BRPI0721984A2 - Interferon alfa 2b modificado por polietileno glicol, preparação e uso do mesmo - Google Patents

Interferon alfa 2b modificado por polietileno glicol, preparação e uso do mesmo Download PDF

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Qingjiang Xiao
Li Sun
Tiebing Wang
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Shihong Luo
Lu Zhuang
Min Liu
Tianle Xu
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Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "INTERFE- RON ALFA 2B MODIFICADO POR POLIETILENO GLICOL, PREPARA- ÇÃO E USO DO MESMO".
CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se ao interferon-a2b modificado com
polietileno glicol de ramificação em forma de Y (PEG) em um único resíduo de aminoácido e a preparação do mesmo, bem como o uso do IFN-a2b PE- Guilado preparado em um único resíduo de aminoácido no campo farmacêu- tico.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
Interferons (IFNs) são uma família de proteínas ou glicoproteí- nas de molécula pequena produzida por células eucarióticas em resposta a infecção viral e outros estímulos antigênicos, que exibe efeitos antivirais, antiproliferativos e imunomoduladores de amplo espectro. IFNs foram am- piamente aplicados no tratamento de várias condições e doenças, tal como infecções virais, por exemplo, hepatite B, hepatite C e HIV; distúrbios e do- enças inflamatórias, por exemplo, esclerose múltipla, artrites, asma, fibrose cística e pulmonar intersticial doença; e tumores, por exemplo, mielomas, linfomas, câncer do fígado, câncer do pulmão, leucemia de célula pilosa, e assim por diante (Kenji Oritani, Paul W Kincade e outros. Type I interferon and limitin: a comparison of structures, receptors, and functions. Cytokine and Growth Factor Reviews, 12, 337-348, 2001; Yu-Sen Wang, Stephen Youngster, e outros Structural and biological characterization of PEGyIated recombinant interferon alfa-2b and its therapeutic implications. Advance Drug Delivery Reviews, 54, 547-570, 2002).
IFNs são classificados em quatro tipos de acordo com suas dife- renças em propriedades químicas, imunológicas e biológicas: interferon- a, β, y e ε. Interferon-a (IFN-a) é secretado por leucócitos. IFNs-α humanos são codificados por uma família de multigene que consiste em cerca de 20 30 genes, as proteínas codificadas compartilhando até cerca de cerca de 90% de homologia de seqüência de aminoácido (Henco K., Brosius F.J., e outros. J. Mol. Biol., 185, 227-260, 1985). IFN-a2b humano é um dos subtipos da subfamília α2 da família de IFN-α humana, e é uma proteína de cadeia única com várias atividades biológicas. A proteína de cadeia única consiste em 165 resíduos de aminoácidos com 4 Cys, em que duas ligações de dissulfe- to de intracadeia são formadas entre Cys1-Cys98 e Cys29-Cys138 respecti- 5 vãmente e o aminoácido de terminal N é Cys com um grupo Ci-NH2 livre. Os resíduos nas posições 31, 49, 70, 83, 112, 121, 131, 133, 134 e 164 da se- qüência de aminoácido são Lys, cada dos quais contém um grupo ε-ΝΗ2 livre. Esta proteína não é glicosilada e sensível a muitas proteases. A se- qüência de aminoácido de interferon-a2b humano é mostrada em SEQ ID 10 No: 1.
IFNs são geralmente administrados parenteralmente em trata- mentos clínicos. A meia-vida in vivo curta (2-4h) e imunogenicidade forte de IFNs resultam em um intervalo de dosagem mais curto e uma frequência de dosagem maior. Como os anticorpos gerados significantemente diminuem a 15 eficácia terapêutica, é difícil obter uma eficácia clínica ideal. A tecnologia de modificação de polietileno glicol (PEG) desenvolvida nos últimos anos forne- ceu uma possível solução para os problemas acima.
PEG é um polímero orgânico inerte, não-tóxico e biodegradá- vel, e é importante nos campos tanto de biotecnologia quanto de farmacêuti- cos. A técnica de modificação de PEG é ligar PEG a uma proteína ativa a- través de ligação covalente. Após a glicolação de polietileno (PEGuilação), as propriedades da proteína podem ser significantemente melhoradas, por exemplo, o prolongamento da meia vida metabólica do fármaco, a redução da imunogenicidade, o aumento da segurança, a melhora da eficácia tera- pêutica, a diminuição da frequência de dosagem, o aumento de solubilidade de fármaco/solubilidade em água, o aumento de resistência contra proteóli- se, a facilitação de liberação controlada de fármaco e assim por diante. Para detalhes adicionais, favor referir-se a Inada e outros J. Bioact. and Compati- ble Polymers, 5, 343, 1990, Delgado e outros Criticai Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 9, 249, 1992, Katre. Advanced Drug Delivery Sys- tems, 10, 91, 1993, e Publicação de Patente U.S. UP 4179337.
É descrita na Patente U.S. No. 4179337, que após a ligação de PEG a uma enzima ou insulina, a imunogenicidade da proteína foi reduzida, ao mesmo tempo em que simultaneamente as atividades da proteína foram reduzidas também. Isto foi também encontrado em G-CSF (Satake- Ishikawa e outros Cell Structure and Function, 17, 157-160, 1992), IL-2 (Ka- 5 tre e outros Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 84, 1487, 1987), TNF-α (Tsutsumi e outros Jpn. J. Cancer Res., 85, 9, 1994), IL-6 (Inoue e outros J. Lab. Clin. Med., 124, 529, 1994) e CD4-lgG (Chamowe outros Bioconj. Chem., 5, 133, 1994).
Foi reportado que a proteína modificada por PEG ramificado e- 10 xibiu melhor tolerância ao pH, termoestabilidade e resistência contra proteó- Iise do que proteínas modificadas por PEG de cadeia linear (Monfardini e outros Bioconjugate Chem., 6, 62, 1995). Geralmente, uma molécula PEG modifica uma proteína por ligação da própria ao grupo α-amino de terminal N ou grupos ε-amino de um resíduo Lys na molécula de proteína. Existem 15 normalmente três tipos de PEGs para modificação de proteína: um PEG de cadeia linear (EP 0593868), um PEG de ramificação em forma de U (EP 0809996) e um PEG de ramificação em forma de Y (CN1243779C).
Atualmente muitos tipos de proteínas PEGuiIadas têm sido apli- cadas clinicamente. Em 1990, a adenosina deaminase PEGuilada-bovina (Adagen) produzida por ENZON Inc. foi fornecida por FDA, e usada para tratar doença da imunodeficiência combinada severa (pegfamg013102LB, http://www.fda.gov')· Em 1994, outra proteína modificada por PEG para tratar leucemia linfoblástica aguda, a asparaginase PEGuiIada (pegaspargase, Oncaspar), foi também comercializada em US (103411s50521b1, http^/www.fda.gov)· O interferon-a2b modificado por PEG (PEG IFN-a2b, PEG-Intron) desenvolvido por Schering-Plough foi aprovado pelo FDA para o comércio em 2000 e o interferon-α PEGuiIado (PEG IFN-a2a, Pegasys) pro- duzido por Hoffman-Ia Roche Ltd. foi também aprovado para comercializa- ção em 2002, ambos os quais são usados para tratar hepatite (103964s50371b1, pegsche011901LB, http://www.fda.gov). Em 2002, o fa- tor de estimulação de colônia de granulócito humano modificado por PEG produzido por Amgen Inc. (PEG-filgrastim, Neulasta) foi também aprovado pelo FDA1 que é usado para tratar câncer de mama metastático (peg- famg013102LB, http://www.fda.gov). O FDA também aceitou a aplicação para antagonista de fator de crescimento humano PEGuiIado desenvolvido por Pharmacia. O fragmento de anticorpo de TNF-α combinado de PEG de 5 Celltech e o receptor de PEG-TNF de Amgen são testados nas experiências clínicas avançadas. O primeiro conjugado de PEG-molécula orgânica, camp- totecina PEGuilada, também entrou na fase Il de experiência clínica. Em 2004, o oligonucleotídeo modificado por PEG (Pegaptanib, Macugen®) foi aprovado pelo FDA. O metabolismo in vivo do PEG no fármaco (ou próprio 10 PEG) já foi claramente entendido, e PEG provou ser um modificador de fár- maco bom e seguro sem qualquer efeito adverso.
normalmente necessitam de derivação, se modo que um ou dois grupos terminais das extremidades de PEGs possam ser quimicamente ativados 15 para possuir um grupo funcional adequado que exiba atividade, e desse modo possa formar uma ligação covalente estável com, pelo menos um gru- po funcional do fármaco a ser ligado. Por exemplo, PEGs podem ser ligados a E-NH2 de resíduo Lys na cadeia de peptídeo de proteína, ou ao a-NH2 do resíduo de aminoácido de terminal N da cadeia de peptídeo de proteína. Na 20 PEGuilação de IFN-α descrita na patente Européia EP0809996, PEG-NHS é ligado por meio de substituição nucleofílica ao a-NH2 do aminoácido de ter- minal N ou E-NH2 de Lys em IFN-α. O PEG-NHS mencionado na patente a- cima é um derivado de PEG de ramificação em forma de U (PEG2-NHS), a fórmula molecular do mesmo como abaixo:
Os PEGs que podem ser ligados a um fármaco de proteína
r
(CHj)4
em que, ReR' são independentemente um grupo alquila de peso molecular baixo, n e n' são de 600 a 1500, e o peso molecular médio do PEG é de 26KD a 66KD. A fórmula molecular do IFN-α modificado por PEG2-NHS é como abaixo:
o
ROCH2CH1(OCHiCHj)il-O-C-NH
ROCH2CH2(OCH2CH2)n-0—C-f^ X—
onde uma ou mais moléculas de PEG2-NHS são ligadas a a-NH2 do amino- ácido de terminal N ou £-NH2de Lys em IFN-α, os produtos obtidos são uma 5 mistura de IFNs-α não-PEGuilados, IFNs-α PEGuiIados em um único resí- duo de aminoácido e IFNe-α PEGuiIados em múltiplos resíduos de aminoá- cidos. O IFN-α PEGuiIado em um único resíduo de aminoácido pode ser iso- lado dos produtos obtidos por qualquer meio de purificação apropriado. IFN- α tem um aminoácido de terminal N e mais do que um resíduo de Lys1 isto é, 10 vários sítios reativos para PEG2-NHS1 desse modo os IFNs-α PEGuiIado isolados em um único resíduo de aminoácido são uma mistura de isômeros dos IFNs-α PEGuiIados em diferentes resíduos de aminoácido únicos.
Na Patente Européia EP 0593868, PEG de cadeia linear é usa- do para modificar IFN1 a fórmula molecular do produto modificado como a- baixo:
O
- interferon- α m
em que R é um grupo alquila de peso molecular baixo ; Ri, R2, R3 e R4 são H ou grupos alquila de peso molecular baixo ; m é de 1 ao número de possí- veis modificações de PEG em IFN; W é O ou NH; x é de 1 a 1000, y e z são de 0 a 1000, x+y+z é de 3 a 1000; e pelo menos um dentre R-ι, R2, R3 e R4 é 20 um grupo alquila de peso molecular baixo. Yu-Sen Wang e outros (Yu-Sen Wang e outros, Advanced Drug Delivery Reviews, 54: 547-570, 2002. Yu- Sen Wang e outros, Biochemistry1 39, 10634-10640, 2000.) reportaram a modificação de rlFN-a2b com monometóxi-PEG linear de 12KD (Peg-íntron) e mostraram que os produtos analisados por HPLC-IE são uma mistura de mais do que 14 isômeros modificados por PEG em diferentes resíduos de 5 aminoácidos únicos. A fórmula molecular dos PEGs lineares usados por Yu- Sen Wang e outros é mostrada abaixo:
o o "
H3C-COCH2 CH2 )n -O-C-O-H
Il
0
em que o peso molecular médio do PEG é 12KD.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
Os derivados de PEG usados na presente invenção são novos
derivados de PEG ramificados, de ramificação em forma de Y, e suas estru- turas são diferentes daquelas dos PEGs de ramificação em forma de U . A maior diferença entre estes dois tipos de PEGs é que as cadeias de PEG de duas ramificações dos derivados de PEG em forma de Y de acordo com a presente invenção são conectados juntos através de átomo de N, ao mesmo 15 tempo em que as cadeias de PEG de duas ramificações dos derivados de PEG em forma de U em EP0809996 são conectados juntos através de áto- mo de C. A composição molecular dos derivados de PEG em forma de Y de acordo com a presente invenção é mostrada como abaixo:
Pa-X1
^N-(CHR1)-F
Pb-X2
em que, Pa e Pb são PEGs iguais ou diferentes; j é um número inteiro de 1 a 20 12; Rj é H, um grupo C1-C12 alquila substituído ou não-substituído, uma arila substituída , uma aralquila ou uma heteroalquila; Xi e X2 são indepen- dentemente um grupo de ligação, em que Xi é (CH2)n, e X2 é selecionado do grupo que consiste em (CH2)n, (CH2)nOCO, (CH2)nNHCO e (CH2)nCO; n é um número inteiro de 1 a 10; e F é um grupo terminal selecionado do grupo 25 que consiste em um grupo hidroxila, um grupo carboxila, um grupo éster, cloreto de acila, hidrazida, maleimida, dissulfeto de piridina, capazes de rea- gir com grupo amino, hidroxila ou mercapto de um agente terapêutico ou um substrato para formar uma ligação covalente.
Em uma modalidade preferida da presente invenção, a molécula derivada de PEG em forma de Y é mostrada como abaixo:
ROCH2CH2(OCH2CH2 Jm-O-CH2CH2^
^ (CHRi)j F /
■*2'
Il
O
ROCH2 CH2 (OCH2 CH2 )-o — CH,-/
em que, ReR' são independentemente um grupo C1-C4 alquila , preferi- velmente metila; m e m' significam o grau de polimerização e podem ser qualquer número inteiro; m+m' é preferivelmente de 600 a 1500; R, é H, um grupoC1-C12 alquila substituída ou não-substituída, um grupo arila substitu- ída, um grupo aralquila, ou a heteroalquila ; j é um número inteiro de 1 a 12; 10 e F é um grupo terminal selecionado do grupo que consiste em um grupo hidroxila, um grupo carboxila, um grupo éster, cloreto de ácido carboxílico, hidrazida, maleimida, dissulfeto de piridina, capazes de reagir com um ami- no grupo, um grupo hidroxila ou um grupo mercapto de um agente terapêu- tico ou um substrato para formar uma ligação covalente. Preferivelmente, o 15 peso molecular total médio do PEG é de cerca de 10000 a cerca de 60000 Dáltons, mais preferivelmente cerca de 40000 Dáltons.
Em uma modalidade preferida da presente invenção, uma possí- vel fórmula estrutural da molécula derivada de PEG em forma de Y é mos- trada como fórmula (I):
o
ROCH2CH2(OCH2CH2)m-O-CH2CH2 f\ H
'^'N-(CH2)J—C —N—O—N I (I) ROCH2CH2(OCH2CH2)m--O-CH^-C7 '
Y
O O
em que ReR' são independentemente um grupoC1-C4 alquila, preferivel- mente metila; m e m' significam o grau de polimerização e podem ser qual- quer número inteiro; m+m' é preferivelmente de 600 a 1500; j é um número inteiro de 1 a 12; e o peso molecular total médio dos PEGs é cerca de 40000 Dáltons. Os presentes inventores usaram derivados de PEG de ramifica- ção em forma de Y (YPEG) para modificar interferon-a2b (IFN-a2b), e isola- ram o YPEG-IFNs-a2b, modificado por PEG em um único resíduo de amino- ácido, por cromatografia de permuta de íon de Q-Sefarose FF. Além disso, 5 os YPEG-IFNs-a2b isolados, modificados por PEG em um único resíduo de aminoácido, foram também separados por cromatografia de SP-Sefarose FF para obter YPEG-IFN-a2b em que o YPEG é principalmente ligado ao E-NH2 de cadeia lateral de Lys na posição 134 em SEQ ID N0.1, que é chamado de YPEG-IFN-a2b(134). Após a medição, descobriu-se que a atividade in 10 vitro do YPEG-IFN-a2b(134) é significantemente maior do que aquela do YPEG-IFN-a2b no qual o YPEG é ligado a outro resíduo de aminoácido, e a meia vida do YPEG-IFN-a2b(134) no soro é significantemente mais longa do que aquela do IFN-a2b não-modificado.
Entretanto, a presente invenção fornece IFNs-a2b PEGuiIados em um único resíduo de aminoácido, a estrutura do qual é como abaixo:
Pa-M H
-(CHRi)j-C — N—IFN-a2 b
Pb-X2
em que Pa e Pb são iguais ou diferentes PEGs; j é um número inteiro de 1 a 12; R, é H, um grupo C1-C12 alquila substituído ou não-substituído , um grupo arila , aralquila, ou heteroalquila substituído; Xi e X2 são independen- temente um grupo de ligação, em que Xi é (CH2)n, e X2 é selecionado do 20 grupo que consiste em (CH2)n, (CH2)nOCO, (CH2)nNHCO e (CH2)nCO, em que n é um número inteiro de 1 a 10.
Em uma modalidade preferida da presente invenção, os IFNs- a2b PEGuiIados da presente invenção são da fórmula estrutural (II) abaixo:
ROCH2CH2(OCH2CH2)m-O-CH2CH2 fj H
"^N-(CH2)j —C—N—IFN-a2b
ROCH2CH2(OCH2CH2)m--O-CH2-C7
Il
O
(Il)
em que ReR' são independentemente um grupo C1-C4 alquila , preferível- mente metila; j é um número inteiro de 1 a 12; m e m' significam o grau de polimerização e podem ser qualquer número inteiro iguais ou diferentes. Nesta estrutura, a molécula de PEG de ramificação em forma de Y é ligada a uma molécula de IFN-a2b através de um único resíduo de aminoácido. O peso molecular médio do YPEG-IFN-a2b na fórmula (II) depende principal- mente do grau de polimerização, m e m'. Onde m+m' for preferivelmente de 600 a 1500, o peso molecular médio correspondente do YPEG será de cer- ca de 26000 a cerca de 66000 Dáltons. Onde m+m' for preferivelmente de 795 a 1030, o peso molecular médio correspondente do YPEG será de cer- ca de 35000 a cerca de 45000 Dáltons. Onde m+m' for preferivelmente de 885 a 1030, o peso molecular médio correspondente do YPEG será de cer- ca de 39000 a cerca de 45000 Dáltons. Onde m+m' for mais preferivelmente 910, o peso molecular médio correspondente do YPEG será 40000 Dáltons. A relação de m e m' pode estar em uma faixa de 0,5 a 1,5, preferivelmente de 0,8 a 1,2.
Em uma modalidade preferida, no IFN-a2b PEGuiIado da pre- sente invenção, uma molécula PEG é ligada a IFN-a2b através de uma liga- ção de amido formada por grupo α-amino do aminoácido de terminal N ou do grupo ε-amino de cadeia lateral de resíduo Lys de IFN-a2b correspon- 20 dendo a posição 31, 49, 70, 83, 112, 121, 131, 133, 134 ou 164 como mos- trado em SEQ ID No.1.
Em uma outra modalidade preferida, no IFN-a2b PEGuiIado da presente invenção, uma molécula PEG é ligada a IFN-a2b através de uma ligação de amido principalmente formada pelo grupo ε-amino de cadeia Iate- ral de resíduo Lys de IFN-a2b correspondendo à posição 134 como mostra- do em SEQ ID No.1.
Opcionalmente, o IFN-a2b da presente invenção pode ser extra- ído de fontes naturais ou obtido pela biotecnologia recombinante. Preferi- velmente, o IFN-a2b é IFN-a2b humano (hlFN-a2b) tendo a seqüência de 30 aminoácido de SEQ ID No.1, que é extraída de fontes naturais ou obtida pe- la biotecnologia recombinante. Mais preferivelmente, o IFN-a2b humano é IFN-a2b humano recombinante (rhlFN-a2b). O rhlFN-a2b pode ser artificial- mente sintetizado, ou ser expressado de sistemas de expressão procarióti- cos tais como E. coli, ou ser expressado de sistemas de expressão de leve- dura eucarióticos tais como Pichia, ou ser expresso de sistemas de expres- são de célula de inseto ou sistemas de expressão de célula de mamífero tais 5 como CHO. Os métodos de preparação do IFN-a2b natural ou recombinante e os testes de atividade de IFN-a2b e IFN-a2b modificado por YPEG são conhecidos na técnica anterior.
Similar a IFN-a2b, o YPEG-IFN-a2b da presente invenção pode também ser usado clinicamente para tratar tumores e infecções virais, tal 10 como hepatite, leucemia de célula pilosa, linfólise mediada por célula, sar- coma de Kaposi e assim por diante. Clinicamente, o YPEG-IFN-a2b da pre- sente invenção é claramente melhorado, quando comparado com IFN-a2b, em estabilidade, solubilidade, meia-vida em soro e eficácia terapêutica clíni- ca. Quanto ao modo de administração, o YPEG-IFN-a2b da presente inven- 15 ção pode ser administrado aos pacientes na forma de uma composição que compreende uma quantidade farmaceuticamente eficaz do YPEG-IFN-a2b e um veículo ou um excipiente farmaceuticamente aceitável. Portanto, a pre- sente invenção, em outro aspecto, também fornece uma composição que compreende uma quantidade farmaceuticamente eficaz do IFN-a2b PEGui- 20 lado da presente invenção e um veículo ou excipiente farmaceuticamente aceitável. Preferivelmente, a composição compreende manitol, aminoácidos, cloreto de sódio e acetato de sódio, em que os aminoácidos são preferivel- mente selecionados do grupo que consiste em ácido aspártico, asparagina e glicina.
Em outro aspecto, a presente invenção também fornece o uso
do IFN-a2b PEGuiIado da invenção ou a composição que compreende o IFN-a2b PEGuiIado da invenção na preparação de um medicamento para tratar uma doença em necessidade de tratamento com IFN-a2b. Preferivel- mente, a doença em necessidade de tratamento com IFN-a2b é selecionada 30 do grupo que consiste em infecções virais, por exemplo, hepatite B, hepatite C1 hepatite D e condiloma acuminado, tumores, por exemplo, leucemia de célula pilosa, leucemia mieloide crônica, leucemia de não-Hodgkin maligno de grau baixo, linfólise mediada por célula, sarcoma de Kaposi, mieloma múltiplo, melanoma maligno, Iinfoma de célula T cutâneo, papiloma laríngeo, carcinoma de célula renal recorrente ou metastático, distúrbios e doenças inflamatórias, por exemplo, esclerose múltipla, artrites, asma, fibrose cística 5 e pulmonar intersticial doença, e doenças mieloproliferativas relacionadas com trombocitemia.
Para obter o IFN-a2b modificado por YPEG, em uma modalidade da presente invenção, inicialmente a fração de PEG de derivado de YPEG ativados tal como succinimidil éster de N-hidroxila de PEG (YPEG-NHS) é 10 covalentemente ligada a um grupo amino (-NH2) da proteína através de substituição nucleofílica, em que o grupo amino inclui grupo α-amino de ter- minal N da proteína e um grupo ε-amino de resíduo de Lys. A equação da reação para a geração de YPEG-IFN-a2b de IFN-a2b e YPEG é como abai- xo: o.
ROCH2CH2(OCH2CH2)m-O-GH2CH2^.. Π H
0 V-I
^N-(CH2)j-C-N-O-N R1OCH2 CH2 (OCH2 CH2 W-O-CH2-C
O o
+ H9 N-IFNa 2b
I
ROCH2CH2(OCH2CH2 Jrri-O-CH2CH2 M H
N—(CH2) j —C — N— IFNa 2b
ROCH2 CH2 (OCH2 CH2 ) m· -o - CH,-/
~ Il O
As condições de reação são moderadas, o pH está em uma fai-
xa de 4,5 a 9,5, a temperatura está entre 0-25°C, e as medições de agitação ou outra mistura são necessárias. Para condições detalhadas favor referir-se aos Exemplos na DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO. Todos YPEGs com pesos moleculares diferentes podem ser ligados a IFN-a2b u- 20 sando o método acima. Os produtos incluem a modificação por PEG em um único resíduo de aminoácido (YPEG-IFN-a2b), a modificação por PEG em dois resíduos de aminoácidos (YPEG2-IFN-a2b) e a modificação por PEG em múltiplos resíduos de aminoácidos (YPEGn-IFN-a2b), em que os produ- tos modificados por PEG em um único resíduo de aminoácido podem ser os produtos predominantes ajustando-se à condição da reação.
Subsequentemente, o YPEG-IFN-a2b, modificado por PEG em um único resíduo de aminoácido, pode ser isolado da mistura de todos os tipos do IFNs-a2b modificado por YPEG usando um método tal como croma- tografia de permuta de cátion, cromatografia de permuta de ânion, ou croma- tografia por exclusão, e em seguida o IFNs-a2b modificado por PEG em re- síduo de aminoácidos únicos diferentes pode ser também resolvido para ob- ter o YPEG-IFN-a2b no qual o YPEG está ligado em uma posição específi- ca. Os métodos de purificação convencionais incluem cromatografia de per- muta de cátion, cromatografia de permuta de ânion, cromatografia de intera- ção hidrofóbica e cromatografia por exclusão. A análise característica pode ser realizada por um método conhecido na técnica, por exemplo, a espec- troscopia de massa, a eletroforese em gel de poliacrilamida e a cromatogra- fia líquida de alto desempenho por exclusão pode ser usada para analisar o peso molecular dos produtos, a fim de distinguir os produtos modificados por PEG em um único resíduo de aminoácido daqueles modificados por PEG em dois ou múltiplos resíduos de aminoácido e IFN-a2b não-modificado. Os mé- todos de purificação mencionados acima podem também ser usados para também resolver os produtos modificados por PEG em um único resíduo de aminoácido para obter isômeros diferentes com a modificação de PEG em posições únicas diferentes. As atividades biológicas in vitro de todos os tipos dos produtos modificados por PEG podem ser medidas de acordo com qual- quer ensaio conhecido para a atividade de IFN, por exemplo, inibição do e- feito citopático. Para IFNs modificados por PEG em um único resíduo de a- minoácido, as frações de PEG nos isômeros diferentes têm efeitos diferentes em manter os domínios ativos de IFNs, resultando nas diferenças maiores nas atividades biológicas de isômeros diferentes. De modo geral, as ativida- des in vitro de IFNs são notavelmente diminuídas após a modificação de PEG. Entretanto, de acordo com a presente invenção, a atividade específica in vitro dos isolados de três picos obtidos por cromatografia de permuta de íon foram medidos, e os resultados indicam que o isolado de pico 3 (SP2) tem atividade específica significantemente maior do que os isolados de ou- tros picos e PEGASYS (Hoffmann-La Roche1 Basel1 Switzerland), e tem meia-vida significantemente mais longa no soro do que IFN-a2b não- modificado.
Em uma outra modalidade, o peptídeo ligado a PEG em forma
de Y isolado do SP2 é sequenciado usando a degradação de Edman, e os resultados mostraram que o componente primário de SP2 foi YPEG-IFN- a2b(134).
Portanto, em outro aspecto, a presente invenção também forne- ce os métodos de preparação e purificação para YPEG-IFN-a2b(134), que compreendem:
(a) sob uma condição alcalina, preferivelmente em pH 9,0, per- mitindo PEG de ramificação em forma de Y como mostrado na fórmula (I) abaixo reagir com IFN-a2b, e obter IFN-a2b PEGuiIado.;
ROCH2CH2(OCH2CH2 Jm-O-CH2CH2 μ H
""''"'N-(CH2); —C—N-O-
ROCH2 CH2(OCH2 CH2 )m· _q-GH -Q7
I!
O
(I)
em que ReR' são independentemente um grupoC1-C4 alquila , preferivel- mente metila; j é um número inteiro de 1 a 12; m e m' significam o grau de polimerização e podem ser qualquer número inteiro; e m+m' é preferivel- mente de 600 a 1500;
(b) capturar os produtos de reação na etapa (a) com uma resina
de permuta de ânion, preferivelmente Q Sefarose FF, e eluindo os produtos em um gradiente de ânion, preferivelmente em um gradiente de íon de clore- to, para obter os produtos modificados;
(c) eluir os produtos de reação capturados na etapa (b) com uma resina de permuta de cátion, preferivelmente SP Sefarose FF, em um
gradiente de cátion, preferivelmente em um gradiente de íon de sódio, e co- letar cada pico separadamente:
(d) determinar a atividade do produto de cada pico, e selecionar o pico correspondendo ao produto de reação com atividade maior.
BREVE DESCRICÃO DOS DESENHOS
Figura 1: SDS-PAGE de 2 bateladas de IFN-a2b modificado com YPEG (40KD). A concentração do gel de separação foi 12%, e azul Coo- massie brilhante R-250 foi usado como tinta de manchamento. Pode ser vis- to a partir do resultado de SDS-PAGE da Figurai, sob a condição, a taxa de modificação de PEG de rHulFN-a2b foi entre 30-50%, e foi estável. Os pro- dutos modificados primários foram IFN-a2b modificado por PEG em um úni- co resíduo de aminoácido (YPEG-IFN-a2b), e houve também algum IFN-a2b modificado por PEG em múltiplos resíduos de aminoácido (YPEGn-IFN- a2b). A Faixa 1: IFN-a2b, reação de modificação de NHS-YPEG (40KD) em Oh; Faixa 2: Batelada 060604-1 de IFN-a2b, reação de modificação de NHS- YPEG (40KD) em 2h; Faixa 3: Batelada 060604-2 de IFN-a2b, reação de modificação de NHS-YPEG (40KD) em 2h; Faixa 4: marcador (GE Lifescien- ce).
Figura 2: O perfil de resolução de isômeros de modificação de YPEG-IFN-a2b por SP-Sefarose FF.
Figura 3: SDS-PAGE manchado de prata (12%) das amostras de YPEG-IFN-a2b purificadas por SP-Sefarose FF. Faixa 1: marcador de peso molecular (GE Lifescience); Faixa 2: pico de purificação 1de SP-
pico de purificação 2 de SP- pico de purificação 3 de SP- pico de purificação 4 de SP-
Sefarose FF de YPEG-IFN-a2b; Faixa 3:
Sefarose FF de YPEG-IFN-a2b, Faixa 4:
Sefarose FF de YPEG-IFN-a2b; Faixa 5:
Sefarose FF de YPEG-IFN-a2b.
Figura 4: Peso molecular evidente da amostra de YPEG-rHulFN-
a2b purificada por SP-Sefarose FF determinado por 7,5% de redução de SDS-PAGE com manchamento prata. Faixa 1: marcador de peso molecular (GE Lifesciences); Faixa 2: YPEG-HulFN-a2b SP1, 2pg; Faixa 3: YPEG- rHulFN-a2b SP2, 2pg; Faixa 4: YPEG-rHulFN-a2b SP3, 2pg.
Figura 5: Os pesos moleculares das amostras de YPEG-IFN-a2b
purificadas por SP-Sefarose FF determinados por MALDI-TOF MS.
Figura 6: O peso molecular de YPEG-NHS (40KD) determinado por MALDI-TOF MS.
Figura 7: A concentração de fármaco no soro e atividade após uma única ineção s.c. de 30 pg kg"1 de YPEG-rhlFN-a2b em Macaco que se alimenta de siri (Macaca fascicularis).
Figura 8: O controle nulo de Mapeamento de Peptídeo de Tripsi-
nase do YPEG-rHulFN-a2b SP2 digerido por tripsina. Dois picos pequenos foram detectados respectivamente em 71,674min e 17,589min; e o pico de tripsina foi detectado entre 2-3 min.
Figura 9: A análise de Mapeamento de Peptídeo de Tripsinase da amostra de YPEG-IFN-a2b SP2 digerido por tripsina (Oh) por HPLC-RP Cie- O tempo de retenção de YPEG-IFN-a2b SP2 foi 62,114 min; e o pico de eluição em 71,908min foi a base, 2-3min.
Figura 10: A análise de Mapeamento de Peptídeo de Tripsinase da amostra de YPEG-IFN-a2b SP2 digerida por tripsina (48h) por HPLC-RP Ci8. Nenhum pico de substrato (62,114min) foi detectado entre 60,5 min-63,2 min, demonstrando que a amostra foi completamente digerida.
Figura 11: Perfil de separação de Sephacryl S-100 HR dos pep- tídeos modificados por YPEG da amostra de YPEG-IFN-a2b SP2 completa- mente digerida por tripsina. As amostras foram coletadas de acordo com os picos, S100-1 foi o peptídeo modificado por YPEG, isto é, a amostra-alvo. DESCRICÂO DETALHADA DA INVENÇÃO
A presente invenção será melhor descrita pelos seguintes e- xemplos, porém qualquer exemplo ou a combinação destes não deveria ser entendido como Iimitante do escopo ou modalidade da invenção. O escopo 25 da invenção é limitado somente pelas reivindicações anexas. Em combina- ção com a descrição e técnica anterior, as pessoas versadas na técnica cla- ramente entenderiam o escopo limitado pelas reivindicações.
Exemplo 1
Preparação de IFN-a2b humano recombinante modificado por PEG de rami- ficacão em forma de Y
(1) Preparação em pequena escala de IFN-a2b humano recombinante modi- ficado por PEG de ramificação em forma de Y 166,1 mg de YPEG (fórmula (I), peso molecular médio de 40KD, ramificação uniforme, número do lote RD010P041, Beijing JenKem Techno- logy Co., Ltd.) foi pesado e dissolvido em 1ml de 2mM de HCI (Guangdong Guanghua Chemical Factory Co., Ltd.). e 40mg de IFN-a2b (Xiamen Amoy- 5 top Biotech Co., Ltd.) e tampão de ácido bórico-borax a 50mM (pH 9,0, Si- nopharm Shanghai Chemical Reagent Co., Ltd.) foram adicionados a um volume de reação final de 10ml. Neste sistema de reação, a concentração final de IFN-a2b foi 4 mg/ml, e a relação molar da reação de IFN-a2b e YPEG foi 1:2. O sistema de reação foi mantido sob 0-20°C durante 2h com 10 agitação. Os IFNs-a2b PEGuiIados foram em seguida gerados, e a reação foi parada adicionando-se ácido acético glacial (Shantou Xilong Chemical Co., Ltd.) para tornar o pH < 4,0. Uma amostra foi submetida a SDS-PAGE.
O sistema de reação foi diluído 50 vezes com água e em seguida 0,2μιη fil- trado antes do armazenamento a 4°C para uso adicional.
A cromatografia de Q-Sefarose FF foi usada para separar o res-
tante de hidrolatos de PEG e PEG, IFNs-a2b modificado por YPEG em múl- tiplos resíduos de aminoácidos, IFNs-a2b modificado por YPEG em um úni- co resíduo de aminoácido e o IFN-a2b não modificado. A coluna de Q- Sefarose FF (GE Healthcare) (ct>12mm χ 90mm, 1CV = 10 ml) foi regenera- 20 da com 3CV de tampão de ácido bórico/borax a 20 mM de (pH 9,0)-1M de NaCI (BBI), e em seguida equilibrada com 5CV de tampão de ácido bóri- co/borax a 20 mM (pH 9,0). O comprimento de onda de detecção UV foi a- justado a 280nm. A amostra total armazenada a 4°C foi carregada. Após o carregamento, a coluna foi equilibrada com 3CV de tampão de ácido bóri- 25 co/borax (pH 9,0), e em seguida tampão de ácido bórico/borax a 20 mM (pH
9,0)- NaCI a 12 mM foi usado para eluição até que o primeiro pico fosse completamente eluído, cujo pico foi o PEG restante. O tampão de ácido bóri- co/borax a 20 mM (pH 9.0)- NaCI a 60 mM foi então usado para eluição, e a amostra coletada neste pico de eluição foi principalmente o YPEG-IFNs-a2b, 30 modificado por PEG em um único resíduo de aminoácido. e em seguida o tampão de ácido bórico/borax a 20mM (pH9,0)- NaCI a 500mM foi usado para eluição e o pico de eluição foi o IFN-a2b não modificado. Os produtos-alvo foram principalmente o YPEG-IFNs-a2b modi- ficado por PEG em um único resíduo de aminoácido, com uma taxa de pro- dução de 20-40%.
2) Preparação em grande escala de IFN-a2b humano recombinante modifi- cado por PEG de ramificação em forma de Y
4982,4 mg de YPEG (fórmula (I), peso molecular médio 40KD, ramificação uniforme, número do lote RD010P041, Beijing JenKem Techno- logy Co., Ltd.) foi pesado e dissolvido em 25 ml de HCI a 2mM. E 1200 mg de IFN-a2b e tampão de ácido bórico/borax a 50mM (pH 9,0) foram adicio- 10 nados a um volume de reação final de 200 ml. Neste sistema de reação, a concentração de reação final de IFN-a2b foi 6 mg/ml, e a relação molar da reação de IFN-a2b e YPEG foi 1:2. O sistema de reação foi mantido sob 0- 25°C durante 2h com agitação. A reação foi parada adicionando-se ácido acético glacial para tornar o pH<4,0. Uma amostra foi submetida a SDS- 15 PAGE. O sistema de reação foi diluído 50 vezes com água e em seguida 0,2pm filtrado antes de armazenado a 4°C para uso adicional.
A cromatografia de Q-Sefarose FF foi usada para separar os hidrolatos de PEG e PEG restantes, IFNs-a2b modificado por YPEG em múl- tiplos resíduos de aminoácido, IFNs-a2b modificado por YPEG em um único 20 resíduo de aminoácido e o IFN-a2b não modificado. Coluna de Q-Sefarose FF (GE Healthcare) (<t>38mmx265mm, 1CV = 300ml) foi regenerada com 3 CV de tampão de ácido bórico/borax a 20 mM (pH 9,0)- NaCI a 1M, e em seguida equilibrada com 5CV de tampão de ácido bórico/borax a 20mM (pH
9,0). O comprimento de onda de detecção UV foi ajustado a 280 nm. A a- 25 mostra total armazenada a 4°C foi carregada. Após o carregamento, a colu- na foi equilibrada com 3CV de tampão de ácido bórico/borax (pH9,0), e em seguida tampão de ácido bórico/borax a 20 mM (pH9,0)- NaCI a 12 mM foi usado para eluição até que o primeiro pico fosse completamente eluído, cujo pico foi o PEG restante. O tampão de ácido bórico/borax a 20 mM (pH9,0)- 30 NaCI a 60 mM foi então usado para eluição, e a amostra coletada neste pico de eluição foi principalmente o YPEG-IFNs-a2b modificado por PEG em um único resíduo de aminoácido. E em seguida o tampão de ácido bórico/borax a 20 mM (pH9,0)- NaCI a 500 mM foi usado para eluição e o pico de eluição foi o IFN-a2b não-modificado.
Os produtos-alvo foram principalmente o YPEG-IFNs-a2b modi- ficado por PEG em um único resíduo de aminoácido, com uma taxa de pro- dução de 35-50%.
A figurai mostra os resultados de SDS-PAGE para 2 bateladas de IFNs-a2b modificado com YPEG (40KD). Pode ser visto a partir da figura
1 que sob a condição, a taxa de modificação de PEG de rhlFN-a2b foi entre 35-50% e mantida estável. Os produtos modificados primários foram modifi- cados por PEG em um único resíduo de aminoácido (YPEG-IFN-a2b), e houve também alguns produtos modificados por PEG em múltiplos resíduos de aminoácidos (YPEGn-IFN-a2b).
Exemplo 2
Resolução de YPEG-IFNs-a2b por SP-Sefarose FF A amostra de YPEG-IFNs-a2b capturada por Q-Sefarose FF foi
ajustada ao pH 5,0 com 20% de ácido acético, em seguida diluída 15 vezes com NaAc/HAc a 5 mM (pH 5,0, Shantou Xilong Chemical Co., Ltd.). A a- mostra foi carregada a 0,5 mg/ml de capacidade de carregamento para co- luna de 100ml de SP-Sefarose FF (GE Healthcare) (Φ18 mmx394 mm). A 20 coluna foi equilibrada com 3CV de NaAc/HAc a 5 mM (pH5,0), e em seguida eluída com 2,5 CV do gradiente de 0%-30% de NaAc/HAc a 5 mM - NaCI a 70 mM (pH5,0), seguindo com 50 CV do gradiente de 30%-100% de Na- Ac/HAc a 5 mM -NaCI a 70 mM (pH5,0). YPEG-IFN-a2b foi resolvido como 4 picos de eluição por SP-Sefarose FF a 100 ml. As amostras foram coletadas 25 de acordo com estes picos e em seguida medidas por SDS-PAGE com manchamento de prata respectivamente. De acordo com os resultados de SDS-PAGE, pode ser visto que o pico 1 resolvido por SP-Sefarose FF foi principalmente os produtos modificados por YPEG em múltiplos resíduos de aminoácidos (YPEGn-IFN-a2b). O pico 2 por SP-Sefarose FF foi principal- 30 mente os produtos modificados por PEG em um único resíduo de aminoáci- do (YPEG-IFN-a2b), e também conteve alguns produtos modificados por PEG em múltiplos resíduos de aminoácido. O pico 3 e pico 4 por SP- Sefarose FF foram ambos os produtos modificado por PEG em um único resíduo de aminoácido. Os picos 2-4 resolvidos por SP-Sefarose FF foram isômeros com modificação de YPEG em posições únicas diferentes, e foram chamados respectivamente como YPEG-IFN-a2b SP1, YPEG-IFN-a2b SP2 5 e YPEG-IFN-a2b SP3. Os resultados de perfil de resolução e SAD-PAGE manchado de prata foram mostrados na figura 2 e figura3 respectivamente.
Toda a amostra de YPEG-IFN-a2b SP1-3 foi suplementada com cloreto de sódio, acetato de sódio, manitol, ácido aspártico e foi esterilizado com 0,22 μητι de filtro antes de armazenado a 4°C para uso adicionado.
Exemplo 3
Análise da Característica de isômeros de modificação de YPEG-lFN-a2b (1) Concentração de Proteína
As concentrações de isômeros de modificação de YPEG-IFN- a2b foram determinadas pelo método de Kjeldahl.
(2) Peso molecular evidente de proteína
Os pesos moleculares evidentes de isômeros de modificação de YPEG-IFN-a2b foram determinados por SDS-PAGE. O método foi de acordo com Laemmli e outros (Nature 227: 680, 1970). A concentração do gel foi 7,5%, e o gel foi visualizado por manchamento de prata. Os pesos molecula- 20 res evidentes de isômeros de modificação de YPEG-IFN-a2b foram quase iguais, cerca de 123KD (figura4).
(3) Peso molecular determinado por MALDI-TOF MS
MALDI-TOF MS (Autoflex TOF/TOF system, Bruker Daltonics, Alemanha) foi usado para determinar os pesos moleculares de isômeros de 25 modificação de YPEG-rHulFN-a2b. Ácido sinapínico (SA, C11H12O5, M.W. 224.22, número do lote: 2006 236870 002, Bruker Daltonics, Alemanha) foi usado como matriz. O Padrão de Calibração de Proteína Il (Part No.207234, Bruker Daltonics, Alemanha) foi usado como padrão de peso molecular de proteína, e o programa para análises de dados foi FIexAnaIysis Ver.3.0.54.0. 30 Os pesos moleculares MS de isômeros de modificação de YPEG-IFN-a2b foram quase iguais, cerca de 59000 Dáltons (figura5).
(4) Teste de teor de endotoxina Com base no ensaio de Iimulus (Pharmacopoeia of the PeopIe1S Republic of China, 2005, Volume 3, Appendix X C), o teor de endotoxina de cada amostra de YPEG-IFN-a2b foi menor do que 5,0EU/mg.
(5) Atividade in vivo e Farmacocinéticos de YPEG-IFN-a2b SP2 no animal.
Atividade in vivo de YPEG-IFN-a2b SP2 em animal.
O mecanismos de ação de IFN é parcialmente para induzir a produção de 2',5-AS (2',5'-oligoadenilato sintetase), que sucessivamente exerce seus efeitos antivirais. Usando 125I como um traçador, os parâmetros farmacodinâmicos de IFN são refletidos pela atividade 2',5'-AS in vivo. 2',5'- 10 AS catalisa a síntese de 2',5'-A (2',5'-oligoadenilato) de ATP na presença de PoIi(I) PoIi(C) ágar (A atividade de 2',5'-AS pode ser representada pela con- centração do 2',5'-A sintetizado). Primeiro, 2',5'-AS nas amostras são absor- vidos e ativados por PoIi(I)-PoIi(C) agarose, em seguida catalisa o substrato ATP para gerar 2',5'-A. Uma mistura de 2',5'-A rotulado por 125I1 soro anti- 15 2',5'-A e anticorpo secundário é adicionado na amostra que em seguida é incubada e centrifugada para separar a mistura. O sobrenadante é descar- tado e um Contador Gama foi usado para medir a radioatividade do sedi- mento. A taxa de ligação do 2',5'-A rotulado por 125I inicialmente adicionado é calculada. A regressão logística de quatro parâmetros é usada para gerar 20 a curva padrão, e em seguida a concentração dos produtos de 2',5'-A indu- zidos por 2',5'-AS em uma amostra desconhecida pôde ser estimada.
Ao usar o método de 2', 5'-A mencionado acima, os resultados na Tabela 1 e na figura 7 mostraram a concentração de 2', 5'-A de soro após uma única injeção s.c. de 30pg kg'1 de YPEG-IFN-a2b SP2 em Macaco que 25 se alimenta de siri (Macaca fascicularís) (18 Macacos que se alimentam de siris, Guangxi Weimei Biotecnologia Co., Ltd., Certificação No. S.CXK GUI 2002-0001, peso corporal 2,5-5,5 kg, 6 fêmeas e 12 machos, elevado em gaiolas separadas, alimentados com comida de macaco, água livremente). Pode ser visto a partir da figura8 que o tempo para o pico médio foi 30 64+27,71 h, e a concentração para pico foi 292,30+148,08 PmoI dL'1. Após a administração, a atividade de 2', 5'-AS no soro foi claramente aumentada, e o tempo para pico de 2', 5'-A no soro foi mais lento do que aquele de YPEG- rhlFNa2b SP2.
Tabela 1. As concentrações de 2',5'-A no soro com o passar do tempo, após uma única injeção s.c. de 30 pg*kg'1 de YPEG-rhlFN-a2b SP2 em Macaco que se alimenta de siri (PmoI dL'1)
tempo(h) No. de Macaco que se alimenta de siri SD 1 2 3 0 19,32 13,63 20,74 17,90 ± 3,76 1 40,17 218,67 --- 129,42 ± 126,22 2 45,74 14,30 80,23 46,76 ± 32,98 4 14,89 69,41 138,23 74,18 ± 61,81 8 49,12 243,43 141,66 144,74 ± 97,19 10 119,51 274,99 109,89 168,13 ± 92,67 12 72,75 152,81 112,87 112,81 ± 40,03 24 10,05 321,23 159,12 163,47 ± 155,63 48 45,60 622,42 164,49 277,50 ± 304,56 96 400,67 352,65 123,58 292,30 ± 148,08 168 10,87 286,38 4,17 100,47 ± 161,03 240 2,74 323,83 10,48 112,35 ± 183,19 312 20,65 238,65 1,54 86,94 ± 131,72 2 Farmacocinéticos de YPEG-IFNs-a2b e rhlFN-a2b em Macaco que se ali- menta de siri
Uma única injeção s.c. de 10, 30 ou 100 Mg kg'1 de YPEG-IFN- a2b foi dada ao Macaco que se alimenta de siri. Para o grupo de administra- ção, 1ml de sangue venoso foi tomado do membro traseiro oposto ao lado 10 injetado na hora anterior, 1 h, 2h, 4h, 8h, 10h, 12h, 24h, 48h, 72h, 96h, 168h, 240h, e 312h após a administração. Para o grupo com uma única injeção de s.c. de IFN-a2b (30pg kg'1), 1 ml de sangue foi tomado na hora anterior,
0,5h, 1 h, 2h, 3h, 4h, 5h, 6h, 8h e 24h após a administração. Após serem mantidas a 4°C durante 30 min, as amostras de sangue foram centrifugadas em 2000 rpm durante 10 min sob baixa temperatura, em seguida o soro foi separado imediatamente e armazenado a -20°C para outra análise.
O imunoensaio intercalado duplo quantitativo foi usado. Um an- ticorpo monoclonal específico para IFN-α humano recombinante foi pré- revestido em placa de microtítulo. O padrão e as amostras foram pipetadas nas cavidades de microtítulo, em que o IFN-a2b ou YPEG-IFN-a2b SP2 se ligaria ao anticorpo imobilizado. A placa foi lavada para remover as substân- cias soltas, e em seguida IgG de IFN-α anti-humano (anticorpo secundário) 5 foi adicionado nas cavidades. Após a reação ter sido concluída, a placa foi lavada e a peroxidase de rábano-silvestre (HRP) foi adicionada nas cavida- des. Após a lavagem longe da enzima solta e reagentes, a cor gerada adi- cionando-se solução de substrato de HRP em cada cavidade foi proporcio- nal à quantidade do IFN-a2b ou YPEG-rhlFN-a2b SP2 ligado na primeira 10 etapa. A reação foi parada e a intensidade de cor foi medida. Quanto maior o valor de OD de absorbância, maior a concentração de IFN-a2b ou YPEG- IFN-a2b SP2 na amostra. As curvas-padrão foram plotadas para IFN-a2b e YPEG-IFN-a2b SP2, respectivamente, para medir a concentração de fárma- co no soro nas amostras de sangue.
De acordo com o protocolo na descrição do kit (American Bio-
medical Co., número do lote 3271), 10ΟμΙ de amostra de sangue ou padrão foram adicionados em cada cavidade, e misturados com misturador de placa gentilmente. De acordo com a concentração antecipada de uma amostra desconhecida, a amostra foi diluída com a solução diluída para as faixas de 20 concentração da curva-padrão. A curva-padrão de IFN-a2b ou YPEG-IFN- a2b SP2 para cada placa foi plotada para calcular a concentração da amos- tra desconhecida naquela placa. A placa foi incubada em temperatura ambi- ente durante 1 h, e lavada uma vez com solução de lavagem de placa. 10ΟμΙ de anticorpo secundário foram adicionados a cada cavidade, e mantidos em 25 temperatura ambiente durante 1h. A placa foi lavada 3 vezes, e 10ΟμΙ de conjugado de HRP foram adicionados a cada cavidade. A placa foi incubada em temperatura ambiente durante 1h e lavada 4 vezes. 100 μΙ de substrato de TMB foram adicionados em cada cavidade, e mantido em temperatura ambiente no escuro durante 15 min. 100 μΙ de solução de interrupção foram 30 adicionados a cada cavidade, e misturados suavemente para parar a rea- ção. O valor de OD de absorbância em 450nm foi medido com um leitor de microplaca em 5 minutos para determinar a concentração de cada amostra. Após uma única injeção subcutânea de dose baixa, dose média, ou dose elevada (10, 30 e 100 Mg kg'1, respectivamente) de YPEG-IFN-a2b em Macaco que se alimenta de siri, as meia-vidas foram 48,87±11,67, 51,94±3,52 e 49,60±2,97h, respectivamente. Após uma única injeção subcu- 5 tânea de 30 MQ kg'1 de IFN-a2b em Macaco que se alimenta de siri, a meia- vida foi 3,22 ± 0,1 Oh. A meia-vida de IFN-a2b foi prolongada pelo menos dez vezes após a modificação de YPEG.
(6) A atividade biológica in vitro de cada isômero de modificação YPEG-IFN- a2b foi estimada usando ensaio de inibição de efeito citopático. De acordo com o método descrito em Determination Method of Interferon Activity (,Pharmacopoeia of the PeopIe1S Republie of China, 2005, Volume 3, Appen- dix X C), interferon protege as células amnióticas humanas (WISH) do dano causado pelo vírus de estomatite vesicular (VSV). A violeta cristal foi usada para manchar as células de WISH sobreviventes, e o valor de OD de absor- bância foi medido em 570 nm. A curva de efeito de proteção de interferon foi plotada para as células WISH, para determinar a atividade biológica in vitro dos interferons. Os resultados da atividade biológica in vitro de cada amos- tra são mostrados na Tabela 2, e 3 testes paralelos foram realizados para cada amostra. Após a modificação de YPEG, em todos os isômeros de mo- dificação dos produtos modificados por PEG em um único resíduo de ami- noácido, a amostra de SP2 mostrou a atividade específica in vitro mais ele- vada, que foi 1-2 vezes maior do que SP1, SP3 e PEGASYS (fabricado por Hoffmann-La Roche, Basel, Switzerland; embalado separadamente por Shanghai Roche Pharmaceuticals Ltd., número do lote do produto B1016, número do lote da embalagem SH0020), e foi também 1-2 vezes maior do que a amostra não resolvida.
Tabela 2. Resultados da atividade biológica in vitro para cada isômero de modificação de YPEG-IFN-a2b (3 testes paralelos)
Amostra Tipo de PEG PEG No. de Po¬ Atividade M.W. sições da Específica (KD) Modificação Média (x106IU/mg) YPEG-IFN-a2b SP1 ramificaçãoY 40 1 1,07±0,172 Amostra Tipo de PEG PEG No. de Po¬ Atividade M.W. sições da Específica (KD) Modificação Média (x106IU/mg) YPEG-IFN-a2b SP2 ramificação Y 40 1 2,65±0,185 YPEG-IFN-a2b SP3 ramificação Y 40 1 1,13±0,215 YPEG-IFN-a2b a- ramificação Y 40 1 1,68±0,217 mostra não-resolvida PEGASYS ramificação U 40 1 0,934±0,042 Observação: a amostra não-resolvida refere-se a amostra antes de resolver YPEG-rhlFN-a2b por SP-Sefarose FF
(7) A resolução da posição de modificação em YPEG-IFN-a2b SP2
O sistema de solvente de YPEG-IFN-a2b SP2 foi mudado para 5 50mM de NH4HCO3 (pH8,0) por uItrafiItração com ultrafiltro 5K (Millipore, material de polietersulfona), e a concentração de proteína foi determinada ser 3,82 mg/ml usando espectroscopia UV. A tripsina de TPCK (Promega) foi dissolvida (0,5 pg/μΙ) na solução fornecida pelo fabricante. As amostras fo- ram adicionadas de acordo com a Tabela 3:
Tabela 3. Composição de reação de digestão de tripsina de YPEG-IFN-a2b SP2
Composição de Reação Volume 50mM de NH4HC03, pH8,0 7,08ml PEG-IFN-a2b SP2 (3,82 mg/ml) 1,32ml Tripsina (0,5 pg/pl) 0,2ml Volume de reação total 8,6ml O sistema de reação foi mantido em um banho de água a 37°C
durante 48h, em seguida 1,52ml de 20% de ácido acético foi adicionado pa- ra parar a reação. Uma quantidade pequena da amostra foi tomada para 15 mapeamento de peptídeo de HPLC-RP C18. O instrumento para análise foi 0 sistema de HPLC Waters, com um controlador do tipo 600, detector de comprimento de onda dupla 2487, e o software para processamento de da- dos foi Empower 2. A coluna analítica de HPLC foi Jupiter C18 (diâmetro de partícula 5pm, diâmetro de poro 300Â, <3>4,6x150mm, produzido por Pheno- 20 menex, USA). A Fase Móvel A foi 0,1% de TFA/H20, Fase Móvel B foi 0,1% de TFA/90% de ACN/H2O, a taxa de fluxo foi 1 ml/min, e o comprimento de onda de detecção foi ajustado em 214nm. Favor referir-se a Tabela 4 para os gradientes de eluição, e os resultados foram mostrados nas figuras 8-10. Tabela 4. Os gradientes de eluição para mapeamento de peptídeo de HPLC- RP C18 do YPEG-IFN-a2b SP 2 digerido por tripsina
Tempo (min) % de A % de B % deACN 1 0 100 0 0 2 8 100 0 0 3 68 40 60 54 4 72 40 60 54 75 100 0 0 6 80 100 0 0 Com base no resultado de detecção, pode ser determinado que
a amostra foi quase completamente digerida. Os produtos foram tratados com redução de DTT após a reação ter sido parada. A coluna de Sephacryl S-100HR (Φ18x255 mm, 1CV=64 ml; GE Healthcare) foi pré-equilibrada
com 3CV de PBNa a 20 mM -NaCI a 400 mM (pH7,0), e 3% de CV da a- mostra de YPEG-IFN-a2b SP2 por TPCK digerida por tripsina completamen- te foi carregado por pressão hidrostática. PBNa a 20 mM -NaCI a 400 mM (pH7,0) foi usado para eluição, e o comprimento de onda de detecção foi ajustado em 280 nm. A amostra do primeiro pico de eluição foi coletada 15 (número da amostra: YPEG-IFN-a2b S100-1, figurai 1), e o sistema de sol- vente foi mudado para PBNa a 5mM (pH 7,0) com ultrafiltro 5K. Liofilização a vácuo foi feita. Os aminoácidos de terminal N da amostra Iiofilizada foram determinados usando degradação de Edman, e a seqüência dos 7 aminoá- cidos no terminal N da amostra foi XYSPXAW (Tabela 5), em que X significa 20 cisteína de α-aminoácido (Cys), um não α-aminoácido ou outro aminoácido modificado que não possa ser detectado usando a degradação de Edman. De acordo com a seqüência mostrada na SEQ ID NO: 1, pode ser determi- nado que YPEG-IFN-a2b SP2 foi principalmente os produtos modificados com YPEG em Lys134.
Tabela 5. Resultado de sequenciamento para os aminoácidos de terminal N de YPEG-IFN-a2b S100-1
Amostra Seqüência de termi¬ A posição de modificação nal N detectada de PEG correspondente. YPEG-IFN-a2b S100-1 XYSPXAW Lys134 Nota: X significa cisteína de α-aminoácido, um não α-aminoácido ou outro aminoácido modificado que não possa ser detectado usando a degradação de Edman.

Claims (12)

1. lnterferon-a2b PEGuiIado (IFN-a2b) da estrutura como abai- xo, obtido por ligação de IFN-a2b com um polietileno glicol de ramificação em forma de Y (YPEG): <formula>formula see original document page 28</formula> em que, Pae Pb são polietileno glicol igual ou diferente (PEG); j é um número inteiro entre 1-12; Ri é H, grupo C1-C12 alquila substituído ou não-substituído, ari- la, aralquila, ou heteroalquila substituída; e Xi e X2 são independentemente um grupo de ligação, em que Xi é (CH2)n, e X2 é selecionado do grupo que consiste em (CH2)n, (CH2)nOCO, (CH2)n NHCO e (CH2)n CO, em que n é um número inteiro entre 1-10.
2. IFN-a2b PEGuilado, de acordo com a reivindicação 1, com a estrutura como abaixo <formula>formula see original document page 28</formula> em que ReR' são independentemente um grupo C1-C4 alquila, preferivel- mente metila; j é um número inteiro entre 1-12; m e m' significam o grau de polimerização e pode ser qualquer número inteiro; m+m' é preferivelmente de 600 a 1500, e o peso molecular total médio do YPEG é preferivelmente de cer- ca de 10000 a cerca de 60000 Dáltons, mais preferivelmente cerca de40000 Dáltons.
3. IFN-a2b PEGuilado, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, em que o YPEG é ligado ao IFN-a2b através de uma ligação de amido for- mada por grupo α-amino do aminoácido de terminal N de IFN-a2b ou o gru- po ε-amino de cadeia lateral de um resíduo Lys em IFN-a2b correspondendo à posição 31, 49, 70, 83, 112, 121, 131, 133, 134, ou 164 em SEQ ID No.1, preferivelmente posição 134 em SEQ ID No.1.
4. IFN-a2b PEGuilado, de acordo com qualquer uma das reivin- dicações 1 a 3, em que o IFN-a2b é extraído de uma fonte natural ou obtido através de biotecnologia recombinante, preferivelmente é IFN-a2b humano tendo a seqüência de aminoácido como mostrado em SEQ ID No.1, mais preferivelmente é um IFN-a2b humano recombinante.
5. IFN-a2b PEGuilado, de acordo com a reivindicação 4, em que o IFN-a2b humano recombinante é artificialmente sintetizado ou expresso em um sistema de expressão selecionado do grupo que consiste em um sistema de expressão procariótico tal como E. coli, um sistema de expres- são de levedura eucariótico tal como Pichia, um sistema de expressão de célula de inseto ou um sistema de expressão de célula de mamífero tal co- moCHO.
6. IFN-a2a PEGuilado, de acordo com qualquer uma das reivin- dicações 1 a 5, em que o YPEG é um YPEG de ramificação uniforme do pe- so molecular de 40000 Dáltons.
7. Composição, que compreende uma quantidade farmaceuti- camente eficaz do IFN-a2b PEGuilado, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6, e um veículo ou excipiente farmaceuticamente aceitá- vel.
8. Composição, de acordo com a reivindicação 7, que adicio- nalmente compreende manitol, um aminoácido, cloreto de sódio e acetato de sódio, em que o aminoácido é preferivelmente selecionado do grupo que consiste em ácido aspártico, asparagina e glicina.
9. Uso do IFN-a2b PEGuilado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, ou a composição de acordo com a reivindicação 7 ou 8, na preparação de um medicamento para o tratamento de uma doença em necessidade de tratamento com IFN-a2b, em que a doença é preferivelmen- te selecionada do grupo que consiste em infecções virais, por exemplo, he- patite B, hepatite C, hepatite D, e condiloma acuminado, tumores, por exem- pio, leucemia de célula pilosa, leucemia mieloide crônica, leucemia de não- Hodgkin maligno de grau baixo, linfólise mediada por célula, Sarcoma de Kaposi, mieloma múltiplo, melanoma maligno, Iinfoma de célula T cutâneo, papiloma laríngeo, carcinoma de célula renal recorrente ou metastático, dis- túrbios e doenças inflamatórias, por exemplo, esclerose múltipla, artrites, asma, fibrose cística e doença pulmonar intersticial, e doenças mieloprolife- rativas relacionadas com trombocitemia.
10. Método para preparar e purificar o IFN-a2b PEGuilado, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6, que compreende as eta- pas (a) sob uma condição alcalina, preferivelmente em pH 9,0, permitindo PEG de ramificação em forma de Y da seguinte fórmula reagir com IFN-a2b, e obter IFN-a2b PEGuilado; <formula>formula see original document page 30</formula> em que ReR' são independentemente um grupo C1-C4 alquila, preferivel- mente metila; j é um número inteiro entre 1-12; m e m' significam o grau de polimerização e pode ser qualquer número inteiro, e m+m' é preferivelmente de 600 a 1500; (b) capturar os produtos de reação obtidos na etapa (a) com uma resina de permuta de ânion, preferivelmente Q Sefarose FF, e eluir os produtos em um gradiente de ânion, preferivelmente em um gradiente de íon de cloreto, para obter produtos modificados; (c) eluir os produtos de reação capturados na etapa (b) com uma resina de permuta de cátion, preferivelmente SP Sefarose FF, em um gradiente de cátion, preferivelmente em um gradiente de íon de sódio, e em seguida coletar cada pico separadamente: (d) determinar a atividade do produto de cada pico, e selecionar o pico correspondendo ao produto de reação com atividade mais elevada.
11. Método, de acordo com a reivindicação 10, em que o YPEG tem um peso molecular de 40KG, e preferivelmente é um Y-PEG de ramifi- cação uniforme, e mais preferivelmente a relação molar da reação de IFN- a2be YPEG é 1:2.
12. Método de tratamento de um paciente que sofre de uma do- ença em necessidade de tratamento com IFN-a2b, que compreende admi- nistrar uma quantidade terapeuticamente eficaz do IFN-a2b PEGuilado, co- mo definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6, ou a composição como definida em qualquer uma das reivindicações 7 e 8, ao paciente, em que a doença em necessidade de tratamento com IFN-a2b é preferivelmen- te selecionada do grupo que consiste em infecções virais, por exemplo, he- patite B, hepatite C, hepatite D e condiloma acuminado, tumores, por exem- plo, leucemia de célula pilosa, leucemia mieloide crônica, leucemia de não- Hodgkin maligno de grau baixo, linfólise mediada por célula, Sarcoma de Kaposi, mieloma múltiplo, melanoma maligno, Iinfoma de célula T cutâneo, papiloma laríngeo, carcinoma de célula renal recorrente ou metastático e doenças mieloproliferativas relacionadas com trombocitemia, distúrbios e doenças inflamatórias, por exemplo, esclerose múltipla, artrites, asma, fibro- se cística e doença pulmonar intersticial.
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