BRPI0805370A2 - extrato bacteriano eliciador, processo para sua extração, composição compreendendo extrato e processo de estimulação da defesa de plantas - Google Patents

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Abstract

EXTRATO BACTERIANO ELICIADOR, PROCESSO PARA SUA EXTRAçãO, COMPOSIçãO COMPREENDENDO EXTRATO E PROCESSO DE ESTIMULAçãO DA DEFESA DE PLANTAS. A invenção induz o aumento da resistência de plantas de batata, sem toxicidade aparente para o vegetal. Experimentos preliminares indicaram que o aumento do metabolismo das plantas promove de forma eficiente (acima de 60%) a redução do desenvolvimento da fitobactéria patogênica E,winia carotovora, um dos principais agentes causador de doenças em batata.

Description

nuout)3/o - 7
Relatório Descritivo de Patente de Invenção
Extrato Bacteriano Eliciador, Processo para sua Extração,Composição Compreendendo Extrato ε Processo de Estimulaçãoda Defesa de Plantas.
Campo da Invenção
A presente invenção descreve um extrato bacteriano com a capacidadede estimular o metabolismo responsável pela defesa de plantas, em especialplantas pertencentes ao gênero Solanum.
A presente invenção descreve ainda um processo para produção desteextrato e composições compreendendo tal extrato, onde tal composição éutilizada na agricultura.
Por fim a presente invenção descreve um processo de estimulação dadefesa de plantas compreendendo o uso de uma composição compreendendo oextrato bacteriano.
Antecedentes da Invenção
Cerca de 75% das perdas de produção no mundo podem ser atribuídasdiretamente a doenças (Agrios 1997). Neste contexto, aproximadamente 24%da produção de batata mundial é perdida devido a doenças causadas porbactérias, sendo que aproximadamente 40% de perdas podem ocorrer nospaíses subdesenvolvidos (Oerke, 2006). Para contornar as perdas, é práticaindispensável o uso de agroquímicos na lavoura. Contudo, cada vez mais o usodestas técnicas de controle de doenças vem sendo questionado quanto aoimpacto no ambiente e na saúde humana. A fim de superar este impasse, omelhoramento convencional tem desenvolvido cultivares mais resistentes adoenças. Entretanto, variedades resistentes a doenças bacterianas são aindararas (Yi etal., 2004).A adaptação e a resistência vegetal a doenças traduzem-se porprofundas alterações no metabolismo da célula, entre elas a síntese deproteínas e moléculas de defesa, induzidas através de mecanismos complexosde reconhecimento da presença do patógeno.
A ativação de mecanismos latentes de resistência nos vegetais, pormeio de tratamentos com agentes eliciadores representa uma alternativa parao controle de doenças agrícolas, sem o uso de substâncias com efeitos diretossobre fitopatógenos e muitas vezes tóxicos para o homem, como fungicidas,bactericidas e nematicidas. Segundo Medeiros et al., (2003), o contato entre opatógeno e célula vegetal hospedeira desencadeia reações de síntese decompostos tóxicos para o patógeno, imitando de forma rudimentar o sistemaimunológico humano e animal.
Em alguns casos, é difícil determinar se a resposta do vegetal ocorreuantes ou após o reconhecimento do patógeno. Porém, em geral, o vegetalquando atacado por microorganismos é capaz de produzir moléculas inibidoraspróximas ao local de penetração, promovendo a inibição do crescimento depatógenos.
A seleção natural e a co-evolução dos vegetais com os patógenoslevaram as plantas a selecionarem uma série de mecanismos de defesa. Nestesentido, acredita-se que a diferença entre a resistência e suscetibilidade podeser o resultado de uma variação de tempo, autonomia celular ou intensidadedas respostas de defesa das plantas (Moraes, 1998).
O reconhecimento de patógenos para a ativação de respostas de defesaem plantas não-hospedeiras, provavelmente é determinado por padrõesinvariáveis de moléculas associadas aos patógenos, que são características detodas as classes de microrganismos, levando a indução de cascatas desinalização, assemelhando-se parcialmente com aquelas que mediam aativação das respostas imunes inatas nos animais (Nürnberger e Lipka, 2005).
O termo eliciador foi utilizado originalmente para se referir as moléculase outros estímulos que induziam a síntese ou acumulação de compostosantimicrobianos (fitoalexinas) nas células da planta. Fitoalexinas constituem umgrupo heterogêneo de substâncias pós-formadas, que não contêm nitrogêniona molécula, dentre as quais, compostos isoflavonóides, furanoacetilenos outerpenóides (cíclicos ou não-cíclicos) parecem ser os mais importantes(Romeiro, 2001). Atualmente, o termo eliciador é utilizado para moléculas queestimulam algum mecanismo de defesa na planta, como o acúmulo defitoalexinas antimicrobianas, a indução da morte celular (reação dehipersensibilidade) e a síntese de proteínas que inibem as enzimas dedegradação produzidas por patógenos (Hahn, 1996). Eliciadores, geralmente,são moléculas da superfície de um microrganismo patogênico da planta, asquais, quando aplicadas em plantas hospedeiras ou não hospedeiras, induzirãosintomas de reações de resistência típicas do sistema patógeno-plantaestudado (Kortekamp e Zyprian, 2003). A localização dos receptores dohospedeiro, que reconhecem os eliciadores dos patógenos, não é em grandeparte conhecida. Estudos indicam que esses receptores existem na membranaplasmática ou exteriormente a ela, enquanto outros parecem localizar-se nomeio intracelular (Hutcheson, 1998).
Uma reação das plantas à infecção por patógenos é a indução deresistência de longa duração e amplo espectro a infecções subseqüentes. Estaresposta de resistência induzida a doenças é conhecida há muitos anos sobdiferentes nomes tais como imunidade fisiológica adquirida ou resistênciainduzida; aqui nos referiremos a ela pela sigla SAR, do inglês, (SystemicAcquired Resistance) (Ryals et al.,1994).
O fenômeno de indução de resistência sistêmica ou resistência sistêmicaadquirida foi conceituado como sendo a ativação de um estado de resistênciacontra doenças, induzido sistemicamente em plantas, pela infecção localizadapor fitopatógenos, ou em resposta a tratamentos com diferentes agentesabióticos. Entre eles, podemos citar o ácido β-aminobutírico (BABA), o ácidosalicílico (AS) e os respectivos análogos funcionais como o ácido 2,6dicloroisonicotínico (INA) e o éster S-metil do ácido benzo-(1,2,3)-tiadiazole-7-carbotióico (acibenzolar-S-metil, ASM) (Herbers et ai, 1996; Guzzo, 2004).Além disso, a SAR pode ser induzida por diferentes moléculas, comocarboidratos, glicoproteínas, proteínas e lipídeos (Ricci et ai, 1993; Hahn et al.,1996). Essas moléculas podem ser originadas de lipopolissacarídeosextracelulares de bactérias, glicoproteínas da parede celular de fungospatogênicos, carboidratos da parede celular de fungos não patogênicos eoutros (Hahn e Albershein, 1978; Koch et al., 1998; Coventry e Dubery, 2001).Neste sentido, Wulff e Pascholati (1999), realizaram a purificação parcial ecaracterização bioquímica de um eliciador glicoprotéico presente na paredecelular de Saccharomyces cereviseae, capaz de induzir a síntese defitoalexinas em mesocótilos estiolados de sorgo.
Em Solanum tuberosum, a SAR pôde ser induzida por componentes daparede celular das hifas do fungo Phytophthora infestans, como o oligopeptídeoPep-13 (Halim, 2004), ocorrendo queima oxidativa local e sistêmica. Destaforma, o tratamento local com o eliciador nos folíolos das folhas compostas daplanta, induziu queima oxidativa local, subsistêmica, isto é, em outros folíolosnão tratados das mesmas folhas, além de sistêmica (Park et ai, 1998;Vleeshouwers et al., 2000). Em tecidos distantes do sítio de inoculação defolhas de Arabidopsis com o patógeno avirulento Pseudomonas syringae, aSAR desenvolveu-se mais efetivamente nas folhas mais jovens e esta respostafoi associada com forte acúmulo do ácido salicílico (Zeier, 2005).
Vários agentes podem induzir o metabolismo de defesa do vegetal,promovendo reações de proteção duradoura contra uma ampla gama defitopatógenos. Estes agentes (produtos) representam a nova geração dedefensivos agrícolas comerciais que em geral não possuem efeito direto sobreos patógenos, e sim, promovendo o aumento da resistência do vegetal.
Desde a descoberta do indutor de resistência vegetal, o éster S-metil doácido benzo-(1,2,3)-tiadiazole-7-carbotióico (denominado de Acibenzolar-S-Metil®, ou ASM), ocorreu um grande avanço no desenvolvimento de produtosque exploram a capacidade de ativação de diferentes mecanismos de defesanas plantas. O produto comercial Acibenzolar-S-Metil (ASM), com nomecomercial de Actigard® (Europa) ou Bion® (Brasil), produzidos pela empresaNovartis, foi registrado no Brasil para ser utilizado nas culturas de tomate, citrose cacau. O ASM parece agir induzindo a síntese de uma molécula fitoalexina (acumarina) e um rápido acúmulo de compostos fenólicos em plantas de cevada,reduzindo a penetração de fungos na folha. Da mesma forma, a aplicação deASM em trigo induziu a síntese de proteínas de resistência (PR proteínas) novegetal.
O Messenger®, produzido pela empresa Eden Bioscience1 representaum produto comercial onde o ingrediente ativo é uma proteína denominada deharpina, a qual foi isolada e purificada da bactéria Erwinia amyiovora eproduzida artificialmente, para fins comerciais, em Escherichia coii. Essaproteína possui peso de 44 kDa e apresenta alta estabilidade em altastemperaturas, estando naturalmente associada a parede da bactéria. Após aaspersão do Messenger®, a proteína harpina se liga ao receptor da célulavegetal e desencadeia respostas de defesa cerca de 5 a 10 minutos após aaplicação, sendo que a resposta de defesa se completa de três a cinco dias(Eden Bioscience, 2002). O produto não é tóxico para animais e é rapidamentedegradado pela ação da radiação solar ou pela ação de organismosdecompositores tanto na superfície da planta quanto no solo.
O Milsana®, produzido pela KHH BioSci Inc, a base de extrato foliar daplanta Reynoutria sachaiinensis (giant knotweed- Polygonaceae). O materialvegetal seco e moído (5g) é misturado com etanol (100 ml) e aspergido nasplantas. Foi registrado como bio-pesticida nos EUA em 2000, sendo utilizadoem plantas ornamentais (casa de vegetação), promovendo a proteção contraOidio spp. e o mofo cinzento Botrytis cinerea. Este extrato vegetal induz oacúmulo de proteínas-PR e de fitoalexinas, levando ao aumento da defesa daplanta.
Plantas de pepino (Cucumis sativus) tratadas com Milsana®aumentaram sua resistência contra Sphareotheca fuiiginea, promovendo oaumento no vegetal de vias de defesa endógenas como a elevação naatividade das peroxidases, P-1,3-glucanases, além da produção de compostosfenólicos glicosilados, que apresentam toxicidade contra microrganismos(Daayf et al., 1995). Este composto apresenta seus efeitos variáveis edependentes da cultivar a ser protegida. Contudo, esta formulação nãoapresenta toxicidade a animais e pode promover resultados de proteçãosemelhantes aos obtidos quando se utiliza fungicida convencional.
Oxycom®, produzido pela empresa Redox Chemicals, é umacombinação de um indutor (ácido peracético) da produção de espécies reativasoxigênio (Hammerschimidt et al., 2001) e de um mix de nutrientes. Emespécies de feijoeiro, este produto induz a expressão de genes relacionados adefesa, codificando proteínas envolvidas no metabolismo de fenólicos e noespessamento (reforço) da parede celular, bem como de peroxidases e deproteínas extensinas em fumo (Anderson et al., 2001).
Neemazal®, produzido pela empresa EID-Parry, é um produto obtido apartir de extratos da planta Nim (,Azadirachta indica), que tem sidocomercializado como inseticida. O ingrediente ativo do extrato é um triterpenopresente a uma concentração de 5% no produto comercial.
Ecolife 40®, produzido pela empresa Quinabra1 apresenta na suaformulação bioflavonóides cítricos (vitamina P), ácido ascórbico (vitamina C),ácido lático e ácido cítrico, obtidos industrialmente pela fermentação e/ouextração de substratos orgânicos derivados de plantas cítricas, além depolifenóis e fitoalexinas. O produto apresenta mecanismos de ação variados,dos quais a indução de resistência via o aumento da síntese de fitoalexinas,parece ser um dos mais importantes (Motoyama, 2001). O produto apresentaeficiência em alguns patossistemas. Jayme et al. (1999) e Castro et al. (1999),destacam a eficiência do produto no controle do oídio e ferrugem em feijoeiro.Da mesma forma, Gasparotto et al. (2000), demonstrou que este produto foieficiente no controle da doença Sigatoka negra (Mycosphaereiia fijiensis),apresentando níveis de proteção semelhantes aos obtidos com o fungicidatebuconazola, com a vantagem de não apresentar resíduos nos frutos(Sanhueza, 2002).
Elexa®, o produto apresenta como ingrediente ativo uma molécula decarboidrato derivada de quitina. Nos EUA existem três produtos contendoquitina: Elexa® (0,95% de quitosana); Hygra Yield Enhancing Seed TreatingAgent (2,5% de quitosana) e Yea Poly-D-Glucosamine Solution (2,5% dequitosana). A quitosana é um polissacarídeo que ocorre principalmente emanimais do filo Arthropoda e seu mecanismo de ação no vegetal é semelhanteao observado quando um fungo ataca uma planta. Ocorre a percepção dopatógeno pelo reconhecimento de monômeros de quitina, levando a reaçõesbioquímicas que culminam com a expressão da Resistência SistêmicaAdquirida (SAR). Este produto é pulverizado em plantações de morango,tomate a maçã, promovendo o aumento da resistência das plantas.
Oryzemate®, produzido pela BioSafe1 é utilizado principalmente emlavouras de arroz como agente fungicida. Contudo, foi demonstrado que esteproduto não possui ação direta sobre os patógenos do arroz, e sim, promove oaumento da resistência das plantas contra micorganismos. Este produto possuina sua formulação o 2-sulfamoilbenzoato, a sacarina e o Ν-β-D-glucopiranosilsacarina. Este mix de moléculas induz a expressão da proteínade defesa PRR1, promovendo a resistência contra o patógeno Pyriculariaoryzae.
O extrato da cultura bacteriana poderia ser utilizado como biopesticida.Segundo definição adotada pela United States Environmentai ProtectionAgency (EPA), biopesticidas são certos tipos de pesticidas derivados demateriais naturais como animais, bactérias e certos minerais(http://www.epa.gov/pesticides/biopesticides). Embora a EPA apresenteatualmente uma numerosa lista de produtos registrados como biopesticidas,incluindo aqueles que induzem a resistência sistêmica em vegetais, muitosoutros produtos que promovem a resistência vegetal não são registrados comobiopesticida devido ao elevado custo no registro de um produto como pesticida(Anderson et al., 2006).
A literatura patentária possui diversos documentos relacionados acomposições eliciadoras, onde os mais relevantes para a presente invençãoestão descritos abaixo.
O documento Pl 0402152-5 consiste no controle biológico de levedurase fungos filamentosos em alimentos estocados ou no campo através doprocesso de predação realizado por leveduras do gênero Saccharomycopsis. Odocumento Pl 0402152-5 utiliza leveduras vivas exóticas provenientes doCanadá e inoculadas diretamente sobre as plantas ou partes delas que devemser preservadas da ação de microrganismos degradadores ou produtores detoxinas.
O documento US 5,968,504 utiliza o fungo Gliocladium catenulatumcomo biocontrole através do mecanismo de competição e inibição docrescimento de fungos patogênicos.
A presente invenção difere dos documentos citados, pois promove oaumento do metabolismo de defesa da planta, sem interagir diretamente comos microrganismos degradadores ou causadores de doenças nos vegetais.
Desta forma, a presente invenção não depende da existência de interaçõesecológicas de antagonismo como competição, parasitismo e produção deantibióticos, bem como não apresenta o risco da colonização oportunista deanimais e humanos.
O documento Pl 0418380-0A consiste no uso de uma mistura compostade bioextratos que aspergidos sobre as plantas promovem a indução deresistência nos vegetais contra o ataque de Xanthomonas fitopatogênicos. Oproduto consiste de misturas de extratos de Xanthomonas spp. não-fitopatogênicas, Trichoderma harzianum e da planta Yueea sehidigera. Oproduto promove indução do sistema de defesa natural dos vegetais contrauma variedade de Xanthomonas spp. e suas variações.
A presente invenção difere deste documento por promover resistência aum patógeno não relacionado com a bactéria que originou o extrato. A presenteinvenção consiste do extrato contendo Xanthomonas axonopodis patovar citrique, preferencialmente aspergido em plantas, plântulas e sementes, tais comoem Solanum tuberosum, induz a defesa natural do vegetal contra bactérias efungos patogênicos, preferencialmente as bactérias Erwinia earotovora e ofungo Alternaria solaniem plantas da família Solanaceae.O documento US 6,242,420 refere-se ao uso de uma proteína (pesomolecular de 18 kDa) extraída e purificada de culturas do fungo Trichodermavirense aplicada na forma de solução em plantas, plântulas e sementes.
A presente invenção difere deste documento, pois utiliza extrato deXanthomonas axonopodis patovar citri contendo tanto estruturas derivadas daparede celular quanto componentes citoplasmáticos.
Portanto, pode-se ver que o estado da técnica não descreve nem sequersugere os objetos da presente invenção, de forma que a mesma atende aosrequisitos de patenteabilidade.
Sumário da invenção
Em um primeiro aspecto a presente invenção proporciona um extratobacteriano capaz de promover e/ou estimular as defesas naturais de plantasfrente a patógenos.
É um objeto da presente invenção um extrato compreendendofragmentos de membrana plasmática, parede celular e proteínascitoplasmáticas obtido de uma bactéria pertencente ao gênero Xanthomonas.
É um adicional objeto da invenção uma composição compreendendo:
a) Um extrato compreendendo fragmentos de membrana plasmática,parede celular e proteínas citoplasmáticas obtido de uma bactériapertencente ao gênero Xanthomonas, e
b) Um veículo aceitável.
Em especial, a composição é aplicada a plantas de interesse agrícola,como a batata, e o veículo pode ser o mesmo meio para diluição do extrato.
Em um segundo aspecto, a presente invenção proporciona um processode produção do extrato a partir do cultivo e Iise de bactérias.
É um adicional objeto da presente invenção um processocompreendendo as etapas de:
a) Cultivo de bactérias pertencentes ao gênero Xanthomonas em meiolíquidob) Lise das bactérias cultivadas, produzindo fragmentos de membranaplasmática, parede celular e proteínas citoplasmáticas; e
c) Diluição do extrato;
Em um terceiro aspecto a presente invenção descreve um processo paraestimulação das defesas de uma planta compreendendo a etapa de administrara uma planta necessitando de estímulo para produção de defesas umacomposição compreendendo:
a) Um extrato compreendendo fragmentos de membrana plasmática,parede celular e proteínas citoplasmáticas obtido de uma bactériapertencente ao gênero Xanthomonas, e
b) Um veículo aceitável.
Estes e outros objetos da invenção serão detalhados na descrição aseguir.
Descrição das figuras
A Figura 1 ilustra folhas de S. tuberosum analisadas após múltiplasinoculações com suspensões de bactérias (48 e 96 hpi - horas pós-inoculação). O gráfico A mostra os compostos fenólicos e B o conteúdo deflavonóides. Letras diferentes indicam diferenças significativas (ANOVA, Turkeyp^0,05. Experimentos independentes foram realizados em triplicata comresultados similares; 1 - folhas intactas; 2 - água; 3 - X. axonopodis, 4 -Ecarotovora.
A Figura 2 mostra a atividade da polifenol oxidase em folhas de S.tuberosum analisadas após inoculação com suspensões de bactérias (48 e 96hpi - horas pós-inoculação). Letras diferentes indicam diferenças significativas(ANOVA, Turkey p^0,05. Experimentos independentes foram realizados novevezes com resultados similares; 1 - folhas intactas; 2 - água; 3 - X.axonopodis, 4 - E carotovora.
A Figura 3 mostra a porcentagem de morte de plantas de batataaspergidas com extratos de Xanthomonas axonopodis autoclavados ouaspergidas com água (Controle). Após a aspersão, todas as plantas foraminoculadas com o patógeno Erwinia carotovora. Controle(n); Extrato (■)
A Figura 4 mostra a porcentagem de folhas de plantas de batataapresentando sintomas de doença causada pela fitobactéria Erwiniacarotovora. As plantas foram previamente aspergidas uma única vez comextrato de Xanthomonas axonopodis autoclavado, com o indutor de resistênciaBion® ou aspergidas com água (controle). Após a aspersão todas as plantasforam inoculadas com o patógeno Erwinia carotovora. A análise dos resultadosfoi realizada 72 dias após a inoculação com o patógeno.
Descrição detalhada da invenção
Os exemplos aqui mostrados têm o objetivo apenas de exemplificar umadas possíveis realizações da invenção, sem, contudo limitá-la, de forma querealizações similares estão dentro do escopo da invenção.
A vantagem do extrato de bactérias da presente invenção é anecessidade de um número baixo de aplicações nas plantas (somente uma),promovendo uma elevada taxa de imunização por cerca de 60 dias. Outravantagem é a utilização de um indutor biótico (Xanthomonas) proveniente doambiente natural, sendo empregado na indução de resistência em plantas deSoianum adaptadas às condições brasileiras. Esta proximidade entre o indutor eo vegetal aumenta as chances de uma melhor eficiência na imunização.
Neste contexto, a presente invenção serve para aumentar a resistêncianas batatas a bactérias e fungos, reduzindo os níveis de agrotóxicosempregados para o controle das doenças causadas por estes microrganismos.
As bactérias capazes de originar o extrato preferidas pela presenteinvenção são escolhidas do gênero Xanthomonas. Exemplos de espéciespreferidas incluem, sem limitações, a espécie Xanthomonas axonopodis pv.citri, que são bactérias de solo que causam doenças em plantas de rúcula ecitrus (cancro cítrico). O agente utilizado no preparo do produto épreferencialmente Xanthomonas axonopodis, podendo ser qualquer outromicrorganismo patogênico ou não.Sinônimos das bactérias estão listados a seguir: Pseudomonas citriHasse1 Xanthomonas citri (Hasse) Dowson, Xanthomonas citri f.sp.aurantifoiiae Namekata & Oliveira, Xanthomonas campestris pv. Citri (Hasse)Dye 1978, Xanthomonas campestris pv. Aurantifotii Gabriel et ai., Xanthomonascitri (ex Hasse) nom. rev. Gabriel et ai., Xanthomonas axonopodis pv.Aurantifoiii Vauterin et ai.
Culturas de X. axonopodis pv. citri podem ser obtidas a partir de plantascítricas contaminadas e apresentando sintomas de doença (cancro cítrico),caracterizada pela formação de pequenas pústulas circulares de coloraçãomarrom e oleosas na superfície abaxial das folhas infectadas. O isolamento emplaca permite observar claramente a coloração amarelo-alaranjada dascolônias, típicas do gênero. Este isolamento pode ser realizado em meio Ágarnutritivo segundo a técnica descrita por Meneguim et al., 2007.
Utilizaram-se culturas da bactéria X. axonopodis pv. citri para produzirextratos aquosos. Os extratos desta bactéria foram empregados nosexperimentos na forma bruta, sem a utilização de nenhum método ou processode purificação.
As plantas que receberão os extratos são plantas cultiváveis comumenteencontradas na agricultura. Exemplos de tais plantas incluem as plantaspertencentes à família Solanaceae, em especial pertencente ao gêneroSolanum. A espécie preferida é a Soianum tuberosum.
O extrato é eficaz a bactérias e/ou fungos reconhecidamentepatogênicas para as plantas cultiváveis. Exemplos de tais bactérias e/ou fungosincluem, sem limitações, Erwinia carotovora subsp. carotovora que sãobactérias de solo, amplamente distribuídas no meio ambiente, que causamdoenças em uma ampla variedade de plantas olerícolas, sendo a batata a maisafetada por este patógeno. Esta bactéria causa a podridão-mole ou podridão-da-haste, afetando tanto as plantas a campo quanto na fase de pós-colheita eno armazenamento dos tubérculos. A Erwinia carotovora pertencem a um táxoncomplexo, consistindo de linhagens com ampla variação fenotípica, bioquímica,genética e com diversos hospedeiros.Processo de Extração
O processo de extração compreende as etapas de:
a) Cultivo de bactérias pertencentes ao gênero Xanthomonas em meiolíquido
b) Lise das bactérias cultivadas, produzindo fragmentos de membranaplasmática, parede celular e proteínas citoplasmáticas; e
c) Diluição do extrato;
Em uma realização preferencial, o processo consiste de todas asseguintes etapas:
1. Seleção da bactéria Xanthomonas sp,
2. Cultura da bactéria Xanthomonas sp, preferencialmente Xanthomonasaxonopodis ρ ν. citrie m meio líquido;
3. Retirada das bactérias do meio de cultura, preferencialmente porcentrifugação;
4. Ressuspensão das bactérias e ajuste da densidade óptica da soluçãobacteriana (DC>6oo=1,0 Abs);
5. Lise das bactérias utilizando meios físicos e químicos,preferencialmente utilizando autoclavagem a 121 0C por 20 min;
6. Diluição do extrato (5 mL do extrato/L) - o solvente pode ser água,solventes orgânicos como etanol, metanol, inorgânicos e combinações dosmesmos;
7. Aspersão das folhas das plantas a serem protegidas (10 mL/planta).
A composição compreendendo o extrato é uma composição com utilidadeagrícola, e compreende:
a) Um extrato compreendendo fragmentos de membrana plasmática,parede celular e proteínas citoplasmáticas obtido de uma bactériapertencente ao gênero Xanthomonas, e
b) Um veículo aceitável.
O veículo aceitável é qualquer veículo que permita a distribuição dacomposição. Além disso, a composição pode estar na forma líquida ou sólida. Oveículo pode ainda ser o meio de diluição do extrato.O produto desenvolvido consiste em extrato da bactéria Xanthomonasaxonopodis patovar citri preparado preferencialmente em água, podendo ser emoutros solventes inorgânicos ou orgânicos. A concentração do extrato podevariar de 0,1 a 1,5 Abs em 600nm. O extrato consiste de fragmentos de paredecelular e componentes citoplasmáticos da bactéria. O extrato é preparadopreferencialmente utilizando-se ultra-som e 3 ciclos de 24h de congelamento-descongelamento (-20C), podendo-se utilizar outros meios físicos ou químicospara promover a Iise bacteriana e obter o extrato.
O produto desenvolvido apresenta a concentração de 5 ml_ do extratobruto preparado em meio líquido. São utilizados 10 mL do produto em cadaplanta, utilizando preferencialmente o método de pulverização, podendo serempregado na forma de pó ou qualquer outra forma, diretamente sobre ovegetal ou nas raízes. Pode ser utilizado na forma puro ou em combinação comfungicidas ou outros agentes bióticos e abióticos que potencializem a induçãodo metabolismo relacionado a defesa. Sua utilização pode também ocorrerjunto com agentes surfactantes ou que promovam a aderência no vegetal.
Exemplo 1
As bactérias Erwinia carotovora subsp. carotovora foram utilizadas comodesafiantes em testes de resistência das plantas de batata após a aplicação doproduto indutor de resistência.
Utilizaram-se plantas envasadas de S. tuberosum com sete semanas deidade, mantidas em casa de vegetação. Suspensões bacterianas comXanthomonas axonopodis pv. citri e Erwinia carotovora subsp. carotovoraforam preparadas com H2O (Abs 0,3-0,4 a 600 nm). As inoculações de folhasbasais, intermediárias e apicais dos ramos foram realizadas com seringa semagulha na face abaxial do folíolo terminal.
O tempo entre a aplicação do produto indutor do metabolismo deresistência vegetal e o desafio com o patógeno foi de 5 dias. Foi realizadasomente uma aplicação nos vegetais.Retiraram-se amostras de diversas folhas (0,5g cada) das plantas dostratamentos e procedeu-se a extração macerando-se as amostras em metanol80% e utilizado para quantificação de compostos fenólicos (técnica de Folin-Ciocaulteau) e de flavonóides (nitrato de alumínio e acetato de potássio).
A determinação das atividades enzimáticas foi realizada em extratosobtidos pela maceração de folhas em tampão fosfato gelado. Para asatividades das enzimas PPO1 avaliou-se a diferença de absorbância emtampão com o substrato ácido clorogênico. Resultados foram submetidos àanálise de variância one-way (p^0,05) e ao teste de Tukey.
Após a inoculação das bactérias X. axonopodis e E. carotovora,procedeu-se a observação das plantas quanto ao desenvolvimento de sintomasde doença, e a retirada de amostras das folhas visando avaliar os níveis demarcadores do metabolismo secundário de defesa vegetal (compostosfenólicos, flavonóides, atividade enzimática das polifenoloxidases e dasperoxidases).
Pode-se observar a formação de uma resposta de defesa nas regiões dafolha inoculada com esta bactéria. Este fato indicou que as plantas de batatapossuem a capacidade de reconhecer a presença de X. axonopodis, induzindouma resposta de defesa que impede o desenvolvimento desta bactéria emseus tecidos. A inoculação de culturas de Erwinia carotovora nas folhas debatata levou ao desenvolvimento de sintomas de doença e a posterior mortedas plantas. Este resultado indica que esta espécie vegetal não possuimecanismos de defesa contra o ataque da fitobactéria patogênica. Estaincapacidade de defesa da planta deve-se a inexistência/baixa sensibilidade dereceptores específicos nas células que possibilitam o reconhecimento dafitobactéria.
As plantas inoculadas com E. carotovora não apresentaram respostasbioquímicas de defesa, como o aumento nos níveis de compostos fenólicos(Figura 1A). Contudo, a presença de X. axonopodis promoveu um intensoaumento nos compostos relacionados a defesa vegetal, indicando a indução deuma resposta de defesa. Da mesma forma, os níveis de flavonóides nas folhasda batateira apresentaram um aumento intenso e estável quando inoculadascom X. axonopodis (Figura 1B). Tanto o aumento nos níveis de compostosfenólicos quanto de flavonóides representam mecanismos de defesa do vegetalcontra o ataque de microrganismos.
Quando se analisa a atividade de enzimas relacionadas ao mecanismode defesa vegetal, observa-se que X. axonopodis promove um aumentosignificativo das atividades (Figura 2). Dentre as bactérias utilizadas nosexperimentos, observou-se que X. axonopodis promoveu o aumento defenólicos e de flavonóides e o aumento das atividades das PPOs. Osresultados indicam que esta fitobactéria atua como indutora do metabolismorelacionado a defesa nesta cultivar de batata.
Os resultados indicam que X. axonopodis induz um eficiente aumento nometabolismo relacionado a defesa vegetal.
Exemplo 2
A fim de avaliar a eficiência de extratos de Xanthomonas axonopodis noaumento da resistência de plantas de batata contra fitobactérias patogênicas,procedeu-se a aplicação de extratos autoclavados de X. axonopodis eposteriormente a inoculação com bactérias patogênicas.
Foram utilizadas plantas de batata com aproximadamente 12 semanasde idade. Suspensões bacterianas com Xanthomonas axonopodis pv. citriforam preparadas com H2O (Abs 0,3-0,4 a 600 nm). As suspensõesbacterianas foram autoclavadas por 20min a 120 0C e 1 atm. As plantas foramaspergidas somente uma vez com suspensões autoclavadas de bactéria X.axonopodis ou aspergidas com água destilada estéril.
Após cinco dias da aspersão, procedeu-se a inoculação de todas asplantas com uma cultura de Erwinia carotovora, fitobactéria patogênica deplantas de batata. Esta inoculação seguiu a mesma metodologia da utilizadaanteriormente, sendo as folhas inoculadas com o auxílio de uma seringa semagulha.Neste experimento foi observado que a exposição prévia das plantas aoextrato autoclavado com Xanthomonas axonopodis promoveu uma redução de60% na morte após 78 dias da inoculação com a fitobactéria patogênicaErwinia carotovora, aplicada diretamente nas folhas (Figura 3).
Os tratamentos controle (aspergidas com água) apresentaram 75% demorte após 78 dias da inoculação com E. carotovora.
Estes resultados deixam claro o efeito protetor que as culturas de X.axonopodis possuem na redução de ataques posteriores de fitobactérias e,possivelmente, de outros microrganismos patogênicos, evidenciado noretardamento da mortalidade e também na taxa de mortalidade das plantas.Neste experimento procedeu-se somente uma aplicação do extrato de X.axonopodis, podendo-se aumentar o número de aplicações visando elevarainda mais o nível de proteção das plantas.
A eficiência de extratos autoclavados de X. axonopodis foi comparadacom o produto comercial Bion® 500 WG (empresa Syngenta Proteção deCultivos Ltda.), utilizado como indutor de resistência em batata (Classe:Ativador de Plantas), a fim de avaliar a porcentagem de proteção induzida.Para tanto, procedeu-se a aplicação de extratos autoclavados de X.axonopodis, solução de Bion® (concentração de 0,0005g/planta) ou água(controle), e posteriormente a inoculação com bactéria patogênica Erwiniacarotovora. Procedeu-se somente uma aspersão com os indutores deresistência ou água.
Quando se compara o efeito de imunização do extrato deXanthomonas com o efeito de proteção promovido pelo produto comercialBion®, pode-se verificar que o extrato de bactéria foi significativamente superioraos demais tratamentos (Figura 4).
Estes resultados revelam uma elevada eficiência dos extratos deXanthomonas na indução do aumento da resistência em batata. O mecanismoou a via exata desta resposta não é conhecido, mas deve envolver aestimulação das vias de defesa do vegetal, podendo também abranger a rotade síntese de compostos fenólicos. Esta elevada eficiência pode também estarrelacionada ao uso de extrato complexo ao invés de uma molécula única comoo acibenzolar-S-metil (Bion®) possibilitando a ativação concomitante devariadas vias de resposta nas plantas.

Claims (23)

Extrato Bacteriano Eliciador, Processo para sua Extração,Composição Compreendendo Extrato ε Processo de Estimulaçãoda Defesa de Plantas
1. Extrato bacteriano eliciador caracterizado por compreenderfragmentos de membrana plasmática, parede celular e proteínascitoplasmáticas obtido de uma bactéria pertencente ao gênero Xanthomonas.
2. Extrato bacteriano, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopela bactéria ser escolhida do grupo que compreende Xanthomonas citri,Xanthomonas campestris, Xanthomonas axonopodis e combinações dasmesmas.
3. Processo de produção de extrato bacteriano caracterizado porcompreender as etapas de:a) Cultivo de bactérias pertencentes ao gênero Xanthomonas,b) Lise das bactérias cultivadas, produzindo fragmentos de membranaplasmática, parede celular e proteínas citoplasmáticas; ec) Diluição do extrato;
4. Processo, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelabactéria ser escolhida do grupo que compreende Xanthomonas citri\Xanthomonas campestris, Xanthomonas axonopodis e combinações dasmesmas.
5. Processo, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado porcompreender uma etapa preliminar de seleção das bactérias.
6. Processo, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo cultivodas bactérias ser em meio líquido.
7. Processo, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado porcompreender uma etapa de separação das bactérias do meio líquido.
8. Processo, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelaseparação ser por meio de centrifugação.
9. Processo, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pela lise serocasionada por meios físicos e/ou químicos.
10. Processo, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pela liseser realizada por meio de autoclavagem.
11. Processo, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelosolvente diluidor ser escolhido do grupo que compreende água, etanol, metanole combinações dos mesmos.
12. Processo, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelaconcentração final do extrato variar de 0,1 a 1,5 Abs em 600nm.
13. Composição compreendendo extrato bacteriano caracterizado porcompreender:a) Um extrato compreendendo fragmentos de membrana plasmática,parede celular e proteínas citoplasmáticas obtido de uma bactériapertencente ao gênero Xanthomonas, eb) Um veículo aceitável.
14. Composição, de acordo com a reivindicação 13, caracterizada pelabactéria ser escolhida do grupo que compreende Xanthomonas citn;Xanthomonas campestris, Xanthomonas axonopodis e combinações dasmesmas.
15. Composição, de acordo com a reivindicação 13, caracterizada porestar na forma sólida ou líquida.
16. Composição, de acordo com a reivindicação 15, caracterizada peloveículo da forma líquida ser o meio de cultivo.
17. Composição, de acordo com a reivindicação 13, caracterizada porser pulverizada sobre uma planta.
18. Composição, de acordo com a reivindicação 17, caracterizada pelaplanta ser pertencente à família Solanaceae.
19. Composição, de acordo com a reivindicação 18, caracterizada pelaplanta ser Solanum tuberosum.
20. Composição, de acordo com a reivindicação 13, caracterizada porcompreender adicionalmente agentes que promovam aderência da composiçãoà planta.
21. Processo de estimulação da defesa de plantas caracterizado porcompreender a administração de uma composição compreendendo um extratobacteriano eliciador compreendendo fragmentos de membrana plasmática,parede celular e proteínas citoplasmáticas obtido de uma bactéria pertencenteao gênero Xanthomonas a uma planta.
22. Processo, de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelaplanta ser ser Solanum tuberosum.
23. Processo, de acordo com a reivindicação 21, caracterizado peloextrato ser aplicado a folhas e/ou raízes da planta.
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