos transformados com pDAB2475, pDAB2478, e pDAB2481. Um potencial de recuperação de proteína significativamente maior de pDAB2475 é indicado na figura.

A Figura 24 representa amostras de eventos selecionados que foram analisados por Western blot (calo do dia 14). De muitos dos eventos pDAB2475, proteína E de extensão total foi detectada no tamanho esperado de ~54 kDa da proteína E de virion maturo autêntico.

As Figuras 25 e 26 ilustram que menos eventos expressando a proteína E de extensão total foram detectados com os constructos pDAB2478 e pDAB2481.

A Figura 27 compara Resultados de ELISA do Calo do Dia 14 de Todos os Eventos de pDAB3920, pDAB3922, pDAB3924, pDAB3927, pDAB3929, pDAB3943, pDAB3934 e pDAB3941.

A Figura 28 representa amostras de calo do Dia 14 de eventos de pDAB3920 e pDAB3922 analisados por Western blot.

A Figura 29 representa amostras de calo do Dia 14 de eventos de pDAB3924 e pDAB3927 analisados por Western blot.

A Figura 30 representa amostras de calo do Dia 14 de eventos de pDAB3929 e pDAB3934 analisados por Western blot.

A Figura 31 ilustra perfis de fermentação on-line para evento de WNV 1622-207 durante uma rodada de fermentação de STR de 10 litros (Lo- te ID WNV SRD05006). A redução na taxa de velocidade do agitador resul- tou na redução na captação de oxigênio próximo do término da fermentação.

A Figura 32 proporciona uma análise dos resíduos da fermenta- ção para o lote ID WNV SRD05006.

A Figura 33 proporciona uma análise dos resíduos da fermenta- ção para o lote ID WNV SRD05007.

A Figura 34 ilustra a cinética da produção de ME em células de suspensão de NT-1 de N. tobacum conforme determinado durante um perío- do de 9 dias para Vírus West Nile recombinante eventos 1622-207 e 1622- 210. É representada a produção de proteína do envelope de WNV durante uma fermentação de reactor de tanque agitado de 218 horas (dia 9,08; sub- trair a fawse de 42 horas pré-inoculação do tempo do eixo x) de 10 litros. A 5 produtividade volumétrica máxima de eventos de ME 1622-210 e 1622-207 ocorreu em 164 horas (206-42 horas), e 188 horas (230-42 horas) pós- inoculação respectivamente.

A Figura 35 proporciona uma representação gráfica de títulos séricos neutralizantes de WNV de um estudo de modelo clínico de camun- dongo (Estudo I). A figura foi gerada alterando títulos de neutralização de >2560 a 2560 e títulos de <20 a 20 e calculando o título médio geométrico de neutralização sérica (GMT) para cada grupo de tratamento.

A Figura 36 mostra a reação variável demonstrada por diferentes doses de antígeno e formulação com diferentes adjuvantes (Estudo II).

BREVE DESCRIÇÃO DAS SEQÜÊNCIAS

A SEQ ID NO: 1 é uma seqüência de DNA nativa de isolato fla- mingo de vírus do Nilo Ocidental "West Nile Virus" de GenBank Acesso n° AF196835, codificando prM-, M-, e E-peptídeos (Versão 1). A região codifi- cante de peptídeo prM-M-E de WNV nativo tem 2004 bases de extensão e 20 codifica o peptídeo prM (bases 1-276), o peptídeo M (bases 277-501) e o Peptídeo E (bases 502-2004).

A SEQ ID NO: 2 é uma seqüência de aminoácidos de peptídeos prM, M, e E nativos codificada por SEQ ID NO: 1. O peptídeo prM é aminoá- cidos 1-92, o peptídeo M é aminoácidos 93-167 e o peptídeo E é aminoáci- dos 168-668.

A SEQ ID NO: 3 é uma seqüência de DNA otimizada por tabaco para peptídeos prM, MeE peptídeos (Versão 2). A SEQ ID NO: 3 tem 2004 bases de extensão e o peptídeo prM é codificado pelas bases 1-276, o pep- tídeo M é codificado pelas bases 277-501 e o peptídeos E é codificado pelas bases 502-2004.

A SEQ ID NO: 4 é uma seqüência de DNA otimizada por tabaco para peptídeos prM, MeE com sítio de N-glicosilação mutado (Versão 4). O códon de prolina é nos nts 967-969 e a seqüência tem 2004 bases de exten- são. O peptídeo prM é codificado pelas bases 1-276, o peptídeo M é codifi- cado pelas bases 277-501 e o peptídeo E é codificado pelas bases 502- 2004.

5 A SEQ ID NO: 5 é uma seqüência de aminoácidos de peptídeos

prM, M, e E codificados por SEQ ID NO: 4 e contendo um sítio de N- glicosilação mutado. O resíduo prolina está na posição 323 e a seqüência tem 668 aminoácidos de extensão. O peptídeo prM é aminoácidos 1-92, o peptídeo M é aminoácidos 93-167 e o peptídeo E é aminoácidos 168-668.

A SEQ ID NO: 6 é uma seqüência de DNA otimizada por tabaco

codificando peptídeos MeE (Versão 2). A seqüência tem 1728 bases de extensão e o peptídeo M é codificado pelas bases 1-225. O peptídeo E é codificado pelas bases 226-1728.

A SEQ ID NO: 7 é uma seqüência de DNA otimizada por tabaco codificando peptídeos MeE (Versão 3). Esta seqüência tem 1728 bases de extensão e o peptídeo M é codificado pelas bases 1-225. O peptídeo E é codificado pelas bases 226-1728.

A SEQ ID NO: 8 é uma seqüência de DNA otimizada por tabaco codificando proteína quimérica incluindo zeína de 15 kDa ER tendo por alvo 20 peptídeo de sinal, peptídeos prM, MeE (Versão 2), e KDEL. A seqüência tem 2106 bases de extensão e o sinal tendo por alvo ER de 15 kDa é codifi- cado pelas bases 1-66. O peptídeo prM é codificado pelas bases 67-342, o peptídeo M é codificado pelas bases 343-567, o peptídeo E é codificado pe- las bases 568-2070, o sinal de retenção do ER KDEL é codificado pelas ba- 25 ses 2071-2082 e seis paradas de estrutura estão localizadas nas bases 2083-2106.

A SEQ ID NO: 9 é uma seqüência de aminoácidos da proteína de fusão quimérica codificada por SEQ ID NO: 8. A proteína de fusão tem 694 aminoácidos de extensão e contém um peptídeo tendo por alvo ER zeí- 30 na de 15 kDa (aminoácidos 1-22), o peptídeo prM (aminoácidos 23-114), o peptídeo M (aminoácidos 115-189), o peptídeo E (aminoácidos 190-690), um sítio de N-glicosilação (aminoácidos 343-345) e o sinal de retenção do ER KDEL (aminoácidos 691-694).

A SEQ ID NO: 10 é uma seqüência de DNA otimizada por taba- co codificando proteína quimérica incluindo peptídeo de sinal tendo por alvo ER zeína de 15 kDa, peptídeos prM, MeE com sítio de N-glicosilação mu- 5 tado (Versão 4) e KDEL. A seqüência tem 2106 bases de extensão e o sinal tendo por alvo ER de 15 kDa é codificado pelas bases 1-66, o peptídeo prM é codificado pelas bases 67-342, o peptídeo M é codificado pelas bases 343- 567, o peptídeo E é codificado pelas bases 568-2070, o sinal de retenção do ER KDEL é codificado pelas bases 2071-2082 e seis paradas de estrutura 10 estão localizadas nas bases 2083-2106.

A SEQ ID NO: 11 é uma seqüência de aminoácidos da proteína de fusão quimérica codificada por SEQ ID NO: 10. O polipeptídeo tem 694 aminoácidos de extensão e o peptídeo tendo por alvo ER zeína de 15 kDa está localizado nos aminoácidos 1-22. O peptídeo prM é encontrado nos a- 15 minoácidos 23-114, o peptídeo M é encontrado nos aminoácidos 115-189, o peptídeo E é encontrado nos aminoácidos 190-690 e sítio de N-glicosilação mutado é nos aminoácidos 343-345 e o sinal de retenção do ER KDEL é aminoácidos 691-694.

A SEQ ID NO: 12 é uma seqüência de DNA otimizada por taba- 20 co codificando proteína quimérica incluindo peptídeo de sinal tendo por alvo ER zeína de 15 kDa, peptídeos MeE (Versão 2) e KDEL. A seqüência tem 1830 bases de extensão e o sinal tendo por alvo ER de 15 kDa é codificado pelas bases 1-66, o peptídeo M é codificado pelas bases 67-291, o peptídeo E é codificado pelas bases 292-1794, o sinal de retenção do ER KDEL é co- 25 dificado pelas bases 1795-1806 e as seis paradas de estrutura compreen- dem as bases 1807-1830.

A SEQ ID NO: 13 é uma seqüência de aminoácidos da proteína de fusão quimérica codificada por SEQ ID NO: 12. Esta seqüência tem 602 aminoácidos de extensão e o peptídeo tendo por alvo ER zeína de 15 kDa é 30 aminoácidos 1-22. O peptídeo M está localizado nos aminoácidos 23-97, o peptídeo E está localizado nos aminoácidos 98-598 e o sinal de retenção do ER KDEL é encontrado nos aminoácidos 599-602. A SEQ ID NO: 14 é uma seqüência de DNA otimizada por taba- co codificando proteína quimérica incluindo peptídeo de sinal tendo por alvo ER zeína de 15 kDa, peptídeos MeE (Versão 3) e KDEL. Esta seqüência tem 1832 bases de extensão, o sinal tendo por alvo ER de 15 kDa é codifi- 5 cado pelas bases 6-68, o peptídeo M é codificado pelas bases 69-293, o peptídeo E é codificado pelas bases 294-1796, o sinal de retenção do ER KDEL é codificado pelas bases 1797-1808 e seis paradas de estrutura com- preendem as bases 1809-1832.

A SEQ ID NO: 15 é uma seqüência de aminoácidos da proteína 10 de fusão quimérica codificada por SEQ ID NO: 14. A seqüência tem 601 a- minoácidos de extensão e o peptídeo tendo por alvo ER zeína de 15 kDa é aminoácidos 1-21. O peptídeo M está localizado nos aminoácidos 22-96, o peptídeo E está localizado nos aminoácidos 97-597 e o sinal de retenção do ER KDEL é encontrado nos aminoácidos 598-601.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

O presente pedido proporciona as seguintes composições de substâncias não-limitantes bem como métodos para usar estas composições de substâncias na produção de polipeptídeos imunogênicos e métodos para induzir reações imunes em indivíduos. Portanto, a presente invenção pro- porciona várias composições de substâncias compreendendo:

a) polipeptídeos isolados, purificados, e/ou recombinantes com- preendendo SEQ ID NO: 5, 9, 11, 13 ou 15;

b) um fragmento do polipeptídeo determinado em SEQ ID NO: 5, 9, 11, 13, 15 ou um fragmento de SEQ ID NO: 5, 9, 11, 13 ou 15 que é "de Y

a Z", em que Y é o aminoácido N-terminal da seqüência especificada e Z é o aminoácido C-terminal da seqüência especificada. Portanto, para SEQ ID NO: 5, cada fragmento pode ter entre 5 aminoácidos consecutivos e 667 a- minoácidos consecutivos de extensão. Cada fragmento contendo entre 5 e 693 aminoácidos consecutivos de SEQ ID NO: 9 e 11 são especificamente 30 contemplados pela presente invenção. Igualmene, para SEQ ID NO: 13, ca- da fragmento de polipeptídeo entre 5 e 601 aminoácidos consecutivos é es- pecificamente contemplado pela presente invenção. Adicionalmente, cada fragmento de polipeptídeo abarcando entre 5 e 600 aminoácidos consecuti- vos de SEQ ID NO: 15 também é especificamente contemplado pela presen- te invenção. Fragmentos "de Y a Z", em que Y é o aminoácido N-terminal da seqüência especificada e Z é o aminoácido C-terminal de uma seqüência 5 especificada também proporcionada na Tabela 9 para SEQ ID NO: 5, Tabela 10 para SEQ ID NOs: 9 e 11, Tabela 11 para SEQ ID NO: 13 e Tabela 12 para SEQ ID NO: 15. Fragmentos de polipeptídeos conforme determinado neste pedido têm no mínimo uma atividade biológica que é substancialmente a mesma que a atividade biológica correspondente do polipeptídeo de ex-

tensão total de SEQ ID NO: 5, 9, 11, 13 ou 15. Vários outros fragmentos de polipeptídeos exemplares são determinados nas Tabelas 15 ou 16;

c) um peptídeo E conforme determinado em qualquer uma das SEQ ID NOs: 5, 9, 11, 13 ou 15 ou um fragmento de um E-peptídeo confor- me determinado em qualquer uma das SEQ ID NOs: 5, 9, 11, 13 ou 15 que

produz uma reação de anticorpos neutraIizantes quando administrado a um indivíduo;

d) um polipeptídeo de acordo com qualquer uma das modalida- des a), b) ou c) que compreende adicionalmente uma seqüência de polipep- tídeo heteróloga;

e) um polipeptídeo derivado de planta de acordo com qualquer

uma das modalidades a), b), c) ou d);

f) uma composição compreendendo um veículo e um polipeptí- deo conforme determinado em qualquer uma de a), b), c), d) ou e), em que o referido veículo é material celular do sistema de expressão em planta, mamí-

fero ou bacteriano (opcionalmente suspendido em um tampão), um adjuvan- te ou um excipiente farmaceuticamente aceitável;

g) uma seqüência de polinucleotídeos codificando um polipeptí- deo compreendendo SEQ ID NO: 5, 9, 11, 13 ou 15 ou codificando um ou mais fragmentos de polipeptídeo de SEQ ID NOs: 5, 9, 11, 13 ou 15 confor-

me determinado em (b) ou (c), opcionalmente em que a referida seqüência de polinucleotídeos tem um teor de G+C de no mínimo 40% e menos de 50% ou um teor de G+C conforme determinado na Tabela 13; h) uma seqüência de polinucleotídeos que é no mínimo 70% (ou uma percentagem conforme especificado na Tabela 14) idêntica à SEQ ID NO: 1, codifica um polipeptídeo compreendendo SEQ ID NO: 2 e tem um teor de G+C dentre cerca de 40% e cerca de 50% (ou um teor de G+C es-

pecífico conforme especificado na Tabela 13);

i) uma seqüência de polinucleotídeos no mínimo 8 nucleotídeos consecutivos de uma seqüência de polinucleotídeos conforme determinado em (g) ou (h);

j) uma seqüência de polinucleotídeos compreendendo SEQ ID NO: 3, 4, 6, 7, 8, 10, 12, ou 14 ou um fragmento de no mínimo 8 nucleotí- deos consecutivos de SEQ ID NO: 3, 4, 6, 7, 8, 10, 12, ou 14;

k) um polinucleotídeo que é complementar aos polinucleotídeos determinados em (g), (h), (i), ou (j);

I) um polinucleotídeo que hibridiza sob baixa, intermediária ou elevada estringência com uma seqüência de polinucleotídeos conforme de- terminado em (g), (h), (i), (i) ou (k);

m) um constructo genético compreendendo uma seqüência de polinucleotídeos conforme determinado em (g), (h), (i), (i) ou (k);

n) um vetor compreendendo um polinucleotídeo ou constructo genético conforme determinado em (g), (h), (i), (i), Q), (k) ou (I);

o) uma célula hospedeira compreendendo um vetor conforme determinado em (n), um constructo genético conforme determinado em (m), ou um polinucleotídeo conforme determinado em qualquer uma de (g), (h), (i), (j)ou(k);

p) uma planta transgênica, célula de planta, ou parte de planta

compreendendo um vetor conforme determinado em (n), um constructo ge- nético conforme determinado em (m) ou um polinucleotídeo conforme de- terminado em qualquer um de (g), (h), (i), (j) ou (k); ou

q) uma sonda compreendendo um polinucleotídeo de acordo com (g), (h), (i), (j), (k) ou (I) e, opcionalmente, uma etiqueta ou marcador.

No contexto da presente invenção, os termos "oligopeptídeo", "polipeptídeo", "peptídeo" e "proteína" podem ser usados de modo intercam- biável; no entanto, deve ser entendido que a invenção não se refere ao poli- peptídeos em forma natural, isto é, não estão em seu ambiente natural mas que os polipeptídeos podem ter sido isolados ou obtidos por purificação a partir de fontes naturais ou obtidos de células hospedeiras preparadas por 5 manipulação genética (por exemplo, os polipeptídeos, ou fragmentos dos mesmos, são produzidos de modo recombinante por células hospedeiras, ou por síntese química). Polipeptídeos de acordo com a presente invenção também podem conter aminoácidos não-naturais, conforme será descrito abaixo. Os termos "oligopeptídeo", "polipeptídeo", "peptídeo" e "proteína" 10 também são usados, na presente especificação, para designar uma série de resíduos, tipicamente L-aminoácidos, conectados uns aos outros, tipicamen- te por ligações de peptídeos entre os grupamentos Oamino e carboxila de aminoácidos adjacentes. Elementos Iigantes podem ser unidos aos polipep- tídeos da presente invenção através de ligações de peptídeos ou através de 15 ligações químicas (por exemplo, elementos Iigantes químicos heterobifun- cionais) conforme determinado abaixo. Adicionalmente, os termos "aminoá- cido(s)" e "resíduo(s)" podem ser usados de modo intercambiável.

No contexto tanto de polipeptídeos quanto de polinucleotídeos, o termo "sucessivo" pode ser usado de modo intercambiável com o termo "consecutivo" ou a expressão "trecho contíguo" ("span contíguo") do início ao fim do presente pedido. Portanto, em algumas modalidades, um fragmen- to de polinucleotídeo pode ser referido como "um trecho contíguo de no mí- nimo X nucleotídeos, em que X é qualquer valor inteiro iniciando com 5; o limite superior para fragmentos conforme determinado aqui, neste pedido de patente, é um nucleotídeo menos do que o número total de nucleotídeos en- contrado na seqüência de extensão total codificando um polipeptídeo em particular (por exemplo, um polipeptídeo compreendendo SEQ ID NO: 9). Um fragmento de polipeptídeo, por exemplo, pode ser referido como "um trecho contíguo de no mínimo X aminoácidos, em que X é qualquer valor inteiro iniciando com 5; o limite superior para os fragmentos de polipeptídeo referidos é um aminoácido menos do que o número total de aminoácidos encontrado na seqüência de extensão total de um polipeptídeo em particular (por exemplo, 667 para SEQ ID NO: 5, 693 para SEQ ID NO: 9 e 11, 601 aminoácidos para SEQ ID NO: 13 e 600 aminoácidos para SEQ ID NO: 15). Conforme usado aqui, neste pedido de patente, o termo "inteiro" se refere a números inteiros no sentido matemático.

5 "Seqüência de nucleotídeo", "polinucleotídeo" ou "ácido nuclei-

co" pode ser usado de modo intercambiável e são entendidos como indican- do, de acordo com a presente invenção, ou um DNA de filamento duplo, um DNA de filamento único ou produtos da transcrição dos DNAs referidos (por exemplo, moléculas de RNA). Também deve ser entendido que a presente 10 invenção não se refere a seqüências de polinucleotídeos genômicas em seu ambiente natural ou estado natural. As seqüências de ácido nucleico, polinu- cleotídeo, ou nucleotídeos da invenção podem ser isoladas, purificadas (ou parcialmente purificadas), por métodos de separação incluindo, mas não limitados à, cromatografia de permuta iônica, cromatografia de exclusão de 15 tamanho molecular, ou por métodos de engenharia genética tais como am- plificação, hibridização subtrativa, clonagem, subclonagem ou síntese quími- ca, ou combinações destes métodos de engenharia genética. Os termos "vacina de polinucleotídeo" e "vacina de DNA" também pode ser usado de modo intercambiável aqui, neste pedido de patente.

Os termos "compreendendo", "consistindo em" e "consistindo

essencialmente de" são definidos de acordo com seu significado de via. Os termos podem ser substituídos uns pelos outros do início ao fim do presente pedido de modo a agregar o significado específico associado com cada ter- mo. As expressões "isolado" ou "biologicamente puro" se referem a material 25 que é substancialmente ou essencialmente livre de componentes os quais normalmente acompanham o material conforme é encontrado em seu estado nativo. Portanto, peptídeos isolados de acordo com a invenção preferencial- mente não contêm materiais normalmente associados com os peptídeos em seu ambiente in situ. "Encadear" ou "unir" se refere a quaisquer métodos 30 conhecidos na técnica para conectar funcionalmente peptídeos, incluindo, sem limitação, fusão recombinante, ligação covalente, ligação dissulfeto, ligação iônica, ligação de hidrogênio, e ligação eletrostática. Portanto, a presente invenção proporciona polipeptídeos com- preendendo SEQ ID NOs: 5, 9, 11, 13 ou 15 e/ou fragmentos de polipeptídeo de SEQ ID NOs: 5, 9, 11, 13 ou 15. Fragmentos de polipeptídeos, de acordo com a presente invenção, compreendem um trecho contíguo de no mínimo 5 5 aminoácidos consecutivos de SEQ ID NOs: 5, 9, 11, 13 ou 15. Fragmentos de polipeptídeos de acordo com a presente invenção pode ser qualquer nú- mero inteiro de extensão de no mínimo 5 aminoácidos consecutivos a 1 ami- noácido menos do que um polipeptídeo de extensão total de SEQ ID NO: 5, 9, 11, 13 ou 15. Fragmentos de SEQ ID NO: 5 podem conter qualquer núme- 10 ro (inteiro) de aminoácidos consecutivos entre, e incluindo, 5 e 667. Para SEQ ID NO: 9 ou 11 um fragmento de polipeptídeo é qualquer número (intei- ro) de aminoácidos consecutivos entre, e incluindo, 5 e 693. Para SEQ ID NO: 13, um fragmento de polipeptídeo é qualquer número (inteiro) de ami- noácidos consecutivos entre, e incluindo, 5 e 601. Para SEQ ID NO: 15, um 15 fragmento de polipeptídeo é qualquer número (inteiro) de aminoácidos con- secutivos entre, e incluindo 5 e 600 aminoácidos.

Cada fragmento de polipeptídeo da presente invenção também pode ser descrito em termos de suas posições N-terminal e C-terminal. Adi- cionalmente, modalidades de fragmentos de polipeptídeos descritos aqui, neste pedido de patente, podem ser "no mínimo", "igual a", "igual a ou me- nos de", "menos de", "no mínimo_mas não mais de_” ou "de Y a Z",

em que Y é o aminoácido N-terminal da seqüência especificada e Z é o ami- noácido C-terminal da seqüência especificada, o fragmento tem no mínimo 5 aminoácidos de extensão, e Y e Z são qualquer número inteiro especificado 25 (ou selecionado entre) os inteiros identificados nas tabelas especificando as extensões de fragmentos correspondentes para cada polipeptídeo revelado aqui, neste pedido de patente, (vide as Tabelas 9, 10, 11, 12, 15, e 16 [as posições listadas nas tabelas correspondem à posição de aminoácido con- forme proporcionado na listagem de seqüência anexada]). Conforme é evi- 30 dente na Tabela 10, o aminoácido N-terminal para os fragmentos de SEQ ID NOs: 9 e 11 pode ser qualquer número inteiro de 1 a 690 e o aminoácido C- terminal é qualquer número inteiro de 5 a 694 (dependendo da extensão do fragmento a qual deve ser qualquer número (inteiro) de aminoácidos conse- cutivos entre, e incluindo, 5 e 694). Para fragmentos de SEQ ID NO: 5 (mos- trada na Tabela 9), o aminoácido N-terminal pode ser qualquer número intei- ro entre 1 e 664 e o aminoácido C-terminal é qualquer número inteiro de 5 a 5 667 (dependendo da extensão do fragmento a qual deve ser qualquer núme- ro (inteiro) de aminoácidos consecutivos entre, e incluindo, 5 e 667). Com respeito a fragmentos de SEQ ID NO: 13 (ilustrada na Tabela 11), o aminoá- cido N-terminal pode ser qualquer número inteiro entre 1 e 598 e o aminoá- cido C-terminal é qualquer número inteiro de 5 a 602 (dependendo da exten- 10 são do fragmento a qual é qualquer número (inteiro) de aminoácidos conse- cutivos entre, e incluindo, 5 e 601 aminoácidos). Para SEQ ID NO: 15 (pro- porcionada na Tabela 12), o aminoácido N-terminal pode ser qualquer núme- ro inteiro entre 1 e 597 e o aminoácido C-terminal é qualquer número inteiro de 5 a 601 (dependendo da extensão do fragmento a qual é qualquer núme- 15 ro (inteiro) de aminoácidos consecutivos entre, e incluindo, 5 e 600 aminoá- cidos). Observa-se que todas as faixas usadas para descrever qualquer mo- dalidade da presente invenção são inclusivas a menos que especificamente determinado de modo diverso e que fragmentos de um dado polipeptídeo pode ser qualquer número inteiro de extensão, contanto que a extensão do 20 fragmento de polipeptídeo seja no mínimo um aminoácido mais curto do que o polipeptídeo identificado na SEQ ID NO: 5, 9, 11, 13 ou 15. Para ilustrar este conceito, são proporcionados os quatro fragmentos proporcionados pe- la Tabela 12 que têm 598 aminoácidos de extensão. Portanto, os vários fragmentos de polipeptídeo são definidos como: onde Y é posição 1 de SEQ 25 ID NO: 15, Z é posição 598 de SEQ ID NO: 15 (o peptídeo tem 598 aminoá- cidos de extensão); onde Y é posição 2 de SEQ ID NO: 15, Z é posição 599 de SEQ ID NO: 15 (o peptídeo tem 598 aminoácidos de extensão); onde Y é posição 3 de SEQ ID NO: 15, Z é posição 600 de SEQ ID NO: 15 (o peptí- deo tem 598 aminoácidos de extensão); e onde Y é posição 4 de SEQ ID 30 NO: 15, Z é posição 601 de SEQ ID NO: 15 (o peptídeo tem 598 aminoáci- dos de extensão).

A presente invenção também proporciona vários fragmentos de polipeptídeo (compreendendo trechos contíguos ou trechos consecutivos de no mínimo cinco aminoácidos consecutivos) que abarcam resíduos particula- res de SEQ ID NO: 5, 9, 11, 13 ou 15. Para SEQ ID NOs: 9 e 11, fragmentos preferenciais incluem os de no mínimo cinco aminoácidos consecutivos que 5 incluem no mínimo um dos aminoácidos nas posições 1-22 [isto é, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 ou todos os 22 dos aminoácidos], no mínimo um, dois ou todos os três dos aminoácidos nas posições 343-345 de SEQ ID NOs: 9 ou 11, e no mínimo um, dois, três ou todos os quatro dos aminoácidos 691 a 694 conforme determinado em SEQ 10 ID NO: 9 ou 11. Exemplos não-limitantes ilustrando algumas destas combi- nações de aminoácidos são determinados na Tabela 15 ou 16. Para SEQ ID NO: 5, algumas modalidades proporcionam quaisquer dos fragmentos de no mínimo cinco aminoácidos consecutivos que abarcam o aminoácido 323. Para SEQ ID NO: 13, várias modalidades da invenção proporcionam frag- 15 mentos de polipeptídeo de no mínimo cinco aminoácidos consecutivos que abarcam ou incluem: no mínimo um dos aminoácidos nas posições 1-22 de SEQ ID NO: 13; e/ou no mínimo um, dois, três, ou todos os quatro dos ami- noácidos nas posições 599-602 de SEQ ID NO: 13. Referindo-se à SEQ ID NO: 15, fragmentos de polipeptídeo exemplares incluem os que abarcam, ou 20 incluem no mínimo um dos aminoácidos nas posições 1-21 e/ou 598-601 de SEQ ID NO: 15. Fragmentos de polipeptídeos adicionais também são deter- minados nas Tabelas 15 e 16. Em alguns aspectos da invenção, fragmentos de polipeptídeo preferenciais são a seqüência de peptídeo E completa identi- ficada nas SEQ ID NOs: 5, 9, 11, 13 ou 15.

Fragmentos, conforme descrito aqui, neste pedido de patente,

podem ser obtidos clivando os polipeptídeos da invenção com uma enzima proteolítica (tal como tripsina, quimotripsina, ou colagenase) ou com um rea- gente quiímico, tal como brometo de cianogênio (CNBr). Alternativamente, fragmentos de polipeptídeo podem ser gerados em um ambiente altamente 30 acidífero, por exemplo, em pH 2,5. Os fragmentos de polipeptídeo refridos podem ser igualmente bem preparados por síntese química ou usando hos- pedeiros transformados com um vetor de expressão de acordo com a inven- ção. As células hospedeiras transformadas contêm um ácido nucleico, per- mitindo a expressão destes fragmentos, sob o controle de elementos apro- priados para regulação e/ou expressão do fragmentos de polipeptídeo.

Em algumas modalidades preferenciais, fragmentos dos polipep- tídeos revelados aqui, neste pedido de patente, retêm no mínimo uma pro- priedade biológica ou atividade biológica do polipeptídeo de extensão total do qual os fragmentos são derivados (os fragmentos referidos também po- dem ser referidos como "fragmentos biologicamente ativos". Portanto, tanto os polipeptídeos de extensão total quanto os fragmentos dos polipeptídeos proporcionados por SEQ ID NO: 5, 9, 11, 13 ou 15 têm uma ou mais das seguintes propriedades ou atividades biológicas: a capacidade de: 1) ligar especificamente a anticorpos específicos para SEQ ID NO: 5, 9, 11, 13 ou 15; 2) ligar especificamente anticorpos encontrados em um animal ou huma- no infectado com vírus West Nile e/ou anticorpos que neutralizam vírus in- feccioso West Nile (a capacidade do vírus infectar um hospedeiro ou célula- alvo); a capacidade para ligar a, e ativar receptores de células T (CTL (linfó- cito T citotóxico) e/ou HTL (receptores de linfócitos T auxiliares)) no contexto de antígeno MHC Classe I ou Classe Il que são isolados ou derivados de um animal ou humano infectado com vírus West Nile; 3) a capacidade para in- duzir uma reação imune em um animal ou humano contra um vírus West Nile; 4) a capacidade para induzir uma reação imune protetora em um ani- mal ou humano contra um vírus West Nile; e/ou 5) a capacidade para induzir a produção de anticorpos neutralizantes de vírus West NiIe (também referi- dos como anticorpos neutralizantes) em um animal / indivíduo imunizado com um ou mais dos referidos polipeptídeos.

Onde sistemas de expressão vegetal são usados para a produ- ção de polipeptídeos proporcionados no presente pedido, ou fragmentos dos mesmos, uma composição compreendendo o polipeptídeo purificado pode incluir componentes de células de planta (por exemplo, paredes celulares, a 30 matriz celular de membranas de células de planta e carboidratos, e etc.) ou componentes da matriz de células de planta. Igualmente, onde sistemas de expressão eucarióticos ou procarióticos são usados para a produção de po- lipeptídeos da presente invenção, ou fragmentos dos mesmos, membrana celular ou componentes da parede celular de cada sistema de expressão respectivo pode estar presente em uma composição compreendendo poli- peptídeos parcialmente purificados.

5 Os polipeptídeos (ou fragmentos dos mesmos) da invenção po-

dem ser monoméricos ou multiméricos (por exemplo, dímeros, trímeros, te- trâmeros e multímeros maiores). Por conseguinte, a presente invenção se refere a monômeros e multímeros dos polipeptídeos da invenção, sua prepa- ração, e composições contendo os mesmos. Polipeptídeos multiméricos, 10 conforme determinado aqui, neste pedido de patente, podem ser formadas associações hidrofóbicas, hidrofílicas, iônicas e/ou covalentes e/ou podem ser encadeadas indiretamente, por, por exemplo, formação de lipossoma. Portanto, em uma modalidade, multímeros da invenção, tais como, por e- xemplo, homodímeros ou homotrímeros, são formados quando polipeptídeos 15 da invenção contactam um ao outro em solução. Em outra modalidade, hete- romultímeros da invenção, tais como, por exemplo, heterotrímeros ou hete- rotetrâmeros, são formados quando polipeptídeos da invenção contactam anticorpos com os polipeptídeos da invenção (incluindo anticorpos para a seqüência de polipeptídeo heteróloga em uma proteína de fusão da inven- 20 ção) em solução. Em outras modalidades, multímeros da invenção são for- mados por associações covalente com e/ou entre os polipeptídeos da inven- ção. Um exemplo não-limitante de uma associação covalente semelhante é a formação de ligações dissulfeto entre cadeias pesadas de imunoglobulina conforme proporcionado por uma proteína de fusão da invenção que com- 25 preende um polipeptídeo compreendendo SEQ ID NO: 5, 9, 11, 13 ou 15 (ou fragmentos dos mesmos) fundido a uma cadeia pesada de Ig (vide, por e- xemplo, a Patente dos Estados Unidos n° 5.478.925, cuja descrição é por este incorporada por meio de referência em sua totalidade). Outro exemplo de uma proteína de fusão capaz de formar multímeros associados de modo 30 covalente é oseteoprotegerina (vide, por exemplo, a Publicação de Patente Internacional WO N0 98/49305, aqui, a este pedido de patente, incorporada por meio de referência em sua totalidade). Em outra modalidade, dois ou mais polipeptídeos da invenção são unidos através de Iigantes de peptídeos. Exemplos incluem os Iigantes de peptídeos descritos na Patente dos Esta- dos Unidos n° 5.073.627 (por este incorporada por meio de referência). Pro- teínas compreendendo múltiplos polipeptídeos da invenção separados por 5 Iigantes de peptídeos podem ser produzidas usando tecnologia de DNA re- combinante convencional.

Outros polipeptídeos multiméricos podem ser formados fundindo os polipeptídeos da invenção a uma seqüência de polipeptídeo de zíper de Ieucina ou de zíper de isoleucina. Domínios de zíper de Ieucina e de zíper de 10 isoleucina são polipeptídeos que promovem multimerização das proteínas nas quais são encontrados. Exemplos não-limitantes de domínios de zíper de Ieucina adequados para produzir proteínas multiméricas solúveis da in- venção são os descritos no pedido de patente internacional PCT WO N0 94/10308, por este incorporado por meio de referência. Proteínas de fusão 15 recombinantes compreendendo um polipeptídeo da invenção fundido a uma seqüência de polipeptídeo que dimeriza ou trimeriza em solução são expres- sadas em células hospedeiras adequadas, e a proteína de fusão multimérica solúvel resultante é recuperada do sobrenadante da cultura usando técnicas conhecidas na área.

Polipeptídeos multiméricos também podem ser gerados usando

técnicas químicas conhecidas na área. Por exemplo, polipeptídeos deseja- dos a serem contidos nos multímeros da invenção podem ser quimicamente reticulados usando moléculas encadeadoras e técnicas de otimização da extensão de moléculas encadeadoras conhecidas na área (vide, por exem- 25 pio, a Patente dos Estados Unidos n° 5.478.925, a qual é aqui, a este pedido de patente, incorporada por meio de referência em sua totalidade). Adicio- nalmente, polipeptídeos multiméricos também podem ser gerados introdu- zindo ligações dissulfeto entre os resíduos cisteína localizados dentro da seqüência dos polipeptídeos que estão sendo usados para construir o poli- 30 peptídeo multimérico (vide, por exemplo, Patente dos Estados Unidos n° 5.478.925, a qual é aqui, a este pedido de patente, incorporada por meio de referência em sua totalidade). Adicionalmente, polipeptídeos da invenção podem ser modificados rotineiramente pela adição de cisteína ou biotina ao C-término ou N-término do polipeptídeo e técnicas conhecidas na área po- dem ser aplicadas para gerar multímeros contendo um ou mais destes poli- peptídeos modificados (vide, por exemplo, a Patente dos Estados Unidos n° 5 5.478.925, a qual é aqui, a este pedido de patente, incorporada por meio de referência em sua totalidade). Adicionalmente, outras técnicas conhecidas na área podem ser aplicadas para gerar Iipossomas contendo os componen- tes do polipeptídeo que se deseja que seja contido no multímero da inven- ção (vide, por exemplo, Patente dos Estados Unidos n° 5.478.925, a qual é 10 aqui, a este pedido de patente, incorporada por meio de referência em sua totalidade).

Os polipeptídeos proporcionados aqui, neste pedido de patente, bem como os fragmentos dos mesmos, podem compreender adicionalmente elementos Iigantes (L) que facilitam a fixação dos fragmentos a outas molé- 15 cuias, aminoácidos, ou seqüências de polipeptídeos. Os Iigantes também podem ser usados para fixar os polipeptídeos, ou fragmentos dos mesmos, a matrizes de suporte sólido para uso em protocolos de purificação por afini- dade. Exemplos não-limitantes de "ligantes" adequados para a prática da invenção incluem ligantes químicos (tais como os vendidos por Pierce, Rock- 20 ford, IL), ou peptídeos que permitem para a conexão combinações de poli- peptídeos (vide, por exemplo, ligantes tais como os revelados nas Patentes dos Estados Unidos n°s 6.121.424, 5.843.464, 5.750.352, e 5.990.275, por este incorporadas por meio de referência em sua totalidade).

Em outras modalidades, o elemento Iigante (L) pode ser uma 25 seqüência de aminoácidos (um Iigante de peptídeo). Em algumas modalida- des, o Iigante de peptídeo tem uma ou mais das seguintes características: a) permite a livre rotação dos polipeptídeos que encadeia (em relação um ao outro); b) é resistente ou suscetível à digestão (clivagem) por proteases; e c) não interage com os polipeptídeos que une juntos. Em várias modalidades, 30 um constructo multimérico de acordo com a presente invenção inclui um Ii- gante de peptídeo e o Iigante de peptídeo tem 5 a 60 aminoácidos de exten- são. Mais preferencialmente, o Iigante de peptídeo tem 10 a 30, aminoácidos de extensão; ainda mais preferencialmente, o Iigante de peptídeo tem 10 a 20 aminoácidos de extensão. Em algumas modalidades, o Iigante de peptí- deo tem 17 aminoácidos de extensão.

Ligantes de peptídeo adequados para uso na presente invenção são compostos de aminoácidos selecionados entre o grupo consistindo em Gly, Ser, Asn, Thr e Ala. Preferencialmente, o Iigante de peptídeo inclui um elemento Gly-Ser. Em uma modalidade preferencial, o Iigante de peptídeo compreende (Ser-GIy-GIy-GIy-GIy)y em que y é 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, ou 8. Ou- tras modalidades proporcionam um Iigante de peptídeo compreendendo ((Ser-GIy-GIy-GIy-GIy)y-Ser-Pro). Em algumas modalidades preferenciais, y é um valor de 3, 4, ou 5. Em outra modalidade preferencial, o Iigante de pep- tídeo compreende (Ser-Ser-Ser-Ser-GIy)y ou ((Ser-Ser-Ser-Ser-GIy)y-Ser- Pro), em que y é 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, ou 8. Em algumas modalidades preferen- ciais, y é um valor de 3, 4, ou 5. Onde elementos ligantes cliváveis são dese- jados, uma ou mais seqüências de ligantes cliváveis tais como Fator Xa ou enteroquinase (Invitrogen, San Diego Calif.) podem ser usadas sozinhas ou em combinação com os elementos supracitados.

Constructos multiméricos da presente invenção também podem compreender uma série de eiementos de repetição, opcionalmente interca- 20 lados com outros elementos. Conforme seria reconhecido por uma pessoa versada na técnica, a ordem na qual os elementos de repetição ocorrem no polipeptídeo multimérico não é crucial e qualquer disposição dos elementos de repetição conforme determinado aqui, neste pedido de patente, pode ser proporcionada pela presente invenção. Portanto, um "constructo multiméri- 25 co" de acordo com a presente invenção pode proporcionar um polipeptídeo multimérico compreendendo uma série de polipeptídeos ou fragmentos de polipeptídeo que são, opcionalmente, unidos juntos por elementos ligantes (quer elementos ligantes químicos ou elementos ligantes de aminoácidos).

Proteínas de fusão de acordo com a presente invenção compre- endem uma ou mais seqüências de polipeptídeos heterólogas (por exemplo, etiquetas que facilitam a purificação dos polipeptídeos da invenção (vide, por exemplo, a Patente dos Estados Unidos n° 6.342.362, por este incorporada por meio de referência em sua totalidade; Altendorf et ai, (1999-WWW, 2000); Baneyx, (1999); Eihauer et ai, (2001); Jones et al. (1995); Margolin (2000); Puig et ai, (2001); Sassenfeld (1990); Sheibani (1999); Skerra et ai, (1999); Smith (1998); Smyth et ai, (2000); Unger (1997), cada uma das 5 quais é por este incorporada por meio de referência em suas totalidades), ou etiquetas disponíveis comercialmente a partir de vendedores tais como S- TRATAGENE (La Jolla, CA), NOVAGEN (Madison, Wl), QIAGEN, Inc., (Va- lencia, CA), ou InVitrogen (San Diego, CA).

Em outras modalidades, polipeptídeos da presente invenção (por 10 exemplo, SEQ ID NOs: 5, 9, 11, 13, 15 ou fragmentos dos mesmos) podem ser fundidos a seqüências de polipeptídeos heterólogas que têm atividade adjuvante (um polipeptídeo adjuvante). Exemplos não-limitantes de seme- lhantes polipeptídeos incluem proteínas de choque térmico (hsp) (vide, por exemplo, a Patente dos Estados Unidos n° 6.524.825, cuja descrição é por 15 este incorporada por meio de referência em sua totalidade).

A presente invenção também proporciona fragmentos biologica- mente ativos de um polipeptídeo de acordo com a invenção e inclui os peptí- deos capazes de provocar uma reação imune dirigida contra um vírus West Nile, a referida reação imune proporcionando componentes (células B, anti- 20 corpos, e/ou componentes da reação imune celular (por exemplo, células T auxiliares, citotóxicas, e/ou supressoras)) reativa com o fragmento do referi- do polipeptídeo; o polipeptídeo não modificado intacto, de extensão total, revelado aqui, neste pedido de patente; ou tanto um fragmento de um poli- peptídeo quanto os polipeptídeos não modificados intactos, de extensão to- 25 tal, revelados aqui, neste pedido de patente. Algumas modalidades propor- cionam métodos para induzir uma reação de anticorpos que produz anticor- pos neutralizantes do vírus West Nile.

O presente pedido também proporciona uma composição com- preendendo no mínimo um polipeptídeo isolado, recombinante, ou purificado compreendendo a SEQ ID NO: 5, 9, 11, 13 ou 15 (ou um fragmento dos mesmos) e no mínimo um componente adicional. Em vários aspectos da invenção, o componente adicional é um suporte sólido (por exemplo, poços de microtitulação, contas magnéticas, contas não magnéticas, contas agaro- se, vidro, celulose, plásticos, polietileno, polipropileno, poliéster, nitrocelulo- se, náilon, ou polissulfona). O componente adicional também pode ser um excipiente farmaceuticamente aceitável ou adjuvante de conhecimento da- 5 queles versados na técnica. Em alguns aspectos da invenção, o suporte só- lido proporciona uma série de polipeptídeos da presente invenção ou uma série de polipeptídeos compreendendo combinações de vários polipeptídeos da presente invenção. Outros aspectos da invenção proporcionam uma composição compreendendo o polipeptídeo purificado que inclui componen- 10 tes de células de planta (por exemplo, paredes celulares, a matriz celular de membranas de células vegetais e carboidratos, e etc.) ou componentes da matriz de células vegetais. Igualmente, onde são usados sistemas de ex- pressão eucarióticos ou procarióticos para a produção de polipeptídeos ou fragmentos dos polipeptídeos proporcionados por este pedido, membrana 15 celular ou componentes da parede celular de cada sistema de expressão respectivo podem estar presentes em uma composição compreendendo po- lipeptídeos parcialmente purificados.

A presente invenção também proporciona métodos para provo- car uma reação imune em um indivíduo compreendendo a administração de composições compreendendo polipeptídeos de acordo com a presente in- venção a um indivíduo em quantidades suficientes para induzir uma reação imune no indivíduo. Em algumas modalidades, uma "reação imune proteto- ra" ou "terapêutica" é induzida no indivíduo. Uma "reação imune protetora" ou "reação imune terapêutica" se refere a uma indução na produção de anti- corpos que neutralizam vírus West Nile infecciosos, ou induzem uma CTL (ou célula T CD8+) e/ou uma HTL (ou célula T CD4+), e/ou uma reação de anticorpos que prevene, reduz ou no mínimo detém parcialmente sintomas de doença, efeitos colaterais ou progressão no indivíduos. Por exemplo, in- divíduos nos quais uma reação imune protetora foi induzida podem apresen- tar mortalidade reduzida e/ou apresentar reduzida disseminação viral com- parados com indivíduos de controle não-imunizados. A reação imune prote- tora também pode incluir uma reação de anticorpos que foi facilitada pela estimulação de células T auxiliares (ou células T CD4+). Métodos adicionais para induzir uma reação imune em um indivíduo são ensinados na Patente dos Estados Unidos n° 6.419.931, incorporada a este por meio de referência em sua totalidade. O termo CTL pode ser usado de modo intercambiável 5 com uma ou mais células T CD8+ e o termo HTL pode ser usado de modo intercambiável com uma ou mais células T CD4+ do início ao fim do presente pedido.

Indivíduos, no contexto deste pedido, se refere a aves e/ou ma- míferos tais como, mas não limitados a, monos, chimpanzés, orangotangos, 10 seres humanos, macacos ou animais domesticados (animais de estimação) tais como cães, gatos, porquinhos-da-índia, hamsters, coelhos, ferrets, va- cas, cavalos, cabras e carneiro. Avícola ou ave é definido aqui, neste pedido de patente, como qualquer vertebrado de sangue quente membro da classe Aves tipicamente tendo membros anteriores modificados em asas, pernas 15 escamosas, um bico, e produzindo crias em ovos de casca dura. Para os fins deste relatório, grupos preferenciais de aves são frangos domesticados, perus, avestruzes, patos, gansos, cisne, galinhas de competição da Cornua- Iha e aves exóticas mantidas como animais de estimação ou para exibição em zoológicos.

Administração ou administrar é definido como a introdução de

uma substância no corpo de um indivíduo e inclui vias oral, nasal, ocular, retal, vaginal e parenteral. Composições podem ser administradas individu- almente ou em combinação com outros agentes através de qualquer via de administração, incluindo mas não limitada a subcutânea (SQ), intramuscular 25 (IM), intravenosa (IV), intraperitoneal (IP), intradérmica (ID), transdérmica, (TD), ou através da mucosa nasal, ocular, oral, ou retal.

A composição administrada ao indivíduo pode conter, opcional- mente, um adjuvante e pode ser liberada de qualquer maneira conhecida na técnica para a liberação de imunogênio a um sujeito. Composições também 30 podem ser formuladas em quaisquer veículos, incluindo por exemplo, veícu- los farmaceuticamente aceitáveis tais como os descritos em Remington1S Pharmaceutical Science de E.W. Martin, Mack Publishing Company, Easton, PA. Em modalidades preferenciais, as composições podem ser formuladas em adjuvante incompleto de Freund, adjuvante completo de Freund, ou alú- me. Outros exemplos não-limitantes de adjuvantes que podem ser usados na pratica da invenção incluem: emulsões de óleo-água, Polygen, Carbigen 5 (Carbopol 974P NF) ou Titer-Max (copolímero em bloco CRL-8941, esquale- no e um estabilizador de microparticulado único).

Em outras modalidades, a presente invenção proporciona ensai- os de diagnóstico à base de formatos de Western blot ou imunoensaios de via de conhecimento do técnico versado e os quais utilizam um polipeptídeo compreendendo, consistindo essencialmente em, ou consistindo em SEQ ID NO: 5, 9, 11, 13 ou 15. Por exemplo, ensaios à base de anticorpos tais como ensaios imunossorventes ligados a enzimas (ELISAs), radioimunoensaios (RIAs), ensaios de fluxo lateral, ensaio de ligação cromatográfica de fluxo reversível (vide, por exemplo, a Patente dos Estados Unidos n° 5.726.010, a qual é por este incorporada por meio de referência em sua totalidade), en- saios de fitas imunocromatográficas, ensaios de fluxo automatizado, e en- saios utilizando biossensores contendo peptídeo podem ser empregados para a detecção de anticorpos que ligam aos polipeptídeos (ou fragmentos dos mesmos) que também são proporcionados pela presente invenção. As ensaios e métodos para conduzir as ensaios são de conhecimento geral na técnica e os métodos podem testar amostras biológicas (por exemplo, soro, plasma, ou sangue) qualitativamente (presença ou ausência de anticorpo) ou quantitativamente (comparação de uma amostra contra uma curva padrão preparada usando um polipeptídeo da presente invenção) para a presença de anticorpos que ligam a polipeptídeos da presente invenção.

Os ensaios à base de anticorpos podem ser considerados como sendo de quatro tipos: ensaios de ligação direta, ensaios intercalados, en- saios de competição, e ensaios de deslocamento. Em um ensaio de ligação direta, ou o anticorpo ou antígeno é etiquetado, e há um meio para medir o 30 número de complexos formados. Em um ensaio intercalado, é medida a for- mação de um complexo de no mínimo três componentes (por exemplo, anti- corpo-antígeno-anticorpo). Em um ensaio de competição, etiquetado antíge- no e antígeno não etiquetado competem por ligação ao anticorpo, e é medi- do ou o componente ligado ou o livre. Em um ensaio de deslocamento, o antígeno etiquetado é pré-ligado ao anticorpo, e uma alteração na sinaliza- ção é medida à medida que o antígeno não etiquetado desloca o antígeno 5 etiquetado ligado do receptor.

Ensaios de fluxo lateral podem ser conduzidos de acordo com os ensinamentos da Patente dos Estados Unidos n° 5.712.170 e as referências citadas na mesma. A Patente dos Estados Unidos n° 5.712.170 e as refe- rências citadas na mesma são por este incorporadas por meio de referência em suas totalidades. Ensaios de deslocamento e imunossensores de fluxo úteis para realizar ensaios de deslocamento são descritos em: Kusterbeck et ai, (1990); Kusterbeck et ai, (1990a); Ligler et al., (1992); Ogert et ai, (1992), todos os quais são incorporados aqui, a este pedido de patente, por meio de referência em suas totalidades. Ensaios de deslocamento e imu- nossensores de fluxo também são descritos na Patente dos Estados Unidos n° 5.183.740, a qual também é incorporada aqui, a este pedido de patente, por meio de referência em sua totalidade. O imunoensaio de deslocamento, diferentemente da maioria dos imunoensaios competitivos usados para de- tectar moléculas pequenas, pode gerar um sinal positivo com concentração crescente de antígeno.

A presente invenção também proporciona métodos para ligar um anticorpo a um polipeptídeo da presente invenção (por exemplo, SEQ ID NO: 5, 9, 11, 13 ou 15, ou um fragmento de ligação de anticorpo do mesmo) compreendendo contactar uma amostra contendo um anticorpo com um po- 25 lipeptídeo sob condições que permitem a formação de um complexo de antí- geno-anticorpo. Estes métodos podem compreender adicionalmente a etapa de detectar a formação do referido complexo de antígeno-anticorpo. Em vá- rios aspectos deste método, um imunoensaio é conduzido para a detecção de anticorpos específicos contra o vírus West Nile em uma amostra. Exem- 30 pios não-limitantes de semelhantes imunoensaios incluem ensaios imunos- sorventes ligados à enzima (ELISAs), radioimunoensaios (RIAs)1 ensaios de fluxo lateral, ensaios de fita imunocromatográfica, ensaios de fluxo automati- zado, Western blots, ensaios de imunoprecipitação, ensaios de ligação cro- matográfica de fluxo reversível, ensaios de aglutinação, e biossensores. As- pectos adicionais da invenção proporcionam o uso de uma série de polipep- tídeos ao conduzir os métodos mencionados acima para detectar anticorpos 5 específicos para o vírus West Nile (a série pode conter no mínimo um dos polipeptídeos determinados na SEQ ID NOs: 5, 9, 11, 13 ou 15 (ou fragmen- tos dos mesmos) e também pode conter outros polipeptídeos da mesma ori- gem viral ou de origem viral diferente).

A presente invenção também refere-se a anticorpos que ligam a 10 polipeptídeos da invenção. Anticorpos que são imunoespecíficos para os polipeptídeos conforme determinado aqui, neste pedido de patente, são es- pecificamente contemplados. Em várias modalidades, são preferenciais anti- corpos que não têm reação cruzada com outros polipeptídeos do vírus West Nile. Anticorpos particularmente preferenciais não têm reação cruzada com 15 anticorpos produzidos contra polipeptídeos derivados de cepas conhecidas do vírus West Nile. Os anticorpos da presente invenção podem ser prepara- dos usando materiais de via e métodos conhecidos na técnica (vide, por e- xemplo, Monoclonal Antibodies: Principies e Practiee, 1983; Monoclonal Hy- bridoma Antibodies: Techniques and Applications, 1982; Selected Methods 20 in Cellular Immunology, 1980; Immunological Methods, Vol. II, 1981; Practi- cal Immunology, e Kohler et ai, 1975; Letchworth and Appleton, 1984). Es- tes anticorpos podem compreender adicionalmente um ou mais componen- tes adicionais, tais como um suporte sólido, um veículo ou excipiente farma- ceuticamente aceitável, ou uma etiqueta.

O termo "anticorpo" inclui anticorpos monoclonais (incluindo an-

ticorpos monoclonais de extensão total), anticorpos policlonais, anticorpos multiespecíficos (por exemplo, anticorpos biespecíficos), e fragmentos de anticorpos na medida que apresentem a atividade biológica desejada, parti- cularmente atividade neutralizante. "Fragmentos de anticorpos" compreen- 30 dem uma porção de um anticorpo de extensão total, geralmente a região variável ou de ligação de antígeno dos mesmos. Exemplos de fragmentos de anticorpos incluem fragmentos Fab, Fab', F(ab')2, e Fv; diacorpos; anticorpos lineares; moléculas de anticorpos de cadeia única; e anticorpos multiespecí- ficos formados de fragmentos de anticorpos. Anticorpos particularmente pre- ferenciais de acordo com a presente invenção são os que não ligam aos po- lipeptídeos de WNV não modificados conhecidos na técnica.

5 O termo "anticorpo monoclonal" conforme usado aqui, neste pe-

dido de patente, se refere a um anticorpo obtido de uma população de anti- corpos substancialmente homogêneos, isto é, os anticorpos individuais com- preendendo a população são idênticos exceto por possíveis mutações que ocorrem naturalmente que podem estar presentes em quantidades menores. 10 Anticorpos monoclonais são altamente específicos, sendo dirigidos contra um único sítio antigênico. Além disso, em contraste com preparações de an- ticorpos (policlonais) convencionais que tipicamente incluem diferentes anti- corpos dirigidos contra diferentes determinantes (epítopos), cada anticorpo monoclonal é dirigido contra um único determinante sobre o antígeno. O 15 "monoclonal" modificador indica o caráter do anticorpo como sendo obtido de uma população de anticorpos substancialmente homogênea, e não deve ser considerado como requerendo produção do anticorpo por qualquer mé- todo particular. Por exemplo, os anticorpos monoclonais a serem usados de acordo com a presente invenção podem ser produzidos pelo método do pri- 20 meiro hibridoma descrito por Kohler et ai, (1975), ou podem ser produzidos por métodos de DNA recombinante (vide, por exemplo, a Patente dos Esta- dos Unidos n° 4.816.567). Os "anticorpos monoclonais" também podem ser isolados de bibliotecas de fagos de anticorpos usando as técnicas descritas em Clackson et al. (1991) e Marks etal. (1991), por exemplo.

Os anticorpos monoclonais descritos aqui, neste pedido de pa-

tente, incluem especificamente anticorpos "quiméricos" (imunoglobulinas) nos quais uma porção da cadeia pesada e/ou leve é idêntica a ou homóloga a seqüências correspondentes em anticorpos derivados de uma espécie par- ticular ou pertencentes a uma classe ou subclasse de anticorpos em particu- 30 lar, ao passo que o restante da uma ou mais cadeias é idêntico a ou homó- logo às seqüências correspondentes em anticorpos derivados de outra es- pécie ou pertencentes à outra classe ou subclasse de anticorpos, bem como fragmentos de semelhantes anticorpos, na medida que apresentem a ativi- dade biológica desejada (Patente dos Estados Unidos n° 4.816.567; e Morri- son etal., (1984)). Também são incluídos anticorpos humanizados que ligam especificamente aos polipeptídeos, ou fragmentos dos mesmos, determina- 5 dos em SEQ ID NO: 5, 9, 11, 13 ou 15 (vide, por exemplo, as Patentes dos Estados Unidos n°s 6.407.213 ou 6.417.337, as quais são por este incorpo- radas por meio de referência em sua totalidade, ensinando métodos para produzir anticorpos humanizados).

Fragmentos de anticorpos "de cadeia única Fv" ou "sFv" com- 10 preendem os domínios Vh e Vl de um anticorpo, em que estes domínios es- tão presentes em uma única cadeia de polipeptídeo. Geralmente, o polipep- tídeo Fv compreende adicionalmente um polipeptídeo Iigante entre os domí- nios Vh e Vl o qual permite que o sFv forme a estrutura desejada para liga- ção de antígeno. Para uma revisão de sFv vide Pluckthun (1994).

O termo "diacorpos" se refere a pequenos fragmentos de anti-

corpos com dois sítios de ligação de antigênio, cujos fragmentos compreen- dem um domínio variável de cadeia pesada (Vh) conectado a um domínio variável de cadeia leve (Vl) na mesma cadeia de polipeptídeo (VH -VL). Dia- corpos são descritos mais totalmente, por exemplo, na patente européia EP 20 n° 404.097; na publicação de patente internacional WO N0 93/11161; e em Holliger et al. (1993). O termo "anticorpos lineares" se refere aos anticorpos descritos em Zapata etal. (1995).

Um anticorpo "isolado" é um anticorpo o qual foi identificado e separado e/ou recuperado de um componente de seu ambiente natural. 25 Componentes contaminantes de seu ambiente natural são materiais os quais interfeririam com usos diagnósticos ou terapêuticos para o anticorpo, e po- dem incluir enzimas, hormônios, e outros solutos proteináceos ou não prote- ináceos. Em modalidades preferenciais, o anticorpo será purificado (1) até mais de 95% em peso de anticorpo conforme determinado pelo método de 30 Lowry, e o mais preferencialmente mais de 99% em peso, (2) até um grau suficiente para obter no mínimo 15 resíduos de N-terminal ou seqüência de aminoácidos interna por uso de um sequenciador de copo giratório, ou (3) até a homogeneidade por SDS-PAGE sob condições redutoras ou não- redutoras usando azul Coomassie ou, preferencialmente, tintura prata. Anti- corpo isolado inclui o anticorpo in situ dentro de células recombinantes des- de que no mínimo um componente do ambiente natural do anticorpo não 5 venha a estar presente. Ordinariamente, no entanto, anticorpo isolado será preparado por no mínimo uma etapa de purificação.

Conforme discutido acima, "seqüência de nucleotídeos", "polinu- cleotídeo" ou "ácido nucleico" podem ser usados de modo intercambiável e são entendidos como significando, de acordo com a presente invenção, quer um DNA de filamento duplo, um DNA de filamento único ou produtos de transcrição dos referidos DNAs (por exemplo, moléculas de RNA).

A faixa de percentagem de identidade, entre 20,00% e 99,99%, deve ser tomada como incluindo, e proporcionando descrição por escrito e suporte para, qualquer percentagem fracionária, em intervalos de 0,01%, 15 entre 20,00% e, até, inclusive 99,99%. Estas percentagens são puramente estatísticas e diferenças entre duas seqüências de ácidos nucleicos podem ser distribuídas aleatoriamente e sobre toda a extensão da seqüência. Por exemplo, seqüências homólogas podem apresentar uma percentagem de identidade de 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 20 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, ou 99 por cento com as seqüências da presente invenção. Tipi- camente, a percentagem de identidade é calculada com referência ao poli- 25 nucleotídeo de extensão total, nativo, e/ou que ocorre naturalmente. Os ter- mos "idênticas" ou percentagem de "identidade", no contexto de duas ou mais seqüências de polinucleotídeos ou polipeptídeos, se referem a duas ou mais seqüências ou subsequências que são as mesmas ou têm uma percen- tagem especificada de nucleotídeos ou resíduos aminoácidos que são os 30 mesmos, quando comparados e alinhados para máxima correspondência em relação a uma janela de comparação, conforme medido usando um algorit- mo de comparação de seqüências ou por alinhamento manual e inspeção visual.

Tanto homologias de seqüências de proteína quanto de ácido nucleico podem ser avaliadas usando qualquer um da variedade de algorit- mos de comparação de seqüências e de programas conhecidos na técnica.

5 Os algoritmos e programas referidos incluem, mas não devem ser limitados de modo algum a, TBLASTN, BLASTP, FASTA, TFASTA, e CLUSTALW (Pearson etal., 1988; Altschul etal., 1990; Thompson etal., 1994; Higgins et ai, 1996; Gish et ai, 1993). Comparações de seqüências são, tipicamente, conduzidas usando parâmetros padrão proporcionados pelo vendedor ou 10 usando os parâmetros determinados nas referências identificadas acima, as quais são por este incorporadas por meio de referência em suas totalidades.

Uma seqüência de polinucleotídeos "complementar", conforme usado aqui, neste pedido de patente, geralmente se refere a uma seqüência originária da ligação de hidrogênio entre uma purina particular e uma pirimi- 15 dina particular em moléculas de ácido nucleico de filamento duplo (DNA- DNA, DNA-RNA, ou RNA-RNA). Os principais pareamentos específicos são guanina com citosina e adenina com timina ou uracila. Uma seqüência de polinucleotídeos "complementar" também pode ser referida como uma se- qüência de polinucleotídeos "antissenso" ou uma "seqüência antissenso".

A homologia de seqüência e identidade de seqüência também

podem ser determinadas por estudos de hibridização sob alta estringência, estringência intermediária, e/ou baixa estringência. Podem ser empregados vários graus de estringência de hibridização. As condições mais severas são, quanto maior a complementaridade que é requerida para formação de 25 duplex. A gravidade das condições pode ser controlada por temperatura, concentração da sonda, extensão da sonda, força iônica, tempo, e seme- lhantes. Preferencialmente, hibridização é conduzida sob condições de baixa estringência, estringência intermediária, ou de alta estringência por técnicas de conhecimento geral na área, conforme descrito, por exemplo, em Keller e 30 Manak (1987).

Por exemplo, hibridização de DNA imobilizado sobre Southern blots com sondas gene-específicas com etiqueta de 32P pode ser realizada por métodos de via (Maniatis et ai, 1982). Em geral, hibridização e subse- quentes lavagens podem ser realizadas sob condições de estringência in- termediária a alta que permitem a detecção de seqüências alvo com homo- Iogia com a seqüência de polinucleotídeos exemplificada. Para sondas gené- 5 ticas de DNA de filamento duplo, pode ser realizada hibridização de um dia para o outro em 20 a 25° C abaixo da temperatura de fusão (Tm) do híbrido de DNA em 6X SSPE, 5X solução de Denhardt, 0,1% de SDS, 0,1 mg/ml de DNA desnaturado. A temperatura de fusão é descrita pela fórmula seguinte (Beltz etal., 1983).

Tm = 81,5°C + 16,6 Log[Na+] + 0,41 (%G+C) - 0,61 (% de for-

mamida) - 600/ extensão de duplex em pares de bases.

Lavagens são tipicamente realizadas como se segue:

(1) duas vezes em temperatura ambiente por 15 minutos em 1X SSPE, 0,1% de SDS (lavagem de baixa estringência);

(2) uma vez a Tm - 20°C por 15 minutos em 0,2X SSPE, 0,1 % de

SDS (lavagem de estringência intermediária).

Para sondas de oligonucleotídeos, pode ser realizada hibridiza- ção de um dia para o outro em 10 a 20°C abaixo da temperatura de fusão (Tm) do híbrido em 6X SSPE, 5X solução de Denhardt, 0,1% de SDS, 0,1 mg/ml de DNA desnaturado. A Tm para sondas de oligonucleotídeos pode ser determinada pela seguinte fórmula:

Tm (0C) = 2 (número de pares de bases T/A) + 4 (número de pa- res de bases G/C) (Suggs et al., 1981).

Lavagens podem ser realizadas como se segue:

(1) duas vezes em temperatura ambiente por 15 minutos 1X

SSPE, 0,1% de SDS (lavagem de baixa estringência);

2) uma vez na temperatura de hibridização por 15 minutos em 1X SSPE, 0,1% de SDS (lavagem de estringência intermediária).

Em geral, sal e/ou temperatura podem ser alterados para mudar a estringência. Com um fragmento de DNA etiquetado >70 bases de exten- são aproximadamente, podem ser usadas as seguintes condições:

Baixa: 1 ou 2X SSPE, temperatura ambiente Baixa: 1 ou 2X SSPE, 42°C

Intermediária: 0,2X ou 1X SSPE, 65°C Elevada: 0,1X SSPE, 65°C.

A título de outro exemplo não-limitante, procedimentos usando condições de alta estringência também podem ser realizadas como se se- gue: Pré-hibridização de filtros contendo DNA é realizada por 8 h até durante a noite a 65°C em tampão composto de 6X SSC, 50 mM de Tris-HCI (pH 7,5), 1 mM de EDTA, 0,02% de PVP, 0,02% de Ficoll, 0,02% de BSA, e 500 □g/ml de DNA de esperma de salmão desnaturado. Os filtros são hibridiza- dos por 48 h a 65°C, a temperatura de hibridização preferencial, em mistura pré-hibridização contendo 100 Dg/ml de DNA de esperma de salmão desna- turado e 5-20 x 106 cpm de sonda marcada com 32P. Alternativamente, a e- tapa de hibridização pode ser realizada a 65°C na presença de tampão SSC, 1X SSC correspondendo a 0,15 M de NaCI e 0,05 M de citrato de Na. Sub- sequentemente, podem ser feitas lavagens de filtro a 37°C por 1 h em uma solução contendo 2X SSC, 0,01% de PVP, 0,01% de Ficoll, e 0,01% de BSA, seguidas por uma lavagem em 0,1 X SSC a 50°C por 45 min. Alternati- vamente, podem ser realizadas lavagens de filtro em uma solução contendo 2X SSC e 0,1% de SDS, ou 0,5X SSC e 0,1% de SDS, ou 0,1X SSC e 0,1% de SDS a 68°C por intervalos de 15 minutos. Depois das etapas de lavagem, as sondas hibridizadas são detectáveis por autorradiografia. Outras condi- ções de alta estringência as quais podem ser usadas são de conhecimento geral na técnica e conforme citado em Sambrook et al. (1989) e Ausubel et al. (1989) são incorporadas aqui, a este pedido de patente, em sua totalida- de.

Outro exemplo não-limitante de procedimentos usando condi- ções de estringência intermediária são como se segue: Filtros contendo DNA são pré-hibridizadas, e em seguida hibridizadas em uma temperatura de 60°C na presença de 5X um tampão SSC e sonda etiquetada. Subsequen- 30 temente, são realizadas lavagens dos filtros em uma solução contendo 2X SSC a 50°C e as sondas hibridizadas são detectáveis por autorradiografia. Outras condições de estringência intermediária as quais podem ser usadas são de conhecimento geral na técnica e conforme citado em Sambrook et al. (1989) e Ausubel et al. (1989) são incorporadas aqui, a este pedido de pa- tente, em sua totalidade.

A formação de dúplex e a estabilidade dependem de comple- mentaridade substancial entre os dois filamentos de um híbrido e, conforme mencionado acima, pode ser tolerado um certo grau de combinação inade- quada. Portanto, as seqüências de sondas da invenção em questãopresente incluem mutações (tanto únicas quanto múltiplas), eliminações, inserções das seqüências descritas, e combinações das mesmas, em que as referidas mutações, inserções e eliminações permitem a formação de híbridos está- veis com o polinucleotídeo alvo de interesse. Mutações, inserções e elimina- ções podem ser produzidas em uma dada seqüência de polinucleotídeos em muitos modos, e estes métodos são de conhecimento de um profissional ordinariamente versado. Outros métodos podem se tornar conhecidos no futuro.

Também é de conhecimento geral na técnica que enzimas de restrição podem ser usadas para obter fragmentos funcionais das seqüên- cias de DNA em questão presente. Por exemplo, exonuclease Ba/31 pode ser usada convenientemente para digestão de DNA limitada controlada com 20 o tempo (referidos comumente como procedimentos de "apagar uma base"). Vide, por exemplo, Maniatis etal. (1982); Wei et al. (1983).

A presente invenção compreende adicionalmente fragmentos das seqüências de polinucleotídeos da presente invenção. Fragmentos típi- cos das seqüências de polinucleotídeos de acordo com a invenção serão 25 entendidos como significando qualquer fragmento de nucleotídeo tendo no mínimo 5 nucleotídeos sucessivos, preferencialmente no mínimo 12 nucleo- tídeos sucessivos, e ainda mais preferencialmente no mínimo 15, 18, ou no mínimo 20 nucleotídeos sucessivos da seqüência da qual é derivado. O limi- te superior para fragmentos conforme determinado aqui, neste pedido de 30 patente, é o número total de nucleotídeos encontrados na seqüência de ex- tensão total codificando um polipeptídeo em particular (por exemplo, um po- lipeptídeo tal como o de SEQ ID NO: 5). Em algumas modalidades, a presente invenção inclui os frag- mentos capazes de hibridizar sob várias condições de condições de estrin- gência (por exemplo, estringência alta ou intermediária ou baixa) com uma seqüência de nucleotídeos de acordo com a invenção; fragmentos que hibri- 5 dizam com uma seqüência de nucleotídeos da presente invenção podem ser, opcionalmente, etiquetados conforme determinado abaixo.

A presente invenção proporciona, em uma modalidade, métodos para a identificação da presença de ácidos nucleicos de acordo com a pre- sente invenção em células hospedeiras transformadas ou em células isola- 10 das de um indivíduo suspeito de ser infectado por vírus West Nile. Nestas modalidades variadas, a invenção proporciona a detecção de ácidos nuclei- cos em uma amostra (obtida do indivíduo ou de uma cultura celular) com- preendendo contactar uma amostra com um ácido nucleico (polinucleotídeo) da presente invenção (tal como um RNA, mRNA, DNA, cDNA, ou outro ácido 15 nucleico). Em uma modalidade preferencial, o polinucleotídeo é uma sonda que é, opcionalmente, etiquetado e usado no sistema de detecção. Existem muitos métodos para detecção de ácidos nucleicos e qualquer método ade- quado para detecção é englobado pela presente invenção. Formatos de en- saios típicas utilizando hibridização de ácido nucleico incluem, e não estão 20 limitados a, 1) ensaio de run on nuclear, 2) ensaio de slot blot, 3) ensaio Nor- thern blot (Alwine et al., 1977, 4) separação de partículas magnéticas, 5) chips de DNA ou ácido nucleico, 6) ensaio Northern blot reverso, 7) ensaio de dot blot, 8) hibridização in situ, 9) ensaio de proteção de RNase (Melton et al., 1984) e conforme descrito no catálogo de 1998 da Ambion, Inc., Aus- 25 tin, Tex., 10) reação de cadeia ligase, 11) reação de cadeia polimerase (P- CR), 12) transcriptase reversa (RT)-PCR (Berchtold, 1989), 13) RT-PCR de display diferencial (DDRT-PCR) ou outras combinações adequadas de técni- cas e ensaios. Etiquetas adequadas para uso nestas metodologias de de- tecção incluem, e não estão limitados a 1) etiquetas radioativas, 2) etiquetas 30 enzimáticas, 3) etiquetas quimiluminescentes, 4) etiquetas fluorescentes, 5) etiquetas magnéticas, ou outras etiquetas adequadas, incluindo as determi- nadas abaixo. Estas metodologias e etiquetas são de conhecimento geral na técnica e estão amplamente disponíveis para o técnico versado. Igualmente, métodos para incorporar etiquetas nos ácidos nucleicos também são de co- nhecimento geral do técnico versado.

Portanto, a presente invenção também proporciona sondas de detecção (por exemplo, fragmentos das seqüências de polinucleotídeos re- veladas) para hibridização com uma sequência-alvo ou o amplicon gerado a partir da sequência-alvo. Uma sonda de detecção semelhante compreenderá um trecho contíguo / consecutivo de no mínimo 8, 9, 10, 11, 12, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, ou 100 nucleotídeos. Sondas etiquetadas ou iniciado- res são etiquetados com um composto radioativo ou com outro tipo de eti- queta conforme determinado acima (por exemplo, 1) etiquetas radioativas, 2) etiquetas enzimáticas, 3) etiquetas quimiluminescentes, 4) etiquetas fluores- centes, ou 5) etiquetas magnéticas). Alternativamente, seqüências de nucle- otídeos não marcadas podem ser usadas diretamente como sondas ou inici- adores; no entanto, as seqüências são geralmente etiquetadas com um ele- mento radioativo (32P, 35S, 3H, 125I) ou com uma molécula tal como biotina, acetilaminofluoreno, digoxigenina, 5-bromo-deoxiuridina, ou fluoresceína para proporcionar sondas que podem ser usadas em numerosas aplicações. Polinucleotídeos da presente invenção também podem ser usa-

dos para a análise qualitativa e quantitativa da expressão genética usando séries ou polinucleotídeos que são fixados a um suporte sólido. Conforme usado aqui, neste pedido de patente, o termo série significa uma disposição uni-, bi-, ou multidimensional de polinucleotídeos de extensão total ou poli- 25 nucleotídeos de suficiente extensão para permitir detecção específica de expressão genética. Preferencialmente, os fragmentos têm no mínimo 15 nucleotídeos de extensão. Mais preferencialmente, os fragmentos têm no mínimo 100 nucleotídeos de extensão. Mais preferencialmente, os fragmen- tos têm mais de 100 nucleotídeos de extensão. Em algumas modalidades os 30 fragmentos podem ter mais de 500 nucleotídeos de extensão.

Por exemplo, pode ser realizada análise quantitativa da expres- são genética com polinucleotídeos de extensão total da presente invenção, ou fragmentos dos mesmos, em uma microssérie de DNA complementar conforme descrito por Schena et al. (1995, 1996). Polinucleotídeos, ou frag- mentos dos mesmos, são amplificados por PCR e ordenados sobre placas de microscópio sililadas. Séries impressas são incubadas em uma câmara 5 úmida para permitir reidratação dos elementos da série e enxaguadas, uma vez em 0,2% de SDS por 1 min, duas vezes em água por 1 min e uma vez por 5 min em solução de boridreto de sódio. As séries são submergidas em água por 2 min a 95°C, transferidas para 0,2% de SDS por 1 min, enxagua- das duas vezes com água, secos ao ar e armazenadas no escuro a 25°C.

mRNA é isolado de uma amostra biológica e sondas são prepa-

radas por uma única rodada de transcrição reversa. Sondas são hibridizadas para microsséries de 1 cm2 sob uma sobrelâmina de vidro de 14 x 14 mm por 6 a 12 horas a 60°C. As séries são lavadas por 5 min a 25°C em tampão de lavagem de baixa estringência (1 x SSC / 0,2% de SDS), em seguida por 15 10 min em temperatura ambiente em tampão de lavagem de alta estringên- cia (0,1 x SSC / 0,2% de SDS). As séries são varridas em 0,1 x SSC usando um dispositivo de varredura a laser de fluorescência equipado com uma sé- rie de filtro habitual. Medições de expressão diferencial precisa são obtidas tomando a média das proporções de duas hibridizações independentes.

Análise quantitativa dos polinucleotídeos presentes em uma a-

mostra biológica também pode ser realizada em séries de DNA complemen- tar conforme descrito por Pietu et al. (1996). Os polinucleotídeos da inven- ção, ou fragmentos dos mesmos, são amplificados por PCR e pincelados sobre membranas. Em seguida, mRNAs originários de amostras biológicas 25 derivadas de vários tecidos ou células são etiquetados com nucleotídeos radioativos. Depois de hibridização e lavagem em condições controladas, os mRNAs hibridizados são detectados por fosfo-imaging ou autorradiografia. São realizados experimentos em duplicata e em seguida é realizada uma análise quantitativa de mRNAs expressados diferencialmente.

Alternativamente, as seqüências de polinucleotídeos da inven-

ção também podem ser usadas em sistemas analíticos, tais como chips de DNA. Chips de DNA e seus usos são de conhecimento geral na técnica (vi- de, por exemplo, as Patentes dos Estados Unidos n°s 5.561.071; 5.753.439; 6.214.545; Schena 1996; Bianchi etal., 1997; cada uma das quais é por este incorporada por meio de referência em suas totalidades) e/ou também pro- porcionadas por vendedores comerciais tais como Affymetrix, Inc. (Santa 5 Clara, CA). Além disso, as seqüências de ácido nucleico da presente inven- ção podem ser usadas como marcadores de peso molecular em procedi- mentos de análise de ácido nucleico.

A presente invenção também proporciona composições de subs- tâncias que compreendem:

a) uma seqüência de polinucleotídeos codificando um polipeptí-

deo compreendendo SEQ ID NO: 5, 9, 11, 13 ou 15 ou codificando um ou mais fragmentos de polipeptídeo de SEQ ID NOs: 5, 9, 11, 13 ou 15 confor- me determinado na Tabela 9, 10, 11, 12, 15, ou 16. Em vários aspectos da invenção, estes polinucleotídeos podem ter um teor de G+C de no mínimo

40% e menos de 50% ou um teor de G+C conforme determinado na Tabela 13;

b) uma seqüência de polinucleotídeos que é no mínimo 70% (ou uma percentagem conforme especificado na Tabela 14) idêntica à SEQ ID NO: 1, codifica um polipeptídeo compreendendo SEQ ID NO: 2 e tem um

teor de G+C de entre cerca de 40% e cerca de 50% (ou um teor específico de G+C conforme especificado na Tabela 13);

c) uma seqüência de polinucleotídeos no mínimo 8 nucleotídeos consecutivos de uma seqüência de polinucleotídeos conforme determinado em (a) ou (b);

d) uma seqüência de polinucleotídeos compreendendo SEQ ID

NO: 3, 4, 6, 7, 8, 10, ou 12 ou um fragmento de no mínimo 8 nucleotídeos consecutivos de SEQ ID NO: 3, 4, 6, 7, 8, 10, ou 12;

e) um polinucleotídeo que é complementar aos polinucleotídeos determinados em (a), (b), (c), ou (d);

f) um polinucleotídeo que hibridiza sob baixa, intermediária ou

elevada estringência com uma seqüência de polinucleotídeos conforme de- terminado em (a), (b), (c), (d) ou (e); g) um constructo genético compreendendo uma seqüência de polinucleotídeos conforme determinado em (a), (b), (c), (d) ou (e);

h) um vetor compreendendo um polinucleotídeo ou constructo genético conforme determinado em (a), (b), (c), (d), (e), (f) ou (g);

5 i) uma célula hospedeira compreendendo um vetor conforme

determinado em (h), um constructo genético conforme determinado em (g), ou um polinucleotídeo conforme determinado em qualquer uma de (a), (b), (c), (d) ou (e);

j) uma planta transgênica, célula de planta, ou parte de planta compreendendo um vetor conforme determinado em (h), um constructo ge- nético conforme determinado em (g) ou um polinucleotídeo conforme deter- minado em qualquer uma de (a), (b), (c), (d) ou (e); ou

k) uma sonda compreendendo um polinucleotídeo de acordo com (a), (b), (c), (d), (e) ou (f) e, opcionalmente, uma etiqueta ou marcador. A presente invenção também proporciona constructos genéticos

compreendendo: a) uma seqüência de polinucleotídeos codificando um poli- peptídeo compreendendo SEQ ID NO: 5, 9, 11, 13 ou 15, ou um fragmento dos mesmos; b) uma seqüência de polinucleotídeos tendo no mínimo cerca de 20% a 99,99% de identidade com uma seqüência de polinucleotídeos 20 codificando um polipeptídeo compreendendo SEQ ID NO: 5, 9, 11, 13 ou 15, ou um fragmento de SEQ ID NO: 5, 9, 11, 13 ou 15, em que o referido poli- peptídeo tem no mínimo uma das atividades biológicas de um polipeptídeo compreendendo SEQ ID NO: 5, 9, 11, 13 ou 15, ou um fragmento dos mes- mos; c) uma seqüência de polinucleotídeos codificando um polipeptídeo ten- 25 do no mínimo cerca de 20% a 99,99% de identidade com um polipeptídeo compreendendo SEQ ID NO: 5, 9, 11, 13 ou 15, ou um fragmento de SEQ ID NO: 5, 9, 11, 13 ou 15, em que o referido polipeptídeo tem no mínimo uma das atividades biológicas de um polipeptídeo compreendendo SEQ ID NO: 5, 9, 11, 13 ou 15, ou um fragmento dos mesmos; d) uma seqüência de polinu- 30 cleotídeos codificando um fragmento de um polipeptídeo compreendendo SEQ ID NO: 5, 9, 11, 13 ou 15, em que o referido fragmento tem no mínimo uma das atividades do polipeptídeo de SEQ ID NO: 5, 9, 11, 13 ou 15; e) uma seqüência de polinucleotídeos compreendendo SEQ ID NO: 3, 4, 6, 7, 8, 10, 12, ou 14; f) uma seqüência de polinucleotídeos tendo no mínimo cer- ca de 20% a 99,99% de identidade com a seqüência de polinucleotídeos de SEQ ID NO: 3, 4, 6, 7, 8, 10, 12, ou 14; g) uma seqüência de polinucleotí- 5 deos codificando constructo multimérico; ou h) um polinucleotídeo que é complementar aos polinucleotídeos determinados em (a), (b), (c), (d), (e), (f), ou (g). Constructos genéticos da presente invenção também pode conter elementos regulatórios adicionais tais como promotores e reforçadores e, opcionalmente, marcadores selecionáveis.

Também dentro do âmbito da presente presente invenção estão

vetores ou cassetes de expressão contendo constructos genéticos conforme determinado aqui, neste pedido de patente, ou polinucleotídeos codificando os polipeptídeos, determinados acima, encadeados operavelmente a ele- mentos regulatórios. Os vetores e cassetes de expressão podem conter se- 15 quências de controle transcricional adicional também. Os vetores e cassetes de expressão podem compreender adicionalmente marcadores selecioná- veis. O cassete de expressão pode conter no mínimo um gene adicional, encadeado operavelmente a elementos de controle, a ser co-transformado no organismo. Alternativamente, o um ou mais genes adicionais e um ou 20 mais elementos de controle podem ser proporcionados sobre múltiplos cas- setes de expressão. Os cassetes de expressão referidos também podem ser proporcionados com uma pluralidade de sítios de restrição para inserção das seqüências da invenção a estarem sob a regulação transcricional das regi- ões regulatórias. O um ou mais cassetes de expressão podem conter adicio- 25 nalmente genes marcadores selecionáveis encadeados operavelmente a elementos de controle.

O cassete de expressão incluirá na direção de transcrição 5-3’, uma região de iniciação transcricional e translacional, uma seqüência de DNA da invenção, e regiões de terminação transcricional e translacional. A 30 região de iniciação transcricional, o promotor, pode ser nativa ou análoga, ou estranha ou heteróloga, à célula hospedeira. Adicionalmente, o promotor pode ser a seqüência natural ou alternativamente uma seqüência sintética. Por "estranha" se pretende que a região de iniciação transcricional não é encontrada na planta nativa na qual a região de iniciação transcricional é introduzida. Conforme usado aqui, neste pedido de patente, um gene quimé- rico compreende uma seqüência codificante ligada operavelmente a uma 5 região de iniciação transcricional que é heteróloga à seqüência codificante.

Outro aspecto da invenção proporciona vetores para a clonagem e/ou a expressão de uma seqüência de polinucleotídeos ensinada aqui, nes- te pedido de patente. Vetores desta invenção, incluindo vetores de vacina, também podem compreender elementos necessários que permitem a ex- 10 pressão e/ou a secreção das referidas seqüências de nucleotídeos em uma dada célula hospedeira. O vetor pode conter um promotor, sinais para inicia- ção e para terminação de translação, bem como regiões apropriadas para regulação de transcrição. Em algumas modalidades, os vetores podem ser mantidos estavelmente na célula hospedeira e, opcionalmente, podem con- 15 ter seqüências de sinal dirigindo a secreção da proteína traduzida. Estes diferentes elementos são escolhidos de acordo com a célula hospedeira u- sada. Vetores podem se integrar no genoma hospedeiro ou, opcionalmente, ser vetores que se replicam autonomamente.

A presente invenção também proporciona a expressão de um 20 polipeptídeo ou fragmento de peptídeo codificado por uma seqüência de po- linucleotídeos revelada aqui, neste pedido de patente, compreendendo a cultura de uma célula hospedeira transformada com um polinucleotídeo da presente invenção sob condições que permitem a expressão do polipeptídeo e, opcionalmente, recuperando o polipeptídeo expressado.

As seqüências de polinucleotídeos reveladas também podem ser

reguladas por uma segunda seqüência de ácido nucleico de modo que a proteína ou peptídeo seja expressado em um hospedeiro transformado com a molécula de DNA recombinante. Por exemplo, expressão de uma proteína ou peptídeo pode ser controlada por qualquer promotor / elemento reforça- 30 dor conhecido na técnica. Promotores os quais podem ser usados para con- trolar expressão incluem, mas não estão limitados a, o promotor CMV-IE, a região do promotor precoce SV40 (Benoist e Chambon 1981), o promotor contido na repetição terminal 3' de extensão do Rous sarcoma vírus (Yama- moto et al., 1980), o promotor de timidina quinase de herpes simples (Wag- ner et al., 1981), as seqüências regulatórias do gene de metalotioneína (Brinster etal., 1982); vetores procarióticos contendo promotores tais como o 5 promotor de D-Iactamase (Villa-Kamaroff et al., 1978), ou o promotor tac (deBoer et al., 1983); vide também "Useful proteins from recombinant bacté- ria" em Scientific American, 1980, 242:74-94; vetores de expressão em plan- ta compreendendo a região promotora de nopalina sintetase (Herrera- Estrella et al., 1983) ou o promotor de RNA 35S do vírus do mosaico da cou- 10 ve-flor (Gardner et al., 1981), e o promotor da enzima fotossintética ribulose bifosfato carboxilase (Herrera-Estrella etal., 1984); elementos promotores de levedura ou fungos tais como o promotor Gal 4, o promotor ADC (álcool dei- drogenase), promotor PGK (fosfoglicerol quinase), e/ou o promotor da fosfa- tase alcalina.

Os vetores de acordo com a invenção são, por exemplo, vetores

de origem viral ou de plasmídeo. Em uma modalidade específica, é usado um vetor que compreende um promotor encadeado operavelmente a uma seqüência de ácido nucleico codificando proteína ou peptídeo contida dentro das seqüências de polinucleotídeos reveladas, uma ou mais origens de re- 20 plicação, e, opcionalmente, um ou mais marcadores selecionáveis (por e- xemplo, um gene de resistência a antibiótico). Vetores de expressão com- preendem seqüências regulatórias que controlam expressão genética, inclu- sive expressão genética em uma célula hospedeira desejada. Vetores e- xemplares para a expressão dos polipeptídeos da invenção incluem os veto- 25 res de plasmídeo do tipo pET (Promega) ou vetores de plasmídeo pBAD (In- vitrogen) ou os proporcionados nos exemplos abaixo. Além disso, os vetores de acordo com a invenção são úteis para transformar células hospedeiras de modo a clonar ou expressar as seqüências de polinucleotídeos da invenção.

A invenção também engloba as células hospedeiras transforma- das por um vetor de acordo com a invenção. Estas células podem ser obti- das introduzindo em células hospedeiras uma seqüência de nucleotídeos inserida em um vetor conforme definido acima, e em seguida cultivando as células referidas sob condições que permitem a replicação e/ou a expressão das seqüências de polinucleotídeos da presente invenção.

A célula hospedeira pode ser escolhida entre sistemas eucarióti- cos ou procarióticos, tais como por exemplo, células bacterianas, (Gram- 5 negativa ou Gram-positiva), células de levedura (por exemplo, Saccharomy- ees eereviseae ou Piehia pastoris), células animais (tais como células de ovário de hamster Chinês (CHO)), células de plantas, e/ou células de inseto usando vetores de baculovírus. Em algumas modalidades, as células hospe- deiras para expressão dos polipeptídeos incluem, e não estão limitadas a, 10 aquelas ensinadas nas Patentes dos Estados Unidos n°s 6.319.691, 6.277.375, 5.643.570, ou 5.565.335, cada uma das quais é incorporada por meio de referência em sua totalidade, incluindo todas as referências citadas dentro de cada patente respectiva.

Além disso, pode ser escolhida uma cepa de célula hospedeira a qual modula a expressão das seqüências inseridas, ou modifica e processa o produto genético no modo específico desejado. A expressão de alguns promotores pode ser elevada na presença de alguns indutores; portanto, a expressão do polipeptídeo produzido por engenharia genética pode ser con- trolada. Além do mais, diferentes células hospedeiras têm mecanismos ca- racterísticos e específicos para o processamento translacional e pós- translacional e modificação (por exemplo, glicosilação, fosforilação) de prote- ínas. Linhagens celulares apropriadas ou sistemas hospedeiros podem ser escolhidos para assegurar a modificação e processamento desejados da proteína estranha expressada. Por exemplo, a expressão em um sistema bacteriano pode ser usado para produzir um produto de proteína de núcleo não glicosilado. A expressão em levedura produzirá um produto glicosilado. A expressão em células de mamífero pode ser usada para assegurar glicosi- lação "nativa" de uma proteína heteróloga. Além do mais, diferentes siste- mas de expressão de vetor / hospedeiro podem efetuar reações de proces- sarnento para diferentes extensões.

Também são proporcionadas células de planta transformadas, sementes transgênicas, partes de planta transgênica e plantas transgênicas as quais contêm uma ou mais seqüências de polinucleotídeos, constructo genético, vetor, ou cassete de expressão compreendendo um ou mais dos polinucleotídeos revelados aqui, neste pedido de patente, ou fragmentos biologicamente ativos dos mesmos, encadeados operavelmente a elementos 5 de controle. Conforme usado aqui, neste pedido de patente, o termo "planta" inclui algas e plantas maiores (incluindo, mas não limitado a árvores). Deste modo, algas, monocotiledôneas, e dicotiledôneas podem ser transformadas com constructos genéticos da invenção, cassetes de expressão, ou vetores de acordo com a invenção. Em algumas modalidades preferenciais, plantas 10 de tabaco ou linhagens de células de tabaco são transformadas com cons- tructos genéticos de acordo com a presente invenção.

Portanto, polipeptídeos úteis na produção das composições ou protocolos de imunização discutidos neste pedido podem ser derivados ou obtidos a partir de uma célula de planta transgênica que foi produzida por 15 engenharia genética para expressar um polipeptídeo compreendendo (con- sistindo essencialmente em ou consistindo em) SEQ ID NO: 5, 9, 11, 13, 15, ou fragmentos dos mesmos. Vide, por exemplo, a Publicação do pedido de Patente dos Estados Unidos No: 2004/0268442 A1, cuja revelação é por es- te incorporada por meio de referência em sua totalidade.

Planta transgênica é aqui, neste pedido de patente, definida co-

mo uma cultura de células de planta, linhagem de células de planta, cultura de tecido de planta, planta inferior, planta monocotiledônea, planta dicotile- dônea, ou progênie ou parte das mesmas derivadas de uma célula de planta transformada ou protoplasto, em que o genoma da planta transformada con- 25 tém DNA estranho, introduzido por técnicas de laboratório, não presente ori- ginalmente em uma célula transgênica nativa, não-vegetal da mesma espé- cie. Os termos "planta transgênica" e "planta transformada" têm sido usados algumas vezes na técnica como termos sinônimos para definir uma planta cujo DNA contém uma molécula de DNA exógena. Onde apropriado, os poli- 30 nucleotídeos codificando os polipeptídeos determinados aqui, neste pedido de patente, podem ser otimizados para expressão nas plantas transforma- das, células de plantas ou partes de plantas. Isto é, os genes podem ser sin- tetizados usando códons para espécies preferenciais correspondentes às espécies de interesse. Estão disponíveis métodos na técnica para sintetizar, por exemplo, genes preferenciais para plantas. Vide, por exemplo, as Paten- tes dos Estados Unidos n°s 5.380.831 e 5.436.391, e Murray et al. (1989), 5 incorporadas aqui, a este pedido de patente, por meio de referência.

A construção de cassetes genéticos para expressar polipeptí- deos em plantas é prontamente realizada utilizando métodos de conheci- mento geral, tais como os revelados em Sambrook et al. (1989); e Ausubel et al. (1987).

Ao preparar os constructos desta invenção, os vários fragmentos

de DNA podem ser manipulados, de modo a proporcionar as seqüências de DNA na orientação apropriada, conforme adequado, na estrutura de leitura apropriada. Adaptadores ou ligantes podem ser empregados para unir os fragmentos de DNA ou outras manipulações podem ser envolvidos para pro- 15 poriconar sítios de restrição convenientes, remoção de DNA supérfluo, re- moção de sítios de restrição, ou semelhantes.

Ao realizar as várias etapas, se emprega clonagem, de modo a amplificar um vetor contendo o promotor / gene de interesse para subse- quente introdução nas células hospedeiras desejadas. Uma ampla variedade 20 de vetores de clonagem estão disponíveis, onde o vetor de clonagem inclui um sistema de replicação funcional em Escherichia coli (E. coli) e um mar- cador o qual permite a seleção das células transformadas. Vetores ilustrati- vos incluem pBR322, série pUC, pACYC184, série Bluescript (Stratagene) e etc. Portanto, a seqüência pode ser inserida no vetor em um ou mais sítios 25 de restrição apropriados, o plasmídeo resultante usado para transformar o hospedeiro de E. coli (por exemplo, E. coli cepas HB101, JM101 e DH5D), a E. coli cultivada em um meio nutriente apropriado e as células colhidas e Iisadas e o plasmídeo recuperado. A análise pode envolver análise de se- qüência, análise de restrição, eletroforese, ou semelhantes. Depois de cada 30 manipulação, a seqüência de DNA a ser usada no constructo final pode ser restrita e unida à próxima seqüência, onde cada um dos constructos parciais pode ser clonado no mesmo ou em diferentes plasmídeos. Vetores estão disponíveis ou podem ser prontamente prepara- dos para transformação de células de plantas. Em geral, plasmídeo ou veto- res virais devem conter todas as seqüências de controle de DNA necessá- rias tanto para manutenção quanto expressão de uma seqüência de DNA 5 heteróloga em um dado hospedeiro. As seqüências de controle referidas geralmente incluem uma seqüência líder e uma seqüência de DNA codifi- cando para códon de sinal de iniciação de translação, um códon terminador de translação, e uma seqüência de DNA codificando para um sinal 3' UTR controlando o processamento de RNA mensageiro. A seleção de elementos 10 apropriados para otimizar expressão em qualquer espécie particular é um questão de conhecimento ordinário na técnica utilizando os ensinamentos desta descoberta. Finalmente, os vetores devem ter desejavelmente um ge- ne marcador que é capaz de proporcionar uma propriedade fenotípica a qual permite a identificação de células hospedeiras contendo o vetor.

A atividade da seqüência codificante estranha inserida nas célu-

las de plantas é dependente da influência de DNA de planta endógeno adja- cente ao inserto. Geralmente, a inserção de genes heterólogos parece ser aleatória usando qualquer técnica de transformação; no entanto, existe tec- nologia para produzir plantas com recombinação de sítio específica de DNA 20 em células de plantas (vide a publicação de patente internacional WO N0 91/09957). Qualquer método ou combinação de métodos resultante na ex- pressão da seqüência ou seqüências desejadas sob o controle do promotor é aceitável.

A presente invenção não está limitada a qualquer método parti- 25 cular para transformar células de plantas. A tecnologia para introduzir DNA em células de plantas é de conhecimento geral daqueles versados na técni- ca. Foram descritos quatro métodos básicos para liberar DNA estranho den- tro das células de plantas. Métodos químicos (Graham and van der Eb, 1973; Zatloukal et al., 1992); métodos físicos incluindo microinjeção (Capec- 30 chi, 1980), eletroporação (Wong e Neumann 1982; Fromm et al., 1985; Pa- tente dos Estados Unidos n° 5.384.253) e a pistola genética (Johnston and Tang, 1994; Fynan et al., 1993); métodos virais (Clapp, 1993; Lu et al., 1993; Eglitis and Anderson 1988; Eglitis et al., 1988); e métodos mediados por re- ceptor (Curiel etal., 1991; Curiel etal., 1992; Wagner etal., 1992).

A introdução de DNA em células de plantas por meios de eletro- poração é de conhecimento geral daqueles versados na técnica. Enzimas de 5 degradação da parede de células vegetais, tais como enzimas de degrada- ção de pectina, são usadas por render células reciientes mais sucetiveis à transformação por eletroporação do que células não-tratadas. Para realizar transformação por eletroporação pode-se empregar ou tecidos friáveis tais como uma cultura de suspensão de células, ou calo embriogênico, ou em- 10 briões imaturos ou outros tecidos organizados diretamente. Geralmente é necessário degradar parcialmente as paredes celulares do material da planta alvo com enzimas de degradação de pectina ou ferindo mecanicamente em uma maneira controlada. O material de planta tratado referido está pronto para receber DNA estranho por eletroporação.

Outro método para liberar DNA transformante estranho para cé-

lulas de plantas é por bombardeamento de microprojéteis. Neste método, micropartículas são revestidas com DNA estranho e liberadas dentro de cé- lulas por uma força propelente. As micro partículas referidas são tipicamente compostas de tungstênio, ouro, platina, e metais similares. Uma vantagem 20 do bombardeamento de microprojéteis é que não é necessário nem o isola- mento de protoplastos (Cristou et al., 1988) nem a suscetibilidade à infecção por Agrobacterium. Uma modalidade ilustrativa de um método para liberar DNA em células de milho por aceleração é um Sistema de Liberação de Par- tículas Biolistics (Biolistics Particle Delivery System), o qual pode ser usado 25 para impelir partículas revestidas com DNA ou células através de uma tela sobre uma superfície de filtro coberta com células de milho cultivadas em suspensão. A tela dispersa as partículas de modo que não sejam liberadas para as células receptoras em grandes agregados. Para o bombardeamento, células em suspensão são preferencialmente concentradas sobre filtros ou 30 meio de cultura sólido. Alternativamente, embriões imaturos ou outras célu- las-alvo podem ser arranjados sobre meio de cultura sólido. As células a se- rem bombardeadas são posicionadas em uma distância apropriada abaixo da placa de parada de macroprojéteis. Em transformação de bombardea- mento, pode-se otimizar as condições de cultura pré-bombardeamento e os parâmetros de bombardeamento para produzir os números máximos de transformantes estáveis. Tanto os parâmetros físicos quanto biológicos para 5 bombardeamento são importantes nesta tecnologia. Fatores físicos são os que envolvem manipular o precipitado de DNA / microprojétil ou os que afe- tam o vôo e a velocidade de quaisquer dos microprojéteis. Fatores biológicos incluem todas as etapas envolvidas na manipulação de células antes e ime- diatamente depois de bombardeamento, o ajuste osmótico de células-alvo 10 para ajudar a aliviar o trauma associado com bombardeamento, e também a natureza do DNA transformante, tal como DNA Iinearizado ou plasmídeos superespiralados intactos.

Transferência mediada por Agrobacterium é um sistema ampla- mente aplicável para introduzir DNA estranho em células de plantas porque 15 o DNA pode ser introduzido em tecidos de planta sadios, eliminando a ne- cessidade de regenerar uma planta intacta de um protoplasto. O uso de ve- tores integrando plantas mediadas por Agrobacterium para introduzir DNA em células de plantas é de conhecimento geral na técnica. Vide, por exem- plo, os métodos descritos em Fraley et al. (1985) e Rogers et al. (1987). Adi- 20 cionalmente, a integração do Ti-DNA é um processo relativamente preciso resultando em poucas redisposições. A região de DNA a ser transferida é definida pelas seqüências de borda, e DNA intermediário é geralmente inse- rido no genoma da planta conforme descrito em Spielmann et al. (1986) e Jorgensen etal. (1987).

Vetores de transformação de Agrobaeterium modernos são ca-

pazes de replicação em E. coli bem como Agrobaeterium, permitindo mani- pulações convenientes. Além disso, recentes avanços tecnológicos em veto- res para transferência genética mediada por Agrobaeterium aprimoraram a disposição de genes e sítios de restrição nos vetores para facilitar a constru- 30 ção de vetores capazes de expressar várias proteínas ou polipeptídeos. Re- giões multiligantes convenientes flanqueadas por um promotor e um sítio de poliadenilação para expressão direta de genes codificando polipeptídeos inseridos são adequados para os presentes fins. Além disso, Agrobacterium contendo tanto genes Ti armados quanto desarmados podem ser usados para as transformações.

A transformação de protoplastos de plantas pode ser obtida u- 5 sando métodos baseados em precipitação de fosfato de cálcio, tratamento de polietileno glicol, eletroporação, e combinações destes tratamentos (vide, por exemplo, Potrykus et al., 1985; Marcotte et al., 1988). A aplicação destes sistemas a diferentes espécies de plantas depende da capacidade para re- generar as espécies particulares de protoplastos.

Uma vez que as células de plantas tenham sido transformadas,

selecionadas e verificadas para expressão de antígeno, é possível em al- guns casos regenerar plantas férteis saudáveis. Isto dependerá grandemen- te das espécies de plantas escolhidas. Métodos para regenerar numerosas espécies de plantas foram relatados na literatura e são de conhecimento 15 geral do técnico versado. Para a prática da presente invenção, é preferencial transformar linhagens de células de plantas que podem ser cultivadas e es- caladas rapidamente evitando a etapa de regeneração geralmente longa. Além disso, o uso de culturas de células de plantas evita produção em cam- po aberto e reduz grandemente as probabilidades de fuga genética e conta- 20 minação alimentar. Culturas de células de suspensão de tabaco tais como NT-1 e BY-2 (An, 1985) são preferenciais porque estas linhagens são parti- cularmente suscetíveis a manuseio em cultura, são prontamente transforma- das, produzem eventos integrados estavelmente e são suscetíveis a criopre- servação.

A linhagem celular dé suspensão de tabaco, NT-1, é adequada

para a prática da presente invenção. Células NT-1 foram originalmente de- senvolvidas a partir de Nicotiana tabacum L.cv. amarelo brilhante 2. A linha- gem celular NT-1 é amplamente usada e está prontamente disponível; em- bora, qualquer linhagem celular de suspensão de tabaco seja consistente 30 com a prática da invenção. Células NT-1 adequadas para uso nos exemplos abaixo estão disponíveis na American Type Culture Collection sob o número de acesso ATCC n° 74840. Vide também a Patente dos Estados Unidos n° 6.140.075, aqui, neste pedido de patente, incorporada por meio de referên- cia em sua totalidade.

Têm sido descritos muitas técnicas de cultura de células de plan- tas e sistemas variando de frascos de agitador em escala laboratorial a va- sos de biorreator de vários milhares de litros e são de conhecimento geral na técnica da cultura de células de plantas. Vide, por exemplo, Fischer, R. et al (1999) e Doran, P. (2000). Depois das células de plantas transformadas te- rem sido cultivadas até a massa desejada, elas são colhidas, gentilmente lavadas e colocadas em um tampão adequado para disrupção. Muitos tam- pões diferentes são compatíveis com a presente invenção. Em geral o tam- pão é uma solução aquosa salina tamponada isotônica em ou proximo a um valor de pH neutro, com ou sem detergente para solubilizar proteínas ligadas à membrana. Preferencial tampões incluem Salina Tamponada com Fosfato de Dulbecco, PBS contendo 1 mM de EDTA, e MOPS (ácido 3-(N- Morfolino)propanossulfônico).

Em uma modalidade, células podem ser rompidas por sonica- ção. As células lavadas são colocadas em tampão em uma faixa de cerca de 0,01 mg/ml a cerca de 5,0 mg/ml, preferencialmente em uma faixa de cerca de 0,1 mg/ml a cerca de 0.5 mg/ml (lavadas células em peso por volume de 20 tampão). Muitos instrumentos de sonicação disponíveis comercialmente são consistentes com a invenção e os tempos de sonicação variam a partir de cerca de 5 a cerca de 20 segundos, preferencialmente cerca de 15 a cerca de 20 segundos. Os fragmentos celulares resultantes podem variar de tama- nho a partir de algumas micra até várias centenas de micra e expõem o poli- 25 peptídeo ou fragmentos imunogênicos do mesmo.

A presente invenção também refere-se a composições de vaci- nas de DNA que podem ser empregadas para provocar uma reação imune ou uma reação imune protetora. Neste aspecto da invenção, uma quantida- de de uma composição compreendendo DNA recombinante ou mRNA codi- 30 ficando um polipeptídeo conforme proporcionado aqui, neste pedido de pa- tente, (ou um fragmento do mesmo) é administrada a um indivíduo em uma quantidade suficiente para provocar uma reação imune ou reação imune pro- tetora no referido indivíduo. Seqüências de sinal podem ser deletadas do ácido nucleico codificando um antígeno de interesse e o indivíduo pode ser monitorado para a indução de uma reação imune de acordo com métodos conhecidos na técnica. Uma "reação imune protetora" ou "reação imune te- 5 rapêutica" se refere a uma reação imune CTL (ou célula T CD8+), uma HTL (ou célula T CD4+), e/ou uma reação imune humoral protetora contra um an- tígeno que, de algum modo, previne ou no mínimo detém parcialmente sin- tomas de doença, efeitos colaterais ou progressão. No contexto desta inven- ção, uma reação protetora ou terapêutica semelhante proporciona aumento 10 das taxas e sobrevida (reduzida mortalidade) em indivíduos imunizados comparados com indivíduos não imunizados ou uma redução na dissemina- ção viral em indivíduos imunizados estimulados com o vírus West Nile.

Em outra modalidade, a presente invenção compreende adicio- nalmente a administração de vacinas de polinucleotídeos (DNA) em combi- 15 nação com um antígeno de polipeptídeo, ou composição dos mesmos, da invenção. Em uma modalidade preferencial, o antígeno é o polipeptídeo que é codificado pelo polinucleotídeo administrado como a vacina de polinucleo- tídeo. Como uma modalidade particularmente preferencial, o antígeno de polipeptídeo é administrado como um reforço subsequente à administração 20 inicial da vacina de polinucleotídeo.

Uma modalidade adicional da presente invenção proporciona a indução de uma reação imune aos novos antígenos do vpirus West Nile re- velados aqui, neste pedido de patente, (vide, por exemplo, os polipeptídeos e fragmentos de peptídeos determinados aqui, neste pedido de patente) u- 25 sando um regime de vacinação "prime-boosf de conhecimento daqueles versados na técnica. Neste aspecto da invenção, uma vacina de DNA ou antígeno de polipeptídeo da presente invenção é administrada a um indiví- duo em uma quantidade suficiente para "disparar" a reação imune do indiví- duo. A reação imune do indivíduo é em seguida "reforçada" através da ad- 30 ministração de: 1) um ou uma combinação de: um peptídeo, polipeptídeo, e/ou antígeno de polipeptídeo de extensão total da presente invenção (op- cionalmente em combinação com uma molécula imunoestimulatória e/ou um adjuvante); ou 2) um vetor viral que contém ácido nucleico codificando um, ou mais, dos mesmos constructos de antígeno ou, opcionalmente, diferen- tes, e/ou antígenos de peptídeos determinados aqui, neste pedido de paten- te. Em algumas modalidades alternativas da invenção, um gene codificando 5 uma molécula imunoestimulatória pode ser incorporada no vetor viral usado para "reforçar a reação imune do indivíduo. Moléculas imunoestimulatórias exemplares incluem, e não estão limitadas a, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-15, 11-16, 11-18, IL-23, IL-24, eritropoietina, G- CSF, M-CSF, fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF), MSF, Ii- 10 gante de FLT-3, EGF, fator de crescimento de fibroblasto (FGF; por exem- plo, aFGF (FGF-1), bFGF (FGF-2), FGF-3, FGF-4, FGF-5, FGF-6, ou FGF- 7), fatores de crescimento semelhantes à insulina (por exemplo, IGF-1, IGF- 2); fator de crescimento endotelial vascular (VEGF); interferons (por exem- plo, IFN-D, IFN-D1 IFN-D); fator inibitório de leucemia (LIF); fator neurotrófico 15 ciliar (CNTF); oncostatina M; fator de células-tronco (SCF); fatores de cres- cimento transformar (por exemplo, TGF-a, TGF-βΙ, TGF-p2, TGF-P3), ou quimocinas (tais como, mas não limitadas a, BCA-1/BLC-1, BRAK/Kec, CX- CL16, CXCR3, ENA-78/LIX, Eotaxin-1, Eotaxin-2/MPIF-2, Exodus-2/SLC, Fractalkine/Neurotactin, GROalpha/MGSA, HCC-1, l-TAC, Lymphotac- 20 tin/ATAC/SCM, MCP-1/MCAF, MCP-3, MCP-4, MDC/STCP-1, ABCD-1, MIP- 1 □, MIP-1 □, MIP-2D/GROD, MIP-3D/Exodus/LARC, MIP-3D/Exodus-3/ELC, MIP-4/PARC/DC-CK1, PF-4, RANTES, SDF1 □, TARC, ou TECK). Genes codificando estas moléculas imunoestimulatórias são de conhecimento da- queles versados na técnica e seqüências codificantes podem ser obtidas a 25 partir de uma variedade de fontes, incluindo vários bancos de dados de pa- tentes, bancos de dados disponíveis publicamente (tais como os bancos de dados de ácidos nucleicos e proteínas encontrados na National Library of Medicine ou no European Molecular Biology Laboratory), a literatura científi- ca, ou literatura científica citada em catálogos produzidos por empresas tais 30 como Genzyme, Inc., R&D Systems, lnc, ou InvivoGen, Inc. [vide, por exem- plo, o catálogo de 1995 Cytokine Research Products, Genzyme Diagnostics, Genzyme Corporation, Cambridge MA; 2002 ou 1995 Catalog of R&D Sys- tems, Inc (Minneapolis, MN); ou 2002 Catalog of InvivoGen1 Inc (San Diego1 CA) cada das quais é incorporada por meio de referência em sua totalidade, incluindo todas as referências citadas no mesmo].

Métodos para introduzir vacinas de DNA em indivíduos são de 5 conhecimento geral do técnico versado. Por exemplo, DNA pode ser injetado no músculo esquelético ou outros tecidos somáticos (por exemplo, injeção intramuscular). Lipossomas catiônicos ou dispositivos biolísticos, tais como uma pistola genética, podem ser usados para liberar vacinas de DNA. Alter- nativamente, iontoforese e outros meios para transmissão transdérmica po- 10 dem ser usados para a introdução de vacinas de DNA em um indivíduo.

Vetores virais para uso na presente invenção podem ter uma porção do genoma viral eliminado para introduzir novos genes sem destruir a infectividade do vírus. O vetor viral da presente invenção é, tipicamente, um vírus não-patogênico. A critério do profissional, o vetor viral pode ser sele- 15 cionado de modo a infectar um tipo celular específico, tal como células apre- sentando antígeno competente (por exemplo, macrófago ou células dendríti- cas). Alternativamente, um vetor viral pode ser selecionado que é capaz de infectar qualquer célula no indivíduo. Vetores virais exemplares adequadas para uso na presente invenção incluem, mas não estão limitados a poxvírus 20 tais como vírus de varíola bovina (vaccinia), avipox vírus, fowlpox vírus, um vírus de varíola bovina altamente atenuado (tal como Ankara ou MVA [Vac- cinia Ankara Modificado]), retrovírus, adenovírus, baculovírus e semelhantes. Em uma modalidade preferencial, o vetor viral é Ankara ou MVA.

Estratégias gerais para construção de vetores de expressão do 25 vírus de varíola bovina são conhecidos na técnica [vide, por exemplo, Smith e Moss, 1984; Patente dos Estados Unidos n° 4.738.846 (por este incorpo- rada por meio de referência em sua totalidade)]. Sutter e Moss (1992) e Sut- ter et al. (1994) revelam a construção e uso como um vetor, um vírus Ankara recombinante não-replicante (MVA) o qual pode ser usado como um vetor 30 viral na presente invenção.

Composições compreendendo os polinucleotídeos em questão podem incluir vetores de vacinas de ácidos nucleicos apropriados (plasmí- deos), os quais estão disponíveis comercialmente (por exemplo, Vical, San Diego, CA) ou outros vetores de ácidos nucleicos (plasmídeos), os quais também estão disponíveis comercialmente (por exemplo, Valenti, Burlinga- me, CA). Alternativamente, composições compreendendo vetores virais e 5 polinucleotídeos de acordo com a presente invenção também são proporcio- nadas pela presente invenção. Além disso, as composições podem incluir um veículo farmaceuticamente aceitável, por exemplo, salina. Os veículos farmaceuticamente aceitáveis são de conhecimento geral na técnica e tam- bém estão disponíveis comercialmente. Por exemplo, os veículos aceitáveis 10 referidos são descritos em E.W. Martin's Remington's Pharmaceutical Scien- ce, Mack Publishing Company, Easton, PA.

Todas as patentes, pedidos de patente, pedidos provisórios, e publicações referidos ou citados aqui, neste pedido de patente, são incorpo- rados por meio de referência em sua totalidade, incluindo todas as figuras e tabelas, na medida que não sejam inconsistents com os explícitos ensina- mentos nesta especificação.

Seguem-se exemplos os quais ilustram procedimentos para pra- ticar a invenção. Estes exemplos não devem ser considerados como Iimitan- tes. Todas as percentagens são em peso e todas as proporções de misturas de solvente são em volume a menos que mencionado de modo diverso.

EXEMPLO 1 - OTIMIZAÇÃO DE SEQÜÊNCIA DE ÁCIDO NUCLEICO PARA

EXPRESSÃO EM PLANTAS

Antecedentes

Para obter maiores níveis de expressão de um gene heterólogo 25 em plantas, pode ser preferencial a reengenharia da seqüência codificando proteína do gene de modo a ser expressado de modo mais eficaz em células de plantas. Tabaco é uma planta semelhante onde pode ser preferencial re- desenhar a região codificante de proteína heteróloga antes da transformação para aumentar o nível de expressão do gene e o nível de proteína codificada 30 na planta. Portanto, uma etapa adicional no desenho de um gene codifican- do uma proteína de vírus de mamífero é reengenharia de um gene heterólo- go para expressão ótima. Um motivo para a reengenharia de um gene codificando uma proteína de vírus de mamífero para expressão em tabaco é devido ao teor de G+C não-ótimo do gene de vírus mamífero nativo. Por exemplo, o baixo teor de G+C de muitos genes de vírus mamífero nativos (e conseqüente in- 5 clinando a direção do teor A+T alto) resulta na generação de seqüência que mimicam ou duplicam as seqüências de controle de gene de planta que são conhecidas por serem ricas altamente em A+T. A presença de algumas se- qüências ricas em A+T dentro do DNA de um ou mais genes introduzidos em plantas (por exemplo, regiões de TATA-box normalmente encontradas 10 em promotores genéticos) pode resultar em transcrição aberrante do um ou mais genes. Por outro lado, a presença de outras seqüências regulatórias inerentes no mRNA transcrito (por exemplo, seqüências de sinal de poliade- nilação (AAUAAA), ou seqüências complementares a pequenos RNAs nu- cleares envolvidos em unir pré-mRNA) pode levar a instabilidade de RNA. 15 Portanto, um objetivo no desenho de genes codificando uma proteína de vírus de mamífero para expressão de tabaco, mais preferencialmente referi- dos como um ou mais genes otimizados por planta, é gerar uma seqüência de DNA tendo um teor de G+C próximo ao da média de regiões codificantes de gene de tabaco. Outro objetivo no desenho do um ou mais genes otimi- 20 zados por planta codificando uma proteína de vírus de mamífero é gerar uma seqüência de DNA na qual as modificações das seqüências não impe- dem translação.

O teor de G+C das regiões codificantes de 1343 genes de taba- co é calculado como sendo de 43,6%. Portanto é preferencial, ao desenhar um gene heterólogo codificando uma proteína de vírus de mamífero, atingir um teor de G+C próximo a cerca de 44%.

Devido à plasticidade proporcionada pela redundância / degene- ração do código genético (isto é, alguns aminoácidos são especificados por mais de um códon), a evolução dos genomas em diferentes organismos ou 30 classes de organismos resultou em uso diferencial de códons redundantes. Esta "propensão de códons" é refletida na composição de bases média de regiões codificantes de proteína. Por exemplo, organismos com teores de G+C relativamente baixos utilizam códons tendo A ou T na terceira posição de códons redundantes, ao passo que aqueles tendo maiores teores de G+C utilizam códons tendo G ou C na terceira posição de códons. Imagina-se que a presença de códons "menores" dentro de um mRNA pode reduzir a taxa 5 de translação absoluta daquele mRNA, especialmente quando a relativa a- bundância do tRNA carregado correspondente ao menor códon é baixa. Uma extensão deste conceito é que a diminuição da taxa de translação por códons menores individuais seria no mínimo aditivo para múltiplos códons menores. Portanto, mRNAs tendo teores altos relativos de códons menores 10 teriam taxas de translação correspondentemente baixas. Esta taxa seria re- fletida por baixos níveis subsequentes da proteína codificada.

Para ajudar na produção de genes codificando uma proteína de vírus de mamífero para expressão em tabaco (ou em outra planta, tal como algodão, milho, ou soja), pode ser determinada a propensão de códons de 15 genes de tabaco (ou outros genes de plantas relevantes). A propensão de códons para regiões codificantes de proteína genética de tabaco é represen- tada pela distribuição de códons estatística que a planta usa para codificar suas proteínas, e é mostrada na Tabela 1, expressada como a frequência (em percentagens) com a qual cada códon especificando um único aminoá- 20 cido é usado para codificar o aminoácido. Os códons mais preferenciais pela planta são determinados, bem como a segunda, terceira, ou quarta escolhas de códons preferenciais quando existem múltiplas escolhas. Uma nova se- qüência de DNA pode ser então designada a qual codifica a seqüência de aminoácidos da proteína de vírus de mamífero, mas a nova seqüência de 25 DNA difere da seqüência de DNA ou RNA de vírus de mamífero nativo (codi- ficando a proteína) pela substituição dos códons (primeiro preferencial, se- gundo preferencial, terceiro preferencial, ou quarto preferencial) da planta para especificar o aminoácido apropriado em cada posição dentro da se- qüência de aminoácidos da proteína. A nova seqüência pode ser então ana- 30 Iisada para sítios de reconhecimento de enzimas de restrição que podem ter sido criadas pelas modificações. Os sítios identificados são adicionalmente modificados substituindo os códons relevantes com primeira, segunda, ter- ceira, ou quarta escolha de códons preferenciais. Outros sítios na seqüência os quais podem afetar transcrição ou translação do gene de interesse inclu- em as junções éxon:íntron (5’ ou 3'), sinais de poli A adição, ou sinais de terminação de RNA polimerase. A seqüência modificada é adicionalmente analisada e adicionalmente modificada para reduzir a frequência de dubletos TA ou CG, e para aumentar a frequência de dubletos TG ou CT. Além des- tes dubletos, blocos de seqüências que têm mais de cerca de cinco resíduos consecutivos de [G+C] ou [A+T] podem afetar a transcrição ou translação da seqüência. Portanto, estes blocos de seqüências também são modificados substituindo os códons de primeira ou segunda escolha, e etc. com outros códons preferenciais de escolha. Códons raramente usados não são incluí- dos em uma extensão substancial no design genético, sendo usados somen- te quando necessário para conciliar um critério de design diferente da com- posição de códon per se (por exemplo, adição ou eliminação de sítios de reconhecimento de enzimas de restrição).

O método descrito acima permite a uma pessoa versada na téc- nica desenhar um ou mais genes modificados que são estranhos para uma planta em particular de modo que os genes são otimamente expressados em plantas. O método é adicionalmente descrito e ilustrado na Patente dos Es- 20 tados Unidos Número 5.380.831 e no pedido de patente internacional WO N0 97/13402.

Portanto, de modo a desenhar genes otimizados de plantas codi- ficando uma proteína de vírus de mamífero, uma seqüência de DNA é dese- nhada para codificar a seqüência de aminoácidos da referida proteína utili- 25 zando um código genético redundante estabelecido a partir de uma tabela de propensão de códons compilada a partir das seqüências genéticas para a planta ou plantas em particular. A seqüência de DNA resultante tem um mai- or grau de diversidade de códons, uma composição de base desejável, pode conter sítios de reconhecimento de enzima de restrição dispostos estrategi- 30 camente, e carece de seqüências que podem interferir com transcrição do gene, ou translação do mRNA do produto. Portanto, genes sintéticos que são funcionalmente equivalentes para as proteínas / genes da presente in- venção podem ser usados para transformar hospedeiros, inclusive plantas. Orientação adicional referente à produção de genes sintéticos pode ser en- contrada, por exemplo, na Patente dos Estados Unidos n° 5.380.831.

Uma vez que a referida seqüência de DNA tenha sido desenha- 5 da sobre papel ou in sílico, moléculas de DNA reais podem ser sintetizadas no laboratório para corresponder em seqüência precisamente à seqüência designada. As moléculas de DNA sintético referidas podem ser clonadas e manipuladas de modo diverso exatamente como se fossem derivadas de fontes naturais ou nativas.

Desenho de regiões codificantes com propensão para tabaco para peptídeos prM-M-E de WNV.

Toda a seqüência genômica de um isolado de flamingo do Vírus West Nile é revelada como GenBank Acesso n° AF196835. A seqüência de DNA de 2004 pares de bases (pb) da porção do genoma viral nativo que co- 15 difica os peptídeos prM, M e E do vírus são representadas na SEQ ID NO: 1 pelos nucleotídeos 1-276 (peptídeo prM), 277-501 (peptídeo M), e 502-2004 (peptídeo E) [A SEQ ID NO: 1 compreende as bases 466 a 2469 de AF196835]. Para os fins deste exemplo, a seqüência de nucleotídeos nativa será referida como Versão 1. As seqüências de aminoácidos dos peptídeos 20 prM, MeE codificadas por SEQ ID NO: 1 são apresentadas como SEQ ID NO: 2. O exame da seqüência de DNA genômica nativa de SEQ ID NO: 1 revelou a presença de vários motivos de seqüências que se considera que sejam prejudiciais para expressão de planta ótima, bem como uma composi- ção de códons não-ótima para expressão em tabaco. Para melhorar a pro- 25 dução destas proteínas recombinantes em tabaco, foi desenvolvida uma se- qüência de DNA "otimizada por tabaco" (SEQ ID NO: 3) que codifica os pep- tídeos prM, M, e E de SEQ ID NO: 2

Os peptídeos prM, M, e E (SEQ ID NO: 2) codificados pela se- qüência da região codificante nativa em SEQ ID NO: 1 e pela região codifi- cante otimizada por tabaco em SEQ ID NO: 3 são idênticos. Em contraste, a seqüência de DNA viral nativa e a seqüência de DNA otimizada por tabaco codificando os peptídeos prM, MeE são somente 78,7% idênticas. Desenho de regiões codificantes com propensão para tabaco para peptídeos prM-M-E de WNV com sítio de N-glicosilacão modificado.

É conhecido dentro do campo da bioquímica de proteínas vege- tais que vários açúcares ou oligossacarídeos podem ser fixados a moléculas 5 de proteína (o processo referido sendo referido coletivamente como glicosi- lação), e que a composição e a apresentação de semelhantes porções de açúcar podem afetar a antigenicidade da proteína quando introduzida em mamíferos. É adicionalmente conhecido que as seqüências de aminoácido curtas Asparagina-Xaa-Serina1 e Asparagina-Xaa-Treonina (abreviadas co- 10 mo Asn-Xaa-Ser/Thr ou N-X-S/T, onde Xaa e X representam quaisquer dos 20 aminoácidos normalmente encontrados em proteínas) podem servir como sítios aceptores para ligações de glicosilação nas proteínas, em que os açú- cares são fixados ao resíduo Asn (N). A seqüência aceitadora de N- glicosilação Asn-Tyr-Ser é encontrada como aminoácidos 321 a 323 na SEQ 15 ID NO: 2, e é um sítio de N-glicosilação conhecido para o peptídeo E. A SEQ ID NO: 4 revela uma seqüência de DNA otimizada por tabaco codificando os peptídeos prM, M e E1 em que a seqüência de DNA codificando a seqüência aceitadora de N-glicosilação Asn-Tyr-Ser do peptídeo E nativo foi mutada para codificar Asn-Tyr-Pro. Portanto, a única diferença entre a SEQ ID NO: 3 20 e a SEQ ID NO: 4 é a substituição de um códon CCA prolina pelo códon AGC Serina nas bases 967 a 969. A seqüência de aminoácidos da proteína mutada, carecendo da seqüência aceitadora de N-glicosilação, e codificada pela SEQ ID NO: 4, é revelada como SEQ ID NO: 5.

Região codificante de peptídeos M e E de WNV com propensão para tabaco Versão 2.

Para algumas utilidades, é desejável utilizar uma seqüência de DNA que codifica somente os peptídeos M e E do Vírus West Nile. Para ex- pressão em céulas de tabaco, é suficiente usar a porção de SEQ ID NO: 3 que codifica estes peptídeos (isto é, bases 277-2004 de SEQ ID NO: 3). Por- 30 tanto, a seqüência de uma região codificante com propensão para tabaco codificando os peptídeos M e E de WNV é apresentada como SEQ ID NO: 6. Esta seqüência codifica os resíduos 93-668 de SEQ ID NO: 2. A seqüência de DNA viral nativa codificando os peptídeos MeE (bases 277-2004 de SEQ ID NO: 1) e a seqüência de DNA otimizada por tabaco de SEQ ID NO: 6, a qual também codifica os peptídeos MeE, são somente 78,4% idênticas, enquanto as proteínas codificadas são 100% idênticas.

5 Desenho de região codificante de peptídeos M e E de WNV com propensão para tabaco Versão 3.

Frequentemente é desejável e vantajoso introduzir mais de uma única cópia de um gene codificando uma proteína em uma célula de planta de modo a produzir maiores níveis da proteína desejada. As cópias separa- 10 das da região codificante de proteína podem ser introduzidas com cada có- pia sob os controles de expressão de promotores separados e elementos de controle transcricionais associados, ou podem ser introduzidas como uma unidade sob o controle de expressão de um único promotor de planta bidire- cional. Em qualquer caso é desejável e vantajoso que as regiões codifican- 15 tes de proteína separadas tenham seqüências de DNA não-idênticas. Há duas ou mais razões biológicas porque isto é assim. Primeiro, é conhecido que grandes seqüências de DNA duplicadas são instáveis em muitas cepas bacterianas usadas como hospedeiros de clonagem molecular (por exemplo, Escherichia eoii) ou em transformação de planta (Agrobaeterium tumefaei- 20 ens). Portanto, a provisão de regiões codificantes não-idênticas especifican- do proteínas idênticas reduz a oportunidade de redisposições prejudiciais e/ou eliminações ocorrerem durante estas manipulações. Segundo, imagina- se que a expressão de regiões codificantes altamente homólogas duplicadas em plantas transgênicas pode sofrer através de mecanismos tais como si- 25 Ienciamento genético. A introdução de regiões codificantes não-idênticas especificando proteínas idênticas portanto proporciona maior oportunidade para maiores níveis de produção de proteína (e mais estável).

Usando os fundamentos resumidos acima, uma segunda região codificante otimizada por tabaco para os peptídeos M e E de WNV foi desig- nada e é revelada como SEQ ID NO: 7. É enfatizado que a proteína codifi- cada por SEQ ID NO: 7 é idêntica à codificada por bases 277-2004 da se- qüência nativa de SEQ ID NO: 1 (isto é, resíduos 93-668 de SEQ ID NO: 2), e a qual é também codificada pela versão prévia otimizada por tabaco reve- lada na SEQ ID NO: 6. Comparações da segunda seqüência otimizada por tabaco revelada na SEQ ID NO: 7 com bases 277-2004 da seqüência nativa em SEQ ID NO: 1, e com a primeira versão otimizada por tabaco em SEQ ID. NO: 6, revela que é 74,6 % idêntica à seqüência de WNV nativa corres- pondente, e 69,4 % idêntica à primeira versão otimizada por tabaco. Portan- to, é evidente que pode-se gerar diversidade de seqüência de DNA substan- cial entre diferentes designs de região codificante otimizada por planta, en- quanto ainda permanecendo dentro dos limites da seqüência de aminoáci- dos da proteína codificada, composição de códons global, e a ausência de seqüências que podem ser prejudiciais para expressão genética em planta. Esta característica da invenção é ilustrada na Tabela 2, a qual apresenta as composições de códons diferenciais das três seqüências de DNA reveladas. Modificações adicionais das regiões codificantes dos peptídeos prM. MeE de WNV otimizados por tabaco.

É de conhecimento daqueles versados no campo da expressão genética de plantas transgênicas que os níveis de acreção de proteínas he- terólogas são dependentes de muitas variáveis, uma das quais é a localiza- ção intracelular para a qual a proteína é dirigida durante ou depois de trans- 20 lação. Além disso, é adicionalmente conhecido que a translocação de uma proteína heteróloga para o retículo endoplasmático (ER) pode ter um efeito positivo sobre a acumulação da proteína, e que uma proteína heteróloga pode ser dirigida para acumulação dentro do retículo endoplasmático pela adição de um peptídeo tendo por alvo retículo endoplasmático curto ao tér- 25 mino amino da proteína. As proteínas zeína de 15 quiloDalton (kDa) de milho possuem um peptídeo tendo por alvo ER semelhante, e foi demonstrado que a fixação de um peptídeo tendo por alvo ER zeína de 15 kDa ao término a- mino de uma proteína heteróloga pode resultar no tráfico da proteína para o ER de células monocotiledôneas bem como células dicotiledôneas. O méto- 30 do mais direto por meio do qual fixar o peptídeo tendo por alvo ER ao térmi- no amino de uma proteína heteróloga é construir uma região codificante de proteína que codifica ambos os elementos (o peptídeo tendo por alvo ER e a região codificante de proteína) em uma única estrutura de leitura aberta a qual quando traduzidao gera uma proteína de fusão (quimérica) contendo ambos os domínios. É adicionalmente conhecido por aqueles versados no campo que algumas seqüências de peptídeo curtas, quando presentes no 5 término carbóxi de proteínas localizadas no retículo endoplasmático, podem ditar a retenção das proteínas dentro do retículo endoplasmático, deste mo- do proporcionando acumulação de proteína eficaz e glicosilação dentro do retículo endoplasmático. Um peptídeo de sinal de retenção do ER semelhan- te é a seqüência de aminoácidos Lisina-Ácido Aspártico-Ácido Glutâmico- 10 Leucina (abreviada como KDEL). Portanto, pode-se facilitar a translocação de uma proteína heteróloga para o retículo endoplasmático e sua retenção dentro do retículo endoplasmático construindo uma única estrutura de leitura aberta que codifica todos os três elementos (a seqüência do peptídeo tendo por alvo ER, a seqüência da região codificante de proteína heteróloga, e a 15 seqüência de sinal de retenção do ER), e a qual quando traduzida produz uma proteína de fusão (quimérica) que contém todos os três domínios na ordem listada do término amino ao término carbóxi.

Também é de conhecimento geral daqueles no campo da ex- pressão de transgene em plantas que alguns elementos de seqüências de nucleotídeos flanqueando (ou incluídos dentro de) uma região codificante para uma proteína heteróloga pode afetar a translação do RNA mensageiro (mRNA) codificando a proteína heteróloga. Um elemento de seqüência se- melhante que afeta a translação do mRNA é a seqüência de nucleotídeos em torno do códon de iniciação de translação AUG (ATG no código de DNA). Em plantas dicotiledônea, incluindo tabaco, é conhecido que um con- texto de seqüência de início de translação ótima inclui os nucleotídeos GC imediatamente depois do ATG. No código genético universal, GCN represen- ta códons especificando Alanina. Portanto, um contexto de códon de inicia- ção translacional ótimo é especificado como ATGGCN (codificando Metioni- na-Alanina). É adicionalmente conhecido que um contexto de seqüência óti- ma precedendo o códon de iniciação translacional ATG em mRNAs de dicot é representado por AAACA. Finalmente, é essencial que a estrutura de Ieitu- ra aberta codificando uma proteína seja terminado com no mínimo um códon de terminação translacional (isto é, TGA1 TAA ou TAG no código genético de DNA universal), e ainda mais preferencial que múltiplos códons de termina- ção translação estejam presentes em não somente o mesmo estrutura de 5 leitura que a região codificante de proteína (denominado o estrutura +1), mas também nos outros cinco estruturas de leitura possíveis em DNA de filamento duplo.

A SEQ ID NO: 8 revela a seqüência de DNA de uma região codi- ficante de proteína quimérica otimizada por tabaco completa que incorpora 10 os elementos mencionados acima, compreendendo uma seqüência otimiza- da por tabaco codificando o peptídeo de sinal tendo por alvo ER zeína de 15 kDa, uma região codificante de peptídeos prM. MeE otimizada por tabaco (revelada como SEQ ID NO: 3), e um sinal de retenção do ER KDEL otimi- zado por tabaco. A proteína de fusão quimérica codificada por SEQ ID NO: 8 15 é revelada como SEQ ID NO: 9. O sinal tendo por alvo ER codificado por SEQ ID NO: 8 e apresentado na SEQ ID NO: 9 difere da seqüência de pep- tídeo tendo por alvo ER zeína de 15 kDa de milho nativa pela adição de um resíduo Alanina na posição n° 2, para conciliar o contexto da seqüência de códon de iniciação translacional de consenso descrita acima.

A SEQ ID NO: 10 revela a seqüência de DNA de uma segunda

região codificante de proteína quimérica otimizada por tabaco completa que incorpora os elementos mencionados acima, compreendendo uma seqüên- cia otimizada por tabaco codificando o peptídeo de sinal tendo por alvo ER zeína de 15 kDa, uma região codificante de peptídeos prM. MeE otimizada 25 por tabaco incluindo um sítio aceptor de N-glicosilação mutado conforme revelado na SEQ ID NO: 4, e um sinal de retenção do ER KDEL otimizado por tabaco. O sinal tendo por alvo ER codificado por SEQ ID NO: 10 é o mesmo que o revelado na SEQ ID NO: 8. A proteína de fusão quimérica co- dificada por SEQ ID NO: 10 é revelada como SEQ ID NO: 11 30 A SEQ ID NO: 12 revela a seqüência de DNA de uma terceira

região codificante de proteína quimérica otimizada por tabaco completa que incorpora os elementos mencionados acima, compreendendo uma sequên- cia otimizada por tabaco codificando o peptídeo de sinal tendo por alvo ER zeína de 15 kDa, uma região codificante de peptídeos MeE otimizada por tabaco conforme revelado na SEQ ID NO: 6, e um sinal de retenção do ER KDEL otimizado por tabaco. O sinal tendo por alvo ER codificado por SEQ 5 ID NO: 12 é o mesmo que o revelado na SEQ ID NO: 8. A proteína de fusão quimérica codificada por SEQ ID NO: 12 é revelada como SEQ ID NO: 13.

A SEQ ID NO: 14 revela a seqüência de DNA de uma quarta região codificante de proteína quimérica otimizada por tabaco completa que incorpora os elementos mencionados acima, compreendendo uma sequên- 10 cia otimizada por tabaco codificando o peptídeo de sinal tendo por alvo ER zeína de 15 kDa, uma região codificante de peptídeos MeE otimizada por tabaco conforme revelado na SEQ ID NO: 7, e um sinal de retenção do ER KDEL otimizado por tabaco. O sinal tendo por alvo ER codificado por SEQ ID NO: 14 é o mesmo que o revelado na SEQ ID NO: 8. A proteína de fusão 15 quimérica codificada por SEQ ID NO: 14 é revelada como SEQ ID NO: 15.

Moléculas de DNA compreendendo as seqüências de DNA reve- ladas na SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, e SEQ ID NO: 14 foram sintetizadas por um vendedor comercial (PicoScript; Houston, Texas) e as moléculas resultantes foram clonadas em vetores de expressão em 20 planta e de transformação por técnicas biológicas moleculares de rotina. EXEMPLO 2 - CONSTRUÇÃO DE VETOR DE EXPRESSÃO EM PLANTA Constructos Binários de Dicot.

Três vetores binários de dicot, pDAB2475, pDAB2478, e pDAB2481, para transformação vegetal mediada por Agrobacterium foram 25 construídos com base nos plasmídeos pDAB2406, pDAB2418, e pDAB2407. pDAB2406 (Figura 1) contém o promotor do vírus do mosaico da veia da mandioca (CsVMV) descrito na publicação de patente internacional WO N0 97/48819 e uma região não traduzida 3' de estrutura de leitura aberta, ORF23 3'UTR (GenBank número de acesso X00493) v1. Localizados entre o 30 promotor CsVMV e ORF23 3'UTR v1 estão sítios únicos, Ncol e Saci, os quais foram usados para inserir o gene de interesse. pDAB2418 (Figura 2) contém a região de fixação de matriz RB7 (MAR) (Patente dos Estados Uni- dos n0 5.773.689; Patente dos Estados Unidos n° 5.773.695; Patente dos Estados Unidos n° 6.239.328, publicação de patente internacional WO N0 94/07902, e publicação de patente internacional WO N0 97/27207) e a uni- dade de transcrição vegetal onde o marcador de seleção vegetal fosfinotrici- 5 na acetil transferase (PAT) (Patentes dos Estados Unidos Nos.: 5.879.903; 5.637.489; 5.276.268; e 5.273.894) é dirigida pelo promotor AtUbiIO (Sun C.- W. etal., 1997; Norris, S.R. et ai, 1993; Callis, J. etal, 1995) e flanqueada, a jusante pela AtuORFI 3’ UTR v3 (US5428147; Barker, R.F., et ai, 1983; GenBank número de acesso X00493). Um único sítio Notl, localizado entre o 10 gene RB7 MAR e o promotor AtUbiIO vegetal, foi usado para clonar frag- mentos genéticos de pDAB2406 contendo o promotor CsVMV1 gene de inte- resse, e ORF23 3’UTR v1.

Um vetor binário básico modificado, pDAB2407 (Figura 3), foi construído adicionando um Iigante Agel no único sítio BamHI de pBBV per- mitindo a ligação Agel/Agel do antígeno de WNV e cassetes de expressão de marcadores selecionáveis entre as bordas de T-DNA.

O vetor binário de dicot do Vírus West Nile, pDAB2475 (Figura 4), codifica uma proteína quimérica consistindo em peptídeo de membrana e de envelope do Vírus West Nile com propensão para códon de tabaco (ver- 20 são 2) com ER tendo por alvo v2 e sinais de retenção KDEL v3 (SEQ ID NO 12). Mais especificamente, a unidade de transcrição vegetal (PTU) inclui: T- DNA Borda B / RB7 MAR v3 / CsVMV promotor v2 / zeína de 15 kDa ER sinal v2 - WNV ME v2 - KDEL v3 / Atu ORF23 3'UTR v1 / AtUbiIO promotor v2 / PAT v3 / AtuORFI 3' UTR v3 / T-DNA Borda A. Conforme obtido de Pi- 25 coScript no vetor Bluescript da Stratagene, o constructo primário foi desig- nado como DASPIC020. Para isolar o gene de sinal de ER de 15 kDa v2- WNV ME V2-KDEL v3 de seu vetor da espinha dorsal Bluescript, DASPI- C020 foi digerido com Ncol/Sacl e foi em seguida inserido em plasmídeo pDAB2406 nos sítios Ncol e por T4 ligase, onde o fragmento genético foi 30 intercalado entre o CsVMV promotor v2 e a ORF23 3' UTR v1, resultando no vetor intermediário pDAB2473. Para verificar um clone com o inserto ade- quado, DNA isolado foi cortado com Ncol/Sacl, identificado por eletroforese por gel, e aumentado. O promotor do cassete de expressão CsVMV conten- do sinal de ER-WNV ME v2-KDEL e ORF23 3'UTR foi removido de pDAB2473 com Notl e foi ligado por T4 no sítio Notl de pDAB2418, a jusante do RB7 MARv3 e a montante dos cassetes de marcadores selecionáveis 5 AtUbiIO promotor v2-PAT v3-AtuORF1 3'UTR formando as unidades de transcrição vegetal (PTU) no vetor intermediário pDAB2474. Os componen- tes da PTU foram então excisados de pDAB2474 usando digestão por Agel e ligados em orientação reversa no sítio Agel de pDAB2407, o que resultou no vetor binário de dicot final, pDAB2475, onde os elementos PTU são flan- 10 queados por T-DNA bordas AeB.

O vetor binário de dicot, pDAB2478 (Figura 5), codifica uma pro- teína quimérica consistindo nos peptídeos do Vírus West Nile com propen- são para códon de tabaco pré-membrana v2, de membrana e de envelope v2 com ER tendo por alvo v2 e sinais de retenção KDEL v3 (SEQ ID NO 8). 15 Mais especificamente, os dois PTU incluem: T-DNA Borda B/RB7 MAR v3 / CsVMV promotor v2 / zeína de 15 kDa ER sinal v2 - prMEv2 - KDEL v3 / Atu ORF23 3'UTR v1 / AtUbiIO promotor v2 / PAT v3 / AtuORFI 3' UTR v3 / T-DNA Borda A. Conforme obtida do PICOSCRIPT em vetor Bluescript da Stratagene, o constructo primário foi designado como DASPIC021. Para 20 isolar o gene de sinal de ER v2-prME V2-KDEL v3 de seu vetor da espinha dorsal, DASPIC021 foi digerido com Ncol/ Saci. O fragmento genético de sinal de ER v2-prME v2-KDEL v3 foi em seguida ligado por T4 em plasmídeo pDAB2406 nos sítios Ncol e Sacl onde o fragmento genético foi flanqueado pelo promotor CsVMV e ORF23 3' UTR resultando no vetor intermediário 25 pDAB2476. Para verificar um clone com inserto adequado, DNA isolado foi cortado com Ncol/Sacl, identificado por eletroforese por gel, e aumentado. O promotor do cassete de expressão CsVMV contendo sinal de ER v2- prME v2-KDEL v3 e ORF23 3'UTR foi removido de pDAB2476 com Notl e ligado usando T4 Iigase no sítio Notl de pDAB2418, a jusante do gene RB7 MARv3 30 e a montante do cassete de marcadores selecionáveis de AtUbiIO promotor v2-PAT v3-AtuORF1 3'UTR formando as unidades de transcrição vegetal (PTU) do constructo intermediário pDAB2477. Os componentes da PTU fo- ram em seguida excisados de pDAB2477 com Agel, purificados por gel, e ligados em orientação reversa no sítio Agel de pDAB2407, o que resultou no vetor de dicot final, pDAB2478, onde os componentes da PTU são flanquea- dos por T-DNA bordas AeB.

5 O vetor binário de dicot, pDAB2481 (Figura 6), codifica uma pro-

teína quimérica consistindo nos peptídeos do Vírus West Nile com propen- são para códon do tabaco pré-membrana v2, de membrana v2, e de envelo- pe com um sítio de N-glicosilação mutado (versão 4) com ER tendo por alvo sinais de retenção v2 e KDEL v3 (SEQ ID NO 10). Mais especificamente, as 10 unidades PTU incluem: T-DNA Borda B / RB7 MAR v3 / CsVMV promotor v2 / zeína de 15 kDa de sinal de ER v2- WNV prM v2 E v4 com sítio de N- glicosilação mutado - KDEL v3 / Atu ORF23 3'UTR v1 / AtUbiIO promotor v2 / PAT v3 / AtuORFI 3’ UTR v3 / T-DNA Borda A. Conforme obtido de Pl- COSCRIPT em vetor Bluescript da Stratagene, o constructo primário foi de- 15 signado como DASPIC022. Para isolar o gene de sinal de ER v2 -WNV prM v2 E v4 com sítio de N-glicosilação mutado-KDEL v3 de seu vetor da espi- nha dorsal, DASPIC022 foi digerido com Ncol/ Sacl e purificado por gel. O fragmento genético de sinal de ER v2-WNV prM v2 E v4 com sítio de N- glicosilação mutado -KDEL v3 foi em seguida inserido por T4 Iigase em 20 plasmídeo pDAB2406 nos sítios Ncol e Saci, onde o fragmento genético foi intercalado entre o CsVMV promotor v2 e a ORF23 3' UTR v1 resultando no vetor intermediário pDAB2479. Para verificar um clone com inserto, DNA isolado foi cortado com Ncol/Sacl, identificado por eletroforese por gel, e aumentado. O promotor do cassete de expressão CsVMV contendo sinal de 25 ER v2-WNV prM v2 E v4 com sítio de N-glicosilação mutado -KDEL v3 e ORF23 3’UTR foi removido de pDAB2479 com Notl e foi ligado no sítio Notl de pDAB2418, a jusante do gene RB7 MARv3 e a montante do cassete de marcadores selecionáveis de AtUbiIO promotor v2-PAT v3-AtuORF1 3'UTR formando os componentes da PTU do constructo intermediário pDAB2480. 30 As unidades PTU foram então excisadas de pDAB2480 com Agel, purifica- das por gel, e ligadas em orientação reversa no sítio Agel de pDAB2407, o que resultou no vetor de dicot final, pDAB2481, onde o cassete PTU é flan- queado por T-DNA bordas AeB. Todos os constructos finais foram verifica- dos inicialmente por digestão de restrição, seguidos por sequenciamento entre as bordas de T-DNA, o que confirmou que a seqüência real e esperada eram idênticas.

5 Constructos Binários de Dicot Gateway®.

Gateway® Technology (Invitrogen) foi usada para clonar os nove vetores binários de dicot de WNV ME seguintes, os quais contêm múltiplas versões de peptídeo ME, promotores, e orientação do gene de interesse em relação ao promotor e UTR. Tanto os vetores de destinação quanto doado- 10 res foram preparados seguindo o protocolo Gateway® Technology da Invi- trogen. Um vetor de destinação, pDAB3736 (Figura 7), e quatro vetores doa- dores, pDAB3912 (Figura 8), pDAB3914 (Figura 9), pDAB3916 (Figura 10), e pDAB3724 (Figura 11) compuseram a espinha dorsal dos constructos Gate- way® usados para construir estes nove constructos binários.

O vetor de destinação pDAB3736 foi derivado de pDAB2407 (Fi-

gura 3) e contém sítios attR os quais recombinam com um clone de entrada em uma reação de LR clonase para gerar um clone de expressão. Adicio- nalmente, pDAB3736 tem múltiplas cópias de T-DNA Borda A. Dentro das regiões de Borda A e Borda B, há uma região de fixação de matriz RB7 20 (MAR) e sítios de clonagem Gateway® attR1 e attR2. O vetor de entrada pDAB3912 (Figura 8) contém o promotor CsVMV e o cassete ORF23 3'UTR. Localizados entre o promotor e UTR estão sítios Ncol e Sacl onde o gene de interesse foi inserido. O cassete é flanqueado por sítios de clonagem Gate- way® attL1 e attL2 para geração de clones de entrada. Outro vetor de entra- 25 da, pDAB3914 (Figura 9), contém o promotor AMAS 40CS (promotor Atu- Mas) v4 (Genbank número de acesso X00493) e o cassete ORF23 3'UTR. Novamente, entre o promotor e UTR estão sítios de clonagem, Ncol e Saci, onde o gene de interesse foi inserido. O cassete é flanqueado por sítios Ga- teway® attL1 e attL2. Como os outros vetores doadores, pDAB3916 (Figura 30 10) é um constructo Gateway® o qual contém promotor AtUbiIO e cassete ORF23 3'UTR. Entre o promotor e UTR estão sítios Ncol e Saci, onde o ge- ne de interesse foi inserido. O cassete é flanqueado por sítios de clonagem Gateway® attL1 e attL2. O vetor doador Gateway, pDAB3724 (Figura 11), contém o promotor CsVMV seguido seqüencialmente por Nt Osmotin 5' UTR v3 (Genbank número de acesso S40046), gene repórter de β-Glucuronidase (GUS) (Jefferson, 1987), e Nt Osm 3' UTR v3 (Genbank número de acesso 5 S40046). Estes elementos são flanqueados por sítios Gateway® attL1 e at- tL2. Sítios de restricção, Ncol e Saci, limitando o gene GUS foram usados para substituir GUS com o gene de interesse.

Vetor binário Gateway® WNV ME, pDAB3920 (Figura 12), con- tém as unidades PTU: T-DNA Borda B / RB7 MAR v3 / CsVMV promotor v2 / WNV ME v2 / Atu ORF23 3' UTR v1 / AtUbiIO promotor v2 / PAT v3 / Atu ORF1 3' UTR v3 / Múltiplo T-DNA Borda A. Amplificação do peptídeo de WNV ME v2 foi realizada por reação de cadeia polimerase (PCR). As se- qüências ER v2 tendo por alvo e de retenção KDEL v3 de DASPIC020 (SEQ ID NO 12) foram removidas do peptídeo ME usando iniciadores de PCR (di- anteiro: 5' aga gaa cta gta aaa agg aga aat cca tgg ctt ccc tga cag tgc aaa ctc atg 3’; Reverso: 5' Ccc tcg agg gag ctc tta tca ctt age atg aac att tac ag 3') que iniciou somente para a seqüência de WNV ME v2 e consistiram de um sítio Ncol no iniciador dianteiro e um sítio Sacl no iniciador reverso. O produ- to de PCR WNV ME v2 foi clonado diretamente no vetor pCR2.1 TOPO u- sando o protocolo de clonagem da Invitrogen TOPO TA para formar pDAB3918. O gene WNV ME v2 foi em seguida isolado usando digestão por Ncol e Sacl da espinha dorsal TOPO e ligado usando T4 Iigase no sítio Ncol/Sacl de pDAB3912 para formar o clone de entrada, pDAB3919. pDAB3919 foi reagido com LR Clonase em pDAB3736 para formar pDAB3920.

Vetor binário Gateway®, pDAB3922 (Figura 13), contém os se- guintes elementos: T-DNA Borda B / RB7 MAR v3 / AtuMAS 40CS promotor v4 / zeína de 15 kDa ER v2-WNV ME v2-KDELv3 / Atu ORF23 3’ UTR v1 / AtUbiIO promotor v2 / PAT v3 / Atu ORF1 3' UTR v3 / Múltiplo T-DNA Borda 30 A. O peptídeo de sinal de ER v2-ME V2-KDEL v3 de DASPIC020 (SEQ ID NO 12) foi removido de seu plasmídeo da espinha dorsal com Ncol e Saci. O fragmento genético excisado foi em seguida inserido no sítio Ncol/Sacl de pDAB3914 para formar clone de entrada, pDAB3921, com o gene de inte- resse intercalado entre o AtuMAS 40CS promotor v4 e ORF23 3' UTR v1. pDAB3921 foi em seguida reagido com LR Clonase no vetor de destinação pDAB3736 para formar o vetor de expressão e binário, pDAB3922.

5 Vetor binário Gateway® do Vírus West Nile, pDAB3924 (Figura

14), contém os seguintes elementos: T-DNA Borda B / RB7 MAR v3 / At U- bi10 promotor (Genbank Acesso n° L05363) v2 / zeína de 15 kDa ER v2- WNV ME V2-KDEL v3 / Atu ORF23 3' UTR v1 / AtUbiIO promotor v2 / PAT v3 / Atu ORF1 3' UTR v3 / Múltiplo T-DNA Borda A. O peptídeo de sinal de 10 ER v2-WNV ME V2-KDEL v3 de DASPIC020 (SEQ ID NO 12) foi removido de seu plasmídeo da espinha dorsal com Ncol e Saci. O fragmento genético excisado foi em seguida inserido no sítio Ncol/Sacl de pDAB3916 para for- mar clone de entrada, pDAB3923, com o gene de interesse ensanduichado entre o promotor At UbiIO v2 e ORF23 3' UTR v1. pDAB3923 foi em seguida 15 reagido com LR Clonase com vetor de destinação pDAB3736 para formar vetor binário de dicot, pDAB3924.

Vetor binário Gateway®, pDAB3927 (Figura 15), contém os se- guintes elementos PTU: T-DNA Borda B / RB7 MAR v3 / CsVMV promotor v2 / zeína de 15 kDa de sinal de ER v2-WNV ME v2 / Atu ORF23 3' UTR v1 / 20 AtUbiIO promotor v2 / PAT v3 / Atu ORF1 3’ UTR v3 / Múltiplo T-DNA Borda A. Amplificação do peptídeo de sinal de ER v2-WNV ME v2 foi realizada por PCR. A seqüência de retenção de KDEL v3 de DASPIC020 (SEQ ID NO 12) foi removida do peptídeo ME v2 usando iniciadores de PCR (dianteiro: 5' cat gcc atg gct aag atg gtc att gtg ctt gtt gtg tgc 3'; Reverso: 5' ccc tcg agg gag 25 ctc tta tca ctt age atg aac att tac ag 3’) que iniciou somente para a seqüência de sinal de ER v2-WNV ME v2 e consistiram em um sítio Ncol no iniciador forward e um sítio Sacl no iniciador reverso para fins de clonagem. O produ- to de PCR de sinal de ER v2-WNV ME v2 foi clonado diretamente no vetor pCR2.1 TOPO usando o protocolo de clonagem da Invitrogen TOPO TA pa- 30 ra formar pDAB3925. O gene de sinal de ER v2-WNV ME v2 foi em seguida isolado usando Ncol e Sacl de seu plasmídeo da espinha dorsal TOPO e foi ligado usando T4 Iigase no sítio Ncol/Sacl de pDAB3912 para formar o clone de entrada, pDAB3926. pDAB3926 foi reagido com LR Clonase com vetor de destinação, pDAB3736, para formar o vetor binário final pDAB3927.

Vetor binário Gateway®, pDAB3929 (Figura 16), contém as se- guintes unidades PTU: T-DNA Borda B / RB7 MAR v3 / CsVMV promotor v2 5 / Nt osm 5' UTR v3 / zeína de 15 kDa de ER v2-WNV ME v2-KDEL v3 / Nt osm 3' UTR v3 / Atu ORF23 3’ UTR v1 / AtUbiIO promotor v2 / PAT v3 / Atu ORF1 3’ UTR v3 / Múltiplo T-DNA Borda A. O peptídeo de sinal de ER v2- ME V2-KDEL v3 de DASPIC020 (SEQ ID NO 12) foi removido de seu plas- mídeo da espinha dorsal com Ncol e Saci. O gene fragmento excisado foi 10 em seguida inserido no sítio Ncol/Sacl de pDAB3724 (Figura 11) usando T4 Iigase para formar clone de entrada, pDAB3928, com o gene de interesse intercalado entre o CsVMV/Nt osm 5' UTR e Nt osm 3' UTR V3/ORF23 3'UTR. Reação de LR clonase com pDAB3928 e vetor de destinação pDAB3736 resultou na produção do vetor binário, pDAB3929.

Vetor binário Gateway®, pDAB3934 (Figura 17), contém os se-

guintes elementos: T-DNA Borda B / RB7 MAR v3 / ORF25 / 26 3'UTR / KDELv3 / WNV ME v3 / zeína de 15 kDa ER signal v2 (SEQ ID NO 14) / A- tuMAS 40CS promotor v4 / 15kD zeína de sinal de ER v2- WNV ME v2- KDELv3 / Atu ORF23 3' UTR v1 / AtUbiIO promotor v2 / PAT v3 / Atu ORF1 20 3' UTR v3 / Múltiplo T-DNA Borda A. Para geração deste constructo, um processo de clonagem de múltiplas etapas incluiu amplificação do ORF 25/26 poli A UTR a partir do constructo p501 (Murai e Kemp, 1982) usando iniciadores (dianteiro: 5' ccc aag ctt ggg tgt cca aca gtc tca ggg tta atg tc 3'; Reverso: ccca agct tgg g tgg cac gtg agg tcc atg cgg ctg c) que continham 25 sítios Hindlll flanqueando o produto de PCR. O produto de PCR ORF25/26 poli A foi em seguida clonado em um vetor pCR2.1 TOPO para produzir pDAB3930. O sinal de ER v2-WNV ME V2-KDEL v3 de DASPIC020 (SEQ ID NO 12) foi removido de seu plasmídeo da espinha dorsal com Ncol e Sacl e foi inserido em pDAB3914 no sítio Ncol/Sacl usando T4 Iigase para formar 30 pDAB3931. Sacll foi usado para remover o sinal de ER v2-WNV ME v3- KDEL de DASPIC072 (PicoScript, SEQ ID NO 14) de sua espinha dorsal Bluescript e o fragmento genético foi em seguida inserido em pDAB3931 no sítio Sacll em orientação reversa para formar pDAB3932. Hindlll foi usado para excisar o produto de PCR ORF 25/26 poly A de pDAB3930. O ORF25/26 Poli A UTR foi em seguida inserido em orientação reversa em pDAB3932 em seu sítio Hindlll para formar clone de entrada, pDAB3933.

5 pDAB3933 foi reagido com LR Clonase em pDAB3736 para formar o vetor de expressão e binário, pDAB3934.

Vetor binário Gateway®, pDAB3941 (Figura 18), contém os se- guintes componentes da PTU: T-DNA Borda B / RB7 MAR v3 / CsVMV pro- motor v2 / 15kD zein ER v2-WNV ME v2-KDEL v3 / Atu ORF23 3'UTR v1 / 10 AtUbi3 promotor v2 / 15kD zeína ER v2-WNV ME v3-KDELv3 / Atu ORF23 3’ UTR v1 / AtUbiIO promotor v2 / PAT v3 / Atu ORF1 3' UTR v3 / Múltiplo T- DNA Borda A. Este processo de clonagem de múltiplas etapas incluiu ampli- ficar o promotor AtUbi3 v2 a partir de outro constructo usando iniciadores (dianteiro: 5' ccc aag ctt ata aga atg cgg ccg cta aac tat age ttc gga ttt gga 15 gcc aag te 3'; Reverso: 5' ccg ctc gag cgg tcc ccg cgg gga gct gaa ata aaa caa tag aac aag tag 3') que continham sítio Hindlll/Notl na extremidade 5' do produto de PCR e sítios Sacl/Xhol flanqueando o produto de PCR na extre- midade 3'. O produto de PCR AtUbi3 v2 foi em seguida clonado no vetor pCR2.1 TOPO para produzir o plasmídeo pDAB3935. Um Iigante Xhol (Sen- 20 so: cgatccgctcgagcggtagg; Antissenso: gtg acc cta ccg ctc gag cgg ate gag ct) foi adicionada a pDAB2406 no sítio Sacl/BstEII para introduzir um sítio Xhol entre o promotor CsVMV v2 e ORF23 3'UTR v1 para produzir o vetor, pDAB3936. pDAB3936 foi em seguida cortado com Xhol e Hindlll para re- mover o promotor CsVMV e reter o vetor da espinha dorsal. O produto de 25 PCR, promotor AtUbi3 v2, de pDAB3935 foi cortado com Hindlll e Xhol e ligado na espinha dorsal pDAB3936 no sítio Hindlll / Xhol, produzindo pDAB3937. O peptídeo de sinal de ER v2-ME v2-KDEL v3 de DASPIC020 (SEQ ID NO 12) foi removido de seu plasmídeo da espinha dorsal com Ncol e Sacl e ligado em pDAB3912 no sítio Ncol/Sacl para formar o vetor de 30 plasmídeo, pDAB3939. O peptídeo de sinal de ER v2-WNV ME v3-KDEL v3 de DASPIC072 (SEQ ID NO 14) foi removido de seu plasmídeo da espinha dorsal Bluescript com Sacll-Xhol e foi inserido em pDAB3937 nos sítios Sa- clI/Xhol para construir pDAB3938. O cassete genético AtUbi3 / sinal de ER v2-ME v3-KDEL v3 / ORF23 de pDAB3938 foi em seguida excisado com Notl e inserido em pDAB3939 no sítio Notl para formar clone de entrada, pDAB3940. Reação de LR clonase com pDAB3940 e vetor de destinação, pDAB3736, resultou na formação do vetor binário de dicot, pDAB3941.

Vetor binário Gateway®, pDAB3943 (Figura 19), contém os se- guintes elementos: T-DNA Borda B / RB7 MAR v3 / CsVMVv2 / WNV M v2 E com sítios de glicosilação modificados (v5) / Atu ORF23 3' UTR v1 / AtUbiIO promotor v2 / PAT v3 / Atu ORF1 3' UTR v3 / Múltiplo T-DNA Borda A. O 10 processo de clonagem incluiu remover a região do sítio de N-glicosilação mutado do peptídeo de WNV prM v2 E v4 de DASPIC022 (SEQ ID NO 10) usando enzimas de restrição Accl e Avrll e ligando em pDAB3919 (consultar estratégia de clonagem de pDAB3920) nos sítios Accl/Avrll para estabelecer

o clone de entrada, pDAB3942. pDAB3942 foi reagido com LR Clonase no vetor de destinação, pDAB3736, para produzir o plasmídeo binário de dicot final, pDAB3943.

Todos os constructos binários Gateway finais foram verificados inicialmente por digestão de restrição, seguida por sequenciamento entre as bordas de T-DNA, o que confirmou que a seqüência real e esperada eram idênticas.

EXEMPLO 3 - TRANSFORMAÇÃO DE AGROBACTERIUM COM VETORES DE EXPRESSÃO EM PLANTA

De modo independente, 1,5 a 3 pg de DNA de plasmídeo para cada constructo de WNV foram adicionados a 50 μΙ de células de Agrobacte- 25 rium tumefaciens Electromax® LBA4404 (Invitrogen, Carlsbad, CA) e gentil- mente misturados. A mistura foi transferida para cuvetas Gene Pulser® de 0,2 cm a frio (BioRad Hercules, CA) e colocada sobre gelo. As cuvetas foram em seguida colocadas em um rack Gene Pulser® a frio (BioRad, Hercules, CA) e electroporadas nas seguintes condições:

Capacitância de Saída 25 pFarad

Extensor da Capacitância 960 pFarad

Resistência 200 ohms Voltagem 2,5 kVolts

Imediatamente depois da eletroporação, 950 μΙ de meio SOC (Invitrogen, Carlsbad, CA) foi adicionado e a mistura foi transferida para um tubo Falcon 2059 (Becton Dickinson e Co., Franklin Lakes, NJ) ou equivalen- te. As células transformadas foram em seguida incubadas a 28°C por 1 hora. Depois da incubação, 50 μΙ, 100 μΙ, e 200 μΙ de células foram laminados so- bre placas de meio YEP separado (10 g de extrato de levedura, 10 g de pep- tona, 5 g de NaCI1 10 g de sacarose, e 15 g de ágar em 1 Litro de água) con- tendo antibióticos conforme apropriado. As placas foram cultivadas inverti- das a 28°C por aproximadamente 36 a 48 horas. Colônias únicas foram se- lecionadas e propagadas em 50 ml de YEP líquido (10 g de extrato de leve- dura, 10 g de peptona, 5 g de NaCI, e 10 g de sacarose em 1 Litro de água), contendo antibióticos conforme apropriado, a 28°C por aproximadamente 36 horas. Seguindo o protocolo miniprep de baixo número de cópias Qiagen® (Qiagen, Valencia, CA), DNA de plasmídeo purificado foi preparado a partir das culturas bacterianas. A integridade do DNA foi avaliada por digestão de restrição. Clones com os padrões de formação de banda esperados foram identificados e estoques de glicerol foram preparados adicionando 500 μΙ de cultura bacteriana a 500 μΙ de glicerol estéril (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) e invertendo para misturar. Os estoques de glicerol foram congelados sobre gelo seco e armazenados a -80°C.

EXEMPLO 4 - TRANSFORMAÇÃO ESTÁVEL DE CULTURAS DE CÉLU- LAS DE NICOTIANA TABACUM PARA EXPRESSÃO DE PROTEÍNAS WNV Culturas de células NT-1 de Nicotiana tabacum foram mantidas 25 asseticamente em um ciclo subcultura de uma semana, adicionando 2 ml da cultura de NT-1 ou 1 ml de células acondicionadas em 40 ml de meio NT-1 B (Tabela 3) dentro de um frasco de 250 ml. As suspensões foram mantidas no escuro a 25 + 10C a 125 rpm.

Na preparação para transformação de cultura de NT-1, um esto- que a 50% de glicerol de Agrobacterium tumefaciens contendo o vetor de expressão de interesse foi usado para iniciar uma cultura bacteriana líquida adicionando 20 a 500 μΙ de estoque de glicerol a 30 ml de meio líquido YEP (10 g de extrato de levedura, 10 g de peptona, 5 g de NaCI, e 10 g de saca- rose em 1 litro de água) contendo 50 mg/l de espectinomicina e 100 μΜ de acetossiringona. A cultura bacteriana foi incubada no escuro a 28°C a 150 a 200 rpm até a OD6oo ser 0,5 a 0,6. Isto tomou aproximadamente 18 a 20 ho- 5 ras.

No dia de transformação, quatro dias depois da subcultura NT-1, 20 mM de acetossiringona (em etanol) foram adicionados a suspensões ce- lulares em uma concentração de 1 μΙ por ml da cultura NT-1. As células NT-

1 foram feridas para aumentar a eficiência da transformação puxando-as 10 para cima e para baixo 20 vezes através de uma pipeta estéril de 10 ml de orifício padrão. Quatro mililitros da suspensão foram transferidos para dentro de cada uma das placas de Petri de 10, 60 x 20 mm. Uma placa foi separada para ser usada como um controle não-transformado. A cada uma das 9 pla- cas restantes, 100 μΙ de suspensão de Agrobacterium foram adicionados. As 15 placas foram embrulhadas com parafilme e incubadas no escuro a 100 rpm e 25 + 1°C por 3 dias.

Eventos transgênicos também foram criados por um método al- ternativo que não usou acetossiringona quer em crescimento da cultura de Agrobacterium nem foi usado durante o processo de transformação de célu- 20 Ias de planta. Quatro mililitros da suspensão de tabaco (não ferido) foi trans- ferido para dentro de cada uma das 10 placas de Petri de 100x25 mm. A cada uma de 9 placas, 100 μΙ de suspensão de Agrobacterium a OD6oo = 1.5 + 0,2 foi adicionado, novamente mantendo 1 placa como um controle não- transformado. As placas foram redemoinhadas para misturar, embrulhadas 25 em parafilme e cultivadas no escuro a 25 + 1°C por 3 dias sem serem agita- das.

Depois do período de cocultivação para qualquer método de transformação, todo o líquido foi removido com as células e em seguida res- suspenso em 8 ml de meio NTC (meio NT-1 B contendo 500 mg/l de carbe- 30 nicilina, adicionado depois de autoclavar). Alíquotas de um mililitro de sus- pensão foram distribuídas a cada uma de 8 placas de Petri (100 x 25 mm) contendo meio NTC+B5 [meio NTC solidificado com 8g/l de ÁgarTC, suple- mentado com 5 mg/l de sódio fosfinotricilalanialanina (bialaphos) depois de autoclavar]. Todas as placas de seleção, quer embrulhadas com parafilme ou deixadas desembrulhadas, foram mantidas no escuro em 25 a 28°C. An- tes de embrulhar, o líquido foi removido de quaisquer placas que estavam excessivamente úmidas.

Depois de 2 a 8 semanas, transformantes putativos apareceram como pequenos aglomerados de calo sobre um fundo de células mortas, não-transformadas. Estes calos viáveis foram transferidos para meio fresco NTC+B5, atribuídos números de identificação, e mantidos como eventos de 10 transformação individuais. As placas foram deixadas desembrulhadas, incu- badas no escuro a 28 + 1°C, e os eventos foram subcultivados sobre meio fresco NTC+B5 a cada 2 semanas por um total de 3 passagens, depois das quais a carbenicilina foi removida do meio para futuras subculturas. Porções de cada transformante putativo foram usadas para análise da expressão de 15 proteína. Eventos selecionados foram expandidos como calo e estabelecidos em cultura de suspensão.

Suspensões foram iniciadas transferindo 500 mg de calo trans- gênico proliferante de 7 dias de idade, para dentro de um frasco de 125 ml_ contendo 20 ml de NT1B + 10 mg/l de bialafos. As células e líquido foram 20 misturados pipetando 3 a 5 vezes com uma pipeta de 50 ml para romper o tecido e em seguida foram agitados em um agitador a 130 rpm no escuro a 25+°C. As suspensões foram subcultivadas em uma base semanal transfe- rindo 1 ml de células acondicionadas para dentro de 20 ml de NT1B com 10 mg/l bialaphos em um frasco de 125 ml. As suspensões foram mantidas no 25 escuro a 25 + 10C a 125 rpm.

EXEMPLO 5 - ANÁLISE DE EXPRESSÃO DE PROTEÍNA WNV Padrão de referência de WNV inativado.

Antígeno de referência foi preparado por modificação de um mé- todo publicado (Blitvich, et al., 2003). WNV foi inoculado em uma multiplici- dade de infecção de aproximadamente 0,01 dentro de células VERO em cin- co frascos de rolo e incubado sobre um rack de rolo a 37°C. Dois frascos idênticos de células VERO não inoculadas foram alimentados com o mesmo meio de crescimento (meio 199 com sais de Earles, 5% de soro bovino fetal, Penicilina / Estreptomicina) e incubados sob as mesmas condições. Depois de cinco dias, as células inoculadas e não inoculadas foram raspadas do interior de seus frascos. O meio e as células foram colocados dentro de tu- 5 bos de centrífuga de 50 ml e peletizados a 2000 rpm. O sobrenadante foi descartado e as células foram reunidas em 15 ml de meio de crescimento e congeladas a -80°C em 5 alíquotas iguais.

Um tubo de células infectadas e um tubo de células controle fo- ram degeladas a 37°C. As células foram peletizadas a 3500 rpm por 10 mi- nutos e lavadas duas vezes em 6 ml de tampão de salina de borato conge- lado (120 mM de cloreto de sódio, 50 mM de ácido bórico, hidróxido de sódio a 24 mM, pH 9,0), com centrifugação a 3500 rpm por 10 minutos a A°C. As células foram ressuspensas em 900 μΙ de 0,1% de dodecil sulfato de sódio, em seguida 100 μΙ de Triton X-100 e 2 ml de tampão de salina de borato fo- ram adicionados à suspensão. A suspensão foi sonicada a 20% de produção por 30 segundos sobre gelo, transferida para tubos Eppendorf e centrifuga- das em velocidade total em uma microcentrífuga por 10 minutos. Finalmente, os sobrenadantes foram transferidos para tubos Eppendorf limpos, 500 μΙ por tubo, e congelados a -80°C. Tubos Eppendorf contendo o material infec- tado com WNV foram etiquetados "WNV/VERO Antigen". Tubos Eppendorf contendo as células controle não inoculadas foram etiquetadas "Control VE- RO Antigen".

A inativação de WNV foi verificada inoculando quantidades de 50 μΙ e 25 μΙ de WNV/VERO Antigen sobre monocamadas de células VERO 25 dentro de frascos de 150cm2, incubando por 5 a 6 dias, em seguida passan- do o meio sobre células VERO frescas e incubando 6 dias. Algum dano de células VERO, atribuído ao detergente usado para inativação, foi observado na primeira passagem. A ausência de efeitos citopáticos na segunda passa- gem indicou o sucesso da inativação viral.

Western Blot de Proteína E do Vírus West Nile.

Um protocolo de Western blot foi desenvolvido para detectar pro- teína E usando anticorpos disponíveis comercialmente. Vírus West Nile ina- tivado (WNV/VERO Antigen, a 5,1 Mg/ml) foi preparado em tampão de amos- tra Leammli (125 mM de Tris-HCI, pH 6,8, 40 mM de DTT, 1 mM de EDTA, 2% de SDS, 10% de glicerol) e separado por SDS-PAGE sobre um gel Bis- Tris a 4 a 12% (Invitrogen, Carlsbad, CA). Proteínas foram transferidas para 5 0,2 pm de membrana de nitrocelulose por eletroblot. Blots de membrana fo- ram bloqueados em tampão de bloqueio (bloqueador/diluente WesternBree- ze (WesternBreeze Blocker/Diluent, parte A e B), Invitrogen, Carlsbad, CA) seguido por incubação com um anticorpo monoclonal contra Vírus West Nile por no mínimo 1 hora (Mab8151 Ms X West Nile/Kunjin Vírus, Chemicon In- 10 ternational, Temecula, CA diluído a 1:5000 em tampão de bloqueio ou Anti- corpo Monoclonal contra WNV 7H2 (WNV Monoclonal Antibody 7H2), purifi- cado por afinidade, BioReIiance Invitrogen BioServices, Rockville, MD, 75 pg/ml em PBS-glicerol diluído a 1:500 em tampão de bloqueio). Depois de três etapas de lavagem de 5 minutos (solução de lavagem WesternBreeze 15 (WesternBreeze Wash Solution) (16X), Invitrogen, Carlsbad, CA), os blots foram incubados em anticorpo de detecção. Para blots detectados por fosfa- tase alcalina, um anticorpo etiquetado com fosfatase alcalina anticamundon- go de cabrea (Catálogo Número 075-1806, KPL, Gaithersburg, MD) foi diluí- do em tampão de bloqueio a 1:1000. Para blots detectados por peroxidase 20 de rábano silvestre, um anticorpo etiquetado com peroxidase de rábano sil- vestre anticamundongo de cabra (Catálogo Número 074-1806, KPL, Gai- thersburg, MD) foi diluído em tampão de bloqueio a 1:1000. Depois de incu- bação com anticorpo de detecção, os blots foram lavados e desenvolvidos com o substrato apropriado: substrato de fosfatase NBT/BCIP (NBT/BCIP 25 Phosphatase Substrate, Catálogo Número 50-81-08, KPL, Gaithersburg, MD) para detecção por fosfatase alcalina ou Pierce SuperSignaI (Catálogo Número 34080, Pierce, Rockford, IL) para peroxidase de rábano silvestre para visualizar as bandas.

ELISA de Proteína E do Vírus West Nile.

Placas ELISA de microtítulo de 96 poços Nunc Maxisorp foram

preparadas por Beacon Analytical Systems Inc. (Portland, ME) revestindo placas com anti-WNV Equino (Novartis n° 215-006, Webster Veterinary Sup- ply, Sterling, MA) em uma concentração de 2 pg/ml em tampão de carbona- to, 100 μΙ por poço. As placas foram bloqueadas com 1% de BSA (Serologi- cals Corporation Inc., Norcross, GA) em PBST (1X PBS contendo 0,05% de Tween 20, Sigma Cat. n° P-1379), secadas, e embaladas para armazena- mento a 4°C. No dia da ensaio, as placas foram aquecidas até a temperatura ambiente antes de carregar as amostras. Antígeno de referência de WNV (Antígeno WNV/VERO, a 5,1 pg/ml) foi diluído para 200 ng/ml em PBST. Amostras de planta foram pré-diluídas em PBST. O antígeno de referência diluído e amostras de antígeno de teste foram adicionados à placa aplicando 200 μΙ de amostra para duplicar poços em linha A e 100 μΙ de tampão de bloqueio às poços restantes. Foram feitas diluições seriais 2 vezes mistu- rando e transferindo 100 μΙ por poço; para um total de 7 diluições e um em branco para o antígeno de referência e 4 ou mais diluições para amostras de teste. Em seguida as placas foram incubadas 1 hora em temperatura ambi- ente. As placas foram lavadas 3X em PBST. Anticorpo monoclonal (Anticor- po Monoclonal de WNV 7H2, purificado por afinidade, BioReIiance Invitrogen BioServices, Rockville, MD, 75 μg/ml em PBS-glicerol) foi diluído a 1:500 em 1% de BSA-PBST e adicionado a 100 μg/ poço seguido por incubação por 1 hora em temperatura ambiente. As placas foram lavadas 3X com PBST. Conjugado de anticorpo marcado com peroxidase de IgG anticamundongo de Cabra (BioRad 170-6516, Hercules, CA) diluído a 1:10.000 em 1% de BSA-PBST foi adicionado a 100 μΙ/ poço e as placas foram incubadas 1 hora em temperatura ambiente. As placas foram lavadas 3X em PBST e 100 μΙ de substrato TMB (BioFX Laboratories Inc., Cowings, MD) foi adicionado a cada placa e incubado em temperatura ambiente por aproximadamente 5 a 10 minutos. A reação foi interrompida com HCI a 1 N. A densidade ótica foi lida a 450 nm menos um comprimiento de onda de 650 nm de referência usando uma leitora de microlâmina cinética Vmax Kinetic Microplate Reader (Mole- cular Devices, Sunnyvale, CA). Os dados foram transportados para software SoftMaxPro 4.0 e a curva padrão foi ajustada para uma equação logística de

4 parâmetros para quantificação da amostra.

Triagem de Transformantes Putativos. Amostras de calo foram coletadas de transformantes putativos (Exemplo 4) em duplicata no dia 7 e no dia 14 depois de subcultura. Para cada amostra, 200 μΙ de calo foram coletados de um grupo homogeneizado de calo usando uma seringa de 1 ml (BD, Franklin Lakes, NJ) com o corte de 5 ponta. As amostras foram coletadas dentro de caixas de tubos de grupo de 96 poços (tubos de 1,2 ml, Costar, Corning, NY), congeladas sobre gelo se- co e armazenadas a -80°C.

Na hora da análise, as amostras foram extraídas em 0,1% de DBDM (n-Dodecil b-D-maltosídeo, Sigma D4611) em PBS usando um bate- 10 dor de contas Kleco (Garcia Machine, Visalia, CA). Dois BB’s de aço (Daisy de 4,5 mm) foram adicionados a cada tubo junto com 200 μΙ de DBDM-PBS. As amostras foram agitadas em velocidade máxima por 4 minutos seguidos por uma centrifugação por 10 minutos a 3000 x g. Os sobrenadantes foram removidos para novos tubos. O pélete resultante foi reextraído (200 μΙ de 15 tampão, 4 minutos de agitação, 10 minutos de centrifugação). Os sobrena- dantes de ambas as extrações foram reunidos e usados para análise. Amos- tras de calo de 14 dias foram analisadas em uma série de diluição a 1:10, 1:20, 1:40 e 1:80. Para confirmação da classificação de expressão, amostras de calo do dia 7 foram analisadas em uma diluição a 1:40. Os resultados de 20 triagem de expressão de eventos a partir dos constructos pDAB2475, pDAB2478, e pDAB2481 são resumidos nas Figuras 20 a 22. A comparação de eventos de expressão máxima entre os 3 vetores (Figura 23) indicou um potencial de recuperação de proteína E significativamente maior de pDAB2475.

Amostras de eventos selecionados destes constructos também

foram analisadas por Western blot (calo do dia 14). As diferenças nos pa- drões de formação de bandas entre constructos foram evidentes. De muitos dos eventos pDAB2475, proteína E de extensão total foi detectada no tama- nho esperado de -54 kDa (Figura 24). Outras bandas de -35 kDa e menores 30 também foram detectadas de modo reprodutível. Menos eventos expressan- do a proteína E de extensão total foram detectados com os constructos pDAB2478 e pDAB2481 (Figuras 25 e 26). A Figura 27 é uma representação comparativa da expressão de proteína E dos 8 constructos restantes. Todos demonstraram proteína E ex- pressada em células de plantas de tabaco, conforme detectado por ELISA. Adicionalmente, análise Western blot revelou proteína E de extensão total 5 bem como truncações (Figuras 28 a 30).

EXEMPLO 6 - ESCALA DE ANTÍGENOS DE WNV PRODUZIDOS POR CÉ- LULAS VEGETAIS

Escala e Fermentação de Cultura Celular.

Transformantes dos constructos pDAB2475 e pDAB2481, ex- pressando proteína E de extensão total foram identificados para escala. Cul- turas de suspensão de Nicotiana tobacum NT1 de eventos individuais foram escaladas a partir de volume de trabalho de 20 ml em um frasco Erlenmeyer de 125 ml até 70 ml e em seguida 140 ml de volume total em um frasco de 250 ml com base no "volume celular acondicionado no frasco". O volume celular acondicionado no frasco foi determinado depois de um período de incubação de 7 dias aspirando uma amostra de 10 ml sob condições assép- ticas de um frasco de poço misturada para dentro de uma pipeta sorológica para um volume final de 10 ml. Depois de 30 segundos de sedimentação estática, o volume das células dentro da pipeta foi multiplicado por 10 e re- gistrado como o "volume celular acondicionado no frasco" para diferenciar a medição de uma medição do volume celular acondicionado centrífugo (PCV). A faixa normal para o volume celular acondicionado no frasco foi va- riável (15 a 60%) para eventos individuais, mas se um volume celular acon- dicionado de □ 15% não foi atingido dentro de 14 dias, o evento foi descon- tinuado.

Foi realizada manutenção e escala de cultura transferindo célu- las de um frasco de 7 dias para um volume celular acondicionado do frasco final de 5%. Para culturas com um volume celular acondicionado de 50%, o volume de transferência do inóculo foi de 10% em vol:vol. Todas as culturas 30 do frasco Erlenmeyer foram incubadas a 26°C em um agitador orbital com uma extensão de golpe de 5,08 cm (2") a 120 rpm por 7 dias. Fermentações utilizando o frasco Fernbach de 2.800 m1 (volume de trabalho de 1.000 ml) foram conduzidas em uma incubadora/agitador orbital com uma extensão de golpe de 5,08 cm a 110 rpm por 7 dias a 26°C. Fermentações conduzidas em fermentadores de 10 litros 101 Braun Biostat C foram iniciadas em uma velocidade de agitação de 200 rpm, um fluxo de ar de 4 litros por minuto, e 5 uma temperatura do vaso de 26°C. Oxigênio dissolvido foi mantido acima de 30% por um Ioop controle de PID que aumentou automaticamente a taxa de agitação entre 200 e 450 rpm.

Para avaliar e caracterizar as culturas cultivadas em fermenta- dor, amostras de 10 ml in-processo foram coletadas dentro de tubos de cen- 10 trífuga graduados de 15 ml sob condições asséticas em intervalos de 24 ho- ras. De cada amostra, 10 μΙ foram assentados para isolamento sobre ágar de soja tríptica para avaliação de crescimento estranho. Placas de Petri fo- ram incubadas a 30°C por dois dias, e em seguida classificadas para a pre- sença de crescimento bacteriano ou fúngico. Amostras contendo crescimen- 15 to estranho foram verificadas por microscopia ótica em ampliação a 1.000x em compilações de amostras subsequentes. Fermentadores que se verificou que continham crescimento estranho foram autoclavados e as culturas foram adequadamente descartadas.

O remanescente de cada amostra de fermentação foi centrifuga- 20 do a 2.500 x g por 10 minutos para separar as células de plantas do líquido da cultura celular. O PCV foi determinado por observação direta do volume (ml) de células acondicionadas no tubo depois da centrifugação. A medição do volume final foi multiplicada por 10 e registrada como o PCV no momento da compilação. Cerca de 3 a 4 ml da fase de sobrenadante clara do tubo foi 25 transferido para dentro de uma seringa de 3 ml e filtrado (Corning PTFE n° 431231) para dentro de um tubo de microcentrífuga limpo de 1,5 ml. O con- teúdo do tubo foi analisado para glicose, pH, acetato, orto-fosfato, amônia, sódio, potássio, e Iactato usando o analisador bioquímico Bioprofile 300A Biochemistry Analyzer (Nova Biomedical, Boston, MA).

Para proteína solúvel total e concentração de proteína recombi-

nante, a amostra remanescente de sobrenadante e células acondicionadas foi tratada adicionando 2 a 3 mm de carga (shot) de aço inoxidável, e em seguida colocando o tubo de amostra de 15 ml em um triturador Geno Grin- der por 2 minutos em taxa de agitação máxima. A fração livre de células foi coletada depois de centrifugação a 10.000 rpm por 5 minutos, e a fração de pélete foi ressuspensa em um tampão consistindo em PBS, pH 6,8, com 5 0,1% de β-D-dodecil maltosídeo. O pélete ressuspenso foi colocado de volta dentro do triturador Geno Grinder e agitado por 2 minutos. Depois de centri- fugação a 10.000 rpm por 5 minutos, as frações de sobrenadante foram reu- nidas e avaliadas para proteína solúvel total usando o método de Bradford. Extratos também foram analisados para proteína E de WNV por ELISA e 10 Western blot (vide o Exemplo 5).

Eventos de dois constructos, pDAB2475 e pDAB2481, foram escalados para reatores de tanque agitado de 10 L. Um sumário dos lotes de fermentação é apresentado na Tabela 4.

Medições à base do tempo da produção de proteína recombi- nante em fermentadores indicaram que o maior título volumétrico foi produ- zido em 188 horas para o evento 1622-207 e em 172 horas para o evento 1702-525. Critérios de colheita com base na produtividade volumétrica ótima foram desenvolvidos com base em alterações: (1) glicose residual no fer- mentador, (2) volume celular acondicionado, (3) análise gasosa respiratória, (4) oxigênio dissolvido, e (5) pH (Figuras 31 a 33). O tempo de colheita ótimo com base na produtividade volumétrica foi similar para todos os eventos, e ocorreu 46 horas depois da depleção de glicose. A depleção de uma ou mais fontes de carbono correspondeu a um aumento no pH de 5,90 ±0,12 -Iog H+ a 6,5 ± 0,24 -Iog H+, um escurecimento visível do caldo de fermentação, e uma redução >85% na atividade respiratória conforme evidenciado pela cap- tação de oxigênio, evolução de dióxido de carbono, e oxigênio dissolvido. O evento 1622-207 apresentou um título volumétrico de 1,570 ± 0,077 (média ± desvio padrão) mg de proteína Έ' /1 de volume de trabalho do fermentador e uma produtividade de 0,200 ± 0,010 (média ± desvio padrão.) mg de proteí- na Έ' /1 de volume de trabalho do fermentador / dia (consultar Tabela 4, Lote WNV-SRD05006).

A cinética de produção de ME e prME(-) em células de suspen- são de N. tobacum NT-1 foi determinada durante um período de 9 dias para eventos de Vírus West Nile recombinante 1622-207 e 1622-210 (Figura 34). Perdas significativas (até 50%) em proteína recombinante foram observadas para fermentações que excederam um período de tempo de 8 dias (>70 ho- ras além da depleção de glucose). Western blots para amostras de fermen- tação envelhecidas apresentaram significativa truncação da proteína Έ', e uma maior percentagem de proteína Έ' truncada e de extensão total no so- brenadante a 8.000 x g depois de disrupção celular (dados não mostrados). A tendência para baixo na produtividade volumétrica que é mostrada na Fi- gura 34 pode ser o resultado de diferenças na reatividade do anticorpo ELI- SA primário com proteína Έ’ truncada, e/ou um aumento da perda de proteí- na Έ' devido a alterações nas propriedades de particionamento da proteína. Devem ser realizados estudos adicionais para investigar este fenômeno. EXEMPLO 7 - PROCESSAMENTO DE ANTÍGENOS DE WNV PRODUZI- DOS POR CÉLULAS DE PLANTAS

Processamento a jusante de culturas de células cultivadas em biorreatores de 10 litros consistiu em seis procedimentos que foram condu- zidos em paralelo. Todos os procedimentos foram completados em 0 a 4o C sob condições assépticas. Devido a alterações induzidas por pH reportadas 20 para a estrutura quaternária de proteína E resultante na formação de um trímero inativo (Modis etal., 2004), o pH de todas as amostras do processo e de cultura celular foi mantido a 7,0 ± 0,2 usando 50 mM (pH 7,5) de ácido 3- (N-morfolino)propanossulfônico (MOPS; pKa = 7,2) como um tampão padrão para todas as condições, a menos que determinado de modo diverso.

Método 1 do processo (PM1):

As células da suspensão vegetal foram colhidas do meio usado uma camada de 30 pm de Spectramesh e um funil de Buchner de 25 cm de diâmetro. A torta a úmido foi lavada com um volume igual de tampão de Iise (50 mM de MOPS, pH 7,5 + 1 mM de EDTA), secada por filtro (70 s em uma 30 pressão de vácuo de coluna de água de 63,50 cm (25 polegadas), e em se- guida ressuspensa em tampão de Iise (50 mM de MOPS, pH 7,5 + 1 mM de EDTA) até uma concentração final de 33% (em peso : vol). A suspensão ce- I 88

Iular foi rapidamente (3 minutos) homogeneizada usando um homogeneiza- dor de laboratório Silverson L4R, equipado com uma cabeça de rotor-estator de 3 cm, e operada a 1.500 rpm. As células pré-homogeneizadas foram rom- pidas por duas passagens através de um disruptor celular Microfludics de 5 110 L, o qual foi operado a 110,3 mPa (16.000 psi) (pressão do caminho de fluxo medida). Depois de clarificação centrífuga do Iisado a 8.000 x G por 15 min, o sobrenadante foi decantado do pélete (descartar pélete), e armaze- nado a -20°C até as ensaios serem realizadas.

Método 2 do processo (PM2):

As células colhidas foram centrifugadas a 8.000 x G por 15 min,

e o meio usado foi decantado da pasta celular. O pélete celular foi ressus- pendido com 150 ml_ de tampão de lise, congelado a -20°C por um mínimo de 16 horas, e em seguida degelado em um banho-maria a 25°C. As células degeladas foram ressuspendidas para uma concentração final de 33% (em 15 peso : vol) em tampão de lise, e rapidamente (3 minutos) homogenizadas usando um homogenizador de laboratório Silverson L4R, equipado com uma cabeça de 3 cm de rotor-estator, e operado a 1.500 rpm. A pasta semifluida celular homogenizada foi rompida a 110,3 mPa (16.000 psi) por duas passa- gens através de um disruptor celular Microfludics de 110 L, e o Iisado foi cla- 20 rificado conforme descrito em PM1.

Método 3 do processo (PM3):

Agrimul NRE-1406 (464 g/mol; Cognis Corp., Cincinnati, OH) e MOPS, pH 7,5 (conc. final de 50 mM) foi adicionado diretamente à cultura celular colhida em um frasco Erlenmyer de 500 ml_ até uma concentração 25 final de 0,3% (em peso : vol). O frasco foi agitado sobre uma placa de agita- ção magnética a 100 rpm usando uma barra de agitação de 5,08 cm por 30 minutos. A suspensão celular foi rapidamente (3 minutos) homogeneizada usando um homogeneizador de laboratório Silverson L4R, equipado com uma cabeça de 3 cm de rotor-estator, e operado a 1.500 rpm. A suspensão 30 pré-homogenizada foi rompida por duas passagens através de um disruptor celular Microfludics de 110 L, o qual foi operado a 110,3 mPa (16,000 psi). Depois de clarificação centrífuga do Iisado a 8.000 x g por 15 min., o sobre- nadante foi decantado do pélete (descarta pélete), e armazenado a -20°C até as ensaios serem realizadas.

Método 4 do processo (PM4Y.

O método 4 do processo seguiu o processo descrito no método 5 2 do processo, exceto que 0,3% (em peso : vol) de Deriphat 160 (Cognis Corp., Cincinnati, OH) foi adicionado à pasta celular degelada antes de ho- mogenização com o homogenizador de laboratório. Todos os outros proce- dimentos foram idênticos a PM2.

Método 5 do processo (PM5):

Foi conduzida precipitação de sulfato de amônio sobre a fração

clarificada de PM2 usando três etapas de fracionamento separadas: Etapa 1: Uma solução saturada a 20% (com base em uma temperatura de 25°C) de sulfato de amônio ((NH4)2SO4) foi preparada adicionando 114 g/l de (NH4)2SO4 diretamente à fração clarificada de PM2. A solução (temp medida = 15°C) foi agitada a 100 rpm por 10 minutos e em seguida centrifugada a

10.000 x g por 25 minutos para remover proteínas precipitadas. O sobrena- dante, o qual continha proteína E do vírus West Nile e foi referido como a fração s0-20%, foi coletado e transferido para a etapa 2. Etapa 2: Uma solu- ção saturada a 30% de (NH4)2SO4 foi preparada adicionando 59 g/l de 20 (NH4)2SO4 diretamente à fração s0-20%. A solução (temp medida = 15°C) foi agitada a 100 rpm por 10 minutos e em seguida centrifugada a 10.000 x g por 25 minutos para remover proteínas precipitadas. O sobrenadante, o qual continha proteína E do vírus West Nile e foi referido como a fração s20-30%, foi coletado e transferido para a etapa 3. Etapa 3: Uma solução saturada a 25 40% de (NH4)2SO4 foi preparada adicionando 62 g/l de (NH4)2SO4 direta- mente à fração s20-30%. A solução (temp medida = 8°C) foi agitada a 100 rpm por 10 minutos e em seguida centrifugada a 10.000 x g por 25 minutos para remover proteínas precipitadas. O pélete adquirido da etapa de centri- fugação, a qual continha proteína E do vírus West Nile e foi referida como o 30 precipitante p30-40%, foi decantado do sobrenadante (descartar sobrena- dante), e armazenado a -20°C até as ensaios serem realizadas.

Método 7 do processo (PM7): O método 7 do processo seguiu o processo descrito no método

1 do processo, exceto que a fração do sobrenadante depois da disrupção celular e centrifugação foi descartada e a fração de particulado foi adicio- nalmente processada para recuperar proteínas de WNV recombinantes. A fração de particulado foi diluída até uma concentração final de 20% (em pe- so : vol) em 50 mM de MOPS, pH 7,5 e 1 mM de EDTA. Deriphat 160 (um tensoativo anfotérico de Ácido Monossódico N-Lauril-beta-lminodipropiônico [Cognis Corporation, Cincinnati, OH]) foi adicionado diretamente à suspen- são diluída para obter uma proporção de detergente para proteína solúvel total de 1,30 ± 0,14 mg de Deriphat 160 por mg de proteína solúvel total. De modo a acelerar as etapas de processamento primário, uma correlação ba- seada em uma equação linear foi desenvolvida entre proteína solúvel total na fração de particulado livre de células e o volume celular acondicionado por colheita para o fermentador. A quantidade requerida de detergente Deri- phat 160 foi rapidamente calculada usando a medição do volume celular a- condicionado centrífugo final com base na Equação 1:

Equação 1:

Deriphat _(g) = V0Final_ PCV * Sample Vol(L) * 0.0341

onde:

Deriphat_(g) é a quantidade de Deriphat 160 adicionao à fração

de particulado ressuspenso.

% Final_PCV é a medição de PCV centrífugo da cultura celular como uma percentagem.

Sample_Vol (L) é o volume total em litros da cultura celular na

colheita.

0,0341 = concentração de proteína final para constante de con- versão da inclinação do PCV da colheita.

A suspensão foi homogeneizada usando uma homogeneizador de laboratório Silverson L4R, equipado com uma cabeça de rotor-estator de 3 cm, e operado a 1.500 rpm por 10 minutos, e em seguida centrifugado a

8.000 x g por 25 minutos. O sobrenadante foi decantado do pélete (pélete descartado), e armazenado a -20°C até as ensaios serem realizadas. Todas as amostras de preparativo (>40 ml) foram reduzidas em volume por liofilização em bandejas de aço inoxidável de 3 litros. As amos- tras foram transferidas para uma bandeja de aço inoxidável e congeladas a - 80°C por 16 horas, em seguida foram transferidas para um Iiofilizador mode- 5 Io 422116 Genesis Vertis com uma temperatura do condensador de -44°C e uma temperatura da prateleira inicial de -10°C. O programa de secagem consistiu de 7 etapas cronometradas nas seguintes temperaturas: -10°C por 20 minutos, -5°C por 200 minutos, O0C por 400 minutos, 5°C por 200 minu- tos, 10°C por 200 minutos, 15°C por 200 minutos, e 25°C por 4000 minutos. 10 O produto foi considerado seco se a pressão do vácuo final (usando uma temperatura de prateleira de 25°C) puder ser mantida abaixo de 100 mTorr. Frações do preparativo secas das bandejas de 3 L foram ressuspendidas em um volume mínimo (<40 ml) de água destilada estéril e em seguida transfe- ridas para um frasco de soro estéril de 100 mL. Os frascos foram transferi- 15 dos para um freezer a -80°C sobre um rack de congelamento em ângulo (25°) por 16 horas. Os frascos foram secados de acordo com o programa de secagem do preparativo.

A Tabela 5 resume as diferentes amostras preparadas para ava- liação em uma ensaio clínica (Estudo I). Estas amostras representam dois constructos de expressão vegetal, três eventos e cinco métodos de proces- so, junto com controles negativos e positivos.

EXEMPLO 8 - FORMULAÇÃO DE ANTÍGENOS DE WNV PRODUZIDOS POR CÉLULAS DE PLANTAS. ESTUDO I

Dois constructos de expressão vegetal, três eventos e cinco mé- 25 todos de processo foram usados para produzir vacinas e vacinas de controle negativo para avaliação clínica de antígenos de WNV produzidos por células vegetais em camundongos. Todas as vacinas foram combinadas com adju- vante completo de Freund para a primeira dose e adjuvante incompleto de Freund para a segunda. WNV inativado foi formulado para uso como um 30 controle positivo.

Formulação de antígeno produzido por célula vegetal.

No início da formulação da vacina, foi preferencial a preparação de doses de 100 ou 50 pg. Portanto, o material vegetal Iiofilizado foi reidra- tado na quantidade mínima de água destilada requerida para passar através da agulha de uma seringa. Com um máximo de 100 μΙ de volume de antíge- no por dose, a dose foi consequentemente determinada por solubilidade do 5 material vegetal (Tabela 6). O antígeno Iiofilizado para o grupo de tratamento 3 foi insolúvel e removido do estudo; o antígeno Iiofilizado para o grupo 1 não foi suficientemente concentrado para atingir a dose de 100 pg no volu- me de 100 μΙ requerido e também foi removido do estudo. Preparações de controle negativo foram reidratadas com a quantidade mínima de água re- 10 querida e em seguida trazidas até aproximadamente 1 ml com água adicio- nal.

Uma alíquota de antígeno reidratado foi emulsificada com um volume igual de adjuvante completo de Freund (ICN 642851) usando duas seringas de vidro de 2 ml e uma agulha de micro-emulsificação de 2 7/8 po- 15 legadas calibre 20. As vacinas foram mantidas sobre gelo do início ao fim, e suspensões de estoque reidratadas foram congeladas a -80°C imediatamen- te depois do uso. Para um segundo uso, o material vegetal previamente rei- dratado foi degelado em temperatura ambiente e emulsificado com um vo- lume igual de adjuvante incompleto de Freund (ICN 642861) usando as 20 mesmas seringas e agulhas que antes. As emulsões foram mantidas sobre gelo e injetadas imediatamente depois da preparação de todas as vacinas. Formulação de antígeno de referência.

A partir do padrão de referência de WNV inativado (descrito no Exemplo 5), Triton X-100 foi removido com uma coluna de spin "Detergent- OUT" da Chemicon International antes de formulação para uso como uma vacina. A dose se basou na concentração de proteína E de WNV a 27,2 pg por mL (Tabela 6).

EXEMPLO 9 - PRODUÇÃO DE SORO NEUTRALIZANTE DE WNV COM ANTÍGENOS PRODUZIDOS POR CÉLULAS DE PLANTAS. ESTUDO I Vacinação de camundongos.

Camundongos SPF fêmeas, CD-1 não consanguíneos, (Charles River) foram adquiridos e aclimatados às instalações do estudo antes da vacinação. Os camundongos foram alojados, 5 por gaiola, e identificados por número do grupo com um clipe de orelha. No dia 0, aos 50 dias de idade, todos os camundongos receberam uma dose de 200 pl_ dos vários tratamen- tos conforme descrito na Tabela 6 (Exemplo 8). As vacinações foram Iibera- 5 das a partir de uma seringa de 1 ml com uma agulha calibre 27 em quatro sítios de 50 pl_ cada por via subcutânea na região abdominal. Devido a um atraso na disponibilidade de reagentes, os camundongos do Grupo 12 foram vacinados um mês depois dos outros e portanto foram vacinados aos 80 di- as de idade. No dia 17, os camundongos receberam uma segunda dose de 10 200 pl_ dos vários tratamentos conforme descrito na Tabela 6 (Exemplo 8). As vacinações foram liberadas em quatro sítios de 50 pl_ cada por via subcu- tânea na região do abdômen. O Grupo 12 foi revacinado em 14 dias ao invés de 18. Dois camundongos do Grupo 4 adoeceram depois da segunda vaci- nação e um morreu 30 horas depois.

Coleta de soro.

No dia 31, os camundongos foram anestesiados por breve expo- sição a CO2 e foram exsanguinados por punção cardíaca. O sangue foi cole- tado dentro de tubos Eppendorf etiquetados, deixado para coagular, e centri- fugado para sedimentar as células remanescentes. O soro foi mantido a - 20 80°C até a hora da ensaio. Os camundongos Grupo 12 foram exsanguina- dos no dia 28 ao invés de 32.

Ensaio de Neutralização Sérica de WNV.

Todas as ensaios de neutralização sérica foram realizadas em um laboratório BL-3. Os títulos de neutralização foram medidos em uma en- 25 saio sérica variável, de vírus constante, sobre células VERO. Soro inativado por calor (30 minutos a 56°C) foi diluído a partir de 1:10 em etapas duplas até 1:1280 em uma placa de microtitulação, dois poços por diluição, em Meio 199 com 5% de soro bovino fetal (FBS). Estoque de vírus WNV, um isolado de centrocerco do Wyoming, foi diluído para 1:10 no mesmo meio e um vo- 30 lume igual foi adicionado ao soro dentro de cada poço, dando diluições séri- cas finais de 1:20 a 1:2560. As placas foram incubadas por 30 minutos para permitir ao soro neutralizar o vírus, e em seguida 12.000 células VERO em um volume igual do mesmo meio foram adicionadas a cada poço para detec- tar vírus não-neutralizado. Controles (soros positivos conhcidos, poços não infectadas, e titulação do vírus) foram incluídos sobre uma placa separada. As placas foram incubadas a 37°C em 5% de CO2 por 13 dias e observadas microscopicamente em intervalos para a presença de efeito citopático (CPE).

A leitura da ensaio final foi em 13 dias. O controle de células não infectadas não teve CPE. Os títulos de neutralização das amostars de teste foram expressados como a recíproca da diluição final de soro presente nas misturas de soro e vírus no desfecho de 50%. A retrotitulação de WNV foi 10 >128 TCID50 por poço. Soro de controle positivo anti-WNV de coelho teve um título de >2560. Soros de camundongos vacinados tiveram títulos de neutralização conforme mostrado na Tabela 7. Alterando títulos de neutrali- zação de >2560 a 2560 (0 título máximo que a ensaio pode medir) e títulos de <20 a 20 (o título mínimo que a ensaio pode medir) e calculando um título 15 de média geométrica por grupo, foi gerada a Figura 35. A Figura 35 propor- ciona uma apresentação gráfica de títulos de neutralizantes séricos de WNV.

O teste t de Student mostrou que os títulos do Grupo 2 foram estatisticamente maiores do que todos os outros grupos exceto o Grupo 5 e que os Grupos 4 e 5 não foram estatisticamente diferentes. O controle posi- 20 tivo para WNV inativado (Grupo 12) foi medido em uma ensaio separada com uma diluição de desfecho maior e portanto não foi rigorosamente com- parável aos outros resultados.

Em conclusão, todas as preparações de proteína E de WNV produzidas por células de planta usadas para vacinação, independente da quantidade de proteína E presente ou do método do processo, produziram anticorpos neutralizantes. Preparações de controle negativo não produziram anticorpos neutralizantes (Grupos 8, 9, 11, e 13).

Em geral, as injeções foram bem toleradas pelos animais. Não está evidente se a doença e a única morte depois da segunda injeção do Grupo 4 foi devida a trauma físico ou a uma reação adversa ao antígeno, o adjuvante, ou outros componentes da vacina.

EXEMPLO 10 - PRODUÇÃO DE SORO NEUTRALIZANTE DE WNV COM ANTÍGENOS PRODUZIDOS POR CÉLULAS DE PLANTAS. ESTUDO Il

Para confirmar e entender mais a eficácia de the plant-cell- produced antígenos de WNV no modelo de camundongo, foi adquirido um grupo adicional de camundongos e foram imunizados com doses elevadas, 5 médias, e baixas de antígeno formuladas com cinco adjuvantes diferentes, conforme listado na Tabela 8. O evento de transformação e método do pro- cesso para recuperação de antígeno não foram variados. O evento (pDAB 2475) 1622-207 colhido por PM7 foi usado exclusivamente neste estudo. Formulação de vacinas.

A formulação de vacinas foi iniciada reidratando extrato de plan-

ta de WNV liofilizado. Foi adicionada água suficiente a cada um de cinco frascos para produzir uma solução de antígeno a 125 pg/ml. Foi feita reidra- tação usando água estéril e usando agulhas e seringas estéreis para a adi- ção de água. As soluções reidratadas foram reunidas dentro de um novo 15 frasco estéril. Em seguida a solução foi homogeneizada por 50 passagens através de uma válvula reguladora estéril de três posições usando duas se- ringas estéreis. A solução homogeneizada foi reunida dentro de um novo frasco estéril.

Lotes de seis mililitros de cada vacina de 25 pg/dose foram pre- parados primeiro extraindo 3,0 ml de solução de antígeno dentro de uma nova seringa descartável estéril de 10 ml. Em seguida, 3,0 ml de adjuvante esterilizado foram extraídos dentro de uma segunda nova seringa descartá- vel estéril. Ambas as seringas foram ajustadas a uma nova válvula regulado- ra estéril de três posições. O extrato de planta foi em seguida movido para dentro da seringa de adjuvante através da válvula reguladora. A vacina foi emulsificada passando a vacina entre as duas seringas através do 50 ciclos. No completamento do último ciclo a seringa contendo a vacina foi removida da válvula reguladora. A vacina foi transferida para dentro de frascos de se- ringa de soro estéreis, selados e etiquetados. Vacinas embaladas foram ar- mazenadas a 4 °C. As vacinas foram mantidas a 4°C até serem usadas.

Para formular as vacinas de 5 pg/dose, uma porção da solução de extrato de planta original de 125 pg/ml foi diluída com água para produzir uma solução a 25 pg/ml. Esta solução de antígeno diluída foi usada para formular estas vacinas. O procedimento resumido acima foi repetido para cada uma das cinco vacinas de teste usando novas seringas estéreis e vál- vulas reguladoras de três posições para cada vacina.

5 As vacinas de 0,5 pg por dose foram formuladas usando uma

porção da solução de antígeno a 25 pg/ml diluída até 5 pg/ml. Esta solução de antígeno diluído foi usada para formular estas vacinas. Os mesmos pro- cedimentos previamente resumidos foram usados para produzir as cinco vacinas da ensaio neste nível de dose.

Adjuvante Titer-Max é incompatível com borracha de neopreno.

Não se deve deixar vacinas contendo adjuvante Titer-Max entrar em contato com borracha de neopreno. Portanto, todas as seringas plásticas foram usa- das durante a formulação e septos revestidos de Teflon foram usados para selar os frascos de soro para as vacinas embaladas.

Formulação de Controle de Célula Vegetal.

Dois frascos de extrato NT-1 Tobacco Cell não-transgênico Iiofi- Iizado foram reidratados com água estéril para produzir uma solução similar à solução de antígeno a 125 pg/ml. Esta solução de controle em branco foi homogenizada na mesma maneira que a solução de antígeno. A vacina de 20 controle foi formulada usando os mesmos procedimentos que as vacinas de 25 pg/dose. Conforme determinado anteriormente todas as seringas plásti- cas e um septo revestido de Teflon foram usados com esta vacina.

Vacinação de Camundongos.

Camundongos SPF fêmeas, CD-1 outbred, (Charles River) fo- 25 ram recebidos de uma única colônia em recipientes de remessa de 40 ca- mundongos cada. Os camundongos foram alojados 5 por gaiola, aclimados às instalações do estudo, e o número do seu grupo foi identificado com um clipe de orelha. Com 10 a 11 semanas de idade, todos os camundongos re- ceberam uma dose de 200 pL dos vários tratamentos conforme descrito na 30 Tabela 8. As vacinações foram liberadas de uma seringa de 1 ml com uma agulha calibre 27 em quatro sítios de 50 pL cada, por via subcutânea na re- gião abdominal. Dentro de 48 horas depois da primeira vacinação, foi evidente que os camundongos nos grupos 6 a 8 estavam reagindo localmente e sis- temicamente à injeção. Os camundongos que receberam vacinas formula- das com carbopol pararam de comer e de beber, se amontoaram juntos, e 5 cresceu o pelo. A estes camundongos não foram administradas quaisquer vacinações adicionais.

No dia 15, camundongos nos grupos 1 a5e9a17 receberam uma segunda dose de 200 μΙ_ dos vários tratamentos conforme descrito na Tabela 8. As vacinações foram liberadas asiem quatro sítios de 50 μΙ_ cada subcutaneamente na região do abdômen. Não foram observadas reações adversas nestes grupos.

Coleta de soro.

No dia 22, camundongos nos grupos 6-8 foram anestesiados por breve exposição a CO2 e exsanguinados por punção cardíaca. No dia 28, 15 camundongos em todos os outros grupos foram anestesiados de modo simi- lar e exsanguinados. O sangue foi coletado dentro de tubos Eppendorf eti- quetados, deixado para coagular e centrifugado para sedimentar as células remanescentes. O soro foi mantido a <_-80°C.

Ensaio de Neutralização Sérica de WNV.

Todos os ensaios de neutralização sérica foram realizados em

um laboratório BSL-3. Os títulos de neutralização foram medidos em um ví- rus constante, variando o ensaio sérico sobre células VERO. Soro inativado com calor (30 minutos a 56°C) foi adequadamente diluído em uma placa de microtitulação, cinco poços por diluição, em DMEM com 2% de soro bovino 25 fetal (FBS). Estoque de vírus WNV, um isolado de centrocerco do Wyoming, foi diluído para obter uma faixa de 100-300 TCID50/25 μΙ no mesmo meio de diluição e um volume igual foi adicionado ao soro dentro de cada poço. As placas foram incubadas por 60 minutos para permitir que o soro neutralizas- se o vírus, e em seguida 20.000 a 30.000 células VERO em 150 μΙ de meio 30 foram adicionadas a cada poço para detectar vírus não-neutralizado. Contro- les (soros positivos conhecidos, poços não infectados, e titulação do vírus) foram incluídos sobre uma placa separada. As placas foram incubadas a 37°C em 5% de CO2 por 4 a 7 dias e foram observadas microscopicamente em intervalos para a presença de efeito citopático (CPE). O controle celular não infectado não teve CPE. A retro titulação de WNV foi 194 TCID5O por poço. Os títulos de neutralização desconhecidos foram expressados como a 5 recíproca da diluição final de soro presente nas misturas de soro e vírus na diluição onde as células não foram infectadas.

Muitos camundongos vacinados desenvolveram altos níveis de anticorpos neutralizantes e a reação variou com a dose de antígeno e o ad- juvante (Figura 36). Os anticorpos não foram engendrados em camundongos 10 que receberam adjuvante e células NT-1 somente (Grupo 1, dados não mos- trados). É evidente que E proteína de WNV produzida por célula de planta foi altamente imunogênica e possui no mínimo um epítopo requerido para pro- duzir anticorpos neutralizantes. O fato de que uma única injeção engendrou anticorpos neutralizantes nos camundongos injetados com a formulação de 15 carbopol (Grupos 6 a 8) sugere que o antígeno induziu um nível protetor de IgM. Embora as diferenças entre alguns grupos fossem estatisticamente sig- nificantes em p < 0,05, não foram claros padrões óbvios devido àinerente variabilidade dentro do ensaio.

EXEMPLO 11 - DEMONSTRAÇÃO DE EFICÁCIA PROTETORA DE ANTÍ- GENO PRODUZIDO POR CÉLULAS DE PLANTAS EM CAVALOS.

Para confirmar e entender adicionalmente a eficácia dos antíge- nos de WNV produzidos por células de planta na espécie equina, cavalos foram adquiridos e vacinados com altas e baixas doses de antígeno formu- ladas com 2 diferentes adjuvantes, conforme listado na Tabela 17. O evento 25 de transformação e método de processo para recuperação de antígeno não foram variados. O evento (pDAB 2475)1622-207 colhido por PM7 foi exclusi- vamente usado neste estudo.

Formulação de vacinas.

A formulação de vacinas foi iniciada por reidratação de extrato de planta WNV liofilizada, usando o mesmo lote de antígeno como no Estu- do Il (Exemplo 10). As concentrações alvo das vacinas foram 10 e 1 pg/ml. O antígeno Iiofilizado foi reidratado com água estéril até 70 ml de volume e concentração de 20 pg/ml, com base na concentração de proteína E deter- minada por ELISA antes da liofilização do extrato. Depois de reidratação, a solução de estoque de antígeno foi homogeneizada para proporcionar uma solução uniforme. Foi realizada homogenização usando duas seringas de 20 5 ml conectadas a uma válvula reguladora de três posições. A solução foi pas- sada para frente e para trás entre as seringas por 50 ciclos e em seguida colocada dentro de um novo frasco estéril de 100 ml. Uma vez homogenei- zado, o estoque foi filtrado estéril para dentro de um novo frasco plástico estéril. Filtração estéril foi realizada usando unidades de filtro Millipore Steri- 10 vex - GV, de 0,22 pm (Número do Lote H4NN92488). Neste ponto o material foi amostrado usando técnicas estéreis tanto para ensaio ELISA quanto para ensaio de Esterilidade. A ensaio de Esterilidade necessitou de duas sema- nas para completar e confirmou que a solução era estéril dentro dos limites do teste descrito abaixo. Ensaio ELISA confirmou que a solução de estoque 15 continha aproximadamente 20 pg/ml. Este valor de concentração foi consis- tente com os valores prévios para este material.

Solução de Estoque de Carboool 974 P NF.

Tampão estéril de 1X PBS foram preparados primeiro diluindo 100 ml de Fisher Scientific Brand PBS: 10X solução de Salina Tamponada com Fosfato (Lote n° 044924-36) para 1 litro em água Dl. 500 ml de 1X PBS foi transferido para dentro de um béquer limpo de 600 ml equipado com uma barra de agitação magnética. 5,0 gramas de Carbopol 974P NF (Noveon, Lote n° CC52NAB635) foram dispersados dentro do tampão de PBS usando o agitador magnético. A mistura foi agitada por 30 minutos para assegurar a dispersão do pó. O béquer agitado foi equipado com uma sonda de pH, e o pH da solução foi ajustado para estar dentro de uma faixa de pH de 6,8 a 7,6 usando Solução de Hidróxido de Sódio, 50% em peso/ peso (Fisher Brand, Lote n° 0430451-24). Uma vez que o pH foi ajustado, a solução foi deixada para agitar por um adicional de 30 minutos para assegurar que o pH estives- se estável. Este procedimento resultou em 10 mg/ml (10.000 pg/ml) de uma solução de estoque de Carbopol 974P NF neutralizado. A solução final foi transferida para dentro de vários tamanhos de frascos limpos Pyrex Media Bottles e etiquetados. Os frascos foram em seguida autoclavados por 45 minutos, 121°C, e 124,1 kPa (18 psi) para assegurar a esterilidade. Na re- moção do autoclave, os frascos foram selados e deixados para esfriar em uma coifa. Antes da montagem da vacina, um frasco de solução de estoque 5 de Carbopol 974P NF foi selecionado e submetido a ensaio de esterilidade conforme descrito abaixo.

Solução de Estoque a 30% de Polvaen.

Polygen é um adjuvante disponível comercialmente. P fabricante de Polygen recomenda que o produto seja diluído para uma solução a 30% antes da formulação. Também se recomenda que as vacinas sejam formula- das para conterem 15% em vol/ vol de Polygen como o pacote de adjuvante. Solução de Estoque a 30% de Polygen foi preparada em um gabinete BL2 Biosafety, transferindo 140 ml de água estéril para um frasco estéril de 250 ml de policarbonato. 60 ml de Polygen (MVP Laboratories, Inc. Ralston, NE, Lote 10011) foi adicionado à água estéril e misturado, resultando em uma solução de Polygen a 30%. Esta solução foi em seguida transferida para um frasco de 250 ml Pyrex Media Bottle e autoclavado. Na remoção do autocla- ve, o frasco foi selado e transferido para a coifa BL2 e deixado para esfriar até a temperatura ambiente. Este recipiente foi testado para esterilidade an- tes da montagem da vacina.

Água Estéril

Água estéril foi preparada enchendo parcialmente frascos limpos Pyrex Media Bottles com água Dl. Os frascos foram em seguida autoclava- dos por 45 minutos, 121 °C, e 124,1 kPa (18 psi). Na remoção do autoclave, 25 os frascos foram selados enquanto ainda quentes e deixados para esfriar em uma coifa. Antes da montagem da vacina um frasco de água estéril foi sele- cionado e submetido a prova da esterilidade conforme descrito abaixo. Ensaio da Esterilidade.

Para assegurar a axenicidade das vacinas formuladas, todas as matérias-primas estéreis usadas na formulação, e as próprias vacinas formu- ladas, foram testadas para esterilidade.

Preparação de Áqar e Placas de Petri Ágar de Bennett foi usado para a laminação de esterilidade. Á- gar de Bennett foi preparado na seguinte maneira:

Ágar de Bennett Quantidade

Extrato de Levedura 1,0 g/L

Extrato de Carne 1,0 g/L

NZ Amina A 2,0 g/L

Glicose 10,0 g/L

Ágar 15,0 g/L

Água Dl 1,0 L

Aquecer sobre uma placa de agitação até o ágar ser dissolvido.

(Cobrindo ligeiramente com folha fina de metal facilitará o aquecimento)

Encher os frascos cerca da metade, tampar frouxamente e auto- clavar no ciclo líquido por 20 minutos, 1210C e 18 psi.

Placas de Petri de 100X15 mm foram enchidas até aproximada- mente % repletas com ágar de Bennett e foram deixadas para solidificar. As placas foram preparadas no mínimo quatro dias antes da experimentação para assegurar que estivessem estéreis antes de usar na experimentação. Laminação de Matérias-primas e Vacinas Formuladas

Uma alça inoculante estéril de 10 μΙ foi usada para obter uma amostra do ingrediente bruto ou da vacina formulada sendo testada. O mé- todo de faixa de quadrante, uma técnica comum em microbiologia usada para obter isolados de colônia única, foi usado para laminar a amostra. Em um esforço para aumentar a sensibilidade do teste, uma segunda placa foi estabelecida com uma amostra de 200 μΙ. A amostra foi uniformemente es- palhada através da placa com um espalhador celular estéril. As placas foram incubadas de cabeça para baixo dentro de uma incubadora a 30°C. Foram verificadas diariamente (exceto nos fins de semana) para quaisquer sinais de crescimento de contaminantes. Uma vez que as placas tinham permane- cido limpas por duas semanas, a matéria-prima laminada foi considerada estéril e pronta para uso.

Duas a três semanas antes da data de início do estudo as vaci- nas foram reunidas. A Tabela 18 mostra os cálculos para este lote de vacina e os volumes de cada componente usado. A vacina foi reunida primeiro pipe- tando a água e a solução de adjuvante requerida para dentro de um frasco plástico estéril de 250 ml estéril. O frasco foi fechado e agitado para misturar os dois componentes. O frasco foi em seguida aberto e o antígeno foi adi- 5 cionado por pipeta. O frasco foi novamente fechado e agitado para misturar completamente os componentes. A vacina final foi transferida para dentro de frascos estéreis contendo ou 10 ou 25 ml de vacina. As rolhas do septo fo- ram colocadas dentro dos frascos usando um par de fórceps autoclavados para manusear a rolha. Uma vez que a rolha estava assentada sobre os 10 frascos, estes foram selados com um selo de alumínio plissado. Os frascos foram etiquetados com a etiqueta previamente aprovada e armazenados dentro do refrigerador e mantidos em 2 a TC antes da expedição. Um frasco de cada cada vacina foi testado para esterilidade conforme descrito in the Sterility Testing seção. Depois do experimento de esterilidade ser completa- 15 do, a amostra de vacina foi avaliada para pH, densidade, e Osmolalidade. Os resultados do experimento de propriedade física são mostrados na Tabe- la 19.

Vacinação de cavalos.

Quarenta e seis cavalos negativos para anticorpos neutralizan- tes séricos WNV (machos e fêmeas; de 6 a 12 meses de idade; títulos de WNV SN < 1:20) foram adquiridos de um fornecedor externo. Os cavalos foram misturados em uma instalação à ensaio de mosquito e foram identifi- cados individualmente por microchips implantados. No Dia 0 do Estudo, foi colhida uma amostra de sangue de todos os cavalos e em seguida todos os cavalos receberam 1 mL do tratamento prescrito conforme descrito na Tabe- la 17. As vacinações foram administrados por via intramuscular sobre o lado esquerdo do pescoço. O sangue foi processado em soro e armazenado a - 28,9°C (-20°F) para análise posterior. Os cavalos foram monitorados diaria- mente para quaisquer sinais de reatividade adversa à vacinação. Não foram observadas reações.

No Dia 14 do Estudo, uma amostra de sangue foi colhida de todos os cavalos e em seguida todos os cavalos receberam 1 mL do trata- mento prescrito conforme descrito na Tabela 17. As vacinações foram libe- radas por via intramuscular sobre o lado direito do pescoço. O sangue foi processado em soro e armazenado a -28,9°C para análise posterior. Os ca- valos foram monitorados diariamente para quaisquer sinais de reatividade 5 adversa à vacinação. Não foram observadas reações.

Além das amostras de sangue coletadas nos Dias 0 e 14 do Es- tudo, também foram coletadas amostras de sangue de todos os cavalos nos Dias 7, 21, 28, 35, 42 e 49 do Estudo. Todas as amostras de sangue foram coletadas da veia jugular e aproximadamente 12 mL de sangue foi coletado 10 em cada dia da amostra. Todo o sangue foram processados em soro e ar- mazenado a -28,9°C para análise posterior.

Ensaio de Neutralização Sérica do WNV.

Todas as ensaios de neutralização sérica foram realizadas em um laboratório BSL-3. Os títulos de neutralização foram medidos em uma ensaio sérica variável, de vírus constante, sobre células VERO. Soro inati- vado por calor (30 minutos a 56°C) foi adequadamente diluído em uma placa de microtitulação, cinco poços por diluição, em DMEM com 2% de soro bovi- no fetal (FBS). Vírus WNV do estoque, um isolado de centrocerco do Wyo- ming, foi diluído para obter uma faixa de 100 a 300 TCID5o/25 μΙ no mesmo meio de diluição e um volume igual foi adicionada ao soro em cada poço. As placas foram incubadas por 60 minutos para permitir ao soro neutralizar o vírus, e em seguida 20.000 a 30.000 células VERO em 150 μΙ de meio foram adicionadas a cada poço para detectar vírus não-neutralizado. Controles (soros positivos conhecidos, poços não infectadas, e titulação do vírus) fo- ram incluídos sobre uma placa separada. As placas foram incubadas a 37°C em 5% de CO2 por 4 a 7 dias e observadas microscopicamente em interva- los para a presença de efeito citopático (CPE). O controle celular não infec- tado não teve CPE. Os títulos de neutralização das amostras de teste foram expressadas como a recíproca da diluição final do soro presente nas mistu- ras de soro e vírus na diluição onde 50% das células foram não infectadas. A retrotitulação de WNV estava dentro da faixa de 50 a 300. Soro controle po- sitivo anti-WNV equino teve uma faixa de título de 150 a 450. Para calcular o título médio geométrico (GMT), títulos <_2 foram atribuídos 2 e títulos > 356 foram atribuídos 356. Soros de cavalos vacinados tiveram títulos de neutrali- zação conforme mostrado na Tabela 20. Não foram gerados títulos de neu- tralizantes séricos em cavalos recebendo as vacinas de controle celular NT-

5 1 com adjuvante (Grupos 1 e 2). Cavalos recebendo a proteína E de WNV com adjuvante (Grupos 3, 4, 5 e 6) gerados de WNV anticorpo neutralizante (Tabela 20). É evidente que a proteína E de WNV produzida por células de planta foi altamente imunogênica e possui no mínimo um epítopo requerido para produzir anticorpos neutralizantes.

No Dia 101 do Estudo, todos os cavalos dos Grupos 1 e 3 e 2

cavalos do Grupo 2 (total de 15 cavalos) foram remetidos para uma instala- ção BSL-3 para estímulo. No Dia do Estudo 105 todos os cavalos foram es- timulados pela inoculação intratecal de 107.000 unidades formadoras de placa (pfu) WNV NY99 em 1 mL de PBS. Os cavalos foram monitorados du- 15 as vezes ao dia por 14 dias e amostras de sangue foram colhidas duas ve- zes ao dia no dia 1 ao 6 e uma vez ao dia no dia 0 (dia do estímulo), 7, 10 e 14 pós-estímulo para processamento no soro e avaliação da viremia. Os ca- valos demonstrando graves sintomas neurológicos durante o período de ob- servação de 14 dias pós-estímulo foram humanamente sacrificados por uma 20 overdose de barbiturato. Todos os cavalos restantes foram sacrificados ao final do estudo (Dia 14 a 17). Os cavalos foram considerados como estando infectados com WNV e não-protegidos se tiveram 2 culturas positivas conse- cutivas das amostras de sangue colhidas nos dias 0a 7, 10 e 14 pós- estímulo. Adicionalmente, foi avaliada a proteção contra doença por monito- 25 ramento clínico duas vezes ao dia inclusive medição da temperatura. Foi realizada histopatologia sobre seções do cérebro de todos os cavalos.

Os dados da viremia são apresentados na Tabela 21. Todos os cavalos controle não vacinados (Grupo 1 e 2) foram virêmicos por no mínimo

2 dias consecutivos durante o período pós-estímulo. Na viremia foi detectada em qualquer dos cavalos vacinados durante o período de monitoramento pós-estímulo.

Os dados da temperatura são apresentados na Tabela 22. Os cavalos foram considerados como sendo febris se 2 medições de temperatu- ra consecutivas foram maiores ou iguais a 39,17°C (102,5°F). Quatro dos cinco cavalos controle não vacinados (Grupo 1 e 2) foram febris durante o período pós-estímulo. Um dos cavalos controle não foi considerado como 5 sendo febril com base no critério de 2 medições de temperatura consecuti- vas de > 39,17°C (102,5°F); no entanto, este cavalo teve vários eventos fe- bris independentes e foi sacrificado devido a graves sinais clínicos antes do fim do período de observação do estímulo. Nove dos 10 cavalos vacinados no Grupo 3 estavam afebris durante o período pós-estímulo. Um dos 10 ca- 10 valos vacinados (Grupo 3) teve 2 medições de temperatura consecutivas > 39,17°C (102,5°F).

Dados de avaliação clínica são apresentados na Tabela 23. Os cavalos foram monitorados duas vezes ao dia para sinais clínicos de doença inclusive letargia, depressão, tremores, diminuição do apetite, hipersensibili- 15 dade, relutância para mover, moribundo. Se não foram observados sinais de doença clínica e os cavalos estavam clinicamente normais eles foram avali- ados como sendo espertos e responsivos (BAR). Os cavalos foram conside- rados como tendo sinais clínicos de WNV se tiveram 2 avaliações consecuti- vas onde foram observados sinais clínicos de doença. Três dos cinco cava- 20 Ios controle não vacinados (Grupo 1 e 2) demonstraram sinais clínicos de doença. A gravidade destes sinais clínicos progrediu significativamente e estes 3 cavalos foram humanamente sacrificados durante o período pós- estímulo. Dois dos 5 cavalos controle não demonstraram sinais clínicos de doença. Nove dos 10 cavalos vacinados no Grupo 3 foram assintomáticos 25 durante o período pós-estímulo. Um dos 10 cavalos vacinados (Grupo 3) teve 2 avaliações consecutivas onde foram evidentes sinais clínicos brandos de doença. Estes sinais clínicos não progrediram e o cavalo retornou à ava- liação BAR.

Foi realizado exame histológico de 2 seções do cérebro (através da ponte e através da medula média) em cada cavalo. Os resultados destes exames histológicos são apresentados na Tabela 24. A histologia foi consi- derada como sendo anormal se ambas as seções apresentaram sinais de alterações brandas, moderadas ou graves. Cinco dos cinco cavalos controle não vacinados (Grupo 1 e 2) foram histologicamente anormais com ambas as seções examinados tendo alterações histológicas moderadas a graves associadas com encefalite. Três dos 10 cavalos vacinados no Grupo 3 tive- 5 ram histologia anormal das 2 seções cerebrais examinadas. Em 2 destes cavalos, estes achados anormais foram brandos em ambas as seções exa- minadas. Um dos cavalos teve encefalite moderada observada. Não foram evidentes lesões graves. Sete dos 10 cavalos vacinados tiveram histologia normal ou somente alterações histológicas brandas em somente uma das 10 seções examinadas. Estas alterações unilaterais brandas não foram consi- deradas como sendo consistentes com infecção por WNV.

Deve ser entendido que os exemplos e modalidades descritos aqui, neste pedido de patente, são para fins ilustrativos somente e que vá- rias modificações ou alterações à Iuz dos mesmos serão sugeridas a pesso- 15 as versadas na técnica e devem ser incluídas dentro do espírito e do âmbito deste pedido. Além disso, quaisquer elementos ou limitações de qualquer invenção ou modalidade da mesma revelados aqui, neste pedido de patente, podem ser combinados com quaisquer e/ou todos outros elementos ou limi- tações (individualmente ou em qualquer combinação) ou qualquer outra in- 20 venção ou modalidade da mesma revelados aqui, neste pedido de patente, e todas as referidas combinações são contemplados com o âmbito da inven- ção sem limitação a estes. Tabela 1. Distribuição de códons em regiões codificantes de proteína do gene do tabaco Aminoáci- Códon % de Uso Aminoáci- Códon % de Uso do do Tabaco do do Tabaco ALA (A) GCA 31,0 LEU (L) CTA 10,5 GCC 17,3 CTC 13,0 GCG 8,1 CTG 11,2 GCT 43,6 CTT 25,9 ARG (R) AGA 31,7 TTA 15,3 AGG 24,6 TTG 24,0 CGA 11,9 LYS (K) AAA 50,0 CGC 8,1 AAG 50,0 CGG 7,7 MET (M) ATG 100,0 CGT 16,0 PHE (F) TTC 41,9 ASN (N) AAC 39,4 TTT 58,1 AAT 60,6 PRO (P) CCA 38,9 ASP (D) GAC 31,1 CCC 13,6 GAT 68,9 CCG 10,0 CYS (C) TGC 42,6 CCT 37,5 TGT 57,4 SER (S) AGC 12,5 END TAA 42,6 AGT 17,3 TAG 19,6 TCA 22,6 TGA 37,8 TCC 14,1 GLN (Q) CAA 58,9 TCG 7,2 CAG 41,1 TCT 26,2 GLU (E) GAA 55,7 THR (T) ACA 32,7 GAG 44,3 ACC 19,1 GLY (G) GGA 34,6 ACG 8,8 GGC 16,2 ACT 39,4 GGG 15,4 TRP (W) TGG 100,0 GGT 33,7 TYR (Y) TAC 41,4 HIS (H) CAC 38,3 0 TAT 58,6 CAT 61,7 VAL (V) GTA 18,3 ILE(I) ATA 25,8 GTC 17,0 ATC 24,6 GTG 24,3 ATT 49,6 GTT 40,4 Tabela 2. Comparações da composição de códons de regiões codificantes de peptídeo M e E da seqüência de WNV nativo (bases 277-2004 de SEQ ID NO: 1) e duas versões de gene otimizado para tabaco (SEQ ID NO: 6 e SEQ ID NO: 7). Amino- Códon SEQ SEQ SEQ Amino- Códon SEQ SEQ SEQ ácido ID NO: ID NO: ID NO: ácido ID NO: ID NO: ID NO: ALA 1 6 7 LEU 1 6 7 GCA 10 19 17 CTA 7 0 0 GCC 15 10 10 CTC 10 8 8 GCG 6 0 0 CTG 9 7 7 GCT 21 23 25 CTT 5 15 16 ARG AGA 10 10 8 TTA 1 9 9 AGG 5 7 6 TTG 22 15 14 CGA 0 2 2 LYS AAA 10 18 14 CGC 2 0 0 AAG 20 12 16 CGG 1 0 0 MET ATG 15 15 15 (M) CGT 3 2 5 PHE TTC 11 10 10 ASN AAC 15 7 8 TTT 13 14 14 AAT 6 14 13 PRO CCA 7 8 8 ASP GAC 16 8 7 CCC 2 3 3 GAT 5 13 14 CCG 1 0 0 CYS TGC 9 5 5 CCT 9 8 8 TGT 3 7 7 SER AGC 13 6 6 END TAA AGT 3 7 8 TAG TCA 14 10 10 TGA TCC 5 7 8 GLN CAA 6 9 10 TCG 3 0 0 (Q) CAG 9 6 5 TCT 5 13 11 GLU GAA 15 14 14 THR ACA 14 17 18 (E) (T) GAG 10 11 11 ACC 13 11 10 Tabela 2. Comparações da composição de códons de regiões codificantes de peptídeo M e E da seqüência de WNV nativo (bases 277-2004 de SEQ ID NO: 1) e duas versões de gene otimizado para tabaco (SEQ ID NO: 6 e SEQ ID NO: 7). GLY GGA 34 20 20 ACG 9 0 0 GGC 14 11 10 ACT 13 21 21 GGG 8 7 9 TRP TGG 12 12 12 (W) GGT 3 21 20 TYR TAC 8 7 7 HIS (H) CAC 8 4 5 TAT 6 7 7 CAT 6 10 9 VAL GTA 1 11 10 ILE(I) ATA 5 5 6 GTC 12 6 9 ATC 9 5 6 GTG 32 11 14 ATT 7 11 9 GTT 10 27 22 Tabela 3. Meio NT-1 B Reagente Por litro Sais MS (10X) 100 ml MES 0,5 g Tiamina-HCI (1 mg/ml) 1 ml Myo-inositol 100 mg K2HPO4 137,4 mg 2,4-D (10 mg/ml) 222 μΙ Sacarose 30 g pH até 5,7 + 0,03 Tabela 4. Sumário de rodadas de fermentação de reator de tanque agitado (STR). Evento ID do Lote Vaso fer- % de Volume Recuperação mentador PCV da da co¬ volumétrica (mg colheita lheita de antígeno /L (L) de volume de trabalho) 1622-210δ WNV S- Biostat 50 9,9 1,846 RD05005 C20 1622-2075 WNV S- Biostat 38 9,3 1,574 RD05006 B10 1622-210 WNV S- Bioflo 56 9,8 1,997 RD05007 3000 1622-207 WNV S- Biostat 36 9,3 1,645 RD05008 B10 1622-207 WNV S- Biostat 38 9,4 1,492 RD05009 B10 1702-5255 WNV S- Biostat 41 9,5 0,966 RD05010 KB10 δ = Todos os 1622 eventos foram transformados com pDAB2475, codifican- do as proteínas ME1 ao passo que todos os 1702 eventos foram transforma- dos com pDAB2481, codificando as proteínas prME com sítio de glicosilação

mutado com proteína E (prME(-)). Tabela 5. Amostras de antígeno do Vírus West Nile recombinante produzi¬ do para o Estudo I. Grupo de Evento de Método do Concentração de No. de ID do tratamen¬ cultura celular processo proteína E (mg) Lote, rótulo to, n = 5 do frasco 1 1622-207 PM7 3,38 SRD05005 2 1622-207 PM7 3,38 SRD05005 3 1622-207 PM3 0,71 SRD05006 4 1622-210 PM4 0,48 SRD05007 5 1622-210 PM2 0,51 SRD05008 6 1702-525 PM2 e 0,93 SRD05009 PM3, jun¬ tos 7 1602-207 PM5 0,18 SRD05010 8 NT1 selvagem PM2 0 SRD05011 9 NT1 selvagem PM3 0 SRD05012 10 NT1 selvagem ΡΜ4Ψ 0 SRD050134; 11 NT1 selvagem PM7 0 SRD05014 12 WNV Inativa- Blitvich et 2,72 pg/100 μΙ SRD05015 do al( 3) 13 PBS NA 0 SRD05016 Ψ = amostra omitida devido a insuficiente massa de amostra disponível de-

pois da liofilização. Tabela 6. Amostras de antígeno do Vírus West Nile recombinante formulado para o Estu¬ do I. Grupo Evento Método Concen¬ no. de ID Água Capaci¬ Dose Aprox. de de do tração de do Lote, adicio dade para de proteína trata¬ cultura Pro¬ proteína rótulo do nada Reidratar E por ca- mento, celular cesso E (mg) frasco (ml) mundongo n = 5 (M9) 1 1622- PM7 3,38 SRD05005 Não a 100 207 Mg da dose de¬ sejada 2 1622- PM7 3,38 SRD05005 6,8 Facilmen¬ 50 207 te 3 1622- PM3 0,71 SRD05006 14,2 Insolúvel - 207 4 1622- PM4 0,48 SRD05007 24 Sim 3 210 1622- PM2 0,51 SRD05008 10,2 Sim 5 210 6 1702- PM2 e 0,93 SRD05009 21,6 Sim 4 525 PM3, juntos 7 1602- PM5 0,18 SRD05010 3,6 Sim 5 207 8 NT1 PM2 0 SRD05011 1,02 Sim 0 selva¬ gem 9 NT1 PM3 0 SRD05012 1,22 Sim 0 selva¬ gem 11 NT1 PM7 0 SRD05014 3,38 Sim 0 selva¬ gem 12 WNV Blitvich 2,72 Mg/ SRD05015 Sim 2,72 Inati- et al (3) 100 μΙ vado 13 PBS NA 0 SRD05016 0 Sim 0 Tabela 7. Titulos de neutralização de WNV produzidos a partir de vacina¬ ção com antígeno de WNV produzido por célula de planta, Estudo I. Grupo Camun- Camun- Camun- Camun- Camun- Título de tra¬ dongo n° dongo n° dongo n° dongo n° dongo n° Médio tamento 1 2 3 4 5 2 1280 1920 >2560 1920 >2560 >2560 4 1280 960 640 1280 ND 1040 5 >2560 >2560 1280 1920 80 656 6 120 480 40 <20 240 176 7 480 480 1280 320 1280 768 8 <20 <20 <20 <20 <20 <20 9 <20 <20 <20 <20 <20 <20 11 <20 <20 <20 <20 <20 <20 12 >20480 >20480 >20480 >20480 >20480 >20480 13 <20 <20 <20 <20 <20 <20 Tabela 8. Grupos de tratamento para segundo estudo com camundongo, testando múltiplas doses e múltiplos adjuvantes (CFA, adjuvante completo de Freund; IFA1 adjuvante incompleto de Freund; OW, óleo em água) GRUPO TRATAMENTO DOSE DE ADJUVANTE N0 de A- ANTÍGENO NIMAIS 1 Controle de célu¬ NA Titer-Max 5 la vegetal NT-1 2 Vacina de célula 25 μ CFA IFA 5 de planta (evento 1622-207) 3 Vacina de WNV 25 /vg Titer-Max 10 produzida por célula de planta (evento 1622- 207) 4 Vacina de WNV 5 /vg Titer-Max 10 produzida por célula de planta (evento 1622- 207) 5 Vacina de WNV 0,5/vg Titer-Max 10 produzida por célula de planta (evento 1622- 207) 6 Vacina de WNV 25 ^g Carbopol 10 produzida por célula de planta (evento 1622- 207) 7 Vacina de WNV 5//g Carbopol 10 produzida por célula de planta (evento 1622- 207) Tabela 8. Grupos de tratamento para segundo estudo com camundongo, testando múltiplas doses e múltiplos adjuvantes (CFA, adjuvante completo de Freund; IFA, adjuvante incompleto de Freund; OW, óleo em água) 8 Vacina de WNV 0,5 /yg Carbopol 10 produzida por célula de planta (evento 1622- 207) 9 Vacina de WNV 25 /yg Carbigen 10 produzida por célula de planta (evento 1622- 207) Vacina de WNV 5/vg Carbigen 10 produzida por célula de planta (evento 1622- 207) 11 Vacina de WNV 0,5 /yg Carbigen 10 produzida por célula de planta (evento 1622- 207) 12 Vacina de WNV 25/yg OW 10 produzida por célula de planta (evento 1622- 207) 13 Vacina de WNV 5 /L/g OW 10 produzida por célula de planta (evento 1622- 207) 14 Vacina de WNV 0,5/yg OW 10 produzida por célula de planta (evento 1622- 207) Tabela 8. Grupos de tratamento para segundo estudo com camundongo, testando múltiplas doses e múltiplos adjuvantes (CFA, adjuvante completo de Freund; IFA1 adjuvante incompleto de Freund; OW, óleo em água) Vacina de WNV 25ji/g Polygen 10 produzida por célula de planta (evento 1622- 207) 16 Vacina de WNV 5jug Polygen 10 produzida por célula de planta (evento 1622- 207) 17 Vacina de WNV 0,5/yg Polygen 10 produzida por célula de planta (evento 1622- 207) λ Tabela 9. Fragmentos de SEQ ID NO: 5.

Extensão do Y é qualquer nú¬ Z Fragmento mero inteiro sele¬ (aminoáci- cionado entre, e dos) incluindo: 5 1 e 664 Y+4 6 1 e 663 Y+5 7 1 e 662 Y+6 8 1 e 661 Y+7 9 1 e 660 Y+8 10 1 e 659 Y+9 11 1 e 658 Y+10 12 1 e 657 Y+11 13 1 e 656 Y+12 14 1 e 655 Y+13 15 1 e 654 Y+14 16 1 e 653 Y+15 17 1 e 652 Y+16 18 1 e 651 Y+17 19 1 e 650 Y+18 20 1 e 649 Y+19 21 1 e 648 Y+20 22 1 e 647 Y+21 23 1 e 646 Y+22 24 1 e 645 Y+23 25 1 e 644 Y+24 26 1 e 643 Y+25 27 1 e 642 Y+26 28 1 e 641 Y+27 29 1 e 640 Y+28 30 1 e 639 Y+29 31 1 e 638 Y+30 32 1 e 637 Y+31 33 1 e 636 Y+32 34 1 e 635 Y+33 35 1 e 634 Y+34 36 1 e 633 Y+35 37 1 e 632 Y+36 38 1 e 631 Y+37 39 1 e 630 Y+38 40 1 e 629 Y+39 41 1 e 628 Y+40 42 1 e 627 Y+41 43 1 e 626 Y+42 44 1 e 625 Y+43 45 1 e 624 Y+44 46 1 e 623 v+45 Extensão do Y é qualquer Z Frag-mento número inteiro (aminoáci- selecionado dos) entre, e incluin¬ do: 53 1 e 616 Y+52 54 1 e 615 Y+53 55 1 e 614 Y+54 56 1 e 613 Y+55 57 1 e 612 Y+56 58 1 e 611 Y+57 59 1 e 610 Y+58 60 1 e 609 Y+59 61 1 e 608 Y+60 62 1 e 607 Y+61 63 1 e 606 Y+62 64 1 e 605 Y+63 65 1 e 604 Y+64 66 1 e 603 Y+65 67 1 e 602 Y+66 68 1 e 601 Y+67 69 1 e 600 Y+68 70 1 e 599 Y+69 71 1 e 598 Y+70 72 1 e 597 Y+71 73 1 e 596 Y+72 74 1 e 595 Y+73 75 1 e 594 Y+74 76 1 e 593 Y+75 77 1 e 592 Y+76 78 1 e 591 Y+77 79 1 e 590 Y+78 80 1 e 589 Y+79 81 1 e 588 Y+80 82 1 e 587 Y+81 83 1 e 586 Y+82 84 1 e 585 Y+83 85 1 e 584 Y+84 86 1 e 583 Y+85 87 1 e 582 Y+86 88 1 e 581 Y+87 89 1 e 580 Y+88 90 1 e 579 Y+89 91 1 e 578 Y+90 92 1 e 577 Y+91 93 1 e 576 Y+92 94 1 e 575 Y+93 Tabela 9. Fragmentos

Extensão do Y é qualquer nú¬ Z Fragmento mero inteiro sele¬ (aminoáci- cionado entre, e dos) incluindo: 47 1 e 622 Y+46 48 1 e 621 Y+47 49 1 e 620 Y+48 50 1 e 619 Y+49 51 1 e 618 Y+50 52 1 e 617 Y+51 101 1 e 568 Y+100 102 1 e 567 Y+101 103 1 e 566 Y+102 104 1 e 565 Y+103 105 1 e 564 Y+104 106 1 e 563 Y+105 107 1 e 562 Y+106 108 1 e 561 Y+107 109 1 e 560 Y+108 110 1 e 559 Y+109 111 1 e 558 Y+110 112 1 e 557 Y+111 113 1 e 556 Y+112 114 1 e 555 Y+113 115 1 e 554 Y+114 116 1 e 553 Y+115 117 1 e 552 Y+116 118 1 e 551 Y+117 119 1 e 550 Y+118 120 1 e 549 Y+119 121 1 e 548 Y+120 122 1 e 547 Y+121 123 1 e 546 Y+122 124 1 e 545 Y+123 125 1 e 544 Y+124 126 1 e 543 Y+125 127 1 e 542 Y+126 128 1 e 541 Y+127 129 1 e 540 Y+128 130 1 e 539 Y+129 131 1 e 538 Y+130 132 1 e 537 Y+131 133 1 e 536 Y+132 134 1 e 535 Y+133 135 1 e 534 Y+134 136 1 e 533 Y+135 137 1 e 532 Y+136 de SEQ ID NO: 5.

Extensão do Y é qualquer Z Frag-mento número inteiro (aminoáci- selecionado dos) entre, e incluin¬ do: 95 1 e 574 Y+94 96 1 e 573 Y+95 97 1 e 572 Y+96 98 1 e 571 Y+97 99 1 e 570 Y+98 100 1 e 569 Y+99 149 1 e 520 Y+148 150 1 e 519 Y+149 151 1 e 518 Y+150 152 1 e 517 Y+151 153 1 e 516 Y+152 154 1 e 515 Y+153 155 1 e 514 Y+154 156 1 e 513 Y+155 157 1 e 512 Y+156 158 1 e 511 Y+157 159 1 e 510 Y+158 160 1 e 509 Y+159 161 1 e 508 Y+160 162 1 e 507 Y+161 163 1 e 506 Y+162 164 1 e 505 Y+163 165 1 e 504 Y+164 166 1 e 503 Y+165 167 1 e 502 Y+166 168 1 e 501 Y+167 169 1 e 500 Y+168 170 1 e 499 Y+169 171 1 e 498 Y+170 172 1 e 497 Y+171 173 1 e 496 Y+172 174 1 e 495 Y+173 175 1 e 494 Y+174 176 1 e 493 Y+175 177 1 e 492 Y+176 178 1 e 491 Y+177 179 1 e 490 Y+178 180 1 e 489 Y+179 181 1 e 488 Y+180 182 1 e 487 Y+181 183 1 e 486 Y+182 184 1 e 485 Y+183 185 1 e 484 Y+184 Tabela 9. Fragmentos de SEQ ID NO: 5.

Extensão do Y é qualquer nú¬ Z Extensão do Y é qualquer Z Fragmento mero inteiro sele¬ Frag-mento número inteiro (aminoáci- cionado entre, e (aminoáci- selecionado dos) incluindo: dos) entre, e incluin¬ do: 138 1 e 531 Y+137 186 1 e 483 Y+185 139 1 e 530 Y+138 187 1 e 482 Y+186 140 1 e 529 Y+139 188 1 e 481 Y+187 141 1 e 528 Y+140 189 1 e 480 Y+188 142 1 e 527 Y+141 190 1 e 479 Y+189 143 1 e 526 Y+142 191 1 e 478 Y+190 144 1 e 525 Y+143 192 1 e 477 Y+191 145 1 e 524 Y+144 193 1 e 476 Y+192 146 1 e 523 Y+145 194 1 e 475 Y+193 147 1 e 522 Y+146 195 1 e 474 Y+194 148 1 e 521 Y+147 196 1 e 473 Y+195 197 1 e 472 Y+196 245 1 e 424 Y+244 198 1 e 471 Y+197 246 1 e 423 Y+245 199 1 e 470 Y+198 247 1 e 422 Y+246 200 1 e 469 Y+199 248 1 e 421 Y+247 201 1 e 468 Y+200 249 1 e 420 Y+248 202 1 e 467 Y+201 250 1 e 419 Y+249 203 1 e 466 Y+202 251 1 e 418 Y+250 204 1 e 465 Y+203 252 1 e 417 Y+251 205 1 e 464 Y+204 253 1 e 416 Y+252 206 1 e 463 Y+205 254 1 e 415 Y+253 207 1 e 462 Y+206 255 1 e 414 Y+254 208 1 e 461 Y+207 256 1 e 413 Y+255 209 1 e 460 Y+208 257 1 e 412 Y+256 210 1 e 459 Y+209 258 1 e 411 Y+257 211 1 e 458 Y+210 259 1 e 410 Y+258 212 1 e 457 Y+211 260 1 e 409 Y+259 213 1 e 456 Y+212 261 1 e 408 Y+260 214 1 e 455 Y+213 262 1 e 407 Y+261 215 1 e 454 Y+214 263 1 e 406 Y+262 216 1 e 453 Y+215 264 1 e 405 Y+263 217 1 e 452 Y+216 265 1 e 404 Y+264 218 1 e 451 Y+217 266 1 e 403 Y+265 219 1 e 450 Y+218 267 1 e 402 Y+266 220 1 e 449 Y+219 268 1 e 401 Y+267 221 1 e 448 Y+220 269 1 e 400 Y+268 222 1 e 447 Y+221 270 1 e 399 Y+269 223 1 e 446 Y+222 271 1 e 398 Y+270 224 1 e 445 Y+223 272 1 e 397 Y+271 225 1 e 444 Y+224 273 1 e 396 Y+272 226 1 e 443 Y+225 274 1 e 395 Y+273 227 1 e 442 Y+226 275 1 e 394 Y+274 228 1 e 441 Y+227 276 1 e 393 Y+275 Tabela 9. Fragmentos de SEQ ID NO: 5.

Extensão do Y é qualquer nú¬ Z Extensão do Y é qualquer Z Fragmento mero inteiro sele¬ Frag-mento número inteiro (aminoáci- cionado entre, e (aminoáci- selecionado dos) incluindo: dos) entre, e incluin¬ do: 229 1 e 440 Y+228 277 1 e 392 Y+276 230 1 e 439 Y+229 278 1 e 391 Y+277 231 1 e 438 Y+230 279 1 e 390 Y+278 232 1 e 437 Y+231 280 1 e 389 Y+279 233 1 e 436 Y+232 281 1 e 388 Y+280 234 1 e 435 Y+233 282 1 e 387 Y+281 235 1 e 434 Y+234 283 1 e 386 Y+282 236 1 e 433 Y+235 284 1 e 385 Y+283 237 1 e 432 Y+236 285 1 e 384 Y+284 238 1 e 431 Y+237 286 1 e 383 Y+285 239 1 e 430 Y+238 287 1 e 382 Y+286 240 1 e 429 Y+239 288 1 e 381 Y+287 241 1 e 428 Y+240 289 1 e 380 Y+288 242 1 e 427 Y+241 290 1 e 379 Y+289 243 1 e 426 Y+242 291 1 e 378 Y+290 244 1 e 425 Y+243 292 1 e 377 Y+291 293 1 e 376 Y+292 341 1 e 328 Y+340 294 1 e 375 Y+293 342 1 e 327 Y+341 295 1 e 374 Y+294 343 1 e 326 Y+342 296 1 e 373 Y+295 344 1 e 325 Y+343 297 1 e 372 Y+296 345 1 e 324 Y+344 298 1 e 371 Y+297 346 1 e 323 Y+345 299 1 e 370 Y+298 347 1 e 322 Y+346 300 1 e 369 Y+299 348 1 e 321 Y+347 301 1 e 368 Y+300 349 1 e 320 Y+348 302 1 e 367 Y+301 350 1 e 319 Y+349 303 1 e 366 Y+302 351 1 e 318 Y+350 304 1 e 365 Y+303 352 1 e 317 Y+351 305 1 e 364 Y+304 353 1 e 316 Y+352 306 1 e 363 Y+305 354 1 e 315 Y+353 307 1 e 362 Y+306 355 1 e 314 Y+354 308 1 e 361 Y+307 356 1 e 313 Y+355 309 1 e 360 Y+308 357 1 e 312 Y+356 310 1 e 359 Y+309 358 1 e 311 Y+357 311 1 e 358 Y+310 359 1 e 310 Y+358 312 1 e 357 Y+311 360 1 e 309 Y+359 313 1 e 356 Y+312 361 1 e 308 Y+360 314 1 e 355 Y+313 362 1 e 307 Y+361 315 1 e 354 Y+314 363 1 e 306 Y+362 316 1 e 353 Y+315 364 1 e 305 Y+363 317 1 e 352 Y+316 365 1 e 304 Y+364 318 1 e 351 Y+317 366 1 e 303 Y+365 319 1 e 350 Y+318 I 367 1 e 302 Y+366 Tabela 9. Fragmentos de SEQ ID NO: 5.

Extensão do Y é qualquer Z Frag-mento número inteiro (aminoáci- selecionado dos) entre, e incluin¬ do: 368 1 e 301 Y+367 369 1 e 300 Y+368 370 1 e 299 Y+369 371 1 e 298 Y+370 372 1 e 297 Y+371 373 1 e 296 Y+372 374 1 e 295 Y+373 375 1 e 294 Y+374 376 1 e 293 Y+375 377 1 e 292 Y+376 378 1 e 291 Y+377 379 1 e 290 Y+378 380 1 e 289 Y+379 381 1 e 288 Y+380 382 1 e 287 Y+381 383 1 e 286 Y+382 384 1 e 285 Y+383 385 1 e 284 Y+384 386 1 e 283 Y+385 387 1 e 282 Y+386 388 1 e 281 Y+387 437 1 e 232 Y+436 438 1 e 231 Y+437 439 1 e 230 Y+438 440 1 e 229 Y+439 441 1 e 228 Y+440 442 1 e 227 Y+441 443 1 e 226 Y+442 444 1 e 225 Y+443 445 1 e 224 Y+444 446 1 e 223 Y+445 447 1 e 222 Y+446 448 1 e 221 Y+447 449 1 e 220 Y+448 450 1 e 219 Y+449 451 1 e 218 Y+450 452 1 e 217 Y+451 453 1 e 216 Y+452 454 1 e 215 Y+453 455 1 e 214 Y+454 456 1 e 213 Y+455 457 1 e 212 Y+456 458 1 e 211 Y+457 Extensão do Y é qualquer nú¬ Z Fragmento mero inteiro sele¬ (aminoáci- cionado entre, e dos) incluindo: 320 1 e 349 Y+319 321 1 e 348 Y+320 322 1 e 347 Y+321 323 1 e 346 Y+322 324 1 e 345 Y+323 325 1 e 344 Y+324 326 1 e 343 Y+325 327 1 e 342 Y+326 328 1 e 341 Y+327 329 1 e 340 Y+328 330 1 e 339 Y+329 331 1 e 338 Y+330 332 1 e 337 Y+331 333 1 e 336 Y+332 334 1 e 335 Y+333 335 1 e 334 Y+334 336 1 e 333 Y+335 337 1 e 332 Y+336 338 1 e 331 Y+337 339 1 e 330 Y+338 340 1 e 329 Y+339 389 1 e 280 Y+388 390 1 e 279 Y+389 391 1 e 278 Y+390 392 1 e 277 Y+391 393 1 e 276 Y+392 394 1 e 275 Y+393 395 1 e 274 Y+394 396 1 e 273 Y+395 397 1 e 272 Y+396 398 1 e 271 Y+397 399 1 e 270 Y+398 400 1 e 269 Y+399 401 1 e 268 Y+400 402 1 e 267 Y+401 403 1 e 266 Y+402 404 1 e 265 Y+403 405 1 e 264 Y+404 406 1 e 263 Y+405 407 1 e 262 Y+406 408 1 e 261 Y+407 409 1 e 260 Y+408 410 1 e 259 Y+409 Tabela 9. Fragmentos de SEQ ID NO: 5.

Extensão do Y é qualquer Z Frag-mento número inteiro (aminoáci- selecionado dos) entre, e incluin¬ do: 459 1 e 210 Y+458 460 1 e 209 Y+459 461 1 e 208 Y+460 462 1 e 207 Y+461 463 1 e 206 Y+462 464 1 e 205 Y+463 465 1 e 204 Y+464 466 1 e 203 Y+465 467 1 e 202 Y+466 468 1 e 201 Y+467 469 1 e 200 Y+468 470 1 e 199 Y+469 471 1 e 198 Y+470 472 1 e 197 Y+471 473 1 e 196 Y+472 474 1 e 195 Y+473 475 1 e 194 Y+474 476 1 e 193 Y+475 477 1 e 192 Y+476 478 1 e 191 Y+477 479 1 e 190 Y+478 480 1 e 189 Y+479 481 1 e 188 Y+480 482 1 e 187 Y+481 483 1 e 186 Y+482 484 1 e 185 Y+483 533 1 e 136 Y+532 534 1 e 135 Y+533 535 1 e 134 Y+534 536 1 e 133 Y+535 537 1 e 132 Y+536 538 1 e 131 Y+537 539 1 e 130 Y+538 540 1 e 129 Y+539 541 1 e 128 Y+540 542 1 e 127 Y+541 543 1 e 126 Y+542 544 1 e 125 Y+543 545 1 e 124 Y+544 546 1 e 123 Y+545 547 1 e 122 Y+546 548 1 e 121 Y+547 549 1 e 120 Y+548 Extensão do Y é qualquer nú¬ Z Fragmento mero inteiro sele¬ (aminoáci- cionado entre, e dos) incluindo: 411 1 e 258 Y+410 412 1 e 257 Y+411 413 1 e 256 Y+412 414 1 e 255 Y+413 415 1 e 254 Y+414 416 1 e 253 Y+415 417 1 e 252 Y+416 418 1 e 251 Y+417 419 1 e 250 Y+418 420 1 e 249 Y+419 421 1 e 248 Y+420 422 1 e 247 Y+421 423 1 e 246 Y+422 424 1 e 245 Y+423 425 1 e 244 Y+424 426 1 e 243 Y+425 427 1 e 242 Y+426 428 1 e 241 Y+427 429 1 e 240 Y+428 430 1 e 239 Y+429 431 1 e 238 Y+430 432 1 e 237 Y+431 433 1 e 236 Y+432 434 1 e 235 Y+433 435 1 e 234 Y+434 436 1 e 233 Y+435 485 1 e 184 Y+484 486 1 e 183 Y+485 487 1 e 182 Y+486 488 1 e 181 Y+487 489 1 e 180 Y+488 490 1 e 179 Y+489 491 1 e 178 Y+490 492 1 e 177 Y+491 493 1 e 176 Y+492 494 1 e 175 Y+493 495 1 e 174 Y+494 496 1 e 173 Y+495 497 1 e 172 Y+496 498 1 e 171 Y+497 499 1 e 170 Y+498 500 1 e 169 Y+499 501 1 e 168 Y+500 Tabela 9. Fragmentos de SEQ ID NO: 5.

Extensão do Y é qualquer nú¬ Z Extensão do Y é qualquer Z Fragmento mero inteiro sele¬ Frag-mento número inteiro (aminoáci- cionado entre, e (aminoáci- selecionado dos) incluindo: dos) entre, e incluin¬ do: 502 1 e 167 Y+501 550 1 e 119 Y+549 503 1 e 166 Y+502 551 1 e 118 Y+550 504 1 e 165 Y+503 552 1 e 117 Y+551 505 1 e 164 Y+504 553 1 e 116 Y+552 506 1 e 163 Y+505 554 1 e 115 Y+553 507 1 e 162 Y+506 555 1 e 114 Y+554 508 1 e 161 Y+507 556 1 e 113 Y+555 509 1 e 160 Y+508 557 1 e 112 Y+556 510 1 e 159 Y+509 558 1 e 111 Y+557 511 1 e 158 Y+510 559 1 e 110 Y+558 512 1 e 157 Y+511 560 1 e 109 Y+559 513 1 e 156 Y+512 561 1 e 108 Y+560 514 1 e 155 Y+513 562 1 e 107 Y+561 515 1 e 154 Y+514 563 1 e 106 Y+562 516 1 e 153 Y+515 564 1 e 105 Y+563 517 1 e 152 Y+516 565 1 e 104 Y+564 518 1 e 151 Y+517 566 1 e 103 Y+565 519 1 e 150 Y+518 567 1 e 102 Y+566 520 1 e 149 Y+519 568 1 e 101 Y+567 521 1 e 148 Y+520 569 1 e 100 Y+568 522 1 e 147 Y+521 570 1 e 99 Y+569 523 1 e 146 Y+522 571 1 e 98 Y+570 524 1 e 145 Y+523 572 1 e 97 Y+571 525 1 e 144 Y+524 573 1 e 96 Y+572 526 1 e 143 Y+525 574 1 e 95 Y+573 527 1 e 142 Y+526 575 1 e 94 Y+574 528 1 e 141 Y+527 576 1 e 93 Y+575 529 1 e 140 Y+528 577 1 e 92 Y+576 530 1 e 139 Y+529 578 1 e 91 Y+577 531 1 e 138 Y+530 579 1 e 90 Y+578 532 1 e 137 Y+531 580 1 e 89 Y+579 581 1 e 88 Y+580 629 1 e 40 Y+628 582 1 e 87 Y+581 630 1 e 39 Y+629 583 1 e 86 Y+582 631 1 e 38 Y+630 584 1 e 85 Y+583 632 1 e 37 Y+631 585 1 e 84 Y+584 633 1 e 36 Y+632 586 1 e 83 Y+585 634 1 e 35 Y+633 587 1 e 82 Y+586 635 1 e 34 Y+634 588 1 e 81 Y+587 636 1 e 33 Y+635 589 1 e 80 Y+588 637 1 e 32 Y+636 590 1 e 79 Y+589 638 1 e 31 Y+637 591 1 e 78 Y+590 639 1 e 30 Y+638 592 I 1 e 77 Y+591 640 1 e 29 Y+639 Tabela 9. Fragmentos de SEQ ID NO: 5.

Extensão do Y é qualquer Z Frag-mento número inteiro (aminoáci- selecionado dos) entre, e incluin¬ do: 641 1 e 28 Y+640 642 1 e 27 Y+641 643 1 e 26 Y+642 644 1 e 25 Y+643 645 1 e 24 Y+644 646 1 e 23 Y+645 647 1 e 22 Y+646 648 1 e 21 Y+647 649 1 e 20 Y+648 650 1 e 19 Y+649 651 1 e 18 Y+650 652 1 e 17 Y+651 653 1 e 16 Y+652 654 1 e 15 Y+653 655 1 e 14 Y+654 656 1 e 13 Y+655 657 1 e 12 Y+656 658 1 e 11 Y+657 659 1 e 10 Y+658 660 1 e 9 Y+659 661 1 e 8 Y+660 662 1 e 7 Y+661 663 1 e 6 Y+662 664 1 e 5 Y+663 665 1 e 4 Y+664 666 1 e 3 Y+665 667 1 e 2 Y+666 Extensão do Y é qualquer nú¬ Z Fragmento mero inteiro sele¬ (aminoáci- cionado entre, e dos) incluindo: 593 1 e 76 Y+592 594 1 e 75 Y+593 595 1 e 74 Y+594 596 1 e 73 Y+595 597 1 e 72 Y+596 598 1 e 71 Y+597 599 1 e 70 Y+598 600 1 e 69 Y+599 601 1 e 68 Y+600 602 1 e 67 Y+601 603 1 e 66 Y+602 604 1 e 65 Y+603 605 1 e 64 Y+604 606 1 e 63 Y+605 607 1 e 62 Y+606 608 1 e 61 Y+607 609 1 e 60 Y+608 610 1 e 59 Y+609 611 1 e 58 Y+610 612 1 e 57 Y+611 613 1 e 56 Y+612 614 1 e 55 Y+613 615 1 e 54 Y+614 616 1 e 53 Y+615 617 1 e 52 Y+616 618 1 e 51 Y+617 619 1 e 50 Y+618 620 1 e 49 Y+619 621 1 e 48 Y+620 622 1 e 47 Y+621 623 1 e 46 Y+622 624 1 e 45 Y+623 625 1 e 44 Y+624 626 1 e 43 Y+625 627 1 e 42 Y+626 628 1 e 41 Y+627 Tabela 10. Fragmentos de SEQ ID NOs: 9 e 11. Extensão Y é qualquer número Z Extensão do Y é qualquer Z do Frag¬ inteiro selecionado Fragmento número inteiro mento entre, e incluindo: (aminoácidos) selecionado (aminoá- entre, e incluin¬ cidos) do: 5 1 e 690 Y+4 53 1 e 642 Y+52 6 1 e 689 Y+5 54 1 e 641 Y+53 7 1 e 688 Y+6 55 1 e 640 Y+54 8 1 e 687 Y+7 56 1 e 639 Y+55 9 1 e 686 Y+8 57 1 e 638 Y+56 10 1 e 685 Y+9 58 1 e 637 Y+57 11 1 e 684 Y+10 59 1 e 636 Y+58 12 1 e 683 Y+11 60 1 e 635 Y+59 13 1 e 682 Y+12 61 1 e 634 Y+60 14 1 e 681 Y+13 62 1 e 633 Y+61 1 e 680 Y+14 63 1 e 632 Y+62 16 1 e 679 Y+15 64 1 e 631 Y+63 17 1 e 678 Y+16 65 1 e 630 Y+64 18 1 e 677 Y+17 66 1 e 629 Y+65 19 1 e 676 Y+18 67 1 e 628 Y+66 1 e 675 Y+19 68 1 e 627 Y+67 21 1 e 674 Y+20 69 1 e 626 Y+68 22 1 e 673 Y+21 70 1 e 625 Y+69 23 1 e 672 Y+22 71 1 e 624 Y+70 24 1 e 671 Y+23 72 1 e 623 Y+71 1 e 670 Y+24 73 1 e 622 Y+72 26 1 e 669 Y+25 74 1 e 621 Y+73 27 1 e 668 Y+26 75 1 e 620 Y+74 28 1 e 667 Y+27 76 1 e 619 Y+75 29 1 e 666 Y+28 77 1 e 618 Y+76 1 e 665 Y+29 78 1 e 617 Y+77 31 1 e 664 Y+30 79 1 e 616 Y+78 32 1 e 663 Y+31 80 1 e 615 Y+79 33 1 e 662 Y+32 81 1 e 614 Y+80 34 1 e 661 Y+33 82 1 e 613 Y+81 1 e 660 Y+34 83 1 e 612 Y+82 36 1 e 659 Y+35 84 1 e 611 Y+83 37 1 e 658 Y+36 85 1 e 610 Y+84 38 1 e 657 Y+37 86 1 e 609 Y+85 39 1 e 656 Y+38 87 1 e 608 Y+86 Tabela 10. Fragmentos de SEQ ID NOs: 9 e 11. Extensão Y é qualquer número Z Extensão do Y é qualquer Z do Frag¬ inteiro selecionado Fragmento número inteiro mento entre, e incluindo: (aminoácidos) selecionado (aminoá- entre, e incluin¬ cidos) do: 40 1 e 655 Y+39 88 1 e 607 Y+87 41 1 e 654 Y+40 89 1 e 606 Y+88 42 1 e 653 Y+41 90 1 e 605 Y+89 43 1 e 652 Y+42 91 1 e 604 Y+90 44 1 e 651 Y+43 92 1 e 603 Y+91 45 1 e 650 Y+44 93 1 e 602 Y+92 46 1 e 649 Y+45 94 1 e 601 Y+93 47 1 e 648 Y+46 95 1 e 600 Y+94 48 1 e 647 Y+47 96 1 e 599 Y+95 49 1 e 646 Y+48 97 1 e 598 Y+96 50 1 e 645 Y+49 98 1 e 597 Y+97 51 1 e 644 Y+50 99 1 e 596 Y+98 52 1 e 643 Y+51 100 1 e 595 Y+99 101 1 e 594 Y+100 149 1 e 546 Y+148 102 1 e 593 Y+101 150 1 e 545 Y+149 103 1 e 592 Y+102 151 1 e 544 Y+150 104 1 e 591 Y+103 152 1 e 543 Y+151 105 1 e 590 Y+104 153 1 e 542 Y+152 106 1 e 589 Y+105 154 1 e 541 Y+153 107 1 e 588 Y+106 155 1 e 540 Y+154 108 1 e 587 Y+107 156 1 e 539 Y+155 109 1 e 586 Y+108 157 1 e 538 Y+156 110 1 e 585 Y+109 158 1 e 537 Y+157 111 1 e 584 Y+110 159 1 e 536 Y+158 112 1 e 583 Y+111 160 1 e 535 Y+159 113 1 e 582 Y+112 161 1 e 534 Y+160 114 1 e 581 Y+113 162 1 e 533 Y+161 115 1 e 580 Y+114 163 1 e 532 Y+162 116 1 e 579 Y+115 164 1 e 531 Y+163 117 1 e 578 Y+116 165 1 e 530 Y+164 118 1 e 577 Y+117 166 1 e 529 Y+165 119 1 e 576 Y+118 167 1 e 528 Y+166 120 1 e 575 Y+119 168 1 e 527 Y+167 121 1 e 574 Y+120 169 1 e 526 Y+168 122 1 e 573 Y+121 170 1 e 525 Y+169 123 1 e 572 Y+122 I 171 1 e 524 Y+170 I I Tabela 10. Fragmentos de SEQ ID NOs: 9 e 11. Extensão Y é qualquer número Z Extensão do Y é qualquer Z do Frag¬ inteiro selecionado Fragmento número inteiro mento entre, e incluindo: (aminoácidos) selecionado (aminoá- entre, e incluin¬ cidos) do: 124 1 e 571 Y+123 172 1 e 523 Y+171 125 1 e 570 Y+124 173 1 e 522 Y+172 126 1 e 569 Y+125 174 1 e 521 Y+173 127 1 e 568 Y+126 175 1 e 520 Y+174 128 1 e 567 Y+127 176 1 e 519 Y+175 129 1 e 566 Y+128 177 1 e 518 Y+176 130 1 e 565 Y+129 178 1 e 517 Y+177 131 1 e 564 Y+130 179 1 e 516 Y+178 132 1 e 563 Y+131 180 1 e 515 Y+179 133 1 e 562 Y+132 181 1 e 514 Y+180 134 1 e 561 Y+133 182 1 e 513 Y+181 135 1 e 560 Y+134 183 1 e 512 Y+182 136 1 e 559 Y+135 184 1 e 511 Y+183 137 1 e 558 Y+136 185 1 e 510 Y+184 138 1 e 557 Y+137 186 1 e 509 Y+185 139 1 e 556 Y+138 187 1 e 508 Y+186 140 1 e 555 Y+139 188 1 e 507 Y+187 141 1 e 554 Y+140 189 1 e 506 Y+188 142 1 e 553 Y+141 190 1 e 505 Y+189 143 1 e 552 Y+142 191 1 e 504 Y+190 144 1 e 551 Y+143 192 1 e 503 Y+191 145 1 e 550 Y+144 193 1 e 502 Y+192 146 1 e 549 Y+145 194 1 e 501 Y+193 147 1 e 548 Y+146 195 1 e 500 Y+194 148 1 e 547 Y+147 196 1 e 499 Y+195 197 1 e 498 Y+196 245 1 e 450 Y+244 198 1 e 497 Y+197 246 1 e 449 Y+245 199 1 e 496 Y+198 247 1 e 448 Y+246 200 1 e 495 Y+199 248 1 e 447 Y+247 201 1 e 494 Y+200 249 1 e 446 Y+248 202 1 e 493 Y+201 250 1 e 445 Y+249 203 1 e 492 Y+202 251 1 e 444 Y+250 204 1 e 491 Y+203 252 1 e 443 Y+251 205 1 e 490 Y+204 253 1 e 442 Y+252 206 1 e 489 Y+205 254 1 e 441 Y+253 207 1 e 488 Y+206 I 255 1 e 440 Y+254 Tabela 10. Fragmentos de SEQ ID NOs: 9 e 11. Extensão Y é qualquer número Z Extensão do Y é qualquer Z do Frag¬ inteiro selecionado Fragmento número inteiro mento entre, e incluindo: (aminoácidos) selecionado (aminoá- entre, e incluin¬ cidos) do: 208 1 e 487 Y+207 256 1 e 439 Y+255 209 1 e 486 Y+208 257 1 e 438 Y+256 210 1 e 485 Y+209 258 1 e 437 Y+257 211 1 e 484 Y+210 259 1 e 436 Y+258 212 1 e 483 Y+211 260 1 e 435 Y+259 213 1 e 482 Y+212 261 1 e 434 Y+260 214 1 e 481 Y+213 262 1 e 433 Y+261 215 1 e 480 Y+214 263 1 e 432 Y+262 216 1 e 479 Y+215 264 1 e 431 Y+263 217 1 e 478 Y+216 265 1 e 430 Y+264 218 1 e 477 Y+217 266 1 e 429 Y+265 219 1 e 476 Y+218 267 1 e 428 Y+266 220 1 e 475 Y+219 268 1 e 427 Y+267 221 1 e 474 Y+220 269 1 e 426 Y+268 222 1 e 473 Y+221 270 1 e 425 Y+269 223 1 e 472 Y+222 271 1 e 424 Y+270 224 1 e 471 Y+223 272 1 e 423 Y+271 225 1 e 470 Y+224 273 1 e 422 Y+272 226 1 e 469 Y+225 274 1 e 421 Y+273 227 1 e 468 Y+226 275 1 e 420 Y+274 228 1 e 467 Y+227 276 1 e 419 Y+275 229 1 e 466 Y+228 277 1 e 418 Y+276 230 1 e 465 Y+229 278 1 e 417 Y+277 231 1 e 464 Y+230 279 1 e 416 Y+278 232 1 e 463 Y+231 280 1 e 415 Y+279 233 1 e 462 Y+232 281 1 e 414 Y+280 234 1 e 461 Y+233 282 1 e 413 Y+281 235 1 e 460 Y+234 283 1 e 412 Y+282 236 1 e 459 Y+235 284 1 e 411 Y+283 237 1 e 458 Y+236 285 1 e 410 Y+284 238 1 e 457 Y+237 286 1 e 409 Y+285 239 1 e 456 Y+238 287 1 e 408 Y+286 240 1 e 455 Y+239 288 1 e 407 Y+287 241 1 e 454 Y+240 289 1 e 406 Y+288 242 1 e 453 Y+241 290 1 e 405 Y+289 243 1 e 452 Y+242 291 1 e 404 Y+290 Tabela 10. Fragmentos de SEQ ID NOs: 9 e 11. Extensão Y é qualquer número Z Extensão do Y é qualquer Z do Frag¬ inteiro selecionado Fragmento número inteiro mento entre, e incluindo: (aminoácidos) selecionado (aminoá- entre, e incluin¬ cidos) do: 244 1 e 451 Y+243 292 1 e 403 Y+291 293 1 e 402 Y+292 341 1 e 354 Y+340 294 1 e 401 Y+293 342 1 e 353 Y+341 295 1 e 400 Y+294 343 1 e 352 Y+342 296 1 e 399 Y+295 344 1 e 351 Y+343 297 1 e 398 Y+296 345 1 e 350 Y+344 298 1 e 397 Y+297 346 1 e 349 Y+345 299 1 e 396 Y+298 347 1 e 348 Y+346 300 1 e 395 Y+299 348 1 e 347 Y+347 301 1 e 394 Y+300 349 1 e 346 Y+348 302 1 e 393 Y+301 350 1 e 345 Y+349 303 1 e 392 Y+302 351 1 e 344 Y+350 304 1 e 391 Y+303 352 1 e 343 Y+351 305 1 e 390 Y+304 353 1 e 342 Y+352 306 1 e 389 Y+305 354 1 e 341 Y+353 307 1 e 388 Y+306 355 1 e 340 Y+354 308 1 e 387 Y+307 356 1 e 339 Y+355 309 1 e 386 Y+308 357 1 e 338 Y+356 310 1 e 385 Y+309 358 1 e 337 Y+357 311 1 e 384 Y+310 359 1 e 336 Y+358 312 1 e 383 Y+311 360 1 e 335 Y+359 313 1 e 382 Y+312 361 1 e 334 Y+360 314 1 e 381 Y+313 362 1 e 333 Y+361 315 1 e 380 Y+314 363 1 e 332 Y+362 316 1 e 379 Y+315 364 1 e 331 Y+363 317 1 e 378 Y+316 365 1 e 330 Y+364 318 1 e 377 Y+317 366 1 e 329 Y+365 319 1 e 376 Y+318 367 1 e 328 Y+366 320 1 e 375 Y+319 368 1 e 327 Y+367 321 1 e 374 Y+320 369 1 e 326 Y+368 322 1 e 373 Y+321 370 1 e 325 Y+369 323 1 e 372 Y+322 371 1 e 324 Y+370 324 1 e 371 Y+323 372 1 e 323 Y+371 325 1 e 370 Y+324 373 1 e 322 Y+372 326 1 e 369 Y+325 374 1 e 321 Y+373 327 1 e 368 Y+326 375 1 e 320 Y+374 Tabela 10. Fragmentos de SEQ ID NOs: 9 e 11. Extensão Y é qualquer número Z Extensão do Y é qualquer Z do Frag¬ inteiro selecionado Fragmento número inteiro mento entre, e incluindo: (aminoácidos) selecionado (aminoá- entre, e incluin¬ cidos) do: 328 1 e 367 Y+327 376 1 e 319 Y+375 329 1 e 366 Y+328 377 1 e 318 Y+376 330 1 e 365 Y+329 378 1 e 317 Y+377 331 1 e 364 Y+330 379 1 e 316 Y+378 332 1 e 363 Y+331 380 1 e 315 Y+379 333 1 e 362 Y+332 381 1 e 314 Y+380 334 1 e 361 Y+333 382 1 e 313 Y+381 335 1 e 360 Y+334 383 1 e 312 Y+382 336 1 e 359 Y+335 384 1 e 311 Y+383 337 1 e 358 Y+336 385 1 e 310 Y+384 338 1 e 357 Y+337 386 1 e 309 Y+385 339 1 e 356 Y+338 387 1 e 308 Y+386 340 1 e 355 Y+339 388 1 e 307 Y+387 389 1 e 306 Y+388 437 1 e 258 Y+436 390 1 e 305 Y+389 438 1 e 257 Y+437 391 1 e 304 Y+390 439 1 e 256 Y+438 392 1 e 303 Y+391 440 1 e 255 Y+439 393 1 e 302 Y+392 441 1 e 254 Y+440 394 1 e 301 Y+393 442 1 e 253 Y+441 395 1 e 300 Y+394 443 1 e 252 Y+442 396 1 e 299 Y+395 444 1 e 251 Y+443 397 1 e 298 Y+396 445 1 e 250 Y+444 398 1 e 297 Y+397 446 1 e 249 Y+445 399 1 e 296 Y+398 447 1 e 248 Y+446 400 1 e 295 Y+399 448 1 e 247 Y+447 401 1 e 294 Y+400 449 1 e 246 Y+448 402 1 e 293 Y+401 450 1 e 245 Y+449 403 1 e 292 Y+402 451 1 e 244 Y+450 404 1 e 291 Y+403 452 1 e 243 Y+451 405 1 e 290 Y+404 453 1 e 242 Y+452 406 1 e 289 Y+405 454 1 e 241 Y+453 407 1 e 288 Y+406 455 1 e 240 Y+454 408 1 e 287 Y+407 456 1 e 239 Y+455 409 1 e 286 Y+408 457 1 e 238 Y+456 410 1 e 285 Y+409 458 1 e 237 Y+457 411 1 e 284 Y+410 459 1 e 236 Y+458 Tabela 10. Fragmentos de SEQ ID NOs: 9 e 11. Extensão Y é qualquer número Z Extensão do Y é qualquer Z do Frag¬ inteiro selecionado Fragmento número inteiro mento entre, e incluindo: (aminoácidos) selecionado (aminoá- entre, e incluin¬ cidos) do: 412 1 e 283 Y+411 460 1 e 235 Y+459 413 1 e 282 Y+412 461 1 e 234 Y+460 414 1 e 281 Y+413 462 1 e 233 Y+461 415 1 e 280 Y+414 463 1 e 232 Y+462 416 1 e 279 Y+415 464 1 e 231 Y+463 417 1 e 278 Y+416 465 1 e 230 Y+464 418 1 e 277 Y+417 466 1 e 229 Y+465 419 1 e 276 Y+418 467 1 e 228 Y+466 420 1 e 275 Y+419 468 1 e 227 Y+467 421 1 e 274 Y+420 469 1 e 226 Y+468 422 1 e 273 Y+421 470 1 e 225 Y+469 423 1 e 272 Y+422 471 1 e 224 Y+470 424 1 e 271 Y+423 472 1 e 223 Y+471 425 1 e 270 Y+424 473 1 e 222 Y+472 426 1 e 269 Y+425 474 1 e 221 Y+473 427 1 e 268 Y+426 475 1 e 220 Y+474 428 1 e 267 Y+427 476 1 e 219 Y+475 429 1 e 266 Y+428 477 1 e 218 Y+476 430 1 e 265 Y+429 478 1 e 217 Y+477 431 1 e 264 Y+430 479 1 e 216 Y+478 432 1 e 263 Y+431 480 1 e 215 Y+479 433 1 e 262 Y+432 481 1 e 214 Y+480 434 1 e 261 Y+433 482 1 e 213 Y+481 435 1 e 260 Y+434 483 1 e 212 Y+482 436 1 e 259 Y+435 484 1 e 211 Y+483 485 1 e 210 Y+484 533 1 e 162 Y+532 486 1 e 209 Y+485 534 1 e 161 Y+533 487 1 e 208 Y+486 535 1 e 160 Y+534 488 1 e 207 Y+487 536 1 e 159 Y+535 489 1 e 206 Y+488 537 1 e 158 Y+536 490 1 e 205 Y+489 538 1 e 157 Y+537 491 1 e 204 Y+490 539 1 e 156 Y+538 492 1 e 203 Y+491 540 1 e 155 Y+539 493 1 e 202 Y+492 541 1 e 154 Y+540 494 1 e 201 Y+493 542 1 e 153 Y+541 495 1 e 200 Y+494 543 1 e 152 Y+542 Tabela 10. Fragmentos de SEQ ID NOs: 9 e 11. Extensão Y é qualquer número Z Extensão do Y é qualquer Z do Frag¬ inteiro selecionado Fragmento número inteiro mento entre, e incluindo: (aminoácidos) selecionado (aminoá- entre, e incluin¬ cidos) do: 496 1 e 199 Y+495 544 1 e 151 Y+543 497 1 e 198 Y+496 545 1 e 150 Y+544 498 1 e 197 Y+497 546 1 e 149 Y+545 499 1 e 196 Y+498 547 1 e 148 Y+546 500 1 e 195 Y+499 548 1 e 147 Y+547 501 1 e 194 Y+500 549 1 e 146 Y+548 502 1 e 193 Y+501 550 1 e 145 Y+549 503 1 e 192 Y+502 551 1 e 144 Y+550 504 1 e 191 Y+503 552 1 e 143 Y+551 505 1 e 190 Y+504 553 1 e 142 Y+552 506 1 e 189 Y+505 554 1 e 141 Y+553 507 1 e 188 Y+506 555 1 e 140 Y+554 508 1 e 187 Y+507 556 1 e 139 Y+555 509 1 e 186 Y+508 557 1 e 138 Y+556 510 1 e 185 Y+509 558 1 e 137 Y+557 511 1 e 184 Y+510 559 1 e 136 Y+558 512 1 e 183 Y+511 560 1 e 135 Y+559 513 1 e 182 Y+512 561 1 e 134 Y+560 514 1 e 181 Y+513 562 1 e 133 Y+561 515 1 e 180 Y+514 563 1 e 132 Y+562 516 1 e 179 Y+515 564 1 e 131 Y+563 517 1 e 178 Y+516 565 1 e 130 Y+564 518 1 e 177 Y+517 566 1 e 129 Y+565 519 1 e 176 Y+518 567 1 e 128 Y+566 520 1 e 175 Y+519 568 1 e 127 Y+567 521 1 e 174 Y+520 569 1 e 126 Y+568 522 1 e 173 Y+521 570 1 e 125 Y+569 523 1 e 172 Y+522 571 1 e 124 Y+570 524 1 e 171 Y+523 572 1 e 123 Y+571 525 1 e 170 Y+524 573 1 e 122 Y+572 526 1 e 169 Y+525 574 1 e 121 Y+573 527 1 e 168 Y+526 575 1 e 120 Y+574 528 1 e 167 Y+527 576 1 e 119 Y+575 529 1 e 166 Y+528 577 1 e 118 Y+576 530 1 e 165 Y+529 578 1 e 117 Y+577 531 1 e 164 Y+530 579 1 e 116 Y+578 Tabela 10. Fragmentos de SEQ ID NOs: 9 e 11. Extensão Y é qualquer número Z Extensão do Y é qualquer Z do Frag¬ inteiro selecionado Fragmento número inteiro mento entre, e incluindo: (aminoácidos) selecionado (aminoá- entre, e incluin¬ cidos) do: 532 1 e 163 Y+531 580 1 e 115 Y+579 581 1 e 114 Y+580 629 1 e 66 Y+628 582 1 e 113 Y+581 630 1 e 65 Y+629 583 1 e 112 Y+582 631 1 e 64 Y+630 584 1 e 111 Y+583 632 1 e 63 Y+631 585 1 e 110 Y+584 633 1 e 62 Y+632 586 1 e 109 Y+585 634 1 e 61 Y+633 587 1 e 108 Y+586 635 1 e 60 Y+634 588 1 e 107 Y+587 636 1 e 59 Y+635 589 1 e 106 Y+588 637 1 e 58 Y+636 590 1 e 105 Y+589 638 1 e 57 Y+637 591 1 e 104 Y+590 639 1 e 56 Y+638 592 1 e 103 Y+591 640 1 e 55 Y+639 593 1 e 102 Y+592 641 1 e 54 Y+640 594 1 e 101 Y+593 642 1 e 53 Y+641 595 1 e 100 Y+594 643 1 e 52 Y+642 596 1 e 99 Y+595 644 1 e 51 Y+643 597 1 e 98 Y+596 645 1 e 50 Y+644 598 1 e 97 Y+597 646 1 e 49 Y+645 599 1 e 96 Y+598 647 1 e 48 Y+646 600 1 e 95 Y+599 648 1 e 47 Y+647 601 1 e 94 Y+600 649 1 e 46 Y+648 602 1 e 93 Y+601 650 1 e 45 Y+649 603 1 e 92 Y+602 651 1 e 44 Y+650 604 1 e 91 Y+603 652 1 e 43 Y+651 605 1 e 90 Y+604 653 1 e 42 Y+652 606 1 e 89 Y+605 654 1 e 41 Y+653 607 1 e 88 Y+606 655 1 e 40 Y+654 608 1 e 87 Y+607 656 1 e 39 Y+655 609 1 e 86 Y+608 657 1 e 38 Y+656 610 1 e 85 Y+609 658 1 e 37 Y+657 611 1 e 84 Y+610 659 1 e 36 Y+658 612 1 e 83 Y+611 660 1 e 35 Y+659 613 1 e 82 Y+612 661 1 e 34 Y+660 614 1 e 81 Y+613 662 1 e 33 Y+661 615 1 e 80 Y+614 663 1 e 32 Y+662 Tabela 10. Fragmentos de SEQ ID NOs: 9 e 11. Extensão Y é qualquer número Z Extensão do Y é qualquer Z do Frag¬ inteiro selecionado Fragmento número inteiro mento entre, e incluindo: (aminoácidos) selecionado (aminoá- entre, e incluin¬ cidos) do: 616 1 e 79 Y+615 664 1 e 31 Y+663 617 1 e 78 Y+616 665 1 e 30 Y+664 618 1 e 77 Y+617 666 1 e 29 Y+665 619 1 e 76 Y+618 667 1 e 28 Y+666 620 1 e 75 Y+619 668 1 e 27 Y+667 621 1 e 74 Y+620 669 1 e 26 Y+668 622 1 e 73 Y+621 670 1 e 25 Y+669 623 1 e 72 Y+622 671 1 e 24 Y+670 624 1 e 71 Y+623 672 1 e 23 Y+671 625 1 e 70 Y+624 673 1 e 22 Y+672 626 1 e 69 Y+625 674 1 e 21 Y+673 627 1 e 68 Y+626 675 1 e 20 Y+674 628 1 e 67 Y+627 676 1 e 19 Y+675 677 1 e 18 Y+676 678 1 e 17 Y+677 679 1 e 16 Y+678 680 1 e 15 Y+679 681 1 e 14 Y+680 682 1 e 13 Y+681 683 1 e 12 Y+682 684 1 e 11 Y+683 685 1 e 10 Y+684 686 1 e 9 Y+685 687 1 e 8 Y+686 688 1 e 7 Y+687 689 1 e 6 Y+688 690 1 e 5 Y+689 691 1 e 4 Y+690 692 1 e 3 Y+691 693 1 e 2 Y+692 Tabela 11. Fragmentos de SEQ ID NO: 13.

Exten¬ Y é qualquer nú¬ Z são do mero inteiro sele¬ Frag¬ cionado entre, e mento incluindo: (amino- ácidos) 1 e 598 Y+4 6 1 e 597 Y+5 7 1 e 596 Y+6 8 1 e 595 Y+7 9 1 e 594 Y+8 1 e 593 Y+9 11 1 e 592 Y+10 12 1 e 591 Y+11 13 1 e 590 Y+12 14 1 e 589 Y+13 1 e 588 Y+14 16 1 e 587 Y+15 17 1 e 586 Y+16 18 1 e 585 Y+17 19 1 e 584 Y+18 1 e 583 Y+19 21 1 e 582 Y+20 22 1 e 581 Y+21 23 1 e 580 Y+22 24 1 e 579 Y+23 1 e 578 Y+24 26 1 e 577 Y+25 27 1 e 576 Y+26 28 1 e 575 Y+27 29 1 e 574 Y+28 1 e 573 Y+29 31 1 e 572 Y+30 32 1 e 571 Y+31 33 1 e 570 Y+32 34 1 e 569 Y+33 1 e 568 Y+34 36 1 e 567 Y+35 37 1 e 566 Y+36 38 1 e 565 Y+37 39 1 e 564 Y+38 Extensão do Y é qualquer Z Fragmento número inteiro (aminoáci- selecionado dos) entre, e incluin¬ do: 53 1 e 550 Y+52 54 1 e 549 Y+53 55 1 e 548 Y+54 56 1 e 547 Y+55 57 1 e 546 Y+56 58 1 e 545 Y+57 59 1 e 544 Y+58 60 1 e 543 Y+59 61 1 e 542 Y+60 62 1 e 541 Y+61 63 1 e 540 Y+62 64 1 e 539 Y+63 65 1 e 538 Y+64 66 1 e 537 Y+65 67 1 e 536 Y+66 68 1 e 535 Y+67 69 1 e 534 Y+68 70 1 e 533 Y+69 71 1 e 532 Y+70 72 1 e 531 Y+71 73 1 e 530 Y+72 74 1 e 529 Y+73 75 1 e 528 Y+74 76 1 e 527 Y+75 77 1 e 526 Y+76 78 1 e 525 Y+77 79 1 e 524 Y+78 80 1 e 523 Y+79 81 1 e 522 Y+80 82 1 e 521 Y+81 83 1 e 520 Y+82 84 1 e 519 Y+83 85 1 e 518 Y+84 86 1 e 517 Y+85 87 1 e 516 Y+86 Tabela 11. Fragmentos de SEQ ID NO: 13.

Exten¬ Y é qualquer nú¬ Z são do mero inteiro sele¬ Frag¬ cionado entre, e mento incluindo: (amino- ácidos) 40 1 e 563 Y+39 41 1 e 562 Y+40 42 1 e 561 Y+41 43 1 e 560 Y+42 44 1 e 559 Y+43 45 1 e 558 Y+44 46 1 e 557 Y+45 47 1 e 556 Y+46 48 1 e 555 Y+47 49 1 e 554 Y+48 50 1 e 553 Y+49 51 1 e 552 Y+50 52 1 e 551 Y+51 101 1 e 502 Y+100 102 1 e 501 Y+101 103 1 e 500 Y+102 104 1 e 499 Y+103 105 1 e 498 Y+104 106 1 e 497 Y+105 107 1 e 496 Y+106 108 1 e 495 Y+107 109 1 e 494 Y+108 110 1 e 493 Y+109 111 1 e 492 Y+110 112 1 e 491 Y+111 113 1 e 490 Y+112 114 1 e 489 Y+113 115 1 e 488 Y+114 116 1 e 487 Y+115 117 1 e 486 Y+116 118 1 e 485 Y+117 119 1 e 484 Y+118 120 1 e 483 Y+119 121 1 e 482 Y+120 122 1 e 481 Y+121 Extensão do Y é qualquer Z Fragmento número inteiro (aminoáci- selecionado dos) entre, e incluin¬ do: 88 1 e 515 Y+87 89 1 e 514 Y+88 90 1 e 513 Y+89 91 1 e 512 Y+90 92 1 e 511 Y+91 93 1 e 510 Y+92 94 1 e 509 Y+93 95 1 e 508 Y+94 96 1 e 507 Y+95 97 1 e 506 Y+96 98 1 e 505 Y+97 99 1 e 504 Y+98 100 1 e 503 Y+99 149 1 e 454 Y+148 150 1 e 453 Y+149 151 1 e 452 Y+150 152 1 e 451 Y+151 153 1 e 450 Y+152 154 1 e 449 Y+153 155 1 e 448 Y+154 156 1 e 447 Y+155 157 1 e 446 Y+156 158 1 e 445 Y+157 159 1 e 444 Y+158 160 1 e 443 Y+159 161 1 e 442 Y+160 162 1 e 441 Y+161 163 1 e 440 Y+162 164 1 e 439 Y+163 165 1 e 438 Y+164 166 1 e 437 Y+165 167 1 e 436 Y+166 168 1 e 435 Y+167 169 1 e 434 Y+168 170 1 e 433 Y+169 Tabela 11. Fragmentos de SEQ ID NO: 13.

Exten¬ Y é qualquer nú¬ Z são do mero inteiro sele¬ Frag¬ cionado entre, e mento incluindo: (amino- ácidos) 123 1 e 480 Y+122 124 1 e 479 Y+123 125 1 e 478 Y+124 126 1 e 477 Y+125 127 1 e 476 Y+126 128 1 e 475 Y+127 129 1 e 474 Y+128 130 1 e 473 Y+129 131 1 e 472 Y+130 132 1 e 471 Y+131 133 1 e 470 Y+132 134 1 e 469 Y+133 135 1 e 468 Y+134 136 1 e 467 Y+135 137 1 e 466 Y+136 138 1 e 465 Y+137 139 1 e 464 Y+138 140 1 e 463 Y+139 141 1 e 462 Y+140 142 1 e 461 Y+141 143 1 e 460 Y+142 144 1 e 459 Y+143 145 1 e 458 Y+144 146 1 e 457 Y+145 147 1 e 456 Y+146 148 1 e 455 Y+147 197 1 e 406 Y+196 198 1 e 405 Y+197 199 1 e 404 Y+198 200 1 e 403 Y+199 201 1 e 402 Y+200 202 1 e 401 Y+201 203 1 e 400 Y+202 204 1 e 399 Y+203 205 1 e 398 Y+204 Extensão do Y é qualquer Z Fragmento número inteiro (aminoáci- selecionado dos) entre, e incluin¬ do: 171 1 e 432 Y+170 172 1 e 431 Y+171 173 1 e 430 Y+172 174 1 e 429 Y+173 175 1 e 428 Y+174 176 1 e 427 Y+175 177 1 e 426 Y+176 178 1 e 425 Y+177 179 1 e 424 Y+178 180 1 e 423 Y+179 181 1 e 422 Y+180 182 1 e 421 Y+181 183 1 e 420 Y+182 184 1 e 419 Y+183 185 1 e 418 Y+184 186 1 e 417 Y+185 187 1 e 416 Y+186 188 1 e 415 Y+187 189 1 e 414 Y+188 190 1 e 413 Y+189 191 1 e 412 Y+190 192 1 e 411 Y+191 193 1 e 410 Y+192 194 1 e 409 Y+193 195 1 e 408 Y+194 196 1 e 407 Y+195 245 1 e 358 Y+244 246 1 e 357 Y+245 247 1 e 356 Y+246 248 1 e 355 Y+247 249 1 e 354 Y+248 250 1 e 353 Y+249 251 1 e 352 Y+250 252 1 e 351 Y+251 253 1 e 350 Y+252 Tabela 11. Fragmentos de SEQ ID NO: 13.

Exten¬ Y é qualquer nú¬ Z são do mero inteiro sele¬ Frag¬ cionado entre, e mento incluindo: (amino- ácidos) 206 1 e 397 Y+205 207 1 e 396 Y+206 208 1 e 395 Y+207 209 1 e 394 Y+208 210 1 e 393 Y+209 211 1 e 392 Y+210 212 1 e 391 Y+211 213 1 e 390 Y+212 214 1 e 389 Y+213 215 1 e 388 Y+214 216 1 e 387 Y+215 217 1 e 386 Y+216 218 1 e 385 Y+217 219 1 e 384 Y+218 220 1 e 383 Y+219 221 1 e 382 Y+220 222 1 e 381 Y+221 223 1 e 380 Y+222 224 1 e 379 Y+223 225 1 e 378 Y+224 226 1 e 377 Y+225 227 1 e 376 Y+226 228 1 e 375 Y+227 229 1 e 374 Y+228 230 1 e 373 Y+229 231 1 e 372 Y+230 232 1 e 371 Y+231 233 1 e 370 Y+232 234 1 e 369 Y+233 235 1 e 368 Y+234 236 1 e 367 Y+235 237 1 e 366 Y+236 238 1 e 365 Y+237 239 1 e 364 Y+238 240 1 e 363 Y+239 Extensão do Y é qualquer Z Fragmento número inteiro (aminoáci- selecionado dos) entre, e incluin¬ do: 254 1 e 349 Y+253 255 1 e 348 Y+254 256 1 e 347 Y+255 257 1 e 346 Y+256 258 1 e 345 Y+257 259 1 e 344 Y+258 260 1 e 343 Y+259 261 1 e 342 Y+260 262 1 e 341 Y+261 263 1 e 340 Y+262 264 1 e 339 Y+263 265 1 e 338 Y+264 266 1 e 337 Y+265 267 1 e 336 Y+266 268 1 e 335 Y+267 269 1 e 334 Y+268 270 1 e 333 Y+269 271 1 e 332 Y+270 272 1 e 331 Y+271 273 1 e 330 Y+272 274 1 e 329 Y+273 275 1 e 328 Y+274 276 1 e 327 Y+275 277 1 e 326 Y+276 278 1 e 325 Y+277 279 1 e 324 Y+278 280 1 e 323 Y+279 281 1 e 322 Y+280 282 1 e 321 Y+281 283 1 e 320 Y+282 284 1 e 319 Y+283 285 1 e 318 Y+284 286 1 e 317 Y+285 287 1 e 316 Y+286 288 1 e 315 Y+287 Tabela 11. Fragmentos de SEQ ID NO: 13.

Exten¬ Y é qualquer nú¬ Z são do mero inteiro sele¬ Frag¬ cionado entre, e mento incluindo: (amino- ácidos) 241 1 e 362 Y+240 242 1 e 361 Y+241 243 1 e 360 Y+242 244 1 e 359 Y+243 293 1 e 310 Y+292 294 1 e 309 Y+293 295 1 e 308 Y+294 296 1 e 307 Y+295 297 1 e 306 Y+296 298 1 e 305 Y+297 299 1 e 304 Y+298 300 1 e 303 Y+299 301 1 e 302 Y+300 302 1 e 301 Y+301 303 1 e 300 Y+302 304 1 e 299 Y+303 305 1 e 298 Y+304 306 1 e 297 Y+305 307 1 e 296 Y+306 308 1 e 295 Y+307 309 1 e 294 Y+308 310 1 e 293 Y+309 311 1 e 292 Y+310 312 1 e 291 Y+311 313 1 e 290 Y+312 314 1 e 289 Y+313 315 1 e 288 Y+314 316 1 e 287 Y+315 317 1 e 286 Y+316 318 1 e 285 Y+317 319 1 e 284 Y+318 320 1 e 283 Y+319 321 1 e 282 Y+320 322 1 e 281 Y+321 323 1 e 280 Y+322 Extensão do Y é qualquer Z Fragmento número inteiro (aminoáci- selecionado dos) entre, e incluin¬ do: 289 1 e 314 Y+288 290 1 e 313 Y+289 291 1 e 312 Y+290 292 1 e 311 Y+291 341 1 e 262 Y+340 342 1 e 261 Y+341 343 1 e 260 Y+342 344 1 e 259 Y+343 345 1 e 258 Y+344 346 1 e 257 Y+345 347 1 e 256 Y+346 348 1 e 255 Y+347 349 1 e 254 Y+348 350 1 e 253 Y+349 351 1 e 252 Y+350 352 1 e 251 Y+351 353 1 e 250 Y+352 354 1 e 249 Y+353 355 1 e 248 Y+354 356 1 e 247 Y+355 357 1 e 246 Y+356 358 1 e 245 Y+357 359 1 e 244 Y+358 360 1 e 243 Y+359 361 1 e 242 Y+360 362 1 e 241 Y+361 363 1 e 240 Y+362 364 1 e 239 Y+363 365 1 e 238 Y+364 366 1 e 237 Y+365 367 1 e 236 Y+366 368 1 e 235 Y+367 369 1 e 234 Y+368 370 1 e 233 Y+369 371 1 e 232 Y+370 Tabela 11. Fragmentos de SEQ ID NO: 13.

Exten¬ Y é qualquer nú¬ Z são do mero inteiro sele¬ Frag¬ cionado entre, e mento incluindo: (amino- ácidos) 324 1 e 279 Y+323 325 1 e 278 Y+324 326 1 e 277 Y+325 327 1 e 276 Y+326 328 1 e 275 Y+327 329 1 e 274 Y+328 330 1 e 273 Y+329 331 1 e 272 Y+330 332 1 e 271 Y+331 333 1 e 270 Y+332 334 1 e 269 Y+333 335 1 e 268 Y+334 336 1 e 267 Y+335 337 1 e 266 Y+336 338 1 e 265 Y+337 339 1 e 264 Y+338 340 1 e 263 Y+339 389 1 e 214 Y+388 390 1 e 213 Y+389 391 1 e 212 Y+390 392 1 e 211 Y+391 393 1 e 210 Y+392 394 1 e 209 Y+393 395 1 e 208 Y+394 396 1 e 207 Y+395 397 1 e 206 Y+396 398 1 e 205 Y+397 399 1 e 204 Y+398 400 1 e 203 Y+399 401 1 e 202 Y+400 402 1 e 201 Y+401 403 1 e 200 Y+402 404 1 e 199 Y+403 405 1 e 198 Y+404 406 1 e 197 Y+405 Extensão do Y é qualquer Z Fragmento número inteiro (aminoáci- selecionado dos) entre, e incluin¬ do: 372 1 e 231 Y+371 373 1 e 230 Y+372 374 1 e 229 Y+373 375 1 e 228 Y+374 376 1 e 227 Y+375 377 1 e 226 Y+376 378 1 e 225 Y+377 379 1 e 224 Y+378 380 1 e 223 Y+379 381 1 e 222 Y+380 382 1 e 221 Y+381 383 1 e 220 Y+382 384 1 e 219 Y+383 385 1 e 218 Y+384 386 1 e 217 Y+385 387 1 e 216 Y+386 388 1 e 215 Y+387 437 1 e 166 Y+436 438 1 e 165 Y+437 439 1 e 164 Y+438 440 1 e 163 Y+439 441 1 e 162 Y+440 442 1 e 161 Y+441 443 1 e 160 Y+442 444 1 e 159 Y+443 445 1 e 158 Y+444 446 1 e 157 Y+445 447 1 e 156 ' Y+446 448 1 e 155 Y+447 449 1 e 154 Y+448 450 1 e 153 Y+449 451 1 e 152 Y+450 452 1 e 151 Y+451 453 1 e 150 Y+452 454 1 e 149 Y+453 Tabela 11. Fragmentos de SEQ ID NO: 13.

Exten¬ Y é qualquer nú¬ Z são do mero inteiro sele¬ Frag¬ cionado entre, e mento incluindo: (amino- ácidos) 407 1 e 196 Y+406 408 1 e 195 Y+407 409 1 e 194 Y+408 410 1 e 193 Y+409 411 1 e 192 Y+410 412 1 e 191 Y+411 413 1 e 190 Y+412 414 1 e 189 Y+413 415 1 e 188 Y+414 416 1 e 187 Y+415 417 1 e 186 Y+416 418 1 e 185 Y+417 419 1 e 184 Y+418 420 1 e 183 Y+419 421 1 e 182 Y+420 422 1 e 181 Y+421 423 1 e 180 Y+422 424 1 e 179 Y+423 425 1 e 178 Y+424 426 1 e 177 Y+425 427 1 e 176 Y+426 428 1 e 175 Y+427 429 1 e 174 Y+428 430 1 e 173 Y+429 431 1 e 172 Y+430 432 1 e 171 Y+431 433 1 e 170 Y+432 434 1 e 169 Y+433 435 1 e 168 Y+434 436 1 e 167 Y+435 485 1 e 118 Y+484 486 1 e 117 Y+485 487 1 e 116 Y+486 488 1 e 115 Y+487 489 1 e 114 Y+488 Extensão do Y é qualquer Z Fragmento número inteiro (aminoáci- selecionado dos) entre, e incluin¬ do: 455 1 e 148 Y+454 456 1 e 147 Y+455 457 1 e 146 Y+456 458 1 e 145 Y+457 459 1 e 144 Y+458 460 1 e 143 Y+459 461 1 e 142 Y+460 462 1 e 141 Y+461 463 1 e 140 Y+462 464 1 e 139 Y+463 465 1 e 138 Y+464 466 1 e 137 Y+465 467 1 e 136 Y+466 468 1 e 135 Y+467 469 1 e 134 Y+468 470 1 e 133 Y+469 471 1 e 132 Y+470 472 1 e 131 Y+471 473 1 e 130 Y+472 474 1 e 129 Y+473 475 1 e 128 Y+474 476 1 e 127 Y+475 477 1 e 126 Y+476 478 1 e 125 Y+477 479 1 e 124 Y+478 480 1 e 123 Y+479 481 1 e 122 Y+480 482 1 e 121 Y+481 483 1 e 120 Y+482 484 1 e 119 Y+483 533 1 e 70 Y+532 534 1 e 69 Y+533 535 1 e 68 Y+534 536 1 e 67 Y+535 537 1 e 66 Y+536 Tabela 11. Fragmentos de SEQ ID NO: 13.

Exten¬ Y é qualquer nú¬ Z são do mero inteiro sele¬ Frag¬ cionado entre, e mento incluindo: (amino- ácidos) 490 1 e 113 Y+489 491 1 e 112 Y+490 492 1 e 111 Y+491 493 1 e 110 Y+492 494 1 e 109 Y+493 495 1 e 108 Y+494 496 1 e 107 Y+495 497 1 e 106 Y+496 498 1 e 105 Y+497 499 1 e 104 Y+498 500 1 e 103 Y+499 501 1 e 102 Y+500 502 1 e 101 Y+501 503 1 e 100 Y+502 504 1 e 99 Y+503 505 1 e 98 Y+504 506 1 e 97 Y+505 507 1 e 96 Y+506 508 1 e 95 Y+507 509 1 e 94 Y+508 510 1 e 93 Y+509 511 1 e 92 Y+510 512 1 e 91 Y+511 513 1 e 90 Y+512 514 1 e 89 Y+513 515 1 e 88 Y+514 516 1 e 87 Y+515 517 1 e 86 Y+516 518 1 e 85 Y+517 519 1 e 84 Y+518 520 1 e 83 Y+519 521 1 e 82 Y+520 522 1 e 81 Y+521 523 1 e 80 Y+522 524 1 e 79 Y+523 Extensão do Y é qualquer Z Fragmento número inteiro (aminoáci- selecionado dos) entre, e incluin¬ do: 538 1 e 65 Y+537 539 1 e 64 Y+538 540 1 e 63 Y+539 541 1 e 62 Y+540 542 1 e 61 Y+541 543 1 e 60 Y+542 544 1 e 59 Y+543 545 1 e 58 Y+544 546 1 e 57 Y+545 547 1 e 56 Y+546 548 1 e 55 Y+547 549 1 e 54 Y+548 550 1 e 53 Y+549 551 1 e 52 Y+550 552 1 e 51 Y+551 553 1 e 50 Y+552 554 1 e 49 Y+553 555 1 e 48 Y+554 556 1 e 47 Y+555 557 1 e 46 Y+556 558 1 e 45 Y+557 559 1 e 44 Y+558 560 1 e 43 Y+559 561 1 e 42 Y+560 562 1 e 41 Y+561 563 1 e 40 Y+562 564 1 e 39 Y+563 565 1 e 38 Y+564 566 1 e 37 Y+565 567 1 e 36 Y+566 568 1 e 35 Y+567 569 1 e 34 Y+568 570 1 e 33 Y+569 571 1 e 32 Y+570 572 1 e 31 Y+571 Tabela 11. Fragmentos de SEQ ID NO: 13.

Exten¬ Y é qualquer nú¬ Z são do mero inteiro sele¬ Frag¬ cionado entre, e mento incluindo: (amino- ácidos) 525 1 e 78 Y+524 526 1 e 77 Y+525 527 1 e 76 Y+526 528 1 e 75 Y+527 529 1 e 74 Y+528 530 1 e 73 Y+529 531 1 e 72 Y+530 532 1 e 71 Y+531 581 1 e 22 Y+580 582 1 e 21 Y+581 583 1 e 20 Y+582 584 1 e 19 Y+583 585 1 e 18 Y+584 586 1 e 17 Y+585 587 1 e 16 Y+586 588 1 e 15 Y+587 589 1 e 14 Y+588 590 1 e 13 Y+589 591 1 e 12 Y+590 592 1 e 11 Y+591 593 1 e 10 Y+592 594 1 e 9 Y+593 595 1 e 8 Y+594 596 1 e 7 Y+595 597 1 e 6 Y+596 598 1 e 5 Y+597 599 1 e 4 Y+598 600 1 e 3 Y+599 601 1 e 2 Y+600 Extensão do Y é qualquer Z Fragmento número inteiro (aminoáci- selecionado dos) entre, e incluin¬ do: 573 1 e 30 Y+572 574 1 e 29 Y+573 575 1 e 28 Y+574 576 1 e 27 Y+575 577 1 e 26 Y+576 578 1 e 25 Y+577 579 1 e 24 Y+578 580 1 e 23 Y+579 Tabela 12. Fragmentos de SEQ ID NO: 15.

Exten¬ Y é qualquer nú¬ Z são do mero inteiro sele¬ Frag¬ cionado entre, e mento incluindo: (amino- ácidos) 1 e 597 Y+4 6 1 e 596 Y+5 7 1 e 595 Y+6 8 1 e 594 Y+7 9 1 e 593 Y+8 1 e 592 Y+9 11 1 e 591 Y+10 12 1 e 590 Y+11 13 1 e 589 Y+12 14 1 e 588 Y+13 1 e 587 Y+14 16 1 e 586 Y+15 17 1 e 585 Y+16 18 1 e 584 Y+17 19 1 e 583 Y+18 1 e 582 Y+19 21 1 e 581 Y+20 22 1 e 580 Y+21 23 1 e 579 Y+22 24 1 e 578 Y+23 1 e 577 Y+24 26 1 e 576 Y+25 27 1 e 575 Y+26 28 1 e 574 Y+27 29 1 e 573 Y+28 1 e 572 Y+29 31 1 e 571 Y+30 32 1 e 570 Y+31 33 1 e 569 Y+32 34 1 e 568 Y+33 1 e 567 Y+34 36 1 e 566 Y+35 37 1 e 565 Y+36 38 1 e 564 Y+37 39 1 e 563 Y+38 Extensão do Y é qualquer Z Fragmento número inteiro (aminoáci- selecionado dos) entre, e incluin¬ do: 53 1 e 549 Y+52 54 1 e 548 Y+53 55 1 e 547 Y+54 56 1 e 546 Y+55 57 1 e 545 Y+56 58 1 e 544 Y+57 59 1 e 543 Y+58 60 1 e 542 Y+59 61 1 e 541 Y+60 62 1 e 540 Y+61 63 1 e 539 Y+62 64 1 e 538 Y+63 65 1 e 537 Y+64 66 1 e 536 Y+65 67 1 e 535 Y+66 68 1 e 534 Y+67 69 1 e 533 Y+68 70 1 e 532 Y+69 71 1 e 531 Y+70 72 1 e 530 Y+71 73 1 e 529 Y+72 74 1 e 528 Y+73 75 1 e 527 Y+74 76 1 e 526 Y+75 77 1 e 525 Y+76 78 1 e 524 Y+77 79 1 e 523 Y+78 80 1 e 522 Y+79 81 1 e 521 Y+80 82 1 e 520 Y+81 83 1 e 519 Y+82 84 1 e 518 Y+83 85 1 e 517 Y+84 86 1 e 516 Y+85 87 1 e 515 Y+86 Tabela 12. Fragmentos de SEQ ID NO: 15.

Extensão do Y é qualquer Z Fragmento número inteiro (aminoáci- selecionado dos) entre, e incluin¬ do: 88 1 e 514 Y+87 89 1 e 513 Y+88 90 1 e 512 Y+89 91 1 e 511 Y+90 92 1 e 510 Y+91 93 1 e 509 Y+92 94 1 e 508 Y+93 95 1 e 507 Y+94 96 1 e 506 Y+95 97 1 e 505 Y+96 98 1 e 504 Y+97 99 1 e 503 Y+98 100 1 e 502 Y+99 149 1 e 453 Y+148 150 1 e 452 Y+149 151 1 e 451 Y+150 152 1 e 450 Y+151 153 1 e 449 Y+152 154 1 e 448 Y+153 155 1 e 447 Y+154 156 1 e 446 Y+155 157 1 e 445 Y+156 158 1 e 444 Y+157 159 1 e 443 Y+158 160 1 e 442 Y+159 161 1 e 441 Y+160 162 1 e 440 Y+161 163 1 e 439 Y+162 164 1 e 438 Y+163 165 1 e 437 Y+164 166 1 e 436 Y+165 167 1 e 435 Y+166 168 1 e 434 Y+167 169 1 e 433 Y+168 170 1 e 432 Y+169 Exten¬ Y é qualquer nú¬ Z são do mero inteiro sele¬ Frag¬ cionado entre, e mento incluindo: (amino- ácidos) 40 1 e 562 Y+39 41 1 e 561 Y+40 42 1 e 560 Y+41 43 1 e 559 Y+42 44 1 e 558 Y+43 45 1 e 557 Y+44 46 1 e 556 Y+45 47 1 e 555 Y+46 48 1 e 554 Y+47 49 1 e 553 Y+48 50 1 e 552 Y+49 51 1 e 551 Y+50 52 1 e 550 Y+51 101 1 e 501 Y+100 102 1 e 500 Y+101 103 1 e 499 Y+102 104 1 e 498 Y+103 105 1 e 497 Y+104 106 1 e 496 Y+105 107 1 e 495 Y+106 108 1 e 494 Y+107 109 1 e 493 Y+108 110 1 e 492 Y+109 111 1 e 491 Y+110 112 1 e 490 Y+111 113 1 e 489 Y+112 114 1 e 488 Y+113 115 1 e 487 Y+114 116 1 e 486 Y+115 117 1 e 485 Y+116 118 1 e 484 Y+117 119 1 e 483 Y+118 120 1 e 482 Y+119 121 1 e 481 Y+120 122 1 e 480 Y+121 Tabela 12. Fragmentos de SEQ ID NO: 15.

Exten¬ Y é qualquer nú¬ Z são do mero inteiro sele¬ Frag¬ cionado entre, e mento incluindo: (amino- ácidos) 123 1 e 479 Y+122 124 1 e 478 Y+123 125 1 e 477 Y+124 126 1 e 476 Y+125 127 1 e 475 Y+126 128 1 e 474 Y+127 129 1 e 473 Y+128 130 1 e 472 Y+129 131 1 e 471 Y+130 132 1 e 470 Y+131 133 1 e 469 Y+132 134 1 e 468 Y+133 135 1 e 467 Y+134 136 1 e 466 Y+135 137 1 e 465 Y+136 138 1 e 464 Y+137 139 1 e 463 Y+138 140 1 e 462 Y+139 141 1 e 461 Y+140 142 1 e 460 Y+141 143 1 e 459 Y+142 144 1 e 458 Y+143 145 1 e 457 Y+144 146 1 e 456 Y+145 147 1 e 455 Y+146 148 1 e 454 Y+147 197 1 e 405 Y+196 198 1 e 404 Y+197 199 1 e 403 Y+198 200 1 e 402 Y+199 201 1 e 401 Y+200 202 1 e 400 Y+201 203 1 e 399 Y+202 204 1 e 398 Y+203 205 1 e 397 Y+204 Extensão do Y é qualquer Z Fragmento número inteiro (aminoáci- selecionado dos) entre, e incluin¬ do: 171 1 e 431 Y+170 172 1 e 430 Y+171 173 1 e 429 Y+172 174 1 e 428 Y+173 175 1 e 427 Y+174 176 1 e 426 Y+175 177 1 e 425 Y+176 178 1 e 424 Y+177 179 1 e 423 Y+178 180 1 e 422 Y+179 181 1 e 421 Y+180 182 1 e 420 Y+181 183 1 e 419 Y+182 184 1 e 418 Y+183 185 1 e 417 Y+184 186 1 e 416 Y+185 187 1 e 415 Y+186 188 1 e 414 Y+187 189 1 e 413 Y+188 190 1 e 412 Y+189 191 1 e 411 Y+190 192 1 e 410 Y+191 193 1 e 409 Y+192 194 1 e 408 Y+193 195 1 e 407 Y+194 196 1 e 406 Y+195 245 1 e 357 Y+244 246 1 e 356 Y+245 247 1 e 355 Y+246 248 1 e 354 Y+247 249 1 e 353 Y+248 250 1 e 352 Y+249 251 1 e 351 Y+250 252 1 e 350 Y+251 253 1 e 349 Y+252 Tabela 12. Fragmentos de SEQ ID NO: 15.

Extensão do Y é qualquer Z Fragmento número inteiro (aminoáci- selecionado dos) entre, e incluin¬ do: 254 1 e 348 Y+253 255 1 e 347 Y+254 256 1 e 346 Y+255 257 1 e 345 Y+256 258 1 e 344 Y+257 259 1 e 343 Y+258 260 1 e 342 Y+259 261 1 e 341 Y+260 262 1 e 340 Y+261 263 1 e 339 Y+262 264 1 e 338 Y+263 265 1 e 337 Y+264 266 1 e 336 Y+265 267 1 e 335 Y+266 268 1 e 334 Y+267 269 1 e 333 Y+268 270 1 e 332 Y+269 271 1 e 331 Y+270 272 1 e 330 Y+271 273 1 e 329 Y+272 274 1 e 328 Y+273 275 1 e 327 Y+274 276 1 e 326 Y+275 277 1 e 325 Y+276 278 1 e 324 Y+277 279 1 e 323 Y+278 280 1 e 322 Y+279 281 1 e 321 Y+280 282 1 e 320 Y+281 283 1 e 319 Y+282 284 1 e 318 Y+283 285 1 e 317 Y+284 286 1 e 316 Y+285 287 1 e 315 Y+286 288 1 e 314 Y+287 Exten¬ Y é qualquer nú¬ Z são do mero inteiro sele¬ Frag¬ cionado entre, e mento incluindo: (amino- ácidos) 206 1 e 396 Y+205 207 1 e 395 Y+206 208 1 e 394 Y+207 209 1 e 393 Y+208 210 1 e 392 Y+209 211 1 e 391 Y+210 212 1 e 390 Y+211 213 1 e 389 Y+212 214 1 e 388 Y+213 215 1 e 387 Y+214 216 1 e 386 Y+215 217 1 e 385 Y+216 218 1 e 384 Y+217 219 1 e 383 Y+218 220 1 e 382 Y+219 221 1 e 381 Y+220 222 1 e 380 Y+221 223 1 e 379 Y+222 224 1 e 378 Y+223 225 1 e 377 Y+224 226 1 e 376 Y+225 227 1 e 375 Y+226 228 1 e 374 Y+227 229 1 e 373 Y+228 230 1 e 372 Y+229 231 1 e 371 Y+230 232 1 e 370 Y+231 233 1 e 369 Y+232 234 1 e 368 Y+233 235 1 e 367 Y+234 236 1 e 366 Y+235 237 1 e 365 Y+236 238 1 e 364 Y+237 239 1 e 363 Y+238 240 1 e 362 Y+239 Tabela 12. Fragmentos de SEQ ID NO: 15.

Extensão do Y é qualquer Z Fragmento número inteiro (aminoáci- selecionado dos) entre, e incluin¬ do: 289 1 e 313 Y+288 290 1 e 312 Y+289 291 1 e 311 Y+290 292 1 e 310 Y+291 341 1 e 261 Y+340 342 1 e 260 Y+341 343 1 e 259 Y+342 344 1 e 258 Y+343 345 1 e 257 Y+344 346 1 e 256 Y+345 347 1 e 255 Y+346 348 1 e 254 Y+347 349 1 e 253 Y+348 350 1 e 252 Y+349 351 1 e 251 Y+350 352 1 e 250 Y+351 353 1 e 249 Y+352 354 1 e 248 Y+353 355 1 e 247 Y+354 356 1 e 246 Y+355 357 1 e 245 Y+356 358 1 e 244 Y+357 359 1 e 243 Y+358 360 1 e 242 Y+359 361 1 e 241 Y+360 362 1 e 240 Y+361 363 1 e 239 Y+362 364 1 e 238 Y+363 365 1 e 237 Y+364 366 1 e 236 Y+365 367 1 e 235 Y+366 368 1 e 234 Y+367 369 1 e 233 Y+368 370 1 e 232 Y+369 371 1 e 231 Y+370 Exten¬ Y é qualquer nú¬ Z são do mero inteiro sele¬ Frag¬ cionado entre, e mento incluindo: (amino- ácidos) 241 1 e 361 Y+240 242 1 e 360 Y+241 243 1 e 359 Y+242 244 1 e 358 Y+243 293 1 e 309 Y+292 294 1 e 308 Y+293 295 1 e 307 Y+294 296 1 e 306 Y+295 297 1 e 305 Y+296 298 1 e 304 Y+297 299 1 e 303 Y+298 300 1 e 302 Y+299 301 1 e 301 Y+300 302 1 e 300 Y+301 303 1 e 299 Y+302 304 1 e 298 Y+303 305 1 e 297 Y+304 306 1 e 296 Y+305 307 1 e 295 Y+306 308 1 e 294 Y+307 309 1 e 293 Y+308 310 1 e 292 Y+309 311 1 e 291 Y+310 312 1 e 290 Y+311 313 1 e 289 Y+312 314 1 e 288 Y+313 315 1 e 287 Y+314 316 1 e 286 Y+315 317 1 e 285 Y+316 318 1 e 284 Y+317 319 1 e 283 Y+318 320 1 e 282 Y+319 321 1 e 281 Y+320 322 1 e 280 Y+321 323 1 e 279 Y+322 Tabela 12. Fragmentos de SEQ ID NO: 15.

Exten¬ Y é qualquer nú¬ Z são do mero inteiro sele¬ Frag¬ cionado entre, e mento incluindo: (amino- ácidos) 324 1 e 278 Y+323 325 1 e 277 Y+324 326 1 e 276 Y+325 327 1 e 275 Y+326 328 1 e 274 Y+327 329 1 e 273 Y+328 330 1 e 272 Y+329 331 1 e 271 Y+330 332 1 e 270 Y+331 333 1 e 269 Y+332 334 1 e 268 Y+333 335 1 e 267 Y+334 336 1 e 266 Y+335 337 1 e 265 Y+336 338 1 e 264 Y+337 339 1 e 263 Y+338 340 1 e 262 Y+339 389 1 e 213 Y+388 390 1 e 212 Y+389 391 1 e 211 Y+390 392 1 e 210 Y+391 393 1 e 209 Y+392 394 1 e 208 Y+393 395 1 e 207 Y+394 396 1 e 206 Y+395 397 1 e 205 Y+396 398 1 e 204 Y+397 399 1 e 203 Y+398 400 1 e 202 Y+399 401 1 e 201 Y+400 402 1 e 200 Y+401 403 1 e 199 Y+402 404 1 e 198 Y+403 405 1 e 197 Y+404 406 1 e 196 Y+405 Extensão do Y é qualquer Z Fragmento número inteiro (aminoáci- selecionado dos) entre, e incluin¬ do: 372 1 e 230 Y+371 373 1 e 229 Y+372 374 1 e 228 Y+373 375 1 e 227 Y+374 376 1 e 226 Y+375 377 1 e 225 Y+376 378 1 e 224 Y+377 379 1 e 223 Y+378 380 1 e 222 Y+379 381 1 e 221 Y+380 382 1 e 220 Y+381 383 1 e 219 Y+382 384 1 e 218 Y+383 385 1 e 217 Y+384 386 1 e 216 Y+385 387 1 e 215 Y+386 388 1 e 214 Y+387 437 1 e 165 Y+436 438 1 e 164 Y+437 439 1 e 163 Y+438 440 1 e 162 Y+439 441 1 e 161 Y+440 442 1 e 160 Y+441 443 1 e 159 Y+442 444 1 e 158 Y+443 445 1 e 157 Y+444 446 1 e 156 Y+445 447 1 e 155 Y+446 448 1 e 154 Y+447 449 1 e 153 Y+448 450 1 e 152 Y+449 451 1 e 151 Y+450 452 1 e 150 Y+451 453 1 e 149 Y+452 454 1 e 148 Y+453 Tabela 12. Fragmentos de SEQ ID NO: 15.

Exten¬ Y é qualquer nú¬ Z são do mero inteiro sele¬ Frag¬ cionado entre, e mento incluindo: (amino- ácidos) 407 1 e 195 Y+406 408 1 e 194 Y+407 409 1 e 193 Y+408 410 1 e 192 Y+409 411 1 e 191 Y+410 412 1 e 190 Y+411 413 1 e 189 Y+412 414 1 e 188 Y+413 415 1 e 187 Y+414 416 1 e 186 Y+415 417 1 e 185 Y+416 418 1 e 184 Y+417 419 1 e 183 Y+418 420 1 e 182 Y+419 421 1 e 181 Y+420 422 1 e 180 Y+421 423 1 e 179 Y+422 424 1 e 178 Y+423 425 1 e 177 Y+424 426 1 e 176 Y+425 427 1 e 175 Y+426 428 1 e 174 Y+427 429 1 e 173 Y+428 430 1 e 172 Y+429 431 1 e 171 Y+430 432 1 e 170 Y+431 433 1 e 169 Y+432 434 1 e 168 Y+433 435 1 e 167 Y+434 436 1 e 166 Y+435 485 1 e 117 Y+484 486 1 e 116 Y+485 487 1 e 115 Y+486 488 1 e 114 Y+487 489 1 e 113 Y+488 Extensão do Y é qualquer Z Fragmento número inteiro (aminoáci- selecionado dos) entre, e incluin¬ do: 455 1 e 147 Y+454 456 1 e 146 Y+455 457 1 e 145 Y+456 458 1 e 144 Y+457 459 1 e 143 Y+458 460 1 e 142 Y+459 461 1 e 141 Y+460 462 1 e 140 Y+461 463 1 e 139 Y+462 464 1 e 138 Y+463 465 1 e 137 Y+464 466 1 e 136 Y+465 467 1 e 135 Y+466 468 1 e 134 Y+467 469 1 e 133 Y+468 470 1 e 132 Y+469 471 1 e 131 Y+470 472 1 e 130 Y+471 473 1 e 129 Y+472 474 1 e 128 Y+473 475 1 e 127 Y+474 476 1 e 126 Y+475 477 1 e 125 Y+476 478 1 e 124 Y+477 479 1 e 123 Y+478 480 1 e 122 Y+479 481 1 e 121 Y+480 482 1 e 120 Y+481 483 1 e 119 Y+482 484 1 e 118 Y+483 533 1 e 69 Y+532 534 1 e 68 Y+533 535 1 e 67 Y+534 536 1 e 66 Y+535 537 1 e 65 Y+536 Tabela 12. Fragmentos de SEQ ID NO: 15.

Exten¬ Y é qualquer nú¬ Z são do mero inteiro sele¬ Frag¬ cionado entre, e mento incluindo: (amino- ácidos) 490 1 e 112 Y+489 491 1 e 111 Y+490 492 1 e 110 Y+491 493 1 e 109 Y+492 494 1 e 108 Y+493 495 1 e 107 Y+494 496 1 e 106 Y+495 497 1 e 105 Y+496 498 1 e 104 Y+497 499 1 e 103 Y+498 500 1 e 102 Y+499 501 1 e 101 Y+500 502 1 e 100 Y+501 503 1 e 99 Y+502 504 1 e 98 Y+503 505 1 e 97 Y+504 506 1 e 96 Y+505 507 1 e 95 Y+506 508 1 e 94 Y+507 509 1 e 93 Y+508 510 1 e 92 Y+509 511 1 e 91 Y+510 512 1 e 90 Y+511 513 1 e 89 Y+512 514 1 e 88 Y+513 515 1 e 87 Y+514 516 1 e 86 Y+515 517 1 e 85 Y+516 518 1 e 84 Y+517 519 1 e 83 Y+518 520 1 e 82 Y+519 521 1 e 81 Y+520 522 1 e 80 Y+521 523 1 e 79 Y+522 524 1 e 78 Y+523 Extensão do Y é qualquer Z Fragmento número inteiro (aminoáci- selecionado dos) entre, e incluin¬ do: 538 1 e 64 Y+537 539 1 e 63 Y+538 540 1 e 62 Y+539 541 1 e 61 Y+540 542 1 e 60 Y+541 543 1 e 59 Y+542 544 1 e 58 Y+543 545 1 e 57 Y+544 546 1 e 56 Y+545 547 1 e 55 Y+546 548 1 e 54 Y+547 549 1 e 53 Y+548 550 1 e 52 Y+549 551 1 e 51 Y+550 552 1 e 50 Y+551 553 1 e 49 Y+552 554 1 e 48 Y+553 555 1 e 47 Y+554 556 1 e 46 Y+555 557 1 e 45 Y+556 558 1 e 44 Y+557 559 1 e 43 Y+558 560 1 e 42 Y+559 561 1 e 41 Y+560 562 1 e 40 Y+561 563 1 e 39 Y+562 564 1 e 38 Y+563 565 1 e 37 Y+564 566 1 e 36 Y+565 567 1 e 35 Y+566 568 1 e 34 Y+567 569 1 e 33 Y+568 570 1 e 32 Y+569 571 1 e 31 Y+570 572 1 e 30 Y+571 Tabela 12. Fragmentos de SEQ ID NO: 15.

Exten¬ Y é qualquer nú¬ Z são do mero inteiro sele¬ Frag¬ cionado entre, e mento incluindo: (amino- ácidos) 525 1 e 77 Y+524 526 1 e 76 Y+525 527 1 e 75 Y+526 528 1 e 74 Y+527 529 1 e 73 Y+528 530 1 e 72 Y+529 531 1 e 71 Y+530 532 1 e 70 Y+531 581 1 e 21 Y+580 582 1 e 20 Y+581 583 1 e 19 Y+582 584 1 e 18 Y+583 585 1 e 17 Y+584 586 1 e 16 Y+585 587 1 e 15 Y+586 588 1 e 14 Y+587 589 1 e 13 Y+588 590 1 e 12 Y+589 591 1 e 11 Y+590 592 1 e 10 Y+591 593 1 e 9 Y+592 594 1 e 8 Y+593 595 1 e 7 Y+594 596 1 e 6 Y+595 597 1 e 5 Y+596 598 1 e 4 Y+597 599 1 e 3 Y+598 600 1 e 2 Y+599 Extensão do Y é qualquer Z Fragmento número inteiro (aminoáci- selecionado dos) entre, e incluin¬ do: 573 1 e 29 Y+572 574 1 e 28 Y+573 575 1 e 27 Y+574 576 1 e 26 Y+575 577 1 e 25 Y+576 578 1 e 24 Y+577 579 1 e 23 Y+578 580 1 e 22 Y+579 Tabela 13, teor de G+C (%)

40,0 45,1 40,1 45,2 40,2 45,3 40,3 45,4 40,4 45,5 40,5 45,6 40,6 45,7 40,7 45,8 40,8 45,9 40,9 46,0 41,0 46,1 41,1 46,2 41,2 46,3 41,3 46,4 41,4 46,5 41,5 46,6 41,6 46,7 41,7 46,8 41,8 46,9 41,9 47,0 42,0 47,1 42,1 47,2 42,2 47,3 42,3 47,4 42,4 47,5 42,5 47,6 42,6 47,7 42,7 47,8 42,8 47,9 42,9 48,0 43,0 48,1 43,1 48,2 43,2 48,3 43,3 48,4 Tabela 13, teor de G+C (%)

43,4 48,5 43,5 48,6 43,6 48,7 43,7 48,8 43,8 48,9 43,9 49,0 44,0 49,1 44,1 49,2 44,2 49,3 44,3 49,4 44,4 49,5 44,5 49,6 44,6 49,7 44,7 49,8 44,8 49,9 44,9 50,0 45,0 Tabela 14, Percentagem de Identidade

70,0 75,1 80,2 85,3 90,4 95,5 70,1 75,2 80,3 85,4 90,5 95,6 70,2 75,3 80,4 85,5 90,6 95,7 70,3 75,4 80,5 85,6 90,7 95,8 70,4 75,5 80,6 85,7 90,8 95,9 70,5 75,6 80,7 85,8 90,9 96,0 70,6 75,7 80,8 85,9 91,0 96,1 70,7 75,8 80,9 86,0 91,1 96,2 70,8 75,9 81,0 86,1 91,2 96,3 70,9 76,0 81,1 86,2 91,3 96,4 71,0 76,1 81,2 86,3 91,4 96,5 71,1 76,2 81,3 86,4 91,5 96,6 71,2 76,3 81,4 86,5 91,6 96,7 71,3 76,4 81,5 86,6 91,7 96,8 71,4 76,5 81,6 86,7 91,8 96,9 71,5 76,6 81,7 86,8 91,9 97,0 71,6 76,7 81,8 86,9 92,0 97,1 71,7 76,8 81,9 87,0 92,1 97,2 71,8 76,9 82,0 87,1 92,2 97,3 71,9 77,0 82,1 87,2 92,3 97,4 72,0 77,1 82,2 87,3 92,4 97,5 72,1 77,2 82,3 87,4 92,5 97,6 72,2 77,3 82,4 87,5 92,6 97,7 72,3 77,4 82,5 87,6 92,7 97,8 72,4 77,5 82,6 87,7 92,8 97,9 72,5 77,6 82,7 87,8 92,9 98,0 72,6 77,7 82,8 87,9 93,0 98,1 72,7 77,8 82,9 88,0 93,1 98,2 72,8 77,9 83,0 88,1 93,2 98,3 72,9 78,0 83,1 88,2 93,3 98,4 73,0 78,1 83,2 88,3 93,4 98,5 73,1 78,2 83,3 88,4 93,5 98,6 73,2 78,3 83,4 88,5 93,6 98,7 73,3 78,4 83,5 88,6 93,7 98,8 Tabela 14, Percentagem de Identidade

73,4 78,5 83,6 88,7 93,8 98,9 73,5 78,6 83,7 88,8 93,9 99,0 73,6 78,7 83,8 88,9 94,0 99,1 73,7 78,8 83,9 89,0 94,1 99,2 73,8 78,9 84,0 89,1 94,2 99,3 73,9 79,0 84,1 89,2 94,3 99,4 74,0 79,1 84,2 89,3 94,4 99,5 74,1 79,2 84,3 89,4 94,5 99,6 74,2 79,3 84,4 89,5 94,6 99,7 74,3 79,4 84,5 89,6 94,7 99,8 74,4 79,5 84,6 89,7 94,8 99,9 74,5 79,6 84,7 89,8 94,9 100,0 74,6 79,7 84,8 89,9 95,0 74,7 79,8 84,9 90,0 95,1 74,8 79,9 85,0 90,1 95,2 74,9 80,0 85,1 90,2 95,3 75,0 80,1 85,2 90,3 95,4 Polipeptídeos Tabela 15. Fragmentos ou trechos de polipeptídeos exem¬ ou Fragmen¬ plares contendo os seguintes aminoácidos consecutivos de tos Exempla¬ SEQ ID NO: 9. res 1 1-22 X X 2 1-22 343 3 1-22 343 344 4 1-22 343 344 345 5 1-22 343 344 345 691-694 6 343 X ^XC 7 343 344 8 343 344 345 9 343 344 345 691-694 10 X 344 X ^xC 11 ^X^ 344 345 691-694 12 ^X^ ^x^ 345 ^XI 13 3><c 345 691-694 14 691-694 Tabela 16. Vários Fragmentos Exemplares de SEQ ID NOs: 5, 9, 11, 13 e 15.

SEQ ID resíduo resíduo NO: amino- amino- ácido ácido de N- de C- termi- termi- nal nal 9 ou 11 3 692 9 ou 11 4 692 9 ou 11 5 692 9 ou 11 6 692 9 ou 11 7 692 9 ou 11 8 692 9 ou 11 9 692 9 ou 11 10 692 9 ou 11 11 692 9 ou 11 12 692 9 ou 11 13 692 9 ou 11 14 692 9 ou 11 15 692 9 ou 11 16 692 9 ou 11 17 692 9 ou 11 18 692 9 ou 11 19 692 9 ou 11 20 692 9 ou 11 21 692 9 ou 11 22 692 9 ou 11 1 693 9 ou 11 2 693 9 ou 11 3 693 9 ou 11 4 693 9 ou 11 5 693 9 ou 11 6 693 9 ou 11 7 693 9 ou 11 8 693 9 ou 11 9 693 9 ou 11 10 693 9 ou 11 11 693 9 ou 11 12 693 9 ou 11 13 693 9 ou 11 14 693 9 ou 11 15 693 9 ou 11 16 693 9 ou 11 17 693 9 ou 11 18 693 SEQ ID resíduo resíduo NO: amino- amino- ácido ácido de N- de C- termi- termi- nal nal 9 ou 11 1 690 9 ou 11 2 690 9 ou 11 3 690 9 ou 11 4 690 9 ou 11 5 690 9 ou 11 6 690 9 ou 11 7 690 9 ou 11 8 690 9 ou 11 9 690 9 ou 11 10 690 9 ou 11 11 690 9 ou 11 12 690 9 ou 11 13 690 9 ou 11 14 690 9 ou 11 15 690 9 ou 11 16 690 9 ou 11 17 690 9 ou 11 18 690 9 ou 11 19 690 9 ou 11 20 690 9 ou 11 21 690 9 ou 11 22 690 9 ou 11 1 691 9 ou 11 2 691 9 ou 11 3 691 9 ou 11 4 691 9 ou 11 5 691 9 ou 11 6 691 9 ou 11 7 691 9 ou 11 8 691 9 ou 11 9 691 9 ou 11 10 691 9 ou 11 11 691 9 ou 11 12 691 9 ou 11 13 691 9 ou 11 14 691 9 ou 11 15 691 9 ou 11 16 691 SEQID resíduo resíduo NO: amino- amino- ácido ácido de N- de C- terminal terminal 5 93 668 5 168 668 9 ou 11 1 114 9 ou 11 2 114 9 ou 11 3 114 9 ou 11 4 114 9 ou 11 5 114 9 ou 11 6 114 9 ou 11 7 114 9 ou 11 8 114 9 ou 11 9 114 9 ou 11 10 114 9 ou 11 11 114 9 ou 11 12 114 9 ou 11 13 114 9 ou 11 14 114 9 ou 11 15 114 9 ou 11 16 114 9 ou 11 17 114 9 ou 11 18 114 9 ou 11 19 114 9 ou 11 20 114 9 ou 11 21 114 9 ou 11 22 114 9 ou 11 1 189 9 ou 11 2 189 9 ou 11 3 189 9 ou 11 4 189 9 ou 11 5 189 9 ou 11 6 189 9 ou 11 7 189 9 ou 11 8 189 9 ou 11 9 189 9 ou 11 10 189 9 ou 11 11 189 9 ou 11 12 189 9 ou 11 13 189 9 ou 11 14 189 Tabela 16. Vários Fragmentos Exemplares de SEQ ID NOs: 5, 9, 11, 13 e 15.

SEQ ID resíduo resíduo NO: amino- amino- ácido ácido de N- de C- termi- termi- nal nal 9 ou 11 19 693 9 ou 11 20 693 9 ou 11 21 693 9 ou 11 22 693 9 ou 11 1 694 9 ou 11 2 694 9 ou 11 3 694 9 ou 11 4 694 13 16 599 13 17 599 13 18 599 13 19 599 13 20 599 13 21 599 13 22 599 13 1 600 13 2 600 13 3 600 13 4 600 13 5 600 13 6 600 13 7 600 13 8 600 13 9 600 13 10 600 13 11 600 13 12 600 13 13 600 13 14 600 13 15 600 13 16 600 13 17 600 13 18 600 13 19 600 13 20 600 13 21 600 13 22 600 13 1 601 13 2 601 SEQID resíduo resíduo NO: amino- amino- ácido ácldo de N- de C- termi- termi- nal nal 9 ou 11 17 691 9 ou 11 18 691 9 ou 11 19 691 9 ou 11 20 691 9 ou 11 21 691 9 ou 11 22 691 9 ou 11 1 692 9 ou 11 2 692 13 14 97 13 15 97 13 16 97 13 17 97 13 18 97 13 19 97 13 20 97 13 21 97 13 22 97 13 1 598 13 2 598 13 3 598 13 4 598 13 5 598 13 6 598 13 7 598 13 8 598 13 9 598 13 10 598 13 11 598 13 12 598 13 13 598 13 14 598 13 15 598 13 16 598 13 17 598 13 18 598 13 19 598 13 20 598 13 21 598 13 22 598 SEQ ID resíduo resíduo NO: amino- amino- ácido ácido de N- de C- terminal terminal 9 ou 11 15 189 9 ou 11 16 189 9 ou 11 17 189 9 ou 11 18 189 9 ou 11 19 189 9 ou 11 20 189 9 ou 11 21 189 9 ou 11 22 189 9 ou 11 5 694 9 ou 11 6 694 9 ou 11 7 694 9 ou 11 8 694 9 ou 11 9 694 9 ou 11 10 694 9 ou 11 11 694 9 ou 11 12 694 9 ou 11 13 694 9 ou 11 14 694 9 ou 11 15 694 9 ou 11 16 694 9 ou 11 17 694 9 ou 11 18 694 9 ou 11 19 694 9 ou 11 20 694 9 ou 11 21 694 9 ou 11 22 694 9 ou 11 23 690 9 ou 11 23 691 9 ou 11 23 692 9 ou 11 23 693 9 ou 11 23 694 9 ou 11 115 690 9 ou 11 115 691 9 ou 11 115 692 9 ou 11 115 693 9 ou 11 115 694 9 ou 11 190 690 9 ou 11 190 691 9 ou 11 190 692 Tabela 16. Vários Fragmentos Exemplares de SEQ ID NOs: 5, 9, 11,13 e 15.

SEQID resíduo resíduo NO: amino- amino- ácido ácido de N- de C- termi- termi- nal nal 13 3 601 13 4 601 13 5 601 13 6 601 13 7 601 13 8 601 13 9 601 13 10 601 13 11 601 13 12 601 13 13 601 13 14 601 13 15 601 13 16 601 13 17 601 15 16 598 15 17 598 15 18 598 15 19 598 15 20 598 15 21 598 15 1 599 15 2 599 15 3 599 15 4 599 15 5 599 15 6 599 15 7 599 15 8 599 15 9 599 15 10 599 15 11 599 15 12 599 15 13 599 15 14 599 15 15 599 15 16 599 15 17 599 15 18 599 SEQ ID resíduo resíduo NO: amino- amino- ácldo ácido de N- de C- termi- termi- nal nal 13 1 599 13 2 599 13 3 599 13 4 599 13 5 599 13 6 599 13 7 599 13 8 599 13 9 599 13 10 599 13 11 599 13 12 599 13 13 599 13 14 599 13 15 599 12 96 13 96 14 96 15 96 16 96 17 96 18 96 19 96 20 96 21 96 1 597 2 597 3 597 4 597 5 597 6 597 7 597 8 597 9 597 10 597 11 597 12 597 13 597 14 597 SEQ ID resíduo resíduo NO: amino- amino- ácldo ácldo de N- de C- terminal terminal 9 ou 11 190 693 9 ou 11 190 694 13 1 97 13 2 97 13 3 97 13 4 97 13 5 97 13 6 97 13 7 97 13 8 97 13 9 97 13 10 97 13 11 97 13 12 97 13 13 97 13 18 601 13 19 601 13 20 601 13 21 601 13 22 601 13 1 602 13 2 602 13 3 602 13 4 602 13 5 602 13 6 602 13 7 602 13 8 602 13 9 602 13 10 602 13 11 602 13 12 602 13 13 602 13 14 602 13 15 602 13 16 602 13 17 602 13 18 602 13 19 602 Tabela 16. Vários Fragmentos Exemplares de SEQ ID NOs: 5, 9, 11,13 e 15.

SEQ ID resíduo resíduo NO: amino- amino- ácido ácido de N- de C- termi- termi- nal nal 19 599 20 599 21 599 1 599 2 599 3 599 4 599 5 599 6 599 7 599 8 599 9 599 10 599 11 599 12 599 13 599 14 599 15 599 16 599 17 599 18 599 19 599 SEQID resíduo resíduo NO: amino- amino- ácido ácido de N- de C- termi- termi- nal nal 15 15 597 15 16 597 15 17 597 15 18 597 15 19 597 15 20 597 15 21 597 15 1 598 15 2 598 15 3 598 15 4 598 15 5 598 15 6 598 15 7 598 15 8 598 15 9 598 15 10 598 15 11 598 15 12 598 15 13 598 15 14 598 15 15 598 15 22 600 15 22 601 15 97 598 15 97 599 15 97 600 15 97 601 SEQID resíduo resíduo NO: amino- amino- ácido ácido de N- de C- terminal terminal 13 20 602 13 21 602 13 22 602 13 23 599 13 23 600 13 23 ! ^ O CO 13 23 602 13 98 599 13 98 600 13 98 601 13 98 602 15 1 96 15 2 96 15 3 96 15 4 96 15 5 96 15 6 96 15 7 96 15 8 96 15 9 96 15 10 96 15 11 96 15 20 599 15 21 599 15 1 600 15 2 600 15 3 600 15 4 600 15 5 600 15 6 600 15 7 600 15 8 600 15 9 600 15 10 600 15 11 600 15 12 600 15 13 600 15 14 600 15 15 600 Tabela 16. Vários Fragmentos Exemplares de SEQ ID NOs: 5, 9, 11,13 e 15. SEQID resíduo resíduo SEQ ID resíduo resíduo NO: amino- amino- NO: amino- amino- ácido ácido ácido ácido de N- de C- de N- de C- termi- termi- termi- termi- nal nal nal nal SEQ ID resíduo resíduo NO: amino- amino- ácido ácido de N- de C- terminal terminal 16 600 17 600 18 600 19 600 20 600 21 600 1 601 2 601 3 601 4 O CO 5 601 6 601 7 601 8 601 9 601 10 601 11 O CO 12 601 13 601 14 601 15 601 16 601 17 i o I Ώ I 18 601 19 601 20 601 21 601 22 598 22 599 Tabela 17. Grupos de tratamento para estudo da eficácia em eqüinos, tes¬ tando dois níveis de dose e 2 adjuvantes diferentes (Polygen® e Carbopol) GRU¬ TRATAMENTO DOSE DE ADJU- N0 DE CA¬ PO ANTÍGENO VANTE VALOS 1 Controle de célula de NA Carbopol 3 planta 1 2 Controle de célula de NA Polygen® 3 planta 2 3 Vacina de WNV produ¬ 10/yg Carbopol 10 zida por célula de planta - Alta Dose de PM7 4 Vacina de WNV produ¬ 1 Carbopol 10 zida por célula de planta - Baixa Dose de PM7 5 Vacina de WNV produ¬ 10/yg Polygen® 10 zida por célula de planta - Alta Dose de PM7 6 Vacina de WNV produ¬ 1 /vg Polygen® 10 zida por célula de planta - Baixa Dose de PM7 Tabela 18. Composição de vacina para estudo da eficácia em eqüinos, testando dois níveis de dose e 2 adjuvantes diferentes (Polygen® e Carbopol) Cálculos de WNV para Protocolo 61004 Denota Input Requerido Dose Alvo (ug/dose) 10 Volume de Injeção Alvo 1000 (ul) Volume/Vacina necessᬠ120 Reidratação de ria (ml) Antígeno no. inj/ml 1 Concentração 20 Reidratada Dese¬ jada Ensaio antes da 20 liofilização (ug/ml) Soluções de Matéria- Volume Original 70 Prima Teor de Antígeno em 20 NB C2004-6A total de ug/ frasco 1400 Massa: (ug/ml) Matéria-Prima de Carbo¬ 1000 Lote Volume da Rei¬ 70 pol CC52NAB635 dratação Matéria-Prima de Polygen 30 MVP Lote 10011 Concentração 20 a 30% Reidratada Total de Frascos 1.7 para reidratar NOTAS: Alvos da Formulação: ug/ml de ug/dose Vac. Alto teor de Antígeno 10 10 Caso não reidratar (ug/ml) antígeno introduzir célula de ensaio de antígeno B9 Baixo teor de Antígeno 1 1 (ug/ml) Carbopol 4000 4000 Polygen 30% 15 15 Os Valores de Polygen são em % em volume, o Alvo é 15% de Polygen em Vacina Antígeno em Branco Tabela 18. (continuação)

Todos os Volumes estão em ml Formulação NT-1 Con¬ NT-1 Alta Dose Baixa Do¬ Alta Dose Baixa trole + Controle + Carbopol se + Car¬ + Poly¬ Dose + Carbopol + Polygen bopol gen Polygen Volume para 120 120 120 120 120 120 produzir NT-1 em 60,000 60,000 Branco Alta Dose de 60,000 60,000 Antígeno Baixa Dose 6,000 6,000 de Antígeno Matéria-Prima 48,000 48,000 48,000 de Carbopol Matéria-Prima 60,000 60,000 60,000 de Polygen a 30% Água 12,000 0,000 12,000 66,000 0,000 54,000 Total 120,000 120,000 120,000 120,000 120,000 120,000 No. Serial C1670-40- C1670- C1670-40- C1670-40- C1670- C1670- A 40-B C D 40-E 40-F Tabela 19. Propriedades Físicas de Vacinas de Estudo da Sorologia Série n° Densidade @ 20 PH Osmolalidade 0C C1670-40-A 1,0080 7,66 222 C1670-40-B 1,0040 7,79 136 C1670-40-C 1,0088 7,41 220 C1670-40-D 1,0055 7,29 157 C1670-40-E 1,0046 7,54 127 C1670-40-F 1,0010 7,28 60 PM7 NT-1 Con¬ 1,0040 8,47 143 trole Antígeno em 1,0057 7,97 141 Massa Tabela 20. Títulos de Neutralização Sérica do Vírus West Nile, estudo da eficácia em eqüi¬ nos Grupo Cavalo no. Dia 0 Dia 7 Dia Dia Dia Dia Dia Dia no. 14 21 28 35 42 49 1 132663371 2 2 3 4 2 2 2 2 1 133134514 2 2 2 2 2 2 2 2 1 133218532 2 2 2 3 2 2 2 2 GMT 2,0 2,0 2,3 2,9 2,0 2,0 2,0 2,0 STD 0,0 0,0 0,6 1,0 0,0 0,0 0,0 0,0 2 132761220 2 2 2 3 2 2 2 2 2 133125371 2 2 2 2 2 2 2 2 2 133339624 2 2 2 2 2 2 2 2 GMT 2,0 2,0 2,0 2,3 2,0 2,0 2,0 2,0 STD 0,0 0,0 0,0 0,6 0,0 0,0 0,0 0,0 3 132713454 2 13 22 21 32 32 27 32 3 132725167 2 22 46 49 89 128 49 51 3 133132466 2 2 2 4 7 22 12 14 3 133167527 2 3 22 22 54 41 32 38 3 133169647 2 2 5 6 22 21 10 9 3 133215467 2 3 6 13 21 27 16 22 3 133216291 2 6 12 16 20 25 11 1 3 133334763 2 163 326 282 101 157 89 57 3 133352724 2 2 6 18 21 18 11 9 3 133353395 2 2 6 8 20 36 24 24 GMT 2,0 5,8 13,4 18,5 29,0 37,4 21,5 22,5 STD 0,0 50,0 99,5 84,6 32,1 49,4 24,7 17,0 4 132714272 2 2 6 11 45 54 41 45 4 132724335 2 11 112 97 355 256 300 163 4 132725096 2 2 3 8 41 45 25 24 4 132752597 2 5 32 49 71 45 32 45 4 132863266 3 3 9 7 22 25 24 32 4 133125091 2 12 89 140 202 178 81 162 4 133133383 2 2 3 6 73 108 73 56 4 133133523 2 2 10 19 54 97 128 89 4 133167760 2 2 7 22 45 45 36 36 4 133213152 5 5 6 21 20 25 8 27 GMT 2,3 3,5 12,1 21,5 61,2 65,6 46,9 53,7 STD 1,0 3,8 39,6 45,4 105,7 75,6 86,7 53,2 5 132668226 2 2 3 3 16 21 4 6 5 132675665 2 2 2 3 3 4 2 2 5 132725594 2 2 2 2 3 3 2 2 Tabela 20. Títulos de Neutralização Sérica do Vírus West Nile, estudo da eficácia em eqüi¬ nos Grupo Cavalo no. Dia 0 Dia 7 Dia Dia Dia Dia Dia Dia no. 14 21 28 35 42 49 5 132844457 2 2 3 2 2 6 2 2 5 133126771 2 3 5 6 3 5 3 2 5 133131652 2 2 2 2 2 2 2 2 5 133164716 2 4 5 6 5 7 4 6 5 133223315 2 2 2 3 2 2 2 2 5 133333646 2 18 25 14 8 18 6 6 5 133349224 2 5 8 9 3 6 5 2 GMT 2,0 3,0 3,9 4,0 3,6 5,4 2,9 2,8 STD 0,0 5,0 7,1 3,9 4,4 6,6 1,5 1,9 6 132652471 2 3 6 10 9 16 10 6 6 132722692 2 2 2 3 5 7 10 4 6 132722714 2 2 3 4 10 20 6 3 6 132728113 2 2 2 9 14 22 11 22 6 132735313 2 6 7 11 10 7 6 6 6 132822260 2 3 5 6 6 7 6 4 6 133125493 2 3 5 6 7 9 5 4 6 133126691 2 2 5 10 11 14 10 12 6 133136216 2 2 2 3 4 6 3 3 6 133162564 2 2 2 45 3 6 3 5 GMT 2,0 2,5 3,5 7,5 7,2 10,1 6,4 5,5 STD 0,0 1,3 1,9 12,4 3,5 6,1 3,0 5,9 Tabela 21. Dados da Viremia. estudo da eficácia em eqüinos Viremia (pfu/ml de soro)

Grupo 1 Grupo 2 Grupo 3 Cavalo Cavalo Cavalo Dia pós- estímulo (amfpnt) mmn 1331W514 13321*53! umiafl ímm mim !83M7U 133198647 t8tJ2#í 1 i «ü» i I i i ^r** M 4 <5 4 <5 4 4 4 4 <5 4 4 4 4 4 4 1{am) <s 4 <5 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 1W 4 <6 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 2 (Btn) 50 : ■« ■ : ' 5 ■ r- 70 , - m 4 4 4 4 <5 4 4 4 4 4 m ' .....!43 . 5 5 ' «T " 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 Sfwfl <5 ■ r n- ■ 4 . 40 , λ.---: 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 S 1 ' 5' 2S 10 , ίο ■· m: <| 4 4 4 4 4 4 4 4 4 <1 » <5 25 f' aso 4 4 4 4 <5 4 4 4 4 4 4p} <5 45 4 <5 118 <S 4 4 4 4 4 4 4 4 4 S fam) <5 4 4 <5 5 ’ <s 4 <5 4 4 <5 4 4 4 4 <5 <5 <$ 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 <5 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 S(pml <5 «5 4 4 4 4 <5 4 4 <5 4 4 4 4 4 m 4 <5 4 4 <5 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 <5 <5 4 4 <5 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 Hfiffli 4 * 4 .. 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 Tabela 22. Dados da Temperatura, estudo da eficácia em eauinos Temperatura pós-estímulo

Grupo 1 Grupo 2 Grupo 3 Cavalo Cavalo ..................... Cavalo Dia I3313WM 183«» txsieraa? 1»SS» ia»nni 1J3IU6I7 181®W 13H1SW vítsrm -isbsin'!? IXdUtN 18!1E2f "M IBdH 1122’ mi ■: wr m !di-1 o.» »1# 117 IMS IS! S «13 1C0Í 1(S2 c[»s oia ®u 1121 U 1.5 IÍ3Z5 ti,e HJie toi.r X»4 SMH ms KOB ICCI 1042 I (acm} Sffl-S 1«í 119.» «44 m «HS twe m Wi «16 W3 ms «18 IKM I »2 f ípj 01.0 IM V '"ViteLgK'-"'-: me ms 1314 a»3 . o:*' ffllí 1)10 Bl 12 tOC.2 Mia ISDS I »2 s:r*i soe? 1»S IBB «s "!01JS «02 IMS ÍO.» IttO 1302 1£»1D WXM 1«t 1*9 KN OtQ SB SSlS ■«D SMS ms tose 0.4 3SI T»2 a.a IOOS mo iini ms 8 M 012 ffl» 1BJ2 HB8 «02 iM m ffií* i»S m \m WJfi IttH 1»2 f-ÍPÍ ma MJ su m KKO ms !01» 101.4 391 H»2 m «na 1(0.1 1»3 m mz É>i ifti W AM ÍOP ISÍ 1ΕΗΛ ^iS 1MB «912 1M2 IIOi IOIS asâ Wi 1ΜΪ IftM -M12 es* t»a 1CM· m 1590 IMÍ 1*1 WlU ItCi 1®3 m m !MJ m 10012 ií» i m ÍÓX3 \ΟΛ m IEO ÜW* WS «w 1«.i K,b È-ffB} soas KCJ ms. KMS ma (DiI) 02 1008 m m sea IO> ItCO i»a 6 M ■se® IiSUi Ák m Wi m HW m m mã m HtU I »2 ew m MUI w.* kx» m m f»3 IC?* taaa IXlg í«í IDCC mi ICOJ 18» IMS •w* W*6 mi S9 6 HRi 9i 1CM· 1002 «2:2 mo S.4 Wt IMl «Λ m ÍD02· Sli m IOlD m mis 1133.2 m 1002 1B6 !51D w* IDOjS 1Q5S 6iw) i.eoei Mi ■mo *»1 1W UW S?S IBtfli m M IK »3 t»1 1»! 353 m- Vtt ISIjO SffllS ■81.0 nu Sl6 ΗΒΛ 10?» 1062 tm 1996 9@s MdJ 1008 1«β •m: TO ■ ■181.1 Wi m 101J8 nos SSs IOIF m mt 9BI Wll MJt ItOi IK 2 § Isnti : !«C< ■Mi IEdB ■' «te IGW . , m ■ ma ία» 1930 WA 1098 mi WJ 8 se IKS 111« 1125· ysm k*s . a« IM 3: IBS HÈ1 Wí «JM mo 1090 mt tois ias 111 IfltiJ Ifeff mu ; - «41 . Jt ..:.v . íom 105.1 ic«a m Iiiie »62 MM IBi 1 £í.i 1 '(Wli 1814 ssiJ mu Vic ···" ' taor I0D2 1QL1 βω ma iOGIJ m m HB2 i m ijí| -■ Pl ■'· - m ■ ::í £'·ΛΙϊ*ί í-v ; !·»« 101.1 ICO-CK «H.4 m WD κβι m IH.4 I SI 12 (mi; IÍ52- PJ _ jmj _■;? :·$·'; -·:» λ„ j ·ν. ID.! 1Ó&5 0.8· IOOJ HtO Üf «β.1 WU HDI ΊΜ IMft : ' V!?íV V.: íi' W.S mi 993 »9 1£»2 «M tooo «M K02 iru ISO fôW; m Ettl mi 1092 «03 «Ofl KMC I3MI m Síl-t IOlB mi m *. ■ > ·.. r .. M tttJ IGt*. 1í«2 1« ¥HÜ3 KCS t»s 1DDÍ \m i*-'W i W m mo SMG 101» IM m W7 WW t®3 «03 IDSI Tabela 23. Dados da Avaliação Clínica, estudo da eficácia em eauinos - Parte 1 Cavalo Grupo Dia -1 Dia 0 Dia 1 dia 2 dia 3 dia 4 dia 5 dia 6 132663371 1 BAR BAR BAR BAR BAR BAR BAR BAR 133134514 1 BAR BAR BAR BAR BAR BAR BAR BAR 133218532 1 BAR BAR BAR BAR BAR BAR BAR BAR 132761220 2 BAR BAR BAR BAR BAR BAR BAR BAR 133339624 2 BAR BAR BAR BAR BAR BAR BAR BAR 133167527 3 BAR BAR BAR BAR BAR BAR BAR BAR 133353395 3 BAR BAR BAR BAR BAR BAR BAR BAR 133334763 3 BAR BAR BAR BAR BAR BAR BAR BAR 133169647 3 BAR BAR BAR BAR BAR BAR BAR BAR 133132466 3 BAR BAR BAR BAR BAR BAR BAR BAR 133215467 3 BAR BAR BAR BAR BAR BAR BAR BAR 133352724 3 BAR BAR BAR BAR BAR BAR BAR BAR 132725167 3 BAR BAR BAR BAR BAR BAR BAR Insensível e letárgico 132713454 3 BAR BAR BAR BAR BAR BAR BAR BAR 133216291 3 BAR BAR BAR BAR BAR BAR BAR BAR Tabela 23 - 2a Parte - continuação Cavalo Grupo dia 7 dia 8 dia 9 dia 10 dia 11 dia 12 dia 13 dia 14 132663371 1 BAR BAR BAR BAR BAR BAR BAR BAR am - insensível e lento 133134514 1 BAR BAR BAR pm - muito insensível, Morto Morto Morto Morto fraco eutanizado 133218532 1 BAR BAR BAR BAR depressão BAR BAR BAR branda 132761220 2 BAR BAR BAR Tremores dos lábios, Tremores dos Tremores de lᬠMorto Morto tremores de cabeça, lábios bran¬ bios/cabeça, hiper¬ dos, apetite sensível, reulante grave fraqueza, masti¬ para mover o pesco¬ gação, eutanizado ço, eutanizado 133339624 2 BAR BAR BAR Morto Morto Morto Morto 133167527 3 BAR BAR BAR BAR BAR BAR BAR BAR 133353395 3 BAR BAR BAR BAR BAR BAR BAR BAR 133334763 3 BAR BAR BAR BAR BAR BAR BAR BAR 133169647 3 BAR BAR BAR BAR BAR BAR BAR BAR 133132466 3 hipersensível BAR BAR BAR BAR BAR BAR BAR 133215467 3 BAR BAR BAR BAR BAR BAR BAR BAR 133352724 3 BAR BAR BAR BAR BAR BAR BAR BAR 132725167 3 letárgico BAR BAR BAR BAR BAR BAR BAR 132713454 3 BAR BAR BAR BAR BAR BAR BAR BAR 133216291 3 BAR BAR BAR BAR ligeira hiper- BAR BAR BAR sensibilidade Tabela 24. Achados ao Exame Histológico, estudo da eficácia em eqüinos Cavalo Grupo Eutanizado Dia Achados Histológicos 132663371 1 15 encefalite branda a moderada em ambas as seções 133134514 1 10 encefalite grave em ambas as seções 133218532 1 14 encefalite moderada a grave em ambas as seções 132761220 2 12 encefalite grave em ambas as seções 133339624 2 10 encefalite grave em ambas as seções 133167527 3 17 normal 133353395 3 17 encefalite branda em uma se¬ ção 133334763 3 14 encefalite branda em uma se¬ ção 133169647 3 14 Normal 133132466 3 17 encefalite branda em ambas as seções 133215467 3 14 encefalite branda em ambas as seções 133352724 3 15 encefalite branda em uma se¬ ção 132725167 3 14 normal 132713454 3 17 encefalite branda em uma se¬ ção 133216291 3 15 encefalite moderada em am¬ bas as seções REFERÊNCIAS

Patente dos Estados Unidos n° 5.773.689 Patente dos Estados Unidos n° 5.773.695 Patente dos Estados Unidos n° 6.239.328 5 Patente dos Estados Unidos n° 5.879.903

Patente dos Estados Unidos n° 5.637.489 Patente dos Estados Unidos n° 5.276.268 Patente dos Estados Unidos n° 5.273.894 Patente dos Estados Unidos n° 5.478.925 Patente dos Estados Unidos n° 5.073.627

Patente dos Estados Unidos n° 6.121.424 Patente dos Estados Unidos n° 5.843.464 Patente dos Estados Unidos n° 5.750.352 Patente dos Estados Unidos n° 5.990.275 Patente dos Estados Unidos n° 6.342.362

Patente dos Estados Unidos n° 6.524.825 Patente dos Estados Unidos n° 6.419.931 Patente dos Estados Unidos n° 5.712.170 Patente dos Estados Unidos n° 5.183.740 Patente dos Estados Unidos n° 4.816.567

Patente dos Estados Unidos n° 5.380.831 Patente dos Estados Unidos n° 5.436.391 Patente dos Estados Unidos n° 6.319.691 Patente dos Estados Unidos n° 6.277.375 Patente dos Estados Unidos n° 5.643.570

Patente dos Estados Unidos n° 5.565.335 Patente dos Estados Unidos n° 5.561.071 Patente dos Estados Unidos n° 5.753.439 Patente dos Estados Unidos n° 6.214.545 Patente dos Estados Unidos n° 5.384.253

Patente dos Estados Unidos n° 5.428.147 Publicação do Pedido de Patente dos Estados Unidos n° 2004/0268442 Al

Patente Européia n0 EP 404.097 Publicação de Patente Internacional WO N0 93/11161 Publicação de Patente Internacional WO N0 94/10308 Publicação de Patente Internacional WO N0 94/07902

Publicação de Patente Internacional WO N0 97/27207 Publicação de Patente Internacional WO N0 98/49305 Publicação de Patente Internacional WO N0 91/09957 Altendorf et al. (1999-WWW, 2000) "Structure and Function of the F0 Complex of the ATP Synthase from Escherichia Colf J. of Experimen- tal Biology 203:19-28.

Altschul, S. F. et al. (1990) "Basic Local Alignment Search Tool" J. Mo!. Biol. 215(3):403-410.

Alwine, J. C. et al. (1977) "Method for detection of specific RNAs in agarose gels by transfer to diazobenzyloxymethyl-paper and hybridization with DNA probes" Proc. Natl. Acad. Sei. 74:5350-5354.

An, G. (1985) "High Efficiency Transformation of Cultured To- bacco Cells" Plant Physiol., 79:568-570.

Ausubel, M. et al. (1987) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, New York, NY.

Ausubel, M. et al. (1989) Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y.

Baneyx, F. (1999) "Recombinant Protein Expression in Es- cherichia colF' Biotechnology 10:411-21.

Barker, R. F. et al. (1983) "Nucleotide sequence of the T-DNA

region from the Agrobaeterium tumefaeiens octopine Ti plasmid pTi15955" Plant Molecular Biology 2:335-350.

Beasley, D. W., and A. D. Barrett (2002) "Identification of neutral- izing epitopes within structural domain Ill of the West Nile virus envelope pro- tein" J Virol 76:13097-13100.

Beltz, G. et al. (1983) "Isolation of multigene families and deter- mination of homologies by filter hybridization methods" Methods of Enzymol- ogy, R. Wu1 L. Grossman and K. Moldave [eds.] Academic Press, New York 100:266-285.

Benoist, C., Chambon, P. (1981) "In vivo sequence requirements of the SV40 early promoter region" Nature 290:304-310.

Berchtold, M. W. (1989) "A simple method for direct cloning and

sequencing cDNA by the use of a single specific oligonucleotide and oli- go(dT) in a polymerase chain reaction (PCR)" Nuc. Acids. Res. 17:453.

Bianchi, N. et al. (1997) "Biosensor technology and surface plasmon resonance for real-time detection of HIV-1 genomic sequences am- plified by polymerase chain reaction" Clin. Diagn. Virol. 8(3): 199-208.

Blitvich1 B. J. et al. (2003) "Epitope-blocking enzyme-linked im- munosorbent assays for the detection of serum antibodies to West Nile virus in multiple avian species" J. Clin. Microbiol. 41 (3): 1041-1047.

Bray, M., B. T. Zhao, L. Markoff, K. H. Eckels, R. M. Chanock, and C. J. Lai (1989) "Mice immunized with recombinant vaccinia virus ex- pressing dengue 4 virus structural proteins with or without nonstructural pro- tein NS1 are protected against fatal dengue virus encephalitis" J Virol 63:2853-2856.

Bressanelli1 S., K. Stiasny1 S. L. Allison1 E. A. Stura1 S. Duquer- roy, J. Lescar1 F. X. Heinz, and F. A. Rey (2004) "Structure of a flavivirus en- velope glycoprotein in its low-pH-induced membrane fusion conformation" EmboJ 23:728-738.

Brinster, R. L. et al. (1982) "Regulation of metallothionein- thymidine kinase fusion plasmids injected into mouse eggs" Nature 296:39- 42.

Callis, J. et ai (1995) "Structure and Evolution of Genes Encod- ing Polyubiquitin and Ubiquitin-Like Proteins in Arabidopsis thaliana Ecotype Columbia" Genetics 139(2):921-939.

Cammack, N., and E. A. Gould (1986) "Topographical analysis of epitope relationships on the envelope glycoprotein of yellow fever 17D vac- cine and the wild type Asibi parent virus" Viroiogy 150:333-341.

Capecchi, M. R. (1980) "High efficiency transformation by direct microinjection of DNA into cultured mammalian cells" Cell 22(2):479-488.

Cecilia, D., and E. A. Gould (1991) "Nucleotide changes respon- sible for Ioss of neuroinvasiveness in Japanese encephalitis virus neutraliza- tion-resistant mutants" Virology 181:70-77.

Clackson, T. et al. (1991) "Making Antibody Fragments Using

Phage Display Libraries” Nature 352:624-628.

Clapp1 J. F. (1993) "Somatic gene therapy into hematopoietic cells. Current status and future implications" Clin. Perinatol. 20(1 ):155-168.

Curiel, D. T. et al. (1991) "Adenovirus Enhancement of Transfer- rin-Polylysine-Mediated Gene Delivery" Proc. NatL Acad. Sei. USA 88(19):8850-8854.

Curiel, D. T. et al. (1992) "High-efficiency gene transfer mediated by adenovirus coupled to DNA-polylysine complexes" Hum. Gen. Ther. 3(2): 147-154.

deBoer, Η. A. et al. (1983) "The tac promoter: a functional hybrid derived from the trp and Iac promoters" Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 80(1):21-25.

Doran, P. M. (2000) "Foreign protein produetion in plant tissue cultures" Current Opinions in Biotechnology, 11:199-204.

Eglitis, Μ. A. et al. (1988) "Retroviral-mediated gene transfer into hemopoietic cells" Avd. Exp. Med. Biol. 241:19-27.

Eglitis, M. A., Anderson, W. F. (1988) "Retroviral Vectors for In- troduetion of Genes into Mammalian Cells" Biotechniques 6(7):608-614.

Eihauer, A. et al. (2001) "The FLAG ™ Peptide, a Versatile Fu-

sion Tag for the Purification of Recombinant Proteins" J. Biochem Biophys Methods 49:455-65.

Fischer, R. et al. (1999) "Towards molecular farming in the fu- ture: Pichia pastoris-based produetion of single-chain antibody fragments" Bioteehnol. Appl. Biochem. 30:109-112.

Fraley, R. T. et al. (1985) "The SEV system: A new disarmed Ti plasmid vector system for plant transformation" Biotechnology 3:629-635. Fromm1 M. et al. (1985) "Expression of Genes Transferred into Monocot and Dicot Plant Cells by Electroporation" Proc. Nati Acad. Sei. USA 82(17):5824-5828.

Fynan1 E. F. et al. (1993) "DNA Vaeeines: Proteetive Immuniza- tions by Parenteral1 Mucosal1 and Gene-Gun Inoculations" Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 90(24):11478-11482.

Gao1 G. F., Μ. H. Hussain1 H. W. Reid1 and E. A. Gould (1994) "Identification of naturally occurring monoclonal antibody escape variants of Iouping ill virus" J Gen Virol 75 (Pt 3):609-614.

Gardner1 R. C. et ai (1981) "The complete nucleotide sequence

of an infectious clone of cauliflower mosaic virus by M13mp7 shotgun se- quencing" Nucl. Acids Res. 9(12):2871-2888.

Graham1 F. L., van der Eb1 A. J. (1973) "Transformation of rat cells by DNA of human adenovirus 5" Virology 54(02):536-539.

Gish1 W. et al. (1993) "Identification of protein coding regions by

database similarity search" Nature Genetics 3:266-272.

Guirakhoo1 F., F. X. Heinz, and C. Kunz (1989) "Epitope model of tick-borne encephalitis virus envelope glycoprotein E: analysis of structural properties, role of carbohydrate side chain, and conformational changes oc- curring at acidic pH" Virology 169:90-99.

Hanna, Sheri L1 Theodore C. Pierson1 Melissa D. Sanchez1 Asim A. Ahmed1 Mariam M. Murtadha1 and Robert W. Doms (2005) "N-Linked Gly- cosylation of West Nile Virus Envelope Proteins Influences Particle Assembly and Infectivity" J Virol. 79:13262-13274.

Hasegawa1 H., M. Yoshida1 T. Shiosaka1 S. Fujita1 and Y. Koba-

yashi (1992) "Mutations in the envelope protein of Japanese encephalitis vi- rus affect entry into cultured cells and virulence in mice" Virology 191:158- 165.

Heinz, F., and C. Kunz (1977) "Characterization of tick-borne encephalitis virus and immunogenicity of its surface components in mice" Acta Virol 21:308-316.

Heinz, F. X. (1986) "Epitope mapping of flavivirus glycoproteins" Adv Virus Res 31:103-168.

Heinz, F. X., R. Berger, W. Tuma1 and C. Kunz (1983) "A topo- Iogical and functional model of epitopes on the structural glycoprotein of tick- borne encephalitis virus defined by monoclonal antibodies" Virology 126:525- 537.

Heinz, F. X., and C. Kunz (1982) "Molecular epidemiology of tick- borne encephalitis virus: peptide mapping of Iarge non-structural proteins of European isolates and comparison with other flaviviruses" J Gen Virol 62 (Pt 2):271-285.

Heinz, F. X., C. W. Mandl, H. Holzmann, C. Kunz1 B. A. Harris1 F.

Rey1 and S. C. Harrison (1991) "The flavivirus envelope protein E: isolation of a soluble form from tick-borne encephalitis virus and its crystallization" J Virol 65:5579-5583.

Heinz, F. X., and J. T. Roehrig (1990) Flaviviruses, p. 289-305, Immunochemistry of viruses, vol. II. Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford.

Herrera-Estrella, L. et al. (1983) "Expression of chimaeric genes transferred into plant cells using a Ti-plasmid-derived vector" Nature 303:209-213.

Herrera-Estrella, L. et al. (1984) "Light-inducible and chloroplast- associated expression of a chimaeric gene introduced into Nicotiana ta- bacum using a Ti plasmid vector" Nature 310:115-120.

Higgins, D. G. et al. (1996) "Using CLUSTAL for multiple se- quence alignments" Methods Enzymol. 266:383-402.

Holliger, P. et al. (1993) '"Diabodies': small bivalent and bispecific antibody fragments" Proc. Nati Acad. Sei. USA 90:6444-6448.

Holzmann, H., K. Stiasny, M. Ecker, C. Kunz1 and F. X. Heinz (1997) "Characterization of monoclonal antibody-escape mutants of tick- borne encephalitis virus with reduced neuroinvasiveness in mice" J Gen Virol 78 (Pt 1):31-37.

Holzmann, H., G. Utter, E. Norrby, C. W. Mandl, C. Kunz, and F.

X. Heinz (1993) "Assessment of the antigenic structure of tick-borne en- cephalitis virus by the use of synthetic peptides" J Gen Virol IA (Pt 9):2031- Jan1 L. R., C. S. Yang1 L. S. Henchal, H. Sumiyoshi1 P. L. Sum- mers, D. R. Dubois1 and C. J. Lai (1993) "Increased immunogenicity and pro- tective efficacy in outbred and inbred mice by strategic carboxyl-terminal truncation of Japanese encephalitis virus envelope glycoprotein" Am J Trop Med Hyg 48:412-423.

Jefferson1 R.A. (1987) "Assaying chimeric genes in plants: the GUS fusion system" Plant Mol Biol Rep 5:387-405.

Jiang1 W. R., A. Lowe1 S. Higgs1 H. Reid1 and E. A. Gould (1993) "Single amino acid codon changes detected in Iouping ill virus antibody- resistant mutants with reduced neurovirulence" J Gen Virol 74 (Pt 5):931- 935.

Johnston1 S. A., Tang1 D. C. (1994) "Gene gun transfection of animal cells and genetic immunization" Methods Cell. Bioi 43(A):353-365.

Jones1 C. et ai (1995) "Current Trends in Molecular Recognition and Bioseparation" J. of Chromatography A. 707:3-22.

Jorgensen1 R. A. et al. (1987) T-DNA is organized predominantly in inverted repeat structures in plants transformed with Agrobacterium tume- faciens C58 derivatives" Moi Gen. Genet. 207:471-477.

Kanai R1 Kar K1 Anthony K1 Gould LH1 Ledizet M1 Fikrig E1 Koski RA, Modis Y. (2006) "Crystal structure of West Nile virus envelope glycopro- tein reveals viral surface epitopes" J Virol. Aug 30; [Epub ahead of print]

Keller1 G.H., M.M. Manak (1987) DNA Probes, Stockton Press, NewYork1 NY., pp. 169-170.

Kohler, G. et al. (1975) "Continuous Cultures of Fused Cells Se- creting Antibody of Predefined Specificity" Nature 256(5517):495-497.

Kolaskar, A. S., and U. Kulkarni-Kale (1999) "Prediction of three- dimensional structure and mapping of conformational epitopes of envelope glycoprotein of Japanese encephalitis virus" Virology 261:31-42.

Konishi, E., S. Pincus, E. Paoletti1 R. E. Shope, T. Burrage, and P. W. Mason (1992) "Mice immunized with a subviral particle containing the Japanese encephalitis virus prM/M and E proteins are protected from Iethal JEV infection" Virology 188:714-720.

Kuhn1 R. J., W. Zhang1 M. G. Rossmann1 S. V. Pletnev1 J. Cor- ver, E. Lenches1 C. T. Jones1 S. Mukhopadhyay1 P. R. Chipman1 E. G. S- trauss, T. S. Baker, and J. H. Strauss (2002) "Structure of dengue virus: im- plications for flavivirus organization, maturation, and fusion" Cell 108:717- 725.

Kusterbeck1 A. W. et al. (1990a) "A Continuous Flow Immunoas- say for Rapid and Sensitive Detection of Small Molecules" Journal of Immu- nological Methods 135(1-2):191-197.

Kusterbeck1 A. W. et al. (1990) "Antibody-Based Biosensor for

Continuous Monitoring" In Biosensor Technology. R. P. Buck et al., eds., Marcel Dekker1 N.Y. pp. 345-350.

Lee1 E., and M. Lobigs (2000) "Substitutions at the putative re- ceptor-binding site of an encephalitic flavivirus alter virulence and host cell tropism and reveal a role for glycosaminoglycans in entry" J Virol 74:8867- 8875.

Letchworth1 G. J. and J. A. Appleton (1984) Methods for Produe- tion of Monoclonal Antibodies. USDA Handbook #630.

Ligler1 F. S. et al. (1992) "Drug Detection Using the Flow Im- munosensor" In Biosensor Design and Application. J. Findley et al., eds., American Chemical Society Press, pp. 73-80.

Lin1 B., C. R. Parrish1 J. M. Murray1 and P. J. Wright (1994) "Lo- calization of a neutralizing epitope on the envelope protein of dengue virus type 2" Virology 202:885-890.

Lu, L. et al. (1993) "High efficiency retroviral mediated gene

transduction into single isolated immature and replatable CD34 (3+) hemato- poietic stem/progenitor cells from human umbilical cord blood" J. Exp. Med. 178(6):2089-2096.

Mandl, C. W., F. Guirakhoo, H. Holzmann, F. X. Heinz, and C. Kunz (1989) "Antigenic structure of the flavivirus envelope protein E at the molecular levei, using tick-borne encephalitis virus as a model" J Virol 63:564-571. Maniatis, J.-M. et al. (1982) Molecular Cloning: A Laboratory Ma- nual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York.

Marcotte1 W. R. et al. (1988) "Regulation of a wheat promoter by abscisic acid in rice protoplasts" Nature 335:454-457.

Margolin1 W. (2000) "Green Fluoreseent Protein as a Reporterfor

Macromolecular Loealization in Bacterial Cells" Methods 20:62-72.

Marks1 J. D. et al. (1991) "By-Passing Immunization: Human An- tibodies from V-Gene Libraries Displayed on Phage" J. Mol. Biol. 222(3):581-597.

Mason1 P. W., J. M. Dalrymple1 Μ. K. Gentry1 J. M. MeCown1 C.

H. Hoke1 D. S. Burke1 M. J. Foumier1 and T. L. Mason (1989) "Molecular cha- racterization of a neutralizing domain of the Japanese encephalitis virus s- tructural glycoprotein" J Gen Virol 70 (Pt 8):2037-2049.

Mason1 P. W., S. Pincus1 M. J. Fournier1 T. L. Mason1 R. E. Sho- pe, and E. Paoletti (1991) "Japanese encephalitis virus-vaccinia recombi- nants produce particulate forms of the structural membrane proteins and in- duce high leveis of protection against Iethal JEV infection" Virology 180:294- 305.

Melton1 D. A. et al. (1984) "Efficient In Vitro Synthesis of Biologi- cally Active RNA and RNA Hybridization Probes From Plasmids Containing a Bacteriophage SP6 Promoter" Nuc. Acids Res. 12:7035-7036.

Men1 R. H., M. Bray1 and C. J. Lai (1991) "Carboxy-terminally truncated dengue virus envelope glycoproteins expressed on the cell surface and secreted extracellularly exhibit increased immunogenicity in mice" J Virol 65:1400-1407.

Modis1 Y., Ogata1 S., Clements1 D., Harrison1 S. C. (2004) "Struc- ture of the dengue virus envelope protein after membrane fusion" Nature 427:313-319.

Morrison1 S. L. et al. (1984) "Chimeric Human Antibody Mole- cules: Mouse Antigen-Binding Domains with Human Constant Region Do- mains" Proc. NatL Acad. Sei. USA 81:6851-6855.

Mukhopadhyay, S., B. S. Kim1 P. R. Chipman1 M. G. Rossmann, and R. J. Kuhn (2003) "Structure of West Nile virus" Science 302:248.

Murai et al. (1982) "T-DNA of pTi-15955 from Agrobacterium tu- mefaciens is transcribed into a minimum of seven polyadenylated RNAs in a sunflower crown gall tumor" Nucleic Acids Res. 10(5):1679-1689.

Murray1 E. E. et al. (1989) "Codon usage in plant genes" Nucleic

Aeids Res. 17(2):477-498.

Norris1 S. R. et al. (1993) "The intron of Arabidopsis thaliana pol- yubiquitin genes is conserved in Iocation and is a quantitative determinant of chimeric gene expression" Plant Mol. Biol. 21(5):895-906.

Nowak1 T., and G. Wengler (1987) "Analysis of disulfides present

in the membrane proteins of the West Nile flavivirus" Virology 156:127-137.

Ogert1 R. A. et ai (1992) "Detection of Cocaine Using the Flow Immunosensor" Analytieal Letters 25:1999-2019.

Pearson1 W. R. et al. (1988) "Improved Tools for Biological Se- quence Comparison" Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85(8):2444-2448.

Pietu1 G. et al. (1996) "Novel gene transcripts preferentially ex- pressed in human muscles revealed by quantitative hybridization of a high density eDNA array" Genome Research 6(6):492-503.

Pineus1 S., P. W. Mason1 E. Konishi1 B. A. Fonseca, R. E. Shope1 C. M. Rice1 and E. Paoletti (1992) "Recombinant vaccinia virus producing the prM and E proteins of yellow fever virus protects mice from Iethal yellow fever encephalitis" Virology 187:290-297.

Pluckthun1 A. (1994) In The Pharmacoloqy of Monoclonal Anti- bodies. Vol. 113:269-315, Rosenburg and Moore eds. Springer-Verlag1 New York.

Potrykus1 I. et al. (1985) "Direct gene transfer to cells of a grami- naceous monocot" Mol. Gen. Genet. 199:183-188.

Puig, O. et al. (2001) "The Tandem Affinity Purification (TAP) Method: A General Procedure of Protein Complex Purification" Methods 24:218-29.

Rey1 F. A., F. X. Heinz, C. Mandl1 C. Kunz1 and S. C. Harrison (1995) "The envelope glycoprotein from tick-borne encephalitis virus at 2 A resolution" Nature 375:291-298.

Roehrig, J. T., J. H. Mathews, and D. W. Trent (1983) "Identifica- tion of epitopes on the E glycoprotein of Saint Louis encephalitis virus using monoclonal antibodies" Virology 128:118-126.

Roehrig, J. T. (1986) The use of monoclonal antibodies in studies

of the structural proteins of togaviruses and flaviviruses, p. 251-278. In S. Schlesinger and M. J. Schlesinger (ed.), The Togaviridae and Flaviviridae. Plenum Press, New York.

Roehrig, J. T., A. R. Hunt, A. J. Johnson, and R. A. Hawkes (1989) "Synthetic peptides derived from the deduced amino acid sequence of the E-glycoprotein of Murray Valley encephalitis virus elicit antiviral antibody" Virology 171:49-60.

Rogers, S. G. et al. (1987) "Improved Vector for plant transforma- tion: expression cassette vectors and new selectable markers" Meth. in En- zymol. 153:253-277.

Sambrook, J. et al. (1989) Molecular Cloning, A Laboratory Man- ual, Second Edition, Cold Spring Harbor Press, N.Y., pp. 9.47-9.57.

Sanchez, M. D., T. C. Pierson, D. McAIIister, S. L. Hanna, B. A. Puffer, L. E. Valentine, Μ. M. Murtadha, J. A. Hoxie, and R. W. Doms (2005) "Characterization of neutralizing antibodies to West Nile virus" Virology 336:70-82.

Sassenfeld, Η. M. (1990) "Engineering Proteins for Purification" TibTech 8:88-93.

Schena, M. et al. (1995) "Quantitative Monitoring of Gene Ex- pression Patterns With a Complementary DNA Microarray" Science 270:467- 470.

Schena, M. et al. (1996a) "Parallel human genome analysis: mi- croarray-based expression monitoring of 1000 genes" Proc. NatL Acad. Sei. U.S.A. 93(20):10614-10619.

Schena, M. (1996b) "Genome analysis with gene expression mi-

croarrays" BioEssays 18(5):427-431.

Schlesinger, J. J., J. R. Putnak1 and Κ. H. Eckels (1992) "New approaches to flavivirus vaccine development" Biotechnology 20:289-307.

Sheibani, N. (1999) "Prokaryotic Gene Fusion Expression Sys- tems and Their Use in Structural and Functional Studies of Proteins" Prep. Biochem. & Biotechnoi 29(1):77-90.

Skerra, A. et ai (1999) "Applications of a Peptide Ligand for S-

treptavidin: the Strep-tag" Biomolecular Engineering 16:79-86.

Smith1 C. (1998) "Cookbook for Eukaryotic Protein Expression: Yeast, Inseet1 and Plant Expression Systems" The Seientist 12(22):20.

Smith1 G. L. and B. Moss (1984) "Vaccinia Virus expression Vec- tors: Construction1 Properties1 and applications" Bio Teehniques Nov/Dec:306-312.

Smyth1 G. K. et al. (2000) "Eukaryotie Expression and Purifica- tion of Reeombinant Extracellular Matrix Proteins Carrying the Strep Il Tag" Methods in Molecular Biology 139:49-57.

Spielmann, A. et al. (1986) "T-DNA structure in transgenic to-

bacco plants with multiple independent integration sites" Mol. Gen. Genet. 205:34-41.

Stiasny1 K., S. L. Allison1 A. Marchler-Bauer1 C. Kunz1 and F. X. Heinz (1996) "Structural requirements for low-pH-induced rearrangements in the envelope glycoprotein of tick-borne encephalitis virus" J Virol 70:8142- 8147.

Suggs1 S. V. et al. (1981) ICN-UCLA Symp. Dev. Bioi Using Pu- rified Genes, D.D. Brown [ed.], Academic Press, New York, 23:683-693.

Sun C.-W. et al. (1997) "Independent modulation of Iarabidopsis thaliana polyubiquitin mRNAs in different organs and in response to environ- mental changes" Plant J. 11(5):1017-1027.

Sutter, G. et al. (1994) "A recombinant vector derived from the host range-restricted and highly attenuated MVA strain of vaccinia virus sti- mulates protective immunity in mice to influenza virus" Vaeeine 12(11):1032- 1040.

Sutter, G., Moss, B. (1992) "Nonreplicating Vaccinia Vector Effi- ciently Expresses Recombinant Genes" Proc. Nat'1. Acad. Sci U.S.A. 89:10847-10851.

Thompson, J. et al. (1994) "Clustal-W: improving the sensitivity of Progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, posi- tion specific gap penalties and weight matrix choice" Nucleic Aeids Res.

22(2):4673-4680.

Unger, T. F. (1997) "Show Me the Money: Prokaryotic Expres- sion Veetors and Purifieation Systems" The Seientist 11(17):20.

Villa-Kamaroff, L. et al. (1978) "A bacterial clone synthesizing proinsulin" Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 75(8):3727-3731.

Wagner, M. J. et al. (1981) "Nucleotide sequence of the thymidi-

ne kinase gene of herpes simplex virus type 1" Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 78(3):1441-1445.

Wagner, E. et al. (1992) "Coupling of Adenovirus to Transferrin- Polylysine/DNA Complexes Greatly Enhances Receptor-Mediated Gene De- Iivery and Expression of Transfected Genes" Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89(13):6099-6103.

Wei, C. F. et al. (1983) "Isolation and comparison of two molecu- lar species of the BAL 31 nuclease from Alteromonas espejiana with distinct kinetic properties" J. Biol. Chem. 258:13506-13512.

Wengler, G., and G. Wengler (1989) "An analysis of the antibody

response against West Nile virus E protein purified by SDS-PAGE indicates that this protein does not contain sequential epitopes for efficient induetion of neutralizing antibodies" J Gen Virol 70 (Pt 4):987-992.

Winkler, G., F. X. Heinz, and C. Kunz (1987) "Characterization of a disulphide bridge-stabilized antigenic domain of tick-borne encephalitis vi- rus structural glycoprotein" J Gen Virol 68 (Pt 8):2239-2244.

Wong, T. K., Neumann, E. (1982) Electric field mediated gene transfer" Biochim. Biophys. Res. Commun., 107(2):584-587.

Yamamoto, T. et al. (1980) "Identification of a functional promoter in the Iong terminal repeat of Rous sarcoma virus" Cell 22(3):787-797.

Zapata, G. et al. (1995) "Engineering linear F(ab')2 fragments for efficient produetion in Escherichia coli and enhanced antiproliferative activity" Protein Eng. 8(10):1057-1062.

Zatloukal, K. et al. (1992) "Transferrinfection: a highly efficient way to express gene constructs in eukaryotic cells" Ann. N.Y. Acad. Sei. 660:136-153. LISTAGEM DE SEQÜÊNCIAS <110> Smith, Kelley

Mihaliak, Charles A.

Webb, Steven Robert Merlo, Donald J.

Evans, Steven L.

Letchworth, Geoffrey J. <120> Vacinas de Virus West Nile

e Seqüências Optimizadas de DAS-I39X US 60/871.518 22/12/2006 15

PatentIn versão 3.3 1

2004 DNA

virus West Nile

(WNV) Produzidas por Plantas, Códons de Plantas

<130>

<150>

<151>

<160>

<17 0>

<2io>

<211>

<212>

<213>

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(2004)

<4 00> 1

gtt acc ctc tct aac ttc caa ggg aag gtg Val Thr Leu Ser Asn Phe Gln Gly Lys Val

1 5 10

act gac gtc aca gat gtc ate acg att cca Thr Asp Val Thr Asp Val He Thr He Pro 20 25

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145

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aag gcc aca agg Lys Ala Thr Arg

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aac acc atg cag Asn Thr Met Gln 150

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gaa gga gtg tet Glu Gly Val Ser 180

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atg atg aat atg Met Met Asn Met 215

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tea gea gtc tac gtc Ser Ala Val Tyr Val 75

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gga gea aca tgg gtg Gly Ala Thr Trp Val 185

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Asp Pro Glu Asp

agg tat gga aga Arg Tyr Gly Arg 80

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240

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576

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tgc ccg acc atg gga gaa gct cac aat gac aaa cgt gct gac cca gct Cys Pro Thr Met Gly Glu Ala His Asn Asp Lys Arg Ala Asp Pro Ala

245 250 255

ttt gtg tgc aga caa gga gtg gtg gac agg ggc tgg ggc aac ggc tgc Phe Val Cys Arg Gln Gly Val Val Asp Arg Gly Trp Gly Asn Gly Cys 260 265 270

gga cta ttt ggc aaa gga age att gac aca tgc gcc aaa ttt gcc tgc Gly Leu Phe Gly Lys Gly Ser Ile Asp Thr Cys Ala Lys Phe Ala Cys 275 280 285

tet acc aag gea ata gga aga acc atc ttg aaa gag aat atc aag tac Ser Thr Lys Ala Ile Gly Arg Thr Ile Leu Lys Glu Asn Ile Lys Tyr 290 295 300

gaa gtg gcc att ttt gtc cat gga cca act act gtg gag tcg cac gga Glu Val Ala Ile Phe Val His Gly Pro Thr Thr Val Glu Ser His Gly 305 310 315 320

aac tac tcc aca cag gtt gga gcc act cag gea ggg aga ttc age atc Asn Tyr Ser Thr Gln Val Gly Ala Thr Gln Ala Gly Arg Phe Ser Ile

325 330 335

act cct gcg gcg cct tea tac aca cta aag ctt gga gaa tat gga gag Thr Pro Ala Ala Pro Ser Tyr Thr Leu Lys Leu Gly Glu Tyr Gly Glu 340 345 350

gtg aca gtg gac tgt gaa cca cgg tea ggg att gac acc aat gea tac Val Thr Val Asp Cys Glu Pro Arg Ser Gly Ile Asp Thr Asn Ala Tyr 355 360 365

tac gtg atg act gtt gga aca aag acg ttc ttg gtc cat cgt gag tgg Tyr Val Met Thr Val Gly Thr Lys Thr Phe Leu Val His Arg Glu Trp 370 375 380

ttc atg gac ctc aac ctc cct tgg age agt gct gga agt act gtg tgg Phe Met Asp Leu Asn Leu Pro Trp Ser Ser Ala Gly Ser Thr Val Trp

720

7 68

816

864

912

960

1008

1056

1104

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660 665 <210> 6 <211> 1728 <212> DNA <213> vírus West Nile <4 00> 6 tccctgacag tgcaaactca tggagagtca actttggcca acaagaaagg cgcatggatg 60 gattctacca aagcaacaag atatcttgtc aaaactgagt catggattct taggaatcct 120 ggatatgctt tagttgcagc tgtcattgga tggatgcttg ggtccaatac catgcagaga 180 gttgtcttcg tagttctgtt gttacttgta gctccagctt actcattcaa ctgtcttgga 240 atgagcaata gggatttcct tgaaggtgtt tccggtgcaa catgggttga tcttgtctta 300 gaaggagatt catgtgtgac aatcatgtcc aaagacaagc caaccattga tgtcaagatg 360 atgaacatgg aagctgccaa tcttgcagaa gttaggtctt actgctatct ggcaacagtg 420 agtgatttgt caacaaaagc tgcctgtccc acaatgggag aggctcacaa tgacaaacgt 480 gctgatcctg catttgtatg cagacaagga gttgtagaca gaggttgggg aaatggttgt 540 ggtctctttg gcaaaggcag cattgacact tgtgcaaagt ttgcttgcag caccaaagca 600 attggtcgaa ccatattgaa agagaacatt aagtatgaag ttgccatctt tgttcatggt 660 ccaacaactg tggaatctca tggcaattac agcacacaag ttggtgccac ccaagctggg 720 aggttttcaa tcactcctgc tgctccaagt tacactctga aattgggtga atatggtgaa 780 gtaacagttg attgtgaacc taggtctggc attgacacca atgcttacta tgtaatgact 840 gtgggaacaa agacattctt agttcacaga gaatggttca tggatttgaa tctcccttgg 900 agttctgctg gaagcactgt ttggaggaat cgtgaaacat tgatggagtt tgaggaacca 960 catgcaacaa aacagtcagt aatagcattg ggcagtcaag agggagcatt acatcaagcc 1020 ttggctgggg caattcctgt tgagtttagt tccaacactg tgaaactgac aagtggtcat 1080 ctgaaatgca gagtaaagat ggagaagtta cagttgaaag gaaccactta tggtgtttgt 1140 tccaaagcct tcaagtttct tggaactcct gctgacactg gtcatgggac tgtggttttg 1200 gaattgcagt acactggcac tgatggtcca tgcaaggttc ccataagcag tgttgcttca 1260 ctcaatgatc tcactccagt aggcagactt gtgacagtca acccctttgt ttctgttgca 1320 actgccaatg caaaggtgct catagaattg gagcctccat ttggtgattc ttacattgtt 1380 gtaggcagag gagagcaaca gatcaaccat cactggcaca aatctggttc ttcaattggc 1440 aaagccttca caaccactct caaaggggca cagagacttg ctgctttagg agacactgca 1500 tgggatttcg gatctgttgg aggtgttttc acctctgtgg gaaaggctgt gcatcaagtt 1560 tttggtgggg cttttcgatc cttgtttggt ggaatgtctt ggataactca aggtctttta 1620 ggggctctgc ttttgtggat gggcatcaat gcaagggaca gatcaattgc cttaaccttc 1680 cttgcagttg gaggtgttct tctctttctc tctgtaaatg ttcatgct 1728 <210> 7 <211> 1728 <212> DNA <213> vírus West Nile <400> 7 agcttaactg tccagacaca cggtgaatcc acacttgcta acaagaaagg tgcttggatg 60 gacagcacta aagcaactag atacttggtc aagacagaat cttggatctt acgtaatcct 120 ggttacgcac ttgtagccgc agtcataggt tggatgttgg gcagtaacac tatgcaacgt 180 gtagtgtttg ttgtacttct tctcttggtt gcacctgcat attccttcaa ttgcttgggg 240 atgtccaaca gagatttcct ggaaggagta agtggagcaa cttgggtcga tttggttctt 300 gaqggtgatt cttgtgtcac cattatgagt aaagacaaac ccacaataga tgtgaaaatg 360 atgaatatgg aggccgctaa cttggcagaa gtccgtagct attgttactt agctactgtt 420 tcagaccttt ctactaaagc cgcttgccca actatgggtg aagcacacaa tgataagagg 480 gcagaccctg cttttgtttg tcgtcaaggt gtagttgata ggggatgggg aaatggctgt 540 ggactgtttg ggaagggttc tatagatact tgcgctaagt tcgcatgttc aacaaaagct 600 ataggacgaa caattctcaa ggaaaacatc aagtatgagg tcgcaatctt cgtacatgga 660 cccactacag tcgaaagcca cgggaactat tccactcaag taggagcaac acaagctgga 720 agattcagca ttacaccagc cgctccttca tacacattga aacttggtga gtacggtgag 780 gtcactgttg attgcgagcc aagaagtgga atagatacaa atgcctatta cgttatgaca 840 gttggcacta agacttttct tgttcatagg gagtggttca tggacttgaa tctgccctgg 900 tccagtgctg gctctacagt ttggagaaac agagaaactc tcatggaatt tgaagagcct 960 catgctacta agcaatcagt tattgctctt gggtcccaag aaggtgctct ccatcaggct 1020 ttagctggtg ctattccagt tgagttttcc agcaatactg ttaagttgac ttctggccat 1080 ttgaagtgta gggtgaagat ggagaaactc caacttaaag ggacaaccta tggagtttgc 1140 tctaaggctt tcaagttctt gggcacacca gcagataccg gacatggaac agttgtactt 1200 gaacttcagt atactgggac cgatggacct tgtaaagtgc caatttcttc agttgcctct 1260 ctcaatgact taactcctgt tgggaggtta gttaccgtga atccatttgt gagtgtagct 1320 accgcaaatg ctaaagttct cattgagctt gaaccacctt ttggcgattc ctacatagtg 1380 gttggaaggg gtgaacagca aatcaatcac cattggcata agagtggctc ttcaatcgga 1440 aaggccttta ccacaaccct gaaaggtgct caacgtttag ccgcactcgg tgataccgct 1500 tgggactttg gttcagtggg tggtgtgttt acatcagttg gcaaagcagt gcatcaggtg 1560 tttggaggag cctttagaag tcttttcgga gggatgtcat ggattaccca aggtttgctt 1620 ggagccttgt tactttggat ggggatcaac gctagagatc gatctattgc actgactttt 1680 ctggctgtgg gtggcgtgtt gctgttctta tcagtgaatg tacacgct 1728 <210> 8

<211> 2106

<212> DNA

<213> vírus West Nile <220>

<221> CDS

<222> (1) .. (2082)

<4 00> 8

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576

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1104

1152

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1248

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1392

1440

1488

1536

1584 Leu Glu Leu 515

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1680

1728

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Lys Glu Asn Ile Lys Tyr Glu Val Ala Ile Phe Val His Gly Pro Thr 325 330 335

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1344

1392

1440 Ser Asn Thr Val Lys Leu Thr Ser Gly His Leu Lys Cys Arg Val Lys 465 470 475 480

atg gag aag tta cag ttg aaa gga acc act tat ggt gtt tgt tcc aaa Met Glu Lys Leu Gln Leu Lys Gly Thr Thr Tyr Gly Val Cys Ser Lys 5 485 490 495

gcc ttc aag ttt ctt gga act cct gct gac act ggt cat ggg act gtg Ala Phe Lys Phe Leu Gly Thr Pro Ala Asp Thr Gly His Gly Thr Val 500 505 510

gtt ttg gaa ttg cag tac act ggc act gat ggt cca tgc aag gtt ccc Val Leu Glu Leu Gln Tyr Thr Gly Thr Asp Gly Pro Cys Lys Val Pro 515 520 525

ata age agt gtt gct tca ctc aat gat ctc act cca gta ggc aga ctt Ile Ser Ser Val Ala Ser Leu Asn Asp Leu Thr Pro Val Gly Arg Leu 530 535 540

gtg aca gtc aac ccc ttt gtt tct gtt gea act gcc aat gea aag gtg Val Thr Val Asn Pro Phe Val Ser Val Ala Thr Ala Asn Ala Lys Val 545 550 555 560

ctc ata gaa ttg gag cct cca ttt ggt gat tct tac att gtt gta ggc Leu Ile Glu Leu Glu Pro Pro Phe Gly Asp Ser Tyr Ile Val Val Gly 565 570 575

aga gga gag caa cag atc aac cat cac tgg cac aaa tct ggt tct tca Arg Gly Glu Gln Gln Ile Asn His His Trp His Lys Ser Gly Ser Ser 580 585 590

att ggc aaa gcc ttc aca acc act ctc aaa ggg gea cag aga ctt gct Ile Gly Lys Ala Phe Thr Thr Thr Leu Lys Gly Ala Gln Arg Leu Ala 595 600 605

gct tta gga gac act gea tgg gat ttc gga tct gtt gga ggt gtt ttc Ala Leu Gly Asp Thr Ala Trp Asp Phe Gly Ser Val Gly Gly Val Phe 610 615 620

acc tct gtg gga aag gct gtg cat caa gtt ttt ggt ggg gct ttt cga Thr Ser Val Gly Lys Ala Val His Gln Val Phe Gly Gly Ala Phe Arg 625 630 635 640

1488

1536

1584

1632

1680

1728

1776

1824

1872

1920 tcc ttg ttt ggt gga atg tct tgg ata act caa ggt ctt tta ggg gct Ser Leu Phe Gly Gly Met Ser Trp Ile Thr Gln Gly Leu Leu Gly Ala 645 650 655

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<210> 11 <211> 694

<212> PRT

<213> vírus West Nile

<4 00> 11

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Ala Ser Ala Ser Ala Ser Val Thr Leu Ser Asn Phe Gln Gly Lys Val 20 25 30

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Arg Arg Ser Leu Thr Val Gln Thr His Gly Glu Ser Thr Leu Ala Asn

1968

2016

2064

2106 115 120 125

Lys Lys Gly Ala Trp Met Asp Ser Thr Lys Ala Thr Arg Tyr Leu 130 135 140

Lys Thr Glu Ser Trp Ile Leu Arg Asn Pro Gly Tyr Ala Leu Val 145 150 155

Ala Val Ile Gly Trp Met Leu Gly Ser Asn Thr Met Gln Arg Val 165 170 175

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Val

Ala

160

Val

Cys

Thr

Ser

Ala

240

Asp

Asp

Arg

Thr

Leu

320

Thr

Gln

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Gly 370 375 380

Ile Asp Thr Asn Ala Tyr Tyr Val Met Thr Val Gly Thr Lys Thr Phe 385 390 395 400

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675

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680

685

12

1830

DNA

vírus West Nile

<210>

<211>

<212>

<213>

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(1806)

<4 00> 12

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acc atg Thr Met 80

96

144

192

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aca atc atg Thr Ile Met 130 atg gaa gct Met Glu Ala

145

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gct cac aat Ala His Asn

gtt gta gac Val Val Asp 195

age att gac Ser Ile Asp 210 cga acc ata Arg Thr Ile

225

cat ggt cca His Gly Pro

gtc ttc gta gtt Val Phe Val Val 85

tgt ctt gga atg Cys Leu Gly Met 100

aca tgg gtt gat Thr Trp Val Asp

tcc aaa gac aag Ser Lys Asp Lys 135

gcc aat ctt gea Ala Asn Leu Ala 150

gat ttg tca aca Asp Leu Ser Thr 165

gac aaa cgt gct Asp Lys Arg Ala 180

aga ggt tgg gga Arg Gly Trp Gly

act tgt gea aag Thr Cys Ala Lys 215

ttg aaa gag aac Leu Lys Glu Asn 230

aca act gtg gaa Thr Thr Val Glu

ctg ttg tta ctt Leu Leu Leu Leu 90

age aat agg gat Ser Asn Arg Asp 105

ctt gtc tta gaa Leu Val Leu Glu 120

cca acc att gat Pro Thr Ile Asp

gaa gtt agg tct Glu Val Arg Ser 155

aaa gct gcc tgt Lys Ala Ala Cys 170

gat cct gea ttt Asp Pro Ala Phe 185

aat ggt tgt ggt Asn Gly Cys Gly 200

ttt gct tgc age Phe Ala Cys Ser

att aag tat gaa Ile Lys Tyr Glu 235

tct cat ggc aat Ser His Gly Asn

gta gct cca gct tac Val Ala Pro Ala Tyr 95

ttc ctt gaa ggt gtt Phe Leu Glu Gly Val 110

gga gat tca tgt gtg Gly Asp Ser Cys Val 125

gtc aag atg atg aac Val Lys Met Met Asn 140

tac tgc tat ctg gea Tyr Cys Tyr Leu Ala 160

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gta tgc aga caa gga Val Cys Arg Gln Gly 190

ctc ttt ggc aaa ggc Leu Phe Gly Lys Gly 205

acc aaa gea att ggt Thr Lys Ala Ile Gly 220

gtt gcc atc ttt gtt Val Ala Ile Phe Val 240

tac age aca caa gtt Tyr Ser Thr Gln Val

288

336

384

432

480

528

576

624

672

720

768 ggt gcc Gly Ala

tac act Tyr Thr

cct agg Pro Arg

290

aca aag Thr Lys 305

cct tgg Pro Trp

atg gag Met Glu

ggc agt Gly Ser

gtt gag Val Glu 370

tgc aga

Cys Arg 385

gtt tgt

Val Cys

cat ggg

245

acc caa gct Thr Gln Ala 260 ctg aaa ttg Leu Lys Leu 275

tct ggc att Ser Gly Ile

aca ttc tta Thr Phe Leu

agt tct gct Ser Ser Ala 325

ttt gag gaa Phe Glu Glu 340 caa gag gga Gln Glu Gly 355

ttt agt tcc Phe Ser Ser

gta aag atg Val Lys Met

tcc aaa gcc Ser Lys Ala 405

act gtg gtt

ggg agg ttt tca Gly Arg Phe Ser 265

ggt gaa tat ggt Gly Glu Tyr Gly 280

gac acc aat gct Asp Thr Asn Ala 295

gtt cac aga gaa Val His Arg Glu 310

gga age act gtt Gly Ser Thr Val

cca cat gea aca Pro His Ala Thr 345

gea tta cat caa Ala Leu His Gln 360

aac act gtg aaa Asn Thr Val Lys 375

gag aag tta cag Glu Lys Leu Gln 390

ttc aag ttt ctt Phe Lys Phe Leu

ttq gaa ttg cag

250

atc act cct Ile Thr Pro

gaa gta aca Glu Val Thr

tac tat gta Tyr Tyr Val 300

tgg ttc atg Trp Phe Met 315 tgg agg aat Trp Arg Asn 330

aaa cag tca Lys Gln Ser

gcc ttg gct Ala Leu Ala

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ttg aaa gga Leu Lys Gly 395 gga act cct Gly Thr Pro 410

tac act ggc

255

gct gct cca agt

Ala Ala Pro Ser 270

gtt gat tgt gaa

Val Asp Cys Glu 285

atg act gtg gga

Met Thr Val Gly

gat ttg aat ctc

Asp Leu Asn Leu 320

cgt gaa aca ttg

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gta ata gea ttg

Val Ile Ala Leu 350

ggg gea att cct

Gly Ala Ile Pro 365

ggt cat ctg aaa

Gly His Leu Lys

acc act tat ggt Thr Thr Tyr Gly 400

gct gac act ggt Ala Asp Thr Gly 415

act gat ggt cca

816

864

912

960

1008

1056

1104

1152

1200

1248

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420 425 430

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465 470 475 480

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485 490 495

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1344

1392

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1488

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1584

1632

1680

1728

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<210> 13

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<213> virus West Nile

<4 00> 13

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165 170 175

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1826

1830 180 185 190

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210 215 220

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<210> 14

<211> 1832

<212> DNA

<213> virus West Nile

<220> <221> <222> <4 00>

CDS (6)..(1808)

14

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146

194

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290

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674

722

770

818

866

914

962

1010

1058

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Ala Gly Ala Ile Pro 365

tct ggc cat ttg aag Ser Gly His Leu Lys 380

ggg aca acc tat gga Gly Thr Thr Tyr Gly 395

cca gea gat acc gga Pro Ala Asp Thr Gly 415

ggg acc gat gga cct Gly Thr Asp Gly Pro 430

aat gac tta act cct Asn Asp Leu Thr Pro 445

agt gta gct acc gea Ser Val Ala Thr Ala 460

ttt ggc gat tcc tac Phe Gly Asp Ser Tyr 475

cac cat tgg cat aag His His Trp His Lys 495

acc ctg aaa ggt gct Thr Leu Lys Gly Ala 510

gac ttt ggt tca gtg Asp Phe Gly Ser Val 525

1154

1202

1250

1298

1346

1394

1442

1490

1538

1586 ggt ggt gtg ttt aca tca gtt ggc aaa gea gtg cat cag gtg ttt gga Gly Gly Val Phe Thr Ser Val Gly Lys Ala Val His Gln Val Phe Gly 530 535 540

gga gcc ttt aga agt ctt ttc gga ggg atg tca tgg att acc caa ggt Gly Ala Phe Arg Ser Leu Phe Gly Gly Met Ser Trp Ile Thr Gln Gly 545 550 555

ttg ctt gga gcc ttg tta ctt tgg atg ggg atc aac gct aga gat cga Leu Leu Gly Ala Leu Leu Leu Trp Met Gly Ile Asn Ala Arg Asp Arg 560 565 570 575

tct att gea ctg act ttt ctg gct gtg ggt ggc gtg ttg ctg ttc tta Ser Ile Ala Leu Thr Phe Leu Ala Val Gly Gly Val Leu Leu Phe Leu 580 585 590

tca gtg aat gta cac gct aag gat gaa ctg tgagtagtta gcttaatcac Ser Val Asn Val His Ala Lys Asp Glu Leu

595 600

ctag

<210> 15

<211> 601

<212> PRT

<213> vírus West Nile

<4 00> 15

Met Ala Lys Met Val Ile Val Leu Val Val Cys Leu Ala Leu Ser Ala

10 15

Ala Ser Ala Ser Ala Ser Leu Thr Val Gln Thr His Gly Glu Ser Thr

20 25 30

Leu Ala Asn Lys Lys Gly Ala Trp Met Asp Ser Thr Lys Ala Thr Arg

40 45

Tyr Leu Val Lys Thr Glu Ser Trp Ile Leu Arg Asn Pro Gly Tyr Ala 50 55 60

Leu Val Ala Ala Val Ile Gly Trp Met Leu Gly Ser Asn Thr Met Gln 65 70 75 80

Arg Val Val Phe Val Val Leu Leu Leu Leu Val Ala Pro Ala Tyr Ser

1634

1682

1730

1778

1828

1832 85 90 95

Phe Asn Cys Leu Gly Met Ser Asn Arg Asp Phe Leu Glu Gly Val Ser 100 105 110

Gly Ala Thr Trp Val Asp Leu Val Leu Glu Gly Asp Ser Cys Val Thr 115 120 125

Ile Met Ser Lys Asp Lys Pro Thr Ile Asp Val Lys Met Met Asn Met 130 135 140

Glu Ala Ala Asn Leu Ala Glu Val Arg Ser Tyr Cys Tyr Leu Ala Thr 145 150 155 160

Val Ser Asp Leu Ser Thr Lys Ala Ala Cys Pro Thr Met Gly Glu Ala

165 170 175

His Asn Asp Lys Arg Ala Asp Pro Ala Phe Val Cys Arg Gln Gly Val 180 185 190

Val Asp Arg Gly Trp Gly Asn Gly Cys Gly Leu Phe Gly Lys Gly Ser 195 200 205

Ile Asp Thr Cys Ala Lys Phe Ala Cys Ser Thr Lys Ala Ile Gly Arg 210 215 220

Thr Ile Leu Lys Glu Asn Ile Lys Tyr Glu Val Ala Ile Phe Val His 225 230 235 240

Gly Pro Thr Thr Val Glu Ser His Gly Asn Tyr Ser Thr Gln Val Gly

245 250 255

Ala Thr Gln Ala Gly Arg Phe Ser Ile Thr Pro Ala Ala Pro Ser Tyr 260 265 270

Thr Leu Lys Leu Gly Glu Tyr Gly Glu Val Thr Val Asp Cys Glu Pro 275 280 285

Arg Ser Gly Ile Asp Thr Asn Ala Tyr Tyr Val Met Thr Val Gly Thr 290 295 300

Lys Thr Phe Leu Val His Arg Glu Trp Phe Met Asp Leu Asn Leu Pro 305 310 315 320

Trp Ser Ser Ala Gly Ser Thr Val Trp Arg Asn Arg Glu Thr Leu Met

325 330 335

Glu Phe Glu Glu Pro His Ala Thr Lys Gln Ser Val Ile Ala Leu Gly 340 345 350

Ser Gln Glu Gly Ala Leu His Gln Ala Leu Ala Gly Ala Ile Pro Val 355 360 365

Glu Phe Ser Ser Asn Thr Val Lys Leu Thr Ser Gly His Leu Lys Cys 370 375 380

Arg Val Lys Met Glu Lys Leu Gln Leu Lys Gly Thr Thr Tyr Gly Val 385 390 395 400

Cys Ser Lys Ala Phe Lys Phe Leu Gly Thr Pro Ala Asp Thr Gly His 405 410 415

Gly Thr Val Val Leu Glu Leu Gln Tyr Thr Gly Thr Asp Gly Pro Cys 420 425 430

Lys Val Pro Ile Ser Ser Val Ala Ser Leu Asn Asp Leu Thr Pro Val 435 440 445

Gly Arg Leu Val Thr Val Asn Pro Phe Val Ser Val Ala Thr Ala Asn

450 455 460

Ala Lys Val Leu Ile Glu Leu Glu Pro Pro Phe Gly Asp Ser Tyr Ile 465 470 475 480

Val Val Gly Arg Gly Glu Gln Gln Ile Asn His His Trp His Lys Ser 485 490 495

Gly Ser Ser Ile Gly Lys Ala Phe Thr Thr Thr Leu Lys Gly Ala Gln 500 505 510

Arg Leu Ala Ala Leu Gly Asp Thr Ala Trp Asp Phe Gly Ser Val Gly 515 520 525

Gly Val Phe Thr Ser Val Gly Lys Ala Val His Gln Val Phe Gly Gly 530 535 540

Ala Phe Arg Ser Leu Phe Gly Gly Met Ser Trp Ile Thr Gln Gly Leu 545 550 555 560

Leu Gly Ala Leu Leu Leu Trp Met Gly Ile Asn Ala Arg Asp Arg Ser 565 570 575

Ile Ala Leu Thr Phe Leu Ala Val Gly Gly Val Leu Leu Phe Leu Ser 580 585 590 Val Asn Val His Ala Lys Asp Glu Leu

595

600

Claims (20)

1. Composição de substâncias compreendendo: a) polipeptídeos isolados, purificados, e/ou recombinantes com- preendendo SEQ ID NO: 5, 9, 11, 13 ou 15; b) um fragmento do polipeptídeo determinado na SEQ ID NO: 5,9 , 11, 13,15 ou um fragmento de SEQ ID NO: 5, 9, 11, 13 ou 15 que é "de Y a Z", em que Y é o aminoácido de N-terminal da seqüência especificada e Z é o aminoácido de C-terminal da seqüência especificada conforme determi- nado em qualquer uma de Tabelas 9, 10, 11, ou 12, ou um fragmento de um polipeptídeo conforme determinado nas Tabelas 15 ou 16; c) um peptídeo E conforme determinado em qualquer uma das SEQ ID NOs: 5, 9, 11, 13 ou 15 ou um fragmento de um peptídeo E confor- me determinado em qualquer uma das SEQ ID NOs: 5, 9, 11, 13 ou 15 que produz uma reação de anticorpos neutralizantes quando administrado a um indivíduo; d) um polipeptídeo de acordo com a), b) ou c) que compreende adicionalmente uma seqüência de polipeptídeo heteróloga; e) um polipeptídeo derivado de planta de acordo com a), b), c) ou d); f) uma composição compreendendo um veículo e um polipeptí- deo conforme determinado em qualquer um de a), b), c), d) ou e), em que o referido veículo compreendendo material celular do sistema de expressão em planta, mamífero ou bacteriano (opcionalmente suspenso em um tam- pão), um adjuvante ou um excipiente farmaceuticamente aceitável; g) uma seqüência de polinucleotídeos codificando um polipeptí- deo compreendendo SEQ ID NO: 5, 9, 11, 13 ou 15 ou codificando um ou mais fragmentos de polipeptídeo de SEQ ID NOs: 5, 9, 11, 13 ou 15 confor- me determinado em (b) ou (c), opcionalmente em que a referida seqüência de polinucleotídeos tem um teor de G+C de no mínimo 40% e menos de50% ou um teor de G+C conforme determinado na Tabela 13; h) uma seqüência de polinucleotídeos que é no mínimo 70% (ou uma percentagem conforme especificado na Tabela 14) idêntica à SEQ ID NO: 1, codifica um polipeptídeo compreendendo SEQ ID NO: 2 e tem um teor de G+C de entre cerca de 40% e cerca de 50% (ou um teor de G+C es- pecífico conforme especificado na Tabela 13); i) uma seqüência de polinucleotídeos de no mínimo 8 nucleotí- deos consecutivos de uma seqüência de polinucleotídeos conforme determi- nado em (g) ou (h); j) uma seqüência de polinucleotídeos compreendendo SEQ ID NO: 3, 4, 6, 7, 8, 10, 12, ou 14 ou um fragmento de no mínimo 8 nucleotí- deos consecutivos de SEQ ID NO: 3, 4, 6, 7, 8, 10, 12, ou 14; k) um polinucleotídeo que é complementar aos polinucleotídeos determinados em (g), (h), (i), ou Q); I) um polinucleotídeo que hibridiza sob baixa, intermediária ou elevada estringência com uma seqüência de polinucleotídeos conforme de- terminado em (g), (h), (i), (i) ou (k); m) um constructo genético compreendendo uma seqüência de polinucleotídeos conforme determinado em (g), (h), (i), (i) ou (k); n) um vetor compreendendo um polinucleotídeo ou constructo genético conforme determinado em (g), (h), (i), (i), (j), (k) ou (I); o) uma célula hospedeira compreendendo um vetor conforme determinado em (n), um constructo genético conforme determinado em (m), ou um polinucleotídeo conforme determinado em qualquer uma de (g), (h), (i), 0) ou (k); p) uma planta transgênica, célula de planta, ou parte de planta compreendendo um vetor conforme determinado em (n), um constructo ge- nético conforme determinado em (m) ou um polinucleotídeo conforme de- terminado em qualquer uma de (g), (h), (i), (j) ou (k); ou q) uma sonda compreendendo um polinucleotídeo de acordo com (g), (h), (i), (j), (k) ou (I) e, opcionalmente, uma etiqueta ou marcador.

2. Polipeptídeo isolado de acordo com a reivindicação 1, em que o referido polipeptídeo é produzido em uma célula de planta compreenden- do: a) transformar uma célula de planta com um vetor recombinante compreendendo um polinucleotídeo codificando o referido polipeptídeo ou fragmento do mesmo para formar uma célula de planta transformada; b) cultivar a referida célula de planta transformada sob condi- ções adequadas para a expressão do referido polipeptídeo; e c) recuperar o referido polipeptídeo da referida célula de planta transformada.

3. Polipeptídeo isolado de acordo com a reivindicação 2 ou a reivindicação 3, em que o referido polipeptídeo ou fragmento de polipeptídeo é fundido a uma seqüência de polipeptídeo heteróloga.

4. Método para imunizar um indivíduo contra um vírus West Nile compreendendo administrar uma quantidade de uma composição suficiente para induzir uma reação imune no referido indivíduo, a referida composição compreendendo: um veículo e um polipeptídeo compreendendo: (i) SEQ ID NO: 5, 9, 11, 13 ou 15; (ii) um E-peptídeo conforme determinado em qual- quer uma das SEQ ID NOs: 5, 9, 11, 13 ou 15 ou um fragmento de um E- peptídeo conforme determinado em qualquer uma das SEQ ID NOs: 5, 9, 11,13 ou 15 que produz uma reação de anticorpos neutralizantes quando admi- nistrado a um indivíduo; (iii) um fragmento de no mínimo cinco aminoácidos consecutivos de SEQ ID NO: 5, 9, 11, 13 ou 15; ou (iv) um fragmento con- forme determinado na Tabela 9, 10, 11, 12, 15, ou 16, em que o referido po- lipeptídeo ou fragmento induz uma reação imunoprotetora contra um vírus West Nile infeccioso ou uma reação de anticorpos que neutraliza vírus West Nile infeccioso.

5. Método de acordo com a reivindicação 4, em que o referido polipeptídeo ou o referido fragmento de polipeptídeo é fundido a uma se- qüência de polipeptídeo heteróloga.

6. Método de acordo com a reivindicação 4 ou 5, em que o refe- rido polipeptídeo ou fragmento do mesmo é uma polipeptídeo produzido por planta fragmento de polipeptídeo produzido por planta.

7. Método para induzir uma reação imune a cepas de vírus West Nile (WNV) compreendendo administrar: (A) uma seqüência de ácido nuclei- co codificando um polipeptídeo compreendendo: (i) SEQ ID NO: 5, 9, 11, 13 ou 15; (ii) um E-peptídeo conforme determinado em qualquer uma das SEQ ID NOs: 5, 9, 11, 13 ou 15 ou um fragmento de um E-peptídeo conforme de- terminado em qualquer uma das SEQ ID NOs: 5, 9, 11, 13 ou 15 que produz uma reação de anticorpos neutralizantes quando administrado a um indiví- duo; (iii) um fragmento de no mínimo cinco aminoácidos consecutivos de SEQ ID NO: 5, 9, 11, 13 ou 15; ou (iv) um fragmento conforme determinado na Tabela 9, 10, 11, 12, 15, ou 16, em que o referido polipeptídeo ou frag- mento induz uma reação imunoprotetora contra um vírus West Nile infeccio- so ou uma reação de anticorpos neutralizantes contra um vírus West Nile infeccioso; (B) um viral vetor que compreende uma seqüência de ácido nu- cleico codificando um polipeptídeo compreendendo: SEQ ID NO: 5, 9, 11, 13 ou 15; (ii) um E-peptídeo conforme determinado em qualquer uma das SEQ ID NOs: 5, 9, 11, 13 ou 15 ou um fragmento de um E-peptídeo conforme de- terminado em qualquer uma das SEQ ID NOs: 5, 9, 11, 13 ou 15 que produz uma reação de anticorpos neutralizantes quando administrado a um indiví- duo; (iii) um fragmento de no mínimo cinco aminoácidos consecutivos de SEQ ID NO: 5, 9, 11, 13 ou 15; ou (iv) um fragmento conforme determinado na Tabela 9, 10, 11, 12, 15, ou 16, em que o referido polipeptídeo ou frag- mento induz uma reação imunoprotetora contra um vírus West Nile infeccio- so ou uma reação de anticorpos neutralizantes contra um vírus West Nile infeccioso; ou (C) no mínimo um polipeptídeo compreendendo: SEQ ID NO: 5, 9, 11, 13 ou 15; (ii) um E-peptídeo conforme determinado em qualquer uma das SEQ ID NOs: 5, 9, 11,13 ou 15 ou um fragmento de um E-peptídeo conforme determinado em qualquer uma das SEQ ID NOs: 5, 9, 11, 13 ou 15 que produz uma reação de anticorpos neutralizantes quando administrado a um indivíduo; (iii) um fragmento de no mínimo cinco aminoácidos consecuti- vos de SEQ ID NO: 5, 9, 11, 13 ou 15; ou (iv) um fragmento conforme de- terminado na Tabela 9, 10, 11, 12, 15, ou 16, em que o referido polipeptídeo ou fragmento induz uma reação imunoprotetora contra um vírus West Nile infeccioso ou uma reação de anticorpos neutralizantes contra um vírus West Nile infeccioso para um indivíduo em uma quantidade suficiente para induzir uma reação imune no referido animal.

8. Método de acordo com a reivindicação 7, em que o referido método compreende adicionalmente reforçar a reação imune do referido a- nimal por administração de uma composição compreendendo um polipeptí- deo compreendendo: SEQ ID NO: 5, 9, 11, 13 ou 15; (ii) um E-peptídeo con- forme determinado em qualquer uma das SEQ ID NOs: 5, 9, 11, 13 ou 15 ou um fragmento de um E-peptídeo conforme determinado em qualquer uma das SEQ ID NOs: 5, 9, 11, 13 ou 15 que produz uma reação de anticorpos neutralizantes quando administrado a um indivíduo; (iii) um fragmento de no mínimo cinco aminoácidos consecutivos de SEQ ID NO: 5, 9, 11, 13 ou 15; ou (iv) um fragmento conforme determinado na Tabela 9, 10, 11, 12, 15, ou 16, em que o referido polipeptídeo ou fragmento induz uma reação imuno- protetora contra um vírus West Nile infeccioso ou uma reação de anticorpos neutralizantes contra um vírus West Nile infeccioso.

9. Método de acordo com a reivindicação 7 ou 8, em que o refe- rido polipeptídeo ou fragmento do referido polipeptídeo é fundido a uma se- qüência de polipeptídeo heteróloga.

10. Método de acordo com a reivindicação 7, 8 ou 9, em que o referido polipeptídeo ou fragmento do referido polipeptídeo é de origem de planta ou obtido de uma planta transgênica ou parte de planta.

11. Método de acordo com a reivindicação 4, 5, 8 ou 9, em que o referido polipeptídeo é preparado em uma célula procariótica ou eucariótica.

12. Método para ligar um anticorpo a um polipeptídeo compre- endendo contactar uma amostra contendo um anticorpo com um polipeptí- deo compreendendo: a) polipeptídeos isolados, purificados, e/ou recombi- nantes compreendendo SEQ ID NO: 5, 9, 11, 13 ou 15; b) um fragmento do polipeptídeo determinado em SEQ ID NO: 5, 9, 11, 13, 15 ou um fragmento de SEQ ID NO: 5, 9, 11, 13 ou 15 que é "de Y a Z", em que Y é o aminoáci- do de N-terminal da seqüência especificada e Z é o aminoácido de C- terminal da seqüência especificada conforme determinado em qualquer uma das Tabelas 9, 10, 11, ou 12, um fragmento de um polipeptídeo conforme determinado na Tabela 15 ou 16; c) um E-peptídeo conforme determinado em qualquer uma das SEQ ID NOs: 5, 9, 11, 13 ou 15 ou um fragmento de um E-peptídeo conforme determinado em qualquer uma das SEQ ID NOs: 5,9, 11, 13 ou 15 que produz uma reação de anticorpos neutralizantes quando administrado a um indivíduo; ou d) um polipeptídeo de acordo com qualquer um de a), b) ou c) que compreende adicionalmente uma seqüência de poli- peptídeo heteróloga sob condições que permitem a formação de um com- plexo de antígeno-anticorpo.

13. Método de acordo com a reivindicação 12, compreendendo adicionalmente a etapa de detectar a formação do referido complexo de an- tígeno-anticorpo.

14. Método de acordo com a reivindicação 13, em que o referido método é um imunoensaio.

15. Método de acordo com a reivindicação 14, em que o referido imunoensaio é selecionado entre o grupo consistindo em ensaios imunos- sorventes ligados a enzimas (ELISAs), radioimunoensaios (RIAs), ensaios de fluxo lateral, ensaios de fitas imunocromatográficas, ensaios de fluxo au- tomatizado, Western blots, ensaios de imunoprecipitação, ensaios de ligação cromatográfica de fluxo reversível, ensaios de aglutinação, e biossensores.

16. Método de acordo com a reivindicação 12, em que o referido método é realizado usando uma série de polipeptídeos compreendendo o mesmo polipeptídeo ou uma combinação de polipeptídeos compreendendo um polipeptídeo derivado de outros vírus e um ou mais polipeptídeos selecionados entre : a) polipeptídeos isolados, purificados, e/ou recombinantes compreen- dendo SEQ ID NO: 5, 9, 11, 13 ou 15; b) um fragmento do polipeptídeo deter- minado em SEQ ID NO: 5, 9, 11, 13, 15 ou um fragmento de SEQ ID NO: 5, 9,11, 13 ou 15 que é "de Y a Z", em que Y é o aminoácido de N-terminal da se- qüência especificada e Z é o aminoácido de C-terminal da seqüência especifi- cada conforme determinado em qualquer uma de Tabelas 9, 10, 11, ou 12, um fragmento de um polipeptídeo conforme determinado nas Tabelas 15 ou 16; c) um E-peptídeo conforme determinado em qualquer uma das SEQ ID NOs: 5,9, 11, 13 ou 15 ou um fragmento de um E-peptídeo conforme determinado em qualquer uma das SEQ ID NOs: 5, 9, 11, 13 ou 15 que produz uma reação de anticorpos neutralizantes quando administrado a um indivíduo; ou d) um poli- peptídeo de acordo com qualquer um de a), b) ou c) que compreende adicio- nalmente uma seqüência de polipeptídeo heteróloga.

17. Método para produzir polipeptídeo compreendendo: a) transformar uma célula com um polinucleotídeo codificando no mínimo um polipeptídeo compreendendo: (i) SEQ ID NO: 5, 9, 11, 13 ou15; (ii) um fragmento do polipeptídeo determinado em SEQ ID NO: 5, 9, 11, 13, 15 ou um fragmento de SEQ ID NO: 5, 9, 11, 13 ou 15 que é "de Y a Z", em que Y é o aminoácido de N-terminal da seqüência especificada e Z é o aminoácido de C-terminal da seqüência especificada conforme determinado em qualquer uma de Tabelas 9, 10, 11, ou 12, um fragmento de um polipep- tídeo conforme determinado nas Tabelas 15 ou 16; (iii) um E-peptídeo con- forme determinado em qualquer uma das SEQ ID NOs: 5, 9, 11, 13 ou 15 ou um fragmento de um E-peptídeo conforme determinado em qualquer uma das SEQ ID NOs: 5, 9, 11, 13 ou 15 que produz uma reação de anticorpos neutralizantes quando administrado a um indivíduo; ou iv) um polipeptídeo de acordo com qualquer um de (i), (ii) ou (iii) que compreende adicionalmen- te uma seqüência de polipeptídeo heteróloga; b) cultivr a referida célula transformada sob condições que per- mitem a proliferação da referida célula de planta transformada e a acumula- ção do referido polipeptídeo; e c) recuperar ou purificar o referido no mínimo um polipeptídeo a partir da referida célula.

18. Método de acordo com a reivindicação 1, em que a célula é uma célula de planta transformada é selecionada entre o grupo consistindo em uma célula de planta inferior, uma célula de planta monocotiledônea, e uma célula de planta dicotiledônea; uma célula procariótica; ou uma linha- gem celular de mamífero.

19. Método de acordo com a reivindicação 18, em que a célula de planta transformada é uma linhagem de células de tabaco.

20. Método de acordo com a reivindicação 19, em que a referida linhagem de células de tabaco é NT-1.