BRPI0801514A2 - método e aparato para detecção de nanopartìculas magnéticas - Google Patents

Abstract

MéTODO E APARATO PARA DETECçãO DE NANOPARTiCULAS MAGNéTICAS A presente invenção trata de um método e aparato para detecção de nanopartículas magnéticas em solução. Em especial, o método da presente invenção é capaz de medir o fluxo magnético causado pelo campo magnético remanente gerado durante o resfriamento das nanopartículas após processo de magnetização. A presente invenção se situa principalmente no campo da física e da medicina.

Description

Relatório Descritivo de Patente de Invenção

Método ε Aparato para Detecção de Nanopartículas Magnéticas

Campo da Invenção

A presente invenção trata de um método e aparato para detecção denanopartículas magnéticas em solução. Em especial, o método da presenteinvenção permite a medição do fluxo magnético causado pelo campomagnético remanente gerado durante o resfriamento das nanopartículas apósprocesso de magnetização, assim como um aparato para realização de talmedição. A presente invenção se situa principalmente no campo da física e damedicina.

Antecedentes da Invenção

Nanopartículas Magnéticas

Nanopartículas magnéticas são importantes ferramentas para odiagnóstico em biologia e medicina. Seus tamanhos podem ser controladosvariando de dezenas até centenas de nanômetros, tornando-as menores oucomparáveis às dimensões de células (5-100 μηι), bactérias (200 nm - 6 μΓη),vírus (20 - 500 nm) e proteínas (5 - 50 nm). Por terem seu tamanho reduzido,elas chegam muito perto e podem interagir com estas estruturas. Asnanopartículas possuem um núcleo de material magnético, na maioria dasvezes, coberto por sílica, um polímero, ou algum tipo de açúcar, como odextran. Esta cobertura é funcionalizada através da adição de moléculasbiológicas, permitindo que a nanopartícula se ligue aos vírus, bactérias oucélulas de interesse. Desta forma eles poderão ser acessados, marcadosmagneticamente, contados e imobilizados, por exemplo.

Nanopartículas magnéticas podem ser utilizadas in vivo e in vitro. Acapacidade das nanopartículas de transporte e manipulação à distância, devidoao seu núcleo magnético, permite várias aplicações in vivo. Elas podemtransportar drogas como quimioterápicos, diretamente para a região específicade um tumor no corpo humano, diminuindo os efeitos colaterais domedicamento. As nanopartículas podem também ser aquecidas através decampos magnéticos variantes no tempo, tornando-se um agente efetivo emtratamentos baseados em hipertermia, eficazes no combate às célulasmalignas, sem falar no seu uso como agente de contraste para medidas deressonância magnética.

Cobertas com anticorpos apropriados, elas também podem ser utilizadaspara procedimentos in-vitro como imunoensaios, onde funcionam comobiosensores para marcar vírus, moléculas específicas ou bactérias com oobjetivo de detectá-las e quantificá-las. O procedimento consiste em introduzirnanopartículas cobertas com os anticorpos da célula ou vírus que se desejadetectar em uma amostra. Se estes estiverem presentes na amostra, eles seligarão por afinidade às nanopartículas através da ligação antígeno-anticorpo.

As partículas tradicionalmente usadas em imunoensaios contêm uma camadaextra com enzimas, materiais fluorescentes ou radioisótopos. A detecção étradicionalmente realizada através das propriedades desta última camada, porexemplo, medindo a fluorescência da amostra.

Recentemente, com o objetivo de aumentar sua sensibilidade,imunoensaios magnéticos têm sido propostos, onde a detecção e quantificaçãosão feitas através do campo magnético, gerado ou induzido no núcleo dananopartícula magnética ligada à célula de interesse. Para isto ummagnetômetro sensível é utilizado.

A utilização de magnetômetros como os baseados nos dispositivossupercondutores de interferência quântica (SQUIDs), nos sensores baseadosna magnetoresistência gigante (GMR) e na magnetoimpedância gigante (GMI),para detecção e quantificação das nanopartículas, abre novas perspectivaspara a realização deste tipo de imunoensaio. Sua aplicação permitirá adeterminação de um número reduzido de células procuradas quandocomparado às técnicas tradicionais. O diagnóstico precoce de várias patologiasserá possível.

Na maioria dos casos, o núcleo das nanopartículas é constituído demagnetita (Fe3O4) o que implicará, dependendo do tamanho do núcleo, que asnanopartículas apresentem propriedades ferromagnéticas ousuperparamagnéticas. Isto afetará sua forma de excitação e detecção, quepoderá ser: (i) através do campo remanente adquirido após magnetizaçãoprévia; (ii) através da aplicação de um campo e da medida simultânea dasusceptibilidade magnética a este campo e (iii) da medida do tempo derelaxação da magnetização após a aplicação de um pulso de campomagnético. Dos três, o melhor sistema de excitação seria o primeiro já queevita contribuições paramagnéticas ou diamagnéticas do recipiente onde asolução de partículas está contida e evita a aplicação de um campo externo napresença de um magnetômetro sensível.

A presente invenção trata de um método e aparato para detecção denanopartículas magnéticas em solução. Em especial, o método da presenteinvenção é capaz de medir o fluxo magnético causado pelo campo magnéticoremanente gerado durante o resfriamento das nanopartículas após processo demagnetização.

No âmbito patentário, alguns documentos descrevem métodos dedetecção de nanopartículas magnéticas.

O documento WO 05/47864 descreve nanopartículas magnéticas,métodos de detecção dessas nanopartículas e também a detecção demoléculas biológicas. Esse método consiste em ter uma moléculacovalentemente ligada à pelo menos uma nanopartícula magnetizável e umasegunda molécula ligada à um substrato, no qual a primeira molécula irá seligar, sendo assim selecionada. O método necessita de canais microfluídicospara sua realização e magnetiza as partículas durante a realização dasmedidas. A presente invenção difere desse documento por não necessitar decanais microfluídicos para a detecção e por utilizar um processo demagnetização da nanopartícula distinto, realizado durante uma variação datemperatura desde a temperatura ambiente até a temperatura do hélio líquido.

Além disso, na presente invenção o campo de magnetização é desligadodurante a realização da medida.O documento US 2006/0292555 descreve nanopartículas magnéticaspara a detecção de patógenos. Essas nanopartículas são submetidas à umcampo magnético a fim de agregar nanopartículas e patógenos e a detecção érealizada através de microscopia óptica ou eletrônica. A presente invençãodifere desse documento por não se destinar a agregação de complexospatógeno-nanopartícula e por utilizar detecção magnética que relaciona o fluxomagnético medido com o número de marcadores magnéticos da amostra.

O documento WO 07/027843 descreve um dispositivo de NMR paradetecção de nanopartículas magnéticas. Esse dispositivo compreende umsuporte contendo uma amostra líquida com as partículas magnéticas e analitosonde as partículas magnéticas se ligam. Logo após, a amostra é exposta à umcampo magnético. A presente invenção difere desse documento pelodispositivo de medição ser um sensor de fluxo magnético e, não, um NMR.

O documento WO 07/089564 descreve um imunoensaio magnético paradeterminar a concentração de analitos. Esse ensaio consiste no contato deuma amostra do analito com uma partícula magnética Iuminescente e nocalculo da quantidade do analito através de sua marcação luminescente. Apresente invenção difere desse documento por não necessitar denanopartículas magnéticas Iuminescentes para a detecção.

O documento US 6,825,655 descreve um método para detectarmudanças na resposta magnética de partículas em uma camada externa de umfluido através da medição da rotação da partícula utilizando o relaxamentoBrowniano e, consequentemente, a modificação do volume hidrodinâmico. Apresente invenção difere desse documento por não utilizar o relaxamentoBrowniano para detecção da mesma em uma solução, mas sim, a relação entreo fluxo magnético remanente com o número de marcadores magnéticos daamostra na temperatura de hélio líquido.

O documento US 6,770,489 descreve um método para detectar analitosutilizando nanopartículas magnéticas e um dispositivo SQUID através daaplicação de um campo de magnetização perpendicular à direção do fluxodetectado pelo SQUID estando o analito e as partículas à temperaturaambiente. A presente invenção difere desse documento por magnetizar osanalitos enquanto a temperatura nas partículas ligadas é diminuída, por fazer adetecção a uma temperatura de hélio líquido e por não aplicar o campo demagnetização enquanto a medição é realizada.

O documento US 6,123,902 descreve um dispositivo magnético paradetecção de analitos de alta sensibilidade. Esse aparato compreende aprodução de um campo magnético no local em que se encontra a amostra emeios para reduzir a força do campo magnético na amostra por um fator depelo menos 10 durante o tempo de medição. A presente invenção difere dessedocumento por compreender um resfriamento da amostra durante amagnetização das mesmas, sendo que a medição do fluxo somente ocorreapós esse resfriamento, o que não é citado pelo referido documento.

Portanto, não foi encontrado nenhum documento antecipando e/ousugerindo os objetos da presente invenção.

Sumário da Invenção

É um dos objetos da presente invenção um método para detecção denanopartículas magnéticas. Em uma concretização preferencial, o método dainvenção compreende:

a) magnetizar as nanopartículas enquanto são resfriadas;

b) medir o fluxo magnético remanente após o resfriamento de a) pormeio de um sensor magnético.

Em uma realização preferencial, o resfriamento das nanopartículas de a)ocorre preferencialmente entre a temperatura ambiente e -270° C.

Em uma realização preferencial, a medição do fluxomagnéticoremanente de b) é realizada utilizando sensores magnéticos que compreendemimersão em hélio líquido.

Em uma realização preferencial, o sistema permite a medição deamostras de 1 μΙ a 20 μΙ.

E um objeto adicional da presente invenção um aparatocompreendendo:a) meios para magnetização de nanopartículas magnéticasdesmagnetizadas;

b) meios para resfriamento das nanopartículas magnéticas; e

c) meios para medição do fluxo magnético remanente após oresfriamento.

Esses e outros objetos da invenção serão valorizados e melhorcompreendidos a partir da descrição detalhada da invenção.

Breve Descrição das Figuras

A figura 1 mostra um microtubo contendo partículas sendo inseridasdentro de um dos furos do SQUID.

A figura 2 exemplifica a técnica da presente invenção através darepresentação dos sinais magnéticos gerados pela mesma quantidade departículas (Nanomag-D-spio fabricada pela Micromod). Utilizando a medida docampo remanente após o resfriamento das nanopartículas previamentemagnetizadas (curva em formato de sino — resfriada com campo) e sem autilização da mesma (linha reta - resfriada sem campo). Um aumento de 100vezes na sensibilidade é alcançado utilizando a metodologia da presenteinvenção.

A figura 3 exemplifica a bobina de magnetização utilizada paramagnetizar as partículas enquanto elas são resfriadas e finalmentemergulhadas no hélio líquido.

Descrição Detalhada da Invenção

Os exemplos aqui mostrados têm o intuito somente de exemplificar umadas inúmeras maneiras de se realizar a invenção, contudo sem limitar, oescopo da mesma.

Método Para Detecção de Nanopartículas

O método para detecção de nanopartículas magnéticas da presenteinvenção compreende as etapas de:a) magnetizar as nanopartículas desmagnetizadas enquanto sãoresfriadas;

b) medir o fluxo magnético remanente após o resfriamento de a) pormeio de um sensor magnético;

Em uma realização preferencial, as nanopartículas de a) sãomagnetizadas, preferencialmente à 10 mT de campo magnético através deuma bobina de 770 voltas, e o campo magnético é desligado logo após oresfriamento das nanopartículas.

O método da presente invenção pode ser utilizado para detectarnanopartículas ligadas a vírus, bactérias, moléculas e/ou células de interesse,permitindo assim uma medida indireta de tal objeto ligado.

Nanopartículas magnéticas

A presente invenção utiliza nanopartículas disponíveis comercialmenteque apresentam características superparamagnéticas, o que implica naausência de remanência à temperatura ambiente, prejudicando sua detecçãomagnética através do campo remanente nessa temperatura. Em umarealização preferencial, a presente invenção utiliza nanopartículas magnéticascomerciais, comumente utilizadas em imunoensaios. Em uma realizaçãopreferencial, a presente invenção utiliza nanopartículas magnéticas cobertascom sílica e/ou dextran.

Sensores magnéticos contendo imersão em hélio Iiguirin

A presente invenção utiliza sensores magnéticos contendo dispositivoscontendo imersão em hélio líquido. Em uma realização preferencial é utilizadoum dispositivo supercondutor de interferência quântica (SQUID) maciço. Apresente invenção utilizou um SQUID simétrico de dois furos feito de nióbiocom design tradicional Zimmerman (2,4 mm de diâmetro de furo, profundidadede 10 mm e com junção Josephson do tipo ponto de contacto). Ainda, o SQUIDutiliza uma bobina de calibração com momento magnético detectável mínimode 6,6x10"16 Am2.

Aparato de Detecção de NanopartículasO aparato de detecção de nanopartículas da presente invençãocompreende:

a) meios para magnetização de nanopartículas magnéticasdesmagnetizadas;

b) meios para resfriamento das nanopartículas magnéticas; e

c) meios para medição do fluxo magnético remanente após oresfriamento.

Em especial, os meios para magnetização das nanopartículas inclui,sem contudo limitar-se a bobinas. Já os meios para resfriamento incluem, semcontudo limitar-se a hélio líquido.

Exemplo 1 - Método de detecção

Exemplo 1.1 - Calibracão do sistema

Utilizando o SHE SQUID 330X, o sistema da presente invençãoapresentou um ruído de 50μΦ0/Ηζ1/2 na faixa de 0,1 Hz- 100 Hz. Entretanto, asmedidas aqui apresentadas foram realizadas de 0,1 Hz à 10 Hz1 o que levou aum ruído de fluxo com amplitude de 20μΦ0 à 5 Hz. O O0 eqüivale a2,05 χ 10"15Tm2.

Utilizando uma bobina de calibração introduzida no SQUID, tem-se ummomento magnético detectável mínimo de 6,6 χ 10"16 Am2.

Exemplo 1.2 Preparação da Amostra

Na presente invenção, foram utilizadas partículas magnéticas recobertascom sílica e/ou dextran. Cuidados especiais devem ser tomados com partículasque tenham seu núcleo na faixa das centenas de nanômetros, a fim de evitarprecipitação e/ou agregação. Para este caso as partículas devem serinicialmente desmagnetizadas. A fim de dispersar uniformemente estaspartículas, um meio viscoso de PEG (polietileno glicol) em água miliQ (1:2 w/w)foi feito. Cerca de 10 μΙ das suspensões de partículas foram transferidas paraos microtubos a fim de realizar as medidas com o SQUID. Se o núcleo daspartículas for menor, não há necessidade dos cuidados mencionadosanteriormente.Exemplo 1.3 Medidas com SQUID

A suspensão de partículas dentro dos microtubos é magnetizada aolongo do microtubo com 10 mT de campo magnético através de uma bobinacom 770 voltas com diâmetro interno de 14,7 mm e diâmetro externo de27 mm. Este conjunto (microtubo e bobina) é resfriado até a temperatura dohélio líquido com o campo magnético ligado. Depois de imerso no banho dehélio o campo magnético é desligado e o microtubo é introduzido no furo doSQUID.

Um dos resultados demonstrou que o fluxo dentro do SQUID para amesma massa de nanopartículas tem um aumento de 100 vezes em relação aofluxo que seria detectado utilizando um processo de magnetização semresfriamento.

O técnico no assunto saberá avaliar que a presente invenção pode serrealizada de diferentes maneiras à luz das informações aqui descritas.

Claims (16)

Método E Aparato para Detecção de Nanopartículas Magnéticas

1. Método para detecção de nanopartículas magnéticas caracterizadopor compreender as etapas de:a) magnetizar as nanopartículas enquanto são resfriadas;b) medir o fluxo magnético remanente após o resfriamento de a) pormeio de um sensor magnético.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado peloresfriamento das nanopartículas magnetizadas de a) ocorrerempreferencialmente em uma faixa de temperatura que vai de 25°C a -270° C.

3. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelasnanopartículas magnéticas de a) estarem ligadas a vírus, bactérias, células,proteínas, macromoléculas e mistura dos mesmos.

4. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelasnanopartículas de a) serem previamente magnetizadas através de uma bobina.

5. Método, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelamagnetização prévia das nanopartículas ocorrer preferencialmente à 10 mT decampo magnético através de uma bobina de 770 voltas.

6. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo campomagnético ser desligado logo após o resfriamento das nanopartículas.

7. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pela mediçãodo fluxo magnético remanente de b) ser realizada utilizando sensoresmagnéticos que compreendem imersão em hélio líquido.

8. Método, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo sensormagnético ser preferencialmente o dispositivo supercondutor de interferênciaquântica maciço (SQUID).

9. Método, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo SQUIDutilizar uma bobina de calibração com momento magnético detectável mínimode 6,6 XlO-16Am2.

10. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelasnanopartículas estarem cobertas com sílica e/ou dextran.

11. Aparato para detecção de nanopartículas magnéticas caracterizadopor compreender:a) meios para magnetização de nanopartículas magnéticasdesmagnetizadas;b) meios para resfriamento das nanopartículas magnéticas; ec) meios para medição do fluxo magnético remanente após oresfriamento.

12. Aparato, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo meiode magnetização ser uma bobina.

13. Aparato, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelamagnetização ocorrer preferencialmente à 10 mT de campo magnético atravésde uma bobina de 770 voltas.

14. Aparato, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo meiode medição utilizar sensores magnéticos que compreendem imersão em héliolíquido.

15. Aparato, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelosensor magnético ser preferencialmente o dispositivo supercondutor deinterferência quântica maciço (SQUID).

16. Aparato, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado peloSQUID utilizar uma bobina de calibração com momento magnético detectávelmínimo de 6,6 x10"16 Am2.