BRPI0805370B1 - Process of production of bacterial extract, composition composing composition of bacterial extract and process of stimulation of plant defense - Google Patents

Abstract

extrato bacteriano eliciador, processo para sua extração, composição compreendendo extrato e processo de estimulação da defesa de plantas. a invenção induz o aumento da resistência de plantas de batata, sem toxicidade aparente para o vegetal. experimentos preliminares indicaram que o aumento do metabolismo das plantas promove de forma eficiente (acima de 60%) a redução do desenvolvimento da fitobactéria patogênica e,winia carotovora, um dos principais agentes causador de doenças em batata.

Description

Relatório Descritivo de Patente de Invenção Processo de Produção de Extrato Bacteriano, Composição Compreendendo Extrato Bacteriano e Processo de Estimulação da Defesa de Plantas.

Campo da Invenção A presente invenção descreve um extrato bacteriano com a capacidade de estimular o metabolismo responsável pela defesa de plantas, em especial plantas pertencentes ao gênero Solanum. A presente invenção descreve ainda um processo para produção deste extrato e composições compreendendo tal extrato, onde tal composição é utilizada na agricultura.

Por fim a presente invenção descreve um processo de estimulação da defesa de plantas compreendendo o uso de uma composição compreendendo o extrato bacteriano.

Antecedentes da Invenção Cerca de 75% das perdas de produção no mundo podem ser atribuídas direta mente a doenças (Ag ri os 1997). Neste contexto, aproximadamente 24% da produção de batata mundial é perdida devido a doenças causadas por bactérias, sendo que aproximadamente 40% de perdas podem ocorrer nos países subdesenvolvidos (Oerke, 2006). Para contornar as perdas, é prática indispensável o uso de agroquímicos na lavoura. Contudo, cada vez mais o uso destas técnicas de controle de doenças vem sendo questionado quanto ao impacto no ambiente e na saúde humana. A fim de superar este impasse, o melhoramento convencional tem desenvolvido cultivares mais resistentes a doenças. Entretanto, variedades resistentes a doenças bactéria nas são ainda raras (Yi et al., 2004). A adaptação e a resistência vegetal a doenças traduzem-se por profundas alterações no metabolismo da célula, entre elas a síntese de proteínas e moléculas de defesa, induzidas através de mecanismos complexos de reconhecimento da presença do patógeno. A ativação de mecanismos latentes de resistência nos vegetais, por meio de tratamentos com agentes eliciadores representa uma alternativa para o controle de doenças agrícolas, sem o uso de substâncias com efeitos diretos sobre fitopatógenos e muitas vezes tóxicos para o homem, como fungicidas, bactericidas e nematicidas. Segundo Medeiros et al., (2003), o contato entre o patógeno e célula vegetal hospedeira desencadeia reações de síntese de compostos tóxicos para o patógeno, imitando de forma rudimentar o sistema imunológico humano e animal.

Em alguns casos, é difícil determinar se a resposta do vegetal ocorreu antes ou após o reconhecimento do patógeno. Porém, em geral, o vegetal quando atacado por microorganismos é capaz de produzir moléculas inibidoras próximas ao local de penetração, promovendo a inibição do crescimento de patógenos. A seleção natural e a co-evolução dos vegetais com os patógenos levaram as plantas a selecionarem uma série de mecanismos de defesa. Neste sentido, acredita-se que a diferença entre a resistência e suscetibilidade pode ser o resultado de uma variação de tempo, autonomia celular ou intensidade das respostas de defesa das plantas (Moraes, 1998). O reconhecimento de patógenos para a ativação de respostas de defesa em plantas não-hospedeiras, provavelmente é determinado por padrões invariáveis de moléculas associadas aos patógenos, que são características de todas as classes de microrganismos, levando a indução de cascatas de sinalização, assemelhando-se parcialmente com aquelas que mediam a ativação das respostas imunes inatas nos animais (Nümberger e Lipka, 2005). O termo eliciador foi utilizado originalmente para se referir as moléculas e outros estímulos que induziam a síntese ou acumulação de compostos antimicrobianos (fitoalexinas) nas células da planta. Fitoalexinas constituem um grupo heterogêneo de substâncias pós-formadas, que não contêm nitrogênio na molécula, dentre as quais, compostos isoflavonóides, furanoacetilenos ou terpenóides (cíclicos ou não-cíclicos) parecem ser os mais importantes (Romeiro, 2001). Atualmente, o termo eliciador é utilizado para moléculas que estimulam algum mecanismo de defesa na planta, como o acúmulo de fitoalexinas antimicrobianas, a indução da morte celular (reação de hipersensibilidade) e a síntese de proteínas que inibem as enzimas de degradação produzidas por patógenos (Hahn, 1996). Eliciadores, geralmente, são moléculas da superfície de um microrganismo patogênico da planta, as quais, quando aplicadas em plantas hospedeiras ou não hospedeiras, induzirão sintomas de reações de resistência típicas do sistema patógeno-planta estudado (Kortekamp e Zyprian, 2003). A localização dos receptores do hospedeiro, que reconhecem os eliciadores dos patógenos, não é em grande parte conhecida. Estudos indicam que esses receptores existem na membrana plasmática ou exteriormente a ela, enquanto outros parecem localizar-se no meio intracelular (Hutcheson, 1998).

Uma reação das plantas à infecção por patógenos é a indução de resistência de longa duração e amplo espectro a infecções subseqüentes. Esta resposta de resistência induzida a doenças é conhecida há muitos anos sob diferentes nomes tais como imunidade fisiológica adquirida ou resistência induzida; aqui nos referiremos a ela pela sigla SAR, do inglês, (Systemic Acquired Resistance) (Ryals et al.,1994). O fenômeno de indução de resistência sistêmica ou resistência sistêmica adquirida foi conceituado como sendo a ativação de um estado de resistência contra doenças, induzido sistemicamente em plantas, pela infecção localizada por fitopatógenos, ou em resposta a tratamentos com diferentes agentes abióticos. Entre eles, podemos citar o ácido β-aminobutírico (BABA), o ácido salicílico (AS) e os respectivos análogos funcionais como o ácido 2,6 dicloroisonicotínico (INA) e o éster S-metil do ácido benzo-(1,2,3)-tiadiazole-7-carbotióico (acibenzolar-S-metil, ASM) (Herbers et al., 1996; Guzzo, 2004). Além disso, a SAR pode ser induzida por diferentes moléculas, como carboidratos, glicoproteínas, proteínas e lipídeos (Ricci et ai, 1993; Hahn et al., 1996). Essas moléculas podem ser originadas de lipopolissacarídeos extracelulares de bactérias, glicoproteínas da parede celular de fungos patogênicos, carboidratos da parede celular de fungos não patogênicos e outros (Hahn e Albershein, 1978; Koch et al., 1998; Coventry e Dubery, 2001). Neste sentido, Wulff e Pascholati (1999), realizaram a purificação parcial e caracterização bioquímica de um eliciador glicoprotéico presente na parede celular de Saccharomyces cereviseae, capaz de induzir a síntese de fitoalexinas em mesocótilos estiolados de sorgo.

Em Solanum tuberosum, a SAR pôde ser induzida por componentes da parede celular das hifas do fungo Phytophthora infestans, como o oligopeptídeo Pep-13 (Halim, 2004), ocorrendo queima oxidativa local e sistêmica. Desta forma, o tratamento local com o eliciador nos folíolos das folhas compostas da planta, induziu queima oxidativa local, subsistêmica, isto é, em outros folíolos não tratados das mesmas folhas, além de sistêmica (Park et al., 1998; Vleeshouwers et al., 2000). Em tecidos distantes do sítio de inoculação de folhas de Arabidopsis com o patógeno avirulento Pseudomonas syringae, a SAR desenvolveu-se mais efetivamente nas folhas mais jovens e esta resposta foi associada com forte acúmulo do ácido salicílico (Zeier, 2005). Vários agentes podem induzir o metabolismo de defesa do vegetal, promovendo reações de proteção duradoura contra uma ampla gama de fitopatógenos. Estes agentes (produtos) representam a nova geração de defensivos agrícolas comerciais que em geral não possuem efeito direto sobre os patógenos, e sim, promovendo o aumento da resistência do vegetal.

Desde a descoberta do indutor de resistência vegetal, o éster S-metil do ácido benzo-(1,2,3)-tiadiazole-7-carbotióico (denominado de Acibenzolar-S-Metil®, ou ASM), ocorreu um grande avanço no desenvolvimento de produtos que exploram a capacidade de ativação de diferentes mecanismos de defesa nas plantas. O produto comercial Acibenzolar-S-Metil (ASM), com nome comercial de Actigard® (Europa) ou Bion® (Brasil), produzidos pela empresa Novartis, foi registrado no Brasil para ser utilizado nas culturas de tomate, citros e cacau. O ASM parece agir induzindo a síntese de uma molécula fitoalexina (a cumarina) e um rápido acúmulo de compostos fenólicos em plantas de cevada, reduzindo a penetração de fungos na folha. Da mesma forma, a aplicação de ASM em trigo induziu a síntese de proteínas de resistência (PR proteínas) no vegetal. O Messenger®, produzido pela empresa Eden Bioscience, representa um produto comercial onde o ingrediente ativo é uma proteína denominada de harpina, a qual foi isolada e purificada da bactéria Erwinia amylovora e produzida artificialmente, para fins comerciais, em Escherichia coli. Essa proteína possui peso de 44 kDa e apresenta alta estabilidade em altas temperaturas, estando naturalmente associada a parede da bactéria. Após a aspersão do Messenger®, a proteína harpina se liga ao receptor da célula vegetal e desencadeia respostas de defesa cerca de 5 a 10 minutos após a aplicação, sendo que a resposta de defesa se completa de três a cinco dias (Eden Bioscience, 2002). O produto não é tóxico para animais e é rapidamente degradado pela ação da radiação solar ou pela ação de organismos decompositores tanto na superfície da planta quanto no solo. O Milsana®, produzido pela KHH BioSci Inc, a base de extrato foliar da planta Reynoutria sachalinensis (giant knotweed- Polygonaceae). O material vegetal seco e moído (5g) é misturado com etanol (100 ml) e aspergido nas plantas. Foi registrado como bio-pesticida nos EUA em 2000, sendo utilizado em plantas ornamentais (casa de vegetação), promovendo a proteção contra Oidio spp. e o mofo cinzento Botrytis cinerea. Este extrato vegetal induz o acúmulo de proteínas-PR e de fitoalexinas, levando ao aumento da defesa da planta.

Plantas de pepino (Cucumis sativus) tratadas com Milsana® aumentaram sua resistência contra Sphareotheca fuliginea, promovendo o aumento no vegetal de vias de defesa endógenas como a elevação na atividade das peroxidases, β-1,3-glucanases, além da produção de compostos fenólicos glicosilados, que apresentam toxicidade contra microrganismos (Daayf et ai., 1995). Este composto apresenta seus efeitos variáveis e dependentes da cultivar a ser protegida. Contudo, esta formulação não apresenta toxicidade a animais e pode promover resultados de proteção semelhantes aos obtidos quando se utiliza fungicida convencional.

Oxycom®, produzido pela empresa Redox Chemicals, é uma combinação de um indutor (ácido peracético) da produção de espécies reativas oxigênio (Hammerschimidt et al., 2001) e de um mix de nutrientes. Em espécies de feijoeiro, este produto induz a expressão de genes relacionados a defesa, codificando proteínas envolvidas no metabolismo de fenólicos e no espessamento (reforço) da parede celular, bem como de peroxidases e de proteínas extensinas em fumo (Anderson et al., 2001).

Neemazal®, produzido pela empresa EID-Parry, é um produto obtido a partir de extratos da planta Nim (Azadirachta indica), que tem sido comercializado como inseticida. O ingrediente ativo do extrato é um triterpeno presente a uma concentração de 5% no produto comercial.

Ecolife 40®, produzido pela empresa Quinabra, apresenta na sua formulação bioflavonóides cítricos (vitamina P), ácido ascórbico (vitamina C), ácido lático e ácido cítrico, obtidos industrialmente pela fermentação e/ou extração de substratos orgânicos derivados de plantas cítricas, além de polifenóis e fitoalexinas. O produto apresenta mecanismos de ação variados, dos quais a indução de resistência via o aumento da síntese de fitoalexinas, parece ser um dos mais importantes (Motoyama, 2001). O produto apresenta eficiência em alguns patossistemas. Jayme et al. (1999) e Castro et al. (1999), destacam a eficiência do produto no controle do oídio e ferrugem em feijoeiro. Da mesma forma, Gasparotto et al. (2000), demonstrou que este produto foi eficiente no controle da doença Sigatoka negra (Mycosphaerella fijiensis), apresentando níveis de proteção semelhantes aos obtidos com o fungicida tebuconazola, com a vantagem de não apresentar resíduos nos frutos (Sanhueza, 2002).

Elexa®, o produto apresenta como ingrediente ativo uma molécula de carboidrato derivada de quitina. Nos EUA existem três produtos contendo quitina: Elexa® (0,95% de quitosana); Hygra Yield Enhancing Seed Treating Agent (2,5% de quitosana) e Yea Poly-D-Glucosamine Solution (2,5% de quitosana). A quitosana é um polissacarídeo que ocorre principalmente em animais do filo Arthropoda e seu mecanismo de ação no vegetal é semelhante ao observado quando um fungo ataca uma planta. Ocorre a percepção do patógeno pelo reconhecimento de monômeros de quitina, levando a reações bioquímicas que culminam com a expressão da Resistência Sistêmica Adquirida (SAR). Este produto é pulverizado em plantações de morango, tomate a maçã, promovendo o aumento da resistência das plantas.

Oryzemate®, produzido pela BioSafe, é utilizado principalmente em lavouras de arroz como agente fungicida. Contudo, foi demonstrado que este produto não possui ação direta sobre os patógenos do arroz, e sim, promove o aumento da resistência das plantas contra micorganismos. Este produto possui na sua formulação o 2-sulfamoilbenzoato, a sacarina e o Ν-β-D-glucopiranosilsacarina. Este mix de moléculas induz a expressão da proteína de defesa PRR1, promovendo a resistência contra o patógeno Pyrícularia oryzae. O extrato da cultura bacteriana podería ser utilizado como biopesticida. Segundo definição adotada pela United States Environmental Protection Agency (EPA), biopesticidas são certos tipos de pesticidas derivados de materiais naturais como animais, bactérias e certos minerais (http://www.epa.gov/pesticides/biopesticides). Embora a EPA apresente atualmente uma numerosa lista de produtos registrados como biopesticidas, incluindo aqueles que induzem a resistência sistêmica em vegetais, muitos outros produtos que promovem a resistência vegetal não são registrados como biopesticida devido ao elevado custo no registro de um produto como pesticida (Anderson et al., 2006). A literatura patentária possui diversos documentos relacionados a composições eliciadoras, onde os mais relevantes para a presente invenção estão descritos abaixo.

O documento PI 0402152-5 consiste no controle biológico de leveduras e fungos filamentosos em alimentos estocados ou no campo através do processo de predação realizado por leveduras do gênero Saccharomycopsis. O documento PI 0402152-5 utiliza leveduras vivas exóticas provenientes do Canadá e inoculadas diretamente sobre as plantas ou partes delas que devem ser preservadas da ação de microrganismos degradadores ou produtores de toxinas. O documento US 5,968,504 utiliza o fungo Gliocladium catenulatum como biocontrole através do mecanismo de competição e inibição do crescimento de fungos patogênicos. A presente invenção difere dos documentos citados, pois promove o aumento do metabolismo de defesa da planta, sem interagir diretamente com os microrganismos degradadores ou causadores de doenças nos vegetais. Desta forma, a presente invenção não depende da existência de interações ecológicas de antagonismo como competição, parasitismo e produção de antibióticos, bem como não apresenta o risco da colonização oportunista de animais e humanos. O documento PI 0418380-0A consiste no uso de uma mistura composta de bioextratos que aspergidos sobre as plantas promovem a indução de resistência nos vegetais contra o ataque de Xanthomonas fitopatogênicos. O produto consiste de misturas de extratos de Xanthomonas spp. não-fitopatogênicas, Trichoderma harzianum e da planta Yucca schidigera. O produto promove indução do sistema de defesa natural dos vegetais contra uma variedade de Xanthomonas spp. e suas variações. A presente invenção difere deste documento por promover resistência a um patógeno não relacionado com a bactéria que originou o extrato. A presente invenção consiste do extrato contendo Xanthomonas axonopodis patovar citri que, preferencialmente aspergido em plantas, plântulas e sementes, tais como em Solanum tuberosum, induz a defesa natural do vegetal contra bactérias e fungos patogênicos, preferencialmente as bactérias Erwinia carotovora e o fungo Alternaria solani em plantas da família Solanaceae. O documento US 6,242,420 refere-se ao uso de uma proteína (peso molecular de 18 kDa) extraída e purificada de culturas do fungo Trichoderma virens e aplicada na forma de solução em plantas, plântulas e sementes. A presente invenção difere deste documento, pois utiliza extrato de Xanthomonas axonopodis patovar citri contendo tanto estruturas derivadas da parede celular quanto componentes citoplasmãticos.

Portanto, pode-se ver que o estado da técnica não descreve nem sequer sugere os objetos da presente invenção, de forma que a mesma atende aos requisitos de patenteabilidade.

Sumário da invenção Em um primeiro aspecto a presente invenção proporciona um extrato bactéria no capaz de promover e/ou estimular as defesas naturais de plantas frente a patógenos. É um objeto da presente invenção um extrato compreendendo fragmentos de membrana plasmática, parede celular e proteínas citoplasmáticas obtido de uma bactéria pertencente ao gênero Xanthomonas. É um adicional objeto da invenção uma composição compreendendo: a) Um extrato compreendendo fragmentos de membrana plasmática, parede celular e proteínas citoplasmáticas obtido de uma bactéria pertencente ao gênero Xanthomonas, e b) Um veículo aceitável.

Em especial, a composição é aplicada a plantas de interesse agrícola, como a batata, e o veículo pode ser o mesmo meio para diluição do extrato.

Em um segundo aspecto, a presente invenção proporciona um processo de produção do extrato a partir do cultivo e lise de bactérias, É um adicional objeto da presente invenção um processo compreendendo as etapas de: a) Cultivo de bactérias pertencentes ao gênero Xanthomonas em meio líquido b) Lise das bactérias cultivadas, produzindo fragmentos de membrana plasmática, parede celular e proteínas citoplasmáticas; e c) Diluição do extrato;

Em um terceiro aspecto a presente invenção descreve um processo para estimulação das defesas de uma planta compreendendo a etapa de administrar a uma planta necessitando de estímulo para produção de defesas uma composição compreendendo: a) Um extrato compreendendo fragmentos de membrana plasmática, parede celular e proteínas citoplasmãticas obtido de uma bactéria pertencente ao gênero Xanthomonas; e b) Um veículo aceitável.

Estes e outros objetos da invenção serão detalhados na descrição a seguir.

Descrição das figuras A Figura 1 ilustra folhas de S. tuberosum analisadas após múltiplas inoculações com suspensões de bactérias (48 e 96 hpi - horas pós-ínoculação). O gráfico A mostra os compostos fenólicos e B o conteúdo de flavonóides. Letras diferentes indicam diferenças significativas (ANOVA, Turkey p<0,05. Experimentos independentes foram realizados em triplicata com resultados similares; 1 - folhas intactas; 2 - água; 3 - X. axonopodis; 4 - E. carotovora. A Figura 2 mostra a atividade da polifenol oxidase em folhas de S. tuberosum analisadas apôs inoculação com suspensões de bactérias {48 e 96 hpi - horas pós-inoculação). Letras diferentes indicam diferenças significativas (ANOVA, Turkey p<0,05, Experimentos independentes foram realizados nove vezes com resultados similares; 1 - folhas intactas; 2 - água; 3 - X. axonopodis; 4 - £ carotovora. A Figura 3 mostra a porcentagem de morte de plantas de batata aspergidas com extratos de Xanthomonas axonopodis autoclavados ou aspergidas com água (Controle). Após a aspersão, todas as plantas foram inoculadas com o patógeno Erwinia carotovora. Gontrole(n); Extrato (■) A Figura 4 mostra a porcentagem de folhas de plantas de batata apresentando sintomas de doença causada pela fitobactéria Erwinia caroiovora. As plantas foram previamente aspergidas uma única vez com extrato de Xanthomonas axortopodis autoclavado, com o indutor de resistência Bion® ou aspergidas com água (controle). Após a aspersão todas as plantas foram inoculadas com o patógeno Erwinia carotovora. A análise dos resultados foi realizada 72 dias após a inoculação com o patógeno.

Descrição detalhada da invenção Os exemplos aqui mostrados têm o objetivo apenas de exemplificar uma das possíveis realizações da invenção, sem, contudo limitá-la, de forma que realizações similares estão dentro do escopo da invenção. A vantagem do extrato de bactérias da presente invenção é a necessidade de um número baixo de aplicações nas plantas (somente uma), promovendo uma elevada taxa de imunização por cerca de 60 dias. Outra vantagem é a utilização de um indutor biótico (Xanthomonas) proveniente do ambiente natural, sendo empregado na indução de resistência em plantas de Sotanum adaptadas às condições brasileiras. Esta proximidade entre o indutor e o vegetal aumenta as chances de uma melhor eficiência na imunização.

Neste contexto, a presente invenção serve para aumentar a resistência nas batatas a bactérias e fungos, reduzindo os níveis de agrotóxicos empregados para o controle das doenças causadas por estes microrganismos.

As bactérias capazes de originar o extrato preferidas pela presente invenção são escolhidas do gênero Xanthomonas. Exemplos de espécies preferidas incluem, sem limitações, a espécie Xanthomonas axonopodis pv. citri., que são bactérias de solo que causam doenças em plantas de rúcula e citrus (cancro cítrico), O agente utilizado no preparo do produto é preferencial mente Xanthomonas axonopodis, podendo ser qualquer outro microrganismo patogênico ou não.

Sinônimos das bactérias estão listados a seguir: Pseudomonas citri Hasse, Xanthomonas citrí (Hasse) Dowson, Xanthomonas citri f.sp. aurantifoiiae Namekata & Oliveira, Xanthomonas campestris pv. Citri (Hasse) Dye 1978, Xanthomonas campestris pv. Aurantifoiii Gabriel et ai., Xanthomonas citrí (ex Hasse) nom, rev, Gabriel et a/., Xanthomonas axonopodis pv. A urantifoiii Va ute ri n et ai.

Culturas de X. axonopodis pv, citrí podem ser obtidas a partir de plantas cítricas contaminadas e apresentando sintomas de doença (cancro cítrico), caracterizada pela formação de pequenas pústulas circulares de coloração marrom e oleosas na superfície abaxial das folhas infectadas. O isolamento em placa permite observar claramente a coloração amarelo-alaranjada das colônias, típicas do gênero. Este isolamento pode ser realizado em meio Ágar nutritivo segundo a técnica descrita por Meneguim et al., 2007, Utilizaram-se culturas da bactéria X. axonopodis pv. citri para produzir extratos aquosos. Os extratos desta bactéria foram empregados nos experimentos na forma bruta, sem a utilização de nenhum método ou processo de purificação.

As plantas que receberão os extratos são plantas cultiváveis comumente encontradas na agricultura. Exemplos de tais plantas incluem as plantas pertencentes à família Solanaceae, em especial pertencente ao gênero Solanum. A espécie preferida é a Sotanum tuberosum. O extrato é eficaz a bactérias e/ou fungos reconhecidamente patogênicas para as plantas cultiváveis. Exemplos de tais bactérias e/ou fungos incluem, sem limitações, Erwinia carotovora subsp. carotovora que são bactérias de solo, amplamente distribuídas no meio ambiente, que causam doenças em uma ampla variedade de plantas olerícolas, sendo a batata a mais afetada por este patógeno. Esta bactéria causa a podridão-mole ou podridão-da-haste, afetando tanto as plantas a campo quanto na fase de pós-colheita e no armazenamento dos tubérculos. A Erwinia carotovora pertencem a um táxon complexo, consistindo de linhagens com ampla variação fenotípica, bioquímica, genética e com diversos hospedeiros.

Processo de Extração O processo de extração compreende as etapas de: a) Cultivo de bactérias pertencentes ao gênero Xanthomonas em meio líquido b) Lise das bactérias cultivadas, produzindo fragmentos de membrana plasmática, parede celular e proteínas citoplasmáticas; e c) Diluição do extrato;

Em uma realização preferencial, o processo consiste de todas as seguintes etapas: 1. Seleção da bactéria Xanthomonas sp; 2. Cultura da bactéria Xanthomonas sp, preferencialmente Xanthomonas axonopodis pv. citrí em meio líquido; 3. Retirada das bactérias do meio de cultura, preferencialmente por centrifugação; 4. Ressuspensão das bactérias e ajuste da densidade óptica da solução bacteriana (D06oo=1,0 Abs); 5. Lise das bactérias utilizando meios físicos e químicos, preferencialmente utilizando autoclavagem a 121 °C por 20 min; 6. Diluição do extrato (5 mL do extrato/L) - o solvente pode ser água, solventes orgânicos como etanol, metanol, inorgânicos e combinações dos mesmos; 7. Aspersão das folhas das plantas a serem protegidas (10 mL/planta). A composição compreendendo o extrato é uma composição com utilidade agrícola, e compreende: a) Um extrato compreendendo fragmentos de membrana plasmática, parede celular e proteínas citoplasmáticas obtido de uma bactéria pertencente ao gênero Xanthomonas; e b) Um veículo aceitável. O veículo aceitável é qualquer veículo que permita a distribuição da composição. Além disso, a composição pode estar na forma líquida ou sólida. O veículo pode ainda ser o meio de diluição do extrato. O produto desenvolvido consiste em extrato da bactéria Xanthomonas axonopodis patovar citrí preparado preferencialmente em água, podendo ser em outros solventes inorgânicos ou orgânicos. A concentração do extrato pode variar de 0,1 a 1,5 Abs em 600nm. O extrato consiste de fragmentos de parede celular e componentes citoplasmáticos da bactéria. O extrato é preparado preferencialmente utilizando-se ultra-som e 3 ciclos de 24h de congelamento-descongelamento (-20C), podendo-se utilizar outros meios físicos ou químicos para promover a lise bacteriana e obter o extrato. O produto desenvolvido apresenta a concentração de 5 ml_ do extrato bruto preparado em meio líquido. São utilizados 10 mL do produto em cada planta, utilizando preferencialmente o método de pulverização, podendo ser empregado na forma de pó ou qualquer outra forma, diretamente sobre o vegetal ou nas raízes. Pode ser utilizado na forma puro ou em combinação com fungicidas ou outros agentes bióticos e abióticos que potencializem a indução do metabolismo relacionado a defesa. Sua utilização pode também ocorrer junto com agentes surfactantes ou que promovam a aderência no vegetal.

Exemplo 1 As bactérias Erwinia carotovora subsp. carotovora foram utilizadas como desafiantes em testes de resistência das plantas de batata após a aplicação do produto indutor de resistência.

Utilizaram-se plantas envasadas de S. tuberosum com sete semanas de idade, mantidas em casa de vegetação. Suspensões bacterianas com Xanthomonas axonopodis pv, citri e Erwinia carotovora subsp. carotovora foram preparadas com HjO (Abs 0,3-0,4 a 600 nm). As inoculações de folhas basais, intermediárias e a pi ca is dos ramos foram realizadas com seringa sem agulha na face abaxial do folíolo terminal. O tempo entre a aplicação do produto indutor do metabolismo de resistência vegetal e o desafio com o patógeno foi de 5 dias. Foi realizada somente uma aplicação nos vegetais.

Retiraram-se amostras de diversas folhas (0,5g cada) das plantas dos tratamentos e procedeu-se a extração macerando-se as amostras em metanol 80% e utilizado para quantificação de compostos fenólicos (técnica de Folin-Ciocaulteau) e de flavonóides (nitrato de alumínio e acetato de potássio). A determinação das atividades enzimáticas foi realizada em extratos obtidos pela maceração de folhas em tampão fosfato gelado. Para as atividades das enzimas PPO, avaliou-se a diferença de absorbância em tampão com o substrato ácido clorogênico. Resultados foram submetidos à análise de variância one-way (p£0,05) e ao teste de Tukey.

Após a inoculação das bactérias X. axonopodis e E. carotovora, procedeu-se a observação das plantas quanto ao desenvolvimento de sintomas de doença, e a retirada de amostras das folhas visando avaliar os níveis de marcadores do metabolismo secundário de defesa vegetal (compostos fenólicos, flavonóides, atividade enzimática das polifenoloxidases e das peroxidases).

Pode-se observar a formação de uma resposta de defesa nas regiões da folha inoculada com esta bactéria. Este fato indicou que as plantas de batata possuem a capacidade de reconhecer a presença de X. axonopodis, induzindo uma resposta de defesa que impede o desenvolvimento desta bactéria em seus tecidos. A inoculação de culturas de Envinia carotovora nas folhas de batata levou ao desenvolvimento de sintomas de doença e a posterior morte das plantas. Este resultado indica que esta espécie vegetal não possui mecanismos de defesa contra o ataque da fitobactéria patogênica. Esta incapacidade de defesa da planta deve-se a inexistência/baixa sensibilidade de receptores específicos nas células que possibilitam o reconhecimento da fitobactéria.

As plantas inoculadas com E. carotovora não apresentaram respostas bioquímicas de defesa, como o aumento nos níveis de compostos fenólicos (Figura 1A). Contudo, a presença de X. axonopodis promoveu um intenso aumento nos compostos relacionados a defesa vegetal, indicando a indução de uma resposta de defesa. Da mesma forma, os níveis de flavonóides nas folhas da batateira apresentaram um aumento intenso e estável quando inoculadas com X. axonopodis (Figura 1B). Tanto o aumento nos níveis de compostos fenólicos quanto de flavonóides representam mecanismos de defesa do vegetal contra o ataque de microrganismos.

Quando se analisa a atividade de enzimas relacionadas ao mecanismo de defesa vegetal, observa-se que X. axonopodis promove um aumento significativo das atividades (Figura 2). Dentre as bactérias utilizadas nos experimentos, observou-se que X. axonopodis promoveu o aumento de fenólicos e de flavonóides e o aumento das atividades das PPOs. Os resultados indicam que esta fitobactéria atua como indutora do metabolismo relacionado a defesa nesta cultivar de batata.

Os resultados indicam que X. axonopodis induz um eficiente aumento no metabolismo relacionado a defesa vegetal.

Exemplo 2 A fim de avaliar a eficiência de extratos de Xanthomonas axonopodis no aumento da resistência de plantas de batata contra fitobactérias patogênicas, procedeu-se a aplicação de extratos autoclavados de X. axonopodis e posteriormente a inoculação com bactérias patogênicas.

Foram utilizadas plantas de batata com aproximadamente 12 semanas de idade. Suspensões bactéria nas com Xanthomonas axonopodis pv. citri foram preparadas com HjO (Abs 0,3-0,4 a 600 nm). As suspensões bactéria nas foram auto cia vad as por 20mín a 120 °C e 1 atm. As plantas foram aspergidas somente uma vez com suspensões autoclavadas de bactéria X. axonopodis ou aspergidas com água destilada estéril, Após cinco dias da aspersão, procedeu-se a inoculação de todas as plantas com uma cultura de Erwinia carotovora, fitobactéria patogênica de plantas de batata. Esta inoculação seguiu a mesma metodologia da utilizada anteriormente, sendo as folhas inoculadas com o auxílio de uma seringa sem agulha.

Neste experimento foi observado que a exposição prévia das plantas ao extrato autoclavado com Xanthomonas axonopodis promoveu uma redução de 60% na morte após 78 dias da inoculação com a fitobactéria patogênica Erwinia carotovora, aplicada diretamente nas folhas (Figura 3).

Os tratamentos controle (aspergidas com água) apresentaram 75% de morte após 78 dias da inoculação com E. carotovora.

Estes resultados deixam claro o efeito protetor que as culturas de X. axonopodis possuem na redução de ataques posteriores de fito bactérias e, possivelmente, de outros microrganismos patogênicos, evidenciado no retardamento da mortalidade e também na taxa de mortalidade das plantas. Neste experimento procedeu-se somente uma aplicação do extrato de X, axonopodis, podendo-se aumentar o número de aplicações visando elevar ainda mais o nível de proteção das plantas. A eficiência de extratos autoclavados de X. axonopodis foi comparada com o produto comercial Bion® 500 WG (empresa Syngenta Proteção de Cultivos Ltda.), utilizado como indutor de resistência em batata (Classe: Ativador de Plantas), a fim de avaliar a porcentagem de proteção induzida. Para tanto, procedeu-se a aplicação de extratos autoclavados de X. axonopodis, solução de Bion* (concentração de 0,0005g/planta) ou água (controle), e posteríormente a inoculação com bactéria patogênica Erwinia carotovora. Procedeu-se somente uma aspersão com os indutores de resistência ou água, Quando se compara o efeito de imunização do extrato de Xanthomonas com o efeito de proteção promovido pelo produto comercial Bion®, pode-se verificar que o extrato de bactéria foi significativamente superior aos demais tratamentos (Figura 4).

Estes resultados revelam uma elevada eficiência dos extratos de Xanthomonas na indução do aumento da resistência em batata, O mecanismo ou a via exata desta resposta não é conhecido, mas deve envolver a estimulação das vias de defesa do vegetal, podendo também abranger a rota de síntese de compostos fenólicos. Esta elevada eficiência pode também estar relacionada ao uso de extrato complexo ao invés de uma molécula única como o acibenzolar-S-metiI (Bion®) possibilitando a ativação concomitante de variadas vias de resposta nas plantas.

Reivindicações

Claims (19)

1. Processo de produção de extrato bactéria no caracterizado por compreender as etapas de: a) Cultivo de bactérias pertencentes ao gênero Xanthomonas; b) Use das bactérias cultivadas, produzindo fragmentos de membrana plasmática, parede celular e proteínas citoplasmáticas; e c) Diluição do extrato; em que a lise é realizado por meio de autoclavagem.

2. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pela bactéria ser escolhida do grupo que compreende Xanthomonas ciirí, Xanthomonas campesths, Xanthomonas axonopodis e combinações das mesmas.

3. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por compreender uma etapa preliminar de seleção das bactérias.

4. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo cultivo das bactérias ser em meio líquido.

5. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por compreender uma etapa de separação das bactérias do meio líquido.

6. Processo, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pela separação ser por meio de centrifugação.

7. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo solvente díluidor ser escolhido do grupo que compreende água, etanol, metanol e combinações dos mesmos.

8. Processo, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pela concentração final do extrato variar de 0,1 a 1,5 Abs em 6Ü0nm,

9. Composição compreendendo extrato bacteriano caracterizado por compreender: a) Um extrato autoclavado compreendendo fragmentos de membrana plasmática, parede celular e proteínas citoplasmáticas obtido de uma bactéria pertencente ao gênero Xanthomonas; e b) Um veículo aceitável.

10. Composição, de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pela bactéria ser escolhida do grupo que compreende Xanthomonas citri, Xanthomonas campestris, Xanthomonas axonopodis e combinações das mesmas.

11. Composição, de acordo com a reivindicação 9, caracterizada por estar na forma sólida ou líquida.

12. Composição, de acordo com a reivindicação 10, caracterizada por estar na forma líquida, em que o veículo é o meio de cultivo.

13. Composição, de acordo com a reivindicação 9, caracterizada por ser pulverizada sobre uma planta.

14. Composição, de acordo com a reivindicação 13, caracterizada pela planta ser pertencente â família Sotanaceae.

15. Composição, de acordo com a reivindicação 14, caracterizada pela planta ser Solanum tuberosum.

16. Composição, de acordo com a reivindicação 9, caracterizada por compreender adicionalmente agentes que promovam aderência da composição à planta,

17. Processo de estimulação da defesa de plantas caracterizado por compreender a administração de uma composição, conforme definida por qualquer uma das reivindicações 9 a 16, compreendendo um extrato bacteriano eliciador compreendendo fragmentos de membrana plasmática, parede celular e proteínas citoplasmáticas obtido de uma bactéria pertencente ao gênero Xanthomonas a uma planta.

18. Processo, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pela planta ser Solanum tuberosum.

19. Processo, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo extrato ser aplicado a folhas e/ou raízes da planta.