BRPI0802690A2

BRPI0802690A2 - proteÍna recombinante do fator ix de coagulaÇço sanguÍnea humana, composiÇço, uso de uma proteÍna recombinante do fator ix, uso de uma composiÇço, mÉtodo de obtenÇço de proteÍna recombinante do fator ix de coagulaÇço sanguÍnea humana e uso da mesma

Info

Publication number: BRPI0802690A2
Authority: BR
Inventors: Aparecida Maria Fontes; Dimas Tadeu Covas
Original assignee: Fundacao Hemoct De Ribeirao Pr; Univ Sao Paulo
Priority date: 2008-05-30
Filing date: 2008-05-30
Publication date: 2010-03-02

Abstract

PROTEÍNA RECOMBINANTE DO FATOR IX DE COAGULAÇçO SANGUÍNEA HUMANA, COMPOSIÇçO, USO DE UMA PROTEÍNA RECOMBINANTE DO FATOR IX, USO DE UMA COMPOSIÇçO, MÉTODO DE OBTENÇçO DE PROTEÍNA RECOMBINANTE DO FATOR IX DE COAGULAÇçO SANGUÍNEA HUMANA E USO DA MESMA. A presente invenção refere-se a uma proteína recombinante mutada do fator IX de coagulação sanguínea humana e a uma composição que a contém. A presente invenção trata ainda do uso da proteína ou composição da invenção para a fabricação de um medicamento para tratar hemofilia B. Adicionalmente, a presente invenção refere-se ao método de obtenção de uma proteína recombinante mutada do fator IX de coagulação sanguínea humana. Ainda outro objeto da presente invenção é a proteína recombinante mutada obtida pelo método aqui descrito, e seu uso para preparar um medicamento para o tratamento de hemofilia B.

Description

"PROTEÍNA RECOMBINANTE DO FATOR IX DE COAGULAÇÃOSANGÜÍNEA HUMANA, COMPOSIÇÃO, USO DE UMA PROTEÍNARECOMBINANTE DO FATOR IX, USO DE UMA COMPOSIÇÃO, MÉTODODE OBTENÇÃO DE PROTEÍNA RECOMBINANTE DO FATOR IX DECOAGULAÇÃO SANGÜÍNEA HUMANA E USO DA MESMA"

Campo da Invenção

A presente invenção refere-se a uma proteína recombinante dofator IX (FIX) de coagulação sangüínea humana.

Adicionalmente, a presente invenção refere-se ao método deobtenção da mencionada proteína recombinante e seu uso para preparar ummedicamento para o tratamento de hemofilia B.

Antecedentes da InvençãoA hemofilia B é uma doença hereditária causada pela deficiênciado fator IX de coagulação sangüínea no plasma sangüíneo. Clinicamente, estadoença apresenta muitas similaridades com a hemofilia A, isto é, o pacienteapresenta freqüentes episódios de sangramento, na maioria das vezes emregiões muco-cutâneas, músculo-esquelético e em tecidos moles. Osangramento pode ocorrer também em outros espaços críticos como, porexemplo, no espaço intracranial ou retroperitoneal, o qual pode ser fatal.

O fator IX de coagulação sangüínea, ou globulina anti-hemofílicaB, é um dos fatores de coagulação do sangue. É uma proteína solúvel queforma a matriz de fibrina de um coágulo de sangue.

Produtos de FIX derivado de plasma humano foramrotineiramente utilizados na técnica para tratar indivíduos com hemofilia B.

Concentrados de FIX com baixa atividade específica e baixa pureza foramdesenvolvidos há mais de 30 anos, e o uso destes concentrados aumentou aduração e qualidade de vida das pessoas com hemofilia B. No entanto, estesprodutos infectaram os pacientes com vírus da hepatite B (HBV), vírus dahepatite C (HCV) e vírus da imunodeficiência humana (HIV). Os concentradosde fator IX utilizados continham ainda protrombina, fator VII, e fator, X, e seuuso para tratar hemofilia B gerou trombose em alguns pacientes, geralmenteatribuída ao acúmulo ou demora de liberação destas proteínas dependentes devitamina K, ativadas e não-ativadas.

Desta forma, anos depois, foram desenvolvidos novosconcentrados de FIX derivados de plasma, altamente purificados, quesubstituíram os primeiros concentrados, sem apresentar o problemarelacionado à trombose. No entanto, os novos concentrados, mesmo altamentepurificados, ainda apresentavam o inconveniente de contaminar os pacientescom diversos vírus, como o vírus da hepatite B (HBV), vírus da hepatite C(HCV) e vírus da imunodeficiência humano (HIV).

Os inconvenientes relacionados aos concentrados derivados deplasma, purificados ou não, estimularam as tentativas no desenvolvimento deprodutos recombinantes de FIX para uso em pacientes com hemofilia B.

O gene que codifica a proteína do FIX situa-se na região 27.1 dobraço longo do cromossomo X (Xq27.1) e apresenta uma extensão de 33.5 Kb(Camerino, G., Grzeschik, K.H., Jaye, M., De La Salle, H., Tolstoshev, P.,Lecocq, J.P., Heilig, R., and Mandei, J.L. (1984). Regional localization on thehuman X chromosome and polymorphism of the coagulation factor IX gene(hemophilia B locus). Proc Natl Acad Sei U S A 81, 498-502). O RNA relativo aoFIX é composto por 2802 nucleotídeos, possuindo uma pequena região 5' não-traduzida (29 nucleotídeos), a região entre o códon iniciador e o códon detérmino (1383 nucleotídeos), e uma longa região 3' não-traduzida (1390nucleotídeos) (Kurachi, K., and Davie, E.W. (1982). Isolation andcharacterization of a cDNA coding for human factor IX. Proc Natl Acad Sei U SA 79, 6461-6464.) e (Yoshitake, S., Schach, B.G., Foster, D.C., Davie, E.W.,and Kurachi, K. (1985). Nucleotide sequence of the gene for human factor IX(antihemophilic factor B). Biochemistry 24, 3736-3750).

A proteína deduzida da seqüência de nucleotídeos do cDNA doFIX contém 461 aminoácidos, onde os primeiros vinte e sete aminoácidosrepresentam a seqüência peptídica sinal. Após a remoção da seqüênciapeptídica sinal, a proteína é submetida a uma segunda clivagem, o que resultana remoção dos resíduos cisteína -19 a arginina -1, e os outros 404aminoácidos constituem a forma madura da proteína do FIX de coagulaçãosangüínea humana. Além da remoção das seqüências pré e pró-peptídica, ofator IX, antes de sua secreção, apresenta 05 outras modificações pós-traducionais, entre eles: v-carboxilação; (3-hidroxilação; glicosilação; sulfataçãoe fosforilação. Estas modificações têm a finalidade de que a proteína atinja odobramento adequado, para que sua secreção e o seu funcionamento sejamapropriados, tornando-a biologicamente ativa se necessário (Kaufman, RJ.(1998). Post-translational modifications required for coagulation factor secretionand function. Thromb Haemost 79, 1068-1079.); ( White, G.C., 2nd, Pickens,E.M., Liles, D.K., and Roberts, H.R. (1998). Mammalian recombinantcoagulation proteins: structure and function. Transfus Sei 19, 177-189).

Assim, a complexidade das modificações pós-traducionais dofator IX conduziram os pesquisadores a focarem seus estudos iniciais nainvestigação da linhagem celular mais apropriada para a produção do fator IXbiologicamente ativo.

Desta forma, FIX recombinante foi desenvolvido na técnica,representando uma fonte livre de patógenos do fator IX. O FIX recombinante datécnica é produzido a partir de linhagens de células de mamífero não-humanas,particularmente, linhagem de célula de ovário de hamster chinês, livre destesagentes infecciosos.

No processo de produção de FIX recombinante, a linhagemcelular não-humana é transfectada com DNA complementar (cDNA) quecodifica FIX humano.

Os primeiros estudos utilizaram vetores plasmidiais convencionaise o sistema viral vaccinia. Nesses estudos, o FIX foi produzido em diferenteslinhagens celulares, entre elas, de hepatoma de rato (H4-11-E-C3) e fibroblasto(LM-TK), rim (BHK) e ovário (CHO) de camundongo. A análise do FIXrecombinante presente no sobrenadante destas culturas celulares mostrou quenão foi possível a produção do fator IX biologicamente ativo na linhagem defibroblasto de camundongo, o que levou aos autores sugerirem a ausência deum sistema v-carboxilase eficiente nesta linhagem celular (Anson, D.S.; Austen, D.E.; Brownlee, G.G. (1985). Expression of active human clotting factorIX from recombinant DNA clones in mammalian cells. Nature, 315, 683-5). Poroutro lado, nas demais linhagens, a presença de fator IX biologicamente ativofoi diagnosticada, e ainda um aumento de pelo menos 2 vezes no nível de fatorIX ativo após a adição de vitamina K ao meio de cultura. Entretanto, em todosos casos, os níveis de rFIX foram inferiores à quantidade de fator IX presenteno plasma (1 lU/mL = 5 ug/mL) (de Ia Salle, H., Altenburger, W., Elkaim, R.,Dott, K., Dieterle, A., Drillien, R., Cazenave, J.P., Tolstoshev, P., and Lecocq,J.P. (1985). Active gamma-carboxylated human factor IX expressed usingrecombinant DNA techniques. Nature 316, 268-270), (Busby, S., Kumar, A.,Joseph, M., Halfpap, L, Insley, M., Berkner, K., Kurachi, K., and Woodbury, R.(1985). Expression of active human factor IX in transfected cells. Nature 316,271-273).

O mesmo não ocorreu com o uso da linhagem celular CHO-dhfr-,que permitiu a amplificação do gene de interesse após a seleção com a drogametotrexato e resultou em um nível de rFIX de cerca de 20 vezes superior aonível de fator IX presente no plasma (100 ug/mL), na presença de vitamina K,embora somente 2% da proteína seja funcional (1,5 ug/mL/24 h) (Kaufman,R.J., Wasley, L.C., Furie, B.C., Furie, B., and Shoemaker, C.B. (1986).Expression, purification, and characterization of recombinant gamma-carboxylated factor IX synthesized in Chinese hamster ovary cells. J Biol Chem261, 9622-9628).

Em conjunto, estes estudos demonstram a importância davitamina K como um co-fator do fator IX, bem como a importância dodesenvolvimento de estratégias de seleção que permitam a expressão estávele duradoura do FIX recombinante (rFIX) no meio de cultura.

Adicionalmente, desenvolveram-se no estado da técnica, outrossistemas de expressão, em particular, sistema de expressão adenoviral eretroviral, o que resultou na geração de novas linhagens celularesrecombinantes produtoras de FIX (Gordon, E.M., Tang, H., Salazar, R.L., andKohn, D.B. (1993). Expression of coagulation factor IX (Christmas factor) inhuman hepatoma (HepG2) cell cultures after retroviral vector-mediated transfer.Am J Pediatr Hematol Oncol 15, 196-203), ( Miao, C.H., Ohashi, K., Patijn, G.A., Meuse, L, Ye, X., Thompson, A.R., and Kay, M.A. (2000). Inclusion of thehepatic locus control region, an intron, and untranslated region increases andstabilizes hepatic factor IX gene expression in vivo but not in vitro. Mol Ther 1,522-532).

Esses estudos mostram que o sistema retroviral é um sistema apropriado para a produção do FIX recombinante e permite a geração delinhagens celulares com expressão estável e duradoura de rFIX.

Um exemplo de molécula recombinante comercialmentedisponível é a BeneFIX, fabricada por Genetics Institute, Inc., USA,desenvolvida para o tratamento de hemofilia B. Essa molécula foi licenciada em1997 e estima-se que o número de indivíduos portadores de hemofilia B quepuderam ter acesso à forma recombinante do fator IX é cerca de 6500pessoas.

A hemofilia B é uma doença genética que afeta 1 em cada 20.000nascimentos masculinos em todo o mundo. No Brasil, estima-se a existência de1000 hemofílicos B cadastrados e dados do Ministério da Saúde mostram queo tratamento dos mesmos é com o fator IX concentrado derivado do plasma.

O produto recombinante tem sido fabricado em apenas algumasregiões por uma única empresa e isso leva a uma carência no fornecimento doproduto.

Adicionalmente, observou-se que o fator IX recombinanteproduzido por linhagens não-humanas, pode levar o paciente a desenvolveranticorpos neutralizadores de atividade (inibidores).

Desta forma, o alto custo do fator IX recombinante, sua limitadaquantidade disponível no mercado e a possibilidade de desenvolver anticorposinibidores, são fatores que têm incentivado os pesquisadores aodesenvolvimento de novas formulações de rFIX, tornando-o mais acessível apopulação de hemofílicos B e mais clinicamente eficazes e viáveis.

Descrição Resumida da Invenção

A partir de um aprofundado estudo dos mecanismos molecularesque governam a expressão do gene que codifica a proteína do FIX, bem comoa caracterização bioquímica minuciosa da proteína do FIX, a Depositanteconseguiu desenvolver uma nova molécula recombinante do FIX, produzida emelevados níveis a partir de linhagens celulares humanas.

A molécula da presente invenção, além de ser produzida emníveis elevados, apresenta atividade biológica aumentada e não apresenta oinconveniente de induzir o desenvolvimento de anticorpos inibidores, uma vezque é produzida a partir de linhagem celular humana.

Ainda, a proteína FIX da invenção oferece vantagens em relaçãoàs proteínas obtidas por linhagens celulares murinas, em se tratando deproteínas complexas que apresentam muitas modificações pós-traducionaisdurante sua síntese no organismo humano.Assim, a presente invenção refere-se a uma proteínarecombinante do fator IX de coagulação sangüínea humana, que apresentauma mutação na posição 359, onde o aminoácido ácido aspártico (D) ésubstituído por valina (V), sendo que a proteína recombinante é produzida porlinhagens humanas.

Outro objeto da presente invenção é uma composição quecompreende a proteína recombinante do fator IX mutada da presente invenção.

A presente invenção refere-se ainda ao uso da proteínarecombinante mutada aqui descrita, ou da composição que a contém, para a fabricação de um medicamento para tratar hemofilia B.

A presente invenção tem também por objeto um método deobtenção de uma proteína recombinante do fator IX de coagulação sangüíneahumana mutada, em que o método compreende:

a) isolamento e purificação do fator IX de coagulação sangüíneahumano;

b) inserção de sítios de restrição e substituição do aminoácidoácido aspártico na posição 359 por valina;

c) introdução da molécula de fator IX obtido pela etapa (b) em umvetor;

d) transfecção de células humanas com o vetor obtido pela etapa (c);

e) tratamento da cultura de células humanas com concentraçõescrescentes de antibiótico;

f) cultivo das culturas recuperadas; e

g) recuperação do fator IX recombinante obtido pelasmencionadas culturas.

Adicionalmente, a presente invenção tem por objeto a proteínarecombinante do fator IX de coagulação sangüínea humana mutada, obtidapelo método acima, e ao uso desta proteína para a fabricação de ummedicamento para o tratamento de hemofilia B.

Breve Descrição das Figuras

A figura 1 ilustra a clonagem do cDNA relativo ao fator IX no vetorplasmidial retroviral pLXIN através de gel de agarose 1% corado com brometode etídeo, após a eletroforese. Raia 1: clone recombinante antes da digestão.Raia 2: DNA pLXIN-FIX após a digestão com as enzimas de restrição Hpal +BamHI resultando em dois fragmentos: 6,1kb referente ao vetor e 1,3 kbreferente ao cDNA do fator IX. Raia M1: marcador de peso molecular 1 kb(fragmentos: 10.0; 8.0; 6.0; 5.0; 4.0; 3.0; 2.0; 1.5; 1.0; 0.5) e Raia M2: OX-174(fragmentos 1.3; 1.0; 0.8; 0.6; 0.2 kb).

A figura 2 ilustra o seqüenciamento do cDNA relativo ao fator IXda presente invenção, clonado no vetor pLXIN, demonstrando a presença damutação mutação na posição 1243 A->T do cDNA relativo ao Fator IXconduzindo a substituição de um ácido aspártico na posição 359 por umavalina (D359V).

A figura 3 ilustra esquematicamente a proteína recombinanteFIXD359vLXIN de coagulação sangüínea humana da presente invenção.

A figura 4 ilustra o vetor retroviral pLXIN portador do cDNArelativo ao fator IX da presente invenção entre os sítios de restrição Hpal eBamHI.

A figura 5 ilustra a estratégia para a produção do fator IXrecombinante da presente invenção nas linhagens celulares humanas HepG2 eHek293 utilizando o sistema retroviral.

A figura 6 ilustra a análise da atividade biológica do fator IX decoagulação sangüínea humana da presente invenção em 2 linhagens celulareshumanas HepG2 e Hek293. Essas linhagens celulares mostraram níveis deexpressão do FIX da ordem de 9 a 11 lU/mL conforme avaliado pelo teste deativação parcial de protrombina.

A figura 7 ilustra a expressão do mRNA relativo ao fator IXrecombinante da invenção nas linhagens celulares Hep-G2/FIXD359vLXIN eHek293- FIXD359vLXIN. Á esquerda: Raia M1: DNA do fago OX-174 (fragmentos1.3; 1.0; 0.8; 0.6; 0.2 kb). Raia C: controle positivo da reação de PCR. Nasraias 1 a 4 foram utilizados os "primers" do FIX, e as raias 5 a 8 representam asmesmas amostras de 1 a 4 utilizando os "primers" da B-actina. As Raias 1 e 3representam as linhagens celulares Hep-G2 virgem e /-/ep-G2/FIXD359vLXIN,respectivamente, mostrando a ausência do mRNA do FIXD359vLXIN na célulavirgem e a presença do mesmo na célula recombinante. As raias 2 e 4representam os controles negativos das reações 1 e 3 (ausência da enzimatranscriptase reversa). As raias 5 e 7 mostram a presença do mRNA endógenoda B-actina tanto na linhagem celular virgem como recombinante. Os controlesnegativos das respectivas reações estão nas raias 6 e 8 (ausência da enzimatranscriptase reversa). Raia M2: marcador de peso molecular 1 kb (fragmentos:10.0; 8.0; 6.0; 5.0; 4.0; 3.0; 2.0; 1.5; 1.0; 0.5). À direita: Raia M1: DNA do fagoOX-174. Nas raias 1 a 4 foram utilizados os primers do FIX, e as raias 5 a 8representam as mesmas amostras de 1 a 4 utilizando os primers da B-actina.As Raias 1 e 3 representam as linhagens celulares Hek-293 virgem e Hek-293/FIXd359vLXIN, respectivamente, mostrando a ausência do mRNA do rFIXna célula virgem e a presença do mesmo na célula recombinante. As raias 2 e4 representam os controles negativos das reações 1 e 3 (ausência da enzimatranscriptase reversa). As raias 5 e 7 mostram a presença do mRNA endógenoda p-actina tanto na linhagem celular virgem como recombinante. Os controlesnegativos das respectivas reações estão nas raias 6 e 8 (ausência da enzimatranscriptase reversa). A raia C- representa o controle negativo da reação dePCR.

A figura 8 ilustra a expressão de rFIX pelas Linhagens CelularesHep-G2/FIXD359vLXIN e Hek293- FIXD359vl-XIN após a seleção com geneticina,mostrando a análise por citometria de fluxo da percentagem de célulasexpressando a proteína FIXD359vLXIN (que representa a proteína recombinantemutada da presente invenção). (A) gráfico "dot plot SSCXFSC mostrando otamanho e complexidade das células HepG2 virgens; (B) gráfico "dor plof%GFP X SSC mostrando a ausência de FIX na célula HepG2 virgem; (C)gráfico dot plot das células HepG2/FIXD359vLXIN marcadas com anti-FIX-FITCmostrando que após a seleção com o antibiótico obteve-se uma populaçãocelular recombinante em que 46% das células expressam a proteínaFIXD359VLXIN. (D) gráfico "dot plot' SSCXFSC mostrando o tamanho ecomplexidade das células Hek-293 virgens; (E) gráfico "dor plot' %GFP X SSCmostrando a ausência de rFIX na célula Hek-293 virgem; (F) gráfico dot plotdas células Hek-293/FIXD35gvl-XIN marcadas com anti-FIX-FITC mostrando queapós a seleção com o antibiótico obteve-se uma população celularrecombinante em que 21% das células expressam a proteína rFIX.

A figura 9 ilustra a análise da expressão da proteína doFIXD359vLXIN no sobrenadante das células recombinantes Hep-G2/FIXD359vLXIN e Hek293/ FIXd359vLXIN e ausência do mesmo nas célulasvirgens. À esquerda: análise da linhagem celular HepG2/FIX-LXIN. Raia 1:

Controle positivo - FIX derivado do plasma (1,5 ug/uL - Octanyne®). Raia 2:Hep-G2 virgem (15 ug) e Raia 3: Hep-G2/FIXD3s9vLXIN+ (15 ug). Primeiro - gelcorado com Coomassie e ao lado - autoradiograma do western blot após aimunodetecção utilizando o anticorpo anti-FIX. À direita análise da linhagemcelular Hek-293/FIX-LXIN. Raia 1: Controle positivo - FIX derivado do plasma(1,5 ug/uL- Octanyne®). Raia 2: Hek-293 virgem (15 ug) e Raia 3: Hek-293/FIXD359vLXIN+ (15 ug). Primeiro - gel corado com Coomassie e ao lado -autoradiograma do western blot após a imunodetecção utilizando o anticorpoanti-FIX. Observa-se uma banda imunoreativa do tamanho esperado de 57 kDana célula produtora de rFIX e no controle positivo e a ausência da mesma nacélula virgem. O marcador peso molecular LMW (fragmentos 97, 66, 45, 30 e20 kDa.

Descrição Detalhada da Invenção

Em uma primeira realização, a presente invenção refere-se a umaproteína recombinante do fator IX de coagulação sangüínea humana, queapresenta uma mutação na posição 359, onde o aminoácido ácido aspártico(D) é substituído por valina (V), sendo que a proteína recombinante é produzidapor linhagens humanas.

Dentro de uma realização particular da presente invenção, aslinhagens celulares humanas são selecionadas entre linhagens hepáticas erenais. De preferência, as linhagens humanas utilizadas pelo presenteinvenção para a obtenção de uma proteína recombinante do fator IX decoagulação sangüínea humana mutada são HepG2 e Hek293.

A proteína recombinante do fator IX de coagulação sangüíneahumana mutada (D359V) da presente invenção é produzida em níveis elevadose apresenta atividade biológica aumentada, sendo apropriada para uso notratamento de hemofilia B.

A presente invenção trata ainda de uma composição quecompreende a proteína recombinante do fator IX da presente invenção eveículos, excipientes ou estabilizantes farmaceuticamente aceitáveis. Acomposição farmacêutica de acordo com a presente invenção pode ser líquida,semi-sólida ou sólida e podem ser adaptadas para qualquer rota deadministração enteral ou parenteral, seja de liberação imediata ou modificada.

Em realização particular, dita composição farmacêutica é adaptada paraadministração oral, mais particularmente na forma de comprimidos, cápsulas,tinturas, emulsões, lipossomas, microcápsulas ou nanoparticulas.

Veículos, excipientes ou estabilizantes adequados à invençãosão, por exemplo, e sem qualquer limitação, aqueles citados na obraRemington's Pharmaceutical Sciences, da editora americana Mack Publishing,ou ainda na Farmacopéia Européia ou Farmacopéia Brasileira.

Em outro aspecto, a presente invenção trata do uso da proteínaFIX recombinante mutada da invenção, ou de composições que a contêm, paraa preparação de medicamentos para tratar hemofilia B.

Em outra realização, a presente invenção refere-se a um métodode obtenção de uma proteína recombinante do fator IX de coagulaçãosangüínea humana mutada, em que o método compreende:a) isolamento e purificação do fator IX de coagulação sangüíneahumano;

b) inserção de sítios de restrição e substituição do aminoácidoácido aspártico na posição 359 por valina (D359V);

c) introdução da molécula de fator IX obtido pela etapa (b) em um vetor;

d) transfecção de células humanas com o vetor obtido pela etapa (c);

f) cultivo das culturas recuperadas; e

g) recuperação do fator IX recombinante obtido pelasmencionadas culturas.

De acordo com um aspecto preferencial da presente invenção, aetapa (b) do método acima é realizada através de PCR utilizando primers específicos portadores de sítios de restrição. De preferência, os sítios derestrição inseridos são Hpa I e Bam Hl.

A etapa (c) é realizada particularmente a partir da digestão damolécula da etapa (b) com endonucleases específicas, preferencialmente Hpa Ie Bam Hl, e ligação da molécula assim tratada ao DNA do vetor linearizadocom as mesmas enzimas de restrição.

Em uma realização preferencial, o vetor utilizado pela presenteinvenção é um vetor retroviral, particularmente, plasmidial retroviral. De acordocom uma realização preferencial, o vetor utilizado é pLXIN.

De acordo com outro aspecto da presente invenção, a transfecçãodas células humanas com o vetor obtido pela etapa (c)vpode ser realizada porqualquer método conhecido na técnica. Particularmente, a transfecção érealizada através do método de eletroporaçãoParticularmente, o método da presente invenção apresenta doissistemas de produção de retrovírus para aumentar o título viral. Primeiramente,o FIX é transfectado em células produtoras de retrovírus ecotrópicas. Naseqüência, o retrovírus produzido pelas células mencionadas acima étransduzido em linhagens de células anfotrópicas. Por fim, a célula humana é então transduzida com o retrovírus produzido pela linhagem anfotrópica.

Ainda, o antibiótico utilizado pela presente invenção para otratamento das culturas transfectadas pode ser qualquer um apropriado noestado da técnica, desde que o vetor utilizado contenha um gene de resistênciapara o mesmo. De forma particular o antibiótico utilizado é geneticina, semexcluir qualquer outro sistema de seleção adequado

Conforme descrito acima, a seleção das culturas transduzidas, érealizada a partir de tratamento crescente com antibiótico. De acordo com apresente invenção, as doses de antibiótico utilizadas na primeira seleção(baixas doses) estão compreendidas entre 400 e 600 ug/mL, e as doses deantibiótico utilizadas na segunda seleção (altas doses) estão compreendidasentre 1.000 e 2.000 ug/mL.

O cultivo das células é realizado sob condição padrão, podendoser determinado pelo técnico no assunto dependendo do tipo de linhagemcelular utilizada. Particularmente, o cultivo é realizado a uma temperatura de37°C e 5% de C02.

Ainda, a recuperação do fator IX recombinante mutado obtido pelométodo da presente invenção pode ser realizada por qualquer métodoconhecido na técnica.

O método da presente invenção permite obter proteínas FIXrecombinantes humanas mutadas em altos níveis, sendo que as proteínasapresentam alta atividade biológica e não apresentam os inconvenientesapresentados pelas proteínas recombinantes da técnica.

De acordo com uma realização adicional, a presente invençãorefere-se à proteína recombinante do fator IX mutada obtida pelo métododescrito acima, apresentando uma substituição de aminoácido ácido asparticoda posição 359 por valina.

Ainda outro objeto da presente invenção refere-se ao uso da proteína obtida pelo método da presente invenção na preparação de ummedicamento para tratar hemofilia B.

A presente invenção pode ser compreendida de forma mais clarae precisa através da leitura dos exemplos a seguir, que ilustram a presenteinvenção sem apresentar qualquer caráter limitativo.

Exemplos

Exemplo 1

Obtenção de vetor contendo a molécula do Fator IX mutante

O clone recombinante portador de seqüências de cDNA relativasao fator IX nomeado 7-5A2 foi isolado e purificado após quatro rastreamentosconsecutivos de uma biblioteca de cDNA de fígado humana, utilizando comosonda o clone plasmidial pMac-FIX, gentilmente cedido pelo Prof. Dr. MarceloBrígido da UnB. Em seguida, esse clone foi submetido à reação de PCRutilizando primers específicos portadores dos sítios para as enzimas derestrição Hpa I + Bam Hl em suas extremidades, e um fragmento de tamanhoesperado de 1,4 kb foi obtido. Após a purificação desse fragmento de DNA, foirealizada a digestão com endonucleases específicas (Hpa I + Bam Hl) e omesmo submetido à ligação ao DNA plasmidial retroviral pLXIN linearizadocom as mesmas enzimas de restrição, conforme demonstrado pela figura 1.

Em seguida, a seqüência do cDNA relativa ao fator IX clonado novetor pLXIN foi submetida ao seqüenciamento, o que mostrou a presença damutação D359V no domínio catalítico da proteína (cadeia pesada), ilustrado pelafigura 2. O desenho esquemático da proteína recombinante FIXd359vLXIN decoagulação sangüínea humana da presente invenção pode ser verificado na figura 3.

Exemplo 2

Produção de FIX mutante a partir de Linhagens Humanas

As linhagens celulares humanas HepG2 e Hek293 foram transduzidas com o vetor retroviral pLXIN-FIX o btido pelo exemplo! Após otratamento com concentrações crescentes de geneticina, foi realizada a análise daatividade biológica do fator IX presente no sobrenadante dessas linhagenscelulares. A figura 5 mostra a estratégia utilizada para a geração de linhagenscelulares humanas com expressão estável do fator IX de coagulação sangüínea humana, e elevados níveis do mesmo. Após a seleção das linhagens celularesrecombinantes HepG2-FIXD359vLXIN e Hek293- FIXD359vLXIN, foi realizado oensaio do tempo de tromboplastina parcial ativada (aPTT), que permitiu mostrarque ambas linhagens celulares expressam níveis do fator IX de coagulaçãosangüínea humana da presente invenção, de 9 a 11 vezes superiores ao nível defator IX presente no plasma sangüíneo (figura 6), e ao fator IX recombinanteproduzido pelas linhagens murinas descritas no estado da técnica.

Exemplo 3

Avaliação do nível de produção da molécula recombinante da invençãopelas linhagens celulares humanas HEPG2 e HEK293

A avaliação do nível de produção da molécula recombinante FIX-LXIN pelas linhagens celulares humanas HepG2 e Hek293 pode ser realizadapor RT-PCR convencional; citometria de fluxo, ensaio de tempo detromboplastina parcial ativada (aPTT) e western blot.

RT-PCR convencional

A avaliação por RT-PCR convencional, ilustrada pela figura 7,permitiu diagnosticar a presença do mRNA relativo ao fator IX de coagulaçãoda presente invenção nas linhagens celulares recombinantes HepG2-FIXD359vLXIN e Hek293-FIXD359vLXIN, utilizando o seguinte procedimento: érealizada a extração de RNA total utilizando o kit RNAsy Mini kit (Quiagen), deacordo com as instruções do fabricante. Em seguida, 1 a 3 ug de RNA total éconvertido em cDNA, utilizando o kit Superscript II (Invitrogen), conforme asinstruções do fabricante, e 50 pmoles dos oligonucleotídeos específicos (P5 eP3) Posteriormente, o fragmento de DNA relativo ao fator IX da invenção éamplificado em uma mistura reacional que contém: 2 uL do cDNA, 0,2 M dedNTPs; 1 U da enzima Taq DNA polimerase (Amershan Bioscience), 2,5 uL dotampão 10x da respectiva enzima (Amershan Bioscience) e 10 pmoles de cadaoligonucleotídeo P3FIX5seq e P5FIX3seq. Essa reação foi realizada em termociclador com o programa: 95°C por 2min; 35 ciclos de 95°C por 40s, 55°Cpor 40s e 72°C por 1 min; 72°C por 10min.

Citometria de fluxoPara marcação intracelular da proteína do fator IX recombinantemutado da presente invenção, cerca de 1x106 de células HepG2/F/X-LX7/V eHek-293/F/X-LX7A/ são fixadas com paraformaldeído 1% (m/v) durante 20minutos a 4°C e, em seguida, permeabilizadas com Tween 0,5% por 15minutos a 37°C. Após a etapa de lavagem com PBS-BSA 2%, as células sãoincubadas com solução de bloqueio (soro de cabra 10%) por 1 hora a 37°C. Aseguir, é colocado o anticorpo primário monoclonal anti-fator IX diluído emsolução PBS-BSA 2% (1:100), por aproximadamente 24 horas a temperaturaambiente. Em seguida, é realizada a lavagem com PBS-BSA 2% e as célulassão incubadas com o anticorpo secundário diluído em solução PBS-BSA 2%(1:400), durante 45 minutos em temperatura ambiente. Após este período, érealizada uma segunda lavagem com PBS 1X, e as células são eluídas emIOOjxL de PBS 1X, para posterior análise de emissão de fluorescência pelascélulas recombinantes por de citometria de fluxo. A quantificação da emissãode fluorescência foi realizada com uma suspensão celular utilizando 10.000 eventos (células) em citômetro de fluxo laminar (FACSort, Beckton Dickinson,San Jose, CA,EUA).

A avaliação por citometria de fluxo mostrou que as populaçõescelulares recombinantes, HepG2-FIXD359vLXIN e Hek-293-FIXD359vLXIN,apresentam expressão estável do FIX da ordem de 46% e 21%,respectivamente, conforme ilustrado pela figura 8.

Ensaio de tempo de tromboplastina parcial ativada f aPTT)

A avaliação da atividade biológica é realizada pelo teste de tempode tromboplastina parcial ativada (aPTT), ilustrado pela tabela 1.

Tabela 1

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O teste da coagulação aPTT, mede a velocidade in vitro que umaamostra de plasma contendo o FIX leva para coagular uma amostra de plasmadeficiente em FIX. O parâmetro medido é o tempo necessário para a atividadeprotrombínica, sendo assim, o tempo levado para coagulação varia de acordocom a concentração de FIX presente na amostra a ser analisada. Na presenteinvenção, a amostra a ser testada foi diluída 1:10 em tampão (Owren's Veronal- Biomérieux) e, depois de 20 segundos, misturada com o plasma deficiente emFIX humano (Biomérieux, Durham), fosfolipídeos e um ativador de contato(Platelin® LS - Biomérieux). Depois da incubação por aproximadamente 240segundos a 37°C, 100 uL de cloreto de cálcio (CaCI2 0,25M) foi adicionado, e otempo para a formação do coágulo foi marcado utilizando o coagulômetroautomático (COAG-A-MATE® XM - Organon Teknika), de acordo com asinstruções do fabricante. Antes de iniciar a dosagem, uma curva de calibraçãopadrão foi construída utilizando FIX derivado do plasma (Verify - Referenceplasma - (Organon Teknika, Durham), reconstituído com 1ml_ de águadestilada e diluído para concentração de (1 U ml_ FIX). Seis diluições (1:5;1:10; 1:20; 1:40; 1:80; 1:160) são realizadas em tampão (Owrens Veronal -Biomérieux), e usadas para construção da curva para cada amostra. Umarelação linear foi traçada em um gráfico, com atividade de FIX em escalalogarítima (abscissa) e o tempo de tromboplastina parcialmente ativa(segundos), e a porcentagem de atividade de FIX calculada foi obtida com amédia da inclinação da curva.

A tabela 1 mostra a análise da atividade biológica do FIX presenteno sobrenadante das duas populações celulares HepG2/FIXD35gVLXIN e Hek-293/FIXd359vLXIN através do teste aPTT. Pode-se observar que as populaçõescelulares recombinantes portadoras do FIX após o tratamento com geneticina,apresentam níveis de atividade biológica de FIX da ordem de 9 a 11 vezes aonível de fator IX presente no plasma sangüíneo.

Western Blot

A caracterização da proteína FIXD359VLXIN, produzida pelaslinhagens celulares HepG2/FIXd359vLXIN e Hek-293/FIXD359vLXIN, foi realizadapor western blot.

Para o preparo do gel, 7 ml_ de sobrenadante são coletados de1x107 células HepG2/FIX-LXIN e Hek-293/FIX-LXIN, e submetidos aconcentração em colunas Centrícon® Amicon® (Millipore), por centrifugação à7500 rpm durante 2 a 4 horas. Em seguida, é realizada uma lavagem,utilizando 3 ml de H20 MHHQ autoclavada, por centrifugação à 6000 rpm.Posteriormente, as colunas foram invertidas para eluição das amostras emaproximadamente 150 ul de H20 MHHQ autoclavada, e centrifugadas à 6000rpm durante 15 minutos. Após a eluição da proteína, as amostras sãoquantificadas em um espectrofotômetro pelo Método de Bradford.

Para a realização do Western Blot, as amostras foram submetidasà eletroforese utilizando o sistema Phast System. Cerca de 10 uL da amostra(30 ug) foram misturadas com 10 pi do tampão de amostra (10 mM Tris-HCI,pH 8,0; 2,5% SDS (m/v); 1 mM EDTA; 0,01% (v/v) de azul de bromofenol), e1,5 pi de p-mercaptoetanol (Sigma). A mistura é submetida ao aquecimento eaplicada no gel. A eletroforese é realizada em tampão de corrida para oPhastGel (SDS Buffer - Amersham Biociences) a 100 V, duranteaproximadamente 40 minutos. Dois géis, exatamente idênticos, são submetidosà eletroforese, um para ser corado e outro para a transferência. Após aeletroforese, o gel a ser corado é incubado por 1 hora em solução fixadora(etanol 40% (v/v), ácido acético 10% (v/v), água estéril qsp 0,125L) e,posteriormente, corado com solução de azul brilhante de Coomassie (1,3%ácido fosfórico (v/v), 0,75 M (NH4)2 S04, 0,1% Coomassie B-Blue G250 (v/v)),durante 18 horas. Em seguida, o gel é lavado de 3 a 5 vezes com água MilliQ,e montado entre duas folhas de papel celofane para a completa secagem.

Após a eletroforese, as proteínas contidas no gel de poliacrilamidasão transferidas para uma membrana de nitrocelulose, pelo método de eletro-transferência semi-seca com o aparelho Phast System - Amersham Biociences,conforme as instruções do fabricante. A eletroforese é realizada em tampão detransferência (0,25 M de Tris-Base; 0,96 M de glicina; 0,5% SDS (sódioduodecil sulfato); água estéril qsp 1L) a 90 V, durante aproximadamente 2horas e 30 minutos. Concluída a transferência a membrana é preparada paraimunodetecção.

A membrana de nitrocelulose é submetida ao bloqueio de sítiosinespecíficos pela adição da solução de bloqueio TBS-T (10 mM Tris pH 7,5, 150mM NaCI, 0,1% Tween-20), em 5% de leite em pó (m/v), por cerca de 16 horas.Após o bloqueio, a membrana é lavada rapidamente 2 vezes com TBS 1X, 0,1%Tween-20, e incubada com anticorpo primário monoclonal (QED), diluído emsolução TBS-T (1:800) durante 2 horas à temperatura ambiente, e sob agitaçãoconstante. Em seguida, é realizada a lavagem da membrana com TBS 1X, 0,1%Tween-20 (2X / 15 minutos; 3X / 5 minutos), e a membrana é incubada com oanticorpo secundário diluído em solução TBS-T (1:3000), durante 1 hora. Após aincubação com o segundo anticorpo, a membrana é lavada novamente e inicia-se o procedimento de detecção. Para a detecção, é utilizado o "kit ECL Westernblotting" (Amersham Biosciences), conforme instruções do fabricante.Finalmente, a membrana é exposta ao filme de raio-X por 15 segundos e arevelação é realizada em máquinas automáticas da KODAK.

Conforme ilustrado pela figura 9, pode-se observar uma bandaimuno-reativa do tamanho esperado de 57 kDa, referente à proteína do fator IXde coagulação sangüínea humana, presente nos sobrenadantes das célulasrecombinantes FIXD359V e a ausência da mesma nas células HepG2 e Hek-293 virgens.

Como bem compreendem os técnicos no assunto, são possíveisnumerosas modificações e variações da presente invenção à luz dosensinamentos acima, sem se afastar do seu escopo de proteção, conformedelimitado pelas reivindicações anexas.

Claims

1. PROTEÍNA RECOMBINANTE DO FATOR IX DECOAGULAÇÃO SANGÜÍNEA HUMANA, caracterizada pelo fato de quecompreende uma substituição do aminoácido ácido aspártico na posição 359,porvalina.

2. PROTEÍNA, de acordo com a reivindicação 1,caracterizada pelo fato de que é obtida por linhagens celulares humanas.

3. PROTEÍNA, de acordo com a reivindicação 2,caracterizada pelo fato de que as linhagens celulares são humanas renais ouhepáticas.

4. PROTEÍNA, de acordo com a reivindicação 3,caracterizada pelo fato de que a linhagens celulares humanas são HepG2 eHek293.

5. COMPOSIÇÃO, caracterizada pelo fato de quecompreende a proteína recombinante do fator IX, conforme descrita em umadas reivindicações 1 a 4, e veículos, excipientes ou estabilizantesfarmaceuticamente aceitáveis.

6. USO DE UMA PROTEÍNA RECOMBINANTE DO FATORIX, conforme descrita em uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fatode que é na preparação de um medicamento para tratar hemofilia B.

7. USO DE UMA COMPOSIÇÃO, conforme descrita nareivindicação 5, caracterizado pelo fato de que é na preparação de ummedicamento para tratar hemofilia B.

8. MÉTODO DE OBTENÇÃO DE PROTEÍNARECOMBINANTE DO FATOR IX DE COAGULAÇÃO SANGÜÍNEA HUMANA,caracterizado pelo fato de que compreende:a) isolamento e purificação do fator IX de coagulação sangüíneahumano;b) inserção de sítios de restrição e substituição do aminoácidoácido aspártico na posição 359 por valina (D359V);c) introdução da molécula de fator IX obtido pela etapa (b) em umvetor;d) transfecção de células humanas com o vetor obtido pela etapa(c);e) tratamento da cultura de células humanas com concentraçõescrescentes de antibiótico;f) cultivo das culturas recuperadas; eg) recuperação do fator IX recombinante obtido pelasmencionadas culturas.

9. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 8, caracterizadopelo fato de que a etapa (b) é realizada através de PCR utilizando primersespecíficos portadores de sítios de restrição.

10. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 9, caracterizadopelo fato de que os sítios de restrição são Hpa I e Bam Hl.

11. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 8, caracterizadopelo fato de que o vetor é retroviral.

12. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 11, caracterizadopelo fato de que o vetor é pLXIN.

13. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 8, caracterizadopelo fato de que a transfecção das células humanas com o vetor obtido pelaetapa (c) ser realizada através de eletroporação.

14. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 8, caracterizadopelo fato de apresentar dois sistemas de produção de retrovírus: (1) o FIX étransfectado em células produtoras de retrovírus ecotrópicas e (2) o retrovírusproduzido pelas células ecotrópicas é transduzido em linhagens de célulasanfotrópicas.

15. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 8, caracterizadopelo fato de que as doses crescentes de antibiótico da etapa (e) estãocompreendidas entre 400 a 600 ug/mL na primeira seleção (baixas doses) eentre 1000 a 2000 ug/mL na segunda seleção (altas doses).

16. PROTEÍNA RECOMBINANTE DO FATOR IX DECOAGULAÇÃO SANGÜÍNEA HUMANA, caracterizada pelo fato de que éobtida a partir do método conforme descrito em uma das reivindicações 8 a 15e contém uma substituição de aminoácido ácido aspártico da posição 359 porvalina.

17. USO DE UMA PROTEÍNA RECOMBINANTE DO FATORIX, conforme descrita na reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que é napreparação de um medicamento para tratar hemofilia B.