BRPI0805767A2 - proteÍna recombinante do fator viii de coagulaÇço sanguÍnea humana, composiÇço, uso de uma proteÍna recombinante do fator viii, uso de uma composiÇço, mÉtodo de obtenÇço de uma proteÍna recombinante do fator viii de coagulaÇço sanguÍnea humana e uso da mesma - Google Patents

Abstract

A presente invenção refere-se a uma proteína recombinante do fator VIII de coagulação sanguínea humana e a uma composição que a contém. A presente invenção trata ainda do uso da proteína ou composição da invenção para a fabricação de um medicamento para tratar hemofilia A. Adicionalmente, a presente invenção refere-se ao método de obtenção de uma proteína recombinante do fator VIII de coagulação sanguínea humana.Ainda outro objeto da presente invenção é a proteína recombinante obtida pelo método aqui descrito, e seu uso para preparar um medicamento para o tratamento de hemofilia A.

Description

"PROTEÍNA RECOMBINANTE DO FATOR Vlll DE COAGULAÇÃOSANGÜÍNEA HUMANA, COMPOSIÇÃO, USO DE UMA PROTEÍNARECOMBINANTE DO FATOR VIII, USO DE UMA COMPOSIÇÃO, MÉTODODE OBTENÇÃO DE UMA PROTEÍNA RECOMBINANTE DO FATOR Vlll DECOAGULAÇÃO SANGÜÍNEA HUMANA E USO DA MESMA"

Campo da Invenção

A presente invenção refere-se a uma proteína recombinante dofator Vlll (FVIII) de coagulação sangüínea humana, a uma composição que acontém e seus usos para preparar um medicamento para o tratamento dehemofilia A.

Adicionalmente, a presente invenção refere-se ao método deobtenção de uma proteína recombinante do fator Vlll (FVIlI) de coagulaçãosangüínea humana.

Antecedentes da Invenção

A hemofilia A é uma doença recessiva ligada ao sexo, causadapela deficiência do fator Vlll de coagulação sangüínea no plasma.

Os pacientes com hemofilia A podem, freqüentemente, apresentarhematomas. Ainda, são comuns hemartroses (sangramento nas articulações)nos tornozelos, joelhos, quadris e cotovelos. Elas são freqüentementedolorosas, e episódios repetidos podem levar à destruição da sinóvia e àdiminuição da função articular. Sangramentos intracranianos também sãocomuns, podendo levar à morte de hemofílicos.

O fator Vlll (FVIII) é um procofator glicoproteína sintetizado eliberado na corrente sangüínea pelo endotélio vascular. No sangue circulante,ele é principalmente ligado ao fator de von Willebrand (vWF) para formar umcomplexo estável. Na cascata da coagulação o fator Vllla se associa com ofator IXa (fator Vllla:fator IXa), o qual converte o fator X em fator Xa. Esteúltimo se associa ao complexo protrombinase (fator Va:fator Xa) o que resultana conversão da protrombina em trombina (lia). A trombina, por sua vez exibeatividades procoagulantes, convertendo o fibrinogênio em fibrina, promovendoativação plaquetária e ativando o fator Xlll da coagulação, que, por sua vez,estabiliza o coágulo de fibrina.

Produtos de FVIII derivado de plasma humano foramrotineiramente utilizados na técnica para tratar indivíduos com hemofilia A.

Concentrados de FVIII foram desenvolvidos, e o uso destes concentradosaumentou a duração e qualidade de vida das pessoas com hemofilia A. Noentanto, estes produtos infectaram os pacientes com vírus da hepatite B (HBV),vírus da hepatite C (HCV) e vírus da imunodeficiência humana (HIV).

Os inconvenientes relacionados aos concentrados derivados deplasma, purificados ou não, estimularam as tentativas no desenvolvimento deprodutos recombinantes de FVIII, para uso em pacientes com hemofilia A.

Desta forma, no início dos anos 90, companhias farmacêuticasiniciaram o desenvolvimento de produtos com o fator Vlll sintéticorecombinante (rFVIII).

O gene que codifica a proteína do FVIII situa-se na região 28 dobraço longo do cromossomo X (Xq28) e apresenta uma extensão de 186 Kbcom uma estrutura bastante complexa (Poustka A, Dietrich A, Langenstein G,Toniolo D, Warren ST and Lehrach H. "Physical map of human Xq27-qter:Iocalizing the region of the fragile X mutation". Proc Natl Acad Sci USA1991;88:8302-6). O RNA relativo ao FVIII é composto por 9010 nucleotídeos,possuindo uma pequena região 5' não-traduzida (150 nucleotídeos), a regiãoentre o códon iniciador e o códon de término (7056 nucleotídeos), e uma longaregião 3' não-traduzida (Wood Wl, Capon DJ, Simonsen CC, Eaton DL,Gitschier J, Keyt B1 Seeburg PH, Smith DH, Hollingshead P, Wion KL and et al."Expression of active human factor Vlll from recombinant DNA clones". Nature1984;312:330-7).A proteína deduzida da seqüência de nucleotídeos do cDNA doFVIII contém 2351 aminoácidos, onde os primeiros dezenove aminoácidosrepresentam a seqüência peptídica sinal, e os outros 2331 aminoácidos aproteína madura. Esta proteína apresenta três domínios nomeados de A (330aminoácidos), B (980 aminoácidos) e C (160 aminoácidos) sendo trêsrepetições do domínio A, duas do domínio C e um único domínio B. Essesdomínios apresentam a seguinte disposição: A1-A2-B-A3-C1-C2, sendo acadeia pesada constituída pelos domínios A1-A2-B e a cadeia leve pelosdomínios A3-C1-C2.

Como é conhecido por um técnico no assunto, quanto maior amolécula a ser produzida, menor será o rendimento, e mais difícil será amanipulação da mesma.

Desta forma, a complexidade e grande tamanho do fator Vlllconduziram os pesquisadores a focarem seus estudos iniciais na investigaçãodas condições (como linhagem celular e vetor) mais apropriadas para aprodução do fator Vlll biologicamente ativo.

Os primeiros vetores plasmidiais que permitiram a expressão doFVIII recombinante em células de mamíferos apresentavam as característicasbásicas dos vetores de expressão, entre eles, uma região promotora (promotorSV40 ou adenovirus-2) e um sinal de poliadenilação (do gene que codifica oantígeno de superfície do virus da hepatite). Nesses estudos iniciais, foirealizada a clonagem e expressão do rFVIII completo em linhagens celularesde murinos (COS e 62.2 - linhagem celular derivada de rim de hamster chinês),e os níveis de atividade biológica do fator Vlll presente no sobrenadantedessas culturas celulares foram da ordem de 0,01 lU/ml (Wood Wl, Capon DJ,Simonsen CC, Eaton DL, Gitschier J, Keyt B, Seeburg PH, Smith DH,Hollingshead P, Wion KL and et al. "Expression of active human factor Vlll fromrecombinant DNA clones". Nature 1984;312:330-7) e (Toole JJ1 Knopf JL,Wozney JM1 Sultzman LA, Buecker JL1 Pittman DD, Kaufman RJ1 Brown E1Shoemaker C, Orr EC and et al. "Molecular cloning of a cDNA encoding humanantihaemophilic factor". Nature 1984;312:342-7).

Em seguida, Pavirani et al. (Pavirani A, Meulien P, Harrer H, DottK1 Mischler F, Wiesel ML1 Mazurier C, Cazenave JP e Leeoeq JP. "Twoindependent domains of factor Vlll co-expressed using recombinant vacciniaviruses have procoagulant activity". Biochem Biophys Res Commun1987;145:234-40) propuseram duas modificações para a produção do fator VIII:o uso de vetores virais e a co-transfecção da cadeia pesada com a cadeia leve,uma vez que é conhecido na técnica que o domínio B não é necessário para aatividade biológica do fator VIII. Nesse estudo, a análise da atividade biológicado fator Vlll completo ou após a co-infecção das cadeias pesadas e leve dofator Vlll produzido em células BHK foi da ordem de 0,1 lU/mL ou 0,01 lU/mL,respectivamente.

Posteriormente, foram realizadas construções recombinantescontendo o cDNA relativo ao fator Vlll em quatro diferentes vetores virais, entreeles, vetores adenovirais, adeno-associados, retrovirais e lentivirais. Nestesestudos, ensaios funcionais do fator Vlll recombinante presentes em diferenteslinhagens celulares demonstraram níveis de atividade biológica bastantevariável, conforme a linhagem celular e o tipo de vetor. Por exemplo, linhagenscelulares transfectadas com vetores adeno-associados mostraram níveis deatividade biológica da ordem de 0,02-0,08 lU/mL (Chão H, Mao L, Bruce ATand Walsh CE. Sustained expression of human factor Vlll in mice using aparvovirus-based vector. Blood 2000;95:1594-9), enquanto que linhagenstransfectadas com vetores adenovirais portadores de rFVl11 mostraram níveisde atividade biológica entre 0,25-3,15 lU/mL (Andrews JL1 Weaver L, Kaleko Mand Connelly S. Efficient adenoviral vector transduction and expression offunctional human factor Vlll in cultured primary human hepatocytes.Haemophilia 1999;5:160-8). Ainda, estudos utilizando culturas primárias evetores retrovirais, mostraram a geração de uma população portadora de rFVIIIcom níveis de atividade biológica entre 0,3-0,7 lU/mL . (Van Damme A1 ChuahMK1 Deiraccio F1 De Bari C1 Luyten F1 Collen D and VandenDriessche T. Bonemarrow mesenchymal cells for haemophilia A gene therapy using retroviralvectors with modified long-terminal repeats. Haemophilia 2003;9:94-103).

É importante ressaltar que os mencionados vetores utilizados nosestudos realizados no estado da técnica são monocistrônicos, ou seja,permitem a expressão de um único mRNA a partir da região promotora, e nãoapresentam um gene marcador de seleção. Desta maneira, nesses casos, aexpressão e atividade do rFVIII é investigada transitoriamente, entre 24 e 72horas após a transfecção.

No entanto, há aproximadamente 18 anos, este cenário foimodificado, com a descoberta de que o controle da tradução de alguns RNAsmensageiros poderia ser governada por um mecanismo independente de suaestrutura "cap". Nesse caso, a tradução do RNA mensageiro seria dependentede uma seqüência interna específica do mRNA, reconhecida pelo RNAribossômico, denominada IRES (sítio de entrada interno do ribossomo). Entresuas distintas aplicações, essa descoberta levou ao desenvolvimento devetores de DNA plasmidiais bicistrônicos que permitissem a expressão de doisgenes distintos: o gene marcador de seleção e o gene de interesse, a partir deuma única região promotora (Gurtu V, Yan G and Zhang G. IRES bicistronicexpression vectors for efficient creation of stable mammalian cell lines. BiochemBiophys Res Commun 1996;229:295-8).

Com o uso de vetores bicistrônicos, três são as principaisestratégias utilizadas para a geração de uma população celular com expressãoestável do rFVIII, entre elas: 1) seleção da população transgênica porcitometria de fluxo mediante a análise da expressão da proteína GFP (proteínafluorescente verde - do Inglês Green Fluorescent Protein); 2) tratamento dapopulação transgênica com geneticina mediante a co-expressão do gene quecodifica para neomicina e 3) tratamento da população transgênica commetotrexato mediante a co-expressão do gene que codifica para dihidrofolatoredutase (DHFR).

No primeiro caso, linhagens de fibroblastoNIH3T3/rFVIIlAB+/GFP+ modificadas geneticamente com o sistema retroviral eselecionadas com a expressão de GFP mostraram a secreção do rFVl11biologicamente ativo com um nível de 0,93+0,13 IU/106 células (Moayeri M,Ramezani A, Morgan RA, Hawley TS and Hawley RG. "Sustained phenotypiccorrection of hemophilia a mice following oncoretroviral-mediated expression ofa bioengineered human factor Vlll gene in long-term hematopoietic repopulatingcells". Mol Ther 2004;10:892-902). Estudos adicionais mostraram níveis deatividade biológica entre 1,0-5,0 UI/mL, em linhagens celulares humanashepáticas quando transduzidas com vetores Ientivirais portadores do promotorde citomegalovirus (CMV) (Picanco V, Heinz S, Bott D, Behrmann M, CovasDT, Seifried E and Tonn T. "Recombinant expression of coagulation factor Vlllin hepatic and non-hepatic cell Iines stably transduced with third generationIentiviral vectors comprising the minimal factor Vlll promoter". Cytotherapy2007;9:785-94).

Outros grupos de pesquisa adotaram o tratamento com geneticinapara a seleção de uma população celular com expressão estável do rFVIII.Neste caso, linhagens de células Cos-7 (rim de macaco) ou SMMC-7721(hepatoma humano) foram transfectadas com rFVIII, utilizando o sistemaplasmidial. Após a seleção com geneticina, foi diagnosticada a secreção dorFVIII com uma atividade biológica de 0,24±0,005 IU/106 células e 0,74±0,003IU/106 células, respectivamente (Chen C, Fang XD1 Zhu J, Wu XF1 Zhang ZC,Gu JX1 Wang ZY and Chi CW. "The gene expression of coagulation factor Vlllin mammalian cell lines". Thromb Res 1999;95:105-15).

A seleção com metotrexato é outra forma de tratamentoamplamente utilizada em virtude de sua eficácia e baixo custo. Neste sentido,linhagens celulares CHO deficientes em dihidrofolato redutase (DHFR) foramtransfectadas com plasmídeos bicistrônicos portadores de rFVIII, e o gene daneomicina. Após a transfecção, foi realizada a dupla seleção, inicialmente comgeneticina, seguido do tratamento com metotrexato. A análise da atividadebiológica pelo ensaio do tempo de ativação parcial da tromboplastina mostrou ageração de um clone celular com produção de rFVIII entre 0,5-2 IU/106 células(Chun BH1 Park SY1 Chung N and Bang WG. "Enhanced production ofrecombinant B-domain deleted factor Vlll from Chinese hamster ovary cells bypropionic and butyric acids". Biotechnol Lett 2003;25:315-9).

Desta forma, o advento dos vetores bicistrônicos permitiram aexpressão estável do FVIII recombinante em diferentes linhagens celulares demamíferos, e diferentes estratégias para a seleção de um clone celular portador dealtos níveis de rFVIII vêm sendo desenvolvidas no estado da técnica.

O fator recombinante Vlll de coagulação sangüínea constitui ummedicamento bastante seguro para o tratamento de indivíduos portadores deHemofilia A. Em alguns países como Canadá e Irlanda, é a única fonte detratamento para esses pacientes, e vêm sendo utilizado não apenas comoterapia, mas também como profilaxia. Em outros países, como os EstadosUnidos, 70% dos hemofílicos são tratados com a forma recombinante dessaproteína, enquanto outros 30% dependem do fator Vlll purificado a partir doplasma de indivíduos saudáveis.

Exemplos de produtos recombinantes utilizados na técnicaincluem: KOGENATE e KOGENATE FS da Bayer, RECOMBINATE da Baxter,e REFACTO da Wyeth/Genetics Instituí. Nestes casos, a proteínarecombinante é produzida em células CHO (ovário de hamster chinês) ou emBHK (rim de hamster recém nascido), que são transfectadas estavelmentecomo FVIII completo ou sem o domínio B (Lee CA1 Owens D, Bray G,Giangrande P1 Collins P, Hay C1 Gomperts E1 Schroth P and Barrowcliffe T."Pharmacokinetics of recombinant factor Vlll (recombinate) using one-stageclotting and chromogenic factor Vlll assay". Thromb Haemost 1999;82:1644-7).

A hemofilia A afeta 1 em cada 5.000 nascimentos masculinos emtodo o mundo. No Brasil, estima-se a existência de 9000 hemofílicoscadastrados que demandariam, em condições ideais, 630 milhões de Ul dofator Vlll para o seu adequado tratamento (70.000 Ul/paciente/ano).

Como os produtos recombinantes têm sido produzidos em apenasalgumas regiões do mundo, e por poucas empresas, isso leva a uma carênciano fornecimento do produto.

Adicionalmente, observou-se que o fator Vlll recombinanteproduzido por linhagens não-humanas, pode levar o paciente a desenvolveranticorpos neutralizadores de atividade (inibidores).

Desta forma, o alto custo do fator Vlll recombinante, sua limitadaquantidade disponível no mercado e a possibilidade de desenvolver anticorposinibidores, são fatores que têm incentivado os pesquisadores aodesenvolvimento de novas formulações de rFVIII, tornando-o mais acessível apopulação de hemofílicos A, e mais clinicamente eficazes e viáveis.

Descrição Resumida da Invenção

A partir de um aprofundado estudo dos mecanismos molecularesque governam a expressão do gene que codifica a proteína do FVI11, bem comoa caracterização bioquímica minuciosa da proteína do FVIII, a Depositanteconseguiu desenvolver uma nova molécula recombinante do FVIII, produzidaem níveis elevados, particularmente em linhagens celulares humanas.

A molécula da presente invenção, além de ser produzida emníveis elevados, apresenta atividade biológica aumentada e não apresenta oinconveniente de induzir o desenvolvimento de anticorpos inibidores, uma vezque é produzida a partir de linhagem celular humana.

Desta forma, a presente invenção refere-se a uma proteínarecombinante do fator Vlll de coagulação sangüínea humana, que apresenta odomínio B reduzido, em que são preservados de 17 a 19 aminoácidos dodomínio B do FVIII natural, onde de 6 a 8 aminoácidos preservados são do N-terminal, e de 11 a 13 aminoácidos preservados são do C-terminal do domínioB original, e que apresenta, entre os aminoácidos conservados do N-terminal edo C-terminal, uma serina e uma treonina.

Outro objeto da presente invenção é uma composição quecompreende a proteína recombinante do fator Vlll da presente invenção.

A presente invenção refere-se ainda ao uso da proteínarecombinante aqui descrita, ou da composição que a contém, para a fabricaçãode um medicamento para tratar hemofilia A.

Um objeto adicional da presente invenção é o método deobtenção de uma proteína recombinante do fator Vlll de coagulação sangüíneahumana, em que o método compreende:

a) obtenção de uma molécula de DNA que codifica o fator Vlll decoagulação sangüínea humana;

b) amplificação da molécula da etapa (a) por PCR, utilizandoprimers que restringem a seqüência de nucleotídeos que codifica o domínio B,onde o primer 3' restringe para uma seqüência que codifica de 6 a 8aminoácidos do N-terminal do domínio B original, e o primer 5' restringe parauma seqüência que codifica de 11 a 13 aminoácidos do C-terminal do domínioB original, em que um dos primers apresenta ainda nucleotídeos que codificamserina (S), e o outro primer apresenta nucleotídeos que codificam treonina (T),que são inseridos entre as seqüências de nucleotídeos conservados do N-terminal e do C-terminal do domínio B;c) introdução da molécula de DNA recombinante de FVIII obtidapela etapa (b) em um vetor;

d) introdução do elemento IRES no vetor da etapa (c), através deenzimas de restrição, após o isolamento por PCR;

e) transfecção de células humanas com o vetor obtido pela etapa (d);

f) tratamento da cultura de células humanas com concentraçõesde drogas quimioterapêuticas e estringência crescentes;

g) cultivo das culturas recuperadas; e

h) recuperação do fator Vlll recombinante obtido pelasmencionadas culturas.

Adicionalmente, a presente invenção tem por objeto a proteínarecombinante do fator Vlll de coagulação sangüínea humana, obtida pelométodo acima, e ao uso desta proteína para a fabricação de um medicamentopara o tratamento de hemofilia A.

Breve Descrição das Figuras

A figura 1 representa uma figura esquemática da molécula híbridada presente invenção (cadeia pesada + cadeia leve + 17 aminoácidos dodomínio B + 2 aminoácidos de fusão). A dita molécula é uma molécula única,em que foi realizada a fusão da cadeia pesada (domínios A1 e A2) com acadeia leve (domínios A3, C1 e C2). Na união das duas cadeias foramconservados 17 aminoácidos do domínio B, acrescidos de 2 aminoácidosextras, entre os ditos 17 aminoácidos.

A figura 2 representa a análise do seqüenciamento da região IRESpresente no vetor da presente invenção. A seqüência em negrito foi inserida emtodos os clones devido ao primer utilizado. As bases grifadas demonstram a baseadenina que foi acrescentada, e a inversão de GC para CG.

A figura 3 ilustra a estratégia para a produção do FVIIIrecombinante da presente invenção na linhagem celular HepG2.A figura 4 ilustra a análise da atividade biológica do FVIIIrecombinante da presente invenção em 10 clones celulares de HepG2contendo a mencionada molécula da invenção. O clone 18 mostrou níveis maiselevados de FVIII da ordem de 29 lU/mL conforme avaliado pelo teste deativação parcial de protrombina

A figura 5 ilustra a expressão permanente do mRNA relativo aofator Vlll da invenção na linhagem celular HepG2, através de gel de agarosecorado por brometo de etídeo após a eletroforese dos produtos de RT-PCR.Cerca de 2 pg de RNA total foram submetidos a reação com a transcriptasereversa, utilizando primers específicos do FVIII (3B), e β-actina (1A e 3A). Emseguida, 1/10 do produto da reação de RT é submetida a reação de PCRutilizando primers específicos do FVIII (raias 1 e 3 -B), e β-actina (raias 1 e 3 -A). As raias 1 e 2 apresentam o RNA das células HepG2 não transduzidas,mostrando em 1 uma banda de 612 pb referente ao gene da β-actina, e nosdemais controles de ausência de amplificação. As raias 3 e 4 apresentam oRNA das células HepG2 transduzidas com FVIII da invenção, mostrando osfragmentos de 612pb e 546pb, relativos ao gene da β-actina e FVIII,respectivamente. As demais raias (2 e 4) representam o controle negativo dareação de RT, em que não foi adicionado a transcriptase reversa. As primeirasraias mostram o DNA marcador de peso molecular φΧ 174 (fragmentos 1353;1078; 872; 603e310pb).

A figura 6 ilustra a expressão de FVIII da presente invenção nalinhagem celular HepG2, após o tratamento com as drogas quimioterapêuticasO6-Benzilguanina + Temozolomide. (A) gráfico "dot plot" SSCXFSC, mostrandoo tamanho e complexidade celular de HepG2 virgens; (B) gráfico tipohistograma, mostrando a ausência da expressão de FVIII nas células HepG2virgens; e (C) gráfico tipo histograma, mostrando o nível de expressão de FVIIIatravés da ligação específica com anticorpo anti- na população celular HepG2.A figura 7 ilustra a análise da expressão da proteína do FVIII dapresente invenção no sobrenadante das células recombinantes HepG2, eausência do mesmo nas células virgens. À esquerda, foi utilizado o anticorpoanti-cadeia pesada e, à direita, o anticorpo anti-cadeia leve. AeC representameletroforese em Phast System com gel SDS/PAGE 12,5%, corado comComassie blue R250 0,25%. A raia pdF8 representa o concentrado Iiofilizadodo FVIII humano comercial, a raia 1 representa o sobrenadante da célulaHepG2 virgem, e a raia 2 representa o sobrenadante da célula recombinanteHepG2 com o FVIII da invenção. BeD representam imunodetecção daproteína transferida para membrana de PVDF por "Western bloting". Observa-se uma banda imunoreativa do tamanho esperado de 90 kDa na membranaincubada com o anticorpo anti-cadeia pesada do FVIII, e uma bandaimunoreativa do tamanho esperado de 80 kDa na membrana incubada com oanticorpo anti-cadeia leve do FVIII. A raia à esquerda mostra o marcador depeso molecular (bandas 97, 66, 45 e 30 kDa).

Descrição Detalhada da Invenção

Em uma primeira realização, a presente invenção refere-se a umaproteína recombinante do fator Vlll de coagulação sangüínea humana, quecompreende o domínio B reduzido, em que são preservados de 17 a 19aminoácidos do domínio B do FVIII natural, onde de 6 a 8 aminoácidospreservados são do N-terminal, e de 11 a 13 aminoácidos preservados são doC-terminal do domínio B original, e que apresenta, entre os aminoácidosconservados do N-terminal e do C-terminal, uma serina e uma treonina, sendoque a proteína recombinante é preferencialmente produzida por linhagenshumanas.

Dentro de uma realização particular, as linhagens celulares humanassão selecionadas entre linhagens hepáticas. De preferência, a linhagem humanautilizada pela presente invenção para a obtenção de uma proteína recombinante dofator Vlll de coagulação sangüínea humana é HepG2.

A proteína recombinante do fator Vlll de coagulação sangüíneahumana da presente invenção é produzida em níveis elevados, uma vez quepossui uma estrutura menor do que o FVIII natural, e apresenta atividadebiológica aumentada, sendo apropriada para uso no tratamento de hemofilia A.

A presente invenção trata ainda de uma composição quecompreende a proteína recombinante do fator Vlll da presente invenção eveículos, excipientes ou estabilizantes farmaceuticamente aceitáveis.

A composição de acordo com a presente invenção pode serlíquida, semi-sólida ou sólida, e pode ser adaptada para qualquer rota deadministração enteral ou parenteral, seja de liberação imediata ou modificada.Em uma realização particular, dita composição é adaptada para administraçãooral, mais particularmente, na forma de comprimidos, cápsulas, tinturas,emulsões, lipossomas, microcápsulas ou nanoparticulas.

Veículos, excipientes ou estabilizantes adequados à invençãosão, por exemplo, e sem qualquer limitação, aqueles citados na obraRemington1S Pharmaceutical Sciences, da editora americana Mack Publishing,ou ainda na Farmacopéia Européia ou Farmacopéia Brasileira.

Em outro aspecto, a presente invenção trata do uso da proteínaFVIII recombinante da invenção, ou de composições que a contêm, para apreparação de medicamentos para tratar hemofilia A.

Em outra realização, a presente invenção refere-se a um métodode obtenção de uma proteína recombinante do fator Vlll de coagulaçãosangüínea humana, em que o método compreende:

a) obtenção de uma molécula de DNA que codifica o fator Vlll decoagulação sangüínea humana;

b) amplificação da molécula da etapa (a) por PCR, utilizandoprimers que restringem a seqüência de nucleotídeos que codifica o domínio B,onde o primer 3' restringe para uma seqüência que codifica de 6 a 8aminoácidos preservados são do N-terminal, e de 11 a 13 aminoácidospreservados são do C-terminal do domínio B original, em que um dos primersapresenta ainda nucleotídeos que codificam serina (S), e o outro primerapresenta nucleotídeos que codificam treonina (T)1 que são inseridos entre asseqüências de nucleotídeos conservados do N-terminal e do C-terminal dodomínio B;

c) introdução da molécula de DNA recombinante de FVIII obtidapela etapa (b) em um vetor;

d) introdução do elemento IRES no vetor da etapa (c), através deenzimas de restrição;

e) transfecção de células humanas com o vetor obtido pela etapa (d);

f) tratamento da cultura de células humanas com concentraçõesde drogas quimioterapêuticas e estringência crescentes;

g) cultivo das culturas recuperadas; e

h) recuperação do fator Vlll recombinante obtido pelasmencionadas culturas.

De acordo com uma realização preferencial, os primers utilizadosna etapa (b) apresentam a seguinte seqüência (sendo 1 e 2 para a região N-terminal e 3 e 4 para a região C-terminal):

Primer 1 - 5'-TTCTATCACACGTGACCATGCAAATAGAGCTCTCCACC-3'

Primer 2 - 5'-TTCTATAAAGTACTTGAATTCTGGGAGAAGCTTCTTG-3'

Primer 3 - 5-TTCTATAAAGTACTCAAAACCCACCAGTCTTGAAAC-3'

Primer 4 - 5'-TTCTATACACACGTGTCAGTAGAGGTCCTGTGCC TC-3'

As condições utilizadas para reação de PCR1 são conhecidaspelos técnicos no assunto e descritas no estado da técnica.

A etapa (c) é realizada particularmente a partir da digestão damolécula da etapa (b) com uma endonucleases específica, preferencialmentePme I, e ligação da molécula assim tratada ao DNA do vetor Iinearizado com asmesmas enzimas de restrição.

Ainda, a etapa (d) do método acima é realizada a partir dadigestão do vetor da etapa (c) com endonucleases específicas,preferencialmente Pme I e Nco I, e ligação do vetor assim tratado ao IRESIinearizado com as mesmas enzimas de restrição.

Em uma realização preferencial, o vetor utilizado pela presenteinvenção é um vetor retroviral, particulamente, plasmidial retroviral. De acordocom uma realização preferencial, o vetor utilizado é pMGF-P140K.

De acordo com outro aspecto da presente invenção, a transfecçãodas células humanas com o vetor obtido pela etapa (d) pode ser realizada porqualquer método conhecido na técnica. Particularmente, a transfecção érealizada através de Iipofectamina.

Particularmente, o método da presente invenção apresenta umsistema de produção de retrovírus. Primeiramente, o FVIII é transfectadoem células produtoras de retrovírus anfotrópicas. Em seguida, a célulahumana é então transduzida com o retrovírus produzido pela linhagemanfotrópica.

Ainda, as drogas quimioterapêuticas utilizadas pela presenteinvenção para o tratamento das culturas transfectadas pode ser qualquer umaapropriada no estado da técnica, desde que o vetor utilizado contenha um genede resistência para o mesmo. De forma particular, as drogasquimioterapêuticas utilizadas são O6-Benzilguanina e Temozolomide, semexcluir qualquer outro sistema de seleção adequado.

Conforme descrito acima, a seleção das culturas transduzidas érealizada a partir de tratamento crescente com drogas quimioterapêuticas, comestringência também crescente. De acordo com a presente invenção, as dosesde drogas quimioterapêuticas utilizadas na primeira seleção (baixaestringência) estão compreendidas entre 200 e 400 pg/mL, e as doses dedrogas quimioterapêuticas utilizadas na segunda seleção (alta estringência)estão compreendidas entre 500 e 800 pg/mL.

O cultivo das células é realizado sob condição padrão, podendoser determinado pelo técnico no assunto dependendo do tipo de linhagemcelular utilizada. Particularmente, o cultivo é realizado a uma temperatura de37°C e 5% de C02.

Ainda, a recuperação do fator Vlll recombinante obtido pelométodo da presente invenção pode ser realizada por qualquer métodoconhecido na técnica.

O método da presente invenção permite obter proteínas FVIIIrecombinantes humanas em altos níveis, sendo que as proteínas apresentamalta atividade biológica e não apresentam os inconvenientes apresentadospelas proteínas recombinantes da técnica.

De acordo com uma realização adicional, a presente invençãorefere-se à proteína recombinante do fator VIII obtida pelo método descritoacima, apresentando o domínio B reduzido, em que são preservados de 17a 19 aminoácidos do domínio B do FVIII natural, onde de 6 a 8aminoácidos preservados são do N-terminal, e de 11 a 13 aminoácidospreservados são do C-terminal do domínio B original, e que apresenta,entre os aminoácidos conservados do N-terminal e do C-terminal, umaserina e uma treonina.

Ainda outro objeto da presente invenção refere-se ao uso daproteína obtida pelo método da presente invenção na preparação de ummedicamento para tratar hemofilia A.

A presente invenção pode ser compreendida de forma mais clarae precisa através da leitura dos exemplos a seguir, que ilustram a presenteinvenção sem apresentar qualquer caráter limitativo.Exemplos

Exemplo 1

Produção de FVIlI mutante a partir de Linhagens Humanas

A linhagem c elular humana HepG2 foi t ransduzida com o vetorretroviral FVI11ABstPI 40K, que contém o FVIII recombinante da presente invençãoe o elemento IRES ilustrado pela figura 2. Após o tratamento com concentraçõescrescentes das drogas quimioterapêuticas O6-Benzilguanina + Temozolomidepara a seleção de uma população celular com altos níveis de expressão de rFVIII,foi realizada a clonagem celular. A figura 3 mostra a estratégia utilizada para ageração da linhagem celular humana com expressão estável do fator Vlll decoagulação sangüínea humana, e elevados níveis do mesmo.

A análise da atividade biológica do FVIII presente nosobrenadante destes clones celulares mostrou a variação na atividadebiológica entre 4,8 e 29 vezes superior ao fator Vlll presente no plasmasangüíneo e ao fator Vlll recombinante produzido pelas linhagens murinasdescritas no estado da técnica (figura 4).

Exemplo 2

Avaliação do nível de produção da molécula recombinante da invençãopela linhagem celular humanas HepG2

A avaliação do nível de produção da molécula recombinanteFVIIIABStP140K pela linhagem celular humana HepG2 pode ser realizada porRT-PCR convencional; citometria de fluxo, tempo de tromboplastina parcialativado (TTPA) e western blot.

RT-PCR convencional

A avaliação por RT-PCR convencional, ilustrada pela figura 5,permitiu diagnosticar a presença do mRNA relativo ao fator Vlll de coagulaçãoda presente invenção utilizando o seguinte procedimento: é realizada aextração de RNA total utilizando o kit RNAsy Mini kit (Quiagen)1 de acordo comas instruções do fabricante. Em seguida, 1 a 3 pg de RNA total é convertido emcDNA, utilizando o kit Superscript Il (Invitrogen), conforme as instruções dofabricante, e 50 pmoles de primer randômico. Posteriormente, o fragmento deDNA relativo ao fator Vlll da invenção é amplificado em uma mistura reacionalque contém: 2 pL do cDNA, 0,2 M de dNTPs; 1 U da enzima Taq DNApolimerase (Amershan Bioscience), 2,5 μΙ_ do tampão 10x da respectivaenzima (Amershan Bioscience) e 10 pmoles de cada oligonucleotídeoP5FVIII5seq e P3FVIIIseq. Essa reação foi realizada em termocíclador com oprograma: 95°C por 2min; 35 ciclos de 95°C por 40s, 56°C por 40s e 72°C por1min; 72°C por 10min.

Citometria de fluxo

Para marcação intracelular da proteína do FVIII recombinante dapresente invenção, cerca de 1x106 de células HepG2/FVIIIABStP140K sãofixadas com paraformaldeído 1% (m/v) durante 20 minutos a 4°C e, emseguida, permeabilizadas com Tween 0,5% por 15 minutos a 37°C. Após aetapa de lavagem com PBS-BSA 2%, as células são incubadas com soluçãode bloqueio (soro de cabra 10%) por 1 hora a 37°C. A seguir, é colocado oanticorpo primário monoclonal (QED) diluído em solução PBS-BSA 2% (1:100),por aproximadamente 24 horas a temperatura ambiente. Em seguida, érealizada a lavagem com PBS-BSA 2%, e as células são incubadas com oanticorpo secundário diluído em solução PBS-BSA 2% (1:400), durante 45minutos em temperatura ambiente. Após este período, é realizada umasegunda lavagem com PBS 1X, e as células são eluídas em 100μΙ_ de PBS 1X,para posterior análise de emissão de fluorescência pelas célulasrecombinantes por de citometria de fluxo. A quantificação da emissão defluorescência foi realizada com uma suspensão celular utilizando 10.000eventos (células) em citômetro de fluxo laminar (FACSort, Beckton Dickinson,San Jose, CA,EUA).A avaliação por citometria de fluxo mostrou que a populaçãocelular recombinante HepG2 apresenta uma expressão estável do FVIII daordem de 77%, conforme ilustrado pela figura 6.

Ensaio de tempo de tromboplastinaparcial ativado (TTPA)

A avaliação da atividade biológica é realizada pelo teste do tempode tromboplastina parcial ativado (TTPA) ilustrado pela tabela 1.

Tabela 1

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O teste da coagulação TTPA (tempo de tromboplastina parcialativado), mede a velocidade in vitro que uma amostra de plasma contendo oFVIII leva para coagular uma amostra de plasma deficiente em FVIII. Oparâmetro medido é o tempo necessário para a atividade protrombínica, sendoassim, o tempo levado para coagulação varia de acordo com a concentraçãode FVIII presente na amostra a ser analisada. Na presente invenção, a amostraa ser testada foi diluída 1:10 em tampão (Owren^s Veronal - Biomérieux) e,depois de 20 segundos, misturada com o plasma deficiente em FVIII humano(Biomérieux, Durham), fosfolipídeos e um ativador de contato (Platelin® LS -Biomérieux). Depois da incubação por aproximadamente 240 segundos a 37°C,100 μι. de cloreto de cálcio (CaCb 0,25M) foi adicionado, e o tempo para aformação do coágulo foi marcado, utilizando o coagulômetro automático(COAG-A-MATE® XM - Organon Teknika), de acordo com as instruções dofabricante. Antes de iniciar a dosagem, uma curva de calibração padrão foiconstruída, utilizando FVIlI derivado do plasma (Verify - Reference plasma -(Organon Teknika, Durham)), reconstituído com 1mL de água destilada ediluído para concentração de (1 U ml_ FVIII). Seis diluições (1:5; 1:10; 1:20;1:40; 1:80; 1:160) são realizadas em tampão (Owren's Veronal - Biomerieux), eusadas para construção da curva para cada amostra. Uma relação linear foitraçada em um gráfico, com atividade de FVIII em escala logarítima (abscissa)e o tempo de tromboplastina parcial ativado (segundos), e a porcentagem deatividade de FVIII calculada foi obtida com a média da inclinação da curva.

A tabela 1 mostra a análise da atividade biológica do FVIIIpresente no sobrenadante de 10 clones celulares da população celular HepG2/FVIIIABstP140K através do teste TTPA. Pode-se observar que os clones celularesrecombinantes portadores do FVIII após o tratamento com O6-Benzilguanina +Temozolomide, apresentam níveis de atividade biológica de FVIII da ordem de 4,8 a29 vezes ao nível de fator Vlll presente no plasma sangüíneo.

WesternBlot

A caracterização da proteína FVIIIABstP140K, produzida pelalinhagem celular HepG2/ FVIIIABStP140K, foi realizada por western blot.

Para o preparo do gel, 7 mL de sobrenadante são coletados de1x107 células HepG2/ FVIIIABSjP140K e submetidos a concentração emcolunas Centricon® Amicon® (Millipore), por centrifugação à 7500 rpm durante2 a 4 horas. Em seguida, é realizada uma lavagem utilizando 3 ml de H2OMiUiQ autoclavada, por centrifugação à 6000 rpm. Posteriormente, as colunasforam invertidas para eluição das amostras em aproximadamente 150 μΙ deH2O MilIiQ autoclavada, e centrifugadas à 6000 rpm durante 15 minutos. Apósa eluição da proteína, as amostras são quantificadas em um espectrofotômetropelo Método de Bradford.Para a realização do Western Blot, as amostras foram submetidasà eletroforese utilizando o sistema Phast System. Cerca de 10 pL da amostra(30 pg) foram misturadas com 10 μΙ do tampão de amostra (10 mM Tris-HCI1pH 8,0; 2,5% SDS (m/v); 1 mM EDTA; 0,01% (v/v) de azul de bromofenol), e1,5 μΙ de β-mercaptoetanol (Sigma). A mistura é submetida ao aquecimento eaplicada no gel. A eletroforese é realizada em tampão de corrida para oPhastGeI (SDS Buffer - Amersham Biociences) a 100 V, duranteaproximadamente 40 minutos. Dois géis, exatamente idênticos, são submetidosà eletroforese, um para ser corado e outro para a transferência. Após aeletroforese, o gel a ser corado é incubado por 1 hora em solução fixadora(etanol 40% (v/v), ácido acético 10% (v/v), água estéril qsp 0,125L) e,posteriormente, corado com solução de azul brilhante de Coomassie (1,3%ácido fosfórico (v/v), 0,75 M (NH4)2 SO4, 0,1% Coomassie B-Blue G250 (v/v)),durante 18 horas. Em seguida, o gel é lavado de 3 a 5 vezes com água MiIIiQ1e montado entre duas folhas de papel celofane para a completa secagem.

Após a eletroforese, as proteínas contidas no gel de poliacrilamidasão transferidas para uma membrana de nitrocelulose, pelo método de eletro-transferência semi-seca, com o uso do aparelho Phast System - AmershamBiociences, conforme as instruções do fabricante. A eletroforese é realizada emtampão de transferência (0,25 M de Tris-Base; 0,96 M de glicina; 0,5% SDS(sódio duodecil sulfato); água estéril qsp 1L) a 90 V, durante aproximadamente2 horas e 30 minutos. Concluída a transferência, a membrana é preparada paraimunodetecção.

A membrana de nitrocelulose é submetida ao bloqueio de sítiosinespecíficos pela adição da solução de bloqueio TBS-T (10 mM Tris pH 7,5, 150mM NaCI, 0,1% Tween-20), em 5% de leite em pó (m/v), por cerca de 16 horas.Após o bloqueio, a membrana é lavada rapidamente 2 vezes com TBS 1X, 0,1%Tween-20, e incubada com anticorpo primário monoclonal (QED), diluído emsolução TBS-T (1:800) durante 2 horas à temperatura ambiente, e sob agitaçãoconstante. Em seguida, é realizada a lavagem da membrana com TBS 1X, 0,1%Tween-20 (2X /15 minutos; 3X / 5 minutos), e a membrana é incubada com oanticorpo secundário diluído em solução TBS-T (1:3000), durante 1 hora. Após aincubação com o segundo anticorpo, a membrana é lavada novamente e inicia-se o procedimento de detecção. Para a detecção, é utilizado o "kit ECL Westernblotting" (Amersham Biosciences), conforme instruções do fabricante.

Finalmente, a membrana é exposta ao filme de raio-X por 15 segundos e arevelação é realizada em máquinas automáticas da KODAK.

Conforme ilustrado pela figura 7, pode-se observar uma bandaimuno-reativa mais intensa do tamanho esperado de 80 kDa, referente a cadeialeve do FVIII e de 90 kDa, referente a cadeia pesada do FVIII, presente nascélulas recombinantes HepG2IFVIIIABStP140K e a ausência da mesma nascélulas HepG2 virgens.

Como bem compreendem os técnicos no assunto, são possíveisnumerosas modificações e variações da presente invenção à luz dosensinamentos acima, sem se afastar do seu escopo de proteção, conformedelimitado pelas reivindicações anexas.

Claims (25)

1. PROTEÍNA RECOMBINANTE DO FATOR Vlll DECOAGULAÇÃO SANGÜÍNEA HUMANA, caracterizada pelo fato de quecompreende o domínio B reduzido, em que são preservados de 17 a 19aminoácidos do domínio B do FVIII natural, onde de 6 a 8 aminoácidospreservados são do N-terminal, e de 11 a 13 aminoácidos preservados são doC-terminal do domínio B original, e que apresenta, entre os aminoácidosconservados do N-terminal e do C-terminal, uma serina e uma treonina.

2. PROTEÍNA, de acordo com a reivindicação 1,caracterizada pelo fato de que são preservados 17 aminoácidos do domínio Bdo FVIII natural, onde 6 aminoácidos preservados são do N-terminal e 11aminoácidos preservados são do C-terminal do domínio B original.

3. PROTEÍNA, de acordo com a reivindicação 1,caracterizada pelo fato de que é obtida por linhagens celulares humanas.

4. PROTEÍNA, de acordo com a reivindicação 3,caracterizada pelo fato de que as linhagens celulares são humanas hepáticas.

5. PROTEÍNA, de acordo com a reivindicação 4,caracterizada pelo fato de que a linhagem celular humana é HepG2.

6. COMPOSIÇÃO, caracterizada pelo fato de quecompreende a proteína recombinante do fator VIII, conforme descrita em umadas reivindicações 1 a 5, e veículos, excipientes ou estabilizantesfarmaceuticamente aceitáveis.

7. USO DE UMA PROTEÍNA RECOMBINANTE DO FATORVIII, conforme descrita em uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelofato de que é na preparação de um medicamento para tratar hemofilia A.

8. USO DE UMA PROTEÍNA RECOMBINANTE DO FATORVIII, conforme descrita em uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelofato de que é para tratar hemofilia A.

9. USO DE UMA COMPOSIÇÃO, conforme descrita nareivindicação 6, caracterizado pelo fato de que é na preparação de ummedicamento para tratar hemofilia A.

10. USO DE UMA COMPOSIÇÃO, conforme descrita nareivindicação 6, caracterizado pelo fato de que é para tratar hemofilia A.

11. MÉTODO DE OBTENÇÃO DE UMA PROTEÍNARECOMBINANTE DO FATOR Vlll DE COAGULAÇÃO SANGÜÍNEA HUMANA,caracterizado pelo fato de que compreende:a) obtenção de uma molécula de DNA que codifica o fator Vlll decoagulação sangüínea humana;b) amplíficação da molécula da etapa (a) por PCR1 utilizandoprimers que restringem a seqüência de nucleotídeos que codifica o domínio B,onde o primer 3' restringe para uma seqüência que codifica de 6 a 8aminoácidos do N-terminal do domínio B original, e o primer 5' restringe parauma seqüência que codifica de 11 a 13 aminoácidos do C-terminal do domínioB original, em que um dos primers apresenta ainda nucleotídeos que codificamserina (S), e o outro primer apresenta nucleotídeos que codificam treonina (T)1que são inseridos entre as seqüências de nucleotídeos conservados do N-terminal e do C-terminal do domínio B;c) introdução da molécula de DNA recombinante de FVIII obtidapela etapa (b) em um vetor;d) introdução do elemento IRES no vetor da etapa (c), através deenzimas de restrição, após o isolamento por PCR;e) transfecção de células humanas com o vetor obtido pela etapa (d);f) tratamento da cultura de células humanas com concentraçõesde drogas quimioterapêuticas e estringência crescentes;g) cultivo das culturas recuperadas; eh) recuperação do fator Vlll recombinante obtido pelasmencionadas culturas.

12. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 11, caracterizadopelo fato de que os primers utilizados na etapa (b) apresentam as seguintesseqüências:Primer 1 - 5-TTCTATCACACGTGACCATGCAAATAGAGCTCTCCACC-3'Primer 2 - 5'-TTCTATAAAGTACTTGAATTCTGGGAGAAGCTTCTTG-3'Primer 3 - 5'-TTCTATAAAGTACTCAAAACCCACCAGTCTTGAAAC-3'Primer 4 - 5'-TTCTATACACACGTGTCAGTAGAGGTCCTGTGCC TC-3'.

13. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 11, caracterizadopelo fato de que a etapa (c) é realizada a partir da digestão da molécula daetapa (b) com enzimas de restrição, e ligação da molécula assim tratada aoDNA do vetor Iinearizado com as mesmas enzimas de restrição.

14. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 13, caracterizadopelo fato de que a enzima de restrição é Pme I.

15. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 11, caracterizadopelo fato de que a etapa (d) é realizada a partir da digestão do vetor da etapa(c) com enzimas de restrição, e ligação do vetor assim tratado ao IRESIinearizado com as mesmas enzimas de restrição.

16. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 15, caracterizadopelo fato de que as enzimas de restrição são Pme I e Nco Hl.

17. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 11, caracterizadopelo fato de que o vetor é retroviral.

18. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 17, caracterizadopelo fato de que o vetor é pMGF-P140K.

19. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 11, caracterizadopelo fato de que a transfecção das células humanas com o vetor obtido pelaetapa (d) ser realizada através de lipofectamina.

20. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 11, caracterizadopelo fato de apresentar um sistema de produção de retrovírus, em que o FVIII étransfectado em células produtoras de retrovírus anfotrópicas.

21. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 11, caracterizadopelo fato de que as as drogas quimioterapêuticas utilizadas na etapa (f) são O6-Benzilguanina e Temozolomide.

22. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 11, caracterizadopelo fato de que as doses crescentes de drogas quimioterapêuticas da etapa (f)estão compreendidas entre 200 a 400 pg/ml na primeira seleção (baixaestringência) e entre 500 a 800 Mg/ml na segunda seleção (alta estringência).

23. PROTEÍNA RECOMBINANTE DO FATOR Vlll DECOAGULAÇÃO SANGÜÍNEA HUMANA, caracterizada pelo fato de que éobtida a partir do método conforme descrito em uma das reivindicações 11a-22, apresentando o domínio B reduzido, onde são preservados 17 a 19aminoácidos do domínio B do FVIII natural, onde de 6 a 8 aminoácidospreservados são do N-terminal, e de 11 a 13 aminoácidos preservados são doC-terminal do domínio B original, e que apresenta, entre os aminoácidosconservados do N-terminal e do C-terminal, uma serina e uma treonina.

24. PROTEÍNA, de acordo com a reivindicação 23,caracterizada pelo fato de que são preservados 17 aminoácidos do domínio Bdo FVIII natural, onde 6 aminoácidos preservados são do N-terminal e 11aminoácidos preservados são do C-terminal do domínio B original.

25. USO DE UMA PROTEÍNA RECOMBINANTE DO FATORVIII, conforme descrita em uma das reivindicações 23 ou 24, caracterizado pelofato de que é na preparação de um medicamento para tratar hemofilia A.