JPS5925697A - グルコ−ス異性化法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明ハクルコース（デキストロース）をフルクトース
（レブロース）へ変換する酵素的方法に関する。

食品用等級のグルコースの大部分はトウモロコシ澱粉の
酵素的加水分解物、すなわち、商業的なコーン・７０ツ
ブとして供給される。一般に、クルコースはショ糖の６
０〜８０％の甘味度に等級つけられており、したかつて
、それに対応する低い筒路で販売される。従前より、ク
ルコース・イソメラーゼ活性を有する酵素、好まＬ　＜
は、ジエチルアミノエチル−セルロース、多孔質ガラス
またはキチンのような不活性担体」５に固定された酵素
を用いてクルコースをフルクトース（ショ糖より甘味が
強い）へ異性化することが知られている。

クルコース・イソメラーゼを用いるクルコースのフルク
トースへの酵素的変換の詳細な記載はハミルトンら（Ｉ
（ａ＋ｎｉｄ　ｔｏｎ　ｅｔ　ａｌ、、　′Ｇｌｕｃｏ
ｓｃ　Ｉｓｏｍｅ　−ｒａｓｅ　ａ　Ｃａ５ｅ　５ｔｕ
ｄｙ　ｏｆ　Ｅｎｚｙｍｅ−Ｃａｔａ（ｌ　ｙｓｅｄＰ
ｒｏｃｅｓｓ　Ｔｅｃｈｎｏｐｏｇｙ”、　Ｉｍｍｏ　
ｂｉ（７ｉ　ｚｅｄ　Ｅｎ　ｙ、　ｙｍｅ　ｓｉｎ　Ｆ
ｏｏｄ　ａｎｄ　Ｍｉｃｒｏｂｉａｄ　Ｐｒｏｃｅｓｓ
ｅｓ　、０ｄｓｏｎ　ｅＬ　ａｄ、。

１’７７ｃｎｕｍ　Ｐｒｅｓｓ　、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、
　（１９７４）　、　１）Ｐ９４〜１０６　、１１２　
、１．１５〜１３７〕、アントリムら（Ａｎｃｒｉｍｅ
（ａｌ、、　”Ｇｌｕｃｏｓｅ　ＩｓｏｍｅｒａｓｅＰ
ｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｈｉｇｈ−Ｆｒｕｃｔｏｓ
ｅ　５ｙｒｕｐｓ”。

Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｉ′Ｊｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ａｎ
ｄ　Ｉ３ｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ。

Ｖｏ（１，２、Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ　（１９
７９）　：］、チェンら（Ｃｂｅｎ　ｅＬ　ａｌ、　、
　”Ｇｌｕｃｏｓｅ　Ｉｓｏ＋ｎｅｒａｓｅ　（ａＲｅ
ｖｉｅｗ）　−１’ｒｏｃｅｓｓ　１３ｉｏｃｈｅｍ、
、（１９８Ｑ　）、ｐｐ３ｏ−３５〕、チェノら（Ｃｈ
ｅｎ　ｅｔ　ａ［、、”Ｇｌ　−ｕｃｏｓｅ　ｌｓｏｍ
ｅｒａｓｅ　（ａ　Ｒｅｖｉｅｗ　）　−１’ｒｏｃｅ
ｓｓ　Ｂｉｏｃｈｅｍ、。

（１９８０）、ＰＰ３６〜４に」、ノルダールら（Ｎｏ
−ｒ山Ｊ　ｅＬ　ａｄ、、　”Ｆｒｕｃｔｏｓｅ　ｌ’
＋ｈｎｕｆａｃＬｕｒｅ　　ｆｒｏｍ　Ｇｄｕｃｏｓｅ
ｂｙ　　Ｉｎｎｎｏｂｉ　Ｉ：！ｅｄ　　Ｇｌｕｃｏｓ
ｅ　　Ｉｓｏｍｅｒａｓｅ　　”、　Ｃｂｅｍ、　　Ａ
ｂｓｔｒａｃ　−ＬＳ　　Ｖｏ６．８２．　　（１９７
５）　　、　　ノ＼ｂｓ　　１ｋ１１０：３１６１１：
ｌ　、タカサキ（Ｔａｋａｓａｋｉ　、　　”Ｆｒｕｃ
【ｏｓｃ　ｌ’ｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　Ｇｅｕ−ｃｏｓｅ
　Ｉｓｏｍｅｒａｓｃ”、　Ｃｈｃｍ、Ａｂｓｔｒａｃ
ｔｓ、　Ｖｏｅ、８２　、　　〔１９７５）、Ａｂｓ、
隘１１０３１６１１１およびタカザキ（１’ａｋａｓａ
ｋｉ　、　′１’ｒｕｃｔｏｓｅ　　Ｉ’ｒｏｄｕｃｔ
ｉｏｎ　ｂｙＧｅ−ｕｃｏｓｅ　　Ｉｓｏｍｅｒａｓｅ
”　、　Ｃｈｅｍ　、Ａｂｓｔｒａｃｔｓ、＼７０７？
、８１゜（１９７４）、Ａｂｓ、ｆｆｉ　７６４７ａ〕
にμられる。

加えて、クルコース異性化に関する多くの特許かあり、
例えは、米国特許第３６１６２２１号、ｉｌＦ発行第２
８８８５号（原特許第：３６２　：３９５３号）、第３
６９４３１４号、第：３７０８３９７号、第３７１５２
７６号、第３７８８９４５号、第：３８２６７１４号、
第３８４３４４２号、第３９０９３５４号、第３９６０
６６３号、第４１４４１２７号および第４３０８３４９
号か挙けられる。

グルコース・イソメラーゼを用いるクルコースの異性化
によって達成できるフルクトースのレベルは該異性化反
応の平衡によって制限される。６５℃にわいて、反応平
衡は純デキストロース出発基質から約５１重量％のフラ
クトースのところで起る。出発基質として精製液体グル
コース（約６重量％までの非単糖類を含有）を用い、酵
素反応器中に適当な時間滞留させる場合、４８〜５２％
フルクトース・シロップが従来の方法によって得ること
のできる最高のフルクトース含量（乾物換算）である。

より高フルクトース含量のシロップを得るには、最終製
品の価格を非常に増加させる分別ンステムを採用しなけ
ればならない。しかしながら、より高い温度では、平衡
はより有利になる。

例えは、約９０〜１４０℃の温度で操作できるクルコー
ス・イソメラーゼ酵素法を用いることができれば、乾物
換算で５３〜６０重１ｒｉ％のフルクトース含有スる高
フルクトース・コーン・シロップ（ＨＦ’　ＣＳ　）を
直接得ることか可能であり、これにより、分別および再
循環の必要性が除かれる。

一方、公知のグルコース・イソメラーゼ系は活性の急激
な減少を伴う熱変性を受けやすい傾同にあり、従来、異
性化の平衡をフルクトースに有利にさせるための高温度
の条件を利用する試みは失敗していた。さらに、グルコ
ースおよび、ことに、フルクトースは敏感な還元糖であ
り、本発明による異性化に必要な温度に加熱した場合、
プシコース、着色生成物、着色物質ｒ’＋ｒＪ駆体、フ
ルクトース・ジ無水物、マンノース、タカドースおよび
酸のような望ましくない副生成物を形、成する著しい四
回を有する。

驚くべきことに、以下に記載することく、クルコース異
性化をある特定のｐＨ条件および酵素反応器内滞留時間
条件下で行なうことにより、約り０℃〜約１４０℃の異
性化温度を有効に利用して、約５２〜約６０重１迂％の
フルクトースを含有する高品質（すなわち、副生成物か
許容限界内）の１１１”　ＣＳシロップを直接得ること
かでき、これにより、従来公知のグルコース異性化法に
よってｆｉｉＪ記範囲のフルクトース含量を達成するに
要求される高価な、複雑な操作の分別および再循環操作
の必要性を除くことができることか判明した。

本発明によれば、グルコース含有液体を化学的に安定化
されたグルコース・イソメラーゼと、温度約９０°Ｃ〜
約１４０℃、ｐ　Ｉ−１約３〜約８およびプシコースお
よび／または非フルクトース、非グルコース糖の何ら実
質的な形成な［２に該液体中の最終フルクトース含量が
全炭水化物Ｏｌｌｔに基いて少なくとも約５３〜約６０
重、１社％となるに充分な接触時間で接触させることか
らなる方法によりグルコースかフルクトースに異性化さ
れる。

本発明に従ってフルクトースに異性化されるグルコース
はこの糖の公知の源のいずれからの由来のものでもよい
。経済的理由から、通常、クルコースは、公知の方法に
従って、酸および／または酵素、好ましくは、後者を用
いるセルロースまたは澱粉の加水分解から由来する。こ
のようにして得られたグルコース含有液体は、典型的に
は、用いた炭水化物源および加水分解法に従って、少量
の多糖類、糖オリゴマー等を含有する。トウモロコシ、
マイロウ（ｍｉ［ｏ）、小麦、ライ麦等の穀類、馬鈴薯
、ヤム、人参、キャソサバ（＋ｎａｎｉｏｃ）なとの澱
粉含有板および塊茎が本発明のグルコース出発物質に変
換するのに好適な澱粉源である。米国においては、トウ
モロコシ澱粉が比較的安１ｄ５で入手しやすいのでこと
に好ましい。食品用等級のクルコース生産には酵素的澱
粉加水分解法を用いることが望ましいので、かかる方法
か本発明でも好ましい。この酵素的ｌ１１１水分解法に
ついては、例えは、米国特許第４０１７３６３号、第３
９１２５９０号、第３９２２１９６号、第：３９２２１
９７号〜第３９２２２０１号および第４２８４７２２号
の開示か参照できる。

化学的に安定化するための酵素線として本発明で用いる
グルコース・イソメラーゼは、ストレフトマイセス・フ
ラボリレンス（Ｓｔ　ｌ’ｅｌ）１０１１１ｙＣｅＳｆ
４ａｖｏｒｉｒｅｎｓ）　、ストレプトマイセス・アク
ロモゲオ、ス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ａｃｈｒｏ
＋ｎｏｇｃｎｅｓ）　、ストレプトマイセス・エチナッ
ス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｅｃｈｉ口ａｔｕｓ）、
　　ストレプトマイセス・アルプス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍ
ｙｃｅｓ　ａｄｂｕｓ）、ストレプトマイセス・ウニト
モレンジｘ　（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｗｅｄｍｏ
ｒｅｎｓｉｓ）、ストレプトマイセス・ファエオクロモ
ゲネス（Ｓｔ−ｒｅｐｉｏｍｙｃｅｓ　ｐｈａｅｏｃｈ
ｒｏｍｏｇｅｎｅｓ）、ストレブトマイセス−ボヒ＋Ｊ
　７　ｘ　（Ｓｔ　ｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｂｏｂｉｌ
ｉａｅ）、ストレプトマイセス・オリボクロモゲネス（
Ｓｔｒｅ−ｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｏ６ｉｖｏｃｈｒｏｍｏ
ｇｅｎｅｓ）、ストレプトマイセス・ベネズエラｘ　（
Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｖｅｎｅｚｕ　−ｅｌａｅ
）、アエロパクター−アエロバクタ（Ａｅｒｏｂａ−ｃ
Ｌｅｒ　、ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）、アエロバクタ−・ク
ロアカニ（Ａｅｒｏｂａｃｃｅｒ　ｃｄｏａｃａｅ　）
　、バルチス・コアグラ７ス（Ｂａｃｉｄｌｕｓ　ｃｏ
ａｇｕ５ａｎｓ）、バチ／Ｉ／スーメガテリウム（１３
ａｃｉ　ｄｄｕｓ、、ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、ハチル
ア、−７／ｌｚクトサス（Ｂａｃｉ４／ｕｓ　　ｆｒｕ
ｃｔｏｓｕｓ）、　プレヒバクテリウム・ペンタアミノ
アソシクム（１３ｒｅｖｉ−ｂａｃｔｅｒｉｕｍ　　ｐ
ｃｎｔａａｍｉｎｏａｃｉｄｉｃｕ＋ｎ）、エノエリヒ
ア・インテルメジア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　　ｉｎ
ｔｅｍ＋ｅ−ｄｉａ）、ロイコノストック・メセンテロ
イデス（Ｌｅ−ｕｃｏｎｏｓｔｏｃ　ｍｅｓｅｎｔｅｒ
ｏｉｄｅｓ）およびパラコロハクトルムーアｘｏゲノイ
デス（ＰａｒＨ＋ｃｏｌｏｂａｃｔｒｕｎａｅｒｏｇｅ
ｎｏｉｄｅｓ　）を包含する公知のクルコース−イソメ
ラーゼ産生微生物のいずれからも単離てきる。さら１こ
、ノカルジア（Ｎｏ（：・ａｒｄｉａ）、マイクロモノ
スポラ（Ｎｌｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ）、マイクロ
ビスポラ（Ｍｉ　ｃｒｏｂｉｓｐｏｒａ）、マイクロビ
スポラポラ（へｈ−ｃｒｏ＋４１ｏｂｏｓｐｏｒａ）お
よびアエロバクタ−（Ａｒ−ｃｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属
によって産生されるクルコース・イソメラーゼも使用で
きる。ストレプトマイセス−１，；１．−ビイ（Ｓｔｒ
ｅｐｔｏｍｙｃｃｓ　Ｓ））、）　Ａ　Ｉ’　ＣＣ２１
１７５は本発明の方法で用いるクルコース・イソメラー
ゼのすぐれた源である。前記のよう（乙本発明で採用す
る比較的高い異性化温度において安定なグルコース・イ
ソメラーゼを用いることか有利−Ｃ１例えは、バチルス
・ステアロサーモフィルス（Ｂａｃｉｅｄｕｓ　ｓｔｅ
ａｒｏｔｈｅｒｍｏｐＨｉＩ：！ｕｓ）、ことに、米国
特許第３８２６７１４　ｐ：に開２Ｊ＜されていルヨウ
ナハチルス・ステアロサーモノイルスフ＼′ＩＣＣ２１
３６５、ＮＲＲＬＢ−：う６８０、ＮＲＲＬＢ−３６８
１およびＮ　Ｒ＋＜　Ｌ　　Ｂ−３６８２からなる群か
ら選ばれる菌株によって産生されるグルコース・イソメ
ラーゼ、アムブラリエラ・ジギタタ（Ａｍｐｕｄ４ａｒ
ｉｅ４１ａ　ｄｉｇｉＬａＬａ）、アムブラ１７　エラ
ー０ハタ（ｋｍｐｕｌｌａｒｉｅｌｌａ　（ｉｏｂａＬ
ａ）、アムブラリエラ・カムパヌラタ（Ａｒｎｐｕｄｄ
ａｒｉｅｄ４ａｃａｍｐａｎｕｌａｃａ）およびアムプ
ラリエラ・レギュラリス（Ａｍｐｕ４７？ａｒｉｅ７７
４ａ　ｒｅｇｕｌａｒｉｓ）のようなアムブラリエラ属
の微生物によって産生されるグルコース・イソメラーゼ
（米国特許第４３０８３４９号）、バチルス・リケニホ
ルミス（Ｂａｃｉ／ｌｕｓｅｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉ　
ｓ　）によって産生されるグルコース・イソメラーゼ（
ヨーロッパ特許出願第４１２１３号）および日本特許公
報７４−３０５８８号に記載される属の高温性菌によっ
てｍ・生きれるグルコース・イソメラーゼが挙けられる
。

前記の微生物に加えて、本発明では、それらの変異種、
変種ならひに、中温性および高温性微生物を包含する他
の微生物に変異グルコース・イソメラーゼ遺伝子を導入
することによってそれらから由来した遺伝的形質転換微
生物の使用も含む。

かかる使用に選択される変異グルコース・イソメラーゼ
遺伝子は、高温、ことに、９０℃以上、好ましくは、約
１４０℃までの温度において安定なりルコース・イソメ
ラーゼを与えるものである。

かかる遺伝子は照射才たは化学的変異誘発剤によるよう
な微生物の変異に通常用いられる技法ｊこよって調製で
きる。別法として１例えは、ある種のストレプトマイセ
ス属の菌株によって産生されるような、穏やかな温度で
安定なりルコース・イソメラーゼを産生ずる単離したク
ルコース・イソメラーゼ遺伝子を１ｎｖｉｔｒｏで変異
させることもてきる。適当な変異遺伝子の選択は、該遺
伝子を親または他の生物に再導入し、ついて、該生物の
増殖および複製ならひに得られたクルコース・イソメラ
ーゼの熱安定性をテストすることにより行なうことがで
きる。

また、組換えＯＮＡ技法も本発明における化学的安定化
および使用に適した熱安定性の向上したクルコース・イ
ソメラーゼを得るために使用できる。アルゴスら（Ａｒ
ｇｏｓ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ。

１８（２５）：５６９８〜５７０　：３　（１９７９）
〕は中温性生物の酵素におけるクリンル、セリル、バリ
ルおよびリジルのアラニルへのある種の置換が高温性生
物からの対応する酵素に見られることを指摘している。

ペルッ（Ｐｅｒｕｉｚ　、　５ｃｉｅｕｃｅ　。

２０１．１１８７〜１１９１（１９７８））は高温性細
菌の酵素の特別な安定性は蛋白表面の付加塩架橋による
ところが大きいことを示している。

ツーバー（Ｚｕｂｅｒ　、　”Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒ
ｙ　ｏｆ　Ｔｈｅｒｎｃｏｌ）１１　ｉ　ｌ　ｙ”、旨
ｅｉｄｍａｎ　、　Ｓ、Ｍ、、ｅｄ、、　ｌ）Ｐ、　　
２５７−２８５　、　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ　
、　Ｎ、　Ｙ、１９７８　）は熱安定性酵素の構造に関
してさらに情報を与えている。すなわち、もし、グルコ
ース・イソメラーゼのアミノ酸鎖および三次元（第三級
）構造か判明すれば、イソメラーゼ遺伝子の部位特異性
変異により安定性を向上させ、より安定な構造を与える
アミノ酸の含量が増加するように設計した酵素を得るこ
とが可能となる。グルコース・イソメラーゼのＤＮＡ鎖
が決定された後、遺伝子シンセサイザーを新たな鎖の形
成に用いることができ、それにより、かかる人工遺伝子
によって産生されるグルコース・イソメラーゼの熱安定
性を増加させることができる。このように設計された酵
素は本発明の実施にことに有用なものである。

クルコース・イソメラーゼはこれらの、および他の微生
物の細胞内で産生されるのて、クルコース・イソメラー
ゼ源は、単に微生物体を収集することによって得ること
かでき、酵素は公知の方法、例えば、細胞自己融解、音
波破壊によって微生物体から分離でき、公知の辿常の設
計の酵素反応器中で用いることができる。好ましくは、
化学的に安定化されたグルコース・イソメラーゼは、化
学的安定化により不溶化されていない場合、不活性担体
上で固定することができる。酵素固定に用いる材料およ
び方法はよく知られており、ファンら（ｔＶａｎｇ　ｅ
ｔ　ａ７７０．　Ｆｅｒｎｔｅｎｔａｔ　ｉｏｎ　ｋ　
Ｅｕｚｙ＋ｎｅ　’Ｉ’ｅｃ　−ｈｎｏ５ｏｇｙ　　　
、　　　Ｊｏｈｎ　　Ｗｉ７？ｅｙ　　＆　　　５ｏｎ
ｓ　　、　　　Ｉｎｃ、、Ｎ　ハ　。

円）、　３１８〜３３８（１９７９）、ＩＪおよびキル
クーオズ？　−（Ｋｉ　ｒｋ　−Ｏｔｈｍｅｒ　、　Ｌ
ｎｃｙｃｄｏｐｃｄｉａ　ｏｆＣｈｅｍｉｃａ／　Ｔｅ
ｃｈｎｏｌｏｇｙ、　３ｒｄ、ＥｄｌＪｏｌｌｎ　Ｗｉ
ｅｅ）＆５ｏｎｓ、　Ｉｎｃ、、Ｎ、Ｙ、（１９８０）
　、ＶＯｌ、９．１）Ｉ）。

１４８〜１７２〕を包含する多くの文献に記載されてお
り、それらを参照できる。米国再発行特許第２８８８５
号に教示されているような少量のコバルト、マンガンお
よびマグネシウム・カチオンおよび／または亜硫酸の水
溶性塩（例えは、亜硫酸ナトリウム、重亜硫酸ナトリウ
ム。亜硫酸マグネシウムおよび／または重亜硫酸マグネ
シウム）の存在により、この操作の間のクルコース・イ
ソメラーゼの変性を減少または防止することもできる。

所望の結果を達成するには、クルコース含有供給液中の
炭水化物濃度が約２０〜約８５重量％、好ましくは、約
３０〜約５０重量％の範囲内であることか必要である。

捷だ、異性化は、約３〜約８．好捷しくは、約４〜約７
、もつとも好１しくは、５〜６．５のｐＨ範囲で行なう
ことか必要である。かかるｐＨ範囲より著しく低いまた
け高い範囲での異姓化模作は大計のプシコース、有機酸
ｈ　４’ｆ色生ＩＪｖ物、着色物質前駆体、フルクトー
ス・ジノ１１〔水物なとの望甘しくない副生成物の形１
戊につながる。

高〆＾ｌ！了は、グルコース・イソメラーゼの至適活性
１）１１かとしく低下することかｉｌｌ明した。例えは
、ストレプトマイセスールビゲノサス（ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｒｕｌ）ｉｇｅｎｏｓｕｓ
）からのグルコース・イソメラーゼでは、至適活性ｌ）
■は２５℃でｐｆ１８．６〜９．２．７５℃でｐｌｌ　
６．９〜７．５．１２５℃てＰ１１５，６〜６．２であ
る。すなわち、異［生化涛”度が十昇するに従って、異
性化、、１１をトげることにより、最大酵素活性を維持
し、加えて、望ましくない副生１ｊν物の形ｔＪｙをさ
け餐ことかできる。

さら（乙本発明のもう１つの必「歩な非件は、グルコー
ス含有供給液と化学的に安定化されたグルコース・イソ
メラーゼの接触時間である。かかる接触は許容される品
質のフルクトース・シロップを得るために、約１秒〜約
５時曲、奸捷しくは、約３０秒〜約１時間、もつともθ
ｒ斗＋、＜は、約２分〜約３０分の範囲で維持するｌ・
川・がある。

化学的に安定化されたグルコース・イソメラ一ゼとグル
コース含有液の間の好捷しい接触時間は異性化反応が行
なわわるｐＬ＋に依存するところか大キイ・ｉｐＬ＋範
囲の下限では、より長い接触時間でも、グルコースやフ
ルクトースか望捷しくない分解を起してプシコースや他
の望ましくない分解生成物を形成するこ吉なく耐えるこ
とかできる。

該範囲のＬ限では、プシコースおよび着色生成回避のた
めに、より短い接触時間が必要である。実際には・糖分
解反応は非酵素的であり、該液体がグルコース・イソメ
ラーゼと接触していても、接触していなくても起るので
、グルコース含有液が最終反応扁度捷たはそれに近いｆ
晶度におかれる合計の時間が有効接剤１時間とみなされ
る。したがって、異性化を９０℃以上で行なう場合、グ
ルコース含有液を所望の異性化ｌ関度に上昇させるｌこ
仰する時間を最少にしく例えは、イソメラーゼと接＋＋
ｃｂさせる直前−または接触の聞１（、該液体を蒸気と
混合することにより）、−４ｊ、所望のフルクトースレ
ベルが達ＩＪＶされたら、その後、速やか１こ液体をい
ずれの活性イソメラーゼからも分：ｓｌｔ、　Ｌ、つい
て、できるだけ速恰かに液体を９（ビＣＩ〃、ド、好−
＋　Ｌ　＜　ハ。

７（）℃以ドに冷却することか市゛珍である。化学的に
安定化さオ］たグルコース・イソメラーゼの可溶性形を
川し）る場ｒ型は、異性化１叉１息か、もちろん、可逆
的であるので、高／Ａ１１度異１ノ１．什、上梓て生１
戊したフルクトースかグルコースへ（＋）変換さイアる
のをさけるため、該冷ＪａＪ　Ｅ「程のＩＪ１目こイソ
メラーゼを不５店外化すること（例えは、イソメラーゼ
を不活＋７＋化する範囲捷てＩａｌｌを減少させること
により）か必りＰである。

達成することのできるグルコースのフルクトースへの変
換の最大度合は、グル」−スとフルクトース間の外力学
的”Ｉ’　ｋ　ｌζよって律され、こ、ｆｌｌは。

さら番こ、異性化を行なう温度に依存する。グルコース
とフルクトースの混合物の平衡に１シ、１する非′畠に
注意深い分析から、つぎの関係か確立された。

Ｆ＝１００に／（Ｋ＋１　）　　　　　　　ｌ１ｌＩ”
＋２７３ 式中、Ｆはグルコースとフルクトースの全ｙ晴に基く平
衡時のフルクトースの係、Ｔは異性イトを行なうｔＡａ
度ｉ℃）、にはグルコース−フルクトース平衡定数を意
味する。

反ＬｒＦｌｈｒ　ｋ中におＣｖるグルコース含有シロッ
プとイソメラーゼの１１１１の実際の接触時１？ｊｌ　
Ｉｔ、固定化さ右た形のイソメラーゼを入れた反応器を
用いる場合。

一般に、つきの式を参〇＜ｉ　Ｌ　Ｔ　Ｍ出さイする。

Ａ 式中、ｔは実際の接触時間、Ｃはグルコースおよびフル
クトースの濃度、■は充填床中の遊離液体の容晴（床の
容凄−固定化酵素によって占められた容ｋ）、Ｆｅは異
性化？都度における平衡時のグルコース／フルクトース
混合物中のフルクトースのフラクション、Ｆｏは充填床
への入口におけるフルクトースのフラクション（グルコ
ース→−フルクトースに基く）、Ｆは充填床に存在す４
液体中のフルクトースのフラクションでグルコース→−
フルクトースに基く）、ｋはその異性イヒ条件ｔｃおけ
る劉↓性化の反応速度定数、八は充填床ＩＣお（ハ）る
イソメラーゼの活性を意味する。

後記実施例に従って調製した固定化イソメラーゼ１こつ
いてのに値は、各々％９　（１〜１４（１℃〕洗１１度
て約０．ｎ７−約５ｆｈｒｌｌ（冊Ｌｌ　　’　　（７
）　範囲Ｉこある。この廣１係はｌｉ位容ンｔ；当りの
活性のｌｊ’４ｊい充填床を月１いることによる。シ油
Ａｌ！におけるｆｅ）ｌｌｌｂ　＋＋；“１間を最少（
こするための要求を示している。後記の実施例の方法に
従って形成さオ］た充Ｊ１゛「床は２　（１（＋　０１
Ｇ　Ｉ　ＩＩ　／　ｍｌ−ｉで含むことかてさ、こ１１
は、段階反り器を別々のｌ６４度で用い、第１段の反（
噸乙、器への供給物を、第２段の反応器にオ）げるＮｈ
　’１品てのＴｆＬ性化の的に低温で異性化させる場合
、６１；渦反０２に中で１分以内にフルクトース含量止
面の９９．５％を達成できることとなる。段階反応相シ
ステムを利用する場合、約２０〜約８５市計％のグルコ
ースを含有するグルコース含有供給液を約り０℃〜約８
０℃、Ｐｌ−１約６．０〜約９０で、約０．５〜約２時
間の接触時間でグルコース・イソメラーゼと７８Ｍ１＋
すせて核酸【４コ番こ存在するグルコースの４０〜約４
５＠附易をフルクトースに変換させ％該”Ｉυ性化液の
、ｕ度を約り０℃〜約１４０℃に１．ｙｌさ１１．要す
ねは、該異性化液のＰＩＩを約３〜約８の１・１゛ノ囲
に調整し、このフルクトース含有液をさらに約１秒〜約
５時間グルコース・イソメラーゼと接触させて変換レベ
ルを当初のグルコース含有供給液中Ｃと存在したグルコ
ースの約５３〜約６０屯計％に増加させることからなる
酵素的にグルコースをフルクトースに変換する方法を用
いることが好捷しく、こ１１により、プシコース甘たは
他の非フルクトース。

非グルコース糖の生成は実質的ｌこ起らｆゴい。したか
つて、高効力の充填床の使用は非常に短い有効接触時間
の採用を可能番こし、こイ１は、さらに、本発明に必要
な品ｌ＾、１において起るフルクトースの分解を岐少に
することかできる。

グルコース・イソメラーゼ調定化技法の選択においては
、小さな、実質的に弁用縮性の多孔質触媒粒子か得られ
ることのてきる力／、Ｉが好捷しく・これにより、異性
什速度拡散効果の１；ＩＩ害か最少になる。別法として
、酵素と基質のＬ４好なｆ）′触を促進させ、拡散の制
限を最少にするための手段として該グルコース溶液を高
温異性化の出１に強制的に辿過させる膜の孔内に該イソ
メラーゼを１１定することもてきる。同定化に用いる担
体は、基質溶液のグルコース／フルクトース成分の望甘
しくない汚染捷たは分解をさけるために全く不溶性、不
活性であることが好捷しい。

しかし、商業的実施において、フルクトース含有シロッ
プは純グルコースから製ｉ／ｌｊさ第１るものてはない
。むしろ、澱粉加水分解物（＋ｉｉｉ記の文献中で製造
されているような）をグルコース源として用いており、
こイ１らは常に、澱粉の不完全な加水分解や、グルコー
スの戻りに由来する非グルコ−スおよび非フルクトース
糖類（殿下、多糖類という）を含有している。典型的１
こは、こ、１１らは、澱粉加水分解に由来す餐糖類の全
乾燥＠量の３〜８係を構成する。したがって、異性化を
行なうｔ１□ル度を算出する場合に・グルコース液中に
含有さ１１るいずれの多糖類ならびＣ乙達成すべき総乾
物換算のフルクトース合計、グルコース液とイソメラー
ゼの有効接触時間の間のプシコースおよび他の非グルコ
ース、非フルクトース生成物の形成のような他の因子を
考慮することが必惨である。異性化温度のり出について
の関係を以Ｆに示す。

２．３（１（１５−Ａｎ　Ｋ ００−Ｆ 式中、Ｔは異性化ｌ都度［℃）、Ｆはｌ！＋ｉ！度゛１
゛における平衡フルクトース含ｉｖｔ　（全グルコース
→−）　）Ｌｔラクトース基＜循）、Ｍは異性化生＋ｊ
１２物中に要求される乾物換算のフルクトース％、Ｃは
打効異性化接触時間の間に形成さＡまたプシコース＋他
の分解生成物受、Ｑは異性化反応の間に達成された平衡
の係、Ｐはクルコース液の多糖ｆ［Ｊ含′Ｉけ勿を意味
する。

典型的には、１％以十、奸才しくは、０．５％１．、Ｉ
。

下のプシコースおよび曲の分解生成物か形成さ才］、９
９５％の平衡が達成される。したかつて、５５５％フル
クトース（乾物換す４）のシロップを調装するには、以
下に示す多糖類’；’＋　＃）のグルコース液ζこはつ
き゛のような異性化ｈ！Ａ度か必Ｉと１てｆ）る。

グルコース液中の　　　　　　異性化７ｆｏｉ度多糖類
（乾物換算％）　　　　　（℃）０　　　　　　　　　
　９５．７ １　　　　　　　　　９９１ ２　　　　　　　　　１０４．３ ３　　　　　　　　　１０８．９ ４　　　　　　　　　　　　　　　　　１１３．８６　
　　　　　　　　　　　　　　１２４．３８　　　　　
　　　　　　　　　　１３６．１許容される商品は、平
均的に、乾物換算で５５゜５係のフルクトースを含有す
る。こイ′１は、このフルクトース−レベルで、高フル
クトース・コーンシロップ（ＨＦｃｓ）が乾物換算重着
でショ糖と等しい甘味を呈することになるからである。

さらに、５５．５％フルクトース含妙のＩＩ　ｌ”　Ｃ
Ｓは多くの食品、ことに、炭酸飲料において、ショ糖の
全部捷たは一部と置き換えて同等に使用される商品とし
て確固たる地位を得ている。米国におけるこのタイプの
ｉ−Ｉ　Ｆ　ＣＳの消費は１９８２年で２９優ポンドが
期待され、１９８３年では４０億ポンドとなることか予
想される。１１　Ｆ　ＣＳの配送・貯蔵・計滑および食
品への処方における固ｒｌの腹維さから、異なった供給
源からの製品か同等に、かつ、同時に使用できるよう番
こするため１こ、１つの１ｉＦＣＳ製造聚者製造品を（
Ｉｉ！の業者の＜）のよ一様ｉこするための普遍的な要
求が存在する。したかつて。

乾物換算で５５〜５６％のフルクトース・レベルはＩＩ
　ＦＣＳ制令１こ伴　う技南における目標レベルとして
牡に市惨な意味がある。

本発明の方〃ユは、少なくとも５３％、好１しくは、少
なくとも５４％、もつとも４「−：ｔＬ＜は・少なくと
も５５％のフルクトース・レベルを与え心。

所望により１本発明の方法におＵる基質としてグルコー
スのみを含有する溶液を月４いる代りに。

グルコースの一部かすてにフルクトースに異ｆＪＩ化さ
れたグルコースの溶液を用いることも”＝Ｉ能である。

例えば、５０％ｆてのフルクトースを含Ｔｒする異性化
グルコースの溶液を本発明の方法にイ１１：つて処理し
てフルクトースの濃ｆαを５０壬以にノヨり望ましいレ
ベル、好捷しくは、５５〜５６循の好捷しいレベルまた
はそ１１以−１−（こト１゛９加させることかできる。

炭水化物中の５０市ｉ）係以トのｉｌｉのフルクトース
を含有するグルコース溶液は公知の方法で（ＪＯｉｌｉ
てきる。

ｉｉＩ　ＷＥのグルコース濃度、１）１および１８″触
１１、″「間の要件に従って、公知のグルコースｊ′を
骨化法を適宜採用し、約９０〜約１４０℃、好−手しく
は、約１００〜約１１（１℃で操作し、本発明の高グル
コース−フルクトース・シロップを得ることかできる。

グルコース・イソメラーゼの熱安定性は、以下ｌご記載
するように、適当な活性を保持している酵素を１種また
はそれ以りの化学処理することにより、著しく増加させ
ることができる。このように処理した酵素を本明細書に
おいては［化学的に安定化さ才またイソメラーゼ」と称
する。

イソメラーゼの化学的安定化は熱安定性を増加させるこ
とのできる種々の方法で行なわれる。基本的には、酵素
がその通常の熱変性点を超えて加熱さねた場合に、折り
たたみの広がり（ｕｎｆｏｌＪＪｉｎｇ）に抵抗するよ
うな方法で酵素分子内に構造的健素を導入することであ
る。これを行なうための好ましい１つの方法は、重合性
のビニル基を含む基を該ビニル基か数箇所で酵素分子表
面にしっかりと結合するように酵素上に化学的に置換さ
せることにより酵素を改変することである。ついで、改
変させた酵素を水性溶液中、１種またはそれ以」二の重
合性ビニル化合物と混合し、混合物を共重合させて化学
的に安定化さＩ］た目イ素を形成する。この安定化され
た酵素では、形状かＩＹ素の形状を補足する構造に形１
ｊＭされた三次元重合体マ）　ＩＪラックス酵素が多く
の箇所でしっかりと結合している。

このタイプの′７７′宇化の例はマルチ不りら〔Ｍａｒ
ｔ　１ｎｃｋ　ａｔ２７　、、Ｂｉｏｃ１１ｅ＋ｎ、Ｂ
ｉｏｐｈｙｓ。

ＡＣ（ａ、４８５　、１−１２ｆ１９７７）　］　＃よ
びクリスら［Ｋｕｚｙｓ　ｅｔａｚ、、Ｂｉｏｋｂｉ＋
ｎ１ｙａ、　４２　、　ｉｔ５３　、４５３〜４５９（
１９７８）：］により１ｉ己１１ｔ９されている。

この反応を行なう場合（こ１才、イソメラーゼの変性を
起し、活性を失なわせるような条件をさけることか必要
である。例えは、極ｆ１，１な、、ＩＩ　ｉよＵｉｉｕ
ｉ度は、前記、の反応を行なうに必力゛な操作のいず１
１のｒｔｉｌ　ｌこおいても％寸た。全体１こおいても
さげｆｉｒｊれはならない。

酵素上に重合性ビニル基を置換させて酵素を改変するた
め番こ用いる薬剤の例としては、アクリロイルクロリド
、メタクリロイルクロリド、アクロレイン、クロトンア
ルデヒド−１１！ｊ水マレイン酸、３．４−エポキシブ
テン、アクリルｍ−２，３−エポキシプロピルエステル
、アクリル酸−２，３−チオグリシジルエステル、１−
アリルオキシ−３−ＩＮ−エチレンイミン）−２−プロ
パツール。

アクリル酸−〇−スクシンイミドエステル、クロロマレ
イン酸無水物、マレイン酸アシド、３−フロモプロペン
およびアリ！レイソチ３オシア不−トカ）挙げられる。

かかる化合物はイソメラーゼの遊１ｆ４１１：アミン基
、例えば、リシン基のε−アミノ基と反応することかで
きる。

当業者にとって明らかなごとく、イソメラーゼの遊離カ
ルボキシル基と反応できる曲の化合物を用いて酵素上の
容易に重合するビニル基と置換させることができる。

改変したイソメラーゼと共重合できるビニル化合物の例
としては、アクリル酸ナトリウム、メタクリル酸ナトリ
ウム、アクリルアミド、ヒドロキシエチルメタクリレー
ト、アクリロイルピペＩＪ　シン−４−スピロ−２’　
−（１’　、３／−ジオ・ヤソアクリロペンタン）、Ｉ
−アクリロイル−４−ピペリトンおよびアクリロイルメ
トキシアミンが挙けられる。一般（乙水溶性市合体とな
る（架橋剤の非イイ在下に重合させた場合）単１ｊ）休
または（１１□ｆ）休を昆合物が好捷しい。

典型的には、二官能性ビニル化合物が該単量体混合物に
含まれ（全単量体の０１〜５　！ｊ６　）　、三次元重
合体ネットワークとなる架橋部位を５える。

適当な化合物はＮ、Ｎ−メチレン−ビス−アクリルアミ
ドおよびエチレングリコールジメタクリレートである。

これらを用いる場合、重合混合物は不溶性ゲルを形成し
、それがイソメラーゼを固定する。

ビニル重合に通常用いられる開始系が好適で−例えば、
過硫酸アンモニウム十重亜硫酸ナトリウム、過酸化水素
＋硫酸第一鉄、硫酸カリウム十へ。

Ｎ　、Ｎ’、Ｎ′−テトラメチルエチレンジアミンおよ
びリボフラヒン（十光〕か挙げられる。

別法トして、三次元重合体マトリックスへの非共有結合
が、イソメラーゼ分子に所望の剛性を与え、それによっ
て、熱安定性の著しい増加を生じさせるに充分なものと
なりつる。これは−イソメラーゼを架橋重合体ゲル中に
機械的に閉じ込める場合に起すことができる。この場合
、重合工程に先立ってビニル化合物を結合させることに
よるインメラーゼの政友は必要ない。しかし、ゲルの濃
度は、有意な安定化か起る前、約３０重量％以上である
必要があり、約５０％のゲル濃度が好ましい。イソメラ
ーゼと静電気的な、水素結合を形成することのできる重
合体ゲルを与えることの＝ｒ能な単量体が必要で、例え
ば−アクリル酸すＩ−Ｕラム、メタクリル酸ナトリウム
、アクリルアミドおよびヒドロキシエチルメタクリレー
トか挙げられる。

ゲルへの組み込みによる安定化の例はマルチネクら［Ｍ
ａｒｔｉｎｅｋ　ｅｔ　ａｌ、　、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、
　　Ｂｉｏｐｈｙｓ。

ＡＣＬａ、４８５．１３〜２８（１９７７））およびグ
リスら［Ｋｕｌｙｓ　　ｅｔ　　ａｌ、、Ｊ、５ｏｌｉ
ｄ　　Ｐｈａｓｅ　　１３ｉｏｃｈｃｒｒｌ　　。

３．９５〜１．０５　（１９７８）　］によって与えら
れている。

イソメラーゼ硬質化の第３の方法は増加した熱安定性を
与えることのできる分子内架橋である。

かかる安定化の例はトルチリンら［Ｔ’ｏｒｃｌ＋　ｉ
　Ｉ　１ｎｅｔ　ａｌ、、１３ｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐ
ｈｙｓ、Ａｃｔａ、５２２，２７７〜２８３（１９７８
）］、マルチネクら［Ｍａｒｔｉｎｃｋｅｃ　ａｌ、　
、Ｊ、５ｏｌｉｄ　Ｐｈａｓｅ　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　、
　２．３４３〜３８５（１９７７））およびトルチリン
ら［Ｔｏ　ｒｃｈｉ　ｔｉｎｅＬ　　ａｌ、、Ｂｉｏｃ
ｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ａｃｃａ、５５８．ｌ　〜
１０（１９７９）］　によって検討されている。

本発明において用いる適当な架橋剤には酵素分子」二の
側鎖官能基と反応できる二官能性化合物が包含される。

もつとも一般的には、かかる官能基はアミノ基、一般に
は、カルボン酸、スルホニルハライド、アルデヒド、イ
ンシアネート、プロピオレート、などのような広範な官
能基と反応できる第一級アミノ基である。

かくして、該架橋剤には、コハク酸無水物およびアジピ
ン酸無水物のジカルボン酸無水物、グリオキサール、ス
クシンアルデヒドおよびグルタルアルデヒドのような対
応するジアルデヒド、アクロレインおよびクロトンアル
デヒ１：のような不飽和化合物、エチレングリコールビ
スプロピオレート、プロピレングリコールビスブロピオ
レ−トおよびヘキサメチレングリコールビスプロピオレ
ートのようなジオールプロピオレートならひにベンゼン
−１＋３−ジスルホニルクロリド−ナフタレン−１゜５
−ジスルホニルクロリドおよびトリル−２゜４−ジスル
ホニルクロリド°のようなジスルホニルハライドが包含
される。

さらに、酵素はアミンと反応する酸基を含有するか、含
有させることができるので、本発明においては二官能性
アミンを架橋剤として使用することができる。これらに
は、例えは、炭素原子１２個までを含有するジアミン、
例えは、フェニレンジアミン−ブチレンジアミン、ヘキ
シレンジアミン、オクチレンジアミンーペンチレンジア
ミン、エチレンジアミンおよびドデシレ／ジアミンか包
含される。

架橋剤の量はかなり変化させることかでき、架橋剤に対
する酵素の比率は約０１〜約０．０００１の範囲にわた
る。必要な結合を行ｊＳう方法はある程度選択した架橋
剤および酵素の性負によって決定される。一般に、薬剤
を適当な不メ古性Ｒ；媒中に浴解し、反応は高温に敏感
な酵素に悪影響の及ぶことをさけるために適当な低７ｒ
−＾て行なうへきである。通常、室温またＣま室温に近
いｊｒａ度での反応か好ましく、反応俗媒として水また
は水性ｍ媒を用いる。

前記の方法により、酵素分子上に重合性ビニル基を置換
させ、ついで、重合させることに加えて、さらに他の具
体例ては、分子間共有結合の形成により、予備成形した
重合体をイソメラーゼと縮合させて安定な分子を形成す
ることを包含する。例えば−天然に存在する蛋白やその
加水ｌ））解生成物のようなペプチドはペプチド結合形
成に公知の技術を用いてグルコース・イソメラーゼと反
応させて安定化酵素を形成させることができる。得られ
た生成物は水浴性ではあるが、グルタルアルデヒドのよ
うな架橋剤を用いて水軍ｍ性にすることができ、得られ
た架橋酵素系は一般により安定である。このペプチド形
成反応は公知の方法、例えはカルボジイミドの使用によ
って行なうことができる。

所望により、予備成形した分子との縮合のために、当初
の酵素を誘尊して所望の官能性を分子内に挿入すること
ができる。すなわち、カルボキシ官能性には一遊離アミ
ノ含有酵素をンカルボン酸と反応させてカルボキシ含有
酵素に夏換することかできる。

前記の具体例で用いるへき予（１１“１′ｊ成形成形体
は一所望の反応に必要なタイプおよび量の官能基、例え
ば、アミノまたはカルボキシを含有するいずれのもので
もよい。好ましいものは、天然の蛋白、例えば、キトサ
ン、酵母蛋白なとのようなポリペプチド°およびその混
合物ならびにポリエチレンイミンのようなアミノ含有重
合体である。通常、該好ましい予備成形された重合体は
水Ｒｉ性主生成物形成し、これらを架橋剤、例えば、グ
ルタルアルデヒドおよび前記したその他の架橋剤と反ニ
ジ：させて不溶性にすることが好ましい。

前記した酵素改変の方法の全てにおいて、充分な化学的
官能性、例えば−アミノまたはカルホキシル基を存在さ
せて所望の結果の有意なレベルか達成できることを確実
にすることか必要である。

例えは、酵素と反応させるへき予（＋ｆｉｉ成形された
重合体を選択する場合、該重合体か酵素分子上の該有効
基と反応性の基を含有することが必要である。かくして
、側鎖カルボキシル基を有する蛋白が酵素の側鎖アミノ
基との反応に選択される。さらに、反応体が多くの箇所
で結合することを保証し、充分な安定化を生じさせるた
めに一選択した反応体上には適当な数の反応性基が存在
しなければならない。各薬剤についてのかかる反応性基
の性質および数の決定は、もちろん、当該分野において
公知である。

酵素の熱安定性を増加てきるさらに他の方法は、感知で
きるほどの活性の損失なしに表面構造を化学的に変化さ
せることである。例えは、表面アミノ基はアミジン化［
Ｌｕｄｗｉｇ　　、　Ｍ、Ｌ、　ａｎｄ　Ｉ（ｕｎＬｅ
ｒ。

Ｍ、　Ｊ、　、Ｍｅｔｈ、　Ｅｎｚｙｍｏｌ、１１．５
９５〜６０４　（１９６７）〕またはグアニジン化（Ｋ
ｉｎｔｍｅｌ　、　Ｊ、　Ｒ，＋　Ｍｅｔｈ。

Ｆ、ｎｚｙｍｏｌ、　１１．５８４〜５８９（１９６７
）］　してアルギニンにきわめて近似した置換基を形成
させることができる。乳酸デヒドロゲナーゼおよび数種
の他の蛋白が安定化されている［Ｔｕｅｎｇｌｃｒ　、
　Ｆ’、　ａｎｄＰｆｌｅｉｄｅｒｅｒ　、Ｇ、、１３
ｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｂｙｓ＋Ａｃｔａ。

２８４．１〜８（１９７７）　、Ｍｉｎｏｔａｎｉ　、
Ｎ、　ｅｔ　ａｌ、。

Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ａｃｔａ、５８１＋
３３４〜３４１（１９７９）　；Ｃｕｐｏ、　ｌ’、　
ｅＬ　ａｌ、、Ｊ、Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　。

２５５．１０８２８〜１０８３３（１９８０）参＋１（
４，）。

可ｍ性インメラーセ調製物の活性はロイ１ら［Ｌｌｏｙ
ｄ　　　ｅｔ　　ａｌ、　　　、Ｃｅｒｅａｌ　　　Ｃ
ｈｅｍｉｓ　　【　ｒｙ＋　　　４９　　、　　　　イ
１５、ＰＰ５４４〜５５３（１９７２）］による記載に
従って測定さレル。１１ＧＩＵは−グルコース２モル／
１ｋｉｇｓ０４０．０２モル／ｌおよびＣｏＣ１２’０
．００１　　モル／ｌを含有するｐＨ６，８５のｍ液中
、前記の方法で測定した場合に−１マイクロモルのグル
コースをフルクトースに及換させるインメラーセの；ｊ
ｔである。

つぎに実施例を挙げて本発明をさらに詳しく説明する。

実施例１ 本実施例は一乾物換算でフルクトース５５．５９６の組
成物を得るだめの、土として精製トウモロコン澱粉加水
分解物からなるグルコース含有Ｎｉ液の直接異性化を示
すもので、ここでは２段階異性化法を用いる。ます、７
０℃における低温異性化を行ない、この反応生成物を化
学的に安定化されたインメラーゼを含有する第２の高温
反応器（１０５２℃）への供給物として用い′る。該化
学的に安定化されたインメラーゼは、該酵素を可溶性重
合Ｕ＝に共有的に結合させ、ついで、不溶性にして固定
化触媒を形成させたものである。

該加水分解物は米国特許第３６４４１２６号（液化〕お
よび米国特許＠３２８０００６号（糖化）の記載に従っ
てトウモロコシ澱粉から調製したものである。糖化液を
米国特許第３８３４９４０号に従って精製し、乾物換算
で９５３％グルコースを含有する生成物を得た。充分な
１ｉｌＯ）結晶グルコースを加えて、乾物換算で総グル
コース含量９７．６％とした。得られた浴液はつぎの組
成を有する。

総乾物（％）　　　　　　　　　　　　　５０２グルコ
ース（乾物換算％）　　　　　　　９７６フルクトース
（乾物換算％）ＯＯ 多糖類（乾物換算％）２４ プシコース（乾物換算％）ＯＯ ＮａＩＩＳ０３（ｍＭ）　　　　　　　　　　　　　５
０．０Ｍｇ５０４（＋ｎＭ）　　　　　　　　　　　　
　　　５．ＯＣｏ　ｃ　ｅ　２　（館４）　　　　　　
　　　　　　　　　０．１ｐＨ５８ この基質浴液を３．２　ｍｌ７分の流速で低温反騰器で にポンプで通し一７０°Ｃ低温異性化を行なった。

△ 低温（７０℃フィンメラーゼ反此：器は一へｌ〜ｊおよ
び出口を有し、サーモスタットからの水を循環させるジ
ャケットを備えた１インチ径のガラスかラムにｌ）　Ｅ
　Ａ　Ｅ−セルロース（米国特許第３７８８９４５号に
従って調製）上に固定化したイソメラーゼを充填して調
製した。充填物」二のヘット°・スペースに温度計を入
れ、ガラスピーズて満たし、できるたけ無効な空間のな
いようにした。該反ニジ：器には一２００００１ＧＩＵ
となるように固定化イソメラーゼを充填し、充填床の＋
＋’：４さは約１５Ｃｍであった。反応器から流出する
最初の１０１００Ｏをすて−その後に流出する液を集め
て一第２の高温異性化に用いた。

高温反応器で用いた化学的に安定化した酵素はつぎのよ
うにして調製した。

ストレプトマイセス・ルビゲノサス（ Ｓｔｒｅｐｃｏｍｙｃｅｓ　ｒ１＋ｂｉｇｅｎｏｓｕｓ
）　ＡＴＣＣ２１１７５から由来したストレプトマイセ
ス・ルビゲノサス閑をつぎの組成の培地で好気的液体醗
酵により増殖させた。

重量％ デキストロース　　　　　　　　　　　　　９．０コー
ン・ステイープ・リカー（固形分）１６リン酸ジアンモ
ニウム　　　　　　　　　　００８硫酸マグネシウム　
　　　　　　　　　　　０．０６発泡防止剤（Ｐｌｕｒ
ｏｎｉｃ　ＰＬ−６１Ｊ　　　　　Ｏ，００３この培地
を１２１　℃で４５分間滅菌し、冷却し、ｐＩｌ５．８
〜７０に調製した。前記のストレプトマイセス・ルビゲ
ノサス株を用いて調製した種醗酵物からなる接種物を１
４％（ｖ　／　ｖ　）の量でこれに接種した。醗酵を無
菌条件下に３０℃で約６０時間０．６５ｖｖｍでエアレ
ーションして行なった。ストレプトマイセス・ルビゲノ
サスＡＴＣＣ２１１７５も接種およびイソメラーゼの産
生に用いることができ、この場合はつぎの組成の培地が
用いられる。

重ｔｉｔ％ デキストロース　　　　　　　　　　　　０．２４コー
ン・ステープ・リカー（固形分〕１５ソルビトール　　
　　　　　　　　　　１６Ｃｏ　Ｃｌ　２　　　　　　
　　　　　　　　　　ｏ、　０２リン毅ジアンモニウム
　　　　　　　　　０．５６キシロース　　　　　　　
　　　　　　　　１．０グルコース・イソメラーゼを、
０３５％３５％マクアラ　Ｍａｑｕａｔ）ＭＣ１４１２
（メイソン・ケミカル社製（Ｍａｓｏｎ　Ｃｈｅｍｉｃ
ａｌ　Ｃｏ、））およびｌ　Ｏ１）ｐＨｌ　Ｊ！５卵リ
ゾチームを添加して、５時間４０℃、１ｉ＋（３，３〜
６６にて攪拌することによりストレプトマイセス・ルビ
ゲノサスから抽出した。ついて、混合物を濾過し、粗製
の未精製グルコース・イソメラーゼｍ液を得た。

この粗製イソメラーゼを、Ｉ）　ＥＡ　ｌｉ−セルロー
ス（米国特許ｆ３，８２３，１３３　　号により製造）
に吸着させ、濾過し、該吸着生成物をＱ、１ＭＮａｃ７
俗液で洗浄し、不純物を除去した後、０．４５ＭＮａＣ
ｌｇ液と接触させることにより脱着させて精製した。全
ての浴液のｐＨは、精製工程中７８５に維持した。この
ようにして得られた部分精製イソメラーゼｍ液を０℃で
３倍容量の９５％エタノールと混合し、イソメラーゼを
沈澱させた。パーライト７過助剤を加え一濾過して固形
物を回収し、風乾し、２ｓｏＯＩＧＩ’Ｕ／Ｐを含む可
溶性イソメラーゼ調製物を得た。

精製したイソメラーゼを室温てｌ　ｍ　ＭのＭｎ　Ｃ（
２２に俗解して１０　”Ｖ　／　ｍｌのイソメラーゼを
含有する混合液を得、濾過助剤を戸去する。この調製物
の比活性は３７．３１ＧＩＵ／〜蛋白であった。

キトサン３９０ｆｊ〔ヘルクルス社（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ
Ｉｎｃ、　、ＷｉｌｍｉｎｇＬｏｎ　、　Ｄｅｌａｗａ
ｒｅ　ｌ　９８９９　）よりノＫｙｔｅｘｌを０．０８
Ｎ　　ＨＣｌ３１に浴解して可ｍ性重合体溶液を得た。

浴解さぜたら、ＮａＣ／３８０ｇを加えて、このキトサ
ンｍ液のＮａＣｌ　濃［を０．５　Ｍとし、こ０）７Ｂ
液を８ＮＮａα■でｐＩｌ　６−１５に調製した。最後
に、このキト→Ｊ−ンｍ液をホワットマン＃３Ｐ紙で濾
過して不溶性物質を除去シタ。Ｑ、　５　Ｍ　　ＮａＣ
Ｊを含む、ＰＩＩ６１５　のこの０．３％キトサンｌ谷
液液１３１．１００ＯＯＯＩＧＴＵの活性の可溶性イン
メラーゼ１００ｒｎｌ、キシリトール〔シグマ社（Ｓｉ
ｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｇｏ、））　１９７６ｖお
よびＣＯＣｌ２・６６Ｈ２Ｏ０６１９を加えた。

この溶液を２時間攪拌し、ついて、１−エチル−３−ジ
メチルアミノプロピル力ルホジイミ）′（シグマ社）６
．２４！ｌｉ’を加え、インメラーセのカルボキシル基
とキトサンのアミノ基を多くの箇所の様式で共有的に結
合させた。室温で２時間後、８ＮＮａＯｔｌてｐｌ−１
３，Ｑに調製した５０％（Ｗ／Ｗ）グルタルアルデヒＷ
ｒ＆液〔イーストマン・コダック社（Ｅａｓｔｍａｎ　
Ｋｏｄａｋ）　］　ｌ　５．５　ｍＡ！を該反応混合液
に加え、共有的に結合したインメラーセーキトサン複合
体を不俗性化した。１５分後、Ｉ）Ｉｆ　８．ＯのＩ　
１１１＋リン酸塩ｍ液２１を加えて、グルタルアルデヒ
ド添加後に形成されたゲルの粉砕を容易にする。得られ
た不ｍ性化インメラーゼーキトサンを、ブフナー真空フ
ィルター上、脱イオン水て洗浄する。

ついで、この稠製物を室温にて一夜風乾させ、粉砕し、
１２〜６０メツシユに篩別した。この乾燥触媒は３８４
１ＧＩＵ１５’の活性をイｆしていた。

１０５２℃の反応器はつぎのようにして調製した。触媒
１３Ｐを基質中に懸濁させ、ロータリー真空ポンプで室
温にて６０分間脱気した。脱気したスラリーを用いて、
ジャケット付カラム中、１．５×２０−の床を調製した
。充填床は４９９２ＩＧＩＵのインメラーゼを含有して
いた。

第１段の７０℃異性化で得られた基質をｐ［Ｉ　（３，
７５に調整し、乾物含量４２．０％に稀釈した。この基
質を１．９６ｍ１／分の流速でｌ　Ｑ　ｐｓｉｇの圧力
下の該高温反応器にポンプで通した。カラム内の温度を
床の直上に位置させ、無効な容積をできるたけ少なくす
るための０．５　ｃｍガラスピーズに囲まれた温度計で
モニターした。ついで−サーモスタット付の１０６℃の
浴からジャケットを通して循環される浦により、カラム
の温度を急速に上昇させた。

カラムからの流出ｌ夜を、５０〜５８％フルクトースを
読み取るために目盛づけされた記録式旋光計でモニター
した。カラムの温度か１０５２℃に達し、流出液のフル
クトース含量が所望のレベルに達した後、流出液を集め
、１１」、ちに水浴中で冷却した。１Ｍクエン酸の添加
によりＩ）ＩＩを４．９０　ニｊｌ＾］整した。流出液
は見かけ上のフルクトースレベルが５５％以下に低下す
るまで集めた。

７０℃および１０５２℃の反心器から得られた異性化石
液の炭水化物組成および色を分析し、その結果を未異性
化基質ｍ液の同様な分析結果と比較した。結果をつぎの
第１表に示す。

第１表 ７０℃および１０５２℃で異性化された基′Ｉ！′ｉ′
ｍ液の組成 この結果に示すごとく、乾物換算でプシコースを０．４
重量％以下、色を＜２０（ＣＩＲＦＸｌｏｏ）に維持し
て５５．５％フルクトースレベルが達成された。

実施例２ 本実施例は、乾物換算で５５．２％フルクトースを含有
する組成物を得る高温におけるグルコース含有溶液（精
製トウモロコシ澱粉加水分解物および結晶グルコースか
らなる）の直接異性化を示すもので、ここでは、＠２段
階がポリエチレンイミンと複合体を形成させ、グルタル
アルデヒドの処理によって不溶性化させたグルコース・
インメラーゼからなる化学的に安定化されたインメラー
ゼを用いる２段階異性化を用いている。

安定化インメラーゼの調製 実施例１と同様にしてグルコース・インメラーゼｍ液を
調製した。室温で精製インメラーゼを１ｍＭ　　Ｍ　ｎ
　Ｃ１２に浴解し、９　ｍｇ／　ｍｌのインメラーゼを
含有する混合液を得、濾過助剤を許去した。

１０％（Ｗ／Ｖ）ＰＩＩＩ−６（ポリエチレンイミン、
分子量６００、ｐｌ−１８）〔ダウ・ケミカル社（１）
ｏｗ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、　）］　６０　ｍｌお
よびキシリトール３７を該酵素ｍ液に加え、１５分間］
（１拌した。

２、５１１＋Ｉグルタルアルデヒド１０＊＋ｌを加え、
／Ｍ合液を室温で２時間撹拌した。本市性化酵素を沖過
して回収し、水洗し、３７℃の対ｄＬオーブン中で−イ
ソ乾燥した。乾燥後、約７７ｓｌＧＩＵ／ｇをｒｑ有す
る固定化イソメラーゼ１２８７を回収した。

この固定化酵素１２ｇを基質中に１冒濁し、室？’ｕ’
ｒで真空下、６０分間脱気し−１，５ｃｍ　ｔｌの１’
＋：ｆｌ　７ＡＡ反↓し）４調製のために用いた。

この反応器用の基質は実施例１と同様にして２段階異性
化の第１段階で調製したものである。この基質の組成は
つぎのとおりである。

全乾物〔％〕　　　　　　　　　　　　　４２６グルコ
ース（乾物換算％〕　　　　　　　４６４フルクトース
（乾物換算％）５］３ 多糖類（乾物換算％）２３ プシコース（乾物換算％〕０Ｏ Ｎ　ａ　ＨＳ　０３（ｍＭ　）　　　　　　　　　　　
　　　　　０Ｍ　ｇ　Ｓ　Ｏ４（ｒｎＭ　）　　　　　
　　　　　　　５０ＣｏＣＩ！２　（ｍＭ）　　　　　
　　　　　　　　０．１ｐＨ６，７５ この基質をポンプで５．＋７！／分の流速で６０°Ｃの
反応器に４５分間通した。ついて、カラム温度を１０１
６℃に」−昇させ、流速を２ｍｌ／分に識少させた。カ
ラムに１２ｐｓｉの背圧をかけ、基質の沸騰を防いだ。

流出液を、５０％〜５８％のフルクトースを読みとれる
ように目盛付（月、た記録式旋光計でモニターした。フ
ルクトース５５％以上の流出液を水浴中で集め、］、Ｑ
Ｍクエン酸でｐＨ４Ｑに調製した。

高温反応器からの流出液−第１段階反応器からの基質お
よび第１段階の反応器用の基′Ｇとして用いた当初のグ
ルコース含有液の炭水化物組成および色を分析した。結
果を第２表に示す。

第２表 ＠１段階および第２段階異性化からのｌ液液の組成 この結果に示すご七く、乾物換↓？］でプシコース０、
２　’Ｑ　、＠　％以下に維持して５５２％のフルクト
ースレベルが達成されたことを示している。

実施例　３ 本実施例は、第１段階反応器か７０℃で、第２段階（高
温９反↓じ（器が１１０．４℃である２段階異性化法に
よるグルコースの５７２％フルクトースへの直接異性化
を示す。高温反ル・て用いた化学的に安定化されたイソ
メラーゼは酵素が可溶性重合体に共有結合し一ついで、
下型性化されて固定化触媒を形成したものである。

第１段階の７０℃の反応器における基質およびその反換
は実施例１に記載したとおりである。

１１０４℃の高温反応器で用いた固定化触媒も実施例１
に記載したとおりである。

１１０４℃の反応器はつぎのようにして調製した。触媒
の２８４２の部分を基質に懸濁させ、室温で６０分間真
空下で脱気した。脱気したスラリーを用いてジャケット
付ガラスカラム中−２５×１２．４ｃｍの床をＪ１Δ製
した。充填床は１０８８５１ＧＩＵを含有していた。

第１段階の７０℃異性化で調製した基質をｐ　ｌ−１６
４７に調整し一乾物含量４２０％に稀釈した。

ついで−この基質を温度６０℃で３０分間−３３８ｍ１
１分の流速で、１２ＰＳｉの圧力下の高温反応器にポン
プで通した。カラム内の温度を、床の直上に位置させ、
無効な容積をできるたけ少なくするための０．３　ｃｒ
ｈガラスピーズによって囲まれた温度計でモニターした
。ついて、サーモスタット住宅からの１１１℃の浦をジ
ャケットを通して循環させ、カラム温度を速かに」−昇
させた。

カラムからの流出液を、５０〜５８％フルクトースを読
み取る目盛の付いた記録式旋光計でモニターした。カラ
ム温度が１１０４℃に達し、流出液のフルクトース含量
が所望のレベルに達したら一流出液を集め、直ちに水浴
中で冷却した。Ｉ　Ｎ＋クエン酸を添加してｐｉ−１４
，Ｑに、、１！、Ｊ整した。

７０℃および１１０４℃の反応器から得られた異性化溶
液の炭水化物組成および色を分析し一未異性化基質溶液
について同様に行なった分析結果と比較した。結果を第
３表に示す。

第３表 ７０℃および１１０．４℃で異性化された基質溶液の組
成 この結−果は、乾物換算で０４重量％以下のプシコース
および２０以下の色（ＣＩＲＦＸＩ　００　）を維持し
て５７，２％のフルクトースレベルか達成されたことを
示す。

実施例４ 本実施例は、乾物換算°てフルクト−ス５６３％の組成
物を得る、主として精製！・ウモロコシ澱粉加水分解物
からなるグルコース含有ｍ液の直接異性化を示すもので
、ここでは２段階異性化法を用いた。７０℃における低
温異性化をます行ない、その反応生成物を、化学的に安
定化されたイソメラーゼを含む第２の品温反応器（１０
３，３°Ｃ）への供給物として用いた。化学的に安定化
されたイソメラーゼは酵素か保護蛋白（酵母から納得し
たような）と共反応したものである。

基質および実験条件の記載を含め、低ｉ’Ａ＾異性化工
程は実施例１に開示しである。

高温反応器で用いる化学的に安定化されたグルコース・
イソメラーゼ酵素はつきのとおり調製した。化学的安定
化用の可溶性グルコース・イソメラーゼは実施例１に記
載の方法に従って調製、ｆｌ“１製した。この調製物の
比活性は約４ＱＩＧＩＵ／ｍ２蛋白てあった。保護蛋白
は製パン酵母からつきの方法で得られた。製パン酵ＩＪ
湿潤ケーキ１２２７に水１００（ｌおよびトルエン５０
０ｙ−を加えた。混合液を室温で一夜攪拌し、ついて、
８５°Ｃに加熱し、この温度で３０分間保持した。ブフ
ナーｐ斗で混合液を濾過した。はとんど全てのトルエン
Ｃま下型性の細胞片と共に残り、−万一水性１戸液は可
溶性酵母エキスを含有していた。この水性Ｐ液を２７６
２に濃縮しくロータリー・エバポレータ、４０℃）、攪
拌しながらトリクロロ酢酸を加えた。沈澱した酵母蛋白
を集め、０．１　Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７，
０）に再ｍ解した。濾過して清澄にした後、溶液をアセ
トン９ｏｏｒｎｌ（約３倍容〕で処理した。沈澱を集め
、０．０１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７，０）に
浴解し、得られた浴液を０．０１Ｍリン酸ナトリウム緩
衝液に対して透析した。得られた生成物（１５０ｍ７り
に製パン酵母から得られた保護蛋白とラベルを付した。

キトサンｃ　Ｋｙｔｅｘ）　２４　ｙを０．０８Ｎ　Ｈ
ＣＩ！ＩＵｌ’ｊＪＨして０６％キトサン溶液を調製し
た。この溶液を８Ｎ　　Ｎａ（Ｍ−１テＰＨ６，２に副
整し、小ワツトマン４１３Ｐ紙で許過し、脱イオン水１
６１に対して透析した。４００ｍ１”−カーに約１００
’０ＯＯＩＧＩＵの可溶性グルコース・イソメラーゼ（
濾過助剤と混合〕−キシリトール１ｇおよび製パン酵母
から得られた保護蛋白１００ｍ１（２／３）を入れた。

この混合液にＭ　ｇ　Ｓ　０４・７　Ｈ２０２，４”５
’　オヨヒ１　’ＣｏＣ１２溶液１μｌを加えた。混合
液を濾過して濾過助剤を除き、得られた溶液を２１丸底
フラスコ中てほぼ濃縮乾固させた（ロータリー・エバポ
レータ、〜４０℃）。このフラスコにキトサンＣＰ１１
６．２）８００ｍｌを加えた。混合液をほぼ濃縮、ｉ、
Ｚ固さぜ（ロータリー・エバポレータ、〜４０℃）−５
０％グルタルアルデヒド俗液溶液ｐＨを６５に調整）６
４０）ｂｌを加えた。フラスコからゲルを取り出し、ｕ
、ｓ、　＃ｉａ　ｏメツシュのスクリーンに強制的に通
し、〜３７℃でオーブン乾燥した。この乾燥酵素調製物
を篩別して微細粒子を除き（Ｕ、　Ｓ。

＃８０メツシュ・スクリーン〕、最終生成物８９ｇを高
温異性化に用いた。

１０３３°Ｃの反応器はつきのようにしてＪ＋’Ｊ製し
た。前記で調製したグルコース・インメラーゼ調製物８
９ｇを基質に懸濁さぜ、室ｌ晶て真空下、３０分間脱気
した。脱気したスラリ＝を用いてジャケット付ガラスカ
ラム中、１５Ｘ２９ｃｍ床を調製した。

第１段階の７０℃異性化てＮ１“、１製した基質をＩ）
ＩＩ６．７５に調整し、乾物４２０％に稀釈した。この
基質を約１．５ｍｌ／分の流速で、６０℃にて３０分間
高温反応器にポンプで通した。カラム内の温度を、床置
上に位置させ、無効な容積を最小にするためのガラスピ
ーズ（径０．５　ｃ＋ｎ　）で囲まれた温度計でモニタ
ーした。ついで、サーモスタット住宅からの１０４℃の
油をジャケットを通じて循環させてカラムの温度を速か
に上昇させた。

カラムからの流出液を、フルクトース５０〜５８％を読
み取るための目盛付記録式旋光計でモニターした。５５
％以上のフルクトースが生成されるまでフラクション（
約５Ｔｎｌ）を集め、該フルクトースが生成された時点
で実験を終Ｊ′シた。試料収集の間、流出液を水浴中で
冷却し、ｌ　Ｍクエン酸０、１　＋７＋７！、ついで稀
塩酸を加えてｐＨを〜４０に調整した。

７０℃および１０３３℃の反応器から得られた異性化溶
液の炭水化物組成および色を分析した。

この結果を未異性化基質溶液について同様に分析した結
果と比較した。結果を第４表に・」；ず。

第４表 ７０℃および１０３．３℃で異性化した基質溶液の組成 この結果に示すごとく、乾物換算で０２重計９６以下の
プシコースを維持しながら、ｓ　６．３９６のフルクト
ースレベルか達成でキタ。

実施例５ 本実施例は、乾物換算で５５４％フルクト−７゜の組成
物を得る、王としてトウモロコシ澱粉加水分解物からな
る低塩濃度のグルコース含有溶液の直接異性化を示すも
ので、ここでは、２段階異性化法を用いた。まず、７０
　’Ｃにて低温異性化を行ない、その反応生成物を化学
的に安定化されたインメラーゼを含有する第２の高温反
応器（１１２６℃）の供給物として用いた。化学的に安
定化されたインメラーゼは酵素が可溶性重合体に多くの
箇所の結合様式で共有結合し、ついで、本市性化された
固定化触媒を形成したものである３゜加水分解物はトウ
モロコシ澱粉から、米国特許第３６４４１２６号Ｃｔｉ
化）および米国特許第３２８０００６号（糖化）に記載
される方法で調製したものである。糖化液を米国特許ｉ
３８３４９４０号に従って精製して乾物換算で９３８％
のグルコースを含有する生成物を得た。充分な量の結晶
グルコースを加えて乾物換算で９６９％のグルコース含
量とした。得られた浴液はっぎの組成を有していた。

全乾物ｃ％）　　　　　　　　　　　　　５ｏ３グルコ
ース（乾物換算％）　　　　　　　９６９フルクトース
（乾物換算％）０１ 多糖類〔乾物換算％〕３１ プシコース〔乾物換算％）ｏ。

ＮａｆｌＳ０３（ｍＭ　）　　　　　　　　　　　　　
　２．５Ｍｇ　Ｓ　０４（ｒｎＭ　）　　　　　　　　
　　　　　　　２．５Ｃｏ　Ｃ１２（ｒｎＮ４　）　　
　　　　　　　　　　　　　ｏ、　１ｐａｌ　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　５８この
基質溶液を、実施例１に記載したと同様な低温反応器に
２．５　ｍｌ　７分の流速でポンプにより通し、７０℃
で低温異性化を行なった。反応器から流出する最初の１
０１００Ｏをすて、その後の流出液を集めて第２の高温
異性化に使ｊ（１シた。

高温反応器で用いた化学的に安定化された触媒はつぎの
とおり調製した。実施例１に記載の方法により、可溶性
グルコース・イソメラーゼを調製精製した。この調製物
の比活性は約４０１ＧＩＵ／ｍ’ｉ’＆白でアラた。−
１−）す７　（Ｋｙｔｅｘ）　４８．４　Ｆｌを０．０
８　Ｎ　　ｌＩＣ４に〆谷解して”Ｉ　ｆ８性！Ｒ合体
、ホリアミンの溶液を得た。俗解したら、このキトザン
溶液にＮａＣ／４３８５１’を加えてＮａＣＪ濃度を０
５Ｍとし、得られた溶液を８Ｎ　　Ｎａ（Ｊｔｌてｐ１
１６．１に調整した。ついて、キトサンａｆ液をホワッ
トマン＃３Ｐ紙て濾過して不溶性物質を除去した。こｏ
Ｊ　Ｏ，５Ｍ　ＮａＣ１を含むｐ）１６．１０）　０．
３％キトサン浴液１５／に約６０２０００ＩＧＩＵの活
性の可溶性イソメラーゼ５００ｒｎｌ−キシリトール（
シグマ社）２３６５’およびＭｎ　Ｃ１２・４Ｉ１２０
３．０７９を加えた。この溶液を２時間攪拌し、１−エ
チル−３−ジメチルアミノプロピルカルポジイミド（シ
グマ社）７．４４９−を加え、イソメラーゼのカルボキ
シル基をキトサンのアミノ基土多くの箇所の様式で共有
結合させた。室温で２時間後、８ＮＮ　ａ　ＯＩ−１で
ｐＨ６，Ｑに３周整した５０％（Ｗ／Ｗ）グルタルアル
テヒト浴液（イーストマン・コダック社）１５５ｉを加
え、共有結合したイソメラーゼ−キトサン複合体を本市
性化した。１５分後、ｐＨ８，０の１Ｍリン酸塩溶液４
ｔ！を下型性インメラーゼーキトサンと混合する。この
固定化イソメラーゼ−キトサンをホワットマン＃３涙紙
を用いたブフナー真空フィルター」−５脱イオン水てｌ
ル浄する。、ｊ！、！ｌ製物を風乾し、粉砕し、１２〜
６０メツシユの範囲で篩別した。この乾燥触媒は８０３
１ＧＩＵ／りの活性を有していた。

１１２６℃の反応器はつぎのようにして調製した。触媒
の７．０７部分を基質に懸濁し、室温で６０分間真空下
に脱気した。脱気したスラリーを用いて、ジケット付ガ
ラスカラム中−１，ＯＸ４０ｃｍの床を調製した。充填
床の活性Ｃま５６２１１ＧＩＵであった。

第１段階の７０℃異性化から得られた基質をｐＨ６５５
に調製し、脱イオン水て稀釈して乾物４２０％とし、こ
れにより、塩濃度もＮａｆｌＳＯ３２，１ｍＭおよびＭ
ｇ５０４２．１ｍＭ　に低下した。こ（Ｄ基質を温度６
０．０℃、流速８ｍｉ／分て１２ｐｓｉｇの圧力下の高
温反応器カラムに１０分間通した。カラム内の温度を床
置上に位置さぜ−）（！（効な容積をできるだけ少なく
するために目盛のところまで入れた砂に囲まれた温度計
てモニターした。ついてサーモスタット住宅から循環さ
れる約１１４℃の浦てカラムの温度を速かに上昇させた
。カラム温度を１１２６℃に上昇させ、流速を１．８ｃ
＋ｍｌ／分に減少させた。

カラムからの流出液を、フルクトース５０〜５８％を読
み取る目盛付記録式旋光計てモニターした。カラム温度
が１１２．６℃に達し、流出液のフルクトース濃度が所
望のレベルに達した後、流出液を集めた。＠ちに１Ｍク
エン酸を加えてｐＨを４０に調整した。流出液は見かけ
のフルクトースレベルが５５％以下に低下するまで集め
た。

７０℃および１１２．６℃反応器から得られた異性化溶
液の炭水化物組成および色を分析［−１その結果を未異
性化基質溶液について同様に分析した結果と比較した。

結果を第５表に示す。

第５表 ７０℃および１１２．６℃での異性化におけるこの結果
に示すことく、乾物換算て０２重量％以下のプシコース
および＜９（ＣＩＲＦＸｌｏｏ）の色を維持しながら一
５５４％のフルクトースレベルを達成できた。

実施例６ 木実施例は、乾物換算でフルクトース５４．８９６の、
非常に低プシコース含１ｉｉの〔プシコース＜０１％お
よび色（（２ＣＩ　Ｒ］・Ｘ１００）］組成物を得る、
上として精製トウモロコシ澱粉加水分解物からなる低塩
濃度のグルコース含有ｌｒＩ液の直接異性化を示すもの
で、ここでは２段階異性化法を用いた。第１段（低温）
反応器は７０℃、第２段Ｇ１温〕反応器は１０５８℃で
あった。高温反応器に用いた化学的に安定化したイソメ
ラーセは、酵素か多（の箇所の結合様式で可溶性重合体
に共有結合し、ついて、不ｍ性化されて固定化触媒を形
成したものである。

７０℃の第１段の反応器の基質およびその敦換は実施例
５に記載したとおりである。

１０５８℃の高温反応器で用いた固定化触媒も実施例５
に記載したとおりである。

１０５８℃の反応器はつきのとおり調製した。

触媒の５６３ｙ一部分を基質に）Ｖ濁し、室温で６０分
間、真空下に脱気した。脱気したスラリーを用いて、ジ
ャケット付ガラスカラム中て］、ＯＸ３２ｃｍの床を調
製した。充填床の活性は４５２１．　Ｉ　ＧＩＵであっ
た。

第１段の７０°Ｃ異性化で得られた基質をＰＩＩ６．５
に調整し、脱イオン水て４２．０％の乾物含量に稀釈、
これにより、塩濃度も、ＭｇＳＯ４２，ｌ、ｍＭおよび
Ｎ　ａ　ＨＳ　０３２．１　ｒｎＭに低下した。この基
質を６００℃の温度て、８ｒｎｌ／分の流速にて、１０
ｐｓ　ｉｇの圧力下の高温反応器カラムに１０分間ポン
プで通した。カラム内の温度は、床置上に位置させ、無
効な容積をできるたけ少なくするために目盛の最初のと
ころまで詰めた砂に囲まれた温度計でモニターした。つ
いで、サーモスタット寸浴からジャケットを通して循環
される約１０７°Ｃの浦でカラムの温度を速かに上昇さ
せた。

カラムからの流出液はフルクトース５０〜５８％を読み
取るための目盛付の記録式旋光計でモニターした。カラ
ム温度が１０５８℃に達し、流出液のフルクトース含量
が所望のレベルに達したら流出液を収集した。直ちに、
ＩＮｔクエン酸の添加によりｐ　Ｈを４９０に１．！１
整した。

７０℃および１０５８℃の反応器からの異性化ｍ液の炭
水化物組成および色を分析し、その結果を未異性化基質
溶液の同様な分析結果と比較した。

結果を第６表に示す。

＠６表 ７０℃および１０５．８℃で異性化した基Ｗｌｌ液液組
成 この結果に示すごとく、乾物換算で０１％以下のプシコ
ースおよび２以下の色ＣＣＩｋＦ×１００）を維持して
５４．８％のフルクトースレベルが達成された。

特ｎ−出願人　ナビスコ・ブラング・インコーポレイテ
ッド代理人弁理士　肯　山　　保ほか２名

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）グルコース含有供給液を化学的に安定化させたグ
   ルコース・イソメラーゼと、温度約９０℃〜約１４０℃
   、ｐＨ約３〜約８にて、プシコースおよび／または他の
   非フルクトース、非りルコース糖の何ら実質的な形成な
   しに該液中のフルクトースの最終濃度が全炭水化物含量
   に基いて少なくとも約５３〜約６０重量％となるに充分
   な接触時間接触させることを特徴とするグルコースのフ
   ルクトースへの異性化法。 （２）該クルコース含有液が、トウモロコン編粉の加水
   分解により得られる前記第（１）項の方法。 （３）該グルコース含有供給液か、トウモロコツ澱粉加
   水分解物を異性化して、全炭水化物含量に基いてフルク
   トース含量的５２％までとしたものである前記第（１）
   項の方法。 （４）グルコース・イソメラーゼ源か、ストレプトマイ
   セス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）種、その変異種、変
   種および遺伝千載変種からなる群より選ばれた微生物で
   ある前記第＋１ｊ〜（３）項のいずれかの方法。 （５）グルコース・イソメラーゼ源か、ストレプトマイ
   セス・ニス・ビイ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　Ｓｐ、
   　）ＡＴＣＧ２１１７５　、その変異種、変種および遺
   伝千載変種からなる群より選ばれた微生物である前記第
   （１）〜（３）項のいずれかの方法。 （６）グルコース・イソメラーゼ源か、変異クルコース
   ・イソメラーゼ遺伝子を導入した微生物であり、該変異
   遺伝子が熱安定性の高いグルコース・イソメラーゼを提
   供するものである前記第（１）〜（５）項のいずれかの
   方法。 （７）グルコース・イソメラーゼか、熱安定性クルコー
   ス・イソメラーゼである前記第（１）〜（６）項のいず
   れかの方法。 （８）熱安定性グルコース・イソメラーゼが、バチルス
   ・ステアロサーモフィルス（Ｂａｃｉ／ｊｕｓ　ｓｔｅ
   −ａｒｏｔｈｅｒｍｏｆｈｉｌｕｓ）由来である前記第
   （６）項または第（７）項の方法。 （９）熱安定性グルコース・イソメラーゼか、バチルス
   Ｉリケニホルミス（Ｂａｃｉｇ４ｕｓ　Ｉｉｃｌｌｅｎ
   ｉｆｏｒ−ｍｉｓ）由来であるｌ１ｉｌＩ記第（６）項
   または第（７）項の方法。 叩熱安定性クルコース・イソメラーゼか、サーモアクチ
   ェマイセス（ＴＩｔｅｒｍｏａｃｔｉｎｏ＋ｎｙｃｃｓ
   ）、サーモポリスポラ（Ｔｈｅｒｍｏｐｏ５ｙｓｐｏｒ
   ａ）　、サーモモノスポラ（１’ｈｅｒ＋ｎｏｍｏｎｏ
   ｓｐｏｒａ）またはンウドノカルデア（Ｐｓｅｕｄｏ＋
   １ｏｃａｒｄｉａ）属の高温性微生物由来である前記第
   （６）項または第（７）項の方法。 ｆＩｌｌ　熱安定性クルコース・イソメラーゼか、アム
   フ５　リエラ（ＡｍｐｕＪ’ｌａ　ｒ　ｉ　ｅｌｌａ）
   属の微生物由来である前記第（６）項または第（７）項
   の方法。 （１２）酵素変性防止量の亜硫酸の水溶性塩か異性化基
   材中に存在する前記第（１）〜（１１）項のいずれかの
   方法。 （１３）クルコース含有供給液か、約３０〜約５０重量
   ％の炭水化物を含むＩＩ’Ｊ　ｇｅ第（１）〜（１２）
   項のいずれかの方法。 （１４）クルコース含有供給液を化学的に安定化させた
   グルコース・イソメラーゼと約１００°Ｃ〜約１１０℃
   で接触させる前記第（１）〜（１３）項のいずれかの方
   法。 （１５）異性化基材のｐ　）−１を約５〜約６．５に維
   持する前記第（１）〜（１４）項のいずれかの方法。 （１６）接触時間か、約２分〜約３０分である前記第（
   １）〜（１５）項のいずれかの方法。 （１７）化学的に安定化させたグルコース・イソメラー
   ゼを固定化形にて用いる前記第（１）〜（１６）項のい
   ずれかの方法。 ｆ１８＋化学的に安定化させたクルコース・イソメラー
   ゼ力、ジエチルアミンエチルセルロース−１−に固定化
   されている前記第（１η項の方法。 （１９）第１工程として、グルコース含有供給液をクル
   コース・イソメラーゼと、温度約２０’Ｃ〜約８０℃、
   ｐＨ約６〜９にて、接触時間約０．５〜約２時間で接触
   を行ない前記液中の全炭水化物に基いて約５２市量％ま
   でのフルクトースレベルを達成し、第２工程として、異
   性化基材の温度を約９００Ｃ〜１４０℃に昇温させ、要
   すれは、約；３〜約８の範囲にｐＨを調整し、ついて、
   該フルクトース含有液を、さらに、フルクトースレベル
   を約５３〜約６０重量％に増加させるに充分な時間、化
   学的に安定化させたグルコース・イソメラーゼと接触さ
   せる前記第（１）〜（１８）項のいずれかの方法。 １２０）　生成したフルクトース−クルコース・ンロソ
   ブが約８０℃以下の温度に冷却される前記第（１）〜（
   １９）項のいずれかの方法。 （２１）酵素を異性化混合液との接触から除いた後、異
   性化混合液を温度約２０℃〜約８０°Ｃに冷却する前記
   第（１）〜（２０）項のいずれかの方法。