BRPI0806578A2 - Promotores de lactococcus e usos dos mesmos - Google Patents

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "PROMOTO- RES DE LACTOCOCCUS E USOS DOS MESMOS".

CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção está no campo de biologia molecular e refe- re-se à engenharia recombinante e expressão de proteína. Mais em particu- lar, a invenção refere-se a ácidos nucleicos para expressão recombinante de proteínas compreendendo seqüências derivadas de Lactococcus e úteis co- mo promotores. A invenção refere-se ainda a vetores compreendendo os ditos ácidos nucleicos e células hospedeiro transformadas com eles. A in- venção também compreende o uso de células hospedeiro compreendendo os ditos ácidos nucleicos ou vetores para expressão de proteínas heterólo- gas ou homólogas; e também para aplicação, especialmente aplicação tera- pêutica, das ditas proteínas a indivíduos.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

Bactérias do ácido láctico estão cada vez mais se tornando im- portantes como hospedeiros para expressão recombinante de polipeptídeos heterólogos in vitro (por exemplo, US 5.559.007) bem como para expressão in vivo ou in situ e aplicação de antígenos e/ou polipeptídeos terapeutica- mente relevantes (por exemplo, WO 97/14806).

Bactérias do ácido láctico, e particularmente Lactococcus, são consideradas micro-organismos GRAS (isto é, considerados como geral- mente seguros) e podem então ser relativamente prontamente administradas a humanos e animais.

No entanto, atingir nível forte de expressão heteróloga em bacté- rias do ácido láctico frequentemente requer a introdução de promotores e outras seqüências que são exógenas a essas bactérias (por exemplo, vide Wells e outros, 1993A) e então pode comprometer sua percepção de GRAS.

Deste modo, existe uma necessidade de prover promotores adi- cionais que sejam derivados de bactérias do ácido láctico, com mais prefe- rência de Lactococcus, e possam ser favoravelmente usados para expres- são de proteínas, de preferência expressão de proteína heteróloga, neles.

São também necessários promotores que possam atingir níveis de expressão altos a fim de obter quantidades suficientes de proteínas então expressas em ambientes industriais e/ou terapêuticos.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Os aspectos da presente invenção se direcionam, pelo menos alguns, por exemplo, um ou mais, às necessidades da técnica discutidas acima.

Em particular, os presentes inventores reconheceram ácidos nu- cleicos e seqüências de ácido nucleico derivadas de Lactococcus que po- dem ser vantajosamente usados como promotores adicionais para expres- 10 são recombinante, tal como de preferência expressão de polipeptídeos, em células hospedeiro, de preferência em bactérias, e com mais preferência em Lactococcus.

Mais em particular, os inventores começaram e tiveram sucesso em identificar ácidos nucleicos e seqüências de ácido nucleico de Lactococ- 15 eus que podem funcionar como promotores fortes, isto é, uns que atingem nível de expressão alto, para expressão recombinante, tal como de prefe- rência expressão de polipeptídeos, em células hospedeiro, de preferência em bactérias, e com mais preferência em Lactococcus. Expressão forte pode aumentar favoravelmente a quantidade de produtos de expressão, por e- 20 xemplo, polipeptídeos, recombinantemente produzidos pelas células hospe- deiro, que podem ficar disponíveis para usos adicionais, tal como, por exem- plo, para purificação a partir de ou para aplicação terapêutica pelas células hospedeiro.

Ainda mais surpreendente, os inventores perceberam que os 25 ácidos nucleicos e seqüências de ácido nucleico da invenção podem agir como promotores que são ainda mais fortes, especialmente quando usados em Lactococcus, do que promotores previamente derivados de Lactococcus. Mais especificamente, os ácidos nucleicos e seqüências da invenção podem então funcionar como promotores ainda mais fortes, por exemplo, promoto- 30 res constitutivos ainda mais fortes, do que o promotor do gene da timidilato sintase (thyA) de Lactococcus Iactis que, para o melhor conhecimento dos inventores, é o promotor derivado de Lactococcus mais forte, mais em parti- cular o promotor derivado de Lactococcus constitutivo mais forte, até agora. O promotor da thyA de Lactococcus Iactis é, para o melhor conhecimento dos inventores, também o promotor atualmente conhecido mais forte para expressão de gene recombinante, por exemplo, heteróloga, em Lactococcus, e de preferência em Lactococcus lactis.

Surpreendentemente, uma análise de transcriptoma combinada conforme mostrado nos exemplos junto com dados proteômicos sofisticados não foi proficiente em sugerir a resistência ou atividade de promotores can- didatos. Em particular, alguns promotores identificados foram apenas fraca- 10 mente ativos quando testados. Ainda, algumas seqüências promotoras po- tenciais não foram ativas fora do ambiente natural ou configuração nativa, isto é, quando testadas com genes heterólogos.

Como uma vantagem adicional, expressão particularmente alta é observada usando os promotores da invenção inter alia para IL-10 humana, peptídeo humano YY (PYY), peptídeo-1 tipo glucagon humano (GLP-1), GLP-2 humano (GLPH-2) e fatores trefoil humanos (TTF) como alvos prefe- ridos.

Deve ser também compreendido que os ácidos nucleicos e se- qüências de ácido nucleico identificados pelos inventores são derivados de 20 Lactococcus, que é estabelecido como um micro-organismo GRAS (isto é, "geralmente considerado como seguro"). Consequentemente, composições, por exemplo, células hospedeiro, compreendendo tais promotores podem ser administradas a humanos e animais com menos preocupação com segu- rança biológica do que quando introduzindo seqüências originadas de, por 25 exemplo, micro-organismos não-GRAS ou outras fontes.

Então, a invenção provê ácidos nucleicos e seqüências deriva- dos de Lactococcus vantajosos, isto é, comparavelmente seguros, que cons- tituem promotores adicionais, com mais preferência promotores fortes adi- cionais, e com mais preferência ainda promotores mais fortes do que o pro- 30 motor da thyA, para uso em várias aplicações envolvendo expressão recom- binante, por exemplo, de polipeptídeos, em células hospedeiro, de preferên- cia em bactérias e com mais preferência ainda em Lactococcus. A presente invenção integra as percepções relevantes acima em seus aspectos diversos.

Deste modo, em um aspecto, a invenção provê um ácido nuclei- co recombinante compreendendo um promotor (P), sendo um promotor nati- 5 vo de uma espécie Lactococcus ou uma variante funcional ou fragmento funcional do mesmo, operavelmente ligado a uma ou mais estruturas de lei- tura aberta heterólogas para o promotor (P), caracterizado pelo fato de que o promotor (P) é mais forte em Lactococcus do que o promotor do gene da timidilato sintase (thyA) de Lactococcus lactis.

Com relação a isso, a invenção então também provê um ácido

nucleico recombinante compreendendo um promotor (P) operavelmente li- gado a uma ou mais estruturas de leitura aberta heterólogas ao promotor (P), onde o promotor (P) é escolhido do grupo compreendendo ou consistin- do nos promotores nativos de genes de Lactococcus para 1) polimerase de 15 RNA direcionada a DNA, subunidade beta’ / subunidade de 160 kD (rpoC), 2) polimerase de RNA direcionada a DNA, subunidade beta / subunidade de 140 kD (rpò2), 3) proteína tipo ferritina de ligação a DNA (protetora de dano oxidativo) (dps), 4) piruvato cinase (py/c), 5) glutamil- e glutaminil-tRNA sinte- tases (glnS), 6) enolase (eno), 7) glutamina sintetase (glnA), regulador trans- 20 cripcional tipo HTH (glnR), Xaa-His dipeptidase (argE ou pepV), 10) subuni- dade beta de ATP sintase tipo F0F1 (subunidade beta de ATP sintase F1) (atpD), 11) 3-fosfoglicerato cinase (pgk), 12) gliceraldeído-3-fosfato desidro- genase / eritrose-4-fosfato desidrogenase (gapA), 13) acetato cinase (ackA), 14) 3-oxoacil-(proteína carreadora de acil) sintase (fabB), 15) 3-oxoacil- 25 (proteína carreadora de acil) redutase (fabG), 16) polimerase de RNA dire- cionada a DNA, subunidade alfa / subunidade de 40 kD (rpoA), 17) Xaa-Pro aminopeptidase (pepP), 18) frutose / tagatose bisfosfato aldolase (tbp), 19) proteína ribossomal S4 (rpsD), 20) superóxido dismutase (sodA), 21) proteí- na ribossomal S12 (rpsL) e proteína ribossomal S7 (rpsG), 22) proteína ri- 30 bossomal L18 (rpIR) e proteína ribossomal S5 (rpsE) e proteína ribossomal L30/L7E (rpmD), 23) S-ribosil homocisteína Iiase (IuxS), 24) proteína ribos- somal L19 (rpIS), 25) proteína ribossomal S11 (rpsK), 26) proteína ribosso- mal LIO (rplJ), 27) proteína ribossomal L7/L12 (rplL), 28) proteína de ligação de DNA de nucleoide bacteriano / proteína de ligação de DNA HU (hup), 29) proteína ribossomal 50S L28 (rpmB), 30), componente IIB específico de ce- Iobiose do sistema fosfotransferase (/acE), 31) subunidade ATP alfa sintase 5 tipo F0F1 (atpA), 32) sistema de transporte de açúcar tipo ABC (componente ATPase) (ma/K), 33) subunidade alfa do componente E1 do complexo aceto- ína desidrogenase (acoA), 34) proteína de divisão celular (difIVA ou ftsA),

35) UDP-galactopiranose mutase (glf), 36) glutamil aminopeptidase (frvX), 37) proteína relacionada à desidrogenase prevista (mviM), 38) proteína ri- bossomal S2, 39) fator-3 de início de tradução (IF-3) (infC), 40) proteína ri- bossomal L4 (rplD) e proteína ribossomal L23 (rplW) e proteína ribossomal L2 (rplB), 41) domínio EMAP (ydjD), 42) fator de alongamento de transcrição (greA), 43) subunidade de protease de protease Clp dependente de ATP (dpP), 44) proteína ribossomal L15 (rp/O), 45) proteína ribossomal L11 (r- plK), 46) proteína ribossomal S8 (rpsH), 47) proteína ribossomal L21 (rpIU), 48) proteína ribossomal S13 (rpsM), 49) proteína ribossomal S19 (rpsS) e proteína ribossomal L22 (rpIU) e proteína ribossomal L16 (rp/P) e proteína ribossomal L14 (rplN), 50) proteína ribossomal S10 (rpsJ), 51) co- chaperonina GroES (HspIO) (cpn10), 52) proteína ribossomal L24 (rlpX) e 53) proteína hipotética LACR_0137 (duf965) e variantes funcionais e frag- mentos funcionais dos ditos promotores nativos.

A invenção provê um ácido nucleico recombinante, onde o pro- motor (P) é escolhido do grupo consistindo nos promotores nativos dos ge- nes de Lactococcus, de preferência de Lactococcus lactis, para 1) polimera- 25 se de RNA direcionada a DNA, subunidade beta’ / subunidade de 160 kD (rpoC), 3) ferritina de ligação a ferro não-heme (dpsA), 4) piruvato cinase (pyk), 5) glutaminil-tRNA sintetases (gltX), 6) fosfopiruvato hidratase (eno), 9) dipeptidase PepV (pepV), 12) gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (gapB), 13) acetato cinase (ackA), 18) frutose bisfosfato aldolase (fbaA), 20) superó- 30 xido dismutase (sodA), 21) proteína ribossomal S12 (rpsL) e proteína ribos- somal S7 (rpsG), 22) proteína ribossomal L18 (rpIR) e proteína ribossomal S5 (rpsE) e proteína ribossomal L30/L7E (rpmD), 24) proteína ribossomal LI 9 (rplS), 26) proteína ribossomal L10 (rplJ), 28) proteína de ligação de DNA tipo HU (hlIA), 29) proteína ribossomal 50S L28 (rpmB), 30) componen- te IIB do sistema de fosfotransferase (ptcB), 31) subunidade ATP alfa sintase tipo F0F1 (atpA), 32) proteína de ligação de ATP de transporte de ligação de 5 açúcar múltiplo (msmK), 33) subunidade alfa do componente E1 de piruvato desidrogenase (pdhA), 34) proteína de divisão celular (difIVA ou ftsA), 35) UDP-galactopiranose mutase (glfl), 36) glutamil aminopeptidase (pepA), 37) proteína relacionada à desidrogenase prevista (Ilmg 0272), 38) proteína ri- bossomal S2 (rpsS), 39) fator-3 de início de tradução (IF-3) (infC), 40) prote- 10 ína ribossomal L4 (rp/D) e proteína ribossomal L23 (rplW) e proteína ribos- somal L2 (rplB), 41) cadeia beta de fenilalanil-tRNA sintetase (pheT), 42) fator de alongamento de transcrição GreA (greA), 43) subunidade proteolíti- ca de protease Clp dependente de ATP (dpP), 44) proteína ribossomal L15 (rp/O), 45) proteína ribossomal L11 (rp/K), 46) proteína ribossomal S8 (rpsH), 15 47) proteína ribossomal L21 {rpIU), 48) proteína ribossomal S13 (rpsM), 49) proteína ribossomal S19 (rpsS) e proteína ribossomal L22 (rpIU) e proteína ribossomal L16 (rplP) e proteína ribossomal L14 (rplN), 50) proteína ribos- somal S10 (rpsJ), 51) co-chaperonina GroES (HspIO) (groES), 52) proteína ribossomal L24 (rlpX) e 53) resolvase de junção Holliday putativa (/- 20 lmg_0151) e variantes funcionais e fragmentos funcionais dos ditos promoto- res nativos.

Em uma modalidade ainda mais preferida, a invenção provê um ácido nucleico recombinante, onde o promotor (P) é escolhido do grupo con- sistindo nos promotores nativos dos genes de Lactococcus, de preferência 25 de Lactococcus Iactis, para 1) polimerase de RNA direcionada a DNA, subu- nidade beta’ / subunidade de 160 kD (/poC), 3) ferritina de ligação a ferro não-heme (dpsA), 4) piruvato cinase (pyk), 5) glutaminil-tRNA sintetases (gltX), 6) fosfopiruvato hidratase (eno), 9) dipeptidase PepV (pepV), 12) gli- ceraldeído-3-fosfato desidrogenase (gapB), 13) acetato cinase (ackA), 18) 30 frutose bisfosfato aldolase (fbaA), 20) superóxido dismutase (sodA), 21) pro- teína ribossomal S12 (rpsL) e proteína ribossomal S7 (rpsG), 22) proteína ribossomal L18 (rpIR) e proteína ribossomal S5 (rpsE) e proteína ribossomal L30/L7E (rpmD), 24) proteína ribossomal L19 (rp/S), 26) proteína ribossomal L10 (rp/J), 28) proteína de ligação de DNA tipo HU (hlIA), 29) proteína ribos- somal 50S L28 (rpmB), 30) componente IIB do sistema de fosfotransferase {ptcB), conforme definido na Tabela 1.

Em uma modalidade preferida adicional, a invenção provê um

ácido nucleico recombinante compreendendo o promotor 28) proteína de ligação a DNA de nucleoide bacteriano / proteína de ligação de DNA tipo HU (hlla ou hup), operavelmente ligado a uma ou mais estruturas de leitura aber- ta heterólogas para o promotor. Com mais preferência ainda, o dito promotor é o promotor PhlIA.

Em uma modalidade preferida adicional, a invenção provê um ácido nucleico recombinante compreendendo promotor (3) ferritina de liga- ção a ferro não-heme (dpsA ou LACR_2311), promotor 9) dipeptidase PepV (pepV ou LACR_0908) ou promotor 20) superóxido dismutase (sodA ou LA- 15 CR_0458), respectivamente, o dito promotor operavelmente ligado a uma ou mais estruturas de leitura aberta heterólogas para o promotor. Com mais preferência ainda, o dito promotor é promotor PdpsA, PpepV ou PsodA.

Em uma seleção preferida, a invenção provê um ácido nucleico recombinante compreendendo um promotor (P) operavelmente ligado a uma 20 ou mais estruturas de leitura aberta heterólogas para o promotor (P), onde o promotor (P) é escolhido do grupo compreendendo ou consistindo nos pro- motores nativos dos genes de Lactococcus listados sob 1) a 30) acima, ou Tabela 1, de preferência o promotor PhlIA, o PdpsA, PpepV ou PsodA, e variantes funcionais e fragmentos funcionais dos ditos promotores nativos.

Em uma modalidade preferida adicional, os genes acima men-

cionados, e os respectivos promotores nativos e variantes funcionais e frag- mentos funcionais dos mesmos, são derivados de Lactococcus lactis.

Em aspectos exemplares relacionados, são também providos vetores compreendendo os ácidos nucleicos recombinantes da invenção, cassetes de expressão cromossomalmente integrados, células hospedeiro transformadas com os ácidos nucleicos recombinantes da invenção ou com vetores compreendendo tais; o uso dos ácidos nucleicos recombinantes da invenção para obter expressão de produtos de expressão, de preferência de um ou mais polipeptídeos, codificados pelas ditas estruturas de leitura aber- ta, em uma célula hospedeiro; métodos para expressão recombinante e iso- lamento de produtos de expressão, de preferência polipeptídeos, de interes- 5 se usando ditas células hospedeiro; métodos de tratamento envolvendo apli- cação in situ de produtos de expressão terapeuticamente relevantes, de pre- ferência polipeptídeos, por exemplo, antígenos e/ou polipeptídeos terapeuti- camente ativos não-vacinogênicos, a humanos ou animais por tais células hospedeiro; e usos relacionados das células hospedeiro para a fabricação 10 de medicamentos para facilitar a dita aplicação; composições farmacêuticas compreendendo as ditas células hospedeiro; etc.

Esses e aspectos adicionais e modalidades preferidas da inven- ção são descritos nas seções que seguem e nas reivindicações apensas. BREVE DESCRICÃO DAS FIGURAS A Figura 1 (A-H) ilustra seqüências de promotor preferidas.

A Figura 2 ilustra separação eletroforética de polipeptídeo de MG 1363 de Lactococcus lactis.

A Figura 3 ilustra uma estratégia de clonagem.

Figura 4 subclonagem de fusões de promotor-Usp45h[Gly2] 20 GLP2. P significa qualquer um dos promotores que seguem: P1 (Waterfield e outros, 1995), PthyA (promotor da timidilato sintase) e PhIIA (promotor de proteína de ligação de DNA de nucleoide bacteriano / proteína de ligação de DNA HU); usp45 significa o sinal de secreção de usp45 do tipo selvagem (van Asseldonk e outros, 1990) ou mutante do mesmo, incluindo Usp45 N4 25 no qual Iisina na posição 4 foi substituída por asparagina; Em significa mar- cador de seleção de eritromicina; ori significa origem de replicação.

Figura 5 Produção e secreção de h[Gly2]GLP-2 por linhagens de L. Iactis recombinantes reveladas pelo anticorpo anti-hGLP2. (A) Secre- ção de h[Gly2]GLP-2. 1 pg de hGLP2 recombinante foi carregado como con- 30 trole positivo. (B) Produção e secreção celular de h[Gly2]GLP-2. Cada faixa no blot representa 1 ml de fração de célula de L. Iactis ou sobrenadante de cultura obtido após três horas de crescimento. SeeBlue® Plus2 (Invitrogen) foi usado como marcador de peso molecular (MW).

Figura 6 Comparação esquemática de MG1363 de L Iactis e as várias linhagens de expressão de hlL-10 usadas neste estudo. Durante a construção, os cassetes de expressão de hlL-10 são integrados no cromos- 5 somo de MG 1363 de L. Iactis através de recombinação homóloga em se- qüências idênticas, ambos a montante bem como a jusante dos cassetes de expressão de thyA e hlL-10, respectivamente. Pontos de recombinação são esquematicamente representados por V Isto faz com que todas as seqüên- cias de DNA fora dos cassetes de expressão sejam idênticas às linhagens 10 descritas acima. Elementos genéticos não são desenhados em escala.

Figura 7 Comparação de expressão de hlL-10 de PthyA (promo- tor de timidilato sintase, linhagens sAGX0005 e Thy12) com expressão de IL-10 a partir de (A) promotor da PdpsA (proteína tipo ferritina de ligação a DNA, SEQ ID NO:3, sAGX0012), (B) PpepV (promotor da dipeptidase Xaa- 15 His SEQ ID NO:9 ou 158, Linhagem sAGX0018), (C) PsodA (promotor da superóxido dismutase, SEQ ID NO: 20 sAGX0029) e (D) PhIIA (promotor de proteína de ligação de DNA de nucleoide bacteriano / proteína de ligação de DNA HU; SEQ ID NO: 28, linhagem sAGX0037). "Promotor" indica o promo- tor que está na frente do gene de hlL-10.

Figura 8 Comparação de expressão de hlL-10 por 109 células

de MG1363, sAGX0005 e SAGX0037.

Figura 9 Comparação esquemática de MG 1363 de L. Iaetis e das várias linhagens de expressão de hTFF usadas neste estudo. Durante construção, os cassetes de expressão de TFF são integrados no cromosso- 25 mo de MG1336 de L Iaetis através de recombinação homóloga em seqüên- cias idênticas, ambos a montante bem como a jusante dos cassetes de ex- pressão de thyA e TFF, respectivamente. Pontos de recombinação são es- quematicamente representados por V Isto faz com que todas as seqüências de DNA fora dos cassetes de expressão sejam idênticas para todas as Ii- 30 nhagens descritas. usp45 mutante é indicado por *. Elementos genéticos não são desenhados em escala.

Figura 10 Comparação de (A) Expressão de hTFF1 a partir de PthyA (promotor da timidi- Iato sintase) ligado ao sinal de secreção de usp45 do tipo selvagem (wt) e hTFF1 (linhagem SAGX0041), PhIIA (promotor de proteína de ligação de DNA de nucleotídeo bacteriano / proteína de ligação de DNA HU; SEQ ID

NO:28) ligado ao sinal de secreção de usp45 mutante (mut) e hTFF1 (linha- gem SAGX0049) ou PhIIA ligado ao sinal de secreção de usp45 wt e hTFF1 (linhagem SAGX0048).

(B) Expressão de hTFF3 a partir de PthyA (promotor da timidi- Iato sintase) ligado ao sinal de secreção de usp45 wt e hTFF3 (linhagem-

SAGX0043), promotor PdpsA (proteína tipo ferritina de ligação a DNA, SEQ ID NO:3) ligado ao sinal de secreção de usp45 wt e hTFF3 (sAGX0059) e PhIIA ligado ao sinal de secreção de usp45 mut e hTFF3 (linhagem SAGX0057).

"Promotor" e "sinal de secreção" indicam o promotor e sinal de secreção que estão em frente ao gene TFF.

Figura 11 Análise Western blot de sobrenadantes das várias li- nhagens indicadas. Faixas contendo proteínas de referência são indicadas com "hTFF" (referência hTFF1) e "MWM" (marcadores de peso molecular, pesos moleculares são indicados por "kDa"). Todas as outras faixas contêm 20 o equivalente de 0,5 ml de sobrenadante de cultura das linhagens indicadas, coletado conforme acima descrito. O primeiro anticorpo era anti-hTFF1 mo- noclonal de camundongo: 1/1000 (Abnova: No. Cat. H00007031-M02). O segundo anticorpo era anti-camundongo-AP de cabra: 10/1000 (Southern Biotech: 4050-04) e detecção foi feita com NBT/BCIP (Roche 11 697 471 25 0001). MWM são padrão pré-tingido Invitrogen SeeBIue plus2 (No. Cat. LC5925).

Figura 12 Visão esquemática da estrutura de pT1NX e dos vá- rios plasmídeos de expressão de hPYY G9 (3-36) usados no presente estu- do. Plasmídeos de expressão pAGX0211, pAGX0212 e pAGX0213 foram 30 obtidos através de inserção dos respectivos cassetes de expressão como fragmentos EcoRI-SpeI no pT1NX aberto com EcoRI-SpeI. Deste modo, a estrutura e a posição de todas as seqüências de DNA fora dos cassetes de expressão, tal como a origem de replicação (ori) e marcador de resistência à eritromicina (EmR), são idênticas para todos os plasmídeos. Elementos ge- néticos não são desenhados em escala.

Figura 13 Comparação de expressão de hPYY G9 (3-36) de P1 5 (Waterfield e outros, 1995) (plasmídeo pAGX0211), PthyA (promotor da timi- dilato sintase, plasmídeo pAGX0212) e PhIIA (promotor de proteína de liga- ção de DNA de nucleotídeo bacteriano / proteína de ligação de DNA HU1 SEQ ID NO: 28, plasmídeo pAGX0213) ligado ao sinal de secreção de usp45 e hPYY G9 (3-36). Todos os plasmídeos estavam presentes em 10 MG1363 de L. lactis. "Promotor" indica o promotor que está a montante do gene hPYY G9 (30-36) ou presente no sítio equivalente em pT1NX.

Figura 14 Visão esquemática da estrutura de pT1NX e dos vá- rios plasmídeos de expressão hGLP-1 G8 (7-36) usados no presente estudo. Plasmídeos de expressão pAGX0233 e pAGX0234 foram obtidos através de 15 inserção dos respectivos cassetes de expressão como fragmentos EcoRI- Spel no pT1NX aberto com EcoRI-SpeI. Deste modo, a estrutura e a posição de todas as seqüências de DNA fora dos cassetes de expressão, tal como a origem de replicação (ori) e marcador de resistência à eritromicina (EmR), são idênticas para todos os plasmídeos. Elementos genéticos não são dese- 20 nhados em escala.

Figura 15 Comparação de expressão de hGLP-1 G8 (7-36) de P1 (Waterfield e outros, 1995) (plasmídeo pAGX0211), PthyA (promotor da timidilato sintase, plasmídeo pAGX0212) e PhIIA (promotor de proteína de ligação de DNA de nucleotídeo bacteriano / proteína de ligação de DNA HU; 25 SEQ ID NO:28, plasmídeo pAGX0213) ligado ao sinal de secreção de usp45 e hGLP-1 G8 (7-36). Todos os plasmídeos estavam presentes em L lactis. "Promotor" indica o promotor que está a montante do gene hGLP-1 G8 (7-

36) ou presente no sítio equivalente em pT1NX.

Figura 16 Comparação esquemática de MG1363 de L. lactis e das várias linhagens de expressão de hlL-10 usadas no presente estudo. Durante a construção, os cassetes de expressão de hlL-10 são integrados ao cromossomo de MG1363 de L lactis através de recombinação homóloga em seqüências idênticas, ambos a montante bem como a jusante de thyA e os cassetes de expressão de hll_-10 respectivamente. Pontos de recombina- ção são esquematicamente representados por Y Isto faz com que todas as seqüências de DNA fora dos cassetes de expressão sejam idênticas para as 5 linhagens descritas acima. Aqui "promotor" é qualquer um dos promotores, conforme presente na linhagem "sAGXOOx" (Tabela 11). Elementos genéti- cos não são desenhados em escala.

Figura 17 Comparação da expressão de hlL-10 de PthyA (pro- motor da timidilato sintase, linhagem sAGX0005) com expressão de hlL-10 de qualquer uma das séries de linhagens (vide Figura 16 e Tabela 11) onde esses promotores Iactococcais foram postos a montante de um gene de fu- são de usp45-hlL-10.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Conforme aqui usado, as formas singulares "um", "uma" e "o" e "a" incluem ambos referentes no singular e no plural, a menos que o contex- to dite claramente de outro modo. A título de exemplo, "uma célula" refere-se a uma ou mais de uma célula.

Os termos "compreendendo", "compreende" e "compreendido de" conforme aqui usado são sinônimos de "incluindo", "inclui" ou "conten- do", "contém", e são inclusivos ou de extremidade aberta e não excluem membros, elementos ou etapas de método adicionais, não-mencionados.

A menção de faixas numéricas por pontos finais inclui todos os números e frações incluídos dentro desta faixa, bem como os pontos finais mencionados.

O termo "cerca de" conforme aqui usado quando se referindo a

um valor mensurável tal como um parâmetro, uma quantidade, uma duração temporal, e similar, pretende compreender variações de +/- 20% ou menos, de preferência +/- 10% ou menos, com mais preferência +/- 5% ou menos, com mais preferência ainda +/-1% ou menos e com mais preferência ainda +/- 0,1% ou menos do valor especificado, enquanto tais variações forem a- ' propriadas para atuar na invenção revelada.

Todos os documentos mencionados na presente especificação são aqui incorporados a título de referência em sua totalidade. Em particular, os ensinamentos de todos os documentos, aqui especificamente referidos, são incorporados a título de referência.

A menos que de outro modo definido, todos os termos usados

na revelação da invenção, incluindo termos técnicos e científicos, têm o sig- nificado conforme geralmente compreendido por uma pessoa versada na técnica à qual a presente invenção pertence. Por meio de orientação adicio- nal, definições que seguem são incluídas para melhor compreender o ensi- namento da presente invenção.

O termo "ácido nucleico" conforme aqui usado significa um polí-

mero de qualquer comprimento composto essencialmente de nucleotídeos, por exemplo, desoxirribonucleotídeos e/ou ribonucleotídeos. Ácidos nuclei- cos podem compreender bases purina e/ou pirimidina e/ou outras bases de nucleotídeo naturais (por exemplo, xantina, inosina, hipoxantina), quimica- 15 mente ou bioquimicamente modificadas (por exemplo, metiladas), não- naturais ou derivatizadas. A estrutura principal de ácidos nucleicos pode compreender açúcares e grupos fosfato, como pode ser tipicamente encon- trado em RNA ou DNA, e/ou um ou mais açúcares modificados ou substituí- dos e/ou um ou mais grupos fosfato modificados ou substituídos. O termo 20 "ácido nucleico" compreende de preferência ainda DNA, RNA e moléculas híbridas de DNA/RNA, especificamente incluindo hnRNA, pre-mRNA, mR- NA, cDNA, DNA genômico, produtos de amplificação, oligonucleotídeos e DNA, RNA ou híbridos de DNA/RNA sintéticos (por exemplo, quimicamente sintetizados). Um "ácido nucleico" pode ser de filamento duplo, de filamento 25 parcialmente duplo ou de filamento simples. Onde de filamento simples, o ácido nucleico pode ser o filamento de sentido ou o filamento de antissenso. Ainda, o ácido nucleico pode ser circular ou linear.

Em uma modalidade preferida, o ácido nucleico compreendendo um promotor da invenção é DNA ou RNA, com mais preferência DNA.

O termo "ácido nucleico recombinante" refere-se em geral a um

ácido nucleico que é compreendido de segmentos unidos usando tecnologia de DNA recombinante. Quando um nucleico recombinante repica em um organismo hospedeiro, os ácidos nucleicos da progênie são também com- preendidos dentro do termo "ácido nucleico recombinante".

Trabalhos de referência padrão revelando os princípios gerais de tecnologia de DNA recombinante incluem Molecular Cloning: A Laboratory 5 Manual, 2a ed., Vol. 1-3, ed. Sambrook e outros, Cold Spring Harbor Labora- tory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989; Current Protocols in Molecular Biology, ed. Ausubel e outros, Greene Publishing and Wiley-lnterscience, Nova York, 1992 (com atualizações periódicas) ("Ausubel e outros, 1992"); Innis e outros, PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Aca- 10 demic Press: San Diego, 1990. Princípios gerais de microbiologia são reve- lados, por exemplo, em Davis, B.D. e outros, Microbiology, 3a edição, Harper

& Row, publishers, Filadélfia, Pa. (1980).

Por "promotor" quer dizer geralmente uma região em uma molé- cula de ácido nucleico, de preferência molécula de DNA, à qual uma polime- 15 rase de RNA se liga e inicia transcrição. Um promotor está de preferência, mas não necessariamente, posicionado a montante, isto é, 5’, da seqüência cuja transcrição ele controla. Na presente invenção, promotores específicos são indicados pelo termo "P", seguido pelo nome do gene do qual eles são derivados, por exemplo, "PthyA", que significa que o promotor do gene thyA, 20 e "PhlIA" que significa que o promotor do gene hlIA.

O termo "promotor nativo" refere-se a um promotor cuja seqüên- cia de nucleotídeo é idêntica àquela de um promotor presente na natureza, por exemplo, em uma célula ou organismo na natureza. O modificador "pro- motor nativo" então refere-se à seqüência do promotor e não deve ser con- 25 siderado como requerendo que o promotor seja obtido ou produzido de qualquer maneira particular. A título de exemplo e não-limitação, o termo deve então compreender promotores em seus hospedeiros naturais, isola- dos dos mesmos, clonados e propagados usando tecnologia de DNA re- combinante, produzidos através de um método de amplificação ou gerados 30 através de meios sintéticos, etc, enquanto a seqüência de tais promotores for a mesma que seus contrapartes ocorrendo na natureza (vide, por exem- plo, Tabela 1). Uma pessoa versada na técnica compreende que a seqüência nativa do promotor de um dado gene pode diferir entre espécies diferentes de Lactococcus e/ou entre subespécies diferentes dentro de uma espécie simples de Lactococcus e/ou entre linhagens diferentes dentro de uma única 5 espécie ou subespécies de Lactobacillus, devido à divergência genética na- tural entre as ditas espécies, subespécies e/ou linhagens. Então, tais se- qüências promotoras divergentes mas encontradas na natureza seriam con- sideradas nativas.

Uma pessoa versada na técnica é em geral capaz de prever e identificar promotores bacterianos naturais, tal como promotores de Lacto- coccus. Não-obstante, para oferecer mais orientação, um promotor natural pode ser frequentemente identificado através da análise de uma seqüência genômica ou parte da mesma de uma bactéria, de preferência de uma espé- cie Lactococcus; identificação de uma estrutura de leitura aberta nela, isto é, uma sucessão de tripletos de nucleotídeo de codificação começando com um códon de início de tradução (de preferência ATG) e fechamento com um códon de término de tradução (por exemplo, TAA, TAG ou TGA) e não con- tendo qualquer códon de terminação de tradução em estrutura interno; e a- nálise da seqüência a montante do dito códon de início de tradução para localizar o códon de início de tradução mais a montante, a montante do qual ocorre um códon de terminação de tradução em estrutura. De preferência, a transcrição da estrutura de leitura aberta então identificada pode ser verifi- cada experimentalmente, tal como, por exemplo, através de Northern blotting ou RT-PCR; e o sítio de início de tradução (por exemplo, adjacente a um códon de início de tradução mais a montante e/ou, talvez, um ou mais dos de início de tradução a jusante) pode ser avaliado usando, por exemplo, am- plificação rápida 5’ de método de extremidades de cDNA (5’-RACE).

Tipicamente, as seqüências 5’ adjacentes a e proximais ao có- don de início de tradução mais a montante (e/ou, se evidência experimental então indicar, um ou mais dos códons de início de tradução a jusante) po- dem compreender o promotor nativo responsável por transcrição da dita ORF. Por meio de um exemplo preferido, quando o primeiro nucleotídeo do códon de início de tradução é marcado +1 (por exemplo, o nucleotídeo A do códon ATG é +1) e o nucleotídeo diretamente 5’ do mesmo é marcado -1, então o termo "promotor nativo" pode se referir à seqüência de a partir de cerca de -500 a cerca de +50, por exemplo, de a partir de cerca de -500 a 5 cerca de +20, de a partir de cerca de -500 a cerca de +10, de a partir de cer- ca de -500 a cerca de +5, de a partir de cerca de -500 a cerca de +2 ou de a partir de cerca de -500 a cerca de -1; de preferência de a partir de cerca de - 400 a cerca de +50, por exemplo, em exemplos preferidos, de a partir de cerca de -400 a cerca de +20, por exemplo, de a partir de cerca de -400 a 10 cerca de +10, de a partir de cerca de -400 a cerca de +5, de a partir de cerca de -400 a cerca de +2 ou de a partir de cerca de -400 a cerca de -1; com mais preferência de a partir de cerca de -300 a cerca de +50, por exemplo, em exemplos preferidos, de a partir de cerca de -300 a cerca de +20, por exemplo, de a partir de cerca de -300 a cerca de +10, de a partir de cerca de 15 -300 a cerca de +5, de a partir de cerca de -300 a cerca de +2 ou de a partir de cerca de -300 a cerca de -1; tal como, por exemplo, em exemplos preferi- dos, de a partir de cerca de -200 a cerca de +50 e em exemplos preferidos adicionais, de a partir de cerca de -200 a cerca de +20, por exemplo, de a partir de cerca de -200 a cerca de +10, de a partir de cerca de -200 a cerca 20 de +5, de a partir de cerca de -200 a cerca de +2 ou de a partir de cerca de - 200 a cerca de -1; ou tal como, por exemplo, em outro exemplo preferido de a partir de cerca de -100 a cerca de +50 e em exemplos preferidos adicio- nais de a partir de cerca de -100 a cerca de +20, por exemplo, de a partir de cerca de -100 a cerca de +10, de a partir de cerca de -100 a cerca de +5, de 25 a partir de cerca de -100 a cerca de +2 ou de a partir de cerca de -100 a cer- ca de -1; enquanto a dita seqüência mostrar a atividade de promotor.

O uso de variantes funcionais de promotores de Lactococcus nativos em ácidos nucleicos recombinantes da invenção é também compre- endido. O termo "variante" refere-se a uma seqüência que é substancialmen- 30 te idêntica (isto é, muito, mas não totalmente idêntica) a uma seqüência nati- va correspondente, por exemplo, à seqüência de um promotor de Lactococ- cus nativo correspondente. "Substancialmente idêntico" refere-se a pelo me- nos 60%, de preferência pelo menos 70%, idêntico, com mais preferência pelo menos 80% idêntico, por exemplo, pelo menos 85% idêntico, com mais preferência ainda pelo menos 90% idêntico, pelo menos 91% idêntico, 92% idêntico, com mais preferência ainda pelo menos 93% idêntico, por exemplo, 5 94% idêntico, com mais preferência ainda pelo menos 95% idêntico, por e- xemplo, pelo menos 96% idêntico, com mais preferência ainda pelo menos 97% idêntico, por exemplo, pelo menos 98% idêntico e com mais preferência pelo menos 99% idêntico. Alinhamentos de seqüência e determinação de identidade de seqüência podem ser feitos, por exemplo, usando o Basic ιο- ί 0 cal Alignment Search Tool (BLAST) originalmente descrito por Altschul e ou- tros (1990), tal como o algoritmo "Blast2 sequences" descrito por Tatusova e Madden (1999).

O uso de fragmentos funcionais de promotores de Lactococcus nativos em ácidos nucleicos recombinantes da invenção é também compre- 15 endido. Conforme aqui usado, o termo "fragmento" refere-se a uma seqüên- cia que tem uma deleção 5’ e/ou 3’ de um ou mais nucleotídeos comparado com uma seqüência nativa, por exemplo, um promotor de Lactococcus nati- vo ou uma variante do mesmo, mas onde a seqüência de ácido nucleico res- tante do fragmento é idêntica às posições correspondentes na seqüência do 20 promotor de Lactococcus nativo ou uma variante do mesmo. A seqüência restante de um fragmento pode representar de preferência pelo menos 30%, por exemplo, pelo menos 40%, com mais preferência pelo menos 50%, por exemplo, pelo menos 60%, com mais preferência ainda pelo menos 70%, por exemplo, pelo menos 80% ou pelo menos 85% e com mais preferência 25 ainda pelo menos 90%, por exemplo, pelo menos 95% ou mais da seqüência de ácido nucleico do respectivo promotor de Lactococcus nativo ou uma va- riante do mesmo, tal como identificado através dos métodos da presente invenção, por exemplo, conforme provido pelas SEQ ID NOs.: específicas da Tabela 1.

O termo "funcional" com referência às variantes e fragmentos de

promotores como acima refere-se ao fato que as variantes e fragmentos par- ticulares terão pelo menos parcialmente retido a atividade promotora, isto é, a capacidade de se ligar à polimerase de RNA e iniciar transcrição, do pro- motor nativo correspondente. De preferência, tais variantes funcionais ou fragmentos funcionais podem reter pelo menos 50% da atividade do promo- tor nativo correspondente, por exemplo, pelo menos 60%, com mais prefe- 5 rência pelo menos 70%, por exemplo, pelo menos 80%, com mais preferên- cia ainda pelo menos 85%, por exemplo, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88% ou 89%, com mais preferência ainda pelo menos 90%, por exemplo, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94% e com mais preferência pelo menos 95%, por exemplo, pelo menos 10 96%, pelo menos 97% e com muita preferência pelo menos 98% ou pelo menos 99% da atividade do promotor nativo correspondente. Também de preferência, tais variantes funcionais ou fragmentos funcionais podem até mesmo ter atividade maior do que o promotor nativo correspondente.

Uma pessoa versada na técnica pode também compreender que 15 em modalidades os ácidos nucleicos recombinantes da invenção podem compreender ainda mais do que um promotor (P) e/ou variante funcional e/ou fragmento funcional da invenção. Por exemplo, os ditos promotores, variantes funcionais ou fragmentos funcionais - que podem ser iguais ou di- ferentes - podem ser operavelmente ligados a e controlar a expressão de 20 unidades de transcrição distintas dentro dos ditos ácidos nucleicos recombi- nantes. Alternativamente ou em adição, expressão de uma unidade de transcrição única pode ser controlada por mais de um promotor, variante funcional e/ou fragmento funcional, ligado operavelmente a ela, que pode ser igual ou diferente. Por exemplo, associação operável de mais de um dos 25 elementos acima tendo atividade promotora com uma unidade de transcrição única pode aumentar mais o nível de transcrição da dita unidade. A título de exemplo e não-limitação, tais promotores, variantes funcionais e/ou fragmen- tos funcionais podem ser dispostos seqüencialmente, por exemplo, seqüen- cialmente a montante da respectiva unidade de transcrição.

Ainda alternativamente, a invenção também compreende ácidos

nucleicos recombinantes compreendendo promotores quiméricos incluindo duas ou mais porções derivadas de promotores diferentes, variantes funcio- nais e/ou fragmentos funcionais da invenção e juntos constituindo um novo promotor.

Uma pessoa versada na técnica conhece técnicas para avaliar a atividade de promotores. Por exemplo, uma seqüência de ácido nucleico 5 cuja atividade como um promotor é procurada ser determinada pode ser in- serida em um construto repórter recombinante de modo que ela seja opera- velmente ligada com uma seqüência repórter, de preferência uma seqüência de codificação de repórter, tal como, por exemplo, proteína verde fluorescen- te (GFP) ou cloranfenicol acetil transferase (CAT), etc, e a expressão e/ou 10 acúmulo do mRNA repórter (por exemplo, através de Northern blotting, RT- PCR quantitativa, etc) e/ou proteína (por exemplo, através de Western blot- ting, ELISA, medição de atividade de fluorescência ou enzimática, etc) é en- saiado quando o dito construto repórter é introduzido em células hospedeiro ou organismos de interesse.

Em uma modalidade preferida exemplar, a expressão pode ser

medida para uma proteína heteróloga para o organismo onde a expressão é medida, por exemplo, heteróloga para bactérias, de preferência heteróloga para Lactococcus, com mais preferência ainda heteróloga para Lactococcus lactis. Por exemplo, em uma modalidade preferida, expressão em bactérias, 20 de preferência em Lactococcus, com mais preferência ainda em Lactococcus lactis, pode ser avaliada para um gene codificando um polipeptídeo de ori- gem eucariótica, com mais preferência ainda para qualquer um dos genes codificando os polipeptídeos terapeuticamente relevantes pretendidos para expressão usando os ácidos nucleicos da invenção (conforme descrito em 25 outro lugar na presente especificação), de preferência GLP-2, GLP-1, PYY e TFF, e com mais preferência ainda para qualquer um de polipeptídeos imu- nomoduladores, citocinas, fatores de crescimento ou interleucinas, tal como, com muita preferência para hlL-10. Valores então medidos para seqüências de ácido nucleico ensaiadas indicam a atividade ou resistência de promoto- 30 res potenciais compreendidos dentro de tais seqüências. Uma pessoa ver- sada também compreende que para assegurar a natureza comparativa de tais ensaios de atividade de promotor, condições outras que não as sequên- cias de ácido nucleico ensaiadas devem ser mantidas mais ou menos as mesmas ou, idealmente, as mesmas entre os ensaios diferentes. Tais condi- ções podem compreender, a título de exemplo, a quantidade de construto repórter introduzido nas células, o método de transformação usado para a 5 dita introdução, o número e sítio de integração de tais construtos repórter no genoma das células recipientes ensaiadas e/ou estado (por exemplo, fase de crescimento, por exemplo, de preferência fase de crescimento exponen- cial) das células hospedeiro recipientes no momento da medição, etc. Um modo exemplar de medição da resistência de um promotor em células reci- 10 pientes de Lactococcus lactis usando hlL-10 como o gene expresso é indi- cado no Exemplo 2. Uma maneira exemplar adicional de medir a resistência de um promotor em células recipientes de Lactococcus lactis e Lactobacillus casei usando GLP-2 como o gene expresso é indicada nos Exemplos 3 e 4. Maneiras ainda mais exemplares de medição da resistência de um promotor 15 em células recipientes de Lactococcus lactis, agora usando GLP-1, hPYY, hlL-10 e TFF como os genes de expressão, são indicadas nos Exemplos 5- 9. Experimentos usando Lactobacillus casei como células recipientes resul- tam em resultados similares (não-mostrado).

Deste modo, um promotor (1) que é dito ser "mais forte" do que 20 outro promotor (2) mostraria uma atividade significantemente maior confor- me avaliado através de ensaios adequados, por exemplo, aqueles descritos no parágrafo anterior, por exemplo, o ensaio conforme exemplificados nos Exemplo 2 a 9. Atividade significantemente maior refere-se a uma constata- ção estatisticamente significante de atividade maior para promotor (1), por 25 exemplo, de preferência com p < 0,5 ou p < 0,05.

A atividade do promotor (1) pode ser maior do que a atividade do promotor (2) em qualquer ponto e, de preferência, a atividade do promotor (1) pode ser maior do que a atividade do promotor (2) em pelo menos 1% do valor da atividade do promotor (2), por exemplo, em pelo menos 2%, pelo 30 menos 3% ou pelo menos 4%, com mais preferência em pelo menos 5%, por exemplo, em pelo menos 6%, pelo menos 7%, pelo menos 8% ou pelo me- nos 9%, com mais preferência ainda em pelo menos 10%, por exemplo, em pelo menos 15%, com mais preferência ainda em pelo menos 20%, por e- xemplo, em pelo menos 30% ou pelo menos 40%, com mais preferência a- inda em pelo menos 50%, por exemplo, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80% ou pelo menos 90%, e em exemplos ainda muito preferidos 5 em pelo menos 100%, pelo menos 150%, pelo menos 200%, pelo menos 250%, pelo menos 300%, pelo menos 400% ou pelo menos 500% do valor de atividade do promotor (2); ou em exemplos ainda muito mais preferidos a atividade do promotor (1) pode ser pelo menos 10x maior do que a atividade do promotor (2), tal como pelo menos cerca de 50x, pelo menos cerca de 10 100x, pelo menos cerca de 500x ou pelo menos cerca de 1000x maior.

Deste modo, para produzir variantes ou fragmentos funcionais de promotores, especialmente de promotores revelados pela presente in- venção, a pessoa versada na técnica saberia preparar tais variantes (por exemplo, através de metagênese direcionada ou aleatória) ou fragmentos (por exemplo, através de truncamento 5’ e/ou 3’, por exemplo, através de digestão por restrição ou PCR) e ensaio de tais variantes ou fragmentos quanto à sua atividade promotora como acima. Não obstante, a título de ori- entação adicional e não-limitação, é notado que promotores bacterianos fre- quentemente incluem seqüências de consenso adjacentes às posições -10 e -35. Deste modo, fragmentos funcionais de bactérias, por exemplo, promoto- res de Lactococcus, podem compreender de preferência pelo menos se- qüências correspondendo a posições nos promotores nativos de a partir de cerca de -10 a cerca de -35, com mais preferência de a partir de cerca de -8 a cerca de -40, com mais preferência ainda de a partir de cerca de -5 a cerca de -40 ou de a partir de cerca de -5 a cerca de -45, e com mais preferência ainda de a partir de cerca de -2 a -1 a cerca de -50. Além disso, variantes funcionais de bactérias, por exemplo, promotores de Lactococcus, podem de preferência compreender seqüências de consenso adjacentes às posições - e -35 como presente nos promotores contrapartes nativos ou como co- nhecido na técnica.

Uma "ligação operável" é uma ligação onde as seqüências de DNA reguladoras e a seqüência de DNA tentada ser expressar são conecta- das de tal maneira a permitir expressão.

Por exemplo, seqüências de DNA tal como, por exemplo, de pre- ferência um promotor e uma estrutura de leitura aberta heteróloga, são ditas estar operavelmente ligadas se a natureza da ligação entre as seqüências 5 não (1) resultar na introdução de uma mutação de mudança de estrutura, (2) interferir com a habilidade do promotor em direcionar a transcrição da estru- tura de leitura aberta ou (3) interferir com a habilidade da estrutura de leitura aberta em ser transcrita pela seqüência de região promotora.

Em uma modalidade preferida exemplar, o dito promotor pode ser posicionado a montante da, isto é, 5’ da, estrutura(s) de leitura aberta(s) à qual está operavelmente ligado.

A natureza precisa das regiões reguladoras necessárias para expressão pode variar de organismo para organismo, mas devem em geral incluir uma região promotora que, em procariontes, contém ambos o promo- 15 tor (que direciona o início de transcrição de RNA) bem como as seqüências de DNA que, quando transcritas em RNA, vão sinalizar o início de síntese de proteína. Tais regiões vão normalmente incluir aquelas seqüências de 5’- não-codificação envolvidas com início de transcrição e tradução, tal como Pribnow-box (cf. TATA-box), seqüência Shine-Dalgarno e similar.

Vantajosamente, o respectivo códon de início de tradução com o

qual um dado promotor da invenção está normalmente associado na nature- za pode não estar incluído em ácidos nucleicos recombinantes da invenção, de modo a prevenir início de tradução a partir de tais códons. Por exemplo, a extremidade 3’ do promotor pode ser truncada na posição -1 ou a montante 25 da mesma; alternativamente, o códon de início de tradução pode ser mutado (por exemplo, a partir de ATG para um códon diferente); etc. Ainda alternati- vamente, o dito códon de início de tradução nativo pode estar presente e possivelmente também vários códons (por exemplo, de preferência < 20, com mais preferência <10, com mais preferência ainda < 5, por exemplo, no 30 máximo 1, 2, 3 ou 4) subsequentes da estrutura de leitura aberta associada com o dado promotor na natureza, e uma estrutura de leitura aberta heteró- loga de interesse pode ser fundida a ele em estrutura para produzir um pro- duto de fusão.

O termo "estrutura de leitura aberta" ou ORF refere-se a uma sucessão de tripletos de nucleotídeo começando com um códon de início de tradução (de preferência ATG) e fechando com um códon de término de tra- dução (por exemplo, TAA, TAG ou TGA) e não contendo nenhum códon de término de tradução em estrutura interno, e potencialmente capaz de codifi- car um polipeptídeo. Então, o termo pode ser sinônimo de "seqüência de codificação" conforme usado na técnica. No ácido nucleico recombinante da invenção, os códons de início de tradução de uma ou mais ORFs podem tipicamente estar associados com seqüências reguladoras que controlam início de tradução, por exemplo, com seqüência Shine-Dalgarno. É também conhecido que em bactérias, incluindo Lactococcus, unidades multicistrôni- cas contendo duas ou mais ORFs seqüenciais controladas por um promotor a jusante comum podem ser criadas através de associação de códons de início de tradução a jusante com as ditas seqüências controlando tal início de tradução.

O termo "heterólogo", quando se referindo à relação entre uma dada ORF e um promotor, significa que o dito promotor não está normalmen- te associado com a, isto é, não está normalmente controlando a transcrição 20 da, dita ORF na natureza. Em outras palavras, a associação é criada através de técnicas de DNA recombinantes nos ácidos nucleicos recombinantes da invenção.

O termo "Lactococcus" refere-se em geral ao gênero Lactococ- cus e compreende qualquer táxon (por exemplo, espécie, subespécie, Iinha- 25 gem) classificado como pertencente a tal na técnica. A título de exemplo, Lactococcus inclui as espécies Lactococcus garvieae, Lactococcus lactis, Lactococcus piscium, Lactococcus plantarum e Lactococcus raffinolactis e quaisquer subespécies ou linhagens das mesmas.

Em modalidades preferidas da invenção, o Lactococcus é Lacto- coccus lactis. Lactococcus lactis inclui, sem limitação, Lactococcus lactis ssp. cremoris, Lactococcus lactis spp. hordniae, Lactococcus lactis ssp. lac- tis, Lactococcus lactis ssp. bv. Diacetylactis. Em modalidades preferidas adicionais da invenção, o Lactococ- cus lactis é Lactococcus lactis ssp. cremoris ou Lactococcus lactis ssp. lac- tis, com mais preferência Lactococcus lactis ssp. lactis e compreende quais- quer linhagens das mesmas, tal como, por exemplo, Lactococcus lactis ssp.cremoris SK11 ou Lactococcus lactis ssp. lactis MG 1363.

Em modalidades preferidas, o promotor (P) é derivado de Lacto- coccus conforme acima definido, com mais preferência a partir dos táxons Lactococcus preferidos conforme acima definido, esp. nos dois parágrafos acima.

Quando um promotor (P) é dito ser mais forte do que o promotor

da thyA de Lactococcus lactis em Lactococcus, isto quer dizer que ele é mais forte em pelo menos um e potencialmente em mais de um ou em todos os táxons Lactococcus (por exemplo, espécies, subespécies ou linhagens). De preferência, um promotor (P) pode ser muito mais forte em pelo menos 15 Lactococcus lactis. Também de preferência, um promotor (P) pode ser muito mais forte em pelo menos Lactococcus lactis ssp. cremoris e Lactococcus lactis ssp. lactis, com mais preferência em pelo menos Lactococcus lactis ssp. lactis.

O termo "timidilato sintase" refere-se à enzima EC 2.1.1.45 e 20 "gene da timidilato sintase (thyA) de Lactococcus lactis" significa um gene codificando a dita enzima em uma Lactococcus lactis. A seqüência do gene da thyA de vários táxons de Lactococcus lactis foi descrita, tal como, por e- xemplo, de Lactococcus lactis ssp. lactis MG1363 (Ross e outros, 1990; Steidler e outros, 2003; Acesso Genbank: AF462070), Lactococcus lactis 25 ssp. lactis IL1403 (Bolotin e outros, 2001; Genbank GenelD: 1115198) e Lac- tococcus lactis ssp. cremoris SK11 (Acesso Genbank: NC_008527, Iocus LACR_1631, GeneID do Genoma: 4434110). Uma pessoa versada na técni- ca é capaz de identificar e isolar homólogos do gene da thyA a partir de tá- xons adicionais de Lactococcus lactis.

O promotor do gene da thyA então refere-se a um promotor nati-

vo de qualquer gene da thyA conforme aqui definido. A título de exemplo, um dado promotor de thyA pode se referir à seqüência de ácido nucleico de cer- ca de -500 a cerca de +50 do gene de thyA correspondente (+1 significando o primeiro nucleotídeo do códon de início de tradução de um dado gene de thyA)·, e a título de exemplos preferidos adicionais de a partir de cerca de - 500 a cerca de +20, de a partir de cerca de -500 a cerca de +10, de a partir 5 de cerca de -500 a cerca de +5, de a partir de cerca de -500 a cerca de +2 ou de a partir de cerca de -500 a cerca de -1; de a partir de cerca de -400 a cerca de +50, de a partir de cerca de -400 a cerca de +20, de a partir de cer- ca de -400 a cerca de +10, de a partir de cerca de -400 a cerca de +5, de a partir de cerca de -400 a cerca de +2 ou de a partir de cerca de -400 a cerca 10 de -1; de a partir de cerca de -300 a cerca de +50, de a partir de cerca de - 300 a cerca de +20, de a partir de cerca de -300 a cerca de +10, de a partir de cerca de -300 a cerca de +5, de a partir de cerca de -300 a cerca de +2 ou de a partir de cerca de -300 a cerca de +1; de a partir de cerca de -200 a cerca de +50, de a partir de cerca de -200 a cerca de +20, de a partir de cer- 15 ca de -200 a cerca de +10, de a partir de cerca de -200 a cerca de +5, de a partir de cerca de -200 a cerca de +2 ou de a partir de cerca de -200 a cerca de +1; ou de a partir de cerca de -100 a cerca de +50, de a partir de cerca de -100 a cerca de +20, de a partir de cerca de -100 a cerca de +10, de a partir de cerca de -100 a cerca de +5, de a partir de cerca de -100 a cerca de +2 20 ou de a partir de cerca de -100 a cerca de +1; enquanto a dita seqüência mostrar mais ou menos a mesma e de preferência a mesma resistência que o promotor de thyA na natureza.

De preferência, o promotor de thyA para uso como referência na presente invenção é o promotor do gene da thyA de Lactococcus lactis ssp. lactis MG 1363, e um promotor da invenção é mais forte além disso conforme acima definido.

Em um ensaio exemplar, descrito no Exemplo 2, e baseado em Steidler e outros, 2003 (ibid.), o promotor de thyA de L lactis ssp. lactis MG1363 direciona a expressão de IL-10 humana quando integrado em uma 30 cópia única ao lócus de thyaA na linhagem MG1363 de 6,5 ng /1 x 109 bac- térias. Deste modo, um promotor da invenção que é mais forte do que o promotor de thyA pode, no dito ensaio, atingir expressão de hlL-10 maior do que 6,5 ng / 1x109 bactérias, de preferência > 7 ng / 1x109 bactérias, por e- xemplo, > 8 ng / 1x109 ou > 9 ng / 1x109 bactérias, com mais preferência a- inda > 10 ng / 1x109 bactérias, por exemplo, >11 ng / 1x109 bactérias, > 12 ng / 1x109 bactérias, > 13 ng / 1x109 bactérias ou > 14 ng / 1x109 bactérias, 5 com mais preferência ainda, > 15 ng / 1x109, com mais preferência ainda > 20 ng /1 x109 bactérias, por exemplo, 25 ng / 1x109 bactérias, > 30 ng / 1x109 bactérias, > 35 ng / 1x109 bactérias ou > 40 ng / 1x109 bactérias, e com mais preferência > 50 ng / 1x109 bactérias ou mais, por exemplo, >100 ng / 1x109 bactérias; e em exemplos muito mais preferidos > 200 ng / 1x109 10 bactérias, tal como > 500 ng / 1x109 bactérias ou > 1000 ng / 1x109 bactérias ou > 2000 ng / 1x109 bactérias ou > 5000 ng / 1x109 bactérias.

Em ensaios exemplares adicionais, por exemplo, conforme des- crito nos Exemplos 3 e 4, a linhagem MG1363 ou L.casei compreende o ve- tor pT1NX, onde o promotor de thyA de L lactis ssp. lactis MG1363 direcio- 15 na a expressão do gene de GLP-2 humano. Deste modo, um promotor da invenção, por exemplo, o promotor PhIIA1 é mais forte do que o promotor da thyA quando equivalentes de 1 ml de culturas colhidas no final da fase log, carregados em SDS-PAGE e analisados através de western blot, a quanti- dade de GLP-2 expressa pelo promotor da invenção é maior do que através 20 do promotor da thyA. Ensaios exemplares adicionais são descritos nos E- xemplos 5 a 9.

Em uma modalidade relacionada, a invenção então provê tam- bém um ácido nucleico recombinante compreendendo um promotor (P) ope- ravelmente ligado a uma ou mais estruturas de leitura aberta heterólogas 25 para o promotor (P), por exemplo, um gene de GLP-1, um gene de hIL-10, um gene de hPYY ou um gene de TTF, onde o promotor (P) é escolhido do grupo compreendendo ou consistindo nos promotores nativos dos genes de Lactococcus listados sob 1) a 53) na seção Sumário, de preferência nos promotores nativos de genes de Lactococcus listados onde o promotor (P) é 30 escolhido do grupo consistindo em promotores nativos de genes de 1) poli- merase de RNA direcionada a DNA, subunidade beta’ / subunidade de 160 kD (rpoC), 3) ferritina de ligação a ferro não-heme (dpsA), 4) piruvato cinase [pyk), 5) glutaminil-tRNA sintetases (g/fX), 6) fosfopiruvato hidratase (eno), 9) dipeptidase PepV (pepV), 12) gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (gapB), 13) acetato cinase (ackA), 18) frutose bifosfato aldolase (fbaA), 20) superó- xido dismutase (sodA), 21) proteína ribossomal S12 (rpsL) e proteína ribos- 5 somai S7 (rpsG), 22) proteína ribossomal L18 (φ/R) e proteína ribossomal S5 (rpsE) e proteína ribossomal L30/L7E (rpmD), 24) proteína ribossomal L19 (φ/S), 26) proteína ribossomal L10 (rp/J), 28) proteína de ligação a DNA tipo HU (hlIA), 29) proteína ribossomal 50S (rpmB), 30) componente IIB do sistema de fosfotransferase (ptcB), conforme definido na Tabela 1 sob 1) a 10 53), com mais preferência ainda o promotor listado sob 1), 3)-6), 9), 12), 13), 18), 20)-22), 24), 26) e 28)-30) da Tabela 1, com mais preferência ainda o promotor PhIIA listado sob 28), o promotor PdpsA listado sob 3), o promotor PpepV listado sob 9) ou o promotor PsodA listado sob 20) e variantes fun- cionais e fragmentos funcionais dos ditos promotores nativos. É também pre- 15 ferido que o promotor (P) seja escolhido do grupo compreendendo ou con- sistindo em ácidos nucleicos mostrados nas SEQ ID NO:1, 3 a 6, 9, 12, 13, 18, 20 a 22, 24, 26, 28 a 54, 160, 163 a 165, 167, 169, 171 a 180, e varian- tes funcionais e fragmentos funcionais dos ditos promotores nativos.

As ditas designações são claras para uma pessoa versada na técnica e ensinam genes específicos de vários táxons de Lactococcus (por exemplo, espécies, subespécies e linhagens), tal como os táxons de Lacto- coccus preferidos descritos acima. Não obstante, em virtude de mais orien- tação a Tabela 1 abaixo menciona números de ID de gene únicos que identi- ficam os ditos genes como forma isolada de Lactococcus lactis ssp. cremoris SK11 (número de acesso Genbank para seqüência de genoma de compri- mento integral de SK11: NC_008527) e ssp. lactis MG1363. Os números de ID dos genes identificam unicamente os ditos genes no banco de dados "En- trez Gene" do NCBI (www.ncbi.nlm.nih.qov/entrez/auerv.fcqi?db=qene) con- forme descrito em Maglott e outros, 2005. Com base nisto, uma pessoa ver- sada na técnica pode identificar e isolar homólogos dos ditos genes de tá- xons adicionais de Lactococcus outros que não SK11 e/ou MG1363, por e- xemplo, a espécie, subespécie e linhagens preferidas conforme aqui ensina- do. "Homólogos" conforme aqui usado refere-se a seqüências, esp. Genes, de dois ou mais táxons diferentes que são similares (por exemplo, de prefe- rência, podem ser substancialmente idênticos conforme aqui definido) como um resultado de origem de um ancestral comum. Homólogos dos genes a- 5 cima de SK11 e/ou MG1363 de preferência realizam a mesma função em outros táxons Lactococcus.

Uma pessoa versada na técnica pode identificar e isolar promo- tores nativos controlando a expressão de genes listados na Tabela 1 de SK11 e/ou MG1363 ou homólogos dos mesmos a partir de táxons de Lacto- 10 coccus adicionais (incluindo promotores que controlam a expressão de ge- nes que são encontrados em unidades de transcrição multicistrônicas e en- tão não podem conter um promotor diretamente a jusante de seu códon de início de tradução; tal como é o caso em SK11 e/ou MG1363, por meio de ilustração, para rpsL - rpsG com promotor a montante de rpsL direcionando 15 a transcrição de ambos; ou para rpIR - rpsE - rpmD com promotor a montan- te de rpsL direcionando a transcrição de todos; ou para /p/D - rp!W - rplB com promotor a montante de rplD direcionando a transcrição de todos; ou para rpsS - rpIU - epIP - rplN com promotor a montante de /psS direcionando a transcrição de todos; ou para rpsM com um promotor a montante de um 20 gene a montante infA codificando um fator de início e tradução 1 (IF-1) dire- cionando a transcrição de rpsM) seguindo os ensinamentos deste relatório e usando conhecimento comum na técnica.

Em uma modalidade preferida, a invenção provê um ácido nucle- ico recombinante compreendendo um promotor (P) operavelmente ligado a 25 uma ou mais estruturas de leitura aberta heterólogas para o promotor (P), onde o promotor (P) é escolhido do grupo compreendendo ou consistindo nos promotores nativos dos genes de Lactococcus listados sob 1) a 30) na seção Sumário (isto é, os primeiros 30 genes na Tabela 1), com mais prefe- rência ainda o promotor listado sob 1), 3)-6), 9), 12), 13), 18), 20)-22), 24), 30 26) e 28)-30) da Tabela 1, com mais preferência ainda o promotor PhIIA lis- tado sob 28), promotor da proteína tipo ferritina de ligação a DNA (protetor de dano oxidativo) (dps) listado sob 3), o promotor da Xaa-His dipeptidase (argE ou pepV) listado sob 9) ou o promotor da superóxido dismutase (sodA) listado sob 20) e variantes funcionais e fragmentos funcionais dos ditos pro- motores nativos.

Em uma modalidade preferida, a invenção provê um ácido nucle- ico recombinante compreendendo um promotor (P) operavelmente ligado a uma ou mais estruturas de leitura aberta heterólogas para o promotor (P)1 onde o promotor (P) é escolhido do grupo compreendendo ou consistindo em ácidos nucleicos mostrados nas SEQ ID NOs: 1 a 54 e 157 a 180, e ho- mólogos das mesmas, com mais preferência ainda, SEQ ID NOs: 1, 3 a 9, 12, 13, 18, 20 a 22, 24, 26, 28 a 54, 160, 163 a 165, 167, 169, 171 a 180, e variantes funcionais e fragmentos funcionais dos ditos promotores nativos, com mais preferência ainda SEQ ID NOs: 1, 3 a 6, 9, 12, 13, 18, 20 a 22, 24, 26, 28 a 30, 160, 163 a 165, 167, 169 e 171, e variantes funcionais e frag- mentos funcionais dos ditos promotores nativos, de preferência SEQ ID NOs: 28, 3, 9, 158 e/ou 20, e variantes funcionais e fragmentos funcionais dos mesmos.

As ditas seqüências SEQ ID NOs: 1 a 54 e 157 a 180 represen- tam promotores nativos exemplares, mas não-limitantes, associados com a expressão dos genes listados sob 1) a 53) acima (conforme ensinado em 20 mais detalhes na Tabela 1) em Lactococcus lactis ssp. lactis MG1363 e/ou Lactococcus lactis ssp. cremoris SK11. Deste modo, esses promotores e homólogos dos mesmos (esp. de táxons de Lactococcus outros que não MG1363 e/ou SK11) e variantes funcionais e derivados funcionais dos mes- mos podem ser úteis em ácidos nucleicos recombinantes da invenção para 25 realização da expressão de estruturas de leitura aberta úteis em células hospedeiro, de preferência em células hospedeiro bacterianas, com mais preferência ainda em Lactococcus, com mais preferência ainda em Lacto- coccus lactis, com mais preferência ainda em Lactococcus lactis ssp. lactis, tal como em uma linhagem exemplo preferida MG1363.

Em uma modalidade preferida adicional, o promotor (P) é esco-

lhido do grupo compreendendo ou consistindo em ácidos nucleicos mostra- dos na SEQ ID NOs: 1 a 54, e 157 a 180, com mais preferência SEQ ID NOs: 1, 3 a 6, 9, 12, 13, 18, 20 a 22, 24, 26, 28 a 54, 160, 163 a 165, 167, 169, 171 a 180, com mais preferência ainda SEQ ID NOs: 1, 3 a 6, 9, 12, 13, 18, 20 a 22, 24, 26, 28 a 30, 160, 163 a 165, 167, 169 e 171, com mais pre- ferência SEQ ID NOs: 28, 3, 9, 158 e/ou 20 e homólogos das mesmas, vari- antes funcionais e/ou fragmentos funcionais do mesmo.

Em ainda uma modalidade preferida adicional, o promotor (P) é escolhido do grupo compreendendo ou consistindo em ácidos nucleicos mostrados nas SEQ ID NOs: 1 a 30, e 157 a 171, com mais preferência SEQ ID NOs: 28, 3, 9, 158 e/ou 20, e variantes funcionais e fragmentos funcionais do mesmo.

Em outra modalidade preferida, os ácidos nucleicos recombinan- tes da invenção compreendem ainda uma seqüência terminadora de trans- crição 3’ para as ditas uma ou mais estruturas de leitura aberta. Por exem- plo, se apenas uma estrutura de leitura aberta estiver presente, a seqüência 15 terminadora pode estar vantajosamente localizada a jusante, isto é, 3’, da mesma. Se o ácido nucleico recombinante contiver duas ou mais ORFs, por exemplo, sucessivamente ordenadas e formando juntas uma unidade de transcrição multicistrônica, o terminador de transcrição será posicionado vantajosamente 3’ para a ORF mais a jusante.

O termo "terminador de transcrição" refere-se a um elemento de

seqüência na extremidade da unidade de transcrição que sinaliza termina- ção de transcrição. De preferência, um terminador de transcrição para uso na presente invenção vai sinalizar término da transcrição em células hospe- deiro pretendidas para uso com os ácidos nucleicos recombinantes da in- 25 venção, tal como, por exemplo, em células hospedeiro bacterianas, com mais preferência ainda em Lactococcus, com mais preferência ainda em Lactococcus lactis. Técnicas para identificação e isolamento de terminadores adequados, por exemplo, terminadores de Lactococcus, são conhecidas no campo (por exemplo, vide van der Vossen e outros, 1985), como o são ter- 30 minadores exemplares, por exemplo, vide van der Vossen e outros (1992), etc.

Em uma modalidade preferida adicional, os ácidos nucleicos re- combinantes da invenção compreendem ainda um operador configurado pa- ra controlar transcrição a partir do promotor (P). Conforme aqui usado, o termo "operador" refere-se a uma seqüência de nucleotídeo, de preferência seqüência de DNA1 que controla o início e/ou manutenção de transcrição de uma seqüência a partir de um promotor.

Tipicamente, um operador pode ser geralmente posto entre um promotor e uma seqüência a jusante cuja transcrição os promotores contro- lam. Geralmente, um operador é capaz de ligar um polipeptídeo repressor, com o que ele reduz a transcrição a partir do dito promotor. Um repressor útil pode alternar entre um estado onde ele liga o operador e um estado onde ele não e tal alternação pode ser vantajosamente controlada por uma condi- ção externa, por exemplo, uma substância externa ou um metabolito particu- lar. Deste modo, em células hospedeiras compreendendo um repressor compatível, a inclusão de um operador no ácido nucleico da invenção pode permitir controlar a atividade do promotor e expressão a partir do mesmo. Sistemas de operadores - repressores exemplares incluem, por exemplo, o sistema Iac e vide também, por exemplo, Nauta e outros (1996), ou o siste- ma de biossíntese de histidina (vide, por exemplo, Delorme e outros, 1999). Seqüências operadoras podem ser geralmente derivadas de cromossomos bacterianos.

Em uma modalidade preferida adicional, ácidos nucleicos re- combinantes da invenção compreendem ainda seqüências configuradas pa- ra realizar inserção dos ditos ácidos nucleicos recombinantes no genoma, por exemplo, um cromossomo, de uma célula hospedeiro.

Em um exemplo particularmente preferido, inserção dos ácidos

nucleicos da invenção em sítios particulares dentro de um genoma, por e- xemplo, cromossomo, de uma célula hospedeiro pode ser facilitada por re- combinação homóloga. Por exemplo, os ácidos nucleicos recombinantes da invenção podem compreender uma ou mais regiões de homologia para o 30 dito sítio de integração dentro do genoma, por exemplo, um cromossomo, da ! célula hospedeiro. A seqüência no dito sítio de genoma, por exemplo, cro- mossomo, pode ser natural, isto é, como ocorre na natureza, ou pode ser uma seqüência exógena introduzida através de engenharia genética anteri- or.

Por exemplo, a(s) dita(s) região(ões) de homologia podem ser pelo menos de 50 pb, de preferência pelo menos 100 pb, por exemplo, pelo menos 20 pb, com mais preferência pelo menos 300 pb, por exemplo, pelo menos 400 pb, com mais preferência ainda pelo menos 500 pb, por exem- plo, pelo menos 600 pb ou pelo menos 700 pb, com mais preferência ainda pelo menos 800 pb, por exemplo, pelo menos 900 pb ou pelo menos 1000 pb ou mais.

Em um exemplo preferido, duas regiões de homologia podem ser incluídas, uma flanqueando cada lado da(s) unidade(s) de expressão presente(s) nos ácidos nucleicos da invenção. Tal configuração pode inserir vantajosamente as seqüências relevantes, isto é, as que afetam a expressão das estruturas de leitura aberta de interesse a partir dos promotores da in- venção, em células hospedeiro. Meios para realizar recombinação homólo- ga, especialmente em hospedeiro bacterianos, e seleção de recombinantes, são geralmente conhecidos no campo. Um método exemplar e preferido é, por exemplo, aquele de Steidler e outros (2003) para introdução de seqüên- cias exógenas no local de thyA de Lactococcus.

Então, em uma modalidade preferida, a invenção também provê o ácido nucleico recombinante quando integrado a genoma, por exemplo, um cromossomo, de preferência um cromossomo bacteriano, com mais pre- ferência um cromossomo de Lactococcus. Tal integração pode ser obtida em uma célula hospedeiro transformada com o dito ácido nucleico recombinante ou um vetor compreendendo tal, conforme descrito em outro local no presen- te relatório.

Em uma modalidade preferida, a uma ou mais estruturas de lei- tura aberta ligadas a um promotor da invenção nos ácidos nucleicos da in- venção codificam um polipeptídeo.

Como pode ser compreendido, a essência da invenção se rela- ciona principalmente a novos promotores e seus usos e a natureza dos ditos produtos de expressão, de preferência polipeptídeos, não deve ser limitada de modo algum.

Não obstante, células hospedeiro compreendendo estruturas de leitura aberta controladas por promotor de Lactococcus foram relatadas co- mo meios para produção in vitro (vide, por exemplo, US 5.559.007; Steidler e 5 outros, 1995; Wells e outros, 1993B) e aplicação in vivo (vide, por exemplo, WO 97/14806; WO 01/02570; Steidler e outros, 2003, Steidler e outros, 2000) de polipeptídeos relevantes de origem viral, procariótica ou eucarióti- ca, incluindo polipeptídeos úteis na prevenção ou terapia de doença em ho- mem e animais.

Deste modo, em uma modalidade, as ditas uma ou mais estrutu-

ras de leitura aberta dos ácidos nucleicos recombinantes da invenção podem codificar um produto de expressão, de preferência um polipeptídeo, capaz de elicitar uma resposta terapêutica em um indivíduo, de preferência em um indivíduo homem ou animal.

Em uma modalidade particularmente útil, exemplar e não-

limitante, as ditas uma ou mais estruturas de leitura aberta dos ácidos nucle- icos recombinantes da invenção podem codificar um antígeno e/ou um poli- peptídeo terapeuticamente ativo não-vacinogênico.

Conforme aqui usado, o termo "antígeno" refere-se em geral a uma substância que evoca uma resposta imune, incluindo imunidade humo- ral e/ou resposta de imunidade celular, e que é capaz de ligação com um produto, por exemplo, um anticorpo ou uma célula T, da resposta imune. Então, em um exemplo preferido, um antígeno requer um sistema imune em funcionamento de um indivíduo ao qual ele é administrado para elicitar uma resposta fisiológica a partir de tal indivíduo. O "antígeno" da presente inven- ção também compreende "autoantígenos" que não provocam uma resposta imune em um indivíduo saudável, mas o faria em uma pessoa sofrendo de uma doença autoimune, isto é, a falha de um organismo em reconhecer su- as próprias partes constituintes (para baixo para os níveis submoleculares) como "próprias", que resulta em uma resposta imune contra suas próprias células e tecidos. Qualquer doença que resulte de tal resposta imune aber- rante é chamada uma doença autoimune. Deste modo, o "antígeno" da pre- sente invenção também compreende uma proteína (fisiologicamente ativa) que não provocaria uma resposta imune em um indivíduo saudável, mas o faria em uma pessoa geneticamente deficiente da dita proteína. Ainda, o "antígeno" da presente invenção também compreende um alérgeno que não 5 provocaria uma resposta imune em um indivíduo saudável, mas o faria em uma pessoa sofrendo de uma doença alérgica.

Um antígeno de acordo com a invenção pode ser derivado de qualquer polipeptídeo para o qual uma resposta imune em um indivíduo hu- mano ou animal seria terapeuticamente útil, por exemplo, a partir de um pa- 10 tógeno, por exemplo, de um patógeno viral, procariótico (por exemplo, bacte- riano) ou eucariótico, de uma proteína não-fisiológica (por exemplo, uma pro- teína derivada de tecido canceroso), de alérgeno (por exemplo, para elicitar tolerância imune), etc. Um antígeno poderia também ser um metabolita de uma proteína. Como um exemplo, o antígeno poderia ser um polissacarídeo, 15 um lipídeo ou outro. Promotores fortes conforme descrito aqui poderiam di- recionar a expressão das enzimas necessárias para sintetizar ou reunir o dito polissacarídeo, lipídeo ou outro.

O termo "um polipeptídeo terapeuticamente ativo não-vacino- gênico" refere-se geralmente a um polipeptídeo que, em um indivíduo hu- mano ou animal ao qual ele é administrado, não elicita uma resposta imune contra si mesmo e é capaz de atingir um efeito terapêutico. Então, o efeito terapêutico de tal polipeptídeo seria esperado estar diretamente ligado à sua própria função biológica natural com o que ele atinge efeitos particulares no corpo de um indivíduo; ao invés de produzir um efeito terapêutico agindo como um antígeno imunogênico e/ou imunoprotetor no indivíduo. Então, o polipeptídeo terapeuticamente ativo não-vacinogênico deve ser biologica- mente ativo em sua forma expressa ou, pelo menos, deve ser convertido na forma biologicamente ativa uma vez liberado da célula hospedeiro de ex- pressão. De preferência, tal forma biologicamente ativa do dito polipeptídeo pode mostrar uma conformação secundária e de preferência também terciá- ria que é a mesma ou proximamente análoga à sua configuração nativa.

De preferência, o polipeptídeo terapeuticamente ativo não- vacinogênico é também não-tóxico e não-patogênico.

Em uma modalidade preferida, o polipeptídeo terapeuticamente ativo não-vacinogênico pode ser derivado de humano ou animal, e pode de preferência corresponder ao mesmo táxon que o indíviduo humano ou ani- 5 mal ao qual ele deve ser administrado.

Exemplos não-limitantes de polipeptídeos terapeuticamente ati- vos não-vacinogênicos adequados incluem uns que são capazes de funcio- nar localmente ou sistemicamente, por exemplo, é um polipeptídeo capaz de exercer atividades endócrinas afetando metabolismo local ou do corpo todo 10 e/ou o(s) polipeptídeo(s) biologicamente ativo(s) é/são um(uns) que é/são capazes de regular as atividades das células pertencentes ao sistema imu- no-hematopoiético e/ou o um ou mais polipeptídeos biologicamente ativos é/são um(uns) que é/são capazes de afetar a viabilidade, crescimento e dife- renciação de uma variedade de células normais ou neoplásticas no corpo ou 15 afetando a regulagem imune ou indução de respostas inflamatórias de fase aguda à lesão e infecção e/ou o um ou mais polipeptídeos biologicamente ativos é/são um(uns) que é/são capazes de aumentar ou induzir resistência à infecção de células e tecidos mediada por quimiocinas que agem sobre seus receptores de célula-alvo, ou a proliferação de células epiteliais ou a 20 promoção de cicatrização de ferida e/ou o um ou mais polipeptídeos biologi- camente ativos modulam a expressão ou produção de substâncias pelas células no corpo.

Exemplos específicos de tais polipeptídeos incluem, sem limita- ção, insulina, hormônio do crescimento, prolactina, calcitonina, hormônio 25 luteinizante, hormônio paratireoide, somatostatina, hormônio de estimulação da tireoide, polipeptídeo intestinal vasoativo, citocinas tal como IL-2, IL-3, IL- 4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-9, IL-10, IL-11, IL12, IL-13 ou qualquer um de IL-14 a IL- 32, GM-CSF, M-CSF, SCF, IFNs, EPO, G-CSF, LIF, OSM, CNTF, GH, PRL, a família TNF de citocinas, por exemplo, Iigantes TNFa, TNFb, CE40, CD27 30 ou FAS, a família IL-1 de citocinas, a família de fator de crescimento de fi- broblasto, os fatores de crescimento derivados de plaqueta, fatores de cres- cimento transformantes e fatores de crescimento de nervo, a família de fator de crescimento epidermal de citocinas, as citocinas relacionadas à insulina, etc. Alternativamente, o polipeptídeo terapeuticamente ativo pode ser um receptor ou antagonista para os polipeptídeos terapeuticamente ativos con- forme acima definido. Alternativamente, o polipeptídeo terapeuticamente ati- 5 vo pode ser um anticorpo neutralizante ou similares do mesmo. Exemplos específicos adicionais de tais polipeptídeos adequados são listados, por e- xemplo, no WO 96/11277, página 14, linhas 1-30, incorporado aqui a título de referência; no WO 97/14806, página 12, linha 1 até página 13, linha 27, incorporado aqui a título de referência; ou US 5.559.007, col. 8, linha 31 até 10 col. 9, linha 9, incorporado aqui a título de referência. De preferência, o poli- peptídeo adequado é o peptídeo de IL-10, por exemplo, a IL-10 humana (hlL-10), por exemplo, conforme exemplificado no Exemplo 2, 5 ou 9.

Em uma modalidade preferida, o polipeptídeo adequado é um peptídeo Trefoil, tal como TTF1, TTF2 e/ou TTF-3. Três membros desta fa- mília de peptídeos trefoil foram identificados em humanos e originalmente designados: pS2 (gene induzível por estrogênio de câncer de mama, Lefeb- vre, 1993), SP (peptídeo espasmolítico) e ITF (fator trefoil intestinal). Na pre- sente nomenclatura, pS2 é renomeado como TFF1, SP como TFF2 e ITF como TFF3 (vide, por exemplo, Wong e outros, 1999). Esta nova nomencla- tura é usada em todo o presente texto. Em humanos, camundongos e rato TFF1 e TFF2 são predominantemente encontrados no estômago enquanto TFF3 é predominantemente encontrado do duodeno e colo. TFF1 é pensado agir através de um receptor de superfície celular (Tan e outros, 1997). Wong e outros (1999) dão uma visão geral recente de peptídeos trefoil. Os conteú- dos deste artigo são incorporados a título de referência na presente revela- ção. Peptídeos trefoil são secretados por células mucosais epiteliais e são estáveis em um ambiente ácido. Esses peptídeos contribuem para a prote- ção da mucosa (formação de um gel sobre o epitélio) e estão provavelmente envolvidos no reparo de mucosa danificada através da estimulação de mi- gração epitelial (Palyford e outros, 1996). A produção de peptídeos trefoil aumenta localmente em regiões onde dano acontece tal como úlceras gás- tricas e colite (Wright e outros, 1990). Babyatsky e outros (1996) mostraram que a administração de peptídeos trefoil recombinantes reduz do dano nes- ses locais. Em contradição com a maioria das outras proteínas que são im- portantes para a proteção da mucosa (tal como fator de crescimento epider- mal), a maioria dos estudos tem demonstrado que peptídeos trefoil causa pouca ou nenhuma proliferação (Playford e outros, 1996).

Em outra modalidade preferida, o polipeptídeo adequado é o peptídeo PYY, por exemplo, o PYY humano (hPYY), e com mais preferência ainda variante Gly9 de hPYY (3-36) conforme exemplificado no Exemplo 7.

Em uma modalidade preferida adicional, o polipeptídeo adequa- do é o peptídeo-1 tipo glucagon (GLP-1 ou GLP1), por exemplo, o GLP-1 humano (hGLP-1), e com mais preferência ainda variante Glicina 8 de hGLP-

1 (conforme exemplificado no Exemplo 8). Em uma modalidade preferida, o polipeptídeo adequado é o peptídeo-2 tipo glucagon (GLP-2 ou GLP2). O gene proglucagon humano (GenBank no. acess. NM_002054) codifica uma proteína prepro que é clivada em quatro peptídeos maduros distintos, inclu- indo peptídeo-2 tipo glucagon (GLP-2). GLP-2 externamente administrado produz vários efeitos em indivíduos, por exemplo, humanos, incluindo cres- cimento intestinal, melhora da função intestinal, redução em quebra de osso e neuroproteção. GLP-2 pode agir de uma maneira endócrina para ligar crescimento intestinal e metabolismo com ingestão de nutriente. GLP-2 e análogos relacionados podem ser tratamentos para síndrome do intestino curto, doença de Chron, osteoporose e como terapia adjuvante durante qui- mioterapia para câncer. De preferência, o gene de GLP-2 é adaptado para o uso de códon preferido em Lactococcus, por exemplo, L. lactis. De preferên- cia, o gene codifica a seqüência de amino ácido HADGSFSDEMNTILDNLAA RDFINWLIQTKITD.

Em outra modalidade preferida, o gene codifica um análogo de GLP-2 humano maduro com uma substituição de alanina por glicina na posi- ção 2, que foi mostrada reduzir a susceptibilidade à degradação por dipepti- dil peptidase-IV (Booth e outros, 2004), por exemplo, o gene codifica a se- qüência de amino ácido HGDGSFSDEMNTILDNLAARDFINWLIQTKITD.

Em uma modalidade ainda mais preferida, o gene GLP-2 é a- daptado para o uso de códon preferido em Lactococcus e compreende uma substituição de alanina por glicina na posição 2, por exemplo, a seqüência de nucleotídeo de h[Gly2]GLP-2:

CACGGT GAT GGTT CATTTT CAGAT GAAAT GAACACTAT CCTT GATAACCT T GCT GCTCGT GATTTT AT CAACT GGCTT AT CCAAACT AAAAT CACT GATT AA.

Deste modo, em uma modalidade o ácido nucleico recombinante da invenção codifica um antígeno e/ou um polipeptídeo terapeuticamente ativo não-vacinogênico, onde o dito antígeno é capaz de elicitar uma respos- 10 ta imune, de preferência resposta imunoprotetora, em um indivíduo humano ou animal, e/ou o dito polipeptídeo terapeuticamente ativo não-vacinogênico é capaz de produzir um efeito terapêutico em um indivíduo humano ou ani- mal.

O WO 97/14806 revela especificamente coexpressão de antíge- nos com moléculas estimuladoras de resposta imune, tal como, por exemplo, interleucinas, por exemplo, IL-2 ou IL-6, por bactérias. Deste modo, tal co- expressão usando os promotores da invenção é também compreendida.

Em uma modalidade preferida adicional, a estrutura de leitura aberta de acordo com a invenção compreende ainda uma seqüência codifi- 20 cando um sinal de secreção em fase com um polipeptídeo codificado pela ORF. Isto permite vantajosamente a secreção do polipeptídeo expresso a partir da célula hospedeiro e então pode facilitar, por exemplo, isolamento ou aplicação.

Tipicamente, uma seqüência de sinal de secreção representa 25 um segmento de cerca de 16 a cerca de 35 amino ácidos, geralmente con- tendo amino ácidos hidrofóbicos que ficam embebidos na membrana de bi- camada de lipídeo, e então permite a secreção de uma seqüência de proteí- na ou peptídeo acompanhante a partir da célula hospedeiro, e que geral- mente é clivado desta proteína ou peptídeo. De preferência, a seqüência de 30 sinal de secreção pode ser muito ativa em uma célula hospedeiro pretendida para uso com o ácido nucleico compreendendo a dita seqüência de sinal, por exemplo, uma célula hospedeiro bacteriana, de preferência uma bactéria do ácido láctico, com mais preferência Lactococcus, com mais preferência ainda Lactococcus lactis.

Seqüências de sinal de secreção ativas em células hospedeiro adequadas são conhecidas na técnica, seqüências de sinal de Lactococcus 5 exemplares incluem aquelas de usp45 (vide US 5.559.007) e outras, vide, por exemplo, Perez-Martinez e outros (1992); Sibakov e outros (1991). De preferência, a seqüência de sinal está localizada entre a seqüência promoto- ra e a ORF, isto é, a seqüência de sinale está localizada 3’ a partir da se- qüência promotora e precede a ORF do polipeptídeo de interesse. Em uma 10 modalidade preferida, a seqüência de sinal codifica a seqüência de amino ácido MKKKIISAIL MSTVILSAAA PLSGVYA (USP-45).

Os presentes inventores surpreendentemente constataram que a combinação do promotor PhIIA com uma seqüência de sinal usp45 mutado resulta em produção e secreção controláveis adicionais do polipeptídeo de 15 interesse. Em particular, o mutante compreende uma asparagina (N) na po- sição 4 ao invés de uma Iisina (K). Em uma modalidade preferida, a seqüên- cia de sinal codifica a seqüência de amino ácido MKKNIISAIL MSTVILSAAA PLSGVYADTN.

Em uma modalidade preferida adicional a presente invenção re- fere-se a um ácido nucleico recombinante conforme aqui definido, onde o dito ácido nucleico recombinante compreende:

(a) PdpsA, usp45 e hlL-10 (sAGX0012); PdpsA1 usp45N4 e hlL-10;

PpepV, usp45 e hlL-10 (sAGX0018); PpepV, usp45N4 e hlL-10;

PsodA, usp45 e hlL-10 (sAGX0029); PsodA, usp45N4 e hlL-10;

PhlIA, usp45 e hlL-10 (sAGX0037); PhlIA, usp45N4 e hlL-10;

(b) PdpsA, usp45N4 e hTFF1; PdpsA, usp45 e hTFF1;

PpepV, usp45N4 e hTFF1; PpepV, usp45 e hTFF1;

PsodA, usp45N4 e hTFF1; PsodA, usp45 e hTFF1;

PhlIA, usp45N4 e hTFF1 (sAGX0048); PhlIA, usp45 e hTFF1 (SAGX0049);

! (c) PdpsA, usp45N4 e hTFF3; PdpsA, usp45 e hTFF3 (sAGX0048);

PpepV, usp45N4 e hTFF3; PpepV, usp45 e hTFF3; PsodA, usp45N4 e hTFF3; PsodA, usp45 e hTFFC-1:

PhlIA, usp45N4 e hTFF3 (sAGX0057); PhlIA, usp45 e hTFF3;

(d) PdpsA, usp45N4 e hPYY; PdpsA, usp45 e hPYY(sAGX0048); PpepV, usp45N4 e hPYY; PpepV, usp45 e hPYY;

PsodA, usp45N4 e hPYY; PsodA, usp45 e hPYY;

PhlIA, usp45N4 e hPYY (sAGX0057); PhlIA, usp45 e hPYY; Phl- IA, usp45 e hPYY G9 (3-36) (sAGX0213);

(e) PdpsA, usp45N4 e GLP-1; PdpsA, usp45 e GLP-1;

PpepV, usp45N4 e GLP-1 ; PpepV, usp45 e GLP-1;

PsodA, usp45N4 e GLP-1; PsodA, usp45 e GLP-1;

PhlIA, usp45N4 e GLP-1; PhlIA, usp45 e GLP-1;

(f) PdpsA, usp45N4 e GLP-2; PdpsA, usp45 e GLP-2;

PpepV, usp45N4 e GLP-2; PpepV, usp45 e GLP-2;

PsodA, usp45N4 e GLP-2; PsodA, usp45 e GLP-2;

PhlIA, usp45N4 e GLP-2; ou PhlIA, usp45 e GLP-2.

Em um aspecto adicional, a invenção refere-se a um vetor com- preendendo o ácido nucleico da invenção.

Conforme aqui usado, "vetor" refere-se a uma molécula de ácido nucleico, tipicamente DNA, na qual fragmentos de ácido nucleico podem ser 20 inseridos e clonados, isto é, propagados. Então, um vetor vai tipicamente conter um ou mais sítios de restrição únicos, e pode ser capaz de replicação autônoma em um organismo hospedeiro ou veículo definido de modo que a seqüência clonada seja reproduzível. Vetores podem incluir, se limitação, plasmídeos, fagemídeos, bacteriófagos, vetores derivados de bacteriófago, 25 PAC, BAC, ácidos nucleicos lineares, por exemplo, DNA linear, etc, confor- me apropriado (vide, por exemplo, Sambrook e outros, 1989; Ausubel, 1992).

Fatores de importância na seleção de um vetor particular, por exemplo, um plasmídeo, incluem, inter alia: a facilidade com a qual células recipientes que contêm o vetor podem ser reconhecidas e selecionadas da- quelas células recipientes que não contêm o vetor, o número de cópias do vetor que são desejadas em um hospedeiro particular; e se é desejável ser capaz de "mover" o vetor entre células hospedeiro de espécies diferentes. Vetores procarióticos preferidos incluem plasmídeos tal como aqueles capa- zes de replicação em E. coli (tal como, por exemplo, pBR32, ColE1, pSC101, pUC19, etc). Tais plasmídeos são descritos em, por exemplo, Sambrook e 5 outros, 1989; Ausubel, 1992. Vetores particularmente preferidos podem ser aqueles capazes de replicar em E. coli (ou outras bactérias Gram negativas) bem como em outra célula hospedeiro de interesse, tal como em uma bacté- ria Gram positiva, uma bactéria do ácido láctico, de preferência Lactococcus, com mais preferência Lactococcus lactis (vide, por exemplo, Kok e outros 10 (1984). Outros vetores preferidos podem ser aqueles capazes de replicar e/ou mover entre uma ou mais bactérias Gram positivas mas não em bacté- rias Gram negativas. Em uma modalidade preferida, o vetor é pT1NX con- forme descrito por Steidler e outros (1998), que é aqui especificamente in- corporado a título de referência.

Em um aspecto adicional, a invenção provê uma célula hospe-

deiro transformada com 0 ácido nucleico recombinante e/ou com o vetor da invenção. Por exemplo, tal transformação pode ser útil para propagação e manutenção dos ditos ácido nucleico ou vetores.

Alternativamente ou em adição, e, vantajosamente, uma célula hospedeiro transformada será capaz de transcrever a(s) estrutura(s) de leitu- ra aberta do ácido nucleico da invenção usando os promotores da invenção e, de preferência, expressando os produtos de expressão, de preferência um ou mais polipeptídeos, codificados pelas ditas estruturas de leitura aberta.

Então, em um aspecto adicional, a invenção provê o uso de áci- 25 do nucleico recombinante ou vetor da invenção para conseguir expressão de produtos de expressão, de preferência um ou mais polipeptídeos, codifica- dos pelas ditas estruturas de leitura aberta, em uma célula hospedeiro. De preferência, os produtos de expressão, por exemplo, polipeptídeos, podem ser heterólogos, isto é, exógenos, à dita célula hospedeiro.

De preferência, uma célula hospedeiro será uma célula procarió-

tica, por exemplo, uma célula bacteriana, com mais preferência uma bactéria não-patogênica e/ou não-invasiva, com mais preferência ainda uma bactéria Gram-positiva, com mais preferência ainda uma bactéria do ácido láctico (por exemplo, Lactococcus spp., Streptococcus spp., Lactobacillus spp., Leuconostoc spp., Pediococcus spp., Brevibacterium spp., Propionibacterium spp ou Bifidobacterium spp.), com muita preferência uma bactéria Lactococ- 5 cus e com mais preferência ainda uma bactéria Lactococcus lactis, por e- xemplo, conforme acima definido, enquanto os promotores da invenção fo- rem adequadamente ativos nas ditas células hospedeiro.

O ácido nucleico recombinante ou o vetor da invenção pode es- tar presente na célula hospedeiro extracromossomalmente, de preferência 10 replicando autonomamente usando uma própria origem de replicação, ou pode ser integrado a DNA genômico bacteriano, por exemplo, cromossomo bacteriano, por exemplo, cromossomo de Lactococcus. No último caso, có- pias únicas ou múltiplas do dito ácido nucleico podem ser integradas, de pre- ferência uma cópia única; a integração pode ocorrer em um sítio aleatório do 15 cromossomo ou, conforme acima descrito, em um sítio do mesmo predeter- minado, de preferência em um sítio predeterminado, tal como, em um exem- plo não-limitante preferido, no local de thyA de Lactococcus, por exemplo, Lactococcus lactis, por exemplo, conforme descrito por Steidler e outros, (2003), que é aqui especificamente incorporado a título de referência.

Deste modo, em um aspecto adicional a invenção provê uma

célula hospedeiro compreendendo um ácido nucleico recombinante, confor- me aqui definido, onde o dito promotor (P) está presente no cromossomo da dita célula hospedeiro, e onde o dito promotor (P) está operavelmente ligado a uma ou mais estruturas de leitura aberta heterólogas ao dito promotor (P), 25 com mais preferência, o dito promotor (P) compreende ainda uma seqüência de sinal, de preferência usp45 ou usp45N4, com mais preferência o dito promotor (P) compreende ainda um operador configurado para controlar a transcrição a partir do dito promotor (P), e com mais preferência ainda, o promotor (P) é escolhido do grupo consistindo em ácidos nucleicos mostra- 30 dos nas SEQ ID NOs: 1, 3 a 6, 9, 12, 13, 18, 20 a 22, 24, 26, 28 a 54; 160, 163 a 165, 167, 169, 171 a 180; e homólogos das mesmas, e variantes fun- cionais e fragmentos funcionais dos mesmos. Em um aspecto adicional a invenção provê uma célula hospedei- ro conforme aqui definido, onde as ditas uma ou mais estruturas de leitura aberta codificam um polipeptídeo capaz de elicitar uma resposta terapêutica ou resposta imunogênica em um indivíduo, de preferência em um indivíduo 5 humano ou animal, de preferência as dita umas ou mais estruturas de leitura aberta codificam um antígeno e/ou um polipeptídeo terapeuticamente ativo não-vacinogênico, com mais preferência ainda o dito antígeno é capaz de elicitar uma resposta imune, de preferência uma resposta de tolerância imu- ne, em um indivíduo humano ou animal, e/ou o dito polipeptídeo terapeuti- 10 camente ativo não-vacinogênico é capaz de produzir um efeito terapêutico em um humano ou animal. Em um aspecto preferido adicional, a invenção provê uma célula hospedeiro conforme aqui definido, onde o dito polipeptí- deo terapeuticamente ativo não-vacinogênico é hlL-10, GLP-2, GLP-1, TFF ou hPYY. Em outro aspecto preferido adicional a invenção provê uma célula 15 hospedeiro conforme aqui definido, onde o dito antígeno é capaz de elicitar uma resposta imune e usado como uma vacina em um indivíduo humano ou animal e/ou .

Em uma modalidade preferida adicional a presente invenção re- fere-se a uma célula hospedeiro conforme aqui definido, onde a dita célula hospedeiro compreende:

(a) PdpsA, usp45 e hlL-10 (sAGX0012); PdpsA, usp45N4 e hlL-10;

PpepV, usp45 e hlL-10 (sAGX0018); PpepV, usp45N4 e hlL-10;

PsodA, usp45 e hlL-10 (sAGX0029); PsodA, usp45N4 e hlL-10;

PhlIA, usp45 e hlL-10 (sAGX0037); PhlIA, usp45N4 e hlL-10;

(b) PdpsA, usp45N4 e hTFF1; PdpsA, usp45 e hTFF1;

PpepV, usp45N4 e hTFF1; PpepV, usp45 e hTFF1;

PsodA, usp45N4 e hTFF1; PsodA, usp45 e hTFF1;

PhlIA, usp45N4 e hTFF1 (sAGX0048); PhlIA, usp45 e hTFF1 (SAGX0049);

(c) PdpsA, usp45N4 e hTFF3; PdpsA, usp45 e hTFF3 (sAGX0048);

PpepV, usp45N4 e hTFF3; PpepV, usp45 e hTFF3;

PsodA, usp45N4 e hTFF3; PsodA, usp45 e hTFF3; PhlIA, usp45N4 e hTFF3 (sAGX0057); PhlIA, usp45 e hTFF3;

(d) PdpsA, usp45N4 e hPYY; PdpsA, usp45 e hPYY{sAGX0048); PpepV, usp45N4 e hPYY; PpepV, usp45 e hPYY;

PsodA, usp45N4 e hPYY; PsodA, usp45 e hPYY;

PhlIA, usp45N4 e hPYY (sAGX0057); PhlIA, usp45 e hPYY; Phl-

IA1 usp45 e hPYY G9 (3-36) (sAGX0213);

(e) PdpsA, usp45N4 e GLP-1; PdpsA, usp45 e GLP-1;

PpepV, usp45N4 e GLP-1 ; PpepV, usp45 e GLP-1;

PsodA, usp45N4 e GLP-1; PsodA, usp45 e GLP-1;

PhlIA, usp45N4 e GLP-1; PhlIA, usp45 e GLP-1;

(f) PdpsA, usp45N4 e GLP-2; PdpsA, usp45 e GLP-2;

PpepV, usp45N4 e GLP-2; PpepV, usp45 e GLP-2;

PsodA, usp45N4 e GLP-2; PsodA, usp45 e GLP-2;

PhlIA, usp45N4 e GLP-2; ou PhlIA, usp45 e GLP-2.

Em um aspecto adicional a invenção provê um método para ex-

pressão recombinante de um produto de expressão, de preferência um poli- peptídeo, de interesse compreendendo:

a) cultura da célula hospedeiro compreendendo um ácido nu- cleico recombinante ou vetor da invenção, onde as ditas uma ou mais estru-

turas de leitura aberta codificam o produto de expressão, de preferência po- lipeptídeo, de interesse, e

b) isolamento do produto de expressão, de preferência poli- peptídeo, de interesse produzido pela célula hospedeiro na dita cultura.

Uma pessoa versada geralmente sabe e pode otimizar condi- ções de cultura, por exemplo, temperatura, presença e concentração de nu- trientes necessário, oxigenação, agitação, inoculação, etc, que permitem expressão dos polipeptídeos em células hospedeiro, de preferência células hospedeiro da invenção.

Uma pessoa versada na técnica também sabe e pode otimizar técnicas de purificação para o isolamento dos produtos de expressão tal co- mo, por exemplo, de preferência polipeptídeos, expressos pelas ditas células hospedeiro. Por exemplo, técnicas adequadas de isolamento de proteína podem envolver Iise do organismo hospedeiro (por exemplo, quando o poli- peptídeo acumula intracelularmente) através de, por exemplo, rompimento mecânico ou enzimático de parede celular, e remoção de restos celulares, ou coleta do sobrenadante (por exemplo, quando os polipeptídeos são se- 5 cretados), remoção de componentes não-proteína, tal como DNA e Iipopolis- sacarídeos, precipitação de sulfato de amônio, cromatografia de exclusão de tamanho, por exemplo, para enriquecer a proteína desejada, cromatografia de afinidade, etc.

Em um aspecto adicional, a invenção provê o uso da célula hos- 10 pedeiro transformada com o ácido nucleico recombinante e/ou o vetor da invenção para a fabricação de um medicamento para aplicação de produ- to(s) de expressão, de preferência polipeptídeo(s), codificados pelas uma ou mais estruturas de leitura aberta compreendidas dentro do dito ácido nuclei- co recombinante a um humano ou animal.

Em um aspecto relacionado, a invenção provê um método para

aplicação de um polipeptídeo codificado pelas uma ou mais estruturas de leitura aberta compreendidas dentro do ácido nucleico recombinante da in- venção a humano ou animal com necessidade do mesmo compreendendo administrar ao dito humano ou animal uma quantidade terapeuticamente efi- caz de células hospedeiro transformadas com o dito ácido nucleico e/ou ve- tor da invenção. O animal pode, de preferência, ser um mamífero, tal como, por exemplo, animais domésticos, animais de fazenda, animais de zoológico, animais de esporte, animais de estimação e experimentais tal como cachor- ros, gatos, porquinhos-da-índia, coelhos, ratos, camundongos, cavalos, ga- do, vacas, primatas tal como macaco apes, macacos, orangotangos e chim- panzés; canídeos tal como cachorros e lobos; felídeos tal como gatos, leões e tigres; equídeos tal como cavalos, burros e zebras; animais para alimenta- ção tal como vacas, porcos e ovelha; ungulatos tal como cervos e girafas; roedores tal como camundongos, ratos, hamsters e porquinhos-da-índia; e outros.

I Conforme aqui usado, o termo "tratar" ou "tratamento" refere-se

a ambos os tratamentos terapêutico e profilático ou medidas preventivas, onde o objetivo é prevenir ou deixar mais lenta (menos) uma mudança ou distúrbio fisiológico indesejado. Um "humano ou animal com necessidade de tratamento" inclui os que se beneficiariam de tratamento de uma dada con- dição.

O termo "quantidade terapeuticamente eficaz" refere-se a uma

quantidade de uma substância ou composição terapêutica eficaz para tratar uma doença ou distúrbio em um indivíduo, por exemplo, humano ou animal, isto é, para obter efeito e performance locais ou sistêmicos desejados. A títu- lo de exemplo, uma quantidade terapeuticamente eficaz de bactérias pode 10 compreender pelo menos 1 bactéria, ou pelo menos 10 bactérias ou pelo menos 102 bactérias ou pelo menos 103 bactérias ou pelo menos 104 bacté- rias ou pelo menos 105 bactérias ou pelo menos 106 bactérias ou pelo me- nos 107 bactérias ou pelo menos 108 bactérias ou pelo menos 109 bactérias ou pelo menos 1010 bactérias ou pelo menos 1011 bactérias ou pelo menos 15 1012 bactérias ou pelo menos 1013 bactérias ou pelo menos 1014 bactérias ou pelo menos 1015 ou mais células, por exemplo, bactérias, em uma dose úni- ca ou repetida.

As células hospedeiro da presente invenção podem ser adminis- tradas sozinhas ou em combinação com um ou mais compostos ativos. Os últimos podem ser administrados antes, após ou simultaneamente com a administração das ditas células hospedeiro.

Várias revelações da técnica anterior sobre aplicação de antíge- nos e/ou polipeptídeos terapeuticamente ativos existem, e deve ser compre- endido que tais revelações podem ser vantajosamente modificadas com os 25 promotores fortes da presente invenção. A título de exemplo e não-limitação, aplicação bacteriana de interleucinas, em particular IL-10, para tratamento de colite (por exemplo, vide WO 00/23471), aplicação de antígenos como vacinas (por exemplo, WO 97/14806), aplicação de GLP-2 e análogos rela- cionados podem ser usados para tratar doença do intestino curto, doença de 30 Chron, osteoporose e como terapia adjuvante durante quimioterapia para câncer, etc. Ainda, aplicação bacteriana de peptídeos trefoil pode ser usada para tratar doenças do canal alimentar (vide, por exemplo, WO 01/02570). Em particular, o uso de proteínas ou peptídeos trefoil para o tratamento de distúrbios do e dano do canal alimentar, incluindo a boca, esôfago, estôma- go e intestinos grosso e delgado, bem como para a proteção e tratamento de tecidos que ficam por fora ao canal alimentar, é descrito no WO 97/38712 e 5 WO 92/14837. Essas proteínas podem ser usadas ou para tratar lesões nes- sas áreas ou para inibir a formação de lesões. Essas lesões podem ser cau- sadas por: terapia de radiação ou quimioterapia para o tratamento de cân- cer, qualquer outro fármaco incluindo álcool que danifique o canal alimentar, exposição acidental á radiação ou a uma substância cáustica, infecção, um 10 distúrbio digestivo incluindo, mas não-limitado a, dispepsia não-úlcera, gas- trite, úlcera péptica ou duodenal, câncer gástrico, Iinfoma MALT, síndrome de Menetier, doença do refluxo gastro-esofageal, doença de Crohn, colite ulcerativa e colite aguda de origem química, bacteriana ou obscura. Peptí- deos trefoil são particularmente úteis para tratar colite aguda. Aplicações 15 terapêuticas adicionais são pretendidas usando os promotores e células hospedeiro da invenção.

Exemplos não-limitantes adicionais dos tipos de doenças tratá- veis em humanos ou animais através da aplicação de polipeptídeos terapêu- ticos de acordo com a invenção incluem, mas não estão limitados a, por e- 20 xemplo, doença do intestino inflamatória incluindo doença de Chron e colite ulcerativa (tratável com, por exemplo, IL-Ira ou IL-10 ou peptídeos trefoil); doenças autoimunes, incluindo, mas não-limitado a, psoríase, artrite reuma- toide, lúpus eritematoso (tratáveis com, por exemplo, IL-Ira ou IL-10 ou o autoantígeno relevante); doenças alérgicas incluindo, mas não-limitadas a, 25 asma, alergias alimentares (tratáveis com o alérgeno relevante); doença ce- líaca (tratável com alérgenos de glúten); distúrbios neurológicos incluindo, mas não-limitado a, doença de Alzheimer, doença de Parkinson e esclerose amiotrófica lateral (tratáveis com, por exemplo, fator neutrófico derivado do cérebro e fator neutrófico ciliar); câncer (tratável com, por exemplo, fatores 30 de estimulação de colônia IL-1 ou interferon-W); osteoporose (tratável com, por exemplo, fator f3 de crescimento transformante); diabetes (tratável com, por exemplo, insulina); doença cardiovascular (tratável com, por exemplo, ativador de plasminogênio de tecido); aterosclerose (tratável com, por exem- plo, citocinas e antagonistas de citocina); hemofilia (tratável com, por exem- plo, fatores de coagulação); doença do fígado degenerativa (tratável com, por exemplo, fator de crescimento de hepatócito ou interferon a); doenças 5 pulmonares tal como fibrose cística (tratável com, por exemplo, alfa- antitripsina); obesidade; infecções por patógeno, por exemplo, infecções vi- rais ou bacterianas (tratáveis com várias das composições ou antígenos a- cima mencionados); etc.

O leitor versado deve compreender que as doenças aqui especi- ficamente mencionadas são apenas exemplares e sua menção não é de modo algum pretendida confinar o uso dos reagentes providos pela inven- ção, por exemplo, os promotores, ácidos nucleicos, vetores e células hospe- deiro da invenção, a essas doenças particulares. Pelo contrário, um leitor versado compreende que os reagentes da invenção podem ser usados para expressar a princípio quaisquer produtos de expressão, de preferência poli- peptídeos de interesse, que podem ser de relevância terapêutica e não ape- nas os citados, mas também em várias doenças ou condições adicionais de humanos e animais. Consequentemente, uma vez um produto de expressão adequado, de preferência um polipeptídeo, por exemplo, um antígeno e/ou um polipeptídeo terapeuticamente ativo não-vacinogênico, tendo sido esco- lhido ou determinado para um dado alimento, uma pessoa versada seria ca- paz de conseguir sua expressão, isolamento e/ou aplicação usando os rea- gentes da invenção.

A invenção também compreende tratamento de doenças em ou- 25 tros animais incluindo cachorros, cavalos, gatos e aves. Doenças em cachor- ros incluem, mas não estão limitadas a, cinomose canina (paramixovirus), hepatite canina (adenovírus Cav-1), tosse canina ou laringotraqueíte (ade- novírus Cav-2), enterite canina infecciosa (coronavírus) e enterite hemorrá- gica (parvovírus).

Doenças em gatos incluem, mas não estão limitadas a, rinotra-

queíte viral (herpesvírus) doença caliciviral felina (calicivírus), peritonite in- fecciosa felina (parvovírus) e leucemia felina (vírus da leucemia felina). Ou- tras doenças virais em cavalos e aves são também compreendidas como sendo tratáveis usando os métodos e composições da invenção. Para este propósito, o uso de micro-organismos expressando interferons recombinan- tes será particularmente preferido.

Em um aspecto adicional, a invenção então também provê uma

composição farmacêutica compreendendo a célula hospedeiro transformada com o ácido nucleico e/ou o vetor da invenção.

De preferência, tal formulação compreende uma quantidade te- rapeuticamente eficaz das células hospedeiro da invenção e um veículo far- maceuticamente aceitável, isto é, uma ou mais substâncias carreadoras e/ou aditivos farmaceuticamente aceitáveis, por exemplo, tampões, veículos, ex- cipientes, estabilizadores, etc.

O termo "farmaceuticamente aceitável" conforme aqui usado está de acordo com a técnica e significa compatível com os outros ingredien- tes de uma composição farmacêutica e não-prejudicial para o recipiente do mesmo.

As células hospedeiro recombinantes da invenção podem ser suspensas em uma formulação farmacêutica para administração ao humano ou animal tendo a doença a ser tratada. Tais formulações farmacêuticas in- 20 cluem, mas não estão limitadas a, células hospedeiro vivas e um meio ade- quado para administração. As células hospedeiro recombinantes podem ser Iiofilizadas na presença de excipientes comuns tal como lactose, outros açú- cares, estearato alcalino e/ou de metal alcalino, carbonato e/ou sulfato (por exemplo, estearato de magnésio, carbonato de sódio e sulfato de sódio), 25 caulim, sílica, saborizantes e aromas.

Células hospedeiro então Iiofilizadas podem ser preparadas na forma de cápsulas, comprimidos, granulados e pós, cada um dos quais pode ser administrado através da via oral.

Alternativamente, algumas bactérias recombinantes podem ser preparadas como suspensões aquosas em meios adequados, ou bactérias Iiofilizadas podem ser suspensas em um meio adequado um pouco antes do uso, tal meio incluindo os excipientes referidos aqui e outros excipientes tal como glicose, glicina e sacarinato de sódio.

Para administração oral, formas de dosagem orais gastrorresis- tentes podem ser formuladas, formas de dosagem que podem também inclu- ir compostos provendo liberação controlada das células hospedeiro e então 5 prover liberação controlada da proteína desejada codificada nelas. Por e- xemplo, a forma de dosagem oral (incluindo comprimidos, peletes, granula- dos, pós) pode ser revestida com uma camada fina de excipiente (geralmen- te polímeros, derivados celulósicos e/ou materiais lipofílicos) que resistem à dissolução ou rompimento no estômago, mas não no intestino, deste modo 10 permitindo trânsito através do estômago a favor de desintegração, dissolu- ção e absorção no intestino.

A forma de dosagem oral pode ser elaborada para permitir libe- ração lenta das células hospedeiro e da proteína recombinante das mesmas, por exemplo, como comprimidos ou cápsulas de liberação controlada, Iibera- 15 ção sustentada, liberação prolongada, ação sustentada. Essas formas de dosagem geralmente contêm excipientes convencionais e bem conhecidos, tal como excipientes lipofílicos, poliméricos, celulósicos, insolúveis, inchá- veis. Formulações de liberação controlada podem ser também usadas para quaisquer outros sítios de aplicação incluindo aplicação intestinal, colo, bio- 20 adesão ou sublingual (isto é, aplicação mucosal dental) e aplicação bronqui- al. Quando as composições da invenção tiverem que ser administradas re- talmente ou vaginalmente, formulações farmacêuticas podem incluir suposi- tórios e cremes. Neste caso, as células hospedeiro são suspensas em uma mistura de excipientes comuns também incluindo lipídeos. Cada uma das 25 formulações acima mencionadas é bem conhecida na técnica e é descrita, por exemplo, nas referências que seguem. Hansel e outros (1990), Chien (1992), Prescott e outros (1989) e Cazzaniga e outros (1994).

De preferência, uma formulação de enema pode ser usada para administração retal. O termo "enema" é usado para compreender prepara- ções líquidas pretendidas para uso retal. O enema pode ser geralmente for- necido em recipientes de dose única e conter uma ou mais substâncias ati- vas dissolvidas ou dispersas em água, glicerol ou macrogóis ou outros sol- ventes adequados.

Então, de acordo com a invenção, em uma modalidade preferi- da, células hospedeiro recombinantes codificando um gene desejado podem ser administradas ao animal ou humano através de via mucosal, por exem- 5 pio, uma oral, nasal, retal, vaginal ou bronquial através de qualquer uma das formulações do estado da técnica aplicáveis à via específica. Dosagens de células hospedeiro para administração vão variar dependendo de vários fato- res incluindo o tipo de bactéria e o gene codificado desse modo, o tipo e se- veridade da doença a ser tratada e a via de administração a ser usada.

Então, dosagens precisas não podem ser definidas para cada

uma e toda modalidade da invenção, mas serão prontamente aparente à- queles versados na técnica uma vez munidos da presente invenção. A do- sagem poderia ser de qualquer modo determinada de caso para caso atra- vés da medição das concentrações de nível no soro da proteína recombinan- 15 te após administração de números de células predeterminados, usando mé- todos bem conhecidos, tal como aqueles conhecidos como ELISA ou Biaco- re (vide exemplos). A análise do perfil cinético e meia-vida da proteína re- combinante aplicada provê informação suficiente para permitir a determina- ção de uma faixa de dosagem eficaz para as células hospedeiro transforma- 20 das.

Em uma modalidade, quando as células hospedeiro expressam um antígeno, a invenção pode então também prover uma vacina.

O termo "vacina" identifica uma composição farmaceuticamente aceitável que, quando administrada em uma quantidade eficaz a um indiví- duo animal ou humano, é capaz de induzir anticorpos para um imunógeno compreendido na vacina e/ou elicita imunidade protetora no indivíduo.

A vacina da invenção compreenderia as células hospedeiro transformadas com os ácidos nucleicos ou vetores da invenção e ainda op- cionalmente um excipiente. Tais vacinas podem também compreender um 30 adjuvante, isto é, um composto ou composição que melhora a resposta imu- ne a um antígeno. Adjuvantes incluem, mas não estão limitados a, adjuvante de Freund completo, adjuvante de Freund incompleto, saponina, géis mine- rais tal como hidróxido de alumínio, substâncias tensoativas tal como Iisole- citina, polióis pluronic, poliânions, peptídeos, óleo ou emulsões hidrocarbo- no, e adjuvantes humanos farmaceuticamente aceitáveis potencialmente úteis tal como BCG (bacille Calmetle-Guerin) e Corynebacterium parvum.

Em modalidades preferidas adicionais a presente invenção refe-

re-se ao uso de uma célula hospedeiro conforme aqui definido para a fabri- cação de um medicamento para aplicação de um polipeptídeo codificado pelas ditas uma ou mais estruturas de leitura aberta do ácido nucleico re- combinante a um humano ou animal, de preferência o dito polipeptídeo é um

antígeno e/ou um polipeptídeo terapeuticamente ativo não-vacinogênico, de preferência hlL-10, GLP-2, TFF ou hPYY conforme acima definido. A presen- te invenção refere-se ainda a uma composição farmacêutica compreenden- do a célula hospedeiro conforme definido aqui. Ainda, a presente invenção refere-se a uma célula hospedeiro conforme definido aqui, para uso como

um medicamento.

A invenção é ilustrada mais com exemplos que não devem ser considerados limitantes.

EXEMPLOS

Materiais usados nos exemplos

GM17 - Caldo M17 (Oxoid CM0817) preparado de acordo com as ins- truções do fabricante com sem adição de quaisquer açúcares

- Glicose 20% (Merck 1.08337) esterilizada através de filtragem (Stericup-GV 0,22 μιτι PVDF Millipore CGVU05RE).

- Caldo GM17: M17 suplementado com glicose 0,5%.

GM17T é GM17 suplementado com 200 μΜ de timidina (Sigma

NO.T9250)

GM17E é GM17, suplementado com 5 μg/ml de eritromicina (Sigma No.E6376) através de diluição a partir de 25 mg/ml de eritro- micina em solução estoque de etanol 96%.

BM9 - Casiton 10% (Difco 225930) autoclave por 15 minutos a

121°C

- NaHCO3 0,5M (Merck 1.06329) esterilizado através de filtra- 10

15

guem:

20

ΒΜ9Τ

ΒΜ9Ε

25

ELISA

IL10

30

TFF-1

gem (Stericup-GV 0,22 prn PVDF Millipore CGVU05RE).

- Na2CO3 0,5M (Merck 1.06392) esterilizado através de filtra- gem (Stericup-GV 0,22 pm PVDF Millipore CGVU05RE).

- MgSO4 1M (Merck 1.05886) autoclave por 15 minutos a 121° C.

- CaCl2 100 mM (Merck 1.02382) autoclave por 15 minutos a 121° C.

- Sais 10xM9 (Difco 248510) autoclave por 15 minutos a 121° C. Diluir 10x em água estéril para obter sais M9.

- BM9 10 ml: adicionar componentes diferentes na mesma or- dem que a descrita abaixo.

* 1 ml de sais 10x M9

* 500 μΙ de casiton 10%

* 250 μΙ de glicose 20%

* 7,75 ml de água

* 500 μΙ de NaHCO3 0,5M

* 500 ml de Na2CO3 0,5M

Misturar apropriadamente e adicionar os componentes que se-

*20 μΙ de MgSO4IM *10μΜβ CaCI2IOO mM

é BM9 suplementado com 200 μΜ de timidina (Sigma No. T9250)

é BM9, suplementado com 5 μg/ml de eritromicina (Sigma No. E6376) através de diluição a partir de 25 mg/ml de eritromici- na em solução de estoque de etanol 96%.

- Estojo BD OptEIA Human IL-10 ELISA II; No. Cat. 550613; BD Biosciences;

www.bdbiosciences.com

- ELISA sanduíche

- anticorpo de revestimento: anticorpo monoclonal de camun- dongo TFF1 (Μ02), clone 3H5 (Abnova No. Cat. H00007031- M02)

- anticorpo de detecção: anti-hTFF1 de coelho policlonal (Al- pha Diagnostics No. Cat.: TFF12-A; www.4adi.com)

- conjugado: anti-coelho-HRP (Southern Biotech No. Cat.: 4050-05; www.southernbiotech.com)

- substrato: TMB TFF-3 ELISA sanduíche

- anticorpo de revestimento: anticorpo monoclonal de eamun- dongo 4408 contra TFF-3 (R&D Systems No. Cat.: MAB4408; www.rndsystems.co)

- anticorpo de detecção: monoclonal de camundongo biotini- Iado "em casa" 15C6 contra TFF-3 (Calbiochem No. Cat.: 585350; www.calbiochem.com)

- conjugado: Streptavidina-HRP (No. Cat.: 554066; BD Biosci- ences; www.bdbiosciences.com)

- substrato: TMB

PYY Estojo comercial: Total Peptide YY (PYY) ELISA; No. Cat.:

DSL-10-33600; Diagnostic System Laboratories, Inc.; www.dslabs.com

GLP-1 Estojo comercial: Estojo Glucagon-Iike Peptide-1 (Active) ELI-

SA: No. Cat.: EGLP-35K; Linco Research; www.millipore.com Exemplo 1 Isolamento de promotores fortes a partir de Lactococcus lactis

Proteínas fortemente expressas foram identificadas em Lacto- coccus lactis ssp. lactis MG1363 usando o método de Antelmann e outros (2000).

Rapidamente, proteínas altamente expressas foram identificadas através de pontos de proteína abundantes em um gel 1D (Figura 2). As fai- xas de proteína indicadas foram digeridas com tripsina e as misturas de pep- tídeo foram analisadas em modo LC-MS/MS no espectrômetro de massa de aprisionamento de íon (Esquire HCT, Bruker). Os espectros (apenas espec- tros 250 MS/MS por rodada foram mantidos para análise de dados) foram analisados através de MASCOT com o banco de dados de proteínas de Lac- tococcus lactis subsp. cremoris sk11 (Genbank NC_008527). Peptídeos com um escore Mascot acima do escore limiar de identidade são identificados 5 com uma probabilidade de 95%. Quanto mais peptídeos derivados da mes- ma proteína, mais confiável é a identificação.

Esta análise produziu uma lista de proteínas altamente abundan- tes e os genes correspondentes (Tabela 1 acima e Figura 1). Com base nis- so, a requerente identificou e isolou seqüências a montante dos genes indi- cados (SEQ ID NOs.: 1 a 54 e 157 a 180) com suas próprias seqüências Shine Dalgarno (SD). Para a maioria dos promotores, isto foi feito através de PCR em DNA cromossomal de Lactococcus lactis MG1363. A título de e- xemplo, primers usados para amplificar seqüências de promotores corres- pondendo aos genes listados sob 1) a 30) acima são mostrados na Tabela 2. Da mesma maneira, primers adequados podem ser selecionados com base na informação genômica disponível para promotores correspondendo a ge- nes listados sob 31) a 53) acima. Promotores para eno, tbp e IacE foram também sintetizados, usando oligonucleotídeos (oligos na Tabela 3). Exemplo 2 Atividade promotora Uma estratégia foi concebida que permitiu a subclonagem dos

vários promotores em frente ao gene da IL-10 secretável (Figura 3). A sub- clonagem foi realizada de uma maneira que os cassetes de expressão de hlL-10 fossem flanqueados pelas seqüências-alvo. Esta estrutura permite recombinação homóloga dupla em torno do gene da thyA e então integração 25 cromossomal, essencialmente conforme descrito em Steidler e outros, 2003, supra, e WO 02/090551.

Esquematicamente, a estratégia é mostrada com referência à

Figura 3.

A) Usando primers apropriados, promotores são isolados atra- vés de PCR a partir de DNA cromossomal de MG1363 de L lactis; B) pro- motores são ligados a regiões de flanqueamento relevantes (região-alvo a montante parcial, hlL-10 parcial) através de PCR de anelamento; CeD) produtos ligados são subclonados em um plasmídeo condicionalmente não- replicativo usando sítios de endonuclease de restrição apropriadamente po- sicionados (Ncol + Afllll ou alternativamente Ncol + BstEIII). Isto completa ambas a região alvo a montante e a hlL-10. E) construtos de promotor são 5 introduzidos em MG1363 de L. lactis através de recombinação a montante e a jusante consecutiva. Integração cromossomal é realizada através de um procedimento de duas etapas. Seguindo introdução do plasmídeo não- replicativo na linhagem de origem de MG1363 de L. lactis, uma primeira re- combinação homóloga na seqüência-alvo ou a jusante ou a montante pode 10 ser selecionada em meios seletivos contendo eritromicina. A segunda re- combinação homóloga no alvo alternativo é avaliada através da ausência de thyA. F) Estrutura cromossomal final onde thyA é substituída por hlL-10.

Transgenes cromossomalmente integrados são avaliados quan- to a níveis de expressão de hlL-10 secretável (isto é, hlL-10 provida em es- 15 trutura com uma seqüência de sinal de secreção de Lactococcus, por exem- plo, usp45 ou similar) em referência a outras linhagens de Lactococcus es- sencialmente como em Steidler e outros (2003); Self-containing Lactococcus strain WO 02/090551 e rapidamente descrito aqui: as várias linhagens de Lactococcus lactis são postas em tiras para colônia única e uma pré-cultura 20 é preparada através de inoculação de 1 colônia em GM17 (M17, Oxoid, Hampshire, UK1 suplementado com glicose 0,5%) e incubação por 16 horas a 30°C. Essas pré-culturas são inoculadas 1/25 em 5 ml de GM e incubadas por 4 horas a 30°C. As células são coletadas através de centrifugação e res- suspensas em 5 ml de BM9 fresco (composição na Tabela 4). Essas sus- 25 pensões celulares são incubadas por 3 horas a 30°C. As células bacterianas são removidas através de centrifugação e sobrenadantes são transferidos para tubos frescos. O teor de hlL-10 dos sobrenadantes é determinado atra- vés de ELISA e as proteínas de hlL-10 são visualizadas analisando o equi- valente de 1 ml de cultura através de western blot.

Mesmo após repetidas tentativas e estratégias de clonagem dife-

rentes não foi possível subclonar várias seqüências promotoras. As seqüên- cias promotoras subclonadas com sucesso são sumarizadas na Tabela 12. Exemplo 3 Resistência do promotor

Após identificar vários promotores, a requerente testou vários construtos de promotor em uma séria adicional de experimentos. Além disso, a fim de estabelecer se a atividade promotora é independente do gene re- pórter, a requerente elaborou construtos repórteres compreendendo o gene de GLP-2.

O gene proglucagon humano (No. Ace. GenBank NM_002054) codifica uma pré-proteína que é clivada em quatro peptídeos maduros distin- tos, incluindo peptídeo-2 tipo glucagon (GLP-2). A requerente elaborou um 10 gene para h[Gly2]GLP-2 codificado no uso de códon preferencial de L. lactis. Este gene codifica um análogo de GLP-2 humano maduro com uma substitu- ição de alanina por glicina na posição 2, que foi mostrada reduzir a suscepti- bilidade à degradação pela dipeptidil peptidase-IV (Booth e outros, 2004). O gene sintético foi montado usando metodologia do estado da técnica essen- 15 cialmente conforme descrito por Stemmer e outros (1995), que é aqui incor- porado a título de referência.

O fragmento resultante foi fundido ao sinal de secreção de usp45 (van Asseldonk e outros, 1990). O construto de fusão foi posto a ju- sante de uma série de promotores Iactococcais: P1 (Waterfield e outros, 20 1995), PthyA (promotor da timidilato sintase) e PhIIA (promotor da proteína de ligação de DNA de nucleoide bacteriano/proteína de ligação de DNA HU; SEQ ID NO.28).

Esta estratégia deu fragmentos que poderiam ser subclonados como EcoRI-XbaI para P1 (pT1GLP2) ou fragmentos EcoRI-SpeI (todos os outros construtos) no pT1NX de plasmídeo aberto por EcoRI-SpeI (Steidler e outros, 1998; Figura 4).

Uma visão geral dos vários plasmídeo é dada na Tabela 5. To- dos os plasmídeos foram verificados na seqüência após o que eles foram transformados em MG1363 de L lactis usando o método de Gasson (1983). Expressão e secreção de GLP-2 foram documentadas em extra-

tos de proteína das várias linhagens obtidas em paralelo. Em suma, culturas saturadas foram diluídas 25 vezes, cultivadas em um meio de crescimento adequadamente tamponado e coletadas no final da fase log. Equivalentes de

1 ml de cultura foram carregados em SDS-PAGE e analisados através de western blot. GLP-2 foi detectado através de immunobloting com um anticor- po anti-GLP-2 de coelho policlonal (Abcam, Cambridge, UK). O anticorpo 5 secundário era um IgG anticoelho de cabra (Southern Biotechnology Associ- ates, Birmingham, AL) acoplado à fosfatase alcalina. Atividade enzimática foi revelada com substrato NBT/BCIP (Roche Diagnostics, Basel, Suíça).

A partir dos dados da requerente pode ser concluído que o pro- motor PhIIA é extremamente forte.

Exemplo 4 Influência da seqüência de sinal

A fim de controlar os níveis de expressão, incluindo produção e secreção, a requerente construiu uma séria de mutantes de usp45, que fo- ram primeiro testados em conjunto com o promotor PhIIA de 28). Surpreen- dentemente, um mutante de usp45 por meio do que Iisina na posição 4 foi 15 trocada por asparagina (uspA5 N4), resultou em produção e secreção de h[Gly2]GLP-2 drasticamente aumentada (PhllAN4GLP2) com relação à ex- pressão direcionada a promotor de thyA e promotor P1 (Figura 5A). Além disso, esses transformantes era excessivamente estáveis. O construto inte- grado ao genoma de L lactis dá também produção e secreção substancial- 20 mente aumentadas. Expressão do construto repórter em Lactobacillus casei dá essencialmente os mesmos resultados que em L. lactis.

Em seguida, a requerente introduziu esta mutação em usp45 a montante do promotor P1e do promotor da thyA, gerando os plasmídeos pT1N4GLP2 e pThyAN4GLP2, respectivamente. Surpreendentemente, a 25 mutação teve pouco efeito sobre produção de h[Gly2/GLP-1 regulada pelo promotor P1, mas aboliu completamente produção de h[Gly2-GLP-2 sob controle transcripcional do promotor da thyA (Figura 5B).

A partir desses dados é óbvio que o promotor PhIIA em conjunto com a seqüência de sinal uspN4 é muitíssimo bem adequado para controle de expressão de genes.

Exemplo 5 Resistência do promotor testada através de expressão de interleucina-10 humana (hlL-10) A requerente testou vários construtos de promotor em uma série de experimentos. Além disso, a fim de estabelecer se a atividade promotora é independente do gene repórter, a requerente elaborou construtos repórte- res onde cassetes de expressão foram gerados que continham os promoto- 5 res sob investigação, em frente ao sinal de secreção de usp45 (van Assel- donk e outros, 1990) fundidos a um gene de hlL-10 sintético (vide também Exemplo 2). Neste caso, o construto de fusão foi posto a jusante de uma série de promotores Iactococcais: PthyA (promotor da timidilato sintase, li- nhagem sAGX0005 e Thy 12), promotor da PdpsA (proteína tipo ferritina de 10 ligação a DNA, SEQ ID NO:3, SAGX0012), PpepV (promotor da dipeptidase Xaa-His SEQ ID NO: 158, Linhagem SAGX0018), PsodA (promotor da supe- róxido dismutase, SEQ ID N0:20 SAGX0029) e PhIIA (promotor da proteína de ligação a DNA de nucleoide bacteriano / proteína de ligação de DNA HU; SEQ ID NO:28, linhagem sAGX0037).

Todos os cassetes de expressão foram integrados no Ioeus de

thyA do cromossomo de MG1363 de L. lactis através de recombinação ho- móloga dupla, com o que o gene da thyA foi removido (uma estratégia simi- lar a uma aplicada para a construção de Thy12 (Steidler e outros, 2003) mas sem fazer uso do plasmídeo auxiliar pVE6007, conforme mostrado na Figura 20 3. Isto faz com que todas as seqüências de DNA fora dos cassetes de ex- pressão de hlL-10 sejam idênticas. Uma visão geral da estrutura e posição dos cassetes de expressão de hlL-10 nas várias linhagens é dada na Figura 6. Os cassetes de expressão de hlL-10 (promotor, sinal de secreção de usp45, hlL-10) das linhagens descritas aqui tiveram a seqüência verificada. 25 As várias linhagens testadas foram separadas em tiras para co-

lônia única em placas GM17T de ágar sólido. Colônias únicas foram inocula- das em GM17T e cultivadas da noite para o dia para saturação. Diluições apropriadas dessas culturas foram pré-cultivadas por 4 horas em GM17T. Bactérias foram coletadas através de centrifugação e incubadas mais por 3 30 horas em meio de cultura tamponado (BM9T). As bactérias foram removidas através de centrifugação e deste sobrenadante limpo, amostras foram cole- tadas para análise. Amostras foram analisadas através de ELISA específico para hlL-10. Níveis de expressão são dados na Figura 7. Todos os dados são fornecidos como as médias de três medições individuais. Resistência de promotor relativa é dada na Tabela 6.

Para excluir o impacto de características de cultivo diferentes 5 entre as linhagens, a requerente determinou unidades de formação de colô- nia (CFU) no final de um experimento de expressão conforme acima descrito e calculou a produção de hlL-10 por 109 CFU para as várias linhagens. Este experimento mostra que quaisquer taxas de cultivo substancialmente dife- rentes são observadas e que, conforme julgado a partir da expressão de hlL- 10 10, PhIIA é aproximadamente 4x mais forte do que PthyA (Figura 8 e Tabela 7).

A partir dos dados da requerente pode ser concluído que PdpsA, PpepV, PsodA e PhIIA são extremamente fortes e muito competentes para direcionamento da expressão de genes heterólogos.

Exemplo 6 Resistência do promotor testada através da expressão do fator trefoil humano (TFF)

Após identificação de promotores potencialmente fortes, a re- querente testou vários construtos de promotor em uma série adicional de experimento. Além disso, a fim de estabelecer se a atividade do promotor é 20 independente do gene repórter, a requerente elaborou construtos repórteres onde cassetes de expressão foram gerados que continham os promotores sob investigação, em frente ao sinal de secreção de usp45 do tipo selvagem (wt) (van Asseldonk e outros, 1990) ou mutante do mesmo (mut; incluindo Usp45 N4 onde Iisina na posição 4 foi substituída por asparagina) fundidos a 25 um gene de hTFF1 ou hTFF3 sintético. Os construtos de fusão foram postos a jusante de uma série de promotores Iactococcais: PthyA (promotor da timi- dilato sintase, linhagens sAGX0041 e SAGX0043), promotor da PdpsA (pro- teína tipo ferritina de ligação a DNA, SEQ ID NO:3, linhagem SAGX0059) e PhIIA (promotor da proteína de ligação a DNA de nucleoide bacteriano / pro- 30 teína de ligação de DNA HU; SEQ ID NO:28, linhagens SAGX0048, sAGX0049 e sAGX0057). Todos os cassetes de expressão foram integrados no Ioeus de thyA do cromossomo de MG 1363 de L. lactis através de recom- binação homóloga dupla, com o que o gene da thyA foi removido (uma estra- tégia similar a uma aplicada para a construção de Thy12 (Steidler e outros, 2003) mas sem fazer uso do plasmídeo auxiliar pVE6007, conforme mostra- do na Figura 3. Isto faz com que todas as seqüências de DNA fora dos cas- 5 setes de expressão de TFF sejam idênticas. Uma visão geral da estrutura e posição dos cassetes de expressão de TFF nas várias linhagens é dada na Figura 9 e na Tabela 8. Os cassetes de expressão de TFF (promotor, sinal de secreção TFF) das linhagens descritas aqui tiveram a seqüência verifica- da.

As várias linhagens testadas foram separadas em tiras para co-

lônia única em placas GM17T de ágar sólido. Colônias únicas foram inocula- das em GM17T e cultivadas da noite para o dia para saturação. Diluições apropriadas dessas culturas foram pré-cultivadas por 4 horas em GM17T. Bactérias foram coletadas através de centrifugação e incubadas mais por 3 15 horas em meio de cultura tamponado (BM9T). As bactérias foram removidas através de centrifugação e deste sobrenadante limpo, amostras foram cole- tadas para análise. Amostras foram analisadas através de ELISA específico para hTFF. Níveis de expressão são dados na Figura 10. Amostras de linha- gens expressando hTFF1 foram também analisadas através de western blot 20 específico para hTFF1. Todos os dados são fornecidos como as médias de três medições individuais. Resistência de promotor relativa é dada na Tabela 8.

De acordo com o Exemplo 4, os dados na Figura 10 mostram que o mutante de Usp45 N4 não é responsável por uma expressão aperfei- çoada de hTFF3 por SAGX0057, mas provê um nível adicional de expressão de controle.

Os PdpsA, PpepV e PsodA postos em frente aos construtos de expressão hTFF1 e hTFF3 mostram também expressão aperfeiçoada com relação a PhtyA.

A partir dos dados da requerente pode ser concluído que PdpsA,

PpepV, PsodA e PhIIA são extremamente fortes e muito competentes para direcionar expressão de genes heterólogos. Exemplo 7 Resistência de promotor testada através da expressão de amino ácidos 3-36 de variante Gly9 de peptídeo YY humano (hPYY G9 (3-36))

Após identificação de promotores potencialmente fortes, foram testados vários construtos de promotor em uma série de experimentos adi- cionais. Além disso, a fim de estabelecer se a atividade do promotor é inde- pendente do gene repórter, a requerente elaborou construtos repórteres on- de cassetes de expressão foram gerados que continham os promotores sob investigação, em frente ao sinal de secreção de usp45 (van Asseldonk e ou- tros, 1990) fundidos a um gene de hPYY G9 (3-36) sintético. O construto de fusão foi posto a jusante de uma série de promotores Iactococcais: P1 (Wa- terfield e outros, 1995) (plasmídeo pAGX0211); PthyA (promotor da timidilato sintase, plasmídeo pAGX0212) e PhIIA (promotor da proteína de ligação a DNA de nucleoide bacteriano / proteína de ligação de DNA HU; SEQ ID NO:28, plasmídeo pAGX0213). Todos os cassetes de expressão foram inse- ridos como fragmentos EcoRI-SpeI no plasmídeo pT1NX (Schotte e outros, 2000). Isto faz com que todas as seqüências de DNA fora dos cassetes de expressão, incluindo origem de replicação e resistência à eritromicina, sejam idênticas para os plasmídeos acima. Uma visão geral da estrutura dos vários plasmídeos de expressão é dada na Figura 12 e na Tabela 9. Os cassetes de expressão de h PYY (promotor; sinal de secreção de usp45, PYY) das linhagens descritas aqui tiveram seqüência verificada.

O vetor de expressão vazio pT1NX bem como todos os plasmí- deos de expressão de hPYY G9 (3-36) foram transformados para MG1363 25 de L. lactis. As linhagens resultantes foram separadas em tiras para colônia única em placas GM17T de ágar sólido. Colônias únicas foram inoculadas em GM17T e cultivadas da noite para o dia para saturação. Diluições apro- priadas dessas culturas foram pré-cultivadas por 4 horas em GM17E. Bacté- rias foram coletadas através de centrifugação e incubadas mais por 3 horas 30 em meio de cultura tamponado (BM9E). As bactérias foram removidas atra- vés de centrifugação e deste sobrenadante limpo amostras foram coletadas para análise. Amostras foram analisadas através de ELISA específico para hPYY. Níveis de expressão são dados na Figura 13. Resistência de promo- tor relativa é dada na Tabela 9.

Os PdpsA, PpepV e PsodA postos em frente ao sinal de secre- ção de usp45 (van Asseldonk e outros, 1990) fundidos a um gene de hPYY G9 (3-36) sintético, mostra também expressão aperfeiçoada com relação à expressão direcionada por PthyA.

A partir dos dados da requerente pode ser concluído que PdpsA, PpepV, PsodA e PhIIA são extremamente fortes e muito competentes para direcionamento da expressão de genes heterólogos.

Exemplo 8 Resistência do promotor testada através da expressão de amino ácidos 7-36 de variante Gly8 de peptídeo-1 tipo glucagon huma- no (hGLP-1 G8 (7-36))

Após identificar promotores potencialmente fortes, a requerente testou vários construtos de promotor em uma série adicional de experimen- tos. Além disso, a fim de estabelecer se a atividade do promotor é indepen- dente do gene repórter, a requerente elaborou construtos repórteres onde cassetes de expressão foram gerados que continham os promotores sob investigação, em frente ao sinal de secreção de usp45 (van Asseldonk e ou- tros, 1990) fundidos a um gene de hGLP-1 G8 (7-36) sintético. A variante Gly8 de GLP-1 mostra susceptibilidade reduzida com relação à clivagem proteolítica pela dipeptidil peptidase Vl (Deacon e outros, 1998). O construto de fusão foi posto a jusante dos dois promotores Iactococcais: PthyA (pro- motor da timidilato sintase, plasmídeo pAGX0233) e PhIIA (promotor da pro- teína de ligação de DNA de nucleoide bacteriano / proteína de ligação de DNA HU; SEQ ID NO:28, plasmídeo pAGX0234). Todos os cassetes de ex- pressão foram inseridos como fragmentos EcoRI-SpeI no plasmídeo pT1NX (Schotte e outros, 2000). Isto faz com que todas as seqüências de DNA fora dos cassetes de expressão, incluindo origem de replicação e resistência à eritromicina, sejam idênticas para os plasmídeos acima. Uma visão geral da estrutura dos vários plasmídeos de expressão é dada na Figura 14 e na Ta- bela 10. Os cassetes de expressão de Gly8 de GLP-1 (promotor; sinal de secreção de usp45, GLP-1 Gly8) das linhagens descritas aqui tiveram se- quência verificada. O vetor de expressão vazio pT1NX bem como todos os plasmídeos de expressão de G8h deGLP-1 (7-36) foram transformados para MG1363 de L. lactis. As linhagens resultantes foram separadas em tiras para colônia única em placas GM17E de ágar sólido. Colônias únicas foram ino- 5 culadas em GM17E e cultivadas da noite para o dia para saturação. Dilui- ções apropriadas dessas culturas foram pré-cultivadas por 4 horas em GM17E. Bactérias foram coletadas através de centrifugação e incubadas mais por 3 horas em meio de cultura tamponado (BM9E). As bactérias foram removidas através de centrifugação e deste sobrenadante limpo amostras 10 foram coletadas para análise. Amostras foram analisadas através de ELISA específico para hGLP-1. Níveis de expressão são dados na Figura 15. Re- sistência de promotor relativa é dada na Tabela 10.

Exemplo 9 Resistência do promotor testada através de expressão de interleucina-10 humana (hlL-10)

A requerente testou vários construtos de promotor em uma série

adicional de experimentos. Além disso, a fim de estabelecer se a atividade do promotor é independente do gene repórter, a requerente construiu cons- trutos repórteres onde cassetes de expressão foram gerados que continham os promotores sob investigação, em frente ao sinal de secreção de usp45 20 (van Asseldonk e outros, 1990) fundidos a um gene de hlL-10 sintético. O construto de fusão foi posto a jusante de uma série de promotores Iactococ- cais (Figura 16 e Tabela 11).

Todos os cassetes de expressão foram integrados no Iocus de thyA do cromossomo de MG1363 de L lactis através de recombinação ho- 25 móloga dupla, com o que o gene da thyA foi removido (uma estratégia simi- lar a uma aplicada para a construção de Thy12 (Steidler e outros, 2003) mas sem fazer uso do plasmídeo auxiliar pVE6007). Isto faz com que todas as seqüências de DNA fora dos cassetes de expressão de hlL-10 sejam idênti- cas. Uma visão geral da estrutura e da posição dos cassetes de expressão 30 de hlL-10 presentes nas várias linhagens (geralmente chamadas

I "sAGXOOxx") é mostrada na Figura 16. Os cassetes de expressão de hlL-10 (promotor, sinal de secreção de usp45, hlL-10) das linhagens descritas aqui tiveram seqüência verificada.

As várias linhagens testadas foram separadas em tiras para co- lônia única em placas GM17T de ágar sólido. Colônias únicas foram inocula- das em GM17T e cultivadas da noite para o dia para saturação. Diluições 5 apropriadas dessas culturas foram pré-cultivadas por 4 horas em GM17T. Bactérias foram coletadas através de centrifugação e incubadas mais por 3 horas em meio de cultura tamponado (BM9T). As bactérias foram removidas através de centrifugação e deste sobrenadante limpo amostras foram cole- tadas para análise. Amostras foram analisadas através de ELISA específico 10 para hlL-10. Níveis de expressão são dados na Figura 17. Todos os dados são fornecidos como as médias de três medições individuais. Resistência de promotor relativa é dada na Tabela 11.

Em contraste com análise proteômica e transcriptoma projetada, a resistência e competência de um promotor particular direcionando a ex- pressão de genes heterólogos permaneceram inesperadas. Tabela 1 Número GeneID GeneID Proteína correspondente conforme explicado em MG1363 Nome do gene Nome do Seqüência de pro¬ do Gene MG 1363 SK11 MG1363 gene SK11 motor exemplar (SEQ ID NO) 1) 4798573 4432638 polimerase de RNA direcionada a DNA1 subunidade beta’ / rpoC LACRJ 980 1 subunidade de 160 kD 2) 4798827 4432639 polimerase de RNA direcionada a DNA, subunidade beta / rpoB rpoB 2, 157 3) . _ 4798207 4434445 ferritina de ligação de ferro não-heme dpsA LACR 2311 3 4) 4797791 4433214 piruvato cinase pyk LACR 1456 4 5) 4798062 4433965 glutamil -tRNA sintetases gltX gitx 5 6) 4797432 4433058 fosfopiruvato hidratase eno eno 6 7) 4797464 4433379 glutamina sintetase glnA LACR 2512 7 8) 4797312 4433380 repressor de glutamina sintetase glnR LACR 2513 8 9) 4798910 4432071 dipeptidase PepV pepV LACR 0908 9, 158 10) 4797781 4433907 subunidade beta de ATP sintase tipo F0F1 (subunidade atpD LACRJ 933 10 beta ATP sintase F1) 11) 4797899 4433798 3-fosfoglicerato cinase pgk pgk 11 12) 4797877 4432135 gliceraldeido-3-fosfato desidrogenase gapB LACR 2555 12, 159 13) 4798785 4432332 acetato cinase ackA1 LACR 2295 13, 160 14) 4796577 4432366 3-oxoacil-(acil-veículo-proteína) sintase Il fabF LACR 0825 14 15) 4797984 4432365 3-cetoacil-(acil-vefculo-proteína) redutase fabG fabG 15, 161 fabG1 16) 4797865 4434231 polimerase de RNA direcionada a DNA, subunidade alfa / rpoA LACR_2375 16 subunidade de 40 kD 17) 4798484 4432446 Prolina dipeptidase pepQ LACR 1813 17, 162 18) 4798307 4434211 frutose-bifosfato aldolase fbaA LACR 2168 18, 163 19) 4798643 4433237 proteína ribossomal 30S S4 rpsD rpsD 19 20) 4796682 4433052 superóxido dismutase sodA LACR 0458 20 21) 4799037 4433371 proteína ribossomal 30S S12 (rpsL) e proteína ribossomal rpsL rpsL 21, 164 (rpsL) (rPsL) 30S S7 (rpsG / LACR_2596)) rpsG LACR_2596 4797556 4433370 (rpsG) (LACR_2596) 05

05 Tabela 1 continuação Número GeneID GeneID Proteína correspondente conforme explicado em MG1363 Nome do gene Nome do Seqüência de pro¬ do Gene MG1363 SK11 MG1363 gene SK11 motor exemplar (SEQ ID NO) 22) 4799022 4433741 proteína ribossomal 50S L18 (φ/R/ LACR_2385) e proteína rpIR LACR 2385 22, 165 (rpIR) (LACR 2385) ribossomal 30S S5 (rpsE / LACR_2384) e proteína ribos¬ rpsE LACR_2384 4798090 4433740 somal 50S L30/L7E (rpmD) rpmD rpmD (rpsE) (LACR 2384) 4797873 4433739 (rpmD) (rpmD) 23) 4798265 4434424 S-ribosil homocisteinase IuxS LACR 0270 23 24) 4798969 4432986 proteína ribossomal 50S L19 rpIS φ/S 24 25) 4798819 4434232 proteína ribossomal 30S S11 rpsK LACR 2376 25, 168 154) 26) 4797191 4433166 proteína ribossomal 50S L10 rplJ rplJ 26, 169 27) 4797926 4433165 proteína ribossomal 50S L7/L12 rplL LACR 1386 27, 170 28) 4797353 4433712 proteína de ligação de DNA tipo HU hlIA LACR_0525 28 (hup) 29) 4797103 4433888 proteína ribossomal 50S L28 rpmB LACR 0198 29 30) 4797109 4433007 componente IIB do sistema de fosfotransferase ptcB LACR 0465 30, 170 31) 4798114 4432141 subunidade ATP alfa sintase tipo F0F1 atpA LACR 1935 31, 172 32) 4797024 4433016 proteína de ligação de ATP de transporte de ligação de msmK LACR 0474 32, 173 açúcar múltiplo 33) 4798130 4434638 subunidade alfa do componente E1 do complexo de acetoí- pdhA LACR_0051 33, 174 na desidrogenase (acoA) 34) 4797264 4432815 proteína de divisão celular ftsA LACR 2057 34, 175 35) 4798554 4434372 UDP-galactopiranose mutase glfl LACR 0219 35 36) 4796852 4433097 glutamil aminopeptidase pepA LACR 0433 36 37) 4798279 443301 proteína relacionada à desidrogenase prevista Ilmq 0272 LACR 0268 37, 176 38) 4797347 4432587 proteína ribossomal 30S S2 rpsB rpsB 38, 177 39) 4798807 4433762 fator de início de tradução 3 (IF-3) infC LACR 0436 39, 178 Tabela 1 continuação Número GeneID GeneID Proteína correspondente conforme explicado em MG1363 Nome do gene Nome do Seqüência de pro¬ do Gene MG 1363 SK11 MG1363 gene SK11 motor exemplar (SEQ ID NO) 40) 4798524 4433828 proteína ribossomal 50S L4 (φ/D) e proteína ribossomal φ/D φ/D 40, 179 (rplD) (rplD) 50S L23 (rplW) e proteína ribossomal 50S L2 (rplB) φ/W rplW 4798431 4433827 φ/β rplB (rplW) (rplW) 4798645 4433826 (rplB) (rplB) 41) 4797346 4433100 cadeia beta de fenilalanil-tRNA sintetase pheT LACR 0436 41 42) 4799077 4433204 fator de alongamento de transcrição GreA greA LACR_0660 42 43 43) 4796752 4432931 subunidade protease de protease Clp dependente de ATP ClpP ClpP 44 44) 4797213 4433738 proteína ribossomal 50S L15 rplO LACR 2382 45 45) 4798439 4433280 proteína ribossomal 50S L11 rplK rplK 46 46) 4797933 4433743 proteína ribossomal 30S S8 rpsH LACR 2387 47 47) 4797761 4432457 proteína ribossomal 50S L21 rplil rpLU 48 48) 4798259 4433733 proteína ribossomal 30S S13 rpsM rpsM 49 49) 4797839 4433825 proteína ribossomal 30S S19 (rpsS) e proteína ribossomal rpsS rpsS 50 (rpsS) (rpsS) 50S L22 (rplV) e proteína ribossomal 50S L26 (rplP) e ri¬ rplV rplV 4798792 4433824 bossomal 50S rplP rplP (rplV) (rplV) 4798472 4433822 (rplP) (rplP) 4799034 4433748 (rplN) (LACR 2392) 50) 4798419 4433829 proteína ribossomal 30S S10 rpsJ LACR 2402 51 51) 4798582 4433103 cochaperonina GroES groES groES 52, 180 52) 4797891 4433747 proteína ribossomal 50S L24 rplX rplX 53 53) 4797916 4432598 resolvase de junção de Hollyday putativa (MG1363) llmg_0151 LACR 0137 54 Tabela 2

Seqüência do Amplificado com primers Avançado (SEQ ID NO) Reverso (SEQ ID NO:) promotor (SEQ IDNOTabela 1) 1 rGTTCAGAAACTGCCTGATGGATTTTGTAATTAATATTTTGAGATTTATTTACTGAC (55) CATTAAAATAGCTGAGATAATCTTTTTTTTCAATTCTTTCTCCACTTCTAATAAATTTAAC (56) 2 GTTCAGAAACTGCCTGATGGGCTAGATAAGCCTTGAAAATTTC (57) CATTAAAATAGCTGAGATAATCTTTTTTTTCAAGTGTTTTCTCCTCTATTTTTTAG (58) 3 GGTTCAGAAACTGCCTGATGGACTAATCTATACGAAAATTGATTTTGAATG (59) CATTAAAATAGCTGAGATAATCTTTTTTTTCATAACTAACCTCCATTTTTTAAATATTA (60) 4 GTTCAGAAACTGCCTGATGGCTAAGTTACTGCAAATCTGTTTC (61) CATTAAAATAGCTGAGATAATCTTTTTTTTCATTTTGTGTTTTTCTCCTATAATG (62) GTTCAGAAACTGCCTGATGGGATAAATTTCACTGACGCAAGC (63) CATTAAAATAGCTGAGATAATCTTTTTTTTCATTTTAATCCAATTCTCCTCATTG (64) 6 GTTCAGAAACTGCCTGATGGAAATTAAGGATAGATTTTTTCTATCCTTTTTC (65) CATTAAAATAGCTGAGATAATCTTTTTTTTCATTTTAGTCTCCTTATTATTTTTAAGTGCG (66) 7 GTTCAGAAACTGCCTGATGGATTTGGTTGACATAATTTGTCAAG (67) CATTAAAATAGCTGAGATAATCTTTTTTTTCATGCTTTACTCTCCTAGTTAAATTTTC (68) 8 GTTCAGAAACTGCCTGATGGCAAATAAAAAGAACTGATGTGAGAAAATC (69) CATTAAAATAGCTGAGATAATCTTTTTTTTCATAGAGCGTCTTAATTCACG (70) 9 GTTCAGAAACTGCCTGATGGGATATTATCTTTATCCTCCTTATATATAATC (71) CATTAAAATAGCTGAGATAATCTTTTTTTTCATAATCTTCTCCTTGAAGTAG (72) GTTCAGAAACTGCCTGATGGTTACTGTCAAACATTATTCTCAATGTTAC (73) CATTAAAATAGCTGAGATAATCTTTTTTTTCATTTTTAAGCTAATCAGTAAAAATTTAC (74) 11 GTTCAGAAACTGCCTGATGGGTTGCTTAGCAAAGCTC (75) CATTAAAATAGCTGAGATAATCTTTTTTTTCATTTGGAAAAATTCTCCTTATAAG (76) 12 GTTCAGAAACTGCCTGATGGGAATAAAAATTACTGTCAGCCTGC (77) CATTAAAATAGCTGAGATAATCTTTTTTTTCATTAGTAGTTTCCTCCTTATAGGG (78) 13 GTTCAGAAACTGCCTGATGGAAATAAAAAATTATTGGCTAGTCTGTCAG (79) CATTAAAATAGCTGAGATAATCTTTTTTTTCATGTTTAATAAACCTTCCTTGAATTTG (80) 14 GTTCAGAAACTGCCTGATGGATTGCTCATTTATAAATTTTGAAATTAAGAAGG (81) CATTAAAATAGCTGAGATAATCTTTTTTTTCATATTTTTATCCTTCTTAATTTCAAAATTTATAAATG (82) GTTCAGAAACTGCCTGATGGGGAGAAAGGAATTGAGTTCG (83) CATTAAAATAGCTGAGATAATCTTTTTTTTCATTATTTATAAGATGTGAGCCC (84) 16 GTTCAGAAACTGCCTGATGGTTAGTCACTCTTGTCACTAATCAC (85) CATTAAAATAGCTGAGATAATCTTTTTTTTCATGTATGTTCTCCTCTAAAGCG (86) 17 GTTCAGAAACTGCCTGATGGCTATCCTCTTTCTTTTCTTTTTATTCATAG (87) CATTAAAATAGCTGAGATAATCTTTTTTTTCAAAATGGTTCCTCCAATATTAATG (88) 18 GTTCAGAAACTGCCTGATGGGATAAGATTAATAGTTTTAGCTATTAATC (89) CATTAAAATAGCTGAGATAATCTTTTTTTTCATTTCAAAATTCCTCCGAATA (90) 19 GTTCAGAAACTGCCTGATGGGCTTTTCTTGACAAAATAAGGATTTTTG (91) CATTAAAATAGCTGAGATAATCTTTTTTTTCATAATTTATGTCCTCCAAATATTTTATTTG (92) GTTCAGAAACTGCCTGATGGAAATCAAATCATTTGGCAATGATTTC (93) CATTAAAATAGCTGAGATAATCTTTTTTTTCATAGTAATTCTCCTTTTAAGATGTG (94) 21 GTTCAGAAACTGCCTGATGGCTCAAAATATAAGCTTAATCGC (95) CATTAAAATAGCTGAGATAATCTTTTTTTTCATTTTACTGTCTGCTTTTTATATTTTTCC (96) 22 GTTCAGAAACTGCCTGATGGGCGTCGGGCTTGCG (97) CATTAAAATAGCTGAGATAATCTTTTTTTTCACAATTCTACCTCTATATTATTTTAAATTTC (98) 23 GTTCAGAAACTGCCTGATGGCTACAAACGCTTTACTGAAAACG (99) CATTAAAATAGCTGAGATAATCTTTTTTTTCATAAAATATATGATACAAAACTCAGC (100) 24 GTTCAGAAACTGCCTGATGGCAGCATTAAGATAAAGAGTTATGAGC (101) CATTAAAATAGCTGAGATAATCTTTTTTTTCATTTTTTTCTCCTCTTGCCC (102) GTTCAGAAACTGCCTGATGGTAAATCATAAAACCTCTGTCAGAGG (103) CATTAAAATAGCTGAGATAATCTTTTTTTTCAAGCAAAAGTACCTCCTTAAAAATTTC (104) 26 GTTCAGAAACTGCCTGATGGAATAGAAGATATTTTTCAGTAGATATAG (105) CATTAAAATAGCTGAGATAATCTTTTTTTTCATTTTTTTACCTCCATTTTATTTTGG (106) 27 GTTCAGAAACTGCCTGATGGTTATAAGCAACATCACTTATATCGG (107) Cattaaaatagctgagataatcttttttttcattttaatattctcctattaattttttag (108) 28 GTTCAGAAACTGCCTGATGGAAAACGCCTTAAAATGGCATTTTG (10 9) CATTAAAATAGCTGAGATAATCTTTTTTTTCATTTTAGAAATGTCCTCCATTTG (110) 29 GTTCAGAAACTGCCTGATGGCAAAAGCTTGATTTTTTTATTTGAAAAATG (111) CATTAAAATAGCTGAGATAATCTTTTTTTTCATTATATTTACCTCCCATTAGAATTTTTATG (112) GTTCAGAAACTGCCTGATGGTAAATTTGTTCCAAATGAAGAAACAAATA (113) CATTAAAATAGCTGAGATAATCTTTTTTTTCATAATTATTTCTCCTTATTCTTAACG (114) 153 TGGATATTTTTTATAAATCTGG (155) CATGAAATTTTCCTATCTTTTTTAATTC (156) Tabela 3

Sequênda Sintetizado com oligos Oligo (SEQ ID NO) do promotor (SEQID NO na Tabelai) 6 AAATTAAGGATAGATTTTTT (115) ATAATAATGAAAAAGGATAGAAAAAATCTATCCTTAATTT (116) CTATCCTTTTTCATTATTATTCAAATGATAAAATTTCAAA (117) AAAAGGTTTTGCGCTTACATTTTGAAATTTTATCATTTGA (118) ATGTAAGCGCAAAACCTTTTGAAGTTTAGGTTTGCGAAGA (119) AAAGATTTTTCAAGTGAAAATCTTCGCAAACCTAAACTTC (120) TTTTCACTTGAAAAATCTTTCAAAAAATAGTAAAATCAAA (121) GTCTGCACTCTTAATACATCTTTGATTTTACTATTTTTTG (122) GATGTATTAAGAGTGCAGACGCACTTAAAAATAATAAGGAGACTAAAATG (123) CATTTTAGTCTCCTTATTATTTTTAAGTGC (124) 18 AGAGGGTTCAGAAACTGCCTGATGGGATAAGATTAATAGT (125) TTTAGCTATTAATCTTTTTTTATTTTTATTTAAGAATGGC (12 6) TTAATAAAGCGGTTACTTTGGATTTTTGTGAGCTTGGACT (127) AGAAAAAAACTTCACAAAATGCTATACTAGGTAGGTAAAA (128) AAATATTCGGAGGAATTTTGAAATGAAAAAAAAGATTATC (12 9) TCAGCTATTTTAATGTCTAC (130) GTAGACATTAAAATAGCTGAGATAATCTTTTTTTTCATTT (131) CAAAATTCCTCCGAATATTTTTTTACCTACCTAGTATAGC (132) ATTTTGTGAAGTTTTTTTCTAGTCCAAGCTCACAAAAATC (133) CAAAGTAACCGCTTTATTAAGCCATTCTTAAATAAAAATA (134) AAAAAAGATTAATAGCTAAAACTATTAATCTTATCCCATC (135) AGGCAGTTTCTGAACCCTCT (136) GGGTTCAGAAACTGCCTGATGGTAAATTTGTTCCAAATGA (137) AGAAACAAATATTTCAAAATCCTACTATTTGATAGTAGGA (138) TTTTTAATATATTAGTCCAAAAGCTCAAAAAGGCTGATTT (139) AAAGCAGATGAGTAGACTTTTCAATTATTTTGTAAAGCAC (140) TTTCAAAAAAATAGATAACGCTTGCATTATGAAAATGAAA (141) ACGTTATAATTATTTTTATAAAGAACGTTAAATTATAAAA (142) CGTTAAGAATAAGGAGAAATAATTATGAAAAAAAAGATTA (143) TCTCAGCTATTTTAATGTCT (14 4) AGACATTAAAATAGCTGAGATAATCTTTTTTTTCATAATT (145) ATTTCTCCTTATTCTTAACGTTTTATAATTTAACGTTCTT (14 6) TATAAAAATAATTATAACGTTTTCATTTTCATAATGCAAG (147) CGTTATCTATTTTTTTGAAAGTGCTTTACAAAATAATTGA (148) AAAGTCTACTCATCTGCTTTAAATCAGCCTTTTTGAGCTT (149) TTGGACTAATATATTAAAAATCCTACTATCAAATAGTAGG (150) ATTTTGAAATATTTGTTTCTTCATTTGGAACAAATTTACC (151) ATCAGGCAGTTTCTGAACCC (152) Tabela 4: Composição de BM9

No. ml BM9 1000 Sais 10x Md 100 casiton 10% (Difco, BD Biosciences San Jose, CA USA) 50 glicose 20% 25 água 772 NaHCO31M 25 Na2CO31M 25 MgSO41M 2 CaCI2100 mM 1 Sais 10x M9 por litro: 60 g de Na2HP04, 30 g de KH2PO4, 10 g

de NH4CI1 5 g de NaCI. Tabela 5 Visão geral dos vários plasmideos e seus constituintes

A Plasmideos Promotor Líder de Gene Referência Secreção pTREXI P1 - - Wells e outros, 1996 pT1NX P1 usp45 - Steidler e outros, 1998b • pT1GLP2 P1 usp45 h[Gly2]GLP-2 Este trabalho pThyAGLP2 PthyA usp45 h[Gly2]GLP-2 Este trabalho pT1N4GLP2 P1 usp45 N4 h[Gly2]GLP-2 Este trabalho pThyAN4GLP2 PthyA usp45 N4 h[Gly2]GLP-2 Este trabalho phllAN4GLP2 PhIIA usp45 N4 h[Gly2]GLP-2 Este trabalho Tabela 6

Promotor Resistência do promoter relativa Linhagem Referência thyA 1 Thy 12 [2] SAGX0005 este trabalho PdpsA 1,6 SAGX0012 este trabalho PpepV 1,7 SAGX0018 este trabalho PsodA 1,3 SAGX0029 este trabalho PhIIA 3 SAGX0037 este trabalho Resistência relativa dos vários promotores testados conforme avaliado atra-

vés da medição da expressão de hlL-10 das linhagens indicadas. [2]: Stei- 5 dler e outros, 2003.

Tabela 7

Linhagem Cone. média de hlL10 Resistência do Densidadebacteriana

(ng/109 células) promotor relativa (x109CFU/ml)

MG 1363 0 0 4,1

SAGX0005 7,3 1 4,8

SAGX0037 29,1 4 4,2

Resistência do promotor relativa como uma função de unidades de formação

de colônia (CFU).

Tabela 8

Promotor usp45 gene Expressão relativa Linhagem Referência PthyA Wt htFF1 1 SAGX0041 este trabalho PhIIA mut htFF1 2,3 SAGX0049 este trabalho PhIIA Wt htFF1 6,5 SAGX0048 este trabalho PthyA Wt htFF3 1 SAGX0043 este trabalho PdpsA Wt htFF3 1,2 SAGX0059 este trabalho PhIIA mut htFF3 7,5 SAGX0057 este trabalho 10 Visão geral das várias linhagens expressoras de TFF usadas neste estudo e níveis de expressão relativos de TFF secretado das linhagens indicadas. Tabela 9

Plasmídeo Promotor Gene Expressão relativa Referência pT 1NX P1 - 0 [3] PAGX0211 P1 hPYY G9 (3-36) 1 este trabalho PAGX0212 PthyA hPYY G9 (3-36) 1,4 este trabalho PAGX0213 PhIIA hPYY G9 (3-36) 6,3 este trabalho Visão gerai das várias linhagens expressoras de hPYY G9 (3-36) usadas

neste estudo e níveis de expressão relativos de hPYY G9 (3-36) secretado a partir dos plasmideos indicados. Todos os plasmideos estavam presentes em MG1363 de L. lactis. [3]: Schotte e outros, 2000.

Tabela 10

Plasmídeo Promotor Gene Expressão relativa Referência pT1NX P1 - 0 [2] PAGX0233 PthyA GLP-1 G8 (7-36) 1 este trabalho PAGX0234 PhIIA GLP-1 G8 (7-36) 3 este trabalho Visão geral das várias linhagens expressoras de hGLP-1 G8 (7-36) usadas

neste estudo e níveis de expressão relativos de hGLP-1 G8 (7-36) secretado a partir dos plasmideos indicados. Todos os plasmideos estavam presentes em MG1363 de L. lactis. [3]: Schotte e outros, 2000.

Tabela 11

Promotor Linhagem hlL-10 Resistência do pro¬ SEQ Referência (ng/ml) motor relativa ID PthyA SAGX0005 27,74 1.000 153 este trabalho [2] Thy 12 PpepQ SAGX0026 26,39 0,951 17 este trabalho PinfA SAGX0033 16,20 0,584 25 este trabalho Ppgk SAGX0020 14,58 0,526 11 este trabalho PatpD SAGX0019 6,08 0,219 10 este trabalho PrpsD SAGX0028 5,70 0,205 19 este trabalho PIuxS SAGX0031 4,00 0,144 23 este trabalho PgInR SAGX0017 3,03 0,109 8 este trabalho PrpoB SAGX0011 0,59 0,021 2 este trabalho PrpIL SAGX0035 0,50 0,018 27 este trabalho PrpoA SAGX0025 0,24 0,009 16 este trabalho PfabF SAGX0023 0,20 0,007 14 este trabalho PgInA SAGX0016 0,06 0,002 7 este trabalho PfabG SAGX0024 0,02 0,001 15 este trabalho Resistência relativa dos vários promotores conforme avaliado através da medição da expressão de hlL-10 a partir das linhagens indicadas. Tabela 12 Seqüências de promotor subclonadas com sucesso

Linhagem SEQ ID Promotor SAGX0005 153 PthyA s AGXO011 2 PrpoB SAGX0012 3 PdpsA SAGX0016 7 PgInA SAGX0017 8 PgInR SAGX0018 9 PpepV SAGX0019 10 PatpD SAGX0020 11 Ppgk SAGX0023 14 PfabF SAGX0024 15 PfabG SAGX0025 16 PrpoA SAGX0026 17 PpepQ SAGX0028 19 PrpsD SAGX0029 20 PsodA SAGX0031 23 PIuxS SAGX0033 25 PinfA SAGX0035 27 PrpIL SAGX0037 28 PhIIA REFERÊNCIAS

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Claims (35)

1. Ácido nucleico recombinante compreendendo um promotor (P)1 sendo um promotor nativo de uma espécie Lactococcus ou uma variante funcional ou fragmento funcional do mesmo, operavelmente ligado a uma ou mais estruturas de leitura aberta heterólogas para o promotor (P)1 caracteri- zado pelo fato de que o promotor (P) é mais forte em Laetococeus do que o promotor do gene da timidilato sintase (thyA) de Laetococeus lactis.

2. Ácido nucleico recombinante de acordo com a reivindicação 1, em que o promotor (P) é escolhido do grupo consistindo nos promotores na- tivos de genes de Laetococeus, de preferência de Lactococcus lactis, para1) polimerase de RNA direcionada a DNA1 subunidade beta’ / subunidade de 160 kD (rpoC),3) ferritina de ligação a ferro não-heme (dpsA),4) piruvato cinase (pyk),5) glutaminil-tRNA sintetases (gltX),6) fosfopiruvato hidratase (eno), 9) dipeptidase PepV (pepV),12) gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (gapB),13) acetato cinase (ackA),18) frutose bisfosfato aldolase (fbaA),20) superóxido dismutase (sodA), 21) proteína ribossomal S12 (rpsL) e proteína ribossomal S7 (rpsG),22) proteína ribossomal L18 (rpIR) e proteína ribossomal S5 (rpsE) e proteína ribossomal L30/L7E (rpmD),24) proteína ribossomal L19 (rpIS), 26) proteína ribossomal L10 (rp/J),28) proteína de ligação de DNA tipo HU (hlIA),29) proteína ribossomal 50S L28 (rpmB),30) componente IIB do sistema de fosfotransferase (ptcB),31) subunidade ATP alfa sintase tipo F0F1 (atpA), 32) proteína de ligação de ATP de transporte de ligação de açu- car múltiplo (msmK), 33) subunidade alfa do componente E1 de piruvato desidroge- nase (pdhA), 34) proteína de divisão celular (difIVA ou ftsA), 35) UDP-galactopiranose mutase (glfl), 36) glutamil aminopeptidase (pepA), 37) proteína relacionada à desidrogenase prevista (Ilmg 0272), 38) proteína ribossomal S2 (rpsB), 39) fator-3 de iniciação de tradução (IF-3) (infC), 40) proteína ribossomal L4 (rp/D) e proteína ribossomal L23 (r- plW) e proteína ribossomal L2 (rplB), 41) cadeia beta de fenilalanil-tRNA sintetase (pheT), 42) fator de alongamento de transcrição GreA (greA), 43) subunidade proteolítica de protease Clp dependente de ATP (.dpP), 44) proteína ribossomal L15 (rp/O), 45) proteína ribossomal L11 (rplK), 46) proteína ribossomal S8 (rpsH), 47) proteína ribossomal L21 (rpIU), 48) proteína ribossomal S13 (rpsM), 49) proteína ribossomal S19 (rpsS) e proteína ribossomal L22 (rpIU) e proteína ribossomal L16 (rplP) e proteína ribosso- mal L14 (rplN), 50) proteína ribossomal S10 (rpsJ), 51) co-chaperonina GroES (HspIO) (groES), 52) proteína ribossomal L24 (rlpX), e 53) resolvase de junção Holliday putativa (llmg_0151), e variantes funcionais e fragmentos funcionais dos ditos promotores nativos.

3. Ácido nucleico recombinante de acordo com a reivindicação 1, em que o promotor (P) é escolhido do grupo consistindo nos promotores na- tivos dos genes de Lactococcus, de preferência de Lectococcus lactis, para 1) polimerase de RNA direcionada a DNA, subunidade beta’ / subunidade de 160 kD (rpoC),3) ferritina de ligação a ferro não-heme (dpsA),4) piruvato cinase (pyk), 5) glutaminil-tRNA sintetases (gltX),6) fosfopiruvato hidratase (er?o),9) dipeptidase PepV (pepV)12) gliceraldeido-3-fosfato desidrogenase (gapB),13) acetato cinase (ackA),18) frutose bisfosfato aldolase (fbaA),20) superóxido dismutase (sodA), 21) proteína ribossomal S12 (rpsL) e proteína ribossomal S7 (,rpsG), 22) proteína ribossomal L18 (rpIR) e proteína ribossomal S5 (rpsE) e proteína ribossomal L30/L7E (rpmD),24) proteína ribossomal L19 (rp/S),26) proteína ribossomal L10 (rplJ),28) proteína de ligação de DNA tipo HU (hlIA),29) proteína ribossomal 50S L28 (rpmB),30) componente IIB do sistema de fosfotransferase (ptcB), e variantes funcionais e fragmentos funcionais dos ditos promotores nativos.

4. Ácido nucleico recombinante de acordo com a reivindicação 1, em que o promotor (P) é escolhido do grupo compreendendo ou consistindo em ácidos nucleicos mostrados nas SEQ ID NOs: 1, 3 a 6, 9, 12, 13, 18, 20, a 22, 24, 26, 28 a 54, 160, 163 a 165, 167, 169, 171 a 180, e homólogos do mesmo, e variantes funcionais e fragmentos funcionais do mesmo.

5. Ácido nucleico recombinante de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, compreendendo ainda uma seqüência terminadora de transcrição 3’ para as ditas uma ou mais estruturas de leitura aberta.

6. Ácido nucleico recombinante de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, compreendendo ainda um operador configurado para controlar transcrição a partir do dito promotor (P).

7. Ácido nucleico recombinante de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, compreendendo ainda seqüências configuradas para realizar inserção do dito ácido nucleico recombinante no cromossomo de uma célula hospedeiro, de preferência através de recombinação homólo- ga.

8. Ácido nucleico recombinante de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, compreendendo ainda uma seqüência de sinal, de preferência usp45 ou usp45N4.

9. Ácido nucleico recombinante de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, compreendendo SEQ ID NO:28 e usp45 e usp45N4.

10. Ácido nucleico recombinante de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, em que as ditas uma ou mais estruturas de leitura aberta codificam um polipeptídeo capaz de elicitar uma resposta terapêutica ou imunogênica em um indivíduo, de preferência em um indivíduo humano ou animal.

11. Ácido nucleico recombinante de acordo com a reivindicação 10, em que as ditas uma ou mais estruturas de leitura aberta codificam um antígeno e/ou um polipeptídeo terapeuticamente ativo não-vacinogênico.

12. Ácido nucleico recombinante de acordo com a reivindicação 11, em que o dito antígeno é capaz de elicitar uma resposta imune, de prefe- rência uma resposta de tolerância imune, em um indivíduo humano ou ani- mal, e/ou dito polipeptídeo terapeuticamente ativo não-vacinogênico é capaz de produzir um efeito terapêutico em um indivíduo humano ou animal.

13. Ácido nucleico recombinante de acordo com a reivindicação 11, em que o dito antigeno é capaz de elicitar uma resposta imune e usado como uma vacina em um indivíduo humano ou animal.

14. Ácido nucleico recombinante de acordo com a reivindicação13, em que o dito polipeptídeo terapeuticamente ativo não-vacinogênico é hlL-10, GLP-2, GLP-1, TFF ou hPYY.

15. Ácido nucleico recombinante de acordo com a reivindicação14, em que o dito ácido nucleico recombinante compreende: (a) PdpsA, usp45 e hlL-10 (sAGX0012); PdpsA, usp45N4 e hlL-10; PpepV, usp45 e hlL-10 (sAGX0018); PpepV, usp45N4 e hlL-10; PsodA1 usp45 e hlL-10 (sAGX0029); PsodA, usp45N4 e hlL-10; PhIIA1 usp45 e hlL-10 (sAGX0037); PhlIA, usp45N4 e hlL-10; (b) PdpsA, usp45N4 e hTFF1; PdpsA1 usp45 e hTFF1; PpepV, usp45N4 e hTFF1; PpepV1 usp45 e hTFF1; PsodA, usp45N4 e hTFF1; PsodA1 usp45 e hTFF1; PhIIA1 usp45N4 e hTFF1 (sAGX0048); PhIIA1 usp45 e hTFF1 (SAGX0049); (c) PdpsA, usp45N4 e hTFF3; PdpsA1 usp45 e hTFF3 (SAGX0048); PpepV, usp45N4 e hTFF3; PpepV1 usp45 e hTFF3; PsodA, usp45N4 e hTFF3; PsodA1 usp45 e hTFF3; PhIIA1 usp45N4 e hTFF3 (sAGX0057); PhIIA1 usp45 e hTFF3; (d) PdpsA, usp45N4 e hPYY; PdpsA, usp45 e hPYY(sAGX0048); PpepV, usp45N4 e hPYY; PpepV, usp45 e hPYY; PsodA, usp45N4 e hPYY; PsodA1 usp45 e hPYY; PhIIA1 usp45N4 e hPYY (sAGX0057); PhIIA1 usp45 e hPYY; PhIIA1 usp45 e hPYY G9 (3-36) (SAGX0213); (e) PdpsA1 usp45N4 e GLP-1; PdpsA, usp45 e GLP-1; PpepV1 usp45N4 e GLP-1 ; PpepV1 usp45 e GLP-1; PsodA, usp45N4 e GLP-1; PsodA1 usp45 e GLP-1; PhIIA1 usp45N4 e GLP-1; PhIIA1 usp45 e GLP-1; (f) PdpsA1 usp45N4 e GLP-2; PdpsA1 usp45 e GLP-2; PpepV1 usp45N4 e GLP-2; PpepV1 usp45 e GLP-2; PsodA1 usp45N4 e GLP-2; PsodA1 usp45 e GLP-2; PhIIA1 usp45N4 e GLP-2; ou PhIIA1 usp45 e GLP-2.

16. Vetor compreendendo o ácido nucleico recombinante como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 15.

17. Vetor de acordo com a reivindicação 16, em que o dito vetor é derivado de pT 1NX.

18. Célula hospedeiro transformada com o ácido nucleico re- combinante como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 15, ou com o vetor como definido na reivindicação 16 ou 17.

19. Célula hospedeiro compreendendo um ácido nucleico re- combinante, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 15, em que o dito promotor (P) está presente no cromossomo da dita célula hospe- deiro e em que o dito promotor (P) está operavelmente ligado a uma ou mais estruturas de leitura aberta heterólogas ao dito promotor (P).

20. Célula hospedeiro de acordo com a reivindicação 19, em que o dito promotor (P) compreende ainda uma seqüência de sinal, de preferên- cia usp45 ou usp45N4.

21. Célula hospedeiro de acordo com a reivindicação 19 ou 20, em que o dito promotor (P) compreende ainda um operador configurado para controlar transcrição a partir do dito promotor (P).

22. Célula hospedeiro de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 19 a 21, em que o promotor (P) é escolhido do grupo consistindo em ácidos nucleicos mostrados nas SEQ ID NOs: 1, 3 a 6, 9, 12, 13, 18, 20, a 22, 24, 26, 28 a 54, 160, 163 a 165, 167, 169, 171 a 180, e homólogos do mesmo, e variantes funcionais e fragmentos funcionais do mesmo.

23. Célula hospedeiro de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 19 a 22, em que as ditas uma ou mais estruturas de leitura aberta codificam um polipeptídeo capaz de elicitar uma resposta terapêutica ou resposta imunogênica em um indivíduo, de preferência em um indivíduo hu- mano ou animal.

24. Célula hospedeiro de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 19 a 23, em que as ditas uma ou mais estruturas de leitura aberta codificam um antígeno e/ou um polipeptídeo terapeuticamente ativo não- vacinogênico.

25. Célula hospedeiro de acordo com a reivindicação 24, em que o dito antígeno é capaz de elicitar uma resposta imune, de preferência uma resposta de tolerância imune, em um indivíduo humano ou animal, e/ou o dito polipeptídeo terapeuticamente ativo não-vacinogênico é capaz de pro- duzir um efeito terapêutico em um indivíduo humano ou animal.

26. Célula hospedeiro de acordo com a reivindicação 24, em que o dito polipeptídeo terapeuticamente ativo não-vacinogênico é hlL-10, GLP- .2, GLP-I1TFFou hPYY.

27. Célula hospedeiro de acordo com a reivindicação 24, em que o dito antígeno é capaz de elicitar uma resposta imune e usado como uma vacina em um indivíduo humano ou animal.

28. Célula hospedeiro de acordo com a reivindicação 24, em que a dita célula hospedeiro compreende: (a) PdpsA, usp45 e hlL-10 (sAGXOOl 2); PdpsA, usp45N4 e hlL-10; PpepV, usp45 e hlL-10 (sAGXOOl8); PpepV, usp45N4 e hlL-10; PsodA, usp45 e h!L-10 (sAGX0029); PsodA1 usp45N4 e hlL-10; PhIIA1 usp45 e hlL-10 (sAGX0037); PhIIA1 usp45N4 e hlL-10; (b) PdpsA1 usp45N4 e hTFF1; PdpsA1 usp45 e hTFF1; PpepV, usp45N4 e hTFF1; PpepV1 usp45 e hTFF1; PsodA, usp45N4 e hTFF1; PsodA1 usp45 e hTFF1; PhlIA, usp45N4 e hTFF1 (sAGX0048); PhIIA1 usp45 e hTFF1 (SAGX0049); (c) PdpsA, usp45N4 e hTFF3; PdpsA, usp45 e hTFF3 (SAGX0048); PpepV1 usp45N4 e hTFF3; PpepV1 usp45 e hTFF3; PsodA1 usp45N4 e hTFF3; PsodA1 usp45 e hTFF3; PhIIA1 usp45N4 e hTFF3 (sAGX0057); PhIIA1 usp45 e hTFF3; (d) PdpsA1 usp45N4 e hPYY; PdpsA1 usp45 e hPYY(sAGX0048); PpepV1 usp45N4 e hPYY; PpepV1 usp45 e hPYY; PsodA, usp45N4 e hPYY; PsodA1 usp45 e hPYY; PhIIA1 usp45N4 e hPYY (sAGX0057); PhIIA1 usp45 e hPYY; PhIIA1 usp45 e hPYY G9 (3-36) (&AGX0213); (e) PdpsA1 usp45N4 e GLP-1; PdpsA1 usp45 e GLP-1; PpepV1 usp45N4 e GLP-1 ; PpepV1 usp45 e GLP-1; PsodA1 usp45N4 e GLP-1; PsodA1 usp45 e GLP-1; PhIIA1 usp45N4 e GLP-1; PhIIA1 usp45 e GLP-1; (f) PdpsA1 usp45N4 e GLP-2; PdpsA1 usp45 e GLP-2; PpepV1 usp45N4 e GLP-2; PpepV1 usp45 e GLP-2; PsodA, usp45N4 e GLP-2; PsodA1 usp45 e GLP-2; PhIIA1 usp45N4 e GLP-2; ou PhIIA1 usp45 e GLP-2.

29. Célula hospedeiro de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 18 a 28, a qual é uma bactéria não-patogênica e não-invasiva, de preferência bactéria Gram-positiva, com mais preferência bactéria do ácido láctico, com mais preferência ainda bactéria Lactococcus ou uma bactéria Lactobacillus e com mais preferência uma bactéria Laetococeus lactis ou Lactobacillus casei.

30. Uso do ácido nucleico recombinante como definido em qual- quer uma das reivindicações 1 a 15, ou o vetor como definido na reivindica- ção 16 ou 17, para obter expressão de produtos de expressão codificados pelas ditas uma ou mais estruturas de leitura aberta, em uma célula hospe- deiro.

31. Método para expressão recombinante de um polipeptídeo de interesse compreendendo: a) cultura da célula hospedeiro de acordo com qualquer uma das reivindicações 18 a 29, em que as ditas uma ou mais estruturas de leitura aberta codificam o polipeptídeo de inte- resse, b) isolamento do polipeptídeo de interesse produzido pela cé- lula hospedeiro na dita cultura.

32. Uso da célula hospedeiro como definido em qualquer uma das reivindicações 18 a 29, para a fabricação de um medicamento para apli- cação de um polipeptídeo codificado pelas ditas uma ou mais estruturas de leitura aberta do ácido nucleico recombinante a um humano ou animal.

33. Uso de acordo com a reivindicação 32, em que o dito poli- peptídeo é um antígeno e/ou um polipeptídeo terapeuticamente ativo não- vacinogênico, de preferência hlL10, GLP-2, GLP-1, TFF ou hPYY.

34. Composição farmacêutica compreendendo as células hos- pedeiro como definido em qualquer uma das reivindicações 18 a 29.

35. Célula hospedeiro de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 18 a 29, para uso como um medicamento.