BRPI0721465A2 - Planta de tabaco mutagenizada como cultura de semente para a produção de óleo para usos energético, industrial e alimentício - Google Patents

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "PLANTA DE TABACO MUTAGENIZADA COMO CULTURA DE SEMENTE PARA A PRODUÇÃO DE ÓLEO PARA USOS ENERGÉTICO, INDUSTRIAL E ALI- MENTÍCIO".

DESCRIÇÃO TÉCNICA ANTERIOR

O tabaco vinha sendo cultivado, inicialmente, como uma planta ornamental e como uma planta medicinal, impondo-se subsequentemente como um bem essencialmente prazeroso na cultura humana e modificando os hábitos e costumes humanos.

O tabaco tem, entre outras plantas agricultáveis, uma posição que não é comparável com a de outras plantas cultiváveis e apresenta cer- tas peculiaridades, tais como:

1. é uma entre poucas plantas comercializadas apenas por suas

folhas;

2. é a principal planta não alimentícia no mundo com uma exten- são de produção maior do que quatro milhões de hectares em todo o mundo;

3. em muitos países, é um instrumento muito importante para a política econômica e financeira;

4. seu consumo é baseado na transformação das folhas em pro- dutos para fumantes, pós para inalação e produtos mastigáveis;

5. considerando suas características como substância narcótica e sua periculosidade para a saúde humana, sempre houveram tentativas dirigidas para a proibição de seu uso e portanto de sua produção.

A evolução do gênero Nicotiana em diferentes habitats, inicial- mente através da seleção natural e do poliploidismo e, mais tarde, através da seleção dirigida pelo homem, induziu ao aparecimento de uma vasta ga- ma de tipos, todos selecionados com base nas propriedades da folha, sendo a folha considerada como a única parte valiosa da planta.

Recentemente, foram indicados usos alternativos do tabaco a- lém daqueles listados acima:

1. produção de proteínas alimentícias através da sua purificação a partir das folhas (Long R.C. 1979. Tobacco production for protein. Project n. 03245. North Carolina State university, Raleigh NC);

2. a extração de ingredientes farmacologicamente úteis normal- mente presentes nas folhas (Baraldi M. et al. 2004. Presenza di sostanze

Benzodiazepino-simili in estratti di foglie di tabacco (Nicotiana tabacum). Atti lst. Sper. Tab., 23 Aprile, Roma, pp 45-52);

3. a produção de proteínas recombinantes expressas nas folhas ou nas sementes de plantas geneticamente modificadas (Twyman et al. 2003. Molecular farming in plants: host systems and expression technology.

Trends Biotechnol. 21:570-578).

A planta de tabaco apresenta uma grande área de folha, uma pequena inflorescência e uma proporção de partes aéreas:raízes que é a maior observada entre plantas agricultáveis (Went, 1957. The experimental control f plant growth. pp 343. Chronica Botanica, Waltham, Mass.).

Levando em consideração a relevância econômica exercida pelo

cultivo do tabaco, não obstante o aumento alarmante do tabagismo entre os mais jovens, a Europa fornece privilégios para o seu cultivo despertando perplexidade de natureza econômica e ética.

A Comissão Européia, em seu site da internet 20 (www.ec.europa.eu/aqriculture/publi/fact/tobacco) afirma: "não há alternati- vas economicamente válidas a essa cultura que não use bons solos. O in- centivo a cultura do tabaco permite a sobrevivência do tecido rural e produz uma atividade industrial que contribui para a sobrevivência de regiões amea- çadas pela desertificação".

As conseqüências negativas, em termos ambientais, do uso de

combustíveis fósseis e a disponibilidade limitada do petróleo, requerem a busca de novas fontes energéticas. Entre essas, os biocombustíveis são a melhor escolha em uma perspectiva futura devido a sua renovabilidade.

Considerando os biocombustíveis de origem agrícola, até o mo- mento, a atenção está focalizada sobre a produção de bioetanol a partir de plantas que produzem açúcar da forma simples (isto é, sacarose) ou com- plexa (isto é, celulose). Modelos de plantas para tal produção têm sido iden- tificados na cana-de-açúcar, milho, trigo, batata, mandioca, beterraba, ceva- da, sorgo, etc. O desenvolvimento de culturas que se direcionam para a ma- ximização da produção de biomassa a ser transformada em etanol através de processos de fermentação ou para a produção de biocombustíveis ou gás 5 através de gaseificação pode ter o mesmo escopo. Alternativamente, o pa- tamar tecnológico atual objetiva a produção de óleo combustível e biodiesel a partir de espécies de forma oleaginosa ou não oleaginosas mas ricas em óleo tais como a soja, girassol, canola, amendoim, linho, milho, gergelim, palma, coco, mamona, etc.

A escolha da espécie ideal para a produção de biocombustíveis

poderá estar relacionada com o preenchimento de requisitos tais como:

1. determinação do ganho da rede energética na diferença entre o processamento e o rendimento da cultura, compreendendo no dito cálculo os custos energéticos para a produção do maquinário agrícola e para o pro-

cesso de extração e transformação/purificação do óleo;

2. determinação dos benefícios ambientais que derivam da sus- tentabilidade da produção agrícola, diminuição de emissão de CO2 e de ma- téria particulada (por exemplo, PM-10) após a combustão e uso limitado de agroquímicos tais como pesticidas, herbicidas e fertilizantes;

3. ser economicamente competitivo e, possivelmente, determinar

benefícios sociais que possam aumentar a economia dos sistema, por e- xemplo, pela diminuição de custos indiretos sobre o sistema sanitário, consi- derando também que a energia fóssil usada no momento impõe custos am- bientais que não estão, geralmente, na determinação do custo; um biocom-

bustível deve contemplar benefícios para ambos os lados da competitividade e o lado o ambiental;

4. estar disponível em grandes quantidades sem diminuição da disponibilidade alimentícia; 0 uso de plantas agricultáveis tradicionalmente usadas para a produção de alimento não permite seu uso de modo aceitável

para a produção de biocombustíveis sem determinar uma redução das fon- tes de alimento que derivam das ditas plantas, aumento portanto os custos dos materiais brutos; 5. a cultura da planta da qual ele deriva possivelmente se refere a terras marginais que, provavelmente, não são usadas para culturas alter- nativas.

Atualmente, as plantas levadas em consideração para a produ- ção de óleo são: soja (Glycine max), girassol (Helianthus annuus), colza (Brassica napus), amendoim (Arachis hypogaea), mamona (Rieinus commu- nis), linho (Linum usitatissimum), milho (Zea mais), gergelim (Sesamum indi- eum), palma (fruto, Araeaeeae), cerne de palmeira (semente, Araeaeeae), copra (coco, Cocos nueifera), açafrão (Carthamus tinetorius), azeitona (O/ea europea), algodão (Gossypium sp.), caju (Anaeardium oeeidentale), cânha- mo (Cannabis sativa), papoula (Papavers sp.), mostarda (Brassiea sp.), uva (Vitis sp.), damasco (Prunus armeniaea), pinho (Pinus sp.), argan (Argania spinosa), abacate (Persea americana), amêndoa (Prunus amygdalus), avelã (Corylus aveiiana), noz (Juglans regia), amargosa (Azadirachfa indica), niger (Guizotia abyssinica), jojoba (Simmondsia chinensis), arroz (Oryza sativa), abóbora (Cucurbita sp.), crambe (Crambe abyssinica).

Ao contrário, anteriormente, o tabaco sempre foi considerado como uma planta agricultável apta para a produção de folhas.

As três únicas publicações da literatura, relacionadas abaixo, que sugerem outros usos para o tabaco, levam em consideração as varieda- des de tabaco atuais, que foram selecionadas para a produção de folhas, como uma fonte de produto derivado de semente para extração de óleo.

Em particular, Giannelos et al. (Tobacco seed oil as an alternati- ve diesel fuel: physical and chemical properties. Industrial Crops and Pro- 25 ducts, 2002, 16:1-9) declarando que "a semente é um produto derivado da produção de folha na Grécia" sugere a possibilidade de usar as ditas semen- tes para a produção de combustíveis descrevendo métodos para a extração de uma forma de óleo de sementes de tabaco que usa solventes, indicando, entretanto, que o óleo extraído do tabaco não pode ser usado tal como um 30 biodiesel devido ao alto teor de iodo nele.

Usta N. (Use of tobacco seed oil methyl ester in a turbocharged indirect injection diesel engine. Biomass and Bio-energy, 2005, 28:77-86) declara que o óleo das sementes de tabaco é um subproduto da produção mundial de folhas, avalia a produção mundial de semente que deriva do cul- tivo de folhas de tabaco e descreve a extração de óleo da semente através do uso de solventes.

5 Finalmente, Patel et al. (Production potential and quality aspects

of tobacco seed oil. Tobacco Research, 1998, 24:44-49) avaliam a produção de semente de tabaco como um subproduto de folhas na índia igual a 1,171 kg/ha com um conteúdo de óleo de 38% por peso e descrevem sua extração com o uso de solventes.

Os processos tecnológicos para a extração de óleo compreen-

dem técnicas mecânicas (pressão) e químicas (solventes). Na prática, os dois sistemas estão geralmente combinados. Em geral, a extração mecânica é realizada sobre as sementes que contêm mais do que 20% de material oleoso (por exemplo, colza e girassol), em que as dimensões das sementes 15 são favoráveis a técnica de prensagem. A semente do tabaco, por exemplo, devido as suas dimensões muito reduzidas, é submetida à extração de óleo por tratamentos químicos.

Geralmente, a possibilidade de extrair óleo mecanicamente faci- lita a extração direta nos locais de produção de semente, portanto também a nível rural, com pequenas fábricas.

Para quantidades menores de material oleoso é usada a extra- ção química e que pode ser aplicada também a torta de óleo, remanescente da extração mecânica, a fim de recuperar os 6-12% de óleo residual deixado após o tratamento mecânico. Os óleos extraídos pelo uso de solventes (por 25 exemplo, hexano) antes da comercialização para usos alimentícios, reque- rem uma etapa de refino. O produto principal do processo de extração é o óleo bruto; a extração mecânica produz ainda a torta de óleo protéica en- quanto que a extração química produz farinha. A última, usada na alimenta- ção de animais, influencia de modo crítico a economia de produção e pro- 30 cessamento de sementes oleaginosas.

Em certos casos a produção está ligada a requisição de farinha de proteína (por exemplo, soja). O óleo bruto pode ser subsequentemente retificado com uma série de tratamentos físico-químicos (por exemplo, ajuste de pH, filtração, degomação, descoloração, etc.) dependendo do uso pre- tendido.

O equilíbrio da massa do processo completo varia de espécie para espécie, por exemplo, considerando um conteúdo em óleo de 42% para as sementes de girassol, para uma tonelada de sementes (que são o produ- to principal) são consideradas 2,6 ton. de subproduto, com uma produção de 420 kg de óleo bruto, 580 kg de torta de óleo, obtendo uma produção final de 390 kg de óleo refinado e 30 kg de resíduos processados. Levando em con- sideração que o rendimento médio de sementes de girassol é de cerca de 2,6 t/ha (+/-15%), pode ser calculado que o rendimento/hectare de óleo é igual à cerca de uma tonelada. Essa relação é válida também para outras espécies, em particular para a colza, dependendo do percentual de óleo. Óleos vegetais podem ser usados diretamente como óleos combustíveis pa- ra a produção de calor (fornos ou ebulidores) ou para a produção de energia mecânica (motores), utilizando seus valores caloríficos brutos que são de cerca de 8.500 kcal/kg ou, após a transesterificação, transformados como biodiesel.

O uso de óleos vegetais em ebulidores pode ser realizado com aquecedores convencionais com a substituição do óleo diesel industrial ou para aquecimento por óleo vegetal. Esse tipo de solução parece muito inte- ressante devido ao fato de que: (i) o preço do combustível fóssil substituído é geralmente muito semelhante àquele do óleo diesel automotivo e está su- jeito a impostos elevados; (ii) o uso de óleo em ebulidores requer a organi- zação de uma rede agroenergética muito simples que pode terminar direta- mente no ambiente rural, onde os produtores de combustível e os usuários de combustível podem estar localizados muito próximos uns dos outros ou podem até coincidir. A maior ou menor facilidade do processo de extração de óleo é outro aspecto importante a ser levado em consideração quando é considerado o uso local do biocombustível. A economia de produção e o ba- lanço energético mais ou menos favorável dependerão principalmente da produção por hectare de óleo combustível. O uso de óleos vegetais em motores a diesel requer, por outro lado, um processo químico de transesterificação com metanol e uma certa composição de ácido graxo, que pode ser resumida em uma valor de iodo que tem que ser igual ou inferior a 120. Óleos vegetais também são geral- 5 mente usados para objetivos alimentícios. Dependendo da planta, as produ- ções podem ser dirigidas, principalmente, para objetivos alimentícios ou e- nergéticos ou para ambos.

A Iuz dos problemas mencionados acima, pode ser altamente desejável reciclar a indústria do tabaco para objetivos ecológicos e não pre- judiciais para os seres humanos.

A identificação de um uso alternativo e economicamente válido do tabaco constitui, portanto, um tópico mundial claro economicamente inte- ressante.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO A presente invenção descreve a produção de plantas de tabaco

adequadas para uma produção muito alta de um componente particular da planta: a semente. As ditas plantas foram produzidas através de técnicas de mutagênese somática in vitro, química ou física e/ou através de cruzamentos interespecíficos e duplicação cromossômica subsequente. As ditas plantas 20 são opcionalmente modificadas por técnicas de manipulação genética. A seleção da planta de tabaco, atualmente, sempre foi dirigida para a folha como produto final, o foco da atenção e, portanto, a seleção de plantas para a maximização da produção das sementes nunca tinha sido sugerida antes e permite o uso do tabaco a fim de maximizar a produção da semente em de- 25 trimento da produção da folha.

Foi descoberto, surpreendentemente, que a seleção de plantas de tabaco, realizada usando técnicas não biológicas de mutagênese quími- ca, física e somática in vitro, de cruzamento também entre espécies diferen- tes, seguidas pela indução de anfidiplóides e, opcionalmente por técnicas de 30 DNA recombinante, tem permitido obter plantas de tabaco que apresentam as seguintes características:

- elas apresentam as características ideais para a transformação da planta agricultável de tabaco a partir de uma planta para produção de folha em uma planta para produção de semente;

- elas têm a capacidade de produzir sementes até valores entre 2000 kg (20 quintais)/hectare , a 5000 kg (50 quintais)/hectare ou até 7000

kg (70 quintais)/hectare ou mesmo 9000 kg (90 quintais)/hectare com a pos- sibilidade de melhorias adicionais no rendimento de semente/hectare;

- elas apresentam um conteúdo de óleo na semente de até 38% do peso da semente ou até 40% ou até 48%, ou até 52% ou até 58% ou mesmo até 60%;

- elas têm baixa necessidade de insumos agronômicos para de-

fesa contra parasitas e vermes.

Além disso, completamente inesperado, devido às pequenas dimensões da semente de tabaco que tem, entre as plantas cultiváveis, uma das menores sementes, a presente invenção mostra que é possível extrair 15 óleo da semente pela prensagem, alcançando-se rendimentos de extração que são cerca de 80% do óleo total presente na semente, cerca de 90% do óleo total presente na semente ou até cerca de 95% do óleo total presente na semente, garantindo assim a possibilidade de realização da extração também em pequenas fábricas para uso em fazendas.

Portanto, o objetivo da invenção são plantas de tabaco que são

mutagenisadas e/ou obtidas pelo cruzamento interespecífico seguido pela diploidização e seleção caracterizadas em que elas produzem uma quanti- dade de semente igual à pelo menos 2000 kg (20 quintais)/hectare, as ditas plantas opcionalmente modificadas posteriormente por manipulação genéti- 25 ca, o uso das ditas plantas para a produção de sementes, para a produção de óleo e seus derivados, o uso das ditas plantas para a produção de bio- massa para a conversão bioquímica ou termoquímica, o método de produ- ção e seleção das ditas plantas, as sementes das ditas plantas e seu uso para a produção de óleo e seus derivados, o óleo derivado das ditas semen- 30 tes, o biodiesel obtido a partir das ditas sementes, um suplemento alimentar derivado de tabaco, combustíveis sólidos compreendendo a torta de óleo resultante da prensagem das sementes de tabaco, o método para a extração de óleo de sementes de tabaco por prensagem.

DESCRIÇÃO DETALHADA DAS FIGURAS

Figura 1. Características gerais da planta de tabaco produzida através de mutagênese química, cruzamento intra e interespecífico, poliploi- dização, seleção, indução de variabilidade somaclonal, transformação gené- tica, direcionadas para maximizar a produção de semente por unidade de superfície, com um grande conteúdo de óleo e que tem características ade- quadas para uso como fonte energética, para usos industriais e para nutri- ção humana e animal. Principais características induzidas e selecionadas: profundidade e amplitude do aparato radical; folhas Ianceoladas finas e ere- tas; caule robusto na base com internodos distantes; inflorescência seme- lhante à espiga compacta, ampla ou em colunas;pedículo curto, cápsulas não abertas, di ou multiválvulas, ápice reto, com pelo menos 5000 semen- tes/cápsula; sementes ovais ou elípticas com um comprimento > do que 1 mm; altura da planta entre 50 e 120 cm, resistência a insetos, resistência a herbicidas, resistência a fungos, resistência a seca, proporção variável entre os componentes de ácidos graxos.

Figura 2. Exemplo do produto de óleo e torta de óleo obtidos da semente de tabaco pela prensagem com uma prensa helicoidal modelo Ko- met (IBG). Após a prensagem, o óleo foi filtrado em papel e apresenta ele- vadas características de limpidez.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

A presente invenção, portanto, descreve a produção de plantas do gênero Nicotiana, como plantas ideais para a produção de sementes a partir das quais é obtido o óleo combustível, biodiesel, proteínas, óleo para uso zootécnico, para uso industrial, para uso alimentício humano.

As variedades do gênero Nicotiana que podem ser usadas como plantas parentais para a produção das plantas da invenção podem estar, por exemplo, compreendidas entre as seguintes espécies: N. tabacum, N. rusti- 30 ca, N. glauca, N. paniculata, N. knightiana, N. solanifolia, N. benavidesii, N. cordifolia, N. raimondii, N. thyrsiflora, N. tomentosa, N. tomentosiformis, N. otophora, N. setchellii, N. glutinosa, N. ondulata, N. arentsii, N. wigandioides, N. trigonophylla, N. palmeri, N. sylvestris, N. langsdorffii, N. alata, N. forgeti- ana, N. bonariensis, N. longiflora, N. plumbaginifolia, N. repanda, N. stockto- nii, N. nesophila, N. moctiflora, N. tomentosiformis, N. otophora, N. setchellii, N. glutinosa, N. petunioides, N. acaulis, N. ameghinoi, N. acuminata, N. pau- 5 ciflora, N. attenuata, N. miersii, N. corymbosa, N. linearis, N. spegazinii, N. bigelovii, N. clevelandii, N. nudicaulis, N. maritima, N. velutina, N. gossei, N. excelsior, N. megalosiphon, N. exigua, N. goodspeedii, N. ingulba, N. steno- carpa, N. occidentalis, N. rotundifolia, N. debneyi, N. benthamiana, N. fra- grans, N. suaveolens, N. obtusifolia.

De acordo com a presente invenção, a planta será obtida por

meio de técnicas de mutagênese que possibilitarão o desenvolvimento de plantas capazes de produzir uma quantidade de sementes maior do que a média com relação aos indivíduos iniciais. A mutagênese pode ser induzida por técnicas padronizadas de tratamento químico e/ou físico de sementes de 15 tabaco ou também pela cultura in vitro para a indução de mutantes somaclo- nais. A maior produção de semente pode ser obtida também pela geração de plantas híbridas, produzidas pelo cruzamento interespecífico seguido pela diploidização do conjunto cromossômico (a fim de impedir os eventos de es- terilidade exibidos por híbridos interespecíficos) por tratamento químico com 20 colchicina. As plantas produzidas por cruzamento interespecífico podem ser adicionalmente mutagenizadas por técnicas químicas e/ou físicas padroni- zadas.

Uma vez que os mutantes são obtidos, eles serão selecionados quanto ao caráter de produção de semente, de forma a isolar e selecionar plantas que produzam pelo menos 2000 kg (20 quintais) de semente por hectare de cultura.

De acordo com a presente invenção, a planta será produzida partindo de sementes produzidas por:

1. cruzamento entre indivíduos da mesma espécie ou 2. cruzamento entre indivíduos de espécies diferentes que têm o

mesmo número de cromossomos (por exemplo, N. tabacum x N. clevelandii) tal que ou em que o dito cruzamento é seguido por métodos de cultura de embriões e indução de poliplóides pelo tratamento com o mutagênico colchi- cina, usando técnicas bem conhecidas por aquele versado na técnica, a fim de obter anfidiplóides ou

3. cruzamento entre indivíduos de espécies diferentes que têm 5 um número diferente de cromossomos (por exemplo, N. tabacum x N. trigo- nophylla) tal que ou em que o dito cruzamento é seguido por métodos de cultura de embriões e indução de poliplóides pelo tratamento com o mutagê- nico colchicina, usando técnicas bem conhecidas por aquele versado na téc- nica, a fim de obter anfidiplóides 10 Como indicado acima, quando não há indução de diploidização,

como nos casos 1 e 2, as sementes serão mutagenizadas por técnicas físi- cas e/ou químicas, quando a mutação do número de cromossomos é induzi- da por diploidização, como nos casos 2 e 3, a seleção poderá ser realizada nas ditas sementes mutadas assim produzidas ou nas ditas sementes muta- 15 genizadas por técnicas físicas e/ou químicas. As técnicas de mutação co- nhecidas pela pessoa versada na técnica podem ser usadas, tais como, por exemplo, o tratamento da semente com Sulfonato de Etil Metano (EMS) (por exemplo, em solução aquosa em uma concentração de 0,5%) e deixando o EMS em contato com a semente por períodos variáveis, por exemplo, como 20 indicado no exemplo 1 ou, como já dito, com colchicina de maneira a induzir a poliploidização, por radiações X ou Gama realizadas em ambientes ade- quados e pela realização de seleções em grande escala. As sementes assim tratadas serão deixadas germinar e as plantas da geração M2 serão selecio- nadas com base nas seguintes características: forma da inflorescência, nú- 25 mero de cápsulas, número de sementes por cápsula, dimensões da semen- te, formato da folha, dimensões do aparelho da raiz, orientação da folha, etc.

De acordo com a presente invenção, as plantas que têm as se- guintes características serão selecionadas: altura da planta de 80 a 120 cm, folhas com lâmina fina e orientação reta, inflorescência compacta, flores em 30 número superior a 100, cápsulas em número superior a 100, número de se- mentes por cápsula maior do que 5000, caule Iignificado e robusto e raízes profundas. A quantidade de sementes produzidas pelas plantas seleciona- das será então verificada em campo aberto e apenas as plantas que produ- zem pelo menos 2000 quilos (20 quintais) de semente/hectare em uma den- sidade de semeadura de cerca de 125.000 a 250.000 plantas/hectare serão 5 selecionadas.

Por mutagênese química e física e por mutagênese somática, são obtidos mutantes de diferentes classes, aumentando portanto a probabi- lidade de encontrar as variantes desejadas. Como um exemplo, um mutante com folha Ianceolada com orientação ereta permite o aumento da densidade 10 de semeadura sem comprometer a recepção de Iuz que é importante para a atividade fotossintética e, portanto, para aumentar a produção de semente por ha. Por exemplo, um mutante que tem um aparelho radicular profundo permite uma melhor ancoragem e nutrição da planta. Como um exemplo, um mutante com inflorescência compacta e um grande número de cápsulas 15 permite aumentar a quantidade de semente produzida por cada planta isola- da.

A presente invenção abrange as plantas assim obtidas e sele- cionadas, que produzem uma quantidade de semente maior ou igual a 2000 kg (20 quintais)/hectare. As plantas da presente invenção são modificadas a 20 fim de produzir uma quantidade de semente de até 9000 kg (90 quintais) por hectare cultivado, portanto, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000,8000,9000 quilos por hectare cultivado contra as 10.000 a 12.000 normalmente produ- zidas pelas plantas de tabaco selecionadas para a produção de folha.

As plantas da invenção podem ser obtidas também pela indução 25 de variantes somatoclonais, em que as sementes acima indicadas podem ser tratadas com hipoclorito de sódio e então com etanol 70%, das plantas germinadas a partir das ditas sementes são retiradas partes da folha e a formação de calos é induzida e reproduzida por períodos variáveis in vitro a partir das ditas partes. A partir dos ditos calos, plantas que têm característi- 30 cas variáveis, tais como: forma da inflorescência, número de cápsulas, nú- mero de sementes por cápsula, dimensões da semente, formato da folha, dimensões do aparelho da raiz, orientação da folha, produção de semente, conteúdo de óleo da semente, composição de ácido graxo do óleo, conteúdo de proteína da semente, etc, se regeneram, a dita planta sendo selecionável com base nos parâmetros acima mencionados.

As plantas da invenção podem ser selecionadas ainda pela pre- sença de características tais como: percentual de conteúdo de óleo da se- mente. composição de ácido graxo do óleo, conteúdo de proteína da semen- te, etc.

As plantas acima descritas podem ainda ser modificadas por técnicas de DNA recombinante a fim de se obter características vantajosas, no caso das ditas características ainda não estarem presentes nos mutantes selecionados, tais como: aumento no percentual do conteúdo de óleo da semente, composição variável de ácido graxo dependendo dos usos deseja- dos para o óleo, resistência a insetos, resistência a herbicidas, resistência a fungos, etc.

Para a transformação genética das plantas da invenção, podem ser usados vetores adequados para transformação de células de planta as- sim como cassetes de expressão que permitem a expressão na planta de genes de interesse. Dependendo se os genes serão expressos na parte ver- de da planta (isto é, genes para resistência a parasitas ou herbicidas) ou nas sementes (por exemplo, genes envolvidos no metabolismo de ácidos gra- xos), vetores conhecidos na técnica, que asseguram a expressão dos ditos genes nos órgãos de interesse, podem ser selecionados. Portanto, os veto- res com promotores constitutivos conhecidos atualmente ou com promotores induzíveis, por exemplo, pelo ataque de parasitas ou na formação da cápsu- la, podem ser usados. Em particular, como as plantas da invenção são sele- cionadas para a lata produção de semente e, sendo o produto da dita se- mente de interesse particular, vetores que compreendem cassetes de ex- pressão específicos que garantirão a expressão dos genes heterólogos inse- ridos nas sementes da planta da invenção serão particularmente adequados.

Para a transformação genética, os sistemas com Agrobacterium tumefasciens ou de transferência física de DNA podem ser usados.

Em uma modalidade da invenção, será particularmente vantajo- sos produzir plantas que apresentem não apenas uma alta produtividade de semente, mas também resistência a insetos, resistência a herbicidas, resis- tência a fungos, resistência a seca; isso permitirá reduzir significativamente os insumos agrícolas, aumentando assim a produtividade da cultura e a re- 5 dução do impacto ambiental.

Nesse caso, vetores que compreendem o gene de resistência a canamicina como um marcador, regulando regiões que permitem a expres- são constitutiva (por exemplo, promotor 35S ou ubiquitina) dos genes de in- teresse, tais como o gene cry de Bacillus thuringiensis, o gene aroA de Sal- 10 monella typhimurium, o gene Rptl de N. obtusifolia, podem ser usados, tais genes permitem, na mesma ordem, a produção de plantas que resistem res- pectivamente a: insetos, herbicidas, doenças fúngicas e podem ser introdu- zidos de acordo com técnicas de transferência de gene conhecidas pela pessoa versada na técnica.

As resistências podem ser introduzidas acompanhando um ou

mais eventos de transformação com vários vetores ou, alternativamente, devido ao fato de que plantas são muito facilmente cruzadas, as resistências podem ser introduzidas singularmente em indivíduos diferentes da mesma variedade selecionada e subsequentemente agrupadas no mesmo indivíduo por cruzamento.

Nesse caso, será fácil obter homozigose para todas as caracte- rísticas pela duplicação de haplóide obtidos de culturas de anteras in vitro.

A transformação genética pode ser realizada de forma análoga para os propósitos de manipulação metabólica objetivados para o aumento 25 da quantidade de óleo acumulado nas sementes e para a modificação da via metabólica de ácidos graxos. Nesse caso, é possível usar regiões regulado- ras com atividade específica para a semente tal como o promotor de globuli- nas, e direcionar as proteínas enzimáticas para o retículo endoplasmático onde elas podem ser estabilizadas inserindo um sinal específico, tal como 30 KDEL, ou de onde podem ser translocadas para plastídeos, inserindo sinais específicos para aminoácidos, por exemplo a seqüência líder da pequena subunidade RuBisCO. Por exemplo, a quantidade de óleo e a composição de ácidos graxos do mesmo podem ser modificados pela modificação da expressão de genes que codificam enzimas tais como, meramente como meio de exemplo, acetil-CoA carboxilase (ACCase), diacil-glicerol aciltransferase (DGAT), Iiso- 5 fosfatidase acil transferase (LPAT), proteína transportadora de acila (ACP) fosfatidase fosfo-hidrolase (PAPase), malonil-CoA:ACP transacilase, cetoa- cil-ACP sintase (KAS), cetoacil-ACP redutase, 3-hidroxiacil-ACP desidrase, enoil-ACP redutase, estearoil-ACP desaturase, acil-ACP tioesterase, glice- rol-3-fosfatoaciltransferase, 1-acil-sn-glicerol-3-fosfato aciltransferase, citidi- 10 na-5-difosfato-diacilglicerol sintase, fosfatidil glicerofosfato sintase, fosfatidil glicerol-3-fosfato fosfatase, FAD1-8 desaturase, fosfatase do ácido fosfatidi- co, monogalactosil diacil glicerol sintase, digalactosil diacil glicerol sintase, proteína de biossíntese de sulfolipídeo, acil-coA sintase de cadeia longa, glicerol-3-fosfato aciltransferase (GPAT), diacilglicerol colinafosfo transfera- 15 se, fosfatidilinositol sintase, acil-CoA diacilglicerol aciltransferase, acil-ACP desaturase, Iineoil desaturase, esfingolipideo desaturase, oleato 12- desaturase, acetilenase de ácido graxo, epoxigenase de ácido graxo, diacil- glicerol quinase, colinafosfato citidil transferase, colina quinase, fosfolipase, fosfatidilserina decarboxilase, fosfatidilinositol quinase, cetoacil-CoA sintase, 20 fator de transcrição de CER, oleosina, 3-cetoacil-CoA tiolase, acil-CoA desi- drogenase, enoil-CoA hidratase, acil-CoA oxidase.

De acordo com a invenção, um aumento no conteúdo total de óleo da semente pode ser obtido pela determinação de uma superexpressão da Acetil CoA carboxilase do tabaco ou a mesma enzima de outras espécies 25 (por exemplo, colza). Como exemplo, uma variação no perfil de ácido graxo e, portanto, na quantidade de iodo, pode ser obtida pelo silenciamento atra- vés da expressão de construtos antisenso, do gene que codifica a oleato desaturase do plastídeo e do retículo endoplasmático. A expressão ou o si- lenciamento de um ou mais dos ditos genes nas sementes das plantas da 30 invenção, resulta no fato de que o óleo produzido pelas ditas sementes pode ser usado diretamente para a produção de biodiesel, já que ele tem uma quantidade de iodo inferior ou igual a 120. A expressão dos ditos genes também pode afetar o percentual de óleo na semente e as plantas da invenção podem ser selecionadas ainda pelo conteúdo de óleo da semente que pode ser igual à cerca de 38% do peso da semente, a 40%, a 48%, a %2%, a 58% e até a 60%.

5 Os genes acima mencionados podem ser introduzidos em veto-

res para expressão específica na semente, tal como aqueles descritos no pedido de patente W003073839, seguindo os ensinamentos descritos no dito pedido. O vetor de expressão usado para a dita modalidade, portanto, será um vetor que compreende: a. um promotor de um gene de planta espe- 10 cífico para a expressão nos órgãos de armazenamento de semente; b. uma seqüência de DNA que codifique a seqüência de sinal de uma proteína de planta capaz de dirigir o produto do gene de interesse para os órgãos de armazenamento de semente através do retículo endoplasmático; c. uma se- qüência de DNA que codifique o dito gene de interesse privado da seqüência 15 de sinal nativa; d. um sinal de parada. Os promotores e as seqüências líde- res podem pertencer, por exemplo, ao gene 7S de globulina de soja ou ao gene beta-conglicina de soja ou a genes que codifiquem proteínas de arma- zenamento na semente de tabaco.

Os genes mencionados acima podem ser introduzidos seguindo 20 um ou mais eventos de transformação ou pela transformação com vários vetores, ou, alternativamente, como as plantas são muito facilmente cruza- das, os ditos genes podem ser introduzidos singularmente em indivíduos diferentes da mesma variedade selecionada e subsequentemente agrupados no mesmo indivíduo através de cruzamento.

Nesse caso, será fácil obter homozigose para todas as caracte-

rísticas pela duplicação de haplóides obtidos de culturas de anteras in vitro.

Tabela 1. Conteúdo de ácidos graxos de algumas variedades de tabaco selecionadas apenas após a mutagênese ou manipuladas e selecio- nadas a fim de alterar a via metabólica de ácidos graxos e selecionadas 30 quanto à estabilidade do caráter. A tabela aponta o resultado obtido com mutagênese e a intervenção genética realizada pela introdução de alguns dos genes listados a fim de alterar a composição de ácido; o óleo das três ultimas colunas tem um título de iodo adequado para a transformação do dito óleo em biodiesel.

Componente PLT 103 PLT 256 PLT 318 PLT 335 Ácido Palmitico 6,31% 8,26% 7,15% 17,20% Ácido Palmitoleico 0,11% 0,18% 0,18% 1,25% Ácido Esteárico 2,58% 5,20% 8,50% 12,50% Ácido Oleico 12,62% 22,58% 25,56% 53,27% Ácido Linoleico 77,48 58,78% 52,00% 6,45% Ácido Linolenico 0,65% 4,15% 5,25% 7,80% Ácido Araquídico 0,13% 0,85% 0,80% 0,85% Ácido Eicosanóico 0,13% 0,58% 0,56% 0,68% Também são objetivos da invenção as sementes das plantas

como descritas acima que, sendo sementes de plantas mutantes, serão também mutantes e assim conterão as modificações de DNA que as torna- rão de forma diferente das sementes de tipo selvagem. Além disso, como indicado acima, as ditas sementes podem ter um numero cromossômico di- ferente comparadas com as plantas parentais (por exemplo, poliploidias) e 10 na maioria dos casos serão também transformadas com os vetores acima mencionados.

Quando a transformação é feita com vetores que expressam ge- nes relacionados com o metabolismo dos ácidos graxos listados acima, a dita semente também será caracterizada em que ela conterá um óleo que tem um titilo de iodo inferior ou igual a 120 e um percentual de óleo compre- endido entre 38% e 60% do peso total das sementes.

Também é um objetivo da presente invenção o método para a produção da planta da invenção compreendendo as seguintes etapas:

a) semente produzida pelos cruzamentos iniciais entre indiví- duos da mesma espécie pertencentes ao tipo selvagem ou variedades sele- cionadas são submetidas à mutagênese;

b) as dita sementes são deixadas germinar e as plantas das ge- rações M2-M4 são selecionadas de acordo com os seguintes parâmetros: i) presença de características que se manifestam a nível fenotí- pico selecionadas do grupo que compreende a altura da planta de 80 a 120 cm, folhas com lâmina fina e orientação direta, inflorescência compacta, flo- res em número superior a 100, número de cápsulas superior a 100, número

de sementes por cápsula maior do que 5000, caule Iignificado e robusto , raízes profundas;

ii) estabilidade do caráter selecionado nas gerações após a ge- ração M2;

iii) testar a hereditariedade do caráter selecionado;

c) permitir a germinação das sementes selecionadas na etapa b)

e regenerar as plantas iniciando a partir do calo do mesófilo foliar induzido in vitro na presença de fitormônios e selecionar as plantas que mantenham as características selecionadas na etapa b) nas gerações R0-R2;

d) as plantas selecionadas na etapa c) são semeadas em campo aberto e as plantas que produzem pelo menos 2000 kg (20 quintais) de se- mentes por hectare são selecionadas.

No método descrito, as plantas obtidas na etapa a) também po- dem ser obtidas por

a1) realização de cruzamentos interespecíficos no gênero Nieoti- ana, seguido pelo retrocruzamento de F1 ou pela indução de anfidiplóides pelo tratamento do ápice vegetativo com colchicina.

As plantas obtidas com os métodos descritos acima podem ser submetidas a etapas adicionais e) e/ou f) e por uma passagem g) como indi- cado abaixo:

e) transformação genética das plantas obtidas na etapa a-d ou

a'-d com vetores que compreendem cassetes de expressão que expressam em plantas genes de resistência a insetos, herbicidas e/ou doenças fúngicas selecionados no grupo que consiste em gene cry de Bacillus thuringiensis, o gene aroA de Salmonella typhimurium, o gene Rptl de N. obtusifolia e sele- 30 cionar as plantas assim transformadas nas gerações T0-T4 para resistência a insetos, herbicidas e/ou doenças fúngicas;

f) transformação genética das plantas obtidas na etapa a-d ou na etapa a'-d com um ou mais vetores que compreendem cassetes de expres- são que expressam em sementes genes do metabolismo de ácidos graxos selecionados do grupo que consiste em acetil-CoA carboxilase (ACCase), diacil-glicerol aciltransferase (DGAT), Iisofosfatidase acil transferase (LPAT)1 5 proteína transportadora de acila (ACP) fosfatidase fosfo-hidrolase (PAPase), malonil-CoA:ACP transacilase, cetoacil-ACP sintase (KAS), cetoacil-ACP redutase, 3-hidroxiacil-ACP desidrase, enoil-ACP redutase, estearoil-ACP desaturase, acil-ACP tioesterase, glicerol-3-fosfatoaciltransferase, 1-acil-sn- glicerol-3-fosfato aciltransferase, citidina-5-difosfato-diacilglicerol sintase, 10 fosfatidil glicerofosfato sintase, fosfatidil glicerol-3-fosfato fosfatase, FAD1-8 desaturase, fosfatase do ácido fosfatidico, monogalactosil diacil glicerol sin- tase, digalactosil diacil glicerol sintase, proteína de biossíntese de sulfolipi- deo, acil-coA sintase de cadeia longa, glicerol-3-fosfato aciltransferase (GPAT), diacilglicerol colinafosfo transferase, fosfatidilinositol sintase, acil- 15 CoA diacilglicerol aciltransferase, acil-ACP desaturase, Iineoil desaturase, esfingolipideo desaturase, oleato 12-desaturase, acetilenase de ácido graxo, epoxigenase de ácido graxo, diacilglicerol quinase, colinafosfato citidil trans- ferase, colina quinase, fosfolipase, fosfatidilserina decarboxilase, fosfatidili- nositol quinase, cetoacil-CoA sintase, fator de transcrição de CER, oleosina, 20 3-cetoaciI-CoA tiolase, acil-CoA desidrogenase, enoil-CoA hidratase, acil- CoA oxidase, seguido pela seleção das plantas na geração T0-T4 para ca- racterísticas tais como conteúdo de óleo total na semente e composição de ácido graxo do mesmo;

g) cruzamento dos materiais obtidos nas etapas a-f ou a'-f e se- leção das progênies resultantes para características tais como: alta produti- vidade de semente, elevado conteúdo de óleo na semente, composição va- riável de ácido graxo no óleo dependendo do uso pretendido, resistência a insetos, resistência a herbicidas e resistência a fungos.

As plantas nas etapas compreendidas entre b e f podem, por exemplo, ser selecionadas pela presença de características que podem ser apontadas por análise química tal como o conteúdo total de óleo na semente e/ou o conteúdo de componentes ácidos únicos na semente e/ou o conteúdo de proteína da semente.

Um objetivo adicional da invenção é um método para extrair óleo das sementes de tabaco, em que o rendimento do óleo é igual a valores de 70 a 95% do óleo contido nas ditas sementes, compreendendo as seguintes etapas:

a) extrair mecanicamente o dito óleo pela prensagem produzindo o óleo e uma torta de óleo residual;

b) filtrar o dito óleo produzido na etapa a) com filtros de papel ou

de tecido.

O método acima indicado tem, surpreendentemente, um rendi-

mento maior do que 70%, o que é um rendimento totalmente inesperado a- pós o uso dos ditos métodos de prensagem sobre sementes tão pequenas quanto às sementes de tabaco. Na presente invenção, em que plantas que têm uma alta produção de semente são selecionadas com o objetivo de au- 15 mentar a produção de óleo de tabaco por planta, a descoberta de que o mé- todo de prensagem aplicado sobre as sementes de tabaco tem um rendi- mento comparável ao rendimento obtenível com sementes de maior tama- nho, tem aplicações extremamente vantajosas.

Além dos menores custos de produção e dos rendimentos total- mente inesperados dado o avanço tecnológico, o dito método possibilita ex- trair o óleo de tabaco diretamente em locais onde ele pode ser usado com propósitos energéticos.

Em uma modalidade, a semente da invenção pode ser submeti- da à prensagem a frio usando uma prensa helicoidal ou outro tipo de prensa, 25 carregada com as sementes. A prensa pode atingir temperaturas até cerca de 60° quando ela é constantemente operada e o óleo prensado a parir da semente é coletado e filtrado sobre filtros de papel ou filtro-prensa de tecido. Outros sistemas de prensagem adequados para as sementes podem ser usados para prensar sementes de tabaco.

A fim de melhorar o rendimento do método da invenção, onde a

produtividade de óleo da semente é para ser explorada ao máximo, é possí- vel realizar uma etapa adicional de c)extrair quimicamente com solventes o óleo residual presente na torta de óleo obtida na etapa a).

Tabela 2. Características do óleo de tabaco obtido pela prensa- gem da semente e filtração. A tabela aponta o grande valor calorífico bruto, o baixo conteúdo de enxofre, a baixa viscosidade quando comparado com ou- tros óleos vegetais. ___

Determinação Resultado Mis. Un. Métodos Ponto de combustão 236,0 0C UNI EN ISO 27 19 2005 Enxofre <0,01 %m/m ISO 8754 1992 Cinzas 0,005 %m/m EN ISO 6245 2002 Viscosidade a 50°C 21,630 mm2/s UNI EN ISO 3104 200 Ponto de fusão -18 0C ISO 3016 1994 Valor calorífico 9,670 Kcal/Kg ASTM D240-97 Massa vo Iu métrica a 925,0 Kg/m3 UNI EN ISO 3675 2002 15°C Valor de saponifica- 193,6 mg KO H/g ASTM D94-02 ção Também é um objetivo da presente invenção o uso das plantas

da invenção e/ou de suas sementes na produção de combustíveis líquidos ou sólidos, biodiesel, lubrificantes industriais, materiais plásticos tais como linóleo, suplementos alimentares para rações animais, suplementos alimen- tares para uso humano.

As plantas da invenção, de fato, mostram características que são extremamente vantajosas na produção dos ditos produtos como:

- elas produzem um óleo obtido pela prensagem que ó ideal, 15 mesmo sem refinamento já que uma simples filtragem é suficiente, para ser usado como óleo combustível já que ele tem um aspecto límpido, uma vis- cosidade cinemática a 40°C de 29,11 mm2/s e a 50°C de 21,63 mm2/s e um conteúdo de enxofre menor do que 0,01%, entrando numa classe com ca- racterísticas físicas e termodinâmicas muito boas;

- elas produzem um óleo,obtido pela prensagem da semente que, mesmo na modalidade mais simples da invenção, sem a transformação para a expressão de genes do metabolismo de ácidos graxos indicados aci- ma, pode ser usado para a produção de biodiesel uma vez misturado, por exemplo, com 25% de óleo de palma ou com outros percentuais de óleo ve- 5 getal que tenha um título de iodo menor, a fim de diminuir o valor do iodo abaixo do valor de 120 e que, na modalidade que compreende a expressão de um ou mais dos ditos genes com o objetivo de alterar o metabolismo dos ácidos graxos, pode ser usado diretamente para transformá-lo em biodiesel, que tem uma quantidade de iodo igual a 120, ou melhor, igual a 100, ou me- 10 Ihor ainda, igual a 80;

- elas produzem uma torta de óleo resultante da prensagem da semente, que tem um conteúdo de óleo de forma variável entre 6 a 12% e um conteúdo de proteína de cerca de 35%, que é ideal para suplementar dieteticamente rações de animais dado ao seu alto conteúdo de ácidos gra-

xos ômega 6 (ácido linoleico);

- elas produzem uma torta de óleo resultante da prensagem da semente que, como uma alternativa ao seu uso como ração animal, pode ser usado como combustível sólido em fábricas que trabalham com carvão ou pélete de biomassa devido ao seu valor calorífico maior do que 4950 kcal/kg;

- elas produzem um óleo com um ponto de ignição de 236°C e

um ponto de fusão de -18°C sendo assim adequado para uso como um lubri- ficante não poluente, por exemplo, para correntes de motosserra, ou como lubrificantes em geral;

- elas produzem um óleo que, levando em consideração sua composição abundante em ácidos graxos polinsaturados (C18:2, PUFA) que

são essenciais para humanos e são portanto requisitados para propósitos de saúde (ômega 6), podem ser usados como alimento ou suplemento dietético para humanos;

- elas produzem uma biomassa residual (folhas, caules, inflores- cêncías, revestimento de cápsulas) após a coleta da semente, que pode al- cançar valores de 10.000 kg (100 quintais) por hectare ou melhor, 20.000 kg (200 quintais) por hectare ou melhor ainda, 30.000 kg (300 quintais) por hec- tare com a possibilidade de aperfeiçoamento posterior do rendimento por hectare;

- elas produzem uma biomassa residual que pode ser utilizada para usos normalmente atribuídos a ela, tais como, por exemplo, gaseifica- ção, combustão, pirólise, digestão anaeróbica, fermentação ou procedimen- tos de explosão a vapor, contribuindo assim para melhorar o rendimento e- conômico da cultura.

Consequentemente, o objetivo da invenção é o uso das plantas da invenção em geral para a produção em grande escala de sementes de tabaco.

O uso das ditas plantas e/ou sementes para a produção de óleo de tabaco é um objetivo da invenção.

Também é um objetivo da invenção o uso de plantas e/ou se- mentes para a preparação de óleo baseado em tabaco ou combustíveis que consistem essencialmente em óleo de tabaco para ebulidores e motores a diesel.

Em uma modalidade particularmente vantajosa da invenção, o dito óleo de tabaco é obtido pelo método da prensagem da invenção e não por extração com solvente.

O método de extração da invenção, de fato, permite a produção

de um óleo que é diretamente utilizável como combustível devido ao fato de que o dito óleo tem uma viscosidade cinemática de 29,11 mm2/s a 40°C e de 21,63 mm2/s a 50°C, o que permite nebulizá-lo em queimadores sem a necessidade de um tratamento fluidificante preaquecimento.

Um objetivo adicional da invenção é o uso das plantas e/ou das

sementes da invenção para a preparação de biodiesel pela mistura de óleo de semente de tabaco com, por exemplo, 25% de óleo de palma ou com ou- tros percentuais de óleos de planta, reduzindo o título final de iodo. A produ- ção de biodiesel de acordo com a invenção pode ser realizada misturando o 30 óleo de tabaco extraído pelo método acima descrito (prensagem) com óleos de plantas capazes de diminuir seu título de iodo para um valor igual ou me- nor do que 120. Também é um objetivo da invenção o uso de plantas e/ou se- mentes da invenção na preparação de óleo de semente de tabaco que tem um título de iodo igual ou menor do que 120 sem a realização de qualquer procedimento direcionado a reduzir o título de iodo no óleo extraído de acor- 5 do com o método da invenção. Nessa modalidade da invenção, as plantas transgênicas e/ou as sementes transgênicas que expressam um ou mais genes, entre aqueles listados acima, do metabolismo de ácidos graxos de acordo com a invenção, produzindo um óleo de tabaco que tem um título de iodo igual ou menor do que 120, são usadas.

Nesse caso, portanto, nenhum processo de refino ou de trata-

mento do óleo será realizado após a prensagem de acordo com a invenção, a fim de diminuir o título de iodo do óleo assim obtido. O biodiesel de acordo com a invenção pode, portanto, ter uma composição de 100% de óleo de tabaco. O biodiesel será obtido a partir do óleo de tabaco de acordo com os 15 procedimentos normais de transesterificação com metanol conhecidos pela pessoa versada na técnica.

Em uma modalidade da invenção, o biodiesel consistirá total- mente de óleo de tabaco que tem um título de iodo inferior a 120, ou igual ou menor do que 100 ou mesmo igual ou menor do que 80, o dito óleo sendo transesterificado com metanol de acordo com os métodos conhecidos pela pessoa versada na técnica.

Também é um objetivo da invenção o uso de plantas e/ou se- mentes da invenção para a preparação de combustíveis sólidos para fábri- cas que funcionam com carvão ou pellets de biomassa. Nesse caso, a bio- massa resultante da cultura pode ser usada, a dita biomassa tendo um valor calorífico maior do que 4200 kcal/kg.

Também é um objetivo da invenção os combustíveis obteníveis como indicado acima, isto é, combustíveis que compreendem a torta de óleo obtida pela prensagem das sementes de tabaco.

Alternativamente, as plantas e/ou sementes da invenção podem

ser usadas para a preparação de suplementos dietéticos para rações ani- mais. A torta de óleo resultante da prensagem das sementes de tabaco de acordo com a invenção, tem um conteúdo de óleo entre cerca de 6% a cerca de 12% e um conteúdo de proteína de cerca de 35% do peso da torta de óleo e um conteúdo elevado de ácidos graxos ômega 6 (ácido linoleico) que o toma ideal para o dito objetivo. Em experimentos realizados com leitões, a 5 substituição da farinha de proteína de soja pela torta de óleo de tabaco em percentagens variáveis entre 3% a 7% em dietas isoproteicas, não mostrou diferenças significativas no desenvolvimento dos animais.

Em uma modalidade adicional da invenção, as plantas e/ou se- mentes da invenção podem ser usadas para a preparação de lubrificantes 10 não poluentes. Por exemplo, o óleo obtido com o método da invenção, a par- tir de plantas que produzem a semente da invenção que não tem outras mo- dificações além das mutações para o aspecto do caráter básico (isto é, a alta produção de semente) mostra um ponto de ignição de 236°C e um ponto de fusão de -18°C, características que o tornam adequado para o uso como um 15 lubrificante não poluente, por exemplo, para correntes de motosserra ou pa- ra motores em geral.

Em uma modalidade adicional, as plantas e/ou sementes da in- venção podem ser usadas para a preparação de alimentos ou suplementos alimentícios para uso humano.

Nesse caso, o óleo obtido pelo processo da invenção, será refi-

nado posteriormente a fim de eliminar ceras, gomas, carboidratos comple- xos, fosfolipídeos e de-acidificados. Uma vez refinado, ele pode ser usado como tal ou como suplemento alimentício para uso humano. A vantagem do dito uso é dada pela riqueza do dito óleo em ácidos graxos polinsaturados 25 (C18:2, PUFA) que são essenciais para humanos e que são necessários por razões de saúde )ômega 6).

É óbvio que todas as modalidades que tenham por objetivo o uso de óleo de sementes de tabaco, obtido preferivelmente pela prensagem, ou da torta de óleo resultante da prensagem da semente, podem ser realiza- 30 das também em plantas de tabaco não mutagenizadas. A vantagem inques- tionável das plantas da invenção é dada obviamente pelo alta produção de semente e pelo maior rendimento resultante do produto obtenível pelas plan- tas da invenção e por suas sementes comparado com o rendimento obtení- vel com plantas de tipo selvagem e sementes de tabaco plantadas em uma área de cultivo comparável e com métodos de cultivo comparáveis.

O uso de óleo de tabaco para a preparação de lubrificantes, su- 5 plementos dietéticos para humanos ou animais nunca foi descrito na técnica. Obviamente, todas as modalidades nas quais um óleo que tem um título de iodo igual ou menor do que 120 extraído por prensagem e sem ser adicio- nalmente tratado, também nunca foram descritas.

As plantas da invenção também mostram uma biomassa residu- 10 al (folhas, caules, cápsulas e revestimentos de inflorescência) que, após a coleta das sementes, pode alcançar valores entre 10.000 e 30.000 kg ou mais por hectare (100 a 300 quintais), o uso das plantas como uma fonte de biomassa para gaseificação, combustão, pirólise, digestão anaeróbica, fer- mentação ou procedimentos de explosão a vapor, como descrito na técnica 15 a fim de aumentar o rendimento econômico da cultura, é portanto um objeti- vo da invenção.

São também objetivos da invenção: um óleo de semente de ta- baco obtenível a partir de sementes de plantas da invenção com o método de extração da invenção, um biodiesel obtido pela transesterificação do dito 20 óleo, combustíveis compreendendo o dito óleo, suplementos alimentícios para humanos derivados do dito óleo adicionalmente refinado, lubrificantes compreendendo o dito óleo, óleo de semente de tabaco obtenível a partir de sementes das plantas da invenção pelo método de extração da invenção caracterizado em que ele tem um título de iodo igual ou menor do que 120 25 sem a necessidade de misturá-lo com outros óleos para a diminuição do dito título, biodiesel compreendendo o dito óleo que tem um título de iodo igual ou menor do que 120.

EXEMPLOS EXEMPLO 1 Mutaqênese química

A semente da variedade selecionada para a indução de mutan- tes por mutagênese química foi colocada em um frasco de 100 ml na quanti- dade de 20 g por experimento, correspondendo a cerca de 200.000 semen- tes. 50 ml de água deionizada foram adicionados ao frasco e as sementes foram re-hidratadas por 14 horas a 25°C. A água foi então substituída por uma solução aquosa de EMS 0,5%. As sementes foram agitadas com um 5 magneto por um período variável entre 0,5 a 5 horas, dependendo da varie- dade, que em testes preliminares mostrou uma frequência de mutação muito elevada para os caracteres morfológicos tais como altura da planta, dimen- sões da semente, formato da folha, número de cápsulas, produção de se- mente por planta, etc.

Uma vez que o período de tratamento foi finalizado, a solução

mutagênica foi descartada vertendo as sementes em uma peneira fina e en- xaguando-as por vários minutos em água corrente. Subsequentemente, as sementes foram lavadas por 6 vezes em um frasco, pela adição de 50 ml de água e agítando-as por 10 minutos a cada enxágüe.

As sementes foram então secas sobre um filtro de papel e foram

remetidas para uma firma especializada para peletização.

As sementes peletizadas tinham um diâmetro final de 1,2 mm e foram usadas para direcionar a semeadura em campo (M1) com densidade de 100.000 plantas por hectare. A geração Mi foi deixada florescer e foi e- 20 xaminada para a possível presença de mutações dominantes e, uma vez que as sementes amadureceram, uma cápsula por planta foi colhida manu- almente a fim de obter a massa de semente que foi usada para a semeadura em campo aberto no ano seguinte e para o rastreamento fenotípico da gera- ção M2. Cada mutante de interesse foi singularmente colhido e controlado 25 nas gerações seguintes.

EXEMPLO 2

Indução de variantes somaclonais

A semente da variedade selecionada para indução de variantes somaclonais foi esterilizada pela imersão por 5 minutos em uma solução de hipoclorito de sódio 20% seguida por uma imersão por 1 minuto em etanol 70% seguida por 5 lavagens em água estéril. A semente foi deixada germi- nar em recipientes plásticos retangulares com 10 cm de lado e 12 cm de al- tura contendo meio MS agarisado. Das plantas completamente desenvolvi- das, partes de 0,5 cm de lado de folha foram cortadas e colocadas em dis- cos de Petri com meio MS1 (MS + 1 mg/l 2,4-D) a fim de induzir a formação de calo. Indivíduos F1 obtidos de cruzamentos interespecíficos também fo- 5 ram usados. O calo coletado dos discos de folha foi colocado em meio MS1 líquido em frascos de 250 ml contendo 50 ml de meio e agitados a 80 rpm em uma placa rotatória mantida a 28°C com 16 horas de fotoperíodo.

O calo foi mantido em cultura líquida por várias gerações reno- vando a cultura a cada 20 dias e inoculando 50 ml de meio líquido novo com 10 2,5 ml da cultura precedente. A cada geração, uma parte do calo era distri- buída sobre discos de Petri contendo meio MS2 agarisado )MS1 + 1 mg/l NAA + 1,5 mg/l Kinetin) a fim de induzir a formação de brotos que, uma vez alcançados 2 cm de altura, foram transferidos para meio MS3 (MS1 + 1 mg/l IBA) para enraizar e para a transferência subsequente em um vaso para um 15 estufa. As variantes obtidas foras rastreadas nas gerações R1 e R2 e as di- mensões das folhas, o formato das folhas, as dimensões da cápsula, o nú- mero de sementes por cápsula, o conteúdo de óleo das sementes, etc, fo- ram relacionados.

EXEMPLO 3 Cruzamento e duplicação cromossômica

Várias espécies de Nicotiana são sexualmente compatíveis com Nicotiana tabacum e, mesmo que o produto do cruzamento seja estéril, é possível retrocruzar usando as plantas parentais como polinizadoras ou in- duzir a formação de anfidiplóides. Nessa espécie, o trabalho é facilitado pelo 25 fato de que é possível obter populações de híbridos F-ι intergenéricos com vários milhares de indivíduos, permitindo realizar o aperfeiçoamento do pro- grama baseado nos anfidiplóides. Os cruzamentos foram feitos usando am- bas as espécies parentais de Nicotiana spp. que têm o mesmo número de cromossomos (por exemplo, N. paniculata x N. soianifoiia, N. tabacum x 30 N.rústica) ou um número diferente de cromossomos (por exemplo, N.tabacum x N. paniculata, N. tabacum x N. iongiflora). Os indivíduos F1 ob- tidos por alguma combinação de cruzamento foram cultivados em uma estu- fa, a fim de verificar suas características fenotípicas e cruzá-las com ambas as plantas parentais, assim como deixá-los germinar in vitro e micropropa- gar. O material micropropagado foi usado para a realização de experimentos de duplicação cromossômica pelo tratamento com colchicina dos brotos em 5 fase de reprodução ou mais tarde após o transplante para um vaso e antes da florescência. Os brotos das sementes germinadas foram cortados na ba- se e transferidos para meio MS contendo 2 mg/l de benzilaminopurina (BAP). Após 4 a 5 semanas, os brotos laterais foram removidos e mantidos no mesmo meio. A fim de obter plantas completas, a transferência foi reali- 10 zada em meio MS sem hormônios a fim de induzir a formação de raízes. A- pós alguns dias a partir da transferência dos brotos cortados para o meio enraizante, uma gota de solução de colchicina 0,5% foi colocada sobre os mesmos. Uma vez que as plantas enraizaram, elas foram transferidas para vasos em uma estufa e deixadas florescer a fim de verificar sua fertilidade e 15 sua capacidade de formação de sementes viáveis. Em alguns casos, a fim de possibilitar a hibridização entre espécies diferentes, foi necessário dupli- car os haplóides e realizar a hibridização em autotetraplóides.

O material obtido pelo retrocruzamento de gerações ou pela propagação in vitro seguida pela duplicação de cromossomo foi rastreado quanto as suas características fenotípicas e opcionalmente usado para pro- gramas de aperfeiçoamento genético.

O controle do número de cromossomos nas linhagens anfidiplói- des estabilizadas foi realizado usando o ápice da raiz.

EXEMPLO 4

Transformação genética mediada por Aarobacterium tumefasciens

Dia 1: uma pequena quantidade de Agrobaeterium tumefasciens da cepa EHA 105 contendo o plasmídeo de interesse, coletada de uma cul- tura sobre disco de Petri com manuseio estéril, foi inoculada em 2 ml de meio LB estéril. Subsequentemente, uma folha de uma planta saudável não 30 apresentando alterações de forma alguma e mostrando, por outro lado, con- dições ideais de turgidez foi colhida. A folha foi rapidamente enxaguada em água bidestilada a fim de eliminar as impurezas superficiais e mergulhada em uma solução de hipoclorito de sódio 20%, SDS 0,1% por 8 minutos e deixada secar sob condições estéreis. Em particular, a folha foi mergulhada em etanol 95% e agitada a fim de umedecer completamente ambos os lados por cerca de 30 a 40 seg. A folha foi deixada secar completamente.

5 Com um furador esterilizado com etanol, discos de toda a super-

fície da folha foram obtidos e foram colocados sobre placas contendo MS10 sem antibióticos; em detalhe, foram colocados não mais do que 30 discos por placa. Subsequentemente, 2 ml de MB mais Agrobacterium (recém- inoculada) foram vertidos sobre a placa e a suspensão bacteriana foi unifor- 10 memente espalhada com um movimento rotatório leve a fim de obter uma distribuição homogênea de bactéria sobre os discos. O LB em excesso foi cuidadosamente aspirado com uma pipeta. Um controle negativo onde ne- nhum ou pouco LB foi adicionado foi realizado.

As placas foram incubadas por 24-48 horas a 28°C, com ilumi- nação constante e o crescimento bacteriano foi indicado pelo aparecimento de um halo fino opaco difuso sobre toda a placa.

Dia 2: os discos de folha foram cuidadosamente transferidos pa- ra uma placa contendo MS10 + cefotaxima 500 mg/l, e incubados por 6 dias a 28°C, com iluminação constante. Essa etapa determina a inativação da Agrobacterium.

Dia 8: os discos de folha foram cuidadosamente transferidos pa- ra MS10 + cefotaxima 500 mg/l e canamicina 200 mg/l, e incubados por 14 dias a 28°C, com iluminação constante. Essa etapa determina a seleção das plantas transformadas por que o gene de resistência a canamicina é carre- gado pelo plasmídeo inserido na Agrobacterium.

Dia 22: os discos de folha que se desenvolveram nesse meio tempo, portanto formando um calo, foram cuidadosamente transferidos para MS10 + cefotaxima 500 mg/l, canamicina 200 mg/l e carbenicilina 500 mg/l, e incubados por 6 dias Essa etapa determina a eliminação da agrobactéria 30 que possivelmente tenha sobrevivido aos tratamentos com antibióticos pre- cedentes.

Dia 28: os discos de folha foram transferidos mais uma vez para MS10 + cefotaxima 500 mg/l e canamicina 200 mg/l, e incubados até o apa- recimento dos brotos. Uma vez que os brotos apresentaram pelo menos du- as folhas, eles foram separados da massa de calo e transferidos para um meio de enraizamento com MSO + cefotaxima 500 mg/l e canamicina 200 5 mg/l.

Uma vez que as raízes apareceram, as pequenas plantas foram extraídas das placas, liberadas dos resíduos de agar, cuidadosamente en- xaguadas em água corrente e plantadas em pequenos vasos de plástico com terra e areia (2:1). O solo foi previamente saturado com água, subse- 10 quentemente os vasos foram cobertos com tampas de plástico transparente a fim de manter condições de alta umidade e foram colocados em uma câ- mara de crescimento a 25°C com períodos de Iuz diários de 16 horas.A pre- sença do transgene foi rastreada em todas as plantas pela coleta de uma porção da folha (250 mg), extração de DNA e realização de uma primeira 15 análise de PCR e, então, nas plantas positivas foi realizada uma análise Southern a fim de verificar o número de cópias do transgene.

EXEMPLO 5

Extração de óleo da semente.

A semente de tabaco produzida por certas variedades selecio- 20 nadas foi usada para a produção de óleo. Em um caso, a semente analisada tinha um conteúdo de umidade de 7,01% e um conteúdo de substâncias graxas (extração com hexano) de 39,4%. A extração do óleo foi realizada como uma extração a frio, usando uma prensa helicoidal modelo Komet (IBG, Alemanha), carregada manualmente com as sementes de tabaco. No 25 estado estacionário, a prensa atingiu e manteve uma temperatura de 60°C. Após a prensagem, o óleo foi filtrado sobre papel e mostrou boas caracterís- ticas de limpidez. O rendimento do óleo extraído provou ser 81,1% do total de óleo contido na semente. A torta de óleo residual tinha um conteúdo de óleo de 0,74% e um conteúdo de proteína de 34,5% .

EXEMPLO 6

Testes de combustão

O óleo extraído a frio e filtrado com filtros de papel como no e- xemplo 5, foi transesterificado com álcool metílico na presença de NaOH. O óleo foi aquecido até 55°C e a solução de metanol-NaOH foi adicionada e misturada por 90 minutos. No final dessa etapa, após o resfriamento, a mis- tura foi deixada estratificar, separando assim a camada inferior de glicerol do 5 éster. O ésterfoi lavado duas vezes com água e na primeira lavagem foi adi- cionado ácido fosfórico (2,5 ml/litro) a água. No final do processo, o óleo foi aquecido sob vácuo a 90°C a fim de remover todos os resíduos de água e o éster obtido foi denominado com a abreviação TOE (Ester de Óleo de Taba- co). Os testes foram realizados com um motor de injeção indireta a diesel 10 (detalhes: 4 cilindros, bomba de injeção rotatória, taxa de compressão 21,5:1, força máxima 55kW a 4500 rpm). Antes dos testes de combustão, parâmetros analíticos tais como viscosidade a 50°C (21,63 mm2/s), ponto de fusão (-18°C), valor calorífico superior (9,670 kcal/kg), massa volumétrica a 15°C (925,0 kg/m3), enxofre (<0,01 % m/m), cinzas (0,005 % m/m) foram 15 verificados. Durante o teste, um analisador de gás e um dinamômetro hi- dráulico foram usados. O éster do óleo foi usado misturado em 20% com diesel, que tem as seguintes características principais em comparação com TEO (indicadas entre parênteses): densidade 840,8 (886,6), viscosidade a 40°C 2,9 (3,3), conteúdo de enxofre (mg/kg) 6,750 (6). Os resultados do tes- 20 te não apontaram variações detectáveis no desempenho do motor usando os dois produtos e mostrou uma combustão mais complete o que resultou em uma eficiência térmica maior quando o diesel foi adicionado a TEO. O aumento da potência máxima foi observado com 2,200 rpm com um aumen- to de 3,5% em comparação com o diesel puro (29,86 kW contra 28,85 kW). 25 O CO produzido é menor na mistura em comparação com o diesel puro e também o conteúdo de enxofre é menor, o que determina uma diminuição na emissão de SO2 (até 40%).

EXEMPLO 7

Testes de alimentação de animais A torta de óleo obtida da prensagem das sementes de tabaco foi

analisada a fim de avaliar sua adequabilidade para uso como um suplemen- to dietético proteico para rações animais. Os dados analíticos da torta de óleo resultante da prensagem mostraram um conteúdo de substâncias gra- xas de 10,74%, um conteúdo de proteína de 34,5% e uma umidade e subs- tâncias voláteis de 5,97%. Os aminoácidos totais após a hidrólise da amos- tra são: ácido aspártico 2.40%, treonina 1.06%, serina 1.17%, ácido glutami- 5 co 5.53%, prolina 0.83%, glicina 1.29%, alanina 1.18%, valina 1.27%, metio- nina 0.45%, isoleucina 1.13%, Ieucina 1.84%, tirosina 0.97%, fenilalanina 1.43%, histidina 0.72%, Iisina 0.72%, arginina 3.36%. Do conteúdo total de substancias graxas, 76,59% consistem de ácido Iinoleico que se correlaciona com a classe Ômega 6, que tem relevância particular para a dieta animal.

O teste de alimentação foi realizado com leitões que tinham um

peso inicial de cerca de 8 kg, divididos em dois grupos, cada um com 20 in- divíduos, um grupo de controle alimentar com uma alimentação que tem su- plemento de proteína de soja (C), o segundo grupo tem a mesma quantidade de proteína com relação ao primeiro, em que a soja foi parcialmente substi- 15 tuída por 3% de torta de óleo de tabaco (T). Os animais tratados com a torta de óleo não mostraram quaisquer problemas no início e ao longo da duração do teste com a ingestão do dito alimento. O teste foi monitorizado constan- temente e os leitões cevados não mostraram problemas gastrointestinais. Os animais mostraram um ganho de peso diferente diariamente (237 20 g/cabeça/dia com torta de óleo de tabaco, 170 g/cabeça/dia com torta de óleo de soja), e um peso final, após 27 dias, de 15,2 kg para T e 12,8 para C.

Claims (23)

1. Planta de tabaco mutagenizada caracterizada em que ela produz uma quantidade de sementes de pelo menos 2000 kg (20 quintais) por hectare.

2. Planta de acordo com a reivindicação 1, em que a dita quanti- dade de semente é de cerca de 5000 kg (50 quintais) por hectare, ou de cer- ca de 7000 kg (70 quintais) por hectare ou de cerca de 9000 kg (90 quintais) por hectare.

3. Planta de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 ou2, caracterizada em que ela é posteriormente modificada no metabolismo de ácido graxo por transformação genética e pelo fato de que ela produz uma semente que contém um título de iodo menor ou igual a 120.

4. Planta de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada em que ela é posteriormente modificada no metabolismo de ácido graxo por transformação genética e pelo fato de que ela produz uma semente que contém um percentual de óleo compreendido entre cerca de40% a cerca de 60% da semente.

5. Planta de acordo com as reivindicações 3 ou 4, modificada por transformação com um ou mais vetores de expressão que compreendem um cassete de expressão específico para semente compreendendo, orde- nada de 5' para 3', uma seqüência de DNA que codifique um promotor de um gene específico de planta para a expressão em órgãos de armazena- mento da semente; uma seqüência de DNA que codifique uma seqüência de sinal de uma proteína de planta capaz de direcionar a dita proteína para o retículo endoplasmático (ER); uma seqüência de DNA que codifique uma seqüência de sinal capaz de direcionar a proteína para o plastídio ou uma seqüência de DNA que codifique uma seqüência de sinal capaz de ancorar a proteína ao ER; uma seqüência de DNA que codifique uma proteína selecio- nada do grupo que compreende os genes de acetil-CoA carboxilase (ACCa- se), diacil-glicerol aciltransferase (DGAT), Iisofosfatidase acil transferase (LPAT), proteína transportadora de acila (ACP) fosfatidase fosfo-hidrolase (PAPase), malonil-CoA:ACP transacilase, cetoacil-ACP sintase (KAS), ceto- acil-ACP redutase, 3-hidroxiacil-ACP desidrase, enoil-ACP redutase, estea- roil-ACP desaturase, acil-ACP tioesterase, glicerol-3-fosfatoaciltransferase, 1 -acil-sn-glicerol-3-fosfato aciltransferase, citidina-5-difosfato-diacilglicerol sintase, fosfatidil glicerofosfato sintase, fosfatidil glicerol-3-fosfato fosfatase, FAD1-8 desaturase, fosfatase do ácido fosfatidico, monogalactosil diacil gli- cerol sintase, digalactosil diacil glicerol sintase, proteína de biossíntese de sulfolipideo, acil-coA sintase de cadeia longa, glicerol-3-fosfato aciltransfera- se (GPAT), diacilglicerol colinafosfo transferase, fosfatidilinositol sintase, acil- CoA diacilglicerol aciltransferase, acil-ACP desaturase, Iineoil desaturase, esfingolipideo desaturase, oleato 12-desaturase, acetilenase de ácido graxo, epoxigenase de ácido graxo, diacilglicerol quinase, colinafosfato citidil trans- ferase, colina quinase, fosfolipase, fosfatidilserina decarboxilase, fosfatidili- nositol quinase, cetoacil-CoA sintase, fator de transcrição de CER, oleosina,3-cetoacil-CoA tiolase, acil-CoA desidrogenase, enoil-CoA hidratase, acil- CoA oxidase, e um sinal de poliadenilação.

6. Planta de acordo com qualquer uma das reivindicações pre- cedentes, caracterizada em que ela é posteriormente modificada por trans- formação genética para resistência a insetos, herbicidas e fungos.

7. Uso da planta como definido em qualquer uma das reivindica- ções 1 a 6, para a produção de sementes para a fabricação de óleo de taba- co, óleos combustíveis, biodiesel, suplementos alimentícios para animais, combustíveis sólidos, suplementos alimentícios para humanos, lubrificantes.

8. Uso da planta como definido em qualquer uma das reivindica- ções 1 a 6, para a produção de biomassa para conversão bioquímica ou pa- ra conversão termoquímica por combustão direta, carbonização, pirólise, gaseificação, digestão anaeróbica, digestão aeróbica, fermentação alcoólica ou procedimentos de explosão a vapor.

9. Método para produção de plantas como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 4, compreendendo as seguintes etapas: a) submeter à mutagênese sementes produzidas por cruzamen- tos iniciais entre indivíduos da mesma espécie que pertencem a variedades de tipo selvagem ou selecionadas; b) permitir que as ditas sementes germinem e selecionar as plantas das gerações M2-M4 de acordo com os seguintes parâmetros: i) presença de uma ou mais características fenotípicas evidentes selecionadas entre: altura da planta de 80 a 120 cm, folhas com lâmina fina e orientação superior direita, inflorescência compacta, flores em número su- perior a 100, cápsulas em número superior a 100, número de sementes por cápsula maior do que 5000, caule Iignificado e robusto , raízes profundas; ii) estabilidade do caráter selecionado nas gerações seguintes a M2; iii) verificação da hereditariedade do caráter selecionado; c) permitir a germinação das sementes selecionadas na etapa b) e regenerar as plantas iniciando a partir do calo do mesófilo foliar induzido in vitro na presença de fitormônios e selecionar as plantas que mantenham as características selecionadas na etapa b) nas gerações R0-R2; d) semear em campo aberto as plantas selecionadas na etapa c) e selecionar posteriormente as plantas que produzem pelo menos 2000 kg (20 quintais) de sementes por hectare.

10. Método de acordo com a reivindicação 0 no qual a etapa a) é substituída pela etapa a') produzir sementes mutagenizadas pela realização de cruza- mentos interespecíficos no gênero Nicotiana, seguido pelo retrocruzamento dos indivíduos F1 ou pela indução de anfidiplóides pelo tratamento do ápice vegetativo das plantas produzidas pelos ditos cruzamentos com colchicina.

11. Método de acordo com as reivindicações 9 ou 10, compre- endendo ainda as seguintes etapas: e) transformar as plantas obtidas na etapa d) com vetores que compreendem cassetes de expressão que expressam em genes de plantas resistência a insetos, herbicidas e/ou doenças fúngicas e selecionar as plan- tas assim transformadas nas gerações T0-T4 resistentes a ou doenças fún- gicas e/ou; f) transformar as plantas obtidas na etapa d) com um ou mais vetores que compreendem cassetes de expressão que expressam o meta- bolismo de ácidos graxos em genes de sementes, seguida pela seleção das plantas transformadas nas gerações T0-T4 quanto a características tais co- mo conteúdo total de óleo das sementes e composição de ácidos graxos das mesmas; g) cruzar as plantas obtidas nas etapas e) e/ou f) e selecionar a progênie resultante quanto a uma ou mais características selecionadas no grupo: grande habilidade na produção de semente em uma quantidade su- perior a 4000 kg (40 quintais) por hectare, conteúdo de óleo da semente su- perior a 42%, título de iodo no óleo obtido das sementes da dita progênie inferior a 120, composição de ácidos graxos do óleo contido nas ditas se- mentes da progênie variável com relação à planta de tipo selvagem, resis- tência a insetos, resistência a herbicidas, resistência a fungos.

12. Semente das plantas como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6.

13. Uso da semente como definido na reivindicação 12, para a produção de óleo de tabaco, óleos combustíveis, biodiesel, suplementos a- limentícios para animais, combustíveis sólidos, suplementos alimentícios para humanos.

14. Método de extração de óleo das sementes de tabaco, em que o rendimento do óleo está entre 70 e 95% do óleo contido nas ditas se- mentes, que compreende as seguintes etapas: a) extrair mecanicamente o dito óleo pela prensagem com uma prensa helicoidal e obter o óleo e uma torta de óleo residual; b) filtrar o dito óleo extraído na etapa a) com filtros de papel ou de tecido.

15. Método de acordo com a reivindicação 14, compreendendo ainda a etapa de c) extrair quimicamente, pelo uso de solventes, o óleo residual contido na torta de óleo obtida na etapa a).

16. Método de acordo com as reivindicações 14 ou 15, em que o dito óleo é extraído das sementes formadas como definido na reivindicação12.

17. Método de acordo com as reivindicações 15 ou 16, compre- endendo ainda a etapa de d) refinar o óleo obtido nas etapas a) ou b) e c).

18. Óleo de semente de tabaco obtenível pelo método de extra- ção como definido nas reivindicações 15 ou 16, caracterizado em que ele tem um título de iodo menor ou igual a 120.

19. Biodiesel compreendendo o óleo das sementes tabaco como definido na reivindicação 12, transesterificado com metanol.

20. Suplemento alimentício para uso humano, caracterizado em que ele compreende o óleo de semente de tabaco obtenível pelo processo como definido na reivindicação 17.

21. Suplemento para ração para uso animal compreendendo a torta de óleo obtenível na etapa a) de acordo com a reivindicação 14 ou 16, quando depender da reivindicação 15.

22. Combustível sólido compreendendo a torta de óleo obtenível na etapa a) de acordo com a reivindicação 14 ou 16 quando depender da reivindicação 15.

23. Lubrificante industrial compreendendo o óleo das sementes de tabaco obtenível como definido em qualquer uma das reivindicações 14 a16.