BRPI0804288A2 - extratos de lippia salviaefolia cham., frações ativas, composições e seu uso - Google Patents
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Abstract
EXTRATOS DE LIPPIA SALVIAEFOLIA CHAM., FRAçõES ATIVAS, COMPOSIçõES E SEU USO. A presente invenção refere-se aos extratos de folhas de Lippia salviaefolia cham., suas frações ativas, composições farmacêuticas e/ou cosméticas e seu uso como antimicrobiano natural (conservante).
Description
"EXTRATOS DE LIPPIA SALVIAEFOLIA CHAM., FRAÇÕES ATIVAS,COMPOSIÇÕES E SEU USO"
Campo da Invenção
A presente invenção refere-se aos extratos de folhas deLippia salviaefolia Cham., suas frações ativas, composiçõesfarmacêuticas e/ou cosméticas e seu uso como antimicrobiano natural(conseryante).
Antecedentes da Invenção
O gênero Lippia (Verbenaceae) inclui aproximadamente 200espécies de ervas, arbustos e pequenas árvores. Estas espécies estãodistribuídas principalmente pelos países da América do Sul e AméricaCentral, e pelos territórios tropicais da África (TERBLANCHE, F. C. &KORNELIUS, G., Essential oil constituents of the genus Lippia(Verbenaceae) A literature review. J. Ess. Oil Re. 8, 471-485, 1996). Amaioria das espécies do gênero Lippia é tradicionalmente utilizada notratamento de afecções gastrintestinais e respiratórias. Algumasespécies demonstraram atividade antimalarial, antiviral e citostática.(MORTON In: Atlas of Medicinal Plants ofMiddle America I, Springfield,Illinois, USA (1981), pp. 745-750; GASQUET, M., DELMAS, F., TIMÓN-D AVI D, P., KEITA, A., GUINDO, M. KOITA, N., DIALLO, D., DOUMBO,O., Evaluation in vitro and in vivo of a traditional antimalarial,"Malarial-5". Fitoterapia. 64, 423-427, 1993; ABAD, M. J., SANCHEZ,S., BERMEJO, P., VILLAR, A., CARRASCO, L., Antiviral activity of somemedicinal plants. Met. Find., 17 (Suppl. A) p.108, 1995). Em geral, ogênero apresenta um perfil consistente de composição química,atividades farmacológicas e uso tradicional. Duas das espécies maisimportantes desse gênero são L. multiflora e L. alba (PASCUAL, M. E.,SLOWING, K., CARRETEO, E., SÁNCHEZ MATA, D., VILLAR, A., Lippia:Traditional uses, chemistry and Pharmacology: a review. J. ofEthnopharmacol. 76, Issue 3, 201-214, 2001). Na literatura, existe aindaregistro de outras espécies do gênero Lippia com atividadeantimicrobiana como a Lippia sidoides (COSTA, S. M. O.; LEMOS, T. L.
G. ; PESSOA, O. D. L.; ASSUNÇÃO, J. C. C; BRAZ-FILHO, R.; 2002.Constituintes químicos da Lippia sidoides (Cham.) Verbenaceae. Rev.Bras. de Farmacog., v. 12, supl., p. 66-67.) e a Lippia adoensis (TAGET,
H. ; MOHAMMED, E.; ASRES, K. GEBRE-MARIAM, T., Antimicrobialactives of some selected traditional Ethiopian medicinal plants used inthe treatment of skin disorders. J. of Ethnopharmacol. 100, p. 168-175,2005), dentre outras. Entretanto, não existem referências na literaturasobre atividade farmacológica, estudos de toxicidade ou uso tradicionalda espécie L. saluiaefolia.
A L. salviaefolia é uma planta originaria do cerradobrasileiro, pertence ao grande grupo das Dicotiledôneas, família dasVerbenáceas. Como hábito vegetativo, é caracterizado como arbustocom folhas aromáticas, tubo da corola amarelado e flores brancasaromáticas.
Bactérias e fungos são capazes de crescer nos produtoscosméticos quando existem nutrientes disponíveis e as condições domeio são satisfatórias. Para esta finalidade, os conservantes devemapresentar atividade antimicrobiana efetiva e serem seletivamentetóxicos e eficazes contra bactérias, Gram-positivas e/ou Gram-negativas, bolores e leveduras. Entretanto, devido às característicasintrínsecas, a maioria dos conservantes de origem sintética podeapresentar reações tóxicas ao usuário, tais como irritação local,dermatite de contato, hipersensibilidade e outras.
A comprovação da qualidade microbiana em produtoscosméticos visa evitar a transmissão de doenças quando estes sãoutilizados de forma correta, além de assegurar a estabilidade dapreparação e, conseqüentemente, sua eficácia. Os cosméticosnecessitam de conservantes capazes de reduzir a carga microbiana emníveis aceitáveis durante seu uso dentro do prazo de validade. Assim, sefaz necessária a avaliação da eficácia dos conservantes em formulaçõescosméticas, determinando a segurança do uso do produto, visandotestar a capacidade conservadora do cosmético durante sua fabricaçãoe durante o seu prazo de validade, ao longo do seu uso peloconsumidor.
Em geral, os conservantes de origem sintética, têmcaracterísticas lipofílicas, a utilização de extratos aquosos ouhidroalcóolicos pode ser mais efetiva, uma vez que o crescimento dosmicrorganismos ocorre principalmente em meio aquoso.
A utilização de componentes ativos de origem natural naprodução de cosméticos tem crescido muito nos últimos anos. A buscacada vez maior de cosméticos eficazes e seguros tem sido constante.
O desenvolvimento de medicamentos e derivados de origemvegetal é de grande importância na cultura e tradição da história dahumanidade. A maioria da população urbana pobre, assim como empequenas comunidades rurais, confia e faz grande uso da medicinanatural, utilizando plantas, assim como extratos naturais notratamento de suas enfermidades. Esse fato se dá devido à culturadessas populações e principalmente pela acessibilidade edisponibilidade desse tipo tratamento. Como conseqüência, existe umacrescente tendência mundial, em integrar a medicina tradicional aocuidado médico primário (FENNEL, C. W., LINDSEY, K. L., MC. GAW, L.J., SPARG, S. G., STAFFORD, G. I., ELGORASHI, E. E., GRACE, O. M.,VAN STADEN, J., Review: Assessing African medicinal plants forefficacy and safety: Pharmacological screening and toxicology. J. ofEthnopharmacol. 94, 205-217, 2004). Adicionalmente, pesquisas paradesenvolvimento de novos agentes antimicrobianos efetivos sãonecessárias devido ao desenvolvimento da resistência microbiana e aocorrência de infecções oportunistas fatais associadas a AIDS,quimioterapia antineoplásica e transplantes (PENNA, C, MARINO, S.,VIVOT, E., CRUANES, M. C, MUNOZ, J. DE D., CRUANES, J.,FERRARO, G., GUTKIND, G., MARTI NO, V., Antimicrobial activity ofArgentine plants used in the treatment of infectious diseases. Isolationof active compounds from Sebastiania brasiliensis. J. ofEthnopharmacol. 77, 37- 40, 2001). Inúmeras pesquisas extensivas têmsido desenvolvidas no intuito de encontrar e classificar agentesantimicrobianos de extratos de plantas e produtos naturais, sendo queum grande número de plantas representa fonte potencial nesta busca.(DE SMET, P.A.G.M., 1997, The role of plant - derived drugs and herbalmedicines. Healthcare Drugs, v. 54, n. 6, p. 801-840; COWAN, M. M.,Plant products as antimicrobial agents. Clinicai Microb. Rev., v. 12, p.564-582, 1999; HERNÁNDEZ-PEREZ, M., RABANAL, R. M., ÁRIAS, A.,DE LA TORRE, M. C., RODRIGUES, B. Aethiopinone, an antibacterialand citotoxic agent from Salvia aethiopis roots. Pharm. Biol. 37 (1), 17-21, 1999; SOKMEN, A., JONES, B. M., ERTURK, M., The in Vitroantibacterial activity of Turkiv medicinal plants. J. of Ethnopharmacol.67, 79-86, 1999; KELMANSON, J. E., JÀGER, A. K., VAN STADEN, J.,Zulu medicinal plants with antibacterial activity. J. of Ethnopharmacol.69, 241-246, 2000; SRINIVASAN, D., NATHAN, S., SURESH, T.,PERUMALSAMY, O., Antimicrobial activity of certain Indian medicinalplants used in folkloric medicine. J. of Ethnopharmacol. 74, 217-220,2001, MARTINI, N. D., KATERERE, D. R. P., ELLOF J. N., Biologicalactivity of five antimicrobial flavonoids from Combretum erythrophyllum(Combretaceae). J. of Ethnopharmacol. 93, 207-212, 2004; MITSCHER,L. A., DRAKE S., GALLAPUDI, S. R., OIUNTE, K., A modern look atfolkloric use of anti-infective agents. J. of Natural Product. 50, 1025-1040, 1987; CUTCHEON, A. R., STOKES, R. W., THORSON, L. M.,ELLIS, S. M. HANCOCK, R. E. W., Anti-mycobacterial screening ofBritish Columbian medicinal plants. Intem. J. of Pharmacognosy. 32,77-83. 1997; MENG, J. C, ZHU, Q. X., TH AN, R. X., New antimicrobialmono and sesquiterpenes from Soroseris hookeriana subsp.Erysimoides, Planta Medica. 66, 541-544, 2000; RUBERTO, G.,BARATTA, M. T., DEANS, S. G., DORMAN, H. J. D.,. Antioxidant andantimicrobial activity of Foenicullum vulgare and Criyhmum maritimumessential oils. Planta Medica. 66, 687-693, 2000; HO, K. Y., TSAI, C. C,HUANG, U.S., CHEN, C. P., LIN, T. C, LIN, C. CAntimicrobial activity oftannin components from Vaccinium vitis - idaea, L. J. of Pharm. andPharmacol. 53, 187-191, 2001).
A variação observada freqüentemente, nos resultadosquando são testados extratos de plantas para atividade antimicrobianapode ser atribuída a inúmeros fatores. Estes incluem a técnica deensaio, meio de cultura, cepa das bactérias ou fungos, tempo, fonte daplanta (fresca ou seca), e a quantidade testada do extrato dentre outros(FENNEL, C. W., LINDSEY, K. L., MC. GAW, L. J., SPARG, S. G.,STAFFORD, G. I., ELGORASHI, E. E., GRACE, O. M., VAN STADEN, J.,Review: Assessing African medicinal plants for efficacy and safety:Pharmacological screening and toxicology. J. of Ethnopharmacol. 94,205-217, 2004). Porém, estes fatores não são empecilhos na busca dapadronização e maiores pesquisas englobando a atividadeantimicrobiana de extratos naturais.
O estudo da atividade antimicrobiana de substânciasusadas em produtos farmacêuticos e cosméticos é um tema que vem sedesenvolvendo bastante, e somente nos últimos 60 anos tem sidotratado de maneira científica. Grande importância é dada ao assunto,devido à preocupação não somente com o aspecto microbiológico, mastambém com o potencial de irritação e toxicidade ao consumidor(PINTO, T. J. A., KANEKO, T. M., OHARA, M. T., Controle biológico dequalidade de produtos farmacêuticos, correlatos e cosméticos. São Paulo:Atheneu, 2003).
A atividade antimicrobiana de extratos vegetais é avaliadapor meio da determinação da menor quantidade da substância emestudo necessária para inibir o crescimento do microrganismo em teste;esse valor é conhecido como CMI (MADIGAN, M. T.; MARTINKO, J. M.;PARKER, J., Brock biology of microorganisms. Upper Saddle River, NJ:Prentice Hall, 2000. 9th ed. p. 750-751). Um aspecto bastante relevantena determinação da CMI de extratos vegetais é a preocupação,mencionada anteriormente, principalmente em relação aos aspectostoxicológicos, microbiológicos e legais pertinentes aos compostosnaturais e/ou combinações (PINTO, T. J. A., KANEKO, T. M., OHARA,M. T., Controle biológico de qualidade de produtos farmacêuticos,correlatos e cosméticos. São Paulo: Atheneu, 2003).
A pesquisa de novos agentes antimicrobianos se faznecessária devido ao surgimento de microrganismos resistentes e deinfecções oportunistas fatais, associadas a AIDS, quimioterapiaantineoplásica e transplantes (PENNA, C, MARINO, S., VIVOT, E.,CRUANES, M. C, MUNOZ, J. DE D., CRUANES, J., FERRARO, G.,GUTKIND, G., MARTI NO, V., Antimicrobial activity of Argentine plantsused in the treatment of infectious diseases. Isolation of activecompounds from Sebastiania brasiliensis. J. of Ethnopharmacol. 77, 37-40, 2001). O estudo de agentes antimicrobianos tem grandeabrangência, sendo ponto crucial em vários setores do campofarmacêutico e cosmético. Outro ponto a ser ressaltado é que autilização do estudo da CMI serve como primeiro "screening" nadescoberta da atividade farmacológica de novos agentes.
Atualmente, existem vários métodos para avaliar a atividadeantibacteriana e antifúngica dos extratos vegetais. Os mais conhecidosincluem a difusão em ágar e macro e microdiluição (PINTO, T. J. A.,KANEKO, T. M., OHARA, M. T., Controle biológico de qualidade deprodutos farmacêuticos, correlatos e cosméticos. São Paulo: Atheneu,2003; COLLINS, C.H., Antimicrobial susceptibility tests. In: _.
Microbiological methods. 7.ed. Oxford : Butterworth-Hunemann, 1995,p. 178-205; MADIGAN, M. T.; MARTINKO, J. M.; PARKER, J., Brockbiology of microorganisms. Upper Saddle River, NJ: Prentice Hall, 2000.9* ed. p. 750-751). Para determinar a CMI ou a Concentração MínimaBactericida (CMB) de extratos ativos de plantas, tem-se utilizadoabundantemente o método sensível de microdiluição (ELOFF J. N. Asensitive and quick microplate method to determine the minimalinhibitory concentration of plant extracts for bactéria. Planta Médica, v.64, p. 711-713, 1998).
A estabilidade pode ser definida como a capacidade de umproduto contendo ou não substâncias ativas, de manter suaspropriedades químicas, físicas, microbiológicas, toxicológicas ebioativas, dentro dos limites especificados previamente durante todoseu prazo de validade, pois esses produtos quando comercializadospassam por um sistema de estocagem e distribuição e podem ficarsujeitos ao calor prolongado e a umidade (ANVISA - Agência Nacional deVigilância Sanitária. Guia de estabilidade de produtoscosméticos/Agência Nacional de vigilância Sanitária - Ia ed. - BrasíliaANVISA, 2004. 52 p. (Série validade em cosméticos); v.l).
O estudo da estabilidade de produtos cosméticos forneceinformações que indicam o grau de estabilidade relativa de um produtonas variadas condições a que possa estar sujeito desde sua fabricaçãoaté o término de sua validade. Essa estabilidade é relativa, pois variacom o tempo e em função de fatores que aceleram ou retardamalterações nos parâmetros do produto.
A qualidade microbiana de um produto cosmético efarmacêutico deve ser avaliada com o objetivo de garantir a eficácia esegurança em seu prazo de validade e condição de uso. A comprovaçãodos níveis de contaminação microbiana dos produtos não estéreis visaevitar a transmissão de doenças e assegurar a estabilidade do produto.
A presença de microrganismos, acima dos limites aceitáveis, podeacarretar problemas clínicos aos usuários e também, dependendo domicrorganismo presente, o efeito tóxico do produto contaminado põe emrisco a vida do paciente (PINTO, T. J. A., KANEKO, T. M., OHARA, M. T.,Controle biológico de qualidade de produtos farmacêuticos, correlatos ecosméticos. São Paulo: Atheneu, 2003). O perigo relativo criado pelacontaminação microbiológica desses produtos pode ser relatado pelaseveridade da infecção ou doença causada. Microrganismos comoPseudomonas, Proteus, Staphylococcus, Serratia, Streptococcus,Penicilium, Aspergillius e o gênero Cândida são classificados como deriscos à saúde (BAIRD, R.M., HODGES, N.A., Denyer, S.P. (Eds) (2000)Handbook of Microbiological Quality Control: Pharmaceuticals andMedicai Devices Taylor & Francis, London, 2000, p.254).
Uma das principais fontes de contaminação microbiana dasformulações cosméticas e farmacêuticas é a água (CROSHAW, B.,Preservatives for cosmetics and toiletries. J. Soe. Cosmet. Chem., v.28,p.3-16, 1977; DIEHL, K. H., Important secondary conditions for optimaluse of cosmetic preservatives. Parfum Kosmet., Heidelberg, v.71, n.60,p.396-400, 1990; MALCOLM, S. A., Microbiological monitoring andquality control. Manuf. Chem. Aerosol News, London, v.51, nov., p.55-56, 1980). O gênero Pseudomonas é o mais citado na literatura (ORTH,D. S., Preservative Efficacy Testing of Aqueous Cosmetics and DrugsWithout Counting Colonies. Cosmet. & Toilet. 116:41-47, 2001;TENEMBAUM, S. Considerations leading to development of themicrobial limit guidelines of the CTFA. Cosmetics & Toiletries, v.93, n.3,p.78-83, 1977; VAN ABBÉ, N. J. HUGHES, O., DIXON, H.WOODROFFE, R. S. C, The hygienic manufacture and preservation oftoiletries and cosmetics. J. Soe. Cosmet. Chem., 1970, v.21, p.719-800),mas também foram encontrados Xanthomonas, Flavobacterium,Achromobacter e Aerobacter. Segundo alguns autores; TENEMBAUM, S.,Considerations leading to development of the microbial limit guidelinesof the CTFA. Cosmet. Toilet, v. 93, n.3, p. 78-83, 1977) a cargabacteriana atingiu a ordem de IO6 UFC/mL.
Outras fontes importantes de contaminação microbianareferem-se às matérias-primas de origem natural (McCARTHY, T. J.,Microbiological control of cosmetic produets. Cosmet. & Toilet, OakPark, v.95, n.8, p. 23-27, 1980; 0'NEILL, J. J., MEAD, C. A., Theparabéns: bacterial adaptation and preservative capacity. J. Soe.Cosmet. Chem. New York, v.33, p.75-84, 1982). Os autores BONOMI eNEGRETTI investigaram a qualidade microbiana de várias dessasmatérias-primas, principalmente de origem vegetal, usualmenteempregada nas preparações farmacêutica (BONOMI, E., NEGRETTI, F.,Ricerche sul contenudo microbico di materie prime impiegatte nellepreparazioni farmaceutche. Ann. Ist. Super. Sanitá, v. 13, n.4, p. 805-832, 1977). As matérias-primas de origem sintética ou semi-sintéticaapresentam, geralmente, baixa carga microbiana contaminante comexceção de algumas como poliglicóis ou polietilenoglicóis.
Os produtos com sua formulação e sua embalagemprimária contribuem para o desenvolvimento microbiano, pois podemconter carboidratos, ácidos graxos, proteínas, aminoácidos, glicosídeos,alcoóis graxos, esteróides, peptídeos e vitaminas. Esses substratospodem servir de nutrientes para microrganismos contaminantes(MADDEN, I., JACKSON, G. I., Cosmetic preservation and microbes:viewpoint of the Food and Drug Administration. Cosmet. & Toilet, OakPark, v. 96, n. 10, p. 75-78, 1981). O material de acondicionamentopode ser fonte de contaminação, quando não adequadamente limpos(SMART, R., SPOONER, D. F., Microbiological spoilage inpharmaceuticals and cosmetics. J. Soe. Cosmet. Chem., v.23, 1972,p.721-737; VAN ABBÉ, N. J. HUGHES, O., DIXON, H. WOODROFFE, R.S. C, The hygienic manufacture and preservation of toiletries andcosmetics. J. Soe. Cosmet. Chem., 1970, v.21, p.719-800). Oscomponentes podem interagir com os conservantes utilizados naformulação, como os parabenos que podem ser adsorvidos porrecipientes plásticos resultando em diminuição de sua atividadeconservante (BAHAL, S.M. & ROMANSKY, J.M., Sorption of parabéns byfexible tubings. Pharm Deu Technol., Aug; 6(3) : 431-40, 2001). Outroaspecto a ser considerado é o da contaminação do produto pelo própriousuário sendo necessárias recomendações adequadas na sua utilizaçãoe o uso de conservantes na formulação.
Os pesquisadores BONOMI e NEGRETTI tambéminvestigaram o conteúdo microbiano das matérias-primas empregadasnas preparações farmacêuticas. Segundo esses autores, os problemascriados pela contaminação microbiana podem ser minimizados pelo usode matérias-primas que não apresentem histórico de carga microbiana("bioburden") inaceitável, pela adoção das boas práticas de fabricaçãovalidadas para reduzir o risco de contaminação durante o processo, epelo uso efetivo de sistemas conservantes em formulações (BONOMI, E.,NEGRETTI, F., Ricerche sul contenudo microbico di materie primeimpiegatte nelle preparazioni farmaceutche. Ann. Ist. Super. Sanitá, v.13, n.4, p. 805-832, 1977).
Diante de todos os fatores que podem contribuir para acontaminação e visando a eficácia do produto e a segurança doconsumidor, classicamente tem sido utilizada a adição de conservantesnas formulações. Estas são substâncias adicionadas às formasfarmacêuticas e cosméticas com o intuito de evitar a contaminaçãomicrobiana. Sua função é inibir o crescimento de microrganismos noproduto, conservando-o livre de deteriorações causadas por bactérias,bolores e leveduras. Eles podem ter atividade bacteriostática e/oufungistática, sendo utilizados principalmente nos produtos de múltiplasdoses, que podem apresentar contaminação. Escolher um sistemaconservante adequado para um produto cosmético requer consideraçãocuidadosa quanto ao tipo do produto, seu uso, características deformulação e provável desafio microbiano. A seleção definitiva do(s)agente(s) conservante(s) deve ser um compromisso entre eficáciaantimicrobiana e compatibilidade com o produto (PINTO, T. J. A.,KANEKO, T. M., OHARA, M. T., Controle biológico de qualidade deprodutos farmacêuticos, correlatos e cosméticos. São Paulo: Atheneu,2003).
A efetividade do sistema conservante em preparaçõesfarmacêuticas ou cosméticas está relacionada com a composição daformulação, o tipo de material de acondicionamento, grau de pureza dasmatérias-primas, utilização correta pelo consumidor, forma deaplicação, e do próprio sistema conservante. Mesmo com todo rigorexigido de higiene durante a fabricação (GMP - Good ManufacturingPractice), controle de qualidade e uso de matérias-primas com conteúdopermissível de microrganismo, ainda existe a possibilidade decontaminação secundária. Entretanto, alguns componentes mesmo nãosendo substâncias antimicrobianas típicas, podem ajudar contra aproliferação de microrganismos, aumentando a efetividade dosconservantes. Os requisitos gerais para o crescimento microbiano são:água, energia, fontes de nitrogênio, minerais e vitaminas em umambiente com níveis adequados de oxigênio, pH e temperatura (PINTO,T. J. A., KANEKO, T. M., OHARA, M. T., Controle biológico de qualidadede produtos farmacêuticos, correlatos e cosméticos. São Paulo: Atheneu,2003).
Os conservantes, mesmo os origem natural são substânciasintrin secamente tóxica, portanto a concentração utilizada deve serpequena. O sistema conservante utilizado em uma formulação podeexercer um efeito bacteriostático, ou seja, mantém o mesmo nível demicrorganismos ou diminui, porém não destrói. Ou ainda um efeitobiocida de destruição. A ação do sistema conservante normalmente seprocessa por meio da combinação com grupamentos químicos dosconservantes com as proteínas microbianas, ou através da açãocompetitiva com determinados processos enzimáticos.
Descrição das Figuras
A figura 1 mostra a cromatografia em camada delgada dasfrações de acetato de etila de L. salviaefolia.
A figura 2 refere-se aos espectros da fração 4 da fração deacetato de etila de L. salviaefolia. Análise por CG-EM.
A figura 3 indica a atividade antimicrobiana do extrato totalde L. salviaefolia frente a S. aureus. Experimento realizado em trêsreplica com três repetições para cada concentração. Valorescorrespondem a média de cada variável. Determinaçãoespectrofotométrica a 630 nm. Variáveis= Cc: Controle de crescimento;Cs: controle do solvente; C+: Cloranfenicol (1 mg/mL), soluções doextrato total em diferentes concentrações.A figura 4 apresenta a atividade antimicrobiana da fraçãode acetato de etila de L. salviaefolia em frente a S. aureus. Experimentorealizado em três replica com três repetições. Valores correspondem àmédia de cada variável. Determinação espectrofotométrica a 630 nm.Variáveis= Cc: Controle de crescimento; Cs: controle do solvente; C+:Cloranfenicol (1 mg/mL), soluções da fração de acetato de etila doextrato total em diferentes concentrações.
A figura 5 demonstra a atividade antimicrobiana da fraçãode clorofórmica de L. salviaefolia frente a S. aureus. Experimentorealizado em três replica com três repetições. Valores correspondem àmédia de cada variável. Determinação espectrofotométrica a 630 nm.Variáveis= Cc: Controle de crescimento; Cs: controle do solvente; C+:Cloranfenicol (1 mg/mL), soluções da fração clorofórmica do extratototal em diferentes concentrações.
A figura 6 refere-se a atividade antimicrobiana das frações(1-9) da fração de acetato de etila de L. salviaefolia na concentração de1,0 mg/mL, frente a S. aureus. Experimento realizado em três replicacom três repetições. Valores correspondem à média de cada variável.Determinação espectrofotométrica a 630 nm. Variáveis= Cc: Controle decrescimento; Cs: controle do solvente; C+: Cloranfenicol (1 mg/mL),soluções das frações (1-9) de acetato de etila do extrato total naconcentração de 1,0 mg/mL.
A figura 7 mostra a atividade antimicrobiana da fração 3proveniente da fração de acetato de etila frente a S. aureus.Experimento realizado em três replica com três repetições. Valorescorrespondem à média de cada variável. Determinaçãoespectrofotométrica a 630 nm. Variáveis= Cc: Controle de crescimento;Cs: controle do solvente; C+: Cloranfenicol (1 mg/mL), soluções dafração 3 proveniente da fração de acetato de etila do extrato total emdiferentes concentrações
A figura 8 indica a atividade antimicrobiana da fração 4proveniente da fração de acetato de etila frente a S. aureus.
Experimento realizado em três replica com três repetições. Valorescorrespondem à média de cada variável. Determinaçãoespectrofotométrica a 630 nm. Variáveis= Cc: Controle de crescimento;Cs: controle do solvente; C+: Cloranfenicol (1 mg/mL), soluções dafração 4 proveniente da fração de acetato de etila do extrato total emdiferentes concentrações.
A figura 9 apresenta a atividade antimicrobiana do extratototal de L. salviaefolia frente a E. coli. Experimento realizado em trêsreplica com três repetições. Valores correspondem à média de cadavariável. Determinação espectrofotométrica a 630 nm. Variáveis= Cc:
Controle de crescimento; Cs: controle do solvente; C+: Cloranfenicol (1mg/mL), soluções do extrato total em diferentes concentrações.
A figura 10 demonstra a atividade antimicrobiana da fraçãode acetato de etila de L. salviaefolia frente a E. coli. Experimentorealizado em três replica com três repetições. Valores correspondem àmédia de cada variável. Determinação espectrofotométrica a 630 nm.Variáveis= Cc: Controle de crescimento; Cs: controle do solvente; C+:Cloranfenicol (1 mg/mL), soluções da fração de acetato de etila doextrato total em diferentes concentrações.
A figura 11 revela a atividade antimicrobiana da fração declorofórmica do extrato de L. salviaefolia frente a E. coli. Experimentorealizado em três replica com três repetições. Valores correspondem àmédia de cada variável. Determinação espectrofotométrica a 630 nm.Variáveis= Cc: Controle de crescimento; Cs: controle do solvente; C+:Cloranfenicol (1 mg/mL), soluções da fração clorofórmica do extratototal em diferentes concentrações.
A figura 12 refere-se a atividade antimicrobiana da fração 3proveniente da fração de acetato de etila de L. saluiaefolia frente a E.coli. Experimento realizado em três replica com três repetições. Valorescorrespondem à média de cada variável. Determinaçãoespectrofotométrica a 630 nm. Variáveis= Cc: Controle de crescimento;Cs: controle do solvente; C+: Cloranfenicol (1 mg/mL), soluções dafração 3 proveniente da fração de acetato de etila do extrato total emdiferentes concentrações.
A figura 13 apresenta a atividade antimicrobiana da fração4 proveniente da fração de acetato de etila de L. salviaefolia frente a E.coli. Experimento realizado em três replica com três repetições. Valorescorrespondem a média de cada variável. Determinaçãoespectrofotométrica a 630 nm. Variáveis= Cc: Controle de crescimento;Cs: controle do solvente; C+: Cloranfenicol (1 mg/mL), soluções dafração 4 proveniente da fração de acetato de etila do extrato total emdiferentes concentrações.
A figura 14 mostra a atividade antimicrobiana danaringenina, extratos e frações da L. salviaefolia frente a S. aureus.Experimento realizado em três replica com três repetições. Valorescorrespondem à média de cada variável. Determinaçãoespectrofotométrica a 630 nm. Variáveis: Controle de crescimento; Cs:controle do solvente; C+: Cloranfenicol (1 mg/mL); solução denaringenina em diferentes concentrações.
A figura 15 demonstra a atividade antimicrobiana danaringenina, extratos e frações da L. salviaefolia frente a E. coli.Experimento realizado em três replica com três repetições. Valorescorrespondem à média de cada variável. Determinaçãoespectrofotométrica a 630 nm. Variáveis: Controle de crescimento; Cs:controle do solvente; C+: Cloranfenicol (1 mg/mL); solução denaringenina em diferentes concentrações.
A figura 16 revela a atividade antimicrobiana danaringenina, extratos e frações da L. saluiaefolia frente a C. albicans.Experimento realizado em três replica com três repetições. Valorescorrespondem à média de cada variável. Determinaçãoespectro fotométrica a 630 nm. Variáveis: Controle de crescimento; Cs:controle do solvente; C+: Nistatina (1 mg/mL); solução de naringeninaem diferentes concentrações.
A figura 17 apresenta a atividade antimicrobiana danaringenina, extratos e frações da L. saluiaefolia frente a P. aeruginosa.
Experimento realizado em três replica com três repetições. Valorescorrespondem à média de cada variável. Determinaçãoespectrofotométrica a 630 nm. Variáveis: Controle de crescimento; Cs:controle do solvente; C+: Amikacinal (1 mg/mL); solução de naringeninaem diferentes concentrações.
A figura 18 mostra o branco 24h - Controle do compostodérmico-epidérmico após 24hs no sistema de cultivo na interfase ar-líquido.
A figura 19 revela o composto dérmico-epidérmico após24hs de contato com a base gel sem a adição de L. saluiaefolia.
A figura 20 refere-se ao composto dérmico-epidérmico após24hs de contato com a formulação gel incorporado com fração deacetato de etila de L. salviaefolia.
A figura 21 demonstra o composto dérmico-epidérmico após24hs de contato com a base creme sem a adição de L. saluiaefolia.A figura 22 indica o composto dérmico-epidérmico após24hs de contato com a formulação creme incorporada com fração deacetato de etila de L. saluiaefolia.
A figura 23 refere-se ao composto dérmico-epidérmico após24hs de contato com a base xampu sem a adição de L. salviaefolia.
A figura 24 demonstra o composto dérmico-epidérmico após24hs de contato com a formulação xampu incorporado com fração deacetato de etila de L. salviaefolia.
A figura 25 apresenta o branco 48hs - Controle docomposto dérmico-epidérmico após 48hs no sistema de cultivo nainterfase ar-líquido.
A figura 26 indica o composto dérmico-epidérmico após48hs de contato com a base gel sem a adição de L. salviaefolia.
A figura 27 refere-se ao composto dérmico-epidérmico após48hs de contato com a formulação gel incorporado com fração deacetato de etila de L. salviaefolia.
A figura 28 demonstra o composto dérmico-epidérmico após48hs de contato com a base creme sem a adição de L. salviaefolia.
A figura 29 demonstra o composto dérmico-epidérmico após48hs de contato com a formulação creme incorporada de fração acetatode etila de L. salviaefolia.
A figura 30 mostra o composto dérmico-epidérmico após48hs de contato com a base xampu sem a adição de L. salviaefolia.
A figura 31 revela o composto dérmico-epidérmico após48hs de contato com a formulação xampu com incorporada com fraçãode acetato de etila de L. salviaefolia.
A figura 32 apresenta a viabilidade celular através doestudo de citoxicidade em cultura de queratinócitos humanos da fraçãode acetato de etila de L. salviaefolia, em diferentes concentrações(0,0125 %, 0,025 %, 0,05 %, 0,1 %, e 0,2 %) e diferentes tempos decontato (0,5h, lh, 2hs, 6hs, 24hs e 48hs).
Descrição da Invenção
A presente invenção refere-se aos extratos de folhas deLippia salviaefolia Cham., suas frações ativas, composiçõesfarmacêuticas e/ou cosméticas e seu uso como antimicrobiano natural(conservante).
Em uma primeira realização o presente pedido destina-seaos extratos de folhas de Lippia salviaefolia Cham., tais como, extratoshidroalcoólico, diclorometano, acetato de etila e/ou clorofórmico.
Preferencialmente, o presente pedido destina-se aos extratos de acetatode etila e a clorofórmica da L. salviaefolia.
As frações ativas caracterizam-se por conter oscomponentes ativos, por exemplo, flavonóides totais e fenóis totais, emparticular, os ativos contidos, nas frações da presente invenção,referem-se aos 4',5-dihidroxi-7-metoxi-flavonona, a naringenina e oapiflorol.
Em uma segunda realização, o pedido de patente proveformulações cosméticas e/ou farmacêuticas contendo os ditos extratose/ou suas frações ativas. De forma geral, as formulações referem-se àsemulsões, géis, cremes, pomadas, soluções, porém, não se limitando aestes. Em particular, as formulações da presente invenção tratam decremes, xampus e géis.As composições creme podem ser elaboradas com ceraauto-emulsionante e/ou tensoativo, por exemplo, estearatos depoliglicerila, álcool cetoestearílico, sesquiestearato de metilglicose PEG-20; opcionalmente, agentes de consistência polimérica, tais como, omonoestearato de glicerila, dispersão de hidroxietilcelulose 2% p/v;como emoliente, o óleo mineral, acetato de cetila e/ou álcool de lanolinaacetilado, silicone volátil, 2-oetil-dodecanol; como umectante,propilenoglicol e/ou glicerina; e conservantes, tais como os parabenos.
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As composições géis podem apresentar em sua composiçãoagente de consistência poliméricos e/ou gelificantes, por exemplo,polímeros carbonílicos, hidroxicelulose; agentes acidificantes e/oualcalinizantes, como a solução de hidróxido de sódio a 20% (p/v),trietanolamina; tensoativos, tais como, álcool cetoestearílico, álcoolcetílico etoxilado e/ou propoxilado, poliól de éster de ácido graxo, comoumectante, tais como, propilenoglicol, sorbitol 70% e/ou glicerina; econservantes, tais como, os parabenos.
<table>table see original document page 21</column></row><table>
A composição de xampu pode conter em sua formulação ostensoativos aniônico, catiônico e/ou anfótero podendo ser primário ousecundário, tais como, lauril éter sulfato de sódio, lauril sulfato detrietanolamina, lauril sulfosuccinato dissódico e/ou lauril sulfato desódio, dietanolamida de ácidos graxos de coco, cocoamido propilbetaína, fosfato 3-oleílico; agente neutralizante como a solução ácidacítrico a 10% (p/v); agente de consistência como diestearato de glicol,solução de cloreto de sódio 20% (p/v); e conservantes, tais como osparabenos.
Composição Xampu<table>table see original document page 22</column></row><table>
Em uma terceira realização a presente invenção refere-se aouso desses extratos no preparao de formulações cosméticas e/oufarmacêuticas como antimicrobiano e/ou conservante. A atividadeantimicrobiana das frações de Lippia salviaefolia Cham. é indicada parabactérias Gram-negativas; Gram-positivas, leveduras e fungos (bolor).
Ainda, o sistema conservante, resultante do uso das fraçõesativas dos extratos de Lippia salviaefolia Cham. apresenta um amploespectro de ação, eficácia em extensa faixa de pH, maiorcompatibilidade com os demais componentes da formulação, mínimainterferência nas características organolépticas (tais como, cor, odor,sabor, entre outros), ser seguro, atóxico, não irritante, nemsensibilizante, adequado coeficiente de partição óleo em água, de modoa permitir concentração efetiva em ambas as fases, rápida inativaçãodos contaminantes prevenindo a adaptação microbiana, fácilmanipulação, custo baixo, estabilidade de concentração.
Exemplos
Para a fixação da planta Lippia salviaefolia Cham, utilizou-se F.A.A. [formaldeído 37% (v/v): ácido acético glacial: etanol 70% (v/v);(2:1:1)], armazenada em etanol 70% (v/v).
Para a descrição histológica, foram realizados cortes a mãolivre, utilizando lâmina de barbear. O material foi clarificado em soluçãode hipoclorito de sódio 70% (v/v) e submetido à coloração diferencialcom azul de alcian 1% (p/v) e fucsina básica 1% (p/v). Cortestransversais e paradérmicos de limbo foliar e transversais de limbo,pecíolo e caule, foram montados em preparações semi-permanentes, emglicerina 50% (v/v), com gotas de formalina e analisados emmicroscópio óptico binocular Coleman.
Na obtenção dos extratos, aquoso e hidroalcoólico, as folhasforam previamente dessecadas em estufa com temperatura controladade 38°C e circulação de ar por quatro dias, seqüencialmente divididas epulverizadas em moinho de facas com malha de 1 mm de diâmetro.
O processo de obtenção foi realizado por extração emSoxhlet para o extrato hidroalcoólico; e decocção para o extrato aquoso.
Todos os solventes utilizados tanto na extração quanto nosprocedimentos cromatográficos eram de grau cromatográfico. Pesou-secerca de 50 g da planta pulverizada em balança eletrônica,seqüencialmente foram extraídas com etanol PA, até a exaustão, portrês dias, à temperatura aproximada de 70°C. O extrato seco foiconcentrado em rota evaporador e posteriormente liofilizado. Com oresíduo da extração anterior foi realizada uma extração por decocção, apartir de cerca de 30 g da planta. Os extratos obtidos foramarmazenados, devidamente acondicionados sob refrigeração.
A partir dos extratos etanólico e aquoso foram feitos testesiniciais de eficácia como conservantes naturais.
O extrato etanólico foi submetido à partição para verificaçãoda fração com maior atividade antimicrobiana. Pesou-se 10,45 g doextrato etanólico liofilizado que foi dissolvido em cerca de 100 mL dehexano, acondicionado em banho de ultra-som, por 2 minutos e filtradoem Funil de Büchner sob pressão reduzida. A técnica foi repetida trêsvezes, obtendo desta forma a fração hexânica. Em seqüência, o resíduodesta primeira extração, após filtração, foi tratado com clorofórmioempregando-se a mesma técnica da primeira fração. Após obtenção dafração clorofórmica, repetiu-se todo o procedimento utilizando comosolvente o acetato de etila para obtenção da fração de acetato de etila. Epor fim, o resíduo da fração de acetato de etila foi extraído com n-butanol empregando a mesma técnica, obtendo a fração butanólica.Para secagem dos extratos utilizou-se evaporador rotatório a vácuo.
Desta forma, obtiveram-se quatro frações diferentes a partir do extratoetanólico de L. salviaefolia. Todas as frações foram concentradas emrota-evaporador e posteriormente liofilizadas.
Para o fracionamento da fração de acetato de etila obtida apartir do extrato total de L. salviaefolia, foram utilizados os seguintesmétodos cromatográficos: Coluna Cromatográfica e Cromatografia emCamada Delgada (CCD).
Foi realizada inicialmente uma separação prévia através deuma coluna cujas características da coluna utilizada na separaçãopreliminar dos componentes da fração de acetato de etila (Tabela 1).Tabela 1
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Pesou-se 1,0 g da fração de acetato de etila, proveniente doextrato total das folhas de Lippia salviaefolia, sendo solubilizada emmetanol e incorporada a uma pequena porção de sílica(aproximadamente 0,5 g), posteriormente depositada na parte superiorda coluna para realizar separação. Como fase móvel, utilizou-se amistura diclorometano: metanol em diferentes proporções conformedescrito na tabela 2 que mostra a fase móvel utilizada na coluna para aseparação dos componentes da fração de acetato de etila de L.salviaefolia e frações obtidas. Todas as extrações foram realizadas emduplicata, cada fração obtida foi concentrada e liofilizada. Depois deliofilizada cada fração foi submetida à avaliação de sua atividadeantimicrobiana para identificação da fração com melhor resultado.
Tabela 2
<table>table see original document page 25</column></row><table>
As frações obtidas na separação preliminar foramnovamente fracionadas através de cromatografia em camada delgada.Para tanto foram empregadas placas contendo uma camada de 1 mm desílica gel PF254. Os sistemas eluentes utilizados eram compostos pordiclorometano e metanol na proporção volumétrica de 9:1. Antes deefetuar a corrida cromatográfica a cuba foi previamente saturada com opróprio sistema eluente.
Para a realização da análise estrutural utilizou-se ocromatógrafo a gás equipado com detector de ionização de chama. Osespectros obtidos foram comparados com bancos de espectros dopróprio aparelho assim como com dados espectrais da literatura.
No estudo da atividade antimicrobiana, os extratoshidroalcoólico e aquoso, assim como as diferentes frações do extratoetanólico, foram diluídas em dimetilsufoxido (DMSO): metanol (1:1). Asconcentrações correspondentes são expressas em termos de miligramas(mg) do extrato ou fração por mililitros (mL) do solvente.
A atividade antimicrobiana dos extratos foi avaliada contraquatro tipos de microrganismos: bactérias Gram-positivo:
Staphylococcus aureus (ATCC 6538); Gram-negativos: Escherichia coli(ATCC 10536) e Pseudomonas aeruginosa (ATCC 9027); e fungo:Cândida albicans (ATCC 10231).
Quanto ao método de difusão em ágar, os organismostestados foram inoculados em um "slant" de "Trypic Soy Agar" (TSA)para as bactérias, e "Sabouraud Dextrose Agar" (SDA) para o fungo.Depois de um período de incubação de 24 h a 32°C para bactéria e 25°Cpara o fungo, as culturas foram suspensas em solução salina estéril eajustadas de modo a obter uma leitura turbidimétrica comparável como padrão de McFarland n° 05. A partir dessas suspensões microbianas,1,0 mL foi dissolvido em 4,0 mL de TSA para bactéria e SDA para ofungo, seqüencialmente, estes 5 mL resultantes constituíam a segundacamada da placa de Petri, com uma primeira camada de 10 mL de ágarsem micro rganismo. De modo asséptico, próximo ao fogo, comferramentas apropriadas foram feitos alguns poços comaproximadamente 6 mm de diâmetro, onde as frações e os extratosforam depositados para estudo de suas ações. Em cada placa de Petriforam feitos 5 poços: um utilizado como controle negativo, outro paracontrole positivo, e os três restantes para as amostras em triplicada.
Três concentrações foram preparadas para o extratoaquoso, e o extrato etanólico total: 20, 10 e 5 mg/mL. Enquanto duasconcentrações foram preparadas para as frações do extrato etanólico.40,0 \xL de cada solução (extrato aquoso, extrato etanólico e frações)eram colocadas nos poços. Em cada placa de Petri existia um poçocontendo uma solução de 40 |uL DMSO: Metanol (50:50) v/v usadocomo controle negativo, e como controle positivo um poço com 20 juL deuma solução padrão de (1 mg/mL) de cloranfenicol, (potência: 100.000UI/mL), para bactérias; nistatina, (potência: 100.000 UI/mL) parafungo; e amicacina, (potência: 916 jag/mg), para Pseudomonasaeruginosa. As placas eram incubadas por 24 h a 32°C (bactérias) e por48 h a 25°C (fungo). Os diâmetros das zonas de inibição resultantesforam medidos por "Antibiotic Zone Reader - Fisher- Lilly" (mm). Cadaexperimento foi repetido ao menos três vezes. A zona de inibiçãomensurada corresponde à média dos diâmetros das zonas de inibiçãoencontradas.
Os microrganismos testados foram: Staphylococcus aureusATCC 6538, Escherichia coli ATCC 10536, Cândida albicans ATCC10231, Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027, Aspergillus nigerATCC 16404. A avaliação da atividade antimicrobiana dos extratos queapresentaram melhores resultados no teste por difusão em ágar foirealizada através da CMI e visou a seleção dos extratos que foramincorporados nas formulações cosméticas. O ensaio utilizado foi pelométodo de microdiluição em meio líquido com técnicas assépticas. Paramaior confiabilidade dos resultados, a determinação da CMI dosextratos selecionados foi avaliada, após incubação com temperaturacontrolada, por espectrofotometria em microplacas. Esse teste é umaadaptação do procedimento de diluição em meio líquidos que utilizamaior volume (10 mL), com os volumes de inóculo, reduzindo amostra emeio de cultura para 230 jiL, possibilitando maior número de réplicas.
Em uma etapa inicial, foi padronizado e validado o método, oequipamento utilizado foi o leitor de microplacas LM-LGC fornecendoprecisão de leitura espectrofotométrica.
Em cada poço foram colocados 200 (íL descritos a seguir; C:controle negativo (meio); Cs: controle do solvente (meio, microrganismoe solvente); Cc: controle de crescimento (meio e micro rganismo); C+:Controle positivo (meio, micro rganismo e antimicrobiano de referência);
Cext: controle do extrato (meio e extrato); e amostras estudadas nasconcentrações apropriadas. Para todas essas variáveis são utilizados nomínino quatro poços de cada microplaca.
Através do estudo em cromatografia gasosa-espectrofotômetro de Massa (CG-EM) foi constatado que os trêsprincipais -compostos majoritários cujo padrão de fragmentação, dafração 4 descrita na tabela 2, fora compatível são 4',5-Dihidroxi-7-metoxi-flavonona, a naringenina, e o apiflorol. Tais valores serviram debase para comparação com o extrato total e as frações ativas da L.salviaefolia.
As bases cosméticas utilizadas na presente invençãoenvolvem preferencilamente, emulsão (creme), gel e xampu. Forampreparadas 6 formulações testes (2 emulsões, 2 géis e 2 xampus)selecionadas a partir do aspecto sensorial através de critério pessoal(espalhamento adequado na pele, toque sedoso e aspecto). Estasformulações foram submetidas aos testes preliminares de estabilidadefísica (centrifugação e estresse térmico), e ao teste de estabilidadeacelerada. Ao final destes testes foi eleita uma formulação de emulsão,uma de gel e uma de xampu, com as quais se prosseguiu o teste deeficácia de conservante. As composições de cada formulação preliminarestão descritas nas tabelas a seguir:
Tabela 3
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O procedimento para o preparo do Creme A envolveu oaquecimento das fases, aquosa e oleosa, separadamente, até atemperatura de 70-75°C. Ao atingirem este valor, verteu-se a faseaquosa sobre a oleosa, de forma lenta e constante e com auxílio daagitação mecânica (Mixer). Após a obtenção da emulsão, homogeneizou-se até seu resfriamento a 40°C e acrescentaram-se o ciclometicone, aessência e o extrato, previamente diluído em q.s. etanol P.A. O valor depH da formulação foi corrigido para 6,0-6,5.
Tabela 4<table>table see original document page 30</column></row><table>
Misturou-se, com auxílio da espátula de plástico, oHostacerin® SAF e q.s. de água destilada flexível. Adicionaram-se aessência e o extrato homogeneizando-se o sistema. O valor de pH daformulação foi corrigido para 6,0-6,5.
Tabela 5
<table>table see original document page 30</column></row><table>Hidratou-se a hidroxietilcelulose com q.s. de água destiladana temperatura de 50°C e agitou-se com espátula de plástico flexível atéa formação do gel. Adicionaram-se o propilenoglicol, a essência(previamente dispersa no Procetyl® AWS) e o extrato, completando-se amassa do gel com q.s.p. de água destilada e homogeneizou-se. O valorde pH da formulação permaneceu entre 6,0-6,5.
Tabela 6
<table>table see original document page 31</column></row><table>
O polímero carboxivinílico foi disperso em q.s. de águadestilada e permaneceu em repouso por 3 h, a fim de completar ahidratação. Após esse período, foi adicionado o propilenoglicolhomogeneizando-se com auxílio de espátula de plástico flexível. Aessência e o Cetiol® HE foram previamente dispersos em Procetyl® AWSe adicionados à mistura, e posteriormente o extrato homogeneizando-seo sistema. A formulação foi pesada, completou-se a massa com águadestilada e corrigiu-se o valor do pH para 6,0-6,5, com auxílio dohidróxido de sódio e homogeneização manual.Tabela 7
<table>table see original document page 32</column></row><table>
Pesaram-se os componentes lauril éter sulfato de sódio,lauril sulfato de trietanolamina e dietanolamida de ácidos graxos ehomogeneizou-se com auxílio de espátula de plástico flexível.
Adicionaram-se 50 g de água destilada com agitação suave.
Acrescentaram-se o corante, a essência e o extrato, completou-se amassa com água destilada e misturou-se suavemente. Corrigiu-se ovalor do pH para 6,0-6,5 com ácido cítrico, adicionou-se a solução decloreto de sódio até obter o espessamento adequado {observadavisualmente e característica de um xampu) e homogeneizou-se osistema.Tabela 8
<table>table see original document page 33</column></row><table>
Pesou-se o lauril sulfossuccinato dissódico, o lauril sulfatode sódio (Genapol® SSB), o lauril sulfato de sódio (Genapol® LSS), odiestearato glicol (Genapol® EGL), a cocoamidopropil betaína (Dehyton®KB) e o fosfato 3- oleílico (Hostaphat® 0-300) e homogenizou-sesuavemente com auxílio de espátula de plástico flexível. Foramincorporados à formulação, q.s. de água destilada, a essência e oextrato, completou-se o volume com água destilada e misturou-sesuavemente com a mesma agitação. Corrigiu-se o valor do pH para 6,0-6,5 com hidróxido de sódio e adicionou-se a solução de cloreto de sódio,até alcançar espessamento adequado (observada visualmente ecaracterística de um xampu) e homogeneizou-se o sistema.
Todas as pré-formulações cosméticas foram submetidas aestudo de estabilidade acelerada. Assim, com o intuito de avaliarcriteriosamente a atividade conservante dos extratos da L. salviaefolianas pré-formulações cosméticas descritas acima, estas foramsubmetidas a condições drásticas "Stress test". Antes de iniciar oestudo de estabilidade o produto foi submetido ao teste de centrifugaçãoe ao estresse térmico.
Na centrifugação, dez gramas das formulações (creme A ecreme B) foram submetidas a ciclos de rotação de 1000, 2500 e 3500rpm em centrífuga, durante quinze minutos para cada velocidade.
As amostras (Creme A e B e Xampu A e B) foram colocadasem banho-maria termostatizado, entre 40 e 80°C. Realizou-se aelevação da temperatura de 10 em 10°C, mantendo por 30 minutos emcada valor. Foram avaliadas as amostras ao término do teste (80°C),após as mesmas retornarem à temperatura ambiente (22,0 ± 2,0°C).
Após 24 horas de preparo, considerado como ti (tempoinicial), as formulações escolhidas, creme A e B, gel A e B e xampu A eB, foram submetidas às seguintes condições e períodos de avaliação:
No armazenamento, as formulações foram mantidas àtemperatura ambiente (22,0 ± 2,0°C), durante 14 dias, sendo avaliadasno 3o, 7o e 14° dias.
O produto foi exposto à luz solar de forma indireta e nãodiretamente ao sol. Pois a luz solar direta pode alterarsignificativamente a cor e o odor do produto e levar à degradação decomponentes da formulação.
As preparações foram submetidas à temperatura de 45,0 ±2,0°C em estufa, durante 14 dias, sendo avaliadas no Io, 3o, 7o e 14°dias. Ainda, as formulações foram submetidas a ciclos de congelamento(-10,0 ± 2,0°C) por 24 horas em freezer, seguido de descongelamento eaquecimento em estufa (50,0 + 2,0°C) por 24 horas, completando-sedessa forma um ciclo. As amostras foram submetidas a seis ciclos,sendo avaliadas no 3o (6o dia) e 6o ciclos (12° dia).
Também, as formulações foram mantidas à temperatura de-10,0 ± 2,0°C em. freezer, durante 14 dias e avaliadas no 7o e 14° dias. Aavaliação ainda se deu em refrigerador onde as formulações forammantidas em (6,0 ±2,0 °C), durante 14 dias e avaliados no 3o, 7o e 14°dias.
Após 24 horas do preparo (ti), cada formulação foi avaliadaquanto às características organolépticas (aspecto, cor e odor), valor depH e de viscosidade aparente. Os resultados obtidos em ti foramconsiderados como referência para comparação com as demais leiturasdas amostras, em todas as condições, durante o Teste de EstabilidadeAcelerada.
Os microrganismos desafiantes utilizados na validação e noteste de eficácia de conservantes foram: Escherichia coli (ATCC 10536),Pseudomonas aeruginosa (ATCC 9027), Staphylococcus aureus (ATCC6548), Burkholderia cepacia IAL 1834 ATCC (17759), Cândida albicans(ATCC 10231) e Aspergillus niger (ATCC 16404).
A escolha da condição de inativação do sistema conservantetem como objetivo validar o método usado no teste de eficácia dosistema conservante. A confiabilidade do método usado no teste deeficácia de conservante depende da sua capacidade em evitar ainterferência do sistema conservante no crescimento dosmicrorganismos.
Para a escolha de condição de neutralização ou inativaçãodo sistema conservante, o estudo foi conduzido com as formulações decreme A, Gel B e Xampu B. Esses produtos foram preparados emcondições assépticas e considerados como a amostra-teste. Comocontrole da viabilidade dos microrganismos utilizou-se solução salina0,9% (p/v).
As amostras do Creme A, Gel B e Xampu B foram avaliadasquanto à eficácia do sistema conservante. O teste de desafio foiexecutado para cada um dos microorganismos acima mencionados.
Aproximadamente 20g de cada amostra teste foi inoculadacom um dos microrganismos desafiantes em cerca de IO5 a IO6 UFC/g,proveniente da suspensão previamente padronizada conforme descritoanteriormente e respeitando-se a relação entre o volume do inóculo e dasuspensão, para ser menor ou igual a 1% (p/v) do volume da amostra.
Imediatamente após a inoculação, foi homogeneizado por um minutoem agitador e submetido à diluição seriada e à contagem das colôniasde microrganismos viáveis (UFC/g), pela técnica de semeadura emprofundidade. Para o procedimento de diluições decimais empregou-se odiluente Dey Engley (D/E). Como meio de cultura foi utilizado ágarcaseína soja e ágar sabouraud-dextrose 4%.
As amostras desafiadas e os controles foram mantidos emtemperatura ambiente no decorrer do teste. A periodicidade de cadaavaliação do sistema conservante das amostras foi mantida. Ressalta-seque, para todos os métodos utilizados na avaliação da eficácia desistema conservante, foram realizados ensaios logo após a inoculaçãodo microrganismo, considerado tempo zero (to).
Para a verificação da viabilidade dos microrganismosdurante os testes, realizou-se o mesmo procedimento utilizado paraamostra, embora empregando solução salina 0,9 % (p/v), consideradono ensaio como controle da viabilidade do microrganismo.Os tempos para a avaliação, no presente pedido, foram logoapós a inoculação e após 2, 7, 14, 21 e 28 dias. Foram nomeados,respectivamente, de to, t2, t7; ti4; t2i e t28-
Para a avaliação da segurança das formulações cosméticassem e com incorporação de L. salviaefolia em estudos histológicos, ossubstitutos cutâneos dermo-epidérmico foram inicialmente forapreparadas as bases dérmicas. Seqüencialmente foram preparadasculturas secundárias de queratinócitos sobre as bases dérmicas emcultivo na interface ar-líquido. A derme foi preparada com 2x2 cm2 emantida em PBS (Phosphate Buffered Saline - Solução Salina FosfatoTamponada), foi colocado um anel sobre a derme para semear osqueratinócitos em alta densidade, deixando "overnight" para retirar oanel. No sétimo dia o conjunto foi passado para o sistema de rede emplacas de seis poços. As culturas foram mantidas em estufa de cultivocom atmosfera de CO2 a 5%, à temperatura constante de 37°C, sendoque em cada poço continham 3 mL de KGM (Keratinocyte GrowthMédium), o meio de cultivo foi trocado a cada dois dias até o 14° dia ediariamente até o 21° dia. Para início do teste de avaliação de segurançatodo meio foi aspirado e, com o auxílio de uma seringa de insulina de 1mL, colocou-se 1 gota (cerca de 20-30 nL) de cada amostra (gel, creme exampu sem e com a incorporação de L. salviaefolia) sobre os compostoscultivados na interfase ar-líquido, em uniplicata, mantendo um poçocomo controle sem a adição de amostra.
Depois de adicionado às amostras nos compostos cultivadosna interfase ar-líquido, os sistemas foram mantidos por 24 horas ou 48horas no meio de cultivo. O sistema dermo-epidérmico foi lavado 3 vezescom PBS e transferido, com o auxílio de uma pinça e agulha, para umpapel de filtro. Seqüencialmente o sistema foi tratado e fixado, paramicroscopia óptica, por 24-72 horas, em geladeira, comparaformaldeído (PFA) a 4% em tampão cacodilato de sódio pH 7,2. Foilavado novamente três vezes com PBS e deixado em álcool 70% nageladeira. A análise da morfologia da pele humana, sistema dermo-epirdérmico, foi feita em microscópio óptico, com aumento de 1000vezes (microscópio Labophot - Nikon).
Preparou-se solução estoque na concentração de 2 mg/mL,solubilizando-se o extrato seco de acetato de etila de L. salviaefolia empolietilenoglicol 400 (PEG 400). Os queratinócitos HK186 em baixadensidade (com camada de sustentação) formada por Fibroblastos CC1-92 previamente irradiados com 60 Gy, na passagem P0 foramamplificados para uma garrafa de 75 cm2 em meio KGM. À partir decultura primária, após atingir a quantidade de células necessárias,foram tripsinizados e semeados a 50.000 células/poço de HK186 emduas placas "multiwell" de 96 poços. Após 24 horas foram adicionados100 |uL das diluições seriadas necessárias da solução mãe de L.salviaefolia em PEG para atingir as concentrações de 2%, 1%, 0,5%,0,25% e 0,125% (p/v) da fração de acetato de etila do extrato de L.salviaefolia em meio KGM, recém preparado e previamente esterilizadopor filtração, em triplicatas.
As amostras foram mantidas em contato com essa soluçãode L. salviaefolia por 2, 6, 24 e 48 horas. Foi feito também um controlesem tratamento, onde foi adicionado o meio de cultura KGM em 11réplicas e mantidas em incubação até o fim de teste (48 horas). E aavaliação da interferência do solvente: após o período de incubação omeio de cultura foi trocado por meio KGM, contendo quantidadescrescentes do solvente 0%, 5%, 1%, 2%, a serem testados e então aplaca foi novamente incubada nos intervalos de tempo de 2, 6, 24 e 48horas, para o intervalo de tempo 2 horas foram utilizadas apenas asconcentrações de 2% e 1%, ou seja, reproduzindo as condições maisdrásticas do teste de viabilidade celular para L. sálviaefolia. Após estesperíodos pré-estabelecidos de contato, trocou-se o meio de cultura porKGM e as amostras foram mantidas até o final do teste, 2 dias, sendoentão submetidas a coloração por rodamina (avaliação qualitativa) eMTS (avaliação quantitativa) para verificação da viabilidade celular.
Após 48 horas, as soluções, contidas nos poços, foramaspiradas e adicionaram-se alíquotas de 120 da solução MTS/PMSem KGM em todos os poços da placa, que foi imediatamenteacondicionada em estufa de atmosfera controlada a 37°C, com 5% deCO2 e 95% de umidade relativa, por 2 horas. Decorrido este períodoinicial, foi realizada a primeira medida de absorbância, a 490 nm, emespectrofotômetro de placa de ELISA acoplado a impressora. Incubou-senovamente a placa e tomaram-se mais três leituras, com intervalo de 1hora.
Com o intuito de se quantificar a proliferação das células,aplicou-se o método colorimétrico intitulado Cell Titer 96®.
Para preparação das soluções de MTS/PMS em KGM:soluções de MTS e PMS foram descongeladas em banho termostatizado,a 37°C, por 10 minutos. Na preparação foi utilizado transferiu-se15,873% de MTS, para um tubo de fundo cônico contendo 83,333% demeio de cultura celular (KGM). Em seguida adicionou-se 0,794% dePMS agitando a solução vigorosamente.
Os extratos hidroalcoólico e aquoso foram obtidos apósconstatação da ineficiência do extrato aquoso como agenteantimicrobiano, e ação do extrato hidroalcoólico foi feita a partiçãoextrato hidroalcoólico para obtenção das frações e estudo de suasatividades antimicrobianas, com o intuito de identificar a fração commelhor atividade antimicrobiana. Nas tabelas 9 e 10 são descritos opeso seco e rendimento de cada extrato e frações.A tabela 9 refere-se ao rendimento dos extratos aquoso ehidroalcoolico obtidos da L. salviaefolia
Tabela 9
Rendimento dos extratos aquoso e hidroalcoolico de L. salviaefolia
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A tabela 10 mostra o rendimento das frações obtidas apartir da partição do extrato hidroalcoolico de L. salviaefolia.
Tabela 10
Rendimento das frações do extrato hidroalcoolico de L. salviaefolia
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A fração que apresenta maior rendimento é a fração deacetato de etila, com um rendimento de 41,34% (tabela 10).Após a partição e estudo da atividade antimicrobiana pormeio de difusão das frações hexânica, clorofórmica, acetato de etila ebutanólica. Constatou-se que frações ativas mais eficazes são: a fraçãode acetato de etila e a fração clorofórmica. Feita uma análise em CCD,verificou-se que as frações clorofórmica e de acetato de etila temcomposição parecida. Devido ao fato de terem composição parecida e aoCMI das duas frações serem parecidos, a fração de acetato de etila, porter maior massa, melhor rendimento e apresentar melhor facilidade demanuseio, devido a menor concentração de compostos graxos.
A partir da extração em coluna cromatográfica da fração deacetato de etila obtemos as frações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 e 9. Cada umadessas frações foi submetida ao estudo de atividade antimicrobiana à1,0 mg/mL frente a S. aureus, microrganismo mais sensível aos testesde atividade antimicrobiana. Possibilitando a identificação das fraçõescom atividade antimicrobiana considerável e conseqüente de maiorinteresse para o estudo em questão. Sendo as frações 3 e 4 queapresentaram melhor atividade antimicrobiana.
A análise em CCD foi realizada como um "screening",possibilitando identificação das frações que apresentam os compostosmajoritários. Verificou-se que os compostos majoritários estão nasfrações 3 e 4. Assim como as melhores atividades antimicrobianas. Aanálise constitucional foi realizada pelo CG-EM.
A análise estrutural foi realizada apenas para as fraçõesmais purificadas e com maior atividade antimicrobiana, pois nestasfrações estão presentes componentes de interesse, com maior atividademicrobiana. Devido à semelhança de composição entre as frações 3 e 4,observada em CCD, somente a fração 4 foi submetida à análiseestrutural por CG-EM. A análise por CG-EM da fração 4 obtida com osprocedimentos de separação revelou a presença de flavononas. Os trêsprincipais compostos majoritários cujo padrão de fragmentação écompatível são 4',5-Dihidroxi-7-metoxi-flavonona (tempo de retenção =17,032), a naringenina (tempo de retenção= 17,537 min.), e o apiflorol(tempo de retenção = 17,988).
Utilizou-se um "screening" inicial para verificação dasfrações e extratos com atividade antimicrobiana. Os resultados daatividade antimicrobiana pelo método de difusão em ágar dos extratosaquosos etanólicos e das frações do extrato etanólico estão presentes natabela 11. Observou-se que o extrato etanólico mostrou boa atividadeantimicrobiana contra S. aureus, E. coli, e C. albicans. Os diâmetros dasáreas de inibição mensurados, referentes aos extratos estudadosficaram entre 13,3 -1,3 mm dependendo do microrganismo estudado.
A tabela 11 mostra a atividade antimicrobiana mensuradapelo diâmetro de inibição do crescimento, dos extratos de L. salviaefoliae frações pelo método de difusão em ágar. Sendo i: inativo; —: teste nãorealizado; EE: extrato etanólico de L. salviaefolia, EAq: extrato aquosode L. salviaefolia, Fr.H.: fração hexânica; Fr.CHCb: fração declorofórmio; Fr.Ac.Et.: fração de acetato de etila; Fr.ButOH.: fraçãobutanólica.Tabela 11
Método e difusão em ágar, diâmetro do halo de inibição (mm) dosextratos e frações de L. salviaefolia
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As frações hexânica e butanólica apresentaram poucaatividade frente aos microrganismos testados. Entretanto, o uso dasfrações clorofórmicas e de acetato de etila foram efetivas, o quecorrobora uma boa atividade antimicrobiana frente S. aureus, E. coli eC. albicans, entre outras.
De acordo com os resultados apresentados na tabela 11,pode-se notar que os valores referentes às zonas de inibição para afração de acetato de etila estão bem próximos daqueles apresentadospela fração clorofórmica, sendo que os valores das zonas de inibiçãopara fração de acetato de etila são levemente menores do que os valorescorrespondentes à fração clorofórmica.
A atividade antimicrobiana do extrato aquoso, do extratoetanólico total e das frações de L. salviaefolia foi testada pelo método dedifusão em ágar contra quatro micror-ganismos: um Gram-positivo (S.aureus), dois Gram-negativos {E. coli e P. aeruginosa) e um fungo (C.albicans). Os resultados demonstraram considerável atividadeantimicrobiana para o extrato etanólico total e para as fraçõesclorofórmica e de acetato de etila.
Os extratos de L. salviaefolia mostrados aqui no presentepedido relatam ser um ativo funcional em dosagens menores àquelasapresentadas no estado da técnica referente ao método de difusão. Logoo método de difusão em ágar foi utilizado apenas como um "screening"para encontrarmos as frações ativas. O CMI do extrato total como dassuas frações de L. salviaefolia foi determinado pelo método demicrodiluição.Os resultados referentes à determinação da CMI confirmamos resultados apresentados pelo teste de difusão em ágar. As fraçõeshexânica e butanólica são inativas. Porém como se pode observar natabela 8, o extrato total, fração clorofórmica, fração de acetato de etila, eas frações 3 e 4 provenientes da fração de acetato de etila foram ativasfrente S. aureus, E. coli, C. albicans e A. niger. Por outro lado, somenteas frações clorofórmica e a de acetato de etila foram ativas frente a P.aeruginosa.
Na tabela 12 as concentrações mínina inibitórias (CMI) paranaringenina são apresentadas, para o extrato total de L. salviaefolia;para as frações ativas do extrato total: fração de acetato de etila e fraçãoclorofórmica; e ainda para as frações 3 e 4 derivadas da fração deacetato de etila. Como pode ser observado, as frações 3 e 4 derivadas dafração de acetato de etila, não apresentaram CMI superior aos da suafração original, tornado injustificável a purificação das frações deacetato de etila e de clorofórmio, esse fator pode ser explicado pelo efeitosinérgico favorável entre as substâncias presentes nos extratos.
A tabela 12 revela a CMI da naringenina, do extrato total efrações da L. salviaefolia pelo método de microdiluição, frente abactérias e fungos, sendo EE: extrato etanólico; CHCb.Fr: Fraçãoclorofórmica do extrato etanólico; Ac.Et.Fr.: Fração de acetato de etilado extrato etanólico; Fr. 3: Fração 3 da fração de acetato de etila; Fr. 4:Fração 4 da fração de acetato de etila.
Tabela 12Concentração Mínima Inibitória de L. salviaefolia (CMI mg/mL)Método de microdiluição
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De acordo com a tabela 12, observou-se que, ao realizar oteste de atividade antimicrobiana da L. salviaefolia, a fraçãoclorofórmica e a fração de acetato de etila possuem a maior atividadeantimicrobiana, em que apresentaram um CMI de 0,2% para asbactérias e fungos testados.
As frações 3 e 4 provenientes da fração de acetato de etilaapresentaram CMI próximos, quando comparando entre si (tabela 12).
Esse fato pode ser explicado devido à semelhança constitucional entreas frações. Porém a CMI apresentada tanto pela fração 3 como pelafração 4, não foram mais eficazes que as frações de acetato de etila ou afração de clorofórmio (tabela 12). Este fato pode ser explicado devido aoefeito sinérgico apresentado pelos constituintes de cada fração. Destaforma, para a L. salviaefolia, à medida que se purifica a fração diminuia atividade antimicrobiana.Foram isolados três compostos majoritários em CG-EM. Ostrês principais compostos majoritários cujo padrão de fragmentação écompatível são 4',5-Dihidroxi-7-metoxi-flavonona, a naringenina, e oapiflorol. Dentre esses compostos a naringenina é encontrada paracomercialização. Deste modo estudou-se a atividade antimicrobianapara naringenina. Verificou-se que a naringenina assim como o extratoetanólico total da L. salviaefolia (Tabela 12), tem os maiores valores deCMI encontrados no estudo da atividade antimicrobiana. Para o S.aureus o CMI da naringenina e do extrato total foram entre 0,125-0,25mg/mL; para E. coli, CMI entre 1,0 - l,5mg/mL; para P. aeruginosa >2,0 mg/mL; para C. albicans entre 1,5 - 2,0 mg/mL; e para A. nigerentre 1,5 - 2,0 mg/mL. Esse fato evidencia que para alcançar osmelhores níveis da atividade antimicrobiana da L. salviaefolia, deve-sefazer o processo de extração inicial e a partição do extrato total até quese consiga obter a fração clorofórmica e a fração de acetato de etila. Apartir deste ponto se prosseguir a purificação e isolamento doscompostos a atividade antimicrobiana tente a diminuir.
A alta eficiência da fração de acetato de etila e da fraçãoclorofórmica pode ser explicada pelo efeito sinérgico entre todos oscomponentes destas frações de L. salviaefolia. Este fato pode serexplicado devido à semelhança constitucional das duas fraçõesobservada no teste de CCD.
A razão para a diferença entre a sensibilidade de bactériasGram-positivas e Gram-negativas se faz devido à diferença naconstituição das paredes celulares de cada uma. Bactérias Gram-negativas tem uma membrana fosfolipídica carreada de componenteslipopolisacarídeos. Isto faz com que a parede celular seja impermeável aalgumas substâncias químicas antimicrobianas. Por outro lado,bactérias Gram-positivas são mais suscetíveis, uma vez que tem umamembrana celular constituída apenas por uma camada depeptidioglicano, não sendo uma barreira de permeabilidade efetiva.
Entretanto, em relação a estas diferenças de permeabilidade, a L.sálviaefolia se mostrou eficaz tanto para Gram-positivas como paraGram-negativas, especialmente as frações: acetato de etila eclorofórmica (Tabela 12).
O A. niger normalmente é insensível à maioria dos extratosde plantas testados em relação à atividade antimicrobiana, e a C.albicans mostrou-se um fungo de difícil inibição. Entretanto como podeser observado na tabela 12, tanto a fração clorofórmica como a fraçãode acetato de etila da L. sálviaefolia foi ativa com valores de CMIconsiderável. Ainda, todos os extratos testados de L. sálviaefoliapossuíram atividade contra bactérias e fungos, especialmente a fraçãoclorofórmica e a fração de acetato de etila. Indicando boa atividadeantimicrobiana.
Após centrifugação das emulsões: creme A (CA) e creme B(CB), não foi observada coalescência ou separação de fases,demonstrando estabilidade física adequada.
As formulações dos cremes A e B mantiveram-se estáveis,suportando as alterações de temperatura a que foram submetidas noteste de estresse térmico, não apresentando separação de fases.
Os resultados quanto às características organolépticas,valores de pH e viscosidade aparente das formulações avaliadasinicialmente e após exposição às condições do teste (geladeira de 4-8°C,estufa a 45°C; ciclos gela e degela; freezer a -10°C; temperaturaambiente a 22°C e luz solar) para os cremes A e B, para os géis A e B epara os xampus A e B.
A presença de microrganismos, em determinados níveis etipos, em produtos não estéreis, pode ser condição relacionada àdeterioração do produto, bem como o não cumprimento das BoasPráticas de Fabricação pode, também, conduzir a produção comqualidade sanitária inadequada. Esse processo pode até ser observadonos casos em que o substrato oferece condições mínimas necessáriaspara o desenvolvimento microbiano. Os contaminantes que sobrevivemmultiplicam-se em meio pobre de fatores nutricionais ou mesmoadaptam-se em condições bastante desfavoráveis. A proliferação demicrorganismos pode provocar alterações de diversas naturezas, comoperda do teor da substância ativa e alterações físico-químicas e/ouorganolépticas do produto.
Para cosméticos é permitido nível limite de microrganismosviáveis, o ensaio consiste na contaminação proposital da amostra commicrorganismos padrão e determina-se a carga dos sobreviventes emperíodos pré-estabelecidos durante 28 dias, utilizando-se técnica decontagem microbiana validada.
Ao se comparar às condições estudadas observa-se quesomente na condição 2 foi possível recuperar todos os microrganismos(Tabela 13). Esses resultados indicaram que para a enumeração dosmicrorganismos haveria a necessidade de uma diluição IO"1 dasformulações Creme A, Gel B e Xampu B, com diluente Dey Engley(D/E). Frente a esses resultados para o teste de eficácia deconservantes, procedeu-se à diluição das formulações antesenumeração ou contagem de microrganismos viáveis, nos períodosimediatamente após a inoculação, após 2, 7,14, 21 e 28 dias.
A Tabela 13 apresenta os resultados da recuperação dosmicrorganismos nas duas condições de neutralização, onde o controle =solução salina a 0,9% (p/v) estéril; amostra-teste = produto preparadocom conservante, em condições assépticas e cada algarismo representaa média do ensaio realizado em cinco réplicas. Observa-se que ocontrole apresentou a recuperação sempre maior que 70% para todos osmicrorganismos, demonstrando a viabilidade dos microrganismosdurante a validação e garantindo que as recuperações menores que70% eram devidas à condição não adequada para o crescimento dosmicrorganismos.
Tabela 13
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Para avaliação da eficiência do sistema conservante, o testeconsiste na contaminação de Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa,Staphylococcus aureus, Burkholderia cepacia, Cândida albicans eAspergillus niger em cada amostra e determina-se a carga dossobreviventes em períodos pré-estabelecidos durante 28 dias,utilizando-se técnica de contagem microbiana convencional validada.
Os resultados da avaliação da atividade conservante, extrato a 0,2%(p/v), nas formulações de Creme A, Gel B e Xampu B são apresentadosa seguir.
A tabela 14 apresenta a carga de sobreviventes deEscherichia coli ATCC 10536 (UFC/g ou mL) no teste de eficácia deconservantes, onde to = contagem imediatamente após a inoculação; t48= contagem em 48 horas após inoculação e Í7, ti4, t2i e t28 = contagemem 7, 14, 21 e 28 dias após inoculação.
Tabela 14
<table>table see original document page 51</column></row><table>
A tabela 15 mostra a carga de sobreviventes dePseudomonas aeruginosa ATCC 9027(UFC/g ou mL) no teste de eficáciade conservantes, onde to = contagem imediatamente após a inoculação;U8 = contagem em 48 horas após inoculação e t7, ti4, t2i e tas =contagem em 7, 14, 21 e 28 dias após inoculação.
Tabela 15<table>table see original document page 52</column></row><table>
A tabela 16 apresenta a carga de sobreviventes deStaphylococcus aureus ATCC 6538(UFC/g ou mL) no Teste de Eficáciade Conservantes, onde to = contagem imediatamente após a inoculação;t48 = contagem em 48 horas após inoculação e t7, ti4, t2i e t28 =contagem em 7, 14, 21 e 28 dias após inoculação.
Tabela 16
<table>table see original document page 52</column></row><table>
A tabela 17 mostra a carga de sobreviventes deBurkholderia cepacia ATCC (UFC/g ou mL) no Teste de Eficácia deConservantes, onde to = contagem imediatamente após a inoculação; Us= contagem em 48 horas após inoculação e t7, ti4, t2i e t28 = contagemem 7, 14, 21 e 28 dias após inoculação.
Tabela 17
<table>table see original document page 53</column></row><table>
A tabela 18 revela a carga de sobreviventes de Cândidaalbicans ATCC 10231(UFC/g ou mL) no Teste de Eficácia deConservantes, onde to = contagem imediatamente após a inoculação; t48= contagem em 48 horas após inoculação e t7, ti4, t2i e t28 = contagemem 7, 14, 21 e 28 dias após inoculação.
Tabela 18
<table>table see original document page 53</column></row><table>A tabela 19 refere-se à carga de sobreviventes de AspergillusnigerATCC 16404 (UFC/g ou mL) no Teste de Eficácia de Conservantes,onde to = contagem imediatamente após a inoculação; Us = contagemem 48 horas após inoculação e Í7, ti4, t2i e t28 = contagem em 7, 14, 21e 28 dias após inoculação.
Tabela 19
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Os testes foram realizados, concomitantemente com soluçãosalina a 0,9% (p/v) inoculada com a mesma carga microbiana daamostra teste, a suspensão foi considerada controle como intuito averificação da viabilidade dos microrganismos desafiantes durante os 28dias do teste. Nesta condição, verificou-se que para as bactériasEscherichia coli (tabela 14), Pseudomonas aeruginosa (tabela 15),Staphylococcus aureus (tabela 16) e Burkholderia cepacia (tabela 17)apresentaram-se viáveis durante todos os testes, assim como para osfungos Cândida álbicans e Aspergillus niger que se mantiveram,também, adequados no decorrer do tempo de avaliação.
De acordo com os resultados analíticos descritos nastabelas 14, 15, 16, 17, 18 e 19 pode-se afirmar que: as amostras decreme, gel e xampu na concentração de 0,2% da fração de acetato deetila do extrato etanólico de L. salviaefolia atendem a especificaçãoadotada para as bactérias: Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa,Staphylococcus aureus, Burkholderia cepacia, e Cândida albicans.
Após o período de contato de 24 horas ou 48 horas, dasamostras com o substituto cutâneo dérmico-epidérmico, corte ecoloração por hematoxilina-eosina, foi observado o efeito das bases sema incorporação da L. salviaefolia e das formulações cosméticas com aincorporação da L. salviaefolia, na epiderme de cada sistema dérmico-epidérmico. Avaliando, desta forma, a segurança de cada formulação.
Na figura 18 temos o controle chamado de branco 24h emque não foi adicionada nenhuma amostra, mas, permaneceu no sistemade cultivo na interfase ar-líquido durante as 24 horas de teste. Nestailustração o epitélio se mostrou organizado e reproduzindo a morfologiaesperada para derme e epiderme, com diferença tintoriais devido aoamadurecimento celular, podendo ser observado ainda as lamelas dequeratina, constituindo a camada córnea. Além da observação dascamadas intermediária ou espinhosa e a granulosa.
Na figura 19 consta o estudo histológico da pele após ocontato de 24 h com a formulação base gel, observados em microscopiaóptica, revelam a morfologia da epiderme e da derme, apesar daseparação dermo-epidérmica pode ser observada uma leve toxicidadedevido a leve alteração na morfologia da epiderme.
Na figura 20 consta o estudo histológico da pele após ocontato de 24 horas com a formulação cosmética gel, incorporada comL. salviaefolia como conservante natural. Neste caso pode-se observaruma maior toxicidade da formulação uma vez que houve uma alteraçãosignificativa na morfologia da epiderme, e morte de grande parte dosqueratinócitos. Constatado devido à impossibilidade de identificaçãodestas células como ainda pode-se visualizar na figura 18. Essa maiortoxicidade quando comparamos o gel sem a incorporação da L.salviaefolia se deve a toxidade inerente ao extrato, porém é importanteresaltar que a própria formulação sem a adição da L. salviaefolia játinha demonstrado certa toxicidade.
A formulação creme foi a que apresentou menor toxicidademantendo derme e epiderme com características morfológicas normaisapós o tempo de contato de 24 h (Figura 21).
Na figura 22 constatou-se a influência da formulaçãocosmética creme incorporada com L. salviaefolia, apesar do maiordesprendimento da queratina foi verificada uma baixa toxicidade.
Observando ainda as células de queratinócitos viáveis na epiderme.
Além da manutenção na morfologia da derme e da epiderme.
Na figura 23 constatou-se a toxicidade da formulação dexampu mesmo sem a adição da L. salviaefolia, isso se deve a presençade tensoativos, por isso são empregados, na sua maioria, em produtosde uso externo e com enxágüe. Na figura 23 observa a desprendimentode toda parte córnea de queratina, da epiderme e uma própria alteraçãoestrutural da epiderme principalmente na camada intermediária, apesarde ainda ser possível observar células de queratinócitos viáveisprincipalmente próximas às papilas dérmicas na camada basal.
Na figura 24 tem-se o composto dérmico-epidérmico após24 h de contato com a formulação cosmética xampu incorporada com L.salviaefolia. Os efeitos tóxicos são similares aos efeitos apresentadospela figura 23 representando a base de xampu sem a adição da fraçãode acetato de etila do extrato de L. salviaefolia. Na qual se verifica umdesprendimento da camada córnea e a separação dermo-epidérmica,com alteração estrutural da epiderme. Características evidenciadas pelatoxidade da base do xampu e toxicidade da L. salviaefolia, entretantotoda a toxicidade constatada nas figuras 23 e 24 não devem seratribuídas somente ao extrato uma vez que a formulação sem a oextrato também se mostrou tóxica, provavelmente pela presença dostensoativos na formulação.
Na figura 25 temos o controle chamado de branco 48 h emque não foi adicionada nenhuma amostra, mas, permaneceu no sistemade cultivo na interfase ar-líquido durante as 48 horas de teste. Nestailustração o epitélio se mostrou organizado apesar da separação daderme e da epiderme, sendo que na avaliação da toxicidade para estepois pode ser um artefato, desta forma a toxicidade foi avaliadaconforme ao aspecto das diferenças morfológicas e diferenças tintoriaisda pele. Na figura 25 podem-se evidenciar diferenças tintoriais, devidoao amadurecimento celular, podendo ser observado ainda as lamelas dequeratina, constituindo a camada córnea. Além da observação dascamadas intermediária ou espinhosa e a granulosa.
Na figura 26 tem-se a influência da amostra de gel base em48 horas de contato com o composto dérmo-epidérmico. Nestailustração temos a visualização apenas da parte epidérmica em que épossível verificar a toxicidade da base gel devido às característicasmorfológicas e tintoriais presentes na epiderme, principalmente navisualização das células de queratinócitos que ficam pouco evidentes eno desprendimento da parte córnea.
Na figura 27 verifica-se a toxicidade do gel com L.salviaefolia em contato com o composto dérmico-epidérmico,constatando diferença na morfologia e aspectos tintoriais,desprendimento da derme e epiderme, desprendimento da camadasuperficial da camada córnea, dificuldade de identificação dequeratinócitos viáveis. Entretanto é importante ressaltar que nestafigura temos a toxicidade da formulação base associada à toxicidade daL. salviaefolia. E quando comparada com a figura 26 não existemdiferenças significativas. O que sugere que parte da toxicidade deve-seaos próprios constituintes da formulação base.
O estudo histológico por microscopia óptica visando avaliara toxicidade das formulações cosméticas de creme por 48 h de contatoestá evidenciado nas figuras 28 e 29.
Na figura 28 consta apenas à influência da base daformulação sem a adição da L. salviaefolia e na figura 57 tem-se aformulação incorporada com o extrato da planta. Em ambas as figurastêm-se a visualização apenas da epiderme. Na figura 28 pode visualizarmais facilmente queratinócitos viáveis.
Enquanto que na figura 29, a presença das células dequeratinócitos viáveis não é tão facilmente detectável, sugerindo umamaior toxicidade apresentada pela formulação com a incorporação da L.salviaefolia.
A avaliação da toxicidade das formulações de xampu base exampu incorporado com L. salviaefolia em composto dérmico-epidérmico estão elucidados nas figuras 30 e 31. Verificaram-setoxidades significativas, em ambas as formulações, devido a diferençasmorfológicas e tintoriais da epiderme.
Na figura 30 evidenciamos a separação da derme e daepiderme além da separação da camada córnea e da camada superficialna epiderme, adicionalmente a dificuldade em se evidenciar células dequeratinócitos viáveis.
Assim como na figura 30 na figura 31 constata-se aseparação da derme e epiderme, entretanto a epiderme não apresentougrandes alterações morfológicas, o que caracteriza um nível detoxicidade semelhante entre as formulações com e sem a incorporaçãode L. salviaefolia.Depois de verificar a interferência das formulações bases,sem a incorporação da L. salviaefolia, foi constatado que mesmo asbases das formulações, principalmente na formulação de xampu,exercem efeito tóxico perante as culturas dos substitutos cutâneosdermo-epidérmico. Desta forma em alguns casos não se pode afrimarque tais efeitos tóxicos são devidos exclusivamente à fração de acetatode etila da Lippia saviaefolia.
No experimento da citoxicidade em cultura dequeratinócitos humanos a fração de acetato de etila de L. salviaefolia foicolocada diretamente sobre os queratinócitos. Desta maneira o teste émais sensível que o teste in vivo ou até mesmo, desta maneira osresultados são expostos com maior segurança em relação aos estudosde toxicidade no composto dérmico-epidermico. Salientando ainda arelação de diversas concentrações e diferente tempo de contato dafração de acetato de etila da L. salviaefolia em contato com osqueratinócitos humanos.
De acordo com resultados obtidos no teste de citoxicidade(Figura 32) verificou-se que a L. salviaefolia na concentração de 0,2%,correspondente ao CMI, foi tóxica em quase todos os tempos de contato,exceto com meia hora de contato, em que se observa uma viabilidadecelular de cerca de 90%.
Na concentração de 0,1% da fração de acetato de etila da L.salviaefolia, observou-se citoxicidade nos tempos de 24 e 48 horas.
Entretanto nesta mesma concentração (0,1%) com 6h de contatoalcançou uma viabilidade celular de 70%, atingindo segurança nostempos de 2h e meia hora de contato (Figura 32).
Na concentração de 0,05 % da fração de acetato de etila daL. salviaefolia, com 48 horas de contato demonstrou uma viabilidadecelular de cerca de 70%. Nesta mesma concentração com 24 e 6 horasde contato apresentou viabilidade celular em torno de 80%, atingindo afaixa de segurança com meia e 2h de contato (Figura 32).
Já nas concentrações de 0,025 e 0,0125% de acetato deetila de L. sálviaefolia, apenas em 48 horas de contato observou levetoxicidade em que a viabilidade celular ficou entre 80 e 90%. Nosdemais tempos de contato testados, mostraram-se seguras (Figura 32),sugerindo que formulações cosméticas de uso externo, contendo até0,025 % de acetato de etila de L. sálviaefolia, podem ser consideradasseguras.
Deste modo, sugere-se que a fração de acetato de etila de L.sálviaefolia na concentração do CMI (2,0 mg/mL), demonstrou sercitotóxica apenas após 6 horas de contato, sendo que com 2 horas decontato atingiu uma viabilidade celular de pouco menos de 30%,atingindo segurança e viabilidade celular apenas com meia hora decontato com perfil semelhante ao controle.
O presente pedido apresenta como perspectiva umaavaliação de absorção para constatação de qual concentração da L.sálviaefolia entra realmente em contato com os queratinócitos viáveis.
Entretanto, mesmo com a toxicidade determinada a L. sálviaefolia podeser utilizada como conservante em formulações de enxágüe, como nocaso do xampu, onde a legislação permite o uso de substâncias maisagressivas. Outro possível uso para a L. sálviaefolia destina-se comoantimicrobiano seletivo. De acordo com a presente invenção, o CMI paraa fração de acetato de etila apresenta valores dentro do que limite desegurança para S. aureus, com CMI de 0,035 - 0,005 mg/mL; para C.albicans com CMI de 0,25-0,375 mg/mL e para E. coli com CMI de 0,5 -0,75 mg/mL.
Claims (14)
1. EXTRATOS DE FOLHAS DE LIPPIA SALVIAEFOLIACHAM., caracterizado pelo fato de compreender extratos hidroalcoólico,diclorometano, acetato de etila e/ou clorofórmico.
2. EXTRATOS, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato dos extratos compreenderem preferencialmenteos extratos de acetato de etila e/ou clorofórmico.
3. EXTRATOS, de acordo com as reivindicações 1 e 2,caracterizado pelo fato dos extratos compreenderem frações ativas.
4. FRAÇÕES ATIVAS, de acordo com as reivindicações 1a 3, caracterizada pelo fato das frações ativas compreenderem os ativosescolhidos entre flavonóides totais e fenóis totais, em particular, os 4',5-dihidroxi-7-metoxi-flavonona, a naringenina, o apiflorol e/ou suascombinações.
5. FRAÇÕES ATIVAS, de acordo com a reivindicação 4,caracterizada pelo fato das frações ativas de acetato de etila e/ouclorofórmica compreenderem CMI de 0,2%.
6. FRAÇÕES ATIVAS, de acordo com as reivindicações 1a 5, caracterizada pelo fato de compreenderem formulações cosméticase/ou farmacêuticas.
7. COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS E/OUCOSMÉTICAS, de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo fatodas formulações compreenderem formas de apresentação tais como,emulsões, géis, cremes, pomadas, soluções e/ou xampus.
8. COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS E/OUCOSMÉTICAS, de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelo fatodas formulações compreenderem, preferencialmente, cremes, géis exampus.
9. COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS E/OUCOSMÉTICAS, de acordo com a reivindicação 8, caracterizada pelo fatodas formulações cremes compreenderem componentes escolhidos entrecera auto-emulsionante e/ou tensoativo, por exemplo, estearatos depoliglicerila, álcool cetoestearílico, sesquiestearato de metilglicose PEG--20; opcionalmente, agentes de consistência polimérica, tais como, omonoestearato de glicerila, dispersão de hidroxietilcelulose 2% p/v;como emoliente, o óleo mineral, acetato de cetila e/ou álcool de lanolinaacetilado, silicone volátil, 2-octil-dodecanol; como umectante,propilenoglicol e/ou glicerina; e conservantes, tais como os parabenos.
10. COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS E/OUCOSMÉTICAS, de acordo com a reivindicação 8, caracterizada pelo fatodas formulações géis compreenderem componentes escolhidos entreagentes de consistência poliméricos e/ou gelificantes, por exemplo,polímeros carbonílicos, hidroxicelulose; agentes acidificantes e/oualcalinizantes, como a solução de hidróxido de sódio a 20% (p/v),trietanolamina; tensoativos, tais como, álcool cetoestearílico, álcoolcetílico etoxilado e/ou propoxilado, poliól de éster de ácido graxo, comoumectante, tais como, propilenoglicol, sorbitol 70% e/ou glicerina; econservantes, tais como, os parabenos.
11. COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS E/OUCOSMÉTICAS, de acordo com a reivindicação 8, caracterizada pelo fatodas formulações xampus compreenderem componentes escolhidos entretensoativos aniônico, catiõnico e/ou anfótero, primário e/ousecundário, tais como, lauril éter sulfato de sódio, lauril sulfato detrietanolamina, lauril sulfosuccinato dissódico e/ou lauril sulfato desódio, dietanolamida de ácidos graxos de coco, cocoamido propilbetaína, fosfato 3-oleílico; agente neutralizante, como a solução ácidacítrico a 10% (p/v); agente de consistência como diestearato de glicol,solução de cloreto de sódio 20% (p/v); e conservantes, tais como osparabenos.
12. USO DOS EXTRATOS, de acordo com asreivindicações 1 a 11, caracterizado pelo fato de ser para o preparo decomposições farmacêuticas e/ou cosméticas como antimicrobiano.
13. USO DOS EXTRATOS, de acordo com a reivindicação-12, caracterizado pelo fato da aplicação como antimicrobianocompreender a utilização como agente conservante em formulaçõescosméticas e/ou farmacêuticas.
14. USO DOS EXTRATOS, de acordo com asreivindicações 12 e 13, caracterizado pelo fato de ter atividadeantimicrobiana compreender a ação em bactérias Gram-negativas;Gram-positivas, leveduras e/ou fungos (bolor).
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| WO2012088568A1 (pt) * | 2010-12-27 | 2012-07-05 | Ouro Fino Participações E Empreendimentos S/A | Associação farmacêutica fitoterápica de lippia salviifolia e lippia sidoides, composição farmacéutica fitoterápica, processo de preparação de composição farmacêutica fitoterápica e seus usos veterinários |
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