PT2186830E - Interferão alfa 2b modificado com polietilenoglicol e método de preparação e aplicações do mesmo - Google Patents

Interferão alfa 2b modificado com polietilenoglicol e método de preparação e aplicações do mesmo Download PDF

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PT2186830E
PT2186830E PT07800861T PT07800861T PT2186830E PT 2186830 E PT2186830 E PT 2186830E PT 07800861 T PT07800861 T PT 07800861T PT 07800861 T PT07800861 T PT 07800861T PT 2186830 E PT2186830 E PT 2186830E
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Qingjiang Xiao
Li Sun
Tiebing Wang
Fenghong Yin
Shihong Luo
Lu Zhuang
Min Liu
Tianle Xu
Yong Zhang
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Description

Descrição
INTERFERÃO ALFA 2B MODIFICADO COM POLIETILENOGLICOL E MÉTODO DE PREPARAÇÃO E APLICAÇÕES DO MESMO
CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção relaciona-se com interferão a-2b modificado com polietilenoglicol ramificado em forma de y (PEG) num único resíduo aminoácido e a preparação do mesmo, assim como o uso do IFN-a2b peguilado num único resíduo aminoácido no campo farmacêutico.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
Os interferões (IFN) são uma família de proteínas de molécula pequenas ou glicoproteínas produzidas por células eucarióticas em resposta à infecção vírica e outros estímulos antigénicos, que demonstram efeitos de amplo espectro, antivíricos, antiproliferativos e imunomodulatórios. Os IFN têm sido extensamente aplicados no tratamento de várias condições e doenças, tais como infecções víricas, por ex., hepatite B, hepatite C e VIH; distúrbios inflamatórios e doenças, por ex., esclerose múltipla, artrite, asma, fibrose cística e doença de pulmão intersticial; e tumores, por ex., mielomas, linfoma, cancro hepático, cancro do pulmão, tricoleucemia, etc. (Kenji Oritani, Paul W Kincade, et al. Type I interferon and limitin: a comparison of structures, receptors, and functions. Cytokine and Growth Factor Reviews, 12, 337-348, 2001; Yu-Sen Wang, Stephen
Youngster, et al. Structural and biological characterization of PEGylated recombinant interferon alpha-2b and its therapeutic implications. Advance Drug Delivery Reviews, 54, 547-570, 2002).
Os IFN são classificados em quatro tipos de acordo com as suas diferenças em propriedades químicas, imunológicas e propriedades 1/33 biológicas: interferão-α,β, γ e ε. 0 interferão-α (IFN-α) é segregado por leucócitos. Os IFN-α humanos são codificados por uma familia de multigenes que consiste de aproximadamente 20 genes, as proteínas codificadas que partilham até aproximadamente 90% da homologia da sequência de aminoácidos (Henco K., Brosius F.J., et al. J. Mol. Biol., 185, 227-260, 1985) . O IFN-cx2b humano é um dos subtipos da subfamília α 2 da familia IFN-α humano, e é uma única proteína de cadeia com várias actividades biológicas. A proteína de cadeia simples consiste em 165 resíduos de aminoácidos com 4 Cys, em que duas pontes dissulfeto intracadeia são formadas entre Cysl-Cys98 e Cys29-Cysl38, respectivamente, e o aminoácido N-terminal é Cys com um grupo livre oí-NH2 . Os resíduos nas posições 31, 49, 70, 83, 112, 121, 131, 133, 134 e 164 da sequência de aminoácidos são Lys, todos eles contêm um grupo livre de ε-ΝΗ2. Esta proteína não é glicosilada e sensível a muitas proteases. A sequência de aminoácidos de interferão-a-2b é mostrada na SEQ ID N°: 1.
Os IFN são normalmente administrados parenteralmente em tratamentos clínicos. A curta semi-vida in vivo (2-4h) e a forte imunogenicidade dos IFN resultam num intervalo de dosagem mais curto e uma frequência de dosagem mais alta. Como os anticorpos gerados diminuem significativamente a eficácia terapêutica, é difícil obter a eficácia clínica ideal. A tecnologia de modificação polietilenoglicol (PEG) desenvolvida nos últimos anos tem provido uma solução possível aos problemas acima mencionados. PEG é um polímero orgânico, inerte não-tóxico e biodegradável, e é importante nos campos da biotecnologia e farmacêutica. A técnica de modificação PEG é para ligar PEG a uma proteína activa através de ligação covalente. Após a glicosilação de polietileno (Peguilação), as propriedades da proteína podem ser significativamente aperfeiçoadas, por ex., o prolongamento da semi-vida metabólica do medicamento, a redução de 2/33 imunogenicidade, o aumento de segurança, a melhoria da eficácia terapêutica, a diminuição da frequência de dosagem, o aumento da solubilidade do medicamento/solubilidade da água, o aumento da resistência contra a proteólise, a facilitação da administração controlada do medicamento, etc. Para detalhes adicionais, consulte Inada et ai. J. Bioact. And Compatible Polymers, 5, 343, 1990, Delgado et ai. Criticai Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 9, 249, 1992, Katre. Advanced Drug Delivery Systems, 10, 91, 1993, e publicação de patente americana n° . 417933. É descrito na Patente americana n°. 4179337, que após a ligação de PEG a uma enzima ou insulina, a imunogenicidade da proteína foi reduzida, enquanto simultaneamente as actividades da proteína eram também reduzidas. Isto foi também descoberto em G- (Satake-Ishikawa et al. Cell Structure and Function, 17, -160, 1992), IL-2 (Katre et al. Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 1487, 1987) , TNF- oí (Tsutsumi et al. Jpn. J. Câncer Res., 85, 1994), IL-6 (Inoue et al. J. Lab . Clin. Med., 124, 529, 1994) e CD4-IgG (Chamow et al. Bioconj. Chem., 5, 133, 1994).
Foi relatado que a proteína ramificada modificada de PEG exibiu melhor tolerância ao pH, termoestabilidade e resistência contra a proteólise do que proteínas modificadas por PEG de cadeia linear (Monfardini et al. Bioconjugate Chem., 6, 62, 1995).
Geralmente, uma molécula PEG modifica uma proteína ao ligar-se ao grupo N-terminal α-amino ou grupos ε-amino de um resíduo Lys dentro da molécula da proteína. Existem normalmente três tipos de PEG para modificação proteica: um PEG de cadeia linear (EP 0593868), um PEG ramificado em forma de U (EP 0809996) e um PEG ramificado em forma de Y (CN1243779C).
Actualmente, muitos tipos de proteínas peguiladas têm sido aplicados clinicamente. Em 1990, a adenosina deaminase bovina peguilada (Adagen) produzida por ENZON Inc. foi aprovada pela 3/33 FDA, e usada para tratar a doença de imunodeficiência severa combinada (pegfamg013102LB, http://www.fda.gov). Em 1994, outra proteína modificada de PEG para tratar leucemia linfoblástica aguda, a asparaginasa peguilada (pegaspargase, Oncaspar), foi também comercializada nos Estados Unidos (103411s50521bl, ht tp: / / www. f da. gov) . o interf erão-cx2b modificado por PEG (PEG IFN-cx2b, PEG-intron) desenvolvido por Schering-Plough foi aprovado pela FDA para comercialização em 2000 e o interf erão-cx-2b peguilado (PEG IFN-cx2a, PEGASIS) produzido por Hoffman-La
Roche Ltd. foi também aprovado para comercialização em 2002, ambos usados para tratar a hepatite (103964s50371bl, pegsche011901LB, http: //www.fda. gov). Em 2002, o factor de estimulação de colónias de granulócitos humanos modificado por PEG produzido por Amgen Inc. (PEG-filgrastim, Neulasta) foi também aprovado pela FDA, gue é usado para tratar o cancro da mama metastático (pegfamg013102LB, http://www.fda,gov)· A FDA também aceitou o pedido para o antagonista de factor de crescimento humano peguilado desenvolvido por Pharmacia. O fragmento anticorpo TNF-α combinado com PEG da Celltech e o receptor PEG-TNF da Amgen são testados nos ensaios clínicos avançados. O primeiro conjugado de molécula orgânica PEG, camptotecina peguilada, também entrou na fase II de ensaio clínico. Em 2004, o oligonucleótido modificado com PEG (Pegaptanib, Macugen™) foi aprovado pela FDA. O metabolismo in vivo do PEG no medicamento (ou o PEG em si) tem foi claramente compreendido, e o comprovado que o PEG é um bom e seguro modificador de medicamento, sem qualquer efeito secundário.
Os PEG podem ser ligados a um medicamento proteico normalmente necessitando de derivatização, de modo que um ou dois grupos terminais das extremidades dos PEG podem ser quimicamente activados para possuir um grupo funcional apropriado que mostra actividade, e assim pode formar uma ligação covalente estável com, pelo menos um grupo funcional do medicamento a ser ligado. Por exemplo, os PEG podem ser ligados a ε-ΝΗ2 do resíduo Lys 4/33 dentro da cadeia peptídica da proteína, ou para 0Í-NH2 do resíduo aminoácido N-terminal da cadeia peptídica da proteína. Na Peguilação de IFN-α descrita na patente europeia EP0809996, o PEG-NHS é ligado através de substituição nucleofílica para 0Í-NH2 do aminoácido N-terminal ou ε-ΝΗ2 de Lys em IFN-α. 0 PEG-NHS mencionado na patente acima é um derivado de PEG em forma de U ramificado (PEG2-NHS), a fórmula molecular do mesmo como em baixo: ROCHaCH^OCHzCH^n—O-C—IjtH (CHj),
Em que R e R' são independentemente um grupo alquil de peso molecular baixo, n e n' são entre 600 a 1500, e o peso molecular médio do PEG é de 26KD a 66KD. A fórmula molecular do IFN-a modificado por PEG2-NHS é como se segue:
X— IFNd
Onde uma ou mais moléculas PEG2-NHS estão ligadas a oí-NH2 do aminoácido N-terminal ou ε-ΝΗ2 de Lys em IFN-α, os produtos obtidos são uma mistura de IFN-α não peguilado, IFN-α peguilado com um único resíduo aminoácido e IFN-α peguilado em múltiplos resíduos de aminoácidos. O IFN-α peguilado com um único resíduo aminoácido pode ser isolado dos produtos obtidos por quaisquer 5/33 meios de purificação apropriados. 0 IFN-α tem um aminoácido N-terminal e mais de um resíduo Lys, nomeadamente diferentes lugares reactivos para PEG2-NHS, assim o IFN-α peguilado isolado com um único resíduo aminoácido é uma mistura de isómeros do IFN-α peguilado em diferentes resíduos aminoácidos únicos.
Na patente europeia EP 0593868, o PEG de cadeia linear é utilizado para modificar o IFN, a fórmula molecular do produto modificado é como se segue:
O
RO-íCHjCHO^HÇ^CHO^-íCHíCHO^-C^CH-W NH- - interferão- αk A* H3 A4 m
Em que R é um grupo alquil de peso molecular baixo; Ri, R2, R3 e r4 são H ou grupos alquil de peso molecular baixo; m é de 1 ao número de possíveis posições de modificação PEG no IFN; W é O ou NH; X é de 1 a 1000, Y e z são de 0 a 1000, x+y+z são de 3 a 1000 e, pelo menos um de Ri, R2, R3 e R4 é um grupo alquil de peso molecular baixo. Yu-Sen Wang et al (Yu-Sen Wang et al, Advanced Drug Delivery Reviews, 54: 547-570, 2002. Yu-Sen Wang et al, Biochemistry, 39, 10634-10640, 2000) têm relatado a modificação de rIFN-a2b com PEG-monometoxi linear 12KD (Peg-Intron) e mostraram que os produtos analisados por HPLC-IE são uma mistura de mais que 14 isómeros modificados por PEG em diferentes resíduos de aminoácidos únicos. A fórmula molecular dos PEG lineares usados por Yu-Sen Wang et al é mostrada em baixo: 0
Em que o peso molecular médio do PEG é 12KD. 6/33
RESUMO DA INVENÇÃO
Os derivados de PEG usados na presente invenção são derivados de PEG ramificado em forma de Y, ramificado novo, e as suas estruturas são diferentes destes dos PEG ramificados em forma de U. A grande diferença entre estes dois tipos de PEG é que: as cadeias de PEG com duas ramificações dos derivados de PEG em forma de Y, de acordo com a presente invenção, são juntas através do átomo N, enquanto as cadeias de PEG com duas ramificações dos derivados de PEG em forma de U em EP0809996 são juntas através do átomo C. A composição molecular dos derivados de PEG em forma de Y, de acordo com a presente invenção, é mostrada como se segue:
Pa- N- P b- •X?
Em que Pa e Pb são PEG iguais ou diferentes; j é um número inteiro de 1 a 12; R2 é H, um grupo alquil C1-C12 substituído ou não substituído, um arilo substituído, um aralquil ou um heteroalquileno; Xi e X2 são independentemente um grupo de ligação, em que Xi é (CH2)n, e X2 é seleccionado do grupo composto por (CH2) n, (CH2) n OCO, (CH2)n NHCO, e (CH2)n 00; n é um número inteiro de 1 a 10; e F é um grupo terminal seleccionado do grupo composto por um grupo hidroxilo, um grupo de carboxilo, um grupo de éster, cloreto de acilo, hidrazida, maleimida, dissulfeto de piridina, capaz de reacção com grupo de amino, hidroxilo ou de mercapto de um agente terapêutico ou um substrato para formar uma ligação covalente.
Numa forma de realização preferida da presente invenção, a molécula derivada de PEG em forma de Y é mostrada como se segue: 7/33 ROCH2CH2(OCH2CH2 )m-0-CH.CH2
(CHRj)j —F
ROCH2CH2(OCH2CH2 )m--0—CH--C
* II
O
Em que R e R' são independentemente um grupo alquil C1-C4, preferencialmente metilo; m e m' indicam o grau de polimerização e podem ser qualquer número inteiro; m+m' são preferencialmente entre 600 a 1500; Ri é H, um alquilo C1-C12 substituído ou não substituído, um arilo substituído, um aralquil, ou um grupo de heteroalquileno; j é um número inteiro de 1 a 12; e F é um grupo terminal seleccionado do grupo composto por um grupo de hidroxilo, um grupo de carboxilo, um grupo de éster, cloreto de ácido carboxílico, hidrazida, maleimida, dissulfeto de piridina, capaz de reacção com um grupo amino, um grupo de hidroxilo ou um grupo de mercapto de um agente terapêutico ou um substrato para formar uma ligação covalente. Preferencialmente, o peso molecular total médio do PEG é de aproximadamente 10000 a aproximadamente 60000 Dalton, mais preferivelmente aproximadamente 40000 Dalton.
Numa forma de realização preferida da presente invenção, uma fórmula possível estrutural da molécula derivada de PEG em forma de Y é mostrada como a fórmula (I):
ROCH2CH2(OCH2CH2)m-0-CH2CH^ jj H —C —N—o —
ROCH2CH2(OCH2CH2 )m'-Q-CH,—C
“ II
Em que R e R' são independentemente um Grupo alquil C1-C4, preferencialmente metilo; m e m' indicam o grau de polimerização e podem ser qualquer número inteiro; m+m' são preferencialmente 8/33 entre 600 a 1500; j é um número inteiro de 1 a 12 e o peso molecular médio total dos PEG é aproximadamente 40000 Dalton.
Os presentes inventores usaram derivados de PEG ramificados em forma de Y (YPEG) para modificar interferão-a-2b (IFN-a2b), e isolaram o YPEG-IFN-a2b, modificado por PEG com um único resíduo aminoácido, por cromatografia de troca de iões em Q-Sepharose FF. Além disso, o YPEG-IFN-a2b isolado, modificado por PEG com um único resíduo aminoácido, foi adicionalmente separado por cromatograf ia em SP-Sepharose FF para obter YPEG-IFN-cx2b, caracterizado por o YPEG ser principalmente ligado à cadeia lateral ε-ΝΗ2 de Lys na posição 134, na SEQ ID N°.l, que é chamado de YPEG-IFN-a2b(134). Depois da medição, foi descoberto que a actividade in vitro do YPEG-IFN-cx2b (134) é significativamente superior do que a de YPEG-IFN-cx2b, no qual o YPEG é ligado a outro resíduo aminoácido, e a semi-vida do YPEG-IFN-a2b(134) em soro é significativamente maior que a aquela do lFN-a2b não modificado.
Consequentemente, a presente invenção provê IFN-a2b peguilado com um único resíduo aminoácido, a estrutura do qual é como se segue:
Pa -X| o II H —ÍCHROj— o —N—IFN-a2b pb- —ΧΓ
Em que Pa e Pb são os PEG iguais ou diferentes; j é um número inteiro de 1 a 12; R2 é H, um grupo alquilo C1-C12 substituído ou não substituído, um arilo substituído, um aralquil, ou um grupo de heteroalquileno; X2 e X2 são independentemente um grupo de ligação, em que X2 é (CH2)n, e X2 ser seleccionado do grupo composto por (CH2)n, (CH2)n OCO, (CH2)n NHCO e (CH2)n CO, caracterizado por n ser um número inteiro de 1 a 10. 9/33
Numa forma de realização preferida da presente invenção, o IFN-a2b peguilado da presente invenção é da fórmula estrutural (II) em baixo:
ROCH2CH2(OCH2CH2)m-0-CH2CH^ [} H -( CH2 )j — C—N—IFN-a2b ROCH2 CH2(OCH2 CH2 )m' -O CH,—</
* II o (II)
Em que R e R' são independentemente um grupo alquil C1-C4, preferencialmente metilo; j é um número inteiro de 1 a 12; me m' indicam o grau de polimerização e podem ser números inteiros iguais ou diferentes. Nesta estrutura, uma molécula de PEG ramificada em forma de Y é ligada a uma molécula IFN-cx2b através de um único resíduo aminoácido. 0 peso molecular médio do YPEG-IFN-a2b na fórmula (II) depende principalmente do grau de polimerização, m e m' . Onde m+m' sejam preferencialmente de 600 a 1500, o peso molecular médio correspondente do YPEG é de aproximadamente 26000 a aproximadamente 66000 Dalton. Onde m+m' sejam preferencialmente de 795 a 1030, o peso molecular médio correspondente do YPEG é de aproximadamente 35000 a aproximadamente 45000 Dalton. Onde m+m' sejam preferencialmente de 885 a 1030, o peso molecular médio correspondente do YPEG é de aproximadamente 39000 a aproximadamente 45000 Dalton. Onde m+m' sejam mais preferivelmente 910, o peso molecular médio correspondente do YPEG é 40000 Dalton. O rácio de m e m' pode variar de 0,5 a 1,5, preferencialmente de 0,8 a 1,2.
Numa forma de realização preferida, no IFN-a2b peguilado da presente invenção, uma molécula PEG é ligada a IFN-a2b através de uma ligação amido formada por um grupo α-amino do aminoácido N-terminal ou a cadeia lateral do grupo ε-amino grupo do resíduo 10/33
Lys de IFN-cx2b correspondente à posição 31, 49, 70, 83, 112, 121, 131, 133, 134 ou 164, como mostrado na SEQ ID N°.l.
Numa forma de realização preferida adicional, no IFN-a2b peguilado da presente invenção, uma molécula PEG é ligada a IFN-a2b através de uma ligação amido, principalmente formada pela cadeia lateral do grupo ε-amino do resíduo Lys de IFN-a2b correspondente à posição 134, como mostrado na SEQ ID N°.l.
Opcionalmente, o IFN-a2b da presente invenção pode ser extraído de fontes naturais ou obtido por biotecnologia recombinante. Preferencialmente, o IFN-a2b é um IFN-a2b humano (hIFN-a2b) com a sequência de aminoácidos da SEQ ID N°.l, a qual é extraída de fontes naturais ou obtida por biotecnologia recombinante. Mais preferencialmente, o IFN-a2b humano é IFN-a2b humano recombinante (rhIFN-a2b). 0 rhIFN-a2b pode ser artificialmente sintetizado, ou ser expresso de sistemas de expressão procarióticos tais como E. coli, ou ser expresso de sistemas de expressão eucariótica com base em levedura, tal como Pichia, ou ser expresso de sistemas de expressão de célula de insectos ou sistemas de expressão de células de mamíferos, tais como CHO. Os métodos de preparação do IFN-a2b natural ou recombinante, e os testes de actividade de IFN-a2b e IFN-a2b modificado por YPEG são conhecidos da técnica precedente.
Similar ao IFN-a2b, o YPEG-IFN-cx2b da presente invenção pode também ser usado clinicamente para tratar tumores e infecções virais, tais como hepatite, tricoleucemia, linfólise mediada por células, sarcoma de Kaposi, etc. Em condições clínicas, o YPEG-IFN-a2b da presente invenção é claramente aperfeiçoado, em comparação com IFN-cx2b, em estabilidade, solubilidade, semi-vida no soro e eficácia da terapêutica clínica. Para o modo de administração, o YPEG-IFN-cx2b da presente invenção pode ser administrado aos pacientes em forma de uma composição que compreende uma quantidade farmaceuticamente eficaz do YPEG-IFN-11/33 a2b e um suporte farmaceuticamente aceitável ou excipiente. Assim, a presente invenção, em outro aspecto, também provê uma composição que compreende uma quantidade farmaceuticamente eficaz do IFN-a2b peguilado da presente invenção e um suporte farmaceuticamente aceitável ou excipiente. Preferencialmente, a composição compreende manitol, aminoácidos, cloreto de sódio e acetato sódico, caracterizada por os aminoácidos serem preferencialmente seleccionados do grupo composto por ácido aspártico, asparagina e glicina.
Em outro aspecto, a presente invenção também provê o uso do IFN-a2b peguilado da invenção ou a composição que compreende o IFN-a2b peguilado da invenção na preparação de um medicamento para tratar uma doença com necessidade de tratamento com IFN-a2b. Preferencialmente, a doença com necessidade de tratamento com IFN-cx2b é seleccionada do grupo composto por infecções virais, por ex., hepatite B, hepatite C, hepatite D e condilomas acuminados, tumores, por ex., tricoleucemia, leucemia mielóide crónica, leucemia não-Hodgkin de baixo grau de malignidade, linfólise mediado por células, sarcoma de Kaposi, mieloma múltiplo, melanoma maligno, linfomas cutâneos de células T, papiloma laringeo, carcinoma de células renais recorrente ou metastático, doenças inflamatórias e doenças, por ex., esclerose múltipla, artrite, asma, fibrose cistica e doença pulmonar intersticial, e trombocitemia relacionada com doenças mieloproliferativas.
Para obter o IFN-a2b modificado por YPEG, numa forma de realização da presente invenção, inicialmente as partes de PEG de derivados YPEG activados, tais como PEG éster N-hidroxisuccinimida (YPEG-NHS) é de ligado de forma covalente a um grupo amino (-NH2) da proteina através de substituição nucleofilica, caracterizado por o grupo amino incluir um grupo α-amino N-terminal da proteina e um grupo ε-amino do resíduo 12/33
Lys. A equaçao de reacção para a geração de YPEG-IFN-a2b de IFN-a2b e YPEG é como se segue:
+ H2N-IFN«2b ROCH2CH2(OCH2CH2 )m-0 - ΟΗ,ΟΗ·, ^ - -"v-j ROCH2CH2(OCH2 CH2 )m'-0-CH·»—
II
O 4 ROCH2CH2(OCH2CH2 )rn-0-CH,CH-
II H -(CH2) j - C - N - IFNa 2b
II o
As condições de reacção são suaves, o pH varia de 4,5 a 9,5, a temperatura é entre 0 a 25 °C, e são necessárias medidas de mistura ou agitação. Para condições detalhadas, podem ser consultados os Exemplos na DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO. Todos os YPEG com pesos moleculares diferentes podem ser ligados a IFN-cx2b usando o método acima mencionado. Os produtos incluem o modificado por PEG com um único resíduo aminoácido (YPEG-IFN-cx2b) , o modificado por PEG com dois resíduos aminoácidos (YPEG2 -IFN-cx2b) e o modificado por PEG em resíduos aminoácidos múltiplos (YPEGn-IFN-cx2b) , caracterizados por os produtos modificados por PEG com um único resíduo aminoácido poderem ser produtos predominantes para ajustar a condição de reacção.
Posteriormente, o YPEG-IFN-a2b, modificado por PEG com um único resíduo aminoácido, pode ser isolado da mistura de todos os tipos do IFN-cx2b modificados por YPEG usando um método, tal como cromatografia de troca catiónica, cromatografia de troca aniónica, ou cromatografia de exclusão, e depois o IFN-a2b modificado por PEG em diferentes resíduos aminoácidos únicos pode ser ainda mais resolvido para obter o YPEG-IFN-cx2b no qual o YPEG é ligado a uma posição específica. Métodos de purificação 13/33 convencionais incluem cromatografia de troca catiónica, cromatografia de troca aniónica, cromatografia de interacção hidrofóbica e cromatografia de exclusão. A análise caracteristica pode ser realizada por um método conhecido na matéria, por ex., a espectroscopia de massas, a electroforese em gel de polipoliacrilamida e a cromatografia de exclusão líquida de alta performance pode ser usada para analisar o peso molecular dos produtos, para distinguir os produtos modificados por PEG com um único resíduo aminoácido daqueles modificados por PEG com dois ou múltiplos resíduos aminoácidos e IFN-cx2b não modificado. Os métodos de purificação anteriormente mencionados podem também ser usados para resolver adicionalmente os produtos modificados por PEG com um único resíduo aminoácido para obter isómeros diferentes com a modificação PEG em diferentes posições únicas. As actividades biológicas in vitro de todos os tipos dos produtos modificados por PEG podem ser medidas de acordo com qualquer ensaio conhecido para a actividade IFN, por ex., inibição de efeito citopático. Para IFN modificados por PEG com um único resíduo aminoácido, as fracções PEG nos isómeros diferentes têm efeitos diferentes na manutenção dos domínios activos de IFN, resultando em grandes diferenças nas actividades biológicas dos isómeros diferentes. Geralmente, as actividades in vitro de IFN são notavelmente diminuídas após modificação PEG. No entanto, de acordo com a presente invenção, a actividade específica in vitro dos isolados de três picos obtidos por cromatografia de troca iónica tem sido medida, e os resultados indicam que o isolado do pico 3 (SP2) tem actividade específica significativamente mais elevada que os isolados de outros picos e PEGASYS (Hoffmann-La Roche, Basel, Suíça), e tem uma semi-vida significativamente maior no soro do que o IFN-a2b não modificado.
Numa forma de realização adicional, o péptido ligado a PEG ramificado em forma de Y, isolado do SP2, é sequenciado usando a 14/33 degradaçao Edman, e os resultados mostraram que o componente primário de SP2 foi YPEG-IFN-cx2b (134) .
Deste modo, em outro aspecto, a presente invenção também provê a preparação e métodos de purificação para YPEG-IFN-a2b (134), que compreende: (a) sob uma condição alcalina, preferencialmente com pH 9,0, que permite que o PEG ramificado em forma de Y, como mostrado na fórmula (I) em baixo, reaja com IFN-a2b, e obtenha IFN-cx2b peguilado;
ROCH2CH2(OCH2CH2 )m-0-CH2CH2, "^'N-(CH2)j ROCt·^ CH2(OCH2 CH2 )m'-0-CH>—</
* II o (I)
Em que R e R/ são independentemente um grupo alquil C1-C4, preferencialmente metilo; j é um número inteiro de 1 a 12; m e m' indicam o grau de polimerização e podem ser qualquer número inteiro; e m+m' são preferencialmente entre 600 a 15 0 0; (b) capturando os produtos de reacção na fase (A) com uma resina de troca aniónica, preferencialmente Q Sepharose FF, e eluição dos produtos num gradiente de anião, preferencialmente num gradiente de iões cloreto, para obter produtos modificados; (c) eluição dos produtos de reacção capturados na fase (B) com uma resina de troca catiónica, preferencialmente SP Sepharose FF, num gradiente de catião, preferencialmente num gradiente de iões sódio, e recolhendo cada pico separadamente: 15/33 (d) determinar a actividade do produto de cada pico, e seleccionando o pico correspondente ao produto de reacção com a maior actividade.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS FIG.l: a SDS-PAGE (Electroforese em gel de poliacrilamida com dodecilsulfato sódico) de 2 lotes de IFN-cx2b modificada com YPEG (40KD). A concentração do gel de separação foi de 12%, e foi usado azul de Coomassie brilhante R-250 como coloração. Pode ser visto a partir do resultado da SDS-PAGE (electroforese em gel de poliacrilamida com dodecilsulfato sódico) da FIG.l, sob a condição, o nível de modificação PEG de rHuIFN-a2b foi entre 30 a 50, e foi estável. Os produtos primários modificados eram IFN-a2b modificados por PEG com um único resíduo aminoácido (YPEG-IFN-cx2b) , e existiram também alguns IFN-a2b modificados por PEG em múltiplos resíduos aminoácidos (YPEGn-IFN-cx2b) . Pista 1: IFN-0í2b, NHS-YPEG (40KD) reacção de modificação às Oh; pista 2: lote 060604-1 de IFN-a2b, NHS-YPEG (40KD) reacção de modificação às 2h; pista 3: lote 060604-2 de IFN-a2b, NHS-YPEG (40KD) reacção de modificação às 2h; pista 4: marcador (GE Lifescience). FIG.2: o perfil de resolução dos isómeros de modificação YPEG-IFN-a2b por SP-Sepharose FF. FIG.3: SDS-PAGE (Electroforese em gel de poliacrilamida com dodecilsulfato sódico) com coloração prata (12%) das amostras YPEG-IFN-a2b purificadas por SP-Sepharose FF. pista 1: marcador de peso molecular (GE Lifescience); pista 2: pico de purificação SP-Sepharose FF 1 do YPEG-IFN-a2b; pista 3: pico de purificação SP-Sepharose FF 2 de YPEG-IFN-a2b, pista 4: pico de purificação SP-Sepharose FF 3 de YPEG-IFN-a2b; pista 5: Pico de purificação SP-Sepharose FF 4 de YPEG-IFN-a2b. FIG.4: peso molecular aparente da amostra de YPEG-rHuIFN-cx2b purificado por SP-Sepharose FF determinado por 7,5% de redução 16/33 de SDS-PAGE (Electroforese em gel de poliacrilamida com dodecilsulfato sódico) com coloração prata. Pista 1: marcador de peso molecular (GE Lifesciences); pista 2: YPEG-HuIFN-a2b SP1, 2 yg; pista 3: YPEG-rHuIFN-a2b SP2, 2 yg; pista 4: YPEG-rHuIFN-a2b SP3, 2 yg. FIG.5: os pesos moleculares das amostras de YPEG-IFN-cx2b, purificadas com SP-Sepharose FF, determinado por MALDI-TOF MS. FIG.6: o peso molecular de YPEG-NHS (40KD) foi determinado por MALDI-TOF MS. FIG.7: a concentração do medicamento no soro e a actividade após uma única injecção subcutânea de 30 yg.kg-1 de YPEG-rhIFN-a2b no Macaco cinomolgos (Macaca fascicularis). FIG.8: o ensaio em branco do Mapeamento Peptidico Tripsinase do YPEG-rHuIFN-a2b SP2 digerido por tripsina. Dois picos pequenos foram detectados respectivamente em 71.674 min. e 17.589 min.; e o pico de tripsina foi detectado entre 2-3 minutos. FIG.9: a análise do Mapeamento Peptidico Tripsinase da amostra de YPEG-IFN-a2b SP2 digerida por tripsina (Oh) por HPLC-RP Cis. O tempo de retenção de YPEG-IFN-a2b SP2 foi 62.114 min.; e o pico de eluição aos 71.908 min. foram os anteriores, 2-3 min. FIG.10: a análise do Mapeamento Peptidico Tripsinase da amostra de YPEG-IFN-a2b SP2 digerida por tripsina (48h) por HPLC-RP Ci8. Não foi detectado qualquer pico de substrato (62.114 min.) entre 60.5min.-63.2min., que demonstra que a amostra foi completamente digerida. FIG.ll: o perfil de separação Sephacryl S-100 HR dos péptidos modificados por YPEG da amostra de YPEG-IFN-oí2b SP2 completamente digerida por tripsina. As amostras foram 17/33 recolhidas de acordo com os picos, S100-1 foram péptidos modificados por YPEG, nomeadamente a amostra alvo.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO A presente invenção será adicionalmente descrita pelos exemplos seguintes, mas qualquer exemplo ou a combinação do mesmo não deverá ser compreendido como limitante do âmbito ou forma de realização da invenção. 0 âmbito da invenção é limitado apenas pelas reivindicações em anexo. Em combinação com a descrição e técnica anterior, as pessoas com experiência na matéria compreenderiam claramente o âmbito limitado pelas reivindicações.
Exemplo 1
Preparação de IFN-a2b humano recombinante modificado por PEG ramificado em forma de Y
(1) Preparação em pequena escala de IFN-a2b humano recombinante modificado por PEG ramificado em forma de Y 166,1 mg de YPEG (fórmula (I), peso molecular médio 40KD, braço igual, número de lote RD010P041, Beijing JenKem Technology Co., Ltd.) foram pesados e dissolvidos em 1 ml de 2 mM de HC1 (Guangdong Guanghua Chemical Factory Co., Ltd.). e 40 mg de IFN-a2b (Xiamen Amoytop Biotech Co., Ltd.) e 50 mM de solução tampão de bórax/ácido bórico (pH 9,0, Sinopharm Shanghai Chemical Reagent Co., Ltd.) foram adicionados para um volume de reacção final de 10 ml. Neste sistema de reacção, a concentração final de IFN-a2b foi 4 mg/ml, e o rácio de reacção molar de IFN-cx2b e YPEG foi 1:2. O sistema de reacção foi mantido sob 0-20 °C durante 2h com agitação. O IFN-a2b peguilado foi então gerado, e a reacção foi parada ao adicionar ácido acético glacial (Shantou Xilong Chemical Co., Ltd.) para resultar num pH <4,0. Uma 18/33 amostra foi submetida a SDS-PAGE. 0 sistema de reacção foi diluído 50 vezes com água e depois 0,2 pm filtrados antes de serem armazenados a 4 °C para uso adicional.
Foi usada a cromatografia Q-Sepharose FF para separar o PEG restante e hidrolatos de PEG, IFN-a2b modificado por YPEG em múltiplos resíduos aminoácidos, IFN-a2b modificado por YPEG com um único resíduo aminoácido e o IFN-a2b não modificado. A coluna de Q-Sepharose FF (GE Healthcare) (φ2 mm x 90 mm; lCV=10ml) foi regenerada com 3CV de 20 mM de solução tampão de bórax/ácido bórico (pH 9,0)-lM NaCl (BBI), e depois equilibrada com 5CV de 20 mM solução tampão de bórax/ácido bórico (pH 9,0) . O comprimento da onda de detecção UV foi definido em 280 nm. Toda a amostra armazenada a 4 °C foi carregada. Depois de carregada, a coluna foi equilibrada com 3CV de solução tampão de bórax/ácido bórico (pH 9,0), e depois 20 mM de solução tampão de bórax/ácido bórico (pH 9,0)-12 mM NaCl foi usado para eluição até o primeiro pico ter sido completamente eluído, cujo pico foi o restante PEG 20 mM de solução tampão de bórax/ácido bórico (pH 9,0)-60 mM NaCl foi então usado para eluição, e a amostra recolhida neste pico de eluição foi principalmente o YPEG-IFN-a2b, modificado por PEG com um único resíduo aminoácido. E depois, 20 mM de solução tampão de bórax/ácido bórico (pH 9,0)-500 mM NaCl foi usado para eluição e o pico de eluição foi o IFN-a2b não modificado.
Os produtos alvo eram principalmente o YPEG-IFN-cx2b modificado por PEG com um único resíduo aminoácido, com um nível de produção de 20 a 40%.
2) Preparação em grande escala de IFN-a2b humano recombinante modificado por PEG ramificado em forma de Y 4982,4 mg de YPEG (fórmula (I), peso molecular médio 40KD, braço igual, número de lote RD010P041, Beijing JenKem Technology Co., 19/33
Ltd.) foram pesados e dissolvidos em 25 ml de 2 mM de HC1 e 1200 mg de IFN-a2b e 50 mM de solução tampão de bórax/ácido bórico (pH 9,0) foram adicionados para um volume de reacção final de 200 ml. Neste sistema de reacção, a concentração final de IFN-a2b foi 6 mg/ml, e o rácio de reacção molar de IFN-a2b e YPEG foi 1:2. O sistema de reacção foi mantido abaixo de 0-25 °C durante 2h com agitação. A reacção foi parada ao adicionar ácido acético glacial para resultar num pH <4,0. Uma amostra foi submetida a SDS-PAGE. O sistema de reacção foi diluído 50 vezes com água e depois 0,2 ym filtrados antes de serem armazenados a 4 °C para uso adicional.
Foi usada a cromatografia Q-Sepharose FF para separar o PEG restante e hidrolatos de PEG, IFN-cx2b modificado por YPEG em múltiplos resíduos aminoácidos, IFN-cx2b modificado por YPEG com um único resíduo aminoácido e o IFN-cx2b não modificado. A coluna de Q-Sepharose FF (GE Healthcare) (φ38 mm x 265 mm; 1CV=300 ml) foi regenerada com 3CV de 20 mM de solução tampão de bórax/ácido bórico (pH 9,0)-lM NaCl e depois equilibrada com 5CV de 20 mM de solução tampão de bórax/ácido bórico (pH 9,0) . O comprimento da onda de detecção UV foi definido em 280 nm. Toda a amostra armazenada a 4 °C foi carregada. Depois de carregada, a coluna foi equilibrada com 3CV de solução tampão de bórax/ácido bórico (pH 9,0), e depois 20 mM de solução tampão de bórax/ácido bórico (pH 9,0)-12 mM NaCl foi usado para eluição até o primeiro pico ter sido completamente eluído, cujo pico foi o restante PEG 20 mM de solução tampão de bórax/ácido bórico (pH 9,0)-60 mM NaCl foi então usado para eluição, e a amostra recolhida neste pico de eluição foi principalmente o YPEG-IFN-a2b, modificado por PEG com um único resíduo aminoácido. E depois, 20 mM de solução tampão de bórax/ácido bórico (pH 9,0)-500 mM NaCl foi usado para eluição e o pico de eluição foi o IFN-cx2b não modificado. 20/33
Os produtos alvo eram principalmente o YPEG-IFN-a2b modificado por PEG com um único resíduo aminoácido, com um nível de produção de 35 a 50%. A FIG.l mostra os resultados da SDS-PAGE para 2 lotes de IFN-a2b modificados com YPEG (40KD) . Pode ser visto na figura 1 que sob a condição, o nível de modificação PEG de rhIFN-cx2b encontrava-se entre 35 a 50% e permanecia estável. Os produtos primários modificados foram modificados por PEG com um único resíduo aminoácido (YPEG-IFN-a2b) , e existiam também alguns produtos modificados por PEG em múltiplos resíduos aminoácidos (YPEGn-IFN-a2b) .
Exemplo 2
Resolvendo YPEG-IFN-a2b através de SP-Sepharose FF A amostra YPEG-IFN-a2b capturada por Q-Sepharose FF foi ajustada para pH 5,0 com 20% de ácido acético, depois diluída 15 vezes com 5 mM NaAc/HAc (pH 5,0, Shantou Xilong Chemical Co., Ltd.). A amostra foi carregada em 0,5 mg/ml de capacidade para uma coluna (φ18 mm x 394 mm) com 100 ml de SP-Sepharose FF (GE Healthcare). A coluna foi equilibrada com 3CV de 5 mM NaAc/HAc (pH 5,0), e depois eluida com 2,5CV do gradiente de 0%-30% de 5 mM NaAc/HAc-70 mM NaCl (pH 5,0), depois com 50CV do gradiente de 30%-100% de 5 mM NaAc/HAc-70 mM NaCl (pH 5,0). O YPEG-IFN-a2b foi resolvido como 4 picos de eluição por 100 ml de SP-Sepharose FF. As amostras foram recolhidas de acordo com estes picos e depois medidas por SDS-PAGE com coloração prata, respectivamente. De acordo com os resultados da SDS-PAGE pode ser observado que o pico 1 resolvido por SP-Sepharose FF foi principalmente os produtos modificados por YPEG em múltiplos resíduos aminoácidos (YPEGn-IFN-cx2b) . O pico 2 por SP-Sepharose FF foi principalmente os produtos modificados por PEG com um único resíduo aminoácido (YPEG-IFN-a2b), e também continha alguns produtos modificados 21/33 por PEG em múltiplos resíduos aminoácidos. 0 pico 3 e o pico 4 por SP-Sepharose FF eram ambos os produtos modificados por PEG com um único resíduo aminoácido. Os picos 2-4 resolvidos por SP-- Sepharose FF eram isómeros com modificação YPEG em diferentes posições únicas, e eram nomeados respectivamente como YPEG-IFN-a2b SPl; YPEG-IFN-a2b SP2 e YPEG-IFN-a2b SP3. 0 perfil de resolução e os resultados da SDS-PAGE coloridos com prata foram mostrados na Fig. 2 e FIG.3, respectivamente.
Todas as amostras de YPEG-IFN-a2b SP1-3 foram suplementadas com cloreto de sódio, acetato sódico, manitol, ácido aspártico e foram esterilizadas com um filtro de 0,22 ym antes de serem armazenadas a 4 °C para uso adicional.
Exemplo 3
Análise característica de isómeros de modificação YPEG-IFN-a2b (1) Concentração proteica
As concentrações de isómeros de modificação YPEG-IFN-cx2b foram determinadas pelo método Kjeldahl. (2) Peso molecular aparente da proteína
Os pesos moleculares aparentes de isómeros de modificação YPEG-IFN-a2b foram determinados por SDS-PAGE. O método foi de acordo com Laemmli et al (Nature 227: 680, 1970). A concentração do gel foi 7,5%, e o gel foi visualizado por coloração prata. Os pesos moleculares aparentes de isómeros de modificação YPEG-IFN-a2b foram quase os mesmos, aproximadamente 123KD (FIG.4).
(3) Peso molecular determinado por MALDI-TOF MS 22/33 MALDI-TOF MS (Autoflex TOF/TOF system, Bruker Daltonics, Germany) foi usado para determinar os pesos moleculares dos isómeros de modificação YPEG-IFN-cx2b. 0 ácido sinapínico (SA, C11H12O5, M.W. 224.22, número de lote: 2006 236870 002, Bruker
Daltonics, Germany) foi usado como matriz. O padrão de calibração de proteína II (referência n° 207234, Bruker Daltonics, Germany) foi usado como padrão de peso molecular proteico, e o software para análise de dados foi o FlexAnalysis Ver.3.0.54.0. Os pesos moleculares MS dos isómeros de modificação YPEG-IFN-a2b foram quase os mesmos, aproximadamente 59000 Dalton (FIG.5). (4) Teste de teor de endotoxina
Baseado no ensaio limulus (Pharmacopoeia of the People's
Republic of China, 2005, Volume 3, Appendix X C) , o teor de endotoxina de cada amostra YPEG-IFN-a2b foi menor do que 5,0 EU/mg. (5) Actividade in vivo e Farmacocinética do YPEG-IFN-a2b SP2 em animais. □ % actividade in vivo de YPEG-IFN-a2b SP2 em animais. O mecanismo de acção de IFN é parcialmente para induzir a produção de 2',5'-AS (2',5'-oligoadenilato sintetase), que por sua vez exerce os seus efeitos antivirais. Usando 125I como um marcador, os parâmetros farmacodinâmicos do IFN são reflectidos pela actividade 2',5'-AS in vivo. A 2',5'-AS catalisa a síntese de 2',5'-A (2',5'-oligoadenilato) de ATP na presença de agar Poli(I)-Poli(C) (a actividade de 2',5'-AS pode ser representada pela concentração do sintetizado 2',5'-A). Primeiro, 2',5'-AS nas amostras é absorvida e activada por agarose Poli(I)-Poli(C), depois catalisa o substrato ATP para resultar em 2',5'-A. Uma mistura de 2' , 5'-A marcado por 125I, soro anti-2',5'-A e 23/33 anticorpo secundário são adicionados na amostra que é de seguida incubada e centrifugada para separar a mistura. 0 sobrenadante é eliminado e um espectrómetro de radiação gama foi usado para medir a radioactividade do sedimento. 0 nivel de união do 2',5'-A marcado com 125I é calculado. É usada uma regressão logística de 4 parâmetros para gerar uma curva padrão, e depois a concentração dos produtos 2',5'-A induzidos por 2',5'-AS, numa amostra desconhecida, poderia ser estimada.
Usando o método 2',5'-A anteriormente mencionado, os resultados na Tabela 1 e FIG.7 mostraram a concentração de 2' ,5'-A no soro após uma única injecção subcutânea de 30 pg-kg-1 de YPEG-IFN-a2b SP2 no Macaco cinomolgos (Macaca fascicularis) (18 Macacos cinomolgos, Guangxi Weimei Biotechnology Co., Ltd., Certificação N° . S. CXK GUI 2002-0001, peso corporal 2,5 a 5.5, 6 fêmeas e 12 machos, aumentado em estruturas separadas, alimentados com ração para macacos padrão, com acesso livre a água). Pode ser visto na FIG.8 que o tempo médio para o pico é de 64±27,71h, e a concentração para o pico foi 292,30±148,08 Pmol-dL-1. Depois da administração, a actividade de 2',5'-AS no soro foi claramente aumentada, e o tempo para o pico de 2', 5'-A no soro foi retardado que aquele de YPEG-IFN-a2b SP2.
Tabela 1. As concentrações de 2' . 5'-A no soro ao longo do tempo após uma única injecção subcutânea de 30 pg-kg-1 de YPEG-rhlFN-a2b SP2 no Macaco cinomolgo. (Pmol-dlT1)
Tempo N°. de macacos cinomolgos Média SD (h) 1 2 3 0 19,32 13,63 20, 74 17, 90 + 3, 76 1 40,17 218,67 — 129,42 + 126,22 2 45, 74 14,30 80,23 46, 76 + 32,98 4 14, 89 69, 41 138,23 74, 18 + 61, 81 8 49, 12 243,43 141,66 144,74 + 97, 19 10 119,51 274,99 109,89 168,13 + 92,67 12 72, 75 152,81 112,87 112,81 + 40,03 24/33 24 10,05 321,23 159,12 163,47 + 155,63 48 45,60 622,42 164,49 277,50 + 304,56 96 400,67 352,65 123,58 292,30 + 148,08 168 10,87 286,38 4,17 100,47 + 161,03 240 2, 74 323,83 10,48 112,35 + 183,19 312 20,65 238,65 1,54 86, 94 + 131,72 (2) Farmacocinética de YPEG-IFN-a2b e rhIFN-a2b em Macacos Cinomolgos
Uma única injecção subcutânea de 10, 30 ou 100 yg-kg_1 de YPEG- IFN-a2b foi administrada aos macacos cinomolgos. Para o grupo de administração, 1 ml de sangue venoso foi recolhido da perna posterior oposta ao local injectado na vez anterior, lh, 2h, 4h, 8h, 1 Oh, 12h, 24h, 48h, 72h, 96h, 168h, 240h e 312h depois da administração. Para o grupo com uma única injecção subcutânea de IFN-a2b (30 pgdcg-1), 1 ml de sangue foi recolhido na vez anterior, 0,5h, lh, 2h, 3h, 4h, 5h, 6h, 8h e 24h depois da administração. Depois de mantidas a 4 °C durante 30 minutos, as amostras de sangue foram centrifugadas em 2000 rpm durante 10 min. sob baixa temperatura, depois o soro foi separado imediatamente e armazenado a -20 °C para análise posterior.
Foi usado o imunoensaio "em sanduíche dupla" quantitativo. Um anticorpo monoclonal específico ao IFN-a2b humano recombinante foi pré-revestido na placa de microtitulação. O padrão e as amostras foram pipetados em poços de microtitulação, em que o IFN-a2b ou YPEG-IFN-a2b SP2 se iriam unir ao anticorpo imobilizado. A placa foi lavada para eliminar substâncias livres, e de seguida o IFN-α IgG anti-humano (anticorpo secundário) foi adicionado nos poços. Depois de a reacção estar concluída, a placa foi lavada e a peroxidase de rábano (HRP) foi adicionada nos poços. Depois de lavar as enzimas e reagentes livres, a cor gerada ao adicionar a solução de substrato HRP em cada poço foi proporcional à quantidade de IFN-a2b ou YPEG-rhIFN-a2b SP2 unidos na primeira fase. A reacção foi parada e a 25/33 intensidade de cor foi medida. Quanto maior o valor OD de absorvência, maior é a concentração de IFN-cx2b ou YPEG-IFN-cx2b SP2 na amostra. As curvas padrão foram traçadas para IFN-a2b e YPEG-IFN-a2b SP2, respectivamente, para medir a concentração do medicamento no soro nas amostras de sangue.
De acordo com o protocolo na descrição do kit (American Biomedical Co., número de lote 3271), 100 μΐ padrão ou amostra de sangue foram adicionados a cada poço, e misturados suavemente com misturador de placa. De acordo com a concentração antecipada de uma amostra desconhecida, a amostra foi diluída com a solução de diluição para os intervalos de concentração da curva padrão. A curva padrão do IFN-a2b ou YPEG-IFN-cx2b SP2 para cada placa foi traçada para calcular a concentração da amostra desconhecida nessa placa. A placa foi incubada à temperatura ambiente durante lh, e lavada uma vez com solução de lavagem de placa. 100 μΐ de anticorpo secundário foram adicionados a cada poço, e mantidos à temperatura ambiente durante lh. A placa foi lavada 3 vezes, e 100 μΐ de conjugado HRP foram adicionados a cada poço. A placa foi incubada à temperatura ambiente durante lh e lavada 4 vezes. 100 μΐ de substrato TMB foram adicionados a cada poço, e mantidos à temperatura ambiente no escuro, durante 15 min. 100 μΐ de solução de paragem foram adicionados a cada poço, e misturados suavemente para parar a reacção. O valor OD da absorvência a 450 nm foi medido com um leitor de microplaca no espaço de 5 min. para determinar a concentração de cada amostra.
Após uma única injecção subcutânea de dose baixa, dose média, ou dose elevada (10, 30 e 100 pg-kg-1, respectivamente) de YPEG-IFN-a2b no macaco cinomolgo, as semi-vidas foram de 48,87±11,67, 51,94±3,52 e 49,60±2,97h, respectivamente. Após uma única injecção subcutânea de 30 yg-kg'1 de IFN-a2b em macacos cinomolgos, a semi-vida foi 3,22±0,10h. A semi-vida de IFN-a2b foi prolongada, pelo menos dez vezes após a modificação YPEG. 26/33 (6) A actividade biológica in vitro de cada isómero de modificação YPEG-IFN-cx2b foi estimada usando o ensaio de inibição de efeito citopático.
De acordo com o método descrito no método de determinação de actividade de interferão (Pharmacopoeia of the People's Republic of China, 2005, Volume 3, Appendix X C), o interferão protege as células amnióticas humanas (WISH) das células do dano provocado pelo virus da estomatite vesicular (VSV). Foi usado violeta cristal para marcas células WISH sobreviventes, e o valor OD de absorvência foi medido em 570 nm. A curva de efeito de protecção de interferão foi traçada para células WISH, para determinar a actividade biológica in vitro de interferões. Os resultados da actividade biológica in vitro de cada amostra são mostrados na
Tabela 2, e foram efectuados 3 testes paralelos para cada amostra. Depois da modificação YPEG, em todos os isómeros de modificação dos produtos modificados por PEG com um único residuo aminoácido, a amostra SP2 mostrou a mais elevada actividade especifica in vitro, que foi 1-2 vezes superior a SP1, SP3 e PEGASYS (fabricado por Hoffmann-La Roche, Basel, Suíça; embalado separadamente por Shanghai Roche Pharmaceuticals Ltd., lote de produto número B1016, lote de embalagem número SH0020), e foi também 1-2 vezes superior à amostra não resolvida.
Tabela 2. Resultados da actividade biológica in vitro para cada isómero de modificação YPEG-IFN-a2b (3 testes paralelos)
Amostra Tipo de PEG PEG M. W. (KD) N° de posições de modificaç ão Actividade específica média (xlO6 IU/mg) YPEG-IFN-0(2b SP1 Ramificado em Y 40 1 1,07±0,172 27/33
YPEG-IFN-a2b SP2 Ramificado em Y 40 1 2,65±0,185 YPEG-IFN-a2b SP3 Ramificado em Y 40 1 1,13±0,215 YPEG-IFN-a2b amostra não resolvida Ramificado em Y 40 1 1,68+0,217 PEGASYS Ramificado em U 40 1 0,934±0,042 Nota: a amostra nao resolvida refere-se à amostra antes de resolver YPEG-rhIFN-a2b por SP-Sepharose FF (7) A resolução da posição de modificação em YPEG-IFN-a2b SP2 0 sistema de solvente YPEG-IFN-a2b SP2 foi mudado para 50 mM NH4HCO3 (pH 8,0) por ultraf iltração com um ultra-filtro 5K (material polietersulfona, Millipore) , e a concentração proteica foi determinada ser 3,82 mg/ml usando espectroscopia UV. A TPCK tripsina (Promega) foi dissolvida (0,5 yg/μΐ) na solução proporcionada pelo fabricante. As amostras foram adicionadas de acordo com a Tabela 3:
Tabela 3. Composição da Reacçao da digestão de tripsina de YPEG-IFN-a2b SP2
Composição da reacçao Volume 50mM NH4HCO3, pH 8,0 7,0 8 ml PEG-IFN-a2b SP2 (3,82 mg/ml) 1,32 ml Tripsina (0,5 yg/μΐ) 0,2 ml Volume de reacção total 8,6 ml O sistema de reacção foi mantida em banho-maria a 37 °C durante 48h, depois 1,52 ml de 20% de ácido acético foram adicionados para parar a reacção. Uma quantidade pequena de amostra foi retirada para mapeamento de péptidos HPLC-RP C18. O instrumento para análise foi o sistema HPLC Waters, com um controlador do 28/33 tipo 600, detector de comprimento de onda duplo 2487, e o software para processamento de dados foi o Empower 2. A coluna analítica HPLC foi Júpiter C 18 (diâmetro de partícula 5 ym, diâmetro de poro 300Á, φ4.6 x 150 min., produzido por Phenomenex, USA). A fase móvel A foi 0,1% TFNH20, a fase móvel B foi 0,1 % TFA/90% ACN/H20, a taxa de fluxo foi 1 ml/minuto, e o comprimento de onda de detecção foi definido em 214 nm. Consulte a Tabela 4 para os gradientes de eluição, e os resultados foram mostrados na FIG.8-10.
Tabela 4. Os gradientes de eluiçao para mapeamento de péptidos HPLC-RP C18 YPEG-IFN-a2b SP2 digerido por tripsina
Tempo(minutos) A% B% ACN% 1 0 100 0 0 2 8 100 0 0 3 68 40 60 54 4 72 40 60 54 5 75 100 0 0 6 80 100 0 0
Com base no resultado de detecção, pode ser determinado que a amostra foi quase completamente digerida. Os produtos foram tratados com redução de DTT depois de a reacção ter sido parada. A coluna Sephacryl S-100HR (φ18 x 255 mm, 1CV=64 ml; GE Healthcare) foi pré-equilibrada com 3CV de 20 mM de PBNa-400 mM de NaCl (pH 7,0), e 3% de CV da amostra YPEG-IFN-a2b SP2 por TPCK digerido por tripsina totalmente foi carregado por pressão hidrostática. 20 mM de PBNa-400 mM de NaCl (pH 7,0) foram usados para eluição, e o comprimento de onda de detecção foi definido em 280 nm. A amostra do primeiro pico de eluição foi recolhida (número de amostra: YPEG-IFN-cx2b S100-1; FIG.ll), e o sistema de solvente foi mudado para 5 mM de PBNa (pH 7,0) com ultra-filtro 5K. Foi efectuada a liofilização a vácuo. Os aminoácidos N-29/33 terminais da amostra liofilizada foram determinados ao usar a degradação Edman, e a sequência dos 7 aminoácidos no N-terminal da amostra foi XYSPXAW (Tabela 5), caracterizado por X denotar um α-aminoácido cisteina (Cys), um não α-aminoácido ou outro aminoácido modificado que não pode ser detectado usando a degradação Edman. De acordo com a sequência mostrada na SEQ ID N° . : 1, pode ser determinado que o YPEG-IFN-cx2b SP2 foi principalmente os produtos modificados com YPEG em Lysl34.
Tabela 5. Resultado da sequenciaçao para os aminoácidos N-terminal de YPEG-IFN-a2b S100-1
Amostra Sequência N-terminal detectada A posição de modificação de PEG correspondente. YPEG-IFN-a2b S100-1 XYSPXAW Lysl34 Nota: X denota α-aminoácido cisteina, um não α-aminoácido ou outro aminoácido modificado que não pode ser detectado usando a degradação Edman
Listagem das sequências <110> BIOSTEED GENE EXPRESSION TECH. CO., LTD.
<120> INTERFERÃO ALFA 2B MODIFICADO COM POLIETILENOGLICOL E MÉTODO DE PREPARAÇÃO E APLICAÇÕES DO MESMO
<130> P2007474C <160> 1 <170> Patentln versão 3.3 <210> 1 <211> 165 30/33
<212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1
Cys Asp Leu Pro Gin Thr His Ser Leu Gly ser Arg Arg Thr Leu Met 1 5 10 15 Leu Leu Ala Gin Met Arg Arg ile ser Leu Phe Ser cys Leu Lys ASP 20 25 30 Arg His Asp Phe Giy Phe Pro Gin Glu Glu Phe Gly Asn Gin Phe Gin 35 40 45 Lys Ala Glu Thr ile pro val Leu HiS Glu Met ile Gin Gin ile Phe 50 55 60 Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr Leu 65 70 75 80 Leu Asp Lys Phe Tyr 85 Thr Glu Leu Tyr Gin 90 Gin Leu Asn Asp Leu 95 Glu Ala Cys Val Ile Gin Gly val Gly Val Thr Glu Thr Pro Leu Met Lys 100 105 110 Glu Asp Ser ile Leu Ala val Arg Lys Tyr Phe Gin Açg Ile Thr Leu 115 120 125 Tyr Leu Lys Glu Lys Lys Tyr Ser Pro cys Ala Trp Glu Val val Arg 130 135 140 Ala 145 Glu Ile Met Arg Ser 150 Phe Ser Leu Ser Thr 155 Asn Leu Gin Glu Ser 160 Leu Arg ser Lys Glu 165
Lisboa, 4 de Junho de 2012 31/33
REFERENCIAS CITADAS NA DESCRIÇÃO
Esta lista de referências citadas pelo Titular tem como único objectivo ajudar o leitor e não forma parte do documento de patente europeia. Ainda que na sua elaboração se tenha tido o máximo cuidado, não se podem excluir erros ou omissões e o EPO não assume qualquer responsabilidade a este respeito.
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Claims (10)

  1. REIVINDICAÇÕES 1. Um interferão-a2b (IFN-a2b) peguilado da estrutura como em baixo, obtido ao ligar o IFN-a2b a um polietilenoglicol ramificado em forma de Y (YPEG):
  2. 2. O IFN-cx2b peguilado da reivindicação 1, com a estrutura como em baixo: O
    N—IFN-a2b .11. o ROCH2CH2(OÇH2CH2 )m-0-CH2CH2 R'0CH2 CH2(OCH2 CH2 )m'-0 — CH2—C* 1/4 Em que R e R' são independentemente um grupo alquil C1-C4, preferencialmente metilo; j é um número inteiro entre 1-12; m e m' indicam o grau de polimerização e podem ser qualquer número inteiro; m+m' são preferencialmente entre 600 a 1500, e o peso molecular total médio do YPEG é preferencialmente cerca de 10000 a cerca de 60000 Dalton, mais preferivelmente cerca de 40000 Dalton.
  3. 3. 0 IFN-a2b peguilado da reivindicação 1 ou reivindicação 2, em que o IFN-a2b é extraído de uma fonte natural ou obtido através de biotecnologia recombinante, preferencialmente é IFN-cx2b humano com a sequência de aminoácidos como mostrada na SEQ ID N°.l, mais preferivelmente é um IFN-cx2b humano recombinante.
  4. 4. 0 IFN-a2b peguilado da reivindicação 3, em que o IFN-o(2b humano recombinante é artificialmente sintetizado ou expresso de um sistema de expressão seleccionado do grupo composto por um sistema de expressão procariótica, tal como E. coli, um sistema de expressão eucariótica com base em levedura, tal como Pichia, um sistema de expressão de célula de insectos ou um sistema de expressão de células de mamíferos, tal como CHO.
    —*2 Em que, Pa e Pb é o mesmo ou diferente polietilenoglicol (PEG); j é um número inteiro entre 1-12; Ri é H, grupo alquilo C1-C12 substituído ou não substituído, arilo substituído, aralquil, ou heteroalquileno; e Xi e X2 são independentemente um grupo de ligação, em que Xi é (CH2) n, e X2 é seleccionado do grupo composto por (CH2)n, (CH2)n OCO, (CH2) n NHCO, e (CH2) n CO, em que n é um número inteiro entre 1-10, em que o YPEG é ligado a IFN-a2b através de uma ligação amido formada pela cadeia lateral do grupo ε-amino do resíduo Lys no IFN-a2b correspondente à posição 134 na SEQ ID N°.l.
  5. 5. O IFN-cx2b peguilado de qualquer uma das reivindicações 1-4, em que o YPEG é um YPEG de braço igual, com um peso molecular de 40000 Dalton.
  6. 6. Uma composição que compreende uma quantidade farmaceuticamente eficaz do IFN-a2b peguilado de qualquer uma 2/4 das reivindicações 1-5 e um suporte farmaceuticamente aceitável ou excipiente.
  7. 7. A composição de acordo com a reivindicação 6, que compreende ainda manitol, um aminoácido, cloreto de sódio e acetato sódico, em que o aminoácido é preferencialmente seleccionado do grupo composto por ácido aspártico, asparagina e glicina.
  8. 8. Uso do IFN-a2b peguilado de qualquer uma das reivindicações 1-5 ou a composição de acordo com a reivindicação 6 ou 7, na preparação de um medicamento para tratar uma doença com necessidade de tratamento com IFN-a2b, em que a doença é preferencialmente seleccionada do grupo composto por infecções virais, por ex., hepatite B, hepatite C, hepatite D, e condilomas acuminados, tumores, por ex., tricoleucemia, leucemia crónica mielóide, leucemia não-Hodgkin de baixo grau de malignidade, linfólise mediado por células, sarcoma de Kaposi, mieloma múltiplo, melanoma maligno, linfomas cutâneos de células T, papiloma laríngeo, carcinoma de células renais recorrente ou metastático, doenças inflamatórias e doenças por ex., esclerose múltipla, artrite, asma, fibrose cística e doença pulmonar intersticial, e trombocitemia relacionada com doenças mieloproliferativas.
  9. 9. Um método para preparar e purificar o IFN-cx2b peguilado de qualquer uma das reivindicações 1-5, que inclui as etapas: (a) sob uma condição alcalina, preferencialmente em pH 9,0, que permite um PEG ramificado em forma de Y da fórmula seguinte para reagir com IFN-cx2b, e obtenção de IFN-a2b peguilado; 3/4 ο.
    II O o ROCH2CH2(OCH2CH2)m-o-CH2CH2. R'OGH2 CH2 (OCH2 CH2 )m'-0 — CH2—/ Em que R e R/ são independentemente um grupo alquil C1-C4, preferencialmente metilo; j é um número inteiro entre 1-12; m e m' indicam o grau de polimerização e podem ser qualquer número inteiro, e m+m' são preferencialmente entre 600 a 15 0 0; (b) capturando os produtos de reacção obtidos na fase (A) com uma resina de troca aniónica, preferencialmente Q Sepharose FF, e eluição dos produtos num gradiente de aniões, preferencialmente num gradiente de iões cloreto, para obter produtos modificados; (c) eluição dos produtos de reacção capturados na fase (B) com uma resina de troca catiónica, preferencialmente SP Sepharose FF, num gradiente de catiões, preferencialmente num gradiente de iões sódio e depois recolhendo cada pico separadamente; (d) determinar a actividade do produto de cada pico, e seleccionando o pico correspondente ao produto de reacção com actividade mais elevada.
  10. 10. O método de acordo com a reivindicação 9, em que o YPEG tem um peso molecular de 40KG, e preferencialmente é um YPEG de braço igual, e mais preferencialmente o rácio molar da reacção do IFN-a2b e YPEG é 1:2. Lisboa, 4 de Junho de 2012 4/4
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