ES2397730B2

ES2397730B2 - Preparaci�n de pha (polihidroxialcanoatos) a partir de residuo c�trico

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Publication number: ES2397730B2
Application number: ES201090079A
Authority: ES
Inventors: Glaucia Maria FALC�O DE ARAG�O; Willibaldo SCHIMIDELL NETTO; Jaciane Lutz Ienczak; M�nica LADY FIORESE; Francieli Dalcaton; Franciny Schmidt; Ricardo Deucher; Cinthia Vecchi; Rafael Costa Rodrigues
Original assignee: Ficher S A Com Ind E Agricultura; Ficher S/a - Com Rcio Ind Stria E Agricultura; Universidade Federal de Santa Catarina
Current assignee: Citrosuco SA Agroindustria
Priority date: 2008-06-09
Filing date: 2008-11-18
Publication date: 2013-11-21
Anticipated expiration: 2028-11-18
Also published as: BRPI0801845A2; WO2009149525A8; US20110301325A1; ES2397730B8; BRPI0801845B1; US8618245B2; CN102119220B; WO2009149525A1; CN102119220A; ES2397730A1

Abstract

Preparaci�n de PHA (polihidroxialcanoatos) a partir de residuo c�trico.#La presente invenci�n se refiere a un procedimiento de obtenci�n de poli�steres biodegradables a partir de un residuo c�trico que resulta del tratamiento de naranjas para la obtenci�n de zumo. Los poli�steres de la presente invenci�n descritos son polihidroxialcanoatos, incluy�ndose entre ellos poli(3-hidroxibutirato) y poli (3-hidroxibutirato-co-3-hidroxivalerato). El pol�mero biodegradable se obtiene a partir del procedimiento de cultivo discontinuo o del procedimiento de cultivo con alimentaci�n discontinua, con o sin recirculaci�n de las c�lulas, usando cono fuente de carbono el licor de prensa pretratado y/o las melazas c�tricas. Los polihidroxialcancatos aqu� descritos pueden ser usados como sustitutivos de los poli�steres sint�ticos en diferentes sectores, incluyendo los sectores alimentario, farmac�utico, m�dico, agr�cola y otros.

Description

Preparaci�n de PHA (polihidroxialcanoatos) a partir de residuo c�trico.

La presente invenci�n se refiere a un procedimiento de obtenci�n de poli�steres biodegradables a partir de un residuo c�trico que resulta del tratamiento de naranjas para la obtenci�n de zumo. Los poli�steres de la presente invenci�n descritos son polihidroxialcanoatos (PHA) y pueden ser usados como sustitutivos de poli�steres sint�ticos en muchos sectores que incluyen los sectores alimenticio, farmac�utico, m�dico, agr�cola y otros.

Descripci�n del estado de la t�cnica

Actualmente el uso del material pl�stico es crecientemente frecuente. Este material sustituye materias primas convencionales como papel, cart�n, vidrios y metales, debido a su bajo coste y gran durabilidad. En su fabricaci�n se usan pol�meros sint�ticos como polipropileno, polietileno, poli(cloruro de vinilo), poliestireno y otros. Estos pol�meros son f�cilmente moldeados (incluso en fibras y hebras finas transl�cidas), tienen una elevada resistencia qu�mica y son relativamente el�sticos y pueden ser usados en la fabricaci�n de envases de productos de desecho r�pido, as� como en la producci�n de art�culos duraderos.

A pesar de su gran aplicabilidad, los pl�sticos se han convertido en una grave cuesti�n medioambiental. La principal raz�n es su prolongado tiempo de degradaci�n, de aproximadamente 200 a�os, permaneciendo en el medio ambiente y deteriorando el proceso de descomposici�n de la materia org�nica, adem�s de contribuir al proceso de estancamiento de los r�os y la alteraci�n del y curso natural del lecho fluvial. En zonas de vegetaci�n, ponen en peligro el ciclo reproductor de los animales y crust�ceos.

El aumento del uso de pol�meros sint�ticos ha dado lugar a la necesidad de crear alternativas con el fin de minimizar las cuestiones medioambientales generadas por los mismos. Entre estas alternativas, se pueden mencionar la incineraci�n, reciclado, almacenamiento adecuado y, recientemente, la sustituci�n de pol�meros sint�ticos por materiales biodegradables. La incineraci�n de pl�sticos se usa generalmente como un modo de recuperar energ�a debido a su elevada potencia calor�fica, pero la liberaci�n de di�xido de carbono y otros componentes que resultan de la combusti�n pone en peligro el medio ambiente, aumentando el nivel de contaminaci�n atmosf�rica. El reciclado de los pol�meros sint�ticos es la alternativa m�s usada porque proporciona una reducci�n de los costes de hasta 70% en comparaci�n con la producci�n del pol�mero sint�tico derivado del petr�leo. En relaci�n con los materiales biodegradables, una opci�n importante es la fabricaci�n de polihidroxialcanoatos (PHA). Los polihidroxialcanoatos tienen propiedades termopl�sticas similares a las presentadas por los pol�meros sint�ticos, que pueden ser aplicadas en muchos tipos de productos.

Los polihidroxialcanoatos (PHA) son poli�steres de amplio uso que, como son biodegradables, tienen una menor capacidad potencial de contaminaci�n. Los polihidroxialcanoatos presentan caracter�sticas muy interesantes como propiedades termopl�sticas y f�sico-qu�micas muy similares a las presentadas por los pl�sticos procedentes del petr�leo, principalmente en relaci�n con el polipropileno. Los polihidroxialcanoatos presentan las ventajas de ser completamente biodegradables y biocompatibles, ser producidos a partir de materias primas renovables, que pueden ser recicladas e incineradas sin la generaci�n de productos t�xicos y, por lo tanto, se consideran de una elevada aplicabilidad en relaci�n con los pl�sticos petroqu�micos.

Los polihidroxialcanoatos comparten diferentes propiedades seg�n su composici�n mon�mera. Son sustancias lip�filas acumuladas en el interior de microorganismos productores de PHA, que se encuentran en forma de inclusiones insolubles y que son extra�das bajo la forma de un polvo inodoro.

La estructura general de los polihidroxialcanoatos est� proporcionada por la repetici�n de la siguiente f�rmula general

en la que el radical R puede variar desde solamente un �tomo de hidr�geno hasta C12, que puede tener insaturaciones, grupos arom�ticos o tambi�n enlaces a elementos como fl�or, cloro y cromo.

La composici�n del radical R asociado al valor de n, determina la identidad de la unidad mon�mera, el tipo de repeticiones de esta unidad y las propiedades del pol�mero biodegradable.

De acuerdo con la longitud de las cadenas carbonadas y sus unidades mon�meras, los polihidroxialcanoatos se clasifican en tres grupos:

1.: Polihidroxialcanoatos constituidos por unidades de �cidos hidroxialcanoicos de cadena corta (PHASSC), es decir, los que tienen una cadena carbonada constituida por tres a cinco �tomos de C;

2.: Polihidroxialcanoatos constituidos por unidades de �cidos hidroxialcanoicos de cadena media (PHAMCL), es decir los que tienen una cadena carbonada constituida por 6 a 14 �tomos de C;

3.: Polihidroxialcanoatos constituidos por unidades de �cidos hidroxialcanoicos de cadena larga (PHALCL), es decir los que tienen una cadena carbonada constituida por m�s de 15 �tomos de C.

Los polihidroxialcanoatos (PHA) m�s conocidos son, principalmente, el poli(3-hidroxibutirato) (P(3HB)) y el poli (3hidroxibutirato-co-3-hidroxivalerato) (p(3HB-co-3HV) ).

Los polihidroxialcanoatos son considerados de gran inter�s industrial como pl�sticos biodegradables y/o biocompatibles para diferentes aplicaciones o sectores. Las propiedades deseables para las diferentes aplicaciones de un material pl�stico son un punto de fusi�n elevado, una dureza baja, elevada resistencia a la presi�n, resistencia al alargamiento antes de la rotura y una elevada resistencia al impacto.

Debido a las caracter�sticas que tienen, el P(3HB) y el P(3HB-co-3HV) fueron inicialmente usados en la fabricaci�n de botellas, pel�culas y fibras para envases biodegradables, as� como bolsas para protecci�n de plantas. Estos biopol�meros tienen tambi�n una aplicaci�n en el sector m�dico como materiales osteosint�ticos y suturas quir�rgicas, reposici�n de vasos sangu�neos y vendas. Otras aplicaciones incluyen el hecho de ser usados como un veh�culo biodegradable para la aplicaci�n de f�rmacos, medicaciones, insecticidas, herbicidas y fertilizantes y fragancias o incluso como envases, pel�culas, bolsas y recipientes.

Los polihidroxialcanoatos pueden ser producidos por diferentes microorganismos unicelulares en la forma de gr�nulos intracelulares como una reserva de carbono y de energ�a. Los microorganismos capaces de producir y acumular PHA son principalmente bacterias que se pueden encontrar en la naturaleza, por ejemplo, en el terreno, agua marina, efluentes, etc. Estos microorganismos son los pertenecientes a diferentes grupos taxon�micos o diferentes g�neros como microorganismos metilotr�ficos, Azobacter, Alcaligenes, Pseudomonas, Burkholderia, adem�s de Escherichia coli recombinante.

Los microorganismos m�s usados son: Alcaligenes latus, Pseudomonas oleovorans, Azobacter vinelandii, Cupriavidus necator, Burkholderia sacchari, un cierto n�mero de cepas de metilotrofus y Escherichia coli recombinante. Los PHA pueden ser producidos tambi�n por plantas transg�nicas.

Para que el procedimiento de extracci�n del pol�mero no sea costoso, es necesario que la cepa sea capaz de acumular al menos un 60% de su masa celular en el pol�mero. De esta manera, las bacterias gran-positivas son eliminadas y las que tienen una baja capacidad de s�ntesis y acumulaci�n de pol�mero para la producci�n industrial.

Desde el descubrimiento de bacterias productoras de polihidroxialcanoatos por Lemoigne en 1926, la bacteria Gramnegativa Cupriavidus necator es la mejor estudiada de las representativas en este grupo y es el mayor productor de PHA hasta hoy. Antes de ser clasificada con este nombre, Cupriavidus nec�tor fue previamente descrita como Hydrogenomonas eutropha, Alcaligenes eutrophus, Ralstonia eutropha y Wautersia eutropha. Su amplio uso es debido a la elevada capacidad de acumular grandes cantidades de PHA a partir de fuentes simples de carbono como �cido ac�tico, fructosa y glucosa.

La producci�n de PHA procede cuando el microorganismo crece en condiciones de cultivo desequilibradas. Estas condiciones pueden estar asociadas a la limitaci�n de nutrientes (como N, P, O2, K y Mg) en presencia de una fuente excesiva de carbono o limitaciones f�sicas como la temperatura y la concentraci�n de ox�geno diluido.

En un estado de crecimiento equilibrado, el C. necator usa sustratos como hidratos de carbono, piruvato o acetato, partiendo del mecanismo de regulaci�n por la enzima acetil-CoA. En una primera etapa, la enzima -cetotiolasa conduce a la condensaci�n de dos mol�culas de acetil-CoA en acetoacetil-CoA. En la segunda etapa, una acetoacetil-CoA reductasa dependiente de NaDPH conduce a una conversi�n de R-3-hidroxibutiril-CoA, mediante una reacci�n estereoselectiva. La tercera y �ltima etapa es la polimerizaci�n catalizada por la PHA sintasa. La bios�ntesis del copol�mero por C. necator solamente se produce cuando hay sustratos precursores de la unidad 3HV, que puede ser convertida en propionil-CoA o 3-hidroxivaleril-CoA, en forma de un �cido propi�nico, �cido val�rico o �cido pentanoico.

A partir de estas caracter�sticas metab�licas, la producci�n de polihidroxialcanoatos se produce en dos fases: una primera fase de crecimiento celular en un medio de cultivo equilibrado dirigido al aumento de la biomasa y una segunda fase, en la que se produce la limitaci�n de un nutriente esencial, no una fuente de carbono, en general nitr�geno, f�sforo y ox�geno dirigiendo el metabolismo para la producci�n de PHA. Con el fin de proporcionar la producci�n de copol�mero, la adici�n de uno de los agentes precursores anteriormente mencionados se debe realizar durante la segunda fase del procedimiento.

Son necesarias estrategias de producci�n de P(3HB) para aumentar el contenido de biopol�mero y disminuir el coste total de los biopl�sticos. El uso de sustratos de bajo coste puede representar un 40% de ahorro en el procedimiento de producci�n de P(3HB). Una alternativa interesante es el uso de residuos agroindustriales. Entre los sustratos de bajo coste, los residuos derivados de plantas de tratamiento de alimentos como almid�n, ca�a de az�car y suero de leche son los m�s destacados.

En lo que respecta a la producci�n industrial de PHA, se han encontrado diversos documentos que incluyen su obtenci�n a trav�s del uso de fuentes de carbono renovables en la forma de residuos agroindustriales. Los residuos descritos incluyen bagazo de manzana, suero de leche, mezcla de suero de leche y az�car invertido, residuos de la industria del tratamiento de patatas (almid�n hidrolizado) y otros. El uso de estos residuos de bajo coste contribuye a la reducci�n del precio final de estos biopol�meros.

El documento BRPI0501139-6, publicado el 28 de noviembre de 2006, describe el procedimiento de producci�n de PHA a partir de aceites vegetales, glicerol, mono-, di- o tri-glic�ridos residuales procedentes de la producci�n de biodiesel obtenidos a partir de aceite vegetales.

El documento BRPI0504054-0, publicado el 22 de mayo de 2007, describe el procedimiento de producci�n de PHA de cadena corta y especialmente el poli (3-hidroxibutirato) a partir de aceite vegetal como, por ejemplo, aceite de soja. En el procedimiento descrito, la concentraci�n de aceites vegetales no puede ser superior a 0,3 g.L-1 de �cido oleico debido al hecho de que provoca la inhibici�n del crecimiento de microorganismos. Esta limitaci�n hace que este procedimiento sea muy restringido.

El documento US 2006/0088921 se refiere a un m�todo de producci�n de PHA a partir de basuras org�nicas. El m�todo incluye un pretratamiento de los residuos org�nicos con microorganismos acidog�nicos, seguido del procedimiento de cultivo para la producci�n de PHA por microorganismos espec�ficos que incluyen R. eutropha, P. oleovorans y otros. Aunque te�ricamente es viable, la producci�n de PHA a partir de esta materia org�nica est� obstaculizada por la diversidad y la complejidad del sustrato usado, haciendo que este procedimiento no sea viable.

El documento BRPI0207356-0, publicado el 8 de setiembre de 2004, describe el procedimiento de producci�n de polihidroxibutirato y su copol�mero polihidroxibutirato-Co-hidroxivalerato a partir del bagazo de la ca�a del az�car. Aunque esta es una materia prima que presenta una oferta elevada, el bagazo de la ca�a de az�car debe ser inicialmente hidrolizado para la obtenci�n de un medio de cultivo adecuado para la producci�n de PHA.

El documento titulado "VI SINAFERM 2007; Poster BAM0526" describe el proceso de producci�n de poli(3hidroxibutirato) (P(3HB) ) y poli (3-hidroxidodecanoato) (P(3HDd)) a partir de pectina y �cido c�trico o residuos agroindustriales peletizados que contienen estos sustratos. En el procedimiento descrito, el rendimiento de pol�mero extra�do es menor que 2%, lo que limita mucho el procedimiento.

El documento titulado "J. Natural Gas Chemistry: March 2008, pp. 103-109" se refiere a la bios�ntesis de poli-3hidroxibutirato de alto peso molecular usando metano y metanol como sustrato. Se a�adi� �cido c�trico como inhibidor, incrementando la acumulaci�n de PHB. A pesar del uso de �cido c�trico como agente auxiliar en la producci�n de PHB, el documento no describe el uso de residuos agro-industriales como fuente de residuos de bajo coste.

El pretratamiento de biomasa lignocelul�sica consiste en una de las fases de funcionamiento m�s relevantes en t�rminos de coste directo, adem�s de la influencia de las fases previas y posteriores del procedimiento. El pretratamiento puede generar productos inhibidores para el microorganismo y una enorme cantidad de s�lidos en suspensi�n, haciendo que el procedimiento sea insuficiente y/o que presente una baja productividad.

El documento titulado "Production of poly(3-hidroxybutyrate) from inexpensive substrates" (Enzyme and Microbial Technology Vol. 27, (10), 2000, p�ginas 774-777) describe la producci�n de una PHA, el poli(3-hidroxibutirato) P(3HB) a partir de almid�n y prote�na de suero, ambos residuos procedentes de procedimientos industriales de alimentos. El almid�n es previamente hidrolizado en un procedimiento de dos etapas que incluyen licuefacci�n y sacarificaci�n. El sustrato preparado es sometido a un procedimiento biotecnol�gico usando A. chroococcum y E. coli recombinante. El art�culo destaca adicionalmente la relevancia del uso de materias primas como una forma para disminuir el coste de producci�n del P(3HB).

Aunque es te�ricamente posible producir PHA a partir de diversos tipos de residuos agroindustriales, algunos factores como la disponibilidad de az�car fermentable, la presencia de inhibidores y el tratamiento de material lignocelul�sico pueden hacer que el procedimiento no sea viable.

El uso de residuos, como los descritos en la presente memoria descriptiva, exige a veces, como un requisito previo, el tratamiento previo de la materia prima usada que incluye la hidr�lisis de los az�cares de cadena larga con el fin de hacer posible la asimilaci�n de la fuente de carbono por los microorganismos que producen polihidroxialcanoatos. Este procedimiento de hidr�lisis incluye normalmente un tiempo prolongado de preparaci�n, el uso de enzimas o �cido y, a menudo, genera componentes inhibidores del cultivo, provocando costes adicionales para el procedimiento de producci�n de PHA relevantes.

La invenci�n descrita en el presente documento resuelve los problemas previamente mencionados a trav�s del uso de un procedimiento de obtenci�n de PHA a partir de residuos de la elaboraci�n de zumo de naranja, que comprende un pretratamiento simplificado de la materia prima y sin hidr�lisis. La invenci�n hace viable el uso de un residuo agroindustrial hasta ese momento infrautilizado, aumentando su valor a�adido y, consecuentemente, haciendo el procedimiento rentable, adem�s de ecol�gico.

Breve descripci�n de la invenci�n

La presente invenci�n se refiere a un procedimiento de obtenci�n de polihidroxialcanoatos (PHA) a partir de un residuo c�trico que resulta del tratamiento de naranjas para la obtenci�n de zumo. El procedimiento relevante comprende las siguientes etapas:

a): obtenci�n de licor de prensa y/o melazas c�tricas;

b): tratamiento f�sico-qu�mico de la materia obtenida en la etapa a;

c): preparaci�n de un medio de cultivo para la producci�n de PHA;

d): realizaci�n del procedimiento de cultivo.

La invenci�n se refiere tambi�n al uso de un residuo c�trico para la producci�n de PHA, de acuerdo con el procedimiento descrito en la invenci�n. La invenci�n se refiere todav�a a PHA a una composici�n pol�mera que contiene PHA obtenida a partir del procedimiento descrito en la invenci�n.

La presente invenci�n se refiere tambi�n a un objeto s�lido que comprende PHA obtenido a partir del procedimiento para la producci�n de PHA descrito en la invenci�n, as� como un objeto s�lido que contiene una mezcla pol�mera que comprende PHA obtenido seg�n el procedimiento para la producci�n de PHA descrito en la invenci�n.

Descripci�n detallada de la invenci�n

La presente invenci�n presenta un procedimiento simple de producci�n de PHA, a partir de un residuo agroindustrial abundante y f�cil de manipular. El procedimiento relevante usa el residuo del tratamiento de naranjas, denominado residuo c�trico, que contribuye considerablemente a la reducci�n del impacto medioambiental de este residuo, as� como al aumento de su valor a�adido. La extracci�n de zumo de naranja genera, como residuo, aproximadamente 52% de pulpa c�trica reciente, con 73% a 83% de humedad. La pulpa c�trica est� constituida por pieles (60-65%), dicha pulpa, el bagazo (30%-35%) y las semillas (aproximadamente 10%). Con el aumento de la escala productiva de zumo de naranja y la generaci�n de grandes vol�menes de residuos, comenzaron los primeros problemas de contaminaci�n medioambiental, que estimularon el desarrollo de estrategias de uso del residuo generado. Una alternativa desarrollada para el uso parcial del residuo l�quido generado, constituido por prote�nas, aceites esenciales, pectinas, az�cares, �cidos org�nicos y sales, fue la fermentaci�n alcoh�lica para la producci�n de etanol. Aunque la producci�n de etanol ha minimizado el impacto medioambiental provocado por la generaci�n de residuos del procedimiento de extracci�n, la adici�n de un valor a�adido a la misma representar�a una ganancia considerabIe en la competencia en el contexto productor.

La presente invenci�n presenta un procedimiento de obtenci�n de PHA a partir de un residuo c�trico, que comprende las siguientes etapas:

a) obtenci�n de un licor de prensa y/o melazas c�tricas;

b) tratamiento f�sico-qu�mico del material obtenido en la etapa a;

c) preparaci�n del medio de cultivo para la producci�n de PHA; d) realizaci�n del procedimiento de cultivo.

El residuo c�trico descrito en la invenci�n corresponde a la piel, la pulpa y las semillas que resultan despu�s de prensar las naranjas para extraer el zumo.

El licor de prensa y/o las melazas c�tricas de la presente invenci�n son obtenidas a partir del residuo c�trico. El residuo c�trico, despu�s de ser obtenido, es sometido a un procedimiento de trituraci�n, tratamiento con �xido de calcio (CaO) y prensado para obtener, como resultado, el licor de prensa. Pueden ser usados tambi�n otros agentes, adem�s de CaO, que tengan la propiedad de hidrolizar la pectina para la liberaci�n del agua y facilitar el procedimiento de prensado.

El licor de prensa obtenido puede hacerse pasar tambi�n a trav�s de un procedimiento de concentraci�n, seguido de un procedimiento de enfriamiento, obteniendo as� las melazas c�tricas. Preferentemente, la concentraci�n del licor de prensa tiene lugar a trav�s de la evaporaci�n. Las etapas de obtenci�n del residuo c�trico, licor de prensa y melazas c�tricas que se han descrito anteriormente se pueden observar en la Figura 1.

El licor de prensa y/o las melazas c�tricas obtenidas en la etapa (a) del procedimiento de obtenci�n de PHA son usados como un medio de cultivo de microorganismos en el procedimiento de producci�n de PHA de la presente invenci�n. Para el uso del licor de prensa y/o melazas c�tricas como medio de cultivo es necesario, inicialmente, que estas materias primas sean sometidas a un tratamiento f�sico-qu�mico previo. El tratamiento f�sico-qu�mico al que son sometidos el licor de prensa y/o las melazas c�tricas comprende la centrifugaci�n de los mismos, seguida de una etapa de esterilizaci�n o pasteurizaci�n del material. Despu�s de la esterilizaci�n o pasteurizaci�n, el material exento de microorganismos se somete a un procedimiento de decantaci�n seguido de una separaci�n del material sobrenadante. El material sobrenadante es seguidamente usado para la preparaci�n del medio de cultivo. Opcionalmente, el licor de prensa y/o las melazas c�tricas pueden sufrir una correcci�n del pH antes de la centrifugaci�n. Preferentemente, es escogido el pH 7,0 para correcciones. En una realizaci�n preferida de la invenci�n, la centrifugaci�n del licor de prensa y/o las melazas c�tricas tiene lugar a la temperatura de 5�C y la esterilizaci�n tiene lugar a 121�C durante 15 minutos. En otra realizaci�n preferida de la invenci�n, la centrifugaci�n del l�quido de lavado y/o las melazas c�tricas tiene lugar a una temperatura de 5�C y la pasteurizaci�n tiene lugar a 113�C durante 2 minutos. En otra realizaci�n preferida de la invenci�n, la centrifugaci�n tiene lugar as�pticamente y est� seguida de una filtraci�n as�ptica. El material as�pticamente filtrado es sometido a un procedimiento de decantaci�n seguido de la separaci�n del material sobrenadante. El material sobrenadante es seguidamente usado para la preparaci�n del medio de cultivo. En otra realizaci�n preferida de la invenci�n, el pH inicial del licor de prensa y/o las melazas c�tricas es corregido para 7,0 y el material resultante es centrifugado a 3.500 rpm durante 5 minutos. Despu�s de la centrifugaci�n, el material sobrenadante es calentado a 100�C y seguidamente es sometido a una decantaci�n en fr�o con la separaci�n del material sobrenadante. El material sobrenadante es seguidamente usado para la preparaci�n del medio de cultivo. En una realizaci�n m�s preferida de la invenci�n, el l�quido de comprensi�n y/o las melazas c�tricas son sometidos a una centrifugaci�n a 5�C y una pasteurizaci�n a 113�C durante 2 minutos. Despu�s de la pasteurizaci�n, el licor de prensa y/o las melazas c�tricas son seguidamente sometidos a la decantaci�n en fr�o y la materia sobrenadante es nuevamente sometida al procedimiento de pasteurizaci�n a 113�C durante 2 minutos. El material resultante es seguidamente usado para la preparaci�n del medio de cultivo. En otra realizaci�n preferida de la invenci�n, el tratamiento f�sico-qu�mico del l�quido de lavado y/o las melazas c�tricas consiste en la filtraci�n de los mismos en una membrana de microfiltraci�n o ultrafiltraci�n o someterlos a la separaci�n de los s�lidos en suspensi�n mediante flotaci�n.

El licor de prensa y/o las melazas c�tricas sometidos a un tratamiento f�sico-qu�mico son usados para la preparaci�n del medio de cultivo del procedimiento de producci�n de PHA de la presente invenci�n. La preparaci�n del medio de cultivo tiene lugar inicialmente por medio de la adici�n, al material sobrenadante que resulta del tratamiento f�sicoqu�mico del licor de prensa y/o las melazas c�tricas, de nutrientes esenciales para el procedimiento de cultivo seleccionados entre nitr�geno, f�sforo, azufre, magnesio, potasio, ox�geno, oligo-nutrientes o mezclas de los mismos. Preferentemente, los oligonutrientes adicionales durante la preparaci�n del medio de cultivo de la invenci�n se seleccionan entre molibdeno, manganeso, cobalto, zinc, n�quel, cobre y boro.

Alternativamente, despu�s de la adici�n de los nutrientes, el medio de cultivo puede ser sometido a un procedimiento de esterilizaci�n con el fin de garantizar la realizaci�n as�ptica del procedimiento de cultivo. En una realizaci�n preferida de la invenci�n, el procedimiento de esterilizaci�n del medio de cultivo con nutrientes tiene lugar a 121�C durante 15 minutos.

Las fases del tratamiento f�sico-qu�mico del licor de prensa y/o las melazas c�tricas, as� como las realizaciones preferidas anteriormente descritas, se pueden observar en la Figura 2.

El medio de cultivo usado en el procedimiento biotecnol�gico descrito en a presente invenci�n debe comprender un contenido inicial de az�cares reductores de 10 a 60 g.L-1. Para efectuar el procedimiento biotecnol�gico, se pueden usar microorganismos pertenecientes a diferentes grupos taxon�micos: Azotobacter, microorganismos metilotr�fpicos, Alcaligenes, Pseudomonas, Burkholderia adem�s de Escherichia coli recombinante. Preferentemente los microorganismos usados en la presente invenci�n se seleccionan entre Alcaligenes latus, Pseudomonas oleovorans, Azobacter vinelandii, Bacillus cereus, Cupriavidus necator, Burkholderia sacchari, metilotrofus y Escherichia coli recombinante. Incluso m�s preferentemente, el procedimiento biotecnol�gico de la presente invenci�n se realiza mediante el uso de Cupriavidus necator. Para que el procedimiento biotecnol�gico sea satisfactorio, tanto en la producci�n de microorganismos como en la producci�n de pol�mero, son necesarios dos in�culos previos, que precedan al procedimiento del reactor. El primer in�culo previo debe ser ejecutado preferentemente por medio de la propagaci�n del microorganismo Cupriavidus necator en medio de cultivo que contenga un caldo nutriente que comprenda 5 g.L-1 de peptona, 3 g.L-1 de extracto c�rnico. Este in�culo previo es mantenido en un agitador rotatorio a una temperatura, rotaci�n y tiempo compatibles con el procedimiento. Preferentemente, el primer in�culo previo es mantenido a 30�C bajo agitaci�n de 150 rpm durante 24 h. Despu�s de este per�odo, un 10% del volumen final que va a ser usado en el procedimiento de cultivo es transferido desde el primer in�culo previo hasta el segundo in�culo previo. El segundo in�culo previo se caracteriza por contener sales minerales y nutrientes esenciales para el crecimiento de microorganismos. Este in�culo previo es mantenido en condiciones espec�ficas de temperatura, agitaci�n y tiempo, compatibles con el procedimiento. Preferentemente, el segundo in�culo previo es mantenido a 30�C, 150 rpm durante 24 h. Despu�s de este per�odo, un volumen de in�culo previo, suficiente para la realizaci�n del procedimiento de cultivo, es a�adido al reactor que contiene el medio de cultivo preparado seg�n lo que se describi� anteriormente. Preferentemente, el volumen del segundo in�culo previo que es a�adido al reactor corresponde principalmente a un 10% del volumen del medio de cultivo que va a ser usado en el procedimiento de cultivo.

El procedimiento biotecnol�gico para la producci�n de PHA de la presente invenci�n se puede realizar por medio del procedimiento del cultivo discontinuo o en un procedimiento de cultivo de alimentaci�n discontinua. El procedimiento se puede realizar con o sin recirculaci�n de las c�lulas al reactor, con el fin de obtener una elevada densidad celular. El procedimiento de la presente invenci�n comprende las etapas de un crecimiento celular seguido de la etapa de inducci�n de la producci�n de PHA. El procedimiento de cultivo se realiza a una temperatura de 25�C a 40�C. Durante el procedimiento de cultivo, el PH puede variar entre 7,2 y 5,4 y el medio de cultivo es agitado a una velocidad de 200 a 1.000 rpm. Durante la realizaci�n del procedimiento de cultivo, el contenido de ox�geno diluido puede variar entre 10% y 100% de saturaci�n del medio de cultivo con aire atmosf�rico, no siendo este estado inferior a 10%.

La etapa de inducci�n para la producci�n tiene lugar por medio de la imposici�n de la limitaci�n de un nutriente (nitr�geno, f�sforo, azufre, magnesio, potasio u ox�geno). Esta limitaci�n tiene lugar durante la realizaci�n de un procedimiento de cultivo y debe tener lugar preferentemente despu�s de la obtenci�n de una concentraci�n m�nima de biomasa entre 15 g.L-1 y 60 g.L-1 (peso en seco). La determinaci�n de la concentraci�n inicial del nutriente que limita el medio de cultivo debe considerar los factores de conversi�n de los nutrientes en c�lulas. La recuperaci�n de pol�mero (PHA) se puede realizar por m�todos diferentes compatibles con el procedimiento de cultivo de la invenci�n. Estos m�todos incluyen la separaci�n del material celular que contiene el pol�mero seguido de un procedimiento de extracci�n.

La presente invenci�n se refiere tambi�n al uso de un residuo c�trico para la producci�n de PHA usando el procedimiento de obtenci�n de PHA anteriormente descrito. Otro objeto de la presente invenci�n es el propio PHA obtenido a partir del procedimiento descrito en la invenci�n. La invenci�n se refiere tambi�n a una composici�n pol�mera que comprende PHA obtenido mediante el procedimiento descrito en la invenci�n.

La presente invenci�n se refiere todav�a a un objeto s�lido, que comprende PHA obtenido mediante el procedimiento para la producci�n de PHA descrito en la invenci�n, as� como un objeto s�lido que contiene una mezcla pol�mera que comprende PHA obtenido de acuerdo con el procedimiento para la producci�n de PHA descrito en la invenci�n.

Algunas posibilidades de realizaci�n de la invenci�n relevante se describen a continuaci�n. Los ejemplos descritos en la presente memoria descriptiva deben ser interpretados como posibilidades de realizaci�n de la invenci�n y, sin embargo no deben ser usados para limitar el alcance de su protecci�n.

Ejemplo I

El primer in�culo previo fue cultivado en un caldo nutriente mantenido en un agitador rotatorio durante 24 horas. Despu�s de este per�odo de tiempo, un volumen equivalente a un 10% del volumen final que iba a ser usado en el procedimiento de cultivo fue transferido desde el primero al segundo in�culo previo, que est� constituido por medio de sales minerales y nutrientes adecuados para el crecimiento celular del microorganismo usado. Este segundo in�culo previo se mantuvo en un agitador rotatorio a 30�C y 150 rpm durante 54 horas. Despu�s de este tiempo, un volumen equivalente a un 10% del volumen final que iba a ser usado en el procedimiento de cultivo fue transferido desde el segundo in�culo previo al reactor de 5 litros que conten�a el medio compuesto por el licor de prensa y/o las melazas c�tricas. El licor de prensa y/o las melazas c�tricas contienen aproximadamente 60 a 80 g.L-1 de ART (az�cares reductores totales) y debido a esto, debe ser diluido con agua destilada para la obtenci�n de una concentraci�n de az�cares reductores entre 10-60 g.L-1 (l�mite de crecimiento para el c. necator) a�adido con sales minerales y nutrientes para el crecimiento. Se emple� el pretratamiento 5 (Figura 2) para la reducci�n de los s�lidos en suspensi�n presentes en el licor de prensa y/o las melazas c�tricas. El procedimiento de cultivo se realiz� con la concentraci�n inicial de az�cares reductores totales (ART) entre 10 y 40 g.L-1, la temperatura entre 25 y 40�C, el pH que variaba en el intervalo de 5,4-7,0, agitaci�n de 200 a 900 rpm concentraci�n de ox�geno entre 10 y 100% de la saturaci�n con aire atmosf�rico durante 28 horas de cultivo. El factor de conversi�n del sustrato en c�lulas (Yx/s) obtenido fue de aproximadamente 0,54 g. g-1, la velocidad espec�fica de crecimiento obtenida fue de 0,44 h-1. La producci�n de P(3HB) tuvo un aumento desde la d�cima (10�) hora cuando se produjo el agotamiento de nitr�geno. La biomasa total fue de 17,1 g.L-1. El porcentaje de P(3HB) en la c�lula al final del procedimiento de cultivo fue de 81% con una productividad media de P(3HB) de 0,49 g.L.h-1 en 18 horas de producci�n. La recuperaci�n de pol�mero se realiz� mediante la separaci�n de las c�lulas del l�quido a la conclusi�n del procedimiento de cultivo por medio de centrifugaci�n. La extracci�n se ejecut� con una relaci�n de masa celular y volumen de disolvente, por ejemplo, cloroformo ("Optimization of microbial poly (3-hydroxybutyrate) recovery using dispersions of sodium hypochlorite solution and chloroform" - Biotechnology and Bioengineering, v. 44, pag. 256-261, 1994) que variaba en el intervalo de 1:2 a temperaturas de 20�C hasta 60�C con agitaci�n magn�tica, agitaci�n en un agitador o sin agitaci�n. El porcentaje de recuperaci�n vari� en el intervalo de 80 a 98%.

Ejemplo II

El uso del licor de prensa del bagazo de naranjas fue ensayado en cuanto a la producci�n de P(3HB) como subproducto en la industria del zumo de naranja, sin la aplicaci�n de un tratamiento t�rmico. El primer in�culo previo fue cultivado en un caldo nutriente, mantenido en un agitador rotatorio a 30�C y 150 rpm durante 24 horas. Despu�s de su activaci�n, un volumen equivalente a un 10% del volumen final que iba a ser usado en el procedimiento de cultivo fue transferido desde el primero al segundo in�culo previo, que est� constituido por un medio de sales minerales y nutrientes adecuados para el crecimiento celular del microorganismo usado. Este segundo in�culo previo fue mantenido en un agitador rotatorio a 30�C y 150 rpm durante 24 horas. Despu�s de este tiempo, un volumen equivalente a 10% del volumen final que iba a ser usado en el procedimiento de cultivo fue transferido desde el segundo in�culo previo al reactor de 5 litros que conten�a licor de prensa que presentaba aproximadamente 10 y 60 g. L-1 de az�cares reductores. A este medio se a�adieron adicionalmente sales minerales y nutrientes para el crecimiento.

El procedimiento de cultivo se ejecut� durante 32 horas, la temperatura del procedimiento de cultivo se mantuvo a 30�C, el pH se mantuvo entre 5,4 y 7,0, la agitaci�n vari� en el intervalo de 400-900 rpm, la concentraci�n de ox�geno permaneci� entre 10 y 100% del valor de saturaci�n con aire atmosf�rico durante el procedimiento de cultivo. La velocidad espec�fica de crecimiento fue de aproximadamente 0,24 h-1 cuando se us� medio de cultivo del licor de prensa. El agotamiento de nitr�geno en el procedimiento de cultivo tuvo lugar en la 12� hora. La fase de producci�n fue de aproximadamente 20 horas, con una concentraci�n final de P(3HB) en la c�lula igual a 6,9 g.L-1 y con una productividad media de 0,2 g.L-1.h-1 y una productividad en la fase de producci�n de 0,27 g.L-1.h-1. El porcentaje de pol�mero en las c�lulas era de 53%. La recuperaci�n del pol�mero se realiz� mediante la separaci�n de las c�lulas del l�quido a la conclusi�n del procedimiento de cultivo por medio de centrifugaci�n. La extracci�n se realiz� con una relaci�n de masa de c�lulas y volumen de disolvente, por ejemplo, cloroformo ("Optimization of microbial poly(3-hydroxybutyrate) recovery using dispersions of sodium hypochlorite solution and chloroform"

-: Biotechnology and Bioengineering, v. 44, pago 256-261, 1994) que variaba en el intervalo de 1:2 hasta 1:20. El tiempo de extracci�n vari� en el intervalo de 1 a 4 horas a las temperaturas de 20�C a 60�C con agitaci�n magn�tica, agitaci�n en un agitador o sin agitaci�n. El porcentaje de recuperaci�n vari� en el intervalo de 80 a 98%.

Ejemplo III

El caldo nutriente se us� como un primer in�culo previo realizado en un agitador rotatorio a 30�C y 150 rpm durante 24 horas. El volumen equivalente a un 10% del volumen final que iba ser usado en el procedimiento de cultivo fue transferido desde el primero al segundo in�culo previo que est� constituido por medio de sales minerales y nutrientes adecuados para el crecimiento celular del microorganismo usado. Este segundo in�culo previo fue mantenido en un agitador rotatorio a 30�C y 150 rpm durante 24 horas. Despu�s de este tiempo, las c�lulas fueron transferidas al reactor de 5 litros que conten�a el licor de prensa y/o las c�tricas (aproximadamente 60 a 80 g.L-1 de ART) diluidas en agua destilada para la obtenci�n de una concentraci�n de az�cares reductores entre 10-60 g-l-1 y con adici�n de sales minerales y nutrientes para el crecimiento. Se aplic� una temperatura de 35�C. El pH se mantuvo a 7,0 y la agitaci�n vari� en el intervalo de 400-900 rpm, la concentraci�n de ox�geno permaneci� por encima de 20% de la saturaci�n con aire atmosf�rico durante 26 horas del procedimiento de cultivo. Se apreci� una fase de producci�n de 18 horas, con 9,76 g.L-1 de P (3HB) y 18,16 g.L-1 de biomasa total. El factor de conversi�n del sustrato en las c�lulas (Yx/s) fue de 0,76 g.L-1 y las c�lulas en el producto (Yp/s) fueron de 0,41 g.L-1 dando lugar a una productividad media de 0,46 g.L-1.h-1. El experimento se observ� que tuvo su final a un valor de la concentraci�n de ART por debajo de 5 g.L-1. La producci�n de P(3HB) tuvo un aumento a partir de la octava (8�) hora cuando tuvo lugar el agotamiento de nitr�geno. El porcentaje de P(3HB) en la c�lula al final del procedimiento de cultivo era de 54%. La recuperaci�n de pol�mero se produjo con la separaci�n de las c�lulas del l�quido al final del procedimiento de cultivo por medio de centrifugaci�n. La extracci�n se realiz� con una relaci�n de la masa celular y volumen de

5 disolvente, por ejemplo, cloroformo ("Optimization of microbial poly(3-hydroxybutyrate recovery using dispersions of sodium hypochlorite solution and chloroform" - Biotechnology and Bioengineering, v. 44, pag. 256-261, 1994) que vari� en el intervalo de 1:2 hasta 1:20. El tiempo de extracci�n vari� en el intervalo de 1 a 4 horas y las temperaturas de 20�C hasta 60�C con agitaci�n magn�tica, agitaci�n en un agitador o sin agitaci�n. El porcentaje de recuperaci�n vari� en el intervalo de 80 a 98%.

Claims

REIVINDICACIONES

1.

Procedimiento de obtenci�n de PHA a partir de un residuo c�trico, que comprende las siguientes etapas:
2.

Procedimiento de obtenci�n de PHA seg�n la reivindicaci�n 1, en el que el residuo c�trico corresponde a la piel, la pulpa y las semillas que resultan del prensado de naranjas para la extracci�n de zumo.
3.

Procedimiento de obtenci�n de PHA seg�n cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, en el que en la etapa a, el licor de prensa es obtenido a partir de la trituraci�n, tratamiento con �xido de calcio o agentes que tienen la propiedad de hidrolizar la pectina y prensado del residuo c�trico.
4.

Procedimiento de obtenci�n de PHA seg�n cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que en la etapa a, las melazas c�tricas son obtenidas a partir de la concentraci�n del licor de prensa seguido de enfriamiento.
5.

Procedimiento de obtenci�n de PHA seg�n la reivindicaci�n 4, en el que la concentraci�n del licor de prensa se realiza por medio de evaporaci�n.
6.

Procedimiento de obtenci�n de PHA seg�n cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que en la etapa b el tratamiento f�sico-qu�mico del licor de prensa y/o las melazas c�tricas se produce por medio de las siguientes subetapas:

a)

obtenci�n de licor de prensa y/o melazas c�tricas;

b)

tratamiento f�sico-qu�mico de la materia obtenida en la etapa a;

c)

preparaci�n del medio de cultivo para la producci�n de PHA;

d)

realizaci�n del procedimiento de cultivo.

b1) centrifugaci�n del licor de prensa y/o melazas c�tricas;

b2) esterilizaci�n o pasteurizaci�n del material;

b3) decantaci�n del material esterilizado o pasteurizado, seguido de la separaci�n del material sobrenadante.
7.

Procedimiento de obtenci�n de PHA seg�n la reivindicaci�n 6, en el que se realiza una etapa de correcci�n del pH del licor de prensa y/o las melazas c�tricas antes de la etapa b1.
8.

Procedimiento de obtenci�n de PHA seg�n cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que en la etapa c, el medio de cultivo se prepara por medio de la adici�n de nutrientes esenciales para el procedimiento de cultivo al material sobrenadante obtenido en el apartado b3.
9.

Procedimiento de obtenci�n de PHA seg�n la reivindicaci�n 8, en el que los nutrientes a�adidos se seleccionan entre nitr�geno, f�sforo, azufre, magnesio, potasio, ox�geno, oligonutrientes o una mezcla de los mismos.
10.

Procedimiento de obtenci�n de PHA seg�n la reivindicaci�n 9, en el que los oligonutrientes se seleccionan entre molibdeno, manganeso, cobalto, zinc, n�quel, cobre y boro o una mezcla de los mismos.
11.

Procedimiento de obtenci�n de PHA seg�n cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que tiene lugar una etapa de esterilizaci�n o pasteurizaci�n del material despu�s de la adici�n de nutrientes al medio de cultivo.
12.

Procedimiento de obtenci�n de PHA seg�n cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en el que en la etapa c, el medio de cultivo comprende un contenido inicial de az�cares reductores de 10 a 60 g.L-1.
13.

Procedimiento de obtenci�n de PHA seg�n cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en el que en la etapa d, el procedimiento de cultivo se realiza por medio de un procedimiento de cultivo discontinuo o procedimiento de cultivo de alimentaci�n discontinua.
14.

Procedimiento de obtenci�n de PHA seg�n la reivindicaci�n 13, en el que el procedimiento de cultivo discontinuo

o procedimiento de cultivo de alimentaci�n discontinua se realiza con una recirculaci�n de las c�lulas.
15.

Procedimiento de obtenci�n de PHA seg�n cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en el que en la etapa d, el procedimiento de cultivo tiene lugar en las siguientes etapas:

d1) etapa de crecimiento celular; d2) etapa de inducci�n de la producci�n de PHA.
16.

Procedimiento de obtenci�n de PHA seg�n cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, en el que en la etapa d, el procedimiento de cultivo se realiza a una temperatura de 25�C a 40�C.
17.

Procedimiento de obtenci�n de PHA seg�n cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, en el que en la etapa d, el pH puede variar entre 7,2 y 5,4.
18.

Procedimiento de obtenci�n de PHA seg�n cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, en el que en la etapa d, el medio es agitado a una velocidad de 200 a 1.000 rpm.
19.

Procedimiento de obtenci�n de PHA seg�n cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18, en el que en la etapa d, la concentraci�n de ox�geno diluido debe ser entre 10% y 100% de la saturaci�n del medio de cultivo con aire atmosf�rico.
20.

Procedimiento de obtenci�n de PHA seg�n cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19, en el que en la etapa d2, la inducci�n de la producci�n de PHA es iniciada por medio de la limitaci�n de nutrientes de fuentes que no son de carbono.
21.

Procedimiento de obtenci�n de PHA seg�n cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20, en el que al comienzo de la etapa de inducci�n, la concentraci�n de la biomasa m�nima corresponde de 15 g.L-1 a 60 g.L-1.
22.

Procedimiento de obtenci�n de PHA seg�n cualquiera de las reivindicaciones 20 a 21, en el que los nutrientes de las fuentes que no son de carbono se seleccionan entre nitr�geno, f�sforo, azufre, magnesio, potasio u ox�geno.
23.

Uso de un residuo c�trico para la producci�n de PHA, que se produce por medio del procedimiento definido en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 22.

OFICINA ESPA�OLA DE PATENTES Y MARCAS

N.� solicitud: 201090079

ESPA�A

Fecha de presentaci�n de la solicitud: 18.11.2008

Fecha de prioridad:

INFORME SOBRE EL ESTADO DE LA TECNICA

51 Int. Cl. : C12P7/62 (2006.01)

DOCUMENTOS RELEVANTES

Categor�a

56 Documentos citados Reivindicaciones afectadas

X

WO 03062439 A1 (UNIVERSITY OF HAWAII [US/US]) 31.07.2003, p�gina 3, p�rrafo [0013] – p�gina 4, p�rrafo [0017]; p�gina 11, p�rrafo [0032] – p�gina 136, p�rrafo [0035]; reivindicaciones 1,4-6. 24-27

X

ZHANG Y. et al. Biosynthesis of poly-3-hydroxybutyrate with a high molecular weight by methanotroph from methane and methanol. Journal of Natural Gas Chemistry. 2008. Vol. 17, p�ginas: 103-109, p�gina 103, resumen. 24-27

X

OJUMU TV. et al. Production of Polyhydroxyalkanoates, a bacterial biodegradable polymer. African Journal of Biotechnology. 2004. Vol. 3(1), p�ginas: 18-24, todo el documento. 24-27

X

JIN SK. et al. Production of poly(3-hydroxybutyrate-co-4-hydroxybutyrate) by Ralstonia eutropha. Biochemical Engineering Journal. 2005. Vol. 23, p�ginas: 169-174, p�gina 169, resumen. 24-27

A

SPIER MR. et al. Phytase Production Using Citric Pulp and Other Residues of the Agroindustry in SSF by Fungal Isolates. Food Technology and Biotechnology. 2008. Vol. 46(2), p�ginas: 178-182, ver p�gina 178, resumen. 1-27

Categor�a de los documentos citados X: de particular relevancia Y: de particular relevancia combinado con otro/s de la misma categor�a A: refleja el estado de la t�cnica O: referido a divulgaci�n no escrita P: publicado entre la fecha de prioridad y la de presentaci�n de la solicitud E: documento anterior, pero publicado despu�s de la fecha de presentaci�n de la solicitud

El presente informe ha sido realizado • para todas las reivindicaciones • para las reivindicaciones n�:

Fecha de realizaci�n del informe 29.01.2013

Examinador M. D. Garc�a Gr�valos P�gina 1/5

INFORME DEL ESTADO DE LA T�CNICA

N� de solicitud: 201090079

Documentaci�n m�nima buscada (sistema de clasificaci�n seguido de los s�mbolos de clasificaci�n) C12P Bases de datos electr�nicas consultadas durante la b�squeda (nombre de la base de datos y, si es posible, t�rminos de

b�squeda utilizados) INVENES, EPODOC, WPI, BIOSIS, MEDLINE, EMBASE, USPTO PATENT DATABASE, GOOGLE ACADEMICO.

Informe del Estado de la T�cnica P�gina 2/5

OPINI�N ESCRITA

N� de solicitud: 201090079

Fecha de Realizaci�n de la Opini�n Escrita: 29.01.2013

Declaraci�n

Novedad (Art. 6.1 LP 11/1986)

Reivindicaciones Reivindicaciones 1-23 24-27 SI NO

Actividad inventiva (Art. 8.1 LP11/1986)

Reivindicaciones Reivindicaciones 1-23 24-27 SI NO

Se considera que la solicitud cumple con el requisito de aplicaci�n industrial. Este requisito fue evaluado durante la fase de examen formal y t�cnico de la solicitud (Art�culo 31.2 Ley 11/1986).

Base de la Opini�n.-

La presente opini�n se ha realizado sobre la base de la solicitud de patente tal y como se publica.

Informe del Estado de la T�cnica P�gina 3/5

OPINI�N ESCRITA

N� de solicitud: 201090079

1. Documentos considerados.-

A continuaci�n se relacionan los documentos pertenecientes al estado de la t�cnica tomados en consideraci�n para la realizaci�n de esta opini�n.

Documento

N�mero Publicaci�n o Identificaci�n Fecha Publicaci�n

D01

WO 03062439 A1 31.07.2003

D02

ZHANG Y. et al. Journal of Natural Gas Chemistry. 2008. Vol. 17, p�ginas: 103-109. 2008

D03

OJUMU TV. et al. African Journal of Biotechnology. 2004. Vol. 3(1), p�ginas: 18-24. 2004

D04

JIN SK. et al. Biochemical Engineering Journal. 2005. Vol. 23, p�ginas: 169-174. 2005

D05

SPIER MR. et al. Food Technology and Biotechnology. 2008. Vol. 46(2), p�ginas: 178-182. 2008
2. Declaraci�n motivada seg�n los art�culos 29.6 y 29.7 del Reglamento de ejecuci�n de la Ley 11/1986, de 20 de marzo, de Patentes sobre la novedad y la actividad inventiva; citas y explicaciones en apoyo de esta declaraci�n

La presente invenci�n divulga un procedimiento de obtenci�n de poli�steres biodegradables, polihidroxialcanoatos (PHA), empleando el residuo c�trico resultante del tratamiento de naranjas para la obtenci�n de zumo. El licor de prensa y/o las melazas c�tricas, pretratados, provenientes de la piel, pulpa y/o semillas, son utilizados como fuente de carbono, en un cultivo discontinuo, con o sin recirculaci�n de c�lulas, junto con la adici�n de nutrientes esenciales, as� como condiciones optimas de cultivo para inducir la producci�n de los polihidroxialcanoatos (reivindicaciones 1-23). Se refiere tambi�n a los polihidroxialcanoatos obtenidos por este m�todo y a composiciones u objetos s�lidos que los contienen (reivindicaciones 2427).

El documento D01 divulga un procedimiento de obtenci�n de poli�steres biodegradables, polihidroxialcanoatos (PHA) a partir de residuos org�nicos tratados con una poblaci�n microbiana acidog�nica que forma �cidos org�nicos de cuya polimerizaci�n resultan los polihidroxialcanoatos (ver p�gina 3, p�rrafo [0013] -p�gina 4, p�rrafo [0017]; p�gina 11, p�rrafo [0032] -p�gina 136, p�rrafo [0035]; reivindicaciones 1,4-6).

El documento D02 divulga un estudio sobre la bios�ntesis de poli-3-hidroxibutirato (PHB) de alto peso molecular a partir de un cultivo de Methylosinus trichosporium IMV3011, empleando metano y metanol como fuente de carbono y, �cido c�trico como potenciador de la formaci�n de PHB (ver p�gina 103, resumen).

El documento D03 divulga una revisi�n sobre la obtenci�n de polihidroxialcanoatos (PHA) a partir de fermentaciones de bacterias productoras, de estos pol�meros biodegradables, que son capaces de sintetizarlos y acumularlos en su organismo como un ahorro de energ�a, en condiciones adecuadas de cultivo (ver todo el documento).

El documento D04 divulga un estudio sobre la obtenci�n de poli(3-hidroxibutirato-co-4-hidroxibutirato) a partir de un cultivo de Ralstonia eutropha ATCC 17699, empleando fructosa y gamma-butirolactona como fuente de carbono y, acetato y propionato como estimuladores de la formaci�n del copol�mero (ver p�gina 169, resumen).

El documento D05 divulga un estudio sobre la obtenci�n de la enzima fitasa a partir del residuo c�trico resultante de naranjas empleadas para obtenci�n de zumo (ver p�gina 178, resumen).

1. NOVEDAD Y ACTIVIDAD INVENTIVA (Art. 6.1 y Art. 8.1 LP 11/1986)

La presente invenci�n divulga un procedimiento de obtenci�n de poli�steres biodegradables, polihidroxialcanoatos (PHA), empleando el residuo c�trico resultante del tratamiento de naranjas para la obtenci�n de zumo. El licor de prensa y/o las melazas c�tricas, pretratados, provenientes de la piel, pulpa y/o semillas, son utilizados como fuente de carbono, en un cultivo discontinuo, con o sin recirculaci�n de c�lulas, junto con la adici�n de nutrientes esenciales, as� como condiciones optimas de cultivo para inducir la producci�n de los polihidroxialcanoatos (reivindicaciones 1-23). Se refiere tambi�n a los polihidroxialcanoatos obtenidos por este m�todo y a composiciones u objetos s�lidos que los contienen (reivindicaciones 2427).

1.1. REIVINDICACIONES 1-23

El documento D01 se considera el m�s cercano al estado de la t�cnica ya que anticipa un procedimiento de obtenci�n de polihidroxialcanoatos (PHA) a partir de residuos org�nicos. La diferencia entre este documento y la presente invenci�n radica en el uso de residuos c�tricos que no se encuentra en D01 y en etapas del proceso que tampoco son coincidentes.

En consecuencia, seg�n lo divulgado en D01, las reivindicaciones 1-23 cumplen con el requisito de novedad y actividad inventiva (Art. 6.1 y Art. 8.1 LP11/1986).

Informe del Estado de la T�cnica P�gina 4/5

OPINI�N ESCRITA

N� de solicitud: 201090079

1.2. REIVINDICACIONES 24-27

La obtenci�n de polihidroxialcanoatos (PHA), a partir de cultivos de bacterias productoras de estos poli�steres biodegradables, es un proceso de sobra divulgado en el estado de la t�cnica. De hecho, los documentos D01-D04 anticipan procedimientos de obtenci�n de polihidroxialcanoatos (PHA) a partir de fermentaciones con diferentes cepas bacterianas y diversas fuentes de carbono.

Los procedimientos empleados, anticipados en el estado de la t�cnica, pueden ser diferentes, entre si y respecto al procedimiento reivindicado en la presente invenci�n, pero los productos obtenidos son los mismos.

La presente invenci�n se refiere a la obtenci�n de polihidroxialcanoatos (PHA) en general, no especificando ninguna caracter�stica t�cnica que pudiera ser relevante y, sin definir el tipo y/o estructura de los compuestos reivindicados que los pudiera diferenciar de los que se encuentran en el estado de la t�cnica; simplemente, se refiere a ellos como los PHA obtenidos por el procedimiento de la invenci�n.

En consecuencia, seg�n lo divulgado en D01 -D04, las reivindicaciones 24-27 no cumplen con el requisito de novedad y actividad inventiva (Art. 6.1 y Art. 8.1 LP11/1986).

El documento D05 se refiere al estado de la t�cnica y no se considera relevante en relaci�n con el objeto de la invenci�n.

Informe del Estado de la T�cnica P�gina 5/5