JPH07501451A - 多価抗原結合タンパク質 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 多価抗原結合タンパク質 本発明は国立衛生研究所、国立総合医学研究所によって許可された５ＢＩＲ補助 金５Ｒ４４ＧＭ３９６６２−０３を基金とし、政府の援助を得て行われた。政府 は本発明における権利の幾分かを有する。

関連出願の前後参照 本発明は１９９１年１１月２５日出願の米国特許出願第０７／７９６．９３６号 の一部継続出願であり、該出願は１９９０年４月２５日出願の米国特許出願第０ ７１５１２、９１０号の一部継続出願であり、該出願は１９８９年１月１日出願 の米国特許出願第０７／２９９．６１７号（米国特許第４．９４６．７７８号と して登録、ラドナー（Ｌａｄｎｅｒ）ら）の一部継続出願であり、該出願は現在 放棄されている１９８７年９月２日出願の米国特許出願第０９２．１１０号およ び１９８６年９月２日出願の米国特許出願第９０２．９７１号の一部継続出願で あり、これらすべての内容が参考として本明細書に完全に組み込まれている。

発明の背景 １発明の利用分野 本発明は概して抗原結合分子の生産に関する。さらに詳しくは、本発明は多価型 の抗原結合タンパク質に関する。これらの多価抗原結合タンパク質の組成、遺伝 子構造、使用法および生産法を開示する。

２背景技術の解説 抗体は免疫系によって生産され、抗原と称される侵入分子との複合が可能な特異 的分子のタンパク質である。第１４図は典型的な抗体分子の構造を示すものであ る。自然抗体は２つの相同な抗原結合部位を有しており、両方の結合部位が、あ る特定の抗原に対して特異的である。抗体分子は、その抗原結合部位がエピトー プと称される抗原の領域と複合することによって抗原を「認識」する。エピトー プは抗体の抗原結合部位の高次構造に適合し、抗体を抗原に結合可能にする。

抗体分子は、２本の相同のＨ鎮（ｈｅａｖｙ　ｃｈａｉｎ）と２本の相同のＬ鎖 （ｌｉｇｈｔ　ｃｈａｉｎ）というポリペプチド鎖て構成され、それらは鎖内ノ スルフイド結合によって結合している（第１４図参照）。それぞれのＬ鎖／Ｈ鎖 ベアが相同であるため、この議論の残りは、一つのＬ鎖／Ｈ鎖ベアに関して行う 。それぞれ個々のＬ鎖およびＨ鎖は、保存された３次元フンフォーメーンヨンで あると仮定される、約１１０個のアミノ酸領域に折りたたまれている。Ｌ鎮は１ つの可変領域（Ｖ、と称す）と１つの定常領域（ＣＬ）からなり、一方Ｈ！ＩＩ は１つの可変領域（ＶＨ）と３つの定常領域（Ｃ１，１１、Ｃ１１２およびＣＨ ３）からなる。領域の対は第１４図に示すように会合して不連続構造を形成する 。特に、Ｌ鎖とＨ鎖の可変領域であるＶＬとＶＨは会合して抗原結合部位を含む 「Ｆｖ」領域を形成する。

Ｈ鎖とＬ鎖の両方の可変領域は、１つの抗体分子と他の抗体分子との間において 、構造およびアミノ酸組成がかなり変化するが、定常領域は僅かな変化しか示さ ない。本明細書で用いる語句「可変」とは、抗体のＨ鎖とＬ鎖の可変領域のアミ ノ酸配列の種類が異なることを意味する。各抗体は抗原を認識し、Ｈ鎖とＬ鎖の 可変領域が会合してＦｖ領領域なることによって限定されるその結合部位を介し て抗原と結合する。特定の抗体分子のし鎖の可変領域ｖｌおよびＨ鎖の可変領域 Ｖイは、抗原結合部位が、その特定の抗体によって認識される抗原のエピトープ に結合するコンフォーメーノヨンをとるようにする特異的アミノ酸配列を有する 。

可変領域内には、アミノ酸配列が１つの抗体分子と他の抗体分子との間において 、非常に変化する部分が見られる。これらの「超可変額域」または「相補性決定 領域（ＣＤ　Ｒ）Ｊと呼ばれる部分は、各り鎖およびＨ鎖において３つずつ存在 する。Ｌ鎖の３つのＣＤＲおよびそれに対応するＨ鎖のＣＤＲは、抗原結合部位 を形成する。

タンパク質分解酵素のパパインによって、自然発生の抗体分子が切断されると抗 原結合部位を保有するフラグメントができる。通常Ｆａｂと称されるこれらのフ ラグメントは、抗体のＣＬ、ＶＬ、Ｃ，１および■８からなる。Ｆａｂにおいて Ｌ鎖およびＨ鎖のフラグメントはノスルフイド結合によって共有結合している。

免疫生物学、組換えＤＮＡテクノロジーおよびコンピューター科学における最近 の進歩によって、抗原と結合する一重鎮ポリペプチド分子が創製できるようにな った。これらの−重鎖抗原結合分子は、リンカ−ポリペプチドを組み入れること により、相同の可変領域■ＬおよびＶＨを架橋して一重鎖ポリペプチドにする。

コンピューターを用いるリンカ−の設計法が、１９８７年に登録されたランダー らの米国特許第４．７０４，６９２号に更に詳しく記載されており、ここに参考 文献として挙げる。−重鎖抗原結合タンパク質の理論と生産法が１９９０年８月 ７日登録のランダーらの米国特許第４．９４６．７７８号に記載されており、こ こに参考文献として挙げる。米国特許第４．９４６．７７８号に記載の方法に準 じて生産される一本鎖抗原結合タンパク質は、対応するＦａｂフラグメントと実 質的に類似した結合特異性および親和性をもつ。

三官能的あるいは二特異的抗体は、特異性の異なる結合部位をもつ。二特異的抗 体は細胞、細胞障害性抗体または医薬を特異的部位に配達するために生産される 。重要な用途の１つは、天然のキラーＴ細胞または細胞障害性Ｔ細胞などの宿主 細胞障害性Ｔ細胞を特定の細胞標的に配達することである［Ｕ、　Ｄスターブ（ Ｓｔａｅｒｚ）、　Ｏカナガワ（Ｋａｎａｇａｗａ）、　Ｍ、　Ｊ　ビヴアン（ Ｒｅｖａｎ）のｆＮａｔｕｒｅＪ　、　３１４　：　６２８（１９８５年）、Ｓ 、ソンギルビライ（Ｓｏｎｇｉｌｖｉｌａｉ）、　Ｐ、　Ｊ　、ラックマン（Ｌ ａｃｈｍａｎｎ）のｒｃｌｉｎ、　Ｅｘｐ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、Ｊ、７９　：　 ３１５（１９９０年）］。別の重要な用途は、細胞障害性タンパク質を特定の細 胞標的に配達することである［Ｖ、う゛パＲａ５ｏ）。

Ｔ。グリフイン（Ｇｒｉｆｆｉｎ）のｒｃａｎｓｅｒＲｅｓ、Ｊ、４１　：２０ ７３（１９８１年）：Ｓ。

ホンダ（Ｈｏｎｄａ）、　Ｙ、イチモリ（Ｉｃｈｉｍｏｒｉ）、　Ｓ、イワサ（ Ｉｗａｓａ）のｒｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＪ。

４・５９（１９９０年）］。さらに他の重要な用途は、非タンパク質性抗ガン剤 を特定の細胞標的に配達することである［Ｊ、コーヴアラン（Ｃｏｒｖａｌａｎ ）、　Ｗスミス（Ｓｗｉｔｈ）、　Ｖ、ボア（Ｇｏｒｅ）のｒｌｎｔｌ、　Ｊ、 　Ｃａｎｃｅｒ　５ｕｐｐ１．　Ｊ、　２　：　２２（１９８８年）；Ｍ。

ピム（Ｐｉｗ）らのｒＢｒｉｔｉｓｈ　Ｊ、　ｏｆ　ＣａｎｃｅｒＪ、６１　： 　５０８（１９９０年）］。このような二特異的抗体は、化学的架橋ＣＭ、ブレ ナン（Ｂｒｅｎｎａｎ）らのｒｓｃｉｅｎｃｅＪ、　２２９　：８１（１９８５ 年）］、ジスルフィド交換、またはハイブリッド−ハイブリドーマ（クアドロマ ス）の生産によって製造される。２つの異なる抗原に対して２つの異なる型の抗 体を分泌するハイブリドーマの融合によって、クアドロマスが製造される［クロ 力’７　（Ｋｕｒｏｋａｗａ）、　Ｔ、らのｒＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＪ　 、　７　：１１６３　（１９８９年）］。

発明の概要 本発明は多価型の一本鎖抗原結合タンパク質が、−価の一本鎖抗原結合タンパク 質よりも重要な効用を有することの発見に関する。多価抗原結合タンパク質は１ つ以上の抗原結合部位を持つ。多価抗原結合タンパク質の増強された結合活性、 ２−およびマルチ−特異的結合、およびその他の新規な用途をここに説明する。

したがって、本発明は多価型の一重鎖抗原結合タンパク質、多価および一本鎖抗 原結合タンパク質の組成物、多価型の一本鎖抗原結合タンパク質の製造法ならび に精製法、および多価型の一本鎖抗原結合タンパク質の用途に関する。本発明は ２つ以上の一本鎖抗原結合分子からなる多価抗原結合タンパク質を提供するもの であり、該各−重鎖分子は、抗体のＨ鎖またはＬ鎖の可変領域の結合部分を含む 第１ポリペプチド、抗体のＨ鎖またはＬ鎖の可変領域の結合部分を含む第２ポリ ペプチド；および第１および第２ポリペプチドを結合して一本鎖タンパク質にす るペプチドリンカ−を含む。

さらに、本発明は実質的に一本鎖分子を含まない多価抗原結合タンパク質を含む 組成物を提供する。

さらに、本発明は一本鎖分子および過剰の多価抗原結合タンパク質を含む水性組 成物を提供する。

本発明は多価抗原結合タンパク質および一本鎖分子の組成物を生産するステップ （該各−重鎖分子は、抗体のＨ鎖またはＬ鎖の可変領域の結合部分を含む第１ポ リペプチド：抗体のＨａまたはＬ鎖の可変領域の結合部分を含む第２ポリペプチ ド、および第１ポリペプチドと第２ポリペプチドを結合して該−重鎖タンパク質 にするペプチドリンカ−を含む）ニー重鎖分子から多価タンパク質を分離するス テップ、および多価タンパク質を回収するステップを含む、多価抗原結合タンパ ク質の生産法を提供する。

さらに、本発明は一本鎖分子（前記と同＊ａ＞を含む組成物を生産するステップ 、−重鎖分子を解離するステップ；−重鎖分子を再会合するステップ：得られる 多価抗原結合タンパク質を一本鎖分子から分離するステップ；および多価タンパ ク質を回収するステップを含む、多価抗原結合タンパク質の生産法を提供する。

さらに、本発明は少なくとも２つの一本鎖抗原結合分子を化学的に架橋するステ ップを含む多価抗原結合タンパク質の生産法を提供する。

さらに、本発明は一本鎖分子（前記と同′！！義）を含む組成物を生産するステ ップ：該−重鎖分子を濃縮するステップ：多価タンパク質を該−重鎖分子から分 離するステップ：および最後に該多価タンパク質を回収するステップを含む、多 価抗原結合タンパク質の生産法を提供する。

さらに、本発明は一本鎖分子（前記と同意義）をコードする遺伝子配列を提供す るステップ、宿主細胞（単細胞または複数細胞）を該配列で形質転換するステッ プ、該配列が該宿主（単数または複数）において発現するステップ、および該多 価タンパク質を回収するステップを含む、２つ以上の一本鎖分子を含む多価抗原 結合タンパク質の生産法を提供する。

本発明の別の態様は、サンプルを請求項１の多価抗原結合タンパク質と接触させ 、次いで、該抗原結合タンパク質が抗原に結合したかどうかを検出することを含 む、サンプル中に存在するかまたは存在すると思われる抗原の検出法である。

本発明のさらに別の態様は、動物に標識した請求項１の多価抗原結合タンパク質 の有効量を投与し、次いで、該動物に取り込まれた検出可能な放射線を測定する ことを含む、動物の内部構造の造影法である。

本発明のさらに別の態様は、多価抗原結合タンパク質と治療上または診断上有効 な作用剤との組み合わせを含む組成物である。

本発明のさらに別の態様は、抗体のし鎖の可変領域の結合部分を含む第１ポリペ プチド、抗体のし＃１４の可変領域の結合部分を含む第２ポリペプチド：および 第１ポリペプチド（ａ）および第２ポリペプチド（ｂ）を結合して一本鎖タンパ ク質にするペプチドリンカ−を含む一本鎖タンパク質である。

本発明のさらに別の態様は、−重鎖分子のためのｖＬ−ｖＬ部およびＶｓ　Ｖｓ 部の組み合わせおよび多価抗原結合タンパク質をコードする遺伝子構造である。

本発明を構成する別の要素は、抗体のＨ鎖またはＬＩＪｉの可変領域の結合部分 を含む第１ポリペプチド、抗体のＨ鎖またはＬ鎖の可変領域の結合部分を含む第 ２ポリペプチド；および第１ポリペプチド（ａ）および第２ポリペプチド（ｂ） を結合して該多価タンパク質にするペプチドリンカ−；抗体のＨ鎖またはＬ鎖の 可変領域の結合部分を含む第３ポリペプチド；抗体のＨ鎖またはＬ鎖の可変領域 の結合部分を含む第４ポリペプチド；第３ポリペプチド（ｄ）および第４ポリペ プチド（ｅ）を結合して該多価タンパク質にするペプチドリンカ−；および第２ ポリペプチド（ｂ）および第４ポリペプチド（ｄ）を結合して該多価タンパク質 にするペプチドリンカ−を含む、多価−重鎖抗原結合タンパク質である。本発明 には、この多価−重鎖抗原結合タンパク質をコードする遺伝子構造も含まれる。

本発明には、プラスミドなどの複製可能なりローニングまたは発現手段、前述の 遺伝子配列で形質転換された宿主、および該配列、形質転換された宿主および発 現手段を包含する多価タンパク質の生産法も含まれる。

本発明は、医療状態を診断するための多価抗原結合タンパク質の使用法、動物の 特定の身体器官を造影するための担体としての多価タンパク質の使用法：および 多価タンパク質を治療上または診断上有効な作用剤と複合させる免疫治療法など の使用法を提供する。本発明には標識多価タンパク質、該標識多価タンパク質を 使用する改良イムノアッセイ、および改良イムノアフィニティー精製法も含まれ る。

一本鎖抗原結合分子またはＦａｂフラグメントの代わりに多価抗原結合タンパク 質を使用する利点は、多価型が増強された結合能力もつことである。多価型は１ 分子あたりの結合部位が多いために結合が強化される。本発明の他の利点は、多 価抗原結合タンパク質がマルチ特異的結合分子として使用できることである。

全抗体の代わりに多価抗原結合タンパク質を使用する利点は、全抗体と比べてサ イズが小さいので血清から清澄化しやすいことであり、造影用に使用するときに バックグラウンドを低くすることができる。多価抗原結合タンパク質はモノクロ ーナルよりも容易に固体の腫瘍に浸透することができ、抗腫瘍能力がよりすぐれ ている。また、本発明の多価抗原結合タンパク質はサイズが小さく、完全抗体の Ｆｃ成分がないため、全抗体よりも免疫原性が少ない。全抗体のＦｃ成分もまた 肝細胞、膵臓細胞などの細胞に対する結合部位を含んでおり、したがってＦｃ成 分がないことにより、非標的組織における蓄積が低減化される。

多価抗原結合タンパク質の他の利点は、全抗体を生産するために用いられるケー ラー（Ｋｅｈｌｅｒ）とミルスティン（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ）によって開拓された 骨髄腫融合技術と比べて、生産および工業的処理が容易であることである。

図面の簡単な説明 請求の範囲に記載する本発明は、本文および次の図面を参照することにより、理 解を深めることができる。

第１Ａ図は、２つの相同の一木組抗原結合タンパク質分子の図式的２次元表現で あり、それぞれＬ鎖可変領域（ＶＬ）、Ｈ鎖可変領域（Ｖ、）および２つの可変 領域を結合するポリペプチドリンカ−を含む。−末鎖抗原結合タンパク質分子が その抗原結合部位に抗原を結合していることを示す。

第１Ｂ図は、第１Ａ図の２つの１価の一重鎖抗原結合タンパク質のポリペプチド リンカ−の会合によって形成される仮想のホモ三価の抗原結合タンパク質を描い たものである（会合モデル）。二価の抗原結合タンパク質は、２つの相同の一木 組抗原結合タンパク質分子のｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ−ｄｒｉｖｅｎ会合に よって形成される。

第１Ｃ図は、第１Ｂ図の仮想の二価のタンパク質の両方の抗原結合部位に、抗原 分子が結合した様子を描いたものである。

第２Ａ図は、第１Ｂ図の仮せのホモ三価のタンパク質を描いたものである。

第２Ｂ図は、仮想の三量体として会合した３つの一木組抗原結合タンパク質分子 を描いたものである。

第２Ｃ図は、４つの一木組抗原結合タンパク質分子の仮想の四量体を描いたもの である。

第３Ａ図は、異なる抗原特異性を有する２つの分離した別の１価の一重鎖抗原結 合タンパク質、すなわち抗Ａ−末鎖抗原結合タンパク質と抗Ｂ−重鎮抗原結合タ ンパク質が、抗原Ａまたは抗原Ｂとそれぞれ結合している状態を描いたものであ る。

第３Ｂ図は、前記会合モデルによる、第３Ａ図の一重鎖抗原結合タンパク質から 形成される仮想の二特異的ヘテロ二価の抗原結合タンパク質を描いたものである 。

第３Ｃ図は、二特異的、すなわち２つの異種の抗原ＡおよびＢと結合する第３Ｂ 図の仮想のへテロ三価の抗原結合タンパク質を描いたものである。

第４Ａ図は、それぞれＬ鎖可変領域（ＶＬ）、Ｈ鎖可変領域（ＶＮ）および２つ の可変領域を結合するポリペプチドリンカ−を含む２つの一木組抗原結合タンパ ク賀分子を描いたものである。−末鎖抗原結合タンパク質分子がその抗原結合部 位に抗原を結合していることを示す。

第４Ｂ図は、第４Ａ図に示すＶｔおよび■。部の転位によって形成される仮想の ホモ三価のタンパク質を描いたものである（転位モデル）。結合する抗原も示し ている。

第５Ａ図は、２つの一木組タンパク質分子を描いたものであり、第１のタンパク 質分子は抗ＢのＶＬおよび抗ＡのＶｓ含み、第２のタンパク質分子は抗ＡのＶＬ および抗ＢのＶ、Ｇ含む。この図は各−末鎖タンパク質分子にお番フるＶＬおよ びＶ８部の非相補的状態を示す。

第５Ｂ図は、第５Ａ図の２つの一重鎖タンパク質の転位によって形成される仮想 の二特異的ヘテロ二価の抗原結合タンパク質を示す。

第５Ｃ図は、それぞれの抗原結合部位を占める異種の抗原ＡおよびＢが結合した 第５Ｂ図の仮想のへテロ三価の抗原結合タンパク質を描いたものである。

第６Ａ図は、転位モデルによる、仮想の三価の抗原結合タンパク質の図式的描写 である。

第６Ｂ図は、転位モデルによる、仮想の四価の抗原結合タンパク質の図式的描写 である。

第７図は、陽イオン交換高性能液体クロマトグラフィーカラムにおける、ＣＣ４ ９／２１２抗原績合タンパク質単量体の二量体からの分離を描くクロマトグラム である。カラムはＰｏ　Ｉ　ｙＣＡＴ　Ａアスパラギン酸カラム（ＰｏｌｙＷＣ 社製、コロンビア、メリーランド州）である。単量体はピーク１で示され、２７ ．３２分に溶離し、２ｌ体はピーク２で示され、５５５２分に溶離する。

第８図は、第７図で精製された単量体のクロマトグラムである。単量体は二量体 （２０，１３５分）および３ｌ体（１８，６４０分）が溶離した後、２１．９４ 分で溶離する。ゲル濾過カラム、Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｐａｋ３００ＳＷ（ウォータ ーズ・アソシエイト社製、ミルフォード、マサチューセッツ州）。

第９ＦＸＪは、第７図で精製された二量体（２０，１４分）の同様なりロマトグ ラムである。第８図のゲル濾過ＨＰＬＣカラムで溶離した。

第１０Ａ図は、２１２リンカ−ポリペプチドでＣＣ４９Ｖ□領域と結合する４４ 　２０ＶＬ領域を含む一重鎖タンパク質のアミノ酸配列（配列番号１１）および 核酸配列（配列番号１０）である。

第１０Ｂ図は、２１２リンカ−ポリペプチドで４−４−２０Ｖ、領域と結合する ＣＣ４９ＶＬ領域を含む一重鎖タンパク質のアミノ酸配列（配列番号１３）およ び核酸配列（配列番号１２）である。

第１１図は、Ｐｏ　Ｉ　ｙＣＡＴ　Ａ陽イオン交換カラム（Ｐｏｌ　ｙＬＣ社製 、コロンビア、メリーランド州）を用いた陽イオン交換によるＣＣ４９／２１２ 抗原結合タンパク質の単量体（２７，８３分）および二量体（５０，４７分）の 分離を描くクロマトグラムである。

第１２図は、Ｂ６．２／２１２抗原結合タンパク質の単量体（１７，６５分）、 ２ｌ体（１５，７９分）、３ｌ体（１４，１９分）および高次のオリゴマー（１ ３，０９分におけるショルダ一部）の分離を示す。この分離は、１　、０　ｍｇ ／ｍｌのＢ６．２／２１２−末鎖抗原結合タンパク質サンプルを２４時間処理し た結果を描いたものである。ＴＳＫ　Ｇ２０００ＳＷゲル濾過ＨＰＬＣカラム（ トーヨーンーダ社製、東京、日本）を使用した。

第１３図は、４．Ｏｍｇ／ｍｌのＣＣ４９／２１２抗原結合タンパク質サンプル を２４時間処理した結果を示すものであり、１６９１分、１４．９分および１３ ゜４２分でそれぞれ単量体、二量体および三量体が分離した。第１２図と同じＴ ＳＫゲル濾過カラムを用いた。

第１４図は、ヒトＩｇＧ分子の四本鎖構造を図式的に示すものである。

第１５Ａ図は、１つの７ステインヒンンを含む４−４−２０／２１２−重鎖抗原 結合タンパク質のアミノ酸配列（配列番号１５）および核酸配列（配列番号１４ ）である。

第１５Ｂｍは、２つのシスティンヒンジを含む４−４−２０／２１２−末鎖抗原 結合タンパク質のアミノ酸配列（配列番号１７）および核酸配列（配列番号１６ ）である。

第１６図は、二価ＣＣ４９／２１２−末鎖抗原結合タンパク質のアミノ酸配列（ 配列番号１９）および核酸配列（配列番号１８）である。

第１７図は、大腸菌タンパク質を含有する５ＤＳ−ＰＡＧＥゲル上における第１ ６図の二価ＣＣ４９／２１２−末鎖抗原結合タンパク質の発現を示す。レーン１ は分子量標準である。レーン２は３０℃で成長させた非誘導大腸菌生産株である 。レーン３は４２℃での成長によって誘導された二価ＣＣ４９／２１２−重鎖抗 原結合タンパク質である。矢印は発現した二価ＣＣ４９／２１２−末鎖抗原結合 タンパク質のバンドを示す。

第１８図は、ヒト肺カルシノーマ抽出物のＴＡＧ−７２抗原への結合において、 １５■で放射標識したＣＣ４９のＩｇＧに対して競合する、非標識ＣＣ４９１Ｃ Ｃ４９ｌ、ＣＣ４９／２１２−末鎖抗原結合タンパク質（・）およびＣＣ４９／ ２１２二価抗原結合タンパク質（■）および抗フルオレセイン４−４−２０／２ １２−末鎖抗原結合タンパク質Ｃ口）の４つの競合ラジオイムノアッセイ（ＲＩ Ａ）を表すグラフである。

第１９Ａ図は、２１７リンカーポリペプチドでＣＣ４９ＶＨ領域と結合する４ｌ −２０ＶＬ領域を含む一重鎮ポリベブチドのアミノ酸配列（配列番号２１）およ び核酸配列（配列番号２０）である。

第１９Ｂ図は、２１７リンカーポリペプチドで４−４−２０Ｖ、領域と結合する ＣＣ４９ＶＬ領域を含む一木組ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号２３）お よび核酸配列（配列番号２２）である。

第２０図は、陽イオン交換高性能液体クロマトグラフィーカラムにおける、ＣＣ ４９／４〜４−２０へテロニ量体Ｆ、の精製を描くクロマトグラムである。カラ ムはＰｏ　Ｉ　ｙＣＡＴ　Ａアスパラギン酸カラム（ＰｏｌｙＬＣ社製、コロン ビア、メリーランド州）である。ヘテロニ量体Ｆｖはピーク５て示され、３０． １０分Ｉこ溶離する。

第２１図は、第２０図で分離したタンパク質を示す、クーマノ−ブルーで染色し た４〜２０％５ＤＳ−ＰＡＧＥゲルである。レーン１は分子量標準である。レー ン３は分離前の出発物質である。レーン４〜８はそれぞれフラクション２，３゜ ５．６および７である。レーン９は精製したＣＣ４９／２１２である。

第２２Ａ図は、第２０図のフラクション２の分子サイズを定量するのに使用した クロマトグラムである。ＴＳＫ　Ｇ２０００ＳＷゲル濾過ＨＰＬＣカラム（トー ヨーソーダ社製、東京、日本）を使用した。

第２２Ｂ図は、第２０図のフラクション５の分子サイズを定量するのに使用した クロマトグラムである。ＴＳＫ　Ｇ２０００ＳＷゲル濾過ＨＰＬＣカラム（トー ヨーソーダ社製、東京、日本）を使用した。

第２２Ｃ図は、第２０図のフラクション６の分子サイズを定量するのに使用した クロマトグラムである。ＴＳＫ　Ｇ２０００ＳＷゲル濾ａＨＰＬｃカラム（トー ヨーソーダ社製、東京、日本）を使用した。

第２３図は、ＣＣ４９／４−４−２０へテロニ量体Ｆｖ（第２０図のフラクショ ン５）のフルオレセイン結合アフィニティーのスキャッチャード分析を示す。

第２４図は、ヒト肺カルンノーマ抽出物のＴＡＧ−７２抗原への結合において、 ビオチン標識し：ＣＣＣＣ４９ｌに対して競合する、非樟識ＣＣ４９４−４−２ ０Ｆｖ（■）、ＣＣ４９／２１２−重鎮Ｆｖ（ロ）およびＭＯＰＣ−２１１ｇＧ （＋）の３つの競合エライザ法（ＥＬＩ　ＳＡ）を表すグラフである。ＭＯＰＣ −２１はＴＡＧ−７２抗原と結合しない対照抗体である。

第２５図は、クーマン−ブルー染色非還元４〜２０％５ＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示 す。レーン１および９は分子量標準である。レーン３は精製後の４−４−２０／ ２１２ＣＰＰＣ−末鎖抗原結合タンパク質である。レーン４．５および６はＤＴ Ｔ処理および空気酸化後の４−４−２０／２１２ＣＰＰＣ−末鎖抗原結合タンパ ク質である。レーン７は４−４−２０／２１２−重鎖抗原結合タンパク質である 。

第２６図は、クーマ／−ブルー染色還元４〜２０％５ＤＳ−ＰＡＧＥゲルである （サンプルはゲルに展開する前にβ−メルカプトエタノールで処理した）。レー ン１および８は分子量標準である。レーン３はビス−マレイミドヘキサン処理後 の４−４−２０／２１２ＣＰＰＣ−末鎖抗原結合タンパク質である。レーン５は ビス−マレイミドヘキサン処理した４−４−２０／２１２ＣＰＰＣ−重鎖抗原結 合タンパク質のピーク１を含む。レーン６は、ビス−マレイミドヘキサン処理し た４−４−２０／ＣＰＰＣ−末鎖抗原結合タンパク質のビーク３を含む。

好ましい具体例の詳細な説明 本発明は多価型の一本鎖抗原結合タンパク質が一価の一本鎖抗原結合タンパク質 よりも重要な効用を有することの発見に関する。多価抗原結合タンパク質は１つ 以上の抗原結合部位を持つ。本明細書において、「価」とは、抗原結合部位の数 を意味する。したがって、二価のタンパク質は２つの結合部位をもつタンパク質 を意味する。多価抗原結合タンパク質の増強された結合活性、２−およびマルチ −特異的結合、およびその他の新規な用途を本明細書で説明した。したがって、 本発明は多価型の一本鎖抗原結合タンパク質、多価および一本鎖抗原結合タンパ ク質を含む組成物、多価型の一本鎖抗原結合タンパク質の製造法ならびに精製法 、および多価型の一本鎖抗原結合タンパク質の用途に関する。本発明は２つ以上 の一末鎖タンパク質分子からなる多価抗原結合タンパク質を提供するものであり 、該各−重鎖分子は、抗体のＨ鎖またはＬ鎖の可変領域の結合部分を含む第１ポ リペプチド：抗体のＨ鎮またはＬ鎖の可変領域の結合部分を含む第２ポリペプチ ド、および第１および第２ポリペプチドを結合して一本鎖タンパク質にするペプ チドリンカ−を含む。

「多価」とは、共有的または非共有的に結合した２個以上の一本鎖タンパク質の 集合を意味し、この集合は１つ以上の抗原結合部位を有している。該集合を構成 する一本鎖タンパク質は抗原結合活性があってもよいし、あるいは失活していて もよいが、集合して活性多価抗原結合タンパク質になることができる。「多価」 には、二価、三価、四価などが包含される。二価以上の多価型は幾つかの適用に おいて有用である。

多価抗原結合タンパク質の好ましい型は、ヘテロ三価型およびホモ三価型などの 二価のタンパク質である。「二価」とは、互いに会合して２つの抗原結合部位を 形成する一本鎖タンパク質の集合を意味する。「ヘテロ三価」とは、２つの異な る抗原決定基に結合しうる二特異的分子である多価抗原結合タンパク質をいう。

したがって、ヘテロ三価のタンパク質は、結合特異性の異なる２つの抗原結合部 位を有する。「ホモ三価」とは、同じ抗原決定基に結合しうる２つの結合部位を いう。

「−重鎖分子」または「−末鎖タンパク質」とは、本明細書では互換的に使用さ れる。それらは、抗体の可変領域由来の第１ポリペプチドの結合部分、これと会 合する抗体の可変領域由来の第２ポリペプチドの結合部分、第１および第２ポリ ペプチドを結合して一末鎖ボリベブチドにするペプチドリンカ−を含むものとし て、構造的に定義される。したがって、−重鎮ポリペプチドはポリペプチドリン カ−で結合する−組みの可変領域を含む。該領域が、適当に組み合わせた相補性 決定領域（ＣＤＲ）を有するＬ鎖可変領域およびＨ鎖可変領域を含む場合、それ らは、会合して官能性抗原結合部位を形成する。この場合、−末鎖タンパク質を 「−末鎖抗原結合タンパク質」または「−重鎖抗原結合分子」という。

一方、得られる一本鎖分子が官能性抗原結合部位をもたない場合、可変領域を意 図的にＣＤＲと組み合わせるかまたは同じ種類の抗体鎖のＨＭまたはＬ鎖のいず れかから誘導してもよい。米国特許第４，９４６．７７８号（ラドナーら）には 、−末鎖抗原結合タンパク質について、より十分に記載されており、ここに参考 文献として挙げる。

特定の理論によって制限されることなく、本発明者らは多価性の現象を等しく説 明しうるような幾つかのモデルを推測する。本発明者らのモデルは、解説のため のみにここに提唱されるものであり、本発明の範囲を限定するものと解釈される べきてはない。本発明は多価性の正確なメカニズムにはかかわらず、有用かつ実 施可能である。

第１図は、多価タンパク質の創製のための最初の仮想モデルであり、「会合モデ ル」と称する。第１Ａ図は、それぞれＶ、、ＶＮおよびこれらを共有的に架橋す るリンカ−ポリペプチドからなる、２つの一価の一本鎖抗原結合タンパク質を示 す。各−価の一本鎖抗原結合タンパク質が、相同の抗原結合部位に抗原を結合し ていることが描かれている。第１Ｂ図は、２つの一本鎖抗原結合タンパク質が単 純会合して、二価型の多価タンパク質を創造することを表す。−価のタンパク質 相互間の単純な疎水力が原因となり、このように会合すると仮定される。多価タ ンパク質の発端はそれらの濃度依存状態から突き止めることができる。−価のユ ニットは、ＶＭとＶＬ領域間のそれらの元々の会合を保持している。第１ｃ図は 、２つの相同の抗原分子と同時に結合している新たに形成されたホモ三価タンパ ク質を表す。ホモ三価抗原結合タンパク質は抗原に対して必然的にモノ特異的で ある。

第２Ａ図から第２Ｃ図には、会合モデルによって形成されたホモ価のタンパク質 が描かれている。第２Ａ図はホモ三価のタンパク質、第２Ｂ図は三価のタンパク 質および第２Ｃ図は四価のタンパク質である。もちろん、３次元の物体をＺ次元 のイメージで表現することによる制限は考慮に入れなければならない。したがっ て、多価タンパク質の実際の空間的な構成はこれらの図から幾分は異なることが 予想できる。

ヘテロ三価抗原結合タンパク質には２つの異なる結合部位があり、これらの部位 は異なる結合特異性をもっている。第３Ａ〜３０図はへテロ二個タンパク質の創 造の会合モデル経路を描いたものである。第３Ａ図は、２つの一本鎖抗原結合タ ンパク質、すなわち抗Ａ−末鎖抗原結合タンパク質と抗Ｂ−末鎖抗原結合タンパ ク質において、抗原Ａまたは抗原Ｂがそれぞれの結合部位を占めている状態を描 いたものである。第３Ｂ図は、最初の一価のタンパク質の単純会合によって形成 されるヘテロ三価タンパク質を描いたものである。第３Ｃ図は、抗原結合部位を 占める抗原Ａおよび抗原Ｂを有するヘテロ三価抗原結合タンパク質を描いたもの である。しこがって、第３Ｃ図には二特異的に結合するヘテロ三価タンパク質が 描かれている。

第４図から第６図には、多価抗原結合タンパク質の形成の別のモデルを表す。

この「転位」モデルは、単独または組み合わせで使用するグアニジノ塩酸塩、尿 素またはアルコール（エタノールなど）などの解離剤と接触させることによる可 変領域の解離を仮想したものである。解離剤の組み合わせと適切な１度範囲は、 解離削に関する議論および実施例２で挙げている。第４Ｂ図に描かれるように、 解離した領域を続いて再会合することにより、可変領域が出発−末鎖タンパク質 とは異なるものに組換えられる。第４Ｂ図のホモ二価の抗原結合タンパク質は、 第４Ａ図の親の一本鎖抗原結合タンパク質から形成され、該組換えられた二価の タンパク質は親の一価の一重鎖タンパク質由来のＶ８とｖＬを有している。第４ Ｂ図のホモ二価のタンパク質は完全に官能性モノ特異的二価のタンパク質であり 、２つの抗原分子に結合する活性を示す。

第５Ａ図〜第５Ｃ図は、転位モデルを経るヘテロ三価抗原結合タンパク質の形成 を表す。第５Ａ図は、それぞれ会合するＶｅの相補性決定領域（ＣＤＲ）とは揃 わない相補性決定領域を含むＶＬを有する１組の一本鎖タンパク質を表す。抗原 結合部位が混合している状態なので、これらの−末鎖タンパク質は分解するかま たは抗原結合能力がなく、したがって、この経路を経て多価タンパク質へと集合 させる。第５Ｂ図は、親のタンパク質のＶｌ、ｌおよびＶＬ領領域ヘテロ三価タ ンパク質の分割された半分の間に分配することによって形成されるヘテロ二価の 抗原結合タンパク質を表す。第５Ｃ図は、得られる官能性二特異的ヘテロ三価の タンパク質に２つの異種の抗原が結合することを表す。また、１組以上の一本鎖 タンパク質がこのように再集合しうろことが認められるので、転位モデルによっ て二価より高次の多価タンパク質の生成も説明される。これらのことが第６Ａ図 および第６Ｂ図に描かれている。

多価抗原結合タンパク質の主な効用のひとつは、そのヘテロ二価型にあり、この 型においては、第１の特異性がひとつの型のハプテンまたは抗原に対するもので あり、第２の特異性が第２のハブテンまたは抗原に対するものである。２つの別 々の結合特異性を有する多価分子は多くの潜在的用途がある。たとえば、ひとつ の抗原結合部位は、腫瘍細胞またはその他の望ましくない細胞などの標的細胞の 細胞表面のエピトープに特異的であることができる。他の抗原結合部位は、細胞 障害性Ｔ細胞などのＣＤ３タンパク質エフエククー細胞の細胞表面のエピトープ に特異的であることができる。このようにして、ヘテロ二価の抗原結合タンパク 質は、細胞障害性細胞を優先的に攻撃されるべき特定の種類の細胞へと誘導でき る。

ヘテロ二価の抗原結合タンパク質のその他の用途は、組織プラスミノーゲンアク チベータ−（ｔＰＡ）およびフィブリンに対する特異性をもっ二特異的分子によ る特異的ターゲツティングおよび血餅破壊：腫瘍細胞および酵素に対する特異性 をもつ二特異的分子によるプロドラッグ活性化酵素の腫瘍細胞への特異的ターゲ ツティング、および腫瘍細胞および細胞障害性タンパク質に対する特異性をもっ 二特異的分子による細胞障害性タンパク質の腫瘍細胞への特異性ターゲツティン グである。このリストは例示を意味するのみであり、多価特異性が適用できるい ずれの用途も本発明の範囲に含まれる。

精製およびバイオセンサーにおける多価抗原結合タンパク質の使用も本発明に含 まれる。アフィニティー精製は、抗原結合部位を分離されるリガンドに接触させ 、多価抗原結合タンパク質を支持体に付着させることにより可能となり、がくし で精製が行われる。バイオセンサーは、特異的抗原の抗原結合分子への結合の際 の検出可能なシグナルが発生し、続いてシグナルを加工することにより行われる 。多価抗原結合タンパク質は、バイオセンサーにおける抗原結合分子として使用 される場合、結合の構造を変えることができ、したがって検出可能なノブナルを 発生する。

先行技術に描かれているモノクローナルまたはポリクローナル抗体あるいはそれ らのフラグメント対する用途のすべては、本質的に本発明の多価タンパク質が提 供しうるちのである。これらの用途には、検出可能に標識された型の多価タンパ ク質が包含される。標識の型は、当業者にとって公知である。すなわち、放射標 識、化学発光標識、フルオロクロム酸標識および発色団標識などである。その他 の用途は、標識された多価タンパク質を有効量投与し、該動物に関連する検出可 能な放射線を測定することによる、動物（ヒトを含む）の内部構造のイメージン グである。さらに他の用途は、標識抗体を本発明の多価抗原結合タンパク質で置 き換えることができる、サンドウィッチイムノアッセイ、競合イムノアッセイな どの改良イムノアッセイである。

第１の多価抗原結合タンパク質の好ましい生産法は、実施例１で説明するように 、多価タンパク質および一本鎖タンパク質の両方からなる生産組成物から、多価 タンパク質を分離することである。該方法は多価タンパク質および一重鎖タンパ ク質の組成物を生産し、多価タンパク質を一本鎖タンパク質から分離し、多価タ ンパク質を回収することを特徴とする。

第２の多価抗原結合タンパク質の好ましい生産法は、−重鎖タンパク質分子を生 産し、−重鎖分子を解離し、得られる組成物の多（のフラクションが多価型の一 本鎖抗原結合タンパク質を含むように一本鎖分子を再会合し、多価抗原結合タン パク質を一本鎖分子から分離し、多価タンパク質を回収するステップを特徴とす る。この過程は実施例２てより詳しく説明する。この方法において、「−重鎖分 子からなる組成物の生産」とは、これらの分子の現実的生産を意味する。また、 この語句は、−重鎖分子からなる組成物を調達するために、市販のものを入手し ても実験室で調製してもよいことをも意味している。「−末鎖タンパク質の生産 」という語句は、あらゆる過程による一本鎖タンパク質の生産を意味するが、米 国特許第４．９４６．７７８号（ランダーら）の記載に準じた方法が好ましい。

簡単に言えば、この特許は、抗体のＬ鎖およびＨ鎖可変領域の集塊の結合特異性 およびアフィニティーと類似した結合特異性およびアフィニティーをもつ一重鎖 ポリペプチド抗原結合分子、それらをコードする遺伝子配列およびこのような分 子のＤＮＡ組換え法ならびに該分子の用途に関するものである。ランダーらの方 法によって生産された一重鎖タンパク質は、リンカ−ポリペプチドで結合される ２つの領域からなる。該２つの領域は〜ｒｌｌおよびＶＬ領領域呼ばれ、各領域 は半分の官能性抗原結合部位を含んでいる。

「−重鎖分子の解離」とは、可変領域に変性を起こさずに一本鎖タンパク質の２ つの可変領域を物理的に分離することを意味する。

ここで用いる「解離剤」には、上記のように可変領域を分離しうるすべての解離 剤が含まれる。本発明においては、アルコール（エタノールなど）、グアニジン 塩酸塩（ＧｕＨＣｌ）および尿素などの公知の解離剤を使用しうる。界面活性剤 および相互作用を阻止し、タンパク質の構造を維持しうる類似の作用剤など、他 の解離剤も当業者には明らかであろう。解離剤はＧｕＨＣＩとエタノール（Ｅｔ ＯＨ）の組み合わせて使用するのが好ましい。エタノールは０〜５０％ｖｏｌ／ ｖｏｌ、ＧｕＨＣｌはＯ〜２．０モル／リットル（Ｍ）の使用範囲が好ましい。

さらに好ましい使用範囲は、エタノールが１０〜３０％、ＧｕＨＣｌが０．５〜 １．０Ｍ、最も好ましい使用範囲は、エタノールが２０％、ＧｕＨＣＩが０．５ Ｍである。領５Ｍグアニジン塩酸塩、２０％エタノール、０．０５Ｍ　ＴＲｌ５ および００１ＭＣａＣｌ２を含有し、ｐＨ８，０の解離緩衝液が好ましい。

「−重鎖分子の再会合」とは、可変領域を該領域が再会合しうる緩衝液と接触さ せることによる再会合を意味する。本発明では、そのような緩衝液の使用が好ま しく、たとえば０．０４ＭＭ０ＰＳおよび０１０Ｍ酢酸カルシウムを含有し、ｐ Ｈ７，５のものである。■、およびＶｌｌ領域を再会合しうるその他の緩衝液も 当業者には公知である。

公知の標準的な技術、特に陽イオン交換クロマトグラフィーまたはゲル濾過クロ マトグラフィーなどを用いることにより、−重鎖分子から多価タンパク質が分離 される。

陽イオン交換クロマトグラフィーは、当業者に公知である陰イオンカラムを利用 するイオン交換クロマトグラフィーの中で一般的な液体クロマトグラフィー技術 である。本発明では、交換される陽イオンは一本鎖分子および多価タンパク質分 子である。多価タンパク質は、−重鎖分子の何倍かの正味荷電をもつので、多価 タンパク質はより強力に保持され、したがって−重鎖分子から分離される。本発 明の好ましい陽イオン交換器は、第７図に示すポリアスパラギン酸カラムである 。第７図は、二価のタンパク質（ピーク２．５５．２４分）からの−重鎖タンパ クＷ（ピーク１．２７．３２分）を描いたものである。２つの型のタンパク質分 子を分離可能なものである限り、本発明が特定の型のクロマトグラフィーに限定 されるものではないことが当業者には理解されよう。

ゲル濾過クロマトグラフィーでは、それらの分子量に基づいてタンパク質を分離 するためにゲル様の物質を使用する。「ゲル」とは、アガロースやポリアクリル アミドなどの水とポリマーからできた基質である。当業者には理解されるように 、ゲル＃過ＨＰＬＣ（高性能液体クロマトグラフィー）の使用も本発明に含まれ る。第８図はウォーターズ・アソシェイッＰｒｏｔｅｉｎ−Ｐａｋ３００ＳＷゲ ル濾過カラムを用いて一価の一重鎖タンパク質を多価タンパク質から分離したク ロマトグラムであり、単量体（２１，９４０分）、二価のタンパク質（２０，１ ３５分）および三価のタンパク質（１８，６４０分）が溶離する。

化学および生化学の分野で公知の標準的収集操作によって多価抗原結合タンパク 質の回収を行う。本発明における多価タンパク質の回収は、陽イオン交換カラム またはゲル濾過ＨＰＬＣカラムのいずれかから得られるピークを含有する溶離フ ラクションの収集により行う。手動および自動フラクション収集装置は当業者に は公知である。次の操作は溶離液を凍結乾燥して安定した固体を得るかまたはさ らに精製することである。

多価抗原結合タンパク質の第３の好ましい生産法は、低濃度の精製された一重鎖 タンパク質を出発物質とし、次いで、多価タンパク質のフラクションが形成され るまで濃度を高くする方法である。次いで、多価タンパク質を分離し、回収する 。このようにして多価タンパク質が形成される濃度は、約１５ミリグラム／ミリ リットル（ｍｇ／ｍｌ）から沈殿形成が開始される濃度までである。

多価および一重鎖抗原結合タンパク質分子の組成物を説明するときに用いる語句 「実質的にない」とは、実施例１のように陽イオン交換クロマトグラフィーによ るかまたは実施例２のようにゲル濾過クロマトグラフィーによって、組成物を分 析するときに、−末鎖分子に対応するピークがないことを意味する「水性組成物 」とは、部分的に水を含有する一重鎖分子および多価タンパク質の組成物を意味 する。同様に、「−末鎖分子に対して過剰の多価抗原結合タンパク質」とは、５ ０％以上の多価抗原結合タンパク質を含む組成物をいう。「架橋」とは、−価の 一本餉タンパク質分子から多価抗原結合タンパク質を生産しうる化学的手段を意 味する。たとえば、−重鎖タンパク質上のシスティン残基として、架橋しうるス ルフヒドリル基を結合すると、スルフヒドリル基の緩い還元によって架橋がおこ る。２つ以上の一重鎖タンパク質間に共有結合を生じさせ、該タンパク質の遊離 のンステイン基を架橋することによって、モノ特異的およびマルチ特異的多価タ ンパク質の両方が一重鎖タンパク質から生産できる。実施例５および実施例８に 記載するように、遊離のシスティンは４−４−２０／２１２一本鎖抗原結合タン パク質のＣ末端に取り付けられている。次いで、これらの遊離のシスティンを架 橋して多価抗原結合タンパク質を形成することができる。

また本発明には、（ａ）抗体のし鎖の可変領域の結合部分を含む第１ポリペプチ ド：（ｂ）抗体のＬ鎖の可変領域の結合部分を含む第２ポリペプチド、および（ ｃ）第１ポリペプチド（ａ）および第２ポリペプチド（ｂ）を結合して一重鎖タ ンパク賀にするペプチドリンカ−を含む一重鎖タンパク質も含まれる。Ｈ鎖の可 変領域を含む同様の一重鎖タンパク質もまた本発明の一部分である。これらの分 子をコードする遺伝子配列もまた本発明の範囲に含まれる。これらのタンパク質 は２つの同様な可変部を含むので、抗原結合能力をもつとは隔らない。

本発明には、二特異的二価の抗原結合タンパク質のＤＮＡ配列も含まれる。実施 例４および実施例７において、第１０Ａ図および第１０Ｂ図の配列を詳細に説明 するが、それによって当業者はへテロ三価抗原結合分子を作成しうるであろう。

第１０Ａ図は、２１２リンカ−ポリペプチドでＣＣＣ４９Ｖ領域と結合する４− ４２０ＶＪＪ域を含む一重鎖タンパク質のアミノ酸配列および核酸配列である。

第１０Ｂ図は、２１２リンカ−ポリペプチドで４　４　２０ＶＨ領域と結合する ＣＣ４９Ｖ、領域を含む一重鎖タンパク質のアミノ酸配列および核酸配列である 。

これらの一本鎖分子を含む組成物を解離さ也次いで、再会合させると、２つの異 なる結合特異性をもっ二価のタンパク質が得られる。

ＤＮＡ配列の合成は公知であり、少なくとも２つのルートから合成できる。第１ に、−次配列情報が分かれば、自動ＤＮＡンンセサイザーで初めからＤＮＡ配列 が合成できるのは公知である。別法としては、一本鎖抗原結合タンパク質をコー ドする遺伝子末端から停止コドンを取り除き、次いで、リンカ−と第２−重鎮抗 原結合タンパク質をコードする遺伝子を挿入することにより、多価一本鎖抗原結 合タンパク質をコードするＤＮＡ配列を獲得することができる。実施例６では、 二価の一重鎖抗原結合タンパク質をコードするＤＮＡ配列の構築を説明する。遺 伝子的に多価−重鎮抗原結合タンパク質を構築するその他の方法も本発明の範囲 に含まれる。

本発明を詳しく解説するために次に特定の実施例を記載するが、特記しない限り 、これらは本発明の範囲を限定するものではないと理解すべきである。

実施例１ 精製中の多価抗原結合タンパク質の生産多価抗原結合タンパク質の生産において 、先の一重鎖抗原結合タンパク質の生産で用いたものと同じ組換え大腸菌生産シ ステムを使用した。バード（Ｂｉｒｄ）らのｒｓｃｉｅｎｃｅＪ、２４２：４２ ３（１９８８年）参照。この生産システムは抗原結合タンパク質として全大腸菌 タンパク質の２〜２０％を生産した。タンパク質回収のために、３つの１０リッ トル発酵器（６００〜９００ｇ）からの凍結細胞ペーストを４℃で一夜融解し、 湿潤細胞ペースト１キログラム当たり１０リツトルの溶解緩衝液（５０ｍＭ）リ ス塩酸、１．０ｍＭ　ＥＤＴＡ、１００ｍＭ　ＫＣＩ、０．１ｍＭ　ＰＭＳＦ、 ｐＨ８）に穏やかに再懸濁させた。完全に再懸濁したとき、冷蔵混合物をマント ン−ガラリン（Ｍａｎｔｏｎ−Ｇａｕｌｉｎ）細胞ホモジナイザーに３回通過し て細胞を完全に溶解した。細胞ホモジナイザーが細胞溶解物の温度を２５±５℃ に上昇させるので、各通過後に細胞溶解液をローダ／ブリンクマン（Ｌａｕｄａ ／　Ｂｒｉｎｋｍａｎ）冷蔵コイルで５±２℃に冷却した。顕微鏡で視覚的に視 察して完全に溶解したことを確認した。

５ｏｒｖａｌｌＲＣ−５Ｂ遠心分離機を用い、細胞溶解液を２４３００ｇで３０ 分間、６℃にて遠心分離した。不溶性の抗原結合タンパク質を含むペレットを保 存し、上清を廃棄し、た。ペレットを遠心分離ボトルから穏やかにかき集め、湿 潤細胞ペースト１キログラム当たり５リツトルの溶解緩衝液に再Ｖ、濁させるこ とにより洗浄した。得られる３　０〜４５リツトルの懸濁液を再度２４３００ｇ で３０分間、６℃にて遠心分離した。上清は廃棄した。このペレット洗浄により 、溶解する大ｌｉ！菌タンパク質が除去され、５回繰り返すことができる。この 洗浄操作中いつでも、物質を一２０℃にて凍結ペレットとして保存できる。遠心 分離の代わりに、０．２２μｍ微細孔フィルターを備えたベリコン・タンノエン ンヤル・フロラ（Ｐｅｌｌｊｃｏｎ　Ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ　Ｆｌｏｗ）装置を 利用することにより、洗浄ステップ４こおける実質的な時間の節約が行える。

洗浄したペレットを、ペレット１グラム当たり９ｍｌの新たに調製した解離緩衝 液（６Ｍグアニジン塩酸塩、５０ｍＭトリス塩酸、１０ｍＭ　ＣａＣ１ｘ、５０ ｍＭ　ＫＣＬ　ｐＨ８，０）中で、４℃にて可溶化させた。必要ならば、可溶化 を完全にするために、２〜３回すばやく加熱システム超音波組織ホモジナイザー のパルスを利用することができる。得られる懸濁液を２４３００ｇで４５分間、 ６℃にて遠心分離し、ペレットを廃棄した。２８０ｎｍにおいて、上清の光学密 度を測定し、もし０Ｄｚｓｏが３０以上ならば、さらに解離緩衝液を加えて、Ｏ Ｄ！、、を約２５にした。

１．１０希釈に到達するまで、冷却した（４〜７℃）再生緩衝液（５０ｍＭ）リ ス塩酸、１０ｍＭＣａＣｌ２．５０ｍＭＫＣｌ、ｐＨ８，０）で、上清をゆっく りと希釈した（最終体積１０〜２０リツトル）。これらの条件下、約１８時間で 再生が起こる。ＧｕＨＣ］抽出物を再生緩衝液に、穏やかに撹拌しながら２時間 かけてゆっくりと加えるときに、最もよい結果が得られる。溶液を少なくとも２ ０時間そのままで放置し、この溶液に、最終エタノール濃度が約２０％となるよ うに９５％エタノールを加えた。この溶液を底に固まりの物質が落ち着くまで、 通常６０分以内、放置した。溶液を０．２μｍのミリポア・ミリバク２００で濾 過した。この濾過ステップを必要に応じて遠心分離ステップに先立って行っても よい。１００Ｏ１００ＯＯカートリツジのアミコン（Ａｍｉｃｏｎ）スパイラル カートリッジを用い、４℃で、再度濾液を１〜２リツトルに濃縮した。

濃縮した粗抗原結合タンパク質サンプルを、その伝導率が緩衝液Ａ（６０ｍＭＭ ＯＰＳ、０．５ｍＭ酢酸カルシウム、ｐＨ６，０−６，４）の伝導率より低くな るまで、緩衝液Ａに対して透析した。次いで、サンプルを２１．５ｘ２５０ｍｍ ポリアスパラギン酸Ｐｏ　ｌ　ｙＣＡＴ　Ａカラム（ＰｏｌｙＬＣ社製、コロン ビア、メリーランド州）に通した。このカラムに６Ｑｍｇ以上のタンパク質を通 すと、分解が始まり、劣化する；したがって、濃縮された粗サンプルをしばしば 幾つかのＰｏ　Ｉ　ｙＣＡＴ　Ａに分けて通さなければならない。はとんどの抗 原結合タンパク質が２８０ｎｍにおいて約２．Ｑｍｌ／ｍｇ／ａｍの吸光係数を 有し、これを用いてタンパク質濃度の定量ができる。抗原結合タンパク質サンプ ルを緩衝液Ａから緩衝液Ｂへの５０分間直線勾配を用い、Ｐｏ　Ｉ　ｙＣＡＴ　 Ａカラムを通して溶離した（表１参照）。この勾配を用いる場合、はとんどの一 本鎖タン１＜り勤＜２０〜２６分の間で溶離する。これは、約７０％の緩衝液Ａ と３０％の緩衝液Ｂの溶離溶媒組成に対応する。はとんどの二価の抗原結合タン Ｉくり質は４５分以降（＝溶離し、これは９０％の緩衝液Ｂに対応する。

第７図は、上述の陽イオン交換法を用いた二価のＣＣ４９／２１２タンノくり質 からの一本鎖タンパク質の分離を描くクロマトグラムである。ピーク１（２７， ３２分）は、単量体の一本鎖フラクションを表す。ピーク２（５５，５２分）（ マ、二価のタンパク質フラクションを表す。

第８図は精製した単量体の一本鎖抗原結合タンノくり質ＣＣ４９／２１２（第７ 図ノフラクション７）を、ウォーターズＰｒｏｔｅｉｎ−Ｐａｋ３００ＳＷゲル 濾過カラムに通したクロマトグラムである。少量の二量体および玉量体力くコン タミネーションする単量体が示されている。第９図は、精製した二価の抗原結合 タンパク質ＣＣ４９／２１２（第７図のフラクション１５）を、第８図で用（１ プこウォーターズＰｒｏｔｅｉｎ−Ｐａｋ３００ＳＷゲル濾過カラムに通したク ロマトグラムである。

表１ ｂ　緩衝液Ａ、６０ｍＭ　ＭＯＰＳ、０．５ｍＭ酢酸カルシウム、ｐＨ６，０− ６，４；緩衝液Ｂ、　６０ｍＭ　ＭＯＰ　３．２０＋＋Ｍ酢酸カルシウム、ｐＨ ７，５−８，０；緩衝液Ｃ，４０ｍＭＭ０ＰＳ、１００ｍＭ　ＣａＣ１ｔ、Ｉ） Ｈ７，５この精製操作により、５ＤＳ−ＰＡＧＥおよびサイズ除外クロマトグラ フィーで試験したところ、純度９５％以上の多価抗原結合タンパク質が得られた 。上置操作は、精製される特定の多価抗原結合タンパク質の等電点により、修正 してもよい。現在までに精製された単量体の一本鎖タンパク質において、すべて のタンパク質の等電点（ｐｌ）は８０〜９５の間である。しかし、多価抗原結合 タンパク質はｐＨ７，Ｏ以下で生産することが可能である。この場合、陰イオン 交換カラムが精製に必要である。

ＣＣ４９モノクローナル抗体は、国立ガン研究所の腫瘍免疫学および生物学研究 室のジェフリー・ツユロム（Ｊｅｆｆｒｅｙ　Ｓｃｈｌｏｍ）博士のグループに より作り出された。それはパンカル７ノーマ抗原ＴＡＧ−７２と特異的に結合す る。ムラ口（Ｍｕｒａｒｏ）、　ＲらのｒＣａｎｃｅｒＲｅｓｅａｒｃｈＪ、４ ８：４５８８　４５９６（１９８８年）参照。

ヒト肺カルノノーマ抽出物のＴＡＧ−７２抗原への結合に対する二価および単量 体のＣＣ４９／２１２抗原結合タンパク質の結合特性を決定するために、１２５ ■で放射標識したＣＣ４９ＣＣ４９ｌつの抗原結合部位をもつ）を非標識ＣＣＣ Ｃ４９Ｉ、または−価のＣＣ４９／２１２（第７図のフラクション７）あるいは 二価のＣＣ４９／２１２（第７図のフラクション１５）抗原結合タンパク質に対 して競合させる競合ランオイムノアンセイ（ＲＩＡ）を組み立てた（第１８図参 照）。この競合ＲＩＡから、二価の抗原結合タンパク質が、抗原に対して、Ｉｇ Ｇと同等に競合するが、−価の一本鎖抗原結合タンパク質はＩｇＧと置き換わる ためには１０倍のタンパク質濃度を必要とすることがわかった。したがって、− 価の抗原結合タンパク質は、二価のＩｇＧまたは二価の抗原結合タンパク質と比 べて、約１０分の１の低アフィニティーで抗原に対して競合するといえる。第１ ８図は、結合競合しないＴＡＧ−７２に非特異的一本鎖抗原結合タンパク質であ る抗フルオレセイン４−４−２０／２１２の競合ＲＩＡの結果も示す。

実施例２ 解離剤を用いる多価抗原結合タンパク質の製造工程Ａ、グアニジンＨＣＩおよび エタノールを使用する工程次に示す方法で、精製−末鎖タンパク質から多価抗原 結合タンパク質を生産した。まず初めに、濃度０．２５〜４ｍｇ／ｍｌの精製− 末鎖タンパク質を、緩衝液（０゜０５Ｍ　ＴＲｌ５，０．０５Ｍ　ＫＣＩ、０． ＯＩＭＣａＣｌｔ、ｐＨ８，０）中の領５モル／リットル（Ｍ）のグアニジノ塩 酸塩（ＧｕＨＣＩ）、２０％エタノール（ＥｔＯＨ）で透析した。この解離剤の 組み合わせは、第１の一本鎖分子のＶＨを第２の一本鎖分子からのＶしと接触さ せて、ｖＬ／Ｖ□の界面を破壊すると考えられる。

尿素、およびイソプロパツールまたはメタノールなどのアルコール等の他の解離 剤もＧｕＨＣｌおよびエタノールに置換しうる。最初の透析に続いて、最後のＨ ＰＬＣ精製ステップ用の緩衝液でタンパク質を透析する。−末鎖タンパク質単量 体を多価抗原結合タンパク質から分離するために、２つの分離精製方式、すなわ ち陽イオン交換クロマトグラフィーおよびゲル濾過クロマトグラフィーを使用す る。第１方法において、単量体タンパク質と多価抗原結合タンパク質の分離を、 ポリアスパラギン酸カラム（Ｐｏ　］　ｙＣＡＴ　Ａ）を用いた陽イオン交換Ｈ ＰＬＣクロマ１−グラフィーを利用して行った。この方法は、実施例１に記載し た抗原結合タンパク質の最後の精製において使用した操作と同様の操作で行った 。カラム１４填したＥＩＩｉｉｆｆｌは０．０６Ｍ　ＭＯＰＳ、０００１Ｍ０１ Ｍ酢酸カルシウム６４であった。第２方法において、単量体タンパク質と多価抗 原結合タンノ（り質の分離を、緩衝液として０．０４Ｍ　ＭＯＰＳ、０．１０Ｍ 酢酸カルシウム、ｐＨ７５を用いたゲル濾過ＨＰＬＣクロマトグラフィーによっ て行った。ゲル濾過クロマトグラフィーは分子のサイズに基づいてタンパク質を 分離する。

抗原結合タンパク質サンプルを陽イオン交換ＨＰＬＣカラムに通すとき、充填緩 衝液（００４〜０．０６ＭＭ０ＰＳ、００００〜０．ＯＯＩＭ０１Ｍ酢酸カルシ ウム１０％グリセロール、ｐＨ６，０〜６４）と第２緩衝液（００４〜０．０６ ＭＭ０ＰＳ、００１〜０．０２Ｍ酢酸カルシウム、０〜１０％グリセロール、ｐ Ｈ７，５）の間に直線勾配を作った。抗原結合タンパク賀サンプルをカラムに通 す前に、広範囲にわたって透析することが重要であった。通常、透析緩衝液に対 してサンプルの伝導率をモニターする。伝導率が６００μｓ以下になるまで透析 を続ける。第１１図は、ＣＣ４９／２１２抗原結合タンパク質の単量体型（２７ ８３分）と二価型（５０，４７分）の陽イオン交換による分離を表す。この分離 におけるクロマトグラフィー条件は、次のとおりである：Ｐｏ１ｙＣＡＴ　ａカ ラム、２００Ｘ４．６＋ｎ、送液速度０．６２ｍｌ／分；実施例１の充填緩衝液 と第２緩衝液；勾配プログラムは充填緩衝液Ａを４８分間で１００％〜０％と変 化させる；サンプルはＣＣ４９／２１２．１　、６６ｍｇ／ｍｌ　；住人容量０ ．２＋１１゜類似したクロマトグラムからの２つのピークからフラクションを集 め、次に述べるゲル濾過ＨＰＬＣクロマトグラフィーを用いて単量体および二価 のタンパク質を同定した。

ゲル濾過ＨＰＬＣクロマトグラフィー（ＴＳＫ　Ｇ２００Ｏ３Ｗカラム、トーヨ ーソーダ社製、東京、日本）を用いて一本鎖タンパク質単量体および多価抗原結 合タンパク質の同定、分離を行った。この操作はフカバＦｕｋａｎｏ）らのり、 　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙｊ、１６６　：　４７（１９７８年）に記載さ れている。０．５ＭＧｕＨＣＩと２０％エタノールで表２Ａに表示した時間の処 理を行い、次いでクロマトグラフィー緩衝液に透析することにより、多量体化（ 単量体の一本鎖タンパク質からの多価タンパク質の創製）を行った。第１２図は 、８６．２／２１２抗原結合タンパク質の単量体（１７，６５分）、二価体（１ ５，７９分）、３価体（１４，１９分）および高次オリゴマー（１３，０９分に おけるンヨルダ一部）の分離を表す。Ｂ　６．２／２１２−重鎮抗原結合タンパ ク質はコルチャー（Ｃｏｌｃｈｅｒ）、　Ｄ、らのｒＪ、　Ｎａｔ、　Ｃａｎｃ ｅｒＩｎｓｔｌ、８２：１１９１−１１９７（１９９０年）に記載されている。

この分離は、１．０ｍｇ／ＩＩｌのＢ　６．２／２１２抗原結合タンパク質サン プルを２４時間多量体化処理した結果である。ＨＰＬＣ緩衝液として、０．０４ ＭＭ０ＰＳ、０．１０Ｍ酢酸カルシウム、０．０４％アジ化ナトリウム、ｐＨ７ ，５を使用した。

第１３図は、４．Ｑｍｇ／ｍｌのＣＣ４９／２１２抗原結合タンパク質サンプル を２４時間処理した結果であり、単量体、二価体および３価体がそれぞれ１６． ９１分、１４９分および１３．４２分で溶離された。ＨＰＬＣ緩衝液は４０ｍＭ Ｍ０ＰＳ、１００ｍＭ酢酸カルシウム、ｐＨ７，３５であった。多量体化処理は 表２に表示した時間行った。

実施例２Ａの結果を表２Ａに示す。表２Ａは、２０％エタノールおよび０．５Ｍ ＧｕＨＣＩ処理の前後における二価体および他の多価体のパーセンテージを表す 。他に指示がない限り、パーセンテージは自動データ積分ソフトウェアパッケー ジを用いて決定した。

表２Ａ グアニジン塩酸塩およびエタノールを用いる二価および多価型の時間　濃度　％ ＣＣ４９／２１２　０　０．２５　８６、？　１１．６　１．７　０，００１、 Ｏ’　８４，０　１０．６　５．５　０．００　４．０　？０．０　１？、１　 １２．９’　０．０２　０．２５２６２．９　３３．２　４．２　０，０２　１ ．０　２４．２　７０．６　５．１　０．０２　４．０　９．３　８１．３　９ ．５　０．０２６　０．２５　１６．０　７７．６　６．４　０．０２６　１． ０　９．２　ｇ２．８　７．９　０．０２６　４．０　３．７　７８，２　１８ ．１　０．０Ｂ６．２／２１２　０　０．２５　１００．０　０．０　０．０　 ０．００　１．０　１００．０　０−０　０．０　０．００　４．０　１００． ０　０．０　０．０　０．０２　０．２５’　９ｇ、１　１．９　０．０　０． ０２　１．０　１００．０　０．０　０．０　０．０２　４．０　９０゜０　５ ．５　１．０　０．０２４　０．２５　４５．６　３７，５　１０．２　６．７ ２４　１．０　５０．８　２１．４　１２，３　１５．０２４　４．０　５．９ 　３７，２　２５，７　２９．９１　荷重された切り出しピークに基づく２２つ の実験の平均値 Ｂ、尿素およびエタノールを使用する工程次に示す方法で、精製−末鎖タンパク 質から多価抗原結合タンパク質を生産した。まず初めに、濃度０．２５〜１ｍｇ ／ｍｌの精製−末鎖タンパク質を、２Ｍ尿素、２０％エタノール（ＥｔＯＨ）お よび５０ｍＭのトリス緩衝液（ｐＨ８，０）で表２Ｂに表示した時間透析した。

この解離剤の組み合わせは、第１の一本鎖分子のｖＭを第２の一本鎖分子からの ＶＬと接触させて、ＶＬ／Ｖ、の界面を破壊すると考えられる。イソプロパツー ルまたはメタノールなどの他の解離剤もエタノールに置換しうる。最初の透析に 続いて、最後のＨＰＬＣ精製ステップ用の緩衝液でタンパク質を透析する。

ゲル濾過ＨＰＬＣりｏｖトゲラフイー（ＴＳＫ　Ｇ２００Ｏ８Ｗカラム、トーヨ ーソーダ社製、東京、日本）を用いて一本鎖タンパク質単量体および多価抗原結 合タンパク質の同定、分離を行った。この操作はフカノらのｒＪ、　Ｃｈｒｏ■ ａｔｏｇｒａｐｈｙＪ、１６６　：　４７（１９７８年）に記載されている。

実施例２Ｂの結果を表２Ｂに示す。表２Ｂは、２０％エタノールおよび尿素処理 の前後における２価体および他の多価体のパーセンテージを表す。他に指示がな い限り、パーセンテージは自動データ積分ソフトウェアパッケージを用いて決定 した。

表２Ｂ 尿素およびエタノールを用いる二価および多価型のＢ６．２／２１２およびＣＣ ４９／２１２タンパク質の生産の概要時間　濃度　％ タンパク質　（時間）　（Ｉａｇ／ｍｌ）　単量体　二量体　三量体　多量体Ｂ ６．２　０　０．２５　４４．１　３７，６　１５．９　２．４０　１．０　３ ７．７　３３．７　１９．４　９．４３　０．２５　２２．２　６６．５　１１ ．３　０．０３　１．０　１３．７　６９，９　１６．４　０．０実施例３ 抗フルオレセインモノクローナル抗体４−４−２０に基づいて、３つの抗フルオ レセインー末鎖抗原結合タンパク質を構築した。３つの４−４−２０一本鎖抗原 結合タンパク質は、Ｖｎおよび■Ｌ領領域結合するペプチドリンカ−が異なって いる。使用した３つのリンカ−は２０２°、２１２および２１６である（表３参 照）。精製単量体一本鎖抗原結合タンパク質を、５ｍｇ／ｍｌの陽イオン交換充 填緩衝液（０，０６ＭＭ０ＰＳ、Ｏ，００１Ｍ酢酸カルシウム、ｐＨ６，４）中 で濃縮することにより、４−４−２０抗原結合タンパク質の２価およびそれ以上 の多価体を生産した。陽イオン交換ＨＰＬＣ（ポリアスパラギン酸カラム）で、 充填緩衝液（（１０６Ｍ　ＭＯＰＳ、０．００１Ｍ酢酸カルシウム、ｐＨ６，４ ）と第２緩衝液（００６Ｍ　ＭＯＰＳ、０．０２Ｍの酢酸カルシウム、ｐＨ７， ５）を用いて５０分間処理して、２価型および単量体型の４−４−２０抗原結合 タンパク質を分離した。

２つの０．０２ｍｌのサンプルのタンパク質を分離し、各分離処理ごとに２価タ ンパク質および単量体タンパク質のフラクションを集めた。各フラクションに含 有されるタンパク質の量は、第１の分離処理の２７８ｎｍにおける吸収から定量 した。第２の分離処理からのフラクションを集める前に、各フラクションのチュ ーブに十分量、すなわち、フラクションを集めた後にタンパク質：フルオレセイ ンが比率１１て存在するような量の１．０３Ｘ１０’Ｍのフルオレセインを満た した。フルオレセインを添加することによって、２価型の４−４−２０抗原結合 タンパク質が安定化した。これらのサンプルを２℃（氷上）に保持した。

へｏ　ン（Ｈｅｒｒｏｎ）、　Ｊ　、　Ｎの［蛍光ハブテン：免疫学的プローブ Ｊ、Ｅ、Ｗ、ボス（ＶｏｓｓＥ！、ＣＲＣブレス、ポカ・レイトン、フロリダ州 （１９８４年）に記載の操作に準じて、これらの各サンプルのフルオレセイン解 離速度を決定した。まず、サンプルを２０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ緩衝液で希釈して、 ５．　ＯＸ　１０−”Ｍの４−４−２０抗原結合タンパク質にした。５．０Ｘ１ ０−”Ｍの４−４−２０抗原結合タンパク質サンプルを蛍光分光光度計のキュベ ツトに２℃にて入れ、蛍光を読み取った１、　０２　ｘ　１　ｏ−５Ｍのフルオ レセインアミノ１４０μｍをキュベツトに加え、１分毎に２５分間読み取った（ 表４参照）。

フルオレセインがない場合の２０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ８，０）で希釈 した４−４−２０−末鎖抗原結合タンパク賀単量体の結合定数（Ｋ、）も決定し た（表４参照）。

これらの実験に用いた３つのポリペプチドリンカ−は長さが異なるものである。

２００２°、２１２および２１６リンカーはそれぞれ、１２．１４および１８残 基の長さである。これらの実験は、４−４−２０抗原結合タンパク質のリンカ− の長さが２つの影響を与えることを示している：第１の影響は、短いリンカ−か ら、長い２価タンパク質のフラクションが形成されること：第２の影響は、単量 体の一本鎖抗原結合タンパク質のフルオレセイン解離速度の方が、２価抗原結合 タンパク質の解離速度よりもリンカ−の長さによって受ける影響が大きいことで ある。短いリンカ−である２０２°　と２１２では、２価抗原結合タンパク質の 方が、単量体抗原結合タンパク質よりも解離速度が遅い。したがって、単量体の 抗原結合タンパク質と２価抗原結合タンパク質では、最適生産と最適結合アフィ ニティーを提供するリンカ−が異なっている。長いリンカ−の方が、単量体の一 本鎖抗原結合タンパク質に適しており、短いリンカ−の方が多価の抗原結合タン パク質に適している。

表３ リンカ−設計 （１）配列番号１ （２）配列番号２ （３）配列番号３ （４）配列番号４ 表４ ＳＣＡタンパク質の単量体および二量体におけるリンカ−の影響２０２′　２１ ２　２１６ 転位モデルによる特定のへテロ２価抗原結合タンパク質の遺伝子構造を第１０Ａ 図および第１０Ｂ図に示す。第１０Ａ図は、ＣＣ４９Ｖ、＋と２１２ポリペプチ ドリンカ−で結合した４−４−２０ＶＬからなる一本鎖タンパク質をコードする ４−４−２０ＶＬ／２１２／ＣＣ４９Ｖ、構造のアミノ酸および核酸配列である 。

第１０Ｂ図は、４−４−２０Ｖ１１と２１２ポ＋Ｊペプチドリンカ−で結合シタ ＣＣ４９ＶＬかラナル一本鎖タンパク質をコードするＣＣ４９Ｖ、／２１２／４ ｉ−２０Ｖ１１構造のアミノ酸および核酸配列である。第５Ｂ図に示すように、 これらの−重鎖タンパク質を転位モデルに準じて組換え、４−４−２０抗原結合 部位に結合するＣＣ４９抗原結合部位からなるヘテロ２価タンパク質を生産する ことができる。

ｒＪ−４−２ｏｖＬ」とは、４−４−２０ｖウスモ／　’ｙ　ｏ−ナル抗体ノＩ ＪＩノ可変領域を意味する［バード（Ｂｉｒｄ）、　Ｒ，Ｅ、らのｒｓｃｉｅｎ ｃｅＪ　、　２４２　：　４２３（１９８８年）］。数値ｒ２１２Ｊとは、４− ４−２０ＶＬとＣＣ４９ＶＨを結合する特定の１４残基のポリペプチドリンカ− を意味する［ベジク（Ｂｅｄｚｙｋ）、　Ｗ、　Ｄ、らの「ＪＢｉｏ、Ｃｈｅｍ 、Ｊ、２６５　：　１８６１５−１８６２０（１９９０年）］。ｒＣＣ４９Ｖ、 」とは、Ｃ，Ｃ４９抗体のＨ鎖可変領域であり、ＴＡＧ−７２抗原に結合する。

ＣＣ４９抗体は、国立衛生研究所において、／ユロムらによって作り出された［ “グロブリン関連腫瘍に対して活性のある８７２．３第２産生モノクローナル抗 体の製造と特徴”　ｒＣａｎｃｅｒＲｅｓｅａｒｃｈＪ、４８　：４５８８−４ ５９６（１９８８年）］。

当業者であれば、標準的な組換えＤＮＡ法によって適当なプラスミドベクターへ 第１０Ａ図および第１０Ｂ図に示す配列を挿入し、適当な宿主を形質転換して一 本鎖タンパク質の２次的発現を起こすことができる。この目標を果たすための一 般的な組換え技術に関しては、マニアチス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）らの［モレキュ ラー・クローニング、ラボラトリ−・マニュアルＪ、ｐ１０４．コールド・スプ リング・ハーバ−・ラボラトリ−（１９８２年）参照、また、組換えＤＮＡ技術 による一本鎖タンパク質の生産法に関してはランダーらの米国特許第４．９４６ ．７７８号参照。

２つの一本鎖タンパク質、すなわち４−４−２０Ｖ、、／２１２／ＣＣ４９Ｖｌ ｌおよびＣＣ４９Ｖ、／２１２／４−４−２０Ｖ、から多価抗原結合タンパク質 を生産するために、２つの一本鎖タンパク質を０．５Ｍ　ＧｕＨＣＩ／２０％エ タノールにて透析し、透析の前あるいは後に、２つを合わせてひとつの溶液にす る。次いで、実施例２の記載に従って、多価タンパク質を生産し、分離する。

４−４−２０／２１２−重鎮抗原結合タンパク質を化学的に架橋するために、そ のＣ末端に遊離型システィンを付けた。この設計は、抗体のＣ９，１およびＣ， ，２頌域に見られるヒンジ領域の設計に基づいて行った。ヒトにおける抗原性を 減少する試みのために、最も一般的なＩｇＧクラスであるＴｇＧｌのヒンジ配列 を選択した。マウス４−４−２０　Ｉ　ｇＧ２Ａ抗体において、４−４−２０Ｆ ａｂの構造を調査し、Ｃ末端配列Ｇ］ｕＨ２１６−ＰｒｏＨ２１７−Ａｒｇ８２ １８が、ｃ、１領域の一部であり、ｃ、１とｃｈ２の間のヒンジがＡｒｇＨ２１ ８またはＧ＋ｙＨ２１９で始まることを決定した。第１４図にヒトＩｇＧの構造 を示す。図中のヒンジ領域は一般的に表示されている。したがって、ヒトＩｇＧ １のヒンジはＬｙｓＨ２１８または５ｅｒＨ２１９で始まると考えられる（表５ 参照）。

現在までに開示されたほとんどの一本鎖抗原結合タンパク質のＣ末端残基はアミ ノ酸セリンである。ヒンジ領域の設計において、４−４−２０／２１２−末鎖抗 原結合タンパク質のＣ末端セリンをヒンジの第１セリンとし、ヒンジの第２残基 をシスティンからセリンに変更した。通常、このヒンジ領域のシスティンはＬ鏑 のＣ末端システィンに架橋してジスルフィド結合を形成するものである。　。

表５ 「 ＩｇＧ２Ａマウス’　ＥＰＲＧＰＴＩＫＰ　ＣＰＰＣＬＣ−ＩｇＧｌ　ヒト２　 ＡＥＰＫ　５ＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣ−３ＣＡ本３　−−ＶＴＶＳ ＳＣＡ＊　ｈツノ゛ＬＱ計１’　−−ＶＴＶｓｓＤＫＴＨＴｃＳＣＡ本　Ｅツノ ゛設計２５　−−■Ｔ〜７ＳＳＤＫＴＨＴＣＰＰＣ＊−一本鎖抗原結合タンパク 質 （１）配列番号５ （２）配列番号６ （３）配列番号７ （４）配列番号８ （５）配列番号９ Ｃ末端に２つのシスティンがあることの利点は、分子内ジスルフィド結合が形成 されてＳ原子が酸化から保護されることにより、タンパク質の回収が容易になる ことである。４−４−２０／２１２−末鎖抗原結合タンパク質をコードする遺伝 子の３゛末端にＢｓｔＥＩＩ制限部位を導入することによって、ヒンジ領域を付 加した（第１．５　Ａ図および第１５Ｂ図参照）。

Ｃ末端システィンを有する単量体の一本鎖抗原結合タンパク質は、通常の一本鎖 抗原結合タンパク質の精製法を用いて精製しうるが、遊離型スルフヒドリルを保 護するという点において多少の変更を要する。架橋を達成しつる方法は２つある 。第１の方法とは、精製した一本鎖抗原結合タンパク質をジチオスレイトールな どの弱い還元剤で処理し、次いで、空気酸化に付すことによって、個々の一本鎖 抗原結合タンパク質問にジスルフィド結合を形成することである。この型の化学 的手法は、全抗体からヘテロニ量体を生産する場合に好結果を得ている［ニソノ フ（Ｎｉｓｏｎｏｆｆ）らの“ウサギ抗体のハイブリダイゼーションの定量的評 価“、　ｌ”ＮａｔｕｒｅＪ、４８２６　：　３５５〜３５９（１９６２年）、 ブレナンらの“モノクローナルイムノグロブリンＧ１フラグメントの化学的組換 えによる二特異的抗体の製造”、ｒＳｃｉｅｎｃｅＪ、２２９：８ｌ−８３（１ ９８５年）］。第２の方法とは、ビスマレイミドヘキサンなどの化学的架橋剤を 使用して、２つの一本鎖抗原結合タンパク質のＣ末端の７ステインを架橋するこ とである。バーチイス（Ｐａｒｔｉｓ）らのｒＪ、　ＰｒｏｔＣｈｅｍ」、２　 ：　２６３〜２７７（１９８３年）参照。

２価抗原結合タンパク質を遺伝子操作により構築し、続いて大腸菌またはその他 の弁理系において弁理させることができる。これは、単量体の一本鎖抗原結合タ ンパク質をコードする遺伝子の末端の停止コドンを遺伝子操作により除去し、リ ンカ−および第２の一本鎖抗原結合タンパク質をコードする遺伝子を挿入するこ とによってなし得る。このようにして、我々は２価ＣＣ４９／２１２抗原結合タ ンパク質のための遺伝子を構築した（第１６図参Ｆ）。出発発現プラスミド中の ＣＣ４９／２１２遺伝子はＡａｔＴＩからＢａｍＨｌまでの制限断片中にある［ バードらの“−末鎖抗原結合タンパク質”　、ｒＳｃｉｅｎｃｅＪ、２４２：４ ２３−４２６（１９８８年）：およびウィツトロウ（ｆｈｉｔｌｏｖ）らの°一 本本鎖ｖタンパク質およびその融合タンパク質”　、ｒＭｅｔｈｏｄｓＪ、２　 ＋　９７〜１０５（１９９１年）参照］。ＣＣ４９／２１２抗原結合タンパク質 遺伝子のＣ末端の２つの停止コドンとＢａｍＨ１部位を単一残基のリンカ−（Ｓ ｅｒ）とＡａｔｌｌ制限部位で置換した。得られるプラスミドをＡａｔｌＴで切 断し、精製したＡａｔｌｌがらＡａｔｌｌまでの制限断片をＡａ　ｔ　Ｉ　Ｉ切 断ＣＣ４９／２１２−重鎮抗原結合タンパク質発現プラスミドに連結した。得ら れる２価ＣＣ４９／２１２−重鎖抗原結合タンパク質発現プラスミドを、Ｃｌ８ ５７ｉ度感受性受容体の遺伝子を含有する大腸菌発現宿主に感染（トランスフェ クト）させた。この系における一本鎖抗原結合タンパク質の発現は、温度を３０ ℃から４２℃に上げることにより誘発される。第１７図は、総大腸菌タンパク質 を含有する５ＤＳ−ＰＡＧＥゲル上の、４２℃における第１６図の２価抗原結合 タンパク質の発現を表す。レーン１は分子ｍｌ準である。レーン２は３０℃にお いて成長させた非誘発大腸菌生産株である。レーン３は、４２℃で成長させるこ とによって誘発された二価ＣＣ４９／２１２一本鎖抗原結合タンパク質である。

矢印は発現したＣＣ４９／２１２一本鎖抗原結合タンパク賀２１７リンカーを有 する４−４−２０／ＣＣ４９ヘテロニ量体Ｆ〜の構築、精製および試験 この実験の目的は、フルオレセインとパンカルシノーマ抗原ＴＡＧ−７２の両方 に結合しうる新規なヘテロニ量体Ｆｖの生産、精製および活性の分析である。

該二量体は２つのポリペプチド饋で構成され、これらを会合して活性へテロニ量 体Ｆｖを形成した。各ポリペプチド鎮は混合一本積Ｆｖ（混合５Ｆｖ）として記 載してもよい。第１の混合５Ｆｖ（ＧＸ８９５２）は、２１７ポリベブチドリン カーで結合する４−４−２ＯＬ鎮可変領域（ＶＬ）およびＣＣ４９ＨｊＪｉ可変 領域（ｖＨ）テする（第１９Ａ図）。第２の混合ｓ　Ｆ、（ＧＸ　８９５３）は 、２１７ポリペプチドリンカーで結合するＣＣ４９ＶＬおよび４　４　２０Ｖｏ である（第１９Ｂ図）。２１７ボリベブチドリンカーの配列は表３に示すもので ある。類似のＣＣ４９／４−４−２０へテロニ量体は、実施例４で記載したよう に、２１２ポリペプチドリンカ−によって結合したものである。

精！ Ａ精製 １０リットル発酵器において、各混合ｓＦｖをカゼモノ消化グルコース塩培地中 、３２℃で、６００ｉｍにおいて１５〜２ｏの光学密度まで成長させた。混合ｓ ＦＶの発現は、発酵器の温度を４２℃に１時間上昇させることによって誘発され た。遠心分離機にて７０００ｇで１ｏ分間処理し、大腸菌株ＧＸ８９５２（湿潤 細胞重量にて２７７ｍｇ）および大腸菌株ＧＸ８９５３（湿潤細胞重量にて２３ ３ｍｇ）を収穫した。細胞ペレットを残し、上演を捨てた。細胞ペレットを一２ ０℃にて凍結させて貯蔵した。あらかじめ融解して、両方を合わせておいた混合 ｓＦ、細胞ペレット（合計湿潤細胞重量５１０ｍｇ）に、２．５５リツトルの溶 菌／洗浄緩衝液（５０ｍＭトリス／２００ｍＭ　ＮａＣｌ／１ｍＭ　ＥＤＴＡ、 ｐＨ８，０）を加えた。細胞が完全に懸濁した後、ガラリンホモジナイザーを用 い、４℃にて９゜００ｐｓｉで処理した。この第１処理後、温度は２３℃に上昇 した。ドライアイスとメタノールを用いて、すばや＜０℃に冷却した。該細胞懸 濁液を２回目のガラリンホモジナイザー処理に付し、次いで、デュポンＧ５−３ ０−ターを用い、８０００ｒｐｍにて６０分間遠心分離した。遠心分離した後、 上清を捨て、ペレットを２．５リツトルの溶菌／洗浄緩衝液に４℃にて再懸濁す る。この懸濁液をデュポンＧ５−３０−ターを用い、８０００ｒｐｍで４５分間 遠心分離した。上清を再び捨て、ペレットの重量を測定した。ペレットの重量は １３６．１ｍｇであった。

洗浄したペレットに、１３００ｍｌの６Ｍグアニジン塩酸塩１５０ｍＭ）リス１ ５０ｍＭ　ＫＣＩ／１０ｍＭ　ＣａＣ１ｚ、４℃のｐＨ８，０を加えた。オーバ ーヘッドミキサーを用いて、可溶化を促進した。１時間混合後、ヘテロ二量体Ｇ ｕＨＣ１抽出物を８００Ｏｒｐｍで４５分間遠心分離し、上清を捨てた。１４２ ５ｍ１のへテロニ量体Ｆｖの６ＭＧｕＨＣ］抽出物を、４℃にて一定の混合をし ながら、１４．１リツトルの“リホールド（再生）緩衝液”（５０ｍＭトリス１ ５０ｍＭＫＣｌ／１０ｍＭＣａＣＩａ、Ｉ）Ｈ８，Ｏ）にゆっくりと加え、約１ １０の希釈液を得た。４℃にて一夜再生させた。

リホールディング（再生）の１７時間後、４０％消光アッセイによって、抗フル オレセイン活性をチェックし、活性タンパク質の量を算出した。４０％消光アッ セイによる活性へテロニ量体の総量は１５０＋ａｇであり、分子量は５４０００ である。

あらかじめ冷蔵した（４℃）１９０プルーフのエタノール４リツトルを、再生し たヘテロニ量体１５リットルに加えて３時間混合する。混合物を４℃にて一装置 く。この−夜装置処理の後、集塊状沈殿が容器の底に固まった。はとんど透明の 溶液を、Ｍｉｌｉｐａｋ　−２００（０，２２μ）フィルターで沈殿を壊さない ように濾過した。４０％消光アッセイから、１０％の抗フルオレセイン活性が濾 液に回収されることが解った。

１００００ダルトンＭＷＣＯ膜を有するベリコンシステムを用い、“透析緩衝液 ”として、４０ｍＭ　ＭＯＰＳｌｏ、５ｍＭ酢酸カルシウム（ＣａＡｃ）、４℃ のｐＨ６，４の溶液にてヘテロニ量体の濾過サンプルを透析した。保持液の伝導 率が透析緩衝液の伝導率（〜５００μｓ）と等しくなる前に、２０リツトルの透 析緩衝液を必要とした。透析後、ヘテロニ量体サンプルをＭｉｌｉｐａｋ　−２ ０フイルターで濾過した。このステップ後の４０％消光アッセイから、活性タン パク質８．８＋ａｇが存在することが解った。

粗へテロニ量体サンプルをＰｏ　ｌ　ｙＣＡＴ　Ａ陽イオン交換カラムに２０ｍ １／分の速度で通した。カラムはあらかじめ６０ｍＭＭ０ＰＳ、１ｍＭＣａＡｃ 。

４℃のｐＨ６，４（ｉｉ衝液Ａ）で平衡にしておいた。サンプルを通した後、カ ラムを１５０ｍ１の緩衝液を１５ｍ１／分で流して洗浄した。緩衝液Ａと“緩衝 液Ｂ“（６０ｍＭ　ＭＯＰＳ１２０ｍＭ　ＣａＡｃ、４℃のｐＨ７，５）を用い て、１５０ｍ１／分の速度で５０分間の直線勾配溶離を行った。勾配の条件を表 ６に示す。“緩衝液Ｃ”の組成は、６０ｍＭ　ＭＯＰＳ、１００ｍＭ　ＣａＣｌ ２．１）Ｈ７，５である。

表６ 約５０ｍ１のフラクションを集め、サイズ排除クロマトグラフィーによって、活 性、純度および分子量を分析した。ピーク間のコンタミネーションがありそうな ので、ピークによるフラクション収集は行わなかった。フラクション３〜７を集 めて合わせ（合計容量２１８ｍ１）、５０＋ａｌに濃縮し、６０ｍＭ　ＭＯＰＳ 、０．５ｍＭ　ＣａＡｃ、４℃のｐＨ６，４の緩衝液に対して一夜透析した。透 析した液を０゜２２μフイルターで濾過し、２８０ｉｍの吸光度を調べた。６０ ｍＭＭ０ＰＳ。

１ｍＭ　ＣａＡｃ、４℃のｐＨ７，５の緩衝液で平衡にしたＰｏ１ｙＣＡＴＡカ ラムに、濾液を１０ｍ１／分で通した。緩衝液Ｂを６０ｍＭ　ＭＯＰＳ、１ｍＭ 　ＣａＡｃ、４℃のｐＨ７，５のものに変えた。表６に示すように勾配溶離を行 った。ピークによるフラクション収集を行い、活性、純度および分子量を分析し た。クロマトグラムを第２０図に示す。フラクションの同定と分析を表７に記載 する。

ヘテロ二量体Ｆｖタンパク質のフラクション分析フラクション２〜７および出発 物質を４〜２０％のＳＤＳゲル電気泳動によって分析した。第２１図に描かれた ものがその結果である。

Ｂ、ＨＰＬＣサイズ排除クロマトグラフィーの結果フラクション２．５および６ が第２０図の３つの主要ピークに対応するので、それらを選んで、ＨＰＬＣサイ ズ排除クロマトグラフィーによる分析を行った。

フラクション２は、プレパラティブ精製において２１．７７５分のピークに対応 しく第２０図）、ＨＰＬＣサイズ排除カラムにおいて２０．５２５分のピークに 対応する（第２２Ａ図）。フラクション５および６（第２０図においてそれぞれ ３０１分および３３．４５５分）はＨＰＬＣサイズ排除カラムにおいては、１９ ．１３３分および１９．１６３分（第２２Ｂ図および第２２Ｃ図）である（表７ 参照）。したがって、これらの２つのピークは両方とも二量体であるとみなすこ とができる。

この精製におけるすべてのフラクションの消光アッセイを行った。フラクション ５のみが重要な活性を示した。後述のスキャツチャード分析により、フラクショ ン５から２．４ｍｇの活性ＣＣ４９／４ｉ−２０へテロニ量体ＦＶを回収した。

ＣフラクションのＮ末端配列 活性へテロニ量体Ｆｖのフラクションは両方のポリペプチド鎖を含むべきである 。Ｎ末端配列の分析から、フラクション５と６は、ＣＣ４９および４−４−２Ｏ のポリペプチドの両方が存在するＮ末端配列をとり、フラクション２はＣＣ４９ ／２１２／４−４−２０ポリペプチドのみに対応する単一配列をとることが解っ た。我々は、フラクション６はフラクション５によってコンタミネートされたも のであり（第２０図参照）、フラクション５のみが重要な活性を有すると考える 。

Ｄ、スキャッチャード分析による抗フルオレセイン活性ヘロン（Ｈｅｒｒｏｎ） 、　Ｊ　、　Ｎ、の［蛍光ハプテン・免疫学的プローブＪ　、　Ｅ、　Ｗ、　Ｖ ｏｓｓ編。

ＣＲＣ・プレス、ポカ・レイトン、フロリダ州（１９８４年）に記載の蛍光消光 アッセイを用いてフラクション５および６のフルオレセイン会合定数（Ｋａ）を 決定した。各サンプルを２０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ８，０）で希釈して 、約５×１０−８Ｍの濃度にした。５Ｘ１０−’Ｍのサンプル（５９０μｌ）を 、室温に平衡させた蛍光分光光度計のキュベツトに入れた。第２のキュベツトに ２０ｍＭＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ８，０Ｘ５９０μｌ）を入れた。各キュベツト に２０ｍＭＨＥＰＥＳ（ｐＨ８，０）緩衝液中の３．０Ｘ１０−’Ｍのフルオレ セイン（１０μｍ）を加え、蛍光を配録した。フルオレセイン１４０μｍを加え るまでこれを繰り返した。フラクション５のスキャッチャード分析を行い、結合 定数１．１６　Ｘ　１０’Ｍ−’を得た（第２３図参照）。これは４−４−２０ ／２１２ｓＦｖの結合定数である１、１×１０９Ｍ弓に非常に近い値である［パ ントリアノ（Ｐａｎｔｏｌｊａｎｏ）らのｒＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　Ｊ。

３０　：１０１１７〜１０１２５（１９９１年）参照コ。スキャッチャード分析 における横軸Ｒの切片は活性物質の割合を表す。フラクション５においては、６ １％の物質が活性であった。フラクション６のスキャッチャード分析のグラフは 、結合定数が３．３Ｘ１０’Ｍ−１であり、活性が１４％であることを示してい る。フラクンヨ７６に存在する活性は、フラクション５からのコンタミネーショ ンによるものであろう。

Ｅ、競合ＥＬＩ　ＳＡによる抗ＴＡＧ−７２活性ＣＣ４９モノクローナル抗体は 、国立ガン研究所の腫瘍免疫学および生物学研究室のジェフリー・ツユロム博士 のグループによって作り出された。この抗体は、パンカルシノーマ腫瘍抗原ＴＡ （、−７２と特異的に結合する。ムラノ、Ｒらの「Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅ５ｅａｒ ｃｈＪ　、　４８　：　４５８８〜４５９６（１９８８年）参照。

２価ＣＣ４９／４−４−２０Ｆｖ（フラクション５）およびＣＣ４９／２１２ｓ Ｆｖの結合特性を決定するために、ヒト肺カルシノーマ抽出物中のＴＡＧ−７２ への結合に対して、ビオチンで標識したＣＣＣＣ４９ｌを、非標識ＣＣ４９／４ −４−２０ＦｖおよびＣＣ４９／２１２ｓＦｖと競合させるという競合酵素結合 イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）を組み立てた（第２４図参照）。あら かじめ作成しておいた西洋ワサビペルオキシダーゼにアビジンとビオチンが結合 した複合体および○−フェニレンジアミンジヒドロクロリド（ＯＰＤ）を用いて 、ビオチン標識ＣＣＣＣ４９ｌの量を定量した。１０分後に４Ｎ　Ｈ２Ｓ０４（ 硫酸）で反応を停止し、４９０ｎｍにおける光学密度を読み取った。この競合Ｅ ＬＩＳＡから、２価ＣＣ４９／４−４−２０ＦｖがＴＡＧ−７２抗原に結合する ことが示された。

ＩｇＧと置き換わるためには、ＣＣ４９／４−４−２０Ｆｖは、−末鎖Ｆ、と比 べた場合、２００倍の高タンパク質濃度を必要とした。

２つの方法によって、２つのＣ末端延長ソステインをもつ４−４−２０／２１２ 抗原結合９ンパク’１ｃ４−４−２０／２１２ＣＰＰＣ−末鎖抗原結合タンハク 質）の化学的架橋二量体を得た。実施例５において、我々は４−４−２０／２１ ２ＣＰＰＣ−末鎖抗原結合タンパク質の設計および遺伝子構成について記載した （表５中のヒンジ設計２）。第１５Ｂ図は、このタンパク質の核酸およびタンパ ク質配列を表す。ウィツトロウおよびフィルブラ（Ｆｉｌｐｕｌａ）のｒＭｅｔ ｈ、　Ｅｎｚｙｍｏｌ、　Ｊ、２９７（’１９９１年）に記載の方法を用いて４ −４−２０／２１２ＣＰＰＣ−末鎖抗原結合タンパク質を生成した後、２つの方 法で二量体を形成した。第１の方法は、ノチオスレイトール（ＤＴＴ）で遊離型 のシスティンを穏やかに還元し、次いで、空気酸化によって２つの分子間にジス ルフィド結合を形成する方法である。

第２の方法は、化学的架橋剤であるビスマレイミドヘキサンを用いて、２つの４ −４−２０／２１２ＣＰＰＣ−末鎖抗原結合タンパク質の遊離型システィンを架 橋させることによって二量体を生産する方法である。

４−４−２０／２１２ＣＰＰＣ−末鎖抗原結合タンパク質のＱ、１ｍｇ／ｍｌ溶 液を１ｍＭ　ＤＴＴ、５０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ、５０ｍＭ　ＮａＣｌ、１ｍＭ　Ｅ ＤＴＡ緩衝液（４℃のｐＨ８，０）を用いて穏やかに還元した。サンプルを５Ｏ ｍＭＨＥＰＥＳ、５０ｍＭ　ＮａＣｌ、１ｍＭ　ＥＤＴＡ緩衝液（４℃のｐＨ８ ，０）に対して一夜透析し、遊離型のスルフヒドリルを酸化して、分子内ジスル フィド結合を形成した。第２５図は、空気酸化後の非還元５ＤＳ−ＰＡＧＥゲル である；この図から、約１０％の４−４−２０／２１２ＣＰＰＣタンパク質が約 分子量５５０００ダルトンの二量体となったことが分かる。

４−４−２０／２１２ＣＰＰＣ−末鎖抗原結合タンパク質の０　、１　ＩＩｇ／ ＋ｏｌ溶液を２ｍＭのビスマレイミドヘキサンで処理した。先の実施例における ２つの遊離型システィン間のジスルフィド結合の形成とは違って、ビスマレイミ ドヘキサン架橋物質は、β−メルカプトエタノールなどの還元剤に対して安定で あるべきである。第２６図は、還元５ＤＳ−ＰＡＧＥゲルであり、処理した物質 の約５％が、分子量５５０００ダルトンの二量体を生産したことを表す（サンプ ルはゲルに流す前にβ−メルカプトエタノールで処理した）。ビスマレイミドヘ キサン処理した４−４−２０／２１２ＣＰＰＣタンパク質を緩衝液Ａに対して透 析した後、Ｐｏ１ｙｃＡＴＡ陽イオン交換カラムでさらに精製した。第２６図は 、約１５％まで二量体含有画分を増加しえたことを表す。

精液 我々は、２つの相補的混合ｓＦｖから、該ｓＦｖの二量体のサイズをもつヘテロ 二量体のＦｖを生産した。Ｎ末端の分析によって、活性へテロニ量体Ｆｖは、２ つのポリペプチド鎖を含むことが示された。該ヘテロ二量体はフルオレセインお よびＴＡＧ−７２の両方に対して活性であることが明らかとなった。

本明細書に引用したすべての出版物は、参考文献として本明細書に組み込まれる 。

例証のために本発明を特定の具体例により説明したが、これまでに述べてきたこ とから、本発明の範囲および後述の請求の範囲を逸脱しない種々の修飾を施し得 ることが理解されよう。実施例に関して言えば、好ましい具体例とは、本発明を 具体化しうる工程を行なうひとつの型を構成するにすぎない。

配列表 （１）一般的情報： （ｉ）特許出願人：ウイソトロウ、マークフィルブラ、ディピッド ローレンス、マイケル （ｉｆ）発明の名称：多価抗原結合タンパク質（ｉｉｉ）配列の数：２３ （ｉｖ）連絡先。

（＾）名宛人ニスターン、ケスラー、ゴールドスタイン・アンド・フォックス（ Ｂ）通り・コネチカット・アベニュー１２２５番（Ｃ）市・ワシントン （Ｄ）州：ディー・ンー （Ｅ）国：アメリカ合衆国 （Ｆ）ＺＩＰ：２００３６ （Ｖ）コンピューター解読書式。

（＾）媒体型、フロッピーディスク （Ｂ）コンピューター＋ＩＢＭＰＣ適合（Ｃ）オペレーティング・システム：　 ＰＣ−ＤＯ３／ＭＳ−ＤＯ３（ロ）ソフトウェア：　Ｐａｔｅｎｔｌｎ　Ｒｅ１ ｅａｓｅ　＠１．　Ｑ、　Ｖｅｒｓｉｏｎ　＄１．２５（ｖｉ）本出願のデータ ・ （＾）出願番号、（譲渡された） （Ｂ）出願口、これと共に （Ｃ）分類・ （ｖｉｉ）前出願のデータ・ （Ａ）出願番号＋ＵＳＯ７／７９６．９３６（Ｂ）出願臼＋１９９１年１１月２ ５日（ｖｉｉｉ）弁理士／代理人情報： （Ａ）氏名　ゴールドスタイン、ジョージ・エイ（Ｂ）登録番号　２９，０２１ （Ｃ）参照／整理番号：０９７７．１９０６６０４（ｉｘ）電話連絡先情報： （Ａ）電話番号・　（２０２）８３３−７５３３（Ｂ）ファックス番号：　（２ ０２）８３３−８７１６（２）配列番号１の情報 （ｉ）配列の特徴： （＾）配列の長さ：１２アミノ酸 （Ｂ）配列の型・アミノ酸 （Ｄ）トポロジー・両形態 （ｘｉ）配列：配列番号Ｉ Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ｓｅｒ　Ｓｉｒ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｓａｒ　Ｇｌｕ　 Ｓａｒしｙｓ　Ｉ！ｉ＠ｒ（２）配列番号２の情報 （ｉ）配列の特徴・ （＾）配列の長さ：１４アミノ酸 （Ｂ）配列の型・アミノ酸 （Ｄ）トポロジー、両形態 （ス１）配列・配列番号２ Ｇｌｙ　Ｓｉｒ　Ｔｈｒ　５ｅｒ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　５＠ｒ　 Ｓｅｒ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ｇｌｙ（２）配列番号３の情報 （１）配列の特徴： （＾）配列の長さ：１８アミノ酸 （Ｂ）配列の型　アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：両形態 （ｘｉ）配列：配列番号３ Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　Ｃ１ｙ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　’Ｌ、ｙｍ　Ｓｅ ｒ　Ｓｅｒ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ｂｅｒｒ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　sｈｒ Ｉ　Ｓ　１０　１５ Ｌｙ・Ｇｌｙ （２）配列番号４の情報 （ｉ）配列の特徴・ （＾）配列の長さ・１２アミノ酸 （Ｂ）配列の型；アミノ酸 （Ｄ）トポロジー二両形態 （ｘｌ）配列：配列番号４ Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　Ｇｌｕ　 Ｇｌｙ　Ｌｙｅ　Ｇｌｙ（２）配列番号５の情報 （１）配列の特徴。

（＾）配列の長さ　１５アミノ酸 （Ｂ）配列の型、アミノ酸 （Ｄ）トポロジー　両形態 （ｘｉ）配列、配列番号５ Ｇｌｕ　Ｐｒｏ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　ｌｉｅ　Ｌｙｓ　Ｐｒｏ　 Ｃｙｓ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｃｙｓ　Ｌ＠ｕ　Ｃｙｓｌｏ　１５ （２）配列番号６の情報 （ｉ）配列の特徴 （＾）配列の長さ・１５アミノ酸 （Ｂ）配列の型・アミノ酸 （Ｄ）トポロジー９両形態 （ｘｉ）配列：配列番号６ Ａｌａ　Ｇｌｕ　Ｐｒｏ　Ｌｙｓ　Ｓｅｒ　Ｃｙｓ　Ａｓｐ　Ｌｙｓ　Ｔｈｒ　 ）Ｉｉｓ　Ｔｈｒ　ＣＹ郵　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　ＣｙｍＳ　１０　１５ （２）配列番号７の情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ；４アミノ酸 （Ｂ）配列の型二アミノ酸 （Ｄ）トポロジー二両形態 （ｘｉ）配列：配列番号７ Ｖａｌ　Ｔｈｒ　Ｖａｌ　ｋｒ （２）配列番号８の情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：１１アミノ酸 （Ｂ）配列の型二アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：両形態 （ｘｉ）配列：配列番号８ ｖａｌ　ＴｈｒＶａＬ　ｈｒ　ｓａｙ　Ａ＃ｐ　ＬＦ　Ｔｈｒ　Ｈｌｓ　’ｔ’ ｈｒ　Ｃｙｍ（２）配列番号９の情報 （ｉ）配列の特徴： （＾）配列の長さ　１４アミノ酸 （Ｂ）配列の型−アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：両形態 （スｉ）配列：配列番号９ ｖａｌ　Ｔｈｒ　Ｖａｌｈｒ　Ｂａｒ　Ａｓｐ　Ｌｙｅ　Ｔｈｒ　Ｍ藷Ｔｈｒ　 （’ｙｍ　Ｐｒｏ　Ｉ’ｒｏ　Ｃｙｍ（２）配列番号１０の情報 （ｉ）配列の特徴： （＾）配列の長さ、７３１塩基対 （Ｂ）配列の型　核酸 （Ｃ）鎖の数二両形態 （Ｄ）トポロジー：両形態 （ｉｘ）特徴 （Ａ）特徴を表す記号：　ＣＤ５ （Ｂ）存在位置＋１．．７２９ （ｘｉ）配列：配列番号１０ λＭＡ（ａＧＴＯＣａＯＧＣ’１ｒＧＡＧ（Ｊ、ＴＣＴＩＩＩＧＧＡＯＴｒ丁Ａ ？丁ＴＣ丁ＧＣ〒Ｃ丁Ｃλ入ｋ（ＸＴス龜・８噛ｔ＾ｒｇＶａｌＧｌｕＡｒｍＧ ｌｕ＾ｍｐＬｅｕＧｌｙＶａ１丁ｙｒｌ１ｍａｙｓ８＊ｒａｌｎｓｉｒＩｔｓ　 ９０　９５ ＡＣ＋ＩＧＡ？ＧＴｒｃｃｃＴＯＯＡｃｔ；Ｔ？’ＣＧσＴＯＧ＾ａＧｅ’ｘｃ ｃＡ為ｏｃｒｒａ＾＾Ａ丁ＣＡＡ＾３３６ＴｈｒｓｕｍＶａｌＰｒｏ丁ｒｐ丁ｈ ｒＰｈａＧｌｙＧｌｙＧ１ｙ丁ｈｒＬｙｅｌｌｘｕＧｌｕ工１ｓＬｙｅｏａ’ｒ 丁Ｃ７＾ＣＣ丁ＣＴ　Ｇｃｔ　〒ＣＴ　ＧＧＴ　＾入＾’ｒｃｃ丁ＣＴ　ＧＡ＾ Ｇｃｅ　λ入＾ａＧＴｅ＾Ｇ（Ｔｒ　田Ｇｌｙ　ｇ虹Ｔｈｒ　Ｓａｗ　Ｇｌｙ　 Ｂａｒ　ｃｌｙ　Ｌｙｅ　Ｓａｗ　ｇ嘩ｒ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　ＬｙＩＧｌｙ　Ｇ ｉｎ　Ｖａｎｉｔ５　１２０　１２５ 〒入＾テλＯＱ＾テｃｃ １′　＋　んψ （２）配列番号１１の情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ　２４３アミノ酸 （Ｂ）配列の型・アミノ酸 （Ｄ）トポロジー　ＩＩ鎖状 （１１）分子の型、タンパク質 （ｘｉ）配列　配列番号１１ ｋｔｐ　ＶａｌＶａｌ　Ｍｅｔ　Ｔｈｒ　Ｇｌｎ　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　Ｌｅｕ　ｈ ｒ　Ｌｏｕ　Ｐｒｏ　Ｖａｌ　１ｉａｒ−（＋１ｙｌｌｌ　１５ ｈｐ　Ｇｉｎ＾ｌａ　Ｊｅｅｒ　Ｉｌｅ　Ｓｅｒ　ｃ’ｙｍ　ｘ丙ｓｉｒ　Ｈｅ ｒ　ａｌｎ　ｌｉａｒ−Ｍｍｌ　）１１６　Ｈｅｒ細ｎ　Ｃ１ｙ　ＡＳＨＴｈｒ 　、Ｔｙｅ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　Ｔ’ｒｐ　Ｔｙｒ　１．＊ｕ　Ｇｉｎ　ＬＦ　Ｐ ｒｏ　Ｃ１ｙ　ＧＬｎ　ｇｓｒ（Ｏ４５ Ｐ″′Ｌｙｍ　Ｖａｎ　Ｌｅｕ　ＴｌｏＴｙｒ　Ｌｙ：　Ｖａｌ　ｇｅｒ　Ａｓ ｎ　Ａｒｇ　Ｐｈ°８°ｅ　Ｏｌｙ　Ｖａｌ　ｌ’ｒ。

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Ｂａｒ　ＪＬｒｇ　％ｌａｌ　Ｇｌｕ　Ａｈａ　Ｇｌｕ　Ａｓｐ　ｔａｕ　ａｌ ｙ　Ｖａｌ　Ｔｙｅ　Ｉ’ｈ″Ｃｙｍ　ａｏｒ　Ｇｌｎ　８求h ツロ５Ｓ Ｔｈｒ　Ｒ１＊　Ｖａｌ　Ｐｒｏ　Ｔｒｐ　Ｔｈｒ　Ｐｈａ　Ｇｌｙ　Ｃ１ｙ　 Ｏｌｙ　ｔｈｒ　Ｌｙｅ　ＩＡｕ　Ｇｌｕ　Ｉｌ書Ｌｙｅｚｏｏ　１ａｓ　１１ ゜ Ｇｌｙ　Ｓｉｒ　Ｔｈｒ　Ｈｅｒ　Ｇｌｙ　Ｓｉｒ　Ｇｕｙ　Ｌｙｅ　Ｓｉｒ　 Ｂａｒ　Ｑｌｕ　（ｌｌｙ　Ｌｙｅ　Ｇｌｙ　Ｇｌｎ　ＶａP Ｇ’ｋｎ　Ｌａｕ　Ｇ１＋ａ　Ｇｌｈ　ｓｅｒ　Ａｌｐ　Ａｉｍ　Ｏｌｕ　Ｌａ ｕ　Ｖａｎ　Ｌｙｓ　らηＧｌｙ　Ａｌｅ　ｅａｒ　Ｖａｎ”ｒ；　Ｘ１°８° ｒ　Ｃｙａ　Ｌｙ″Ａｌａ　Ｓｅｔ　Ｇｌｙ　Ｔｙｅ　Ｔｈｒ　Ｐｈ″？ｈｒ　 Ａ′ｐ　Ｈ１＊　Ａｌｅ　Ｋｌ。

１５６　１５５　１Ｇ０ １１１ｓＴｒｐＶａｎＬＹＩＩａｌｎ’Ａ＊ｎＰｒｏＧｌｕＧｉｎ（ｌｌｙＬｅ ｕＧｌｕＴｒｐＩｌ＊ＧｌｙＴｙｒ１６５１フ０１７５ ＰｈｅＳｉｒＰｒｏＧ］γＡｍｎＡｓｐＡｓｐＰｈａＬｙＩＩ’ＴｙｒＡａｎＧ ｌｕ＾ｒｇＰｈｅムＹ自ｃｌｙ１ｇ０　１ｌ１５　、１９０ Ｌｙ＋＋ＡｌａＴｈｒＬ＊ｕＴｈｒＡｌａＡｓｐＬｙｓ５ｅｒＳｉｒＳｉｒＴｈ ｒ＾１ａＴｙｒＶａｎＧｉｎ１゛１°ｎ　５ＩＩＦ　Ｌｏｕ　Ｔｈｒ　Ｓｏｒ　 Ｇ：ｕ　Ａｍｐ　５ｅｒ　Ａｌａ　Ｖａｌ　Ｔ７ｒ　Ｐｈａ　Ｃｙａ　Ｔ１＋ｒ 　Ａ？９丑１−ｑｕ　Ａｓｎ　Ｍｅｔ　Ａｌａ　Ｔｙ：Ｔｒｐ　Ｇｌｙ　（＋ｌ °Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ｓｏｒ　Ｖａｌ　Ｔｈｒ　Ｖａｌ　！１ｅｒ（２）配列番号 １２の情報 （１）配列の特徴６ （＾）配列の長さ、７４４塩基対 （Ｂ）配列の型・核酸 （Ｃ）鎖の数　両形態 （Ｄ）トポロジー　両形態 （ｉｘ）特徴 （Ａ）特徴を表す記号：　ＣＤ５ （Ｂ）存在位置・１　７４４ （χ１）配列、配列番号１２ （２）配列番号１３の情報 （１）配列の特徴。

（Ａ）配列の長さ　２４８アミノ酸 （Ｂ）配列の型、アミノ酸 （Ｄ）トポロジー４直鎖状 （ｉｉ）分子の型　タンパク質 （ｘｌ）配列　配列番号１３ Ａｓｐ　Ｖａｌ　Ｖａｌ　Ｍｅｊ　Ｓｅｒ　にｉｎ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　 Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　ｖａＩＳｅｒ　Ｖａｌ、　Ｇｌｙｌｏ　１Ｓ Ｇｌｕ　Ｌｙｓ　Ｖａｌ　丁ｈｒ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　ＣｙＩＩ　ＬＹＩＩ　Ｓｅ ｒ　Ｓｅｒ　Ｇｉｎ　ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ｌａｕ　Ｔｙｒ　５■■ ２Ｇ　２５　〕Ｏ Ｇ１．ｙ　Ａｓｎ　Ｇｌｎ　Ｌｙｓ　Ａｓｎ　Ｔｙｒ　Ｌｅｕ　八ｌａ　Ｔｒｐ 　Ｔｙｒ　Ｇｉｎ　Ｇｉｎ　Ｌｙｓ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｇ１■ Ｓｅｒ　Ｐｔｏ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｉｌｅ　Ｔｙｒ　Ｔｒｐ　Ａｌａ　 Ｓｅｒ　Ａｌａ　Ａｒｇ　Ｇｌｕ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｖａ１５０　ＳＳ　Ｇ。

Ｐｒｏ　Ａｓｐ　Ａｒｇ　Ｐｈｅ　Ｔｈｒ　Ｃ１ｙ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　 Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ａｇｐ　Ｐｈｅ　丁ｈｒ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒｇ５　７０　７５　 ８０ １１ｅ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｖａｌ　Ｌｙｓ　Ｔｈｒ　Ｇｌｕ　Ａｓｐ　Ｌｅｕ　 Ａｌａ　Ｖａｌ　Ｔｙｒ　’ｒｙｒ　Ｃｙｓ　Ｇｉｎ　Ｇ１■ Ａｓ　９０　９５ ＴｙｒＴｙｒＳｅｒＴｙｒＰｒｏＬｅｕｒｈｒＰｈｅＧｌｙＡｌａＧｌｙＴｈｔ ＬｙｓＬｅｕＶａｌＬｅｕＬｙＩＩＧｌｙ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　Ｃ１ｙ　 Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｇｌｕ　ＧＩＹ　ＬＹ９　ＧＩＹ　 ＧｌｕＶａｌ　Ｌｙｇ　Ｌｅｕ　Ａｇｐ　Ｇｌｕ　Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｇ ｌｙ　Ｌｅｕ　Ｖａｔ　Ｇｉｎ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　Ｐｒ。

１３０　１３５　１４１＋ ＭｅヒＬｙｓＬ、ｅｕ５ｅｒＣｙｓＶａｌＡｌａＳｅｒＧｌｙＰｈｅＴｈｒＰｈ ｅＳｅｒＡｓｐ丁ｙｒＴｒｐＭｅセＡｉｎ　Ｔｒｐ　Ｖａｌ　Ａｒｇ　Ｇｉｎ　 Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　Ｌｙｓ　Ｇｌｙ　Ｌ＠ｕ　Ｇｌｕ　Ｔｒｐ　Ｖａｌ　 Ａ１ｍＧｌｈ　ＩＩｌ！　Ａｒｇ　Ａｓｎ　Ｌｙｓ　Ｐｒｏ　Ｔｙｒ　Ａｓｎ　 Ｔｙｒ　Ｇｌｕ　Ｔｈｒ　Ｔｙｒ　丁ｙｒ　Ｓｅｒ　八ｕｐ　Ｓ＠■ １８０　１Ｊ５　１９０ Ｖａｌ　Ｌｙａ　Ｃ１ｙ　Ａｒｇ　Ｐｈｅ　Ｔｈｒ　ｌｉｅ　Ｓｅｔ　Ａｒｇ　 Ａｓｐ　Ａｓｐ　Ｓｅｒ　Ｌｙｓ　Ｓｅｒ　ｓｅｒ　Ｖａ１１９５　２００　２ ０Ｓ 丁ｙｒ　Ｌｅｕ　Ｇｉｎ　Ｍａｅ　Ａｓｎ　Ａｇｎ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　Ｖａｌ　 Ｇｌｕ　Ａｓｐ　Ｍａｔ　Ｇｌｙ　ＩＩｓ　Ｔｙｒ　ＴｙｒＣｙｉ　Ｔｈｒ　Ｇ ｌｙ　Ｓｅｒ　Ｔｙｒ　Ｔｙｒ　Ｇｌｙ　Ｍｅｔ　Ａｓｐ　丁ｙｒ　Ｔｒｐ　Ｇ ｌｙ　Ｇｉｎ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　５ｅｒ（２）配列番号１４の情報 （ｉ）配列の特徴。

（＾）配列の長さニア６１塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数７両形態 （Ｄ）トポロジー、両形態 （１ｘ）特徴 （Ａ）特徴を表す記号・ＣＤ５ （Ｂ）存在位置・１　７５６ （Ｘｌ）配列　配列番号１４ （２）配列番号１５の情報 （１）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ　２５１アミノ酸 （Ｂ）配列の型二アミノ酸 （Ｄ）トポロジー・直鎖状 （ｉｉ）分子の型　タンパク質 （ｘｌ）配列、配列番号１５ 丁ｈｒ　Ｇｌｙ　５ｅｒ　Ｔｙｒ　Ｔｙｒ　Ｇｌｙ　Ｍｅｔ　八６Ｐ　丁ｙｒ　 Ｔｒｐ　Ｇｌｙ　Ｇｉｎ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ｓｅｔ　Ｖａ１丁ｈｒ　ＶａＩ　Ｓ ａｒ　Ｓ＠ｒ　Ａｓｐ　Ｌｙｓ　Ｔｈｒ　）Ｉｉｓ　Ｔｈｒ　Ｃｙｓ　’２４’ ｉ　２５０ （２）配列番号１６の情報 （ｉ）配列の特徴： （＾）配列の長さ、７７０塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）ｉｌｌの数０両形態 （Ｄ）トポロジー　両形態 （１ｘ）特徴 （＾）特徴を表す記号・ＣＤ５ （Ｂ）存在位置：１．．７６５ （ｘｌ）配列：配列番号１６ ２）配列番号１７の情報 （１）配列の特徴。

（＾）配列の長さ　２５４アミノ酸 （Ｂ）配列の型・アミノ酸 （Ｄ）トポロジー　直鎖状 （１１）分子の型：タンパク質 （ｘｌ）配列　配列番号１７ Ａｓｐ　Ｖａｌ　Ｖａｌ　Ｍｅｔ　Ｔｈｒ　Ｇｉｎ　丁ｈｒ　Ｐｒｏ　Ｌｅｕ　 Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　Ｖａｌ　Ｓｅｒ　Ｌａｕ　Ｇｌｙｌｏ　、　ｉｓ Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　Ａｓｐ　Ｃｌｕ　Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　 Ｖａｌ　Ｇｉｎ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　Ｐｒｏ　Ｍｅｔ１３０　１：＋５　 １４０ Ｌｙｓ　［．ｅｕ　Ｓｅｒ　Ｃ）＋＋　Ｖａｌ　Ａｌａ　５ｅｒ　Ｃｌｙ　Ｐｈ ａ　Ｔｈｒ　Ｐｈｅ　Ｓｅｒ　Ａｓｐ　Ｔｙｒ　丁ｒｐ　Ｍ唐■ Ａｓｎ　Ｔｒｐ　Ｖａｌ　Ａｒｇ　Ｇｉｎ　Ｓ＠ｒ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　Ｌｙｓ　 Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　丁ｒｐ　Ｖａｌ　八ｌａ　Ｇｉｎ１Ｇ５　１７０　１ ７５ １１ｅ　Ａｒｇ　Ａｓｎ　Ｌｙｓ　Ｐｒｏ　Ｔｙｒ　Ａ＋＋ｎ　Ｔｙｒ　Ｇｌｕ 　丁ｈｒ　Ｔｙｒ　Ｔｙｒ　Ｓａｒ　Ａ＠ｐ　Ｓｅｒ　Ｖａ■ Ｌｙｓ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　Ｐｈｅ　Ｔｈｒ　ｌｉｅ　Ｓｅｒ　Ａｒｇ　八ｓｐ　 Ａｓｐ　Ｓ＋ｒ　Ｌｙｓ　Ｓｅｔ　Ｓｅｒ　Ｖａｌ　ＴｙｒＬｅｕ　Ｇｉｎ　Ｍ ｅｔ　八Ｂｎ　Ａｓｎ　Ｌ＠ｕ　Ａｒｇ　Ｖａｌ　Ｇｌｕ　Ａｓｐ　ＭｅＣ　Ｇ ］．ｙ　ｌｉ＠　Ｔｙｒ　Ｔｙｒ　Ｃｙ■ 丁ｈｒ　Ｇｌｙ　ｓ１！ｒ　Ｔｙｒ　Ｔｙｒ　Ｃｌｙ　Ｍｅｔ　Ａｓｐ　丁ｙｒ 　Ｔｒｐ　Ｇｌｙ　Ｇｉｎ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ｓ＠ｒ　Ｖａ{ Ｔｈｒ　Ｖａｌ　Ｓｅｒ　Ｓ＠ｒ　ＡｌＩｐ　Ｌｙｓ　Ｔｈｒ　Ｈｆ　丁ｈｒ　 Ｃｙ＋＋　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｃｙｓ　’（２）配列番号１８の情報 （１）配列の特徴 （＾）配列の長さ　１４６０塩基対 （Ｂ）配列の型　核酸 （Ｃ）！Ｊｌの数　両形聾 （Ｄ）トポロノー　両形懸 （ＩＸ）特徴 （Ａ）特徴を表す記号　ＣＤＳ （Ｂ）存在位置　１．．１３９８ （Ｘ１）配列　配列番号１８ ＧＡＣ　ＧＴＣ　ＧＴＧ　八ＴＧ　ＴＣＡ　ＣＡＧ　ＴＣＴ　ＣＣＡ　ＴＣＣ　 ＴＣＣ　ＣＴＡ　ＣＣＴ　Ｇ丁Ｇ　ＴＣＡ　ＧＴ丁　ＧＧＣ@４８ Ａｓｐ　Ｖａｌ　Ｖａｌ　Ｍｅｔ　Ｓｅｒ　Ｇｌｎ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ｓ＠ｒ　 Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　Ｖａｌ　Ｓｅｒ　Ｖａｌ　ＧｌｙＧＧＴ八ＡＴＩＴ７ ＬＡＡＡＧＡＡＣＴＡＣＴＴＧＧＣＣＴＧＧＴＡＣＣＡＧＣＡＧＡ入ＡＣＣＡＧ ＧＧＣＡＧ１４４ｃｌｙ　Ａｓ．ｎ　Ｇｌｎ　ＬｙＩＩＡｓｎ　Ｔｙｒ　Ｌｅｕ 　Ａｌａ　Ｔｒｐ　Ｔｙｒ　Ｇｉｎ　Ｇｉｎ　Ｌｙｓ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｇｉ■ 丁ＣＴ　ＣＣＴ　ＡＡＡ　ＣＴＧ　＋？ＴＧ　ＡＴＴ　ＴＡＣ　丁（；Ｇ　（； ＣＡ　ＴＣＣ　ＧＣＴ　ＡＧＧ　ＣＭ　ＴＣＴ　ＧＧＧ　ＧsＣ　１９２ Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｉｌ．ａ　丁ｙｒ　Ｔｒｐ　Ａｌａ 　Ｓｅｒ　Ａｌａ　Ａｒｇ　Ｇｌｕ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｖａ■ ｓｏ　５５　６０ （２）配列番号１９の情報 （ｉ）配列の特徴 （Ａ）配列の長さ　４８６アミノ酸 ＣＢ）配列の型　アミノ酸 （Ｄ）トポロンー　直鎖状 （ｌ１）分子の型　タンパク質 （ｘ１）配列　配列番号１９ 八ｓｐ　Ｖａｌ　Ｖａｌ　Ｍｅｔ　Ｓｅｒ　Ｇｌ．ｎ　Ｓｅｒ　Ｐｒａ　Ｓｅｒ 　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　Ｖａｌ　Ｓｅｒ　Ｖａｌ　Ｇｌ■ ＧｌｕＬｙｓＶａｌＴｈｒＬｅｕＳｅｒＣｙ＋ＬｙｓＳｉｒＳｅｒＧｉｎＳｅｒ ＬｅｕＬｅｕＴｙｒＳｅｒＧｉｙ　Ａｓｎ　Ｇｌｎ　Ｌｙｓ　Ａｓｎ　Ｔｙｒ　 Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ｔｒｐ　Ｔｙｒ　Ｇｉｎ　Ｇｌｎ　Ｌｙｅ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　 ＧｉｎＳｅｒ　Ｐｒｏ　ＬｙＳ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　ｌｉｅ　Ｔｙｒ　Ｔｒｐ　Ａ ｌａ　Ｓｅｒ　Ａｌａ　八ｒｇ　Ｇｌ．ｕ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｖａ■ Ｓｏ　５５　６０ Ｐｒｏ　Ａ．ｐ　Ａｒｑ　Ｐｈｅ　丁ｈｒ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｓ＠ｒ　 Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ａｓｐ　Ｐｈａ　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　ＳｅｒＩ＋ｓ　フＯ　７５ 　８０ １１ｅ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｖａｌ　Ｌｙａ　Ｔｈｒ　Ｇ］．ｕ　Ａｇｐ　Ｌｅｕ 　Ａｌａ　Ｖａｌ　Ｔｙｒ　Ｓｅｒ　Ｃｙｇ　Ｇｉｎ　Ｇｌ■ Ｂ５　９０　９５ ＴｙｒＴｙｒＳｅｒＴｙｒＰｒｏＬｅｕＴｈｒＰｈｅＧｌｙＡｌａＧｌｙＴｈｒ ＬｙｓＬｅｕＶａｌＬｅｕＴｙｒ　Ｐｈｅ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ａｅｎ　 Ａｓｐ　Ａｓｐ　Ｐｈ＠　Ｌｙｓ　丁ｙｒ　八ｓｎ　Ｇｌｕ　Ａｒｇ　Ｐｈｅ　 ＬｙｓＧｌｙ　Ｌｙｓ　Ａｌａ　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ａｌａ　Ａｓｐ　Ｌ ＹＩＩ　Ｓａｒ　Ｓｅｔ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ａ］．ａ　丁ｙｒ　Ｖ≠■ Ｇｉｎ　Ｌｅｕ　Ａｓｎ　Ｓａｒ　Ｌａｕ　Ｔｈｒ　Ｓａｒ　Ｇｉｌｌ　ＡＩ＋ Ｐ　Ｓｅｒ　Ａｌａ　Ｖａｌ　Ｔｙｒ　Ｐｈｅ　Ｃｙｓ　Ｔ■■ Ａｒｇ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ａｓｎ　Ｍｅｔ　八ｌａ　Ｔｙｒ　Ｔｒｐ　Ｇｌｙ　 Ｇｉｎ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　Ｖａｌ　Ｔｈｒ　Ｖａｌ２２５　２３０　２ ３Ｓ　２４０ Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ａｓｐ　Ｖａｌ　ＶａＩＭｅｊＳｅｒ　Ｇｉｎ　Ｓｅｒ　Ｐｒ ｏ　Ｓｅｔ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　Ｖａｌ　ＳｅｒＶａｌ　Ｇｌｙ　Ｇｌｕ 　Ｌｙｓ　Ｖａｌ　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ｃｙｓ　Ｌｙ＠Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　 Ｇｌｎ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　ＬｅｕＴｙｒＳｅｒＧｌｙＡｓｎＧｉｎＬｙ＋＋Ａｓ ｎＴｙｒＬａｕｌａＴｒｐＴｙｒ（；ｉｎＧｉｎＬｙｓＰｒｏＧｌｙ　Ｇｌｎ　 Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　ＬｙｌＩ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｉ１．ｅ　Ｔｙｒ　Ｔｒｐ　Ａｌ ａ　Ｓｅｒ　八ｌａ　Ａｒｇ　Ｇｌｕ　Ｓ■■ Ｇａｙ　Ｖａｌ　Ｐｒｏ　Ａｓｐ　Ａｒｇ　ｌｌｈｅ　Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ 　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ａｓｐ　Ｐｈｅ　Ｔｈ■ Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ｉｌｅ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｖａｌ　Ｌｙｓ　Ｔｈｒ　Ｇｌｕ　 Ａｌ＋ｐ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ｖａｌ　Ｔｙｒ　Ｔｙｒ　Ｃｙ■ ３２５　３３０　３３Ｓ Ｇ１ｎ　Ｇｌｎ　Ｔｙｒ　Ｔｙｒ　ｆ＞ｅｒ　ｔｙｒ　Ｐｒｏ　＊ｅｕ　丁ｈｒ 　Ｐｈｅ　Ｇ］．ｙ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　ＬｙＩＩ　kｅｕ Ｖａｌ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　Ｇｌｙ　．’＋ｅｒ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　Ｇａｙ　Ｓｅ ｒ　Ｇｌｙ　ＬｙｌＩＳｅｒ　Ｓｅｒ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ｌ凾■ Ｇｌｙ　Ｇｉｎ　Ｖａｌ　Ｇｉｎ　Ｌｅｕ　（；ｉｎ　Ｇｉｎ　Ｓｅｒ　Ａｓｐ 　Ａｌａ　ＧＬｕ　Ｌｅｕ　Ｖａｉ　Ｌｙｌｌ　Ｐｒｏ　Ｇ撃■ Ａｌａ　Ｓｅｒ　νａｌ　Ｌｙｓ　Ｉｌｅ　Ｓｅｒ　Ｃｙｇ　Ｌｙｓ　Ａｌａ　 Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｔｙｒ　丁ｈｒ　Ｐｈｅ　Ｔｈｒ　ＡｓｐＨｉｓ　Ａｌａ　Ｉ ｌｅ　Ｈｉ＋＋　Ｔｒｐ　’ＪａｌＬｙｓ　Ｇｉｎ　Ａｓｎ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　 Ｇｉｎ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ｔｒ■ Ｘ１ｅ　Ｇｌ．ｙ　Ｔｙｒ　Ｐｈｅ　Ｓｅｒ　ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ａｓｎ　Ａｓｐ 　Ａｓｐ　Ｐｈ＠　Ｌｙｇ　丁ｙｒ　Ａ＊ｎ　Ｇｌｕ　Ａｒ■ Ｐｈｅ　Ｌｙｇ　Ｇｌｙ　Ｌｙｅ　八ｌａ　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　＾ｌａ　 Ａｓｐ　Ｌｙｓ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｓａｒ　丁ｈｒ　Ａ］．■ Ｔｙｒ　Ｖａｌ　Ｇｌｎ　Ｌｅｕ　Ａｓｎ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　 Ｇｌｕ　Ａｓｐ　Ｓｅｒ　Ａｌａ　Ｖａｌ　Ｔｙｒ　ＰｈｅＣｙｓ　Ｔｈｒ　八 ｒｇ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ａｓｎ　間ａｔ　Ａｌａ　丁ｙｒ　Ｔｒｐ　Ｇａｙ　Ｇ ｌｎ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　Ｖａｌ４ｇｓ　４７０　４７５　４８０ （２）配列番号２０の情報 （ｉ）配列の特徴： （＾）配列の長さ　７２５塩基対 （Ｂ）配列の型・核酸 （Ｃ）鎖の数：両形態 （Ｄ）トポロジー：両形態 （ｉｘ）特徴 （＾）特徴を表す記号：ＣＤ５ （Ｂ）存在位置：１．．７２３ （ｘｉ）配列：配列番号２０ ＧＡＣ（ＴＣＧＴＴ　ＡＴＣＡＣＴ　ＣＡに　ＡＣＡ　ＣＣＡ　ＣＴＡ　ＴＣＡ 　ＣＴｒ　ＣＣＴ　（Ｔｒ　ＡＧＴ　ｃＴＡ　ＧＧＴ　４８ＡｓｐＶａＩＶａ１ ＭｅｔＴｈｒＧｉｎＴｈｒＰｒｏＬｅｕｇ＠ｒＬ畿ｕＰｒｏＶａｌＳｅｒＬｅｕ Ｇｌｙ１０　ｉｓ 八へＴＧＧ＾　入ＡＣＡｃｅ　ＴＡＴ　Ｔ”ｒＡ　Ｃ０丁　丁Ｃａ　丁＾ＣＣＴ Ｇ　ＣＡＧ　ＡＡＧ　ＣＣＡ　ＧＧＣＣＡＧ　ＴＣＴ　１４S Ａｓｎ　Ｇｌｙ　Ａｓｎ　Ｔｈｒ　Ｔｙｒ　Ｌｅｕ　Ｌｅｇ　丁ｒｐ　Ｔｙｒ　 Ｌ＠ｕ　Ｇｉｎ　Ｌｙｓ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｇｉｎ　５ａｒＣＣＡ　ＭＧ　ＧＴ ＣＣＴＧ　ＡＴｃ　丁ＡＣＷ　ＧＴｒ　丁ＣＣＡＡＣＣ（Ａ　ＴＴＴ　ＴＣＴ　 ＧＧＧ　ＧＴＣＣＣＡ　１９２Ｐｒｏ　Ｌｙｓ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　ＩＩｓ　Ｔｙ ｒ　Ｌｙ＋　Ｖａｌ　Ｓａｒ　Ａｓｎ　Ａｒｇ　Ｐｈ＠Ｓｅｒ　６１ｙ　ＶａＬ 　Ｐｒ。

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ｐｒｏ　ＡＩＩＰ　Ａｒｇ　Ｐｈｅ　丁ｈｒ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｂａｒ 　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ａｓｐ　Ｐｈ＠　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　Ｓ＠■ ６５７０７５ｅＯ １１＊　５＠ｒ　Ｓａｒ　Ｖａｌ　Ｌｙｓ　Ｔｍ　Ｇｌｕ　Ａｓｐ　Ｌｅｕ　Ａ ｌｍ　Ｖａｌ　Ｔｙｒ　Ｔｙｒ　Ｃｙａ　Ｇｉｎ　Ｇ１ｎ↑ｙｒ　Ｔｙｒ　Ｂ＠ ｒ　Ｔｙｒ　Ｐｒｏ　Ｌ＠ｕ　Ｔｈｒ　Ｐｈｅ　Ｇｌｙ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ｔｈ ｒ　１ｒｙａ＋　Ｌａｕ　Ｖａｌ　Ｌ■■ ｌｏｏ　１０５　１１０ Ｌｙｓ　Ｇｌｙ　Ｓｉｒ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　 Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ｇｌｙ　Ｇｌｕ　Ｖａｌ　ＬｙｓＬ＠ｕ　Ａ＠ｐ　Ｇ ｌｕ　丁ｈｒ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｌ＠ｕ　ＶａＩ　Ｇｉｎ　Ｐｒｏ　Ｇ ｌｙ　Ａｒｇ　Ｐｒｏ　Ｍ＠ｔ　ＬｙｓＬｅｕ　Ｓａｒ　Ｃｙｓ　Ｖａｌ　Ａｌ ａ　ｓａｒ　Ｇｌｙ　Ｐｈｅ　Ｔｈｒ　Ｐｈ瞼　Ｓｅｒ　Ａｓｐ　Ｔｙｒ　丁ｒ ｐ　！４ｓセ　Ａｓ■ １４５　ｉｓθ　１５５　１ＧＯ Ｔｒｐ　ｖａｌ　Ａｒｇ　Ｇｉｎ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　Ｌｙｓ　Ｇｌｙ　 Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ｔｒｐ　Ｖａｌ＾ｌａ　Ｇｉｎ　Ｉｌｅ＾ｒｇ　Ａｓｎ　Ｌｙ ｓ　Ｐｒｏ　Ｔｙｒ　Ａｓｎ　Ｔｙｒ　Ｇｌｕ　Ｔｈｒ　Ｔｙｒ　Ｔｙｒ　Ｓｅ ｒ　Ａｓｐ　Ｓ＠ｒ　Ｖａｌ　ＬＹ＠ＩＪＯＩＪＳ　１９０ にｌｙ　ｌｒｑ　Ｐｈｅ　Ｔｈｒ　Ｉｌｅ　Ｓｅｒ　Ａｒｇ　八ＩＩｐ　Ａｓｐ 　Ｓａｒ　Ｌｙｓ　Ｓｅｒ　Ｓａｒ　Ｖａｌ　丁ｙｒ　Ｌｅ■ にｉｎ　Ｍｅｔ　Ａｓｎ　八ｓｎ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　Ｖａｌ　Ｇｌｕ　Ａｓｐ　 Ｍｅｔ　Ｇｌｙ　Ｉｌｅ　Ｔｙｒ　丁ｙｒ　Ｃｙｓ　ＴｈｒＣｌｙ　Ｓｅｒ　Ｔ ｙｒ　Ｔｙｒ　Ｇｌｙ　Ｍｅｔ　Ａｓｐ　Ｔｙｒ　Ｔｒｐ　Ｇｌｙ　Ｇｉｎ　Ｇ ｌｙ　Ｔｈｒ　！＋ａｒ　Ｖａｌ　Ｔｈ■ ＦＩＧ、ＩＡ ＦＩＧ、ＩＢ ＦＩＧ、ＩＣ ＦＩＧ、２Ａ ＦＩＧ、３Ａ ＦＩＧ、３８ ＦＩＧ、３Ｃ ＦＩＧ、４Ａ ＦＩＧ、４Ｂ 抗ＢＶＬ−胱ＡＶＨすし八　■−９乞β■ＦＩＧ、５Ａ ＦＩＧ、５Ｂ ＦＩＧ、５Ｃ ＦＩＧ、６日 ＦＩＧ、７ ４−４−２０　ＶＬ／２１２／ＣＣ４９ＶＨ＠イ云”ｒ８Ｉｎｄ　ＩＩｌ 、ｊ−４−２０ＶＬ／２＋２／ＣＣ４９ＶＨ１伝）Ｐｈｐ　Ｃｙｓ　Ｔｈｒ　Ａ ｒｇ　Ｓｅ＋ｒ　Ｌｅｕ　Ａｓｎ　Ｍｅｔ＾ｌａ　Ｔｙｒ　Ｔｒｐ　Ｇｌｙ　Ｇ ｉｎ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ｓｐｒ@ＶＱＩ　Ｔｈｒ　Ｖｎｌ　Ｓｅｔ ＣＣ４９Ｖ１／２１２／４（−２Ｑ　ＶＨｆｉ（、，３ＣＣ４９ＶＬ／２＋２７ ４−４−２０　Ｖｌ、ｌ　＝ｊ：［］イ、”ｒＢいＨ１ ４−４−２０／２１２　シ’Ｚ−ｒ弓’ｙ　１つのヒツジｔするクンノ（１質４ −４−２０／２１２　シス５インＬ）のレンジ左有す６クンパフ管４−４−２０ ７２１２　シスライ／２フのしフジ１１幻ン／ξり嘆４−４−２０／２１２　ン ス〒イン２つのしアジ１ｆｉ１１３フン／ぐ７’１ＣＣ４９／２１２　ＳＣＡ” タン／ε７質遺イ反子二１体ＣＣ４９７２１２ＳＣＡＴＭ　ゲンｌぐり債１１仏 ト量イ苓ＣＣ４９／２１２　ｓｃＡＴＭ　タンｌζワ１かムＪ二童ｐト２００． ０００− ヲ ６８．０００−　− ｑ　／：２−ｏ　’　Ｉ、ｔ、吋 ４−４−２０　ＶＬ／２１７／ＣＣ４９Ｖ）ｌ　１ｅａｓト１１０　２１７ソン カー　１２０ ４−４−２０　ＶＬ／２１７／ＣＣ４９ｖＨ＃Ｊａｒ［Ｃ４９Ｖｌ／２１７／４ −４−２０　ＶＨ１（ｔＪ分分合６　：　手、ン恥し＾ へ うｉｌ１寸　：　２μヤン狛１＾ 昏面璋　７３２４５２　＋ＯＯ，ＯＯ０′７σＵ−″７１Ａ： ノ讐賽＾′：　冷ヤンわＶ＾ ｇ−’ｚＮＯ，ａ％Ｐ：Ｉ９　＆ｙ（μＶ）　ｆｆｉ婦帖−５ＥＣ）　Ｔｆｎ傾 ７０．０　４０．０ 佃　訪　：　ｌＦ、ン狛ＶＡ じ０−グＮｏ、　時閉　鷲２　島ブ（μｖ）　＠＊偶（ＩＪＶ−５ＥＣ）　面４ ス［φｄル％ ＦＩＧ、　２５ 一曹＠Ｉ１％１ｌＩＰ　１３１，０００ＦＩＧ、　２６ 補正書の翻訳文提出書

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．２つ以上の一本鎖分子からなる多価抗原結合タンパク質であって、各一本鎖 分子は、 （ａ）抗体のＨ鎖またはし鎖の可変領域の結合部分を含む第１ポリペプチド；（ ｂ）抗体のＨ鎖またはし鎖の可変領域の結合部分を含む第２ポリペプチド；およ び （ｃ）第１ポリペプチド（ａ）および第２ポリペプチド（ｂ）を結合して一本鎖 分子にするペプチドリンカーを含む多価抗原結合タンパク質。 ２．第１ポリペプチドが抗体のＬ鎖の可変領域の結合部分を含み、第２ポリペプ チドが抗体のＨ鎖の可変領域の結合部分を含むものである請求項１に記載の多価 タンパク質。 ３．第１ポリペプチドが抗体のＬ鎖の可変領域の結合部分を含み、第２ポリペプ チドが抗体のＬ鎖の可変領域の結合部分を含むものである請求項１に記載の多価 タンパク質。 ４．第１ポリペプチドが抗体のＨ鎖の可変領域の結合部分を含み、第２ポリペプ チドが抗体のＨ鎮の可変領域の結合部分を含むものである請求項１に記載の多価 タンパク質。 ５．二価抗原結合タンパク質である請求項１、２、３または４に記載の多価タン パク質。 ６．ヘテロニ価抗原結合タンパク質である請求項５に記載の多価タンパク質。 ７．ホモニ価抗原結合タンパク質である請求項５に記載の多価タンパク質。 ８．実質的に一本鎖分子を含まない多価抗原結合タンパク質をむ組成物であつて 、該多価タンパク質は２つ以上の一本鎖分子からなり、各一本鎖分子は、（ａ） 抗体のＨ鎖またはＬ鎖の可変領域の結合部分を含む第１ポリペプチド；（ｂ）抗 体のＨ鎖またはし鎖の可変領域の結合部分を含む第２ポリペプチド；および （ｃ）第１ポリペプチド（ａ）および第２ポリペプチド（ｂ）を結合して一本鎖 分子にするペプチドリンカー限含む組成物。 ９．第１ポリペプチドが抗体のＬ鎖の可変領域の結合部分を含み、第２ポリペプ チドが抗体のＨ鎖の可変領域の結合部分を含むものである請求項８に記載の組成 物。 １０．第１ポリペプチドが抗体のＬ鎖の可変領域の結合部分を含み、第２ポリペ プチドが抗体のＬ鎖の可変領域の結合部分を含むものである請求項８に記載の組 成物。 １１．第１ポリペプチドが抗体のＨ鎖の可変領域の結合部分を含み、第２ポリペ プチドが抗体のＨ鎖の可変領域の結合部分を含むものである請求項８に記載の組 成物。 １２．実質的に一本鎖分子を含まない、二価抗原結合タンパク質を含む請求項８ 、９、１０または１１に記載の組成物。 １３．二価タンパク質がヘテロニ価である請求項１２に記載の組成物。 １４．二価タンパク質がホモニ価である請求項１２に記載の組成物。 １５．一本鎖分子および過剰の多価抗原結合タンパク質を含む水性組成物であっ て、該多価タンパク質は２つ以上の一本鎖分子からなり、各一本鎖分子は、（ａ ）抗体のＨ鎖またはＬ鎖の可変領域の結合部分を含む第１ポリペプチド；（ｂ） 抗体のＨ鎖またはＬ鎖の可変領域の結合部分を含む第２ポリペプチド；および （ｃ）第１ポリペプチド（ａ）および第２ポリペプチド（ｂ）を結合して一本鎖 分子にするペプチドリンカー鎖を含むものである水性組成物。 １６．少なくとも１つの一本鎖分子が、（ａ）抗体のＬ鎖の可変領域の結合部分 を含む第１ポリペプチド；（ｂ）抗体のＨ鎖の可変領域の結合部分を含む第２ポ リペプチド；および（ｃ）第１ポリペプチド（ａ）および第２ポリペプチド（ｂ ）を結合して一本鎖分子にするペプチドリンカーを含むものである請求項１５に 記載の水性組成物。 １７．少なくとも１つの一本鎖分子が、（ａ）抗体のＬ鎖の可変領域の結合部分 を含む第１ポリペプチド；（ｂ）抗体のＬ鎖の可変領域の結合部分を含む第２ポ リペプチド；および（ｃ）第１ポリペプチド（ａ）および第２ポリペプチド（ｂ ）を結合して一本鎖分子にするペプチドリンカーを含むものである請求項１５に 記載の水性組成物。 １８．少なくとも１つの一本鎖分子が、（ａ）抗体のＨ領の可変領域の結合部分 を含む第１ポリペプチド；（ｂ）抗体のＨ鎖の可変領域の結合部分を含む第２ポ リペプチド；および（ｃ）第１ポリペプチド（ａ）および第２ポリペプチド（ｂ ）を結合して一本鎖分子にするペプチドリンカーを含むものである請求項１５に 記載の水性組成物。 １９．多価抗原結合タンパク質の生産法であって、（ａ）多価抗原結合タンパク 質および一本鎖分子［各一本鎖分子は、（ｉ）抗体のＨ鎖の可変領域の結合部分 を含む第１ポリペプチド；（ｉｉ）抗体のＨ鎖の可変領域の結合部分を含む第２ ポリペプチド；および（ｉｉｉ）第１ポリペプチド（ｉ）および第２ポリペプチ ド（ｉｉ）を結合して一本鎖分子にするペプチドリンカーを含む］を含む組成物 を生産するステップ； （ｂ）一本鎖分子から多価タンパク質を分離するステップ；および（ｃ）多価タ ンパク質を回収するステップを含む方法。 ２０．陽イオン交換クロマトグラフィーを利用して該一本領分子から該多価タン パク質を分離する請求項１９に記載の方法。 ２１．ゲル濾過クロマトグラフィーを利用して一本鎖分子から多価タンパク質を 分離する請求項１９に記載の方法。 ２２．多価抗原結合タンパク質の生産法であって、（ａ）一本鎖分子［各一本鎖 分子は、（ｉ）抗体のＨ鎖の可変領域の結合部分を含む第１ポリペプチド；（ｉ ｉ）抗体のＨ鎖の可変領域の結合部分を含む第２ポリペプチド；および（ｉｉｉ ）第１ポリペプチド（ｉ）および第２ポリペプチド（ｉｉ）を結合して一本蹟分 子にするペプチドリンカーを含む］を含む組成物を生産するステップ；（ｂ）一 本鎖分子を解離するステップ；（ｃ）一本鎖分子を再会合するステップ；（ｄ） 一本鎖分子から多価抗原結合タンパク質を分離するステップ；および（ｅ）多価 タンパク質を回収するステップを含む方法。 ２３．解離が、解離溶液に対する透析によって起こる請求項２２に記載の方法。 ２４．再会合が、リホールディング溶液またはりホールディング剤に対する透析 によって起こる請求項２２に記載の方法。 ２５．少なくとも２つの一本鎖分子を互いに架橋するステップを含む多価抗原結 合タンパク質の生産法であって、各一本領分子は、（ａ）抗体のＨ蹟またはし鎖 の可変領域の結合部分を含む第１ポリペプチド；（ｂ）抗体のＨ鎖またはＬ鎖の 可変領域の結合部分を含む第２ポリペプチド；および （ｃ）第１ポリペプチド（ａ）および第２ポリペプチド（ｂ）を結合して一本鎖 分子にするペプチドリンカーを含むものである方法。 ２６．化学的手段によって架橋する請求項２５に記載の方法。 ２７．多価抗原結合タンパク質の生産法であって、（ａ）一本鎖分子［各一本鎖 分子は、（ｉ）抗体のＨ鎖の可変領域の結合部分を含む第１ポリペプチド；（ｉ ｉ）抗体のＨ鎖の可変領域の結合部分を含む第２ポリペプチド；および（ｉｉｉ ）第１ポリペプチド（ｉ）および第２ポリペプチド（ｉｉ）を結合して一本鎖分 子にするペプチドリンカーを含む］を含む組成物を生産するステップ；（ｂ）該 一本鎖分子を濃縮するステップ；（ｃ）一本鎖分子から多価抗原結合タンパク質 を分離するステップ；および（ｄ）多価タンパク質を回収するステップを含む方 法。 ２８．濃縮ステップを一本鎖分子の濃度が０．５ｍｇ／ｍｌから沈殿が始まる濃 度までの間で濃縮ステップを行う請求項２７に記載の方法。 ２９．サンプル中に存在するかまたは存在が予想される抗原の検出法であって、 （ａ）サンプルを請求項１の多価抗原結合タンパク質と接触させ；次いで（ｂ） 多価抗原結合タンパク質が抗原に結合したかどうかを検出することを含む方法。 ３０．有効量の標識した請求項１の多価抗原結合タンパク質を動物に投与し、該 動物に結合した検出可能な放射線を測定することを含む動物の内部構造の造影３ １．請求項１〜４、８〜１１または１５〜１８のいずれか１つに記載の多価抗原 結合タンパク質と治療上または診断上有用な作用剤との組み合わせを含有する祖 成物。 ３２．（ａ）抗体のＬ鎖の可変領域の結合部分を含む第１ポリペプチド；（ｂ） 抗体のＬ鎖の可変領域の結合部分を含む第２ポリペプチド；および（ｃ）第１ポ リペプチド（ａ）および第２ポリペプチド（ｂ）を結合して一本鎖分子にするペ プチドリンカーを含む一本鎖タンパク質。 ３３．（ａ）抗体のＨ領の可変領域の結合部分を含む第１ポリペプチド；（ｂ） 抗体のＨ鎖の可変領域の結合部分を含む第２ポリペプチド；および（ｃ）第１ポ リペプチド（ａ）および第２ポリペプチド（ｂ）を結合して一本鎖分子にするペ プチドリンカーを含む一本鎖タンパク質。 ３４．（ａ）モノクローナル抗体ＣＣ４９のＶＬまたはＶＨを含む第１ポリペプ チド； （ｂ）モノクローナル抗体ＣＣ４９のＶＬまたはＶＨを含む第２ポリペプチド； および （ｃ）第１ポリペプチド（ａ）および第２ポリペプチド（ｂ）を結合して一本鎖 分子にするペプチドリンカーを含む一本鎖タンパク質。 ３５．リンカーが２０２′、２１２、２１６および２１７リンカーからなる群か ら選ばれる請求項３４に記載の一本鎖タンパク質。 ３６．（ａ）モノクローナル抗体ＣＣ４９のＶＬまたはＶＨを含む第１ポリペプ チド； （ｂ）モノクローナル抗体４−４−２０のＶＬまたはＶＨを含む第２ポリペプチ ドおよび （ｃ）第１ポリペプチド（ａ）および第２ポリペプチド（ｂ）を結合して一本鎖 分子にするペプチドリンカーを含む一本鎖タンパク質。 ３７．リンカーが２０２′、２１２、２１６および２１７リンカーからなる群か ら選はれる請求項３６に記載の一本鎖タンパク質。 ３８．（ａ）抗体のＬ鎖の可変領域の結合部分を含む第１ポリペプチドをコード するＤＮＡ配列； （ｂ）抗体のＬ鎖の可変領域の結合部分を含む第２ポリペプチドをコードするＤ ＮＡ配列；および （ｃ）第１ポリペプチド（ａ）および第２ポリペプチド（ｂ）を結合して一本鎖 分子にするペプチドリンカーをコードするＤＮＡ配列を含む請求項３２に記載の 一本鎖タンパク質をコードする遺伝子配列。 ３９．（ａ）抗体のＨ鎖の可変領域の結合部分を含む第１ポリペプチドをコード するＤＮＡ配列； （ｂ）抗体のＨ鎖の可変領域の結合部分を含む第２ポリペプチドをコードするＤ ＮＡ配列；および （ｃ）核第１ポリペプチド（ａ）および該第２ポリペプチド（ｂ）を結合して一 本鎖分子にするペプチドリンカーをコードするＤＮＡ配列を含む請求項３３に記 載の一本鎖タンパク質をコードする遺伝子配列。 ４０．（ａ）モノクローナル抗体ＣＣ４９のＶＬまたはＶＨをコードするＤＮＡ 配列； （ｂ）モノクローナル抗体ＣＣ４９のＶＬまたはＶＨをコードするＤＮＡ配列； および （ｃ）該第１ポリペプチド（ａ〕および該第２ポリペプチド（ｂ）を結合して一 本鎖分子にするペプチドリンカーをコードするＤＮＡ配列を含む請求項３４に記 載の一本鎖タンパク質をコードする遺伝子配列。 ４１．ＤＮＡ配列が２０２′、２１２、２１６および２１７リンカーからなる群 から選ばれるペプチドリンカーをコードするものである請求項４０に記載の遺伝 子配列。 ４２．（ａ）モノクローナル抗体ＣＣ４９のＶＬまたはＶＨをコードするＤＮＡ 配列； （ｂ）モノクローナル抗体４−４−２０のＶＬまたはＶＨをコードするＤＮＡ配 列および （ｃ）第１ポリペプチド（ａ）および第２ポリペプチド（ｂ）を結合して一本鎖 分子にするペプチドリンカーをコードするＤＮＡ配列を含む請求損頁３６に記載 の一本鎖タンパク質をコードする遺伝子配列。 ４３．ＤＮＡ配列が２０２′、２１２、２１６および２１７リンカーからなる群 から選はれるペプチドリンカーをコードする請求項４２に記載の遺伝子配列。 ４４．（ａ）抗体のＨ鎖またはＬ鎖の可変領域の結合部分を含む第１ポリペプチ ド； （ｂ）抗体のＨ鎖またはＬ鎖の可変領域の結合部分を含む第２ポリペプチド；（ ｃ）第１ポリペプチド（ａ）および第２ポリペプチド（ｂ）を結合して多価タン パク質にするペプチドリンカー； （ｄ）抗体のＨ鎖またはＬ鎖の可変領域の結合部分を含む第３ポリペプチド；（ ｅ）抗体のＨ鎖またはし鎖の可変領域の結合部分を含む第４ポリペプチド；（ｆ ）第３ポリペプチド（ｄ）および第４ポリペプチド（ｅ）を結合して多価タンパ ク質にするペプチドリンカー；および （ｇ）第２ポリペプチド（ｂ）および第３ポリペプチド（ｄ）を結合して多価タ ンパク質にするペプチドリンカーを含む多価一本鎖抗原結合タンパク質。 ４５．（ａ）抗体のＬ鎖の可変領域の結合部分を含む第１ポリペプチド；（ｂ） 抗体のＨ鎖の可変領域の結合部分を含む第２ポリペプチド；（ｃ）第１ポリペプ チド（ａ）および第２ポリペプチド（ｂ）を結合して多価クンバク質にするペプ チドリンカー； （ｄ）抗体のＬ鎖の可変領域の結合部分を含む第３ポリペプチド；（ｅ）抗体の Ｈ鎖の可変領域の結合部分を含む第４ポリペプチド；（ｆ）第３ポリペプチド（ ｄ）および第４ポリペプチド（ｅ）を結合して多価タンパク質にするペプチドリ ンカー；および （ｇ）第２ポリペプチド（ｂ）および第３ポリペプチド（ｄ）を結合して多価タ ンパク質にするペプチドリンカーを含む多価一本鎖抗原結合タンパク質。 ４６．（ａ）抗体のＨ鎖またはＬ鎖の可変領域の結合部分を含む第１ポリペプチ ドをコードするＤＮＡ配列。 （ｂ）抗体のＨ鎖またはＬ鎖の可変領域の結合部分を含む第２ポリペプチドをコ ードするＤＮＡ配列。 （ｃ）第１ポリペプチド（ａ）および第２ポリペプチド（ｂ）を結合して多価タ ンパク質にするペプチドリンカーをコードするＤＮＡ配列；（ｄ）抗体のＨ鎖ま たはＬ鎖の可変領域の結合部分を含む第３ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列 ； （ｅ）抗体のＨ鎖またはＬ鎖の可変領域の結合部分を含む第４ポリペプチドをコ ードするＤＮＡ配列； （ｆ）第３ポリペプチド（ｄ）および第４ポリペプチド（ｅ）を結合して多価タ ンパク質にするペプチドリンカーをコードするＤＮＡ配列；および（ｇ）第２ポ リペプチド（ｂ）および第３ポリペプチド（ｄ）を結合して多価タンパク質にす るペプチドリンカーをコードするＤＮＡ配列を含む請求項４４または４５に記載 の多価抗原結合タンパク質をコードする遺伝子配列。 ４７．請求項３８〜４３のいずれか１つに記載のＤＮＡ配列を含む複製可能なク ローニングまたは発現担体。 ４８．プラスミドである請求項４７に記載の担体。 ４９．請求項４７の担体で形質転換された宿主細胞。 ５０．バクテリア細胞、酵母細胞または他の真菌細胞、あるいは哺乳類細胞系で ある請求項４９に記載の宿主細胞。 ５１．２つ以上の一本鎖分子からなる多価抗原結合タンパク質の生産性であって 、各一本鎖分子は、 （ａ）抗体のＨ鎖またはＬ鎖の可変領域の結合部分を含む第１ポリペプチド；（ ｂ）抗体のＨ鎖またはＬ鎖の可変領域の結合部分を含む第２ポリペプチド；およ び （ｃ）第１ポリペプチド（ｉ）および第２ポリペプチド（ｉｉ）を結合して一本 鎖分子にするペプチドリンカーを含み、該方法は、（ｉ）該一本鎖分子をコード する遺伝子配列を得；（ｉｉ）該配列で１つ以上の宿主細胞を形質転換し；（ｉ ｉｉ）該宿主において該配列を発現させ；（ｉｖ）該宿主からの多価タンパク質 そ回収することを含む方法。 ５２．２つ以上の一本鎖分子からなる多価一本鎖抗原結合タンパク質の生産法で あって、各一本鎖分子は、 （ａ）抗体のＨ鎖またはＬ鎖の可変領域の結合部分を含む第１ポリペプチド；（ ｂ）抗体のＨ鎖またはＬ鎖の可変領域の結合部分を含む第２ポリペプチド；およ び （ｃ）第１ポリペプチド（ａ）および第２ポリペプチド（ｂ）を結合して多価タ ンパク質にするペプチドリンカー； （ｄ）抗体のＨ鎖またはＬ鎖の可変領域の結合部分を含む第３ポリペプチド；（ ｅ）抗体のＨ鎖またはＬ鎖の可変領域の結合部分を含む第４ポリペプチド；（ｆ ）第３ポリペプチド（ｄ）および第４ポリペプチド（ｅ）を結合して多価タンパ ク質にするペプチドリンカー；および （ｇ）第２ポリペプチド（ｂ）および第３ポリペプチド（ｄ）を結合して多価タ ンパク質にするペプチドリンカーを含み、該方法は、（ｉ）該一本鎖分子をコー ドする選伝子配列を得；（ｉｉ）該配列で１つ以上の宿主細胞を形質転換し；（ ｉｉｉ）該宿主において該配列を発現させ；（ｉｖ）該宿主から多価タンパク質 を回収することを含む方法。 ５３．一本鎖分子から多価タンパク質を分離して多価タンパク負を回収する請求 項５１または５２に記載の方法。 ５４．多価タンパク質の回収が、 （ａ）一本埴分子を解離し； （ｂ）該一本鎖分子を再会合し； （ｃ）該一本鎖分子から多価抗原結合タンパク質を分離し；次いで（ｄ）該タン パク質を回収することを含む請求項５１または５２に記載の方法。 ５５．回収した多価タンパク負をさらに精製することを含む請求項５１または５ ２に記載の生産法。 ５６．宿主細胞がバクテリア細胞、酵母細胞または他の真菌細胞、あるいは哺乳 類細胞系である請求項５１または５２に記載の生産法。 ５７．宿主細胞が大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）または枯草菌（Ｂａｃｃｉｌｕｓ　ｓ ｕｂｔｉｌｉｓ）である請求項５６に記載の生産法。 ５８．検出可能に標識された請求項１に記載の多価抗原結合タンパク質。 ５９．検出可能に標識された抗原を利用するイムノアッセイにおいて、抗原の代 わりに請求項５８に記載の多価タンパク質を用いることを特徴とする改良イムノ アッセイ。 ６０．競合イムノアッセイである請求項５９に記載の改良イムノアッセイ。 ６１．サンドイッチイムノアッセイである請求項５９に記載の改良イムノアッセ イ。 ６２．治療剤と結合した抗体を利用する免疫治療法において、抗原の代わりに請 求項１に記載の多価タンパク質を用いることを特徴とする改良免疫治療法。 ６３．抗原を利用するイムノアフィニテイー精製法において、抗原の代わりに請 求項１に記載の分子を用いることを特徴とする改良イムノアフィニティー精製法 。