BRPI0806400A2 - composto, composição farmacêutica, produtos, usos de pelo menos um composto, método in vitro, kit, ligantes e processo de preparação de um composto - Google Patents
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Abstract
COMPOSTO, COMPOSIçãO FARMACêUTICA, PRODUTOS, USOS DE PELO MENOS UM COMPOSTO, MéTODO IN VITRO, KIT, LIGANTES E PROCESSO DE PREPARAçãO DE UM COMPOSTO. A presente invenção trata de compostos que têm a fórmula geral (1), de seu processo de preparação e de seu uso no tratamento ou na profilaxia da tuberculose.
Description
"COMPOSTO, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, PRODUTOS, USOS DE PELO MENOS UM COMPOSTO, MÉTODO IN VITRO, KIT, LIGANTES E PROCESSO DE PREPARAÇÃO DE UM COMPOSTO"
Campo da Invenção
A presente invenção trata de novos antígenos sulfoglicolipídios, de seu processo para extraí-los do Mycobacterium tuberculosis, e de seu uso no tratamento o na profilaxia da tuberculose.
Antecedentes da Invenção
Estima-se que a tuberculose causa 3 milhões de mortes todos os anos. O agente causador dessa doença e uma bactéria, Mycobacterium tuberculosis, pela qual uma entre três pessoas é infectada no mundo inteiro. Ela é transmitida pelo ar pelos espirros e pela tosse das pessoas infectadas. A bactéria pode ser abrigada em um estado inativo por pessoas infectadas que nunca vão desenvolver a doença. Entretanto, em certas condições, tais como idade ou depressão do sistema imunológico, a bactéria pode se tomar ativa e causar o início da tuberculose.
Parece que o envelope micobacteriano desempenha um papel importante na virulência das bactérias do gênero Mycobaeterium. De fato, até 40% do peso seco das micobactérias são constituídos de lipídios. Entre esses lipídios, alguns deles parecem restritos ao Mycobaeterium tuberculosis, tais como os sulfoglicolipídios por exemplo (Vergne 1. and Daffe M. Frontiers in Bioscience (1998) 3: 865-876). Essa família de glicolipídios é tipificada por um substituinte de sulfato sub na posição 2' de uma unidade trealose (isto e, a-D- glucopiranosil-1 -(1-1')-a'-D-glucopiranosido) (A). Os membros da família diferem entre si pelo número, a posição e o tipo de ácidos graxos substituídos pelas unidades trealoses. Os substituintes dos ácidos graxos compreendem em particular o ácido palmítico, o ácido esteárico, o ácido ftioceranóico e o ácido hidroxiftioceranóico. Os últimos dois ácidos graxos são característicos dos sulfoglicolipídios. O sulfoglicolipídio mais abundante é o SL-I (Goren et al. Biochemistry (1976) 15: 2728-2735) (B).
Hidroxiftioceraoil
<formula>formula see original document page 3</formula>
Demonstrou-se que SL-I era capaz de inibir a atividade antibacteriana macrofágica e de bloquear os efeitos de diversos agentes antiinflamatórios tais como LPS1 IFN-'y ou TNF-α de macrófagos (Vergne 1. and Daffe M. Frontiers in Bioscience (1998) 3: 865-876).
Atualmente, existem duas maneiras de combater a tuberculose: a terapia com antibióticos e a vacinação.
A vacina usada para a profilaxia da tuberculose consiste em bactérias vivas atenuadas da espécie Mycobacterium bovis. Ela é denominada BCG, Bacilo de Calmette e Guerin, ou seja, o nome dos dois cientistas que a conceberam pela primeira vez no início do século XX. Além dessa do inconveniente de ser uma vacina via, que impossibilita seu uso em pacientes imunodeprimidos, sua proteção contra a tuberculose é controvertida. Assim, a eficácia protetora em adultos varia de 0% a 80% de acordo com os diversos estudos, e ademais, ela falha em proteger contra a tuberculose pulmonar, a forma mais predominante da doença em adultos.
Além disso, linhagens resistentes de M. tuberculosis foram encontradas em mais de 35 países.
Por conseguinte, um dos objetos da presente invenção é propor um meio mais eficaz de tratar e/ou de prevenir a tuberculose.
Outros glicolipídios imunogênicos extraídos de Micobacterium tuberculosis são revelados em W02004/09212. Entretanto, esses produtos naturais só podem ser obtidos em uma quantidade limitada; e, além disso, eles são obtidos a partir de uma linhagem patogênica e sua preparação pode ser arriscada e exige instalações de segurança específicas.
É, portanto altamente desejável propor novos glicolipídios imugênicos sintéticos que possam ser obtidos em escala industrial e em condições factíveis.
Descrição Da Invenção
A presente invenção propõe em particular novos antígenos sulfoglicopídios sintéticos, que se revelaram capazes de estimular os linfócitos T restritos ao CD1 in vitro.
A presente invenção refere-se a compostos que possuem a seguinte formula geral (I):
<formula>formula see original document page 4</formula> em que:
R2', R3', idênticos ou diferentes, são independentemente escolhidos entre H, SO3H ou SO3VM+, desde que pelo menos um de R2', R3' SejaSO3Hou SO3-/M+;
De preferência, R2' é SO3H ou SO3VM+ e R3' é H.
- M+ é o cátion de um metal, tal como Na+, K+.
R2, R3, idênticos ou diferentes, são independentemente escolhidos entre:
a) grupos acila graxos
<formula>formula see original document page 5</formula>
b) ,em que X é uma cadeia hidrocarbonada linear ou ramificada insaturada eventualmente substituída por um ou mais substituintes;
em que pelo menos um entre R2, R3 é b);
e seus enantiômeros, diastereoisômeros, suas misturas e seus sais ou ésteres farmaceuticamente aceitáveis.
De preferência, X é de formula (b-1):
<formula>formula see original document page 5</formula>
em que:
- Y é uma cadeia hidrocarbonada linear ou ramificada saturada ou insaturada, de preferência saturada, eventualmente substituída por um ou mais substituintes.
De preferência, Y é uma cadeia alquila linear saturada eventualmente substituída um a dez, mais preferencialmente um a quatro grupos alquila, de preferência grupos metila.
Mais preferencialmente, os grupos metila estão situados nas posições C-1 , C-3, C-7 ou C-9 da cadeia Y.
Mais preferencialmente, os átomos de carbono substituídos apresentam a configuração (S).
- Ri, Rj, idênticos ou diferentes, são independentemente escolhidos entre H, Alquila; de preferência, R' é Metila e Rj é H.
Ri e Rj são tais que a configuração pode ser (E) ou (Z).
De acordo com um aspecto preferido, a b) cadeia é de fórmula (b- 2):
<formula>formula see original document page 6</formula>
em que r é um número inteiro escolhido entrei, 2 ou 3; de preferência, 1;
I é um número inteiro escolhido entre 0 a 10; de preferência 1, 2 ou 3;
q é um número inteiro escolhido entre 0 a 50; de preferência, 5 a 50; mais preferencialmente 10 a 20;
desde que I + q > 1;
cada um dos Ti, idênticos ou diferentes, é independentemente escolhido entre os grupos alquila; de preferência, cada um dos Ti é metila.
O átomo de carbono ao qual Ti está ligado é assimétrico. De preferência, o referido de carbono apresenta uma configuração (S).
T2 é um grupo alquila; de preferência uma Metila.
De acordo com outro aspecto preferido, R2 é a) grupo acila graxo e R3 é b) - C=O-X tal como definido acima.
Os grupos acila graxos são derivados de grupos de ácidos graxos que esterificam os grupos hidroxila na posição 2 ou 3 da 2'- ou 3'- unidade trealose sulfatada.
Os grupos ácidos graxos são ácidos carboxílicos alifáticos que podem ser lineares ou ramificados, saturados ou insaturados, substituídos ou não substituídos por grupos tais como hidroxila, ou cetona.
De preferência, eles contêm de 5 a 50, de preferência 15 a 50 átomos de carbono, e mais particularmente podem ser escolhidos no grupo que compreende:
<formula>formula see original document page 7</formula>
em que m é 14 ou 16 e η é um número inteiro de 2 a 10.
<formula>formula see original document page 7</formula>
em que m é 14 ou 16 e η é um número inteiro de 2 a 10. Os grupos acila graxos compreendem particularmente grupos acila graxos lineares e saturados tais como grupos de acordo com a fórmula - C=O-(CH2)K-CH3 em que k é um número inteiro de 14 a 50.
Mais preferencialmente ainda, os grupos acila graxos são escolhidos no grupo que compreende acila palmítica e acila esteárica.
A presente invenção trata mais particularmente de compostos de fórmula I, em que R2 representa um grupo acila graxo, de preferência, um grupo acila palmítico ou um grupo acila esteárico e R3 representa a (b-2) cadeia, ou seja, compostos com a seguinte fórmula (II):
<formula>formula see original document page 8</formula>
em que R2, R3, r, ρ, I, q, T2, T1 são tais como definidos acima, ou seu sal correspondente,
e seus enantiômeros, diastereoisômeros, suas misturas e seus sais ou ésteres farmaceuticamente aceitáveis.
A presente invenção trata em particular de compostos de fórmula II, em que:
= 1, q = 14 e r= 1;
=I = 2, q = 14 e r= 1;
= 3, q = 14 e r= 1;
= 4, q = 14 e r= 1;
= 1, q= 14 e r = 2;
= 2,q = 14er = 2;
=I = 3, q = 14 e r = 2;
= 4, q = 14 e r = 2; -I= 1, q = 12 e r= 1; -I = 2, q = 12 e =1; -I = 3, q = 12 e r= 1; -I = 4, q = 12 e r= 1; -I= 1, q = 12 e r = 2; -I = 2, q = 12 e r = 2; -I = 3, q = 12 e r = 2; -I = 4, q = 12 e r = 2; -I = 1,q = 16er=1; -I = 2, q = 16 e r= 1; -I = 3, q = 16er=1; -I = 4, q=16er=1; -I = 1, q = 16e r = 2; -1 = 2, q= 16 e r = 2; -I = 3, q = 16 e r= 2; ou -I = 4, q = 16 e r = 2;
em que ρ é 6 a 22 e T2 e T' são metila.
A presente invenção trata mais especificamente dos compostos com as seguintes fórmulas:
<formula>formula see original document page 9</formula> (II.2)
<formula>formula see original document page 10</formula>
(II.3)
<formula>formula see original document page 10</formula>
(II.4)
<formula>formula see original document page 10</formula>
(II.5) <formula>formula see original document page 11</formula> (11.10)
e seus sais correspondentes, e seus enantiômeros, diastereoisômeros, suas misturas e seus sais ou ésteres farmaceuticamente aceitáveis.
Tal como usada aqui, "sais farmaceuticamente aceitáveis" refere- se aos derivados dos compostos propostos em o composto parente é modificado fazendo sais ácidos ou básicos deles. Os sais farmaceuticamente aceitáveis compreendem os sais não-tóxicos convencionais ou os sais de amônio quaternário do composto parente formado, por exemplo, de ácidos inorgânicos ou orgânicos não tóxicos. Por exemplo, esses sais não-tóxicos convencionais compreendem os que derivam de ácidos inorgânicos tais como hidroclórico, sulfúrico, sulfâmico, fosfórico, nítrico e similares; e os sais preparados a partir de ácidos orgânicos tais como acético, propiônico, sucínico, tartárico, cítrico, glutâmico, benzóico, salicílico, toluenossulfônico, oxálico, e similares.
Os sais farmaceuticamente aceitáveis da presente invenção podem ser sintetizados a partir de um composto parente que contém uma fração básica ou ácida pelos métodos químicos convencionais. Geralmente, esses sais podem ser preparados fazendo-se reagir com as formas de ácido livre ou básica desses compostos com uma quantidade estequiométrica da base ou do ácido apropriados em água ou em um solvente orgânico, ou em uma mistura dos dois. Geralmente, os meios não aquosos tais como éter, acetato de etila, etanol, isopropanol, ou acetonitrila são preferidos. Listas de são apropriadas são encontradas em Remington1S Pharmaceutical Sciences, 17th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1985, p. 1418, cujo conteúdo está incorporado aqui por referência.
De acordo com outro modo de realização, a presente invenção trata de uma composição que compreende pelo menos dois diferentes compostos de fórmula I tal como definido acima.
A presente invenção trata também de uma composição farmacêutica que compreende pelo menos um composto tal como definido acima, ou uma composição tal como definida acima, em associação com o veículo farmaceuticamente aceitável.
Um suporte farmaceuticamente aceitável compreende em particular lipossomas.
A composição pode também compreender adjuvantes de vacina. Adjuvantes de vacina para uso em seres humanos ou animais são bem conhecidas do técnico no assunto, e uma lista desses sais pode ser encontrada por exemplo em "A compendium of vaccine adjuvants and excipients" 2nd edition, Vogel et a). Adjuvantes de vacina particulares compreendem em especial sais de alumínio ou M59, por exemplo.
A presente invenção trata particularmente de uma composição farmacêutica tal como definida acima, caracterizada pelo fato de que ela é apresentada em uma forma destinada á administração por via oral ou injetável.
A presente invenção trata mais particularmente de uma composição farmacêutica tal como definida acima, caracterizada pelo fato que compreende outro ou outros produtos úteis no tratamento ou na profilaxia da tuberculose, tais como proteínas do BCG ou micobacterianas.
BCG significa Bacilo de Calmette e Guerin, e diferentes linhagens de BCG comumente usadas para vacinação estão descritas em particular em Behr Μ.A. et ai. Science (1999) 284:1520-1523.
A expressão "proteínas micobacterianas" refere-se a proteínas, ou seus fragmentos, que são codificadas pelo genoma de bactérias do gênero Mycobacterium e em particular pelo genoma de Mycobacterium tubercuiosis, e essas proteínas podem ser vantajosamente recombinantes. De acordo com um modo de realização preferido as referidas proteínas micobacterianas são antígenos de M. tubercuiosis.
Outros produtos úteis para o tratamento ou a profilaxia da tuberculose compreendem em particular imunomoduladores, tais como citocinas, fragmentos de DNA que codificam os antígenos da M. tubercuiosis, mutantes de deleção da M. tubercuiosis vivos, tais como mutantes em que a virulência dos genes foi deletada, ou BCG recombinante vivo, tal como antígenos de expressão no BCG da M. tubercuiosis.
Tal como usado aqui, a tuberculose trata de uma doença causada em seres humanos pela bactéria Mycobacterium tubercuiosis, mas também da doença correspondente em animais.
De acordo com outro modo de realização, a presente invenção trata de produtos que compreendem:
- pelo menos um composto tal como definido acima,
- e pelo menos um outro produto útil para o tratamento ou a profilaxia da tuberculose, tais como as proteínas BCG ou micobacterianas, como uma preparação combinada para uso simultâneo, separado ou seqüencial no tratamento ou na profilaxia da tuberculose.
A presente invenção trata também do uso de pelo menos um composto tal como definido acima, ou de uma composição supramencionada, para a preparação de um medicamento, em particular uma vacina, destinado ao tratamento ou à profilaxia da tuberculose. Eventualmente, a vacina pode compreender um adjuvante de vacina tal como descrita acima.
A presente invenção trata do uso de pelo menos um composto tal como definido acima, ou de uma composição de acordo com tal como definida acima, como um ativador de resposta imune, e mais particularmente um ativador de resposta inflamatória.
Por "ativador de resposta imune", entende-se um composto que tem a capacidade de ativar componentes ou processos da resposta imune, in vitro ou in vivo, em particular células do sistema imune, tais como linfócitos T, linfócitos B, antígeno que apresenta células (APCs), tais como células dendríticas ou macrófagos, monócitos ou granulócitos.
Por "ativador de reação inflamatória", entende-se um composto que tem a capacidade de ativar componentes ou processos da reação inflamatória, in vitro ou in vivo, tais como diapedese, permeabilização capilar, ativação macrofágica ou início de febre por exemplo.
A presente invenção trata também do uso de pelo menos um composto tal como definido acima, ou de uma composição tal como definida acima, para induzir a ativação dos linfócitos T, em particular linfócitos T restritos ao CD1. A ativação pode ser realizada in vitro ou in VIVO.
A ativação dos T linfócitos pode ser avaliada por diversos métodos, tais como a medição da multiplicação celular ou produção de citocina tais como IFN-γ (interferon-Y), IL-2 (interleucina-2), IL-4 (interleucina-4), ou TNF-α (a fator de necrose tumoral), por exemplo.
Os linfócitos T restritos ao CD1 são linfócitos T que são ativados pelos antígenos apresentados pelas moléculas CD1.
A presente invenção trata também do uso de pelo menos um composto tal como definido acima, ou de uma composição tal como definido acima, para induzir a produção de IFN-γ, TNF-α, IL-4 ou granulisina.
Essa indução da produção pode ser realizada in vitro ou in vivo. A produção de IFN-Y, TNF-α, IL-4 ou granulisina pode ser medida por exemplo por ensaios imunológicos, tais como ELISA (enzyme Iinked immunosorbent assay) ou EIA (enzyme immunoassay).
A presente invenção trata também do uso de pelo menos um composto tal como definido acima, ou de uma composição supramencionada, para a preparação de uma composição para o diagnóstico de uma infecção por Mycobacterium tuberculosis.
O diagnóstico da tuterculose pode ser difícil pelo fato do teste habitual (tuberculina também chamado teste "PPD") pode não diferenciar os indivíduos PPD+ que receberam BCG dos pacientes PPD+ realmente infectados com tuberculose latente.
É portanto extremamente desejável propor um teste específico para a infecção por Mycobacterium tuberculosis.
Isso se tornou agora possível com os compostos da presente invenção.
Os compostos da presente invenção são altamente específicos para a espécie Myeobaeterium tuberculosis. Eles podem ser usados para discriminar os indivíduos PPD+ entre os que foram vacinados com BCG e os que estão realmente infectados com tuberculose.
De acordo com outro aspecto, a presente invenção fornece portanto um método para diagnosticar uma infecção por Mycobacterium tuberculosis que compreende as seguintes etapas:
- fornecer uma amostra biológica de um individual PPD+;
- colocar a referida amostra em contato com um composto de
fórmula (X): <formula>formula see original document page 17</formula>
em que:
R2', R3', idênticos ou diferentes, são independentemente escolhidos entre H, SO3H ou SOaVM+, desde que pelo menos um dos R2, R3 seja SO3H ou S03-/M+;
De preferência, R2' é SO3H ou SO3VM+ e R3' é H.
- M+ é o cátion de um metal, tal como Na+, K+.
R2, R31 idênticos ou diferentes, são independentemente escolhidos entre:
a) grupos acila graxos
b) <formula>formula see original document page 17</formula> , em que X é uma cadeia hidrocarbonada linear ou
ramificada insaturada, eventualmente substituída por um ou mais substituintes;
e seus enantiômeros, diastereoisômeros, suas misturas e seus sais ou ésteres farmaceuticamente aceitáveis,
- avaliar a ativação dos linfócitos T; e
- comparar a ativação dos linfócitos T depois e antes da administração do composto.
Aqueles indivíduos em que os linfócitos T estão ativados (ie), isto é, em que a liberação IFN-γ aumentou após a administração de um composto da presente invenção estão infectados com Mycobacterium tuberculosis.
A presente invenção fornece também um kit para diagnosticar a tuberculose que compreende:
- um composto de fórmula (X);
- células dendríticas;
- meios para detectar a ativação dos linfócitos T1 isto é, a liberação de IFN-/.
Geralmente, a ativação sulfoglicolipídica de células T é detectada pela medida do IFN-γ liberado no sobrenadante 48 horas após a estimulação com células dendríticas e sulfoglicolipídios, usando qualquer kit de detecção IFN-γ ELISA de humanos (por exemplo, comprado junto à BD Pharmingen).
A presente invenção trata também do uso dos com postos da presente invenção para avaliar a eficácia das vacinas preparadas com Mycobacterium tuberculosis recombinante. Foram desenvolvidas vacina que usam bactérias vivas recombinantes obtidas de BCG de Mycobacterium tuberculosis ou Mycobacterium bovis, que podem, por exemplo, sobre- expressar uma proteína. É altamente desejável avaliar se tais vacinas são eficazes e protegem o paciente em que foram administradas. A avaliação torna-se possível pela aplicação do método de diagnóstico da presente invenção.
A presente invenção trata também de Iigantes específicos aos compostos de fórmula (X).
Tal como usado aqui, um "ligante específico" refere-se a qualquer composto que pode ser preparado para uma ligação específica a um composto de acordo com a presente invenção.
Os Iigantes específicos geralmente englobam os anticorpos e os aptâmeros.
O termo "anticorpo" refere-se a anticorpos intiros, em particular anticorpos monoclonais, mas também a fragmentos de anticorpos que mantêm a capacidade de se ligarem especificamente aos compostos da presente invenção, tais como os fragmentos Fab1 Fab', F(ab')2, Fv ou scFv.
A preparação de anticorpos é bem conhecida do técnico no assunto. Habitualmente, a preparação de um composto de acordo com a presente invenção é administrada a um animal, tal como um camundongo, um rato, um coelho, ou uma cabra, por várias vias, tais como a via intramuscular, intravascular ou intraperitoneal. Uma administração adicional pode ser realizada após a primeira administração a fim de aumentar a produção anticorpos. Os anticorpos são obtidos do sangue retirado dos animais, ou de derivados sangüíneos tais como soro ou plasma, e eventualmente purificados, por exemplo por meio de cromatografia de afinidade. Os anticorpos monoclonais podem ser preparados em particular do modo descrito por Koller & Milstein (1975) Nature 256:495-499.
Os "aptâmeros" podem ser do tipo peptídico ou do tipo nucléico (por exemplo, do tipo desoxirribonucléico ou ribonucléico). Os aptâmeros nucléicos podem ser preparados em particular pelo método SELEX que é bem conhecido ou tal como descrito por Ellington & Szostak (1990) Nature 346:818- 22. Os aptâmeros peptídicos podem ser obtidos do modo descrito por Cohen et al. (1998) Proc. Nati Acad Sei. USA 95:14272-7.
A fórmula geral (X) inclui a formula (I) tal como descrita em WO 2004/092192 incorporada aqui por referência bem como os compostos de fórmula (I) e (II) da presente invenção. De preferência, os compostos de fórmula (X) são os de fórmulas (I) e (II) e seus modos preferidos de realização tais como descritos acima.
De acordo com mais um de seus objetos, a presente invenção trata também do processo de preparação de um composto de fórmula (I) tal como definido acima.
Os compostos e processos da presente invenção podem ser preparados de uma série de maneiras conhecidas do técnico no assunto. Os compostos podem ser sintetizados, por exemplo, por aplicação ou adaptação dos métodos descritos abaixo, ou suas variações de acordo com a avaliação do técnico no assunto. As modificações e substituições apropriadas ficarão prontamente evidentes e são bem conhecidas ou fáceis de obter com a leitura da literatura específica para os técnicos no assunto.
Em particular, esses métodos podem ser obtidos em R.C. Larock, Comprehensive Organic Transformations, VCH publishers, 1989.
Os reagentes e materiais de partida estão comercialmente disponíveis, ou podem ser prontamente sintetizados por técnicas bem conhecidas do técnico do assunto.
Nas reações descritas a seguir pode ser necessário proteger os grupos funcionais reativos, por exemplo os grupos hidróxi, amino, imino, tio ou carbóxi, onde eles are são desejados no produto final, para evitar sua participação indesejada nas reações. Grupos de proteção convencionais podem ser usados de acordo com a prática padrão, por exemplos ver T.W. Green and P. G. M. Wuts in Protective Grupos in Organic Chemistry, John Wiley and Sons, 1991; J. F. W. McOmie in Protective Grupos in Organic Chemistry, Plenum Press, 1973.
Habitualmente, as reações são realizadas em um solvente apropriado. Pode-se usar uma variedade de solventes, desde que eles não tenha um efeito adverso sobre a reação ou nos reagentes envolvidos. Como exemplos de solventes apropriados podem ser citados: os hidrocarbonetos, que podem ser hidrocarbonetos aromáticos, alifáticos ou cicloalifáticos, tais como hexano, ciclo-hexano, benzeno, tolueno e xileno; amidas, em particular amidas de ácidos graxos, tais como dimetilformamida; e éteres, tais como dietil éter e tetra-hidrofurano.
As reações podem ocorrer dentro de uma ampla faixa de temperaturas. Em geral, julga-se conveniente realizar reação a uma temperatura que varia de aproximadamente 0°C a aproximadamente 150°C (mais preferencialmente de temperatura de aproximadamente 100°C). O tempo necessário para a reação po de também variar amplamente e m função d e vários fatores, em particular a temperatura reacional e a natureza dos reagentes. Entretanto, desde que a reação seja efetuada nas condições preferidas assinaladas acima, um período de aproximadamente 3 horas a aproximadamente 20 horas será habitualmente suficiente.
O composto assim preparado pode ser recuperado da mistura reacional pelos meios convencionais. Por exemplo, os compostos podem ser recuperados pela destilação do solvente da mistura reacional ou, se necessário, depois de destilar o solvente da mistura reacional, verter o resíduo em água e realizar em seguida uma extração com um solvente orgânico não miscível em água e destilar o solvente do extrato. Adicionalmente, o produto pode, se for desejado, ser ainda mais purificado com várias técnicas de poço, tais como recristalização, reprecipitação ou as diversas técnicas cromatográficas, em particular cromatografia preparativa de camada fina.
De acordo com outro objeto, a presente invenção fornece um processo de preparação de um composto de fórmula (I) tal como definido acima que compreende as etapas de:
- sulfonar; e
- acilar com os compostos correspondentes de fórmulas (IV') e (IV):
R2X R3Y
(IV) (IV')
em que R2 e R3 são definidos tal como na formula (I) e X e Y independentemente representam um átomo de halogênio ou um grupo OH;
um composto de fórmula (III): <formula>formula see original document page 22</formula>
em que cada um de P4, P5, P4', P5', idênticos ou diferentes, representam H ou um grupo protetor OH- ou P4 e P5 e/ou P4' e P5' formam juntos um grupo protetor cíclico OH-.
Podem ser necessárias uma ou duas reações de sulfonação e de acilação.
As etapas de sulfonação e de acilação podem ser realizadas em qualquer ordem, sucessiva ou alternadamente.
Podem ser necessárias uma ou mais etapas de proteção e/ou desproteção antes e/ou depois das etapas de acilação e/ou sulfonação, quando for apropriado.
Esses grupos de proteção os acetais ou quetal tal como grupos protetores tais como
<formula>formula see original document page 22</formula>
ou grupos protetores bidentados tais como
<formula>formula see original document page 22</formula>
O processo da presente invenção compreende ainda a etapa de hidrolisar os referidos grupos de proteção. Essa reação é usualmente realizada em condições ácidas.
A referida reação de sulfonação é geralmente realizada com qualquer agente de sulfonação apropriado, tal como o complexo trióxido piridina-enxofre ou o complexo trióxido trimetilamina-enxofre.
As duas acilações exigidas podem ser realizadas em uma ou duas etapas. A(s) etapa(s) de acilação é (são) usualmente efetuadas com agentes de acoplamento tais como DMAP e/ou DCC.
O processo da presente invenção pode também compreender a etapa final de isolar o composto desejado.
Um processo representativo da presente invenção está ilustrado no seguinte esquema:
<formula>formula see original document page 23</formula>
O composto bissulfonado 2', 3' (7") pode ser obtido pelo uso de um excesso de reagente de sulfonação. O composto 3'-sulfonado (7J é obtido como um subproduto da reação de sulfonação; geralmente, a seletividade da reação de sulfonação é de aproximadamente 5/1. Os compostos 7, T e T' são separados por cromatografia.
O composto de fórmula (IV) está em geral disponível comercialmente.
De preferência, quando R3 representar a cadeia b) tal como definida acima, os compostos de fórmula (IV') podem ser preparados por aplicação ou adaptação do seguinte esquema ilustrativo:
<formula>formula see original document page 24</formula>
em que
R representa a cadeia hidrocarbonada linear ou ramificada insaturada eventualmente substituída correspondente de modo que
<formula>formula see original document page 24</formula>
corresponda a X. Mais precisamente, começando de A comercialmente disponível, as etapas são realizadas até G, que compreende então um grupo metila adicional com a estereoquimia necessária. G é então reduzido em A' reduzido conduzindo ao desejado B', e depois C' que é por sua vez saponificado para conduzir ao composto desejado de fórmula (IV').
Em particular, o composto de fórmula R3Y (IV') que possui a seguinte fórmula (IV'-a):
(IV-a):
<formula>formula see original document page 25</formula>
é obtido a partir do composto correspondente de fórmula (V'):
<formula>formula see original document page 25</formula>
por uma reação de Wittig, usando um composto de fórmula (VI) seguida de uma saponificação:
<formula>formula see original document page 25</formula>
O processo acima de preparação de compostos de fórmula (IV) é particularmente vantajoso e conduzem a compostos com a desejada estereoquimia.
Os processos podem ser realizados pela aplicação ou adaptação das condições experimentais e/ou dos produtos de partida dados nos exemplos.
Breve Descrição das Figuras FiguraI ε Figura 2
As Figuras 1 e 2 representam a quantidade de IFN-γ (em pg/mL, eixo vertical) produzida por um clone de célula T Z4B27 em resposta à estimulação (eixo horizontal) pelos compostos dos compostos comparativos da presente invenção.
Exemplos
Exemplo 1
Síntese dos Compostos da Invenção
A. Síntese dos sulfolipídios
<formula>formula see original document page 26</formula>
1. Benzilidenacão de a.a-trealose
O α,α- di-hidrato de Trealose (1 eq.) foi desidratado por fervedura em etanol absoluto (0,4 M) sob refluxo durante 30 minutos. O resíduo seco 1 foi então suspenso em N,N-dimetilformamida seca (DMF, 0,4 M), e α,α- dimetoxitolueno (DMT1 2 eq.) foi adicionada juntamente com ácido 10- canforsulfônico (CSA, 0,05 eq.). A foi aquecida (60°C) durante 1 hora em um evaporador rotativo com um ligeiro vácuo para eliminar o metanol. Mais DMT (0,25 eq.) e CSA (0,01 eq.) foram então adicionados e a mistura foi colocada novamente no evaporador rotativo. No fim da reação, a DMF foi evaporada. A mistura foi agitada por uma noite em uma solução aquosa de hidrogenocarbonato de sódio (5%) para dar um diacetal cristalino 2. O produto foi recristalizado por dissolução em etanol fervente, adição de água quente, e resfriamento lento. Finalmente, os cristais brancos de 2 foram filtrados, lavados com água e éter de petróleo e secados (84%).
2. AciLAÇÃO DA POSIÇÃO 2
Uma suspensão de diacetal 2 (1 eq.), 4-dimetilaminopiridina (DMAP, 1 eq.) e cloreto de acila (1,3 eq) em piridina seca (0,6 M) foi fervida sob refluxo durante 25 h. O produto monoacilado 3 foi obtido com um rendimento de 45%.
3. SILlLAÇÃO DAS POSIÇÕES 2' E 3'
A uma solução resfriada em gelo de 3 (1 eq.) em piridina (0,1 M) foi adicionado 1,3- dicloro-1,1,3,3-tetraisopropildissiloxano (1,2 eq.). Após agitação durante 2 dias à temperatura ambiente, a mistura foi vertida em água com gelo e o produto extraído com acetato de etila. A purificação foi feita por cromatografia flash e resultou em um produto 4 em forma de xarope com um rendimento de 58%.
4. ACILAÇÃO DA POSIÇÃO 3
O composto 4 (1,5 eq.) foi tratado durante 15 minutos sob micro- ondas com o ácido R3OH (obtido da parte B) (1 eq.), DMAP (1 eq.) e DCC (1.5 eq.) em tolueno seco (0,1 M de ácido). No fim, o solvente foi evaporado e o produto diacilado 5 foi purificado por cromatografia flash. O rendimento da reação é altamente dependente da estrutura do ácido usado (25-60%).
5. DESSILILAÇÃO
O composto 5 (1 eq.) foi aquecido a 40°C com uma solução de Bu4NF/THF (1 M, acidificado com ácido trifluoroacético para ter um pH ≈ 6, 40 eq.) durante 24 h. O produto cristalino 6 foi obtido com um rendimento de 90%. 6. SULFATACAO
A uma solução de 6 (1 eq.) em piridina (0,06 M) foi adicionada uma solução do complexo trióxido piridina-enxofre em DMF (0,5 M, 3 eq.) e a mistura foi agitada à temperatura ambiente. Após 2 dias, a mistura foi evaporada e o resíduo cromatografado sobre gel de sílica para dar 7 (62%), seu isômero 3'-sulfato Teo composto 2',3' dissulfatado 7".
7. HIDROLISE DOS ACETAIS
O derivado de benzilideno 7, 7' ou 7" foi tratado com uma solução de clorofórmio/metanol/1,7% H2SO4 (60/40/8) durante 2 dias à temperatura ambiente. A mistura reacional foi tornada neutra com uma solução de NaHCO3. Essa desproteção suportou quantitativamente sulfoglicolipídio diacilado correspondente 8, 8' ou 8"
B. SINTESE DOS ACIDOS
<formula>formula see original document page 28</formula>
1. ΟΧΙDACAO DO ALCOOL
O álcool A (1 eq.) foi adicionado a uma suspensão agitada rapidamente de clorocromato de piridínio (2 eq.) e acetato de sódio (5 eq.) em diclorometano seco (0,4 M de A) sob nitrogênio à temperatura ambiente. Após agitar durante 1, 5 h, foi adicionado dietil éter e a mistura foi filtrada. O produto cru B não foi mais filtrado em seguida.
2. REACAO DE WITTIQ
A uma solução de B (1 eq.) em diclorometano seco (0,6 M) foi adicionado 1-carboetoxietilideno trifenilfosforano (1,2 eq.). A mistura foi então agitada por uma noite à temperatura ambiente e forneceu o éster Ç. O rendimento das duas etapas de A foi de 87%.
3. Hiprogenação
O éster conjugado Ç (1 eq.) foi hidrogenolisado em acetate de etila (0,4 M) usando paládio a 10% sobre carbono como catalisador. O éster saturado D foi obtido em 77% como uma mistura enanciomérica 1/1 (diastereoisomérica) na posição C-2.
4. Saponificação
O éster D (1 eq.) foi aquecido por uma noite a 110°C em uma solução de hidróxido de potássio (12 eq.) em água/etanol 2/3 (0,2 M). Essa reação suportou quantitativamente o ácido correspondente E como uma mistura racémica (diastereoisomérica 1/1) na posição C-2.
5. Amidação
O ácido E (1 eq.) foi aquecido sob refluxo com cloreto de oxalila (10 eq.) durante 1 hora. O reagente em excesso foi removido sob pressão reduzida. Diclorometano seco (0,4 M) e DMAP (1,2 eq.) seguido de (R)-2- fenilglicinol (1,1 eq.) foi adicionado ao cloreto de acila cru e a mistura reacional foi agitada à temperatura ambiente por uma noite. Uma cromatografia flash permitiu a separação dos diastereoisômeros. O diastereoisômero 2S F foi o composto menos polar e foi isolado com um rendimento de 36%.
6. Hidrólise ácida A amide F (1 eq.) foi levada ao refluxo por uma noite em uma solução de ácido sulfúrico (3 N) em uma mistura de dioxano/água 1/1 (0,02 M) para liberar quantitativamente o ácido-2S G.
7. Redução
O ácido G (1 eq.) foi dissolvido em uma solução de BH3 em THF (1 M, 1,7 eq.) e essa mistura foi agitada por uma noite à temperatura ambiente. O etanol foi adicionado, e o ácido acético aquoso a 80% e a mistura foram tornados neutros com NaHCO3. O álcool foi obtido quantitativamente em forma pura.
A seqüência total da reação foi repetida para a introdução de outras ramificações metila na cadeia de ácidos graxos.
Os ácidos insaturados foram obtidos por saponificação tal como indicada acima dos ésteres insaturados Ç.
Foram obtidos os seguintes ácidos:
<formula>formula see original document page 30</formula>
C21 H40 02 M = 324,5474 g/mol ácido (2E)-2-metileicos-2-enóico
cristais brancos
RMN1H (250 MHz). CDCh)
δ = 0,88 ppm (t, H-t3 J= 6,5 Hz); δ = 1-1,7 ppm (m, H alifático); δ = 1,84 (d, H-2', d,4J2-S = 1,5 Hz); δ = 2,19 ppm (quad, H-4, 3J4.3 = 7Hz); δ = 6,9 ppm (tq, H-3, 3J3^ = 7 Hz e 4J3-Z = 1,5Hz)
<formula>formula see original document page 30</formula>
C24 H46 O2 M = 366,628 g/mol ácido (2E.4S)-2-dimetildocos-2-enóico
cristais brancos
RMN1H (250 MHz), CDCh)
δ = 0,87 ppm (t, H-t3 J = 6,5 Hz); δ = 1,0 ppm (d, H-4', 3J4^4 = 6,5 Hz), δ = 1,1-1,6 ppm (m, H alifático); δ = 1,84 (d, Η-2', d,4J2'-S = 1,5 Hz); δ = 2,5 ppm (m, H-4); δ = 6,65 ppm (quad, H-3, 3J3-4 = 10Hz); e 4J3-2' = 1,.5Hz)
<formula>formula see original document page 31</formula>
C24 H46 O2 M = 366,628 g/mol ácido (2E,4R)-2,4-dimetildocos-2-enóico cristais brancos
RMN1H (250 MHz). CDCI3)
δ = 0,88 ppm (t, H-t3 J = 6,5 Hz); δ = 1,01 ppm (d, H-4, 3J4'-4 = 6,5 Hz), δ = 1,1-1,5 ppm (m, H alifático); δ = 1,85 (d, H-2', d,4J2-Z = 1,5 Hz); δ = 2,5 ppm (m, H-4); δ = 6,67 ppm (dquad, H-3, 3J4.-9 = 10Hz) e 4J3-2' = 1,5Hz)
<formula>formula see original document page 31</formula>
C27 H52 O2 M = 408,7087 g/mol ácido (2E.4S.6S)-2,4.6-trimetiltetracos-2-enóico (Ácido ftienóico)
cristais brancos
[α]D25 = + 1,38 (clorofórmio)
RMN1H (250 MHzh CDCl3)
δ = 0,82 ppm (t, H-6' J6-6 = 6,5 Hz); δ = 0,88 ppm (t, H-t, 3J= 7Hz), δ = 0,99 ppm (d, H-4', 3J4'-4 = 6,5Hz); δ = 1,05-1,4 ppm (m, H alifático); δ = 1,85 (d, H-2', 4J2'-3 = 1,5 Hz); δ = 2,6 ppm (m, H-4); δ = 6,66 ppm (d, H-3, 3J34 = 10Hz); e 4J3-Z = 1,5Hz) RMN1H (250 MHz). CDCh)
δ = 12,1 ppm, C-6'; δ = 14,1 ppm, C-t; δ = 19-32 ppm C alifático δ = 37,6 ppm, C-2'; δ = 44,4 ppm, C-5; δ = 125 ppm, C-2; δ = 151,2 ppm, C-3.
<formula>formula see original document page 32</formula>
M = 422,7356 g/mol ácido (4S,6S,8S)-2.4,6,8-tetrametiltetracos-2-enóico óleo incolor
[a]d25 = + 15 (clorofórmio) RMN1H (250 MHz). CDCh)
δ = 0,83 ppm (d H-6', 3J6^ = 5,5 Hz); δ = 0,88 ppm (d, H-6\ 3J6-6; 6,3Hz), δ = 0,9 ppm (t, H-t, 3J = 6,6Hz); δ = 1,01 ppm (d, H-4\ 3J4^4 = 6,6 Hz); δ = 1,1-1,5 ppm (m, H alifático); δ = 1,88 (s, H-2'); δ = 2,67 ppm (m, H-4); δ = 6,69 ppm (d, H-3, 3J3^ = 10,2 Hz)
<formula>formula see original document page 32</formula>
M = 184,2786 g/mol ácido (4S.6S)-2.4,6-trimetiloct-2-enóico óleo incolor
[a]D25 = + 53,2 (clorofórmio) RMN1H (250 MHzl CPCAJ
δ = 0,86 ppm (td H-6', 3J6.6 = 5,5 Hz); δ = 0,88 ppm (t, H-8, 3J8-? = 7 Hz), δ = 1,03 ppm (d, H-4', 3J4^ = 6,6Hz); δ = 1,1-1,5 ppm (m, H-5, H-6, H-7)); δ = 1,89 (s, Η-2'); δ = 2,67 ppm (m, H-4); δ = 6,7 ppm (d, Η-3, 3J3.4 = 10 Hz) RMN2C (300 MHz). CDCl3)
δ = 11,2 ppm, C-8; δ = 12,1 ppm, C-2'; δ = 19,0 ppm, C-6', δ = 20,4 ppm, C-4'
δ = 30,0 ppm, C-7; δ = 31,1 ppm, C-4; δ = 32,3 ppm, C-6; δ = 44,1 ppm, C-5.
δ = 125,5 ppm, C-2; δ = 151,1 ppm, C-3; δ = 174,1 ppm, C-1
Os seguintes de acordo com a presente invenção foram preparados pela aplicação dos seguintes procedimentos
composto a
<formula>formula see original document page 33</formula>
C49 H89 O16SNa M = 989,2911 g/mol 2-O-hexadecanoil -3-O-(2-metileicos-2-enoil)-2'-O-sulfato-α ,α '-D-trealose RMN1H (250 MHz). CDCIVMeOD 4/1)
δ = 0,89 ppm (t, 3H-t, 3H-t'), 3J = 7 Hz); δ = 1-1,6 (m, H alifático); δ
= 1,81 ppm (d, (CH3)a', 4J = 1 Hz); δ = 2,2 ppm (m, 2H-a, 2Η-γ'); δ = 3,3-4,7 ppm (m, H-2'; H-3\ H-4, H-4'; H-5, H-5'; H-6ax, Η-6'3χΗ-6βς, H-6'eq); δ = 4,95 (dd, H-2, 3J2-I = 4 Hz e 3J2.3 = 10 Hz); δ = 5,29 ppm (d, H-1, %.2 = 4 Hz); δ = 5,45 ppm (t, H-3, 3J3-4 = 3J3-2 = 10 Hz); δ = 5,52 ppm (d, H-1', 3J1-Z = 4 Hz); δ = 6,8 ppm (tquad, Η-β'; 2Jp-.f = 7,5, 4J = 1 Hz). MALDI-Tof (modelo negativo): M/Z = 965,75
<formula>formula see original document page 34</formula>
C52 H95 O16 S Na
M = 1031,3717 g/mol
3-O-(2,4S-Dimetildocos-2-enoil)-2-O-hexadecanoil-2'-O-sulfato-α,α'-D-trealose RMN1H (250 MHz), CDCI3/MeOD 4/1)
δ = 0,9 ppm (t, 3H-t, 3H-t', 3J = 6,5 Hz); δ = 0,99 ppm (d, (CH3)y', 3J = 6,5 Hz); δ = 1,1-1,6 (m, H alifático); δ = 1,82 ppm (d,(CH3)a', 4J = 1 Hz); δ = 2,22 ppm (t, 2H-a, 3J= 7 Hz); δ = 2,46 ppm (m, Η-γ"); δ = 3,4-4,4 ppm (m, H-2'; H-3', H-4, H-4'; H-5, H-5'; H-6ax, Η-6'3Χ, H-6eq, H-6'eq); δ = 4,87 (dd, H-2, 3J2-1 = 4 Hz e 3J2-3 = 10 Hz); δ = 5,29 ppm (d, H-1, 3J^2 = 4 Hz); δ = 5,44 ppm (t, H-3, 3J3- 4 = 3j3_2 = io Hz); δ = 5,51 ppm (d, H-1', 3Jr.2· = 4 Hz); δ = 6,57 ppm (dquad, H- β'; 3β-γ° =10 Hz, 4J = 1 Hz).
MALDI-Tof (modelo negativo): M/Z = 1007,59
Composto c
<formula>formula see original document page 34</formula> C52 H95 O16S Na M = 1031,3717 g/mol 3-O-(2, 4S-Dimetildocos-2-enoil)-2-O-hexadecanoil-2'-0-sulfato-α,α'-D-trealose RMN1H (250 MHz), CDCl3/MeOD 4/1)
δ = 0,89 ppm (t, 3H-t, 3H-t', 3J = 6,5 Hz); δ = 0,99 ppm (d, (CH3)y', 3J= 6,5 Hz); δ = 1,1-1,6 (m, H alifático); δ = 1,82 ppm (d, (CH3)α', 4J = 1 Hz); δ = 2,21 ppm (t, 2H-a, 3J= 7 Hz); δ = 2,5 ppm (m, Η-γ'); δ = 3,3-4,7 ppm (m, H-2'; H-3' H-4, H-4'; H-5, H-5'; H-6ax, H-6'ax, H-6eq, H-6'eq); δ = 4,95 (dd, H-2, 3J2-1 = 4 Hz e 3J2-3 = 10 Hz); δ = 5,29 ppm (d, H-1, 3J1-2 = 4 Hz); δ = 5,45 ppm (t, H-3, 3J3- 4 = 3J3-2 = 10 Hz); δ = 5,52 ppm (d, H-1', 3J1'-2' = 4 Hz); δ = 6,57 ppm (dquad, H- β'; 3J^β-ϒ-10Hz, 4J= 1 Hz).
MALDI-Tof (modelo negativo): M/Z = 1007,49
Composto d
<formula>formula see original document page 35</formula>
C55 H101 O16 S Na
M = 1073,4523 g/mol
2-O-Hexadecanoil-2'-O-sulfato-3-O-[(E)-(4S,6S)-2,4,6-trimetiltetracos-2-enoil]- α,α'-D-trealose
RMN1H (500 MHz), CDCl3/MeOD 4/1)
δ = 0,86 ppm (d, (CH3)δ', 3J= 6,5 Hz); δ = 0,88 ppm (t, 3H-t, 3H-t', 3J = 7 Hz); δ = 0,97 ppm (d, (CH3)y, 3J = 6,5 Hz); δ = 1-1,6 (m, H alifático); δ = 1,82 ppm (d, (CH3)a', 4J = 1 Hz); δ = 2,22 ppm e 2,26 ppm (2quint, 2H-a, 3J α-β = 8 Hz, 2J = 16 Hz); δ = 2,62 ppm (m, Η-γ'); δ = 3,5-3,8 ppm (m, Η-4, Η-4', Η-5', Η-6, 2Η-6'); δ = 3,94 (t, Η-3', 3J3^ = 3J3^ = 10 Hz); δ = 3,97 ppm (dd, Η-6, 2J = 12 Hz, 3J6.5 = 3Hz); δ = 4,23 ppm (m, Η-2", H-5); δ = 4,97 ppm (dd, Η-2, 3J2-1 = 3,6 Hz e 3J2-3= 10 Hz); δ = 5,25 ppm (d, Η-1', 3J-2 = 3,6 Hz); δ = 5,43 ppm (t, Η- 5 3, 3J3-4 = 3J3-2 = 10 Hz); δ = 5,46 ppm (d, H-1, 3J1-2' = 3,6 Hz); δ = 6,54 ppm (dquad, Η-β'; 3Jβ'-γ' = 10 Hz, 4J = 1,5 Hz).
MALDI-Tof (modelo negativo): M/Z = 1049,47 Composto e
<formula>formula see original document page 36</formula>
C56 H103 O16S Na M = 1087,4792 g/mol
2'-O-Sulfato-2-Hexadecanoil-3 -O-[(4S,6S.8S)-2,4,6.8-tetrametiltetracos-2- enoin-a,a'-D-trealose RMN1H (250 MHzl CDCI3/MeOD 4/1)
δ = 0,89 ppm (t, 3H-t, 3H-t\ 3J = 6,5 Hz); δ = 0,82; 0,84 e 0,97 ppm (3d, (CH3)/, (CH3)6-, (CH3)e); δ = 1-1,6 (m, H alifático); δ = 1,84 ppm (d, (CH3)a., 4J = 1 Hz); δ = 2,24 ppm (m, 2H-a); δ = 2,6 ppm (m, H-γ); δ = 3 - 4,5 ppm (m, Η-2', H-3', H-4, H-4', Η-5, Η-5", 2H-6, 2H-6'); δ = 4,96 ppm (dd, H-2, 3J2-1 = 4 Hz e 3J2-S= 10 Hz); δ = 5,27 ppm (d, H-1', 3J1^ = 4 Hz); δ = 5,43 ppm (t, H-3, 3J3. 4 = 3j3.2 = 10 Hz); δ = 5,48 ppm (d, H-1, 3J1'-2' = 4 Hz); δ = 6,54 ppm (dq, Η-β'; 3Jβ'-γ' = 10,2 Hz,4J= 1 Hz).
MALDI-Tof (modelo negativo): M/Z = 1063,66 Composto f
<formula>formula see original document page 37</formula>
C58 H104 O13 M = 985,3430 g/mol 2-O-Hexadecanoil-3-O-f(4S, 6S, 8S)-2,4,6,8-tetrametiltetracos-2-enoil1-α,α'-D- trealose
RMN1H (250 MHz). CDCWMeOD 4/1)
δ = 0,77 ppm (t, 3H-t, 3H-t', 3J = 6,5 Hz); δ = 0,7; 0,72 e 0,86 ppm (3d, (CH3)y, (CH3)5', (CH3)e); δ = 1-1,5 (m, H alifático); δ = 1,73 ppm (d, (CH3)α', 4J= 1,5 Hz); δ = 2,13 ppm (m, 2H-a); δ = 2,5 ppm (m, H-γ); δ = 3,2 - 3,9 ppm (m, H-2', H-3', H-4, H-4', H-5, H-5', 2H-6, 2H-6'); δ = 4,84 ppm (dd, H-2, 3J2-1 = 4 Hz e 3J2-Z= 10 Hz); δ = 5,0 ppm (d, H-1', 3J1-2 = 4 Hz); δ = 5,16 ppm (d, H-1\ 3Jr'1-2' = 4 Hz); δ = 5,36 ppm (t, H-3,3J3-4 = 3J3-2 = 10 Hz); δ = 5,43 ppm (dq, Η-β'; 3Jβ'-y' = 10,2 Hz, 4J= 1 Hz).
MALDI-Tof (modelo negativo): M/Z = 1007,61
Composto g
<formula>formula see original document page 37</formula> C64 H119 O16 S Na M = 1199,6943 g/mol
2'-O-Sulfato-2-O-tetracosanil-3-O-í[(4S, 6S, 8S)-2,4,6,8-tetrametiltetracos-2- enoil1-α,α'-D-trealose
RMN1H (250 MHz), CDCIVMeOD 4/1)
δ = 0,6-0,9 ppm (m, 3H-t, 3H-t', (CH3)y', (CH3)δ', (CH3)ε'); δ = 1-1,5 (m, H alifático); δ = 1,73 ppm (d, (CH3)α', 4J = 1 Hz); δ = 2,1 ppm (m, 2H-α); δ = 2,5 ppm (m, H-γ'); δ = 3,1 - 4,5 ppm (m, H-2', H-3', H-4, H-4', H-5, H-5', 2H-6, 2H-6'); δ = 4,8 ppm (dd, H-2, 3J2-1 = 4 Hz e 3J2-3 = 10 Hz); δ = 5,16 ppm (d, H-1', 10 3J1-Z = 4 Hz); δ = 5,3 ppm (t, H-3, ZJ3-4 = 3J-2 = 10 Hz); δ = 5,46 (d, H-1', 3J1^2- = 4 Hz); δ = 6,43 ppm (dq, Η-β'; 3JB'-y' = 10,2 Hz1 4J = 1 Hz).
MALDI-Tof (modelo negativo): M/Z = 1175,57 Composto h
<formula>formula see original document page 38</formula>
C48 H87 O16 S Na
M = 975,2642 g/mol
2-0-Octanoil-2'-0-sulfato-3-0-í(£)-(4S.6S)-2,4.6- tetrametiltetracos-2-enoin-
α,α'-D-trealose RMN1H (250 MHzl CDCIVMeOD 4/1)
δ = 0,65 ppm (d, (CH3)8', 3J= 7 Hz); δ = 0,7 ppm (t, 3H-t, 3H-t', 3J 20 =7 Hz); δ = 0,8 ppm (d, (CH3)y, 3J = 7 Hz); δ = 1,1-1,5 (m, H alifático); δ = 1,7 ppm (s, (CH3)a-; δ = 2,1 ppm (t, 2H-a, 3J α.β = 7 Hz); δ = 2,5 ppm (m, Η-γ'); δ = 3,1-4,5 ppm (m, Η-2', Η-3', Η-4, Η-4', Η-5', Η-6, 2Η-6'); δ = 4,8 ppm (dd, Η-2, 3J2-1 = 4 Hz e 3J2-S= 10 Hz); δ = 5,15 ppm (d, Η-1', 3J1'-2' = 4 Hz); δ = 5,3 ppm (t, Η-3, 3J3-4 = 3J3-2 = 10 Hz); δ = 5,4 ppm (d, Η-1', zJ1-T = 4 Hz); δ = 6,4 ppm (d, Η-β'; 3Jβ'-γ'= 10,2 Hz)
MALDI-Tof (modelo negativo): Μ/Ζ = 951,43 Composto i:
<formula>formula see original document page 39</formula>
C31 H53 O16 S Na M = 736,8072 g/mol
2-O-Octanoil-2'-O-sulfato-3-O-[(4S16S)-2,4,6-trimetiloct-2-enoin-α,α'-D- trealose RMN 1H (600 MHz, críoprobo, MeOD)
δ = 0,86 ppm (d, (CH3)0, 3J = 6,6 Hz); δ = 0,88 ppm (t, 3H-t, 3J = 7,2 Hz); δ = 0,9 ppm (t, 3H-t, 3J = 7,2 Hz); δ = 0,99 ppm (d, (CH3V, 3J = 7,2 Hz); δ = 1,1-1,6 ppm (m, H alifático); δ = 1,85 ppm (d, (CH3)α, 4J= 1,5 Hz); δ = 2,27 e 2,3 ppm (2td, 2H-α, 3Jα-β = 7,2 Hz, 2J = 14,4 Hz); δ = 2,66 ppm (m, Η-γ'); δ = 3,41 ppm (t, H-4'; 3J4V = 3J4V = 9,3 Hz); δ = 3,66 ppm (dd, 1 H-6', 3J6V = 5,7 e 2J = 1 1,7 Hz); δ = 3,68 ppm (t, H-4, 3J4-5 = 3J4-3 = 10 Hz); δ = 3,75 ppm (m, H-5\ H-6, H-61); δ = 3,91 ppm (dd, H-6,2J = 12 Hz1 3J6.5 = 2,4 Hz); δ = 3,92 ppm (t, H-3', 3J3'-2', = 3J3'-2' = 9-3 Hz); δ = 4,19 ppm (dd, H-2', 3J2'-1', = 3,6 Hz, 3J2'-3', = 9,3 Hz); δ = 4,24 ppm (ddd, H- 5, 3J5^ = 2,4 Hz, 3J5-6 = 4,2 Hz, 3J5-4 = 10 Hz); δ = 4,98 ppm (dd, H-2, zJ2a = 3,6 Hz e 3J2-Z = 10 Hz); δ = 5,27 ppm (d, Η-1 , 3J1-2 = 3,6 Hz); δ = 5,50 ppm (d, Η-1', 3J1'-2 = 3,6 Hz); δ = 5,51 ppm (t, Η-3, 3J3-4 = 3J3-2 = 10 Hz); δ = 6,52 ppm (dquad, Η-β', 3Jβ'-Y', = 10,2 Hz, 4J = 1,5 Hz)
RMN 13C (600 MHz, crioprobo, MeOD)
δ = 11,6 ppm, C-f; δ = 12,8 ppm, (CH3)α'; δ = 14,4 ppm, C-t; δ = 19,5 ppm, (CH3)6,; δ = 20,8 ppm, (CH3)γ; δ = 23,7 ppm, C-(M); δ = 26,0 ppm, C-β; δ = 30; 30,1; 32,8 ppm, C ácido octanóico; δ = 31,1 ppm, C-(t-1)'; δ = 32,1 ppm, C-γ; δ = 33,6 ppm, C-δ'; δ = 35,0 ppm, C-α; δ = 45,3 ppm, C-ε'; δ = 61,8 ppm, C-6; δ = 62,5 ppm, C-61; δ = 69,9 ppm, C-4; δ = 71,6 ppm, C-4'; δ = 72,0 ppm, C-2; δ =72,8 = ppm, C-3'; δ = 73,4 ppm, C-5; δ = 74,1 ppm, C-5'; δ = 74,4 ppm, C-3; δ =78,4 ppm, C-2'; δ = 93,5 ppm, C-1; δ = 94,3 ppm, C-1'; δ = 127,2 ppm, C-α'; δ =150,2 ppm, C-β1; δ = 169,3 ppm, (C=O)3; δ = 174,3 ppm, (C=O)2.
MALDI-Tof (modo negativo) : M/Z = 713,15
bem como os seguintes compostos:
Composto j:
<formula>formula see original document page 40</formula> Composto I:
<formula>formula see original document page 41</formula>
Composto m:
<formula>formula see original document page 41</formula>
Composto n:
<formula>formula see original document page 41</formula>
Composto o:
<formula>formula see original document page 41</formula> Exemplo 2
Ensaio Ex Vivo de Sulfoglicolipídios de Mycobacterium tuberculosis Para definir a imunogenicidade dos antígenos sulfoglicolipídios, a liberação de IFN-γ foi medida após a estimulação com sulfoglicolipídios purificados. 2 χ 105 PBMC por/poço foram incubados durante 4 dias na presença de GM-CSF (500 U/mL) e IL- 4 (5 ng/mL). As células T efetoras autólogas foram incubadas em soro humano a 10% durante esse tempo. Os sulfoglicolipídios (10 pg/mL) foram adicionados às células que expressam antigenos, CD1. Finalmente, as células efetoras foram adicionadas (2 χ 105/ poço) e a liberação de IFN-γ foi medida com ELISA nos sobrenadantes após 18 horas. O ELISA IFN-γ é realizado em placas imunoabsorventes com 96 poços, que são revestidas com um anticorpo de captura IFN-γ (2 pg/mL) por uma noite. Sítios de ligação não específicos são bloqueados com PBS que contém 1% de albumina de soro bovino. Os sobrenadantes são diluídos 1 : 1 e adicionados em um volume final 100 μl. As placas são encubadas à temperatura ambiente durante 2 horas e removidas por lavagem profunda (3-4 vezes). Finalmente, um anticorpo anti-IFN-γ biotinilado é adicionado durante 1 hora (2 pg/mL). Para detecção do IFN-γ imunorreativo peroxidase de raiz forte é adicionada durante 30 minutos. Finalmente, um substrato cromogênio (TMB, Endogen, MA, USA) é adicionado. Após uma incubação de 20 minutos, a reação é interrompida pela adição de ácido sulfúrico (2%). A intensidade do manchamento é determinada fotometricamente a um comprimento de onda de 480 nm. Para estimar a concentração de citocina nos sobrenadantes, um padrão IFN-γ com uma concentração conhecida é incluída em todos os testes.
Exemplo 3
Estudo In Vivo
Doadores PPD+ (positivos ao teste de tuberculina e doadores PPD (negativos ao teste de tuberculina) foram selecionados e receberam a administração de um composto da presente invenção. A resposta aos sulfoglicolipídios é medida pela avaliação da produção de IFN-γ com o teste ELISA (15 pg/mL) em cada paciente de cada grupo. As respostas em cada grupo foram comparadas.
Exemplo 4
Ensaio de Apresentação de Antígeno
A liberação de IFN-γ produzido pelo clone de célula T preparado de acordo com o método descrito em WO 2004/092192 em resposta à estimulação pelos compostos da presente invenção foi medida.
CD1 + APC foram pré-incubadas em 5x104células/poço durante 2 horas a 37°C com antígeno sonicado (1-10 pg/mL) antes da adição das células T (5x104/poço em triplicado). Após 36 horas o TNF-α e o IFN-γ liberados foram medidos com kits de ELISA sanduíche (lnstrumentation Laboratory). Os dados foram expressos como média ng/mL ou pg/mL ±SD de triplicados. Todos os experimentos foram repetidos pelo menos 2 vezes.
Os resultados estão ilustrados na Figura 1 para o composto e (cpd e) da presente invenção. Eles mostram que os compostos da presente invenção apresentam melhor atividade que os compostos não sulfatados correspondentes (ver o composto f "cpd f) e que os compostos saturados correspondentes tais como descritos em WO 2004/092192 em relação ao composto de comparação (ver "comp".) de fórmula: Mais resultados ilustrados na Figura 2 mostram a atividade dos compostos b e d (cpd b e cpd d).
Claims (29)
1. COMPOSTO, caracterizado pelo fato de ser de fórmula geral (I): <formula>formula see original document page 45</formula> em que: R2', R3', idênticos ou diferentes, são independentemente escolhidos entre H, SO3H ou SO3-/M+, desde que pelo menos um de R2', R3' seja SO3H ou SO3-/M+; M+ é o cátion de um metal, tal como Na+, K+; R2, R3, idênticos ou diferentes, são independentemente escolhidos entre: a) grupos acila graxos b) <formula>formula see original document page 45</formula> ,em que X é uma cadeia hidrocarbonada linear ou ramificada insaturada, eventualmente substituída por um ou mais substituintes; em que pelo menos um entre R2, R3 é b); e seus enantiômeros, diastereoisômeros, suas misturas e seus sais ou ésteres farmaceuticamente aceitáveis.
2. COMPOSTO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que R2 é SO3H ou SO3-/M+ e R3 é H.
3. COMPOSTO, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que X é de fórmula (b-1): -CRi=CRj-Y (b-1) em que: - Y é uma cadeia hidrocarbonada linear ou ramificada, saturada ou insaturada, eventualmente substituída por um ou mais substituintes; - Ri, Rj, idênticos ou diferentes, são independentemente escolhidos entre H, Alquila.
4. COMPOSTO, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que Rl é metila e Rj é H.
5. COMPOSTO, de acordo com a reivindicação 3 ou 4, caracterizado pelo fato de que Y é uma cadeia alquila linear saturada, opcionalmente substituída por um a dez grupos alquila.
6. COMPOSTO, de acordo com uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que a cadeia b) é de fórmula (b-2): <formula>formula see original document page 46</formula> em que r é um número inteiro escolhido entrei, 2 ou 3; I é um número inteiro escolhido entre 0 a 10; q é um número inteiro escolhido entre 0 a 50; desde que I + q > 1; T2 é uma alquila; cada um dos T11 idênticos ou diferentes, são independentemente escolhidos entre os grupos alquila.
7. COMPOSTO, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que r é 1; I é 1, 2 ou 3; q é um número inteiro escolhido entre 10 a 20; T2 é metila; cada um dos Ti é metila, e o átomo de carbono ao qual T' está ligado apresenta uma configuração (S).
8. COMPOSTO, de acordo com uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que os grupos acila graxos são escolhidos no grupo que compreende: <formula>formula see original document page 47</formula> em que m é 14 ou 16 e η é um número inteiro de 2 a 10.
9. COMPOSTO, de acordo com uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que R2 é a) um grupo acila graxo e R3 é b) -C=O-X tal como definido em uma das reivindicações 1 a 8.
10. COMPOSTO, de acordo com uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de ser de fórmula (II): <formula>formula see original document page 48</formula> em que R2, R3, r, ρ, I, q, T2, T^i são tais como definidos acima, ou seu sal correspondente, e seus enantiômeros, diastereoisômeros, suas misturas e seus sais ou ésteres farmaceuticamente aceitáveis.
11. COMPOSTO de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que: -I = 1, q = 14 e r= 1; -I = 2, q = 14 e r= 1; -I = 3, q = 14 e r= 1; -I = 4, q = 14 e r= 1; -I = 1, q = 14 e r = 2; -I = 2, q = 14 e r = 2 -I = 3, q = 14 e r = 2 -I = 4, q = 14 e r = 2 -I = 1, q = 12 e r= 1; -I = 2, q = 12 e =1; -I = 3, q = 12 e r= 1; -I = 4, q = 12 e r= 1; -I = 1, q = 12 e r = 2; -I = 2, q = 12 e r = 2; -I = 3, q = 12 e r = 2; -I = 4, q = 12 e r = 2; -I = 1, q = 16 e r= 1; -I = 2, q = 16 e r= 1; -I = 3, q = 16 e r= 1; -I = 4, q= 16 e r= 1; -I = 1, q = 16 e r = 2; -I = 2, q= 16 e r = 2; -I = 3, q = 16 e r = 2; ou -I = 4, q = 16 e r = 2; em que ρ é 6 a 22 e T2 e Tl são metila.
12. COMPOSTO, de acordo com uma das reivindicações 1 a -11, caracterizado pelo fato de ser escolhido a partir do grupo que consiste em: <formula>formula see original document page 49</formula> <formula>formula see original document page 50</formula> <formula>formula see original document page 51</formula> e seus sais correspondentes, e seus enantiômeros, diastereoisômeros, suas misturas e seus sais ou ésteres farmaceuticamente aceitáveis.
13. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, caracterizada pelo fato de que compreende pelo menos um composto tal como definido em uma das reivindicações 1 a 12 em associação com um veículo farmaceuticamente aceitável.
14. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 13, caracterizada pelo fato de ser em uma forma destinada à administração por via oral ou injetável.
15. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 13 ou 14, caracterizada pelo fato de que compreende outro ou outros produtos úteis para o tratamento ou a profilaxia da tuberculose, tais como proteínas BCG ou micobacterianas.
16. PRODUTOS, caracterizados pelo fato de que compreendem: - pelo menos um composto tal como descrito em uma das reivindicações 1 a 12, - e pelo menos um outro produto útil para o tratamento ou a profilaxia da tuberculose, tais como as proteínas BCG ou micobacterianas, como uma preparação combinada para uso simultâneo, separado ou seqüencial no tratamento ou na profilaxia da tuberculose.
17. USO DE PELO MENOS UM COMPOSTO tal como descrito em uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado pelo fato de ser para a preparação de um medicamento, em particular uma vacina, destinada ao tratamento ou à profilaxia da tuberculose.
18. USO DE PELO MENOS UM COMPOSTO tal como descrito em uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado pelo fato de ser como um ativador de resposta imune, e mais particularmente um ativador de reação inflamatória.
19. USO DE PELO MENOS UM COMPOSTO tal como descrito em uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado pelo fato de ser para induzir a ativação dos linfócitos T.
20. USO DE PELO MENOS UM COMPOSTO tal como descrito em uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado pelo fato de ser para induzir a produção de IFN-γ, TNF-α, IL-4 ou granulisina.
21. MÉTODO IN VITRO PARA DIAGNOSTICAR A TUBERCULOSE, caracterizado pelo fato de que compreende as seguintes etapas: - fornecer uma amostra biológica de um individual PPD positivo; - colocar a referida amostra em contato com um composto de fórmula (X): <formula>formula see original document page 53</formula> em que: R2', R3', idênticos ou diferentes, são independentemente escolhidos entre H, SO3H ou SO3-/M+, desde que pelo menos um dos R2 , R3 seja SO3H ou SO3-/M+; - M+ é o cátion de um metal, tal como Na+, K+; R2, R3, idênticos ou diferentes, são independentemente escolhidos entre: a) grupos acila graxos b) <formula>formula see original document page 54</formula> , em que X é uma cadeia hidrocarbonada linear ou ramificada insaturada, eventualmente substituída por um ou mais substituintes; e seus enantiômeros, diastereoisômeros, suas misturas e seus sais ou ésteres farmaceuticamente aceitáveis, - avaliar a ativação dos linfócitos T; e - comparar a ativação dos linfócitos T depois e antes da administração do composto.
22. KIT para diagnosticar a tuberculose, caracterizado pelo fato que compreende: um composto de fórmula (X): <formula>formula see original document page 54</formula> em que: R2', R3', idênticos ou diferentes, são independentemente escolhidos entre H, SO3H ou SO3-/M+, desde que pelo menos um dos R2, R3 seja SO3H ou SO3-/M+; - M+ é o cátion de um metal, tal como Na+, K+; R2, R3, idênticos ou diferentes, são independentemente escolhidos entre: a) grupos acila graxos b) <formula>formula see original document page 54</formula> , em que X é uma cadeia hidrocarbonada linear ou ramificada insaturada, eventualmente substituída por um ou mais substituintes; e seus enantiômeros, diastereoisômeros, suas misturas e seus sais ou ésteres farmaceuticamente aceitáveis, - células dendríticas; e - meios para detectar a ativação dos linfócitos T.
23. USO, de um composto de fórmula (X): <formula>formula see original document page 55</formula> em que R2', R3', idênticos ou diferentes, são independentemente escolhidos entre H, SO3H ou SO3"VM+, desde que pelo menos um dos R2', R3' seja SO3H ou SO3"VM+; - M+ é o cátion de um metal, tal como Na+, K+; R2, R3, idênticos ou diferentes, são independentemente escolhidos entre: a) grupos acila graxos b) <formula>formula see original document page 55</formula> , em que X é uma cadeia hidrocarbonada linear ou ramificada insaturada, eventualmente substituída por um ou mais substituintes; e seus enantiômeros, diastereoisômeros, suas misturas e seus sais ou ésteres farmaceuticamente aceitáveis, caracterizado pelo fato de ser para avaliar a eficácia de uma vacina preparada com Mycobacterium tuberculosis recombinante.
24. LIGANTES, caracterizado pelo fato de serem aos compostos de fórmula (X): <formula>formula see original document page 56</formula> em que R2', R3', idênticos ou diferentes, são independentemente escolhidos entre H, SO3H ou SO3-/M+, desde que pelo menos um dos R2', R3' seja SO3H ou SO3-/M+; - M+ é o cátion de um metal, tal como Na+, K+; R2, R3, idênticos ou diferentes, são independentemente escolhidos entre: a) grupos acila graxos b) <formula>formula see original document page 56</formula>, em que X é uma cadeia hidrocarbonada linear ou ramificada insaturada, eventualmente substituída por um ou mais substituintes; e seus enantiômeros, diastereoisômeros, suas misturas e seus sais ou ésteres farmaceuticamente aceitáveis.
25. MÉTODO, KIT, USO OU LIGANTES, tais como definidos nas reivindicações 21, 22, 23 ou 24, caracterizados pelo fato de que os compostos de fórmula (X) são os de fórmula (I) tais como definidos nas reivindicações 1 a 12.
26. PROCESSO DE PREPARAÇÃO DE UM COMPOSTO de fórmula (I) tal como descrito nas reivindicações 1 a 12, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: - sulfonar; e - acilar com os compostos correspondentes de formulas (IV) e <formula>formula see original document page 57</formula> em que R^2 e R^3 são definidos tal como na formula (I) e X e Y independentemente representam um átomo de halogênio ou um grupo OH; um composto de fórmula (III): <formula>formula see original document page 57</formula> em que cada um de P^4, P^5, P4', P5', idênticos ou diferentes, representam H ou um grupo protetor OH- ou P4 e P5 e/ou P4' e P5' formam juntos um grupo protetor cíclico OH-; em que as reações de sulfonação e acilação são realizadas em qualquer ordem, sucessivamente ou alternadamente.
27. PROCESSO, de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente etapas de proteção e/ou desproteção.
28. PROCESSO, de acordo com a reivindicação 26 ou 27, caracterizado pelo fato de que compreende ainda a etapa de isolar o composto obtido.
29. PROCESSO, de acordo com a reivindicação 26, 27 ou 28, caracterizado pelo fato de que o composto de fórmula (IV'-a): <formula>formula see original document page 58</formula> é obtido a partir do composto correspondente de fórmula (V'): <formula>formula see original document page 58</formula> por uma reação de Wittig1 usando um composto de fórmula (VI) <formula>formula see original document page 58</formula> seguida de uma saponificação.
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