BRPI0804288B1 - Uso de extratos e/ou frações ativas de lippia salviaefolia cham. para preparar composições farmacêuticas e/ou cosméticas e composições contendo extratos e/ou frações ativas de lippia salviaefolia cham - Google Patents
Uso de extratos e/ou frações ativas de lippia salviaefolia cham. para preparar composições farmacêuticas e/ou cosméticas e composições contendo extratos e/ou frações ativas de lippia salviaefolia cham Download PDFInfo
- Publication number
- BRPI0804288B1 BRPI0804288B1 BRPI0804288-8A BRPI0804288A BRPI0804288B1 BR PI0804288 B1 BRPI0804288 B1 BR PI0804288B1 BR PI0804288 A BRPI0804288 A BR PI0804288A BR PI0804288 B1 BRPI0804288 B1 BR PI0804288B1
- Authority
- BR
- Brazil
- Prior art keywords
- salviaefolia
- extracts
- ethyl acetate
- lippia
- active fractions
- Prior art date
Links
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title claims abstract description 116
- 239000000284 extract Substances 0.000 title claims abstract description 90
- 239000002537 cosmetic Substances 0.000 title claims abstract description 53
- 241001604074 Lippia Species 0.000 title claims abstract description 28
- 235000010688 Yerba dulce Nutrition 0.000 title claims abstract description 27
- 230000000845 anti-microbial effect Effects 0.000 claims abstract description 72
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 claims abstract description 52
- 241000404251 Lepechinia salviifolia Species 0.000 claims description 97
- 238000009472 formulation Methods 0.000 claims description 76
- 239000002038 ethyl acetate fraction Substances 0.000 claims description 66
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 56
- 239000002453 shampoo Substances 0.000 claims description 33
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 33
- 239000000499 gel Substances 0.000 claims description 31
- 239000006071 cream Substances 0.000 claims description 25
- DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N Propylene glycol Chemical compound CC(O)CO DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 24
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 20
- FTVWIRXFELQLPI-ZDUSSCGKSA-N (S)-naringenin Chemical compound C1=CC(O)=CC=C1[C@H]1OC2=CC(O)=CC(O)=C2C(=O)C1 FTVWIRXFELQLPI-ZDUSSCGKSA-N 0.000 claims description 19
- WGEYAGZBLYNDFV-UHFFFAOYSA-N naringenin Natural products C1(=O)C2=C(O)C=C(O)C=C2OC(C1)C1=CC=C(CC1)O WGEYAGZBLYNDFV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 19
- 229940117954 naringenin Drugs 0.000 claims description 19
- 235000007625 naringenin Nutrition 0.000 claims description 19
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 18
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 17
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 16
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 claims description 16
- 241000233866 Fungi Species 0.000 claims description 15
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 15
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 15
- 239000004599 antimicrobial Substances 0.000 claims description 10
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 9
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 8
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 7
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 claims description 7
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 claims description 6
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 claims description 6
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 claims description 6
- BXWNKGSJHAJOGX-UHFFFAOYSA-N hexadecan-1-ol Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCO BXWNKGSJHAJOGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- LSTDYDRCKUBPDI-UHFFFAOYSA-N palmityl acetate Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCOC(C)=O LSTDYDRCKUBPDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- ZXKKXAWXZCXPFS-UHFFFAOYSA-N 5-hydroxy-2-(4-hydroxyphenyl)-7-methoxychromene-3,4-dione Chemical compound O1C2=CC(OC)=CC(O)=C2C(=O)C(=O)C1C1=CC=C(O)C=C1 ZXKKXAWXZCXPFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 5
- 230000009471 action Effects 0.000 claims description 5
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 claims description 5
- VBICKXHEKHSIBG-UHFFFAOYSA-N 1-monostearoylglycerol Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OCC(O)CO VBICKXHEKHSIBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 239000004354 Hydroxyethyl cellulose Substances 0.000 claims description 4
- 229920000663 Hydroxyethyl cellulose Polymers 0.000 claims description 4
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 claims description 4
- -1 fatty acid ester polyol Chemical class 0.000 claims description 4
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 claims description 4
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 claims description 4
- 235000019447 hydroxyethyl cellulose Nutrition 0.000 claims description 4
- 235000019333 sodium laurylsulphate Nutrition 0.000 claims description 4
- RMTFNDVZYPHUEF-XZBKPIIZSA-N 3-O-methyl-D-glucose Chemical compound O=C[C@H](O)[C@@H](OC)[C@H](O)[C@H](O)CO RMTFNDVZYPHUEF-XZBKPIIZSA-N 0.000 claims description 3
- LIFHMKCDDVTICL-UHFFFAOYSA-N 6-(chloromethyl)phenanthridine Chemical compound C1=CC=C2C(CCl)=NC3=CC=CC=C3C2=C1 LIFHMKCDDVTICL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 239000004166 Lanolin Substances 0.000 claims description 3
- 229940049297 cetyl acetate Drugs 0.000 claims description 3
- 229960000541 cetyl alcohol Drugs 0.000 claims description 3
- MRUAUOIMASANKQ-UHFFFAOYSA-N cocamidopropyl betaine Chemical compound CCCCCCCCCCCC(=O)NCCC[N+](C)(C)CC([O-])=O MRUAUOIMASANKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 229940079886 disodium lauryl sulfosuccinate Drugs 0.000 claims description 3
- SMVRDGHCVNAOIN-UHFFFAOYSA-L disodium;1-dodecoxydodecane;sulfate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])(=O)=O.CCCCCCCCCCCCOCCCCCCCCCCCC SMVRDGHCVNAOIN-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 3
- KHIQYZGEUSTKSB-UHFFFAOYSA-L disodium;4-dodecoxy-4-oxo-3-sulfobutanoate Chemical compound [Na+].[Na+].CCCCCCCCCCCCOC(=O)C(S(O)(=O)=O)CC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCOC(=O)C(S(O)(=O)=O)CC([O-])=O KHIQYZGEUSTKSB-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 3
- 229930003935 flavonoid Natural products 0.000 claims description 3
- 235000017173 flavonoids Nutrition 0.000 claims description 3
- 150000002215 flavonoids Chemical class 0.000 claims description 3
- 239000003906 humectant Substances 0.000 claims description 3
- 229940039717 lanolin Drugs 0.000 claims description 3
- 235000019388 lanolin Nutrition 0.000 claims description 3
- 229920001296 polysiloxane Polymers 0.000 claims description 3
- LEACJMVNYZDSKR-UHFFFAOYSA-N 2-octyldodecan-1-ol Chemical compound CCCCCCCCCCC(CO)CCCCCCCC LEACJMVNYZDSKR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 229920002125 Sokalan® Polymers 0.000 claims description 2
- 239000003945 anionic surfactant Substances 0.000 claims description 2
- 239000002026 chloroform extract Substances 0.000 claims description 2
- 239000003974 emollient agent Substances 0.000 claims description 2
- 239000002024 ethyl acetate extract Substances 0.000 claims description 2
- 229940075507 glyceryl monostearate Drugs 0.000 claims description 2
- 239000002480 mineral oil Substances 0.000 claims description 2
- 235000010446 mineral oil Nutrition 0.000 claims description 2
- 239000001788 mono and diglycerides of fatty acids Substances 0.000 claims description 2
- GLDOVTGHNKAZLK-UHFFFAOYSA-N octadecan-1-ol Chemical class CCCCCCCCCCCCCCCCCCO GLDOVTGHNKAZLK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 239000002674 ointment Substances 0.000 claims description 2
- 239000002304 perfume Substances 0.000 claims description 2
- 150000002989 phenols Chemical class 0.000 claims description 2
- 229920005862 polyol Polymers 0.000 claims description 2
- 239000008387 emulsifying waxe Substances 0.000 claims 2
- 230000002335 preservative effect Effects 0.000 abstract description 35
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 54
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 44
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 32
- 238000000034 method Methods 0.000 description 29
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 26
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 24
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 24
- 239000002036 chloroform fraction Substances 0.000 description 22
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 22
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 22
- 210000002615 epidermis Anatomy 0.000 description 21
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 19
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 19
- 239000000469 ethanolic extract Substances 0.000 description 19
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 17
- 210000002510 keratinocyte Anatomy 0.000 description 17
- 238000002798 spectrophotometry method Methods 0.000 description 16
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 241000222122 Candida albicans Species 0.000 description 14
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 14
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 14
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 13
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 13
- 239000006286 aqueous extract Substances 0.000 description 12
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 12
- 210000004207 dermis Anatomy 0.000 description 11
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 11
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 11
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 11
- 239000000399 hydroalcoholic extract Substances 0.000 description 10
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 9
- 241001340526 Chrysoclista linneella Species 0.000 description 9
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 9
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 9
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 9
- VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N n-Hexane Chemical compound CCCCCC VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 239000000419 plant extract Substances 0.000 description 9
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 9
- 241000228245 Aspergillus niger Species 0.000 description 8
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 241000589517 Pseudomonas aeruginosa Species 0.000 description 8
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 8
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 8
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 8
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 8
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 8
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 description 8
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 8
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 8
- 241000191967 Staphylococcus aureus Species 0.000 description 7
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 description 7
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 7
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 7
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 7
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 6
- 238000011161 development Methods 0.000 description 6
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 6
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 6
- 238000005192 partition Methods 0.000 description 6
- 241000894007 species Species 0.000 description 6
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 6
- 241000589513 Burkholderia cepacia Species 0.000 description 5
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 5
- 239000002034 butanolic fraction Substances 0.000 description 5
- 229940095731 candida albicans Drugs 0.000 description 5
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 5
- 239000002044 hexane fraction Substances 0.000 description 5
- 229940127557 pharmaceutical product Drugs 0.000 description 5
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 5
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 5
- 241001073567 Verbenaceae Species 0.000 description 4
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 4
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 4
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 4
- 229920002457 flexible plastic Polymers 0.000 description 4
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 4
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 4
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 4
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 4
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 description 4
- 238000012552 review Methods 0.000 description 4
- 239000012449 sabouraud dextrose agar Substances 0.000 description 4
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 4
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 4
- 231100000027 toxicology Toxicity 0.000 description 4
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000011782 Keratins Human genes 0.000 description 3
- 108010076876 Keratins Proteins 0.000 description 3
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 3
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 3
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 3
- 229960001760 dimethyl sulfoxide Drugs 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 230000002500 effect on skin Effects 0.000 description 3
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 3
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 3
- 238000002290 gas chromatography-mass spectrometry Methods 0.000 description 3
- 238000011194 good manufacturing practice Methods 0.000 description 3
- 230000036541 health Effects 0.000 description 3
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 3
- 230000016507 interphase Effects 0.000 description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 3
- 229930014626 natural product Natural products 0.000 description 3
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 3
- 238000000399 optical microscopy Methods 0.000 description 3
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 3
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 3
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 3
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 3
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 3
- 238000012916 structural analysis Methods 0.000 description 3
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 description 3
- 230000008646 thermal stress Effects 0.000 description 3
- 238000004809 thin layer chromatography Methods 0.000 description 3
- CAAYVGWMDZSZAD-UHFFFAOYSA-N 7-methyl-8-(4-methylpent-4-enyl)-3-propan-2-ylnaphthalene-1,2-dione Chemical compound C1=C(C)C(CCCC(C)=C)=C2C(=O)C(=O)C(C(C)C)=CC2=C1 CAAYVGWMDZSZAD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000030507 AIDS Diseases 0.000 description 2
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 2
- FPVVYTCTZKCSOJ-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol distearate Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OCCOC(=O)CCCCCCCCCCCCCCCCC FPVVYTCTZKCSOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000192125 Firmicutes Species 0.000 description 2
- 240000006927 Foeniculum vulgare Species 0.000 description 2
- 235000004204 Foeniculum vulgare Nutrition 0.000 description 2
- 238000002768 Kirby-Bauer method Methods 0.000 description 2
- LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N N-Butanol Chemical compound CCCCO LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000001388 Opportunistic Infections Diseases 0.000 description 2
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 2
- 244000308495 Potentilla anserina Species 0.000 description 2
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 description 2
- 241001300780 Sebastiania brasiliensis Species 0.000 description 2
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 2
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 2
- 230000000078 anti-malarial effect Effects 0.000 description 2
- 230000000118 anti-neoplastic effect Effects 0.000 description 2
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 2
- 239000003430 antimalarial agent Substances 0.000 description 2
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 230000003385 bacteriostatic effect Effects 0.000 description 2
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 2
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 2
- 230000011748 cell maturation Effects 0.000 description 2
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 2
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 2
- 230000001143 conditioned effect Effects 0.000 description 2
- 208000010247 contact dermatitis Diseases 0.000 description 2
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 2
- 239000008278 cosmetic cream Substances 0.000 description 2
- 230000006866 deterioration Effects 0.000 description 2
- GUJOJGAPFQRJSV-UHFFFAOYSA-N dialuminum;dioxosilane;oxygen(2-);hydrate Chemical compound O.[O-2].[O-2].[O-2].[Al+3].[Al+3].O=[Si]=O.O=[Si]=O.O=[Si]=O.O=[Si]=O GUJOJGAPFQRJSV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 2
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 2
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 description 2
- 239000002031 ethanolic fraction Substances 0.000 description 2
- 210000003746 feather Anatomy 0.000 description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 2
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 2
- 229940100608 glycol distearate Drugs 0.000 description 2
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 2
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 2
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000007794 irritation Effects 0.000 description 2
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 2
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 2
- 229960000988 nystatin Drugs 0.000 description 2
- VQOXZBDYSJBXMA-NQTDYLQESA-N nystatin A1 Chemical compound O[C@H]1[C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](C)O[C@H]1O[C@H]1/C=C/C=C/C=C/C=C/CC/C=C/C=C/[C@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)[C@H](C)OC(=O)C[C@H](O)C[C@H](O)C[C@H](O)CC[C@@H](O)[C@H](O)C[C@](O)(C[C@H](O)[C@H]2C(O)=O)O[C@H]2C1 VQOXZBDYSJBXMA-NQTDYLQESA-N 0.000 description 2
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 2
- 239000005022 packaging material Substances 0.000 description 2
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 2
- 230000035699 permeability Effects 0.000 description 2
- 238000005191 phase separation Methods 0.000 description 2
- RGCLLPNLLBQHPF-HJWRWDBZSA-N phosphamidon Chemical compound CCN(CC)C(=O)C(\Cl)=C(/C)OP(=O)(OC)OC RGCLLPNLLBQHPF-HJWRWDBZSA-N 0.000 description 2
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 2
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 2
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 2
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 2
- 238000013112 stability test Methods 0.000 description 2
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 230000008719 thickening Effects 0.000 description 2
- 230000002110 toxicologic effect Effects 0.000 description 2
- 231100000041 toxicology testing Toxicity 0.000 description 2
- 238000010200 validation analysis Methods 0.000 description 2
- 238000012800 visualization Methods 0.000 description 2
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 2
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 2
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 2
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 2
- 239000000341 volatile oil Substances 0.000 description 2
- 241000590020 Achromobacter Species 0.000 description 1
- JUQPZRLQQYSMEQ-UHFFFAOYSA-N CI Basic red 9 Chemical compound [Cl-].C1=CC(N)=CC=C1C(C=1C=CC(N)=CC=1)=C1C=CC(=[NH2+])C=C1 JUQPZRLQQYSMEQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000222120 Candida <Saccharomycetales> Species 0.000 description 1
- 244000060011 Cocos nucifera Species 0.000 description 1
- 235000013162 Cocos nucifera Nutrition 0.000 description 1
- 241000221032 Combretaceae Species 0.000 description 1
- 241000375329 Combretum erythrophyllum Species 0.000 description 1
- 235000004212 Combretum erythrophyllum Nutrition 0.000 description 1
- 241000718430 Comocladia glabra Species 0.000 description 1
- 241001573881 Corolla Species 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 1
- XMSXQFUHVRWGNA-UHFFFAOYSA-N Decamethylcyclopentasiloxane Chemical compound C[Si]1(C)O[Si](C)(C)O[Si](C)(C)O[Si](C)(C)O[Si](C)(C)O1 XMSXQFUHVRWGNA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010012442 Dermatitis contact Diseases 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 241001379910 Ephemera danica Species 0.000 description 1
- 241000589565 Flavobacterium Species 0.000 description 1
- 208000018522 Gastrointestinal disease Diseases 0.000 description 1
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 1
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 1
- 244000185347 Lippia alba Species 0.000 description 1
- 244000025085 Lysimachia decurrens Species 0.000 description 1
- 241001138451 Nothofagus betuloides Species 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 102100024440 Phosphoacetylglucosamine mutase Human genes 0.000 description 1
- 108010074307 Phosphoacetylglucosamine mutase Proteins 0.000 description 1
- 229920002565 Polyethylene Glycol 400 Polymers 0.000 description 1
- 241000588769 Proteus <enterobacteria> Species 0.000 description 1
- 241000227763 Salvia aethiopis Species 0.000 description 1
- 235000001494 Salvia aethiopis Nutrition 0.000 description 1
- 241000607720 Serratia Species 0.000 description 1
- 239000005708 Sodium hypochlorite Substances 0.000 description 1
- 241000825089 Soroseris hookeriana Species 0.000 description 1
- 241000191940 Staphylococcus Species 0.000 description 1
- 241000194017 Streptococcus Species 0.000 description 1
- 235000012308 Tagetes Nutrition 0.000 description 1
- 241000736851 Tagetes Species 0.000 description 1
- GSEJCLTVZPLZKY-UHFFFAOYSA-N Triethanolamine Chemical compound OCCN(CCO)CCO GSEJCLTVZPLZKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 244000077923 Vaccinium vitis idaea Species 0.000 description 1
- 235000017606 Vaccinium vitis idaea Nutrition 0.000 description 1
- 241000589634 Xanthomonas Species 0.000 description 1
- 238000011481 absorbance measurement Methods 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 229960000583 acetic acid Drugs 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 239000008186 active pharmaceutical agent Substances 0.000 description 1
- 239000000443 aerosol Substances 0.000 description 1
- 230000003113 alkalizing effect Effects 0.000 description 1
- LKCWBDHBTVXHDL-RMDFUYIESA-N amikacin Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](N)C[C@H]([C@@H]([C@H]1O)O[C@@H]1[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)NC(=O)[C@@H](O)CCN)[C@H]1O[C@H](CN)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O LKCWBDHBTVXHDL-RMDFUYIESA-N 0.000 description 1
- 229960004821 amikacin Drugs 0.000 description 1
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000002280 amphoteric surfactant Substances 0.000 description 1
- 125000000129 anionic group Chemical group 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 230000000843 anti-fungal effect Effects 0.000 description 1
- 230000001355 anti-mycobacterial effect Effects 0.000 description 1
- 229960005475 antiinfective agent Drugs 0.000 description 1
- 239000003926 antimycobacterial agent Substances 0.000 description 1
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 1
- 230000003078 antioxidant effect Effects 0.000 description 1
- 235000006708 antioxidants Nutrition 0.000 description 1
- 239000012736 aqueous medium Substances 0.000 description 1
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 1
- 239000012298 atmosphere Substances 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 1
- 229940052223 basic fuchsin Drugs 0.000 description 1
- 230000000975 bioactive effect Effects 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 239000007975 buffered saline Substances 0.000 description 1
- 239000007978 cacodylate buffer Substances 0.000 description 1
- CJZGTCYPCWQAJB-UHFFFAOYSA-L calcium stearate Chemical class [Ca+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O CJZGTCYPCWQAJB-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 125000002915 carbonyl group Chemical group [*:2]C([*:1])=O 0.000 description 1
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 1
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 1
- 239000003093 cationic surfactant Substances 0.000 description 1
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 238000013043 cell viability test Methods 0.000 description 1
- 229940082500 cetostearyl alcohol Drugs 0.000 description 1
- 125000003636 chemical group Chemical group 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 238000004581 coalescence Methods 0.000 description 1
- 238000004737 colorimetric analysis Methods 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 1
- 238000004320 controlled atmosphere Methods 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 229940086555 cyclomethicone Drugs 0.000 description 1
- 230000001085 cytostatic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 239000002254 cytotoxic agent Substances 0.000 description 1
- 231100000599 cytotoxic agent Toxicity 0.000 description 1
- 229940127089 cytotoxic agent Drugs 0.000 description 1
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002027 dichloromethane extract Substances 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 241001233957 eudicotyledons Species 0.000 description 1
- 150000002191 fatty alcohols Chemical class 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- YTAQZPGBTPDBPW-UHFFFAOYSA-N flavonoid group Chemical class O1C(C(C(=O)C2=CC=CC=C12)=O)C1=CC=CC=C1 YTAQZPGBTPDBPW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000796 flavoring agent Substances 0.000 description 1
- 235000019634 flavors Nutrition 0.000 description 1
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 230000001408 fungistatic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002496 gastric effect Effects 0.000 description 1
- 239000003349 gelling agent Substances 0.000 description 1
- 239000012362 glacial acetic acid Substances 0.000 description 1
- 229930182470 glycoside Natural products 0.000 description 1
- 150000002338 glycosides Chemical class 0.000 description 1
- 230000009036 growth inhibition Effects 0.000 description 1
- 241000411851 herbal medicine Species 0.000 description 1
- 235000008216 herbs Nutrition 0.000 description 1
- 231100000171 higher toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 238000000265 homogenisation Methods 0.000 description 1
- 230000036571 hydration Effects 0.000 description 1
- 238000006703 hydration reaction Methods 0.000 description 1
- 230000009610 hypersensitivity Effects 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 238000013101 initial test Methods 0.000 description 1
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 1
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 1
- 229920006008 lipopolysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 231100000053 low toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 235000019988 mead Nutrition 0.000 description 1
- 238000010907 mechanical stirring Methods 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 238000011169 microbiological contamination Methods 0.000 description 1
- 238000013048 microbiological method Methods 0.000 description 1
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 229930003658 monoterpene Natural products 0.000 description 1
- 150000002773 monoterpene derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 230000004660 morphological change Effects 0.000 description 1
- 239000010413 mother solution Substances 0.000 description 1
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 231100000344 non-irritating Toxicity 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 235000003170 nutritional factors Nutrition 0.000 description 1
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 1
- BARWIPMJPCRCTP-CLFAGFIQSA-N oleyl oleate Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCCOC(=O)CCCCCCC\C=C/CCCCCCCC BARWIPMJPCRCTP-CLFAGFIQSA-N 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 description 1
- 230000000704 physical effect Effects 0.000 description 1
- 238000009160 phytotherapy Methods 0.000 description 1
- 231100000614 poison Toxicity 0.000 description 1
- 229940068918 polyethylene glycol 400 Drugs 0.000 description 1
- 229920000151 polyglycol Polymers 0.000 description 1
- 239000010695 polyglycol Substances 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 238000009516 primary packaging Methods 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 238000011158 quantitative evaluation Methods 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 238000005057 refrigeration Methods 0.000 description 1
- 208000023504 respiratory system disease Diseases 0.000 description 1
- PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N rhodamine B Chemical compound [Cl-].C=12C=CC(=[N+](CC)CC)C=C2OC2=CC(N(CC)CC)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C(O)=O PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 230000001235 sensitizing effect Effects 0.000 description 1
- 230000001953 sensory effect Effects 0.000 description 1
- 229930004725 sesquiterpene Natural products 0.000 description 1
- 150000004354 sesquiterpene derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 1
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 1
- 208000017520 skin disease Diseases 0.000 description 1
- IHQKEDIOMGYHEB-UHFFFAOYSA-M sodium dimethylarsinate Chemical compound [Na+].C[As](C)([O-])=O IHQKEDIOMGYHEB-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- SUKJFIGYRHOWBL-UHFFFAOYSA-N sodium hypochlorite Chemical compound [Na+].Cl[O-] SUKJFIGYRHOWBL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003381 solubilizing effect Effects 0.000 description 1
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 238000009331 sowing Methods 0.000 description 1
- 230000003595 spectral effect Effects 0.000 description 1
- 230000007480 spreading Effects 0.000 description 1
- 238000003892 spreading Methods 0.000 description 1
- 150000003431 steroids Chemical class 0.000 description 1
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 1
- 230000035882 stress Effects 0.000 description 1
- 235000018553 tannin Nutrition 0.000 description 1
- 229920001864 tannin Polymers 0.000 description 1
- 239000001648 tannin Substances 0.000 description 1
- OULAJFUGPPVRBK-UHFFFAOYSA-N tetratriacontyl alcohol Natural products CCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCO OULAJFUGPPVRBK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- 239000003440 toxic substance Substances 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 1
- 235000013311 vegetables Nutrition 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
- 239000001993 wax Substances 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K36/00—Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
- A61K36/18—Magnoliophyta (angiosperms)
- A61K36/185—Magnoliopsida (dicotyledons)
- A61K36/85—Verbenaceae (Verbena family)
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Natural Medicines & Medicinal Plants (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Alternative & Traditional Medicine (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Botany (AREA)
- Medical Informatics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Medicines Containing Plant Substances (AREA)
- Cosmetics (AREA)
Abstract
extratos de lippia salviaefolia cham., frações ativas, composições e seu uso. a presente invenção refere-se aos extratos de folhas de lippia salviaefolia cham., suas frações ativas, composições farmacêuticas e/ou cosméticas e seu uso como antimicrobiano natural (conservante).
Description
[1] A presente invenção refere-se aos extratos de folhas de Lippia salviaefolia Cham., suas frações ativas, composições farmacêuticas e/ou cosméticas e seu uso como antimicrobiano natural (conservante).
[2] O gênero Lippia (Verbenaceae) inclui aproximadamente 200 espécies de ervas, arbustos e pequenas árvores. Estas espécies estão distribuídas principalmente pelos países da América do Sul e América Central, e pelos territórios tropicais da África (TERBLANCHÉ, F. C. & KORNELIUS, G., Essential oil constituents of the genus Lippia (Verbenaceae) A literature review. J. Ess. Oil Re. 8, 471-485, 1996). A maioria das espécies do gênero Lippia é tradicionalmente utilizada no tratamento de afecções gastrintestinais e respiratórias. Algumas espécies demonstraram atividade antimalarial, antiviral e citostática. (MORTON In: Atlas of Medicinal Plants of Middle America I, Springfield, Illinois, USA (1981), pp. 745-750; GASQUET, M., DELMAS, F., TIMÓN- DAVID, P., KEITA, A., GUINDO, M. KOITA, N., DIALLO, D., DOUMBO, O., Evaluation in vitro and in vivo of a traditional antimalarial, “Malarial-5”. Fitoterapia. 64, 423-427, 1993; ABAD, M. J., SANCHEZ, S., BERMEJO, P., VILLAR, A., CARRASCO, L., Antiviral activity of some medicinal plants. Met. Find., 17 (Suppl. A) p.108, 1995). Em geral, o gênero apresenta um perfil consistente de composição química, atividades farmacológicas e uso tradicional. Duas das espécies mais importantes desse gênero são L. multiflora e L. alba (PASCUAL, M. E., SLOWING, K., CARRETEO, E., SÁNCHEZ MATA, D., VILLAR, A., Lippia: Traditional uses, chemistry and Pharmacology: a review. J. of Ethnopharmacol. 76, Issue 3, 201-214, 2001). Na literatura, existe ainda registro de outras espécies do gênero Lippia com atividade antimicrobiana como a Lippia sidoides (COSTA, S. M. O.; LEMOS, T. L. G.; PESSOA, O. D. L.; ASSUNÇÃO, J. C. C.; BRAZ-FILHO, R.; 2002. Constituintes químicos da Lippia sidoides (Cham.) Verbenaceae. Rev. Bras. de Farmacog., v. 12, supl., p. 66-67.) e a Lippia adoensis (TAGET, H.; MOHAMMED, E.; ASRES, K. GEBRE-MARIAM, T., Antimicrobial actives of some selected traditional Ethiopian medicinal plants used in the treatment of skin disorders. J. of Ethnopharmacol. 100, p. 168-175, 2005), dentre outras. Entretanto, não existem referências na literatura sobre atividade farmacológica, estudos de toxicidade ou uso tradicional da espécie L. salviaefolia.
[3] A L. salviaefolia é uma planta originaria do cerrado brasileiro, pertence ao grande grupo das Dicotiledôneas, família das Verbenáceas. Como hábito vegetativo, é caracterizado como arbusto com folhas aromáticas, tubo da corola amarelado e flores brancas aromáticas.
[4] Bactérias e fungos são capazes de crescer nos produtos cosméticos quando existem nutrientes disponíveis e as condições do meio são satisfatórias. Para esta finalidade, os conservantes devem apresentar atividade antimicrobiana efetiva e serem seletivamente tóxicos e eficazes contra bactérias, Gram-positivas e/ou Gram- negativas, bolores e leveduras. Entretanto, devido às características intrínsecas, a maioria dos conservantes de origem sintética pode apresentar reações tóxicas ao usuário, tais como irritação local, dermatite de contato, hipersensibilidade e outras.
[5] A comprovação da qualidade microbiana em produtos cosméticos visa evitar a transmissão de doenças quando estes são utilizados de forma correta, além de assegurar a estabilidade da preparação e, conseqüentemente, sua eficácia. Os cosméticos necessitam de conservantes capazes de reduzir a carga microbiana em níveis aceitáveis durante seu uso dentro do prazo de validade. Assim, se faz necessária a avaliação da eficácia dos conservantes em formulações cosméticas, determinando a segurança do uso do produto, visando testar a capacidade conservadora do cosmético durante sua fabricação e durante o seu prazo de validade, ao longo do seu uso pelo consumidor.
[6] Em geral, os conservantes de origem sintética, têm características lipofílicas, a utilização de extratos aquosos ou hidroalcóolicos pode ser mais efetiva, uma vez que o crescimento dos microrganismos ocorre principalmente em meio aquoso.
[7] A utilização de componentes ativos de origem natural na produção de cosméticos tem crescido muito nos últimos anos. A busca cada vez maior de cosméticos eficazes e seguros tem sido constante.
[8] O desenvolvimento de medicamentos e derivados de origem vegetal é de grande importância na cultura e tradição da história da humanidade. A maioria da população urbana pobre, assim como em pequenas comunidades rurais, confia e faz grande uso da medicina natural, utilizando plantas, assim como extratos naturais no tratamento de suas enfermidades. Esse fato se dá devido à cultura dessas populações e principalmente pela acessibilidade e disponibilidade desse tipo tratamento. Como conseqüência, existe uma crescente tendência mundial, em integrar a medicina tradicional ao cuidado médico primário (FENNEL, C. W., LINDSEY, K. L., MC. GAW, L. J., SPARG, S. G., STAFFORD, G. I., ELGORASHI, E. E., GRACE, O. M., VAN STADEN, J., Review: Assessing African medicinal plants for efficacy and safety: Pharmacological screening and toxicology. J. of Ethnopharmacol. 94, 205-217, 2004). Adicionalmente, pesquisas para desenvolvimento de novos agentes antimicrobianos efetivos são necessárias devido ao desenvolvimento da resistência microbiana e a ocorrência de infecções oportunistas fatais associadas a AIDS, quimioterapia antineoplásica e transplantes (PENNA, C., MARINO, S., VIVOT, E., CRUANES, M. C., MUNOZ, J. DE D., CRUANES, J., FERRARO, G., GUTKIND, G., MARTINO, V., Antimicrobial activity of Argentine plants used in the treatment of infectious diseases. Isolation of active compounds from Sebastiania brasiliensis. J. of Ethnopharmacol. 77, 37- 40, 2001). Inúmeras pesquisas extensivas têm sido desenvolvidas no intuito de encontrar e classificar agentes antimicrobianos de extratos de plantas e produtos naturais, sendo que um grande número de plantas representa fonte potencial nesta busca. (DE SMET, P.A.G.M., 1997, The role of plant - derived drugs and herbal medicines. Healthcare Drugs, v. 54, n. 6, p. 801-840; COWAN, M. M., Plant products as antimicrobial agents. Clinical Microb. Rev., v. 12, p. 564-582, 1999; HERNÁNDEZ-PEREZ, M., RABANAL, R. M., ARIAS, A., DE LA TORRE, M. C., RODRIGUES, B. Aethiopinone, an antibacterial and citotoxic agent from Salvia aethiopis roots. Pharm. Biol. 37 (1), 1721, 1999; SOKMEN, A., JONES, B. M., ERTURK, M., The in Vitro antibacterial activity of Turkiv medicinal plants. J. of Ethnopharmacol. 67, 79-86, 1999; KELMANSON, J. E., JÃGER, A. K., VAN STADEN, J., Zulu medicinal plants with antibacterial activity. J. of Ethnopharmacol. 69, 241-246, 2000; SRINIVASAN, D., NATHAN, S., SURESH, T., PERUMALSAMY, O., Antimicrobial activity of certain Indian medicinal plants used in folkloric medicine. J. of Ethnopharmacol. 74, 217-220, 2001, MARTINI, N. D., KATERERE, D. R. P., ELLOF J. N., Biological activity of five antimicrobial flavonoids from Combretum erythrophyllum (Combretaceae). J. of Ethnopharmacol.. 93, 207-212, 2004; MITSCHER, L. A., DRAKE S., GALLAPUDI, S. R., OIUNTE, K., A modern look at folkloric use of anti-infective agents. J. of Natural Product. 50, 10251040, 1987; CUTCHEON, A. R., STOKES, R. W., THORSON, L. M., ELLIS, S. M. HANCOCK, R. E. W., Anti-mycobacterial screening of British Columbian medicinal plants. Intern. J. of Pharmacognosy. 32, 77-83. 1997; MENG, J. C., ZHU, Q. X., THAN, R. X., New antimicrobial mono and sesquiterpenes from Soroseris hookeriana subsp. Erysimoides, Planta Medica. 66, 541-544, 2000; RUBERTO, G., BARATTA, M. T., DEANS, S. G., DORMAN, H. J. D.,. Antioxidant and antimicrobial activity of Foenicullum vulgare and Criyhmum maritimum essential oils. Planta Medica. 66, 687-693, 2000; HO, K. Y., TSAI, C. C., HUANG, H. S., CHEN, C. P., LIN, T. C., LIN, C. CAntimicrobial activity of tannin components from Vaccinium vitis - idaea, L. J. of Pharm. and Pharmacol. 53, 187-191, 2001).
[9] A variação observada freqüentemente, nos resultados quando são testados extratos de plantas para atividade antimicrobiana pode ser atribuída a inúmeros fatores. Estes incluem a técnica de ensaio, meio de cultura, cepa das bactérias ou fungos, tempo, fonte da planta (fresca ou seca), e a quantidade testada do extrato dentre outros (FENNEL, C. W., LINDSEY, K. L., MC. GAW, L. J., SPARG, S. G., STAFFORD, G. I., ELGORASHI, E. E., GRACE, O. M., VAN STADEN, J., Review: Assessing African medicinal plants for efficacy and safety: Pharmacological screening and toxicology. J. of Ethnopharmacol. 94, 205-217, 2004). Porém, estes fatores não são empecilhos na busca da padronização e maiores pesquisas englobando a atividade antimicrobiana de extratos naturais.
[10] O estudo da atividade antimicrobiana de substâncias usadas em produtos farmacêuticos e cosméticos é um tema que vem se desenvolvendo bastante, e somente nos últimos 60 anos tem sido tratado de maneira científica. Grande importância é dada ao assunto, devido à preocupação não somente com o aspecto microbiológico, mas também com o potencial de irritação e toxicidade ao consumidor (PINTO, T. J. A., KANEKO, T. M., OHARA, M. T., Controle biológico de qualidade de produtos farmacêuticos, correlatos e cosméticos. São Paulo: Atheneu, 2003).
[11] A atividade antimicrobiana de extratos vegetais é avaliada por meio da determinação da menor quantidade da substância em estudo necessária para inibir o crescimento do microrganismo em teste; esse valor é conhecido como CMI (MADIGAN, M. T.; MARTINKO, J. M.; PARKER, J., Brock biology of microorganisms. Upper Saddle River, NJ: Prentice Hall, 2000. 9th ed. p. 750-751). Um aspecto bastante relevante na determinação da CMI de extratos vegetais é a preocupação, mencionada anteriormente, principalmente em relação aos aspectos toxicológicos, microbiológicos e legais pertinentes aos compostos naturais e/ou combinações (PINTO, T. J. A., KANEKO, T. M., OHARA, M. T., Controle biológico de qualidade de produtos farmacêuticos, correlatos e cosméticos. São Paulo: Atheneu, 2003).
[12] A pesquisa de novos agentes antimicrobianos se faz necessária devido ao surgimento de microrganismos resistentes e de infecções oportunistas fatais, associadas a AIDS, quimioterapia antineoplásica e transplantes (PENNA, C., MARINO, S., VIVOT, E., CRUANES, M. C., MUNOZ, J. DE D., CRUANES, J., FERRARO, G., GUTKIND, G., MARTINO, V., Antimicrobial activity of Argentine plants used in the treatment of infectious diseases. Isolation of active compounds from Sebastiania brasiliensis. J. of Ethnopharmacol. 77, 37- 40, 2001). O estudo de agentes antimicrobianos tem grande abrangência, sendo ponto crucial em vários setores do campo farmacêutico e cosmético. Outro ponto a ser ressaltado é que a utilização do estudo da CMI serve como primeiro “screening” na descoberta da atividade farmacológica de novos agentes.
[13] Atualmente, existem vários métodos para avaliar a atividade antibacteriana e antifúngica dos extratos vegetais. Os mais conhecidos incluem a difusão em ágar e macro e microdiluição (PINTO, T. J. A., KANEKO, T. M., OHARA, M. T., Controle biológico de qualidade de produtos farmacêuticos, correlatos e cosméticos. São Paulo: Atheneu, 2003; COLLINS, C.H., Antimicrobial susceptibility tests. In: . Microbiological methods. 7.ed. Oxford : Butterworth-Hunemann, 1995, p. 178-205; MADIGAN, M. T.; MARTINKO, J. M.; PARKER, J., Brock biology of microorganisms. Upper Saddle River, NJ: Prentice Hall, 2000. 9th ed. p. 750-751). Para determinar a CMI ou a Concentração Mínima Bactericida (CMB) de extratos ativos de plantas, tem-se utilizado abundantemente o método sensível de microdiluição (ELOFF J. N. A sensitive and quick microplate method to determine the minimal inhibitory concentration of plant extracts for bacteria. Planta Médica, v. 64, p. 711-713, 1998).
[14] A estabilidade pode ser definida como a capacidade de um produto contendo ou não substâncias ativas, de manter suas propriedades químicas, físicas, microbiológicas, toxicológicas e bioativas, dentro dos limites especificados previamente durante todo seu prazo de validade, pois esses produtos quando comercializados passam por um sistema de estocagem e distribuição e podem ficar sujeitos ao calor prolongado e a umidade (ANVISA - Agência Nacional de Vigilância Sanitária. Guia de estabilidade de produtos cosméticos/Agência Nacional de vigilância Sanitária - 1a ed. - Brasília ANVISA, 2004. 52 p. (Série validade em cosméticos); v.1).
[15] O estudo da estabilidade de produtos cosméticos fornece informações que indicam o grau de estabilidade relativa de um produto nas variadas condições a que possa estar sujeito desde sua fabricação até o término de sua validade. Essa estabilidade é relativa, pois varia com o tempo e em função de fatores que aceleram ou retardam alterações nos parâmetros do produto.
[16] A qualidade microbiana de um produto cosmético e farmacêutico deve ser avaliada com o objetivo de garantir a eficácia e segurança em seu prazo de validade e condição de uso. A comprovação dos níveis de contaminação microbiana dos produtos não estéreis visa evitar a transmissão de doenças e assegurar a estabilidade do produto. A presença de microrganismos, acima dos limites aceitáveis, pode acarretar problemas clínicos aos usuários e também, dependendo do microrganismo presente, o efeito tóxico do produto contaminado põe em risco a vida do paciente (PINTO, T. J. A., KANEKO, T. M., OHARA, M. T., Controle biológico de qualidade de produtos farmacêuticos, correlatos e cosméticos. São Paulo: Atheneu, 2003). O perigo relativo criado pela contaminação microbiológica desses produtos pode ser relatado pela severidade da infecção ou doença causada. Microrganismos como Pseudomonas, Proteus, Staphylococcus, Serratia, Streptococcus, Penicilium, Aspergillius e o gênero Candida são classificados como de riscos à saúde (BAIRD, R.M., HODGES, N.A., Denyer, S.P. (Eds) (2000) Handbook of Microbiological Quality Control: Pharmaceuticals and Medical Devices Taylor & Francis, London, 2000, p.254).
[17] Uma das principais fontes de contaminação microbiana das formulações cosméticas e farmacêuticas é a água (CROSHAW, B., Preservatives for cosmetics and toiletries. J. Soc. Cosmet. Chem., v.28, p.3-16, 1977; DIEHL, K. H., Important secondary conditions for optimal use of cosmetic preservatives. Parfum Kosmet., Heidelberg, v.71, n.60, p.396-400, 1990; MALCOLM, S. A., Microbiological monitoring and quality control. Manuf. Chem. Aerosol News, London, v.51, nov., p.5556, 1980). O gênero Pseudomonas é o mais citado na literatura (ORTH, D. S., Preservative Efficacy Testing of Aqueous Cosmetics and Drugs Without Counting Colonies. Cosmet. & Toilet. 116:41-47, 2001; TENEMBAUM, S. Considerations leading to development of the microbial limit guidelines of the CTFA. Cosmetics & Toiletries, v.93, n.3, p.78-83, 1977; VAN ABBÉ, N. J. HUGHES, O., DIXON, H. WOODROFFE, R. S. C., The hygienic manufacture and preservation of toiletries and cosmetics. J. Soc. Cosmet. Chem., 1970, v.21, p.719-800), mas também foram encontrados Xanthomonas, Flavobacterium, Achromobacter e Aerobacter. Segundo alguns autores; TENEMBAUM, S., Considerations leading to development of the microbial limit guidelines of the CTFA. Cosmet. Toilet., v. 93, n.3, p. 78-83, 1977) a carga bacteriana atingiu a ordem de 106 UFC/mL.
[18] Outras fontes importantes de contaminação microbiana referem-se às matérias-primas de origem natural (McCARTHY, T. J., Microbiological control of cosmetic products. Cosmet. & Toilet., Oak Park, v.95, n.8, p. 23-27, 1980; O'NEILL, J. J., MEAD, C. A., The parabens: bacterial adaptation and preservative capacity. J. Soc. Cosmet. Chem. New York, v.33, p.75-84, 1982). Os autores BONOMI e NEGRETTI investigaram a qualidade microbiana de várias dessas matérias-primas, principalmente de origem vegetal, usualmente empregada nas preparações farmacêutica (BONOMI, E., NEGRETTI, F., Ricerche sul contenudo microbico di materie prime impiegatte nelle preparazioni farmaceutche. Ann. Ist. Super. Sanitá, v. 13, n.4, p. 805832, 1977). As matérias-primas de origem sintética ou semi-sintética apresentam, geralmente, baixa carga microbiana contaminante com exceção de algumas como poliglicóis ou polietilenoglicóis.
[19] Os produtos com sua formulação e sua embalagem primária contribuem para o desenvolvimento microbiano, pois podem conter carboidratos, ácidos graxos, proteínas, aminoácidos, glicosídeos, alcoóis graxos, esteróides, peptídeos e vitaminas. Esses substratos podem servir de nutrientes para microrganismos contaminantes (MADDEN, I., JACKSON, G. I., Cosmetic preservation and microbes: viewpoint of the Food and Drug Administration. Cosmet. & Toilet., Oak Park, v. 96, n. 10, p. 75-78, 1981). O material de acondicionamento pode ser fonte de contaminação, quando não adequadamente limpos (SMART, R., SPOONER, D. F., Microbiological spoilage in pharmaceuticals and cosmetics. J. Soc. Cosmet. Chem., v.23, 1972, p.721-737; VAN ABBÉ, N. J. HUGHES, O., DIXON, H. WOODROFFE, R. S. C., The hygienic manufacture and preservation of toiletries and cosmetics. J. Soc. Cosmet. Chem., 1970, v.21, p.719-800). Os componentes podem interagir com os conservantes utilizados na formulação, como os parabenos que podem ser adsorvidos por recipientes plásticos resultando em diminuição de sua atividade conservante (BAHAL, S.M. & ROMANSKY, J.M., Sorption of parabens by fexible tubings. Pharm Dev Technol., Aug; 6(3) : 431-40, 2001). Outro aspecto a ser considerado é o da contaminação do produto pelo próprio usuário sendo necessárias recomendações adequadas na sua utilização e o uso de conservantes na formulação.
[20] Os pesquisadores BONOMI e NEGRETTI também investigaram o conteúdo microbiano das matérias-primas empregadas nas preparações farmacêuticas. Segundo esses autores, os problemas criados pela contaminação microbiana podem ser minimizados pelo uso de matérias-primas que não apresentem histórico de carga microbiana (“bioburden”) inaceitável, pela adoção das boas práticas de fabricação validadas para reduzir o risco de contaminação durante o processo, e pelo uso efetivo de sistemas conservantes em formulações (BONOMI, E., NEGRETTI, F., Ricerche sul contenudo microbico di materie prime impiegatte nelle preparazioni farmaceutche. Ann. Ist. Super. Sanitá, v. 13, n.4, p. 805-832, 1977).
[21] Diante de todos os fatores que podem contribuir para a contaminação e visando a eficácia do produto e a segurança do consumidor, classicamente tem sido utilizada a adição de conservantes nas formulações. Estas são substâncias adicionadas às formas farmacêuticas e cosméticas com o intuito de evitar a contaminação microbiana. Sua função é inibir o crescimento de microrganismos no produto, conservando-o livre de deteriorações causadas por bactérias, bolores e leveduras. Eles podem ter atividade bacteriostática e/ou fungistática, sendo utilizados principalmente nos produtos de múltiplas doses, que podem apresentar contaminação. Escolher um sistema conservante adequado para um produto cosmético requer consideração cuidadosa quanto ao tipo do produto, seu uso, características de formulação e provável desafio microbiano. A seleção definitiva do(s) agente(s) conservante(s) deve ser um compromisso entre eficácia antimicrobiana e compatibilidade com o produto (PINTO, T. J. A., KANEKO, T. M., OHARA, M. T., Controle biológico de qualidade de produtos farmacêuticos, correlatos e cosméticos. São Paulo: Atheneu, 2003).
[22] A efetividade do sistema conservante em preparações farmacêuticas ou cosméticas está relacionada com a composição da formulação, o tipo de material de acondicionamento, grau de pureza das matérias-primas, utilização correta pelo consumidor, forma de aplicação, e do próprio sistema conservante. Mesmo com todo rigor exigido de higiene durante a fabricação (GMP - Good Manufacturing Practice), controle de qualidade e uso de matérias-primas com conteúdo permissível de microrganismo, ainda existe a possibilidade de contaminação secundária. Entretanto, alguns componentes mesmo não sendo substâncias antimicrobianas típicas, podem ajudar contra a proliferação de microrganismos, aumentando a efetividade dos conservantes. Os requisitos gerais para o crescimento microbiano são: água, energia, fontes de nitrogênio, minerais e vitaminas em um ambiente com níveis adequados de oxigênio, pH e temperatura (PINTO, T. J. A., KANEKO, T. M., OHARA, M. T., Controle biológico de qualidade de produtos farmacêuticos, correlatos e cosméticos. São Paulo: Atheneu, 2003).
[23] Os conservantes, mesmo os origem natural são substâncias intrinsecamente tóxica, portanto a concentração utilizada deve ser pequena. O sistema conservante utilizado em uma formulação pode exercer um efeito bacteriostático, ou seja, mantém o mesmo nível de microrganismos ou diminui, porém não destrói. Ou ainda um efeito biocida de destruição. A ação do sistema conservante normalmente se processa por meio da combinação com grupamentos químicos dos conservantes com as proteínas microbianas, ou através da ação competitiva com determinados processos enzimáticos.
[24] A figura 1 mostra a cromatografia em camada delgada das frações de acetato de etila de L. salviaefolia.
[25] A figura 2 refere-se aos espectros da fração 4 da fração de acetato de etila de L. salviaefolia. Análise por CG-EM.
[26] A figura 3 indica a atividade antimicrobiana do extrato total de L. salviaefolia frente a S. aureus. Experimento realizado em três replica com três repetições para cada concentração. Valores correspondem a média de cada variável. Determinação espectrofotométrica a 630 nm. Variáveis= Cc: Controle de crescimento; Cs: controle do solvente; C+: Cloranfenicol (1 mg/mL), soluções do extrato total em diferentes concentrações.
[27] A figura 4 apresenta a atividade antimicrobiana da fração de acetato de etila de L. salviaefolia em frente a S. aureus. Experimento realizado em três replica com três repetições. Valores correspondem à média de cada variável. Determinação espectrofotométrica a 630 nm. Variáveis= Cc: Controle de crescimento; Cs: controle do solvente; C+: Cloranfenicol (1 mg/mL), soluções da fração de acetato de etila do extrato total em diferentes concentrações.
[28] A figura 5 demonstra a atividade antimicrobiana da fração de clorofórmica de L. salviaefolia frente a S. aureus. Experimento realizado em três replica com três repetições. Valores correspondem à média de cada variável. Determinação espectrofotométrica a 630 nm. Variáveis= Cc: Controle de crescimento; Cs: controle do solvente; C+: Cloranfenicol (1 mg/mL), soluções da fração clorofórmica do extrato total em diferentes concentrações.
[29] A figura 6 refere-se a atividade antimicrobiana das frações (1-9) da fração de acetato de etila de L. salviaefolia na concentração de 1,0 mg/mL, frente a S. aureus. Experimento realizado em três replica com três repetições. Valores correspondem à média de cada variável. Determinação espectrofotométrica a 630 nm. Variáveis= Cc: Controle de crescimento; Cs: controle do solvente; C+: Cloranfenicol (1 mg/mL), soluções das frações (1-9) de acetato de etila do extrato total na concentração de 1,0 mg/mL.
[30] A figura 7 mostra a atividade antimicrobiana da fração 3 proveniente da fração de acetato de etila frente a S. aureus. Experimento realizado em três replica com três repetições. Valores correspondem à média de cada variável. Determinação espectrofotométrica a 630 nm. Variáveis= Cc: Controle de crescimento; Cs: controle do solvente; C+: Cloranfenicol (1 mg/mL), soluções da fração 3 proveniente da fração de acetato de etila do extrato total em diferentes concentrações
[31] A figura 8 indica a atividade antimicrobiana da fração 4 proveniente da fração de acetato de etila frente a S. aureus. Experimento realizado em três replica com três repetições. Valores correspondem à média de cada variável. Determinação espectrofotométrica a 630 nm. Variáveis= Cc: Controle de crescimento; Cs: controle do solvente; C+: Cloranfenicol (1 mg/mL), soluções da fração 4 proveniente da fração de acetato de etila do extrato total em diferentes concentrações.
[32] A figura 9 apresenta a atividade antimicrobiana do extrato total de L. salviaefolia frente a E. coli. Experimento realizado em três replica com três repetições. Valores correspondem à média de cada variável. Determinação espectrofotométrica a 630 nm. Variáveis= Cc: Controle de crescimento; Cs: controle do solvente; C+: Cloranfenicol (1 mg/mL), soluções do extrato total em diferentes concentrações.
[33] A figura 10 demonstra a atividade antimicrobiana da fração de acetato de etila de L. salviaefolia frente a E. coli. Experimento realizado em três replica com três repetições. Valores correspondem à média de cada variável. Determinação espectrofotométrica a 630 nm. Variáveis= Cc: Controle de crescimento; Cs: controle do solvente; C+: Cloranfenicol (1 mg/mL), soluções da fração de acetato de etila do extrato total em diferentes concentrações.
[34] A figura 11 revela a atividade antimicrobiana da fração de clorofórmica do extrato de L. salviaefolia frente a E. coli. Experimento realizado em três replica com três repetições. Valores correspondem à média de cada variável. Determinação espectrofotométrica a 630 nm. Variáveis= Cc: Controle de crescimento; Cs: controle do solvente; C+: Cloranfenicol (1 mg/mL), soluções da fração clorofórmica do extrato total em diferentes concentrações.
[35] A figura 12 refere-se a atividade antimicrobiana da fração 3 proveniente da fração de acetato de etila de L. salviaefolia frente a E. coli. Experimento realizado em três replica com três repetições. Valores correspondem à média de cada variável. Determinação espectrofotométrica a 630 nm. Variáveis= Cc: Controle de crescimento; Cs: controle do solvente; C+: Cloranfenicol (1 mg/mL), soluções da fração 3 proveniente da fração de acetato de etila do extrato total em diferentes concentrações.
[36] A figura 13 apresenta a atividade antimicrobiana da fração 4 proveniente da fração de acetato de etila de L. salviaefolia frente a E. coli. Experimento realizado em três replica com três repetições. Valores correspondem a média de cada variável. Determinação espectrofotométrica a 630 nm. Variáveis= Cc: Controle de crescimento; Cs: controle do solvente; C+: Cloranfenicol (1 mg/mL), soluções da fração 4 proveniente da fração de acetato de etila do extrato total em diferentes concentrações.
[37] A figura 14 mostra a atividade antimicrobiana da naringenina, extratos e frações da L. salviaefolia frente a S. aureus. Experimento realizado em três replica com três repetições. Valores correspondem à média de cada variável. Determinação espectrofotométrica a 630 nm. Variáveis: Controle de crescimento; Cs: controle do solvente; C+: Cloranfenicol (1 mg/mL); solução de naringenina em diferentes concentrações.
[38] A figura 15 demonstra a atividade antimicrobiana da naringenina, extratos e frações da L. salviaefolia frente a E. coli. Experimento realizado em três replica com três repetições. Valores correspondem à média de cada variável. Determinação espectrofotométrica a 630 nm. Variáveis: Controle de crescimento; Cs: controle do solvente; C+: Cloranfenicol (1 mg/mL); solução de naringenina em diferentes concentrações.
[39] A figura 16 revela a atividade antimicrobiana da naringenina, extratos e frações da L. salviaefolia frente a C. albicans. Experimento realizado em três replica com três repetições. Valores correspondem à média de cada variável. Determinação espectrofotométrica a 630 nm. Variáveis: Controle de crescimento; Cs: controle do solvente; C+: Nistatina (1 mg/mL); solução de naringenina em diferentes concentrações.
[40] A figura 17 apresenta a atividade antimicrobiana da naringenina, extratos e frações da L. salviaefolia frente a P. aeruginosa. Experimento realizado em três replica com três repetições. Valores correspondem à média de cada variável. Determinação espectrofotométrica a 630 nm. Variáveis: Controle de crescimento; Cs: controle do solvente; C+: Amikacinal (1 mg/mL); solução de naringenina em diferentes concentrações.
[41] A figura 18 mostra o branco 24h - Controle do composto dérmico-epidérmico após 24hs no sistema de cultivo na interfase ar- líquido.
[42] A figura 19 revela o composto dérmico-epidérmico após 24hs de contato com a base gel sem a adição de L. salviaefolia.
[43] A figura 20 refere-se ao composto dérmico-epidérmico após 24hs de contato com a formulação gel incorporado com fração de acetato de etila de L. salviaefolia.
[44] A figura 21 demonstra o composto dérmico-epidérmico após 24hs de contato com a base creme sem a adição de L. salviaefolia.
[45] A figura 22 indica o composto dérmico-epidérmico após 24hs de contato com a formulação creme incorporada com fração de acetato de etila de L. salviaefolia.
[46] A figura 23 refere-se ao composto dérmico-epidérmico após 24hs de contato com a base xampu sem a adição de L. salviaefolia.
[47] A figura 24 demonstra o composto dérmico-epidérmico após 24hs de contato com a formulação xampu incorporado com fração de acetato de etila de L. salviaefolia.
[48] A figura 25 apresenta o branco 48hs - Controle do composto dérmico-epidérmico após 48hs no sistema de cultivo na interfase ar-líquido.
[49] A figura 26 indica o composto dérmico-epidérmico após 48hs de contato com a base gel sem a adição de L. salviaefolia.
[50] A figura 27 refere-se ao composto dérmico-epidérmico após 48hs de contato com a formulação gel incorporado com fração de acetato de etila de L. salviaefolia.
[51] A figura 28 demonstra o composto dérmico-epidérmico após 48hs de contato com a base creme sem a adição de L. salviaefolia.
[52] A figura 29 demonstra o composto dérmico-epidérmico após 48hs de contato com a formulação creme incorporada de fração acetato de etila de L. salviaefolia.
[53] A figura 30 mostra o composto dérmico-epidérmico após 48hs de contato com a base xampu sem a adição de L. salviaefolia.
[54] A figura 31 revela o composto dérmico-epidérmico após 48hs de contato com a formulação xampu com incorporada com fração de acetato de etila de L. salviaefolia.
[55] A figura 32 apresenta a viabilidade celular através do estudo de citoxicidade em cultura de queratinócitos humanos da fração de acetato de etila de L. salviaefolia, em diferentes concentrações (0,0125 %, 0,025 %, 0,05 %, 0,1 %, e 0,2 %) e diferentes tempos de contato (0,5h, 1h, 2hs, 6hs, 24hs e 48hs).
[56] A presente invenção refere-se aos extratos de folhas de Lippia salviaefolia Cham., suas frações ativas, composições farmacêuticas e/ou cosméticas e seu uso como antimicrobiano natural (conservante).
[57] Em uma primeira realização o presente pedido destina-se aos extratos de folhas de Lippia salviaefolia Cham., tais como, extratos hidroalcoólico, diclorometano, acetato de etila e/ou clorofórmico. Preferencialmente, o presente pedido destina-se aos extratos de acetato de etila e a clorofórmica da L. salviaefolia.
[58] As frações ativas caracterizam-se por conter os componentes ativos, por exemplo, flavonóides totais e fenóis totais, em particular, os ativos contidos, nas frações da presente invenção, referem-se aos 4’,5-dihidroxi-7-metoxi-flavonona, a naringenina e o apiflorol.
[59] Em uma segunda realização, o pedido de patente provê formulações cosméticas e/ou farmacêuticas contendo os ditos extratos e/ou suas frações ativas. De forma geral, as formulações referem-se às emulsões, géis, cremes, pomadas, soluções, porém, não se limitando a estes. Em particular, as formulações da presente invenção tratam de cremes, xampus e géis.
[60] As composições creme podem ser elaboradas com cera auto-emulsionante e/ou tensoativo, por exemplo, estearatos de poliglicerila, álcool cetoestearílico, sesquiestearato de metilglicose PEG- 20; opcionalmente, agentes de consistência polimérica, tais como, o monoestearato de glicerila, dispersão de hidroxietilcelulose 2% p/v; como emoliente, o óleo mineral, acetato de cetila e/ou álcool de lanolina acetilado, silicone volátil, 2-octil-dodecanol; como umectante, propilenoglicol e/ou glicerina; e conservantes, tais como os parabenos. COMPOSIÇÃO CREME
[61] As composições géis podem apresentar em sua composição agente de consistência poliméricos e/ou gelificantes, por exemplo, polímeros carbonílicos, hidroxicelulose; agentes acidificantes e/ou alcalinizantes, como a solução de hidróxido de sódio a 20% (p/v), trietanolamina; tensoativos, tais como, álcool cetoestearílico, álcool cetílico etoxilado e/ou propoxilado, poliól de éster de ácido graxo, como umectante, tais como, propilenoglicol, sorbitol 70% e/ou glicerina; e conservantes, tais como, os parabenos. COMPOSIÇÃO GEL
[62] A composição de xampu pode conter em sua formulação os tensoativos aniônico, catiônico e/ou anfótero podendo ser primário ou secundário, tais como, lauril éter sulfato de sódio, lauril sulfato de trietanolamina, lauril sulfosuccinato dissódico e/ou lauril sulfato de sódio, dietanolamida de ácidos graxos de coco, cocoamido propil betaína, fosfato 3-oleílico; agente neutralizante como a solução ácida cítrico a 10% (p/v); agente de consistência como diestearato de glicol, solução de cloreto de sódio 20% (p/v); e conservantes, tais como os parabenos. COMPOSIÇÃO XAMPU
[63] Em uma terceira realização a presente invenção refere-se ao uso desses extratos no preparao de formulações cosméticas e/ou farmacêuticas como antimicrobiano e/ou conservante. A atividade antimicrobiana das frações de Lippia salviaefolia Cham. é indicada para bactérias Gram-negativas; Gram-positivas, leveduras e fungos (bolor).
[64] Ainda, o sistema conservante, resultante do uso das frações ativas dos extratos de Lippia salviaefolia Cham. apresenta um amplo espectro de ação, eficácia em extensa faixa de pH, maior compatibilidade com os demais componentes da formulação, mínima interferência nas características organolépticas (tais como, cor, odor, sabor, entre outros), ser seguro, atóxico, não irritante, nem sensibilizante, adequado coeficiente de partição óleo em água, de modo a permitir concentração efetiva em ambas as fases, rápida inativação dos contaminantes prevenindo a adaptação microbiana, fácil manipulação, custo baixo, estabilidade de concentração.
[65] Para a fixação da planta Lippia salviaefolia Cham, utilizou- se F.A.A. [formaldeído 37% (v/v): ácido acético glacial: etanol 70% (v/v); (2:1:1)], armazenada em etanol 70% (v/v).
[66] Para a descrição histológica, foram realizados cortes a mão livre, utilizando lâmina de barbear. O material foi clarificado em solução de hipoclorito de sódio 70% (v/v) e submetido à coloração diferencial com azul de alcian 1% (p/v) e fucsina básica 1% (p/v). Cortes transversais e paradérmicos de limbo foliar e transversais de limbo, pecíolo e caule, foram montados em preparações semi-permanentes, em glicerina 50% (v/v), com gotas de formalina e analisados em microscópio óptico binocular Coleman.
[67] Na obtenção dos extratos, aquoso e hidroalcoólico, as folhas foram previamente dessecadas em estufa com temperatura controlada de 38°C e circulação de ar por quatro dias, seqüencialmente divididas e pulverizadas em moinho de facas com malha de 1 mm de diâmetro.
[68] O processo de obtenção foi realizado por extração em Soxhlet para o extrato hidroalcoólico; e decocção para o extrato aquoso. Todos os solventes utilizados tanto na extração quanto nos procedimentos cromatográficos eram de grau cromatográfico. Pesou-se cerca de 50 g da planta pulverizada em balança eletrônica, seqüencialmente foram extraídas com etanol PA, até a exaustão, por três dias, à temperatura aproximada de 70°C. O extrato seco foi concentrado em rota evaporador e posteriormente liofilizado. Com o resíduo da extração anterior foi realizada uma extração por decocção, a partir de cerca de 30 g da planta. Os extratos obtidos foram armazenados, devidamente acondicionados sob refrigeração.
[69] A partir dos extratos etanólico e aquoso foram feitos testes iniciais de eficácia como conservantes naturais.
[70] O extrato etanólico foi submetido à partição para verificação da fração com maior atividade antimicrobiana. Pesou-se 10,45 g do extrato etanólico liofilizado que foi dissolvido em cerca de 100 mL de hexano, acondicionado em banho de ultra-som, por 2 minutos e filtrado em Funil de Büchner sob pressão reduzida. A técnica foi repetida três vezes, obtendo desta forma a fração hexânica. Em seqüência, o resíduo desta primeira extração, após filtração, foi tratado com clorofórmio empregando-se a mesma técnica da primeira fração. Após obtenção da fração clorofórmica, repetiu-se todo o procedimento utilizando como solvente o acetato de etila para obtenção da fração de acetato de etila. E por fim, o resíduo da fração de acetato de etila foi extraído com n- butanol empregando a mesma técnica, obtendo a fração butanólica. Para secagem dos extratos utilizou-se evaporador rotatório a vácuo. Desta forma, obtiveram-se quatro frações diferentes a partir do extrato etanólico de L. salviaefolia. Todas as frações foram concentradas em rota-evaporador e posteriormente liofilizadas.
[71] Para o fracionamento da fração de acetato de etila obtida a partir do extrato total de L. salviaefolia, foram utilizados os seguintes métodos cromatográficos: Coluna Cromatográfica e Cromatografia em Camada Delgada (CCD).
[72] Foi realizada inicialmente uma separação prévia através de uma coluna cujas características da coluna utilizada na separação preliminar dos componentes da fração de acetato de etila (Tabela 1). TABELA 1
[73] Pesou-se 1,0 g da fração de acetato de etila, proveniente do extrato total das folhas de Lippia salviaefolia, sendo solubilizada em metanol e incorporada a uma pequena porção de sílica (aproximadamente 0,5 g), posteriormente depositada na parte superior da coluna para realizar separação. Como fase móvel, utilizou-se a mistura diclorometano: metanol em diferentes proporções conforme descrito na tabela 2 que mostra a fase móvel utilizada na coluna para a separação dos componentes da fração de acetato de etila de L. salviaefolia e frações obtidas. Todas as extrações foram realizadas em duplicata, cada fração obtida foi concentrada e liofilizada. Depois de liofilizada cada fração foi submetida à avaliação de sua atividade antimicrobiana para identificação da fração com melhor resultado. TABELA 2
[74] As frações obtidas na separação preliminar foram novamente fracionadas através de cromatografia em camada delgada. Para tanto foram empregadas placas contendo uma camada de 1 mm de sílica gel PF254. Os sistemas eluentes utilizados eram compostos por diclorometano e metanol na proporção volumétrica de 9:1. Antes de efetuar a corrida cromatográfica a cuba foi previamente saturada com o próprio sistema eluente.
[75] Para a realização da análise estrutural utilizou-se o cromatógrafo a gás equipado com detector de ionização de chama. Os espectros obtidos foram comparados com bancos de espectros do próprio aparelho assim como com dados espectrais da literatura.
[76] No estudo da atividade antimicrobiana, os extratos hidroalcoólico e aquoso, assim como as diferentes frações do extrato etanólico, foram diluídas em dimetilsufoxido (DMSO): metanol (1:1). As concentrações correspondentes são expressas em termos de miligramas (mg) do extrato ou fração por mililitros (mL) do solvente.
[77] A atividade antimicrobiana dos extratos foi avaliada contra quatro tipos de microrganismos: bactérias Gram-positivo: Staphylococcus aureus (ATCC 6538); Gram-negativos: Escherichia coli (ATCC 10536) e Pseudomonas aeruginosa (ATCC 9027); e fungo: Candida albicans (ATCC 10231).
[78] Quanto ao método de difusão em ágar, os organismos testados foram inoculados em um “slant” de “Trypic Soy Agar” (TSA) para as bactérias, e “Sabouraud Dextrose Agar” (SDA) para o fungo. Depois de um período de incubação de 24 h a 32°C para bactéria e 25°C para o fungo, as culturas foram suspensas em solução salina estéril e ajustadas de modo a obter uma leitura turbidimétrica comparável com o padrão de McFarland n° 05. A partir dessas suspensões microbianas, 1,0 mL foi dissolvido em 4,0 mL de TSA para bactéria e SDA para o fungo, seqüencialmente, estes 5 mL resultantes constituíam a segunda camada da placa de Petri, com uma primeira camada de 10 mL de ágar sem microrganismo. De modo asséptico, próximo ao fogo, com ferramentas apropriadas foram feitos alguns poços com aproximadamente 6 mm de diâmetro, onde as frações e os extratos foram depositados para estudo de suas ações. Em cada placa de Petri foram feitos 5 poços: um utilizado como controle negativo, outro para controle positivo, e os três restantes para as amostras em triplicada.
[79] Três concentrações foram preparadas para o extrato aquoso, e o extrato etanólico total: 20, 10 e 5 mg/mL. Enquanto duas concentrações foram preparadas para as frações do extrato etanólico. 40,0 μL de cada solução (extrato aquoso, extrato etanólico e frações) eram colocadas nos poços. Em cada placa de Petri existia um poço contendo uma solução de 40 μL DMSO: Metanol (50:50) v/v usado como controle negativo, e como controle positivo um poço com 20 μL de uma solução padrão de (1mg/mL) de cloranfenicol, (potência: 100.000 UI/mL), para bactérias; nistatina, (potência: 100.000 UI/mL) para fungo; e amicacina, (potência: 916 μg/mg), para Pseudomonas aeruginosa. As placas eram incubadas por 24 h a 32°C (bactérias) e por 48 h a 25°C (fungo). Os diâmetros das zonas de inibição resultantes foram medidos por “Antibiotic Zone Reader - Fisher- Lilly” (mm). Cada experimento foi repetido ao menos três vezes. A zona de inibição mensurada corresponde à média dos diâmetros das zonas de inibição encontradas.
[80] Os microrganismos testados foram: Staphylococcus aureus ATCC 6538, Escherichia coli ATCC 10536, Candida albicans ATCC 10231, Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027, Aspergillus niger ATCC16404. A avaliação da atividade antimicrobiana dos extratos que apresentaram melhores resultados no teste por difusão em ágar foi realizada através da CMI e visou a seleção dos extratos que foram incorporados nas formulações cosméticas. O ensaio utilizado foi pelo método de microdiluição em meio líquido com técnicas assépticas. Para maior confiabilidade dos resultados, a determinação da CMI dos extratos selecionados foi avaliada, após incubação com temperatura controlada, por espectrofotometria em microplacas. Esse teste é uma adaptação do procedimento de diluição em meio líquidos que utiliza maior volume (10 mL), com os volumes de inóculo, reduzindo amostra e meio de cultura para 230 μL, possibilitando maior número de réplicas. Em uma etapa inicial, foi padronizado e validado o método, o equipamento utilizado foi o leitor de microplacas LM-LGC fornecendo precisão de leitura espectrofotométrica.
[81] Em cada poço foram colocados 200 μL descritos a seguir; C: controle negativo (meio); Cs: controle do solvente (meio, microrganismo e solvente); Cc: controle de crescimento (meio e microrganismo); C+: Controle positivo (meio, microrganismo e antimicrobiano de referência); Cext: controle do extrato (meio e extrato); e amostras estudadas nas concentrações apropriadas. Para todas essas variáveis são utilizados no mínino quatro poços de cada microplaca.
[82] Através do estudo em cromatografia gasosa- espectrofotômetro de Massa (CG-EM) foi constatado que os três principais compostos majoritários cujo padrão de fragmentação, da fração 4 descrita na tabela 2, fora compatível são 4’,5-Dihidroxi-7- metoxi-flavonona, a naringenina, e o apiflorol. Tais valores serviram de base para comparação com o extrato total e as frações ativas da L. salviaefolia.
[83] As bases cosméticas utilizadas na presente invenção envolvem preferencilamente, emulsão (creme), gel e xampu. Foram preparadas 6 formulações testes (2 emulsões, 2 géis e 2 xampus) selecionadas a partir do aspecto sensorial através de critério pessoal (espalhamento adequado na pele, toque sedoso e aspecto). Estas formulações foram submetidas aos testes preliminares de estabilidade física (centrifugação e estresse térmico), e ao teste de estabilidade acelerada. Ao final destes testes foi eleita uma formulação de emulsão, uma de gel e uma de xampu, com as quais se prosseguiu o teste de eficácia de conservante. As composições de cada formulação preliminar estão descritas nas tabelas a seguir: TABELA 3
[84] O procedimento para o preparo do Creme A envolveu o aquecimento das fases, aquosa e oleosa, separadamente, até a temperatura de 70-75°C. Ao atingirem este valor, verteu-se a fase aquosa sobre a oleosa, de forma lenta e constante e com auxílio da agitação mecânica (Mixer). Após a obtenção da emulsão, homogeneizou- se até seu resfriamento a 40°C e acrescentaram-se o ciclometicone, a essência e o extrato, previamente diluído em q.s. etanol P.A. O valor de pH da formulação foi corrigido para 6,0-6,5. TABELA 4
[85] Misturou-se, com auxílio da espátula de plástico, o Hostacerin® SAF e q.s. de água destilada flexível. Adicionaram-se a essência e o extrato homogeneizando-se o sistema. O valor de pH da formulação foi corrigido para 6,0-6,5. TABELA 5
[86] Hidratou-se a hidroxietilcelulose com q.s. de água destilada na temperatura de 50°C e agitou-se com espátula de plástico flexível até a formação do gel. Adicionaram-se o propilenoglicol, a essência (previamente dispersa no Procetyl® AWS) e o extrato, completando-se a massa do gel com q.s.p. de água destilada e homogeneizou-se. O valor de pH da formulação permaneceu entre 6,0-6,5. TABELA 6
[87] O polímero carboxivinílico foi disperso em q.s. de água destilada e permaneceu em repouso por 3 h, a fim de completar a hidratação. Após esse período, foi adicionado o propilenoglicol homogeneizando-se com auxílio de espátula de plástico flexível. A essência e o Cetiol® HE foram previamente dispersos em Procetyl® AWS e adicionados à mistura, e posteriormente o extrato homogeneizando-se o sistema. A formulação foi pesada, completou-se a massa com água destilada e corrigiu-se o valor do pH para 6,0-6,5, com auxílio do hidróxido de sódio e homogeneização manual. TABELA 7
[88] Pesaram-se os componentes lauril éter sulfato de sódio, lauril sulfato de trietanolamina e dietanolamida de ácidos graxos e homogeneizou-se com auxílio de espátula de plástico flexível. Adicionaram-se 50 g de água destilada com agitação suave. Acrescentaram-se o corante, a essência e o extrato, completou-se a massa com água destilada e misturou-se suavemente. Corrigiu-se o valor do pH para 6,0-6,5 com ácido cítrico, adicionou-se a solução de cloreto de sódio até obter o espessamento adequado (observada visualmente e característica de um xampu) e homogeneizou-se o sistema. TABELA 8
[89] Pesou-se o lauril sulfossuccinato dissódico, o lauril sulfato de sódio (Genapol® SSB), o lauril sulfato de sódio (Genapol® LSS), o diestearato glicol (Genapol® EGL), a cocoamidopropil betaína (Dehyton® KB) e o fosfato 3- oleílico (Hostaphat® 0-300) e homogenizou-se suavemente com auxílio de espátula de plástico flexível. Foram incorporados à formulação, q.s. de água destilada, a essência e o extrato, completou-se o volume com água destilada e misturou-se suavemente com a mesma agitação. Corrigiu-se o valor do pH para 6,06,5 com hidróxido de sódio e adicionou-se a solução de cloreto de sódio, até alcançar espessamento adequado (observada visualmente e característica de um xampu) e homogeneizou-se o sistema.
[90] Todas as pré-formulações cosméticas foram submetidas a estudo de estabilidade acelerada. Assim, com o intuito de avaliar criteriosamente a atividade conservante dos extratos da L. salviaefolia nas pré-formulações cosméticas descritas acima, estas foram submetidas a condições drásticas "Stress test". Antes de iniciar o estudo de estabilidade o produto foi submetido ao teste de centrifugação e ao estresse térmico.
[91] Na centrifugação, dez gramas das formulações (creme A e creme B) foram submetidas a ciclos de rotação de 1000, 2500 e 3500 rpm em centrífuga, durante quinze minutos para cada velocidade.
[92] As amostras (Creme A e B e Xampu A e B) foram colocadas em banho-maria termostatizado, entre 40 e 80°C. Realizou-se a elevação da temperatura de 10 em 10°C, mantendo por 30 minutos em cada valor. Foram avaliadas as amostras ao término do teste (80°C), após as mesmas retornarem à temperatura ambiente (22,0 ± 2,0°C).
[93] Após 24 horas de preparo, considerado como ti (tempo inicial), as formulações escolhidas, creme A e B, gel A e B e xampu A e B, foram submetidas às seguintes condições e períodos de avaliação:
[94] No armazenamento, as formulações foram mantidas à temperatura ambiente (22,0 ± 2,0°C), durante 14 dias, sendo avaliadas no 3°, 7° e 14° dias.
[95] O produto foi exposto à luz solar de forma indireta e não diretamente ao sol. Pois a luz solar direta pode alterar significativamente a cor e o odor do produto e levar à degradação de componentes da formulação.
[96] As preparações foram submetidas à temperatura de 45,0 ± 2,0°C em estufa, durante 14 dias, sendo avaliadas no 1°, 3°, 7° e 14° dias. Ainda, as formulações foram submetidas a ciclos de congelamento (-10,0 ± 2,0°C) por 24 horas em freezer, seguido de descongelamento e aquecimento em estufa (50,0 ± 2,0°C) por 24 horas, completando-se dessa forma um ciclo. As amostras foram submetidas a seis ciclos, sendo avaliadas no 3° (6° dia) e 6° ciclos (12° dia).
[97] Também, as formulações foram mantidas à temperatura de -10,0 ± 2,0°C em freezer, durante 14 dias e avaliadas no 7° e 14° dias. A avaliação ainda se deu em refrigerador onde as formulações foram mantidas em (6,0 ± 2,0 °C), durante 14 dias e avaliados no 3°, 7° e 14° dias.
[98] Após 24 horas do preparo (ti), cada formulação foi avaliada quanto às características organolépticas (aspecto, cor e odor), valor de pH e de viscosidade aparente. Os resultados obtidos em ti foram considerados como referência para comparação com as demais leituras das amostras, em todas as condições, durante o Teste de Estabilidade Acelerada.
[99] Os microrganismos desafiantes utilizados na validação e no teste de eficácia de conservantes foram: Escherichia coli (ATCC 10536), Pseudomonas aeruginosa (ATCC 9027), Staphylococcus aureus (ATCC 6548), Burkholderia cepacia IAL 1834 ATCC (17759), Candida albicans (ATCC 10231) e Aspergillus niger (ATCC 16404).
[100] A escolha da condição de inativação do sistema conservante tem como objetivo validar o método usado no teste de eficácia do sistema conservante. A confiabilidade do método usado no teste de eficácia de conservante depende da sua capacidade em evitar a interferência do sistema conservante no crescimento dos microrganismos.
[101] Para a escolha de condição de neutralização ou inativação do sistema conservante, o estudo foi conduzido com as formulações de creme A, Gel B e Xampu B. Esses produtos foram preparados em condições assépticas e considerados como a amostra-teste. Como controle da viabilidade dos microrganismos utilizou-se solução salina 0,9% (p/v).
[102] As amostras do Creme A, Gel B e Xampu B foram avaliadas quanto à eficácia do sistema conservante. O teste de desafio foi executado para cada um dos microorganismos acima mencionados.
[103] Aproximadamente 20g de cada amostra teste foi inoculada com um dos microrganismos desafiantes em cerca de 105 a 106 UFC/g, proveniente da suspensão previamente padronizada conforme descrito anteriormente e respeitando-se a relação entre o volume do inóculo e da suspensão, para ser menor ou igual a 1% (p/v) do volume da amostra. Imediatamente após a inoculação, foi homogeneizado por um minuto em agitador e submetido à diluição seriada e à contagem das colônias de microrganismos viáveis (UFC/g), pela técnica de semeadura em profundidade. Para o procedimento de diluições decimais empregou-se o diluente Dey Engley (D/E). Como meio de cultura foi utilizado ágar caseína soja e ágar sabouraud-dextrose 4%.
[104] As amostras desafiadas e os controles foram mantidos em temperatura ambiente no decorrer do teste. A periodicidade de cada avaliação do sistema conservante das amostras foi mantida. Ressalta-se que, para todos os métodos utilizados na avaliação da eficácia de sistema conservante, foram realizados ensaios logo após a inoculação do microrganismo, considerado tempo zero (t0).
[105] Para a verificação da viabilidade dos microrganismos durante os testes, realizou-se o mesmo procedimento utilizado para amostra, embora empregando solução salina 0,9 % (p/v), considerado no ensaio como controle da viabilidade do microrganismo.
[106] Os tempos para a avaliação, no presente pedido, foram logo após a inoculação e após 2, 7, 14, 21 e 28 dias. Foram nomeados, respectivamente, de t0, t2, t7; t14; t21 e t28.
[107] Para a avaliação da segurança das formulações cosméticas sem e com incorporação de L. salviaefolia em estudos histológicos, os substitutos cutâneos dermo-epidérmico foram inicialmente fora preparadas as bases dérmicas. Seqüencialmente foram preparadas culturas secundárias de queratinócitos sobre as bases dérmicas em cultivo na interface ar-líquido. A derme foi preparada com 2 x 2 cm2 e mantida em PBS (Phosphate Buffered Saline - Solução Salina Fosfato Tamponada), foi colocado um anel sobre a derme para semear os queratinócitos em alta densidade, deixando “overnight” para retirar o anel. No sétimo dia o conjunto foi passado para o sistema de rede em placas de seis poços. As culturas foram mantidas em estufa de cultivo com atmosfera de CO2 a 5%, à temperatura constante de 37°C, sendo que em cada poço continham 3 mL de KGM (Keratinocyte Growth Medium), o meio de cultivo foi trocado a cada dois dias até o 14° dia e diariamente até o 21° dia. Para início do teste de avaliação de segurança todo meio foi aspirado e, com o auxílio de uma seringa de insulina de 1 mL, colocou-se 1 gota (cerca de 20-30 μL) de cada amostra (gel, creme e xampu sem e com a incorporação de L. salviaefolia) sobre os compostos cultivados na interfase ar-líquido, em uniplicata, mantendo um poço como controle sem a adição de amostra.
[108] Depois de adicionado às amostras nos compostos cultivados na interfase ar-líquido, os sistemas foram mantidos por 24 horas ou 48 horas no meio de cultivo. O sistema dermo-epidérmico foi lavado 3 vezes com PBS e transferido, com o auxílio de uma pinça e agulha, para um papel de filtro. Seqüencialmente o sistema foi tratado e fixado, para microscopia óptica, por 24-72 horas, em geladeira, com paraformaldeído (PFA) a 4% em tampão cacodilato de sódio pH 7,2. Foi lavado novamente três vezes com PBS e deixado em álcool 70% na geladeira. A análise da morfologia da pele humana, sistema dermo- epirdérmico, foi feita em microscópio óptico, com aumento de 1000 vezes (microscópio Labophot - Nikon).
[109] Preparou-se solução estoque na concentração de 2 mg/mL, solubilizando-se o extrato seco de acetato de etila de L. salviaefolia em polietilenoglicol 400 (PEG 400). Os queratinócitos HK186 em baixa densidade (com camada de sustentação) formada por Fibroblastos CCl- 92 previamente irradiados com 60 Gy, na passagem P0 foram amplificados para uma garrafa de 75 cm2 em meio KGM. À partir de cultura primária, após atingir a quantidade de células necessárias, foram tripsinizados e semeados a 50.000 células/poço de HK186 em duas placas “multiwell” de 96 poços. Após 24 horas foram adicionados 100 μL das diluições seriadas necessárias da solução mãe de L. salviaefolia em PEG para atingir as concentrações de 2%, 1%, 0,5%, 0,25% e 0,125% (p/v) da fração de acetato de etila do extrato de L. salviaefolia em meio KGM, recém preparado e previamente esterilizado por filtração, em triplicatas.
[110] As amostras foram mantidas em contato com essa solução de L. salviaefolia por 2, 6, 24 e 48 horas. Foi feito também um controle sem tratamento, onde foi adicionado o meio de cultura KGM em 11 replicas e mantidas em incubação até o fim de teste (48 horas). E a avaliação da interferência do solvente: após o período de incubação o meio de cultura foi trocado por meio KGM, contendo quantidades crescentes do solvente 0%, 5%, 1%, 2%, a serem testados e então a placa foi novamente incubada nos intervalos de tempo de 2, 6, 24 e 48 horas, para o intervalo de tempo 2 horas foram utilizadas apenas as concentrações de 2% e 1%, ou seja, reproduzindo as condições mais drásticas do teste de viabilidade celular para L. salviaefolia. Após estes períodos pré-estabelecidos de contato, trocou-se o meio de cultura por KGM e as amostras foram mantidas até o final do teste, 2 dias, sendo então submetidas a coloração por rodamina (avaliação qualitativa) e MTS (avaliação quantitativa) para verificação da viabilidade celular.
[111] Após 48 horas, as soluções, contidas nos poços, foram aspiradas e adicionaram-se alíquotas de 120 μL da solução MTS/PMS em KGM em todos os poços da placa, que foi imediatamente acondicionada em estufa de atmosfera controlada a 37°C, com 5% de CO2 e 95% de umidade relativa, por 2 horas. Decorrido este período inicial, foi realizada a primeira medida de absorbância, a 490 nm, em espectrofotômetro de placa de ELISA acoplado a impressora. Incubou-se novamente a placa e tomaram-se mais três leituras, com intervalo de 1 hora.
[112] Com o intuito de se quantificar a proliferação das células, aplicou-se o método colorimétrico intitulado Cell Titer 96®.
[113] Para preparação das soluções de MTS/PMS em KGM: soluções de MTS e PMS foram descongeladas em banho termostatizado, a 37°C, por 10 minutos. Na preparação foi utilizado transferiu-se 15,873% de MTS, para um tubo de fundo cônico contendo 83,333% de meio de cultura celular (KGM). Em seguida adicionou-se 0,794% de PMS agitando a solução vigorosamente.
[114] Os extratos hidroalcoólico e aquoso foram obtidos após constatação da ineficiência do extrato aquoso como agente antimicrobiano, e ação do extrato hidroalcoólico foi feita a partição extrato hidroalcoólico para obtenção das frações e estudo de suas atividades antimicrobianas, com o intuito de identificar a fração com melhor atividade antimicrobiana. Nas tabelas 9 e 10 são descritos o peso seco e rendimento de cada extrato e frações.
[115] A tabela 9 refere-se ao rendimento dos extratos aquoso e hidroalcoólico obtidos da L. salviaefolia TABELA 9
[116] A tabela 10 mostra o rendimento das frações obtidas a partir da partição do extrato hidroalcoólico de L. salviaefolia. TABELA 10
[117] A fração que apresenta maior rendimento é a fração de acetato de etila, com um rendimento de 41,34% (tabela 10).
[118] Após a partição e estudo da atividade antimicrobiana por meio de difusão das frações hexânica, clorofórmica, acetato de etila e butanólica. Constatou-se que frações ativas mais eficazes são: a fração de acetato de etila e a fração clorofórmica. Feita uma análise em CCD, verificou-se que as frações clorofórmica e de acetato de etila tem composição parecida. Devido ao fato de terem composição parecida e ao CMI das duas frações serem parecidos, a fração de acetato de etila, por ter maior massa, melhor rendimento e apresentar melhor facilidade de manuseio, devido a menor concentração de compostos graxos.
[119] A partir da extração em coluna cromatográfica da fração de acetato de etila obtemos as frações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 e 9. Cada uma dessas frações foi submetida ao estudo de atividade antimicrobiana à 1,0 mg/mL frente a S. aureus, microrganismo mais sensível aos testes de atividade antimicrobiana. Possibilitando a identificação das frações com atividade antimicrobiana considerável e conseqüente de maior interesse para o estudo em questão. Sendo as frações 3 e 4 que apresentaram melhor atividade antimicrobiana.
[120] A análise em CCD foi realizada como um “screening”, possibilitando identificação das frações que apresentam os compostos majoritários. Verificou-se que os compostos majoritários estão nas frações 3 e 4. Assim como as melhores atividades antimicrobianas. A análise constitucional foi realizada pelo CG-EM.
[121] A análise estrutural foi realizada apenas para as frações mais purificadas e com maior atividade antimicrobiana, pois nestas frações estão presentes componentes de interesse, com maior atividade microbiana. Devido à semelhança de composição entre as frações 3 e 4, observada em CCD, somente a fração 4 foi submetida à análise estrutural por CG-EM. A análise por CG-EM da fração 4 obtida com os procedimentos de separação revelou a presença de flavononas. Os três principais compostos majoritários cujo padrão de fragmentação é compatível são 4’,5-Dihidroxi-7-metoxi-flavonona (tempo de retenção = 17,032), a naringenina (tempo de retenção= 17,537 min.), e o apiflorol (tempo de retenção = 17,988).
[122] Utilizou-se um “screening” inicial para verificação das frações e extratos com atividade antimicrobiana. Os resultados da atividade antimicrobiana pelo método de difusão em ágar dos extratos aquosos etanólicos e das frações do extrato etanólico estão presentes na tabela 11. Observou-se que o extrato etanólico mostrou boa atividade antimicrobiana contra S. aureus, E. coli, e C. albicans. Os diâmetros das áreas de inibição mensurados, referentes aos extratos estudados ficaram entre 13,3 - 1,3 mm dependendo do microrganismo estudado.
[123] A tabela 11 mostra a atividade antimicrobiana mensurada pelo diâmetro de inibição do crescimento, dos extratos de L. salviaefolia e frações pelo método de difusão em ágar. Sendo i: inativo; ---: teste não realizado; EE: extrato etanólico de L. salviaefolia, EAq: extrato aquoso de L. salviaefolia, Fr.H.: fração hexânica; Fr.CHCl3: fração de clorofórmio; Fr.Ac.Et.: fração de acetato de etila; Fr.ButOH.: fração butanólica. TABELA 11
[124] As frações hexânica e butanólica apresentaram pouca atividade frente aos microrganismos testados. Entretanto, o uso das frações clorofórmicas e de acetato de etila foram efetivas, o que corrobora uma boa atividade antimicrobiana frente S. aureus, E. coli e C. albicans, entre outras.
[125] De acordo com os resultados apresentados na tabela 11, pode-se notar que os valores referentes às zonas de inibição para a fração de acetato de etila estão bem próximos daqueles apresentados pela fração clorofórmica, sendo que os valores das zonas de inibição para fração de acetato de etila são levemente menores do que os valores correspondentes à fração clorofórmica.
[126] A atividade antimicrobiana do extrato aquoso, do extrato etanólico total e das frações de L. salviaefolia foi testada pelo método de difusão em ágar contra quatro microrganismos: um Gram-positivo (S. aureus), dois Gram-negativos (E. coli e P. aeruginosa) e um fungo (C. albicans). Os resultados demonstraram considerável atividade antimicrobiana para o extrato etanólico total e para as frações clorofórmica e de acetato de etila.
[127] Os extratos de L. salviaefolia mostrados aqui no presente pedido relatam ser um ativo funcional em dosagens menores àquelas apresentadas no estado da técnica referente ao método de difusão. Logo o método de difusão em ágar foi utilizado apenas como um “screening” para encontrarmos as frações ativas. O CMI do extrato total como das suas frações de L. salviaefolia foi determinado pelo método de microdiluição.
[128] Os resultados referentes à determinação da CMI confirmam os resultados apresentados pelo teste de difusão em ágar. As frações hexânica e butanólica são inativas. Porém como se pode observar na tabela 8, o extrato total, fração clorofórmica, fração de acetato de etila, e as frações 3 e 4 provenientes da fração de acetato de etila foram ativas frente S. aureus, E. coli, C. albicans e A. niger. Por outro lado, somente as frações clorofórmica e a de acetato de etila foram ativas frente a P. aeruginosa.
[129] Na tabela 12 as concentrações mínina inibitórias (CMI) para naringenina são apresentadas, para o extrato total de L. salviaefolia; para as frações ativas do extrato total: fração de acetato de etila e fração clorofórmica; e ainda para as frações 3 e 4 derivadas da fração de acetato de etila. Como pode ser observado, as frações 3 e 4 derivadas da fração de acetato de etila, não apresentaram CMI superior aos da sua fração original, tornado injustificável a purificação das frações de acetato de etila e de clorofórmio, esse fator pode ser explicado pelo efeito sinérgico favorável entre as substâncias presentes nos extratos.
[130] A tabela 12 revela a CMI da naringenina, do extrato total e frações da L. salviaefolia pelo método de microdiluição, frente a bactérias e fungos, sendo EE: extrato etanólico; CHCl3.Fr: Fração clorofórmica do extrato etanólico; Ac.Et.Fr.: Fração de acetato de etila do extrato etanólico; Fr. 3: Fração 3 da fração de acetato de etila; Fr. 4: Fração 4 da fração de acetato de etila. TABELA 12
[131] De acordo com a tabela 12, observou-se que, ao realizar o teste de atividade antimicrobiana da L. salviaefolia, a fração clorofórmica e a fração de acetato de etila possuem a maior atividade antimicrobiana, em que apresentaram um CMI de 0,2% para as bactérias e fungos testados.
[132] As frações 3 e 4 provenientes da fração de acetato de etila apresentaram CMI próximos, quando comparando entre si (tabela 12). Esse fato pode ser explicado devido à semelhança constitucional entre as frações. Porém a CMI apresentada tanto pela fração 3 como pela fração 4, não foram mais eficazes que as frações de acetato de etila ou a fração de clorofórmio (tabela 12). Este fato pode ser explicado devido ao efeito sinérgico apresentado pelos constituintes de cada fração. Desta forma, para a L. salviaefolia, à medida que se purifica a fração diminui a atividade antimicrobiana.
[133] Foram isolados três compostos majoritários em CG-EM. Os três principais compostos majoritários cujo padrão de fragmentação é compatível são 4’,5-Dihidroxi-7-metoxi-flavonona, a naringenina, e o apiflorol. Dentre esses compostos a naringenina é encontrada para comercialização. Deste modo estudou-se a atividade antimicrobiana para naringenina. Verificou-se que a naringenina assim como o extrato etanólico total da L. salviaefolia (Tabela 12), tem os maiores valores de CMI encontrados no estudo da atividade antimicrobiana. Para o S. aureus o CMI da naringenina e do extrato total foram entre 0,125-0,25 mg/mL; para E. coli, CMI entre 1,0 - 1,5mg/mL; para P. aeruginosa > 2,0 mg/mL; para C. albicans entre 1,5 - 2,0 mg/mL; e para A. niger entre 1,5 - 2,0 mg/mL. Esse fato evidencia que para alcançar os melhores níveis da atividade antimicrobiana da L. salviaefolia, deve-se fazer o processo de extração inicial e a partição do extrato total até que se consiga obter a fração clorofórmica e a fração de acetato de etila. A partir deste ponto se prosseguir a purificação e isolamento dos compostos a atividade antimicrobiana tente a diminuir.
[134] A alta eficiência da fração de acetato de etila e da fração clorofórmica pode ser explicada pelo efeito sinérgico entre todos os componentes destas frações de L. salviaefolia. Este fato pode ser explicado devido à semelhança constitucional das duas frações observada no teste de CCD.
[135] A razão para a diferença entre a sensibilidade de bactérias Gram-positivas e Gram-negativas se faz devido à diferença na constituição das paredes celulares de cada uma. Bactérias Gram- negativas tem uma membrana fosfolipídica carreada de componentes lipopolisacarídeos. Isto faz com que a parede celular seja impermeável a algumas substâncias químicas antimicrobianas. Por outro lado, bactérias Gram-positivas são mais suscetíveis, uma vez que tem uma membrana celular constituída apenas por uma camada de peptidioglicano, não sendo uma barreira de permeabilidade efetiva. Entretanto, em relação a estas diferenças de permeabilidade, a L. salviaefolia se mostrou eficaz tanto para Gram-positivas como para Gram-negativas, especialmente as frações: acetato de etila e clorofórmica (Tabela 12).
[136] O A. niger normalmente é insensível à maioria dos extratos de plantas testados em relação à atividade antimicrobiana, e a C. albicans mostrou-se um fungo de difícil inibição. Entretanto como pode ser observado na tabela 12, tanto a fração clorofórmica como a fração de acetato de etila da L. salviaefolia foi ativa com valores de CMI considerável. Ainda, todos os extratos testados de L. salviaefolia possuíram atividade contra bactérias e fungos, especialmente a fração clorofórmica e a fração de acetato de etila. Indicando boa atividade antimicrobiana.
[137] Após centrifugação das emulsões: creme A (CA) e creme B (CB), não foi observada coalescência ou separação de fases, demonstrando estabilidade física adequada.
[138] As formulações dos cremes A e B mantiveram-se estáveis, suportando as alterações de temperatura a que foram submetidas no teste de estresse térmico, não apresentando separação de fases.
[139] Os resultados quanto às características organolépticas, valores de pH e viscosidade aparente das formulações avaliadas inicialmente e após exposição às condições do teste (geladeira de 4-8°C, estufa a 45°C; ciclos gela e degela; freezer a -10°C; temperatura ambiente a 22°C e luz solar) para os cremes A e B, para os géis A e B e para os xampus A e B.
[140] A presença de microrganismos, em determinados níveis e tipos, em produtos não estéreis, pode ser condição relacionada à deterioração do produto, bem como o não cumprimento das Boas Práticas de Fabricação pode, também, conduzir a produção com qualidade sanitária inadequada. Esse processo pode até ser observado nos casos em que o substrato oferece condições mínimas necessárias para o desenvolvimento microbiano. Os contaminantes que sobrevivem multiplicam-se em meio pobre de fatores nutricionais ou mesmo adaptam-se em condições bastante desfavoráveis. A proliferação de microrganismos pode provocar alterações de diversas naturezas, como perda do teor da substância ativa e alterações físico-químicas e/ou organolépticas do produto.
[141] Para cosméticos é permitido nível limite de microrganismos viáveis, o ensaio consiste na contaminação proposital da amostra com microrganismos padrão e determina-se a carga dos sobreviventes em períodos pré-estabelecidos durante 28 dias, utilizando-se técnica de contagem microbiana validada.
[142] Ao se comparar às condições estudadas observa-se que somente na condição 2 foi possível recuperar todos os microrganismos (Tabela 13). Esses resultados indicaram que para a enumeração dos microrganismos haveria a necessidade de uma diluição 10-1 das formulações Creme A, Gel B e Xampu B, com diluente Dey Engley (D/E). Frente a esses resultados para o teste de eficácia de conservantes, procedeu-se à diluição das formulações antes enumeração ou contagem de microrganismos viáveis, nos períodos imediatamente após a inoculação, após 2, 7,14, 21 e 28 dias.
[143] A Tabela 13 apresenta os resultados da recuperação dos microrganismos nas duas condições de neutralização, onde o controle = solução salina a 0,9% (p/v) estéril; amostra-teste = produto preparado com conservante, em condições assépticas e cada algarismo representa a média do ensaio realizado em cinco réplicas. Observa-se que o controle apresentou a recuperação sempre maior que 70% para todos os microrganismos, demonstrando a viabilidade dos microrganismos durante a validação e garantindo que as recuperações menores que 70% eram devidas à condição não adequada para o crescimento dos microrganismos. TABELA 13
[144] Para avaliação da eficiência do sistema conservante, o teste consiste na contaminação de Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Burkholderia cepacia, Candida albicans e Aspergillus niger em cada amostra e determina-se a carga dos sobreviventes em períodos pré-estabelecidos durante 28 dias, utilizando-se técnica de contagem microbiana convencional validada. Os resultados da avaliação da atividade conservante, extrato a 0,2% (p/v), nas formulações de Creme A, Gel B e Xampu B são apresentados a seguir.
[145] A tabela 14 apresenta a carga de sobreviventes de Escherichia coli ATCC 10536 (UFC/g ou mL) no teste de eficácia de conservantes, onde t0 = contagem imediatamente após a inoculação; t48 = contagem em 48 horas após inoculação e t7, t14, t21 e t28 = contagem em 7, 14, 21 e 28 dias após inoculação. TABELA 14
[146] A tabela 15 mostra a carga de sobreviventes de Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027(UFC/g ou mL) no teste de eficácia de conservantes, onde t0 = contagem imediatamente após a inoculação; t48 = contagem em 48 horas após inoculação e t7, t14, t21 e t28 = contagem em 7, 14, 21 e 28 dias após inoculação. TABELA 15
[147] A tabela 16 apresenta a carga de sobreviventes de Staphylococcus aureus ATCC 6538(UFC/g ou mL) no Teste de Eficácia de Conservantes, onde t0 = contagem imediatamente após a inoculação; t48 = contagem em 48 horas após inoculação e t7, t14, t21 e t28 = contagem em 7, 14, 21 e 28 dias após inoculação. TABELA 16
[148] A tabela 17 mostra a carga de sobreviventes de Burkholderia cepacia ATCC (UFC/g ou mL) no Teste de Eficácia de Conservantes, onde t0 = contagem imediatamente após a inoculação; t48 = contagem em 48 horas após inoculação e t7, t14, t21 e t28 = contagem em 7, 14, 21 e 28 dias após inoculação. TABELA 17
[149] A tabela 18 revela a carga de sobreviventes de Candida albicans ATCC 10231(UFC/g ou mL) no Teste de Eficácia de Conservantes, onde t0 = contagem imediatamente após a inoculação; t48 = contagem em 48 horas após inoculação e t7, t14, t21 e t28 = contagem em 7, 14, 21 e 28 dias após inoculação. TABELA 18
[150] A tabela 19 refere-se à carga de sobreviventes de Aspergillus niger ATCC 16404 (UFC/g ou mL) no Teste de Eficácia de Conservantes, onde t0 = contagem imediatamente após a inoculação; t48 = contagem em 48 horas após inoculação e t7, t14, t21 e t28 = contagem em 7, 14, 21 e 28 dias após inoculação. TABELA 19
[151] Os testes foram realizados, concomitantemente com solução salina a 0,9% (p/v) inoculada com a mesma carga microbiana da amostra teste, a suspensão foi considerada controle como intuito a verificação da viabilidade dos microrganismos desafiantes durante os 28 dias do teste. Nesta condição, verificou-se que para as bactérias Escherichia coli (tabela 14), Pseudomonas aeruginosa (tabela 15), Staphylococcus aureus (tabela 16) e Burkholderia cepacia (tabela 17) apresentaram-se viáveis durante todos os testes, assim como para os fungos Candida albicans e Aspergillus niger que se mantiveram, também, adequados no decorrer do tempo de avaliação.
[152] De acordo com os resultados analíticos descritos nas tabelas 14, 15, 16, 17, 18 e 19 pode-se afirmar que: as amostras de creme, gel e xampu na concentração de 0,2% da fração de acetato de etila do extrato etanólico de L. salviaefolia atendem a especificação adotada para as bactérias: Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Burkholderia cepacia, e Cândida albicans.
[153] Após o período de contato de 24 horas ou 48 horas, das amostras com o substituto cutâneo dérmico-epidérmico, corte e coloração por hematoxilina-eosina, foi observado o efeito das bases sem a incorporação da L. salviaefolia e das formulações cosméticas com a incorporação da L. salviaefolia, na epiderme de cada sistema dérmico- epidérmico. Avaliando, desta forma, a segurança de cada formulação.
[154] Na figura 18 temos o controle chamado de branco 24h em que não foi adicionada nenhuma amostra, mas, permaneceu no sistema de cultivo na interfase ar-líquido durante as 24 horas de teste. Nesta ilustração o epitélio se mostrou organizado e reproduzindo a morfologia esperada para derme e epiderme, com diferença tintoriais devido ao amadurecimento celular, podendo ser observado ainda as lamelas de queratina, constituindo a camada córnea. Além da observação das camadas intermediária ou espinhosa e a granulosa.
[155] Na figura 19 consta o estudo histológico da pele após o contato de 24 h com a formulação base gel, observados em microscopia óptica, revelam a morfologia da epiderme e da derme, apesar da separação dermo-epidérmica pode ser observada uma leve toxicidade devido a leve alteração na morfologia da epiderme.
[156] Na figura 20 consta o estudo histológico da pele após o contato de 24 horas com a formulação cosmética gel, incorporada com L. salviaefolia como conservante natural. Neste caso pode-se observar uma maior toxicidade da formulação uma vez que houve uma alteração significativa na morfologia da epiderme, e morte de grande parte dos queratinócitos. Constatado devido à impossibilidade de identificação destas células como ainda pode-se visualizar na figura 18. Essa maior toxicidade quando comparamos o gel sem a incorporação da L. salviaefolia se deve a toxidade inerente ao extrato, porém é importante resaltar que a própria formulação sem a adição da L. salviaefolia já tinha demonstrado certa toxicidade.
[157] A formulação creme foi a que apresentou menor toxicidade mantendo derme e epiderme com características morfológicas normais após o tempo de contato de 24 h (Figura 21).
[158] Na figura 22 constatou-se a influência da formulação cosmética creme incorporada com L. salviaefolia, apesar do maior desprendimento da queratina foi verificada uma baixa toxicidade. Observando ainda as células de queratinócitos viáveis na epiderme. Além da manutenção na morfologia da derme e da epiderme.
[159] Na figura 23 constatou-se a toxicidade da formulação de xampu mesmo sem a adição da L. salviaefolia, isso se deve a presença de tensoativos, por isso são empregados, na sua maioria, em produtos de uso externo e com enxágüe. Na figura 23 observa a desprendimento de toda parte córnea de queratina, da epiderme e uma própria alteração estrutural da epiderme principalmente na camada intermediária, apesar de ainda ser possível observar células de queratinócitos viáveis principalmente próximas às papilas dérmicas na camada basal.
[160] Na figura 24 tem-se o composto dérmico-epidérmico após 24 h de contato com a formulação cosmética xampu incorporada com L. salviaefolia. Os efeitos tóxicos são similares aos efeitos apresentados pela figura 23 representando a base de xampu sem a adição da fração de acetato de etila do extrato de L. salviaefolia. Na qual se verifica um desprendimento da camada córnea e a separação dermo-epidérmica, com alteração estrutural da epiderme. Características evidenciadas pela toxidade da base do xampu e toxicidade da L. salviaefolia, entretanto toda a toxicidade constatada nas figuras 23 e 24 não devem ser atribuídas somente ao extrato uma vez que a formulação sem a o extrato também se mostrou tóxica, provavelmente pela presença dos tensoativos na formulação.
[161] Na figura 25 temos o controle chamado de branco 48 h em que não foi adicionada nenhuma amostra, mas, permaneceu no sistema de cultivo na interfase ar-líquido durante as 48 horas de teste. Nesta ilustração o epitélio se mostrou organizado apesar da separação da derme e da epiderme, sendo que na avaliação da toxicidade para este teste não foi levado em consideração a separação da derme e epiderme, pois pode ser um artefato, desta forma a toxicidade foi avaliada conforme ao aspecto das diferenças morfológicas e diferenças tintoriais da pele. Na figura 25 podem-se evidenciar diferenças tintoriais, devido ao amadurecimento celular, podendo ser observado ainda as lamelas de queratina, constituindo a camada córnea. Além da observação das camadas intermediária ou espinhosa e a granulosa.
[162] Na figura 26 tem-se a influência da amostra de gel base em 48 horas de contato com o composto dérmo-epidérmico. Nesta ilustração temos a visualização apenas da parte epidérmica em que é possível verificar a toxicidade da base gel devido às características morfológicas e tintoriais presentes na epiderme, principalmente na visualização das células de queratinócitos que ficam pouco evidentes e no desprendimento da parte córnea.
[163] Na figura 27 verifica-se a toxicidade do gel com L. salviaefolia em contato com o composto dérmico-epidérmico, constatando diferença na morfologia e aspectos tintoriais, desprendimento da derme e epiderme, desprendimento da camada superficial da camada córnea, dificuldade de identificação de queratinócitos viáveis. Entretanto é importante ressaltar que nesta figura temos a toxicidade da formulação base associada à toxicidade da L. salviaefolia. E quando comparada com a figura 26 não existem diferenças significativas. O que sugere que parte da toxicidade deve-se aos próprios constituintes da formulação base.
[164] O estudo histológico por microscopia óptica visando avaliar a toxicidade das formulações cosméticas de creme por 48 h de contato está evidenciado nas figuras 28 e 29.
[165] Na figura 28 consta apenas à influência da base da formulação sem a adição da L. salviaefolia e na figura 57 tem-se a formulação incorporada com o extrato da planta. Em ambas as figuras têm-se a visualização apenas da epiderme. Na figura 28 pode visualizar mais facilmente queratinócitos viáveis.
[166] Enquanto que na figura 29, a presença das células de queratinócitos viáveis não é tão facilmente detectável, sugerindo uma maior toxicidade apresentada pela formulação com a incorporação da L. salviaefolia.
[167] A avaliação da toxicidade das formulações de xampu base e xampu incorporado com L. salviaefolia em composto dérmico- epidérmico estão elucidados nas figuras 30 e 31. Verificaram-se toxidades significativas, em ambas as formulações, devido a diferenças morfológicas e tintoriais da epiderme.
[168] Na figura 30 evidenciamos a separação da derme e da epiderme além da separação da camada córnea e da camada superficial na epiderme, adicionalmente a dificuldade em se evidenciar células de queratinócitos viáveis.
[169] Assim como na figura 30 na figura 31 constata-se a separação da derme e epiderme, entretanto a epiderme não apresentou grandes alterações morfológicas, o que caracteriza um nível de toxicidade semelhante entre as formulações com e sem a incorporação de L. salviaefolia.
[170] Depois de verificar a interferência das formulações bases, sem a incorporação da L. salviaefolia, foi constatado que mesmo as bases das formulações, principalmente na formulação de xampu, exercem efeito tóxico perante as culturas dos substitutos cutâneos dermo-epidérmico. Desta forma em alguns casos não se pode afrimar que tais efeitos tóxicos são devidos exclusivamente à fração de acetato de etila da Lippia saviaefolia.
[171] No experimento da citoxicidade em cultura de queratinócitos humanos a fração de acetato de etila de L. salviaefolia foi colocada diretamente sobre os queratinócitos. Desta maneira o teste é mais sensível que o teste in vivo ou até mesmo, desta maneira os resultados são expostos com maior segurança em relação aos estudos de toxicidade no composto dérmico-epidermico. Salientando ainda a relação de diversas concentrações e diferente tempo de contato da fração de acetato de etila da L. salviaefolia em contato com os queratinócitos humanos.
[172] De acordo com resultados obtidos no teste de citoxicidade (Figura 32) verificou-se que a L. salviaefolia na concentração de 0,2%, correspondente ao CMI, foi tóxica em quase todos os tempos de contato, exceto com meia hora de contato, em que se observa uma viabilidade celular de cerca de 90%.
[173] Na concentração de 0,1% da fração de acetato de etila da L. salviaefolia, observou-se citoxicidade nos tempos de 24 e 48 horas. Entretanto nesta mesma concentração (0,1%) com 6h de contato alcançou uma viabilidade celular de 70%, atingindo segurança nos tempos de 2h e meia hora de contato (Figura 32).
[174] Na concentração de 0,05 % da fração de acetato de etila da L. salviaefolia, com 48 horas de contato demonstrou uma viabilidade celular de cerca de 70%. Nesta mesma concentração com 24 e 6 horas de contato apresentou viabilidade celular em torno de 80%, atingindo a faixa de segurança com meia e 2h de contato (Figura 32).
[175] Já nas concentrações de 0,025 e 0,0125% de acetato de etila de L. salviaefolia, apenas em 48 horas de contato observou leve toxicidade em que a viabilidade celular ficou entre 80 e 90%. Nos demais tempos de contato testados, mostraram-se seguras (Figura 32), sugerindo que formulações cosméticas de uso externo, contendo até 0,025 % de acetato de etila de L. salviaefolia, podem ser consideradas seguras.
[176] Deste modo, sugere-se que a fração de acetato de etila de L. salviaefolia na concentração do CMI (2,0 mg/mL), demonstrou ser citotóxica apenas após 6 horas de contato, sendo que com 2 horas de contato atingiu uma viabilidade celular de pouco menos de 30%, atingindo segurança e viabilidade celular apenas com meia hora de contato com perfil semelhante ao controle.
[177] O presente pedido apresenta como perspectiva uma avaliação de absorção para constatação de qual concentração da L. salviaefolia entra realmente em contato com os queratinócitos viáveis. Entretanto, mesmo com a toxicidade determinada a L. salviaefolia pode ser utilizada como conservante em formulações de enxágüe, como no caso do xampu, onde a legislação permite o uso de substâncias mais agressivas. Outro possível uso para a L. salviaefolia destina-se como antimicrobiano seletivo. De acordo com a presente invenção, o CMI para a fração de acetato de etila apresenta valores dentro do que limite de segurança para S. aureus, com CMI de 0,035 - 0,005 mg/mL; para C. albicans com CMI de 0,25-0,375 mg/mL e para E. coli com CMI de 0,5 - 0,75 mg/mL.
Claims (16)
1. USO DE EXTRATOS E FRAÇÕES ATIVAS DE LIPPIA SALVIAEFOLIA CHAM., caracterizado por ser para o preparo de composições farmacêuticas e/ou cosméticas como antimicrobiano e/ou agente conservante.
2. USO DE EXTRATOS E FRAÇÕES ATIVAS DE LIPPIA SALVIAEFOLIA CHAM., de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de ser utilizado preferencialmente os extratos de acetato de etila e/ou clorofórmico para o preparo de composições.
3. USO DE EXTRATOS E FRAÇÕES ATIVAS DE LIPPIA SALVIAEFOLIA CHAM., de acordo com as reivindicações 1 a 2, caracterizado pelo fato de os extratos compreenderem frações ativas.
4. USO DE EXTRATOS E FRAÇÕES ATIVAS DE LIPPIA SALVIAEFOLIA CHAM., de acordo com as reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de as frações ativas compreenderem os ativos escolhidos entre flavonóides totais e fenóis totais, em particular, os 4’,5- dihidroxi-7-metoxi-flavonona, a naringenina, o apiflorol e/ou suas combinações.
5. USO DE EXTRATOS E FRAÇÕES ATIVAS DE LIPPIA SALVIAEFOLIA CHAM., de acordo com as reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de as frações ativas de acetato de etila e/ou clorofórmica compreenderem CMI de 0,2%.
6. COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS E/OU COSMÉTICAS, CONTENDO EXTRATOS E/OU FRAÇÕES ATIVAS DE LIPPIA SALVIAEFOLIA CHAM., conforme definidos nas reivindicações 1 a 5, caracterizadas pelo fato de compreenderem formas de apresentação como emulsões, géis, cremes, pomadas, soluções e/ou xampus.
7. COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS E/OU COSMÉTICAS, de acordo com a reivindicação 6, caracterizadas pelo fato de as formulações compreenderem, preferencialmente, cremes, géis e xampus.
8. COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS E/OU COSMÉTICAS, de acordo com as reivindicações 6 a 7, caracterizadas pelo fato de as formulações cremes compreenderem em % p/p): a) cera auto-emulsionante e/ou tensoativos e agentes de consistência 5,0-15,0; b) Emolientes 3,0-10,0; c) Umectantes 1,5-7,5; d) Extrato da fração de. Acetato de etila de L. salviaefolia 0,2; e) Agente de consistência polimérico 0,15-1,0; f) Essência e água destiladas q.s.p..
9. COMPOSIÇÃO, de acordo com as reivindicações 6 a 8, caracterizado por preferencialmente a composição creme compreender em % p/p: a) Cera auto-emulsionante não iônica 10,0; b) Óleo mineral 2,0; c) Acetato de cetila e álcool de lanolina acetilado 1,0; d) Silicone volátil 3,0; e) Sesquiestearato de metilglicose PEG-20 2,0; f) Propilenoglicol 5,0; g) Extrato da fração de acetato de etila de L. salviaefolia 0,2; h) Essência e água destilada q. s. p. 100,0.
10. COMPOSIÇÃO, de acordo com as reivindicações 6 a 8, caracterizado por preferencialmente a composição creme compreender em % p/p: a) Álcool cetoestearílico etoxilado 2,0; b) Monoestearato de glicerila 1,0; c) Acetato de cetila e álcool de lanolina acetilado 1,0; d) 2-octil-dodecanol 4,0; e) Silicone volátil 0,3; f) Sesquiestearato de metilglicose PEG-20 2,0; g) Glicerina 5,0; h) Hidroxietilcelulose 2% - p/v 20,0; i) Extrato da fração de acetato de etila de L. salviaefolia 0,2; h) Essência e água destilada q. s. p.. 100,0.
11. COMPOSIÇÃO, de acordo com as reivindicações 6 a 7, caracterizado pelo fato de preferencialmente a composição gel compreender em % p/p): a) Hidroxietilcelulose 2,0; b) Propilenoglicol 6,0; c) Álcool cetílico etoxilado e propoxilado 6,0; d) Extrato da fração de acetato de etila de L. salviaefolia 0,2; e) Essência e água destilada q. s. p. 100,0.
12. COMPOSIÇÃO, de acordo com as reivindicações 6 a 7, caracterizado pelo fato de preferencialmente a composição gel compreender em % p/p): a) Polímero carboxivinílico 0,8; b) Propilenoglicol 5,0; c) Hidróxido de sódio (solução 20%) pH 6,0 q.s.; d) Poliol de éster de ácido graxo 0,8; e) Álcool cetílico etoxilado e propoxilado 2,0; f) Extrato da fração de acetato de etila de L. salviaefolia 0,2; g) Essência 0,2; h) água destilada q. s. p. 100,0.
13. COMPOSIÇÃO, de acordo com as reivindicações 6 a 7, caracterizado pelo fato de preferencialmente a composição de xampu compreender em % p/p): a) Lauril éter sulfato de sódio 20,0; b) Lauril sulfato de trietanolamina 5,0; c) Dietanolamida de ácidos graxos de coco 3,0; d) Propilenoglicol 5,0; e) Ácido cítrico (solução 10% p/v) pH 6,0 q. s.; f) Cloreto de sódio (solução 20% p/v) 0,8; g) Extrato da fração de acetato de etila de L. salviaefolia 0,0 2; h) Essência 0,3; i) Corante 58,0; j) água destilada q. s. p. 100,0.
14. COMPOSIÇÃO, de acordo com as reivindicações 6 a 7, caracterizado pelo fato de preferencialmente a composição de xampu compreender em % p/p): a) Lauril sulfosuccinato dissódico e lauril sulfato de sódio 10,0; b) Lauril éter sulfato de sódio 5,0; c) Diestearatoglicol, tensoativo aniônico e anfótero 1,5; d) Cocoamido propil betaína 8,0; e) Fosfato 3-oleílico 0,5; f) Hidróxido de sódio pH 6,0 q.s.; g) Cloreto de sódio (solução 20% p/v) q. s.; h) Extrato da fração de acetato de etila de L. salviaefolia 0,02; i) Perfume e água destilada q.s.p. 100,0.
15. COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS E/OU COSMÉTICAS, CONTENDO EXTRATOS E/OU FRAÇÕES ATIVAS DE LIPPIA SALVIAEFOLIA CHAM., de acordo com quaisquer reivindicações 6 a 14 caracterizadas por apresentarem atividade antimicrobiana com ação sobre bactérias Gram-negativas; Gram-positivas, leveduras e/ou fungos (bolor).
16. COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS E/OU COSMÉTICAS, CONTENDO EXTRATOS E/OU FRAÇÕES ATIVAS DE LIPPIA SALVIAEFOLIA CHAM., de acordo com quaisquer reivindicações 6 a 14 caracterizadas por terem aplicações como antimicrobiano e/ou como agente conservante.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| BRPI0804288A BRPI0804288B8 (pt) | 2008-10-06 | 2008-10-06 | uso de extratos e/ou frações ativas de lippia salviaefolia cham. para preparar composições farmacêuticas e/ou cosméticas e composições contendo extratos e/ou frações ativas de lippia salviaefolia cham |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| BRPI0804288A BRPI0804288B8 (pt) | 2008-10-06 | 2008-10-06 | uso de extratos e/ou frações ativas de lippia salviaefolia cham. para preparar composições farmacêuticas e/ou cosméticas e composições contendo extratos e/ou frações ativas de lippia salviaefolia cham |
Publications (4)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| BRPI0804288A2 BRPI0804288A2 (pt) | 2010-07-13 |
| BRPI0804288A8 BRPI0804288A8 (pt) | 2017-09-26 |
| BRPI0804288B1 true BRPI0804288B1 (pt) | 2020-12-15 |
| BRPI0804288B8 BRPI0804288B8 (pt) | 2021-05-25 |
Family
ID=42320412
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| BRPI0804288A BRPI0804288B8 (pt) | 2008-10-06 | 2008-10-06 | uso de extratos e/ou frações ativas de lippia salviaefolia cham. para preparar composições farmacêuticas e/ou cosméticas e composições contendo extratos e/ou frações ativas de lippia salviaefolia cham |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| BR (1) | BRPI0804288B8 (pt) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| BRPI1005541A2 (pt) * | 2010-12-27 | 2012-03-20 | Ouro Fino Participações E Empreendimentos S/A | associação farmacêutica fitoterápica, composição farmacêutica fitoterápica, processo de preparação de composição farmacêutica fitoterápica e seus usos veterinários |
-
2008
- 2008-10-06 BR BRPI0804288A patent/BRPI0804288B8/pt active IP Right Grant
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| BRPI0804288A2 (pt) | 2010-07-13 |
| BRPI0804288A8 (pt) | 2017-09-26 |
| BRPI0804288B8 (pt) | 2021-05-25 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Ekom et al. | Antibacterial and therapeutic potentials of the Capsicum annuum extract against infected wound in a rat model with its mechanisms of antibacterial action | |
| El-Mahmood et al. | The antibacterial activity of Azadarichta indica (neem) seeds extracts against bacterial pathogens associated with eye and ear infections | |
| Nowak et al. | Rózewicka-Czaba nska | |
| Almekhlafi et al. | Antimicrobial activity of Yemeni myrrh mouthwash | |
| Buzia et al. | Stability and microbiological analysis of aloe barbadensis and chamomilla matricaria pharmaceutical forms | |
| Ugbabe et al. | Preliminary phytochemical, antimicrobial and acute toxicity studies of the stem, bark and the leaves of a cultivated Syzygium cumini Linn.(Family: Myrtaceae) in Nigeria | |
| Kuntal et al. | Formulation and evaluation of a novel herbal gel of Stevia extract | |
| Munira et al. | Crude extracts of Magnolia alba flowers using n-hexane and methanol solvents and their anti-acne potential | |
| Fahreni et al. | Examination of gel hand sanitizer from mangrove leaves and patchouli oil against Sthapylococcus aureus | |
| Doughari | Evaluation of antimicrobial potentials of stem bark extracts of Erythrina senegalensis DC | |
| Luka et al. | Phytochemical screening and in vitro evaluation of antibacterial activity of aqueous and ethanolic extracts of root and stem bark of Bridelia ferruginea. Benth.(Euphorbiaceae) | |
| BRPI0804288B1 (pt) | Uso de extratos e/ou frações ativas de lippia salviaefolia cham. para preparar composições farmacêuticas e/ou cosméticas e composições contendo extratos e/ou frações ativas de lippia salviaefolia cham | |
| Acheampong et al. | Antioxidant and antimicrobial activity of the methanol and petroleum ether extracts of the stem of Microdesmis puberula | |
| Dupra et al. | Bioactivities of purple shamrock (Oxalis triangularis) crude extract and evaluation of shamrock topical antibacterial gel | |
| Torres et al. | Evaluation of the antibacterial synergism of two plant extracts belonging to Bignoniaceae family and development of a topical formulation | |
| Mbakwem-Aniebo et al. | Effects of Ficus exasperata Vahl on common dermatophytes and causative agent of Pityriasis Versicolor in rivers state, Nigeria | |
| Namukobe et al. | Assessment of oral and dermal toxicity of selected ethno-medicinal plants used to treat bacterial skin infections in Uganda using Wistar albino rats | |
| AlSalih Al-Bakri et al. | Improvement of the Ethanol activity by using leaves extract of Artemisia herb alba against Pseudomonas aeuroginosa | |
| Suproborini et al. | Strobilanthes crispus antibacterial against Aggregatibacter actinomycetecomitans | |
| Laboddu | THE EFFECT OF CHILDREN (Ocimum sanctum) LEAF EXTRACT ON BACTERIA GROWTH Staphylococcus aureus | |
| Patidar et al. | Preparation and Development of Polyherbal Natural Hand Sanitizer | |
| Sharma et al. | Exploring Tea Tree Oil's Potential in Combatting Fungal Infections | |
| Shetty et al. | Mexican Mint (Coleus amboinicus) Emulgel: Natural Solution for Antidandruff Hair Care | |
| Pandey et al. | Evaluation of Phytochemical and In Vitro Anti-inflammatory and Antioxidant Potential of Ocimum americanum L. Leaf | |
| Ameh | Evaluation of the Phytochemical Composition and Antimicrobial Properties of Crude Methanolic Extract of leaves of ocimum gratissimum L. |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| B03A | Publication of a patent application or of a certificate of addition of invention [chapter 3.1 patent gazette] | ||
| B06F | Objections, documents and/or translations needed after an examination request according [chapter 6.6 patent gazette] | ||
| B07D | Technical examination (opinion) related to article 229 of industrial property law [chapter 7.4 patent gazette] | ||
| B15K | Others concerning applications: alteration of classification |
Ipc: A61K 36/85 (2006.01) |
|
| B07E | Notification of approval relating to section 229 industrial property law [chapter 7.5 patent gazette] | ||
| B15K | Others concerning applications: alteration of classification |
Ipc: A61K 36/85 (2006.01), A61K 8/9789 (2017.01), A61P |
|
| B07A | Application suspended after technical examination (opinion) [chapter 7.1 patent gazette] | ||
| B06G | Technical and formal requirements: other requirements [chapter 6.7 patent gazette] | ||
| B06F | Objections, documents and/or translations needed after an examination request according [chapter 6.6 patent gazette] | ||
| B06F | Objections, documents and/or translations needed after an examination request according [chapter 6.6 patent gazette] | ||
| B09A | Decision: intention to grant [chapter 9.1 patent gazette] | ||
| B16A | Patent or certificate of addition of invention granted [chapter 16.1 patent gazette] |
Free format text: PRAZO DE VALIDADE: 10 (DEZ) ANOS CONTADOS A PARTIR DE 15/12/2020, OBSERVADAS AS CONDICOES LEGAIS. |
|
| B16C | Correction of notification of the grant [chapter 16.3 patent gazette] |
Free format text: PRAZO DE VALIDADE: 20 (VINTE) ANOS CONTADOS A PARTIR DE 06/10/2008 OBSERVADAS AS CONDICOES LEGAIS. PATENTE CONCEDIDA CONFORME ADI 5.529/DF |