BRPI0801845B1 - processo de obtenção de pha a partir de resíduo cítrico, pha obtido a partir de resíduo cítrico, composição polimérica contendo pha, artefato sólido contendo pha, artefato sólido contendo composição polimérica compreendendo pha, uso de resíduo cítrico para a obtenção de pha - Google Patents
processo de obtenção de pha a partir de resíduo cítrico, pha obtido a partir de resíduo cítrico, composição polimérica contendo pha, artefato sólido contendo pha, artefato sólido contendo composição polimérica compreendendo pha, uso de resíduo cítrico para a obtenção de pha Download PDFInfo
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Abstract
processo de obtenção de pha a partir de resíduo cítrico, pha obtido a partir de resíduo cítrico, composição polimérica contendo pha, artefato sólido contendo pha, artefato sólido contendo composição polimérica compreendendo pha, uso de resíduo cítrico para a obtenção de pha. a presente invenção refere-se a um processo de obtenção de polímeros biodegradáveis a partir de resíduo cítrico proveniente do processamento de suco de laranja. os polímeros obtidos são poliésteres classificados como polihidroxialcanoatos incluindo, entre estes, o poli(3-hidroxibutirato) e poli(3-hidroxibutirato-co-3-hidroxivalerato). o pol imero biodegradável é obtido a partir de cultivo do tipo batelada ou batelada alimentada com ou sem recirculação de células, utilizando como fonte de carbono o licor de prensagem e/ou melaço cítrico pré-tratados. os poíihidroxialcanoatos, aqui descritos, podem ser utilizados como substitutos dos polímeros sintéticos em diversas áreas incluindo a área de alimentos, farmacêutica, médica, agrícola e outras.
Description
Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "PROCESSO DE OBTENÇÃO DE PHA A PARTIR DE RESÍDUO CÍTRICO, PHA OBTIDO A PARTIR DE RESÍDUO CÍTRICO, COMPOSIÇÃO POLIMÉRICA CONTENDO PHA, ARTEFATO SÓLIDO CONTENDO PHA, ARTEFATO SÓLIDO CONTENDO COMPOSIÇÃO POLIMÉRICA COMPREENDENDO PHA, USO DE RESÍDUO CÍTRICO PARA A OBTENÇÃO DE PHA". A presente invenção refere-se a um processo de obtenção de poliésteres biodegradáveis a partir de resíduo cítrico resultante do processamento de laranjas para a obtenção de suco. Os poliésteres aqui descritos são os polihidroxialcanoatos (PHA) e podem ser utilizados como substitutos dos poliésteres sintéticos em diversas áreas incluindo a área de alimentos, farmacêutica, médica, agrícola e outras.
Descrição do Estado da Técnica Atualmente, o uso de material plástico é cada vez mais freqüen-te. Este material substitui matérias-primas convencionais como papel, pape-- lão, vidros e metais devido a seu baixo custo e grande durabilidade. Em sua fabricação, são utilizados polímeros sintéticos como polipropileno, polietile-no, policloreto de vinila, poliestireno e outros. Estes polímeros são facilmente moldados (inclusive em fibras e finos fios transparentes), possuem alta resistência química e são relativamente elásticos podendo ser utilizados na fabricação de embalagens de produtos de descarte rápido como também na produção de bens duráveis.
Apesar de sua grande aplicabilidade, os plásticos se tornaram um sério problema ambiental. O principal motivo é o seu longo tempo de degradação, em torno de 200 anos, permanecendo no meio ambiente e prejudicando o processo de decomposição da matéria orgânica, além de contribuir para o processo de assoreamento de rios e alteração do curso natural do leito fluvial. Em regiões de manguezal, prejudica o ciclo reprodutivo dos animais e crustáceos. O aumento do uso de polímeros sintéticos resultou na necessidade da criação de alternativas para minimizar os problemas ambientais gerados pelos mesmos. Dentre essas alternativas, podem-se citar a incinera- ção, reciclagem, acondicionamento apropriado e, recentemente, a substituição dos polímeros sintéticos por materiais biodegradáveis. A incineração dos plásticos geralmente é usada como forma de recuperação de energia devido ao alto poder calorífico, porém, a liberação de gás carbônico e outros componentes resultantes da queima prejudicam o meio ambiente, aumentando o nível de poluição atmosférico. A reciclagem de polímeros sintéticos é a alternativa mais utilizada porque proporciona uma redução de custos de até 70% quando comparada à produção do polímero sintético derivado do petróleo. Com relação aos materiais biodegradáveis, uma importante opção é a fabricação de polihidroxialcanoatos (PHA). Os polihidroxialcanoatos possuem propriedades termoplásticas semelhantes àquelas apresentadas pelos polímeros sintéticos, sendo passíveis de aplicação em vários tipos de produtos.
Polihidroxialcanoatos (PHA) são poliésteres de uso amplo que, por serem biodegradáveis, possuem um menor potencial poluidor. Os polihidroxialcanoatos apresentam características muito interessantes como propriedades termoplásticas e físico-químicas muito similares àquelas apresentadas pelos plásticos de origem petroquímica, principalmente em relação ao polipropileno. Os polihidroxialcanoatos apresentam vantagens de serem completamente biodegradáveis e biocompatíveis, serem produzidos a partir de matérias-primas renováveis, poderem ser reciclados e incinerados sem a geração de produtos tóxicos e, portanto, são considerados de grande aplicabilidade em relação aos plásticos petroquímicos.
Os polihidroxialcanoatos compartilham diferentes propriedades de acordo com sua composição monomérica. Eles são substâncias lipofílicas acumuladas dentro de microorganismos produtores de PHA, encontrando-se como inclusões insolúveis e sendo extraídos sob a forma de um pó inodoro. A estrutura geral dos polihidroxialcanoatos é dada pela repetição da seguinte fórmula geral, com o radical R podendo variar de um único átomo de hidrogênio até C12, podendo conter instaurações, grupos aromáticos ou ainda ligações a elementos como flúor, cloro e cromo. A composição do radical R, associado ao valor de n, determina a identidade da unidade monomérica, o tipo, o número de repetições desta unidade e as propriedades do polímero biodegradável.
De acordo com o comprimento das cadeias carbônicas e de suas unidades monoméricas, os polihidroxialcanoatos são classificados em três grupos: 1. Polihidroxialcanoatos constituídos por unidades de ácidos hidroxialcanóicos de cadeia curta (PHASsc), ou seja, aqueles que possuem cadeia carbônica constituída de 3 a 5 átomos de O; 2. Polihidroxialcanoatos constituídos por unidades de ácidos hidroxialcanóicos de cadeia média (PHAMcl). ou seja, aqueles que possuem cadeia carbônica constituída de 6 a 14 átomos de C; 3. Polihidroxialcanoatos constituídos por unidades de ácidos hidroxialcanóicos de cadeia longa (PHAlcl), ou seja, aqueles que possuem cadeia carbônica constituída de mais de 15 átomos de C.
Os polihidroxialcanoatos (PHA) mais conhecidos são, principalmente, o poli(3-hidroxibutirato) (P(3HB)) e o poli(3-hidroxibutirato-co-3-hidroxivalerato) (P(3HB-co3HV)).
Os polihidroxialcanoatos são considerados de grande interesse industrial como plásticos biodegradáveis e/ou biocompatíveis para diversas áreas de aplicação. As propriedades desejáveis às diferentes aplicações de um material plástico são: ponto de fusão elevado, baixa rigidez, alta resistência à pressão, resistência ao alongamento antes da ruptura e forte resistência ao impacto.
Devido às características que possuem, o P(3HB) e o P(3HB-co-3HV) foram inicialmente utilizados na fabricação de garrafas, filmes e fibras para embalagens biodegradáveis, bem como sacos de proteção para plantas. Estes biopolímeros também possuem aplicação na área médica, como materiais osteossintéticos e suturas cirúrgicas, reposição de vasos sangüí- neos e curativos. Outras aplicações incluem o fato de serem utilizados como veículo biodegradável para a aplicação de drogas, medicamentos, inseticidas, herbicidas ou fertilizantes e fragrâncias ou ainda como embalagens, filmes, bolsas e recipientes.
Os polihidroxialcanoatos podem ser produzidos por diversos microorganismos unicelulares na forma de grânulos intracelulares como reserva de carbono e energia. Os microorganismos capazes de produzir e acumular PHA são principalmente bactérias que podem ser encontradas na natureza, isto é, no solo, água do mar, efluentes, etc. Tais microorganismos são pertencentes a diferentes grupos taxonômicos de diferentes gêneros como: microorganismos metilotróficos, Azobacter, Alcaligenes, Pseudomonas, Bur-kholderia além de Escherichia coli recombinante.
Os microorganismos mais utilizados são: Alcaligenes latus, Pseudomonas oieovorans, Azobacter vinelandii, Cupriavidus necator, Bur-kholderia sacchari, várias cepas de metilótrofos e Escherichia coli recombinante. Os PHA também podem vir a ser produzidos por plantas transgêni-cas.
Para que o processo de extração do polímero não seja dispendioso, é necessário que a cepa seja capaz de acumular pelo menos 60% de sua massa celular em polímero. Dessa forma, são eliminadas todas as bactérias Gram-positivas e aquelas com baixa capacidade de síntese e acúmulo de polímero para a produção industrial.
Desde a descoberta de bactérias produtoras de polihidroxialca-noatos por Lemoigne em 1926, a bactéria Gram-negativa Cupriavidus necator é a representante mais bem estudada desse grupo, e a maior produtora de PHA até hoje. Antes de ser classificada com esse nome, Cupriavidus necator foi descrita anteriormente como Hydrogenomonas eutropha, Alcaligenes eutrophus, Ralstonia eutropha e Wautersia eutropha. Seu emprego difundido deve-se a grande habilidade de acumular grandes quantidades de PHA a partir de fontes simples de carbono, como ácido acético, frutose e glicose. A produção de PHA ocorre quando o microorganismo cresce em condições desbalanceadas de cultivo. Estas condições podem estar associadas à limitação de nutrientes (como N, P, O2, K e Mg) na presença em excesso da fonte de carbono ou limitações físicas, como temperatura e concentração de oxigênio dissolvido.
Em condições de crescimento balanceado, C. necator utiliza substratos como carboidratos, piruvato ou acetato, iniciando o mecanismo de regulação pela enzima acetil-CoA. Como primeiro passo, a enzima β-cetotiolase leva à condensação de duas moléculas de acetil-CoA em aceto-acetil-CoA. No segundo passo, uma acetoacetil-CoA redutase NADPH-dependente leva a conversão a R-3-hidroxibutiril-CoA, por uma reação este-reosseletiva. O terceiro e último passo é a polimerização catalisada pela PHA sintase. A biossíntese do copolímero por C. necator somente ocorre quando houver substratos precursores de unidade 3HV, que possam ser convertidos em propionil-CoA ou 3-hidroxivaleril-CoA, como ácido propiôni-co, ácido valérico ou ácido pentanóico. A partir destas características metabólicas, a produção de poii-hidroxialcanoatos ocorre em duas fases: uma primeira fase de crescimento celular em um meio de cultivo balanceado visando o aumento da biomassa e uma segunda fase, onde ocorre a limitação de um nutriente essencial não fonte de carbono, em geral nitrogênio, fósforo e oxigênio direcionando o metabolismo para a produção de PHA. Para proporcionar a produção do copolímero, deve ser realizada, durante a segunda fase do processo, a adição de um dos agentes precursores citados anteriormente.
Estratégias de produção de P(3HB) para elevar o conteúdo de biopolímero e diminuir o custo total dos bioplásticos são necessárias. A utilização de substratos de baixo custo pode representar 40% de economia no processo de produção de P(3HB). Uma alternativa interessante é a utilização de resíduos agroindustriais. Entre os substratos de baixo custo, os resíduos provenientes de plantas de processamento de alimentos como o amido, ca-na-de-açúcar e soro de leite são os de maior destaque.
No que se refere à produção industrial de PHA, diversos documentos são encontrados abrangendo a sua obtenção através da utilização de fontes de carbono renováveis na forma de resíduos agroindustriaís. Os resíduos descritos incluem bagaço de maçã, soro de leite, mistura de soro de ieite e açúcar invertido, resíduo da indústria processadora de batatas (a-mido hidrolisado) e outros. A utilização destes resíduos de baixo custo contribui para a redução do preço final destes biopolímeros. O documento P10501139-6 descreve o processo de produção de PHA a partir de óleos vegetais, glicerol, mono-, di- ou triglicerídeos residuais, provenientes da produção de biodiese! obtido a partir de óleos vegetais. O documento PI0504054-0 descreve o processo de produção de PHA de cadeia curta e, em especial do poli(3-hidroxibutirato) a partir de óleo vegetal como, por exemplo, óleo de soja. No processo descrito, a concentração de óleos vegetais não pode ser superior a 0,3 g.L'1 de ácido oléico pelo fato de causar inibição do crescimento do microorganismo. Essa limitação torna este processo bastante restrito. O documento US 2006/0088921 se refere a um método de produção de PHA a partir de lixo orgânico. O método inclui um pré-tratamento dos resíduos orgânicos com microorganismos acidogênicos, seguido de cultivo para produção de PHA por microorganismos específicos incluindo R. eutropha, P. oleovorans e outros. Embora teoricamente viável, a produção de PHA a partir desta matéria orgânica é dificultada pela diversidade e complexidade do substrato utilizado tornando o processo não viável. O documento PI0207356-0 descreve o processo de produção de polihidroxibutirato e seu copolímero poiihidroxibutirato-co-hidroxivalerato a partir de bagaço de cana-de-açúcar. Embora seja uma matéria-prima que apresenta grande oferta, o bagaço de cana-de-açúcar deve ser primeiramente hidrolisado para a obtenção de um meio de cultivo adequado para a produção e PHA. O pré-tratamento de biomassa lignocelulósica consiste em uma das etapas operacionais mais relevantes em termos de custo direto além de influenciar as etapas anteriores e subseqüentes do processo. O pré-tratamento pode gerar produtos inibidores ao microorganismo e uma grande quantidade de sólidos suspensos, tornando o processo ineficiente e/ou apre- sentando baixa produtividade. O documento intitulado "Production of poly(3-hydroxybutyrate) from inexpensive substrates" {Enzyme and Microbial Technology Vol. 27, (10), 2000, Páginas 774-777) descreve a produção de um PHA, o Poli(3-hidroxibutirato) P(3HB) a partir de amido e soro protéico de leite, ambos resíduos resultantes de processos industriais de alimentos. O amido é previamente hidrolisado em um processo de duas etapas incluindo liquefação e sacarificação. O substrato preparado é submetido a processo biotecnológico utilizando A. chroococcum e E. coli recombinante. O artigo ainda ressalta a relevância do uso das duas matérias-primas como forma de diminuir o custo de produção de P(3HB).
Embora, teoricamente seja possível produzir PHA a partir de diversos tipos de resíduos agroindustriais, alguns fatores como disponibilidade de açúcar fermentescível, presença de inibidores e tratamento do material lignocelulósico, podem tornar o processo não viável. A utilização de resíduos, como aqueles aqui descritos exige, muitas vezes, como pré-requisito, tratamento prévio da matéria-prima utilizada, incluindo a hidrólise dos açúcares de cadeia longa para possibilitar a assimilação da fonte de carbono pelos microorganismos produtores de poli-hidroxialcanoatos. Este processo de hidrólise normalmente envolve um longo tempo de preparo, utilização de enzimas ou ácido e, muitas vezes gera componentes inibidores do cultivo, causando custos adicionais ao processo de produção de PHA em questão. A invenção aqui descrita contorna os problemas anteriormente citados através da utilização de um processo de obtenção de PHA a partir de resíduos do processamento de suco de laranja, compreendendo um pré-tratamento simplificado da matéria-prima e isento de hidrólise. A invenção torna viável a utilização de um resíduo agroindustrial até então pouco aproveitado aumentando seu valor agregado e, consequentemente, tornando o processo rentável além de ecológico.
Breve Descrição da Invenção: A presente invenção refere-se a um processo de obtenção de polihidroxialcanoatos (PHA) a partir de resíduo cítrico resultante do processamento de laranjas para a obtenção de suco. O processo em questão compreende as seguintes etapas: a) obtenção de licor de prensagem e/ou melaço cítrico; b) tratamento físico-químico dos materiais obtidos na etapa a; c) preparação do meio de cultivo para produção de PHA; d) condução do cultivo. A invenção, também se refere ao uso do resíduo cítrico para a produção de PHA, de acordo com o processo descrito na invenção. A invenção se refere, ainda, a PHA ou a uma composição polimérica contendo PHA obtido a partir de processo descrito na invenção. A presente invenção refere-se também a um artefato sólido compreendendo PHA obtidos a partir do processo para a produção de PHA descrito na invenção, bem como, a um artefato sólido contendo uma mistura polimérica que compreende PHA obtido de acordo com processo para a produção de PHA descrito na invenção.
Descrição Detalhada da Invenção A presente invenção apresenta um processo simples de produção de PHA a partir de um resíduo agroindustrial abundante e de fácil manipulação. O processo em questão utiliza o resíduo do processamento de laranjas, denominado resíduo cítrico, contribuindo consideravelmente para a redução do impacto ambiental deste resíduo, bem como aumenta o valor agregado do mesmo. A extração de suco de laranja gera, como resíduo, cerca de 52% de polpa cítrica fresca, com 73% a 83% de umidade. A polpa cítrica é constituída por pele (60% - 65%), a polpa propriamente dita, o bagaço (30% - 35%) e as sementes (ao redor de 10%). Com o aumento de escala produtiva de suco de laranja e a geração de grandes volumes de resíduos, iniciaram-se os primeiros problemas de contaminação do ambiente, o que estimulou o desenvolvimento de estratégias do uso do resíduo gerado. Uma alternativa desenvolvida para a utilização parcial do resíduo líquido gerado, constituído por proteínas, óleos essenciais, pectinas, açúcares, ácidos orgânicos e sais; foi a fermentação alcoólica para a produção de etanol. Em- bora a produção de etanol tenha minimizado o impacto ambiental causado pela geração de resíduos do processo de extração, a agregação de um maior valor ao mesmo representaria um ganho de competitividade considerável dentro do contexto produtivo. A presente invenção apresenta um processo de obtenção de PHA a partir de resíduo cítrico compreendido pelas seguintes etapas: a) obtenção de licor de prensagem e/ou melaço cítrico; b) tratamento físico-químico dos materiais obtidos na etapa a; c) preparação do meio de cultivo para produção de PHA; d) condução do cultivo. O resíduo cítrico descrito na invenção corresponde à casca, polpa e sementes resultantes após prensagem das laranjas para extração do suco. O licor de prensagem e/ou melaço cítrico da presente invenção é obtido a partir do resíduo cítrico. O resíduo cítrico, após obtido, é submetido a um processo de moagem, tratamento com óxido de cálcio (CaO) e prensagem obtendo-se, como resultado, o licor de prensagem. Outros agentes, além do CaO, que possuem a propriedade de hidrolisar a pectina para a liberação de água e facilitar o processo de prensagem também podem ser utilizados. O licor de prensagem obtido pode, ainda, passar por um processo de concentração seguido de resfriamento obtendo-se, então, o melaço cítrico. Preferencialmente, a concentração do licor de prensagem ocorre a-través de evaporação. As etapas de obtenção de resíduo cítrico, licor de prensagem e melaço cítrico como anteriormente descritas, podem ser visualizadas na Figura 1. O licor de prensagem e/ou melaço cítrico obtidos na etapa a do processo de obtenção de PHA são utilizados como meio de cultivo de microorganismos no processo de produção de PHA da presente invenção. Para a utilização do licor de prensagem e/ou melaço cítrico como meio de cultivo é necessário, inicialmente, que estas matérias-primas sejam submetidas a tratamento físico-químico prévio. O tratamento físico-químico pelo qual o licor de prensagem e/ou melaço cítrico é submetido compreende a centrifugação do mesmo seguida de uma etapa de esterilização ou pasteurização do material. Após a esterilização ou pasteurização, o material livre de microorganismos passa por um processo de decantação seguido de retirada do material sobrenadante. O material sobrenadante é então utilizado para a preparação do meio de cultivo. Opcionalmente, licor de prensagem e/ou melaço cítrico pode sofrer correção do pH anterior à centrifugação. Preferencialmente, o pH 7,0 é escolhido para correção. Em uma concretização preferida da invenção, a centrifugação do licor de prensagem e/ou melaço cítrico ocorre à temperatura de 5eC e a esterilização ocorre a 121eC por 15 minutos. Em outra concretização preferida da invenção, a centrifugação do licor de prensagem e/ou melaço cítrico ocorre à temperatura de 5SC e a pasteurização o-corre a 113QC por 2 minutos. Em mais uma concretização preferida da invenção a centrifugação ocorre de forma asséptica e é seguida por uma filtra-ção de forma asséptica. O material filtrado assepticamente é submetido a um processo de decantação seguido de retirada do material sobrenadante. O material sobrenadante é então utilizado para a preparação do meio de cultivo. Em outra concretização preferida da invenção, o pH inicial do licor de prensagem e/ou melaço cítrico é corrigido para 7,0 e o material resultante é centrifugado a 3500 rpm por 5min. Após a centrifugação, o sobrenadante é aquecido a 100-C e então submetido à decantação a frio com a retirada do sobrenadante. O material sobrenadante é então utilizado para a preparação do meio de cultivo. Em mais uma concretização preferida da invenção, o licor de prensagem e/ou melaço cítrico é submetido à centrifugação a 5-C e pasteurização a 113-C por 2 min. Após pasteurização, o licor de prensagem e/ou melaço cítrico é então submetido à decantação a frio e o sobrenadante é submetido novamente ao processo de pasteurização a 113SC por 2 minutos. O material resultante é então utilizado para a preparação do meio de cultivo. Em outra concretização preferida da invenção, o tratamento físico-químico do licor de prensagem e/ou melaço cítrico consiste na filtração do mesmo em membrana de micro filtração, ou ultra filtração, ou submetido à separação dos sólidos suspensos por flotação. O licor de prensagem e/ou melaço cítrico submetido a tratamento físico-químico é utilizado para a preparação do meio de cultivo do processo de produção de PHA da presente invenção. A preparação do meio de cultivo ocorre, inicialmente, através da adição, ao material sobrenadante resultante do tratamento físico-químico do licor de prensagem e/ou melaço cítrico, de nutrientes essenciais ao cultivo selecionados dentre nitrogênio, fósforo, enxofre, magnésio, potássio, oxigênio, oligonutrientes ou mistura dos mesmos. Preferencialmente, os oligonutrientes adicionados durante a preparação do meio de cultivo da invenção, são selecionados dentre molib-dênio, manganês, cobalto, zinco, níquel, cobre e boro.
Alternativamente, após a adição dos nutrientes, o meio de cultivo pode ser submetido a um processo de esterilização para garantir a asse psia/condução do cultivo. Em uma concretização preferida da invenção, o processo de esterilização do meio de cultivo com nutrientes ocorre a 121SC por 15 minutos.
As etapas de tratamento físico-químico do licor de prensagem e/ou melaço cítrico, bem como as concretizações preferidas anteriormente descritas, podem ser visualizadas na Figura 2. O meio de cultivo, utilizado no processo biotecnológico descrito na presente invenção, deve compreender um teor inicial de açúcares reduto-res de 10 a 60g.L'\ Para a condução do processo biotecnológico, podem ser utilizados microorganismos pertencentes a diferentes grupos taxonômi-cos: Azotobacter, microorganismos metilotróficos, Alcaligertes, Pseudomo-nas, Burkholderia além de Escherichia coli recombinante. Preferencialmente, os microorganismos utilizados na presente invenção são selecionados dentre Alcaligenes latus, Pseudomonas oleovorans, Azobacter vinelandii, Bacil-lus cereus, Cupriavidus necator, Burkholderia sacchari, metilótrofos e Escherichia coli recombinante. Ainda mais preferencialmente, o processo biotecnológico da presente invenção é conduzido através da utilização de Cupriavidus necator. Para que o processo biotecnológico tenha êxito, tanto na produção de microorganismos como de polímero, são necessários dois pré-inóculos antecedendo o processo em reator. O primeiro pré-inóculo, deve preferencialmente, ser realizado através da propagação do microorganismo Cupriavidus necator em meio de cultivo contendo caldo nutriente compreendendo 5 g.L'1 de peptona, 3 g.L'1 de extrato de carne. Este pré-inóculo é mantido em agitador rotatório à temperatura, rotação e tempo compatíveis com o processo. Preferencialmente, o primeiro pré-inóculo é mantido a 30-C sob agitação de 150 rpm por 24h. Após esse período, 10% do volume final a ser cultivado é transferido do primeiro pré-inóculo para o segundo pré-inóculo. O segundo pré-inóculo se caracteriza por conter sais minerais e nutrientes essenciais ao crescimento do microorganismo. Este pré-inóculo é mantido em condições específicas de temperatura, agitação e tempo compatíveis com o processo. Preferencialmente, o segundo pré-inóculo é mantido a 30eC, 150 rpm por 24h. Após esse período, um volume de pré-inóculo, suficiente para a condução do processo, é adicionado ao reator contendo o meio de cultivo preparado conforme descrito anteriormente. Preferencialmente, o volume do segundo pré-inóculo que é adicionado ao reator, corresponde a aproximadamente 10% do volume a ser cultivado. O processo biotecnológico para produção de PHA da presente invenção pode ser conduzido através de cultivo em batelada ou em batelada alimentada. O processo pode ser realizado com ou sem recirculação de células para o reator, a fim de se obter alta densidade celular. O processo da presente invenção compreende as etapas de crescimento celular seguido da etapa de indução à produção de PHA. O cultivo é conduzido à temperatura de 25eC a 40eC. Durante o cultivo, o pH pode variar entre 7,2 e 5,4 e o meio de cultivo é agitado a uma velocidade de 200 a 1000 rpm. Durante a condução do cultivo, o teor de oxigênio dissolvido pode variar entre 10% e 100% da saturação do meio de cultivo com ar atmosférico sendo que, esta condição não pode ser inferior a 10%. A etapa de indução à produção ocorre através da imposição da limitação de um nutriente (nitrogênio, fósforo, enxofre, magnésio, potássio ou oxigênio). Essa limitação ocorre durante a condução de cultivo e deve ocorrer preferencialmente após a obtenção de uma concentração de biomassa mínima entre 15 g.L1 a 60 g.L'1 (peso seco). A determinação da concentra- ção inicial do nutriente limitante no meio de cultivo deve considerar os fatores de conversão dos nutrientes em células. A recuperação do polímero (PHA) pode ser realizada por diferentes métodos compatíveis com o cultivo em questão. Esses métodos incluem a separação do material celular contendo o polímero seguido de um processo extrativo. A presente invenção refere-se, também, ao uso de resíduo cítrico para a produção de PHA utilizando o processo de obtenção de PHA descrito anteriormente. Ainda objeto da presente invenção é o próprio PHA obtido a partir de processo descrito na invenção. A invenção se refere também a uma composição polimérica compreendendo PHA obtido a partir de processo descrito na invenção. A presente invenção refere-se, ainda, a um artefato sólido, compreendendo PHA obtido a partir do processo para a produção de PHA descrito na invenção, bem como, a um artefato sólido contendo uma mistura polimérica que compreende PHA obtido de acordo com processo para a produção de PHA descrito na invenção. A seguir são descritos algumas possibilidades de concretização da invenção em questão. Os exemplos aqui descritos devem ser interpretados como possibilidades de concretização da invenção e não devem ser utilizados, entretanto, para limitar o escopo de proteção da mesma.
EXEMPLO I O primeiro pré-inóculo foi cultivado em caldo nutriente (Nutrient Broth) mantido em um agitador rotatório por 24 horas. Após este período, um volume equivalente a 10% do volume final a ser cultivado foi transferido do primeiro para o segundo pré-inóculo que é constituído de meio de sais minerais e nutrientes próprios para o crescimento celular do microrganismo empregado. Este segundo pré-inóculo foi mantido em agitador rotatório, a 30°C e 150 rpm por 54 horas. Após este período, um volume equivalente a 10% do volume final a ser cultivado foi transferido do segundo pré-inóculo para o reator de 5 litros contendo o meio composto por licor de prensagem e/ou melaço cítrico. O licor de prensagem e/ou melaço cítrico contém cerca de 60 a 80 g.L'1 de ART (açúcares redutores totais), por este motivo, deve ser dilu- ído em água destilada para obtenção de uma concentração de açúcares re-dutores entre 10-60 g.L 1 (limite de crescimento para C. ηβοβΐοή, adicionado de sais minerais e nutrientes para o crescimento. O pré-tratamento 5 (figura 2) foi empregado para redução dos sólidos suspensos presentes no licor de prensagem e/ou melaço cítrico. O cultivo for realizado com concentração inicial de açúcares redutores totais (ART) entre 10 e 40 g.L'1, temperatura entre 25 e 4CTC, pH variando de 5,4 - 7,0, agitação de 200 a 900rpm, concentração de oxigênio entre 10 a 100% da saturação com ar atmosférico, durante 28 horas de cultivo. O fator de conversão de substrato em célula (Υχ/s) obtido, foi de 0,54 g.g'1, a velocidade específica de crescimento obtida foi de 0,44 h"1. A produção de P(3HB) teve um aumento a partir da 10- (décima) hora quando a exaustão de nitrogênio ocorreu. A biomassa total foi de 17,1 g.L'1. A porcentagem de P(3HB) na célula ao final do cultivo foi de 81%, com uma produtividade média de P(3HB) de 0,49 g.L'1.h'1, em 18 horas de produção. A recuperação do polímero foi realizada com a separação das células do líquido ao término do cultivo através de centrifugação. A extração foi realizada com uma relação da massa de células e volume do solvente, por exemplo, clorofórmio ("Optimization of microbial poly(3-hydroxybutyrate) recovery using dispersions of sodium hypoclorite solution and chloroform" -Biotechnology and Bioengineering, v. 44, pp. 256-261, 1994) variando de 1:2 nas temperaturas de 20°C até 60°C com agitação magnética, agitação em agitador ou sem agitação. A porcentagem de recuperação variou de 80 a 98%.
EXEMPLO II O uso de licor de prensagem do bagaço da laranja foi testado para a produção de P(3HB) como um subproduto da indústria de suco de laranja, sem aplicação de tratamento térmico. O primeiro pré-inóculo foi cultivado em caldo nutriente, mantido em um agitador rotatório a 30 C e 150rpm por 24 horas. Após sua ativação, um volume equivalente a 10% do volume final a ser cultivado foi transferido do primeiro para o segundo pré-inóculo que é constituído de meio de sais minerais e nutrientes próprios para o crescimento celular do microorganismo empregado. Este segundo pré-inóculo foi mantido em agitador rotatório, a 30QC e 150rpm por 24 horas. Após este período, um volume equivalente a 10% do volume final a ser cultivado foi transferido do segundo pré-inóculo para o reator de 5 litros contendo licor de prensagem apresentado cerca de 10 e 60g.L'1 de açúcares redutores. Este meio, ainda, foi adicionado de sais minerais e nutrientes para o crescimento. O cultivo foi realizado durante 32 horas, a temperatura de cultivo foi mantida em 3CTC, o pH foi mantido entre 5,4 e 7,0, agitação variou de 400-900rpm, a concentração de oxigênio ficou entre 10 e 100% do valor da saturação com ar atmosférico durante o cultivo. A velocidade específica de crescimento foi de 0,24h'1, para o cultivo com licor de prensagem. A exaustão de nitrogênio no cultivo ocorreu na 12a hora. A fase de produção foi de 20 horas, com concentração final de P(3HB) na célula igual a 6,9 g.L'1, com produtividade média de 0,21 g.L'1.h'1 e produtividade na fase de produção de 0,27 g.L'\h'1. A porcentagem de polímero na célula foi de 53%. A recuperação do polímero foi realizada com a separação das células do líquido ao término do cultivo através de centrifugação. A extração foi realizada com uma relação da massa de células e volume de solvente, por exemplo, clorofórmio ("Optimization of microbial poly(3-hydroxybutyrate) recovery using dispersions of sodium hypoclorite solution and chloroform" - Biotechnology and Bioengineering, v. 44, pp. 256-261, 1994) variando de 1:2 até 1:20. O tempo de extração variou de 1 a 4 horas nas temperaturas de 20-C até 60QC com agitação magnética, agitação em agitador ou sem agitação. A porcentagem de recuperação variou de 80 a 98%.
EXEMPLO III
Caldo Nutriente (Nutrient Broth) foi utilizado como primeiro pré-inóculo realizado em um agitador rotatório a 30SC e 150rpm por 24 horas. O volume equivalente a 10% do volume final a ser cultivado, foi transferido do primeiro pra o segundo pré-inóculo que é constituído de meio de sais minerais e nutrientes próprios para o crescimento celular do microorganismo empregado. Este segundo pré-inóculo foi mantido em agitador rotatório, a 30SC e 150rpm por 24 horas. Após este período, as células foram transferidas para o reator de 5 litros contendo o licor de prensagem e/ou melaço cítrico {cerca de 60 a 80 g.L'1 de ART) diluído em água destilada para a obtenção de uma concentração de açúcares redutores entre 10-60 g.L'1e adicionado de sais minerais e nutrientes para o crescimento. A temperatura de 35eC foi aplicada. O pH foi mantido em 7,0 e a agitação variou de 400-900rpm, a concentração de oxigênio se manteve superior a 20% da saturação com ar atmosférico durante 26 horas de cultivo. Observou-se uma fase de produção de 18 horas, com 9,76 g.L'1 de P(3HB) e 18,16 g.L'1 de biomassa total. O fator de conversão do substrato em células (Yx/S) foi de 0,76 g.g-1 e de célula em produto (Yp/S) foi de 0,41 g.g'1 resultando em uma produtividade média de 0,46 g.L'1.h'1. O experimento teve seu final observado pelo valor da concentração de ART inferior a 5g.L'1. A produção de P(3HB) teve seu aumento a partir da 8- (oitava) hora quando a exaustão de nitrogênio ocorreu. A porcentagem de P{3HB) na célula ao final do cultivo foi de 54%. A recuperação do polímero foi realizada com a separação das células do líquido ao término do cultivo através de centrifugação. A extração foi realizada com uma relação da massa de células e volume do solvente, por exemplo, clorofórmio ("Optimization of microbial poly(3-hydroxybutyrate) recovery using disper-sions of sodium hypoclorite solution and chloroform" - Biotechnology and Bioengineering, v. 44, pp. 256-261, 1994) variando de 1:2 até 1:20. O tempo de extração variou de 1 a 4 horas nas temperaturas de 20eC até 60eC com agitação magnética, agitação em shaker ou sem agitação. A porcentagem de recuperação variou de 80 a 98%.
Claims (19)
1. Processo de obtenção de PHA a partir de resíduo cítrico caracterizado pelo fato de que compreende as seguintes etapas: a) obtenção de licor de prensagem e/ou melaço cítrico; b) tratamento físico-químico dos materiais obtidos na etapa a através das sub-etapas: b1) centrifugação do licor de prensagem e/ou melaço cítrico; b2) esterilização ou pasteurização do material; b3) decantação do material esterilizado ou pasteurizado, seguida de retirada do material sobrenadante; c) preparação do meio de cultivo para produção de PHA através de adição ao material sobrenadante obtido em b3, de nutrientes essenciais ao cultivo de microrganismos selecionados de Azotobacter, microorganismos metilotróficos, Alcaligenes, Pseudomonas, Burkholderia ou Escherichia coli recombinante; d) condução do cultivo em batelada ou batelada alimentada, em que o cultivo ocorre nas seguintes sub-etapas: d1) etapa de crescimento celular; d2) etapa de indução a produção de PHA; em que a etapa d2 de indução à produção de PHA é iniciada através da limitação de nutrientes selecionados de nitrogênio, fósforo, oxigênio, potássio e magnésio.
2. Processo de obtenção de PHA de acordo com reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o resíduo cítrico corresponde à casca, polpa e semente resultantes da prensagem de laranjas para a extração de suco.
3. Processo de obtenção de PHA de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 2, caracterizado pelo fato de que na etapa a, o licor de prensagem é obtido a partir da moagem/tratamento com oxido de cálcio e prensagem do resíduo cítrico.
4. Processo de obtenção de PHA de acordo com reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que agentes que possuem a propriedade de hidro- lisar a pectina são utilizados em substituição ao oxido de cálcio.
5. Processo de obtenção de PHA de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que na etapa a, o melaço cítrico é obtido a partir de concentração do licor de prensagem seguido de resfriamento.
6. Processo de obtenção de PHA de acordo com reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que a concentração do licor de prensagem é realizada através de evaporação.
7. Processo de obtenção de PHA de acordo com reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que, opcionalmente, uma etapa de correção de pH do licor de prensagem e/ou melaço cítrico é realizada antes da etapa b1.
8. Processo de obtenção de PHA de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que, os nutrientes adicionados são selecionado dentre nitrogênio, fósforo, enxofre, magnésio, potássio, oxigênio, oligonutrientes ou mistura entre os mesmos.
9. Processo de obtenção de PHA de acordo com reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que os oligonutrientes são selecionados dentre molibdênio, manganês, cobalto, zinco, níquel, cobre e boro ou mistura dos mesmos.
10. Processo de obtenção de PHA de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que, opcionalmente, uma etapa de esterilização ou pasteurização do material ocorre após a adição de nutrientes ao meio de cultivo.
11. Processo de obtenção de PHA de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que na etapa c, o meio de cultivo compreende um teor inicial de açúcares redutores de 10 a 60 g.L' 1
12. Processo de obtenção de PHA de acordo com reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o cultivo em batelada ou batelada alimentada é realizado com recirculação de células.
13. Processo de obtenção de PHA de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado pelo fato de que na etapa d, o culti- vo é conduzido à temperatura de 25°C a 40°C.
14. Processo de obtenção de PHA de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizado pelo fato de que na etapa d, o pH pode variar entre 7,2 e 5,4.
15. Processo de obtenção de PHA de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, caracterizado pelo fato de que na etapa d, o meio é agitado a uma velocidade de 200 a 1000 rpm.
16. Processo de obtenção de PHA de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15, caracterizado pelo fato de que na etapa d, a concentração de oxigênio dissolvido deve estar entre 10% e 100% da saturação do meio de cultivo com ar atmosférico.
17. Processo de obtenção de PHA de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 16, caracterizado pelo fato de que no início da etapa de indução a concentração de biomassa mínima corresponde de 15 g.L"1 a 60 g.L'1.
18. Processo de obtenção de PHA de acordo com qualquer uma das reivindicaçõesl a 17, caracterizado pelo fato de que os nutrientes não fontes de carbono, são selecionados dentre nitrogênio, fósforo, enxofre, magnésio, potássio ou oxigênio.
19. Uso de resíduo cítrico para a produção de PHA, caracterizado pelo fato de que ocorre através de processo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 18.
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