BRPI0721792A2

BRPI0721792A2 - mÉtodos para modular proliferaÇço de condràcito usando campos elÉtricos pulsantes

Info

Publication number: BRPI0721792A2
Application number: BRPI0721792-7A
Authority: BR
Inventors: James W Kronberg; Stephen L Gordon; Timothy Ganey; Robert James Fitzsimmons
Original assignee: Medrelife Inc
Priority date: 2007-06-11
Filing date: 2007-06-12
Publication date: 2013-02-13
Also published as: WO2008153520A1; IL202632A0; US20080039901A1

Abstract

MÉTODOS PARA MODULAR PROLIFERAÇçO DE CONDRàCITO USANDO CAMPOS ELÉTRICOS PULSANTES. São fornecidos composições e métodos para modular o crescimento, desenvolvimento e reparo de cartilagem, osso ou outro tecido conjuntivo. São fornecidos dispositivos e formas de onda de estímulo para modular diferencialmente o comportamento de condrócitos, osteoblastos e outras células do tecido conjuntivo para promover a proliferação, diferenciação, formação o mineralização de matriz para aplicações in vitro ou in vivo. Pode ser usado estimulo em modo contínuo e em modo de rajada de pulsos das células com sinais com carga equilibrada. O crescimento da cartilagem, osso e outro tecido conjuntivo é estimulado, em parte, pela liberação de óxido nítrico através de estímulo elétrico e pode ser moduladeo através de co-administração de doadores de No e de inibidores da sintase de NO. Os métodos e dispositivos descritos são usados na promoção do reparo de fraturas ósseas, no reparo da cartilagem e do tecido conjuntivo, bem como para engenharia de tecido para transplante.

Description

"MÉTODOS PARA MODULAR PROLIFERAÇÃO DE CONDRÓCITO USANDO CAMPOS ELÉTRICOS PULSANTES"

Referência Cruzada a Pedidos Relacionados

Este pedido reivindica o benefício do pedido de patente US intitulado "METHODS FOR MODULATING CHONDROCYTE PROLIFERATION USING PULSING ELECTRIC FIELDS", depositado em 11 de junho de 2007, número de série ainda não atribuído.

Campo Técnico

A presente invenção diz respeito a composições e métodos para modular o cresci- mento, desenvolvimento e reparo de osso, cartilagem ou outro tecido conjuntivo. Dispositi- vos e formas de onda de estímulo são fornecidos para modular diferencialmente o compor- tamento de osteoblastos, condrócitos e outras células do tecido conjuntivo para promover a proliferação, diferenciação, formação ou mineralização de matriz para aplicações in vitro ou in vivo. Estímulo em modo contínuo e em modo de rajada de pulsos de células com sinais com carga equilibrada pode ser usado. Os métodos e dispositivos descritos são usados na promoção do reparo de fraturas ósseas, reparo de cartilagem e do tecido conjuntivo, bem como para engenharia de tecido para transplante.

Antecedentes da Invenção

Doenças e lesões associadas com osso e cartilagem têm um significativo impacto na população. Aproximadamente cinco milhões de fraturas ósseas ocorrem anualmente so- mente nos Estados Unidos. Cerca de 10 % destas têm cura atrasada e, destes, 150.000 a 200.000 fraturas não união ocorrem acompanhadas pela perda de produtividade e indepen- dência. No caso de cartilagem, formas severas e crônicas de dano da cartilagem da articu- lação do joelho podem levar à maior deterioração da cartilagem da articulação e, conse- quentemente, podem levar a uma substituição total da articulação do joelho. Aproximada- mente 200.000 operações de substituição total do joelho são realizadas anualmente e, no geral, a articulação artificial dura somente 10 até 15 anos, levando a perdas similares na produtividade e na independência.

Além do mais, também espera-se que a incidência de fraturas ósseas permaneça alta, em vista da incidência de osteoporose como uma ameaça de saúde pública principal para uma estimativa de 44 milhões de norte americanos. Hoje, nos EUA, 10 milhões de indi- víduos são estimados para já ter a doença, e estima-se que mais quase 34 milhões tenham baixa massa óssea, os colocando em maior risco de osteoporose. Uma em cada duas mu- lheres e um em cada quatro homens acima de 50 anos terão uma fratura relacionada à os- teoporose no restante de suas vidas. Osteoporose é responsável por mais de 1,5 milhão de fraturas anualmente, incluindo: 300.000 fraturas no quadril; 700.000 fraturas vertebrais; 250.000 fraturas nos pulsos; e 300.000 fraturas em outros locais. Os gastos nacionais dire- tos estimados (hospitais e casas de repousos) para fraturas osteoporóticas no quadril foram de $ 18 bilhões em 2002 (National Osteoporosis Foundation Annual Report, 2002).

Diversos tratamentos estão atualmente disponíveis para tratar fraturas recalcitran- tes, tais como fixação interna e externa, enxertos ósseos ou substitutos de enxerto, incluindo matriz óssea desmineralizada, extratos de plaqueta e proteína da matriz óssea, e estímulo biofísico, tais como linhagem mecânica aplicada através de fixadores externos ou campos eletromagnéticos e ultrassônicos.

Tecido de cartilagem tem capacidade limitada para reparo após lesão. Defeitos não tratados na camada da cartilagem de uma articulação se curam fracamente ou simplesmen- te não se curam. A degradação do tecido que segue leva, inevitavelmente, à dor na articula- ção e à osteoartrite. Neste ponto, a abordagem clínica é, usualmente, apenas uma tentativa de reduzir a dor. Tentativas de reparar defeitos na cartilagem incluem incorporar condrócitos intensificados com fatores de crescimento, com a esperança de que a produção da matriz suporte a produção de carga, entretanto, os resultados foram fracos. Em alguns casos, a administração de fatores de crescimento inclui fatores, tais como fator de crescimento tipo insulina 1 (IGF-1) e fator de crescimento derivado de plaqueta, com sucesso somente mar- ginal. Tratamento típico para lesão de cartilagem, dependendo da severidade da lesão e do sintoma, são repouso e outros tratamentos conservadores, menores cirurgias artroscópicas para limpar e suavizar a superfície da área de cartilagem danificada, e outros procedimentos cirúrgicos, tais como microfratura, perfuração e abrasão. Todos estes podem fornecer alívio sintomático, mas o benefício é, usualmente, apenas temporário, especialmente se o nível de atividade pré-lesão da pessoa for mantido.

Osso e outros tecidos, tais como cartilagem, respondem a sinais elétricos de uma maneira fisiologicamente usada. Dispositivos de estímulo bioelétrico aplicados em não uni- ões e uniões atrasadas foram iniciados nos anos 1960 e, agora, são aplicados no osso e na cartilagem (Ciombor and Aaron, Foot Ankle Clin. 2005, (4):579-93). Atualmente, uma aceita- ção de mercado e geral de seus papeis na prática clínica foi estabelecida. Resultados me- nos bem conhecidos atribuídos a estímulo bioelétrico são mudanças positivas na densidade óssea (Tabrah, 1990), e prevenção da osteoporose (Chang, 2003). Um recente relatório ofereceu evidência adjuntiva de que o estímulo com campo eletromagnético pulsado (PEMF) acelera significativamente o osso formado durante a osteogênese de distração (Fredericks, 2003).

No presente, o uso clínico de eletroterapia para reparo ósseo consiste tanto em cor- rente contínua (CC) aplicada através de eletrodos implantados diretamente no interior do local do reparo, quanto em sinais de corrente alternada (CA) aplicados através acoplamento capacitivo ou indutivo não invasivo. Acoplamento indutivo é freqüentemente chamado de PEMF, que significa "campos eletromagnéticos pulsados". CC é aplicada por meio de um eletrodo (catodo) instalado no tecido alvo no local do reparo ósseo, e o anodo é colocado em tecidos macios. Correntes CC de 5-100 μΑ são suficientes para estimular a osteogêne- se. A técnica de acoplamento capacitivo usa eletrodos externos de pele instalados em lados opostos do local da fratura. Ondas senoidais de 20-200 Hz são tipicamente empregadas para induzir campos elétricos de 1-100 mV/cm no local do reparo.

A técnica do acoplamento indutivo (PEMF) induz um campo elétrico com tempo va-

riável no local do reparo pela aplicação de um campo magnético com tempo variável por meio de uma ou duas bobinas elétricas. O campo elétrico induzido age como um mecanis- mo de disparo que modula o processo normal de regulagem molecular de reparo ósseo me- diado por muitos fatores de crescimento. Bassett et ai., foram os primeiros a relatar que um sinal PEMF pode acelerar reparo ósseo em 150 % em um canino. Modelos experimentais de reparo ósseo mostram proliferação celular intensificada, calcificação e maior resistência me- cânica com correntes CC. Tais abordagens também detêm potencial para lesões de cartila- gem.

Tecido ferido tem um potencial elétrico em relação ao tecido normal. Sinais elétri- cos medidos em locais feridos, chamados de "lesão potencial" ou "corrente de lesão", são apenas CC (corrente contínua), mudando lentamente com o tempo. Reparo de fratura óssea e potenciais de recrescimento nervural são, tipicamente, mais rápidos do que o usual nas vizinhanças de um eletrodo negativo, mas mais lentos próximo de um positive, onde, em alguns casos, atrofia de tecido ou necrose pode ocorrer. Por este motivo, pesquisa mais recente focalizou em sinais de freqüência mais alta e mais complexos, freqüentemente, sem nenhum componente de CC líquida.

Infelizmente, a maior parte dos dispositivos eletroterapêuticos agora disponíveis se baseia na implantação direta de eletrodos, ou pacotes eletrônicos inteiros, ou no acoplamen- to indutivo através da pele usando bobinas que geram campos magnéticos com tempo vari- ável, desse modo, induzindo fracas correntes parasitas nos tecidos corpóreos que fornece ineficientemente o sinal para os tecidos e, assim, além de volumosas bobinas, exige gerado- res de sinal e pacotes de bateria relativamente grandes. A necessidade de cirurgia e materi- ais biocompatíveis em um caso, e excessiva complexidade circuito e energia de entrada no outro, mantém o preço da maior parte de tais aparelhos relativamente alto, e também res- tringe a aplicação de tais dispositivos a pessoal altamente treinado. Portanto, permanece uma necessidade de um aparelho versátil e econômico que pode ser usado para fornecer estímulo bioelétrico para modular diferencialmente o crescimento de tecido osteocondral para promover os apropriados desenvolvimento e cura.

Também são necessários métodos para a redução de dor na articulação usando dispositivos eletroterapêuticos não invasivos. Mais especificamente, dispositivos e procedi- mentos são necessários para impedir a perda de cartilagem e para a promoção de cresci- mento celular da cartilagem, incluindo, por exemplo, proliferação de condrócito. Além do mais, dispositivos e procedimentos são necessários para a promoção do crescimento da cartilagem afetando os componentes e mecanismos de desenvolvimento de condrócito.

Sumário da Invenção

De acordo com estes aspectos principais e amplamente declarados, a presente in- venção fornece um método para modular o crescimento ou reparo, por exemplo, de tecido ósseo ou de cartilagem, pela administração de um sinal elétrico ou campo elétrico em tecido ósseo ou de cartilagem em desenvolvimento ou danificado. Além do mais, a presente inven- ção fornece dispositivos e procedimentos para impedir a perda de cartilagem e para a pro- moção de crescimento e desenvolvimento celular da cartilagem, incluindo, por exemplo, a proliferação de condrócito. A presente invenção também fornece dispositivos e procedimen- tos para a promoção do crescimento de cartilagem afetando os componentes e mecanismos de desenvolvimento de condrócito.

A presente invenção supera as deficiências de dispositivos e métodos cia tecnologia anterior pela habilitação da criação de um campo elétrico e da distribuição de sinais bioelé- tricôs otimizados para corresponder aos recursos selecionados de sinais corpóreos naturais, resultando em cura acelerada e mais permanente. Os sinais aqui descritos se conformam com os recursos selecionados dos sinais naturais e, consequentemente, tecidos sujeitos ao eletroestímulo de acordo com a presente invenção passam por mínima tensão fisiológica. Além do mais, a presente invenção é não invasiva e econômica, a tornando desejável para múltiplas aplicações para uso pessoal e individual. Além do mais, os presentes métodos fornecem estímulo elétrico, em que os sinais elétricos imitam rigorosamente características selecionadas de sinais corpóreos naturais. Portanto, o tecido estimulado é sujeito a mínima tensão, e o crescimento e o reparo são enormemente facilitados.

Ao contrário dos dispositivos tipo TENS convencionais, que visam bloquear impul- sos de dor no sistema nervoso, o aparelho usado com os presentes métodos opera em um nível de estímulo que fica abaixo do nível limite humano normal de sensação de dor e, como tal, a maior parte dos usuários não passa por nenhuma sensação durante o tratamento para reparar ou promover o crescimento ósseo.

A tecnologia aqui descrita usa uma classe de formas de onda, algumas das quais são inéditas, e outras das quais são conhecidas por ter efeitos biológicos positivos nos teci- dos quando aplicadas através de bobinas indutivas, mas não demonstraram ter efeitos bio- lógicos positivos através dos eletrodos até agora.

Embora nenhum dispositivo bioelétrico comercial seja atualmente aprovado para te- rapia de osteoporose, a presente invenção fornece um candidato promissor. Da forma aqui demonstrada, padrões de onda exclusivos do campo eletromagnético pulsado (PEMF) po- dem ser vantajosamente aplicados tanto em um nível macroscópico (isto é, fraturas ósseas comuns) bem como em níveis microscópicos (isto é, desenvolvimento de osteoblasto e/ou de condrócito). Com os propósitos desta e de aplicações relacionadas, PEMF também é conhecido com PEF quando distribuído por meio de acoplamento capacitativo, isto é, por meio de eletrodos na pele. Certas modalidades da invenção maximizam a utilidade e a apli- cação de formas de onda PEMF desejadas: por exemplo, a espinha dorsal, os quadris e/ou pulso são os locais mais comuns de fratura osteoporótica. Para tais tipos de fraturas, os inventores fornecem simples almofadas de eletrodo de contato com a pele auto-adesivas como veículos de distribuição eletroterapêutica. O uso de tais almofadas de eletrodo resulta na melhoria do desenvolvimento da cartilagem e da massa óssea em tais locais anatômicos chaves. Em um nível microscópico, os presentes inventores identificaram formas de onda PEF e freqüências específicas que otimizam o desenvolvimento da cartilagem e formas de - onda e freqüências PEMF que otimizam o desenvolvimento de osteoblasto. Da forma descri- ta com mais detalhes nos exemplos, os inventores demonstram que sinais PEMF intensifi- cam a mineralização do osteoblasto e a produção da matriz, e que o sinal também confere recursos estruturais. Os inventores também mostram que outros sinais PEMF intensificaram a proliferação celular e aumentos associados nas proteínas morfogenéticas ósseas (BMPs). Além do mais, os inventores demonstram adicionalmente a efetividade do sinal PEF na me- lhoria do desenvolvimento do condrócito. Embora sinais elétricos tanto em rajada de pulso quanto contínuos possam ser usados na presente invenção, a administração de sinais con- tínuos em vez de sinais em rajada de pulso forneceu os efeitos mais consideráveis na proli- feração e na mineralização.

Os sinais elétricos da presente invenção podem ser usados para promover o reparo e o crescimento de tecidos estruturais, tais como cartilagem e osso. Entretanto, tais siste- mas e métodos não precisam ser confinados ao uso com organismos intactos, já que cultu- ras de células ou de tecido isoladas também podem ser afetadas pelas formas de onda ele- troterapêuticas (estímulo elétrico apropriado foi observado modificando as taxas de metabo- lismo celular, secreção e replicação). Sinais elétricos são aplicáveis, no geral, a outros teci- dos conjuntivos, tais como pele, ligamentos, tendões e congêneres. Os sinais elétricos aqui descritos podem ser usados para estimular outros tecidos a aumentar o reparo dos tecidos e para promover o crescimento de tecidos com propósitos de transplante. Por exemplo, célu- Ias da pele isoladas podem ser tratadas com os dispositivos e formas de onda da presente invenção em um meio de crescimento apropriado para aumentar a proliferação celular e a diferenciação na preparação de material de enxerto na pele autógeno cultivado em tecido. De uma maneira semelhante, estes sinais bioelétricos podem ser aplicados diretamente no tecido da pele Iesionado ou doente para melhorar a cura. Distribuição exógena de sinais bioelétricos e células progenitoras, tais como células

estromais da medula óssea -BMSCs-, em uma fratura pode levar à cura e reparo intensifica- dos de fraturas recalcitrantes. Ambos estes fatores (bioeletricidade e recrutamento celular) são, de fato, partes do processo de cura natural. Para estas aplicações, estímulo elétrico usando as formas de onda aqui descritas pode ser aplicado imediatamente depois da lesão com um sistema de eletroterapia. O sistema de eletroterapia pode ser leve, compacto e por- tátil. Tanto estímulo elétrico quanto terapia universal com base em célula podem ser aplica- dos em uns poucos dias depois da lesão. Células autólogas podem ser adicionadas em um momento adicional jJepois da lesão. A presente invenção também fornece métodos para induzir o reparo ou o desenvolvimento ósseo que regenera tecidos naturais em vez de teci- do cicatrizado.

Dessa maneira, é um objetivo da presente invenção fornecer métodos para modular a proliferação e a diferenciação de condrócitos e tecido ósseo para facilitar reparo e desen- volvimento ósseo e da cartilagem pela administração de inéditos sinais elétrteôs no tecido ósseo.

É um outro objetivo da presente invenção fornecer inéditos sistemas de cultura que compreendem o uso de PEF para engenharia de tecido de cartilagem e ósseo. É um outro objetivo da presente invenção fornecer inéditos sistemas de cultura de

condrócitos em conjunto com estímulo elétrico.

É um outro objetivo da presente invenção fornecer estojos para o crescimento de tecidos autólogo e alogênico para transplante para o interior de um hospedeiro com neces- sidade deste.

É um outro objetivo da presente invenção fornecer métodos para estimular eletri-

camente células progenitoras não comprometidas in vitro ou in vivo para induzir a prolifera- ção ou a diferenciação.

É um outro objetivo da presente invenção fornecer métodos para modular o cresci- mento de cartilagem, osso ou outro tecido conjuntivo. É um outro objetivo da presente invenção fornecer métodos para modular a expres-

são e liberação de proteínas morfogênicas ósseas.

Um objetivo adicional da presente invenção é fornecer métodos para modular a pro- liferação de condrócito e o desenvolvimento usando PEF.

É um outro objetivo da presente invenção fornecer métodos para modular a Iibera- ção de óxido nítrico.

Estes e outros objetivos, recursos e vantagens da presente invenção ficarão apa- rentes depois da revisão da seguinte descrição detalhada das modalidades divulgadas e das reivindicações anexas.

Descrição Resumida dos Desenhos A figura 1 é uma vista esquemática de uma forma de onda usada no estímulo da

cura da fratura óssea.

A figura 2a fornece uma ilustração que mostra uma efetiva forma de onda de sinal elétrico em modo de pulso com base em uma forma de onda espiral indutiva, e adaptada para aplicação na pele para a promoção da mineralização óssea.

A figura 2b fornece uma ilustração que mostra uma efetiva forma de onda de sinal elétrico em modo contínuo para a promoção da mineralização óssea.

A figura 3a fornece uma ilustração que mostra uma efetiva forma de onda de sinal

elétrico em modo de pulso para a promoção da proliferação de células ósseas.

A figura 3b fornece uma ilustração que mostra uma efetiva forma de onda de sinal elétrico em modo contínuo para a promoção da proliferação de células ósseas.

A figura 4 fornece uma ilustração que mostra uma câmara laboratorial experimental para a distribuição de corrente.

A figura 5 fornece um gráfico de barras que mostra asTmudariças em fosfatase alca- Iina em sobrenadante (esquerda) e na membrana (direita).

A figura 6 fornece um gráfico de barras que mostra as mudanças em depósitos de osteocalcina e cálcio com sinal "B".

^ 15 A figura 7 fornece um gráfico de barras que mostra o aumento no número de célu-

las medido por DNA como um percentual ± de desvio padrão de controle para formas de onda de sinal PEMF na presença e ausência de L-NAME. L-NAME sozinho é apresentado como um controle experimental.

A figura 8 fornece representações esquemáticas de configurações para usar uma combinação de estímulo mecânico e elétrico para aplicações in vitro.

A figura 9 fornece uma representação esquemática que mostra o sinal PEF compa- rado com o sinal PEMF.

A figura 10 fornece uma representação gráfica de uma configuração típica para o tratamento de células de cartilagem in vitro com um sinal PEF. A figura 11 fornece um gráfico que mostra os resultados de um experimento que

demonstra os efeitos do estímulo do condrócito por três diferentes estímulos: PEF, IGF1 e IL-1b.

A figura 12 fornece um gráfico que compara a liberação de oxido nítrico (NO) em curto prazo (30 minutos) por condrócitos humanos normais na presença cloreto de cálcio, e ionóforo de cálcio A23187.

A figura 13 fornece um gráfico que mostra sinal PEF e liberação de NO no curto prazo (30 minutos) na presença de L-NAME (inibidor de sintase de óxido nítrico), e W7 (ini- bidor calmodulina).

A figura 14 fornece um gráfico que mostra que o sinal PEF aumenta na geração de cGMP no curto prazo (30 minutos).

A figura 15 fornece um gráfico que mostra que sinal PEF e nitroprusseto de sódio (SNP) (doador de óxido nítrico) aumentam a geração de cGMP no curto prazo (30 minutos). A figura 16 fornece um gráfico que mostra que efeito estimulatório do sinal PEF na proliferação de condrócito em 72 horas e o efeito estimulatório reduzido do estímulo de sinal PEF na presença de L-NAME (inibição de sintase de óxido nítrico) e LY82583 (inibição de ciclase de GTP).

A figura 17 fornece um gráfico que mostra os efeitos do doador de óxido nítrico, ni-

troprusseto de sódio (SNP), no crescimento celular da cartilagem em 72 horas.

Descrição Detalhada da Invenção

A seguinte descrição inclui o melhor modo atualmente contemplado para realizar a invenção. Esta descrição é feita com o propósito de ilustrar os princípios gerais das inven- ções, e não deve ser tomada em um sentido limitante. O texto das referências aqui mencio- nadas é, por meio deste, incorporado em sua íntegreTpela reTèrência, incluindo pedidos pro- visórios US 60/687.430, 60/693.490, 60/782.462 e 60/790.128 e pedido de patente US 11/444.916.

Entende-se que as presentes aplicações in vitro da invenção aqui descritas também podem ser extrapoladas para aplicações, terapias e congêneres in vivo. Versados na técnica percebem que a tecnologia desenvolvida usando preparações reduzidas e modelos in vitro pode, em última análise, ser usada para aplicações in vivo. Valores e faixas efetivos para estímulo elétrico in vivo podem ser extrapolados a partir das curvas dose-resposta derivadas de sistemas de teste em modelo in vitro ou animal. A presente invenção habilita a distribuição de sinais bioelétricos otimizados para

corresponder às características selecionadas de sinais corpóreos naturais, resultando em cura acelerada e mais permanente. Os sinais aqui descritos se conformam exclusivamente com recursos selecionados dos sinais naturais e, consequentemente, tecidos sujeitos ao eletroestímulo de acordo com a presente invenção passam por mínima tensão fisiológica. Além do mais, a presente invenção é não invasiva e econômica, a tornando desejável para múltiplas aplicações para uso pessoal e individual.

Remodelagem Óssea

Osso é um dos tecidos mais rígidos do corpo humano. Como o principal componen- te do esqueleto humano, ele não somente suporta estruturas musculares, mas protege ór- gãos vitais nas cavidades cranianas e torácicas. Osso é composto de material calcificado intercelular (a matriz óssea extracelular) e diferentes tipos de célula: osteoblastos, osteócitos e osteoclastos.

A matriz extracelular é composta de componentes orgânicos e inorgânicos. O com- ponente orgânico inclui células, colágenos, proteoglicanos, hialuronano e outras proteínas, fosfolipídeos e fatores de crescimento. A resistência compressiva óssea vem do componen- te inorgânico mineralizado, que é, predominantemente, cálcio e fósforo cristalizado na forma de hidroxiapatita Ca10PO4(OH)2. Colágeno adiciona resistência à tensão. A combinação de colágeno e hidroxiapatita confere ao compósito características ósseas mecânicas e biológi- cas.

Osteoblastos são derivados das células progenitoras de origem mesenquimal e fi- cam localizados nas superfícies próximas da matriz óssea emergente e arranjados lado a lado. A função primária de osteoblastos é a elaboração e o desenvolvimento de matriz ós- sea e desempenhar um papel na mineralização da matriz. Osteoblastos são chamados de osteócitos quando embutidos na lacuna da matriz óssea, e adotam uma morfologia ligeira- mente diferente e retêm o contato com outros osteócitos. Osteoclastos são células multinu- cleadas maiores que contêm receptores para calcitonina e integrina e outros recursos estru- turais especializados. A função primária de osteoclastes é reabsorver componentes tanto inorgânicos quanto orgânicos da matriz óssea calcifiCada.

Remodelagem óssea é o processo fundamental e altamente integrado de reabsor- ção e formação de tecido ósseo que resulta em massa esquelética precisamente equilibra- da, com renovação da matriz mineralizada. Este processo renovável é alcançado sem com- prometer a arquitetura anatômica óssea geral. Este processo contínuo de modificação inter- na garante que o osso mantenha uma capacidade de verdadeira regeneração e manutenção da integridade óssea pela reparação contínua de microfraturas e alterações em resposta à tensão. A arquitetura e a composição do esqueleto adulto estão em equilíbrio perpetuamen- te dinâmico. A remodelagem também fornece um meio para a liberação de cálcio em res- posta às demandas homeostáticas. Condições que influenciam a remodelagem óssea inclu- em estímulo mecânico, tais como a imobilização ou ausência de peso, corrente elétrica ou campos eletromagnéticos, tais como campo elétrico ou campo eletromagnético pulsado ca- pacitivamente acoplados, mudanças hormonais ou em resposta a certas doenças inflamató- rias.

Remodelagem óssea ocorre através de ciclos orquestrados de atividade que inclu-

em etapas de ativação, reabsorção, inversão, formação e repouso. Ativação é caracterizada pela existência de uma fina camada de células de revestimento. Então, células mononuclea- res circulantes de linhagem hematopoiética começam a migrar para o interior do sítio de ativação e se fundem para formar osteoclastos. A ativação é seguida pela reabsorção, em que os osteoclastos ativos escavam uma superfície óssea. Tipicamente, esta etapa dura cerca de 2-4 semanas. Inversão ocorre depois da reabsorção, e continua por um período de 9 dias, durante este tempo pré-osteoblastos inativos estão presentes nas depressões de reabsorção. A próxima etapa é a formação, e leva de cerca de 3-4 meses. Durante este es- tágio, osteoblastos ativos renovam o sítio de escavação. A última fase de remodelagem ós- sea é repouso, em que não ocorre nenhuma atividade de remodelagem até o início do pró- ximo ciclo de remodelagem. De forma ideal, a quantidade de enchimento ósseo deve igualar a quantidade reabsorvida sem nenhuma perda de massa óssea. Cartilagem

Cartilagem é um tipo de tecido conjuntivo denso. Ela é composta de fibras coláge- nas e/ou fibras elastinas, e células chamadas condrócitos, todas as quais são embutidas em uma firme substância triturada tipo gel chamada de matriz. Cartilagem é avascular (não con- tém vasos sangüíneos) e nutrientes são difundidos através da matriz. Cartilagem serve em diversas funções, incluindo fornecer uma estrutura sobre a qual a deposição óssea pode começar e fornecer superfícies lisas para o movimento de ossos de articulação. Cartilagem é encontrada em muitos locais no corpo, incluindo as articulações, as costelas, o ouvido, o nariz, os tubos bronqueais e entre os discos intervertebrais. Há três tipos principais de carti- lagem: hialina, elástica e fibrocartilagem. Além do mais, tendões são compostos de cartila- gem. Condrócitos são as únicas ceíulas encontradas na cartilagem, e eles produzem e man- têm a matriz cartilaginosa, que consiste principalmente em colágeno e proteoglicanos.

Tecido da cartilagem tem capacidade limitada de reparo após a lesão. Defeitos não tratados na camada da cartilagem de uma articulação curam fracamente ou simplesmente não curam. A degradação do tecido que segue leva, inevitavelmente, à osteoartrite. Neste ponto, a abordagem clínica é, usualmente, apenas uma tentativa para reduzir dor. Tentati- vas de reparar defeitos da cartilagem, que incluem incorporar condrócitos intensificados com fatores de crescimento, com a esperança de que a produção da matriz suporte a produção de carga, foram fracas.

A regeneração normal do tecido prossegue através de uma série de fases, come-

çando com a inflamação e culminando na deposição e na organização de novo tecido. No caso de dor crônica na articulação, seja em função de uma lesão anterior seja em função de osteoartrite, regeneração de tecido para indefinidamente na fase de inflamação. Isto leva à progressiva degeneração da cartilagem, irritação da cápsula sinovial, efusão da articulação e, consequentemente, perda da superfície cartilaginosa integralmente.

Óxido nítrico aparece no início das cascatas bioquímicas envolvidas na fase infla- matória do reparo do tecido. Óxido nítrico é bimodal no caso de cartilagem, contribuindo tanto para o alívio da dor quanto para a degradação do tecido. Considerando a importância do óxido nítrico, aqui, os inventores investigaram e identificaram segundos mensageiros em potencial envolvidos na produção de óxido nítrico depois do tratamento PEF em condrócitos.

A própria degradação da cartilagem não se traduz como uma percepção sensorial diretamente a partir da cartilagem; dor na articulação é o sintoma que faz com que pacientes busquem tratamento. Infelizmente, tratamentos objetivados a reduzir dor na articulação, tal como a administração de medicamentos anti-inflamatórios não esteroidais (NSAIDS), não resolvem o problema fundamental da perda de cartilagem. Se não houver intercessão para parar a perda de cartilagem, o resultado é deficiência. Para inverter esta deficiência, cirurgia, tal como artroplastia total do joelho, pode ser usado com sucesso para retornar um indivíduo a um estilo de vicia funcional, mas, usualmente, cirurgia envolve complicações e não é ade- quada para todos os pacientes. Prevenção é preferida para impedir perda adicional de carti- Iagem ou para restaurar a cartilagem perdida ao seu estado saudável. Entretanto, tratamen- tos preventivos, tais como o uso combinado de fatores de crescimento e engenharia de teci- do, deixaram de produzir uma resposta fisiologicamente significativa consistente. Aqui, os inventores satisfazem a necessidade de inéditos e efetivos métodos e composições direcio- nados para a melhoria da regeneração e desenvolvimento da cartilagem compreendendo o uso de PEF.

Formas de onda

A presente invenção fornece sinais elétricos e formas de onda que habilitam ações

específicas em tecidos Biológicos: Tais formas de onda são efetivas para aplicações tanto in vivo quanto in vitro. Tecidos osteocondrais são aqui mostrados respondendo diferentemente a freqüências é formas de onda notavelmente diferentes.

Sinais que compreendem pulsos retangulares ou quase retangulares alternados com polaridades opostas e comprimentos desiguais são de interesse particular, desse mo- do, formando conjuntos de pulso retangulares e assimétricos. Pulsos de comprimentos es- pecíficos foram teorizados por ativar mecanismos bioquímicos celulares específicos, especi- almente, a ligação de cálcio ou outras espécies pequenas, móveis e carregadas em recepto- res na membrana celular, ou suas (usualmente mais lentas) desligações. As partes de um conjunto como este com polaridades opostas podem equilibrar para produzir substancial- mente uma carga líquida zero, e o conjunto pode ser tanto contínuo quanto dividido em raja- das de pulso separadas por intervalos de sinal substancialmente zero. Estímulo administra- do em modo de rajada de pulso tem ações similares àquelas administradas como conjuntos contínuos, mas suas ações podem diferir em detalhes, em função da capacidade (teorica- mente) de espécies carregadas se desligarem dos receptores durante os períodos de sinal zero, e a programação de administração exigida também pode diferir.

Da forma aqui usada, PEMF (campo eletromagnético pulsado) e PEF (campo elé- trico pulsado) dizem respeito ao mesmo sinal, entretanto, enquanto PEMF é administrado por meio de bobinas eletromagnéticas, PEF é administrado por meio de dispositivo eletro- químico (isto é, eletrodos anexados na pele capacitivamente acoplados). Tanto PEMF quan- to PEF dizem respeito a um sinal equivalente em relação à repetição do trem de pulsos e pulsos individuais. Em algumas modalidades, a largura da rajada (duração do sinal) pode variar, entretanto, o próprio sinal fundamental permanece o mesmo tanto para PEMF quanto para PEF. Em certas modalidades alternativas, o trem de pulsos pode conter um sinal adi- cionado para nenhuma carga líquida.

A figura 1 mostra um vista esquemática de uma forma de onda de base 20 efetiva para estimular tecido ósseo e da cartilagem, em que uma linha 22 representa a forma de onda em modo contínuo, e a linha 24 representa a mesma forma de onda em uma escala de tempo mais longo no modo de rajada de pulso, os níveis 26 e 28 representam dois diferen- tes valores característicos de tensão ou corrente, e os intervalos 30, 32, 34 e 36 represen- tam o sincronismo entre transições específicas. Os níveis 26 e 28 são usualmente selecio- nados, de forma que, quando calculados suas médias em um ciclo completo da forma de onda, não haja componente de corrente contínua líquida (CC), embora os níveis 26 e 28 possam ser selecionados para resultar em um componente de CC positiva líquida ou negati- va líquida, se desejado. Em aplicações do mundo real, forma de onda, tal como 20, é tipi- camente modificada em que todas as tensões ou correntes caem exponencialmente na dire- ção de algum nível intermediário entre os níveis 26 e 28, com um tempo de queda constan- te, preferivelmente, maiüT do que o intervalo 34. O resultado é representado por uma linha 38. No geral, as formas de onda aqui descritas têm dois componentes de sinal: um compo- nente mais longo mostrado como o intervalo 30 e um componente mais curto mostrado co- mo o intervalo 32, um em relação ao outro. Variação nos comprimentos do componente de sinal curto e longo confere efeitos

específicos de um tecido estimulado. Comprimentos de pulso de interesse nesta invenção podem ser definidos como segue, a fim de aumentar o comprimento: Comprimento a: entre e 75 pseg de duração, preferivelmente, entre 10 e 50 pseg de duração, mais preferivel- mente, entre 20 e 35 pseg de duração e, ainda mais preferivelmente, cerca de 28 pseg de duração. Comprimento β: entre 20 e 100 μseg de duração, preferivelmente, entre 40 e 80 μseg de duração, mais preferivelmente, entre 50 e 70 pseg de duração e, ainda mais prefe- rivelmente, cerca de 60 pseg de duração. Comprimento γ: entre 100 e 1.000 pseg de dura- ção, preferivelmente, entre 150 e 800 Mseg de duração, mais preferivelmente, entre 180 e 500 Mseg de duração e, ainda mais preferivelmente, cerca de 200 pseg de duração. Com- primento Δ: em excesso de 1 milissegundo de duração, preferivelmente, entre 5 e 100 mseg de duração, mais preferivelmente, entre 10 e 20 mseg de duração e, ainda mais preferivel- mente, cerca de 13 mseg de duração.

Em uma primeira modalidade, o sinal elétrico tem um componente mais curto de comprimento α e um componente mais longo de comprimento β: assim, tendo, com os com- primentos de pulso mais preferíveis de cada tipo (28 Mseg e 60 pseg, respectivamente), uma freqüência de cerca de 11,4 KHz. Sinais compostos por pulsos, alternativamente, de com- primento α e comprimento β são aqui referidos como sinais "tipo A" e suas formas de onda como formas de onda "tipo A". Um exemplo de um sinal "tipo A" administrado como um trem de pulsos contínuo é mostrado na figura 2a. Sinais, tais como estes, são usados para a promoção da proliferação de uma amostra ou cultura de tecido para uma variedade de apli- cações biológicas ou terapêuticas.

No modo de rajada de pulso, formas de onda "tipo A" serão ativadas em rajadas de cerca de 0,5 até 500 mseg, preferivelmente, cerca de 50 mseg, com rajadas repetidas em 0,1 - 10 Hz ou, preferivelmente, cerca de 1 Hz. Um exemplo deste tipo de forma de onda é mostrado na figura 2b.

Em uma segunda modalidade, o sinal elétrico tem um componente mais curto de comprimento a, mas um componente mais longo de comprimento γ: assim, tendo, com os comprimentos de pulso mais preferíveis de cada tipo (28 pseg e 200 pseg, respectivamen- te), uma freqüência de cerca de 4,4 KHz. Sinais compostos por pulsos, alternativamente, de comprimento α e comprimento γ são aqui referidos como sinais "tipo B" e suas formas de onda como formas de onda "tipo B". Tais formas de onda foram previamente descritas no pedido de patente US 10/875.801 (publicação 2004/0267333). Um exemplo de um sinal "tipo B" admlnistraOõ como um contínuo trem de pulsos é mostrado na figura 3a. Sinais, tais co- mo este, são usados no alívio da dor e na promoção da cura óssea e, também, para estimu- lar o desenvolvimento de estruturas tipo osso poroso em culturas de osteoblasto in vitro, com aplicações no campo do reparo ósseo cirúrgico e de materiais de enxerto. No modo de rajada de pulso, formas de onda "tipo B" são ativadas em rajadas de

cerca de 1 até 50 mseg, preferivelmente, cerca de 5 mseg, com rajadas repetidas em 5-100 Hz ou, preferivelmente, cerca de 15 Hz. Um exemplo deste tipo de forma de onda é mostra- do na figura 3b. Esta forma de onda tem forma e amplitude similares às efetivas correntes distribuídas pelos dispositivos eletromagnéticos indutivo típicos (bobina) que são comumen- te usados em produtos de estímulo ósseo não união, por exemplo, EBI MEDICA, INCrtm (Parsippany, N.J.) e ORTHOFIX, INC.R™ (McKinney, Tex.).

Em uma terceira modalidade, o sinal elétrico tem um componente mais curto de comprimento β, mas um componente mais longo de comprimento γ: assim, tendo, com os comprimentos de pulso mais preferíveis de cada tipo (60 pseg e 200 pseg, respectivamen- te), uma freqüência de cerca de 3,8 KHz. Sinais compostos por pulsos, alternativamente, de comprimento β e comprimento γ são aqui referidos como sinais "tipo C" e suas formas de onda como formas de onda "tipo C". Sinais, tais como este, são usados na promoção da regeneração, maturação e calcificação óssea.

No modo de rajada de pulso, formas de onda "tipo C" são ativadas em rajadas de cerca de 1 até 50 mseg, preferivelmente, cerca de 5 mseg, com rajadas repetidas em 5-100 Hz ou, preferivelmente, cerca de 15 Hz, muito do mesmo como o "tipo B." Esta forma de onda tem forma e amplitude similares a efetivas correntes distribuídas por outros dispositi- vos eletromagnéticos indutivos típicos (bobina), comumente usadas em produtos de estímu- lo ósseo não união, por exemplo, o ORTHOFIX, INC.R™ (McKinney, Tex.) PhysioStim Li- teR™ que é designado para promover a cura de fusões espinhais.

Em uma quarta modalidade, o sinal elétrico tem um componente mais curto de comprimento γ e um componente mais longo de comprimento Δ: assim, tendo, com os com- primentos de pulso mais preferíveis de cada tipo (200 pseg e 13 mseg, respectivamente), uma freqüência de cerca de 75 Hz. Sinais compostos de pulsos, alternativamente, de com- primento γ e comprimento Δ são aqui referidos como sinais "tipo D" e suas formas de onda como formas de onda "tipo D". Sinais, tais como este, são usados especialmente na promo- ção da cura da cartilagem e da calcificação óssea, e no tratamento ou reversão da osteopo- rose e da osteoartrite. Embora amplamente similar àquele distribuído através de eletrodos pelo BIONICARE MEDICAL TECHNOLOGIES INCrtm BIO-1000™, da forma mostrada na figura 3 da patente US 5.273.033, que é aqui incorporada pela referência, o sinal "tipo D" difere substancialmente em forma de onda (ele é retangular, em vez de exponencial) e, no fato de que, preferivelmente, ele tem carga equilibrada.

—' No modo de rajada de pulso, formas de onda "tipo D" são ativadas em rajadas de pelo menos 100 mseg, preferivelmente, de cerca de 1 segundo, com rajadas repetidas em intervalos de um segundo ou mais.

A intensidade do sinal também pode variar; de fato, freqüentemente, sinais mais poderosos não dão mais benefício do que sinais fracos e, algumas vezes, menos. Para um sinal típico (tal como o sinal da figura 1), tipicamente, a efetividade de um pico cai em algum lugar entre um e dez microamperes por centímetro quadrado (μΑ/cm2), e um ponto de cru- zamento em cerca de cem vezes este valor. Além deste ponto, o sinal pode atrasar a cura ou pode, ele próprio, ocasionar lesão adicional. De relevância particular para os presentes métodos são sinais ou formas de onda

elétricos, que correm em modo contínuo em vez do modo de rajada (Por exemplo, figuras 2a ou 3a). Sinais que correm continuamente têm efeitos similares àqueles dos sinais em rajada de pulso, mas podem exigir diferentes programações de distribuição para alcançar resulta- dos similares.

Para as formas de onda usadas com os métodos da presente invenção, densidades

de corrente médias típicas aplicadas são entre 0,1 e 1.000 microamperes por centímetro quadrado, preferivelmente, entre 0,3 e 300 microamperes por centímetro quadrado, mais -preferivelmente entre 1 e 100 microamperes por centímetro quadrado e, ainda mais preferi- velmente, cerca de 10 microamperes por centímetro quadrado, resultando em gradientes de tensão variando entre 0,01 e 1.000, 0,03 e 300, 0,1 e 100, e 1 e 10 microamperes por cen- tímetro, respectivamente, em tecidos corpóreos típicos. O sinal de onda quase quadrado individual é assíncrono com um longo segmento positivo e um curto segmento negativo, ou vice versa. As partes positiva e negativa se equilibram para produzir uma carga líquida zero ou, opcionalmente, podem ser carga não equilibrada com um pulso equalizador no fim do pulso para fornecer equilíbrio de carga líquida zero sobre a forma de onda como um todo. Estas formas de onda distribuídas pelos eletrodos na pele usam formas de onda contínuas retangulares ou aproximadamente retangulares, em vez de formas de onda senoidais ou com forte queda exponencial. Outras formas de onda usadas nos métodos da presente in- venção são divulgadas no pedido de patente US publicado 10/875.801 (publicação 2004/0267333), aqui incorporado pela referência em sua íntegra.

Os sinais elétricos supradescritos podem ser administrados nas células, tecidos biológicos ou indivíduos com necessidade de tratamento com intervalos de tratamento in- termitente ou continuamente ao longo do dia. Um intervalo de tratamento é aqui definido como um intervalo de tempo em que uma forma de onda é administrada em modo contínuo ou de pulso. Intervalos de tratamento podem ser de cerca de 10 minutos até cerca de 4 ho- ras de duração, de cerca de 30 minutos até cerca de 2,5 horas de duração ou de cerca de 1 hora de duração. Intervalos de tratamento podem ocorrer entre cerca de 1 e 100 vezes por dia. A duração e a freqüência de intervalos de tratamento podem ser ajustadas, para cada caso, para obter uma efetiva quantidade de estímulo elétrico para promover a proliferação celular, a diferenciação celular, o crescimento, o desenvolvimento ou o reparo ósseo. Os parâmetros são ajustados para determinar os parâmetros de tratamento mais efetivos. Sinais não necessariamente exigem longas horas de duração no intervalo de trata-

mento, embora administração de 24 horas possa ser usada, se desejado. Tipicamente, 30 minutos (repetidos diversas vezes em um dia) são exigidos para efetividade biológica. Proli- feração celular in vitro pode ser medida por dispositivos padrões, tais como contagens celu- lares, aumentos no ácido nucléico ou na síntese protéica. Suprarregulação ou infrarregula- ção das proteínas da matriz (colágeno tipos I, Ill e IV), bem como dos fatores de crescimen- to e citocinas (tais como TGF-B, VEGF1 SLPI, FN, MMPs), também podem ser medidas (RNAm e síntese protéica). Efeitos in vivo podem ser determinados pela taxa de cura de uma lesão ou pela medição da densidade da massa óssea. Outros métodos de diagnóstico para proliferação, diferenciação ou mineralização de tecido ósseo ficarão prontamente apa- rentes aos versados na técnica.

Em uma modalidade, sinais de promoção da proliferação e de promoção da dife- renciação são usados seqüencialmente. Esta combinação de formas de onda é usada para aumentar o número de células e, então, promover a diferenciação celular. Como um exem- plo, o uso seqüencial dos sinais de proliferação e de diferenciação pode ser feito para pro- mover a proliferação de osteoblastos e, então, a diferenciação dos osteoblastos em osteóci- tos de produção mineral que promovem a mineralização óssea, ou vice versa. Por exemplo, um paradigma do tratamento pode ser usado quando um sinal tipo A de promoção da proli- feração for administrado primeiro em uma população de célula in vitro ou ex vivo por horas, dias ou semanas e, então, o sinal de promoção da proliferação é substituído por um sinal tipo B de promoção de mineralização por horas, dias ou semanas até que a mineralização óssea tenha sido efetuada. Então, o tecido produzido pode ser transplantado para benefício do paciente. Ambos os sinais também podem ser aplicados simultaneamente para promover tanto a proliferação, a diferenciação quanto a mineralização simultaneamente.

Os sinais elétricos podem ser distribuídos por eletrodos na pele ou por conexão ele- troquímica. Eletrodos na pele são comercialmente disponíveis em tamanhos, tais como 3,81 X 30,48, 5,08 X 8,89 e 5,08 X 5,08 centímetros (1 1/2 X 12, 2 X 3 Y2, e 2 X 2 polegadas), que podem ser usados para aplicação na espinha dorsal, costelas, e braço, respectivamente. Estes eletrodos reusáveis são vantajosos em virtude de eles não conterem látex e não ter mostrado significativa irritação da pele. Os eletrodos reusáveis podem ser usados múltiplas vezes, também reduzindo custos para o paciente. Tais eletrodos podem incluir, mas sem limitações, eletrodos #214 (3,81 cm X 33,02 cm (1,5" χ 13")), #220 (12,9 cm2 (2" quadradas)) e #230 (5,08 cm X 8,89 cm (2" χ 3,5")) (KOALATY PRODUCTSr™, Tampa, Fia.) ou eletro- dos #T2020 (12,9 cm2 (2" quadradas)) e #T2030 (5,08 cm X 8,89 cm (2" χ 3,5")) (VERMED, INCrtm, Bellows Falls, Vt.).

Há múltiplas vantagens em usar eletrodos na pele, em vez de bobinas eletromag- néticas. Primeiramente, eletrodos na pele são mais eficientes. Com eletrodos, somente o sinal que será realmente transmitido para o corpo deve se gerado. Com uma bobina, em virtude do fraco acoplamento eletromagnético com os tecidos, o sinal inserido deve ser mui- tas vezes mais forte do que o desejado nos tecidos. Isto torna o sistema de circuitos de ge- ração exigido para eletrodos, potencialmente, muito mais simples do que para bobinas, em- bora exigindo muito menos energia para operar. Em segundo lugar, eletrodos na pele são mais amigáveis ao usuário. Eletrodos na pele têm, no máximo, um pequeno percentual do peso e volume das bobinas necessárias para distribuir níveis de sinal equivalentes. Similar- mente, em virtude da melhor eficiência do acoplamento, os geradores de sinal para acionar os eletrodos podem ser feitos muito menores e mais leves do que aqueles para bobinas. Depois de um curto tempo, um usuário quase não percebe que eles estão ali. Em terceiro lugar, eletrodos na pele são mais econômicos. Diferente das bobinas, que custam centenas a milhares de dólares cada, eletrodos são itens "descartáveis", tipicamente, custando menos de um dólar. Também, em virtude das maiores eficiência e simplicidade, os geradores de sinal e as baterias para acioná-los podem ser pequenos e econômicos para fabricar, se comparado com aqueles para as bobinas. Em quarto lugar, eletrodos na pele permitem construção mais simples da bateria e maior vida útil da bateria, aumentando a facilidade e a conformidade do paciente que usa o dispositivo. Por último, eletrodos na pele são more ver- sáteis de que as bobinas eletromagnéticas. Bobinas devem ser construídas para casar com as características geométricas das partes do corpo nas quais elas serão aplicadas, e cada uma deve ser grande o suficiente para circundar ou confinar a parte a ser tratada. Isto signi- fica que para "cobrir" o corpo deve haver muitos diferentes tamanhos e formas de bobina, alguns dos quais bastante grandes. Por outro lado, com eletrodos, a distribuição de corrente é determinada somente pela instalação do eletrodo, e é prontamente previsível por todo o volume entre eles, então, o corpo pode ser "coberto" com apenas poucos tipos de eletrodo mais uma lista de instalações bem escolhidas.

Sistemas de Estímulo

Sistemas biológicos que incluem células e estimuladores para distribuir sinais elé- tricôs nas células também são contemplados pela presente invenção. Tais células podem incluir, mas sem limitações, células precursoras, tais como células-tronco, progenitores não comprometidos, células progenitoras comprometidas, progenitores multipotentes, progenito- res pluripotentes ou células em outros estágios de diferenciação. Tais células podem ser células embrionárias, fetais ou adultas, e podem ser coletadas ou isoladas das fontes autó- Iogas ou alogênicas. Em uma modalidade, células proliferativas são usadas, embora células não proliferativas também possam ser usadas nos métodos aqui descritos. Tais células po- dem ser combinadas in vitro, por exemplo, na cultura do tecido, ou in vivo, para aplicações de engenharia de tecido ou de reparo do tecido. Células-tronco transplantadas podem ser seletivamente atraídas para locais de lesão ou doença e, então, eletricamente estimuladas para fornecer cura intensificada.

O estímulo de culturas celulares de acordo com o método e o propósito da presente invenção também exige um dispositivo prático para distribuir formas de onda uniformes si- multaneamente para muitos orifícios de cultura sem perturbar o processo de incubação ou causar contaminação. A presente invenção fornece inéditos dispositivos com este propósito, compreendendo inéditos sistemas de eletrodo passivo para distribuir sinais elétricos. Estes sistemas de eletrodo acoplam sinais elétricos com tempo variável para aplicações in vitro ou in vivo, e substituem tecnologia de ponte de eletrólito convencional ou indução magnética para a distribuição de sinais tipo PEMF pela indução em favor de um acoplamento capaciti- vo.

São aqui fornecidos dispositivos para estimular eletricamente culturas durante a in-

cubação que, preferivelmente, contêm uma pluralidade de furos de cultura conectados como um sistema multifuros que usa sistemas de eletrodo anodizado capacitivamente acoplado especialmente desenhados para administração de sinal. Uma configuração típica é mostra- da, de forma parcialmente esquemática, na figura 4. Para conveniência de manuseio, mínima evaporação do meio e facilidade na manu-

tenção da esterilidade, todas as câmaras, pontes e furos de extremidade em um grupo po- dem ser convenientemente montados, da forma mostrada, por exemplo, na figura 4, em uma placa de vidro rígida ou outro portador esterilizável. Então, uma ou mais destas placas, uma vez montadas, podem ser confinadas em um recipiente externo, tal como uma caixa plástica rígida.

Um estimulador ou outra fonte de sinal, indicado, no geral, em 100, é conectado a- través de fios, grampos condutores ou por qualquer outro dispositivo conveniente 102 para um par de eletrodos de metal relativamente inertes 104a e 104b que são imersos em fluido eletricamente condutor em furos de extremidade 106a e 106b. Estes fornecem um ponto de entrada para o sinal na montagem das câmaras de cultura 110a, 110b e assim por diante, conectadas em série pelos eletrodos de ponte 112a, 112b e assim por diante, nos quais ele deve ser aplicado.

Pontes 112a, 112b, e assim por diante, podem ser formadas de qualquer metal re- lativamente inerte, contanto que ele não seja citotóxico. Metais tipicamente usados como eletrodos inertes para fluidos biológicos são prata, ouro, platina e os outros metais do grupo platina. Infelizmente, estes são muito onerosos, podem permitir ou mesmo catalisar algumas reações eletroquímicas em suas superfícies (especialmente, se impurezas menores estive- rem presentes), e os produtos de tais reações podem ser citotóxicos.

Um material preferível para estas pontes de eletrodo é escolhido do grupo de me- tais chamado "autoprotetor" ou "auto-apassivador", e inclui nióbio, tântalo, titânio, zircônio, molibdênio, tungstênio, vanádio e certas ligas destes. Tais metais formam finas, mas muito duráveis e firmemente aderentes, camadas de superfície de óxidos não reagentes quando expostos à umidade ou oxigênio.

Formação de oxido em um metal como este pode ser intensificada, e a espessura do óxido aumentada de uma maneira rigorosamente controlável, através da anodização. A espessura uniforme do óxido dá capacitância uniforme por área unitária da superfície do metal, por sua vez, produzindo intensidade de sinal relativamente uniforme em relação à superfície, quase independentemente de sua forma no fluido. Pequenas quebras no óxido, ocasionadas pelo corte e formação, curam rapidamente pela reação adicional com o fluido. O mesmo é verdade para qualquer dano menor que pode ocorrer posteriormente. Cura do óxido pode ser acelerada pelo calor, por exemplo, por autoclave. Isto não afeta significati- vãmente a espessura ou as propriedades do óxido existente, especialmente, aquele forma- do por anodização.

Alumínio e aços inoxidáveis compartilham a propriedade de auto-apassivamento, mas, no geral, não são usados em meio biológico, que quase invariavelmente, contém quan- tidades significativas de íon cloreto, já que estes metais são lentamente atacados por este íon, e os produtos de reação resultantes podem ser citotóxicos.

O revestimento de óxido em um metal auto-apassivador permite que ele aja como um capacitor de acoplamento para introduzir sinais elétricos em corrente alternada (carga líquida zero, ou ZNC) no meio de cultura com distribuição uniforme e eletrólise desprezível. Óxido fino, juntamente com alta constante dielétrica, equaciona em alta capacitância por unidade da área da superfície do metal, assim, minimizando a distorção de sinal durante a passagem através desta interface.

Um material mais preferível para esta aplicação é nióbio substancialmente puro, que combina excelentes características anodizantes com boa usinabilidade mecânica e cus- to moderado (grosseiramente, duas vezes aquele da prata) e cujo óxido (Nb2O5) tanto é mui- to durável quanto tem uma constante dielétrica incomumente alta, assim, fornecendo alta capacitância por unidade de área de superfície para uma dada espessura do óxido.

Um material ainda mais preferível é o assim denominado "nióbio de joalheiro", que,

graças às cores vividas e estáveis criadas pela interferência da luz no óxido da superfície produzido pela anodização, está disponível em custo razoável em formas fabricadas conve- nientes e em uma variedade de cores de estoque. O suprimento da Joalheria Rio Grande, por exemplo, estoques de arame de nióbio redondo de bitola 20 e 22 foram pré-anodizados em "púrpura", "rosa", "azul marinho" "azul petróleo", "verde" e "ouro", cada cor representan- do uma diferente espessura do óxido. O arame é facilmente usinado e formado em qualquer forma desejada do eletrodo. Dado o índice refrativo de Nb2O5 (Nd = 2,30) e sua constante dielétrica (ε = 41 ε0), a espessura do óxido pode ser facilmente medida a partir do espectro ' de reflexo de luz do arame, e a capacitância resultante por unidade de área ou do compri- mento do arame, então, é calculada.

Um material mais preferível é o estoque "púrpura" (magenta) proveniente do nióbio de joalheiro, que, das cores comumente vendidas, tem o óxido mais fino e, assim, a mais alta capacitância por área unitária. O espectro de luz refletida de uma amostra de número 638-240 do catálogo Rio Grande, arame de nióbio "púrpura", mostrou um pico em 420 na- nômetros, indicando uma espessura do óxido de 48 nanômetros. Portanto, para este arame de bitola 22 (0,0644 cm de diâmetro), a capacitância foi calculada em 0,154 microfarad por centímetro de comprimento. Inicialmente, medição direta deu leituras muito mais altas em função das quebras de óxido, mas depois de 24 horas em salina em temperatura ambiente, a capacitância medida estabilizou em 0,158 microfarad por centímetro, em poucos porcento do valor previsto.

Por outro lado, preferivelmente, os eletrodos 104a e 104b são feitos de um metal que não é auto-apassivador. Isto é em virtude de a facilidade da formação de óxido na su- perfície em um metal auto-apassivador e da durabilidade do óxido já formado tornar difícil formar uma conexão elétrica confiável entre um metal auto-apassivador e um outro, ou entre um metal como este e um como o cobre usado na maioria das fiações elétricas, que não é auto-apassivador.

A invenção supera exclusivamente esta dificuldade pelo uso do acoplamento capa- citivo para induzir uma corrente nos eletrodos de metal auto-apassivador, em vez de tentar a conexão direta. Isto é alcançado enchendo as duas câmaras mais extremas no arranjo com uma solução condutora e nelas afundando os eletrodos 104a e 104b, preferivelmente, feitos de um metal não auto-apassivador. Mais preferivelmente, este metal é prata "fina" (99,9 % puro), e a solução é salina fisiológico (0,9 % NaCI aquoso) ou um outro que contém íon cio- reto, já que, quando sujeito à passagem de corrente elétrica, esta combinação forma, na superfície do metal, um reversível sistema de eletrodo de prata / cloreto de prata. Ainda mais preferivelmente, os eletrodos são formados por tiras de fina prata, imersos em solução de salina, e opcionalmente texturizados ou gravados para maximizar a área de contato entre a prata e a solução e, portanto, a quantidade de cloreto de prata ali formado. Entretanto, outros metais e fluidos também podem ser usados.

Então, já que eletrodos terminais 104a e 104b são de metal não auto-apassivador, qualquer dispositivo de conexão comum, tais como brazagem fraca, clampeamento, solda- gem ou o uso de grampos, pode ser usado para fazer contato entre eles e o mundo exterior usando fiação de cobre convencional. Por exemplo, quando o arranjo supradescrito for usa- do no interior de um incubador com os componentes eletrônicos localizados no exterior, um cabo de fita ou outro tipo de anexação por cabo "chato" pode ser usado de forma que os vazamentos na vedação do incubador sejam minimizados, mantendo o ambiente com CO2 controlado para as culturas, sem exigir que uma abertura especial seja feita através da pa- rede do incubador.

Na configuração mostrada, por exemplo, na figura 4, furos de cultura do tecido 110a até 110f são interconectados, e cada furo inclui eletrodos 140 nas extremidades da câmara.

Sete tais pontes são mostradas na figura 4. Os eletrodos 140 são dimensionados para encaixar nas paredes de extremidade 10 de uma câmara deslizante Lab-Tek II, que mede 18 por 48 milímetros internamente com uma profundidade de enchimento típica de 3 mm.

Eletrodos 104a e 104b são formados a partir de tira de prata fina, da forma supra- descrita. Cada um dos eletrodos 112a, 112b, e assim por diante, é formado por dois seg- mentos retos de 15 mm e um segmento reto de 7,5 mm do arame de nióbio "púrpura" bitola 22, unidos por grampos curvos e conectados por uma curva em ângulo reto para a parte central 142 da ponte 112. O capacitância de um eletrodo como este é de cerca de 0,56 mi- crofarad. Já que eletrodos de prata estão presentes somente nas câmaras de extremidade usadas para acoplamento capacitivo e conexão externa, não há contato entre o meio de cultura nas câmaras ativas e qualquer metal, exceto o nióbio anodizado.

Preferivelmente, as pontes 112a e 112g diferem das outras pontes de arame de ni- óbio tendo maiores comprimentos do arame de nióbio imersos na solução de salina, já que o campo elétrico nestes furos não precisa ser mantido mesmo aproximadamente uniforme, e este arranjo, pelo aumento da quantidade do contato da superfície entre o arame e a solu- ção, também aumenta a capacitância. Convenientemente, este comprimento extra do arame pode ser formado em espirais. Por exemplo, cada espiral do furo de extremidade 144 con- tém cerca de 15 cm de arame, produzindo uma capacitância entre o arame da ponte 112a ou 112g e o correspondente eletrodo de prata 104a ou 104b de cerca de 2,3 microfarads.

Este sistema de eletrodo fornece eletrólise desprezível e nenhuma citotoxicidade fi- siologicamente significativa, e também é usado para aplicações in vivo. Em freqüências u- sáveis, tipicamente, entre cerca de 5 Hz e 3 MHz e, com refinamento de circuito, de abaixo de cerca de 1 Hz até em excesso de cerca 30 MHz, a passagem da corrente CC é desprezí- vel.

Assim, as pontes 112a, 112b, e assim por diante, funcionam eletricamente muito como fazem as pontes de sal convencionais, salvo que não há possibilidade de fluido ou íon fluir através delas, assim, evitando possível contaminação cruzada entre as câmaras ou entre uma câmara e um furo de extremidade. Além do mais, os problemas de evaporação e possível ruptura encontrados nas pontes de sal convencionais, e o inconveniente dêfusinar com ágar ou outros agentes de gelação, são evitados. Já que elas são eletricamente capaci- tivas, as pontes bloqueiam a corrente contínua e, assim, o sinal que alcança as câmaras tem carga equilibrada entre as fases, com nenhum componente da corrente contínua remo- vido.

Sob algumas circunstâncias, descobriu-se ser possível que um canal de fluido se forme, através do umedecimento e da tensão na superfície, entre o arame e a parede da câmara deslizante que leva até a parede e acima dela. O mesmo pode acontecer entre a parede e um eletrodo externo, tal como uma tira de prata. Então, líquido pode se mover a- través de um canal como este, ocasionando a mistura entre as câmaras ou a perda para o exterior. Para impedir isto, preferivelmente, uma folga é deixada entre o arame ou a tira e o topo da parede da câmara, onde o eletrodo ou a tira cruza sobre a parede e é circundado por ar. Alternativamente, este espaço pode ser bloqueado por um material repelente à água, tal como agente de vedação de borracha de silicone Silastic®. Embora, na figura 4, seis câmaras 110a até 110f e sete pontes 112a até 112g, se-

jam aqui mostradas, quaisquer outros números convenientes "n" de câmaras e "n+1" de pontes pode ser usado. Além do mais, cada um de uma pluralidade de tais grupos conecta- dos em série composto de "n" câmaras, "n+1" pontes e dois furos de fim pode ser usado com uma única fonte de sinal 100, usando um dispositivo de distribuição de sinal, tal como uma rede de resistor, para dividir a energia do sinal entre os grupos, como é bem conhecido na tecnologia de sinalização eletrônica.

A impedância elétrica total da configuração mostrada, com doze extremidades de eletrodo da câmara, dois eletrodo espiral de furo de extremidade 106 e seis câmaras, da forma descrita, é, principalmente, capacitivo em 0,045 microfarad mais um componente re- sistivo de cerca de 10.000 ohms. Um resistor em série (não mostrado) conectado entre a fonte de sinal 100 e o furo de extremidade 106a pode tanto regular a corrente aplicada em um nível desejado quanto também "sobrecarregar" a parte capacitiva da reatância em série (embora não mostrado na figura 4, este é o mesmo resistor indicado por "R" na figura 10). Por exemplo, com um resistor de 1 megaohm, a resposta da freqüência é uniforme em ± 3 dB de 5 Hz até 3 Mhz.

Se desejado, a distribuição de energia do sinal em uma câmara pode ser medida com sondas, da forma mostrada na câmara ampliada 110b. As sondas 120, feitas de qual- quer metal razoavelmente inerte, mas, preferivelmente de prata 99,9 % pura, como os ele- trodos 104a e 104b, isolados, exceto em suas pontas, e com estas pontas ajustadas em uma distância conhecida e fixa, são imersos no meio 122 e movidos para o interior de uma sucessão de posições, preferivelmente, marcando uma grade retangular. A tensão diferen- ciai em cada posição é lida por um amplificador de diferencial 124, tal como um Dispositivo Analógico AD522, e transmitida para um osciloscópio ou outro dispositivo inclicadorTio geral, em 126 para exibição ou gravação. Os resultados são convenientemente representados como um arranjo de números que representa a razão da intensidade do sinal em cada ponto pela média geral, da forma mostrada na base da figura 4, novamente, para a câmara ampli- ada 110b. Alternativamente, outros dispositivos, tais como codificação por cor ou gráfico tridimensional, podem ser usados.

Os resultados são convenientemente representados como um arranjo de números que representa a razão da intensidade do sinal em cada ponto pela média geral, da forma mostrada na base da figura 4, novamente, para a câmara ampliada 110b. Alternativamente, outros dispositivos, tais como codificação por cor ou gráfico tridimensional, podem ser usa- dos.

Como é mostrado pela grade na figura 4, a distribuição de sinal com eletrodos colo- cados nas extremidades estreitas de uma câmara retangular é, tipicamente, bastante uni- forme, salvo nas pequenas regiões imediatamente adjacentes aos próprios eletrodos. Uni- formidade também melhora com o tempo, seja no meio seja no salina simples, como curas de oxido cortado ou quebrado. Por exemplo, as leituras médias expostas na parte esquerda inferior da figura 4, por exemplo, podem ter resultado de óxido incompletamente curado na extremidade do arame cortado.

Engenharia de Tecido

Os métodos da presente invenção também podem ser usados em aplicações de

engenharia de tecido. Células podem ser cultivadas usando os métodos e sistemas de cultu- ra da presente invenção em conjunto com plataformas biologicamente compatíveis para gerar tecidos funcionais in vitro ou ex vivo ou transplantados para formar tecidos funcionais in vivo. Células-tronco transplantadas ou hospedeiras também podem ser seletivamente transplantadas ou atraídas para um local de lesão ou doença e, então, estimuladas com os sinais elétricos aqui descritos para fornecer cura ou recuperação intensificadas. Plataformas de tecido podem ser formadas a partir de polímeros naturais biocompatíveis, polímeros sin- téticos, ou combinações destes, em uma matriz aberta não tecida com células, com uma arquitetura substancialmente aberta, que fornece espaço suficiente para infiltração celular na cultura ou in vivo, ainda mantendo resistência mecânica suficiente para resistir às forças contráteis, compressivas ou de tensão exercidas pelas células que crescem na plataforma durante a integração da plataforma em um sítio alvo em um hospedeiro. Plataformas de te- cido podem ser estruturas rígidas para gerar estruturas tridimensionais sólidas com uma forma definida ou, alternativamente, plataformas podem ser matrizes semi-sólidas para ge- rar tecidos flexíveis.

Os métodos e sistemas de cultura da presente invenção incluem o uso de platafor- mas feitas somente de polímeros, de copolímeros, ou de combinações destesr Os polímeros podem ser biodegradáveis ou bioestáveis, ou combinações desles. Da~Tòrma aqui usada, materiais "biodegradáveis" são aqueles que contêm ligações que podem ser clivadas sob condições fisiológicas, incluindo separação enzimática òu hidrolítica das ligações químicas.

Polímeros naturais adequados incluem, mas sem limitações, polissacarídeos, tais como alginato, celulose, dextrano, pulano, ácido poli-hialurônico, quitina, poli(3- hidroxialcanoato), poli(3-hidroxioctanoato) e poli(3-ácido hidroxigraxo). Na invenção, tam- bém são contemplados derivados químicos dos ditos polímeros naturais, incluindo substitui- ções e/ou adições de grupos químicos, tais como alquila, alquileno, hidroxilações, oxida- ções, bem como outras modificações familiar aos versados na técnica. Os polímeros natu- rais também podem ser selecionados de proteínas, tais como colágeno, zeína, caseína, ge- latina, glúten e albumina sérica. Polímeros sintéticos adequados incluem, mas sem limita- ções, polifosfazenos, álcoois polivinílicos, poliamidas, poliéster amidas, poli(aminoácidos), polianidridos, policarbonatos, poliacrilatos, polialquilenos, polialquileno glicóis, óxidos de polialquileno, poli(tereftalatos de alquileno), poli(ortoésteres), polivinil éteres, polivinil éste- res, polivinil heletos, poliésteres, polilactídeos, poliglixolídeos, polissiloxanos, policaprolacto- nas, poliidroxibutratos, poliuretanos, polímero bloco estireno isobutil estireno (SIBS), e copo- límeros e combinações destes.

Polímeros sintéticos biodegradáveis são preferidos e incluem, mas sem limitações, ácidos polia-hidróxi, tais como ácido poli L-lático (PLA), ácido poliglicólico (PGA) e copolíme- ros destes (isto é, ácido poli D,L-lático co-glicólico (PLGA)), e ácido hialurônico. Ácidos po- lia-hidróxi são aprovados pela FDA para uso clínico humano. Percebe-se que certos políme- ros, incluindo os polissacarídeos e ácido hialurônico, são solúveis em água. Durante o uso de polímeros solúvel em água, é importante tornar estes polímeros parcialmente insolúveis em água por modificação química, por exemplo, pelo uso de um reticulador.

Uma das vantagens de uma matriz polimérica biodegradável é que compostos an- giogênicos e outros compostos bioativos podem ser incorporados diretamente na matriz, de forma que eles sejam lentamente liberados à medida que a matriz degrada in vivo. À medida que a estrutura célula-polímero é vascularizada e a estrutura degrada, as células se diferen- ciarão de acordo com suas características inerentes. Fatores, incluindo nutrientes, fatores de crescimento, indutores de diferenciação ou de dediferenciação (isto é, que fazem com que células diferenciadas percam características de diferenciação e adquiram característi- cas, tais como proliferação e função mais geral), produtos de secreção, imunomoduladores, inibidores de inflamação, fatores de regressão, compostos biologicamente ativos que au- mentam ou permitem o crescimento para dentro da rede linfática ou das fibras nervurais, ácido hialurônico e medicamentos, que são conhecidos pelos versados na técnica e comer- cialmente disponíveis com instruções sobre o que constitui uma quantidade efetiva, de for- necedores, tais como Collaborative Research, Sigma Chemical Co.,-fatores de crescimento vasculares, tais como fator de crescimento vascular éndoteliar (VEGF), EGF, e HB-EGF, podem ser incorporados na matriz ou fornecidos em conjunto com a matriz. Similarmente, polímeros que contêm peptídeos, tais como ό peptídeo de anexação RGD (Arg-GIy-AsP)1 podem ser sintetizados para uso na formação de matrizes. Estojos

Na presente invenção, também são fornecidos estojos que combinam estimulado- res elétricos com plataformas biologicamente compatíveis para suportar o crescimento e a integração de células em um tecido unificado. Recipientes com eletrodos embutidos podem ser fornecidos com o estojo, e os eletrodos podem ser feitos de um material auto- apassivador ou outros materiais de eletrodo convencionais. Estes estojos podem incluir, opcionalmente, reagentes, tais como meio de crescimento, e fatores de crescimento para promover a integração das células com as plataformas. Plataformas incluídas no estojo po- dem ser desenhadas para ter moléculas de promoção de crescimento e de adesão fixas nas suas superfícies. Tais estojos são opcionalmente embalados juntos com instruções sobre uso e otimização apropriados.

Células podem ser fornecidas com o estojo em uma forma conservada com um ma- terial protetor até que o tempo tal que as células sejam combinadas com outros elementos do estojo para produzir um tecido apropriado. Em uma modalidade, são fornecidas células que são crioconservadas em nitrogênio líquido ou ressecadas na presença de um composto tal como trealose. Células podem ser células progenitoras não diferenciadas, incluindo célu- las-tronco, células-tronco pluripotentes, células-tronco multipotentes ou progenitores com- prometidos. Alternativamente, células com terminal diferenciado também podem ser usadas com estes estojos. Tais estojos podem ser desenhados para produzir tecido de substituição para uso em qualquer sistema de órgãos, tais como, mas sem limitações, osso, cartilagem, músculo, rim, fígado, sistema nervoso, pulmão, coração, sistema vascular, etc.

Células também podem ser coletadas de um paciente com necessidade de trata- mento para construir tecido de substituição a partir do próprio tecido do paciente. O uso do próprio tecido do paciente fornece uma maneira de produzir tecido transplante com menos complicações associadas com a rejeição de tecido.

Além do estímulo puramente elétrico, uma combinação de estímulo elétrico e me- cânico in vitro pode ser benéfica para alguns propósitos. Estímulo mecânico pode consistir em carga de tensão, carga compressiva ou carga de cisalhamento. Configurações típicas são mostradas em seção transversal nas figuras 8a até 8e.

Em cada caso de carga, a configuração de teste é construída ao redor de um furo de cultura ou câmara 200, de qualquer tipo familiar na tecnologia, que contém meio 202 e uma camada de células 204 tipicamente anexada em uma folha de base ou membrana 206 que pode ou não ser uma parte da base mecânica rígida 208 do furo de cultura. Eletrodos 210, de qualquer metal usável da forma descrita, entrg-'outros, mas, preferivelmente, de um metal autoprotetor, e mais preferivelmente, de nióbio anodizado, são colocados na câmara 200 de uma maneira tal para criar distribuição de corrente relativamente uniforme por todo o meio 202.

Para carga de tensão, a membrana 206 forma uma base adicional ou "falsa" no furo

de cultura ou câmara 200, da forma mostrada na figura 8a. A membrana 206 pode ser feita de qualquer material adequadamente flexível e elástico no qual as células se anexarão, tal como borracha de silicone que foi gravada com plasma. O tubo 212 conecta o espaço 214 entre a membrana 206 e a base da câmara rígida 208 com uma bomba externa ou outra fonte de pressão ou vácuo estacionário ou flutuante 216. A operação intermitente da fonte de pressão ou vácuo 216 faz com que a membrana 206 flexione para cima e para baixo, criando tensão intermitente na membrana e, assim, na camada de célula 204 anexada a ela. Alternativamente, a fonte 216 pode aplicar pouca ou nenhuma pressão através da membra- na 206 por um maior período, permitindo que as células 204 colonizem a membrana em seu estado não estirado, então, pode aplicar uma pressão diferente, desse modo, estirando a membrana 206, por exemplo, em um ponto do crescimento da cultura no qual as células 204 acabaram de alcançar confluência e estabeleceram contato de junção na folga.

Para carga compressiva, o furo de cultura ou câmara 200 é, em vez disto, vedado com uma cobertura 220 e diretamente conectado na fonte de pressão 216, da forma mos- trada na figura 8b. A fonte 216 cria um pressão hidrostática estacionária ou flutuante no meio 202 que, assim, é aplicada diretamente na camada de célula 204.

Como um dispositivo alternativo para carga compressiva, o tubo 212 e a fonte de pressão 216 são eliminados, e a cobertura da câmara 220 toma a forma de um pistão móvel através do qual pressão estacionária ou flutuante pode ser diretamente aplicada no meio 202 e, assim, nas células 204, da forma mostrada na figura 8c.

Em vez disto, para carga de cisalhamento, o furo de cultura 200 é conectado na fonte de pressão 216 por meio de dois tubos 212a e 212b através dos quais o meio 202 é circulado, da forma mostrada na figura 8d. Este fluxo pode ser tanto constante em uma úni- ca direção, intermitente, quanto oscilatório. Preferivelmente, cada tubo é equipado com de- fletores 220 para alcançar fluxo mais uniforme, indicado, no geral, pela seta 222. Defletores 220 podem ser feitos separados dos eletrodos 210 da forma mostrada ou, alternativamente, os eletrodos podem ser perfurados, ou de outra forma feitos descontínuo, para, eles mes- mos, formar defletores. O movimento do meio 202 e seu atrito contra a camada da célula 204 geram a carga de cisalhamento desejada.

Como um dispositivo alternativo para fornecer carga de cisalhamento, tubos 212a e 212b e fonte de pressão 216 são substituídos por um impulsor móvel 230 que mantém o meio 202 em movimento em relação à camada da célula 204 indicado, no geral, pela seta 232. O impulsor 230 pode tomar qualquer uma de diversas formas, mas, vantajosamente pode ser de forma cilíndrica, da forma mostrada na figura 8e, em que a base rígida 208 da câmara 200 aproxima a mesma forma e mantém uma folga relativamente uniforme em rela- ção à superfície do impulsor. Desse modo, o meio 202 é varrido continuamente e em uma velocidade estacionária em relação às células 204 simplesmente pela manutenção do im- pulsor 230 em rotação em uma velocidade constante. Alternativamente, mudar a velocidade de impulsor 230 mudará a velocidade do fluxo e, assim, o nível da carga de cisalhamento. Os eletrodos 210 não são mostrados, já que eles podem tomar uma variedade de posições neste arranjo. Entretanto, preferivelmente, piso rígido da célula 208 e o impulsor 230 são, eles mesmo, feitos de metais de eletrodo adequados, mais preferivelmente, de metais auto- protetores e, ainda mais preferivelmente, de nióbio anodizado, e eles mesmos funcionam como os eletrodos.

Modulação Diferencial do Crescimento Ósseo

Da forma supradescrita, as formas de onda da presente invenção também são usa- das em métodos para a promoção do crescimento e o reparo de tecido ósseo in vivo. Da forma supradescrita, o estímulo com formas de onda tipo A promove a proliferação de célu- las. Formas de onda tipo A também resultam em um aumento nas proteínas morfogênicas ósseas para promover a diferenciação. Em uma modalidade, um aumento na produção de BMP-2 e BMP-7 é efetuado usando sinais elétricos tipo A ou, em um menor grau, sinais elé- tricôs tipo B. Este efeito é altamente valioso e fornece um método para intensificar a geração de tecido suficiente para cura de tecido apropriada in vivo, ou para criar enxertos de tecido. Este sinal também é valioso para fornecer massa celular suficiente pára infiltração em uma plataforma de polímero com propósitos de engenharia de tecido. Em uma outra modalidade, da forma demonstrada pelo teste in vitro, o estímulo in vivo fornece proliferação e diferenci- ação de osteoblastos para aumentar o número de osteoblastos para mineralização. Um au- mento como este no número de células fornece um método para encher folgas ou orifícios no desenvolvimento ou na regeneração óssea através de estímulo elétrico. Células geradas através de proliferação induzida por formas de onda tipo A podem ser usadas imediatamen- te, ou conservadas usando métodos de conservação celular convencional até que surja uma necessidade futura.

O estímulo com formas de onda tipo B promove a proliferação em um pequeno grau, e tem ações diferentes das formas de onda tipo A. Ações promovidas por formas de onda tipo B incluem, mas sem limitações, mineralização, produção de proteína extracelular e organização da matriz. As ações das formas de onda tipo B também são valiosas e forne- cem métodos para intensificar a etapa de mineralização e de ossificação de novo tecido ósseo. Em uma modalidade, o desenvolvimento ou a regeneração de tecido ósseo é estimu- lado com formas de onda tipo B para intensifica a taxa de mineralização. Foi proposto que formas de onda tipo B poderrTagir atrâvés de caminhos de cálcio / calmodulina e, também, pelo estímulo de receptores acoplados de proteína G ou mecanorreceptores nas células ósseas. (Bowler, Pront Biosci, 1998, 3:d769-780; Baribault et ai., Mol Cell Biol, 2006, 26(2):709-717). Como tal, métodos também são fornecidos para modular a atividade de a- ções mediadas por cálcio / calmodulina, bem como de receptores acoplados de proteína G e mecanorreceptores usando estímulo elétrico. A modulação destes caminhos e receptores celulares é valiosa para promover o crescimento e o reparo de tecido ósseo in vitro ou in vivo.

Estímulo com formas de onda tipo C promove a regeneração óssea, a maturação e a calcificação. Estas formas de onda também são valiosas e fornecem métodos para intensi- ficar a etapa mineralização e ossificação do novo tecido ósseo.

Estímulo usando formas de onda tipo D promove o desenvolvimento da cartilagem e a cura e a calcificação óssea, e é usado para tratar ou reverter a osteoporose e a osteoar- trite. Aplicações destas formas de onda incluem aplicações in vivo, tais como o reparo de cartilagem danificada, aumento na densidade óssea em pacientes com osteoporose, bem como aplicações in vitro relacionadas à engenharia de tecido de cartilagem, por exemplo.

Métodos também são fornecidos para a combinação ou uso seqüencial das formas de onda aqui descritas para o desenvolvimento de um regime de tratamento para efetuar os resultados biológicos específicos no desenvolvimento ou regeneração do tecido osteocon- dral.

Em uma modalidade, fraturas em pacientes com um distúrbio ósseo podem ser tra- tadas com sinais para curar fraturas e, então, fortalecer o osso. Como um exemplo não Iimi- tante desta modalidade, um paciente osteoporótico com uma fratura pode ser tratado, pri- meiro, pelo estímulo com um sinal tipo A para promover a proliferação e a liberação de fato- res de crescimento e, então, uma forma de onda tipo B para promover um aumento na den- sidade óssea no local de reparo para aumentar a densidade da massa óssea e impedir a refratura. Em uma outra modalidade, a combinação de dois ou mais tipos de formas de onda aqui descritas pode ser usada para promover a proliferação seqüencial, a diferenciação e a mineralização de tecidos osteocondrais. Como um exemplo não Iimitante desta modalidade, uma cultura de osteoblastos pode crescer sob a influência de um sinal tipo A na conexão com uma matriz polimérica, ou antes da conexão com ela. Então, depois de disseminar a matriz polimérica, sinais tipo B são administrados na construção de matriz da célula para promover a mineralização de uma construção usada como um enxerto ósseo.

Em uma terceira modalidade, dois ou mais sinais podem ser administrados simulta- neamente para promover proliferação concomitante, diferenciação e mineralização de tecido osteocondral in vivo ou in vitro.-Sinais diferentes também podem ser aplicados seqüencial- mente no tecido ostèoconaral, a fim de produzir um maior efeito do que a distribuição de cada sinal sozinho. O processo seqüencial pode ser repetido, conforme necessário, para produzir tecido adicional (tal como osso) pela ciclagem, através do processo de duas eta- pas, vezes suficientes para obter o efeito biológico desejado. Como um exemplo específico e não limitante, sinais tipo A podem ser aplicados, primeiro, para produzir mais células ós- seas pela proliferação e, então, sinais tipo B podem ser aplicados para induzir o maior nú- mero de células ósseas para produzir mais tecido ósseo (matriz, mineral e organização) e, então, repetido, se necessário. A quantidade de osso produzido usando a repetição de um protocolo de estímulo seqüencial será maior do que produzido por cada sinal sozinho ou e combinação.

Estímulo da Célula Progenitora

Os métodos e formas de onda aqui descritos podem ser aplicados em células pre- cursoras não diferenciadas para promover a proliferação e/ou a diferenciação em linhagens comprometidas. Tais células progenitoras podem incluir, mas sem limitações, células-tronco, progenitoras não comprometidas, células progenitoras comprometidas, progenitoras multipo- tentes, progenitoras pluripotentes ou células em outros estágios de diferenciação. Especifi- camente, osteoblastos e condroblastos também são incluídos. Em uma modalidade, células- tronco adultas multipotentes (células-tronco mesenquimais ou células-tronco da medula ós- sea) são estimuladas com sinais tipo A in vitro para promover a proliferação e a diferencia- ção das células-tronco adultas multipotentes em caminhos específicos, tais como osso, teci- dos conjuntivos, gordura, etc. Combinação ou administração seqüencial com ambos os si- nais também são contempladas para estímulo da célula progenitora, como supradescrito.

Alternativamente, as formas de onda e métodos aqui descritos também podem ser aplicados a células-tronco adultas multipotentes (células-tronco mesenquimais ou células- tronco da medula óssea) in vivo para estimular células com sinais tipo A para promover a proliferação e a diferenciação de células-tronco adultas multipotentes em caminhos específi- cos, tais como osso, tecidos conjuntivos, gordura etc. Combinação ou administração se- quencial com ambos os sinais também são contempladas.

O estímulo elétrico de células progenitoras também pode ser acompanhado por fa- tores de proliferação e de diferenciação conhecidos por promover a proliferação ou a dife- renciação de células progenitoras. Fatores de proliferação incluem qualquer composto com ações mitogênicas nas células. Tais fatores de proliferação podem incluir, mas sem limita- ções, bFGF, EGF, fator de estímulo da colônia de granulócito, IGF-I e congêneres. Fatores de diferenciação incluem qualquer composto com ações de diferenciação nas células. Tais fatores de diferenciação podem incluir, mas sem limitações, ácido retinóico, BMP-2, BMP-7 e congêneres.

As formas de onda elétrica aqui descritas fornecem modulação diferencial e de

combinação no crescimento e no desenvolvimento do tecido osteocondral in vitro ou in vivo. Aumentar a proliferação de células com sinais tipo A antes da mineralização aumenta o nú- mero de células ósseas e, portanto, fornece um aumento na subsequente mineralização efetuada pelo estímulo com sinais tipo B. As formas de onda da presente invenção também promovem a proliferação e a diferenciação de células progenitoras através da liberação de óxido nítrico e de proteínas morfogênicas ósseas.

Acoplamento Capacitivo

Freqüentemente, o estímulo de preparações in vitro e in vivo é difícil com metais auto-apassivadores em virtude de ser difícil obter conexões elétricas entre os metais. A pre- sente invenção fornece métodos para obter os benefícios de usar eletrodos de metal auto- apassivador sem problemas associados com a obtenção de conexões elétricas sólidas. O acoplamento capacitivo destes eletrodos fornece um método para induzir a corrente contí- nua através do eletrodo de metal auto-apassivador, evitando a necessidade de alguma co- nexão elétrica. Neste método, eletrodos feitos de metais auto-apassivadores, tais como nió- bio, tântalo, titânio, zircônio, molibdênio, tungstênio, vanádio, alumínio e aços inoxidáveis, são esterilizados e colocados em proximidade imediata com uma população de células a ser estimulada. Fios do circuito são colocados em proximidade imediata com os eletrodos de metal em um meio condutor, tal como solução de salina, e sinais elétricos são transmitidos através dos fios do circuito, com corrente sendo capacitivamente acoplada a partir do ara- me, através do salina e da camada de óxido, no eletrodo de metal auto-apassivador para, desse modo, estimular a população da célula. Em uma modalidade, o estímulo do acopla- mento capacitivo é usado para aplicações in vitro, tais como, mas sem limitações, cultura de célula. Uma placa de cultura pode ser estimulada usando este método, ou diversas placas ou furos de cultura podem ser ligados juntos para estímulo elétrico uniforme. Em uma outra modalidade, o estímulo do acoplamento capacitivo é usado para a-

plicações in vivo em que um eletrodo de metal anodizado estéril é implantado em um paci- ente com necessidade de tratamento, e os fios do circuito são colocados no exterior do pa- ciente, em contato com a pele, para induzir uma corrente no eletrodo de metal implantado por uma quantidade efetiva de tempo para promover o reparo ou o crescimento de um teci- do. Por exemplo, a extremidade externa do eletrodo pode formar uma bobina chata exata- mente debaixo da pele, e o sinal pode ser acoplado no seu interior usando um eletrodo de contato com a pele convencional colocado diretamente na pele acima desta bobina. Partes do eletrodo capacitivamente acoplado, a partir das quais o acoplamento capacitivo imediato nos tecidos não é desejado, podem ser cobertas com qualquer material isolante adequado para uso nos circuitos implantados, como é bem conhecido na tecnologia, assim, minimi- zando a perda de sinal e o estímulo indesejado dos tecidos que não estão sendo tratados. Em um exemplo específico, tal como reparo ósseo, um eletrodo de metal anodizado estéril feito de Tim metal auto-apassivador é implantado em um paciente com necessidade de tra- tamento e é estimulado. Depois de um período de tempo suficiente para reparo do osso, o eletrodo pode ser removido do paciente.

Aumento da Expressão BMP A presente invenção inclui adicionalmente métodos e aparelhos que usam formas

de onda tipo A e tipo B para a promoção da expressão e da liberação de proteínas morfogê- nicas ósseas (BMPs) de células estimuladas. Os sinais elétricos aqui descritos podem ser usados para ocasionar a liberação de BMPs em níveis suficientes para induzir um benefício nos tecidos expostos aos sinais. O benefício pode ocorrer em tecidos não diretamente ex- postos aos sinais.

BMPs são polipeptídeos envolvidos na osteoindução. Eles são elementos da super- família do fator de crescimento-beta de transformação, com a exceção do BMP-1. Pelo me- nos 20 BMPs foram identificados e estudados até o momento atual, mas somente BMP 2, 4 e 7 puderam estimular in vitro todo o processo de diferenciação de célula-tronco em células osteoblásticas maduras. Pesquisa atual está tentando desenvolver métodos para distribuir BMPs para a regeneração ortopédica de tecido. (Seeherman, Cytokine Growth Factor Rev. Junho de 2005;16(3):329-45). Métodos são aqui fornecidos para induzir a liberação de BMPs in vitro ou in vivo para regeneração ortopédica de tecido através do estímulo elétrico, em vez de através da distribuição de BMPs exógeno em métodos de distribuição tecnica- mente exigentes e onerosos.

Em uma modalidade, formas de onda tipo A e, em um menor grau, tipo B são usa- das para induzir a expressão e a liberação de BMPs endógenos. A liberação de BMPs en- dógenos promove o crescimento e a diferenciação de tecidos alvos. A colocação de eletro- dos de estímulo fornece uma maneira de alvejar a expressão BMP em áreas localizadas de uma preparação in vitro ou in vivo em um paciente com necessidade de maior expressão de BMP. Em uma modalidade, BMP-2 ou BMP-7, ou combinações destes, são liberados endo- genamente para efetuar a diferenciação e o crescimento do tecido alvo. Em uma modalida- de específica, a liberação de cada um ou de ambos os BMP-2 e BMP-7 promove a diferen- ciação, a mineralização, a produção de proteína e a organização da matriz no tecido ósseo ou de cartilagem.

Estímulo do Osso, da Cartilagem ou de Outras Células do Tecido Conjuntivo por Óxido Nítrico

Os métodos e sinais elétricos aqui descritos também podem ser usados para pro- mover o reparo e o crescimento de osso, cartilagem ou outros tecidos conjuntivos. Em uma modalidade, uma forma de onda tipo B aumenta o crescimento de células através da libera- ção de óxido nítrico (NO). As formas de onda podem ocasionar a liberação de óxido nítrico em níveis suficientes para induzir um benefício nos tecidos expostos aos sinais. Benefício ~pode ocorrer nos tecidos não diretamente expostos aos sinais. Crescimento celular no osso, na cartilagem, ou em outro tecido conjuntivo pode aumentar adicionalmente pela co- administração de um doador de NO em conjunto com o estímulo elétrico. Doadores de NO incluem, mas sem limitações, nitroprusseto de sódio (SNP), SIN-1, SNAP, DEA/NO e SPER/NO. Crescimento celular de osso, cartilagem, ou outro tecido conjuntivo pode ser re- duzido pela co-administração de um inibidor de sintase de NO em conjunto com o estímulo elétrico. Tais inibidores de sintase de NO incluem, mas sem limitações, N(G)-nitro-1-arginina metil éster (L-NAME), NG-monometil-L-arginina(L-NMMA) e 7-Nitroindazola (7-NI). Usando estes métodos, o crescimento celular do osso, da cartilagem, ou de outro tecido conjuntivo pode ser modulado, dependendo das necessidades específicas.

Regeneração e Desenvolvimento da Cartilagem

Da forma descrita com mais detalhes nos Exemplos, especificamente, nos Exem- plos 6-10, aqui os inventores conduziram experimentos para identificar os efeitos do estímu- lo bioelétrico nos condrócitos e no desenvolvimento, reparo e regeneração da cartilagem. Os experimentos utilizaram sinais PEF adaptados dos sinais usados nos estimuladores do crescimento ósseo, empregados com sucesso para fraturas ósseas recalcitrantes. Há inú- meras similaridades entre o estimulador de crescimento ósseo e sinais PEF, tais como fre- qüência do sinal portador (4,150 Hz), taxa de rajada de pulso (15 Hz) e campos elétricos induzidos. Diferenças chaves entre os sinais incluem acoplamento capacitivo em relação ao acoplamento indutivo e uma rajada de pulso duas vezes (10 em relação a 5 milissegundos) para o PEF em relação ao estimulador de crescimento ósseo. Descobriu-se que o sinal PEF aumenta a proliferação de condrócito humana normal com durações de tratamento de so- mente trinta minutos. Outros sinais eletromagnéticos também foram relatados aumentando o crescimento celular da cartilagem, mas não com tais curtas exposições. Os resultados dos experimentos aqui descritos também sugerem que a liberação

de óxido nítrico é parte do caminho biológico envolvido no estímulo por PEF do crescimento de condrócito. Óxido nítrico foi liberado em trinta minutos de exposição PEF e NOS bloque- antes com L-NAME proibiu o aumento de PEF na proliferação de condrócito vista no contro- le da população celular. Embora a modulação PEMF de oxido nítrico tenha sido relatada em alguns estudos (Diniz et al. Nitric Oxide 7(1): 18-23 (2002) e Kim et al., Exp and Mol Med 34(1):53-59 2002), versados na técnica não esperarão que, em virtude de um tipo em parti- cular de estímulo bioelétrico funcionar para um tipo de célula em particular, portanto ele também deva funcionar em outro tipos. A fim de obter uma resposta biológica desejada u- sando um campo eletromagnético (EMF)1 três fatores principais precisam ser considerados: (1) tipo de célula, (2) forma de onda do EMF aplicado, e (3) método de aplicação. No caso do óxido nítrico, quase todas as células têm a capacidade de gerar óxido nítrico. Entretanto, óxido nítrico é gerado por três enzimas distintas (eNOS, nNOS, iNOS), e a mistura destas três enzimas varia de acordo com o tipo de célula. Além do mais, cada enzima tem seu pró- prio perfil considerando os fatores químicos que ativam a enzima para produzir óxido nítrico. Como tal, o tipo de célula selecionado para a liberação de óxido nítrico é um fator chave. Já que cada tipo de célula tem seu próprio perfil de enzimas produtoras de óxido nítrico, e cada enzima tem seu próprio perfil de fatores químicos para ativação, é razoável que cada tipo de célula tenha sua própria exigência de forma de onda EMF. Um método sistemático para i- dentificar a forma de onda para liberação de óxido nítrico de um dado tipo de célula não e- xiste atualmente. Já que uma dada forma de onda EMF é descoberta como ativa, o método de distribuição se torna um problema. Os três métodos de distribuição principais incluem, mas sem limitações, acoplamento indutivo (bobina), corrente contínua (eletrodos colocados no interior do tecido), e acoplamento capacitivo (eletrodos colocados no exterior do tecido, isto é, na pele). Dada a variabilidade e a imprevisibilidade dos parâmetros supradefinidos, é improvável que versados na técnica sejam motivados a combinar conhecimento atualmente disponível considerando o estímulo bioelétrico para identificar a metodologia exclusiva da presente invenção que envolve o estímulo de células de cartilagem / condrócitos usando um sinal PEF por meio de acoplamento capacitivo.

Óxido nítrico tem muitas influências, das quais, uma pode ser a ativação de guani- Iato ciclase, que produz cGMP. Os presentes inventores mostraram que o sinal PEF aumen- tou cGMP no período de tratamento de trinta minutos e que um inibidor de guanilato ciclase (LY83583) bloqueou esta ação. De forma mais importante, o aspecto inédito deste estudo demonstrou que a maior proliferação de condrócito depois do tratamento com sinal PEF foi bloqueada por LY83583, desse modo, indicando que cGMP está envolvido na proliferação de condrócito estimulada por sinal PEF.

Como exposto, a ativação da sintase de óxido nítrico (NOS) pode ocorrer por inú- meras rotas, com dependência da isozima que é ativada. NOS endotelial (eNOS) e NOS neuronal (nNOS) são expressados constitutivamente e dependem de cálcio. Ao contrário, NOS induzível (iNOS) não depende de cálcio, mas pode ser induzido por fatores inflamató- rios, tal como a interleucina 1b. Nos experimentos aqui descritos, descobriu-se que a libera- ção de óxido nítrico pode aumentar com cálcio ou um ionóforo de cálcio adicionados, suge- rindo que uma das isoformas constitutivas de NOS está presente nestas células de cartila- gem. Estudos anteriores mostraram que sinais eletromagnéticos com formas de onda pul- santes podem modular a ligação de cálcio na calmodulina. Da forma mostrada nos Exem- plos, quando o inibidor de calmodulina W7 foi incluído, o sinal PEF não pode aumentar a liberação de óxido nítrico, sugerindo que uma das isoformas constitutivas de NOS está en- volvida no caminho. A diminuição de óxido nítrico com PEF na presença de W7 é interes- sante à luz de um relato de que um campo eletromagnético de 50 Hz diminuiu iNOS. Uma possibilidade é que W7 bloqueou a isoforma de NOS estimulada por PEF, mas não efetuou uma inibição de iNOS por tratamento com PEF.

Entendido junto, os inventores descobriram que o sinal PEF aqui descrito estimula a proliferação de condrócito através de um caminho biológico que envolve cálcio / calmodu- lina, sintase de óxido nítrico, óxido nítrico e cGMP. A presença prolongada de óxido nítrico, tal como aquele produzido por iNOS, na osteoartrite está, usualmente, associada com a degradação da cartilagem. Os dados deste estudo demonstram como o problema de degra- dação da cartilagem resultante do óxido nítrico prolongado pode ser superado pelo uso do sinal PEF para intensificar a produção de óxido nítrico de curto prazo com uma concentra- ção e padrão de tempo consistentes com a proliferação de condrócito. IGF1 é conhecido por aumentar a proliferação de condrócito. Neste estudo, PEF e

IGF1 aumentaram similarmente a proliferação de condrócito. O sinal PEF usado nestes es-- tudos parece aumentar a produção de óxido nítrico no curto prazo (por exemplo, 30 minu- tos), mas não a produção de óxido nítrico no longo prazo (por exemplo, 72 horas), quando normalizada em relação ao número de células, ambas as quais serão previstas intensifican- do o crescimento da cartilagem. Embora não desejando ser limitado pela seguinte teoria, espera-se que tratamento com PEF para reduzir dor ocorra através de um mecanismo simi- lar que envolve óxido nítrico.

Com base nas descobertas das presentes investigações, versados na técnica po- dem concluir que os sinais PEF aqui descritos podem transmitir ação benéfica à cartilagem em sujeitos humanos e animais.

Aplicação do Aparelho e Métodos da Presente Invenção

Pelo uso do aparelho e dos métodos da presente invenção da forma aqui descrita, o aparelho e os métodos são efetivos na promoção do crescimento, da diferenciação, do desenvolvimento e da mineralização de tecido osteocondral. Acredita-se que o aparelho é opere diretamente no local do tratamento pela intensi-

ficação da liberação de fatores químicos, tais como citocinas, que são envolvidos nas res- postas celulares a várias condições fisiológicas. Isto resulta em maior fluxo sangüíneo e inibe adicionalmente a inflamação no local do tratamento, desse modo, intensificando os processos de cura inerentes do corpo.

A presente invenção é especialmente usada na aceleração da cura de fraturas ós- seas simples ou complexas (múltiplos ou fraturas múltiplas) incluindo, mas sem limitações, ossos serrados ou quebrados durante cirurgia. A presente invenção pode ser usada para promover a fusão de vértebra depois da cirurgia de fusão espinhal.

A presente invenção pode ser usada para tratar fraturas não união; tratar, impedir ou reverter osteoporose; tratar, impedir ou reverter osteopenia; tratar, impedir ou reverter osteonecrose; retardar ou reverter a formação de osso tecido (calo, protuberâncias ósseas), retardo ou reversão de perda de cálcio nos ossos em repouso prolongado na cama, retardo ou reversão da perda de cálcio nos ossos em microgravidade. Além do mais, a presente invenção pode ser usada para aumentar a circulação sangüínea local, aumentar o fluxo sangüíneo nas áreas de lesão traumática, aumentar o fluxo sangüíneo em áreas de úlceras crônicas na pele e para modular o coágulo sangüíneo. Uma das áreas em que a presente invenção também pode ser usada é para acele-

rar a cura de cartilagem danificada ou despedaçada. Também, a presente invenção pode ser usada para acelerar a cura (epitelização) de ferimentos ou úlceras na pele.

A presente invenção pode ser adicionalmente usada para acelerar o crescimento de células ou tecidos cultivados, modular a proliferação celular, modular a diferenciação celular, modular a progressão do ciclo celular, modular a expressão de fatores de cresci- mento de transformação, modular a expressão de proteínas morfogenéticas ósseas, modu- lar a expressão de fatores de crescimento de cartilagem, modular a expressão de fatores de crescimento tipo insulina, modular a expressão de fatores de crescimento de fibroblasto, modular a expressão de fatores de necrose de tumor, modular a expressão de interleucinas e modular a expressão de citocinas.

Os métodos e aparelhos da presente invenção são adicionalmente ilustrados pelos seguintes exemplos não limitantes. Pode-se lançar mão de várias outras modalidades, modi- ficações, e equivalentes destes que, depois da leitura da descrição aqui exposta, podem se sugerir aos versados na técnica sem fugir do espírito da presente invenção e/ou do escopo das reivindicações anexas.

Exemplos

Exemplo 1

Efeito da Configuração do Sinal PEMF na Mineralização e na Morfologia em uma Cultura de Osteoblasto Primário O objetivo deste estudo foi comparar duas configurações de forma de onda PEMF

distribuídas com o acoplamento capacitativo pela avaliação das variações bioquímicas e morfológicas em uma cultura celular óssea primária. Métodos

Cultura celular de osteoblasto: Osteoblastos humanos primários (CAMBREXrtm, Walkersville1 Md.) foram expandidos em 75 % de confluência, e plaqueados em uma densi- dade de 50.000 células/mL diretamente nas câmaras LAB-TEK™ (NALGE NUNC INTERNATIONAL™, Rochester, NY) supradescritas. Culturas foram suportadas, inicialmen- te, com meio de osteoblasto básico sem fatores de diferenciação. Quando as culturas alcan- çaram 70 % de confluência nas câmaras, meio foi complementado com hidrocortisona-21- hemisuccinato (200 mM de concentração final), β-glicerofosfato (10 mM de concentração final) e ácido ascórbico. Osteoblastos foram incubados em ar umidificado em 37 °C, 5 % de CO2, 95 % de ar por até 21 dias. O meio foi mudado a cada dois dias pelo curso do experi- mento, 4 mL complementando cada câmara.

Estímulo Elétrico

Culturas foram estimuladas tanto por 30 minutos quanto por 2 horas, duas vezes por dia. Dois regimes de sinal elétrico foram seletivamente aplicados nas células, um em uma forma de onda contínua indicada como "Sinal A" (duração do sinal positivo / negativo de 60 / 28 pseg), e a outra em uma forma de onda contínua indicada como "Sinal B" (dura- ção do sinal positivo / negativo de 200/28 pseg). A intensidade foi medida em corridas de amostra em 2,4 mV/cm (pico a pico). Osteoblastos não estimulados (NC) foram plaqueados em densidades idênticas (como controles) de uma maneira similar. Os seguintes foram me- didos usando procedimentos nos Métodos Detalhados: fosfatase alcalina, cálcio, osteocalci- na, e histologia. Cada um dos seguintes gráficos é vinculado ao sinal-"A", ao sinal "B", 30 minutos de duração como "1", 2 horas de duração como "2", e NC (ou confluência) como nenhuma corrente (isto é, A1 será sinal A-30 minutos; B2 será sinal B-2 horas).

O dispositivo elétrico aqui usado habilita a aplicação de forma de onda contínua como estímulo elétrico em múltiplos explantes simultaneamente. Para cada experimento, 6 pares de explantes foram colocados em furos individuais em 4 mL de meio de cultura. Espé- cies de controle foram cultivados em condições similares, a única diferença sendo a falta do sinal distribuído. A configuração do presente teste consistiu em seis furos de teste de cultura (17 X 42 mm) conectados em série por meio de uma seção bobinada de arame de nióbio. Células de osteoblasto humanas foram estabelecidas nos furos deslizantes LAB-

TEΚ™ Il (NALGE NUNC INTERNATIONAL™, Rochester, NY), cada um com uma área de superfície de cerca de 10 cm2. Sinais foram aplicados em diversas câmaras simultaneamen- te pela conexão destes em série por meio de fios de nióbio que agiram como um par de ca- pacitância. O estímulo foi tanto uma rajada 9 mseg com pulsos retangulares bipolares de 200/28 μseg repetindo em 15/seg, distribuindo 9 mV/cm (similar ao sinal de cura óssea clíni- ca padrão), designado Sinal B, quanto uma rajada de 48 mseg com pulsos essencialmente unipolares de 60/28 Mseg, distribuindo 4 mV/cm, designado Sinal A. Culturas receberam um estímulo tanto de 30 minutos quanto de 2 horas duas vezes ao dia. Amostras foram toma- das do meio e analisadas em pontos no tempo de 7, 14 e 21 dias para fosfatase alcalina, osteocalcina, cálcio da matriz e histologia. Mineralização após morfologia foi confirmada com mancha Von Kossa. Todas as análises bioquímicas foram realizadas por técnicas de ensaio convencionais.

Resultados

A produção de PGE2 foi avaliada usando estojos ELISA comercialmente disponíveis (R&D SYSTEMS™, Minneapolis Minn.; INVITROGEN, INC.™, Carlsbad, Calif.). Os resulta- dos são expressados como pg/mg de tecido por 24 horas (pM/g/24 horas). Fosfatase alcalina (AP): Nos pontos no tempo indicados no desenho do estudo, cé-

lulas foram Iisadas (PE mamífero, Genotech, St. Louis, Mo.) e o sobrenadante coletado. Fosfatase alcalina foi medida pela clivagem de paranitrofenil fosfato (PNPP) paranitrofenil (PNP) sob condições básicas na presença de magnésio. O produto final PNP é colorimétrico com um pico de absorção em 405 nanômetros. Condições básicas foram alcançadas usan- do 0,5 M de tampão de carbonato em pH 10,3. Meio de cultura foi ensaiado diretamente para atividade ALP. A camada da célula ALP foi extraída com uma solução de triton X-100 e uma alíquota medida em relação à atividade ALP. Fosfatase alcalina foi medida tanto no sobrenadante quanto na membrana após a extração do tampão de Iise (figura 5). Da forma esperada a partir de outros estudos (Lohman, 2003), a expressão de fosfatase alcalina che- gou ao máximo perto de 7 dias na membrana. Entretanto, nas células cultivadas sob o estí- mulo "B", meio de cultura continuou a demonstrar um aumento no AP mensurável.

Osteocalcina: Osteocalcina (5.800 daltons) é um produto específico do osteoblasto. Uma pequena quantidade de osteocalcina é liberada diretamente na circulação; ela é prima- riamente depositada na matriz óssea. Estudos mostraram que osteocalcina circula tanto como a proteína intacta (1-49) e como fragmentos N-terminais. O maior fragmento N- terminal é o peptídeo (1-43). Um estojo Elisa de Osteocalcina Mid-Tact foi selecionado por sua alta especificidade. O ensaio é altamente sensível (0,5 ng/mL) e exige somente uma mostra de 25 microlitros. Padrões corridos simultaneamente com nossos grupos experimen- tais ofereceram uma forte correlação com os valores esperados fornecidos pelos fabricantes BTI (BTI, Stoughton, Mass.). Deposição de osteocalcina, medida subsequente à finalização das culturas e determinada a partir do componente da matriz, foi mais notável após o estí- mulo "B" e mais alta em 21 dias (figura 6).

Conteúdo de DNA: camada da célula foi extraída com 0,1 N hidróxido de sódio e uma alíquota ensaiado em relação ao conteúdo de DNA usando estojo de ensaio CyQuant (INVITROGEN, INC.™, Carlsbad, Calif.). Para amostras de célula extraídas em relação ao conteúdo ALP com triton X-100 o extrato foi ajustado em 0,1 N de hidróxido de sódio usando 1 N de hidróxido de sódio. Curvas padrões contêm tampão casado. Para amostras que tam- bém exigem conteúdo de proteína, uma alíquota foi medida em relação à proteína usando método de ligação do corante (Bradford).

Cálcio: Cálcio foi determinado pela metodologia Schwarzenbach com complexona o-cresolftaleina, que forma um complexo de cor violeta. Pela adição de 2 mL de 0,5 M ácido acético durante a noite, cálcio foi dissolvido e conteúdo foi quantificado em relação aos pa- drões pelo ensaio colorimétrico em 552 nm (CORE LABORATORY SUPPLIES™, Canton, Mich.).

Distribuição de cálcio na cultura também foi avaliada por histologia. Células foram fixadas em 2 % glutaraldeído, lavadas com tampão cacodilato, lavadas com PBS e, então, hidratadas para manchar conforme indicado. Cada período de tempo correu em tandem; morfologia representativa é apresentada por 21 dias, comparando o sinal "A", com o sinal "B", e comparando ambos os sinais com o controle (figura 6). Para o sinal B, a observação mais evidente foi na distribuição do cálcio com um alinhamento preferencial aparente que foi interpretado como um osso "pseudoporoso". Para o sinal A, parece que houve, qualitativa- mente, mais proliferação celular e menos produção da matriz do que para o sinal B (entre- tanto, claramente, o sinal A teve mais matriz do que com controles).

Análise osteométrica foi desenvolvida e modificada a partir da metodologia de Croucher. Neste sistema de câmara bidimensional, área trabecular média em relação à área total da grade amostrada foi estudada. Usando o mínimo de 20 campos das duas câmaras em cada intensidade, o estudo examinou a formação óssea, largura osteóide, e número de células. Grades específicas aleatórias foram desenvolvidas para comparação direta e para remover tendência. Adicionalmente, culturas de osteoblasto tanto nas câmaras estimuladas quanto nas câmaras de controle foram diretamente manchadas pelo método VonKossa (Mallory, 1961) para examinar a histologia e qualificar a distribuição de cálcio nas culturas. Conclusão

Fosfatase alcalina, que subiu até um pico próximo do nível dos dias 10-14 e, então, desceu gradualmente, aumentou no sobrenadante estimulado pelo Sinal B. Deposição de osteocalcina, medida subsequente à finalização das culturas e determinada a partir do com- ponente da matriz, foi mais notável após o Sinal B somente, e aumentou até seu ponto mais alto em 21 dias. Cálcio da matriz, medido em mg/dL, e cálcio da matriz, em função da área da placa da cultura do tecido foram maiores com Sinal B somente. A distribuição de mineral, da forma apontada pela histologia e mancha Von Kossa, validou os dados bioquímicos dos ensaios. O estímulo B conferiu uma maior quantidade de mineral e, além do mais, sugeriu um padrão reticulado bidimensional que pode oferecer dinâmica de tensão análoga, como seria esperado em um arranjo trabecular tridimensional. Proliferação celular pareceu qualita- tivamente maior com sinal A em relação ao controle, ao mesmo tempo em que aumentou significativamente a mineralização e o padrão ficou aparente em 21 dias com o sinal B. Que a configuração de dois sinais produziu efeitos muito diferentes é prontamente explicável por uma análise do sinal pelo ruído (SNR) que mostrou que a detectabilidade do sinal B foi 10 vezes maior que a do sinal A1 considerando um alvo Ca/CaM. Este estudo de- monstra pela primeira vez que PEMF tem o potencial de efetuar mudança estrutural resso- nante com morfologia do tecido. O padrão geométrico aparente em 21 dias de cultura refle- tiu a reticulação trabecular consonante com osso poroso e contrastou incisivamente com a orientação aleatória das células tanto no controle quanto nas culturas exposta ao sinal A em todos

os pontos no tempo avaliados. Tais resultados sugerem que as configurações de sinal preferidas podem efetuar hierarquias estruturais que, previamente, eram confinadas às ob- servações no nível do tecido.

Exemplo 2 —

Uso de uma Ponte de "Sal" de Nióbio para Estímulo PEMF/PEF In Vitro

Introdução

Um sistema de eletrodo passivo que usa arame de nióbio anodizado foi desenvolvi- do para acoplar sinais elétricos com tempo variável no interior das câmaras de cultura. A intenção do desenho foi reduzir a complexidade e melhorar a reprodutibilidade pela substitu- ição da tecnologia de ponte de eletrólito convencional por distribuição de sinais tipo PEMF, tais como aqueles induzidos no tecido pelo estimulador de crescimento ósseo por rajada de pulso repetitiva EBI1 capacitivamente em vez de indutivamente, in vitro para estudos de teci- do celular. Tais sinais, quando capacitivamente acoplados, são aqui chamados de sinais PEF (campo elétrico pulsado). Arame de nióbio anodizado é prontamente disponível e exige somente simples ferramentas de mão para formar a ponte do eletrodo. Em freqüências usá- veis, tipicamente, entre 5 Hz e 3 MHz, a passagem de corrente CC corrente é desprezível.

Antecedentes

Tipicamente, campos elétricos capacitivamente acoplados foram introduzidos em

meio de cultura com pontes de sal de eletrólito convencionais que têm resposta de freqüên- cia limitada e são difíceis de usar sem risco de contaminação por tempos de exposição pro- longados. Nióbio (colúmbio) é um dos diversos metais que são auto-apassivadores, forman- do finas, mas muito duráveis camadas de óxido na superfície quando exposto a oxigênio ou umidade. Outros

são tântalo, titânio, e em um grau muito menor, aços inoxidáveis. O pro- cesso pode ser acelerado e controlado por anodização. Um problema com auto- apassivamento é que ele torna a conexão confiável com outros metais difícil. O presente desenho evita esta dificuldade.

Materiais e Métodos

Óxido de nióbio, Nb2O5, é duro, transparente, isolante elétrico e inerte à água, rea-

gentes comuns e fluidos biológicos em uma ampla faixa de pH. Nióbio anodizante forma Nb2O5 com espessura uniforme, mostrando um faixa de cores vividas na interferência de luz com valor para joalheria, já que nenhum pigmento é adicionado, e produz capacitâncias es- táveis e reprodutíveis. Nióbio de joalheiro é vendido em cores padrão, cada qual represen- tando uma diferente espessura do óxido. Já que o contato dielétrico de Nb2O5 é incomumen- te alto (εκ=41 ε0) e as camadas são finas (48-70 nm), suas capacitâncias são surpreenden- temente grandes. Nióbio "púrpura" tem o óxido mais fino e as medidas de capacitância mais altas: 0,158 pF/cmj)ara arame bitola 22 (Rio Grande #638-240), próximo do valor calculado para 48 nM de óxido (420 nM de refletância de pico). Na água ou salinas fisiológicos, extre- midades de arame cortado e pequeno falhas formadas na rápida curvatura curam com óxi- do, sem necessidade de reanodização. A Ponte de Nióbio

Nesta aplicação, óxido de nióbio forma o único contato elétrico com TTmeio e sinais tipo PEF passam capacitivamente através dela. Em níveis de sinal abaixo de poucos milli- amperes, há eletrólise ou mudança de pH desprezíveis para ocasionar artefatos. Múltiplas câmaras podem ser unidas em série, cada qual recebendo sinais idênticos. Cada ponte de nióbio é curva, formando um eletrodo tipo folha em cada extremidade, com uma capacitân- cia típica de 0,56 pF. Colocar pontes de eletrodo as extremidades de uma câmara retangu- lar cria distribuição de corrente e gradientes de tensão quase uniformes por todo o meio. Gradientes medidos em uma configuração típica de substituto de cultura, eletrodos e sinal tipo PEF, da forma previamente mostrada na figura 4 e descrita no texto anexo, mostram uma variação média de ± 3 %, principalmente próximo dos eletrodos ou quando o meio vari- ar significativamente em profundidade. Uma ou diversas câmaras unidas em série são ener- gizadas através de pontes de extremidade de nióbio especiais, cada qual com suas extremi- dades externas acopladas capacitivamente através de salina em um eletrodo de tira de pra- ta que forma um terminal de conexão. Isto remove qualquer necessidade de conectar nióbio em si mesmo ou em qualquer outro metal. Corrente é controlada por uma resistência Iimitan- te em série RNm. A banda passante resultante (± 3 dB nominal) varia em tanto com Rlimi mas em uma configuração de teste correu de 5 Hz até 3 MHz, a freqüência mais alta examinada. Assim, sinais tipo PEF podem ser distribuídos não distorcidos in vitro por meio de acopla- mento capacitivo. Experimento

A utilidade da ponte do eletrodo de nióbio foi testada nas culturas de osteoblasto e condrócito usando uma forma de onda tipo B, da forma supradescrita. Com este sinal apli- cado no meio de osteoblasto OGM™ (CAMBREXr™, Walkersville, Md.) sem células presen- tes, o pH medido depois de 24 horas foi de 8,29, comparado com 8,27 em controles não energizados, sugerindo eletrólise desprezível. A ausência de citotoxicidade fisiologicamente significativa foi mostrada pela robusta proliferação de osteoblastos, diferenciação e desen- volvimento de uma estrutura tipo osso poroso por 21 dias no OGM™ usando formas de on- da tanto tipo A quanto tipo B. Depois de exposição por 30 minutos e 2 horas por 21 dias na forma de onda na cultura, células e matriz foram analisadas com raios X por energia disper- siva (EDX). Nenhum nióbio pode ser detectado. Em outros estudos, um sinal tipo B foi apli- cado em células de cartilagem humanas (HCC) no meio de cultura contendo 1 % soro fetal de bezerro por 96 horas. O sinal tipo B ocasionou um aumento de 154 % no número de cé- lulas, medido pelo conteúdo de DNA da camada de célula, mostrando, novamente, nenhu- ma citotoxicidade significativa. Em uma comparação direta entre o sinal capacitivamente acoplado e um sinal de outra forma idêntico, mas eletromagneticamente acoplado, cada qual distribuído por 30 minutos diariamente por quatro dias, aumentos medidos no número de osteoblasto pelo DNA diferiu significativamente dos controles (157 %-para nióbio, 164 % para EM acoplado), mas um em relação ao outro. —

Conclusões

Uma ponte do eletrodo de nióbio inédita foi desenvolvida para aplicar sinais capaci- tivamente acoplados tipo PEF em células / tecidos na cultura. A banda passante da ponte de nióbio é de 5 Hz até 3 MHz, então, sinais tipo PEF como aqueles clinicamente usados para reparo de ossos e ferimentos passam sem distorção. Diferente das configurações padrões da ponte de eletrólito, a ponte de nióbio fornece densidade de corrente uniforme na placa de cultura. A aplicação para exposições estendidas de PEF não mostra nenhuma eletrólise ou citotoxicidade fisiologicamente significativa. Exemplo 3

Estímulo de Célalas de Cartilagem Usando um Sinal PEMF/PEF Capacitivamente Acoplado

Introdução

Um sinal de campo elétrico pulsado (PEF), que induz gradientes de tensão em teci- do, que são similares àqueles do PEMF (campos eletromagnéticos pulsados) usado clinica- mente para reparo ósseo, está sendo atualmente testado em relação à sua capacidade de reduzir dor nas articulações de pacientes artríticos. É de interesse se este sinal de alívio da dor também pode melhorar problema fundamental de cartilagem enfraquecida. Antecedentes

Comparado com terapias com medicamento e produtos biológicos, terapia com ba-

se em PEF oferece um tratamento que é fácil de usar, não invasivo, não envolve agente externo com efeitos colaterais potenciais e tem tempo de folga zero. Problemas com a tera- pia PEF incluem identificar células responsivas, elucidar um local de transdução física em uma célula e determinar o mecanismo biológico de ação que resulta em uma resposta celu- lar. O propósito deste estudo foi determinar se um sinal PEF específico atualmente testado em relação ao alívio da dor (MEDRELIEFr™, Healthonics, lnc, Ga.) pode estimular células de cartilagem in vitro e se um mecanismo biológico de ação pode ser solucionado. Métodos

Células de cartilagem humanas normais (HCC; CAMBREXrtm, Walkersville, Md.) foram plaqueadas em câmaras retangulares de célula em monocamada. A aplicação PEF foi capacitivamente acoplada através de um sistema de ponte do eletrodo de nióbio que permi- tiu que uma corrente com tempo variável fluísse uniformemente através das câmaras. Da Jforma aqui descrita, um sinal tipo B em rajada de pulso é composto por uma rajada de pul- sos retangulares assimétricos de 10 mseg, 200/28 microssegundos de largura, repetida em Hz. O sinal PEF foi aplicado por 30 minutos por tratamento. O crescimento celular foi avaliado pelo conteúdo de DNA da camada da célula. O conteúdo de oxido nítrico (NO) do meio de cultura foi avaliado pela reação Griess usando--um estojo de ensaio de INVITROGEN INC.R™ (Carlsbad, Calif.). Os resultados são expressados como micromoles de NO por número de célula, conforme avaliado pelo conteúdo de DNA da camada da célu- la.

Resultados

Um sinal PEF aplicado em 400 microamperes, pico a pico, em células HCC cresci-

das em meio cultivado contendo 1 % de soro fetal de bezerro, a cada 12 horas, por um perí- odo de 96 horas, resultou em maior crescimento celular de 153 ± 22 %, ρ < 0,001. É de inte- resse que foi condicionado meio de cultura coletado 24 horas depois de o primeiro tratamen- to PEF mostrar um aumento em NO de 196 ±14 %, ρ < 0,001, que caiu para níveis não sig- nificativos em 96 horas. Sob condições similares, quando SNP (um nitroprusseto de sódio doador de NO) -foi adicionado em uma concentração final de 3 microgramas/mL, também houve um aumento no NO em 24 horas (174 ± 2 6%, ρ < 0,001) e um aumento no número de células em 96 horas (168 ± 22 %, ρ < 0,001), se comparado com controles não tratados. Em um experimento subsequente, a concentração de soro foi reduzida para 0,1 %, o PEF aplicado em 40 microAmps uma vez a cada 24 horas, e medidas tomadas depois de 72 ho- ras. O tratamento PEF aumentou o conteúdo de NO no meio de cultura condicionado para 154 ± 30 %, < 0 ,01. Da forma mostrada na figura 7, o tratamento PEF aumentou o número de células, e esta resposta celular foi atenuada por L-NAME (um inibidor de sintase de oxido nítrico). Conclusão

Estes resultados sugerem que um sinal PEF atualmente testado por reduzir dor na articulação em função da artrite também pode fornecer um benefício para a cartilagem. Os dados indicam que células de cartilagem humanas podem responder a este sinal com maior crescimento celular. Além do mais, um possível mecanismo biológico de ação para cresci- mento celular da cartilagem estimulado por PEF é através da liberação de NO. Uma respos- ta similar das células de cartilagem a um doador de NO suporta esta hipótese. Os dados sugerem tanto que maior crescimento celular depois do tratamento PEF é mediado por NO, quanto que NO é uma etapa exigida no mecanismo para que PEF produza maior crescimen- to celular.

Exemplo 4

Estímulo PEMF/PEF da Produção BMP em uma Cultura de Osteoblasto Primária: Dependência da Configuração do Sinal e Duração da Exposição

Introdução

As um acessório para a cirurgia na fusão da espinha dorsal, ou para tratamento de não uniões recalcitrantes em ossos longos, PEMF se provou efetivo como uma terapia não cirúrgica. Trabalho piloto usando PEF (campos elétricos pulsados), que induz gradientes de tensão em tecido similar àqueles de PEMF (campos eletromagnéticos pulsados), demons- trou que osteoblastos respondem difererítèment^tanto à configuração de sinal quanto à duração. Uma diferença chave incluiu uma tendência de depositar matriz no lugar de prolife- ração celular. Com base em uma eficácia provada de BMP na fusão da espinha dorsal e em não uniões, e nos esforços que demonstram que BMP-2 e BMP-4 são estimulados por PEMF (Bodamyali, 1998), este estudo focalizou no melhor entendimento se as respostas celulares anteriores podem estar correlacionadas com a regulação de BMP.

Objetivo

Este estudo comparou duas configurações de forma de onda PEF distribuídas com acoplamento capacitivo, correlacionando variações bioquímicas e morfológicas em uma cul- tura celular óssea primária com regulação de BMP.

* Metodologia

Células de osteoblasto humanas normais foram estabelecidas em câmaras de cul- tura individuais de 10 cm2. Sinais foram aplicados em diversas câmaras simultaneamente pela conexão destas em série por meio de fios de nióbio que agiram como uma capacitância de acoplamento. O estímulo consistiu em um conjunto contínuo tanto de pulsos bipolares retangulares de 60/28 microssegundos, designados como "sinal A", quanto de pulsos bipola- res retangulares de 200/28 microssegundos, designado como sinal B, aplicando, pico a pico, campos elétricos de 1,2 mV/cm (em A) ou 2,4 mV/cm (em B) uniformemente nas culturas. Culturas foram expostas por 30 minutos (1), ou 2 horas (2), duas vezes ao dia, produzindo os grupos Α1, A2, B1 e B2 para comparação. Alíquotas previamente usadas para determi- nações da proteína da membrana determinações foram analisadas em relação à proteína de BMP por ensaio ELISA, e matrizes previamente usadas para determinar cálcio e interpretar a morfologia foram usadas para isolar RNA que foi subseqüentemente analisado por uma reação em cadeia transcriptase reversa polimerase (RT-PCR) de duas etapas usando inici- adores de seqüência conhecidos e disponíveis para (18s RNA) BMP-2 e BMP-7. Tanto o sinal que estimulou a proliferação quanto aquele que estimulou a deposição da matriz foram analisados em relação à regulação de BMP e à tradução de proteína. Amostras dos pontos no tempo em 7, 14 e 21 dias foram usadas para assegurar comparações idênticas para o ensaio.

Resultados

Os principais efeitos deste experimento foram seis: 1) proteína de BMP e RNAm para BMP foram elevados em resposta tanto a estímulo, particularmente, aquele do sinal "A"; 2) o estímulo de 30 minutos distribuído duas vezes por dia ofereceu aumento de quase 40 vezes na expressão de BMP-2 em 21 dias, comparado com o tratamento de 2 horas, com o maioria do ganho alcançado durante o período entre 14-21 dias; 3) o estímulo de 30 minutos para o sinal "A" forneceu um aumento de 15 vezes na expressão de BMP-7, nova- mente, quase integralmente percebido entre-as análises dos dias 14 e 21; 4) somente au- mentos moderados tanto em BMP-2 quarito em BUT-7 foram vistos em relação ao sinal "B"; 5) este estudo fornece a primeira evidência de que a expressão de BMP-7 é promovida pelo estímulo por PEF e 6) embora a avaliação da proliferação fosse qualitativa, a natureza mito- gênica da deposição de BMP é de acordo com o trabalho previamente publicado. Trabalho que avalia PEF em uma linha celular transformado por curtos períodos de tempo sugere que nem BMP-3 nem BMP-6 são estimulados (Yajima, 1996). Nosso modelo não foi avaliado em relação a estes fatores de crescimento.

Conclusão

Dado o corpo de trabalho que mostrou que BMP-2 tem propriedades morfogenéti- cas e mitogênicas, a proliferação das células em resposta ao sinal "A" não é surpreendente. Que as duas configurações de sinal produziram efeitos muito diferentes é potencialmente explicável por uma análise SNR que sugere que a dose de sinal "B" pode ser 10 X maior do que o sinal "A", com a suposição de um caminho de transdução Ca/CaM. Talvez mais ines- perado foram os níveis normalizados de BUT-2 e BMP-7, apesar da exagerada deposição de matriz permitida pelo sinal "Β". A formação óssea é muito dependente de um equilíbrio do fator de crescimento e da microtopografia da superfície, de fato, a presença de uma superfí- cie suave anula a resposta celular ao BMP-2 e acentua a mineralização distrófica. Dado os altos graus de organização e deposição da matriz vistos em resposta ao sinal "B", a trans- dução de BMP em si mesmo parece insuficiente para a produtiva formação óssea, e pode ocorrer por um mecanismo de alvejamento separado.

Exemplo 5

Estudo de Caso: Tratamento de Osteoporose com Estímulo PEMF

Um indivíduo osteoporótico (fêmea, idade 50, T= -3,092 no início) usou estímulo e- létrico usando Sinal B (200/30) de 4-5 dias por semana, de 3-5 horas por dia. O paciente permaneceu nos mesmos suplementos, medicações e atividades por um período de um ano. O acompanhamento do mapeamento da densidade óssea em 6 meses e 12 meses revelou um aumento de 16 % e 29 % na densidade da massa óssea, respectivamente. Exemplo 6

Efeito do Estímulo nos Condrócitos

O propósito desta investigação foi avaliar o efeito de vários estímulos na prolifera- ção e no desenvolvimento de condrócito.

Materiais

A maioria dos reagentes foi adquirida de Sigma (St Louis, MO), tais como o meio de cultura (DMEM), o soro de bezerro recém-nascido, e inibidores que incluíam W7 para a ini- bição de calmodulina, L-NAME para a inibição de sintase de óxido nítrico, LY82583 para a inibição de GTP ciclase, A23187 um ionóforo de cálcio, fator de crescimento tipo insulina-1 (IGF1), interleucina 1b (IL-Ib) e o doador de óxido nítrico, nitroprusseto de sódio (SNP).

Cultura CeIuIaF'

Condrócitos humanos normais foram obtidos de Clonetics, subdivisão de Lonza (Walkersville, MD) número de catálogo CC2550. Condrócitos cresceram para expansão em placas de cultura de 100 mm usando DMEM complementado com 5 % de soro de bezerro. Para experimentos, condrócitos foram desanexados usando tripsina, agrupados em uma única alíquota, contados e, então, separados em furos de cultura usando DMEM que contém 0.1 % de soro de bezerro. O uso de 0,1 % de soro de bezerro foi determinado pelos estudos preliminares que indicam que esta foi a mais baixa concentração de soro de bezerro que manteve condrócitos saudáveis quando cultivados por quatro dias. Para o tratamento com sinal PEF, condrócitos foram plaqueados em placas retangulares de 8 furos fabricadas por Nunc (adquirido através de Sigma, número de catálogo 1256578). Células foram plaqueadas em seis furos (n=6), com dois furos de fim contendo somente salina tamponado com fosfato (PBS). Assim, os oito furos formaram um arranjo linear com furos de nas extremidades. Co- nexão foi feita a partir do gerador de PEF através de eletrodos de prata / cloreto de prata nos furos com PBS, mas ao longo do arranjo com saltadores de nióbio, da forma explicada a seguir, assim, isolando o meio e as células de contaminação por íons de prata.

Proliferação Celular

O conteúdo de DNA da camada da célula foi usado como um índice do número de células, e um aumento no número de células foi usado como uma indicação de maior prolife- ração celular. O meio de cultura foi removido, e a camada da célula enxaguada com salina tamponado com fosfato. A camada da célula foi extraída com 0,1 N de hidróxido de sódio e uma alíquota medida em relação ao DNA usando o Estojo de Ensaio de Proliferação Celular CyQuant de Molecular Probes (Eugene, OR) subdivisão de Invitrogen, número de catálogo C7026.

Medição de Óxido Nítrico

Nitrito em meio de cultura foi medido como um índice dos níveis de óxido nítrico usando a reação Griess (Guevara et al. Clin. Chim. Acta 274(2): 177-188 (1998)). Uma ali- quota (250 μΙ_) de meio de cultura condicionado foi coletada e medida em relação aos níveis de nitrito pela adição de 50 μL do coquetel de reação Griess do Estojo Reagente Griess de Molecular Probes, número de catálogo G7921. Medição de cGMP

O nível de cGMP na camada da célula foi medido usando o Estojo de Imunoensaio

de Enzima cGMP da Sigma (número de catálogo CG200-1kt). O meio de cultura foi removi- do e a camada da célula enxaguada com salina tamponado com fosfato em 4 °C. A camada da célula foi extraída com 0,1 N de ácido hidroclórico por instruções no estojo de ensaio e uma alíquota medida for cGMP. Sinal PEF

O sinal PEFiri/IEDRELIEF® modelo SE55, Healthonics lnc, Atlanta1 GA) é caracte- rizado por uma forma de onda em rajada de pulso com um primário sinal de pulsos retangu- lares assimétricos bifásicos. Em uma modalidade, o sinal PEF compreende 200/30 micros- segundos em cada polaridade, respectivamente, repetindo em 4.150 Hz1 distribuído em ra- jadas de 10 milissegundos, 15 vezes por segundo. Componentes positivos e negativos equi- libram, produzindo uma carga líquida zero. A corrente aplicada produz campos elétricos de cerca de 0,1 até 10 milivolts por centímetro, em tecidos ou meio de cultura tratados, que está na mesma faixa daquelas induzidas por sinais PEMF usados em estimuladores do crescimento ósseo para reparo ósseo. O sinal PEF consiste, substancialmente, na mesma forma de onda do sinal PEMF

produzido pelos estimuladores do crescimento ósseo usando bobinas indutivas, mas, em vez disto, é distribuído pelo acoplamento capacitivo. O sinal PEF pode usar a mesma ou diferente duração de rajadas dos conjuntos de pulso ou ter outras diferenças da forma de onda do sinal da forma descritas neste pedido. Para alívio da dor, o sinal PEF usa um maior comprimento da rajada (dez, em vez de cinco segundos), que, descobriu-se, aumentou o alívio da dor em um pequeno grupo de teste, e um pulso equalizador é adicionado no fim de cada rajada para equilíbrio da carga. Na figura 9 o sinal PEF usado nestes estudos é com- parado com o sinal PEMF usado em um estimulador de crescimento ósseo.

Na figura 9 a marca do topo mostra o sinal PEF e a marca de base mostra o sinal PEMF do qual ele foi modificado. Em ambos os sinais, está presente um trem de pulsos que é repetido em uma taxa de 15 Hz (por exemplo, separação de 67 milissegundos) e pulsos individuais (insertos) são os mesmos para ambos os sinais. Uma diferença são as corridas do trem de pulsos PEMF por 5 milissegundos, enquanto o trem de pulsos PEF corre por 10 milissegundos, o que transmitirá duas vezes mais energia. Tipicamente, a largura de pulso de 5 milissegundos pode (mas sem limitação a esta duração) ser usado em aplicações de estímulo ósseo e, tipicamente, a largura de pulso de 10 milissegundos pode (mas sem limi- tação a esta duração) ser usado em aplicações de dor. Também há uma diferença na forma cio trem de pulsos, e para o sinal PEF há um sinal adicionado depois de cada trem de pulsos equalizar as cargas, então, não há movimento de carga líquida no fim de cada trem de pul- sos (partes negativa e positiva igualam uma à outra). De modo concebível, estas formas de onda ligeiramente diferentes com pulsos de 5 ou 10 milissegundos podem promover diferen- tes caminhos de transdução de sinal com cinética ligeiramente diferente. Por exemplo, os dois podem promover ligação de cálcio / calmodulina quando a calmodulina em cada cami- nho ficar em um ambiente celular ligeiramente diferente.

Aplicação do Sinal PEF na Cultura Celular

O sinal PEF foi distribuído pelo acoplamento capacitivo nos condrócitos usando uma substituição-inédita para tradicionais pontes de sal (Kronberg J. et al. 28th annual mee- ting,"Bioelecrròmagnetics Society, abstract 11-5 (2006)). Neste sistema inédito, o arame dos saltadores de nióbio foi usado em vez das pontes de sal. Quando anodizado, nióbio forma uma camada de óxido de nióbio (Nb2O5) muito durável e uniforme, cuja espessura é rigoro- samente controlável. As cores vividas e não desvanecentes na interferência da luz resultan- tes são usadas em joalheria, e nióbio de joalheiro é fabricado em cores padrões. De forma importante para esta aplicação, a alta constante dielétrica de Nb2O5 produz uma alta, mas estável, capacitância por área unitária, diretamente indicada pela cor. O nióbio usado nestes experimentos é "púrpura", com uma capacitância de 0,158 pF/cm para arame de bitola 22. Uma vantagem deste material é que pequenos defeitos provenientes da curvatura ou corte do arame "curam" com óxido quando na água ou em meio de cultura.

Arame de nióbio é cortado e curvo para formar pontes entre furos de cultura, e o si- nal PEF passa através destas pontes capacitivamente. Múltiplos furos são agrupados em série. O arame é formado encaixar através de uma extremidade dos furos retangulares e produz um campo elétrico uniforme (± 3 %) através do meio de cultura em um furo retangu- lar. A banda passante linear medida varia de 5 Hz até 3 MHz, permitindo que o sinal PEF seja aplicado com distorção desprezível. O sistema de exposição, que ilustra a ponte Nb2O5, é mostrado na figura 10.

- A figura 10 fornece uma representação gráfica de uma configuração típica para tra- tar células de cartilagem in vitro com um sinal PEF. Para uma placa de cultura de tecido de 8 furos, células de cartilagem (C) em meio de cultura são adicionadas em seis furos. Os dois furos restantes ficam vazios (B) e contêm salina tamponado com fosfato. Eletrodos de prata se estendem para o interior dos furos vazios e se conectam em grampos tipo jacaré que, através de condutores do arame, são conectados em um gerador de sinal mostrado, Heal- thonics modelo SE-55. O resistor (R) em um condutor do arame é usado para limitar o des- Iocamento da corrente através do meio de cultura. Os furos individuais no interior da placa de cultura de 8 furos são conectados com fios do saltador de nióbio que se estendem na largura de cada furo, cruzam sobre o topo e se estendem na largura do próximo furo. No lado direito mais distante, um único arame de nióbio se estende na largura do furo superior, cruza sobre o furo de base, e se estende na largura do furo inferior. Como uma opção, um par de eletrodos de medição (ME) pode ser adicionado para medir campos elétricos no meio de cultura. Favor notar que para experimentos reais, a tampa para a placa de cultura é adi- cionada com propósitos de esterilidade, o gerador de sinal é colocado no exterior do incuba- dor, e os fios são estendidos para alcançar do exterior do incubador até o interior do incuba- dor.

Estudos preliminares não descobriram indicação de citotoxicidade quando o sinal PEF foi distribuído tanto para osteoblastos quanto para condrócitos por meio da ponte de nióbio. Nenhuma mudança na temperatura ou no pH foi detectada no meio de cultura trata- do p~òr PEF por 30 minutos, distribuído uma vez ao dia durante um período de quatro dias. Usando raios X por energia dispersiva (EDX), nenhum nióbio pode ser detectado no meio de cultura.

Estatística

Para todas as medidas, o valor médio e o desvio padrão são relatados. O número

de amostras por grupo foi seis. Dados são expressados como percentual dos valores de controle. Múltiplas barras de controle em um gráfico indicam que comparações foram reali- zadas somente entre grupos no mesmo experimento. Todas as descobertas experimentais chaves foram repetidas pelo menos três vezes. Dados são mostrados para experimentos representativos específicos. Por exemplo, em uma série de dez experimentos consecutivos, a exposição ao sinal PEF aumentou significativamente a proliferação de condrócito em nove dos dez experimentos. Nos nove experimentos com aumentos significativos no número de células da cartilagem, o aumento variou de 134 % até 261 % de valores de controle. A mé- dia para todos os dez experimentos foi de 165 %, e a mediana foi de 155 %. A seção de resultados mostra dados para aqueles experimentos nos quais o sinal PEF aumentou a pro- liferação de condrócito na faixa de 150 %. A estatística se baseou no teste ANOVA e Sidak- Holms post-hoc para significância, que foi aceito em P < 0,05 (SigmaStat 3.0).

Resultados

O desenho experimental foi, primeiro, investigar se PEF teve um efeito na prolifera- ção de condrócito medida 72 horas depois do tratamento PEF. Segundos mensageiros, tais como óxido nítrico, foram inicialmente medidos no meio de cultura em 72 horas. Então, o desenho experimental deslocou para a medição dos segundos mensageiros no período de tratamento PEF de 30 minutos, já que é neste nível que, mais provavelmente, os sinais PEF disparam o início das cascatas biológicas que se manifestam em 72 horas (por exemplo, proliferação). Então, inibidores descobertos por bloquear precocemente (< 30 minutos) mu- danças nos segundos mensageiros foram testados em relação aos efeitos na proliferação de condrócito em 72 horas pós-tratamento PEF. Em estudos preliminares, o tratamento PEF produziu aumentos reprodutíveis na proliferação de condrócito, 72 horas depois do tratamento, usando um único período de tra- tamento de 30 minutos com amplitude produzindo 2,7 microamperes através do meio de cultura e de um campo elétrico de 0,2 mV/cm. Da forma mostrada na figura 11, quando con- drócitos foram tratados tanto por PEF, IGF1 quanto por interleucina 1b, houve um aumento nos níveis de óxido nítrico no meio de cultura 72 horas depois. Entretanto, não houve uma clara correlação entre os níveis de óxido nítrico e as mudanças no número de células à me- dida que a interleucina 1b diminuiu o número de células, enquanto que tanto PEF quanto IGF1 aumentaram o número de células condrócito. - A figura 11 fornece um gráfico que mostra os resultados deste experimento, de-

monstrando os efeitos do estímulo do condrócito por três diferentes estímulos: PEF, IGF1 e IL-1 b. Da forma aqui descrita, condrócitos humanos normais foram plaqueados em DMEM contendo 0,1 % de soro de bezerro e anexado e equilibrado naturalmente por 24 horas. No gráfico mostrado, o sinal PEF foi aplicado por 30 minutos em 2,7 μΑ (campo elétrico no meio de cultura = 0,2 mV/cm). IGF1 e IL-Ib foram adicionados em uma concentração final de 10 ng/ml_. As culturas incubaram naturalmente por 72 horas antes da terminação. Uma alíquota do meio de cultura foi coletada e óxido nítrico (barras sólidas - NO) medido pela reação Gri- ess. A camada da célula foi enxaguada com salina tamponado com fosfato, extraída com hidróxido de sódio e medida em relação ao conteúdo de DNA como um índice de prolifera- ção. Os dados são expressados como percentual de controles correspondentes (n=6). Note que o óxido nítrico não foi normalizado em relação ao conteúdo de proteína da camada da célula. * denotes P < 0,05.

No mesmo conjunto de experimentos, uma resposta de dose ao IGF1 indicou um estímulo máximo de 160 % de valores de controle em uma concentração de 10 ng/mL (da- dos não mostrados). Concentrações mais altas de IGF1 (até 100 ng/mL) não produziram um maior aumento no crescimento celular. Como tal, neste experimento em particular, tratamen- to PEF estimulou a proliferação em aproximadamente 50 % do estímulo máximo por IGF1.

Quando os níveis de NO em 72 horas foram normalizados em relação ao DNA, tra- tamento PEF não teve efeito (35,5 ± 4,5 nanomoles/pg para controle em relação a 36,2 ± 3,9 nanomoles/pg para PEF) e nem IGF1 (34,6 ± 5,6 nanomoles/pg para controle em relação a 31,1 ± 6,7 nanomoles/pg para IGF1 em uma concentração de 10 ng/mL). Ao contrário, inter- leucina 1b aumentou significativamente óxido nítrico normalizado em relação ao DNA em quase 10 vezes (38,9 ± 6,3 nanomoles/Mg para controle em relação a 385,3 ± 164,5 nano- moles/pg para IL-Ib em 10 ng/mL). Exemplo 7

Efeito de tratamento PEF na liberação de NO em curto prazo Materiais & Métodos Da forma descrita no Exemplo 5 supra.

Resultados

Em estudos preliminares, descobriu-se que PEF pode aumentar o conteúdo de oxi- do nítrico transitoriamente em 30 minutos de iniciação de tratamento PEF1 e este óxido nítri- co elevado pode retornar, tipicamente, aos níveis de controle em pouco tempo (< 1 hora) posteriormente (dados não mostrados). Nem conteúdo de DNA nem conteúdo de proteína de camada da célula mudou significativamente em função do tratamento PEF neste curto período de tempo.

Em uma outra série de experimentos preliminares que adicionam tanto 0,5 mM de CaCI2 no meio de cultura quanto o ionóforo de cálcio A23187 em 1 millimolar e medem o conteúdo de óxido nítrico do meio de cultura 30 minutos depois mostrou-se um aumento em óxido nítrico na faixa de 150 %, se comparado com os valores de controle, (figura 12). Estes dados sugerem que cálcio pode ser parte do caminho biológico para aumentar o óxido nítri- co nas células de cartilagem. A figura 12 fornece um gráfico que compara a liberação de óxido nítrico (NO) em

curto prazo (30 minutos) por condrócitos humanos normais na presença de cloreto de cálcio e de ionóforo de cálcio A23187. Da forma aqui descrita, condrócitos humanos normais foram plaqueados em DMEM que contém 0,1 % de soro de bezerro e anexaram e equilibraram naturalmente por 24 horas. Em um experimento (barras claras), 0,6 millimolar de cloreto de cálcio foi adicionado 30 minutos antes da medição de óxido nítrico em meio de cultura. Em um segundo experimento (barras escuras), o ionóforo de cálcio A23187 foi adicionado em uma concentração final de 1 millimolar 30 minutos antes da medição de óxido nítrico em meio de cultura. O meio de cultura foi medido em relação ao conteúdo de NO pela reação Griess. A camada da célula foi enxaguada com salina tamponado com fosfato, extraída com hidróxido de sódio e medida em relação ao conteúdo de proteína. A proteína da camada da célula foi usada para normaliza o conteúdo de óxido nítrico. Não houve diferenças significa- tivas no conteúdo de proteína. Os dados são expressados como percentuais de controles correspondentes (n=6). * designa P < 0,05.

Para determinar caminhos envolvidos na resposta ao tratamento PEF, condrócitos foram tratados com PEF em experimentos com e sem inibidores. Da forma mostrada na fi- gura 13, tratamento PEF aumentou os níveis de óxido nítrico quando medidos 30 minutos depois da iniciação do tratamento. No experimento mostrado, a inclusão de L-NAME (um inibidor de sintase de óxido nítrico endotelial - eNOS) bloqueou a capacidade de PEF au- mentar óxido nítrico da forma esperada se óxido nítrico for catalisado por isoformas de NOS. Em um outro experimento (também mostrado na figura 13), o inibidor calmodulina, W7, blo- queou a liberação de óxido nítrico depois do tratamento PEF.

O gráfico mostrado na figura 13 fornece um sinal PEF e liberação de NO no curto prazo (30 minutos) na presença de L-NAME (inibidor de sintase de óxido nítrico) e W7 (inibi- dor de calmodulina). Da forma aqui descrita, condrócitos humanos normais foram plaquea- dos em DMEM que contém 0,1 % de soro de bezerro e anexaram e equilibraram natural- mente por 24 horas. Em um experimento (barras claras) L-NAME foi adicionado em 1 mM de concentração final 6 horas antes do tratamento por sinal PEF. Em um segundo experi- mento (barras escuras), W7 foi adicionado em 0,5 mM 2 horas antes do tratamento por sinal PEF. O sinal PEF foi aplicado por 30 minutos em 2,7 uA (campo elétrico no meio de cultura = 0,2 mV/cm). No fim do período de tratamento de 30 minutos com sinal PEF, o meio de cultura foi medido em relação ao conteúdo de NO por reação Griess. A camada da célula foi enxaguada com salina tamponado com fosfato, extraída com hidróxido de sódio e medida em relação ao conteúdo de proteína. A proteína da camada da célula foi usada para norma- lizar o conteúdo de óxido nítrico. Não houve diferenças significativas no conteúdo de proteí- na. Os dados são expressados em percentual de controles correspondentes (n=6). * desig- na P < 0,05. Exemplo 8

Efeito do tratamento PEF na geração de cGMP no curto prazo

Materiais & Métodos

Da forma descrita no Exemplo 5 supra.

Resultados

Óxido nítrico age como um segundo mensageiro para a ativação de guanilato cicla-

se (Knowles R. et al., PNAS 86:5159-5162) (1989)). Portanto, cGMP foi medido na camada célula depois do tratamento PEF. Da forma mostrada na figura 14, o tratamento PEF au- mentou cGMP no período de tratamento de 30 minutos. Este efeito foi bloqueado tanto por W7 quanto por L-NAME, da forma esperada se cGMP fosse aumentado em uma cascata de calmodulina para sintase de óxido nítrico em cGMP.

A figura 14 fornece um gráfico que mostra que sinal PEF aumenta a geração de cGMP no curto prazo (30 minutos). Da forma aqui descrita, condrócitos humanos normais foram plaqueados em DMEM que contém 0,1% de soro de bezerro e anexaram e equilibra- ram naturalmente por 24 horas. Em um experimento (barras claras) L-NAME foi adicionado em 1 mM de concentração final 6 horas antes do tratamento por sinal PEF. Em um segundo experimento (barras escuras), W7 foi adicionado em 0,5 mM 2 horas antes do tratamento por sinal PEF. O sinal PEF foi aplicado por 30 minutos em 2,7 uA (campo elétrico em meio de cultura = 0,2 mV/cm). No fim dos 30 minutos do tratamento por sinal PEF, a camada da célula foi enxaguada com salina tamponado com fosfato, extraída e medida tanto em rela- ção ao conteúdo de cGMP quanto em relação ao conteúdo de proteína. A proteína da ca- mada da célula foi usada para normalizar o conteúdo de cGMP. Os dados são expressados como percentuais de controles correspondentes (n=6). * designa P < 0,05. Da forma mostrada na figura 15, tanto PEF quanto um doador de oxido nítrico (SNP) aumentaram o conteúdo de cGMP da camada da célula em 30 minutos de tratamen- to, da forma também mostrada na figura 12. O inibidor de guanilato ciclase (LY83583) blo- queou tanto o tratamento PEF quanto SNP de aumentar os níveis de cGMP, indicando que o inibidor funciona da forma esperada. Neste experimento, o tratamento PEF aumentou o óxido nítrico no meio de cultura para 140 ± 17 % de valores de controle, ρ < 0,03 e SNP aumentou o óxido nítrico no meio de cultura para 4.813 ± 727 % de valores de controle, ρ < 0,001.

A figura 15 fornece um gráfico que mostra que o sinal PEF e nitroprusseto de sódio (SNP) (doador de óxido nítrico) aumentaram a geração de cGMP no curto prazo (30 minu- tos). Da forma aqui descrita, condrócitos humanos normais foram plaqueados em DMEM que contém 0,1 % de soro de bezerro e anexaram e equilibraram naturalmente por 24 horas. O inibidor LY83583 foi adicionado em 1 mM de concentração final 4 horas antes do trata- mento por sinal PEF ou da adição de SNP (um doador de NO). O sinal PEF foi aplicado por 30 minutos em 2,7 uA (campo elétrico no meio de cultura = 0,2 mV/cm). No fim dos 30 minu- tos do tratamento por sinal PEF ou da presença de SNP, a camada da célula foi enxaguada com salina tamponado com fosfato, extraída e medida tanto em relação ao conteúdo de cGMP quanto em relação ao conteúdo proteína. A proteína da camada da célula foi usada para normalizar o conteúdo de cGMP. Os dados são expressados como percentual de con- troles correspondentes (n=6). * designa P < 0,05.

Exemplo 9

Efeito dos Inibidores na Capacidade do tratamento PEF para Aumentar a Prolifera- ção Celular em 72 Horas

Materiais & Métodos Da forma descrita no Exemplo 5 supra.

Resultados

Da forma mostrada na figura 16, tratamento PEF, quando aplicado por um tempo de 30 minutos, aumentou a proliferação de condrócito, da forma observada nos experimen- tos anteriores. Quando L-NAME foi adicionado antes do tratamento PEF, o aumento na pro- liferação de condrócito foi eliminado. Em um experimento separado, o inibidor LY83583, também bloqueou a proliferação de condrócito depois do tratamento PEF.

O gráfico fornecido na figura 16 mostra o efeito estimulatório de sinal PEF na proli- feração de condrócito em 72 horas e o menor efeito estimulatório do estímulo de sinal PEF na presença de L-NAME (inibição de sintase de óxido nítrico) e de LY82583 (inibição de GTP ciclase). Da forma aqui descrita, condrócitos humanos normais foram plaqueados em DMEM que contém 0,1% de soro de bezerro e anexaram e equilibraram naturalmente por 24 horas. Em um experimento (barras claras), L-NAME foi adicionado em 1 mM de concentra- ção finai 6 horas antes do tratamento por sinal PEF. Em um segundo experimento (barras escuras), LY83583 foi adicionado em 0,5 mM 4 horas antes do tratamento por sinal PEF. O sinal PEF foi aplicado por 30 minutos em 2.7 uA (campo elétrico no meio de cultura = 0,2 mV/cm). As culturas incubaram naturalmente por um período de 72 horas adicionais. A ca- mada da célula foi enxaguada com salina tamponado com fosfato, extraída com hidróxido de sódio e medida em relação ao conteúdo de DNA como um índice de proliferação. Os dados são expressados como percentual de controles correspondentes (n=6). * designa P < 0,05.

Exemplo 10

Efeito de SNP na Proliferação de Condrócito em 72 horas Materiais & Métodos

Da forma descrita no Exemplo 5 supra.

Resultados

Da forma mostrada na figura 17, SNP foi adicionado em uma concentração final de 150 μΜ, que aumentou o conteúdo de óxido nítrico no meio de cultura para 752 ± 74 % de valores de controle, ρ < 0,001. Quando o meio de cultura foi mudado 5 minutos depois da adição de SNP1 não houve mudança na proliferação de condrócito. Quando o meio foi mu- dado tanto 30 minutos quanto 90 minutos depois da adição de SNP, houve um aumento significativo na proliferação de condrócito. Se SNP incubou naturalmente com as células por horas, 44 horas ou 72 horas, houve uma diminuição significativa na proliferação de con- drócito, comparado com controles sem tratamento SNP.

Especificamente, a figura 17 fornece um gráfico que mostra os efeitos do doador de óxido nítrico, nitroprusseto de sódio (SNP), no crescimento celular da cartilagem em 72 ho- ras. Condrócitos humanos normais foram plaqueados em DMEM que contém 0,1 % de soro de bezerro e anexaram e equilibraram normalmente por 24 horas. SNP foi adicionado e, então, em vários momentos, o meio foi removido e substituído por DMEM fresco que contém 0,1 % de soro de bezerro. Culturas de controle foram incubadas em paralelo e o meio foi trocado nos mesmos momentos das culturas tratadas com SNP. Todas as culturas foram interrompidas ao mesmo tempo e 72 horas depois da adição de SNP. A camada da célula foi enxaguada com salina tamponado com fosfato, extraída com hidróxido de sódio e medida em relação ao conteúdo de DNA como um índice de proliferação celular. Os dados são ex- pressados em nanogramas de DNA na camada da célula (n=6). Círculos sólidos são contro- les e círculos vazios tratados com SNP. Note que: eixo geométrico χ é escala logarítmica. * designa P < 0,05.

Claims

1. Método para modular o desenvolvimento de condrócitos, CARACTERIZADO pe- lo fato de que compreende estimular os condrócitos com um sinal elétrico, em que o sinal elétrico compreende um sinal tipo A, tipo B1 tipo C ou tipo D, por um período de tempo sufi- ciente para modular o desenvolvimento ou o reparo do tecido, e em que o sinal elétrico é distribuído através de acoplamento capacitivo.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende adicionalmente estimular um desenvolvimento com um segundo sinal elétrico, em que o segundo sinal elétrico compreende um sinal tipo A, tipo B, tipo C ou tipo D.

3. Método, de acordo com a reivindicação 2, CARACTERIZADO pelo fato de que o sinal tipo A compreende um componente longo com comprimento β e um componente curto"' com um comprimento a.

4. Método, de acordo com a reivindicação 2, CARACTERIZADO pelo fato de que o sinal tipo A compreende um componente longo de cerca de 60 pseg de duração e um com- ponente curto de cerca de 28 pseg de duração.

5. Método, de acordo com a reivindicação 2, CARACTERIZADO pelo fato de que o sinal tipo B compreende um componente longo com um comprimento γ e um curto com um comprimento a.

6. Método, de acordo com a reivindicação 2, CARACTERIZADO pelo fato de que o sinal tipo B compreende um componente longo de cerca de 200 pseg de duração e um componente curto de cerca de 28 pseg de duração.

7. Método, de acordo com a reivindicação 2, CARACTERIZADO pelo fato de que os dois sinais elétricos são administrados de forma simultânea ou seqüencial para promover a proliferação ou a diferenciação.

8. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o período de tempo compreende 1-60 minutos, 1-45 minutos, 1-30 minutos ou 1-15 minutos.

9. Método, de acordo com a reivindicação 8, CARACTERIZADO pelo fato de que o sinal elétrico é distribuído através de eletrodos na pele.

10. Método, de acordo com a reivindicação 8, CARACTERIZADO pelo fato de que o sinal elétrico é distribuído através de um fluido condutor em contato com a pele ou com os tecidos, e em que pelo menos um eletrodo é colocado em contato com o dito fluido condu- tor.

11. Método, de acordo com a reivindicação 10, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito pelo menos um eletrodo é feito de um metal auto-apassivador.

12. Método, de acordo com a reivindicação 8, CARACTERIZADO pelo fato de que o sinal elétrico é distribuído através de uma almofada ou corpo de material poroso umedeci- do com um fluido condutor e colocado em contato com a pele ou com os tecidos, pelo me- nos um eietrodo sendo também colocado em contato com o dito fluido condutor.

13. Método, de acordo com a reivindicação 12, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito pelo menos um eletrodo é feito de um metal auto-apassivador.

14. Método, de acordo com a reivindicação 8, CARACTERIZADO pelo fato de que o sinal elétrico é distribuído através de um fluido condutor no qual os tecidos ou células indi- viduais são imersos ou suspensos, pelo menos um eletrodo de metal auto-apassivador sen- do também colocado em contato com o dito fluido condutor.

15. Método, de acordo com a reivindicação 8, CARACTERIZADO pelo fato de que o sinal elétrico é distribuído através de pelo menos uma superfície condutora de um metal auto-apassivador na qual os tecidos ou células individuais são anexados.

16. Método, de acordo com a reivindicação 8, CARACTERIZADO pelo fãtò de qtrè o sinal elétrico é distribuído através de pelo menos um eletrodo de um metal auto- apassivador colocado em contato com os tecidos a ser tratados, ou neíès embutido, com o propósito de tal tratamento.

17. Método, de acordo com a reivindicação 8, CARACTERIZADO pelo fato de que o sinal elétrico é distribuído através de pelo menos um objeto de um metal auto-apassivador implantado no corpo, em que o dito pelo menos um objeto, tal como um pino de um fixador de osso externo, serve com um outro propósito além da distribuição de um sinal elétrico.

18. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o estímulo elétrico modula a produção de óxido nítrico.

19. Estojo para preparar um tecido adequado para transplante, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende células vivas e um estimulador elétrico que fornece um estí- mulo elétrico em forma de onda, em que o estímulo elétrico em forma de onda compreende um sinal tipo A, tipo B, tipo C ou tipo D, em que a forma de onda promove a proliferação ou a diferenciação das células em um tecido adequado para transplante, e em que o sinal elé- trico é distribuído através de acoplamento capacitivo.

20. Estojo1 de acordo com a reivindicação 19, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende adicionalmente uma plataforma biodegradável ou bioestável.

21. Estojo, de acordo com a reivindicação 20, CARACTERIZADO pelo fato de que a plataforma é feita de um material selecionado a partir de polímeros naturais ou sintéticos.

22. Estojo, de acordo com a reivindicação 19, CARACTERIZADO pelo fato de que a plataforma fica em associação com a promoção do crescimento ou com a promoção da adesão de moléculas.

23. Estojo, de acordo com a reivindicação 19, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende adicionalmente dispositivo para carga mecânica das células.

24. Estojo, de acordo com a reivindicação 19, CARACTERIZADO pelo fato de que as células compreendem condrócitos, osteoblastos, fibroblastos, tenócitos, células precurso- ras, céiuias embriológicas, células-tronco ou células progenitoras.

25. Método para modular proliferação de condrócito, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende estimular os condrócitos com um sinal elétrico, em que o sinal elétrico compreende um sinal tipo A, tipo B, tipo C ou tipo D, por um período de tempo suficiente para modular a produção de oxido nítrico, para modular a produção de cGMP ou para modu- lar caminhos de cálcio/calmodulina, e em que o sinal elétrico é distribuído através de aco- plamento capacitivo.

26. Método, de acordo com a reivindicação 25, CARACTERIZADO pelo fato de que a proliferação de condrócito é aumentada.

27. Método, de acordo com a reivindicação 25, CARACTERIZADO pelo fato de que o período de tempo compreende 1-60 minutos, 1-45 minutos, 1-30 minutosTou 1-f5"minutos.

28. Método, de acordo com a reivindicação 25, CARACTERIZADO pelo fato de que a produção de óxido nítrico é aumentada.

29. Método, de acordo com a reivindicação 25, CARACTERIZADO pelo fato de que a produção de cGMP é aumentada.

30. Método, de acordo com a reivindicação 25, CARACTERIZADO pelo fato de que o cálcio/calmodulina é estimulado.

31. Método para modular o desenvolvimento ou reparo ósseo, da cartilagem ou de outro tecido conjuntivo, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende estimular o de- senvolvimento ou a regeneração de tecido com um sinal elétrico, em que o sinal elétrico compreende um sinal tipo A, tipo B, trpo C ou tipo D, por um período de tempo suficiente para modular o desenvolvimento ou o reparo do tecido, em que o sinal elétrico é distribuído através de acoplamento capacitivo.

32. Método, de acordo com a reivindicação 31, CARACTERIZADO pelo fato de que a cartilagem, osso ou outro tecido conjuntivo compreende condrócitos, osteoblastos, células progenitoras, fibroblastos, tenócitos, células precursoras, células embriológicas ou células- tronco.

33. Método, de acordo com a reivindicação 32, CARACTERIZADO pelo fato de que as células progenitoras compreendem progenitores não comprometidos, progenitores com- prometidos, células progenitoras multipotentes ou células progenitoras pluripotentes.

34. Método, de acordo com a reivindicação 31, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende adicionalmente estímulo com um segundo sinal elétrico, em que o segundo sinal elétrico compreende um sinal tipo A, tipo B, tipo C ou tipo D.

35. Método, de acordo com a reivindicação 31, CARACTERIZADO pelo fato de que o sinal tipo A compreende um componente longo com um comprimento β e um componente curto com um comprimento a.

36. Método, de acordo com a reivindicação 31, CARACTERIZADO pelo fato de que o sinai tipo A compreende um componente longo de cerca de 60 pseg de duração e um componente curto de cerca de 28 pseg de duração.

37. Método, de acordo com a reivindicação 31, CARACTERIZADO pelo fato de que o sinal tipo B compreende um componente longo com um comprimento γ e um curto com um comprimento a.

38. Método, de acordo com a reivindicação 31, CARACTERIZADO pelo fato de que o tipo B compreende um componente longo de cerca de 200 pseg de duração e um compo- nente curto de cerca de 28 μseg de duração.

39. Método, de acordo com a reivindicação 31, CARACTERIZADO pelo fato de que os dois sinais elétricos são administrados de forma simultânea ou seqüencial- para promover a proliferação ou a diferenciação.

40. Método, de acordo com a reivindicação 31, CARACTERIZADO pelo fato de que o período de tempo compreende 1-60 minutos, 1-45 minutos, 1-30 minutos ou 1-15 minutos.

41. Método, de acordo com a reivindicação 31, CARACTERIZADO pelo fato de que o sinal elétrico é distribuído através de eletrodos na pele.

42. Método, de acordo com a reivindicação 31, CARACTERIZADO pelo fato de que fatores de crescimento, citocinas, células mensageiras e outros agentes bioativos são inten- sificados.