BRPI0802649A2 - derivados porfirìnicos, processo de obtenção e composição farmacêutica compreendendo os mesmos - Google Patents

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BRPI0802649A2
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Silva Baptista Mauricio Da
Fernandes Adjaci Uchoa
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Univ Sao Paulo
Fundacao Fapesp
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DERIVADOS PORFIRìNICOS, PROCESSO DE OBTENçãO E COMPOSIçãO FARMACêUTICA COMPREENDENDO OS MESMOS. A presente invenção pertence ao campo dos compostos derivados das porfirinas. Especificamente, os derivados da presente invenção são compostos fotossensíveis e podem ser utilizados na Terapia Fotodinâmica. O processo de preparo dos compostos da presente invenção compreende uma etapa final de metilação e opcionalmente compreende o uso de uma clorofilina como composto de partida uma clorofilina a qual é previamente submetida à uma etapa de remoção do metal/cobre. A invenção compreende ainda, composições farmacêuticas compreendendo tais compostos que pode ser utilizada no tratamento de doenças como o câncer, artrites reumatóides, psoríase dentre outras possíveis.

Description

Relatório Descritivo de Patente de Invenção
Derivados Porfirínicos, Processo de Obtenção e ComposiçãoFarmacêutica Compreendendo os Mesmos
5 Campo da Invenção
A presente invenção pertence ao campo dos compostos derivadosporfirínicos. Especificamente, os derivados da presente invenção sãocompostos anfifílicos fotossensíveis e podem ser utilizados na TerapiaFotodinâmica.
A presente invenção descreve ainda um processo de preparo doscompostos e composições farmacêuticas compreendendo tais compostos quepode ser utilizada no tratamento de doenças como o câncer, artritesreumatóides, psoríase dentre outras possíveis.
Antecedentes da Invenção
O efeito fotodinâmico refere-se à destruição do tecido vivo por luz visívelem presença de um fotossensibilizador (Fs) e de oxigênio. A energia luminosaé absorvida pelo Fs e transferida para o meio, gerando espécies reativas deoxigênio (ROS), incluindo oxigênio singleto e radicais, que causam danos àsbiomoléculas. A região espectral do FS afeta a atividade fotodinâmica. A regiãoespectral de 600nm a 900nm é chamada de janela terapêutica, uma vez queapresenta maior penetração em tecido vivo (Walker et al 2004, Kunz et al2007).
O uso deste efeito na medicina - Terapia Fotodinâmica (PDT do inglêsPhotodynamic Therapy) - é promissor para o tratamento de vários tipos decâncer, sendo uma alternativa cada vez mais utilizada em detrimento dostratamentos tradicionais (cirurgia, quimioterapia e radioterapia). Também outrasdoenças, tais como psoríase, artrite reumatóide sistêmica, degeneraçãomacular da retina, micoses fungóides, infestações bacterianas, verrugas,arteriosclerose e controle de doenças oportunistas relacionadas com AIDS, têmsido tratadas com PDT (Mccaughan 1999; Roberts e co-autores 1995; Bonnett,e co-autores 2001).Na década de 70, surgiram várias preparações de derivados porfirínicoslevando ao desenvolvimento de novos Fs e ao melhoramento do HpD,denominado Photofrin II (Potter e co-autores 1987). Em 1975 a PDT ganhouum novo impulso com os trabalhos de Dougherty e co-autores (1998). Nadécada de 80, o HpD foi otimizado, conseguindo sua aprovação em 1993 paratratamento do câncer por PDT pela FDA/EUA (Food and Drug Administration),sendo posteriormente aprovado em outros países: Canadá, Alemanha, França,Japão e Brasil.
A droga que foi aprovada para uso, Photofrin, tinha diversosinconvenientes: i) estrutura química indefinida; ii) pequena absorção na janelaterapêutica sendo necessário o uso de fontes luminosas intensas e de custoelevado como laser de corante; iii) mecanismo de ação baseado principalmentena destruição da vasculatura tumoral, levando à morte por hipóxia. Neste casoo próprio mecanismo de ação levava a diminuição da eficiência da terapia quenecessita de oxigênio, levando a recorrência freqüente; iv) custo elevadoestando restrita a poucos centros cirúrgicos no mundo que podiam dispor delasers de grande custo de aquisição e manutenção.
Essas deficiências levaram a uma intensa atividade de pesquisa nasdécadas de 80-90, na busca de Fs mais eficientes. Busca-se as seguintescaracterísticas: i) Absorção na janela foto-terapêutica (600-800 nm); ii)Características fotofísicas favoráveis: alto rendimento quântico de formação detripletes, de oxigênio singlete e pequena constante de supressão destes; iii)Baixa citotoxicidade no escuro; iv) Farmacocinética favorável e fácil eliminaçãopelo organismo, evitando fotossensibilidade prolongada; v) Formulaçãodefinida, permitindo estabelecer a relação entre a estrutura e a atividade; vi)Solubilidade em meio fisiológico, facilitando a aplicação da droga; vii)Facilidade de obtenção em escala industrial, com boa reprodutibilidade ecustos reduzidos; viii) Mecanismo de ação intracelular para evitar asrecorrências observadas com os protocolos que envolviam Photofrin.
O desenvolvimento de fotossensibilizadores mais eficientes propiciou autilização de equipamentos de iluminação mais simples e menos custosos doque os lasers de corante, incluindo lasers de diodo, diodos emissores de luz(LEDs do inglês light emitting diodes) e fontes não-coerentes (Tardivo e co-autores 2005). Muitas patentes na área de desenvolvimentos de novas fontesluminosas para PDT foram depositadas e concedidas.
Esse desenvolvimento possibilitou a expansão da técnica para diversosoutros países. Diversas outras moléstias tais como degeneração macular daretina, verrugas, psoríase controle de infecções bacterianas, fúngicas e virais,também têm sido tratadas com PDT (Mang 2004; Tardivo e co-autores, 2005).No entanto, mesmo com o grande desenvolvimento, a PDT ainda continuainviável para pacientes de baixa renda. Por exemplo, uma dose do Fs Foscan®,custa hoje em torno de EU 8.000,00. Desta forma, incluindo os custos doclínico e da fonte de luz, um tratamento de PDT usando Foscan não é realizadopor menos do que R$ 30.000,00. Este fato é de grande importância para umpaís como o Brasil com uma grande população de baixa renda, que poderia sebeneficiar deste tratamento. A busca do conhecimento dos mecanismos deação da PDT, o desenvolvimento de FSs mais eficientes e de fontes de luzacessíveis, podem e devem trazer benefícios para muitos pacientes, inclusivepacientes desprivilegiados monetariamente (Tardivo 2005; Tardivo et al 2006).
A maioria das drogas que estão sendo utilizadas em tratamentos decâncer por PDT ou que estão em testes clínicos em PDT são eficientesgeradoras de 1Ü2 e o mecanismo de ação destas moléculas depende dapresença de oxigênio. O 1Ü2 pode ser detectado por sua emissão característicade luz no Infravermelho próximo (NIR) que desenvolvemos para medir odecaimento radiativo do oxigênio singlete a 1270 nm (Engelmann e co-autores,2004; Araki e co-autores, 2003).
Um dos objetivos de pesquisa atual em PDT é o desenvolvimento desensibilizadores que destruam diretamente e especificamente organelascelulares, por exemplo mitocôndrias, de tumores e que atuem na presença e naausência de oxigênio. A mitocôndria é uma organela intracelular que apresentapotencial eletroquímico negativo (A,+'=-180mV). Os corantes positivos, porexemplo derivados das fenotiazinas, por serem relativamente lipofílicos epossuírem carga positiva, permeiam membranas e são atraídos pelo potencialnegativo das mitocôndrias, devendo atuar nesta organela (Gabrieli e co-autores2004; Tardivo e co-autores 2005; Tardivo, e co-autores 2006). Embora sejameficientes para causar morte cellular in-vitro as suas aplicações in-vivo sãoreduzidas devido a problemas de distribuição tecidual e redução para a formaleuco inativa. Uma estratégia que tem sido considerada para odesenvolvimento de novos Fs é a utilização de Fs anfifílicos (Engelmann ecolaboradores 2007). Este compostos exibem alta afinidade por lipoproteínasde baixa densidade (LDL) do sangue (Michels e co-autores 2003). Sabe-se quetecidos em metástase possuem alta concentração de receptores deste tipo delipoproteína (em comparação com células normais). Esta propriedade promoveum maior acúmulo de Fs porfirínicos em tecidos doentes (Jori e co-autores1984). A incorporação é um fator dependente da interação dofotossensibilizador com sistemas biológicos, tais como com membranas eorganelas. Porfirinas assimétricas, embora tenham excelente penetraçãocelular, localização mitocondrial e excelente atividade fotodinâmica, nãoapresentam absorção de luz adequada na janela terapêutica (Bonnett e co-autores 2001).
As porfirinas apresentam características óticas espectrais com fortestransições n-+n* na região dos 400 nm, conhecida com banda soret ou bandaB, e usualmente quatro bandas Q na região do visível, que são numeradas poralgarismos romanos, em ordem decrescente de energia. Interessantemente,dependendo das características estruturais algumas porfirinas podemapresentar banda Q intensa na janela terapêutica (600-900 nm)
A Cu2+-Clorofilina é uma porfirina tricarboxilada nas posições 131, 152 e173, apresenta uma banda Q intensa em 630nm. Cu2+-Clorofilina é precursorada clorofila a na síntese de Woodward (Woodward e co-autores 1990) comfacilidade de obtenção a baixo custo. Embora essa estrutura de substituição noanel forneça características favoráveis para PDT, sua utilização e de seusderivados não foi explorada até o momento em PDT.<formula>formula see original document page 6</formula>
Fórmula estrutural Cu 2+-clorofilina
A presente invenção refere-se ao método de obtenção, bem como, àsmoléculas com estruturas químicas novas derivadas desta síntese, que sãofotossensibilizadores anfifílicos derivados da Clorofilina. As novas moléculasobtidas apresentem características ideais para utilização em PDT, comoabsorção na janela terapêutica, eficiência de geração de oxigênio singlete,estrutura molecular assimétrica e que seja de fácil obtenção para viabilizarprotocolos de PDT de baixo custo.
A busca na literatura patentária apontou alguns documentos relevantesque serão descritos a seguir.
O documento WO 2002/098882 relata um método de obtenção dederivados de porfirinas solúveis em água que podem ser utilizados na terapiafotodinâmica. Especificamente o processo de obtenção destes compostoscompreende uma etapa de alcólise ácida para a formação de uma porfirinaácida e uma etapa seguinte de reação com uma amina orgânica hidrofílica emum meio que pode compreender água ou um solvente orgânico.
O documento WO 2007/104723 relata uma série de derivados dasporfirinas utilizados na terapia fotodinâmica cujo processo de preparocompreende uma etapa de reação com cianeto de potássio.
O documento US 5,250,668 relata uma série de derivados de porfirinasque compreendem um metal como átomo central.O documento US 4,988,808 relata uma série de derivados dabenzoclorina que compreendem um metal como átomo central. Opcionalmente,o metal central é substituído por 2 hidrogênios que se ligam à 2 nitrogênios.
O documento WO 1997/20846 relata uma série de porfirinas substituídasque compreendem um metal como átomo central. Opcionalmente, asmoléculas podem não compreender o átomo central e compreenderem 2hidrogênios que se ligam em 2 nitrogênios.
A presente invenção difere destes documentos por apresentarcompostos diferentes aos já descritos. Portanto, não foi encontrado naliteratura nenhum documento que antecipe ou sequer sugira as particularidadesda presente invenção.
As características espectroscópicas das clorofilinas foram aproveitadaspara sintetizar novos compostos. Inicialmente foi otimizada a maneira de extrairos íons cobre, seguido da funcionalização com compostos bi-funcionais paraformação de espécies polares nas posições periféricas. Este processoproporcionou compostos com propriedades fotofísicas favoráveis parautilização em PDT como deslocamento da banda Qiv, para 650 nm, altorendimento quântico de triplete e de oxigênio singlete, ligação mitocondrial einternalização celular favoráveis, e grande eficiência de morte celularfotoinduzida. Além da possibilidade de obter Fs que absorvam na janelaterapêutica, esta porfirina é tricarboxilada em um dos lados da molécula,oferecendo a possibilidade de modificações químicas para obter outros Fsassimétricos.
As novas moléculas obtidas apresentam características ideais parautilização em PDT, como absorção na janela terapêutica, eficiência de geraçãode oxigênio singlete, estrutura molecular assimétrica e que seja de fácilobtenção para viabilizar protocolos de PDT de baixo custo.
Sumário da Invenção
É objeto da presente invenção, derivados porfirínicos anfifílicos deacordo com a fórmula geral (I):<formula>formula see original document page 8</formula>
onde:
R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8 e R9 são, independentemente,escolhidos do grupo que compreende H, CH3, CH2-CH3, e (CH2)2;n é um número inteiro entre 1 e 20;
X é escolhido do grupo que compreende O, NH e S; eY é escolhido do grupo que compreende N(CH3)2, N+(CH3)3, S03H, S03",P03H, PO3-, SH,S",Si(0(CH2)nCH3, ácidos carboxílicos, carboidratos,aminoácidos, peptídeos, oligopeptídeos, nucleotídeos, ácidos nucléicos emistura dos mesmos.
Os derivados porfirínicos anfifílicos da presente invenção são compostosfotossensíveis que apresentam absorção entre 600 e 900 nm.
É um adicional objeto da presente invenção, um método de preparo dederivados porfirínicos anfifílicos que compreende as etapas de:
a) Desmetalação e esterificação de um composto porfirínico;
b) Hidrólise em meio ácido ou básico;
c) Formação de cloretos de acila; e
d) Reação com grupo funcional.
Opcionalmente, o processo de obtenção dos derivados porfirínicosanfifílicos pode compreender uma etapa posterior de purificação.
É ainda um objeto da presente invenção, uma composição farmacêuticacompreendendo:a) pelo menos um derivado anfifílico das porfirinas de fórmula geral (I)
<formula>formula see original document page 9</formula>
onde:
R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8 e R9 são, independentemente,escolhidos do grupo que compreende H, CH3, CH2-CH3, e (Chbh;
n é um número inteiro entre 1 e 20;
X é escolhido do grupo que compreende O, NH e S; e
Y é escolhido do grupo que compreende N(CH3)2, N+(CH3)3, S03H, S03",
P03H, P03-, SH,S",Si(0(CH2)nCH3, ácidos carboxílicos, carboidratos,aminoácidos, peptídeos, oligopeptídeos, nucleotídeos, ácidos nucléicos emistura dos mesmos.
b) um veículo farmaceuticamente aceitável
Opcinalmente, a composição farmacêutica pode compreender derivadosporfirínicos anfifílicos encapsulado em micelas, lipossomos, emulsões, dentreoutras formas possíveis de encapsulamento de compostos.
Numa realização preferencial, os compostos anfifílicos da presenteinvenção são utilizados na Terapia Fotodinâmica, no tratamento de câncer,psoríase, artrite reumatóide, micoses, degeneração macular da retina,infestações bacterianas, verrugas, arteriosclerose e no controle de doençasoportunistas com AIDS dentre outras possíveis tanto em humanos como emanimais.
Estes e outros objetos da invenção serão melhor compreendidos à luzdas Figuras, da Descrição Detalhada e dos Exemplos mostrados a seguir.
Breve Descrição das Figuras
A Figura 1 mostra o esquema reacional detalhado (B) para a obtençãodos derivados (compostos 5 e 6) de Cu2+-clorofilina (composto 1). Composto 1:cupro clorofilina de sódio; composto 5: ChINpNA: 8-vinil-13-etil-3,7,12,17-tetrametil-21 H,23H-porfine-18-[3-(dimetilamino)propil-3-carboxilato]-20-[3-(dimetilamino)propil-3-ilacetato]-2-[3-(dimetilamino)propil-3-propanoato];composto 6: ChINpNI: Triiodeto-S-vinil-IS-etil-S.T.^.IT-tetrametil^lH^SH-porfine-18-A/,/V,A/-trimetil-3-[(3-ilcarbonil)oxi]propan-1-aminium-20-A/,A/,A/-trimetil-3-[(3-ilacetil)oxi]propan-1-aminium-2-A/,A/,A/-trimetil-3-[(3-propanoil)oxi]propan-1-aminium onde 1 é HCI/MeOH, 2 é HCI/H2 O e 3 é CH3I/CH2CI2> a é ChINpN eb é ChINpNA.
A Figura 2 mostra os espectros de absorção em metanol de (A)ChlnpnA, (B) Chlnpnl e (C) Cu2+-clorofilina.
A Figura 3 mostra os espectros de fluorescência em metanol para (A)ChINpNA e (B) ChINpNI, excitados em 532 nm com fendas de 8 mm e Abs de0,04 em 532 nm.
A Figura 4 mostra o espectro de emissão de 102 obtido por excitação desolução metanólica de ChINpNA, excitado com laser em 532 nm, com 5mJ/pulso, 10 pulsos/segundo. Amostra com absorbância de 0,2 em 532 nm.
A Figura 5 mostra o log P0/a para os novos fotossensibilizadoresderivados de clorofilina: (A) ChlnpnA e (B) Chlnpnl em função do pH.
A Figura 6 mostra a comparação das taxas de incorporação dasmoléculas (1) ChINpNA, (2) ChINpNI e (3) HP IX a 20 uM em (A)106células.mL"1, (B) lipossomo aniônico de fosfatidicolina «Img.mL"1 e (C)mitocôndrias13mg.mL"1. Experimentos realizados em triplicata.
A Figura 7 mostra a fotocitoxicidade dos novos fotossensibilizadoresChINpNA (3) e ChINpNI (4), azul de Metileno (2) a 20 uM em células tipo HeLa,106 células.mL"1, irradiadas em 650 nm, com dose de 2,4 mJ.cm"2. O grupocontrole (1) compreende células sem a adição de qualquer composto.
Descrição Detalhada da Invenção
Os exemplos aqui descritos não tem a intenção de limitar a invenção,mas apenas de exemplificar uma das formas possíveis de concretizá-la.
Derivados anfifílicos das porfirinas
Os derivados porfirínicos anfifílicos da presente invenção são derivadosde fórmula geral (I):
<formula>formula see original document page 11</formula>
onde:
R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8 e R9 são, independentemente,escolhidos do grupo que compreende H, CH3, CH2-CH3, e (CH2)2-,n é um número inteiro entre 1 e 20;
X é escolhido do grupo que compreende O, NH e S; e
Y é escolhido do grupo que compreende N(CH3)2, N+(CH3)3, SO3H, SO3",PO3H, PO3-, SH,S",Si(0(CH2)nCH3, ácidos carboxílicos, carboidratos,aminoácidos, peptídeos, oligopeptídeos, nucleotídeos, ácidos nucléicos emistura dos mesmos.Os compostos preferenciais da presente invenção são compostos deacordo com a fórmula geral (I) onde R1, R4, R7 e R9 são CH3, R2, R5 e R8são H, R3 é CH2CH3, R6 é (CH2)2, X é NH, n é 3 e Y ser escolhido dentreN+(CH3)3 e N(CH3)2. Adicionalmente, os nitrogênios centrais da porfirina podemser metalados com zinco ou paládio.
Processo de preparo
O processo de preparo dos derivados porfirínicos compreende as etapasde:
a) Desmetalação e esterificação de um composto porfirínico;
A desmetalação pode ser realizada preferencialmente através de trêsdiferentes métodos: eliminação com ácido sulfúrico concentrado (método 1);eliminação com 30% ácido sulfúrico em ácido trifluoroacético (método 2) e umterceiro método (método 3), no qual a porfirina foi refluxada com HCI saturadoem metanol previamente seco.
Dependendo do método utilizado, a desmetalação já produz um derivadoesterificado, preferencialmente o éster metílico.
b) Hidrólise em meio ácido ou básico;
A hidrólise é feita de forma a regenerar as carboxilas das cadeiaslaterais do anel porfirínico, preparando-as para futuras substituições.
c) Formação de cloretos de acila; e
A formação dos respectivos cloretos de acila a partir das carboxilas temo intuito de facilitar a substituição nucleofílica no carbono carbonílico. Talreação é preferencialmente realizada com cloreto de oxalila, embora qualqueroutro reagente capaz de promover formação dos cloretos de acila.
d) Reação com grupo funcional de fórmula (II):
Z-(CH2)n-Y(ll)
onde:
n é um número inteiro entre 1 e 20;
Z é escolhido do grupo que compreende OH, NH2 e SH; eY é escolhido do grupo que compreende N(CH3)2, N+(CH3)3, S03H, S03",P03H, P03-, SH,S",Si(0(CH2)nCH3, ácidos carboxílicos, carboidratos,aminoácidos, peptídeos, oligopeptídeos, nucleotídeos, ácidos nucléicos emistura dos mesmos.
A reação com o respectivo grupo funcional dependerá da naturezadesse grupo, embora a reação seja uma substituição nucleofílica por natureza.
O grupo funcional pode adicionalmente sofrer reações subseqüentes com ointuito de promover a ionização de partes da molécula.
Exemplos de grupos funcionais incluem, mas não se limitam a diaminas.
Adicionalmente, o processo compreende uma etapa de metalação doanel porfirínico com zinco ou paládio. Tal metalação é realizada através deprocessos comumente conhecidos no estado da técnica.
Composição farmacêutica
Para efeitos desta invenção, por "composições farmacêuticas" entende-se toda e qualquer composição que contenha um princípio ativo, com finsprofiláticos, paliativos e/ou curativos, atuando de forma a manter e/ou restaurara homeostase, podendo ser administrada de forma tópica, parenteral, enterale/ou intratecal.
A expressão "farmaceuticamente aceitável" é empregada aqui para se
referir a compostos, materiais, composições, e/ou forma de dosagem que são,dentro do âmbito da medicina, apropriados para uso em contato com os tecidosde humanos e animais sem toxicidade excessiva, irritação, resposta alérgica,ou outro problema ou complicação, proporcional com uma relação razoável debenefício/risco.
A composição da presente invenção pode ser administrada em forma dedosagem oral, como tabletes, cápsulas (cada qual inclui a liberação sustentadaou formulações com tempo de liberação) pílulas, pós, granulados, elixires,tinturas, suspensões, xaropes, e emulsões. Eles podem ser administradossozinhos, mas geralmente serão administrados com um veículo farmacêuticoselecionado na base de rota de administração escolhida e da práticafarmacêutica padrão.Estes compostos podem ser veiculados superficialmente ou através deinjeção local ou através da via intravenosa. Devido a sua característica anfifílicapodem ser solubilizados em solução aquosa ou de solvente orgânico, napresença ou na ausência de agentes emulsionantes e lipossomos. Soluções oucomposições contendo o Fs nas concentrações de 0.00001 % a 10% do Fs.
Após o paciente ter recebido a aplicação do Fs, o local a ser tratadodeve ser irradiado com luz. Qualquer tipo de luz que seja absorvido pelo Fspode ser utilizada incluindo luz coerente monocromática de laser nas regiõesdo vermelho e do azul ou luz policromática incluindo fontes luminosas elétricasou LEDs.
As infermidades que podem ser tratadas são todas aquelas que seutilizam do princípio da PDT incluindo cânceres, combate a infecçõesmicrobianas e virais, degenerescência da mácula ligada a idade, bio-estimulação da pele e de folículos pilosos.
A composição farmacêutica da presente invenção compreende:
a) pelo menos um composto de acordo com a fórmula geral (I):
<formula>formula see original document page 14</formula>
onde:
R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8 e R9 são, independentemente,escolhidos do grupo que compreende H, CH3, CH2-CH3, e (CH2)2;n é um número inteiro entre 1 e 20;X é escolhido do grupo que compreende O, NH e S; eY é escolhido do grupo que compreende N(CH3)2, N+(CH3)3. S03H, S03",P03H, P03-, SH,S',Si(0(CH2)nCH3, ácidos carboxílicos, carboidratos,aminoácidos, peptídeos, oligopeptídeos, nucleotídeos, ácidos nucléicos emistura dos mesmos; e
b) um veículo farmaceuticamente aceitável;Adicionalmente, os nitrogênios centrais da porfirina podem sermetalados com zinco ou paládio.
Exemplo 1. Obtenção dos derivados porfirínicos anfifílicos
As metaloporfirinas de Cu2+ não formam estado triplete, pois o estado ,excitado apresenta tempo de vida curto devido a decaimentos não radiativosatravés dos níveis vibracionais dos orbitais d vazios do Cu2+, que éparamagnético liberam a energia absorvida na forma de calor. Portanto, asCu2+-porfirinas não são bons Fs para PDT e é necessário remover os íons Cu2+para obter estruturas com aplicação em PDT. A interação entre Cu2+ e o anelporfirínico é relativamente estável.
Nesta invenção, a desmetalação foi realizada através de três diferentesmétodos: eliminação com ácido sulfúrico concentrado (método 1); eliminaçãocom 30% ácido sulfúrico em ácido trifluoroacético (método 2) e um terceirométodo (método 3), no qual a porfirina foi refluxada com HCI saturado emmetanol previamente seco. Desta forma, a eliminação do Cu+2 foi acoplado àesterificação dos carboxilatos facilitando a transferência para um solventeorgânico e diminuindo a eficiência de re-metalação que ocorre em meioaquoso.
Os ensaios foram realizados com fração das amostras pré-purificadaspor partição em diclorometano. Os resultados (Tabela 1) mostram uma maiortaxa de eliminação do íon Cu2+ no procedimento de desmetalação com HCI emMeOH, sendo este processo superior à eliminação por ácido sulfúricoconcentrado e muito superior à desmetalação com 30% de ácido sulfúrico emácido trifluoroacético. Para que o processo de desmetalação fosse mais efetivo,este foi repetido por três vezes consecutivas e a amostra foi purificada porcromatografia em coluna: O processo global mostrou em torno de 80% derendimento.
Tabela 1: Comparação dos métodos de eliminação do íon Cu2+ de Cu2+-clorofilina
<table>table see original document page 16</column></row><table>
A trimetoxiclorofilina foi hidrolisada com HCI/H20 para a obtenção daclorofilina (reação B, Figura 1B). As carboxilas foram transformadas em cloretode ácido com cloreto de oxalila (reação C, Figura 1B). Em seqüência efetuou-se uma substituição do Cl por 3-Dimetilamino-1-propilamina para obtenção deChINpNA (reação D, Figura 1B), que foi metilada com CH3I para formação doquaternário ChINpNI (reação E, Figura 1B).
Os compostos foram purificados por cromatografia em coluna utilizandoalumina como fase estacionaria e um gradiente de diclorometano/metanolcomo eluente. O rf de 0,6 para ChINpNI foi determinado em TLC com gel desílica como suporte e diclorometano/metanol 20:1 como eluente.
Exemplo 2. Caracterização dos compostos formados
Os compostos sintetizados e purificados foram caracterizados porespectroscopia eletrônica (Uv-vis e fluorescência), vibracional infravermelhoFTIR, espectrométrica de massas, usando a técnica de spray de elétrons paraa ionização e RMN a 500 MHz. Os espectros de 1H e 13C foram determinadosusando as técnicas unidimensional e bidimensional, cosy e hetcorr (vide dadoscitados abaixo). Vale notar que devido a estes compostos apresentarem umaparte apoiar considerável (anel porfirínico) e as cargas estarem situadas todasdo mesmo lado e na periferia da molécula, estes apresentam característicasanfifílicas favoráveis para interação com membranas (Figura 1).ChINpNA: IV: C=0, 1661 cm'1, Massa: Pico base 648,7, para (C37H44N803)RMN de 1H (500 MHz CDCI3): SH 10,09 (s,1H, CH; 10) 9.67 (s,1H, CH; 20) 8.77( s, H, CH; 5) 7.99 (m, 1H, 31) 6.46-6.36 (m,2H, 32) 4,09 (2H, CH2, 151) 4,07(2H, CH2, 171) 3,58(2H, CH2> 172) 3.37-3.27 (3s, 12H, CH3, 21,71 e 121) 2,99-2,86 (m, OCNCH?CH?CH?N) 2.40(OCNCH7CH7CH?N) 2.131 e 2.132 (6s, 6CH3,-N(CH3)2) 1,64; 1,63 e 1.62(OCNCH?CH?CH2N) 1,56 (t, 3H,CH3, 82) -2.3(s, 2H,H-pirrol)
RMN de 13C (500 MHz CDCI3): 191,65; 185.04 e 173.35 (OCN) 58,45; 58,32 e58.13(CNCCCHZN(CH3)2) 45,45; 45,32; 45,23; 45,21 e 44,98 (6C, 6CH3,N(CH3)2) 31,08 (3C, OCNCH?CH?CH?N) 38,01(1C, CH2,151) 32,1(1C, CH2, 172)29,89 (OCNCH2DZl2CH2N(CH3)3) 25,96(C,CH2, 81) 22,87 (1C, CH2, 171)19,94; 14,46; 14,29; 12,20 (4C, CH3, 21, 82, 121 e 181) .
ChINpNI: IV C=0 1657 crrT1Massa: 1021 m/z para M- (31")RMN de 1H (500 MHz DMSO D6): ÔH 9.35 (s,1H, CH; 10) 9.02 (s,1H, CH; 5)8.48, 1H, CH; 20) 8,14-8,08(m, 1H, CH; 31) 6,12-6,08( m, 2H, 32) 4,21 (2H,CH2, 151) 4,02 (2H, CH2, 171) 3,43(2H, CH2, 81) 3,31(2H, CH2, 172) 3.39 (9s,9CH3, N+(CH3)3) 3,14; 3,12 e 3,10 (4s, 12H, CH3, 21,71 e 121) 3,09-3,07 (m,OCNÇHs) 2,90-2,77 (OCNCH2CH?CH2N) 2,06-1,78 (OCNCH2Ç_H2CH2N) 1,83 (t,3H,CH3, 82) -2.38(s, 2H, H-pirrol)
RMN de 13C (500 MHz DMSO D6): 172,49 e 161,48(OCN) 63,55; 63,41 e62,41 (CNCCCHZN(CH3)?) 52,49; 52,46; 52,44; 52,35; 52,32 e 52,30 (9C, 9CH3,N+(CH3)3) 36,25; 35,50 e 34,20 (3C, OCNCH?CH2CH2N) 35,25(1C, CH2,151)35,50(1C, CH2, 172) 22,97; 22,11 e 19,36 (OCNCH?CH2CH?N(CH3)3)22,87(1C, CH2, 171) 19,94(C,CH2, 81) 17,27; 14,18; 13,98 e 13,91 (4C, CH3, 21,82, 121 e 181).
Exemplo 2.1. Propriedades fotofísicas dos derivados anfifílicosporfirínicos obtidos.
Os espectros UV-vis dos derivados da clorofilina e o espectro docomposto de partida Cu2+-clorofilina estão apresentados na Figura 2. Quandocomparamos os espectros UV-vis observa-se um deslocamento para o azul dabanda soret, para os derivados ChlnpnA e Chlnpnl. A banda de 625 nm deCu2+-clorofilina foi deslocada para 651 nm em ChlnpnA e 650 nm em Chlnpnl.
Este deslocamento ocorreu devido à eliminação dos íons Cu2+. O máximo deabsorção dos compostos sintetizados está posicionado na janela terapêutica,justificando o grande potencial destes compostos de atuarem como eficientesFs para PDT. O espectro de fluorescência (Figura 3) mostra que ambos oscompostos, apresentam fluorescência na região de 630-680 com um pequenorendimento quântico de fluorescência de 1,4% e 1,3% para ChlnpnA e Chlnpnl,respectivamente. Estes rendimentos quânticos de fluorescência pequenossugerem grande eficiência de formação de espécies tripletes econsequementemente de formação de oxigênio singlete.
O espectro de emissão no Infravermelho próximo a partir dafotoexcitação de solução da ChINpNA apresenta máximo em 1270 nm,caracterizando a geração de oxigênio singlete (Figura 4). Espectrossemelhantes de oxigênio singlete foram obtidos através fotoexitação deChlnpnl. O 1Ü2 também foi caracterizado através do tempo de vida em metanol(~10 ^s) e o rendimento quântico foi determinado por comparação direta entrea intensidade do transiente emitido pelos novos compostos e do emitido porhematoporfirina IX (Hp IX), tomado com padrão (Tabela 2).
Os novos compostos atuam como bons fotossensibilizadores,conduzindo há um bom rendimento quântico de formação de oxigênio singlete(<j>A) acima de 50%. Vale ressaltar que estes compostos também absorvem najanela terapêutica, são de fácil obtenção e de baixo custo.
Tabela 2: Absorção em 532nm, intensidade de emissão em 1270nme rendimento quântico de formação de oxigênio singlete em metanol.
<table>table see original document page 18</column></row><table>Exemplo 3. Avaliação da ligação em membranas e em células dosderivados anfifílicos das porfirinas.
Outra propriedade fundamental dos Fs para serem eficientes em PDT éa interação com membranas. O parâmetro mais utilizado para avaliar a ligaçãoem membranas, é a partição octanol água, usualmente expresso na formalogarítimica (logPo/a). A variação do logPo/a em função do pH (Figura 5)mostra que os compostos ChINpNA e ChINpNI apresentam logPo/a entre -1.5e 1 em todos os pHs, o que é considerado ideal para aplicação in-vivo, sendoque o ChINpNA apresenta maior lipossolubilidade e ChINpNI é maishidrossolúvel.
Os ensaios de incorporação em lipossomo foram efetuados em pH 7,2.A Figura 6 apresenta as taxas de incorporação em lipossomos, mitocôndrias ecélulas. Os resultados mostram uma ótima taxa de incorporação para ambosos compostos ensaiados nos três sítios de incorporação. Em lipossomosChINpNA apresenta 28% de incorporação e ChINpNI 48%. mostrando que ocomposto catiônico (ChINpNI) tem uma afinidade superior com os lipossomosde cargas opostas e bastante superior ao observado para Hp IX (em torno de2,5%). A incorporação em mitocôndrias é semelhante para ambos oscompostos (58% de incorporação para ChINpNA e 61% para ChINpNI),provavelmente devido a protonação do derivado de amina no espaço entre-membranas das mitocôndrias. A incorporação em células é também bastanteexpressiva (11% para ChINpNA e 13% para ChINpNI), compado com 1,7%para a Hp IX. Foi determinada uma pequena tendência de maior incorporaçãodo ChINpNI em células e em mitocôndrias. De forma geral estes compostosapresentam características favoráveis à interação com sistemas biológicos,podendo ser incorporados em células e organelas e atraídos maisintensamente por sítios com potencial negativo, tais quais os das mitocôndrias.Os resultados de incorporação das porfirinas ChINpNA e ChINpNI são muitosuperiores do que os da HP IX.Exemplo 4. Avaliação da toxicidade e da fototoxicidade
A maneira de testar a real eficiência de um Fs para PDT é testar afototoxicidade em modelos celulares. A citotoxicidade e a fototoxicidade foramdeterminadas em células HeLa, em experimentos realizados em triplicatas. Nosexperimentos de citotoxicidade, não foi observada toxicidade significativa paraambas as drogas ensaiadas na concentração de 20 |aM, sendo que asdiferenças entre viabilidade das células incubadas com as drogas e as célulascontrole se encontram dentro do desvio padrão.
Para a determinação da fotocitotoxicidade, além do controle naausência do fotossensibilizador também foi realizada uma análise comparativacom azul de metileno, composto com fotocitotoxicidade conhecida. O azul demetileno foi tomado como referência, visto que é uma droga cuja atividade emPDT esta bem estabelecida e ambas as drogas (azul de metileno e asporfirinas aqui ensaiadas) podem ser irradiadas no mesmo comprimento deonda, permitindo uma comparação direta.
A incubação com azul de metileno e irradiação resultou em 88 % demorte celular com desvio padrão de 1 %. Para os novos Fs, observou-se 92%de morte celular com 3% de desvio padrão para ChINpNA (grupo funcionalamina) e 95% com desvio padrão de 1% para o composto catiônico, ChINpNI(Figura 7). Este dado bruto sugere que estes novos compostos apresentamfotoatividade semelhante à do Azul de metileno, o que já é um bom resultado,considerando que AM é já estabelecido como um bom Fs em PDT. No entanto,é importante comparar a quantidade de fótons absorvidas em cada situaçãopara poder comparar a eficiência quântica de morte celular de cada Fs. Pode-se estimar o fator de absorção (fração de luz absorvida por um meio qualquer,(a = 1-10"Abs) utilizando o e de cada composto, a percentagem de incorporaçãonas células e a concentração utilizada, que foi constante para todos os Fs eigual a 20\xM. O s do azul de metileno em 650nm é igual a 68000 M"1cm"1. O sdas porfirinas neste comprimento de onda é 3584 e 3797 para ChINpNI eChINpNA, respectivamente.
A fração de incorporação em células HeLa é 70% para AM (Oliveira,CS.Tese de Doutorado - Instituto de Química - Universidade de São Paulo2006.), 61% para ChINpNI e 58% para ChINpNA. Multiplicando-se a fração deincorporação pela concentração e pelo e, obtem-se os valores de absorção, eutilizando estes na equação 1 obtem-se os fatores de absorção que são 0,9para suspensão de células tratadas com AM; 0,09 para células tratadas comChINpNI e 0,09 para células tratadas com ChINpNA. Ou seja, as célulastratadas com as novas porfirinas absorvem 10 vezes menos fótons do queaquelas tratadas com AM. Conseqüentemente, as novas porfirinas induzemmorte celular muito mais freqüentemente por fóton absorvido. A razão destadiferença deve ser devido a diversos fatores, incluindo, citolocalização eeficiência fotodinâmica intracelular. Cabe mencionar que o AM pode serreduzido no ambiente celular, tendo atividade fotodinâmica diminuída, o quenão acontece com as porfirinas.
A rota sintética proposta forneceu novos compostos químicos comestrutura molecular inédita e com excelentes propriedades fotofísicas, deinteração com membranas e de fotoatividade, suplantando as deficiências deFs de baixo custo disponíveis. Espera-se assim que estes compostos possamser utilizados em diversas enfermidades tratáveis por PDT para o benefício dapopulação em geral.

Claims (14)

Derivados Porfirínicos, Processo de Obtenção e ComposiçãoFarmacêutica Compreendendo os Mesmos
1. Derivados porfirínicos caracterizados por compreenderem estrutura deacordo com a fórmula geral (I): <formula>formula see original document page 22</formula> onde:R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8 e R9 são, independentemente,escolhidos do grupo que compreende H, CH3, ch2-CH3, e (CH2)2;n é um número inteiro entre 1 e 20;X é escolhido do grupo que compreende O, NH e S; eY é escolhido do grupo que compreende N(CH3)2, N+(CH3)3, SO3H, SO3",PO3H, PO3-, SH,S",Si(0(CH2)nCH3, ácidos carboxílicos, carboidratos,aminoácidos, peptídeos, oligopeptídeos, nucleotídeos, ácidos nucléicos emistura dos mesmos.
2. Derivados, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por R1,R4, R7 e R9 serem CH3; R2, R5 e R8 serem H; R3 ser CH2CH3; R6 ser (CH2)2;X ser NH; n ser 3 e Y ser escolhido dentre N+(CH3)3 e N(CH3)2.
3. Derivados de acordo com as reivindicações 1 e 2 caracterizado pelofato dos nitrogênios centrais da porfirina serem metalados com zinco oupaládio.
4. Processo de obtenção de derivados porfirínicos caracterizado porcompreender as etapas de:a) Desmetalação e esterificação de um composto porfirínico;b) Hidrólise em meio ácido ou básico;c) Formação de cloretos de acila; ed) Reação com grupo funcional de fórmula (II):Z-(CH2)n-Y(ll)onde:n é um número inteiro entre 1 e 20;Z é escolhido do grupo que compreende OH, NH2 e SH; eY é escolhido do grupo que compreende N(CH3)2, N+(CH3)3, S03H, S03~,P03H, P03-, SH,S",Si(0(CH2)nCH3, carboidratos, aminoácidos, peptídeos,oligopeptídeos, nucleotídeos, ácidos nucléicos e mistura dos mesmos..
5. Processo, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pela etapade desmetalação ser realizada com ácido sulfúrico concentrado.
6. Processo, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pela etapade desmetalação ser realizada com aproximadamente 30% ácido sulfúrico emácido trifluoroacético.
7. Processo, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pela etapade desmetalação ser realizada com refluxo de HCI saturado em metanol.
8. Processo, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelaformação de cloretos de acila ser realizada com cloreto de oxalila.
9. Processo, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo grupofuncional possuir estrutura onde Z é NH2, n é 3 e Y é N(CH3)2.
10. Processo, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado porcompreender uma etapa adicional de metalação do anel porfirínico com zincoou paládio.
11. Composição farmacêutica caracterizada por compreender:a) pelo menos um composto de acordo com a fórmula geral (I):<formula>formula see original document page 24</formula>onde:R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8 e R9 são, independentemente,escolhidos do grupo que compreende H, CH3, CH2-CH3, e (CH2)2;n é um número inteiro entre 1 e 20;X é escolhido do grupo que compreende O, NH e S; eY é escolhido do grupo que compreende N(CH3)2, N+(CH3)3, S03H, SO3",PO3H, PO3-, SH,S",Si(0(CH2)nCH3, ácido carboxílico, carboidratos,aminoácidos, peptídeos, oligopeptídeos, nucleotídeos, ácidos nucléicos emistura dos mesmos; eb) um veículo farmaceuticamente aceitável;
12. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 11,caracterizada por R1, R4, R7 e R9 serem CH3; R2, R5 e R8 serem H; R3 serCH2CH3; R6 ser (CH2)2; X ser NH; n ser 3 e Y ser escolhido dentre N+(CH3)3 eN(CH3)2.
13. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 11,caracterizada pelo fato dos nitrogênios centrais da porfirina serem metaladoscom zinco ou paládio.
14. Uso de um composto de acordo com a fórmula geral (I):<formula>formula see original document page 25</formula> onde:R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8 e R9 são, independentemente,escolhidos do grupo que compreende H, CH3, CH2-CH3, e (CH2)2;n é um número inteiro entre 1 e 20;X é escolhido do grupo que compreende O, NH e S; eY é escolhido do grupo que compreende N(CH3)2, N+(CH3)3> S03H, S03",P03H, P03-, SH,S",Si(0(CH2)nCH3, carboidratos, aminoácidos, peptídeos,oligopeptídeos, nucleotídeos, ácidos nucléicos e mistura dos mesmos; namanufatura de um medicamento para terapia fotodinâmica.14. Uso, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato dosnitrogênios centrais da porfirina serem metalados com zinco ou paládio.
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