BRPI0721465B1 - Uso de plantas de tabaco mutagenizadas e sementes das mesmas para a produção de óleo para usos energético, industrial e alimentício e métodos para produção das referidas plantas e de extração de óleo de sementes de tabaco - Google Patents

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(54) Título: USO DE PLANTAS DE TABACO MUTAGENIZADAS E SEMENTES DAS MESMAS PARA A PRODUÇÃO DE ÓLEO PARA USOS ENERGÉTICO, INDUSTRIAL E ALIMENTÍCIO E MÉTODOS PARA PRODUÇÃO DAS REFERIDAS PLANTAS E DE EXTRAÇÃO DE ÓLEO DE SEMENTES DE TABACO (51) Int.CI.: C12N 15/82; A01H 1/06 (30) Prioridade Unionista: 14/03/2007 IT RM2007 A 000129 (73) Titular(es): AEP ADVANCED ECOPOWER PATENTS SA (72) Inventor(es): CORRADO FOGHER

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para USO DE PLANTAS DE TABACO MUTAGENIZADAS E SEMENTES DAS MESMAS PARA A PRODUÇÃO DE ÓLEO PARA USOS ENERGÉTICO, INDUSTRIAL E ALIMENTÍCIO E MÉTODOS PARA PRODUÇÃO DAS REFERIDAS PLANTAS E

DE EXTRAÇÃO DE ÓLEO DE SEMENTES DE TABACO.

DESCRIÇÃO TÉCNICA ANTERIOR

O tabaco vinha sendo cultivado, inicialmente, como uma planta ornamental e como uma planta medicinal, impondo-se subsequentemente como um bem essencialmente prazeroso na cultura humana e modificando os hábitos e costumes humanos.

O tabaco tem, entre outras plantas agricultáveis, uma posição que não é comparável com a de outras plantas cultiváveis e apresenta certas peculiaridades, tais como:

1. é uma entre poucas plantas comercializadas apenas por suas folhas;

2. é a principal planta não alimentícia no mundo com uma extensão de produção maior do que quatro milhões de hectares em todo o mundo;

3. em muitos países, é um instrumento muito importante para a 20 política econômica e financeira;

4. seu consumo é baseado na transformação das folhas em produtos para fumantes, pós para inalação e produtos mastigáveis;

5. considerando suas características como substância narcótica e sua periculosidade para a saúde humana, sempre houveram tentativas dirigi25 das para a proibição de seu uso e portanto de sua produção.

A evolução do gênero Nicotiana em diferentes habitats, inicialmente através da seleção natural e do poliploidismo e, mais tarde, através da seleção dirigida pelo homem, induziu ao aparecimento de uma vasta gama de tipos, todos selecionados com base nas propriedades da folha, sendo a folha considerada como a única parte valiosa da planta.

Recentemente, foram indicados usos alternativos do tabaco além daqueles listados acima:

1. produção de proteínas alimentícias através da sua purificação

Petição 870170094841, de 06/12/2017, pág. 5/12 a partir das folhas (Long R.C. 1979. Tobacco production for protein. Project n. 03245. North Carolina State university, Raleigh NC);

2. a extração de ingredientes farmacologicamente úteis normalmente presentes nas folhas (Baraldi M. et al. 2004. Presenza di sostanze Benzodiazepino-simili in estratti di foglie di tabacco (Nicotiana tabacum). Atti Ist. Sper. Tab., 23 Aprile, Roma, pp 45-52);

3. a produção de proteínas recombinantes expressas nas folhas ou nas sementes de plantas geneticamente modificadas (Twyman et al. 2003. Molecular farming in plants: host systems and expression technology. Trends Biotechnol. 21:570-578).

A planta de tabaco apresenta uma grande área de folha, uma pequena inflorescência e uma proporção de partes aéreas:raízes que é a maior observada entre plantas agricultáveis (Went, 1957. The experimental control f plant growth. pp 343. Chronica Botanica, Waltham, Mass.).

Levando em consideração a relevância econômica exercida pelo cultivo do tabaco, não obstante o aumento alarmante do tabagismo entre os mais jovens, a Europa fornece privilégios para o seu cultivo despertando perplexidade de natureza econômica e ética.

A Comissão Européia, em seu site da internet (www.ec.europa.eu/aqriculture/publi/fact/tobacco) afirma: não há alternativas economicamente válidas a essa cultura que não use bons solos. O incentivo a cultura do tabaco permite a sobrevivência do tecido rural e produz uma atividade industrial que contribui para a sobrevivência de regiões ameaçadas pela desertificação.

As consequências negativas, em termos ambientais, do uso de combustíveis fósseis e a disponibilidade limitada do petróleo, requerem a busca de novas fontes energéticas. Entre essas, os biocombustíveis são a melhor escolha em uma perspectiva futura devido a sua renovabilidade.

Considerando os biocombustíveis de origem agrícola, até o momento, a atenção está focalizada sobre a produção de bioetanol a partir de plantas que produzem açúcar da forma simples (isto é, sacarose) ou complexa (isto é, celulose). Modelos de plantas para tal produção têm sido iden3 tificados na cana-de-açúcar, milho, trigo, batata, mandioca, beterraba, cevada, sorgo, etc. O desenvolvimento de culturas que se direcionam para a maximização da produção de biomassa a ser transformada em etanol através de processos de fermentação ou para a produção de biocombustíveis ou gás através de gaseificação pode ter o mesmo escopo. Altemativamente, o patamar tecnológico atual objetiva a produção de óleo combustível e biodiesel a partir de espécies de forma oleaginosa ou não oleaginosas mas ricas em óleo tais como a soja, girassol, canola, amendoim, linho, milho, gergelim, palma, coco, mamona, etc.

A escolha da espécie ideal para a produção de biocombustíveis poderá estar relacionada com o preenchimento de requisitos tais como:

1. determinação do ganho da rede energética na diferença entre o processamento e o rendimento da cultura, compreendendo no dito cálculo os custos energéticos para a produção do maquinário agrícola e para o processo de extração e transformação/purificação do óleo;

2. determinação dos benefícios ambientais que derivam da sustentabilidade da produção agrícola, diminuição de emissão de CO2 e de matéria particulada (por exemplo, PM-10) após a combustão e uso limitado de agroquímicos tais como pesticidas, herbicidas e fertilizantes;

3. ser economicamente competitivo e, possivelmente, determinar benefícios sociais que possam aumentar a economia dos sistema, por exemplo, pela diminuição de custos indiretos sobre o sistema sanitário, considerando também que a energia fóssil usada no momento impõe custos ambientais que não estão, geralmente, na determinação do custo; um biocombustível deve contemplar benefícios para ambos os lados da competitividade e o lado o ambiental;

4. estar disponível em grandes quantidades sem diminuição da disponibilidade alimentícia; 0 uso de plantas agricultáveis tradicionalmente usadas para a produção de alimento não permite seu uso de modo aceitável para a produção de biocombustíveis sem determinar uma redução das fontes de alimento que derivam das ditas plantas, aumento portanto os custos dos materiais brutos;

5. a cultura da planta da qual ele deriva possivelmente se refere a terras marginais que, provavelmente, não são usadas para culturas alternativas.

Atualmente, as plantas levadas em consideração para a produção de óleo são: soja (Glycine max), girassol (Helianthus annuus), colza (Brassica napus), amendoim (Arachis hypogaea), mamona (Ricinus communis), linho (Linum usitatissimum), milho (Zea mais), gergelim (Sesamum indicum), palma (fruto, Aracaceae), cerne de palmeira (semente, Aracaceae), copra (coco, Cocos nucifera), açafrão (Carthamus tinctorius), azeitona (Olea europea), algodão (Gossypium sp.), caju (Anacardium occidentale), cânhamo (Cannabis sativa), papoula (Papavers sp.), mostarda (Brassica sp.), uva (Vitis sp.), damasco (Prunus armeniaca), pinho (Pinus sp.), argan (Argania spinosa), abacate (Persea americana), amêndoa (Prunus amygdalus), avelã (Corylus avellana), noz (Juglans regia), amargosa (Azadirachfa indica), niger (Guizotia abyssinica), jojoba (Simmondsia chinensis), arroz (Oryza sativa), abóbora (Cucurbita sp.), crambe (Crambe abyssinica).

Ao contrário, anteriormente, o tabaco sempre foi considerado como uma planta agricultável apta para a produção de folhas.

As três únicas publicações da literatura, relacionadas abaixo, que sugerem outros usos para o tabaco, levam em consideração as variedades de tabaco atuais, que foram selecionadas para a produção de folhas, como uma fonte de produto derivado de semente para extração de óleo.

Em particular, Giannelos et al. (Tobacco seed oil as an alternative diesel fuel: physical and Chemical properties. Industrial Crops and Products, 2002, 16:1-9) declarando que a semente é um produto derivado da produção de folha na Grécia sugere a possibilidade de usar as ditas sementes para a produção de combustíveis descrevendo métodos para a extração de uma forma de óleo de sementes de tabaco que usa solventes, indicando, entretanto, que o óleo extraído do tabaco não pode ser usado tal como um biodiesel devido ao alto teor de iodo nele.

Usta N. (Use of tobacco seed oil methyl ester in a turbocharged indirect injection diesel engine. Biomass and Bio-energy, 2005, 28:77-86) declara que o óleo das sementes de tabaco é um subproduto da produção mundial de folhas, avalia a produção mundial de semente que deriva do cultivo de folhas de tabaco e descreve a extração de óleo da semente através do uso de solventes.

Finalmente, Patel et al. (Production potential and quality aspects of tobacco seed oil. Tobacco Research, 1998, 24:44-49) avaliam a produção de semente de tabaco como um subproduto de folhas na índia igual a 1,171 kg/ha com um conteúdo de óleo de 38% por peso e descrevem sua extração com o uso de solventes.

Os processos tecnológicos para a extração de óleo compreendem técnicas mecânicas (pressão) e químicas (solventes). Na prática, os dois sistemas estão geralmente combinados. Em geral, a extração mecânica é realizada sobre as sementes que contêm mais do que 20% de material oleoso (por exemplo, colza e girassol), em que as dimensões das sementes são favoráveis a técnica de prensagem. A semente do tabaco, por exemplo, devido as suas dimensões muito reduzidas, é submetida à extração de óleo por tratamentos químicos.

Geralmente, a possibilidade de extrair óleo mecanicamente facilita a extração direta nos locais de produção de semente, portanto também a nível rural, com pequenas fábricas.

Para quantidades menores de material oleoso é usada a extração química e que pode ser aplicada também a torta de óleo, remanescente da extração mecânica, a fim de recuperar os 6-12% de óleo residual deixado após o tratamento mecânico. Os óleos extraídos pelo uso de solventes (por exemplo, hexano) antes da comercialização para usos alimentícios, requerem uma etapa de refino. O produto principal do processo de extração é o óleo bruto; a extração mecânica produz ainda a torta de óleo protéica enquanto que a extração química produz farinha. A última, usada na alimentação de animais, influencia de modo crítico a economia de produção e processamento de sementes oleaginosas.

Em certos casos a produção está ligada a requisição de farinha de proteína (por exemplo, soja). O óleo bruto pode ser subsequentemente retificado com uma série de tratamentos físico-químicos (por exemplo, ajuste de pH, filtração, degomação, descoloração, etc.) dependendo do uso pretendido.

O equilíbrio da massa do processo completo varia de espécie para espécie, por exemplo, considerando um conteúdo em óleo de 42% para as sementes de girassol, para uma tonelada de sementes (que são o produto principal) são consideradas 2,6 ton. de subproduto, com uma produção de 420 kg de óleo bruto, 580 kg de torta de óleo, obtendo uma produção final de 390 kg de óleo refinado e 30 kg de resíduos processados. Levando em consideração que o rendimento médio de sementes de girassol é de cerca de 2,6 t/ha (+/-15%), pode ser calculado que o rendimento/hectare de óleo é igual à cerca de uma tonelada. Essa relação é válida também para outras espécies, em particular para a colza, dependendo do percentual de óleo. Óleos vegetais podem ser usados diretamente como óleos combustíveis para a produção de calor (fornos ou ebulidores) ou para a produção de energia mecânica (motores), utilizando seus valores caloríficos brutos que são de cerca de 8.500 kcal/kg ou, após a transesterificação, transformados como biodiesel.

O uso de óleos vegetais em ebulidores pode ser realizado com aquecedores convencionais com a substituição do óleo diesel industrial ou para aquecimento por óleo vegetal. Esse tipo de solução parece muito interessante devido ao fato de que: (i) o preço do combustível fóssil substituído é geralmente muito semelhante àquele do óleo diesel automotivo e está sujeito a impostos elevados: (ii) o uso de óleo em ebulidores requer a organização de uma rede agroenergética muito simples que pode terminar diretamente no ambiente rural, onde os produtores de combustível e os usuários de combustível podem estar localizados muito próximos uns dos outros ou podem até coincidir. A maior ou menor facilidade do processo de extração de óleo é outro aspecto importante a ser levado em consideração quando é considerado o uso local do biocombustível. A economia de produção e o balanço energético mais ou menos favorável dependerão principalmente da produção por hectare de óleo combustível.

O uso de óleos vegetais em motores a diesel requer, por outro lado, um processo químico de transesterificação com metanol e uma certa composição de ácido graxo, que pode ser resumida em uma valor de iodo que tem que ser igual ou inferior a 120. Óleos vegetais também são geralmente usados para objetivos alimentícios. Dependendo da planta, as produções podem ser dirigidas, principalmente, para objetivos alimentícios ou energéticos ou para ambos.

A luz dos problemas mencionados acima, pode ser altamente desejável reciclar a indústria do tabaco para objetivos ecológicos e não prejudiciais para os seres humanos.

A identificação de um uso alternativo e economicamente válido do tabaco constitui, portanto, um tópico mundial claro economicamente interessante.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

A presente invenção descreve a produção de plantas de tabaco adequadas para uma produção muito alta de um componente particular da planta: a semente. As ditas plantas foram produzidas através de técnicas de mutagênese somática in vitro, química ou física e/ou através de cruzamentos interespecíficos e duplicação cromossômica subsequente. As ditas plantas são opcionalmente modificadas por técnicas de manipulação genética. A seleção da planta de tabaco, atualmente, sempre foi dirigida para a folha como produto final, o foco da atenção e, portanto, a seleção de plantas para a maximização da produção das sementes nunca tinha sido sugerida antes e permite o uso do tabaco a fim de maximizar a produção da semente em detrimento da produção da folha.

Foi descoberto, surpreendentemente, que a seleção de plantas de tabaco, realizada usando técnicas não biológicas de mutagênese química, física e somática in vitro, de cruzamento também entre espécies diferentes, seguidas pela indução de anfidiplóides e, opcionalmente por técnicas de DNA recombinante, tem permitido obter plantas de tabaco que apresentam as seguintes características:

- elas apresentam as características ideais para a transformação da planta agricultável de tabaco a partir de uma planta para produção de folha em uma planta para produção de semente;

- elas têm a capacidade de produzir sementes até valores entre 2000 kg (20 quintais)/hectare , a 5000 kg (50 quintais)/hectare ou até 7000 kg (70 quintais)/hectare ou mesmo 9000 kg (90 quintais)/hectare com a possibilidade de melhorias adicionais no rendimento de semente/hectare;

- elas apresentam um conteúdo de óleo na semente de até 38% do peso da semente ou até 40% ou até 48%, ou até 52% ou até 58% ou mesmo até 60%;

- elas têm baixa necessidade de insumos agronômicos para defesa contra parasitas e vermes.

Além disso, completamente inesperado, devido às pequenas dimensões da semente de tabaco que tem, entre as plantas cultiváveis, uma das menores sementes, a presente invenção mostra que é possível extrair óleo da semente pela prensagem, alcançando-se rendimentos de extração que são cerca de 80% do óleo total presente na semente, cerca de 90% do óleo total presente na semente ou até cerca de 95% do óleo total presente na semente, garantindo assim a possibilidade de realização da extração também em pequenas fábricas para uso em fazendas.

Portanto, o objetivo da invenção são plantas de tabaco que são mutagenisadas e/ou obtidas pelo cruzamento interespecífico seguido pela diploidização e seleção caracterizadas em que elas produzem uma quantidade de semente igual à pelo menos 2000 kg (20 quintais)/hectare, as ditas plantas opcionalmente modificadas posteriormente por manipulação genética, o uso das ditas plantas para a produção de sementes, para a produção de óleo e seus derivados, o uso das ditas plantas para a produção de biomassa para a conversão bioquímica ou termoquímica, o método de produção e seleção das ditas plantas, as sementes das ditas plantas e seu uso para a produção de óleo e seus derivados, o óleo derivado das ditas sementes, o biodiesel obtido a partir das ditas sementes, um suplemento alimentar derivado de tabaco, combustíveis sólidos compreendendo a torta de óleo resultante da prensagem das sementes de tabaco, o método para a extração de óleo de sementes de tabaco por prensagem.

DESCRIÇÃO DETALHADA DAS FIGURAS

Figura 1. Características gerais da planta de tabaco produzida através de mutagênese química, cruzamento intra e interespecífico, poliploidização, seleção, indução de variabilidade somaclonal, transformação genética, direcionadas para maximizar a produção de semente por unidade de superfície, com um grande conteúdo de óleo e que tem características adequadas para uso como fonte energética, para usos industriais e para nutrição humana e animal. Principais características induzidas e selecionadas: profundidade e amplitude do aparato radical; folhas lanceoladas finas e eretas; caule robusto na base com internodos distantes; inflorescência semelhante à espiga compacta, ampla ou em colunas;pedículo curto, cápsulas não abertas, di ou multiválvulas, ápice reto, com pelo menos 5000 sementes/cápsula; sementes ovais ou elípticas com um comprimento > do que 1 mm; altura da planta entre 50 e 120 cm, resistência a insetos, resistência a herbicidas, resistência a fungos, resistência a seca, proporção variável entre os componentes de ácidos graxos.

Figura 2. Exemplo do produto de óleo e torta de óleo obtidos da semente de tabaco pela prensagem com uma prensa helicoidal modelo Komet (IBG). Após a prensagem, o óleo foi filtrado em papel e apresenta elevadas características de limpidez.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

A presente invenção, portanto, descreve a produção de plantas do gênero Nicotiana, como plantas ideais para a produção de sementes a partir das quais é obtido o óleo combustível, biodiesel, proteínas, óleo para uso zootécnico, para uso industrial, para uso alimentício humano.

As variedades do gênero Nicotiana que podem ser usadas como plantas parentais para a produção das plantas da invenção podem estar, por exemplo, compreendidas entre as seguintes espécies: N. tabacum, N. rústica, N. glauca, N. paniculata, N. knightiana, N. solanifolia, N. benavidesii, N. cordifolia, N. raimondii, N. thyrsiflora, N. tomentosa, N. tomentosiformis, N. otophora, N. setchellii, N. glutinosa, N. ondulata, N. arentsii, N. wigandioides,

Λ/, trigonophylla, Ν. palmeri, Ν. sylvestris, Ν. langsdorffii, Ν. alata, Ν. forgetiana, N. bonariensis, N. longiflora, N. plumbaginifolia, N. repanda, N. stocktonii, N. nesophila, N. moctiflora, N. tomentosiformis, N. otophora, N. setchellii, N. glutinosa, N. petunioides, N. acaulis, N. ameghinoi, N. acuminata, N. pauciflora, N. attenuata, N. miersii, N. corymbosa, N. linearis, N. spegazinii, N. bigelovii, N. clevelandii, N. nudicaulis, N. marítima, N. velutina, N. gossei, N. excelsíor, N. megalosiphon, N. exigua, N. goodspeedii, N. ingulba, N. stenocarpa, N. occidentalis, N. rotundifolia, N. debneyi, N. benthamiana, N. fragrans, N. suaveolens, N. obtusifolia.

De acordo com a presente invenção, a planta será obtida por meio de técnicas de mutagênese que possibilitarão o desenvolvimento de plantas capazes de produzir uma quantidade de sementes maior do que a média com relação aos indivíduos iniciais. A mutagênese pode ser induzida por técnicas padronizadas de tratamento químico e/ou físico de sementes de tabaco ou também pela cultura in vitro para a indução de mutantes somaclonais. A maior produção de semente pode ser obtida também pela geração de plantas híbridas, produzidas pelo cruzamento interespecífico seguido pela diploidização do conjunto cromossômico (a fim de impedir os eventos de esterilidade exibidos por híbridos interespecíficos) por tratamento químico com colchicina. As plantas produzidas por cruzamento interespecífico podem ser adicionalmente mutagenizadas por técnicas químicas e/ou físicas padronizadas.

Uma vez que os mutantes são obtidos, eles serão selecionados quanto ao caráter de produção de semente, de forma a isolar e selecionar plantas que produzam pelo menos 2000 kg (20 quintais) de semente por hectare de cultura.

De acordo com a presente invenção, a planta será produzida partindo de sementes produzidas por:

1. cruzamento entre indivíduos da mesma espécie ou

2. cruzamento entre indivíduos de espécies diferentes que têm o mesmo número de cromossomos (por exemplo, N. tabacum χ N. clevelandii) tal que ou em que o dito cruzamento é seguido por métodos de cultura de embriões e indução de poliplóides pelo tratamento com o mutagênico colchicina, usando técnicas bem conhecidas por aquele versado na técnica, a fim de obter anfidiplóides ou

3. cruzamento entre indivíduos de espécies diferentes que têm um número diferente de cromossomos (por exemplo, N. tabacum x N. trigonophylla) tal que ou em que o dito cruzamento é seguido por métodos de cultura de embriões e indução de poliplóides pelo tratamento com o mutagênico colchicina, usando técnicas bem conhecidas por aquele versado na técnica, a fim de obter anfidiplóides

Como indicado acima, quando não há indução de diploidização, como nos casos 1 e 2, as sementes serão mutagenizadas por técnicas físicas e/ou químicas, quando a mutação do número de cromossomos é induzida por diploidização, como nos casos 2 e 3, a seleção poderá ser realizada nas ditas sementes mutadas assim produzidas ou nas ditas sementes mutagenizadas por técnicas físicas e/ou químicas. As técnicas de mutação conhecidas pela pessoa versada na técnica podem ser usadas, tais como, por exemplo, o tratamento da semente com Sulfonato de Etil Metano (EMS) (por exemplo, em solução aquosa em uma concentração de 0,5%) e deixando o EMS em contato com a semente por períodos variáveis, por exemplo, como indicado no exemplo 1 ou, como já dito, com colchicina de maneira a induzir a poliploidização, por radiações X ou Gama realizadas em ambientes adequados e pela realização de seleções em grande escala. As sementes assim tratadas serão deixadas germinar e as plantas da geração M₂ serão selecionadas com base nas seguintes características: forma da inflorescência, número de cápsulas, número de sementes por cápsula, dimensões da semente, formato da folha, dimensões do aparelho da raiz, orientação da folha, etc.

De acordo com a presente invenção, as plantas que têm as seguintes características serão selecionadas: altura da planta de 80 a 120 cm, folhas com lâmina fina e orientação reta, inflorescência compacta, flores em número superior a 100, cápsulas em número superior a 100, número de sementes por cápsula maior do que 5000, caule lignificado e robusto e raízes profundas.

A quantidade de sementes produzidas pelas plantas selecionadas será então verificada em campo aberto e apenas as plantas que produzem pelo menos 2000 quilos (20 quintais) de semente/hectare em uma densidade de semeadura de cerca de 125.000 a 250.000 plantas/hectare serão selecionadas.

Por mutagênese química e física e por mutagênese somática, são obtidos mutantes de diferentes classes, aumentando portanto a probabilidade de encontrar as variantes desejadas. Como um exemplo, um mutante com folha lanceolada com orientação ereta permite o aumento da densidade de semeadura sem comprometer a recepção de luz que é importante para a atividade fotossintética e, portanto, para aumentar a produção de semente por ha. Por exemplo, um mutante que tem um aparelho radicular profundo permite uma melhor ancoragem e nutrição da planta. Como um exemplo, um mutante com inflorescência compacta e um grande número de cápsulas permite aumentar a quantidade de semente produzida por cada planta isolada.

A presente invenção abrange as plantas assim obtidas e selecionadas, que produzem uma quantidade de semente maior ou igual a 2000 kg (20 quintais)/hectare. As plantas da presente invenção são modificadas a fim de produzir uma quantidade de semente de até 9000 kg (90 quintais) por hectare cultivado, portanto, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000,8000,9000 quilos por hectare cultivado contra as 10.000 a 12.000 normalmente produzidas pelas plantas de tabaco selecionadas para a produção de folha.

As plantas da invenção podem ser obtidas também pela indução de variantes somatoclonais, em que as sementes acima indicadas podem ser tratadas com hipoclorito de sódio e então com etanol 70%, das plantas germinadas a partir das ditas sementes são retiradas partes da folha e a formação de calos é induzida e reproduzida por períodos variáveis in vitro a partir das ditas partes. A partir dos ditos calos, plantas que têm características variáveis, tais como: forma da inflorescência, número de cápsulas, número de sementes por cápsula, dimensões da semente, formato da folha, dimensões do aparelho da raiz, orientação da folha, produção de semente, conteúdo de óleo da semente, composição de ácido graxo do óleo, conteúdo de proteína da semente, etc, se regeneram, a dita planta sendo selecionável com base nos parâmetros acima mencionados.

As plantas da invenção podem ser selecionadas ainda pela presença de características tais como: percentual de conteúdo de óleo da semente. composição de ácido graxo do óleo, conteúdo de proteína da semente, etc.

As plantas acima descritas podem ainda ser modificadas por técnicas de DNA recombinante a fim de se obter características vantajosas, no caso das ditas características ainda não estarem presentes nos mutantes selecionados, tais como: aumento no percentual do conteúdo de óleo da semente, composição variável de ácido graxo dependendo dos usos desejados para o óleo, resistência a insetos, resistência a herbicidas, resistência a fungos, etc.

Para a transformação genética das plantas da invenção, podem ser usados vetores adequados para transformação de células de planta assim como cassetes de expressão que permitem a expressão na planta de genes de interesse. Dependendo se os genes serão expressos na parte verde da planta (isto é, genes para resistência a parasitas ou herbicidas) ou nas sementes (por exemplo, genes envolvidos no metabolismo de ácidos graxos), vetores conhecidos na técnica, que asseguram a expressão dos ditos genes nos órgãos de interesse, podem ser selecionados. Portanto, os vetores com promotores constitutivos conhecidos atualmente ou com promotores induzíveis, por exemplo, pelo ataque de parasitas ou na formação da cápsula, podem ser usados. Em particular, como as plantas da invenção são selecionadas para a lata produção de semente e, sendo o produto da dita semente de interesse particular, vetores que compreendem cassetes de expressão específicos que garantirão a expressão dos genes heterólogos inseridos nas sementes da planta da invenção serão particularmente adequados.

Para a transformação genética, os sistemas com Agrobacterium tumefasciens ou de transferência física de DNA podem ser usados.

Em uma modalidade da invenção, será particularmente vantajo14 sos produzir plantas que apresentem não apenas uma alta produtividade de semente, mas também resistência a insetos, resistência a herbicidas, resistência a fungos, resistência a seca; isso permitirá reduzir significativamente os insumos agrícolas, aumentando assim a produtividade da cultura e a redução do impacto ambiental.

Nesse caso, vetores que compreendem o gene de resistência a canamicina como um marcador, regulando regiões que permitem a expressão constitutiva (por exemplo, promotor 35S ou ubiquitina) dos genes de interesse, tais como o gene cry de Bacillus thuringiensis, o gene aroA de Salmonella typhimurium, o gene Rpt1 de N. obtusifolia, podem ser usados, tais genes permitem, na mesma ordem, a produção de plantas que resistem respectivamente a: insetos, herbicidas, doenças fúngicas e podem ser introduzidos de acordo com técnicas de transferência de gene conhecidas pela pessoa versada na técnica.

As resistências podem ser introduzidas acompanhando um ou mais eventos de transformação com vários vetores ou, alternativamente, devido ao fato de que plantas são muito facilmente cruzadas, as resistências podem ser introduzidas singularmente em indivíduos diferentes da mesma variedade selecionada e subsequentemente agrupadas no mesmo indivíduo por cruzamento.

Nesse caso, será fácil obter homozigose para todas as características pela duplicação de haplóide obtidos de culturas de anteras in vitro.

A transformação genética pode ser realizada de forma análoga para os propósitos de manipulação metabólica objetivados para o aumento da quantidade de óleo acumulado nas sementes e para a modificação da via metabólica de ácidos graxos. Nesse caso, é possível usar regiões reguladoras com atividade específica para a semente tal como o promotor de globulinas, e direcionar as proteínas enzimáticas para o retículo endoplasmático onde elas podem ser estabilizadas inserindo um sinal específico, tal como KDEL, ou de onde podem ser translocadas para plastídeos, inserindo sinais específicos para aminoácidos, por exemplo a sequência líder da pequena subunidade RuBisCO.

Por exemplo, a quantidade de óleo e a composição de ácidos graxos do mesmo podem ser modificados pela modificação da expressão de genes que codificam enzimas tais como, meramente como meio de exemplo, acetil-CoA carboxilase (ACCase), diacil-glicerol aciltransferase (DGAT), lisofosfatidase acil transferase (LPAT), proteína transportadora de acila (ACP) fosfatidase fosfo-hidrolase (PAPase), malonil-CoA:ACP transacilase, cetoacil-ACP sintase (KAS), cetoacil-ACP redutase, 3-hidroxiacil-ACP desidrase, enoil-ACP redutase, estearoil-ACP desaturase, acil-ACP tioesterase, glicerol-3-fosfatoaciltransferase, 1-acil-sn-glicerol-3-fosfato aciltransferase, citidina-5-difosfato-diacilglicerol sintase, fosfatidil glicerofosfato sintase, fosfatidil glicerol-3-fosfato fosfatase, FAD1-8 desaturase, fosfatase do ácido fosfatidico, monogalactosil diacil glicerol sintase, digalactosil diacil glicerol sintase, proteína de biossíntese de sulfolipídeo, acil-coA sintase de cadeia longa, glicerol-3-fosfato aciltransferase (GPAT), diacilglicerol colinafosfo transferase, fosfatidilinositol sintase, acil-CoA diacilglicerol aciltransferase, acil-ACP desaturase, lineoil desaturase, esfingolipideo desaturase, oleato 12desaturase, acetilenase de ácido graxo, epoxigenase de ácido graxo, diacilglicerol quinase, colinafosfato citidil transferase, colina quinase, fosfolipase, fosfatidilserina decarboxilase, fosfatidilinositol quinase, cetoacil-CoA sintase, fator de transcrição de CER, oleosina, 3-cetoacil-CoA tiolase, acil-CoA desidrogenase, enoil-CoA hidratase, acil-CoA oxidase.

De acordo com a invenção, um aumento no conteúdo total de óleo da semente pode ser obtido pela determinação de uma superexpressão da Acetil CoA carboxilase do tabaco ou a mesma enzima de outras espécies (por exemplo, colza). Como exemplo, uma variação no perfil de ácido graxo e, portanto, na quantidade de iodo, pode ser obtida pelo silenciamento através da expressão de construtos antisenso, do gene que codifica a oleato desaturase do plastídeo e do retículo endoplasmático. A expressão ou o silenciamento de um ou mais dos ditos genes nas sementes das plantas da invenção, resulta no fato de que o óleo produzido pelas ditas sementes pode ser usado diretamente para a produção de biodiesel, já que ele tem uma quantidade de iodo inferior ou igual a 120.

A expressão dos ditos genes também pode afetar o percentual de óleo na semente e as plantas da invenção podem ser selecionadas ainda pelo conteúdo de óleo da semente que pode ser igual à cerca de 38% do peso da semente, a 40%, a 48%, a %2%, a 58% e até a 60%.

Os genes acima mencionados podem ser introduzidos em vetores para expressão específica na semente, tal como aqueles descritos no pedido de patente WO03073839, seguindo os ensinamentos descritos no dito pedido. O vetor de expressão usado para a dita modalidade, portanto, será um vetor que compreende: a. um promotor de um gene de planta específico para a expressão nos órgãos de armazenamento de semente; b. uma sequência de DNA que codifique a sequência de sinal de uma proteína de planta capaz de dirigir o produto do gene de interesse para os órgãos de armazenamento de semente através do retículo endoplasmático; c. uma sequência de DNA que codifique o dito gene de interesse privado da sequência de sinal nativa; d. um sinal de parada. Os promotores e as sequências líderes podem pertencer, por exemplo, ao gene 7S de globulina de soja ou ao gene beta-conglicina de soja ou a genes que codifiquem proteínas de armazenamento na semente de tabaco.

Os genes mencionados acima podem ser introduzidos seguindo um ou mais eventos de transformação ou pela transformação com vários vetores, ou, alternativamente, como as plantas são muito facilmente cruzadas, os ditos genes podem ser introduzidos singularmente em indivíduos diferentes da mesma variedade selecionada e subsequentemente agrupados no mesmo indivíduo através de cruzamento.

Nesse caso, será fácil obter homozigose para todas as características pela duplicação de haplóides obtidos de culturas de anteras in vitro.

Tabela 1. Conteúdo de ácidos graxos de algumas variedades de tabaco selecionadas apenas após a mutagênese ou manipuladas e selecionadas a fim de alterar a via metabólica de ácidos graxos e selecionadas quanto à estabilidade do caráter. A tabela aponta o resultado obtido com mutagênese e a intervenção genética realizada pela introdução de alguns dos genes listados a fim de alterar a composição de ácido; o óleo das três ultimas colunas tem um título de iodo adequado para a transformação do dito óleo em biodiesel.

Componente	PLT 103	PLT 256	PLT 318	PLT 335
Ácido Palmitico	6,31%	8,26%	7,15%	17,20%
Ácido Palmitoleico	0,11%	0,18%	0,18%	1,25%
Ácido Esteárico	2,58%	5,20%	8,50%	12,50%
Ácido Oleico	12,62%	22,58%	25,56%	53,27%
Ácido Linoleico	77,48	58,78%	52,00%	6,45%
Ácido Linolenico	0,65%	4,15%	5,25%	7,80%
Ácido Araquídico	0,13%	0,85%	0,80%	0,85%
Ácido Eicosanóico	0,13%	0,58%	0,56%	0,68%

Também são objetivos da invenção as sementes das plantas como descritas acima que, sendo sementes de plantas mutantes, serão também mutantes e assim conterão as modificações de DNA que as tomarão de forma diferente das sementes de tipo selvagem. Além disso, como indicado acima, as ditas sementes podem ter um numero cromossômico diferente comparadas com as plantas parentais (por exemplo, poliploidias) e na maioria dos casos serão também transformadas com os vetores acima mencionados.

Quando a transformação é feita com vetores que expressam genes relacionados com o metabolismo dos ácidos graxos listados acima, a dita semente também será caracterizada em que ela conterá um óleo que tem um titilo de iodo inferior ou igual a 120 e um percentual de óleo compreendido entre 38% e 60% do peso total das sementes.

Também é um objetivo da presente invenção o método para a produção da planta da invenção compreendendo as seguintes etapas:

a) semente produzida pelos cruzamentos iniciais entre indivíduos da mesma espécie pertencentes ao tipo selvagem ou variedades selecionadas são submetidas à mutagênese;

b) as dita sementes são deixadas germinar e as plantas das gerações M2-M4 são selecionadas de acordo com os seguintes parâmetros:

i) presença de características que se manifestam a nível fenotípico selecionadas do grupo que compreende a altura da planta de 80 a 120 cm, folhas com lâmina fina e orientação direta, inflorescência compacta, flores em número superior a 100, número de cápsulas superior a 100, número de sementes por cápsula maior do que 5000, caule lignificado e robusto , raízes profundas;

ii) estabilidade do caráter selecionado nas gerações após a geração M2;

iii) testar a hereditariedade do caráter selecionado;

c) permitir a germinação das sementes selecionadas na etapa b) e regenerar as plantas iniciando a partir do calo do mesófilo foliar induzido in vitro na presença de fitormônios e selecionar as plantas que mantenham as características selecionadas na etapa b) nas gerações R0-R2;

d) as plantas selecionadas na etapa c) são semeadas em campo aberto e as plantas que produzem pelo menos 2000 kg (20 quintais) de sementes por hectare são selecionadas.

No método descrito, as plantas obtidas na etapa a) também podem ser obtidas por a') realização de cruzamentos interespecíficos no gênero Nicotiana, seguido pelo retrocruzamento de F1 ou pela indução de anfidiplóides pelo tratamento do ápice vegetativo com colchicina.

As plantas obtidas com os métodos descritos acima podem ser submetidas a etapas adicionais e) e/ou f) e por uma passagem g) como indicado abaixo:

e) transformação genética das plantas obtidas na etapa a-d ou a'-d com vetores que compreendem cassetes de expressão que expressam em plantas genes de resistência a insetos, herbicidas e/ou doenças fúngicas selecionados no grupo que consiste em gene cry de Bacillus thuringiensis, o gene aroA de Salmonella typhimurium, o gene Rpt1 de N. obtusifolia e selecionar as plantas assim transformadas nas gerações T0-T4 para resistência a insetos, herbicidas e/ou doenças fúngicas;

f) transformação genética das plantas obtidas na etapa a-d ou na etapa a'-d com um ou mais vetores que compreendem cassetes de expressão que expressam em sementes genes do metabolismo de ácidos graxos selecionados do grupo que consiste em acetil-CoA carboxilase (ACCase), diacil-glicerol aciltransferase (DGAT), lisofosfatidase acil transferase (LPAT), proteína transportadora de acila (ACP) fosfatidase fosfo-hidrolase (PAPase), malonil-CoA:ACP transacilase, cetoacil-ACP sintase (KAS), cetoacil-ACP redutase, 3-hidroxiacil-ACP desidrase, enoil-ACP redutase, estearoil-ACP desaturase, acil-ACP tioesterase, glicerol-3-fosfatoaciltransferase, 1-acil-snglicerol-3-fosfato aciltransferase, citidina-5-difosfato-diacilglicerol sintase, fosfatidil glicerofosfato sintase, fosfatidil glicerol-3-fosfato fosfatase, FAD1-8 desaturase, fosfatase do ácido fosfatidico, monogalactosil diacil glicerol sintase, digalactosil diacil glicerol sintase, proteína de biossíntese de sulfolipideo, acil-coA sintase de cadeia longa, glicerol-3-fosfato aciltransferase (GPAT), diacilglicerol colinafosfo transferase, fosfatidilinositol sintase, acilCoA diacilglicerol aciltransferase, acil-ACP desaturase, lineoil desaturase, esfingolipideo desaturase, oleato 12-desaturase, acetilenase de ácido graxo, epoxigenase de ácido graxo, diacilglicerol quinase, colinafosfato citidil transferase, colina quinase, fosfolipase, fosfatidilserina decarboxilase, fosfatidilinositol quinase, cetoacil-CoA sintase, fator de transcrição de CER, oleosina, 3-cetoacil-CoA tiolase, acil-CoA desidrogenase, enoil-CoA hidratase, acilCoA oxidase, seguido pela seleção das plantas na geração T0-T4 para características tais como conteúdo de óleo total na semente e composição de ácido graxo do mesmo;

g) cruzamento dos materiais obtidos nas etapas a-f ou a'-f e seleção das progênies resultantes para características tais como: alta produtividade de semente, elevado conteúdo de óleo na semente, composição variável de ácido graxo no óleo dependendo do uso pretendido, resistência a insetos, resistência a herbicidas e resistência a fungos.

As plantas nas etapas compreendidas entre b e f podem, por exemplo, ser selecionadas pela presença de características que podem ser apontadas por análise química tal como o conteúdo total de óleo na semente e/ou o conteúdo de componentes ácidos únicos na semente e/ou o conteúdo de proteína da semente.

Um objetivo adicional da invenção é um método para extrair óleo das sementes de tabaco, em que o rendimento do óleo é igual a valores de a 95% do óleo contido nas ditas sementes, compreendendo as seguintes etapas:

a) extrair mecanicamente o dito óleo pela prensagem produzindo o óleo e uma torta de óleo residual;

b) filtrar o dito óleo produzido na etapa a) com filtros de papel ou de tecido.

O método acima indicado tem, surpreendentemente, um rendimento maior do que 70%, o que é um rendimento totalmente inesperado após o uso dos ditos métodos de prensagem sobre sementes tão pequenas quanto às sementes de tabaco. Na presente invenção, em que plantas que têm uma alta produção de semente são selecionadas com o objetivo de aumentar a produção de óleo de tabaco por planta, a descoberta de que o método de prensagem aplicado sobre as sementes de tabaco tem um rendimento comparável ao rendimento obtenível com sementes de maior tamanho, tem aplicações extremamente vantajosas.

Além dos menores custos de produção e dos rendimentos totalmente inesperados dado o avanço tecnológico, o dito método possibilita extrair o óleo de tabaco diretamente em locais onde ele pode ser usado com propósitos energéticos.

Em uma modalidade, a semente da invenção pode ser submetida à prensagem a frio usando uma prensa helicoidal ou outro tipo de prensa, carregada com as sementes. A prensa pode atingir temperaturas até cerca de 60° quando ela é constantemente operada e o óleo prensado a parir da semente é coletado e filtrado sobre filtros de papel ou filtro-prensa de tecido. Outros sistemas de prensagem adequados para as sementes podem ser usados para prensar sementes de tabaco.

A fim de melhorar o rendimento do método da invenção, onde a produtividade de óleo da semente é para ser explorada ao máximo, é possível realizar uma etapa adicional de

c)extrair quimicamente com solventes o óleo residual presente na torta de óleo obtida na etapa a).

Tabela 2. Características do óleo de tabaco obtido pela prensagem da semente e filtração. A tabela aponta o grande valor calorífico bruto, o 5 baixo conteúdo de enxofre, a baixa viscosidade quando comparado com outros óleos vegetais.

Determinação	Resultado	Mis. Un.	Métodos
Ponto de combustão	236,0	°C	UNI EN ISO 27 19 2005
Enxofre	<0,01	%m/m	ISO 8754 1992
Cinzas	0,005	%m/m	EN ISO 6245 2002
Viscosidade a 50°C	21,630	mm2/s	UNI EN ISO 3104 200
Ponto de fusão	-18	°C	ISO 3016 1994
Valor calorífico	9,670	Kcal/Kg	ASTM D240-97
Massa volumétrica a 15°C	925,0	Kg/m3	UNI EN ISO 3675 2002
Valor de saponifica- ção	193,6	mg KOH/g	ASTM D94-02

Também é um objetivo da presente invenção o uso das plantas da invenção e/ou de suas sementes na produção de combustíveis líquidos ou sólidos, biodiesel, lubrificantes industriais, materiais plásticos tais como linóleo, suplementos alimentares para rações animais, suplementos alimentares para uso humano.

As plantas da invenção, de fato, mostram características que são extremamente vantajosas na produção dos ditos produtos como:

- elas produzem um óleo obtido pela prensagem que ó ideal, 15 mesmo sem refinamento já que uma simples filtragem é suficiente, para ser usado como óleo combustível já que ele tem um aspecto límpido, uma viscosidade cinemática a 40°C de 29,11 mm2/s e a 50°C de 21,63 mm2/s e um conteúdo de enxofre menor do que 0,01%, entrando numa classe com características físicas e termodinâmicas muito boas;

- elas produzem um óleo,obtido pela prensagem da semente que, mesmo na modalidade mais simples da invenção, sem a transformação para a expressão de genes do metabolismo de ácidos graxos indicados acima, pode ser usado para a produção de biodiesel uma vez misturado, por exemplo, com 25% de óleo de palma ou com outros percentuais de óleo vegetal que tenha um título de iodo menor, a fim de diminuir o valor do iodo abaixo do valor de 120 e que, na modalidade que compreende a expressão de um ou mais dos ditos genes com o objetivo de alterar o metabolismo dos ácidos graxos, pode ser usado diretamente para transformá-lo em biodiesel, que tem uma quantidade de iodo igual a 120, ou melhor, igual a 100, ou melhor ainda, igual a 80;

- elas produzem uma torta de óleo resultante da prensagem da semente, que tem um conteúdo de óleo de forma variável entre 6 a 12% e um conteúdo de proteína de cerca de 35%, que é ideal para suplementar dieteticamente rações de animais dado ao seu alto conteúdo de ácidos graxos ômega 6 (ácido linoleico);

- elas produzem uma torta de óleo resultante da prensagem da semente que, como uma alternativa ao seu uso como ração animal, pode ser usado como combustível sólido em fábricas que trabalham com carvão ou pélete de biomassa devido ao seu valor calorífico maior do que 4950 kcal/kg;

- elas produzem um óleo com um ponto de ignição de 236°C e um ponto de fusão de -18°C sendo assim adequado para uso como um lubrificante não poluente, por exemplo, para correntes de motosserra, ou como lubrificantes em geral;

- elas produzem um óleo que, levando em consideração sua composição abundante em ácidos graxos polinsaturados (C18:2, PUFA) que são essenciais para humanos e são portanto requisitados para propósitos de saúde (ômega 6), podem ser usados como alimento ou suplemento dietético para humanos;

- elas produzem uma biomassa residual (folhas, caules, inflorescências, revestimento de cápsulas) após a coleta da semente, que pode alcançar valores de 10.000 kg (100 quintais) por hectare ou melhor, 20.000 kg (200 quintais) por hectare ou melhor ainda, 30.000 kg (300 quintais) por hec23 tare com a possibilidade de aperfeiçoamento posterior do rendimento por hectare;

- elas produzem uma biomassa residual que pode ser utilizada para usos normalmente atribuídos a ela, tais como, por exemplo, gaseificação, combustão, pirólise, digestão anaeróbica, fermentação ou procedimentos de explosão a vapor, contribuindo assim para melhorar o rendimento econômico da cultura.

Consequentemente, o objetivo da invenção é o uso das plantas da invenção em geral para a produção em grande escala de sementes de tabaco.

O uso das ditas plantas e/ou sementes para a produção de óleo de tabaco é um objetivo da invenção.

Também é um objetivo da invenção o uso de plantas e/ou sementes para a preparação de óleo baseado em tabaco ou combustíveis que consistem essencialmente em óleo de tabaco para ebulidores e motores a diesel.

Em uma modalidade particularmente vantajosa da invenção, o dito óleo de tabaco é obtido pelo método da prensagem da invenção e não por extração com solvente.

O método de extração da invenção, de fato, permite a produção de um óleo que é diretamente utilizável como combustível devido ao fato de que o dito óleo tem uma viscosidade cinemática de 29,11 mm2/s a 40°C e de 21,63 mm2/s a 50°C, o que permite nebulizá-lo em queimadores sem a necessidade de um tratamento fluidificante preaquecimento.

Um objetivo adicional da invenção é o uso das plantas e/ou das sementes da invenção para a preparação de biodiesel pela mistura de óleo de semente de tabaco com, por exemplo, 25% de óleo de palma ou com outros percentuais de óleos de planta, reduzindo o título final de iodo. A produção de biodiesel de acordo com a invenção pode ser realizada misturando o óleo de tabaco extraído pelo método acima descrito (prensagem) com óleos de plantas capazes de diminuir seu título de iodo para um valor igual ou menor do que 120.

Também é um objetivo da invenção o uso de plantas e/ou sementes da invenção na preparação de óleo de semente de tabaco que tem um título de iodo igual ou menor do que 120 sem a realização de qualquer procedimento direcionado a reduzir o título de iodo no óleo extraído de acordo com o método da invenção. Nessa modalidade da invenção, as plantas transgênicas e/ou as sementes transgênicas que expressam um ou mais genes, entre aqueles listados acima, do metabolismo de ácidos graxos de acordo com a invenção, produzindo um óleo de tabaco que tem um título de iodo igual ou menor do que 120, são usadas.

Nesse caso, portanto, nenhum processo de refino ou de tratamento do óleo será realizado após a prensagem de acordo com a invenção, a fim de diminuir o título de iodo do óleo assim obtido. O biodiesel de acordo com a invenção pode, portanto, ter uma composição de 100% de óleo de tabaco. O biodiesel será obtido a partir do óleo de tabaco de acordo com os procedimentos normais de transesterificação com metanol conhecidos pela pessoa versada na técnica.

Em uma modalidade da invenção, o biodiesel consistirá totalmente de óleo de tabaco que tem um título de iodo inferior a 120, ou igual ou menor do que 100 ou mesmo igual ou menor do que 80, o dito óleo sendo transesterificado com metanol de acordo com os métodos conhecidos pela pessoa versada na técnica.

Também é um objetivo da invenção o uso de plantas e/ou sementes da invenção para a preparação de combustíveis sólidos para fábricas que funcionam com carvão ou pellets de biomassa. Nesse caso, a biomassa resultante da cultura pode ser usada, a dita biomassa tendo um valor calorífico maior do que 4200 kcal/kg.

Também é um objetivo da invenção os combustíveis obteníveis como indicado acima, isto é, combustíveis que compreendem a torta de óleo obtida pela prensagem das sementes de tabaco.

Alternativamente, as plantas e/ou sementes da invenção podem ser usadas para a preparação de suplementos dietéticos para rações animais. A torta de óleo resultante da prensagem das sementes de tabaco de acordo com a invenção, tem um conteúdo de óleo entre cerca de 6% a cerca de 12% e um conteúdo de proteína de cerca de 35% do peso da torta de óleo e um conteúdo elevado de ácidos graxos ômega 6 (ácido linoleico) que o torna ideal para o dito objetivo. Em experimentos realizados com leitões, a substituição da farinha de proteína de soja pela torta de óleo de tabaco em percentagens variáveis entre 3% a 7% em dietas isoproteicas, não mostrou diferenças significativas no desenvolvimento dos animais.

Em uma modalidade adicional da invenção, as plantas e/ou sementes da invenção podem ser usadas para a preparação de lubrificantes não poluentes. Por exemplo, o óleo obtido com o método da invenção, a partir de plantas que produzem a semente da invenção que não tem outras modificações além das mutações para o aspecto do caráter básico (isto é, a alta produção de semente) mostra um ponto de ignição de 236°C e um ponto de fusão de -18°C, características que o tornam adequado para o uso como um lubrificante não poluente, por exemplo, para correntes de motosserra ou para motores em geral.

Em uma modalidade adicional, as plantas e/ou sementes da invenção podem ser usadas para a preparação de alimentos ou suplementos alimentícios para uso humano.

Nesse caso, o óleo obtido pelo processo da invenção, será refinado posteriormente a fim de eliminar ceras, gomas, carboidratos complexos, fosfolipídeos e de-acidificados. Uma vez refinado, ele pode ser usado como tal ou como suplemento alimentício para uso humano. A vantagem do dito uso é dada pela riqueza do dito óleo em ácidos graxos polinsaturados (C18:2, PUFA) que são essenciais para humanos e que são necessários por razões de saúde )ômega 6).

É óbvio que todas as modalidades que tenham por objetivo o uso de óleo de sementes de tabaco, obtido preferivelmente pela prensagem, ou da torta de óleo resultante da prensagem da semente, podem ser realizadas também em plantas de tabaco não mutagenizadas. A vantagem inquestionável das plantas da invenção é dada obviamente pelo alta produção de semente e pelo maior rendimento resultante do produto obtenível pelas plan26 tas da invenção e por suas sementes comparado com o rendimento obtenível com plantas de tipo selvagem e sementes de tabaco plantadas em uma área de cultivo comparável e com métodos de cultivo comparáveis.

O uso de óleo de tabaco para a preparação de lubrificantes, suplementos dietéticos para humanos ou animais nunca foi descrito na técnica. Obviamente, todas as modalidades nas quais um óleo que tem um título de iodo igual ou menor do que 120 extraído por prensagem e sem ser adicionalmente tratado, também nunca foram descritas.

As plantas da invenção também mostram uma biomassa residual (folhas, caules, cápsulas e revestimentos de inflorescência) que, após a coleta das sementes, pode alcançar valores entre 10.000 e 30.000 kg ou mais por hectare (100 a 300 quintais), o uso das plantas como uma fonte de biomassa para gaseificação, combustão, pirólise, digestão anaeróbica, fermentação ou procedimentos de explosão a vapor, como descrito na técnica a fim de aumentar o rendimento econômico da cultura, é portanto um objetivo da invenção.

São também objetivos da invenção: um óleo de semente de tabaco obtenível a partir de sementes de plantas da invenção com o método de extração da invenção, um biodiesel obtido pela transesterificação do dito óleo, combustíveis compreendendo o dito óleo, suplementos alimentícios para humanos derivados do dito óleo adicionalmente refinado, lubrificantes compreendendo o dito óleo, óleo de semente de tabaco obtenível a partir de sementes das plantas da invenção pelo método de extração da invenção caracterizado em que ele tem um título de iodo igual ou menor do que 120 sem a necessidade de misturá-lo com outros óleos para a diminuição do dito título, biodiesel compreendendo o dito óleo que tem um título de iodo igual ou menor do que 120.

EXEMPLOS

EXEMPLO 1

Mutagênese química

A semente da variedade selecionada para a indução de mutantes por mutagênese química foi colocada em um frasco de 100 ml na quanti27 dade de 20 g por experimento, correspondendo a cerca de 200.000 sementes. 50 ml de água deionizada foram adicionados ao frasco e as sementes foram re-hidratadas por 14 horas a 25°C. A água foi então substituída por uma solução aquosa de EMS 0,5%. As sementes foram agitadas com um magneto por um período variável entre 0,5 a 5 horas, dependendo da variedade, que em testes preliminares mostrou uma frequência de mutação muito elevada para os caracteres morfológicos tais como altura da planta, dimensões da semente, formato da folha, número de cápsulas, produção de semente por planta, etc.

Uma vez que o período de tratamento foi finalizado, a solução mutagênica foi descartada vertendo as sementes em uma peneira fina e enxaguando-as por vários minutos em água corrente. Subsequentemente, as sementes foram lavadas por 6 vezes em um frasco, pela adição de 50 ml de água e agitando-as por 10 minutos a cada enxágue.

As sementes foram então secas sobre um filtro de papel e foram remetidas para uma firma especializada para peletização.

As sementes peletizadas tinham um diâmetro final de 1,2 mm e foram usadas para direcionar a semeadura em campo (M-ι) com densidade de 100.000 plantas por hectare. A geração Mi foi deixada florescer e foi examinada para a possível presença de mutações dominantes e, uma vez que as sementes amadureceram, uma cápsula por planta foi colhida manualmente a fim de obter a massa de semente que foi usada para a semeadura em campo aberto no ano seguinte e para o rastreamento fenotípico da geração M2. Cada mutante de interesse foi singularmente colhido e controlado nas gerações seguintes.

EXEMPLO 2

Indução de variantes somaclonais

A semente da variedade selecionada para indução de variantes somaclonais foi esterilizada pela imersão por 5 minutos em uma solução de hipoclorito de sódio 20% seguida por uma imersão por 1 minuto em etanol 70% seguida por 5 lavagens em água estéril. A semente foi deixada germinar em recipientes plásticos retangulares com 10 cm de lado e 12 cm de al28 tura contendo meio MS agarisado. Das plantas completamente desenvolvidas, partes de 0,5 cm de lado de folha foram cortadas e colocadas em discos de Petri com meio MS1 (MS + 1 mg/l 2,4-D) a fim de induzir a formação de calo. Indivíduos F-ι obtidos de cruzamentos interespecíficos também foram usados. O calo coletado dos discos de folha foi colocado em meio MS1 líquido em frascos de 250 ml contendo 50 ml de meio e agitados a 80 rpm em uma placa rotatória mantida a 28°C com 16 horas de fotoperíodo.

O calo foi mantido em cultura líquida por várias gerações renovando a cultura a cada 20 dias e inoculando 50 ml de meio líquido novo com 2,5 ml da cultura precedente. A cada geração, uma parte do calo era distribuída sobre discos de Petri contendo meio MS2 agarisado )MS1 + 1 mg/l NAA + 1,5 mg/l Kinetin) a fim de induzir a formação de brotos que, uma vez alcançados 2 cm de altura, foram transferidos para meio MS3 (MS1 + 1 mg/l IBA) para enraizar e para a transferência subsequente em um vaso para um estufa. As variantes obtidas foras rastreadas nas gerações Ri e R2 e as dimensões das folhas, o formato das folhas, as dimensões da cápsula, o número de sementes por cápsula, o conteúdo de óleo das sementes, etc, foram relacionados.

EXEMPLO 3

Cruzamento e duplicação cromossômica

Várias espécies de Nicotiana são sexualmente compatíveis com Nicotiana tabacum e, mesmo que o produto do cruzamento seja estéril, é possível retrocruzar usando as plantas parentais como polinizadoras ou induzir a formação de anfidiplóides. Nessa espécie, o trabalho é facilitado pelo fato de que é possível obter populações de híbridos F1 intergenéricos com vários milhares de indivíduos, permitindo realizar o aperfeiçoamento do programa baseado nos anfidiplóides. Os cruzamentos foram feitos usando ambas as espécies parentais de Nicotiana spp. que têm o mesmo número de cromossomos (por exemplo, N. paniculata x N. solanifolia, N. tabacum x N.rústica) ou um número diferente de cromossomos (por exemplo, N.tabacum x N. paniculata, N. tabacum x N. longiflora). Os indivíduos F1 obtidos por alguma combinação de cruzamento foram cultivados em uma estu29 fa, a fim de verificar suas características fenotípicas e cruzá-las com ambas as plantas parentais, assim como deixá-los germinar in vitro e micropropagar. O material micropropagado foi usado para a realização de experimentos de duplicação cromossômica pelo tratamento com colchicina dos brotos em fase de reprodução ou mais tarde após o transplante para um vaso e antes da florescência. Os brotos das sementes germinadas foram cortados na base e transferidos para meio MS contendo 2 mg/l de benzilaminopurina (BAP). Após 4 a 5 semanas, os brotos laterais foram removidos e mantidos no mesmo meio. A fim de obter plantas completas, a transferência foi realizada em meio MS sem hormônios a fim de induzir a formação de raízes. Após alguns dias a partir da transferência dos brotos cortados para o meio enraizante, uma gota de solução de colchicina 0,5% foi colocada sobre os mesmos. Uma vez que as plantas enraizaram, elas foram transferidas para vasos em uma estufa e deixadas florescer a fim de verificar sua fertilidade e sua capacidade de formação de sementes viáveis. Em alguns casos, a fim de possibilitar a hibridização entre espécies diferentes, foi necessário duplicar os haplóides e realizar a hibridização em autotetraplóides.

O material obtido pelo retrocruzamento de gerações ou pela propagação in vitro seguida pela duplicação de cromossomo foi rastreado quanto as suas características fenotípicas e opcionalmente usado para programas de aperfeiçoamento genético.

O controle do número de cromossomos nas linhagens anfidiplóides estabilizadas foi realizado usando o ápice da raiz.

EXEMPLO 4

Transformação genética mediada por Agrobacteríum tumefasciens

Dia 1: uma pequena quantidade de Agrobacteríum tumefasciens da cepa EHA 105 contendo o plasmídeo de interesse, coletada de uma cultura sobre disco de Petri com manuseio estéril, foi inoculada em 2 ml de meio LB estéril. Subsequentemente, uma folha de uma planta saudável não apresentando alterações de forma alguma e mostrando, por outro lado, condições ideais de turgidez foi colhida. A folha foi rapidamente enxaguada em água bidestilada a fim de eliminar as impurezas superficiais e mergulhada em uma solução de hipoclorito de sódio 20%, SDS 0,1% por 8 minutos e deixada secar sob condições estéreis. Em particular, a folha foi mergulhada em etanol 95% e agitada a fim de umedecer completamente ambos os lados por cerca de 30 a 40 seg. A folha foi deixada secar completamente.

Com um furador esterilizado com etanol, discos de toda a superfície da folha foram obtidos e foram colocados sobre placas contendo MS10 sem antibióticos; em detalhe, foram colocados não mais do que 30 discos por placa. Subsequentemente, 2 ml de MB mais Agrobacterium (recéminoculada) foram vertidos sobre a placa e a suspensão bacteriana foi uniformemente espalhada com um movimento rotatório leve a fim de obter uma distribuição homogênea de bactéria sobre os discos. O LB em excesso foi cuidadosamente aspirado com uma pipeta. Um controle negativo onde nenhum ou pouco LB foi adicionado foi realizado.

As placas foram incubadas por 24-48 horas a 28°C, com iluminação constante e o crescimento bacteriano foi indicado pelo aparecimento de um halo fino opaco difuso sobre toda a placa.

Dia 2: os discos de folha foram cuidadosamente transferidos para uma placa contendo MS10 + cefotaxima 500 mg/l, e incubados por 6 dias a 28°C, com iluminação constante. Essa etapa determina a inativação da Agrobacterium.

Dia 8: os discos de folha foram cuidadosamente transferidos para MS10 + cefotaxima 500 mg/l e canamicína 200 mg/l, e incubados por 14 dias a 28°C, com iluminação constante. Essa etapa determina a seleção das plantas transformadas por que o gene de resistência a canamicína é carregado pelo plasmídeo inserido na Agrobacterium.

Dia 22: os discos de folha que se desenvolveram nesse meio tempo, portanto formando um calo, foram cuidadosamente transferidos para MS10 + cefotaxima 500 mg/l, canamicína 200 mg/l e carbenicilina 500 mg/l, e incubados por 6 dias Essa etapa determina a eliminação da agrobactéria que possivelmente tenha sobrevivido aos tratamentos com antibióticos precedentes.

Dia 28: os discos de folha foram transferidos mais uma vez para

MS10 + cefotaxima 500 mg/l e canamicina 200 mg/l, e incubados até o aparecimento dos brotos. Uma vez que os brotos apresentaram pelo menos duas folhas, eles foram separados da massa de calo e transferidos para um meio de enraizamento com MSO + cefotaxima 500 mg/l e canamicina 200 mg/l.

Uma vez que as raízes apareceram, as pequenas plantas foram extraídas das placas, liberadas dos resíduos de agar, cuidadosamente enxaguadas em água corrente e plantadas em pequenos vasos de plástico com terra e areia (2:1). O solo foi previamente saturado com água, subsequentemente os vasos foram cobertos com tampas de plástico transparente a fim de manter condições de alta umidade e foram colocados em uma câmara de crescimento a 25°C com períodos de luz diários de 16 horas.A presença do transgene foi rastreada em todas as plantas pela coleta de uma porção da folha (250 mg), extração de DNA e realização de uma primeira análise de PCR e, então, nas plantas positivas foi realizada uma análise Southern a fim de verificar o número de cópias do transgene.

EXEMPLO 5

Extração de óleo da semente.

A semente de tabaco produzida por certas variedades selecionadas foi usada para a produção de óleo. Em um caso, a semente analisada tinha um conteúdo de umidade de 7,01% e um conteúdo de substâncias graxas (extração com hexano) de 39,4%. A extração do óleo foi realizada como uma extração a frio, usando uma prensa helicoidal modelo Komet (IBG, Alemanha), carregada manualmente com as sementes de tabaco. No estado estacionário, a prensa atingiu e manteve uma temperatura de 60°C. Após a prensagem, o óleo foi filtrado sobre papel e mostrou boas características de limpidez. O rendimento do óleo extraído provou ser 81,1% do total de óleo contido na semente. A torta de óleo residual tinha um conteúdo de óleo de 0,74% e um conteúdo de proteína de 34,5% .

EXEMPLO 6

Testes de combustão

O óleo extraído a frio e filtrado com filtros de papel como no e32 xemplo 5, foi transesterificado com álcool metílico na presença de NaOH. O óleo foi aquecido até 55°C e a solução de metanol-NaOH foi adicionada e misturada por 90 minutos. No final dessa etapa, após o resfriamento, a mistura foi deixada estratificar, separando assim a camada inferior de glicerol do éster. O éster foi lavado duas vezes com água e na primeira lavagem foi adicionado ácido fosfórico (2,5 ml/litro) a água. No final do processo, o óleo foi aquecido sob vácuo a 90°C a fim de remover todos os resíduos de água e o éster obtido foi denominado com a abreviação TOE (Ester de Óleo de Tabaco). Os testes foram realizados com um motor de injeção indireta a diesel (detalhes: 4 cilindros, bomba de injeção rotatória, taxa de compressão 21,5:1, força máxima 55kW a 4500 rpm). Antes dos testes de combustão, parâmetros analíticos tais como viscosidade a 50°C (21,63 mm2/s), ponto de fusão (-18°C), valor calorífico superior (9,670 kcal/kg), massa volumétrica a 15°C (925,0 kg/m3), enxofre (<0,01 % m/m), cinzas (0,005 % m/m) foram verificados. Durante o teste, um analisador de gás e um dinamômetro hidráulico foram usados. O éster do óleo foi usado misturado em 20% com diesel, que tem as seguintes características principais em comparação com TEO (indicadas entre parênteses): densidade 840,8 (886,6), viscosidade a 40°C 2,9 (3,3), conteúdo de enxofre (mg/kg) 6,750 (6). Os resultados do teste não apontaram variações detectáveis no desempenho do motor usando os dois produtos e mostrou uma combustão mais complete o que resultou em uma eficiência térmica maior quando o diesel foi adicionado a TEO. O aumento da potência máxima foi observado com 2,200 rpm com um aumento de 3,5% em comparação com o diesel puro (29,86 kW contra 28,85 kW). O CO produzido é menor na mistura em comparação com o diesel puro e também o conteúdo de enxofre é menor, o que determina uma diminuição na emissão de SO₂ (até 40%).

EXEMPLO 7

Testes de alimentação de animais

A torta de óleo obtida da prensagem das sementes de tabaco foi analisada a fim de avaliar sua adequabilidade para uso como um suplemento dietético proteico para rações animais. Os dados analíticos da torta de óleo resultante da prensagem mostraram um conteúdo de substâncias graxas de 10,74%, um conteúdo de proteína de 34,5% e uma umidade e substâncias voláteis de 5,97%. Os aminoácidos totais após a hidrólise da amostra são: ácido aspártico 2.40%, treonina 1.06%, serina 1.17%, ácido glutamico 5.53%, prolina 0.83%, glicina 1.29%, alanina 1.18%, valina 1.27%, metionina 0.45%, isoleucina 1.13%, leucina 1.84%, tirosina 0.97%, fenilalanina 1.43%, histidina 0.72%, lisina 0.72%, arginina 3.36%. Do conteúdo total de substancias graxas, 76,59% consistem de ácido linoleico que se correlaciona com a classe Ômega 6, que tem relevância particular para a dieta animal.

O teste de alimentação foi realizado com leitões que tinham um peso inicial de cerca de 8 kg, divididos em dois grupos, cada um com 20 indivíduos, um grupo de controle alimentar com uma alimentação que tem suplemento de proteína de soja (C), o segundo grupo tem a mesma quantidade de proteína com relação ao primeiro, em que a soja foi parcialmente substituída por 3% de torta de óleo de tabaco (T). Os animais tratados com a torta de óleo não mostraram quaisquer problemas no início e ao longo da duração do teste com a ingestão do dito alimento. O teste foi monitorizado constantemente e os leitões cevados não mostraram problemas gastrointestinais. Os animais mostraram um ganho de peso diferente diariamente (237 g/cabeça/dia com torta de óleo de tabaco, 170 g/cabeça/dia com torta de óleo de soja), e um peso final, após 27 dias, de 15,2 kg para T e 12,8 para C.

Claims (9)

1. REIVINDICAÇÕES

   1. Uso de uma planta de tabaco mutagenizada que produz uma quantidade de sementes de pelo menos 2.000 kg (20 quintais) por hectare em uma densidade de semeadura de cerca de 125.000 plantas/hectare que é adi5 cionalmente modificada no metabolismo de ácido graxo por transformação genética e pelo fato de que produz uma semente que contém um título de iodo menor ou igual a 120 ou que é adicionalmente modificada no metabolismo de ácido graxo por transformação genética e pelo fato de que produz uma semente que contém um percentual de óleo compreendido entre cerca de 40% a cer10 ca de 60% da semente, caracterizado pelo fato de que é para a produção de sementes para a fabricação de óleo de tabaco, óleos combustíveis, biodiesel, suplementos alimentícios para animais, combustíveis sólidos, suplementos alimentícios para humanos, lubrificantes.
2. 2. Uso da planta como definida na reivindicação 1, caracterizado

   15 pelo fato de que é para a produção de biomassa para conversão bioquímica ou para conversão termoquímica por combustão direta, carbonização, pirólise, gaseificação, digestão anaeróbica, digestão aeróbica, fermentação alcoólica ou procedimentos de explosão a vapor.
3. 3. Método para produção de uma planta de tabaco mutagenizada

   20 que produz uma quantidade de sementes de pelo menos 2.000 kg (20 quintais) por hectare a uma densidade de semeadura de cerca de 125.000 plantas/hectare, caracterizado pelo fato de que compreende as seguintes etapas:

   a) submeter à mutagênese sementes produzidas por cruzamentos iniciais entre indivíduos da mesma espécie que pertencem a variedades de tipo

   25 selvagem ou selecionadas;

   b) permitir que as ditas sementes germinem e selecionar as plantas das gerações M2-M4 de acordo com os seguintes parâmetros:

   i) presença de uma ou mais características fenotípicas evidentes selecionadas entre: altura da planta de 80 a 120 cm, folhas com lâmina fina e

   30 orientação superior direita, inflorescência compacta, flores em número superior a 100, cápsulas em número superior a 100, número de sementes por cápsula maior do que 5000, caule lignificado e robusto, raízes profundas;

   Petição 870170094841, de 06/12/2017, pág. 6/12 ii) estabilidade do caráter selecionado nas gerações seguintes a M2;

   iii) verificação da hereditariedade do caráter selecionado;

   c) permitir a germinação das sementes selecionadas na etapa b) e 5 regenerar as plantas iniciando a partir do calo do mesófilo foliar induzido in vitro na presença de fitormônios e selecionar as plantas que mantenham as características selecionadas na etapa b) nas gerações R0-R2;

   d) semear em campo aberto as plantas selecionadas na etapa c) e selecionar posteriormente as plantas que produzem pelo menos 2000 kg (20

   10 quintais) de sementes por hectare.
4. 4. Método de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que a etapa a) é substituída pela etapa a') produzir sementes mutagenizadas pela realização de cruzamentos interespecíficos no gênero Nicotiana, seguido pelo retrocruzamento dos

   15 indivíduos F1 ou pela indução de anfidiplóides pelo tratamento do ápice vegetativo das plantas produzidas pelos ditos cruzamentos com colchicina.
5. 5. Método de acordo com a reivindicação 3 ou 4, caracterizado pelo fato de que compreende ainda as seguintes etapas:

   e) transformar as plantas obtidas na etapa d) com vetores que 20 compreendem cassetes de expressão que expressam em genes de plantas resistência a insetos, herbicidas e/ou doenças fúngicas e selecionar as plantas assim transformadas nas gerações T0-T4 resistentes a ou doenças fúngicas e/ou;

   f) transformar as plantas obtidas na etapa d) com um ou mais veto25 res que compreendem cassetes de expressão que expressam o metabolismo de ácidos graxos em genes de sementes, seguida pela seleção das plantas transformadas nas gerações T0-T4 quanto a características tais como conteúdo total de óleo das sementes e composição de ácidos graxos das mesmas;

   g) cruzar as plantas obtidas nas etapas e) e/ou f) e selecionar a 30 progênie resultante quanto a uma ou mais características selecionadas no grupo: grande habilidade na produção de semente em uma quantidade superior a 4000 kg (40 quintais) por hectare, conteúdo de óleo da semente superior a

   Petição 870170094841, de 06/12/2017, pág. 7/12

   42%, título de iodo no óleo obtido das sementes da dita progênie inferior a 120, composição de ácidos graxos do óleo contido nas ditas sementes da progênie variável com relação à planta de tipo selvagem, resistência a insetos, resistência a herbicidas, resistência a fungos.
6. 6. Uso de uma semente da planta como definida na reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que é para a produção de óleo de tabaco, óleos combustíveis, biodiesel, suplementos alimentícios para animais, combustíveis sólidos, suplementos alimentícios para humanos.
7. 7. Método de extração de óleo das sementes de tabaco, caracterizado pelo fato de que compreende as seguintes etapas:

   a) extrair mecanicamente óleo de sementes de uma planta de tabaco como definida na reivindicação 1 pela prensagem com uma prensa helicoidal e obter o óleo e uma torta de óleo residual;

   b) filtrar o dito óleo extraído na etapa a) com filtros de papel ou de tecido;

   em que o rendimento do óleo está entre 70 e 95% do óleo contido nas ditas sementes.
8. 8. Método de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que compreende ainda a etapa de

   c) extrair quimicamente, pelo uso de solventes, o óleo residual contido na torta de óleo obtida na etapa a).
9. 9. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 ou 8, caracterizado pelo fato de que compreendendo ainda a etapa de

   d) refinar o óleo obtido nas etapas a) ou b) e c).

   Petição 870170094841, de 06/12/2017, pág. 8/12

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