BRPI0803481A2 - processo de obtenção de xilitol a partir da xilose através de bioconversão enzimática em reator com membrana - Google Patents
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- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
A presente invenção refere-se ao método de obtenção de xilitol a partir da bioconversão multienzimática da xilose com utilização de enzimas, por exemplo, xilose redutase (XR) e glicose 6-fosfato desidrogenase (G6PDH) em um reator com membrana de ultrafiltração. Adicionalmente, o presente pedido ainda provê os usos do xilitol resultante do dito processo em indústrias alimentícia, odontológica e farmacêutica.
Description
"PROCESSO DE OBTENÇÃO DE XILITOL A PARTIR DA itii^JSEATRAVÉS DE BIOCONVERSÃO ENZIMÁTICA EM REATOR COMMEMBRANA"
Campo da Invenção
A presente invenção refere-se ao método de obtenção dexilitol a partir da bioconversão multienzimática da xilose com utilizaçãode enzimas, por exemplo, xilose redutase (XR) e glicose 6-fosfatodesidrogenase (G6PDH) em um reator com membrana de ultrafiltração.Adicionalmente, o presente pedido ainda prove os usos do xilitolresultante do dito processo em indústrias alimentícia, odontológica efarmacêutica.
Antecedentes da Invenção
As bioconversões são reações químicas catalisadas porenzimas, células ou organelas celulares e executadas em meio com altaou baixa atividade de água, vêm apresentando interesse crescente nasíntese orgânica.
O sucesso da biocatálise se deve ao fato da transformaçãopoder ser rigorosamente controlada e conduzida de modo contínuo sobcondições brandas de pH e temperatura, favorecendo a manipulação desubstâncias sensíveis a condições extremas de processo. Associam-se,também, a alta seletividade (do ponto de vista químico, daregiosseletividade e enantiosseletividade), a formação de efluentesmenos tóxicos e facilmente tratáveis e a possibilidade de se executaremreações simultâneas. A disponibilidade de biocatalisadores temaumentado em decorrência dos avanços da biotecnologia (novastécnicas de cultivo celular, isolamento e manipulação genética:cruzamentos, mutações, DNA recombinante, hibridoma), resultando emaumento do número de aplicações em processos industriais, porexemplo, a conversão da insulina suína em humana, a produção deaspartame, acrilamida e penicilinas semi-sintéticas.
Outro aspecto é a competição vantajosa da biocatálise,quando possível de ser aplicada, frente aos processos tradicionais deextração (fortemente dependente da disponibilidade da matéria-prima ebaixo rendimento em produto final), fermentação (só é econômica,quando se operam grandes volumes) e de síntese química (maispoluente, maior consumo de energia, menos enantiosseletiva).
A eficiência da biocatálise depende do binômiobiocatalisador/biorreator.
Os biorreatores são equipamentos nos quais os agentes denatureza biológica (células, enzimas, organelas celulares ou anticorpos)são utilizados para transformar um dado substrato em produto. Emtermos operacionais o biorreator pode ser do tipo descontínuo oucontínuo.
O biorreator descontínuo, no qual o tempo de residência éigual para reagentes, produtos e catalisador, é preferido nos casos emque o biocatalisador é barato, não requer co-fator ou possui meia-vidacurta. Apesar de ser o tipo mais simples para operar e modelar tem oinconveniente de dificultar ou até mesmo impossibilitar a recuperaçãodo biocatalisador no final do processo. No caso do biocatalisador sersolúvel, uma enzima, por exemplo, dever-se-ia adaptar na linha desaída uma unidade de ultrafiltração, a qual permitiria recuperá-lo ereciclá-lo no processo. Por outro lado, se o biocatalisador é suscetível àinibição por substrato, passa a ser recomendável o emprego do processodescontínuo-alimentado, porque ao se adicionar o substratopaulatinamente ter-se-ia a possibilidade de manter sua concentraçãoabaixo do limite inibitório.
O biorreator contínuo surgiu como uma extensão aplicativada técnica de imobilização de biocatalisadores, introduzida efetivamenteno início da década de setenta. Com o biocatalisador ligado por métodofísico ou químico em matrizes inertes e insolúveis foi possível operarbiorreatores contínuos com diferentes configurações, a saber, colunascom o material imobilizado empacotado (reator de fluxo pistonado) oumantido suspenso em meio líquido através da alimentação da soluçãosubstrato sob pressão gerada por bomba peristáltica (reator de leitofluidizado).
Uma variante para manter o biocatalisador imobilizado emsuspensão é o biorreator de tanque continuamente agitado (CSTR), cujaconfiguração básica seria a de um reator descontínuo, ao qual seadaptou um sistema contínuo de introdução e de retirada de material.Os biorreatores dos tipos leito fluidizado e tanque continuamenteagitado não possuem problemas relacionados ao estabelecimento degradientes radiais ou axiais de pH, temperatura e concentrações desubstrato e produto.
Em geral, o biorreator tipo tanque continuamente agitadoacaba sendo a primeira escolha para o desenvolvimento de um novoprocesso, porque possui grande flexibilidade operacional (por exemplo,pode-se trabalhar com um amplo intervalo de velocidades de agitação) ede utilização (não é desenhado para um processo em particular,podendo, inclusive, ser usado na configuração descontínua).
No contexto dos biorreatores contínuos, o biorreator commembrana (BM), pode ser configurado de dois modos distintos, talcomo, um reator continuamente agitado (CSTR) ao qual se acopla umamembrana ou um recipiente cilíndrico desprovido de sistema deagitação contendo grande número de membranas de filtração tangencialdo tipo fibra oca dispostas em um arranjo tipo feixe. Este último tipo deBM é conhecido pelo nome "hollow-fiber reactor" (HFR).
Segundo GIORNO e DRIOLI, (GIORNO, L., & DRIOLI, E.(2000). Biocatalytic membrane reactors: Applications and perspectives.Trends in Biotechnology, 18(8), 339-349) em um biorreator commembrana, que não o HFR, o arranjo biocatalisador/membrana podeser de dois tipos. Em um deles o biocatalisador não está ligado àmembrana, a qual, neste caso, atua como uma unidade de separação,impedindo o escape do biocatalisador no permeado. No outro tipo, obiocatalisador encontra-se unido à membrana, a qual atua tanto comosítio de catalise quanto como unidade de separação. Quando não háinteração entre o biocatalisador e a membrana, têm-se as situações emque a membrana está em um módulo acoplado em série ao biorreator(caso de um CSTR típico), sendo o biocatalisador impelido e removidocontinuamente de sua superfície (caso em que o biocatalisador éreciclado ao CSTR) ou o biocatalisador é confinado dentro do módulocom a membrana (caso em que não há reciclo do biocatalisador).
Existe, ainda, o arranjo em que o CSTR tem umamembrana como integrante de sua base (nesta configuração o sistemafunciona como CSTR e módulo de separação simultaneamente, sem anecessidade de reciclo). Quando existe união entre o biocatalisador e amembrana, pode-se ter o biocatalisador aprisionado na membrana,depositado na forma de gel sobre a superfície da membrana ou ligadoatravés de interação química (adsorção, ligação iônica ou ligaçãocovalente). Para este caso, pode-se, também, dispor de um únicosistema CSTR/módulo de separação.
Os biorreatores com membrana aparecem como alternativaviável aos reatores tradicionais de enzimas imobilizadas (leito fixo,CSTR-Tradicional, leito fluidizado), já que o biocatalisador não precisaestar necessariamente ligado a um suporte insolúvel. Neste últimoaspecto, diferencia-se do reator agitado tradicional (CSTR-TRAD),embora mantenha todos os atributos favoráveis deste tipo de reatorcontínuo. Lembra-se que o BM, em princípio, permite integrar em umaúnica etapa a conversão catalítica, a separação /concentração doproduto e a recuperação do biocatalisador. Estes aspectos podempromover significativa produtividade e redução de custos por ocasião daampliação de escala. O BM apresenta as seguintes vantagens: catalisehomogênea, ausência de limitações difusionais, estéricas econformacionais, alta atividade por unidade de volume, possibilidade dese trabalhar em condições assépticas, produtividade constantegarantida pela constância da dosagem da enzima e possibilidade de usode sistemas multienzimáticos.
Os primeiros estudos sobre os biorreatores com membranativeram início em 1970, resumindo-se na tentativa de hidrolisar o amidoà glicose, usando a-amilase retida em um sistema de filtraçãoconvencional. O principal problema observado relacionou-se àconcentração de polarização da membrana, acarretando diminuição dofluxo ao longo do tempo e perda da enzima. O BM só começou a setornar viável após os avanços ocorridos na tecnologia de membranas, asquais passaram a ser produzidas com espessura adequada, diâmetro eformato dos poros uniformes (microfiltração: 0,1 - 0,5(j.; ultrafiltração:0,001(i - 0,l[i; nanofiltração: menor que 2 nm), além das característicasquímicas definidas das mesmas (hidrofílicas, hidrofóbicas, neutras oucarregadas), as quais resultam da natureza dos materiais empregados,a saber, polímeros orgânicos (por exemplo, polisulfonas, celulose,acetato de celulose, politetrafluoretileno) e inorgânicos (representadosbasicamente pelas cerâmicas porosas).
O BM configurado como CSTR é o mais usado, podendo-seidentificar estudos recentes preconizando sua aplicação na obtenção deciclodextrinas, frutoligossacarídeos, catecol, proteólise da caseína, dahemoglobina e síntese de ésteres.
Ainda, de acordo com GIORNO e DRIOLI, (GIORNO, L., &DRIOLI, E. (2000). Biocatalytic membrane reactors: Applications andperspectives. Trends in Biotechnology, 18(8), 339-349) identificou-se ouso do BM nos setores agro-alimentar (na hidrólise da pectina porpectinase em sucos de fruta, em enologia, na remoção da lactose dosoro e/ou leite integral e modificação de óleos e gorduras), químico-farmacêutico (dentre outros, citam-se a título de exemplos, asconversões do ácido fumárico e L-aspãrtico, respectivamente, em ácidoL-aspártico e L-alanina, a obtenção do ibuprofeno a partir de seu ciano-éster e a obtenção de oligonucleotídeos a partir de DNA) e biomédico(órgãos artificiais para uso extra-corpóreo).
A versatilidade do BM se reflete no grande número deprocessos desenvolvidos até agora, para a obtenção dos mais variadosprodutos, tais como: hidrolisados de caseína e de hemoglobina,ciclodextrinas, frutooligossacarídeos, catecol e ésteres. Inclusive os BMestão sendo preconizados para uso no tratamento da água.O BM configurado desta maneira foi descrito na patenteamericana US 4.304.858, de propriedade da Degussa AG/GBF, visandoo seu uso industrial em processo contínuo para a produção de L-aminoácidos (metionina e valina), estando a aminoacilase retida emuma membrana de ultrafiltração.
O BM configurado como HFR mostrou-se útil no caso de seusar células íntegras (de origem animal ou microbiano) comobiocatalisadores. O HFR, atualmente, está sendo preconizado notratamento de águas residuais, usando o lodo ativado comobiocatalisador" ou, ainda, como simples sistema de microfiltração, bemcomo de ultrafiltração para a sanitização da água e quando combinadocom o tratamento biológico prévio da biomassa, a conjunção deste como uso da membrana mostrou-se muito mais eficiente.
Embora o transporte através da membrana possa se dar pordifusão (a separação se baseia, apenas, no gradiente de concentraçãoestabelecido entre as duas faces da membrana) ou por convecção(resultante do estabelecimento de um gradiente de pressão outemperatura através da membrana), os BM's mais usados, querequerem fluxos elevados, valem-se deste mecanismo de transporte.
A direção do fluxo introduzido no BM e a travessia do fluidoatravés da membrana podem ser paralelos, ambos perpendiculares àsuperfície da membrana, ou perpendiculares entre si (o fluidoalimentado tangencia a superfície da membrana e a travessia se dáperpendicularmente à superfície da mesma). Este último padrão deoperação do BM é o mais indicado para evitar o fenômeno dapolarização da membrana. Caso se faça o reciclo do efluente, aeficiência do BM é, ainda, mais aumentada. Atualmente o custo dasmembranas não afeta substancialmente o custo global do reator,porque são bastante estáveis e podem ser regeneradas várias vezes. Porisso, ao invés de minimizar a área da membrana para um determinadofluxo, prefere-se fornecer área de membrana suficiente para otimizar otempo de operação de um BM.
Apesar da retenção de enzimas por membranas e aimobilização em suportes sólidos serem consideradas duas técnicasdistintas de retenção do biocatalisador, a linha divisória entre elas nãoé nítida, sobretudo quando se imagina a membrana como umasuperfície de imobilização, sendo o BM, neste caso, considerado comoum tipo especial de reator para enzimas imobilizadas.
Finalmente, os biorreatores de membrana podem serutilizados em escala de laboratório para monitoramento contínuo daatividade de enzimas, avaliando-se a desativação por pH ou pelatemperatura em condições operacionais. Pode ser útil, também, naidentificação de mecanismos de inibição enzimática. Em escalaindustrial para recuperação e reutilização de biocatalisadores solúveis,na facilidade de separação dos produtos e como técnica de reator deenzimas imobilizadas com elevada área superficial.
A xilose redutase (XR) de Cândida guilliermondii é umaaldo-ceto redutase com massa molar de 36 kDa, formada por umacadeia peptídica, requer o co-fator NADPH, pi 5,7, pHótimo 7,2, estávelem 5,5 < pH < 7,5, estável até 45°C, Km (xilose) 6,4xlO-2mM e Km(NADPH) 9,5xl0"3m. Apesar de estar sendo amplamente estudadarecentemente, inclusive com sua estrutura já estabelecida, ainda não éencontrada no comércio, devendo, por isso, ser obtida em laboratórioatravés do cultivo descontínuo da Cândida guilliermondii. Nesta linha,KITPREECHAVANICH e seus colaboradores (KITPREECHAVANICH, V.,HAYASHI, M., NISHIO, N., NAGAI, S. (1984). Conversion of D-xyloseinto xylitol by xylose reductase from Cândida pelliculosa coupled withthe oxireductase system of methanogen strain Hu. BiotechnologyLetters, 6(10), 651-656) reportou a produção de xilitol a partir de XR deCândida pelliculosa (usando células ou extrato livre de células) acopladoa um sistema de óxido-redução de Methanobacterium sp (NADP —>NADPH, sendo o H2 o doador de elétrons), usando uma proporção co-fator reduzido/xilose de 1/30 e NIDETZKY e seus colaboradores(NIDETZKY, B., NEUHAUSER, W., HALTRICH, D., KULBE, K.D. (1996).Continuous enzymatic production with simultaneous coenzymeregeneration in a charged membrane reactor. Biotechnology &Bioengineering, 52, 387-396) utilizou em reator descontínuo o sistemaacoplado xilose redutase/NADH//glicose desidrogenase/NAD, obtendo96% de conversão. Executando a reação de modo contínuo em reatorcom membrana, obtiveram produtividade de 80g de xilitol/L.dia, sem anecessidade de repor o co-fator por um período de 150 dias. Estesresultados depõem a favor da exploração de outros arranjos paraexecutar a bioconversão xilose/xilitol, como o uso de reator commembrana uni-modular (BMU), co-fator imobilizado e diferentesenzimas auxiliares.
A enzima glicose-6-fosfato desidrogenase, G6PDH, (D-glicose-6-fosfato: NADP-oxidorredutase) é encontrada em célulasanimais, vegetais e microorganismos, podendo se destacar a leveduraSaccharomyces cereuisiae. A enzima é a primeira do processo oxidativoda via pentose-fosfato convertendo a glicose-6-fosfato a 6-fosfoglicono-ô-lactona, sendo classificada bioquimicamente como oxidorredutase.A G6PDH é de grande importância para a sobrevida dascélulas, uma vez que é responsável pela manutenção de um níveladequado da coenzima reduzida NADPH e participa da regulação dociclo das pentoses. A necessidade celular por G6PDH está relacionadaao fornecimento de NADPH e ribose-5-fosfato. O NADPH é usado embiossínteses redutoras, enquanto que a ribose-5-fosfato é usada nasíntese de DNA e RNA.
Na maioria dos microrganismos, a G6PDH apresenta umasubunidade com massa molar de 50-60 kDa, correspondendoaproximadamente a 500 aminoácidos. Esta enzima aparecenormalmente na forma de dímeros ou tetrâmeros, sendo que asG6PDHs provenientes de Leuconostoc mesenteroid.es e Saccharomycescerevisiae são dímeros. O pH ótimo de atividade da enzima é 7,8 e oponto isoelétrico é 4,6. A enzima nativa pura é estável durante muitassemanas tanto a 0°C como a 20°C. Pode, ainda ser mantida por muitashoras a 40°C, sem apreciável perda de atividade.
O mercado da enzima G6PDH movimentou 7 milhões dedólares no mercado mundial de kits, no ano de 1995, e foi a quartaenzima mais comercializada para esse fim. Esses kits podem serutilizados para medidas de teores de glicose, frutose, manose, ATP e deatividade enzimática de hexoquinase e creatino-quinase. Usando aG6PDH, é possível determinar glicose na presença de outros sacarídeos,como a frutose. Além disso, a G6PDH pode ser empregada para adeterminação de glicose em sistema de reator em fluxo contínuo, pois oNADPH formado pela reação enzimática pode ser facilmente detectadoespectrofotometricamente ou fluorimetricamente.Essa enzima pode ainda detectar baixíssimos níveis deestreptavidina e biotina por ensaios de bioluminescência em reações dehibridização de DNA, sem perda da atividade enzimática. Comobiossensor, a G6PDH pode monitorar rapidamente a concentração deG6P (glicose-6-fosfato) no sangue com menor custo e consumo de tempodo que os métodos tradicionais como cromatografia e espectroscopia.
Esse monitoramento é importante porque ele pode refletir diretamente aatividade relativa da G6PDH na via metabólica e tem sido utilizado porpossibilitar o controle de G6PDH em eritrócitos humanos e em célulasde fígado de ratos.
O xilitol é um poliol de massa molecular 125,15 g/mol(C5H12O5), índice de dulçor semelhante ao da sacarose, PF 92-96°C, PE216°C, hidrossolúvel (169g/100g H20 a 20°C), pH 5,0-7,0 (solução 5%p/v), densidade l,03g/mL (solução 10% p/v), viscosidade 1,23 cP(solução a 10% p/v), calor de dissolução -34,8 cal/g, valor calórico 4Kcal/g e estável nas condições usuais de processamento de alimentos.
O xilitol é utilizado como componente de formulaçõesalimentícias, odontológicas e farmacêuticas. Em alimentos é usadocomo adoçante em produtos dietéticos (indicados para diabéticos,porque o metabolismo do xilitol independe da ação da insulina) e emconfeitos (balas "Smints®", chiclete "Trident®", por exemplo); emodontologia na formulação de cremes dentais pelas suas propriedadesnão cariogênica (os microrganismos bucais não o metabolizam), efeitorefrescante ao paladar (devido ao calor de dissolução ser endotérmico) epossível auxiliar na remineralização de lesões dentárias iniciais; emmedicamentos como coadjuvante (adoçante e/ou excipiente) deformulações.O xilitol ocorre naturalmente em pequenas quantidades emcertos frutos e vegetais, sendo sua extração a partir destas fonteseconomicamente inviável.
A xilose com alto grau de pureza, obtida pela hidrólise dahemicelulose de madeiras e purificação do hidrolisado por colunas detroca iônica e fracionamento cromatográfico, é convertida em xilitolatravés do processo de hidrogenação catalítica (pressão de 50 atm,temperatura entre 80-140°C e níquel como catalisador). Após ahidrogenação, o catalisador é removido empregando sucessivamente afiltração e a passagem por colunas de troca iônica. O efluente éconcentrado, passado em colunas contendo resinas catiônicas e no finalo xilitol é recuperado por cristalização fracionada. A principaldesvantagem desta via é o custo do xilitol obtido, já que é fortementeinfluenciado pela necessidade de se empregar xilose com alto grau depureza (não pode estar contaminada com galactose, arabinose emanose, açúcares normalmente presentes nos hidrolisados de madeira),a fim de otimizar o rendimento da hidrogenação catalítica. Além disso,durante a hidrogenação uma fração do xilitol pode ser convertida emxilulose, resultando na diminuição do rendimento da reação e devendoser removida para não contaminar o produto final. O tratamento dosresíduos resultantes é outro ponto a ser considerado.
Uma outra via para a produção de xilitol é a conversãomicrobiológica da xilose, utilizando-se diferentes espécies de leveduras,dentre as quais a Cândida guilliermondii.
O processo fermentativo comparado ao da hidrogenaçãocatalítica tem a vantagem de não exigir xilose com alto grau de pureza.A levedura consegue metabolizar a xilose presente em hidrolisadoshemicelulósicos obtidos de diferentes fontes, inclusive de resíduosagroindustriais, tais como, bagaço de cana, palha de arroz e cavacos deeucalipto.
Outros aspectos atraentes da via microbiológica são asmenores gerações de resíduos agressivos ao meio ambiente, a plenadisponibilidade do substrato, condições operacionais mais brandas,menor consumo de energia no processo como um todo (o gasto maior deenergia ocorre na preparação do hidrolisado), menos etapas depurificação ("downstream") até o produto final (separação das células docaldo fermentado, concentração do caldo e cristalização do xilitol) e apresença de outros açúcares no hidrolisado não impedem a conversãoxilose/xilitol, inclusive alguns deles servem até de substrato para alevedura (por exemplo, a arabinose).
A fermentação da xilose (presente no hidrolisadohemicelulósico) pela Cândida guilliermondii requer o controle de váriosparâmetros de processo, a saber, concentração inicial de xilose, pH,temperatura e suprimento de oxigênio. Nos hidrolisados provenientes deresíduos agrícolas encontram-se várias substâncias (glicose, fenóis,ácido acético, furfural, hidroximetilfurfural e arabinose, principalmente)que podem influir no crescimento e na produção de xilitol pela levedura.
Porém, a maior parte dos contaminantes voláteis é removida pelaconcentração a vácuo do hidrolisado e a quantidade de ácido acéticomantida em nível não inibitório para o crescimento.
Em Cândida guilliermondii a xilose é isomerizada a xiluloseatravés das reações de redução e oxidação catalisadas pela açãoseqüencial da xilose redutase (enzima NAD(P)H-dependente) e da xilitoldesidrogenase (enzima NAD(P)-dependente), sendo o xilitol ummetabólito intermediário deste processo. Por conseguinte, para se tersucesso no aumento da formação de xilitol pela levedura, deve-sefavorecer a etapa redutora (xilose-->xilitol) frente à etapa oxidativa(xilitol —> xilulose). Isto só pode ser conseguido ou através de condiçõesde cultivo bem equilibradas ou pelo uso de levedura mutante (incapazde produzir a xilitol desidrogenase, sendo, portanto, xilulosedependente).
Até o momento, os esforços para otimizar a formação dexilitol por via microbiológica têm se concentrado no aperfeiçoamentodas condições de cultivo, sobretudo, em termos do fornecimento deoxigênio, que no caso da Cândida guilliermondii deve ser fornecido emquantidade controlada (0,6 wm). A influência do oxigênio nabioconversão xilose /xilitol está na dependência do estado óxido-redutivoda célula, representado, ao menos em parte, pelo balanço entre asconcentrações intracelulares de NADH e NAD e de NADPH e NADP (esteafetando diretamente a atividade da xilose redutase intracelular).
Exatamente a dificuldade em se controlar o metabolismo dalevedura, visando à formação otimizada do xilitol, muito dependente dosmecanismos de indução e repressão catabólica exercidos pelas oses,constitui-se no fator limitante da aplicação generalizada da viamicrobiológica. Apesar da ampla literatura existente sobre esta via deprodução de xilitol (cultivos descontínuo, descontínuo-alimentado econtínuo, executados em fermentadores com as mais diferentesconfigurações), ainda, a síntese química com todas as desvantagensapontadas é o processo preferido para a produção industrial desteproduto.Se por ura lado há dificuldades para a produção de xilitol,por outro a obtenção de biomassa não é problemática. Sendo a xiloseredutase uma enzima constitutiva, e, por conseguinte, a quantidadeformada ser função da biomassa produzida, então existe a possibilidadede extraí-la das células e utilizá-la em reator adequado para realizar abioconversão direta da xilose em xilitol.
A bioconversão da xilose em xilitol em uma única etapacatalisada pela xilose redutase (XR) constitui-se em alternativa viávelpara as vias química e microbiológica. Esta perspectiva fundamenta-seno fato de poder ser conduzida sob condições operacionais brandas,não gerar resíduos poluentes e não apresentar os inconvenientes dalevedura, a saber, usar o xilitol como metabólito intermediário nasreações intracelulares, limitações na transferência de massa (osubstrato e o produto devem atravessar membranas) e susceptibilidadeaos contaminantes existentes no hidrolisado de resíduos vegetais,sobretudo o ácido acético.
No entanto, a XR de Cândida guilliermondii exige o NADPHcomo co-fator na redução da xilose a xilitol, o qual deve ser regeneradodurante a catalise, tanto para sustentar a reação (a formação de 1 molde xilitol requer 1 mol de NADPH) quanto evitar a sua perda, já que éum reagente de custo elevado. Quando se usa a levedura, a regeneraçãodo co-fator é garantida pelo metabolismo celular, mas no caso daenzima livre seu reciclo passa a ser um ponto crítico do processo. Paratanto, procura-se acoplar à reação que o oxida uma capaz de reduzi-lo.
A patente espanhola ES 2.275.437 refere-se a um processode purificação de xilitol em meios fermentados (obtenção microbiológica)obtidos pela bioconversão de hidrolisados de massa vegetal.A patente européia EP 527.758 prove no uso da tecnologiade DNA-recombinante, em linhagens de leveduras, no processo deconversão de xilose em xilitol.
A patente européia EP 432.015 descreve um processo deseparação da xilose a partir de materiais lignocelulósicos por processoquímico e físico-químico combinados.
A patente americana US 1.273.498 reivindica um processode fabricação de xilose e xilitol a partir de material hemicelulósico livrede lignina através da conversão de polissacarídeos em monossacarídeosatravés em processos fermantativos.
O pedido de patente americano US 2005/0148055 trata deum método biotecnológico de produção de xilitol utilizandomicroorganismos capazes de metabolizar xilose em xilitol através daoxidação NADH por enzimas.
A patente americana US 5.081.026 refere-se a um métodode produção de xilitol a partir de materiais contendo xilose e/ou xilanoatravés de processo fermentativos.
O pedido de patente americano US 2007/0072280 trata daconversão xilose/xilitol por processo fermentativo, utilizandomicrorganismos "engenheirados", como a Eschericchia coli.
Diante de todo o exposto, a Depositante, de formainesperada, apresenta um processo de obtenção de xilitol por viamultienzimática que é um processo alternativo e inovador às viasquímicas e fermentativas presentes no estado da técnica.
Descrição das Figuras
A figura 1 mostra o gráfico da bioconversão da xilose emxilitol empregando ambas as enzimas no biorreator com membrana(membrana de ultrafiltração - corte molecular de 500Da ou 30kDa),sendo que ▲ [xilose] alimentada, mg/ml e ■ [xilose] consumida, mg/ml.
A figura 2 representa o fluxograma para a bioconversão daxilose (1-substrato; 2-bomba pistonada/peristáltica; 3 - retentor debolhas; 4- pressurizador; 5-filtro estéril; 6-reator com membrana comagitador magnético; 7-coletor).
Descrição da Invenção
A presente invenção refere-se ao método de obtenção dexilitol a partir da bioconversão multienzimática da xilose com utilizaçãode enzimas, por exemplo, xilose redutase (XR) e glicose 6-fosfatodesidrogenase (G6PDH) em um reator com membrana de ultrafiltração.Adicionalmente, o presente pedido ainda prove os usos do xilitolresultante do dito processo em indústrias alimentícia, odontológica efarmacêutica.
Considerando que as enzimas, devido às suas propriedadesinerentes, permitem a obtenção de alta percentagem de conversão emcondições brandas, o presente pedido tem como objetivo descrever aaplicação seqüencial e conjunta do sistema xilose redutase/glicose 6-fosfato desidrogenase sobre a xilose, utilizando-se reator commembrana (RM) operado de modo contínuo e em regime permanente.
Em uma primeira realização o presente pedido prove ummétodo de obtenção de xilitol a partir da xilose através de processosdescontínuos e/ou contínuos.
Nos processos descontínuos e/ou contínuos de obtenção doxilitol, apresentados a seguir, utiliza-se o bioreator com membrana uni-modular (BMU) com membrana de corte molecular de 100-500 Da e/oude 10-30 kDa. O sistema é mantido pressurizado, a temperatura écontrolada pela circulação de água na jaqueta de revestimento, sendo aalimentação feita com bomba adequada (peristáltica e/ou pistonada). Afaixa de vazão específica de alimentação, definida como a razão entre avazão volumétrica de alimentação e o volume do reator, varia entre 0,1a 1 h-i.
A obtenção de xilitol da presente invenção, no processodescontínuo, realiza-se pelo (a) emprego de uma solução aquosa(tampão fosfato ou tampão Tris-HCl - pH 4,5-8,5), (b) adição do co-fator(NADP e/ou NADPH) solúvel e/ou imobilizado, em quantidades quevariam de 0,1-100 mM, (c) adição das enzimas solúveis xilose redutase(1,0x10-3-1,OxlO5 -U/mL) e G6PDH (1-500 - U/mL), (d) incorporaçãodos substratos, xilose nas concentrações de 0,1-5,0:1000 m/v e D-glicose 6-fosfato em concentrações de 1-100:10000 m/v e (e) agitaçãoconstante de 50 a 500 rotação por minuto por 1 a lOh à temperatura de20a50°C.
Por outro lado, a obtenção do xilitol através do processocontínuo se dá pelas etapas de (a) emprego de solução aquosa (pH 4,5-8,5), (b) adição do co-fator (NADP e/ou NADPH) solúvel ou imobilizado,em quantidades que variam de 0,1 a lOOmM, (c) adição das enzimassolúveis xilose redutase (1,0x10-3-1,0x105 - U/mL) e G6PDH (1-500 -U/mL), (d) alimentação com a solução de substratos, xilose nasconcentrações de 0,1-5,0:1000 m/v e D-glicose 6-fosfato emconcentrações de 1-10:10000 m/v e (e) agitação constante de 50 a 500rotação por minuto por pelo menos 12 a 720hs à temperatura de 20 a50°C.
Em meio ao processo de obtenção de xilitol, do presentepedido, a regeneração do NADPH consumido pela XR é realizada pelautilização da glicose 6-fosfato desidrogenase (G6PDH) como enzimaauxiliar. As razões para a escolha da G6PDH são seu amplo uso comoreagente analítico, atividade catalítica de fácil medição, apresentar altaatividade em pH 7 a 8 (mesma faixa que a requerida pela XR), requerero NADP como co-fator, não ser inibida pela xilose e xilitol e serfacilmente obtida.
A regeneração demonstrada no presente pedido resulta nabioconversão NADPH/XR//G6PDH/NADP em reator com membranauni-modular (BMU). Alternativamente as enzimas podem ser utilizadasna forma solúvel, desde que a membrana tenha corte molecular máximode 30 kDa (massas molares da XR e G6PDH da ordem de 36-40 kDa e100-120 kDa, respectivamente). O não desprendimento do co-fator dossuportes permite o uso da membrana de ultrafiltração de 30 kDa.
A regeneração é enfrentada pelo uso combinado dasenzimas XR e G6PDH, enquanto que a retenção do co-fator é realizadapor imobilização (ligação do NADPH a um suporte inerte) ou pelo uso demembrana com corte molecular máximo de 500 Da (sendo a massamolar do NADPH de 760 Da).
Em particular, a presente invenção pleiteia a bioconversãoda xilose em xilitol através da ação conjunta da XR e G6PDH comregeneração simultânea do NADPH em reator com membrana uni-modular utilizando as enzimas na forma solúvel e o co-fator na formasolúvel e/ou imobilizada em resina trocadora de ânions (copolímero depoli(estireno-divinilbenzeno)).
ExemploO processo de obtenção de xilitol a partir de xilose, de formageral, se dá pelo preparo de seus substratos para posterior inserção aobioreator através das seguintes etapas:
Obtenção de Biomassa
A Cândida guilliermondii FTI 20037 foi cultivada porprocesso descontínuo durante 24h em meio contendo 50 g/L de xilose,2,0 g/L de (NH4)2S04, 0,01 g/L de CaCl2.2H20 e 20 g/L de solução deextrato de farelo de arroz. A seguir, as células foram separadas porcentrifugação (2000xg; 15 min). Após lavagem com água destilada ecentrifugada, as células foram recolhidas para posterior rompimento.
Rompimento das Células (Ultrassom ou por Pérolas de Vidro)
Por ultrassom, as células foram ressuspendidas em tampãofosfato de potássio (5mM, pH 7,0), adicionado de lmL de uma soluçãode inibidores de protease (2mM de ácido aminocapróico, lOmM de (3-mercaptoetanol, lmM fenil-metil-sulfonil-fluoride e 0,2mM de EDTA) ede 3,30mL de tampão fosfato (0,1M; pH7,2), em um tubo cônico embanho refrigerado, foi rompida por ultra-som (Vibra Cell lOOW-Sonics &Materials), usando-se pulsos de ls com intervalos de ls por um períodode 45 minutos à freqüência de 20kHz. Os fragmentos celulares foramremovidos por centrifugação (6700g; 10 min), recolhendo-se o extrato aser usado como fonte de xilose redutase.
Já com uso de pérolas de vidro, as células foramressuspendidas em tampão fosfato de potássio (5mM, pH 4,5-8,5),adicionado de lmL de uma solução de inibidores de protease (2mM deácido aminocapróico, lOmM de P-mercaptoetanol, lmM fenil-metil-sulfonil-fluoride e 0,2mM de EDTA). O rompimento foi feito em um tubocônico contendo 3 mL de suspensão de células e de 3 mL de pérolas devidro. Através de um auxílio de vórtice, o tubo cônico foi agitadodurante 60 segundos seguidos de 30 segundos no banho de gelo. Esteciclo foi repetido durante 7 vezes. Os fragmentos celulares foramremovidos por centrifugação (6700g; 20min), recolhendo-se o extrato aser usado como fonte de XR.
Purificação Parcial da Xilose Redutase
O extrato foi passado através de uma membrana deultrafiltração com membrana de 30 kDa (7000 rpm/20min),recolhendo-se o filtrado contendo a XR.
IMOBILIZAÇÃO DO CO-FATOR
Em 25 mL de água deionizada, tampão fosfato ou tampãoTris-HCl (pH 7,2 ou 7,4) foi adicionada a quantidade de resinatrocadora de ânions (5, 10 ou 25mg), deixando-se a suspensão por 24ha 32°C sob agitação (100 rpm). A seguir, adicionou-se o co-fator (NADPou NADPH; 100 |umol), deixando-se a mistura a 100 rpm e 32°C por umtempo (1, 2 ou 4 horas). O sistema imobilizado foi separado porcentrifugação (4000g; 30min) e a quantidade de co-fator não ligadamedida no sobrenadante.
BlOCONVERSÃO DA XlLOSE EM XlLITOL
Os processos descritos a seguir utilizaram o NADP na formasolúvel e/ou imobilizada, munindo-se, respectivamente, o BMU commembrana de corte molecular de 500 Da ou 30 kDa. O BMU empregadoé da marca BIOENGINEERING® com capacidade operacional de 10 mL,temperatura controlada pela circulação de água na jaqueta derevestimento, tendo acoplados uma bomba peristáltica/pistonada e umsistema de pressurização até 6 bar.Dez mililitros de solução aquosa (pH 7,2) contendo o co-fator solúvel ou imobilizado (e as enzimas solúveis XR (2mL do extratoenzimático) e G6PDH (lOOuL de 272U/mL) foram introduzidos no BMU,sendo, a seguir, alimentado com a solução substrato [D-glicose 6-fosfato (0,5mg/mL) e xilose (lmg/mL) a uma dada vazão especifica de4mL/h (primeiras 24 horas) e 2mL/h (48 horas seguintes)respectivamente. O processo contínuo foi operado por pelo menos 72h,à temperatura ambiente e sob agitação de 100 rpm. Nas amostrascoletadas a cada lh foram feitas as determinações analíticas.
Procedimentos Analíticos
Determinação da Atividade da Xilose RedutaseA atividade da XR foi determinada medindo-se o decréscimoda absorbância a 340nm decorrente da oxidação do NADPH, usando axilose como substrato. Uma unidade de atividade enzimática (Uxr) foidefinida como a quantidade de enzima que catalisa a oxidação de 1 (imolde NADPH por minuto. A atividade específica (UxRe) será expressa em(Uxr)/mg de proteína.
Determinação da Atividade da Glicose 6-Fosfato Desidrogenase
A atividade da G6PDH foi determinada medindo-se oaumento da absorbância a 340nm decorrente da redução do NADP,usando D-glicose 6-fosfato como substrato. Uma unidade de atividadeenzimática (Ugõ) foi definida como a quantidade de enzima que catalisaa redução de l|j.mol de NADP por minuto. A atividade específica (UG6e)será expressa em (UGó)/mg de proteína.
Determinação do NADPH SolúvelA quantidade de NADPH solúvel na amostra foi determinadapor leitura direta em espectrofotômetro a 340nm, considerando ocoeficiente de extinção molar de 6220 M^.cm-1.
Determinação da Proteína Solúvel
Foi usado o método convencional do reagente azul-brilhante(Coomassie G-250) e a albumina bovina como proteína padrão.
Determinação das Concentrações de Xilose e Xilitol
A xilose e o xilitol foram determinados em cromatógrafolíquido de alta eficiência.
Determinação da Concentração de Açúcares Redutores Totais (ART)
Os açúcares redutores representados pela xilose e D-glicose6-fosfato em separado ou em mistura foram determinados pelo uso dosreagentes convencionais de Somogyi-Nelson.
Eficiência da Imobilização (EU do NADPH
A eficiência da imobilização foi calculada através da relação:EI = 100.[(NADPHad-NADPHsobr)/NADPHad]
onde: (NADPHad) = concentração do co-fator antes da imobilização;(NADPHSobr) = concentração do co-fator no sobrenadante.
Purificação Parcial da XR
O grau de purificação da XR foi expresso pela relação:
FP = (UxRe)d / (UxRe)a
onde: FP = fator de purificação; (UxRe)d = atividade específica após otratamento e (UxRe)a= atividade específica antes do tratamento.
Bioconversão
Pela bioconversão realizada em regime descontínuo quercom o NADPH solúvel quer imobilizado, foram estabelecidas asconcentrações das enzimas (XR e G6PDH), substratos (xilose e glicose6-fosfato) e de NADPH que levam à maior conversão.
Os experimentos de bioconversão descontínua foramacompanhados através da diminuição das concentrações iniciais doART e da xilose e do acúmulo de xilitol no meio reacional ao longo doprocesso. Os dados foram apresentados através de gráficos do tipoconcentração (ART, xilose e xilitol) x tempo de reação.
A produtividade em xilitol (Pxüí) foi calculada através darelação:
<formula>formula see original document page 25</formula>
onde (xilitol)f = concentração de xilitol no final do processo; (xilitol)i =concentração de xilitol antes da reação (eventualmente presente no ELCou no extrato de XR parcialmente purificado) e t = tempo total dereação.
Os experimentos de bioconversão contínua foramacompanhados pela determinação da quantidade de ART, xilose e xilitolpresentes no efluente do biorreator ao longo do tempo. No estadoestacionário - constatado através de gráficos concentração (ART, xilosee xilitol) x tempo de processo - foram calculadas a conversão da xilose(X) e a produtividade do processo (Ppc) expressa em (mmol de xilitolformado/h.UxR) através das relações:
X (%) = [(XILOSE)cons /(XILOSE)o]xlOO(Ppc) = {[Q x 60 x (XILITOL)] / 1000 x Uxr}
onde: (XILOSE)COns = (XILOSE)o - (XILOSE)saída, (XILOSE)o =concentração de xilose na entrada do reator, Q = vazão volumétrica nasaída do reator (mL/h), (XILITOL) = concentração de xilitol na saída doreator e Uxr = atividade da XR no meio reacional.
Claims (18)
1. MÉTODO OBTENÇÃO DE XILITOL A PARTIR DABIOCONVERSÃO DA XILOSE, caracterizado pelo fato da bioconversãoser multienzimática.
2. MÉTODO OBTENÇÃO DE XILITOL A PARTIR DABIOCONVERSÃO DA XILOSE, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato da bioconversão multienzimática compreenderparticularmente, as enzimas xilose redutase (XR) e glicose 6-fosfatodesidrogenase (G6PDH).
3. MÉTODO OBTENÇÃO DE XILITOL A PARTIR DABIOCONVERSÃO DA XILOSE, de acordo com as reivindicações 1 e 2,caracterizado pelo fato da bioconversão compreender processosdescontínuos e/ou contínuos.
4. MÉTODO OBTENÇÃO DE XILITOL A PARTIR DABIOCONVERSÃO DA XILOSE, de acordo com as reivindicações 1 a 3,caracterizado pelo fato da bioconversão ser compreendida em umbioreator com membrana de ultraíiltração.
5. MÉTODO OBTENÇÃO DE XILITOL A PARTIR DABIOCONVERSÃO DA XILOSE, de acordo com a reivindicação 4,caracterizado pelo fato dos bioreatores compreenderem membranas decorte molecular de 100 a 500 Da e/ou de 10 a 30 kDa.
6. MÉTODO OBTENÇÃO DE XILITOL A PARTIR DABIOCONVERSÃO DA XILOSE, de acordo com a reivindicação 3,caracterizado pelo fato dos processos contínuos e/ou descontínuoscompreenderem um faixa de vazão específica de alimentação de cercade 0,1 a 1 h-1.
7. MÉTODO OBTENÇÃO DE XILITOL A PARTIR DABIOCONVERSÃO DA XILOSE, de acordo com as reivindicações 3 a 6,caracterizado pelo fato do processo descontínuo compreender as etapas(a) emprego de solução aquosa, (b) adição de co-fatores solúveis e/ouimobilizados, (c) adição das enzimas solúveis, (d) incorporação dossubstratos e (e) agitação constante de 50 a 500 rpm por 1 a lOh àtemperatura de 20 a 50°C.
8. MÉTODO OBTENÇÃO DE XILITOL A PARTIR DABIOCONVERSÃO DA XILOSE, de acordo com a reivindicação 7,caracterizado pelo fato da solução aquosa compreender um tampãofosfato e/ou tampão Tris-HCl com pH de 4,5 a 8,5.
9. MÉTODO OBTENÇÃO DE XILITOL A PARTIR DABIOCONVERSÃO DA XILOSE, de acordo com a reivindicação 7,caracterizado pelo fato dos co-fatores compreenderem NADP e/ouNADPH.
10. MÉTODO OBTENÇÃO DE XILITOL A PARTIR DABIOCONVERSÃO DA XILOSE, de acordo com a reivindicação 7,caracterizado pelo fato dos co-fatores solúveis e/ou imobilizadoscompreenderem quantidades que variam de 0,1 a lOOmM.
11. MÉTODO OBTENÇÃO DE XILITOL A PARTIR DABIOCONVERSÃO DA XILOSE, de acordo com a reivindicação 7,caracterizado pelo fato das enzimas solúveis compreenderem xiloseredutase em concentrações de l,0xl0"3 a l,0xl05 U/mL e G6PDH emconcentrações de 1 a 500 U/mL.
12. MÉTODO OBTENÇÃO DE XILITOL A PARTIR DABIOCONVERSÃO DA XILOSE, de acordo com a reivindicação 7,caracterizado pelo fato dos substratos compreenderem xilose emconcentrações de 0,1 a 5,0:1000 m/v e D-glicose 6-fosfato emconcentrações de 1 a 100:10000 m/v.
13. MÉTODO OBTENÇÃO DE XILITOL A PARTIR DABIOCONVERSAO DA XILOSE, de acordo com as reivindicações 3 a 6,caracterizado pelo fato do processo contínuo compreender as etapas (a)emprego de solução aquosa, (b) adição de co-fatores solúveis e/ouimobilizados, (c) adição das enzimas solúveis, (d) alimentação com asolução de substratos (e) agitação constante de 50 a 500 rpm, por pelomenos 12 a 720hs à temperatura de 20 a 50°C.
14. MÉTODO OBTENÇÃO DE XILITOL A PARTIR DABIOCONVERSAO DA XILOSE, de acordo com a reivindicação 13,caracterizado pelo fato da solução aquosa compreender um tampãofosfato e/ou tampão Tris-HCl com pH de 4,5 a 8,5.
15. MÉTODO OBTENÇÃO DE XILITOL A PARTIR DABIOCONVERSAO DA XILOSE, de acordo com a reivindicação 13,caracterizado pelo fato dos co-fatores compreenderem NADP e/ouNADPH em quantidades que variam de 0,1 a 100 mM.
16. MÉTODO OBTENÇÃO DE XILITOL A PARTIR DABIOCONVERSAO DA XILOSE, de acordo com a reivindicação 12,caracterizado pelo fato das enzimas solúveis compreenderem xiloseredutase em concentrações de l,0xl0"3 a l,0xl05 U/mL e G6PDH emconcentrações de 1 a 500 U/mL.
17. MÉTODO OBTENÇÃO DE XILITOL A PARTIR DABIOCONVERSAO DA XILOSE, de acordo com a reivindicação 12,caracterizado pelo fato dos substratos compreenderem xilose nasconcentrações de 0,1 a 5,0:1000 m/v e D-glicose 6-fosfato emconcentrações de 1 a 100:10000 m/v.16. MÉTODO OBTENÇÃO DE XILITOL A PARTIR DABIOCONVERSÃO DA XILOSE, de acordo com as reivindicações 1 a 16,caracterizado pelo fato do processo compreender particularmente abioconversão da xilose em xilitol através da ação conjunta da XR eG6PDH com regeneração simultânea do NADPH em reator commembrana uni-modular utilizando as enzimas na forma solúvel e o co-fator na forma solúvel e/ou imobilizada em resina trocadora de ânions.17. MÉTODO OBTENÇÃO DE XILITOL A PARTIR DABIOCONVERSÃO DA XILOSE, de acordo com a reivindicação 16,caracterizado pelo fato da resina de trocadora de ânions compreender ocopolímero de poli (estireno-divinilbenzeno).
18. USO DO XILITOL, caracterizado pelo fato de seraplicado em indústrias alimentícias, odontológicas e farmacêuticas.
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