BRPI0806507A2

BRPI0806507A2 - expressão diferencial de alelos subgenÈmicos especifìcos no algodão e usos dos mesmos

Info

Publication number: BRPI0806507A2
Application number: BRPI0806507-1A
Authority: BR
Inventors: Steven Engelen; Antonio Arioli
Original assignee: Bayer Bioscience Nv
Priority date: 2007-01-11
Filing date: 2008-01-07
Publication date: 2011-09-06
Also published as: EP2099917A2; AU2008204548B2; EP2099917B1; WO2008083969A2; US9057073B2; BRPI0806507B1; ZA200904352B; CN101578371A; AU2008204548A1; ES2548763T3; CN101578371B; WO2008083969A3; US20100115659A1

Abstract

EXPRESSãO DIFERENCIAL DE ALELOS SUBGENÈMICOS ESPECìFICOS NO ALGODãO E USOS DOS MESMOS. A presente invenção refere-se a métodos e meios para alterar as propriedades da fibra tais como o comprimento da fibra em plantas que produzem fibra tal como o algodão. Adicionalmente, são providos promotores para plantas com um perfil de expressão preferencial para fibra ou seletiva para fibra.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "EXPRES- SÃO DIFERENCIAL DE ALELOS SUBGENÔMICOS ESPECÍFICOS NO ALGODÃO E USOS DOS MESMOS".

Campo da Invenção

A presente invenção refere-se ao campo da agricultura, mais especificamente dirigida ao uso de técnicas de biologia molecular para alte- rar plantas que produzem fibras, particularmente plantas de algodão e/ou para acelerar a reprodução de tais plantas que contém fibras. São providos métodos e meios para alterar a qualidade das fibras tais como aumentar o comprimento das fibras, particularmente o comprimento das fibras em plu- tnas ou para diminuir o comprimento de fibras distorcidas. Também são pro- vidos métodos para identificar marcadores moleculares associados com o comprimento da fibra em uma população de variedades de algodão e plan- tas parentais relacionadas. Além disso, são fornecidas plantas promotoras com perfil de expressão preferencial para fibra ou seletivo para fibra. Os promotores também são temporariamente regulados. Antecedentes da Técnica

O algodão fornece a maior parte da fibra de alta qualidade para a indústria têxtil. A modificação das características das fibras de algodão que melhor satisfaz as necessidades da indústria é um empenho mais importante na reprodução tanto por métodos clássicos quanto por alterar geneticamente o genoma das plantas de algodão.

Cerca de 90% do algodão cultivado mundialmente é Gossypium hirsutum L., enquanto que Gossypium barbadense é responsável por cerca de 8%. Como na maioria das plantas que produzem flores, os genomas de algodão são considerados como tendo incorrido em um ou mais eventos de poliploidização e terem desenvolvido-se pela união de genomas divergentes em um núcleo comum. O comércio do algodão é dominado por formas aper- feiçoadas de duas espécies tetraploides "AD", Gossypium hirsutum L. e Gossypium barbadense L. Considera-se que algodões tetraploides tenham formado-se a cerca de 1-2 milhões de anos atrás, no Novo Mundo, pela hi- bridização entre o táxon genômico materno Old World "A" que se assemelha ao Gossypium herbaceum e táxon genômico paterno New World "D" que se assemelha ao Gossypium raimondii ou Gossypium gossypioides. Os táxons de genoma diploide A selvagem e de Gossypium tetraploide AD produzem fibras que podem ser tecidas. Uma espécie de genoma diploide A, Gossypi- um arboreum, permanece intensivamente reproduzida e cultivada na Ásia. Seu ascendente mais próximo e possível, a espécie de genoma diploide A G. herbaceum também produz fibra capaz de ser tecida. Embora as semen- tes de genoma diploide D sejam sexualmente maduras, nenhuma produz fibras capazes de serem tecidas. Nenhum táxon de outros genomas diploi- des de Gossypium reconhecidos (B, C, E, F e G) foi domesticado. A seleção intensa direcionada por seres humanos tem produzido consistentemente algodões tetraploides AD que têm rendimento e/ou características de quali- dade superiores comparados aos cultivares de genoma diploide A. A repro- dução seletiva de G. hirsutum (AADD) tem enfatizado o rendimento máximo, enquanto que G. barbadense (AADD) é valorizado por suas fibras de com- primento, resistência e pureza superiores (Jiang et ai, 1998 - Proc Natl A- cad Sci USA. 14 de Abril de 1998; 95(8): 4419-4424).

Uma fibra de algodão é uma célula única que se inicia na epi- derme do tegumento externo dos óvulos, na antese ou pouco antes. Posteri- ormente, as fibras alongam-se rapidamente por cerca de 3 semanas antes delas mudarem para a síntese intensiva de celulose da parede celular se- cundária. As células da fibra interligam-se apenas ao revestimento subjacen- te da semente nas suas extremidades basais e o influxo de solutos, água e outras moléculas ocorre através tanto dos plasmodesmos quanto da mem- brana plasmática. Ruan et ai, 2001 (Plant Cell 13:47-63) demonstraram um fechamento transitório dos plasmodesmos durante o alongamento da fibra. Ruan et al., 2004 (Plant Physiology-Vol 136:pp. 4104-4113) compararam a duração do fechamento de plasmodesmos entre diferentes genótipos de al- godão que diferiam no comprimento da fibra e encontraram uma correlação positiva entre a duração do fechamento de plasmodesmos e o comprimento da fibra. Posteriormente, foi apresentada a evidência microscópica que mos- trou deposição de calose e degradação da base da fibra, que se correlaciona com o período de fechamento e reabertura de plasmodesmos. Além disso, a expressão de um gene de p-1,3-endoglucanase (GhGIuc 1) nas fibras, per- mitindo degradar a calose, correlacionou-se com a reabertura dos plasmo- desmos na base da fibra.

WO2005/017157 descreve métodos e meios para modular o comprimento da fibra em plantas que produzem fibras tais como o algodão, pela alteração da fase de alongamento da fibra como descrito em Ruan et al 2001. A fase de alongamento da fibra pode ser aumentada ou diminuída pe- la interferência com a deposição de calose nos plasmodesmos na base das células da fibra.

Além disso, poderá ser interessante para a modificação de fi- bras através de manipulação genética, possuir promotores que são prefe- rencialmente ou especificamente expressos em células de fibra apenas e/ou que são expressos apenas a partir de um estágio particular de desenvolvi- mento da fibra.

WO2004/018620 refere-se a uma molécula de ácido nucleico i- solado que codifica uma quitinase endógena de algodão e seu promotor, que são preferencialmente expressos nas fibras durante a deposição da parede secundária. O polipeptídeo codificado pela molécula de ácido nucleico, um construto de DNA que liga a molécula de ácido nucleico isolado com um promotor, o construto de DNA incorporado em um sistema de expressão, uma célula hospedeira, uma planta ou uma semente de planta também são descritos. O documento também refere-se a um construto de DNA que liga o promotor isolado com um segundo DNA assim como sistemas de expressão, células hospedeiras, plantas ou sementes de plantas que contém o construto de DNA. Métodos para conferir resistência a insetos e fungos, regular o con- teúdo de celulose da fibra e métodos para expressar um gene preferencial- mente nas fibras durante a deposição da parede secundária também são descritos.

Poderá ser útil ter promotores alternativos que dirigirão a ex- pressão de gene preferencialmente e/ou acentuadamente nas fibras durante a deposição da parede secundária, isto é, acentuadamente e continuamente (por exemplo, >50% de sua atividade máxima), por exemplo, a partir do iní- cio da deposição da parede secundária até seu término ou, por exemplo, a partir do estágio de maturação. O início da deposição da parede secundária é definido como o momento em que o peso seco/unidade de comprimento de uma fibra de algodão começa a aumentar ou quando o peso se- co/unidade de superfície de área de qualquer célula começa a aumentar a - través da síntese de parede com novo material que contém mais do que 40% (peso/peso) de celulose. No caso de fibra de algodão de G. hirsutum L., isso é esperado ocorrer entre 14-17 DPA quando as plantas de algodão são cultivadas sob condições típicas na estufa ou no campo (temperatura diurna de 26 a 34°C, temperatura noturna de 20 a 26°C, intensidade luminosa maior ou igual a 1000 einsteins/m2/s, com água e nutrição mineral adequadas). O final da formação da parede celular secundária e o início da fase de matura- ção está geralmente em torno de 35 DPA no caso de fibra de algodão de G. hirsutum L.

Além disso, poderá ser útil ter promotores alternativos que dirigi- rão a expressão de gene apenas ou preferencialmente nas fibras enquanto excluem ou minimizam a expressão em outros tecidos.

As invenções descritas a seguir nas diferentes modalidades, e- xemplos, figuras e reivindicações proveem métodos e meios aperfeiçoados para modulação de comprimento de fibra pela diminuição ou aumento da deposição de calose na base da célula da fibra em um momento particular. As invenções descritas a seguir também proveem promotores específicos para fibra e/ou preferenciais para fibra e regiões promotoras.

Sumário da Invenção

Em uma modalidade da invenção, é provido um promotor prefe- rencial para célula de fibra compreendendo uma seqüência de nucleotídeos selecionada do seguinte grupo de seqüências de nucleotídeo:

a) uma seqüência de nucleotídeos que compreende a seqüência de nucleotídeos de SEQ ID N° 9 a partir do nucleotídeo na posição 2149 até o nucleotídeo na posição 2307;

b) uma seqüência de nucleotídeos que compreende a seqüência de nucleotídeos de SEQ ID N0 10 a partir do nucleotídeo na posição 3109 até o nucleotídeo na posição 3269;

c) uma seqüência de nucleotídeos que compreende a seqüência de nucleotídeos que tem pelo menos 70%, preferivelmente pelo menos 80%, mais preferivelmente pelo menos 90%, particularmente pelo menos 95% de identidade de seqüência ou que é, mais particularmente, idêntica a qualquer uma das seqüências de nucleotídeos mencionadas sob a) ou b) ou

d) uma seqüência de nucleotídeos que compreende a seqüência de nucleotídeos de um fragmento de DNA com cerca de 150 bp a cerca de 1000 bp que hibridiza sob condições estringentes com um fragmento de DNA que tem a seqüência de nucleotídeos mencionada sob a), b) ou c).

O promotor preferencial para célula de fibra pode compreender a seqüência de nucleotídeos de SEQ ID N0 9 da posição 465 até a posição 2307; ou a seqüência de nucleotídeos de SEQ ID N0 9 da posição 1374 até a posição 2307; a seqüência de nucleotídeos de SEQ ID N0 9 da posição 1531 até a posição 2307; ou a seqüência de nucleotídeos de SEQ ID N0 10 da posição 1397 até a posição 3269; ou a seqüência de nucleotídeos de SEQ ID N0 10 da posição 2371 até a posição 3269; ou a seqüência de nu- cleotídeos de SEQ ID N010 da posição 2718 até a posição 3269.

Em outra modalidade, a invenção provê uma região promotora preferencial para célula de fibra que compreende um promotor preferencial para célula de fibra como aqui descrito, compreendendo ainda a seqüência de nucleotídeos de SEQ ID N0 9 do nucleotídeo da posição 2308 ao nucleo- tídeo da posição 2409 ou o nucleotídeo da posição 3270 ao nucleotídeo da posição 3372.

Em outra modalidade da invenção, é provido um gene quimérico que compreende as seguintes regiões de DNA operativamente ligadas:

a) um promotor preferencial para célula de fibra como aqui des- crito;

b) uma região de DNA heterólogo que codifica um RNA biologi- camente ativo de interesse; e

c) um sinal de término da transcrição e de poliadenilação. O RNA biologicamente ativo pode codificar uma proteína de in- teresse, tal como N-acetilglicosamina transferase, preferivelmente uma N- acetilglicosamina transferase do tipo NodC, uma celulose sintase, uma suca- rose sintase, preferivelmente uma sucarose sintase do tipo C; uma sucarose fosfato sintase ou uma β-1,3-endoglucanase. O RNA biologicamente ativo também pode ser um RNA inibitório ou RNA de silenciamento tal como uma ribozima, microRNA, RNA em forma de grampo de fita dupla, particularmen- te marcado para regular negativamente a expressão de um gene endógeno de algodão, tal como β-1,3-endoglucanase xilano sintase (cs1F), xiloglicano sintase (cs1 D) ou 1,3-1,4 glicano sintase (cs1 C).

Também são providas célula de planta e plantas, tais como plantas de algodão, e sementes dessa que compreendem tais genes quimé- ricos. Uma semente de uma planta que compreende em suas células um gene quimérico de acordo com qualquer uma das reivindicações 11 a 15.

A invenção provê ainda um método para expressar um RNA bio- logicamente ativo, preferencialmente em uma célula de fibra de uma planta que produz fibra, tal como uma planta de algodão, o método compreendendo as etapas de fornecimento de células de planta com um gene quimérico de acordo com a invenção e cultivo das plantas.

Em outra modalidade, a invenção é dirigida ao uso de um pro- motor específico para fibra e/ou preferencial para fibra de acordo com a in- venção para expressão preferencial de um RNA biologicamente ativo em células de fibra de uma planta que produz fibra tal como uma planta de algo- dão.

A invenção ainda provê uma molécula de DNA isolado que compreende uma seqüência de nucleotídeos que codificam uma proteína que compreende uma seqüência de aminoácidos que tem pelo menos 95% de identidade de seqüência, preferivelmente idêntica, a seqüência de ami- noácidos de SEQ ID N0 11 ou SEQ ID N0 12 e que codifica uma β-1,3- endoglucanase; uma molécula de DNA isolado que compreende a seqüência de nucleotídeos selecionada do grupo de SEQ ID N0 1; SEQ ID N0 2, SEQ ID N0 3 e SEQ ID N0 4 ou uma molécula de DNA isolado que compreende uma seqüência de nucleotídeos de SEQ ID N° 9 da posição 2410 a 2443 e a se- qüência de nucleotídeos de SEQ ID N° 9 da posição 2556 a 3499 ou se- qüência de nucleotídeos de SEQ ID N° 10 da posição 3373 a 3406 e a se- qüência de nucleotídeos de SEQ ID N° 10 da posição 3501 a 4444. Essas moléculas de DNA isolado podem ser usadas para o isolamento de um pro- motor preferencial ou região promotora para célula de fibra.

A invenção também provê um método para isolar uma região promotora preferencial para célula de fibra, compreendendo as etapas de:

- identificar um fragmento genômico que codifica um transcrito de RNA a partir do qual um cDNA pode ser sintetizado, o cDNA compreen- dendo a seqüência de nucleotídeos de SEQ ID N° 1, SEQ ID N° 2, SEQ ID N° 3 ou SEQ ID N0 4 ou seus equivalentes funcionais;

- isolar uma região de DNA a montante de uma seqüência de nucleotídeos que codifica a proteína com as seqüências de aminoácidos de SEQ ID N° 11 ou SEQ ID N° 12 ou seus equivalentes funcionais.

Também são providos promotores e regiões promotoras seleti- vas para fibra por esse método.

De acordo com uma segunda característica da invenção, é pro- vido um método para alterar as propriedades de uma fibra em uma planta que produz fibra, aumentando particularmente o comprimento de uma fibra de uma planta de algodão, compreendendo a etapa de introduzir um gene quimérico em uma célula de planta de algodão, o gene quimérico compreen- dendo os seguintes elementos de DNA operativamente ligados:

(a) um promotor que pode ser expresso em planta, preferivel- mente um promotor que pode ser expresso em planta que controle a trans- crição nas células de fibra tais como o promotor beta-específico para tubuli- na de algodão, o promotor de actina específico para fibra de algodão, um promotor específico para fibra a partir de um gene de proteína de transferên- cia de lipídio de algodão, um promotor de um gene de expansina de algodão ou um promotor de um gene de quitinase no algodão ou um promotor aqui descrito;

(b) uma região de DNA transcrito, que quando transcrito produz uma molécula de RNA biologicamente ativo capaz de reduzir a expressão de um gene endógeno que codifica ß-1,3-endoglucanase para a planta que pro- duz fibra, a ß-1,3-endoglucanase que está envolvida na remoção de calose dos plasmodesmos e

(c) uma região terminal 3' que compreende sinais de término da transcrição e de poliadenilação que funcionam em células de planta,

caracterizado em que apenas a expressão de um alelo subge- nômico específico do gene que codifica ß-1,3-endoglucanase endógena é regulado negativamente. Em uma modalidade preferida, o gene que codifica ß-1,3-endoglucanase está compreendido dentro do subgenoma D da planta de algodão. O gene que codifica ß-1,3-endoglucanase compreendida dentro do subgenoma D pode ser caracterizado pela presença de uma seqüência de íntron que tem a seqüência de nucleotídeos de SEQ ID N° 10 da posição 3407 a 3500 ou pode ser caracterizado pela presença de uma seqüência de nucleotídeos AAGATC cerca de 326 nucleotídeos a jusante do códon de iní- cio da tradução (e que não inclui o códon de início da tradução). Convenien- temente, o gene que codifica ß-1,3-endoglucanase compreendido dentro do subgenoma D pode ser caracterizado pela identificação de um fragmento com cerca de 538 bp e um fragmento com 118 bp após amplificação por PCR com oligonucleotídeos que têm a seqüência de nucleotídeos de SEQ ID N° 5 e SEQ ID N° 6 seguida pela digestão com a enzima de restrição A1wl. O gene que codifica ß-1,3-endoglucanase também pode estar codifi- cando uma proteína que compreende a seqüência de aminoácidos de SEQ ID N° 12 ou o gene compreende a seqüência de nucleotídeos de SEQ ID N° 2. A planta de algodão pode ser Gossypium hirsutum.

O RNA biologicamente ativo pode ser um RNA antissense que compreende pelo menos 19 nucleotídeos que têm pelo menos 94% de iden- tidade de seqüência com o complemento da seqüência de nucleotídeos de SEQ ID N° 3 ou um RNA de sense que compreende pelo menos 19 nucleo- tídeos que têm pelo menos 94% de identidade de seqüência com a seqüên- cia de nucleotídeos de SEQ ID N° 3 ou uma molécula de RNA de fita dupla que compreende pelo menos 19 nucleotídeos que têm pelo menos 94% de identidade de seqüência com o complemento da seqüência de nucleotídeos de SEQ ID N0 3 e uma fita de RNA complementar essencialmente similar ao complemento de pelo menos 19 nucleotídeos. Preferivelmente1 os 19 nu- cleotídeos mencionados compreendem pelo menos um nucleotídeo específi- co para o gene Ghgluc 1 do subgenoma D como indicado na Figura 2. Em outra modalidade ainda de acordo com a invenção, o RNA de fita dupla é um microRNA processado a partir de um pré-microRNA que compreende a se- qüência de nucleotídeos de SEQ ID N0 15, SEQ ID N0 16, SEQ ID N0 20 ou SEQ ID N0 21.

A invenção também provê um método para diminuir o compri- mento de uma fibra de uma planta que produz fibra, compreendendo a etapa de introduzir um gene quimérico em uma célula da planta que produz fibra, cujo gene quimérico compreende os seguintes fragmentos de DNA operati- vamente ligados:

(a) um promotor que pode ser expresso em planta de acordo com as reivindicações 1b, 5, 6 ou 7;

(b) uma região de DNA que codifica uma proteína β-1,3 endo- glucanase tal como uma proteína que tem uma seqüência de aminoácidos que tem pelo menos 95% de identidade de seqüência com a seqüência de aminoácidos de SEQ ID N0 11 ou SEQ ID N0 12; e

(c) uma região terminal 3' compreendendo sinais de término da transcrição e de poliadenilação que funcionam em células da planta.

Ainda uma outra modalidade da invenção diz respeito a um ge- ne quimérico como descrito aqui ou a uma célula de uma planta que produz fibra ou a uma planta que produz fibra que compreende tal gene quimérico.

Em outra modalidade ainda, a invenção provê fibras produzidas de acordo com os métodos aqui descritos. Descrição resumida das figuras

Figura 1: alinhamento de regiões promotoras do gene de β-1,3 endoglucanase do subgenoma A e do subgenoma D de Gossypium hirsu- tum. A seqüência de nucleotídeos do promotor do subgenoma A (seqüência superior) corresponde a seqüência de nucleotídeos de SEQ ID N0 9 da posi- ção 1460 a 2408. A seqüência de nucleotídeos do promotor do subgenoma D (seqüência inferior) corresponde a seqüência de nucleotídeos de SEQ ID N0 10 da posição 2372 a 3372. As diferenças na seqüência de nucleotídeos são indicadas por caixas cinza. Nucleotídeos que não têm um nucleotídeo correspondente na outra região promotora são indicados por traços na se- qüência de nucleotídeos que não tem os nucleotídeos. A homologia total entre as duas regiões promotoras é de cerca de 71% de identidade de se- qüência.

Figura 2: alinhamento de regiões codificadoras do gene de β-1,3 endoglucanase (sem íntron) do subgenoma A e do subgenoma D de Gossy- pium hirsutum. A seqüência de nucleotídeos da região codificadora do alelo do subgenoma A (seqüência superior) corresponde a seqüência de nucleotí- deos de SEQ ID N0 9 da posição 2410 a posição 2443 e da posição 2556 a 3499. A seqüência de nucleotídeos da região codificadora do alelo do sub- genoma D (seqüência inferior) corresponde a seqüência de nucleotídeos de SEQ ID N0 10 da posição 3373 a posição 3406 e da posição 3501 a 4444. As diferenças na seqüência de nucleotídeos são indicadas por caixas cinza. Nucleotídeos que não têm um nucleotídeo correspondente na outra região promotora são indicados por traços na seqüência de nucleotídeos que não tem os nucleotídeos. A homologia total entre as duas regiões promotoras é de cerca de 97% de identidade de seqüência.

Figura 3: alinhamento da seqüência de íntron do gene de β-1,3 endoglucanase do subgenoma A e do subgenoma D de Gossypium hirsu- tum. A seqüência superior corresponde a seqüência de nucleotídeos do ín- tron do alelo do subgenoma A, enquanto que a seqüência inferior corres- ponde a seqüência de nucleotídeos do íntron do alelo do subgenoma D.

Figura 4: alinhamento da seqüência de aminoácidos de β-1,3 endoglucanase codificada pelo alelo do subgenoma A (seqüência superior que corresponde a SEQ ID N0 11) e pelo alelo do subgenoma D (seqüência inferior que corresponde a SEQ ID N0 12).

Figura 5: alinhamento da seqüência de nucleotídeos de SEQ IDs 1 a 4 da posição do nucleotídeo 201 a 211. Q sítio de reconhecimento da enzima de restrição Alw 1 presente apenas na seqüência de nucleotídeos do alelo do subgenoma A do gene de β-1,3 endoglucanase está sublinhado e representado em itálico.

Figura 6: Correlação entre a curva de crescimento da fibra (pai- nel A) e a expressão do gene de β-1,3 endoglucanase (GhGIuc 1) (painel B). DNA de uma biblioteca de cDNA de fibras (em desenvolvimento) em Gossy- pium hirsutum foi extraído e equalizado. Os fragmentos de PCR foram ampli- ficados usando os iniciadores de oligonucleotídeo SE002 e SE003 (SEQ ID N0 5 e 6) e digeridos com Alwl. Um produto de PCR amplificado para a vari- ante do genoma A rendeu 3 fragmentos (479bp+118bp+59bp), enquanto que para a variante do genoma D rendeu apenas 2 fragmentos (538bp+118bp).

Figura 7: Análise de expressão de GhGIuc 1 em folhas, raízes e caules de algodão por RT-PCR. O RNA extraído das folhas, raízes e caules de algodão foi submetido a análise RT-PCR para detectar a expressão de glicanase 1 ou da proteína fosfatase 2A (pp2A). A síntese da primeira fita de cDNA foi realizada usando SuperScript First-Strand Synthesis System de Invitrogen. Banda 1: marcador biológico de 100 bp; banda 2: amostra de RNA de folha de algodão + iniciadores específicos para Gluc 1 + transcripta- se reversa; banda 3: amostra de RNA de folha de algodão + iniciadores es- pecíficos para Gluc 1 - transcriptase reversa; banda 4: amostra de RNA de raiz de algodão + iniciadores específicos para Gluc 1 + transcriptase reversa; banda 5: amostra de RNA de raiz de algodão + iniciadores específicos para Gluc 1 - transcriptase reversa; banda 6: amostra de RNA de caule de algo- dão + iniciadores específicos para Gluc 1 + transcriptase reversa; banda 7: amostra de RNA de caule de algodão + iniciadores específicos para Gluc 1 - transcriptase reversa; banda 8: DNA genômico (Fibermax 400 ng) + iniciado- res específicos para Gluc 1; banda 9: marcador biológico de 100 bp; banda 10: amostra de RNA de folha de algodão + iniciadores específicos para pp2A + transcriptase reversa; banda 11: amostra de RNA de folha de algodão + iniciadores específicos para pp2A - transcriptase reversa; banda 12: amostra de RNA de raiz de algodão + iniciadores específicos para pp2A + transcrip- tase reversa; banda 13: amostra de RNA de raiz de algodão + iniciadores específicos para pp2A - transcriptase reversa; banda 14: amostra de RNA de caule de algodão + iniciadores específicos para pp2A + transcriptase rever- sa; banda 15: amostra de RNA de caule de algodão + iniciadores específicos para pp2A - transcriptase reversa; banda 16: marcador biológico de 100 bp;

banda 17: RNA de controle positivo (fornecido com o kit). Modalidades Detalhadas

A presente invenção é baseada no achado inesperado de que o momento da expressão dos alelos específicos dos subgenomas A e D do gene de β-1,3-endoglucanase específica para fibra (GhGIuc 1) é diferente pelo menos em Gossypium hirsutum. Enquanto o início da expressão do ale- lo específico do subgenoma D correlaciona-se com o final da fase de alon- gamento rápido (cerca de 14 a 17 dias pós-antese, daqui por diante "DPA"), o início da expressão do subgenoma A é postergado até o início da fase de maturação tardia da fibra (cerca de 35 a 40 DPA) dependendo das condi- ções de crescimento.

Consequentemente, em um aspecto, a presente invenção refe- re-se a identificação de novos promotores específicos para fibra que são expressos, preferencialmente, em células de fibra tanto no final da fase de alongamento rápido quanto no início da fase de maturação da fibra. Tais promotores têm uma utilidade, por exemplo, na expressão de genes quimé- ricos que expressam uma nova biomolécula nos estágios de desenvolvimen- to tardio da fibra, por exemplo, XET aumentada, Domínio de Ligação de Ce- lulose (CBD), genes mutantes do Inchaço da Raiz (RSW), compósi- tos/propriedades de coloração, plásticas, de digestibilidade de celulose, de parede celular nova. Os promotores também podem ser usados para dirigir a expressão de gene em fibras com 20, 30, 40 DPA; por exemplo, a produção de quitina nos estágios tardios do desenvolvimento da fibra de algodão (20, 30, 40 DPA) ou para expressão de gene em 40 DPA em fibras, por exemplo, produção de quitina em estágios muito tardios de desenvolvimento da fibra (40 DPA). Os promotores de acordo com a invenção também poderiam ser usados para dirigir a expressão de genes CesA em 40 DPA para biossíntese intensificada de celulose e propriedades aperfeiçoadas da fibra ou para pro- duzir RNA biologicamente ativo dirigido ao estágio de silenciamento especí- fico de genes endógenos de algodão, tal como o silenciamento de β-1,3- endoglucanase para um crescimento prolongado da fibra. Os promotores poderão ser aplicados no estágio de expressão específica de genes quiméri- cos que codificam, por exemplo, a calose sintase, para alterar as proprieda- des e qualidade da fibra.

Em outro aspecto, a presente invenção está dirigida para o si- lenciamento da expressão de um alelo de subgenoma específico para o ge- ne de β-1,3-endoglucanase específica para fibra, particularmente o silencia- mento do alelo específico do subgenoma D, para prevenir a degradação da calose e assim aumentar a fase de alongamento rápido da fibra e o compri- mento da fibra, por exemplo, no algodão, particularmente em Gossypium hirsutum.

De acordo com uma modalidade do primeiro aspecto da inven- ção, a invenção provê um fragmento de promotor específico para fibra e/ou preferencial para fibra que pode ser isolado do algodão, particularmente da espécie Gossypium hirsutum, e que está localizado a montante das seqüên- cias de ácido nucleico que codificam uma β-1,3-endoglucanase específica para fibra, que compreendem a seqüência de aminoácidos de SEQ ID 11, 12, 7 ou 8 e suas variantes.

Como usado aqui, a expressão "promotor" denota qualquer DNA que é reconhecido e ligado (diretamente ou indiretamente) por uma RNA polimerase dependente de DNA durante o início da transcrição. Um promo- tor inclui um sítio de início da transcrição e sítios de ligação para fatores de início da transcrição e RNA polimerase e podem compreender vários outros sítios (por exemplo, intensificadores), nos quais proteínas reguladoras de expressão d gene podem ligar-se.

O termo "região reguladora", como usada aqui, significa qual- quer DNA que está envolvido no direcionamento da transcrição e no controle (isto é, regulação) do momento e do nível de transcrição de uma dada se- qüência de DNA, tal como um DNA que codifica uma proteína ou polipeptí- deo. Por exemplo, uma região reguladora 5' (ou "região promotora") é uma seqüência de DNA localizada a montante (isto é, 5') de uma seqüência codi- ficadora e que compreende o promotor e a seqüência líder 5' não-traduzida. Uma região reguladora 3' é uma seqüência de DNA localizada a jusante (isto é, 3') da seqüência codificadora e que compreende sinais de formação(e/ou regulação) da transcrição da terminação 3', incluindo um ou mais sinais de poliadenilação.

O termo "gene" significa qualquer fragmento de DNA compreen- dendo uma região de DNA (a região de DNA transcrito) que é transcrito em uma molécula de RNA (por exemplo, um mRNA) em uma célula sob o con- trole de regiões reguladoras adequadas, por exemplo, uma região promotora que pode ser expressa em planta. Um gene pode, então, compreender vá- rios fragmentos de DNA operativamente ligados tal como um promotor, uma seqüência líder 5' não-traduzida, uma região codificadora e uma região 3' não-traduzida compreendendo um sítio de poliadenilação. Um gene endóge- no de planta é um gene que é naturalmente encontrado em uma espécie de planta. Um gene quimérico é qualquer gene que não é normalmente encon- trado em uma espécie de planta ou, alternativamente, qualquer gene no qual o promotor não está associado na natureza com parte ou com toda a região de DNA transcrito (uma região de DNA "heterólogo") ou com pelo menos uma outra região reguladora do gene.

O termo "expressão de gene" refere-se ao processo no qual uma região de DNA sob o controle de regiões reguladoras, particularmente, o promotor, é transcrita em um RNA que é biologicamente ativo, isto é, que é capaz de interagir com outra molécula de ácido nucleico ou que é capaz de ser traduzido em um polipeptídeo ou proteína biologicamente ativos. Um ge- ne é dito codificar um RNA quando o produto final da expressão do gene é um RNA biologicamente ativo, tal como um RNA antissenso ou uma ribozi- ma. Um gene é dito codificar uma proteína quando o produto final da ex- pressão do gene é uma proteína ou polipeptídeo funcionalmente ou biologi- camente ativos.

O termo "seletivo de fibra" ou "seletivo de célula de fibra" ou "específico de célula de fibra", com relação a expressão de um DNA de a- cordo com essa invenção, refere-se, para propósitos práticos, a expressão altamente específica de um DNA em células de fibra de planta, tais como plantas de algodão ("seletiva para célula de fibra"). Em outras palavras, os níveis de transcrito de um DNA em tecidos diferentes de células de fibra es- tão abaixo da detecção ou são muito baixos (menos do que cerca de 0,2 picogramas por micrograma de RNA total).

O termo "preferencial para fibra" ou "preferencial para célula de fibra" com relação a expressão de um DNA de acordo com essa invenção, refere-se a um padrão de expressão através do qual o DNA é expresso pre- dominantemente em células de fibra ou fibras, mas a expressão pode ser identificada em outros tecidos da planta. Preferivelmente, a expressão em células de fibra é cerca de 2 a cerca de 10 vezes maior nas células de fibra do que em outros tecidos.

As seqüências de nucleotídeos de SEQ ID N° 9 e SEQ ID N° 10 representam a seqüência de nucleotídeos de moléculas de DNA genômico que codificam, respectivamente, uma β-1,3-endoglucanase seletiva para fi- bra do subgenoma A e do subgenoma D. O sítio de início da transcrição de SEQ ID N° 9 foi determinado na posição 2308, enquanto que o sítio de início da transcrição de SEQ ID N° 10 foi determinado na posição 3270. Assim em uma modalidade da invenção, é provido um promotor seletivo para fibra que tem uma seqüência de nucleotídeos de SEQ ID N° 9 do nucleotídeo da posi- ção 1 até o nucleotídeo da posição de 2307 ou 2308; em outra modalidade da invenção, é provido um promotor seletivo para fibra que tem uma se- qüência de nucleotídeos de SEQ ID N° 10 do nucleotídeo da posição 1 até o nucleotídeo da posição de 3269 ou 3270.

O sítio de início da tradução da seqüência de nucleotídeos de SEQ ID N° 9 foi determinado como o códon ATG localizado nas posições 2410 a 2412. A região 5' não-traduzida do promotor seletivo para fibra do alelo subgenômico A que codifica β-1,3-endoglucanase tem, consequente- mente, uma seqüência de nucleotídeos de SEQ ID N° 9 do nucleotídeo da posição 2308 ao nucleotídeo da posição 2409. Uma região promotora seleti- va para fibra do alelo subgenômico A é, consequentemente, uma região promotora que compreende os nucleotídeos 1 a 2409 de SEQ ID N0 9.

Similarmente, o sítio de início da tradução da seqüência de nu- cleotídeos de SEQ ID N0 10 foi determinado como o códon ATG localizado nas posições 3373 a 3375. A região 5' não-traduzida do promotor seletivo para fibra do alelo subgenômico D que codifica p-1,3-endoglucanase tem, consequentemente, uma seqüência de nucleotídeos de SEQ ID N0 10 do nucleotídeo da posição 3270 ao nucleotídeo da posição 3372. Uma região promotora seletiva para fibra do alelo subgenômico D é, consequentemente, uma região promotora que compreende os nucleotídeos 1 a 3372 de SEQ ID N˚10.

O alinhamento das regiões promotoras seletivas para fibra de SEQ ID N0 9 e SEQ ID N0 10 (Figura 1) revelou uma homologia de seqüên- cia geral nas seqüências de nucleotídeos cerca de 1000 nucleotídeos a montante do códon de início da tradução ATG, particularmente na região a cerca de 150 nucleotídeos a montante do códon de início da tradução ATG. Assim, em outra modalidade da invenção, é provido um promotor seletivo para fibra que compreende a seqüência de nucleotídeos de SEQ ID N0 9 do nucleotídeo da posição 2149 ao nucleotídeo da posição 2307 ou que com- preende a seqüência de nucleotídeos de SEQ ID N˚10 do nucleotídeo da posição 3109 ao nucleotídeo da posição 3269.

É óbvio que o promotor ou a região promotora podem estar con- tidos dentro de seqüências de nucleotídeos maiores. Uma região promotora seletiva para célula de fibra pode assim ser determinada como a região a montante (isto é, localizada a 5' de) do códon codificador para o primeiro aminoácido da proteína codificada pelo mRNA indicado na SEQ ID N0 9 ou 10. Tal região promotora pode ter pelo menos cerca de 400 a 500 bp, pelo menos cerca de 1000 bp, pelo menos 1200 bp, pelo menos cerca de 1300 bp ou pelo menos cerca de 1500 a 2000 bp a montante do códon de partida. Por conveniência, é preferido que tal região promotora não se prolongue por mais do que cerca de 3000 a 5000 bp a montante do códon de partida. O tamanho do fragmento pode ser determinado parcialmente pela presença dos sítios de restrição convenientes. Por exemplo, para a região promotora seletiva para fibra do alelo do subgenoma A que codifica β-1,3- endoglucanase, um fragmento com cerca de 1945 bp (do nucleotídeo na posição 465 ao nucleotídeo na posição 2409 de SEQ ID N0 9) pode ser con- venientemente clonado. A presença de enzimas de restrição adequadas permite gerar convenientemente regiões promotoras com cerca de 1036 bp(do nucleotídeo na posição 1374 ao nucleotídeo na posição 2409 de SEQ ID N0 9) ou com cerca de 879 np(do nucleotídeo na posição 1531 ao nucleo- tídeo na posição 2409 de SEQ ID N0 9). Para a região promotora seletiva para fibra do alelo do subgenoma D que codifica β-1,3-endoglucanase, um fragmento com cerca de 1976 bp (do nucleotídeo na posição 1397 ao nucle- otídeo na posição 3372 de SEQ ID N0 10)pode ser convenientemente clona- do. A presença de enzimas de restrição adequadas permite gerar convenien- temente regiões promotoras com cerca de 1002 bp(do nucleotídeo na posi- ção 1397 ao nucleotídeo na posição 3372 de SEQ ID N0 10) ou com cerca de 655 np(do nucleotídeo na posição 2371 ao nucleotídeo na posição 3372 de SEQ ID N0 10).

Será esclarecido mais tarde que promotores ou regiões promo- toras seletivas para fibra equivalentes podem ser isoladas de outras plantas de algodão ou de plantas de algodão parentais. Para essa finalidade, frag- mentos de promotor podem ser isolados de outras plantas de algodão, tal com G. barbadense, incluindo as variedades assim chamadas de ΡΙΜΑ, ou de outras variedades que usam um fragmento de promotor como descrito aqui como uma sonda e que identificam seqüências de nucleotídeos dessas outras plantas que hibridizam sob condições estringentes de hibridização.

"Condições estringentes de hibridização" como usado aqui signi- fica que a hibridização geralmente ocorrerá se houver pelo menos 95% e, preferivelmente, pelo menos 97% de identidade de seqüência entre a sonda e a sequência-alvo. Exemplos de condições estringentes de hibridização são a incubação durante uma noite em uma solução que compreende formamida 50%, 5xSSD (NaCI 150 mM, citrato trissódico 15 mM), fosfato de sódio 50 mM (pH 7.6), 5 x solução de Denhardt, sulfato de dextran 10% e 20 pg/ml de DNA transportador desnaturado, tal como DNA de esperma de salmão, se- guido pela lavagem do suporte de hibridização em 0,1 χ SSC em aproxima- damente 65°C. Outras condições de hibridização e lavagem são bem- conhecidas e estão exemplificadas em Sambrook et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor, NY (1989), particu- larmente no capítulo 11.

Tais promotores seletivos para fibra equivalentes isolados de outras plantas de algodão ou de plantas de algodão parentais podem repre- sentar promotores variantes nos quais um ou mais nucleotídeos foram subs- tituídos por substituição, deleção ou inserção. Promotor variante seletivo pa- ra fibra de acordo com a invenção também pode ser gerado sinteticamente. A Figura 1 representa o alinhamento de promotores seletivos para fibra do subgenoma A e D de G. hirsutum e posições variantes, onde a seqüência de nucleotídeos pode ser aparentemente alterada sem um efeito significativo sobre a capacidade de início da transcrição eletiva para fibra, foram indica- das pelas caixas em cinza. A partir da Figura 1 e de sua legenda, é claro que a identidade de seqüência global entre os dois fragmentos de promotor sele- tivo para fibra exemplificados pode ser tão baixa quanto 71% de identidade de seqüência.

Consequentemente, em outra modalidade da presente inven- ção, são providos o promotor e as regiões promotoras seletivas para fibra que compreendem uma seqüência de nucleotídeos que tem pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90% ou pelo menos 95% de identidade de seqüência com os promotores e regiões promotoras seletivas para fibra aqui descritas.

Para o propósito dessa invenção, a "identidade de seqüência" de duas seqüências de nucleotídeos ou aminoácidos relacionadas, expressa como uma porcentagem, refere-se ao número de posições em duas seqüên- cias otimamente alinhadas que têm resíduos idênticos (x100) divididas pelo número de posições comparadas. Um espaço, isto é, uma posição no ali- nhamento onde um resíduo está presente em uma seqüência mas não na outra, é considerado como uma posição com resíduos não idênticos. O ali- nhamento de duas seqüências é realizado pelo algoritmo de Needleman e Wunsch (Needleman e Wunsch 1970). O alinhamento de seqüência com ajuda de computador acima, pode ser convenientemente realizado usando um programa padronizado tal como ESPAÇO que é parte de Wisconsin Package Versão 10.1 (Genetics Computer Group, Madision, Wisconsin, U- SA) usando a matriz de escore de default com uma penalidade de criação de espaço de 50 e uma penalidade de extensão de espaço de 3.

Será esclarecido que sempre que seqüências de nucleotídeos de moléculas de RNA são definidas por referência a uma seqüência de nu- cleotídeos de moléculas de DNA correspondentes, a timina (T) na seqüência de nucleotídeos deverá ser substituída por uracil (U). Será esclarecido a par- tir do contexto do pedido se a referência é feita a moléculas de RNA ou DNA.

A capacidade de expressão seletiva para fibra do promotor ou região promotora identificados ou gerados pode ser testada, conveniente- mente, pela ligação operativa de tais moléculas de DNA com uma região codificadora que codifique um marcador facilmente contável, por exemplo, um gene de β-glicuronidase, introduzindo tal gene quimérico em uma planta que produz fibra e analisando o padrão de expressão do marcador em célu- las de fibra (preferivelmente durante o desenvolvimento da fibra) em compa- ração com o padrão de expressão do marcador em outras partes das plantas.

É óbvio que os promotores e regiões promotoras da invenção podem também compreender elementos adicionais conhecidos por melhorar a eficiência da transcrição tais como intensificadores, íntrons, etc.

Além disso, as seqüências 5'UTR exemplificadas das regiões promotoras seletivas para fibra exemplificadas são particularmente similares na seqüência de nucleotídeos e espera-se que as seqüências 5'UTR sejam intercambiáveis.

A invenção inclui ainda moléculas de DNA que compreendem os promotores ou regiões promotoras seletivas para fibra da invenção operati- vamente ligadas a uma ou mais regiões heterólogas que codificam um RNA biologicamente ativo, peptídeo ou proteína. Os promotores da invenção po- dem ser usados para expressar qualquer região codificadora heteróloga de- sejada.

Exemplos de moléculas de DNA que codificam outras proteínas que podem ser expressas usando o promotor da presente invenção incluem, mas não são limitados a celuloses sintases (genes CesA) homólogas e hete- rólogas, ambas na forma normal e mutada (Arioli et aí.,"Molecular Analysis of Cellulose Biosynthesis in Arabidopsis," Science, 279: 717-720 (1998); Hol- Iand et ai,"A Comparative Analysis of the Plant Cellulose Synthase (CesA) Gene Family,"Plant Physio., 123: 1313-1324 (2000)); genes que podem mo- dular o fracionamento de carbono para celulose (Delmer, "Cellulose Biosyn- thesis in Developing Cotton Fibers"in: A. S. Basra(ed.), Cotton Fibers: Deve- Iopmental Biology Quality Improvement, and Textile Processing, The Hawor- th Press, New York, pp. 85-112 (1999)) tal como sucarose sintase (Amor et ai,"A Membrane-Associated Form of Sucarose Synthase and Its Potential Role Synthesis of Cellulose and Callose in Plants," Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 92: 9353-9357 (1995), sucarose fosfato sintase (Haigler et ai, "Trans- genic Cotton Over-Expressing Sucarose Phosphate Synthase Produces Hi- gher Quality Fibers with Increased Cellulose Content and Has Enhanced Se- ed Cotton YieId11Abstract 477. In: Proceedings of Plant Biology 2000, July 15- 19, San Diego, CA. American Society of Plant Physiologists, Rockville, MD, (2000), UDPG-pirofosforilase (Waffler and Meier, "Enzyme Activities in Deve- Ioping Cotton Fibers, "Plant Phvsiol. Biochem. 32: 697-702 (1994), pirofos- fosfatase inorgânica (Geigenberger et ai, "Overexpression of Pyrophospha- tase Leads to Increased Sucarose Degradation and Starch Synthesis, Incre- ased Activities of Enzymes for Sucarose-Starch Interconversions, and Incre- ased Leveis of Nucleotides in Growing Potato Tubers," Planta, 205:428-437 (1998)), hexoquinases (Smeekens, "Sugar Regulation of Gene Expression" Curr. Op. Plant Biol., 1: 230-234 (1998), e invertases (Sturm and Tang, "The Sucarose-Cleaving Enzymés of Plants are Crucial for Development, Growth, and Carbon Partitioning,"Trends Plant Sci., 4: 401-407 (1999)); genes que podem afetar as propriedades moleculares e biofísicas da celulose incluindo o grau de polimerização, grau de cristalinidade, tamanho da crisalita e orien- tação de microfibrila (isto é, genes para codificar proteínas, incluindo políme- ros de proteínas cocristalizada ou domínios de ligação de celulose e a sínte- se de polissacarídeos e outras enzimas) (Delmer, "Cellulose Biosynthesis: Exciting Times for a Difficult Field of Study, "Ann. Rev. Plant Physio. Mol. Biol. 50: 245- 276 (1999); Delmer, "Cellulose Biosynthesis in Developing Cot- ton Fibers. In: A. S. Basra(ed.), Cotton Fibers: Developmental Biology, Qua- lity Improvement, and Textile Processing, The Haworth Press, New York, pp.85-112 (1999); Hsieh1 "Structural Development of Cotton Fibers. In: A. S. Basra(ed.), Cotton Fibers: Developmental Biology, Quality Improvement, and Textile Processing, The Haworth Press, New York, pp. 137-166 (1999)); fato- res de transcrição tais como genes MYB que podem prolongar o período de alongamento e/ou alterar o momento ou a extensão da deposição da parede secundária (Wilkins and Jernstedt,"Molecular Genetics of Developing Cotton Fibers. In: A. S. Basra(ed.), Cotton Fibers: Developmental Biology. Quality Improvement, and Textile Processing, The Haworth Press, New York, pp. 231-270 (1999)); genes para afetar a síntese de hormônios de planta e alte- rar as propriedades da fibra (John, "Genetic Engineering Strategies for Cot- ton Fiber Modification. In: A. S. Basra(ed.), Cotton Fibers: Developmental Biology, Quality Improvement, and Textile Processing, The Haworth Press, New York, pp. 271-289 (1999)); genes para elementos citoesqueléticos ou proteínas associadas ao citoesqueleto que podem afetar as propriedades da fibra (Seagull, "Cytoskeletal Involvement in Cotton Fiber Growth and Deve- lopment," Micron, 24: 643-660 (1993)); genes para sintetizar lipídeo ou modi- ficar enzimas que podem alterar as propriedades da membrana e melhorar dessa maneira a qualidade da fibra, inclusive sob condições ambientais es- tressantes (Haigler,"The Crystallinity of Cotton Cellulose in Relation to Cotton Improvement, "Proc. Cotton Fiber Cellulose: Structure. Function and Utiliza- tion Conference, National Cotton Council of America: Memphis, TN., p. 211- 225 (1992)); enzimas tais como xiloglicano endotransferase, peroxidase, ex- pansina, ou ATPase vacuolar que podem, através da atividade aumentada ou diminuída, prolongar ou aumentar o crescimento da extensão durante a deposição da parede secundária (Wilkins and Jernstedt, "Molecular Genetics of Developing Cotton Fibers. In: A. S. Basra(ed-), Cotton Fibers: Develop- mental Biology Quality Improvement, and Textile Processing, The Haworth Press, New York, pp. 231-270 (1999); genes para proteína ou polímeros plásticos que podem estar retidos na luz da fibra ou integrados na parede celular para aumentar a resistência da fibra ou alterar suas propriedades têxteis (John, "Genetic Engineering Strategies for Cotton Fiber Modification, "In: A. S. Basra(ed.), Cotton Fibers: Developmental Biology. Quality Impro- vement, and Textile Processing, The Haworth Press, New York, pp. 271-289 (1999); Guda et al., "Hyperexpression of an Environmentally Friendly Synthe- tic PoIymerGene, "BiotechnologY Letters, 17: 745-750 (1995)); genes para enzimas biossintéticas da matriz da parede celular de planta ou suas proteí- nas reguladoras tal que outros carboidratos possam ser integrados na pare- de celular e alterar as propriedades da fibra (Haigler, "The Relationship Bet- ween Polymerization and Crystallization in CelluIoseBiogenesis," in C. H. Haigler and P. Weimer, eds., Biosynthesis and Biodegradation of Cellulose, New York: Mareei Dekker1 pp. 99-124 (1991); Andrawis et al.," Cotton Fiber Annexins: A Potential Role in the Regulation of Callose Synthase, "Plant J., 3: 763-772 (1993); genes para moléculas tais como taninas, suberinas ou pigmentos que podem conferir cor valiosa as fibras (Ryser, "Cotton Fiber Initiation and Histodifferentiation, "In: A. S. Basra(ed.), Cotton Fi- bers: Developmental Biology. Quality Improvement, and Textile Processing, The Haworth Press, New York, pp. 1-46 (1999); genes para moléculas tais como cutina, suberina ou cera que podem alterar a absorvência e resistência de fibras de algodão (May,"Genetic Variation in Fiber Quality, "In: A. S. Basra (ed.), Cotton Fibers: Developmental Biology, Quality Improvement, and Tex- tile Processing, The Haworth Press, New York, pp. 183-230 (1999); Ryser, "Cotton Fiber Initiation and Histodifferentiation, "In: A. S. Basra(ed.), Cotton Fibers: Developmental Biology. Quality Improvement, and Textile Proces- sing, The Haworth Press, New York, pp. 1--46 (1999); e genes para molécu- las de sinal de transdução tal como Rac que pode regular mudanças entre estágios de desenvolvimento da fibra (Delmer et al."Genes Encoding Small GTP- Binding Proteins Analogous to Mammalian rac are Preferentially Ex- pressed in Developing Cotton Fibers, "Mol. Gen. Genet., 248: 43-51 (1995).

Regiões codificadoras de proteína particularmente preferidas são as regiões codificadoras de N-acetilglicosamina sintase como descritas, por exemplo, em W02006/136351 ou genes de sucarose sintase como des- critos em W02002/45485 ou EP06015433.3 (incorporadas aqui por referência).

RNA biologicamente ativo também pode codificar o assim cha- mado RNA antissenso, RNA sense, RNA de fita dupla como descrito em W099/53053 ou moléculas sintéticas de microRNA determinadas, de acordo com regras bem conhecidas na técnica, para regular negativamente a ex- pressão de outros genes compreendidos dentro da célula das plantas que produzem fibra ou até de genes compreendidos dentro de um patógeno ou praga que se alimenta da planta que produz fibra.

Também são providos métodos para expressar uma proteína ou RNA biologicamente ativo especificamente em células de fibra de uma plan- ta que produz fibra, compreendendo a etapa de introduzir uma molécula de DNA que compreende um promotor ou região promotora seletivos para fibra como aqui descrito, operativamente ligados a uma região de DNA transcrito que codifica a molécula de RNA biologicamente ativa nas células da fibra de plantas que produzem fibra.

Em um segundo aspecto da presente invenção, é provido um método para alterar o comprimento da fibra em uma planta que produz fibra, pela alteração especificamente da expressão de um dos alelos subgenômi- cos que codificam uma β-1,3-endoglucanase seletiva para fibra. Como indi- cado acima, tal alteração da expressão pode prevenir ou intensificar a de- gradação da calose que obstrui os plasmodesmos na base da célula de fibra e assim aumentar ou diminuir a fase de alongamento rápido da fibra e o comprimento da fibra, por exemplo, no algodão, particularmente em Gossy- pium hirsutum. A modulação do comprimento da fibra também pode impactar a resistência e outras qualidades ou propriedades da fibra. Consequente- mente, a invenção também está direcionada para a alteração de proprieda- des da fibra ou qualidades da fibra pelos métodos aqui descritos. Em uma modalidade do segundo aspecto da invenção, é provi- do um método para aumentar o comprimento de uma fibra em uma planta de algodão, particularmente uma planta Gossypium hirsutum, pela introdução de um gene quimérico nas células da dita planta de algodão, o gene quimé- rico compreendendo os seguintes elementos operativamente ligados ao DNA:

a. um promotor que pode ser expresso em planta

b. uma região de DNA transcrito que quando transcrita rende uma molécula de RNA biologicamente ativo capaz de reduzir a expressão de uma β-1,3-endoglucanase seletiva para fibra compreendida dentro do geno- ma D e

c. uma região 3' terminal compreendendo sinais de término da transcrição e de poliadenilação que funcionam em células da dita planta.

Como foi descoberto pelos presentes inventores, a expressão aumentada de β-1,3-endoglucanase nas células da fibra de uma planta de algodão previamente descrita, está correlacionada com a reabertura dos plasmodesmos e marca o final da fase de alongamento rápido da fibra e é devida, especificamente, ao início da expressão do alelo específico do sub- genoma D nesse momento, enquanto que o alelo específico do subgenoma A é expresso apenas nos estágios tardios do desenvolvimento da fibra, pelo menos no Gossypium hirsutum. Consequentemente, os métodos como des- critos em W02005/017157 podem ser ainda aperfeiçoados, pelo menos para Gossypium hirsutum, pela alteração especifica do padrão de expressão de um alelo subgenômico particular que codifica a β-1,3-endoglucanase seletiva para fibra.

Como descrito aqui, um alelo específico do subgenoma D que codifica uma β-1,3-endoglucanase seletiva para fibra pode ser reconhecido de várias maneiras. O isolamento do ácido nucleico (genômico) que codifica uma β-1,3-endoglucanase seletiva para fibra do subgenoma D de diferentes plantas de algodão, assim como de plantas de algodão diploides parentais com um genoma similar a D, revelou que o íntron no alelo subgenômico A tem uma inserção de cerca de 18 nt de comprimento na seqüência de íntron (vide figura 3) que está ausente na seqüência de íntron do alelo subgenômi- co D.

Além disso, a comparação das seqüências de nucleotídeos da região codificadora (cDNA; figura 2) seqüências de aminoácidos codificadas (figura 4) revelou várias diferenças características entre os alelos subgenô- micos AeDe proteínas codificadas, indicadas nas figuras pelas caixas em cinza.

Muito convenientemente, os alelos subgenômicos AeD podem ser distinguidos por um polimorfismo que resulta da presença de um sítio de reconhecimento de enzima de restrição A1wl, cerca de 326 nucleotídeos a jusante do códon de início da tradução no clone genômico do alelo subge- nômico A, que está ausente nos alelos subgenômicos D que codificam a β- 1,3-endoglucanase seletiva para fibra. Um método possível para distinguir alelos subgenômicos A e D, ambos à nível de DNA genômico ou cDNA, é a amplificação por PCR usando cDNA ou DNA genômico como modelo e os olígonucleotídeos que têm a seqüência de nucleotídeos de SEQ ID N° 5 e 6 como iniciadores, seguido pela digestão do produto de PCR amplificado com a enzima de restrição A1wl. O produto de PCR gerado, que tem cerca de 656 bp para ambos os alelos subgenômicos, é clivado em um fragmento de 538 e 118 bp quando o produto de PCR é gerado a partir de um modelo de alelo subgenômico D, enquanto que o produto de PCR gerado amplificado a partir do modelo de alelo subgenômico A é clivado em três fragmentos de 476 bp, 118 bp e 59 bp, respectivamente. A presença de 118 bp serve como um controle interno para o funcionamento apropriado da reação da enzima de restrição.

Vários métodos estão disponíveis na técnica para produzir uma molécula de RNA de silenciamento, isto é, uma molécula de RNA que quan- do expressa reduz a expressão de um gene particular ou grupo de genes, incluindo as assim chamadas tecnologias de RNA "sense" ou "antissenso".

Assim, em uma modalidade, um gene quimérico que codifica a molécula de RNA inibitório é baseado na assim chamada tecnologia antis- senso. Em outras palavras, a região codificadora do gene quimérico com- preende uma seqüência de nucleotídeos de pelo menos 19 ou 20 nucleotí- deos consecutivos do complemento da seqüência de nucleotídeos da β-1,3- endoglucanase seletiva para fibra. Tal gene quimérico pode ser construído pela ligação operativa de um fragmento de DNA que compreende pelo me- nos 19 ou 20 nucleotídeos do gene que codifica a β-1,3-endoglucanase sele- tiva para fibra, isolada ou identificada como descrito nesse pedido em outro lugar, em orientação inversa para um promotor que pode ser expresso em planta e para uma região de formação da terminação 3' envolvida no término da transcrição e na poliadenilação.

Em outra modalidade, o gene quimérico que codifica uma molé- cula de RNA inibitório está baseado na assim chamada tecnologia de cossu- pressão. Em outras palavras, a região codificadora do gene quimérico com- preende uma seqüência de nucleotídeos de pelo menos 19 ou 20 nucleotí- deos consecutivos da seqüência de nucleotídeos do gene da β-1,3- endoglucanase seletiva para fibra. Tal gene quimérico pode ser construído pela ligação operativa de um fragmento de DNA que compreende pelo me- nos 19 ou 20 nucleotídeos do gene de β-1,3-endoglucanase seletiva para fibra, em orientação direta para um promotor que pode ser expresso em planta e para uma região de formação da terminação 3' envolvida no término da transcrição e na poliadenilação.

A eficiência dos genes quiméricos acima mencionados em redu- zir a expressão do gene de β-1,3-endoglucanase seletiva para fibra pode ser ainda intensificada pela inclusão de elemento de DNA que resulta em ex- pressão de moléculas de RNA inibitório aberrante, não-poliadenilado ou re- sulta na retenção das moléculas de RNA inibitório no núcleo das células. Um de tais elementos de DNA adequados para o propósito é uma região de DNA que codifica uma ribozima autocombinada, como descrito em WO 00/01133 (incorporado por referência). Outro de tal elemento de DNA adequado para esse propósito é uma região de DNA que codifica um sinal de localização nuclear ou de retenção de RNA, como descrito em PCT/AU03/00292 publi- cado como W003/076619 (incorporado por referência).

Um meio conveniente e muito eficiente de regular negativamen- te a expressão de um gene de interesse usa o assim chamado RNA de fita dupla (dsRNA) ou RNA de interferência (RNAi), como descrito, por exemplo, em W099/53050 (incorporado por referência). Nessa tecnologia, uma molé- cula de RNA é introduzida em uma célula de planta e dessa maneira a molé- cuia de RNA é capaz de formar uma região de RNA de fita dupla sobre pelo menos cerca de 19 a cerca de 21 nucleotídeos, e dessa maneira uma das fitas dessa região de RNA de fita dupla é quase idêntica em seqüência de nucleotídeos ao gene-alvo ("região sense"), enquanto que a outra fita é qua- se idêntica em seqüência de nucleotídeos ao complemento do gene-alvo ou à região sense ("região antissenso"). É esperado que para o silenciamento da expressão do gene-alvo, a seqüência de nucleotídeos das seqüências de 19 nucleotídeos consecutivos pode ter um não-pareamento ou a região sen- se e a região antissenso podem diferir em um nucleotídeo. Para se obter a construção de tais moléculas de RNA ou dos genes quiméricos codificado- res, pode ser feito o uso do vetor como descrito em WO 02/059294.

Assim, em uma modalidade da invenção, é provido um método para aumentar o comprimento de uma fibra de uma planta que produz fibra, tal como algodão, compreendendo a etapa de introduzir um gene quimérico em uma célula da planta que produz fibra, cujo gene quimérico compreende os seguintes elementos de DNA operativamente ligados:

(a) um promotor que pode ser expresso em planta, preferivel- mente um promotor que pode ser expresso em planta que controle a trans- crição preferencialmente nas células de fibra;

(b) uma região de DNA transcrito, que quando transcrita rende uma molécula de RNA de fita dupla capaz de reduzir especificamente a ex- pressão de um alelo subgenômico de β-1,3-endoglucanase seletiva para fibra e a molécula de RNA compreendendo uma primeira e uma segunda região de RNA em que

i) a primeira região de RNA compreende uma seqüência de nu- cleotídeos de pelo menos 19 nucleotídeos consecutivos que tem pelo menos cerca de 94% de identidade de seqüência com a seqüência de nucleotídeos do alelo subgenômico; ii) a segunda região de RNA compreende uma seqüência de nu- cleotídeos complementar aos pelo menos 19 nucleotídeos consecutivos da primeira região de RNA;

iii) a primeira e a segunda região de RNA são capazes de pare- ar para formar uma molécula de RNA de fita dupla entre pelo menos 19 nu- cleotídeos consecutivos da primeira e segunda regiões; e

c) a região 3' terminal compreendendo sinais de término da transcrição e poliadenilação que funcionam em células de planta.

O comprimento da primeira e segunda regiões de RNA (região sense ou antissenso) pode variar entre cerca de 19 nucleotídeos (nt) até um comprimento correspondente ao comprimento (em nucleotídeos) do gene endógeno envolvido na remoção da calose. O comprimento total da seqüên- cia de nucleotídeos sense e antissenso pode ser, então, pelo menos de 25 nt, ou pelo menos de cerca de 50 nt, ou pelo menos cerca de 100 nt, ou pelo menos de cerca de 150 nt, ou pelo menos de cerca de 200 nt, ou pelo me- nos de cerca de 500 nt. É esperado que não haja limite superior no compri- mento total da seqüência de nucleotídeos sense ou antissenso. Entretanto, por razões práticas (tais como, por exemplo, estabilidade de genes quiméri- cos) é esperado que o comprimento da seqüência de nucleotídeos sense ou antissenso não deve exceder 5000 nt, particularmente não deve exceder 2000 nt e pode estar limitado a cerca de 1000 nt.

Será avaliado que quanto mais longo o comprimento total da re- gião sense ou antissenso, menos estringentes os requisitos para identidade de seqüência entre essas regiões e a seqüência correspondente no gene de β-1,3-endoglucanase seletiva para fibra ou seu complemento. Preferivelmen- te, o ácido nucleico de interesse deve ter uma identidade de seqüência de pelo menos cerca de 75% com a sequência-alvo correspondente, particu- larmente pelo menos cerca de 80%, mais particularmente pelo menos cerca de 85%, muito particularmente cerca de 90%, especialmente cerca de 95%, mais especialmente cerca de 100%, muito especialmente ser idêntica a par- te correspondente da sequência-alvo ou seu complemento. Entretanto, é preferido que o ácido nucleico de interesse sempre inclua uma seqüência com cerca de 19 nucleotídeos consecutivos, particularmente cerca de 25 nt, mais particularmente cerca de 50 nt, especialmente cerca de 100 nt, muito especialmente cerca de 150 nt com 100% de identidade de seqüência com a parte correspondente dp ácido nucleico alvo. Preferivelmente, para calcular a identidade de seqüência e determinar a seqüência sense e antissenso cor- respondentes, o número de espaços deve ser minimizado, particularmente para seqüências sense mais curtas.

Genes quiméricos codificando dsRNA de acordo com a inven- ção podem compreender um íntron, tal como um íntron heterólogo, Iocaliza- do, por exemplo, na seqüência espaçadora entre as regiões sense e antis- senso de RNA de acordo com a descrição de WO 99/53050 (incorporado aqui por referência).

É preferido para a presente invenção que a seqüência do gene alvo específico incluída na molécula de RNA antissenso, sense ou de fita dupla compreenda pelo menos um nucleotídeo e preferivelmente mais de um nucleotídeo, que são específicos para o alelo subgenômico cuja expres- são é para ser regulada negativamente. Tais nucleotídeos específicos estão indicados pelo menos na figura 2 por caixas em cinza.

Em uma modalidade preferida, o RNA biologicamente ativo está adaptado especialmente para regular negativamente o alelo subgenômico D do gene que codifica a p-1,3-endoglucanase seletiva para fibra (GhGIud). Em outra modalidade preferida, o RNA biologicamente ativo está especial- mente adaptado para regular negativamente o alelo subgenômico A do gene que codifica a β-1,3-endoglucanase seletiva para fibra (GhGIuc 1).

O uso de micro-RNAs sintéticos para regular negativamente a expressão de um gene particular em uma célula de planta, possibilita especi- ficidade de seqüência do gene-alvo muito grande e assim permite discrimi- nar convenientemente entre alelos intimamente relacionados como genes- alvo qual expressão deve ser regulada negativamente.

Assim, em outra modalidade da invenção, o RNA biologicamen- te ativo ou RNA de silenciamento ou molécula de RNA inibitório pode ser uma molécula de microRNA, determinada, sintetizada e/ou modulada para atingir e causar a clivagem de alelos específicos de subgenoma, preferivel- mente o alelo subgenômico D do gene de β-1,3-endoglucanase seletiva para fibra em plantas que produzem fibra, tal como uma planta de algodão. Vários métodos têm sido descritos para gerar e usar miRNAs para um gene-alvo específico (incluindo mas não limitado a Schwab et al. (2006, Plant Cell, 18(5):1121-1133), W02006/44322, WO 2005/047505, EP 06009836, incor- poradas por referência). Geralmente, um arcabouço de miRNA existente é modificado na porção de reconhecimento do gene-alvo tal que o miRNA ge- rado guia agora o complexo RISC para clivar as moléculas de RNA transcri- tas a partir do ácido nucleico alvo. Arcabouços de miRNA podem ser modifi- cados ou sintetizados tal que o miRNA compreenda agora 21 nucleotídeos consecutivos de um dos alelos subgenômicos da seqüência de nucleotídeos que codifica β-1,3-endoglucanase seletiva para fibra, tal como as seqüências representadas na Listagem de Seqüências e permitindo não-pareamentos de acordo com as regras aqui descritas abaixo.

Assim, em uma modalidade, a invenção provê um método para regular negativamente a expressão de ou aumentar a resistência de plantas a condições de crescimento adversas, compreendendo as etapas de:

a. Introduzir um gene quimérico nas células da dita planta, o dito gene quimérico compreendendo as seguintes regiões de DNA operativamen- te ligadas:

i. Um promotor que pode ser expresso em planta;

ii. Uma região de DNA que após a introdução e transcrição em uma célula de planta é processada em um miRNA, de acordo com o que o miRNA é capaz de reconhecer e conduzir a clivagem do mRNA de um alelo subgenômico de um gene que codifica β-1,3-endoglucanase seletiva para fibra da planta mas não de outro alelo subgenômico; e

iii. opcionalmente, uma região 3' de DNA envolvida no término da transcrição e na poliadenilação.

A região de DNA mencionada processada em um miRNA pode compreender uma seqüência de nucleotídeos que é essencialmente com- plementar a seqüência de nucleotídeos dos pelo menos 21 nucleotídeos consecutivos de um gene que codifica p-1,3-endoglucanase seletiva para fibra, desde que um ou mais dos seguintes não-pareamentos sejam permiti- dos:

a. Um não-pareamento entre o nucleotídeo na terminação 5' do 5 miRNA e a seqüência de nucleotídeos correspondente na molécula de RNA;

b. Um não-pareamento entre qualquer um dos nucleotídeos na posição 1 a posição 9 do miRNA e a seqüência de nucleotídeos correspon- dente na molécula de RNA;

c. Três não-pareamentos entre qualquer um dos nucleotídeos

na posição 12 a posição 21 do miRNA e a seqüência de nucleotídeos cor- respondente na molécula de RNA, desde que não haja mais do que dois não-pareamentos consecutivos.

Como usado aqui, um "miRNA" é uma molécula de RNA com cerca de 20 a 22 nucleotídeos de comprimento que pode ser carregada em um complexo RISC e direcionar a clivagem de outra molécula de RNA, em que a outra molécula de RNA compreenda uma seqüência de nucleotídeos essencialmente complementar a seqüência de nucleotídeos da molécula de miRNA de acordo com o que um ou mais dos seguintes não-pareamentos pode ocorrer:

a. Um não-pareamento entre o nucleotídeo na terminação 5' do dito miRNA e a seqüência de nucleotídeos correspondente na molécula de RNA-alvo;

b. Um não-pareamento entre qualquer um dos nucleotídeos na posição 1 a posição 9 do dito miRNA e a seqüência de nucleotídeos corres- pondente na molécula de RNA-alvo;

c. Três não-pareamentos entre qualquer um dos nucleotídeos na posição 12 a posição 21 do dito miRNA e a seqüência de nucleotídeos correspondente na molécula de RNA-alvo, desde que não haja mais do que dois não-pareamentos consecutivos.

d. Nenhum não-pareamento é permitido nas posições 10 e 11 do miRNA (todas as posições de miRNA são indicadas começando da ter- minação 5' da molécula de miRNA). Um miRNA é processado a partir de uma molécula de "pré- miRNA" por proteínas, tais como proteínas DCL, presentes em qualquer cé- lula de planta e carregadas dentro de um complexo RISC onde elas podem conduzir a clivagem das moléculas de RNA-alvo.

Como usado aqui, uma molécula de "pré-miRNA" é uma molé- cula de RNA com cerca de 100 a cerca de 200 nucleotídeos, preferivelmente cerca de 100 a cerca de 130 nucleotídeos que pode adotar uma estrutura secundária que compreende um tronco de RNA de fita dupla e uma alça de RNA de fita simples e que compreende ainda a seqüência de nucleotídeos do miRNA (e sua seqüência complementar) no tronco de RNA de fita dupla. Preferivelmente, o miRNA e seu complemento estão localizados a cerca de 10 a cerca de 20 nucleotídeos das extremidades livres do tronco de miRNA de fita dupla. O comprimento e a seqüência da região de alça da fita simples não são críticos e podem variar consideravelmente, por exemplo, entre 30 e 50 nt de comprimento. Um exemplo de um pré-miRNA sintético está repre- sentado na Figura 1. Preferivelmente, a diferença de energia livre entre es- truturas de RNA não-pareada e pareada está entre -20 a -60 kcal/mol, parti- cularmente em torno de -40 kcal/mol. A complementaridade entre o miRNA e o miRNA* não precisa ser perfeita e cerca de 1 a 3 projeções de nucleotí- deos não-pareados podem ser toleradas. A estrutura secundária adotada por uma molécula de RNA pode ser predita por algoritmos de computador con- vencionais na técnica tal como mFOLD. A fita particular do tronco de RNA de fita dupla do pré-miRNA que é liberada pela atividade de DCL e carregada sobre o complexo RISC é determinada pelo grau de complementaridade na extremidade 5', de acordo com o que a fita que está menos envolvida em sua terminação 5' com pontes de hidrogênio entre os nucleotídeos de fitas diferentes do tronco de dsRNA clivado é carregada sobre o complexo RISC e determinará a especificidade de seqüência da degradação da molécula do RNA-alvo. Entretanto, se empiricamente a molécula de miRNA de uma mo- lécula sintética de pré-miRNA particular não é funcional (por que a fita "erra- da" foi carregada sobre o complexo RISC) ficará imediatamente claro que esse problema pode ser solucionado pela alteração de posição da molécula de miRNA e seu complemento sobre as respectivas fitas do tronco de dsR- NA da molécula de pré-miRNA. Como é conhecido na técnica, a ligação en- tre A e U que envolve duas ligações de hidrogênio ou entre GeU que en- volve duas ligações de hidrogênio são menos fortes do que entre GeC que envolve três ligações de hidrogênio.

Moléculas de miRNA que ocorrem naturalmente podem estar compreendidas dentro de suas moléculas de pré-miRNA que ocorrem natu- ralmente, mas elas também podem ser introduzidas em arcabouços existen- tes de molécula de miRNA pela substituição da seqüência de nucleotídeos da molécula de miRNA processada normalmente a partir de tal molécula de pré-miRNA existente pela seqüência de nucleotídeos de outro miRNA de interesse. Igualmente, moléculas sintéticas de miRNA podem estar compre- endidas dentro e processadas a partir de arcabouços de molécula de pré- miRNA existentes ou arcabouços de pré-miRNA sintético.

As moléculas de pré-miRNA (e consequentemente também as moléculas de miRNA) podem ser convenientemente introduzidas em uma célula de planta pelo provimento das células de planta com um gene que compreende um promotor que pode ser expresso em planta operativamente ligado a uma região de DNA1 que quando transcrita rende a molécula de pré- miRNA. O promotor que pode ser expresso em planta pode ser o promotor naturalmente associado com a molécula de pré-miRNA ou pode ser um promotor heterólogo.

Moléculas adequadas de miRNA e pré-microRNA para a regula- ção negativa da expressão do alelo subgenômico D do gene GhGIuc 1 estão descritas nas entradas da listagem de seqüência de SEQ ID N0 15, 16, 20 e 21.

Moléculas adequadas de miRNA e pré-microRNA para a regula- ção negativa da expressão do alelo subgenômico A do gene GhGIuc 1 estão descritas nas entradas da listagem de seqüência de SEQ ID N0 13, 13, 17, 18 e 19.

Como usado aqui, a expressão "promotor que pode ser expres- so em planta" significa uma seqüência de DNA que é capaz de controlar (ini- ciar) a transcrição em uma célula de planta. Isso inclui qualquer promotor originado de planta, mas também qualquer promotor não-originado em plan- ta que é capaz de direcionar a transcrição em uma célula de planta, isto é, certos promotores de origem viral ou bacteriana tais como CaMV35S, o promotor N0 4 ou N0 7 do vírus do trevo subterrâneo ou genes-promotores de T-DNA e similares.

Um promotor que pode ser expresso em planta que controle o início e a manutenção da transcrição, preferencialmente em células de fibra, é um promotor que conduz a transcrição da região de DNA operativamente ligado em um nível mais elevado nas células de fibra e nas células da epi- derme subjacente do que em outras células ou tecidos da planta. Tais pro- motores incluem o promotor para algodão do gene de β-tubulina específico para fibra (como descrito em W00210377), o promotor para algodão do ge- ne de actina específico para fibra (como descrito em W00210413), o promo- tor de um gene de proteína de transferência de lipídeo específica para fibra de algodão (descrito em US5792933), o promotor para um gene de expansi- na de algodão (W09830698) ou um promotor de um gene de quitinase no algodão (US2003106097) ou os promotores dos genes específicos para fibra descritos em US6259003 ou US6166294. Promotores seletivos para fibra como descritos aqui também podem ser usados.

Para algumas aplicações, pode ser benéfico diminuir o compri- mento da fibra em uma planta que produz fibra, tal como uma planta de al- godão. Por exemplo, pode ser benéfico diminuir a quantidade de fibra distor- cida em uma planta de algodão, deixando assim mais energia e material pa- ra incorporação na fibra em plumas em plantas de algodão. Isso pode ser obtido convenientemente pela (super)expressão de uma β-1,3-endogluca- nase em células de fibra em um estágio precoce do desenvolvimento de uma célula de fibra, por exemplo, usando um promotor seletivo para fibra como aqui descrito que é expresso no final da fase de alongamento rápido.

A invenção também abrange os genes quiméricos aqui descri- tos, assim como as plantas, sementes, tecidos que compreendem esses ge- nes quiméricos e fibras produzidas a partir de tais plantas. O comprimento da fibra ou outras propriedades da fibra e a qua- lidade da fibra no algodão também podem ser aumentadas ou alteradas pelo isolamento de variantes alélicas do subgenoma D que não codificam mais uma p-1,3-endoglucanase funcional ou que codificam uma proteína variante com atividade enzimática fraca.

Os métodos para transformação de plantas são bem conhecidos na técnica e são de pouca relevância para a presente invenção. Métodos para transformar plantas de algodão também são bem conhecidos na técni- ca. A transformação do algodão mediada por Agrobactéria foi descrita, por exemplo, na patente U.S. 5.004.863 ou na patente U.S. 6.483.013 e a trans- formação do algodão pelo bombardeio de partícula está descrito, por exem- plo, em WO 92/15675.

Os genes quiméricos de acordo com a invenção podem ser in- troduzidos nas plantas de uma maneira estável ou de uma maneira transitó- ria usando métodos bem conhecidos na técnica. Os genes quiméricos po- dem ser introduzidos nas plantas ou podem ser gerados dentro da célula da planta como descrito, por exemplo, em EP 1339859.

Os genes quiméricos podem ser introduzidos pela transforma- ção em plantas de algodão a partir das quais os calos embriogênicos podem ser derivados, tais como Coker 312, Coker310, Coker 5Acala SJ-5, GSC25110, FIBERMAX 819, Siokra 1-3, T25, GSA75, Acala SJ2, Acala SJ4, Acala SJ5, Acala SJ-C1, Acala B1644, Acala B1654-26, Acala B1654-43, Acala B3991, Acala GC356, Acala GC510, Acala GAM1, Acala C1, Acala Royale, Acala Maxxa, Acala Prema, Acala B638, Acala B1810, Acala B2724, Acala B4894, Acala B5002, non Acala "picker" Siokra1 variedade "stripper" FC2017, Coker 315, STONEVILLE 506, STONEVILLE 825, DP50, DP61, DP90, DP77, DES119, McN235, HBX87, HBX191, HBX107, FC 3027, CHEMBRED A1, CHEMBRED A2, CHEMBRED A3, CHEMBRED A4, CHEMBRED B1, CHEMBRED B2, CHEMBRED B3, CHEMBRED C1, CHEMBRED C2, CHEMBRED C3, CHEMBRED C4, PAYMASTER 145, HS26, HS46, SICALA, PIMA S6 ORO BLANCO ΡΙΜΑ, FIBERMAX FM5013, FIBERMAX FM5015, FIBERMAX FM5017, FIBERMAX FM989, FIBERMAX FM832, FIBERMAX FM966, FIBERMAX FM958, FIBERMAX FM989, Fl- BERMAX FM958, FIBERMAX FM832, FIBERMAX FM991, FIBERMAX FM819, FIBERMAX FM800, FIBERMAX FM960, FIBERMAX FM966, FI- BERMAX FM981, FIBERMAX FM5035, FIBERMAX FM5044, FIBERMAX FM5045, FIBERMAX FM5013, FIBERMAX FM5015, FIBERMAX FM5017 ou FIBERMAX FM5024 e plantas com genótipos derivados dessas.

"Algodão" como usado aqui inclui Gossypium hirsutum ou Gossypium barbadense. "Plantas de algodão parentais" incluem Gossypium arboretum, Gossypium herbaceum e Gossypium raimondii e Gossypium Ion- gicalyx.

Os métodos e meios da presente invenção também podem ser empregados para outras espécies de planta tais como cânhamo, juta, Iinho e plantas lenhosas, incluindo mas não limitado a Pinus spp., Populus spp., Picea spp., Eucalyptus spp. etc.

A planta transformada obtida pode ser usada em um esquema de reprodução convencional para produzir mais plantas transformadas com as mesmas características ou para introduzir o gene quimérico de acordo com a invenção em outras variedades da mesma espécie ou de espécies de planta relacionadas ou em plantas híbridas. As sementes obtidas das plan- tas transformadas contém o gene quimérico da invenção como um inserto genômico estável e são também abrangidas pela invenção.

Em outra modalidade da invenção, são providos anticorpos sur- gidos contra as proteínas β-1,3-endoglucanase, particularmente anticorpos que reconhecem proteínas β-1,3-endoglucanase que têm seqüências de a- minoácidosde SEQ ID N° 11 e 12.

Como usado aqui, "compreendendo" deve ser interpretado co- mo especificando a presença dos aspectos estabelecidos, números inteiros, etapas ou componentes como referidos, mas não excluindo a presença ou adição de um ou mais aspectos, números inteiros, etapas ou componentes 30 ou seus grupos. Assim, por exemplo, um ácido nucleico ou proteína que compreende uma seqüência de nucleotídeos ou aminoácidos, pode compre- ender mais nucleotídeos ou aminoácidos do que aqueles realmente citados, isto é, estar embebidos em um ácido nucleico ou proteína maiores. Um gene quimérico que compreende uma região de DNA1 que está funcionalmente ou estruturalmente definida, pode compreender regiões de DNA adicionais, etc.

Os seguintes Exemplos não-limitantes descrevem a identifica- ção de duas β-1,3-endoglucanases do subtipo A e D no algodão assim como suas regiões promotoras e a análise do momento de expressão e envolvi- mento na síntese da parede celular secundária. Também são descritos ge- nes quiméricos para alteração das características da fibra, para expressão preferencial em fibra e específica para fibra em plantas que produzem fibra tais como o algodão e seus usos. A menos que estabelecido de outra manei- ra nos Exemplos, todas as técnicas de DNA recombinante são realizadas de acordo com protocolos padronizados como descrito em Sambrook et al (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY e nos Volumes 1 e 2 de Ausubel et ai. (1994) Current Protocols in Molecular Biology, Current Protocols, USA. Materiais e métodos padronizados para o trabalho molecular em planta estão descritos em Plant Molecular Biology Labfax (1993) by R.D.D. Croy1 conjuntamente publicado por BIOS Scientific Publications Ltd (UK) e Blackwell Scientific Pu- blications, UK.

Através da descrição e dos Exemplos, é feita referência as se- guintes seqüências representadas na listagem de seqüências:

SEQ ID N0 1: fragmento genômico amplificado de p-1,3-endo- glucanase de Gossypium hirsutum Fiber Max966, subtipo A

SEQ ID N0 2: fragmento genômico amplificado de p-1,3-endo- glucanase de Gossypium hirsutum Fiber Max966, subtipo D

SEQ ID N0 3: fragmento genômico amplificado de p-1,3-endo- glucanase de Gossypium arboretum

SEQ ID N0 4: fragmento genômico amplificado de p-1,3-endo- glucanase de Gossypium raimondii

SEQ ID N0 5: iniciador em sentido reverso (SE002) para amplifi- cação de fragmento genômico de p-1,3-endoglucanase

SEQ ID N0 6: iniciador em sentido direto (SE003) para amplifi- cação de fragmento genômico de β-1,3-endoglucanase

SEQ ID Nº 7: seqüência de aminoácidos codificada pelo frag- mento genômico amplificado de β-1,3-endoglucanase de Gossypium hirsu- tum Fiber Max966, subtipo A

SEQ ID Nº 8: seqüência de aminoácidos codificada pelo frag- mento genômico amplificado de β-1,3-endoglucanase de Gossypium hirsu- tum Fiber Max966, subtipo D

SEQ ID Nº 9: seqüência de nucleotídeos do clone genômico completo de β-1,3-endoglucanase de Gossypium hirsutum Fiber Max966, subtipo A1 incluindo a seqüência promotora

SEQ ID Nº 10: seqüência de nucleotídeos do clone genômico completo de β-1,3-endoglucanase de Gossypium hirsutum Fiber Max966, subtipo D, incluindo a seqüência promotora

SEQ ID Nº 11: seqüência de aminoácidos de β-1,3-endogluca- nase completa de Gossypium hirsutum Fiber Max966, subtipo A

SEQ ID Nº 12: seqüência de aminoácidos de β-1,3-endogluca- nase completa de Gossypium hirsutum Fiber Max966, subtipo D

SEQ ID Nº 13: seqüência de nucleotídeos de pré-miRNA1 SEQ ID Nº 14: seqüência de nucleotídeos de pré-miRNA1 com sítios de clonagem

SEQ ID Nº 15: seqüência de nucleotídeos de pré-miRD1 SEQ ID Nº 16: seqüência de nucleotídeos de pré-miRD1 com sí- tios de clonagem

SEQ ID Nº 17: seqüência de nucleotídeos de pré-miRA2 SEQ ID Nº 18: seqüência de nucleotídeos de pré-miRA2aa

SEQ ID Nº 19: seqüência de nucleotídeos de pré-miRA2aa com sítios de clonagem

SEQ ID Nº 20: seqüência de nucleotídeos de pré-miRD2 SEQ ID Nº 21: seqüência de nucleotídeos de pré-miRD2 com sí- tios de clonagem

Exemplo 1: Identificação de alelos específicos subqenômicos AeD que co- dificam uma B-1,3-endoqlucanase seletiva para fibra em plantas de algodão e plantas de algodão parentais.

Foi proposto que a calose está envolvida no processo de manu- tenção da turgência em células de fibra em crescimento. A remoção da calo- se na base das estruturas de ligação entre células de fibra e não fibra de algodão, conhecidas como plasmodesmos, dissipa a pressão de turgência. Isso resulta no término do alongamento rápido da fibra. Portanto, pelo retar- damento da remoção da calose, o comprimento da fibra deve ser aumenta- do.

A enzima β-1,3-endoglucanase catalisa a hidrólise das ligações β-1,3-D-glicosídicas em β-1,3-D-glicano (calose). Um gene de β-1,3-endoglu- canase específica para fibra codificado por GhGIuc 1 não foi detectado quando a calose foi depositada na base da fibra, mas tornou-se evidente no momento da degradação da calose.

Em resumo, o fechamento dos plasmodesmos parece desem- penhar um papel importante no alongamento das fibras de algodão. A depo- sição e a degradação da calose devem estar envolvidas no fechamento e reabertura dos plasmodesmos, respectivamente. A expressão de GhGluc 1 pode desempenhar um papel nesse processo pela degradação da calose, reabrindo assim os plasmodesmos. (Ruan et al, 2004, Plant Physiology - 136:4104-4113).

Baseado na seqüência de nucleotídeos de GhGIuc 1 ( número de acesso EMBL D88416) descrita em Ruan et al, 2004, Plant Physiology - 136:4104-4113, 2 iniciadores (SE002: ggccgaagccgatcttatctagg (iniciadorem sentido reverso; SEQ ID N0 5) e SE003: cggcaacaatcttccatctccag (iniciador em sentido direto, SEQ ID N0 6)) foram determinados para amplificar frag- mentos genômicos de DNA de G. hirsutum (genoma AD), G. arboreum (ge- noma A) e G.raimondii (genoma D). Esses fragmentos foram seqUenciados (vide SEQ ID N0 1 a 4). Para G. hirsutum foram derivadas 2 seqüências de consenso, para G. arboreum foi derivada 1 seqüência de consenso e para G.raimondii foi derivada 1 seqüência de consenso.

Síntese dos polimorfismos entre as duas seqüências de G. hir- sutum e as duas seqüências diploides: <table>table see original document page 41</column></row><table> Consequentemente, um tipo da seqüência corresponde a se- qüência do genoma Aeo outro tipo corresponde ao genoma D.

Usando um digesto Alwl (sítio de reconhecimento = GGATC) sobre o fragmento amplificado por PCR, ambas as variantes subgenômicas dentro de hirsutum ou do genoma podem ser distinguidas (vide figura 5). Assim o seguinte protocolo pode ser usado para distinguir os alelos do sub- genoma A e D de GhGIuc 1. Os iniciadores usados são:

a. SE002: GGCCGAAGCCGATCTTATCTAGG (SEQ ID N0 5)

b. SE003: CGGCAACAATCTTCCATCTCCAG (SEQ ID N0 6)

O comprimento do produto de PCR esperado é de 655 bp.

Condições de PCR:

<table>table see original document page 42</column></row><table>

Após a amplificação por PCR, o fragmento de PCR é digerido com o digesto Alwl (3 h de incubação @ 37°C) usando 10 μΙ de padrão; 1 μΙ de enzima Alwl; 2 μΙ de tampão de restrição NEB 4, 7 μΙ de água MQ. Os fragmentos resultantes são analisados sobre gel TAE 1,5% corado com EtBr.

Os tamanhos esperados das bandas para o fragmento de PCR específicos para o alelo do subgenoma A são: 479+118+59 bp. Os tama- nhos esperados das bandas para o fragmento de PCR específicos para o alelo do subgenoma D são: 53+118 bp.

Exemplo 2: Expressão diferencial de alelos específicos dos subgenomas A e D que codificam uma 3-1,3-endoglucanase seletiva para fibra e correlação com os estágios de desenvolvimento da fibra em Gossypium hirsutum.

A expressão alélica específica através do perfil de crescimen- to/desenvolvimento da fibra foi analisada para G. hirsutum. DNA de bibliote- cas de cDNA criadas a partir de células de fibra e semente com 5DPA e a partir de células de fibra com 10, 15, 20 e 40 DPA foi extraído, a concentra- ção foi equalizada e a amplificação por PCR mencionada acima foi realiza- da. As diferenças nas intensidades das bandas correspondem a diferenças relativas na expressão (Figura 6, banda 2, 4, 6, 8 e 10. Um controle positivo (DNA genômico) foi incluído (Figura 6, banda 12). Uma digestão com Alwl foi realizada como descrito no Exemplo 1 para distinguir entre os 2 alelos sub- genômicos dos genes GhGIuc 1 (Figura 6, bandas 3, 5, 7, 9, 11 e 13).

O perfil de expressão pode ser resumido como se segue:

<table>table see original document page 43</column></row><table>

Durante a fase de alongamento rápido no desenvolvimento da fibra (5 e 10 dpa), não há expressão de GhGIuc 1. Portanto, o tampão de calose não é degradado; a turgência na célula não é liberada e o alonga- mento continua. Acredita-SE que a banda mais fraca com 5 dpa indica al- guma expressão na semente (não na fibra). Na transição durante a fase de alongamento e a fase de formação da parede secundária (15 DPA), GhGIuc 1 é expresso. Isso libera a turgência na célula e o alongamento rápido ces- sa. Apenas a variante similar ao genoma D do gene GhGIuc 1 é expressa. Com 20 DPA há mais expressão do que com 15 DPA (banda mais intensa). A variante similar ao genoma A não é expressa com 15 e 20 DPA. A variante similar ao genoma A, assim como a variante similar ao genoma D, é expres- sa com 30 e 40 DPA e possivelmente desempenha um papel na maturação ou outras propriedades da fibra.

Exemplo 3: Isolamento e identificação de região promotora de alelos especí- ficos dos subgenomas AeD gue codificam uma β-1.3-endoglucanase seleti- va para fibra.

Um fragmento de PCR gue compreende a seguência de nucleo- tídeos dos alelos específicos subgenômicos A e D de GhGluc 1 foi usado para rastrear uma biblioteca BAC gue contém clones de DNA genômico da variedade de Gossypium hirsutum. 4 clones diferentes foram identificados, 2 para cada variante subgenômica. A seguência de nucleotídeos dos fragmen- tos genômicos para cada uma das variantes alélicas foi identificada e está representada na SEQ ID N° 9 (genoma A) e SEQ ID N° 10 (genoma D).

Para a variante do genoma A, um TATA box pode ser identifica- do nas posições 2278 a 2281; um sítio de início da transcrição na posição 2308. A líder 5' não-traduzida se estende do nucleotídeo 2308 a 2409; o có- don de início da tradução está localizado nas posições 2410 a 2412. A se- guência codificadora consiste em dois éxons (nt 2410 a 2443 e nt 2556 a 3499) separada por uma seguência de íntron (2444 a 2555). O códon de parada da tradução está localizado na posição 3497 a 3499 e o sítio de poli- adenilação está localizado na posição 3624.

Para a variante do genoma D, um TATA box pode ser identifica- do nas posições 3242 a 3245; um sítio de início da transcrição na posição 3270. A líder 5' não-traduzida se estende do nucleotídeo 3270 a 3372; o có- don de início da tradução está localizado nas posições 3373 a 3375. A se- guência codificadora consiste em dois éxons (nt 3373 a 3406 e nt 3501 a 4444) separada por uma seguência de íntron (nt 3407 a 3500). O códon de parada da tradução está localizado na posição 4442 a 4444 e o sítio de poli- adenilação está localizado na posição 4566.

A seguência de nucleotídeos das regiões codificadoras fundidas foi alinhada (Figura 2)e as diferenças estão indicadas; similarmente, as se- guências de nucleotídeos dos íntrons foram alinhadas (Figura 3). A Figura 4 mostra um alinhamento das proteínas codificadas, enquanto que a figura 1 mostra um alinhamento das seqüências de nucleotídeos localizadas a mon- tante da região codificadora.

Exemplo 4: Construtos de gene quimérico que compreendem regiões promo- toras seletivas para fibra diferentes operativamente ligadas a um gene mar- cador.

Os seguintes fragmentos de DNA foram operativamente ligados usando técnicas recombinantes padronizadas:

a. A seqüência de nucleotídeos do promotor específico do alelo

A compreendendo a seqüência de nucleotídeos de SEQ ID N0 9 do nucleotí- deo 465 ao nucleotídeo 2409.

b. Uma região codificadora de β-glicuronidase (GUS)

c. Um fragmento que compreende um sinal de término da trans- crição e de poliadenilação (CaMV) 3' 35S (indicado daqui por diante como Glucl-SGA (A1.9)) e

d. A seqüência de nucleotídeos do promotor específico para o alelo A que compreende a seqüência de nucleotídeos de SEQ ID N0 9 do nucleotídeo 1374 ao nucleotídeo 2409.

e. Uma região codificadora de β-glicuronidase (GUS)

f. Um fragmento que compreende um sinal de término da trans- crição e de poliadenilação (CaMV) 3' 35S

g. A seqüência de nucleotídeos do promotor específico para o alelo A que compreende a seqüência de nucleotídeos de SEQ ID N0 9 do nucleotídeo 1531 ao nucleotídeo 2409.

h. Uma região codificadora de β-glicuronidase (GUS)

i. Um fragmento que compreende um sinal de término da trans- crição e de poliadenilação (CaMV) 3' 35S

j. A seqüência de nucleotídeos do promotor específico para o alelo D que compreende a seqüência de nucleotídeos de SEQ ID N0 10 do nucleotídeo 1397 ao nucleotídeo 3372. (indicado daqui por diante como Glucl-SGD (D2.0))

k. Uma região codificadora de β-glicuronidase (GUS)

l. Um fragmento que compreende um sinal de término da trans- crição e de poliadenilação (CaMV) 3' 35S e

m. A seqüência de nucleotídeos do promotor específico para o alelo D que compreende a seqüência de nucleotídeos de SEQ ID N0 10 do nucleotídeo 2371 ao nucleotídeo 3372.

n. Uma região codificadora de β-glicuronidase (GUS)

Um fragmento que compreende um sinal de término da transcri- ção e de poliadenilação (CaMV) 3' 35S ou

o. A seqüência de nucleotídeos do promotor específico para o alelo D que compreende a seqüência de nucleotídeos de SEQ ID N0 10 do nucleotídeo 2718 ao nucleotídeo 3372.

p. Uma região codificadora de β-glicuronidase (GUS)

q. Um fragmento que compreende um sinal de término da trans- crição e de poliadenilação (CaMV) 3'35S

Os genes quiméricos acima foram clonados separadamente em um vetor de T-DNA1 na presença de um gene marcador quimérico selecio- nado e introduzidos na cepa de Agrobacterium tumefasciens que compreen- de um plasmídeo Ti auxiliar desarmado. As cepas de Agrobacterium foram usadas para gerar plantas de algodão transgênicas de acordo com o método descrito em WOOO/71733. As células de fibra e outros tecidos dessas plan- tas foram corados histoquimicamente.

A expressão dos construtos quiméricos diferentes é predomi- nantemente observada nas células de fibra e fibras. Exemplo 5: Construtos de gene quimérico compreendendo regiões promoto- ras seletivas para fibra diferentes operativamente ligadas a região codifica- dora de N-acetilglicosamina transferase

Construtos similares aos construtos do Exemplo 4, mas em que a região codificadora de GUS foi substituída por uma região codificadora de NodC (vide W02006/136531, especificamente as SEQ ID 1 a 9, incorpora- das por referência) precedida por uma seqüência líder não-traduzida Cab22, que foram reunidas usando técnicas comuns de DNA recombinante.

Esses genes quiméricos são clonados separadamente em um vetor de T-DNA na presença de um gene marcador quimérico selecionado e introduzidos na cepa de Agrobacterium tumefasciens que compreende um plasmídeo Ti auxiliar desarmado. As cepas de Agrobacterium foram usadas para gerar plantas de algodão transgênicas de acordo com o método descri- to em WOOO/71733. As células de fibra e outros tecidos dessas plantas são analisados quanto a presença de oligossacarídeos positivamente carregados como descrito em W02006/136531.

Exemplo 6: Aumento do comprimento da fibra em Gossypium hirsutum pela regulação negativa de alelos específicos do subqenoma D que codificam uma β-1,3-glicanase seletiva para fibra.

Pré-microRNAs sintéticos específicos para a variante alélica subgenômica A ou D de GhGIuc 1 foram planejados usando regras de plane- jamento disponíveis na técnica.

Moléculas adequadas de miRNA e pré-microRNA para a regula- ção negativa específica da expressão do alelo subgenômico D de GhGIuc 1 estão descritas nas entradas da listagem de seqüência de SEQ ID N015, 16, 20 e 21.

Moléculas adequadas de miRNA e pré-microRNA para a regula- ção negativa específica da expressão do alelo subgenômico A de GhGIuc 1 estão descritas nas entradas da listagem de seqüência de SEQ ID N013, 14, 17, 18 e 19.

As seqüências de nucleotídeos que codificam o pré-microRNA são clonadas sob o controle de um promotor CaMV 35S ou sob o controle de um promotor específico para fibra e/ou preferencial para fibra como descrito no Exemplo 4.

Esses genes quiméricos são clonados separadamente em um vetor de T-DNA na presença de um gene marcador quimérico selecionado e introduzidos na cepa de Agrobacterium tumefasciens que compreende um plasmídeo Ti auxiliar desarmado. As cepas de Agrobacterium foram usadas para gerar plantas de algodão transgênicas de acordo com o método descri- to em WOOO/71733. As fibras de tais plantas ou de sua progênie são anali- sadas quanto ao comprimento da fibra aumentado.

Exemplo 7: Análise da especificidade de promotores glucl para fibras.

RNA foi isolado de folhas, raízes e caules de algodão e analisa- do para a expressão de genes glucl e para o gene da proteína fosfatase 2A (uma Serina/Treonina fosfatase abundante e conservada com ampla especi- ficidade pelo substrato e funções celulares diversas). A síntese da primeira fita de cDNA foi realizada usando o sistema SuperScript First Strand Synthe- sis para RT-PCR (Invitrogen), após o que os iniciadores específicos para glucl ou pp2A foram adicionados e a reção de RT-PCR foi realizada. Os resultados são visualizados na Figura 7. O resultado positivo na banda 17 indica que a síntese da primeira fita foi obtida com sucesso. Os resultados positivos nas bandas 10, 12, 14 usando iniciadores específicos para pp2A em amostras de RNA de folha, raiz e caule indicaram especificamente que a síntese da primeira fita na amostra de folha, raiz e caule funcionou. As ban- das 11, 13 e 15 são controles negativos que omitem a transcriptase reversa da reação. A banda 8 é um controle positivo que consiste em DNA genômico para verificar a exatidão da reação de PCR específica para glucl. Nas ban- das 2, 4, 6 nenhum sinal pode ser detectado indicando a ausência da ex- pressão de Glucl em folhas, raízes e caules de algodão. As bandas 3, 5 e 7 são controles negativos que omitem a transcriptase reversa.

Em conclusão, nenhuma expressão de Glucl pode ser detecta- da na folha, raiz e tecido do caule de algodão.

Exemplo 8: Transformação de óvulo de algodão com cepas de Agrobacteri- um contendo

Óvulos de flores de algodão foram isolados com ODPA, 1DPA e 2DPA e usados para experimentos de cultura de óvulo (como descrito, por exemplo, por Feng e Brown, 2000, In vitro Cellular & Developmental Biology, Volume 36, Número 4, páginas 293 a 299) após a transformação com Agro- bacterium tumefasciens que carrega o promotor quimérico diferente de gluc1::genes de fusão de GUS indicados no Exemplo 4 como Glucl- SGA(A1.9) e Gluc1-SGD(D2.0). As células de fibra/fibras iniciais foram ana- lisadas histoquimicamente para a expressão de GUS após 1 semana, 2 se- manas, 3 semanas, 4 semanas ou 5 semanas. Como um controle positivo, óvulos cultivados foram incluídos que tinham sido infectados com uma cepa de Agrobacterium abrigando um promotor quimérico CaMV35::gene de fusão de GUS. Observe que a região codificadora de GUS usada continha uma seqüência de íntron para evitar a expressão acidental de GUS nas Agrobac- térias infectantes. Os resultados estão resumidos na Tabela 1.

Tabela 1: Análise histoquímica de GUS dos óvulos de algodão cultivados e transfectados

<table>table see original document page 49</column></row><table>

Esses dados corroboram os perfis de expressão deduzidos para os promotores dos diferentes alelos subgenômicos para GhGIuc 1 a partir dos dados do Exemplo 2. LISTAGEM DE SEQÜÊNCIAS

<110> Bayer BioScience N.v.

Engelen, steven

Arioli, Tony

<120> EXPRESSÃO DIFERENCIAL DE ALELOS SUBGENÔMICOS ESPECÍ- FICOS NO ALGODÃO E USOS DOS MESMOS

<130> BCS 07-2001 <150> EP07000550.9 <151> 2007-01-11 <150> US60/884,564 <151> 2007-01-11 <160> 21 <170> Patentln versão 3.3 <210> 1 <211> 689 <212> DNA <213> Gossypium hirsutum <400> 1 tggccgtgat attggtgttt gctatggttt gaacggcaac aatcttccat ctccaggaga 60 tgttattaat cttttcaaaa ctagtggcat aaacaatatc aggctctacc agccttaccc 120 tgaagtgctc gaagcagcaa ggggatcggg aatatccctc tcgatgagta cgacaaacga 180 ggacatacaa agcctcgcaa cggatcaaag tgcagccgat gcatgggtta acaccaacat 240 cgtcccttat aaggaagatg ttcaattcag gttcatcatc attgggaatg aagccattcc 300 aggacagtca agctcttaca ttcctggtgc catgaacaac ataatgaact cgctggcctc 360 atttgggcta ggcacgacga aggttacgac cgtggtcccg atgaatgccc taagtacctc 420 gtaccctcct tcagacggcg cttttggaag cgatataaca tcgatcatga ctagtatcat 480 ggccattctg gttcgacagg attcgcccct cctgatcaat gtgtaccctt attttgccta 540 tgcctcagac cccactcata tttccctcaa ctacgccttg ttcacctcga ccgcaccggt 600 ggtggtcgac caaggcttgg aatactacaa cctctttgac ggcatggtcg atgctttcaa 660 tgccgcccta gataagatcg gcttcggcc 689 <210> 2 <211> 689 <212> DNA <213> Gossypium hi rsutum <400> 2 tggccgtgat attggtgttt gctatggttt tgttattaat ctttacaaaa ctagtggcat tgaagtgctc gaagcagcaa ggggatcggg ggacatacaa agcctcgcaa aagatcaaag cgtcccttat aaggacgatg ttcagttcaa aggacaatca agctcttaca ttcctgatgc atttgggtta ggcacgacga aggttacgac gtaccctcct tcagacggcg cttttggaag ggccattctg gctgtacagg attcgcccct tgcctcagac cccactcata tttccctcga ggtggtcgac caaggcttgg aatactacaa tgccgcccta gataagatcg gcttcggcc <210> 3 <211> 655 <212> DNA <213> Gossypi um arboreum <400> 3 cggcaacaat cttccatctc caggagatgt caatatcagg ctctaccagc cttacctgaa tccctctcga tgagtacgac aaacgaggac gccgatgcat gggttaacac caacatcgtc atcatcattg ggaatgaagc cattccagga aacaacataa tgaactcgct cgcctcattt gtcccgatga atgccctaag tacctcgtac ataacatcga tcatgactag tatcatggcc atcaatgtgt acccttattt tgcctatgcc gccttgttca cctcgaccgc accggtggtg tttgacggca tggtcgatgc tttcaatgcc <210> 4

gaacggcaac aatcttccat ctccaggaga 60 aaacaatatc aggctctacc agccttaccc 120 aatatccctc tcgatgggtc cgagaaacga 180 tgcagccgat gcatgggtta acaccaacat 240 gttgatcact attgggaatg aagccatttc 300 catgaacaac ataatgaact cgctcgcctt 360 cgtggtcccg atgaatgccc taagtacctc 420 cgatataaca tcgatcatga ctagtatcat 480 cctgatcaat gtgtaccctt attttgccta 540 ttacgccttg ttcacctcga ccgcaccggt 600 cctctttgac ggcatggtcg atgctttcaa 660 689 tattaatctt tacaaaacta gtggcataaa 60 gtgctcgaag gagcaagggg atcgggaata 120 atacaaagcc tcgcaacgga tcaaagtgca 180 ccttataagg acgatgttca attcaggttc 240 cagtcaagct cttacattcc tggtgccatg 300 gggctaggca cgacgaaggt tacgaccgtg 360 cctccttcag acggcgcttt tggaagcgat 420 attctggttc gacaggattc gcccctcctg 480 tcagacccca ctcatatttc cctcaactac 540 gtcgaccaag gcttggaata ctacaacctc 600 gccctagata agatcggctt cggcc 655 <211> 656 <212> DNA <213> Gossypium raimondii <400> 4 cggcaacaat cttccatctc caggagatgt tattaatctt tacaaaacta gtggcataaa 60 caatatcagg ctctaccagc cttaccctga agtgctcgaa gcagcaaggg gatcgggaat 120 atccctctcg atgggtccga gaaacgagga catacaaagc ctcgcaaaag atcaaagtgc 180 agccgatgca tgggttaaca ccaacatcgt cccttataag gacgatgttc agttcaaatt 240 gatcactatt gggaatgaag ccatttcagg acaatcaagc tcttacattc ctgatgccat 300 gaacaacata atgaactcgc tcgcctcatt tgggttaggc acaacgaagg ttacgaccgt 360 ggtcccgatg aatgccctaa gtacctcgta ccctccttca gacggcgctt ttggaagcga 420 tataacatcg atcatgacta gtatcatggc cattctggct gtacaggatt cgcccctcct 480 gatcaatgtg tacccttatt ttgcctatgc ctcagacccc actcatattt ccctcgatta 540 cgccttgttc acctcgaccg caccggtggt ggtcgaccaa ggcttggaat actacaacct 600 ctttgacggc atggtcgatg ctttcaatgc cgccctagat aagatcggct tcggcc 656 <210> 5 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Iniciador de oligonucleotideo para amplificação do

fragmento genômico de endoglicanase <400> 5

ggccgaagcc gatcttatct agg 23

<210> 6 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220>

<223> Iniciador de oligonucleotideo para amplificação do fragmento genômico de endoglicanase <400> 6 cggcaacaat cttccatctc cag 23

<210> 7 <211> 229 <212> PRT <213> Gossypium hirsutum <400> 7

Gly Arg Asp Ile Gly Val Cys Tyr Gly Leu Asn Gly Asn Asn Leu Pro 1 5 10 15

Ser Pro Gly Asp Val Ile Asn Leu Phe Lys Thr Ser Gly Ile Asn Asn 20 25 30

Ile Arg Leu Tyr Gln Pro Tyr Pro Glu Val Leu Glu Ala Ala Arg Gly

35 40 45

Ser Gly Ile Ser Leu Ser Met Ser Thr Thr Asn Glu Asp Ile Gln Ser 50 55 60

Leu Ala Thr Asp Gln Ser Ala Ala Asp Ala Trp Val Asn Thr Asn Ile 65 70 75 80

Val Pro Tyr Lys Glu Asp Val Gln Phe Arg Phe Ile Ile Ile Gly Asn

85 90 95

Glu Ala Ile Pro Gly Gln Ser Ser Ser Tyr Ile Pro Gly Ala Met Asn 100 105 110

Asn Ile Met Asn Ser Leu Ala Ser Phe Gly Leu Gly Thr Thr Lys Val

115 120 125

Thr Thr Val vai Pro Met Asn Ala Leu Ser Thr Ser Tyr Pro Pro Ser 130 135 140

Asp Gly Ala Phe Gly Ser Asp Ile Thr Ser Ile Met Thr ser Ile Met 145 150 155 160

Ala Ile Leu vai Arg Gln Asp Ser Pro Leu Leu Ile Asn vai Tyr Pro

165 170 175

Tyr Phe Ala Tyr Ala Ser Asp Pro Thr His Ile Ser Leu Asn Tyr Ala 180 185 190

Leu Phe Thr ser Thr Ala Pro Val vai Val Asp Gln Gly Leu Glu Tyr 195 200 205 Tyr Asn Leu Phe Asp Gly Met Val Asp Ala Phe Asn Ala Ala Leu Asp

210 215 220

Lys Ile Gly Phe Gly 225

<210> 8 <211> 229 <212> PRT

<213> Gossypium hirsutum <400> 8

Gly Arg Asp Ile Gly vai Cys Tyr Gly Leu Asn Gly Asn Asn Leu Pro 1 5 10 15

Ser Pro Gly Asp vai Ile Asn Leu Tyr Lys Thr ser Gly Ile Asn Asn

20 25 30

lie Arg Leu Tyr Gln Pro Tyr Pro Glu vai Leu Glu Ala Ala Arg Gly 35 40 45

ser Gly Ile Ser Leu Ser Met Gly Pro Arg Asn Glu Asp Ile Gln Ser

50 55 60

Leu Ala Lys Asp Gln ser Ala Ala Asp Ala Trp vai Asn Thr Asn Ile 65 70 75 80

vai Pro Tyr Lys Asp Asp Val Gln Phe Lys Leu Ile Thr Ile Gly Asn

85 90 95

Glu Ala Ile Ser Gly Gln Ser Ser ser Tyr Ile Pro Asp Ala Met Asn

100 105 110

Asn lie Met Asn Ser Leu Ala Leu Phe Gly Leu Gly Thr Thr Lys Val 115 120 125

Thr Thr Val Val Pro Met Asn Ala Leu Ser Thr Ser Tyr Pro Pro Ser

130 135 140

Asp Gly Ala Phe Gly Ser Asp Ile Thr Ser Ile Met Thr Ser Ile Met 145 150 155 160

Ala Ile Leu Ala Val Gln Asp Ser Pro Leu Leu Ile Asn Val Tyr Pro

165 170 175

Tyr Phe Ala Tyr Ala Ser Asp Pro Thr His Ile ser Leu Asp Tyr Ala 180 185 190

Leu Phe Thr Ser Thr Ala Pro vai Val Val Asp Gln Gly Leu Glu Tyr

195 200 205

Tyr Asn Leu Phe Asp Gly Met vai Asp Ala Phe Asn Ala Ala Leu Asp

210 215 220

Lys Ile Gly Phe Gly 225

<210> 9

<211> 6009

<212> DNA

<213> Gossypium hirsutum <220>

<221> Região de interesse biológico

<222> (2278)..(2281)

<223> TATA box <220>

<221> Região de interesse biológico

<222> (2308)..(2308)

<223> Sitio de inicio da transcrição <220>

<221> Região de interesse biológico

<222> (2308)..(2409)

<223> Seqüência lider 5' não traduzida <220>

<221> Região de interesse biológico

<222> (2410)..(2412)

<223> códon de inicio da tradução (ATG) <220>

<221> Região de interesse biológico

<222> (2410)..(2443)

<223> Seqüência codificante parte I <220> <221> Região de interesse biológico <222> (2444)..(2555) <223> Seqüência do intron <220>

<221> Região de interesse biológico <222> (2556)..(3499) <223> Seqüência codificante parte Ii <220>

<221> Região de interesse biológico

<222> (3497)..(3499)

<223> Códon de parada da tradução <220>

<221> Região de interesse biológico <222> (3624)..(3624) <223> Sitio de poliadenilação <400> 9

cgcggcatat aattttatgt gtgtaatttg ttgggttaat tacttaaaat agtatatttt 60 taattgctgt aattaatgta agataatttt tattatttga atcattgcac aaaattaaaa 120 tagaataatt tatttaacaa ttcaaatata ataataatcc aaattataat tatagtattt 180 ttacaatatt caatatacaa tatagtttta cttcatacaa ttaatataaa aaaatattat 240 tcaaaataat aactaataaa cataattacc atatattaat tattttgata tttcgaacat 300 aacgctaata aaaaatttcc taatcattat taaatcattt gtataaacta taaagaaatt 360 gatatattgt aaattaaact ttattcattt tttttcttaa tactcaataa attaatcata 420 ataactcata aataatatat aattaaaata atcataacat ggtagattat ataaataggg 480 ggcgaatcta gggagctggc atgaccccta aaatagaatt ttctattttg acctatcaaa 540 atttttaaaa ttttaaatta gtaaaggtaa atttgtactt tgacctctta aaatgataaa 600 attttacttt aatcctttaa aatttacatt tttactatca taaaaattac aatttgattt 660 tgcccctaaa atttttttct agcttagccc tgtatataaa tatattattt ataattttta 720 tatttaaaat ataaagtttt taattataca aataattaaa atctgatatt taaaactaaa 780 gtaatttctt ttttcttttt actttttttt aattgcaaca taatggttta aatatctata 840 taacgtatga agtaatttga tataaatttt attttaattt attattatat aaattcattt 900 agtaaaaact tttaatagaa tcaaaatttt tatttgtaaa ttcgataact tttcttatca 960 agtatatttg tgagaaccaa atatttagta

aatcttataa aaaaatattt aaaatgaaaa

aaaatgaaaa acattgtaca aaggctatat

ctcttataga gattatagat agattataaa

aagaggataa atgtatttta atgtactcaa

caatatcaac ctaattaaga ttcattctaa

aaggttaata aattaattag aacacaaaca

tgacccaaag gaaaaatttg ttacgtcgat

cattttaacc taaaaaaaga gaaaagtata

ataaatttat ggcatttcta aaaaaattct

atccgaagca ttaccagaag atggatcacc

taattaattg aaagtgagca tttaattttg

gttctcatta atgcaattaa attatattcg

gaggaaagac ggttcatcta ttttttcttt

ctacatgcaa aaaatcaaat atgaaaaata

gttcaaaacg taaatgtatt gaaaaattat

tcaatgtact cacatttatc aaatgtatac

gtttttttta tagatgggaa aattttttaa

ataaatttta attcgataca tataaatata

atacaattaa gaaaataatt tataaatatt

aatgtcaaca ctttttcatt aaatacaatt

tatctcaggt ggtccaaaaa ctcggaatcc

ataaatccag cagtaggcac aagaaacgag

aaaaagtgct gagatcaaga aatatagtga

atctaagcaa tgctgttttt aactcaactc

acagtgattt tacagtaaat atggctttga

ccattttaat tactgatcta ctatatatgt

tggtttgaac ggcaacaatc ttccatctcc

tggcataaac aatatcaggc tctaccagcc

atcgggaata tccctctcga tgagtacgac

tcaaagtgca gccgatgcat gggttaacac

attcaggttc atcatcattg ggaatgaagc

aaattaatat tcttatttat aaatatgata 1020 aaattgtaca aatattataa aaaaatattt 1080 aagaagttca aaagtttctt cgaccatgta 1140 actatatgta gtttctctta acttttaaat 1200 acttatatat ttttatattg acaataatat 1260 cattaatgtt gaagattttt aataaaagaa 1320 aacacaaatt taagtggtat gtaaggtcct 1380 taaattataa attaatttaa agtaaaatta 1440 tctaatttct tcgaaaatgg aaagaaaatt 1500 gaattcgcta ctaaaagatg aaattataaa 1560 aaatcacaaa caatcaatga aaagtaatga 1620 atagccatat acttcctgct gaatttatag 1680 acaccttttg aatgaaataa aatgacacaa 1740 caatcgccca tcaaaatacc aaaaatgtaa 1800 ttcatatttt gatattttaa tatattgtgt 1860 gatggtgttg ttgctgtatg tccataaaat 1920 tttgagagaa gttattttga taatactcaa 1980 attatttttt gattttgatg aaatgtatat 2040 tatgtaaatt ttaaatttaa atttaataat 2100 ttccgattaa aaataaatct ggaaagaaga 2160 aggatgggac acgatacctt catgcattga 2220 tttttgaaaa aaaacttcca gagagagtat 2280 caccagttat tgactttcct ttgtaaaaaa 2340 aatatgggtc caagattttc tgggttttta 2400 ctctctctaa caggtaaaac aaacttctct 2460 aaaatataca acaaaacatt tatcttcaat 2520 tgcagatggc cgtgatattg gtgtttgcta 2580 aggagatgtt attaatcttt tcaaaactag 2640 ttaccctgaa gtgctcgaag cagcaagggg 2700 aaacgaggac atacaaagcc tcgcaacgga 2760 caacatcgtc ccttataagg aagatgttca 2820 cattccagga cagtcaagct cttacattcc 2880 tggtgccatg aacaacataa tgaactcgct tacgaccgtg gtcccgatga atgccctaag tggaagcgat ataacatcga tcatgactag gcccctcctg atcaatgtgt acccttattt cctcaactac gccttgttca cctcgaccgc ctacaacctc tttgacggca tggtcgatgc cggccaaatt actctcattg tagccgaaac cacgagtgtc gcgaacgctc aaacttataa agggactccg aaaagacctg aatatataat gaacttgaag caacccacag ttgagcagaa tgtttatcca ttttggtgaa cttgaaatgt gacgcttcat atagtttctg catattttga ttttatttgt tgttttttaa ttaaataaaa taattaaata ttaaataaaa agtttaatat aaatatatta aatttatttt tacgaataaa atttgatata aattttcaat tcaacaatag aagatttaac tttaattggt gacctaatat caaaatgact tgtaatgacg aaagagatgt gcataaaagg ataactaaat aactcatgat catctagaaa caaggtatgt cttaaatgat tgcaatgaat tcatggatag cacatctcta tgcagaagtt aattgtgctt taaatacttg tatacttata ataaaaataa ttcgattcgg aaaattttac agatatcttg aaggggatct atatttacaa taaagataac tcaattcgag catatcaaag agggagatct tcttcttccc ttccttatat ttttacatac gttgattata taaaaataaa caacggggtt cttatgtaga aaaatttagg cacattcatt gggcccaggt ttgcccaagc ttgactcaaa taaaaatgct atattatttt atataacttt taaatatata ataaatattt cccaactaaa ctaaaattat ggcctcattt gggctaggca cgacgaaggt 2940 tacctcgtac cctccttcag acggcgcttt 3000 tatcatggcc attctggttc gacaggattc Β060 tgcctatgcc tcagacccca ctcatatttc 3120 accggtggtg gtcgaccaag gcttggaata 3180 tttcaatgcc gccctagata agatcggctt 3240 tggatggccg accgccggta acgagcctta 3300 caagaacttg ttgaatcatg tgacgcagaa 3360 gccgacgttt ttcttcgaga tgttcaacga 3420 tttcggattc ttcttcccca atatgaaccc 3480 tattgttggc tatttaaatc ttttgccaga 3540 aagtggaaaa tcaatctaaa tataaataag 3600 ttttaaatat tttaaaaaca tctttattgg 3660 tcaaatttta tcaattcaaa aataaaataa 3720 ttgattttct attaatgcag attttaaata 3780 taattttgat cacatcaaag gagaaaggga 3840 aacacgttga aaacggagtt cccaataagg 3900 ccaagtgaaa tctgctttaa agtgaaagaa 3960 ctaaattgaa gttctataaa atgcaacttt 4020 gttttatgaa tttgtcttaa ttgggtttta 4080 attatacgtt gctggtttat atgagagtgg 4140 cttagtgttt atgaaatttg aaaagtgtta 4200 aatccaattc agggttcgac tcaatataat 4260 tcttcttctc tacttctcga gcagtgttat 4320 atccgaccta atataataaa attctacaga 4380 tacatcttga ccttcttgat caaaatgacc 4440 tgaatcaaaa gaaagatacc aaaaagtttt 4500 gatgcttatg ggccgggccg gactcaacta 4560 cgggcctaac ccaaaaatgg gcctaaaatt 4620 aaaattcggg cctgaccccg tattaatttt 4680 taatatataa aaaatactaa aaaaattaaa 4740 taagaaaaat aattcatatt agcgtataaa 4800 ttggaaattg accaaaatta aaattattgt atagttaatc tatattaaaa ggacatgtaa 4860 ttaaaaacca ttaaaactat tatacaataa attaaatctt cattgtatac atagaaaggc 4920 attaataatt aaaaaactat attaagatat aaactaaatt caaaattatt aaaaacaaga 4980 actaaataaa aaagcaattg aaaattacga attaatgtta aaatcaaatg ttaaaatcaa 5040 gggacttaaa taaaaatatc ccaaaataca aaacattagc ttcctttccc atccacgtga 5100 atgcaaagtt tacatggtgt ttcctagtgt ttgtgcgact ccaacctttt atttacctct 5160 ttttttcttt atttgaacaa ttatttgata atgattagaa ttttgggatt gttgctcatc 5220 gtacgtgcaa cacttaaaat cactatgatt tttcataatt tatataacct atatcgtttt 5280 ggaaattaat tttatttttt atattatttt aataaaaata ccatctacct tttttaattt 5B40 atgatccctt tcatatttaa aaattcaaat tgacaattgt ctaactaaac accgtcacac 5400 tccaataaga ttgtaatttc ctccatcttg atattacact caaaagcatg ttgccaacaa 5460 acaaatcaac tágccttttt ctaccactat tcatcatctt cttaagagtg tgtttatgtc 5520 atgtgccgag attttaggta tggtcacgtt gtggctttaa actcaaatct attgcccatg 5580 agtctaagtt agcctccgat cctcactaaa gagaggcttg gcacacttta cctagccaag 5640 tacacaagga atagagctat tagaaagcat taaagagtta ggagaatgtg gaagtgtttt 5700 tattactcaa agctaacttg gatacaaata aaggagggag cctctccttt aggcaagctt 5760 cttttgatct gatggttaca attaatctcg aataggaggg gtcaaacttc tcactcagtt 5820 tcatattatc tcttggtgct tggttggcct ccgccttgag acaactttag ataacaccta 5880 gtcttaacac ttttagcttc acattgtacg catccttcat tactcaaatg ccacaaagcc 5940 tccttactta tcccaatcg <210> <211> <212> aggctcttgg 10 68 77 DNA tcgctcccac taccttcggc tttagactca tctaagatct 6000 6009 <21Β> Gossypium hirsutum <220> <221> Região de interesse biológico <222> (3242)..(3245) <223> TATA box <220> <221> Região de interesse biológico <222> (3270)..(3270) <223> Sitio de inicio da transcrição

<220>

<221> Região de interesse biológico

<222> (3270)..(3372)

<223> Seqüência lider 5' não-traduzida

<220>

<221> Região de interesse biológico

<222> (3373)..(3375)

<223> Códon de inicio da tradução (atg)

<220>

<221> Região de interesse biológico

<222> (3373)..(3406)

<223> Seqüência codificante parte I

<220>

<221> Região de interesse biológico

<222> (3407)..(3500)

<223> Seqüência do intron

<220>

<221> Região de interesse biológico

<222> (3501)..(4444)

<223> Seqüência codificante parte II

<220>

<221> Região de interesse biológico

<222> (4442)..(4444)

<223> códon de parada

<220>

<221> Região de interesse biológico

<222> (4566)..(4566)

<223> Sitio de poliadenilação

<400> 10

ttcaaactta ctcgcttgca caaaaataat tttataaaag tatttaaaat ataaaatttt 60 tatgttgata atatttttat atacatttta tattttaaga aataataatt ttttaggaat 120 tagaaaaaaa atgtagaata atatcattga gttcacgtag tctaatttta tctattttaa aaagaacttt tggttcaata tgcaatttga catgaaactt ggcttgtggt ttatacgtat cgcatttaaa gaaatgaaaa tggttctaat taaaactttt atgcattaaa ccacacaaaa actatagttc atgcatattt tttatatttt aacttatatg atagcagtta aatttgttaa cataacttgt agagtttagt ttaagttcac ttcaatttca agatttaagt tttaagctta taaaatgtcc tggggttttt tgtaagtatt aaagtagagt ttaacttaac aaatttaatg aattaaaaaa aaaattatag aggctaaaga attaaaatag ttctggatat taactattta tctaaattat gtaaaattaa aatataaaaa atcaaaagtg attttggtca ttttctttta tatatáatgg tttctaatgt gatatgcgcg attaattatt taaataatat atttttaatt tttgaatcac tgcacaaaat taaaatatac aatctaaatt ataattaaag catttttaca tataattaat acaaagaaat attattcaaa tcaattattt tgatatttcg aacataatgc catttgtata aactataaag aaattgatat ttttcttaat agtcaataaa ttaatcataa ccataacata gaatttttta ttttggccca ggaaaaatta cactttgacc ccttaaaaat gacattttta ctattgtaaa aattacaatt cttcgccctt gtgtataaat atattaatta taaattttga tatttaaaac taaagtaatc cataatggtt taaatatcta tattacgtat ttattattat ataaattcat ttagtaaaaa aattcgataa cttttcttat caagtaaatt

tattttaatt tttcaaaaaa ttaaaaataa 180 tttttatact ttcaaattga gataaatatc 240 tacttaaatt ttaatttgat gtaattatta 300 acatgaaatt tttattttga ttcaattgta 360 tcaataatat tattagtgat ttgtgaaatt 420 tcagagttta tgtatgatat tgcacattgg 480 atccatgtca aattttgaaa tttcattctt 540 gtcaaactct agtattagtt atatactata 600 taatttgatt attttttatc tgtttatttt 660 acttaaacaa tagtcattaa atttattaac 720 ataatatgtt tgccacgtga gattttggta 780 gctactactt agtaaggatt agaatttcaa 840 tgatcaaatt agaggtttaa attaagtcaa 900 aattaattaa tgtcattata aaattagagg 960 ctaaatctcg aatgtgagta tagtataagg 1020 tttacaaata ttcttagaga tgctctttta 1080 gcatataatt ttatgtgttt aatttatttt 1140 actataatta atgtaaaata ttttttatta 1200 taacttaatt aacaattcaa atataataat 1260 atattcagta tataatatag ttttacttta 1320 ataataacta atcaacataa ttactatata 1380 taataaaaaa tttcctaatc attattaaat 1440 attgtaaatt aaacttttaa ctattcaatt 1500 taattcataa ttaatatata attaacataa 1560 ttaaaatttt taaaatttta aattagtaaa 1620 gataaaattt tattttaatc ctttaaaatt 1680 taattttgcc cccctaaaaa atttttctag 1740 caatttttat atttgaatta tataaataat 1800 tctttttttt ttactttttt ttaattgaaa 1860 gaagtaattt aatataaatt ttattttaat 1920 cttttaatag aatcaaaatt tttatttgta 1980 tgttgaatta aatatttagt aaaattaata 2040 tttttattta taaatatgat attgtacaaa ggctatataa ttatagatag attatagaac gtactcaaac ttacatattt cactcgacat taatgttgaa acaagcaagc acaaatttaa tgttgattaa attataaatt aaaatatatc tagtttcttc ttatggcatt tctaaaaaaa aacatataga tttcaagaat agcattagca gaaaatggat attgaaagtg agcatttaaa attaatgcaa ttaaattata attttttttc tttcaatcgc gaaaaatatt catattttga aaattatgat ggtgttgtcg tgtaaatttt gacacaagtt tctcaaaatt atttttatat agtgtcaaaa cctattcatt tatctcatat tgtccaaaaa gtataaatcc agcagtgtgc aaaaaaagaa gctgagatca ttaatctcag caatggtgtt tctacagtga ttttacggta atctaccata tatgttgcag caatcttcca tctccaggag caggctctac cagccttacc ctcgatgggt ccgagaaacg tgcatgggtt aacaccaaca tattgggaat gaagccattt cataatgaac tcgctcgcct gatgaatgcc ctaagtacct

aaatcttata aaaaataaaa gaagttcaaa agtttcttcg tattcatagt ttctcttaac ttatattgat aataatgtca aatttttaat aaaagaaaat gtggtaagta aggtccttga aatttaaggt aaaattatat gaaaatgaaa agaaaataat ttctgaattt gatgaaatta agtgggaaaa ttatatttga caccaaatca caaacaatca tttgatagcc atatacttcc tttgtcactt tttgaatgaa ccatcaaaat accgaaaatg tattttaata gattgtgtgt ctgtatgtcc ataaaattca attctaataa taatcaagtt atccgaaaaa tcataacgta atatgcaaat atgatgggac ctcagaatcc tttttgaaaa acaagaaacg agcaccagtt agaaatatag tgaaatatgg tttaactcaa ctcctctctc agtatggctt tgaaaaatat atggccgtga tattggtgtt atgttattaa tctttacaaa ctgaagtgct cgaagcagca aggacataca aagcctcgca tcgtccctta taaggacgat caggacaatc aagctcttac tatttgggtt aggcacgacg cgtaccctcc ttcagacggc

aaatatttaa aatgaaaaac 2100 accctgtact ctaatagaga 2160 ctttaaataa gaattttagt 2220 ataccagccg agttaagatt 2280 gttgataagt taattagaac 2340 ccctaatgga aaaattgtta 2400 tttgacctaa aaaaatgaaa 2460 aaattgatac attataaaat 2520 taataaaaaa aaagtttaaa 2580 acaacactga agaaatccaa 2640 gtgaaaagta atgataatta 2700 tgctgaattt ataggttctc 2760 ataaatgaca cagttcatct 2820 taactacatt aaaaaagatc 2880 tcaaggcgta atgtactaaa 2940 atgtattcgc atgtatcaaa 3000 atttttatac atgagataca 3060 cgatcaaact agaaagagga 3120 acgataccct catgcattga 3180 aaaaaaattc cagagagagt 3240 attgacattc ctttgtaaaa 3300 gtccaacatt ttctgggttt 3360 taacaggtaa aacaaacttc 3420 acaacaaaac atttatactg 3480 tgctatggtt tgaacggcaa 3540 actagtggca taaacaatat 3600 aggggatcgg gaatatccct 3660 aaagatcaaa gtgcagccga 3720 gttcagttca agttgatcac 3780 attcctgatg ccatgaacaa 3840 aaggttacga ccgtggtccc 3900 gcttttggaa gcgatataac 3960 atcgatcatg actagtatca tggccattct tgtgtaccct tattttgcct atgcctcaga gttcacctcg accgcaccgg tggtggtcga cggcatggtc gatgctttca atgccgccct cattgtagcc gaaactggat ggccgaccgc cgctcaaact tataacaaga acttgttaaa acctgaatat ataatgccga cgtttttctt cacagttgag cagaatttcg gattcttctt gtgaagttga aatgttgttg gctatttaaa tgcatatttt gaaagtggaa aatcaatcta aattaaataa aattttaaat attttaaaaa aaagtttaat attcaaattt tatcaattca tttacgaata aattgatttt ctattaatac attcaacaat agtaattttg atcacatcaa gtgacctaat ataacacgtt gaaaacggag cgaaagagat gtccaagtag aatctgcatt actcatgatc tgacataaat tgaagttcta atgtcttaaa tgatgtttta tgaatttgtc atagcacctc actaattata cgttgctggt gctttaaata cttgcttagt gttcaagaaa ataattcaga tccgactcaa tctagtaaaa ttttctctac ttattgatca gtgttatata cggcctaata taataaaatt ctacagacat tcttgacctt tttgatcaaa atttcctccc tcaacagaaa ggtaccaaaa agtttttaaa atgatatatt gggtctaatt attagaatca aactcaattc catttttgtt tgaacggaaa ttagcgtata aattggaaat tgaccaaaac aaggacatgt aattaaaaac cattaaaact acatacaaag tcattaataa ttaaaaaact attaaaaaca ataactaaat aaaaaaaaca agggacttaa ataaaaatat cccaaaatac

ggctgtacag gattcgcccc tcctgatcaa 4020 ccccactcat atttccctcg attacgcctt 4080 ccaaggcttg gaatactaca acctctttga 4140 agataagatc ggcttcggcc aaattactct 4200 cggtaacgag ccttacacga gtgtcgcgaa 4260 tcatgtgacg cagaagggga ctccgaaaag 4320 cgagatgttc aacgaggatt tgaagcaacc 4380 ccccaatatg aaccctgttt atccattttg 4440 tcttttgcca gagacgcttc atatagtttc 4500 aatattaata agttttatgt gttgtttttt 4560 tatctttatt ggtaattaaa tattaaataa 4620 aaaataaaat aaaaatatat taaatttatt 4680 agattttgaa taatttgata taaattttaa 4740 aggagaaagg gaaagattta actttaattg 4800 ctcccaggaa ggcaaaatga cttgtaatga 4860 aaagtgaaaa aagcataaaa ggataagtaa 4920 taaaatgcaa ctttcatcta gaaacaaggt 4980 ttaactgggt tttatgcaat gaattcatgg 5040 ttatatgaga gtggtgcaga agttaattgt 5100 tttgaaaagt attatatatt tataataaaa 5160 ttttacaaac attctaaagg ggatcttctt 5220 cttataataa agacaacctg atttgagatc 5280 ctcaagggag agatcttctt cttccctaca 5340 ctctatttcc acattggttg atcatatgaa 5400 aataaacaaa ggggttctta tgaaattcat 5460 attttaagtt taaacaaatt taaaattcaa 5520 gttactaatt gttaagaaaa ataattcata 5580 taaaattatt gtatagttaa tctatattaa 5640 attatagaat aaattaaatc ttcattctat 5700 atattaagat ataaactata ttcaaaaaat 5760 attgaaaatt acgaattaat gttaaaatca 5820 aaaacattag cttcctttcc catccacgtg 5880 attgcaaagt ttacatggtg tttcctagtg cttgtgcgac tccaaccttt tatttacttt 5940 tttcttttct ttatttgaac aattatttga taatgattag aattttggga ttgttgctca 6000 tcgtacgtgc aacacttaaa atcactatga tttttcataa tttatataac ctatatcgtt 6060 ttggaaatta atgttattat ttatattgtt ttaataaaaa taccatctac ctcttttaat 6120 ttatgatcca tttcttattt gaaaattcaa attgacagtt gtctaactaa acaccatcgc 6180 actccaataa aattgtaatt ttttctatcg tgaatagtac actcaaaagt atgttgttaa 6240 caaacaaatc aattagcctt tttctacctc tattcatcat cttcttaata gcgtgtttat 6300 gtcacgtgtt gagattttag ttccggtcac gtgtggcctt aaacccgaat ttcttacgca 6360 tgagtctaag ttagcctctg atcctcgcta tggagatgct tggcacagtt tacctaggta 6420 agtaaacaag gaatagagct attagaaagc atcagagagt taggagaatg tggaagtgtt 6480 tctattactc aaagctaact tggatacaaa taaaagaggg agcctctcct ttaggcaagc 6540 ctattttgat ctgacggttg caattaatct cgaataggag gggtcgaact tctcactcag 6600 tttcacatta tctcttggtg cttagttggc ctccgccttg agacacattc aaataacacc 6660 tagtcttaac acttttggct tcttattgtg cgtatccttc attactcaaa tgccacaaag 6720 cctcattact taagactctc ggtcgctccc actaccttcg actttagact catctaagat 6780 cttcccaatc gtagacaact tggccttggt ggggaaatct tgcaccctac ggggccttac 6840 ataagaagca attaaatggc tttctctcac ccacctt 6877

<210> 11 <211> 325 <212> PRT

<213> Gossypium hirsutum <400> 11

Met Leu Phe Leu Thr Gln Leu Leu Ser Leu Thr Asp Gly Arg Asp Ile 15 10 15

Gly Val Cys Tyr Gly Leu Asn Gly Asn Asn Leu Pro Ser Pro Gly Asp 20 25 30

Val Ile Asn Leu Phe Lys Thr Ser Gly Ile Asn Asn Ile Arg Leu Tyr 35 40 45

Gln Pro Tyr Pro Glu Val Leu Glu Ala Ala Arg Gly Ser Gly Ile Ser 50 55 60

Leu Ser Met Ser Thr Thr Asn Glu Asp Ile Gln Ser Leu Ala Thr Asp 65 70 75 80 Gln ser Ala Ala Asp Ala Trp vai Asn Thr Asn Ile Val Pro Tyr Lys

85 90 95

Glu Asp Val Gln Phe Arg Phe Ile Ile Ile Gly Asn Glu Ala Ile Pro 100 105 110

Gly Gln Ser Ser ser Tyr Ile Pro Gly Ala Met Asn Asn lie Met Asn 115 120 125

Ser Leu Ala Ser Phe Gly Leu Gly Thr Thr Lys vai Thr Thr Val Val

130 135 140

Pro Met Asn Ala Leu Ser Thr ser Tyr Pro Pro Ser Asp Gly Ala Phe 145 150 155 160

Gly Ser Asp Ile Thr Ser Ile Met Thr Ser Ile Met Ala Ile Leu vai

165 170 175

Arg Gln Asp Ser Pro Leu Leu Ile Asn Val Tyr Pro Tyr Phe Ala Tyr 180 185 190

Ala Ser Asp Pro Thr His Ile ser Leu Asn Tyr Ala Leu Phe Thr Ser 195 200 205

Thr Ala Pro Val vai Val Asp Gln Gly Leu Glu Tyr Tyr Asn Leu Phe

210 215 220

Asp Gly Met Val Asp Ala Phe Asn Ala Ala Leu Asp Lys Ile Gly Phe 225 230 235 240

Gly Gln lie Thr Leu lie Val Ala Glu Thr Gly Trp Pro Thr Ala Gly

245 250 255

Asn Glu Pro Tyr Thr Ser Val Ala Asn Ala Gln Thr Tyr Asn Lys Asn 260 265 270

Leu Leu Asn His Val Thr Gln Lys Gly Thr Pro Lys Arg Pro Glu Tyr 275 280 285

Ile Met Pro Thr Phe Phe Phe Glu Met Phe Asn Glu Asn Leu Lys Gln

290 295 300

Pro Thr vai Glu Gln Asn Phe Gly Phe Phe Phe Pro Asn Met Asn Pro 305 310 315 320

Val Tyr Pro Phe Trp 325 <210> 12

<211> 325

<212> PRT

<213> Gossypium hirsutum

<400> 12

Met Val Phe Leu Thr Gln Leu Leu Ser Leu Thr Asp Gly Arg Asp Ile 1 5 10 15

Gly Val Cys Tyr Gly Leu Asn Gly Asn Asn Leu Pro Ser Pro Gly Asp 20 25 30

Val Ile Asn Leu Tyr Lys Thr Ser Gly Ile Asn Asn Ile Arg Leu Tyr 35 40 45

Gln Pro Tyr Pro Glu vai Leu Glu Ala Ala Arg Gly Ser Gly Ile Ser 50 55 60

Leu Ser Met Gly Pro Arg Asn Glu Asp Ile Gln Ser Leu Ala Lys Asp 65 70 75 80

Gln Ser Ala Ala Asp Ala Trp Val Asn Thr Asn Ile Val Pro Tyr Lys 85 90 95

Asp Asp Val Gln Phe Lys Leu Ile Thr Ile Gly Asn Glu Ala Ile Ser 100 105 110

Gly Gln Ser Ser Ser Tyr Ile Pro Asp Ala Met Asn Asn Ile Met Asn 115 120 125

Ser Leu Ala Leu Phe Gly Leu Gly Thr Thr Lys Val Thr Thr Val Val 130 135 140

Pro Met Asn Ala Leu Ser Thr Ser Tyr Pro Pro Ser Asp Gly Ala Phe 145 150 155 160

Gly ser Asp Ile Thr Ser Ile Met Thr Ser Ile Met Ala Ile Leu Ala 165 170 175

Val Gln Asp Ser Pro Leu Leu Ile Asn vai Tyr Pro Tyr Phe Ala Tyr 180 185 190

Ala Ser Asp Pro Thr His Ile Ser Leu Asp Tyr Ala Leu Phe Thr ser 195 200 205

Thr Ala Pro vai Val Val Asp Gln Gly Leu Glu Tyr Tyr Asn Leu Phe < 210

Asp Gly Met Val Asp 225

Gly Gln He Thr Leu 245

Asn Glu Pro Tyr Thr 260

Leu Leu Asn His Val 275

Ile Met Pro Thr Phe 290

«

Pro Thr Val Glu Gln 305

Val Tyr Pro Phe Trp 325

<210> 13 <211> 134 <212> DNA <213> Artificial <220>

<223> Pré-miRAl <220>

<221> Região de interesse biológico <222> (17)..(36) <223> Fita I de miRNA <220>

<221> Região de interesse biológico <222> (87)..(107) <223> Fita Ii de miRNA I <400> 13

tctagggtaa gggaggtcct gtcgaaccag aatggcacag ggtactttct tgcatgcttg 60 agcctttcat gcttgaagct ctgcgccatt ctcgttcaga caggatccac ttttctctct 120

215 220

Ala Phe Asn Ala Ala Leu Asp Lys Ile Gly Phe 230 235 240

Ile Val Ala Glu Thr Gly Trp Pro Thr Ala Gly

250 255

Ser Val Ala Asn Ala Gln Thr Tyr Asn Lys Asn

265 270

Thr Gln Lys Gly Thr Pro Lys Arg Pro Glu Tyr

280 285

Phe Phe Glu Met Phe Asn Glu Asp Leu Lys Gln

295 300

Asn Phe Gly Phe Phe Phe Pro Asn Met Asn Pro 310 315 320 ctctctcact cact 134 <210> 14 <211> 146 <212> DNA <21Β> Artificial <220> <223> Pré-miRAl com siti os de clonagem <400> 14 ccatggtcta gggtaaggga ggtcctgtcg aaccagaatg gcacagggta ctttcttgca 60 tgcttgagcc tttcatgctt gaagctctgc gccattctcg ttcagacagg atccactttt 120 CtCtCtCtCt ctcactcact gctagc 146 <210> 15 <211> 134 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Pré-mi RDl <220> <221> Região de interesse biológico <222> (17)..(36) <223> Fita I de miRNA <220> <221> Região de interesse biológico <222> (87)..(107) <223> Fita li de miRNA <400> 15 tctagggtaa gggaggatcc tgtacagcca gaatggacag ggtactttct tgcatgcttg 60 agcctttcat gcttgaagct ctgcccattc tgcctgtaac aggattccac ttttctctct 120 ctctctcact cact 134 <210> 16 <211> 146 <212> DNA <213> Artificial <220>

<223> Pré-miRDl com sítios de clonagem <400> 16

ccatggtcta gggtaaggga ggatcctgta cagccagaat ggacagggta ctttcttgca 60 tgcttgagcc tttcatgctt gaagctctgc ccattctgcc tgtaacagga ttccactttt 120 ctctctctct ctcactcact gctagc 146

<210> 17 <211> 134 <212> DNA

<213> Artificial <220>

<223> Pré-miRA2 <220>

<221> Região de interesse biológico <222> (17)..(36) <223> Fita I de microRNA <220>

<221> Região de interesse biológico <222> (87)..(107)

<223> Fita Il de microRNA <400> 17

tctagggtaa gggaggttcc caatgatgat gaacctacag ggtactttct tgcatgcttg 60 agcctttcat gcttgaagct ctgcaggttc atcatcaatt gggaatccac ttttctctct 120 ctctctcact cact 134

<210> 18 <211> 134 <212> DNA <213> Artificial <220>

<223> Pré-miRA2aa <220> <221> Região de interesse biológico <222> (17)..(36) <223> Fita I de microRNA <220>

<221> Região de interesse biológico <222> (87)..(107) <223> Fita Il de microRNA <400> 18

tctagggtaa gggaggttcc caatgatgat gaacctacag ggtactttct tgcatgcttg 60 agcctttcat gcttgaagct ctgcaggttc ataatcactt gggaatccac ttttctctct 120 ctctctcact cact 134

<210> 19 <211> 146 <212> DNA <213> Artificial <220>

<223> Pré-miRA2aa com sítios de clonagem <400> 19

ccatggtcta gggtaaggga ggttcccaat gatgatgaac ctacagggta ctttcttgca 60 tgcttgagcc tttcatgctt gaagctctgc aggttcataa tcacttggga atccactttt 120 ctctctctct ctcactcact gctagc 146

<210> 20 <211> 134 <212> DNA <213> Artificial <220>

<223> Pré-miRD2 <220>

<221> Região de interesse biológico <222> (17)..(36)

<223> Fita I de microRNA <220> <221> Região de interesse biológico <222> (87)..(107) <223> Fita Il de microRNA <400> 20 tctagggtaa gggaggattc ccaatagtga tcaactacag ggtactttct tgcatgcttg 60 agcctttcat gcttgaagct ctgcagttga tccctatatg ggaattccac ttttctctct 120 ctctctcact cact 134 <210> 21 <211> 146 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Pré-miRD2 com sítios de clonagem <400> 21 ccatggtcta gggtaaggga ggattcccaa tagtgatcaa ctacagggta ctttcttgca 60 tgcttgagcc tttcatgctt gaagctctgc agttgatccc tatatgggaa ttccactttt 120 ctctctctct ctcactcact gctagc 146

Claims

1. Promotor preferencial para célula de fibra compreendendo, uma seqüência de nucleotídeos selecionada do seguinte grupo de seqüên- cias de nucleotídeos: a) uma seqüência de nucleotídeos que compreende a seqüência de nucleotídeos de SEQ ID N0 9 do nucleotídeo na posição 2149 ao nucleo- tídeo da posição 2307; b) uma seqüência de nucleotídeos que compreende a seqüência de nucleotídeos de SEQ ID N0 10 do nucleotídeo na posição 3109 ao nu- cleotídeo da posição 3269; c) uma seqüência de nucleotídeos que compreende a seqüência de nucleotídeos que tem pelo menos 70%, preferivelmente pelo menos 80%, mais preferivelmente pelo menos 90%, particularmente pelo menos 90%, particularmente pelo menos 95% de identidade de seqüência com ou, mais particularmente que é idêntica a qualquer uma das ditas seqüências de nu- cleotídeos mencionadas sob a) ou b) ou d) uma seqüência de nucleotídeos que compreende a seqüência de nucleotídeos de um fragmento de DNA com cerca de 150 bp a cerca de 1000 bp que hibridiza sob condições estringentes com um fragmento de DNA que tem a dita seqüência de nucleotídeos mencionada sob a), b) ou c).

2. Promotor preferencial para célula de fibra de acordo com a reivindicação 1, compreendendo a seqüência de nucleotídeos de SEQ ID N0 9 da posição 465 a posição 2307.

3. Promotor preferencial para célula de fibra de acordo com a reivindicação 1, compreendendo a seqüência de nucleotídeos de SEQ ID N0 9 da posição 1374 a posição 2307.

4. Promotor preferencial para célula de fibra de acordo com a reivindicação 1, compreendendo a seqüência de nucleotídeos de SEQ ID N0 9 da posição 1531 a posição 2307.

5. Promotor preferencial para célula de fibra de acordo com a reivindicação 1, compreendendo a seqüência de nucleotídeos de SEQ ID N0 da posição 1397 a posição 3269.

6. Promotor preferencial para célula de fibra de acordo com a reivindicação 1, compreendendo a seqüência de nucleotídeos de SEQ ID N° -10 da posição 2371 a posição 3269.

7. Promotor preferencial para célula de fibra de acordo com a reivindicação 1, compreendendo a seqüência de nucleotídeos de SEQ ID N° -10 da posição 2718 a posição 3269.

8. Região promotora preferencial para célula de fibra, compre- endendo um promotor preferencial para célula de fibra como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 7.

9. Região promotora preferencial para célula de fibra de acordo com a reivindicação 8, compreendendo ainda a seqüência de nucleotídeos de SEQ ID N° 9 do nucleotídeo da posição 2308 ao nucleotídeo da posição -2409.

10. Região promotora preferencial para célula de fibra de acordo com a reivindicação 8, compreendendo ainda a seqüência de nucleotídeos de SEQ ID N° 10 do nucleotídeo da posição 3270 ao nucleotídeo da posição -3372.

11. Gene quimérico, compreendendo as seguintes regiões de DNA operativamente ligadas: a) um promotor específico para célula de fibra como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 7; b) uma região de DNA heterólogo codificando um RNA biologi- camente ativo de interesse; e c) um sinal de término da transcrição e de poliadenilação.

12. Gene quimérico de acordo com a reivindicação 11, em que o dito RNA biologicamente ativo codifica uma proteína de interesse.

13. Gene quimérico de acordo com a reivindicação 12, em que a dita região de DNA heterólogo codifique uma molécula selecionada entre uma N-acetilglicosamina transferase, preferivelmente uma N-acetilglicosa- mina transferase do tipo NodC, uma celulose sintase, uma sucarose sintase, preferivelmente uma sucarose sintase do tipo C; uma sucarose fosfato sinta- se; uma p-1,3-endoglucanase, xilano sintase (cs1F), xiloglicano sintase (cs1 D) e 1,3-1,4 glicano sintase (cs1 C).

14. Gene quimérico de acordo com a reivindicação 11, em que o dito RNA biologicamente ativo é uma ribozima, microRNA, RNA em forma de

15. Gene quimérico de acordo com a reivindicação 12, em que o dito RNA biologicamente ativo regula negativamente a expressão de um ge- ne endógeno de algodão, tal como β-1,3-endoglucanase.

16. Célula de planta, compreendendo um gene quimérico como definido em qualquer uma das reivindicações 11 a 15.

17. Planta, compreendendo em suas células um gene quimérico como definido em qualquer uma das reivindicações 11 a 15.

18. Planta de acordo com a reivindicação 17, que é uma planta de algodão.

19. Semente de uma planta, compreendendo em suas células um gene quimérico como definido em qualquer uma das reivindicações 11a 15.

20. Método para expressar um RNA biologicamente ativo prefe- rencialmente em uma célula de fibra de uma planta que produz fibra, tal co- mo uma planta de algodão, o dito método, compreendendo: a) fornecer as células da dita planta com um gene quimérico como definido em qualquer uma das reivindicações 11 a 15; e b) cultivar as ditas plantas.

21. Método de acordo com a reivindicação 20, em que a dita planta é uma planta de algodão.

22. Uso de um promotor específico para fibra e/ou preferencial para fibra como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 7, para expressão preferencial de um RNA biologicamente ativo em células de fibra de uma planta que produz fibra.

23. Uso de acordo com a reivindicação 22, em que a dita planta é uma planta de algodão.

24. Molécula de DNA isolado, compreendendo uma seqüência de nucleotídeos que codifica uma proteína que compreende uma seqüência de aminoácidos que tem pelo menos 95% de identidade de seqüência, pre- ferivelmente é idêntica a seqüência de aminoácidos de SEQ ID N° 11 ou SEQ ID N° 12 e que codifica uma B-1,3-endoglucanase.

25. Molécula de DNA isolado compreendendo uma seqüência de nucleotídeos selecionada do grupo de SEQ ID N° 1, SEQ ID N° 2, SEQ ID N° 3 ou SEQ ID N° 4.

26. Molécula de DNA isolado compreendendo uma seqüência de nucleotídeos selecionada a partir da seqüência de nucleotídeos de SEQ ID N°9 da posição 2410 a 2443 e a seqüência de nucleotídeos de SEQ ID N° 9 da posição 2556 a 3499 ou a seqüência de nucleotídeos de SEQ ID N° -10 da posição 3373 a 3406 e a seqüência de nucleotídeos de SEQ ID N°10 da posição 3501 a 4444.

27. Uso da molécula de DNA isolado de acordo com qualquer uma das reivindicações 24 a 27 para isolamento de um promotor ou região promotora preferencial para célula de fibra.

28. Método para isolamento de região promotora preferencial para célula de fibra, compreendendo as etapas de: a) identificar um fragmento genômico que codifique um transcri- to de RNA a partir do qual um cDNA pode ser sintetizado, o dito cDNA, com- preendendo a seqüência de nucleotídeos de SEQ ID N° 1, SEQ ID N° 2, SEQ ID N° 3 ou SEQ ID N° 4 ou seus equivalentes funcionais; b) isolar uma região de DNA a montante de uma seqüência de nucleotídeos que codifique a proteína com a seqüência de aminoácidos de SEQ ID N° 11 ou SEQ ID N° 12 ou seus equivalentes funcionais.

29. Promotor ou região promotora preferencial para célula de fi- bra obtida pelo método como definido na reivindicação 28.

30. Método para aumentar o comprimento de uma fibra de uma planta de algodão, compreendendo a etapa de introduzir um gene quimérico em uma célula da dita planta de algodão, o dito gene quimérico compreen- dendo os seguintes elementos de DNA operativamente ligados: (d) um promotor que pode ser expresso em planta, preferivel- mente um promotor que pode ser expresso em planta que controle a trans- crição preferencialmente nas ditas células de fibra; (e) uma região de DNA transcrito, que quando transcrita produz uma molécula de RNA biologicamente ativa capaz de reduzir a expressão de um gene endógeno que codifica β-1,3-endoglucanase para a dita planta que produz fibra, a dita β-1,3-endoglucanase estando envolvida na remoção de calose dos ditos plasmodesmos e (f) uma região terminal 3' que compreende sinais de término da transcrição e de poliadenilação que funcionam em células de planta, caracterizado em que o dito gene que codifica β-1,3-endogluca- nase endógena é um gene endógeno que codifica β-1,3-endoglucanase compreendido dentro do subgenoma D da dita planta de algodão.

31. Método de acordo com a reivindicação 30, em queo dito promotor é um promotor de beta-tubulina específico para fibra de algodão, um promotor de actina específico para fibra de algodão, um promotor espe- cífico para fibra de algodão de um gene de proteína de transferência de lipí- deo, um promotor de um gene de expansina de algodão ou um promotor de um gene de quitinase em algodão ou um promotor como definido em qual- quer uma das reivindicações 1 a 7.

32. Método de acordo com a reivindicação 31, em que o dito gene que codifica β-1,3-endoglucanase compreendido dentro do subgenoma D é caracterizado pela presença de uma seqüência de íntron que tem a se- qüência de nucleotídeos de SEQ ID N0 10 da posição 3407 a 3500.

33. Método de acordo com a reivindicação 31, em que o dito gene que codifica β-1,3-endoglucanase compreendido dentro do subgenoma D é caracterizado pela presença de uma seqüência de nucleotídeos AA- GATC cerca de 326 nucleotídeos a jusante do códon de início da tradução (e que não inclui o códon de início da tradução).

34. Método de acordo com a reivindicação 31, em que o dito gene que codifica β-1,3-endoglucanase compreendido dentro do subgenoma D é caracterizado pela identificação de um fragmento com cerca de 538 bp e um fragmento com cerca de 118 bp após a amplificação por PCR com oligo- nucleotídeos que têm a seqüência de nucleotídeos de SEQ ID N0 5 e SEQ ID N° 6 seguida pela digestão com a enzima de restrição A1wl.

35. Método de acordo com a reivindicação 31, em que o dito gene endógeno codifica uma proteína que compreende a seqüência de ami- noácidos de SEQ ID N° 12 ou no qual o dito gene endógeno compreende a seqüência de nucleotídeos de SEQ ID N° 2.

36. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 30 a 35, em que a dita planta de algodão é Gossypium hirsutum.

37. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 30 a 35, em que o dito RNA biologicamente ativo é um RNA antissenso que compreende pelo menos 19 nucleotídeos que têm pelo menos 94% de iden- tidade de seqüência com o complemento da seqüência de nucleotídeos de SEQ ID N° 3.

38. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 30 a 35, em que o dito RNA biologicamente ativo é um RNA sense que com- preende pelo menos 19 nucleotídeos que têm pelo menos 94% de identida- de de seqüência com o complemento da seqüência de nucleotídeos de SEQ ID N° 3.

39. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 30 a 35, em que o dito RNA biologicamente ativo é uma molécula de RNA de fita dupla que compreende pelo menos 19 nucleotídeos que têm pelo menos -94% de identidade de seqüência com o complemento da seqüência de nu- cleotídeos de SEQ ID N° 3 e uma fita de RNA complementar essencialmente similar ao complemento dos ditos pelo menos 19 nucleotídeos.

40. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 37 a 39, em que os ditos 19 nucleotídeos compreendem pelo menos um nucleo- tídeo específico para o gene gHgluc 1 do subgenoma D como indicado na Figura 2.

41. Método de acordo com a reivindicação 39, em que o dito RNA de fita dupla é microRNA processado a partir de um pré-microRNA compreendendo a seqüência de nucleotídeos de SEQ ID N° 15, SEQ ID N° -16, SEQ ID N° 20 ou SEQ ID N° 21.

42. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 30 a 41, em que a dita fibra é uma fibra em plumas.

43. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 30 a 41, em que a dita fibra é uma fibra crespa.

44. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 30 a 43, compreendendo ainda (a) cultivar plantas obtidas de acordo com o dito método; e (b) isolar as fibras das ditas plantas que produzem fibras.

45. Método para diminuir o comprimento de uma fibra de uma planta que produz fibra, compreendendo a etapa de introduzir um gene qui- mérico em uma célula da dita planta que produz fibra, em que o dito gene quimérico compreende os seguintes fragmentos de DNA operativamente ligados: (d) um promotor que pode ser expresso em planta como defini- do na reivindicação 1b, 5, 6 ou 7; (e) uma região de DNA codificando uma proteína β- 1,3- glicanase; e (f) uma região terminal 3' compreendendo sinais de término da transcrição e poliadenilação que funcionam em células da dita planta.

46. Método de acordo com a reivindicação 17, em que a dita re- gião de DNA que codifica a dita proteína β-1,3-glicanase codifica uma se- qüência de aminoácidos que tem pelo menos 95% de identidade de seqüên- cia com a seqüência de aminoácidos de SEQ ID N0 11 ou SEQ ID N012.

47. Gene quimérico como definido em qualquer uma das reivin- dicações 30 a 46.

48. Célula de uma planta que produz fibra compreendendo um gene quimérico como definido na reivindicação 47.

49. Planta que produz fibra, compreendendo um gene quimérico como definido na reivindicação 47.

50. Planta que produz fibra de acordo com a reivindicação 49, em que as fibras da dita planta têm o comprimento aumentado comparado com plantas de controle não-transformadas.

51. Planta que produz fibra de acordo com qualquer uma das reivindicações 49 ou 50, em que a dita planta é algodão.

52. Planta de algodão de acordo com a reivindicação 51, que é Gossypium hirsutum.

53. Semente da planta que produz fibra como definido em qual- quer uma das reivindicações 49 a 52, a dita semente compreendendo um gene quimérico como definido na reivindicação 47.

54. Fibras produzidas como definidas nos métodos de qualquer uma das reivindicações 30 a 46.