ES2595729T3 - Promotores de Lactococcus y usos de los mismos - Google Patents

Abstract

Un ácido nucleico recombinante que comprende un promotor nativo de un gen para la proteína de unión a ADN tipo HU (PhIIA) de una especie Lactococcus como se expone en la SEQ ID NO: 28, o un homólogo o una variante funcional o fragmento funcional del mismo, en el que el homólogo o variante funcional o fragmento funcional el mismo es al menos un 95 % idéntico al promotor como se expone en la SEQ ID NO: 28, unido operativamente a un marco de lectura abierto heterólogo al promotor, comprendiendo dicho marco de lectura abierto una secuencia que codifica un polipéptido, y que comprende adicionalmente una secuencia que codifica una secuencia de señal usp45 o usp45N4 5' aguas arriba de dicha secuencia que codifica el polipéptido.

Description

DESCRIPCION

Promotores de Lactococcus y usos de los mismos.

5 CAMPO DE LA INVENCION

La invencion se encuentra en el campo de la biologia molecular, y se refiere a ingenieria recombinante y expresion de proteinas. Mas en particular, la invencion se refiere a acidos nucleicos para la expresion recombinante de proteinas que comprenden secuencias obtenidas a partir de Lactococcus y utiles como promotores. La invencion se 10 refiere adicionalmente a vectores que comprenden dichos acidos nucleicos y celulas huesped transformadas con los mismos. La invencion tambien incluye el uso de celulas huesped que comprenden dichos acidos nucleicos o vectores para expresar proteinas heterologas u homologas, y tambien para la administracion, especialmente administracion terapeutica, de dichas proteinas a sujetos.

15 ANTECEDENTES DE LAINVENCION

Las bacterias lacticas son cada vez mas importantes como huespedes para la expresion recombinante de polipeptidos heterologos in vitro (por ejemplo, documento US 5.559.007), asi como para la expresion in vivo o in situ y la administracion de antigenos y/o polipeptidos terapeuticamente relevantes (por ejemplo, documento WO 20 97/14806).

Las bacterias de acido lactico, y en particular Lactococcus, se consideran como microorganismos GRAS (es decir, considerado como generalmente seguros) y, por lo tanto, pueden administrarse de forma relativamente facil a seres humanos y animales.

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Sin embargo, lograr un fuerte nivel de expresion heterologa en bacterias de acido lactico a menudo requiere la introduccion de promotores y otras secuencias que sean exogenas a estas bacterias (por ejemplo, vease Wells y col., 1993a) y, por lo tanto, puede comprometer la percepcion GRAS de las mismas.

30 Por consiguiente, existe la necesidad de proporcionar promotores adicionales que se obtengan de bacterias de acido lactico, mas preferiblemente de Lactococcus, y se pueden utilizar favorablemente para la expresion de proteinas, preferiblemente la expresion de proteinas heterologas, en las mismas.

El documento WO 02/090551 describe un L. lactis geneticamente modificado en el que el gen hlL10 fusionado a la 35 secuencia de secrecion de usp45 se expresa bajo el control del promotor thyA y el uso del mismo en el tratamiento de trastornos gastrointestinales.

Tambien son necesarios tales promotores que puedan conseguir altos niveles de expresion con el fin de obtener cantidades suficientes de proteinas asi expresadas en entornos industriales y/o terapeuticos.

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RESUMEN DE LA INVENCION

Los aspectos de la presente invencion abordan al menos algunas, por ejemplo, una o mas, de las necesidades que se han analizado anteriormente de la tecnica.

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En particular, los presentes inventores reconocieron acidos nucleicos y secuencias de acido nucleico derivadas de Lactococcus que pueden usarse ventajosamente como promotores adicionales para la expresion recombinante, tal como, preferiblemente, la expresion de polipeptidos, en celulas huesped, preferiblemente en bacterias, y mas preferiblemente en Lactococcus.

50

Mas en particular, los inventores expusieron y tuvieron exito para identificar acidos nucleicos y secuencias de acidos nucleicos a partir de Lactococcus que pueden funcionar como promotores fuertes, es decir, los que alcanzan un alto nivel de expresion, para la expresion recombinante, tal como, preferiblemente, la expresion de polipeptidos, en celulas huesped, preferiblemente en bacterias, y mas preferiblemente en Lactococcus. La fuerte expresion puede 55 aumentar favorablemente la cantidad de productos de expresion, por ejemplo, polipeptidos, producidos de forma recombinante por las celulas huesped, que se vuelven disponibles para otros usos, tales como, por ejemplo, para la purificacion de o para la administracion terapeutica por las celulas huesped.

Incluso mas sorprendentemente, los inventores comprendieron que los acidos nucleicos y secuencias de acidos

nucleicos de la invencion pueden actuar como promotores que son aun mas fuertes, especialmente cuando se usan en Lactococcus, que los promotores derivados previamente de Lactococcus. Mas especfficamente, los acidos nucleicos y las secuencias de la invencion pueden funcionar asf como promotores aun mas fuertes, por ejemplo, promotores constitutivos aun mas fuertes, que el promotor del gen de timidilato sintasa (thyA) de Lactococcus lactis, 5 que, para el mejor conocimiento de los inventores, es el promotor derivado de Lactococcus mas fuerte, mas en particular, el promotor constitutivo derivado de Lactococcus mas fuerte, hasta la fecha. El promotor thyA de Lactococcus lactis es, para el mejor conocimiento de los inventores, tambien el promotor mas fuerte actualmente conocido para la expresion genica recombinante, por ejemplo, heterologa, en Lactococcus, y preferiblemente en Lactococcus lactis.

10

Sorprendentemente, un analisis del transcriptoma combinado como se describe en los ejemplos junto con los datos de la proteomica sofisticada no era competente en lo que sugiere la resistencia o la actividad de los promotores candidatos. En particular, algunos promotores identificados fueron solo debilmente activos cuando se ensayaron. Ademas, algunas secuencias promotoras potenciales no estaban activas fuera del entorno natural o la configuracion 15 nativa, es decir, cuando se ensayaron con genes heterologos.

Como una ventaja anadida, se observa una expresion particularmente alta usando los promotores de la invencion inter alia para IL-10 humana, peptido YY humano (PYY), peptido tipo glucagon humano 1 (GLP-1), GLP-2 humano (GLP-2) y factores trefoil humanos (TTF) como dianas preferidas.

20

Tambien se apreciara que los acidos nucleicos y secuencias de acidos nucleicos que se identifican por los inventores se obtienen a partir de Lactococcus, que se establece como un microorganismo GRAS (es decir, "considerado generalmente como seguro"). En consecuencia, las composiciones, por ejemplo, celulas huesped, que comprenden dichos promotores, pueden administrarse a serse humanos y animales con menos preocupacion por la 25 seguridad biologica que cuando se introducen secuencias que se originan de, por ejemplo, microorganismos no GRAS u otras fuentes.

Por lo tanto, la invencion proporciona acidos nucleicos y secuencias ventajosas derivadas de Lactococcus, es decir, comparativamente seguras, que constituyen promotores adicionales, mas preferiblemente promotores fuertes 30 adicionales, e incluso mas preferiblemente promotores mas fuertes que el promotor thyA, para su uso en numerosas aplicaciones que implican la expresion recombinante, por ejemplo, de polipeptidos, en celulas huesped, preferiblemente en bacterias, e incluso mas preferiblemente, en Lactococcus.

La presente invencion integra las realizaciones pertinentes anteriores en sus diversos aspectos.

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Por consiguiente, en un aspecto, la invencion proporciona un acido nucleico recombinante que comprende un promotor (P), que es un promotor nativo de una especie de Lactococcus o una variante funcional o fragmento funcional del mismo, unido operativamente a uno o mas marcos de lectura abiertos heterologos al promotor (P), caracterizado porque el promotor (P) es mas fuerte en Lactococcus que el promotor del gen timidilato sintasa (thyA) 40 de Lactococcus lactis.

A este respecto, por lo tanto, la invencion tambien proporciona un acido nucleico recombinante que comprende un promotor (P) unido operativamente a uno o mas marcos de lectura abiertos heterologos al promotor (P), en el que el promotor (P) se escoge entre el grupo que comprende o que consiste en los promotores nativos de genes de 45 Lactococcus para 1) ARN polimerasa dirigida a ADN, subunidad beta'/subunidad 160 kD (rpoC), 2) ARN polimerasa dirigida a ADN, subunidad beta/subunidad 140 kD (rpb2), 3) protefna tipo ferritina de union a ADN (protector del dano oxidativo) (dps), 4) piruvato cinasa (pyk), 5) glutamil y glutaminil-ARNt sintetasas (glnS), 6) enolasa (eno), 7) glutamina sintetasa (glnA) 8) Regulador transcripcional tipo HTH (glnR), 9) Xaa-His dipeptidasa (argE o pepV)), 10) subunidad beta ATP sintasa tipo F0F1- (subunidad beta ATP sintasa F1) (atpD), 11) 3-fosfoglicerato cinasa (pgk), 50 12) gliceraldehfdo-3-fosfato deshidrogenasa/eritrosa-4-fosfato deshidrogenasa (gapA), 13) acetato cinasa (ackA), 14) 3-oxoacil-(acil-vehfculo-protema) sintasa (fabB), 15) 3-oxoacil-(acil-vehfculo-protema) reductasa (fabG), 16) ARN polimerasa dirigida a ADN, subunidad alfa/subunidad 40 kD (rpoA), 17) Xaa-Pro aminopeptidasa (pepP), 18) fructosa/tagatosa bisfosfato aldolasa (tbp), 19) protefna ribosomal S4 (rpsD), 20) superoxido dismutasa (sodA), 21) protefna ribosomal S12 (rpsL) y protefna ribosomal S7 (rpsG), 22) protefna ribosomal L18 (rplR) y protefna ribosomal 55 S5 (rpsE) y protefna ribosomal L30/L7E (rpmD), 23) S-ribosilhomocistema liasa (luxS), 24) protefna ribosomal L19 (rplS), 25) protefna ribosomal S11 (rpsK), 26) protefna ribosomal L10 (rplJ), 27) protefna ribosomal L7/L12 (rpIL), 28) protefna de union a ADN nucleoide bacteriano/protefna de union a ADN HU (hup), 29) protefna ribosomal 50S L28 (rpmB), 30) componente especffico celobiosa del sistema fosfotransferasa IIB (lacE), 31) Subunidad alfa ATP sintasa de tipo F0F1 (atpA), 32) Sistema de transporte de azucar tipo ABC (componente ATPasa) (malK), 33) subunidad alfa

del componente E1 del complejo de acetoina deshidrogenasa (acoA), 34) proteina de division celular (diflVA o ftsA),35) UDP-galactopiranosa mutasa (glf), 36) glutamil aminopeptidasa (frvX), 37) proteina relacionada con deshidrogenasa predicha (mviM), 38) proteina ribosomal S2, 39) factor de inicio de la traduccion 3 (IF-3) (infC), 40) proteina ribosomal L4 (rplD) y proteina ribosomal L23 (rplW) y proteina ribosomal L2 (rplB), 41) dominio EMAP 5 (ydjD), 42) factor de elongacion de la transcripcion (greA), 43) subunidad proteasa de Clp proteasa dependiente de ATP (clpP), 44) proteina ribosomal L15 (rplO), 45) proteina ribosomal L11 (rplK), 46) proteina ribosomal S8 (rpsH), 47) proteina ribosomal L21 (rplU), 48) proteina ribosomal S13 (rpsM), 49) proteina ribosomal S19 (rpsS) y proteina ribosomal L22 (rplU) y proteina ribosomal L16 (rplP) y proteina ribosomal L14 (rplN), 50) proteina ribosomal S10 (rpsJ), 51) co-chaperonina GroES (Hsp10) (cpn10), 52) proteina ribosomal L24 (rplX) y 53) proteina hipotetica 10 LACR_0137 (duf965), y variantes funcionales y fragmentos funcionales de dichos promotores nativos.

La invencion proporciona un acido nucleico recombinante, en el que el promotor (P) se escoge entre el grupo que consiste en los promotores nativos de genes de Lactococcus, preferiblemente de Lactococcus lactis, para 1) ARN polimerasa dirigida a ADN, subunidad beta'/subunidad 160 kD (rpoC), 3) ferritina de union a hierro no hemo (dpsA), 15 4) piruvato cinasa (pyk), 5) glutaminil-ARNt sintetasas (gltX), 6) fosfopiruvato hidratasa (eno), 9) dipeptidasa PepV (pepV), 12) gliceraldehido-3-fosfato deshidrogenasa (gapB), 13) acetato cinasa (ackA), 18) fructosa bisfosfato aldolasa (fbaA), 20) superoxido dismutasa (sodA), 21) proteina ribosomal S12 (rpsL) y proteina ribosomal S7 (rpsG), 22) proteina ribosomal L18 (rplR) y proteina ribosomal S5 (rpsE) y proteina ribosomal L30/L7E (rpmD), 24) proteina ribosomal L19 (rplS), 26) proteina ribosomal L10 (rplJ), 28) proteina de union de ADN tipo HU (hllA),), 29) proteina 20 ribosomal 50S L28 (rpmB), 30) componente IIB del sistema fosfotransferasa (ptcB), 31) Subunidad alfa ATP sintasa de tipo F0F1 (atpA), 32) proteina de union a ATP de transporte de union a azucar multiple (msmK), 33) subunidad alfa del componente E! de piruvato deshidrogenasa (pdhA), 34) proteina de division celular (difIVA o ftsA), 35) UDP- galactopiranosa mutasa (glf1), 36) glutamil aminopeptidasa (pepA), 37) proteina relacionada con deshidrogenasa predicha (IImg 0272), 38) proteina ribosomal S2 (rpsB), 39) factor de inicio de la traduccion 3 (IF-3) (infC), 40) 25 proteina ribosomal L4 (rpID) y proteina ribosomal L23 (rplW) y proteina ribosomal L2 (rplB), 41) cadena beta de fenilalanil-ARNt sintetasa (pheT), 42) factor de elongacion de la transcripcion GreA (greA), 43) subunidad proteolitica de Clp proteasa dependiente de ATP (clpP),44) proteina ribosomal L15 (rpIO), 45) proteina ribosomal L11 (rplK), 46) proteina ribosomal S8 (rpsH), 47) proteina ribosomal L21 (rplU), 48) proteina ribosomal S13 (rpsM), 49) proteina ribosomal S19 (rpsS) y proteina ribosomal L22 (rplU) y proteina ribosomal L16 (rpIP) y proteina ribosomal L14 (rpIN), 30 50) proteina ribosomal S10(rpsJ), 51) co-chaperonina GroES (Hsp10) (groES), 52) proteina ribosomal L24 (rplX) y 53) resolvasa de union de holiday putativa (IImg_0151), y variantes funcionales y fragmentos funcionales de dichos promotores nativos.

En una realizacion incluso mas preferida, la invencion proporciona un acido nucleico recombinante, en el que el 35 promotor (P) se escoge entre el grupo que consiste en los promotores nativos de genes de Lactococcus, preferiblemente de Lactococcus lactis, para 1) ARN polimerasa dirigida a ADN, subunidad beta'/subunidad 160 kD (rpoC), 3) ferritina de union a hierro no hemo (dpsA), 4) piruvato cinasa (pyk), 5) glutaminil-ARNt sintetasas (gltX), 6) fosfopiruvato hidratasa (eno), 9) dipeptidasa PepV (pepV), 12) gliceraldehido-3-fosfato deshidrogenasa (gapB), 13) acetato cinasa (ackA), 18) fructosa bisfosfato aldolasa (fbaA), 20) superoxido dismutasa (sodA), 21) proteina 40 ribosomal S12 (rpsL) y proteina ribosomal S7 (rpsG), 22) proteina ribosomal L18 (rplR) y proteina ribosomal S5 (rpsE) y proteina ribosomal L30/L7E (rpmD), 24) proteina ribosomal L19 (rplS), 26) proteina ribosomal L10 (rplJ), 28) proteina de union de ADN tipo HU (hllA),), 29) proteina ribosomal 50S L28 (rpmB), 30) componente IIB del sistema fosfotransferasa (ptcB), como se define en la Tabla 1.

45 En una realizacion preferida adicional, la invencion proporciona un acido nucleico recombinante que comprende el promotor 28) proteina de union a ADN nucleoide bacteriano/proteina de union de ADN tipo HU (hlla o hup), unido operativamente a uno o mas marcos de lectura abiertos heterologos al promotor. Incluso mas preferiblemente, dicho promotor es el promotor PhIIA.

50 En una realizacion preferida adicional, la invencion proporciona un acido nucleico recombinante que comprende el promotor 3) ferritina de union a hierro no hemo (dpsA o LACR_2311), promotor 9) dipeptidasa PepV (pepV o LACR_0908), o el promotor 20) superoxido dismutasa (sodA o LACR_0458), respectivamente, dicho promotor unido operativamente a uno o mas marcos de lectura abiertos heterologos al promotor. Incluso mas preferiblemente, dicho promotor es el promotor PdpsA, PpepV o PsodA.

55

En una seleccion preferida, la invencion proporciona un acido nucleico recombinante que comprende un promotor (P) unido operativamente a uno o mas marcos de lectura abiertos heterologos al promotor (P), en el que el promotor (P) se escoge entre el grupo que comprende o que consiste en los promotores nativos de los genes de Lactococcus enumerados en los puntos 1) a 30) anteriormente, o la Tabla 1, preferiblemente el promotor PhIIA, PdpsA, PpepV o

PsodA, y variantes funcionales y fragmentos funcionales de dichos promotores nativos.

En una realizacion preferida adicional, los genes que se han mencionado anteriormente, y los promotores nativos respectivos y variantes funcionales y fragmentos funcionales de los mismos, se obtienen a partir de Lactococcus 5 lactis.

En aspectos ejemplares relacionados, tambien se proporcionan vectores que comprenden los acidos nucleicos recombinantes de la invencion; casetes de expresion integrados cromosomicamente, celulas huesped transformadas con los acidos nucleicos recombinantes de la invencion o con vectores que los comprenden; el uso de los acidos 10 nucleicos recombinantes de la invencion para conseguir la expresion de productos de expresion, preferiblemente de uno o mas polipeptidos, codificados por dichos marcos de lectura abiertos, en una celula huesped; metodos para la expresion recombinante y el aislamiento de productos de expresion, preferiblemente polipeptidos, de interes usando dichas celulas huesped; metodos de tratamiento que implican la administracion in situ de productos de expresion terapeuticamente relevantes, preferiblemente polipeptidos, por ejemplo, antigenos y/o polipeptidos no vacinogenos 15 terapeuticamente activos, a seres humanos o animales por dichas celulas huesped; y usos relacionados de las celulas huesped para la fabricacion de medicamentos para facilitar dicha administracion; composiciones farmaceuticas que comprenden dichas celulas huesped; etc.

Estos y aspectos adicionales y realizaciones preferidas de la invencion se describen en las siguientes secciones y 20 en las reivindicaciones adjuntas.

BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS

La figura 1 (A-H) ilustra secuencias promotoras preferidas.

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La figura 2 ilustra la separacion electroforetica de polipeptidos MG1363 de Lactococcus lactis.

La figura 3 ilustra una estrategia de clonacion.

30 La figura 4 Subclonacion de las fusiones promotor-Usp45-h[Gly2]GLP2. P se refiere a cualquiera de los siguientes promotores: P1 (Waterfield, y col. 1995), PthyA (promotor de timidilato sintasa) y PhllA (promotor de proteina de union a ADN nucleoide bacteriano/proteina de union a ADN HU); usp45 se refiere a la senal de secrecion de usp45 de tipo silvestre (van Asseldonk, y col. 1990) o mutante del mismo, incluyendo Usp45 N4 en el que la lisina en la posicion 4 se sustituyo por asparagina; Em se refiere al marcador de seleccion de eritromicina; ori se refiere a origen 35 de replicacion.

La figura 5 Produccion y secrecion de h[Gly2]GLP-2 por cepas de L. lactis recombinantes reveladas por el anticuerpo anti-hGLP2. (A) Secrecion de h[Gly2]GLP-2. 1 pg de hGLP-2 recombinante se cargo como control positivo. (B) Produccion celular y secrecion de h[Gly2]GLP-2. Cada carril en la transferencia representa 1 ml de 40 fraccion celular de L. lactis o sobrenadante de cultivo obtenido despues de tres horas de crecimiento. Se uso SeeBlue® Plus2 (Invitrogen) como marcador del peso molecular (PM).

La figura 6 Comparacion esquematica de MG1363 de L. lactis y de las diversas cepas de expresion de hIL-10 usadas en este estudio. Durante la construccion, los casetes de expresion de hIL-10 se integran en el cromosoma 45 MG1363 de L. lactis por recombinacion homologa en secuencias identicas, tanto aguas arriba, asi como aguas debajo de thyA y los casetes de expresion de hIL-10 respectivamente. Los puntos de recombinacion se representan esquematicamente por \. Esto hace que todas las secuencias de ADN fuera de los casetes de expresion sean identicas para las cepas que se han descrito anteriormente. Los elementos geneticos no estan dibujados a escala.

50 La figura 7 Comparacion de la expresion de hIL-10 a partir de PthyA (promotor de timidilato sintasa, cepas sAGX0005 y Thy12) con expresion de hIL-10 a partir del (A) promotor PdpsA (proteina tipo ferritina de union a ADN, SEQ ID NO: 3, sAGX0012), (B) PpepV (promotor de Xaa-His dipeptidasa SEQ ID NO: 9 o 158, Cepa sAGX0018), (C) PsodA (promotor de superoxido dismutasa, SEQ ID NO: 20 sAGX0029) y (D) PhIIA (promotor de proteina de union a AdN nucleoide bacteriano/proteina de union a ADN HU; SEQ ID NO: 28, cepa sAGX0037). "Promotor" 55 indica el promotor que esta delante del gen de hlL-10.

La figura 8 Comparacion de la expresion de hIL-10 por 109 celulas de MG1363, sAGX0005 y sAGX0037

La figura 9 Comparacion esquematica de MG1363 de L. lactis y las diversas cepas de expresion de hTFF usadas en

este estudio. Durante la construccion, los casetes de expresion de TFF se integran en el cromosoma MG1363 de L. lactis por recombinacion homologa en secuencias identicas, tanto aguas arriba como aguas abajo de thyA y los casetes de expresion de TFF respectivamente. Los puntos de recombinacion se representan esquematicamente por \. Esto hace que todas las secuencias de ADN fuera de los casetes de expresion sean identicas para las cepas que 5 se han descrito anteriormente. usp45 mutante se indica por *. Los elementos geneticos no estan dibujados a escala.

La figura 10 Comparacion de

(A) expresion de hTFFI a partir de PthyA (promotor de timidilato sintasa) unido a la senal de

10 secrecion de usp45 de tipo silvestre (ts) y hTFFI (cepa sAGX0041), PhllA (promotor de proteina

de union a ADN nucleoide bacteriano/proteina de union a ADN HU; SEQ ID NO: 28) unido a la senal de secrecion de usp45 mutante (mut) y hTFFI (cepa sAGX0049) o PhllA unido a la senal de secrecion de usp45 ts y hTFFI (cepa sAGX0048).

(B) expresion de hTFF3 a partir de PthyA (promotor de timidilato sintasa) unido a la senal de

15 secrecion de usp45 ts y hTFF3 (cepa sAGX0043), promotor PdpsA (proteina tipo ferritina de union

a ADN, SEQ ID NO: 3) unido a la senal de secrecion de usp45 ts y hTFF3 (sAGX0059) y PhllA unido a la senal de secrecion de usp45 mut y hTFF3 (cepa sAGX0057).

"Promotor" y "senal de secrecion" indican el promotor y la senal de secrecion que esta delante del gen TFF.

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La figura 11 Analisis por transferencia Western de los sobrenadantes de las diversas cepas indicadas. Los carriles que contienen proteinas de referencia se indican con "hTFF1" (hTFF1 de referencia) y "MPM" (marcadores de peso molecular, los pesos moleculares se indican por "kDa"). Todos los demas carriles contienen el equivalente de 0,5 ml de sobrenadante de cultivo de las cepas indicadas, cosechadas como se ha descrito anteriormente. El primer 25 anticuerpo fue anti-hTFF1 monoclonal de raton:1/1000 (Abnova: cat. n.° H00007031-M02). El segundo anticuerpo fue anti-raton-AP de cabra:1/1000 (Southern Biotech: 4050-04) y la deteccion se hizo con NBT/BClP (Roche 11 697 471 0001). MPM son lnvitrogen SeeBlue plus2 tenidos previamente convencionales (cat. n.° LC5925).

La figura 12 Resumen esquematico de la estructura de pT1 NX y de los diversos plasmidos de expresion de hPYY 30 G9 (3-36) usados en este estudio. Los plasmidos de expresion pAGX0211, pAGX0212 y pAGX0213 se obtuvieron insertando los casetes de expresion respectivos como fragmentos EcoRl-Spel en el pT1NX abierto de EcoRl-Spel. Como tal, la estructura y posicion de todas las secuencias de ADN fuera de los casetes de expresion, tal como el origen de replicacion (ori) y el marcador de resistencia a la eritromicina (EmR), son identicas para todos los plasmidos. Los elementos geneticos no estan dibujados a escala.

35

La figura 13 Comparacion de la expresion de hPYY G9 (3-36) a partir de P1 (Waterfield y col. 1995) (plasmido pAGX0211), PthyA (promotor de timidilato sintasa, plasmido pAGX0212) y PhllA (promotor de proteina de union a ADN nucleoide bacteriano/proteina de union a ADN HU; SEQ lD NO: 28, plasmido pAGX0213) unido a la senal de secrecion de usp45 y hPYY G9 (3-36). Todos los plasmidos estaban presentes en MG1363 de L. lactis. "Promotor" 40 indica el promotor que esta aguas arriba del gen hPYY G9 (3-36) o presente en el sitio equivalente en pT 1 NX.

La figura 14 Resumen esquematico de la estructura de pT1 NX y de los diversos plasmidos de expresion de hGLP-1 G8 (7-36) usados en este estudio. Los plasmidos de expresion pAGX0233 y pAGX0234 se obtuvieron insertando los casetes de expresion respectivos como fragmentos de EcoRl-Spel en el pT1 NX abierto con EcoRl-Spel. Como tal, 45 la estructura y la posicion de todas las secuencias de ADN fuera de los casetes de expresion, tal como el origen de replicacion (ori) y el marcador de resistencia a la eritromicina (EmR), son identicas para todos los plasmidos. Los elementos geneticos no estan dibujados a escala.

La figura 15 Comparacion de la expresion de hGLP-1 G8 (7-36) a partir de P1 (Waterfield y col. 1995) (plasmido 50 pAGX0211), PthyA (promotor de timidilato sintasa, plasmido pAGX0212) y PhllA (promotor de proteina de union a ADN nucleoide bacteriano/proteina de union a AdN HU; SEQ lD NO: 28, plasmido pAGX0213) unidos a la senal de secrecion de usp45 y hGLP-1 G8 (7-36). Todos los plasmidos estaban presentes en MG1363 de L. lactis. "Promotor" indica el promotor que esta aguas arriba del gen hGLP-1 G8 (7-36) o presente en el sitio equivalente en pT 1 NX.

55 La figura 16 Comparacion esquematica de MG1363 de L. lactis y de las diversas cepas de expresion de hlL-10 usadas en este estudio. Durante la construccion, los casetes de expresion de hlL-10 se integran en el cromosoma MG1363 de L. lactis por recombinacion homologa en secuencias identicas, tanto aguas arriba como aguas abajo de thyA y los casetes de expresion de hlL-10 respectivamente. Los puntos de recombinacion se representan esquematicamente por \. Esto hace que todas las secuencias de ADN fuera de los casetes de expresion sean

identicas para las cepas que se han descrito anteriormente. Aqui, el "promotor" es uno cualquiera de los promotores, como esta presente en la cepa "sAGX00xx" (Tabla 11). Los elementos geneticos no estan dibujados a escala

La figura 17 Comparacion de la expresion de hIL-10 a partir de PthyA (promotor de timidilato sintasa, cepa 5 sAGX0005) con expresion de hIL-10 de una cualquiera de una serie de cepas (vease la figura 16 y la Tabla 11) en la que estos promotores lactococicos se pusieron aguas arriba de un gen de fusion usp45-hIL-10.

10 DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION

Los terminos "que comprende", "comprende" y "compuesto por" como se usan en el presente documento son sinonimos con "que incluye", "incluye" o "que contiene", "contiene", y son inclusivos o abiertos y no excluyen miembros, elementos o etapas del metodo no mencionadas, adicionales.

15

La enumeracion de intervalos numericos por criterios de valoracion incluye todos los numeros y fracciones incluidas dentro de ese intervalo, asi como los criterios de valoracion enumerados.

El terminos "aproximadamente" como se usa en el presente documento, cuando se refiere a un valor medible, tal 20 como un parametro, una cantidad, una duracion temporal, y similares, pretende incluir las variaciones de +/-20 % o menos, preferiblemente +/-10 % o menos, mas preferiblemente +/-5 % o menos, incluso mas preferiblemente +/-1 % o menos, y aun mas preferiblemente +/-0,1 % o menos del valor especificado, en la medida en que dichas variaciones son apropiadas para realizar la invencion desvelada.

25 A menos que se define de otro modo, todos los terminos usados al desvelar la invencion, incluyendo los terminos tecnicos y cientificos, tienen el significado que se tiende habitualmente por un experto en la tecnica a la que pertenece esta invencion. A modo de una guia adicional, las definiciones siguientes se incluyen para apreciar mejor la ensenanza de la presente invencion.

30 La expresion "acido nucleico" como se usa en el presente documento, se refiere a un polimero de cualquier longitud compuesto basicamente por nucleotidos, por ejemplo, desoxirribonucleotidos y/o ribonucleotidos. Los acidos nucleicos pueden comprender bases de purina y/o pirimidina y/o otras bases nucleotidicas naturales (por ejemplo, xantina, inosina, hipoxantina), quimica o bioquimicamente modificadas (por ejemplo, metiladas), sinteticas o derivatizadas. La estructura principal de los acidos nucleicos puede comprender azucares y grupos fosfato, como 35 puede encontrarse tipicamente en ARN o ADN, y/o uno o mas azucares modificados o sustituidos y/o uno o mas grupos fosfato modificados o sustituidos. La expresion "acido nucleico" incluye preferiblemente ademas ADN, ARN y moleculas hibridas de ADN/ARN, incluyendo especificamente hnRNA, pre-mRNA, ARNm, ADNc, ADN genomico, productos de amplificacion, oligonucleotidos, y ADN sintetico (por ejemplo, quimicamente sintetizado), ARN o hibridos de ADN/ARN. Un "acido nucleico" puede ser bicatenario, parcialmente bicatenario o monocatenario. 40 Cuando es monocatenario, el acido nucleico puede ser la cadena homosentido o la cadena antisentido. Ademas, el acido nucleico puede ser circular o lineal.

En una realizacion preferida, el acido nucleico que comprende un promotor de la invencion es ADN o ARN, mas preferiblemente ADN.

45

La expresion "acido nucleico recombinante" se refiere generalmente a un acido nucleico que esta compuesto por segmentos unidos entre si usando tecnologia de ADN recombinante. Cuando un acido nucleico recombinante se replica en un organismo huesped, la progenie de acidos nucleicos se incluye tambien dentro de la expresion "acido nucleico recombinante".

50

L os trabajos de referencia estandares que exponen los principios generales de la tecnologia de ADN recombinante incluyen Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a ed., vol. 1-3, ed. Sambrook y col., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989; Current Protocols in Molecular Biology, ed. Ausubel y col., Greene Publishing y Wiley-Interscience, Nueva York, 1992 (con actualizaciones periodicas) ("Ausubel y col., 1992"); Innis y 55 col., PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press: San Diego, 1990. Los principios generales de microbiologia se exponen, por ejemplo, en Davis, B. D. y col., Microbiology, 3a edicion, Harper & Row, publishers, Philadelphia, Pa. (1980).

Por "promotor" se refiere en general a una region en una molecula de acido nucleico, preferiblemente una molecula

de ADN, a la que se une la ARN polimerasa e inicia la transcripcion. Un promotor se situa preferiblemente, pero no necesariamente, aguas arriba, es decir, 5', de la secuencia, cuya transcripcion controla. En la presente invencion, los promotores especificos se indican por el termino "P", seguido del nombre del gen del que se obtienen. Por ejemplo, "PthyA", que representa el promotor del gen thyA, y "PHIIA" que representa el promotor del gen hllA.

5

La expresion "promotor nativo" se refiere a un promotor cuya secuencia nucleotidica es identica a la de un promotor presente en la naturaleza, por ejemplo, en una celula u organismo en la naturaleza. Por lo tanto, el modificador "promotor nativo" se refiere a la secuencia del promotor y no debe interpretarse que se requiera que el promotor se obtenga o se produzca de cualquiera manera particular. A modo de ejemplo y no de limitacion, por lo tanto, el 10 termino incluira promotores en sus huespedes naturales, aislados de los mismos, clonados y propagados usando tecnologia de ADN recombinante, producidos por un metodo de amplificacion o generados por medios sinteticos, etc., en la medida en que la secuencia de dichos promotores sea la misma que la de sus contrarios de origen natural (vease, por ejemplo, la Tabla 1).

15 Un experto en la tecnica entiende que la secuencia nativa del promotor de un gen dado puede diferir entre diferentes especies de Lactococcus y/o entre diferentes subespecies en una unica especie de Lactococcus y/o entre diferentes cepas dentro de una unica especie o subespecies de Lactococcus, debido a la divergencia genetica natural entre dichas especies, subespecies y/o cepas. Por lo tanto, dichas secuencias promotoras divergentes pero de origen natural, se consideraran nativas.

20

Un experto en la tecnica en general es capaz de predecir e identificar promotores bacterianos naturales, tales como promotores de Lactococcus. No obstante, para ofrecer orientacion anadida, a menudo un promotor natural puede identificarse analizando una secuencia genomica o parte de la misma, de una bacteria, preferiblemente a partir de una especie Lactococcus; identificando un marco de lectura abierto en la misma, es decir, una sucesion de tripletes 25 nucleotidicos codificantes partiendo de un codon de inicio de la traduccion (preferiblemente, ATG) y cerrando con un codon de terminacion de la traduccion (por ejemplo, TAA, TAG o TGA) y que no contiene ningun codon de terminacion de la traduccion dentro del marco interno; y analizando la secuencia aguas arriba de dicho codon de inicio de la traduccion para localizar el codon de inicio de la traduccion mas aguas arriba, aguas arriba del cual se produce un codon de terminacion de la traduccion dentro del marco. Preferiblemente, la transcripcion del marco de 30 lectura abierto identificado de este modo puede verificarse experimentalmente, tal como, por ejemplo, por transferencia de Northern o RT-PCR; y el sitio de inicio de la transcripcion (por ejemplo, adyacente a los mas aguas arriba y/o, quizas uno o mas de los codones de inicio de la traduccion aguas abajo) puede evaluarse usando, por ejemplo, la amplificacion rapida 5' del metodo de extremos de ADNc (5'-RACE).

35 Tipicamente, las secuencias 5' adyacentes a y proximas al codon de inicio de la traduccion mas aguas arriba (y/o, si la evidencia experimental asi lo indica, uno o mas de los codones de inicio de la traduccion mas aguas abajo), pueden comprender el promotor nativo responsable de la transcripcion de dicho ORF. A modo de ejemplo preferido, cuando el primer nucleotido del codon de inicio de la traduccion se representa +1 (por ejemplo, el nucleotido A del codon ATG es +1) y el nucleotido directamente 5' del mismo se representa -1, entonces la expresion "promotor 40 nativo" puede referirse a la secuencia de aproximadamente -500 a aproximadamente +50, por ejemplo, de aproximadamente -500 a aproximadamente +20, de aproximadamente -500 a aproximadamente +10, de

aproximadamente -500 a aproximadamente +5, de aproximadamente -500 a aproximadamente +2, o de aproximadamente -500 a aproximadamente -1; preferiblemente de aproximadamente -400 a aproximadamente +50, por ejemplo, en los ejemplos preferidos, de aproximadamente -400 a aproximadamente +20, por ejemplo, de 45 aproximadamente -400 a aproximadamente +10, de aproximadamente -400 a aproximadamente +5, de

aproximadamente -400 a aproximadamente +2 o de aproximadamente -400 a aproximadamente -1; mas

preferiblemente de aproximadamente -300 a aproximadamente +50, por ejemplo, en ejemplos preferidos, de aproximadamente -300 a aproximadamente +20, por ejemplo, de aproximadamente -300 a aproximadamente +10, de aproximadamente -300 a aproximadamente +5, de aproximadamente -300 a aproximadamente +2 o de 50 aproximadamente -300 a aproximadamente -1; tal como, por ejemplo, en los ejemplos preferidos, de

aproximadamente -200 a aproximadamente +50 y en los ejemplos preferidos adicionales, de aproximadamente -200 a aproximadamente +20, por ejemplo, de aproximadamente -200 a aproximadamente +10, de aproximadamente - 200 a aproximadamente +5, de aproximadamente -200 a aproximadamente +2 o de aproximadamente -200 a aproximadamente -1; o tal como, por ejemplo, en otro ejemplo preferido, de aproximadamente -100 a 55 aproximadamente +50 y en ejemplos preferidos adicionales, de aproximadamente -100 a aproximadamente +20, por ejemplo, de aproximadamente -100 a aproximadamente +10, de aproximadamente -100 a aproximadamente +5, de aproximadamente -100 a aproximadamente +2 o de aproximadamente -100 a aproximadamente -1; en la medida en que dicha secuencia muestre la actividad promotora.

Tambien se contempla el uso de variantes funcionales de promotores de Lactococcus nativos en acidos nucleicos recombinantes de la invencion. El termino "variante" se refiere a una secuencia que es sustancialmente identica (es decir, en gran medida pero no totalmente identica) a una secuencia nativa correspondiente, por ejemplo, a la secuencia de un promotor de Lactococcus nativo correspondiente. "Sustancialmente identica" se refiere a, al menos 5 el 60 %, preferiblemente al menos el 70 % identica, mas preferiblemente al menos el 80 % identica, por ejemplo, al menos el 85 % identica, incluso mas preferiblemente al menos el 90 % identica, por ejemplo, al menos el 91 % identica, el 92 % identica, aun mas preferiblemente al menos el 93 % identica, por ejemplo, el 94 % identica, aun mas preferiblemente al menos el 95 % identica, por ejemplo, al menos el 96 % identica, incluso mas preferiblemente al menos el 97 % identica, por ejemplo, al menos el 98 % identica, y mucho mas preferiblemente al menos el 99 % 10 identica. Los alineamientos de secuencia y la determinacion de la identidad de secuencia pueden hacerse, por ejemplo, usando la herramienta de busqueda de alineamiento local basico (BLAST, Basic Local Alignment Search Tool) descrito originalmente por Altschul y col. (1990), tal como el algoritmo de "secuencias Blast 2" descrito por Tatusova y Madden (1999).

15 Tambien se contempla el uso de fragmentos funcionales de promotores Lactococcus nativos en acidos nucleicos recombinantes de la invencion. Como se usa en el presente documento, el termino "fragmento" se refiere a una secuencia que tiene una delecion 5' y/o 3' de uno o mas nucleotidos en comparacion con una secuencia nativa, por ejemplo, un promotor nativo de Lactococcus o una variante del mismo, pero donde la secuencia de acido nucleico restante del fragmento es identica a las posiciones correspondientes en la secuencia del promotor de Lactococcus 20 nativo o una variante del mismo. La secuencia restante de un fragmento puede representar preferiblemente al menos el 30 %, por ejemplo, al menos el 40 %, mas preferiblemente al menos el 50 %, por ejemplo, al menos el 60 %, incluso mas preferiblemente al menos el 70 %, por ejemplo, al menos el 80 % o al menos el 85 %, y aun mas preferiblemente al menos el 90 %, por ejemplo, al menos el 95 % o mas de la secuencia de acido nucleico del promotor de Lactococcus nativo o una variante del mismo, tal como se identifica por los metodos de la presente 25 invencion, por ejemplo, como se proporciona por las SEQ ID NO: especificas de la Tabla 1.

El termino "funcional" con referencia a las variantes y fragmentos de promotores como anteriormente, se refiere al hecho de que las variantes y fragmentos particulares tendran, al menos parcialmente, retenido la actividad promotora, es decir, la capacidad de unir ARN polimerasa e iniciar la transcripcion, del promotor nativo 30 correspondiente. Preferiblemente, dichas variantes funcionales o fragmentos funcionales pueden retener al menos el 50 % de la actividad del promotor nativo correspondiente, por ejemplo, al menos el 60 %, mas preferiblemente al menos el 70 %, por ejemplo, al menos el 80 %, aun mas preferiblemente al menos el 85 %, por ejemplo, al menos el 86 %, al menos el 87 %, al menos el 88 % o el 89 %, aun mas preferiblemente al menos el 90 %, por ejemplo, al menos el 91 %, al menos el 92 %, al menos el 93 %, al menos el 94 %, y mucho mas preferiblemente al menos el 35 95 %, por ejemplo, al menos el 96 %, al menos el 97 %, y muy preferiblemente al menos el 98 % o al menos el 99 % de la actividad del promotor nativo correspondiente. Ademas preferiblemente, dichas variantes funcionales o fragmentos funcionales pueden incluso tener mayor actividad que el promotor nativo correspondiente.

Un experto en la tecnica tambien puede apreciar que en la realizaciones, los acidos nucleicos recombinantes de la 40 invencion pueden incluso comprender mas de un promotor (P) y/o variante funcional y/o fragmento funcional de la invencion. Por ejemplo, dichos promotores, variantes funcionales o fragmentos funcionales - que pueden ser iguales o diferentes - pueden unirse operativamente a y controlar la expresion de distintas unidades de transcripcion dentro de dichos acidos nucleicos recombinantes. Como alternativa, o ademas, la expresion de una unica unidad de transcripcion puede controlarse en mas de un promotor, variante funcional y/o fragmento funcional, unidos 45 operativamente a la misma, que pueden ser iguales o diferentes. Por ejemplo, la asociacion operativa de mas de uno de los elementos anteriores que tiene actividad promotora con una unica unidad de transcripcion puede aumentar adicionalmente el nivel de transcripcion de dicha unidad. A modo de ejemplo, y no de limitacion, dichos promotores, variantes funcionales y/o fragmentos funcionales pueden disponerse secuencialmente, por ejemplo, secuencialmente aguas arriba de la unidad de transcripcion respectiva.

50

Aun como alternativa, la invencion tambien contempla acidos nucleicos recombinantes que comprenden promotores quimericos que incluyen dos o mas porciones obtenidas de diferentes promotores, variantes funcionales y/o fragmentos funcionales de la invencion, y juntos constituyen un nuevo promotor.

55 Un experto en la tecnica tendra conocimiento de tecnicas para evaluar la actividad de los promotores. Por ejemplo, una secuencia de acido nucleico cuya actividad como promotor se busca determinar puede insertarse en una construccion indicadora recombinante de tal forma que esta unida operativamente con una secuencia indicadora, preferiblemente una secuencia de codificacion indicadora, tal como, por ejemplo, proteina verde fluorescente (GFP) o cloranfenicol acetil transferasa (CAT), etc. y la expresion y/o acumulacion del ARNm indicador (por ejemplo, por

transferencia de Northern, RT-PCR cuantitativa, etc.) y/o la proteina (por ejemplo, por transferencia de Western, ELISA, medicion de fluorescencia o la actividad enzimatica, etc.) se ensaya cuando dicha construccion indicadora se introduce en las celulas huesped u organismos de interes.

5 En una realizacion preferida ejemplar, la expresion puede medirse para una proteina heterologa al organismo en el que se mide la expresion, por ejemplo, heterologa a la bacteria, preferiblemente heterologa a Lactococcus, incluso mas preferiblemente heterologa a Lactococcus lactis. Por ejemplo, en una realizacion preferida, la expresion en las bacteria, preferiblemente en Lactococcus, incluso mas preferiblemente en Lactococcus lactis, puede evaluarse para un gen que codifica un polipeptido de origen eucariota, incluso mas preferiblemente para cualquiera de los genes 10 que codifican los polipeptidos terapeuticamente relevantes disenados para la expresion usando los acidos nucleicos de la invencion (como se describe en cualquier parte en esta memoria descriptiva), preferiblemente GLP-2, GLP-1, PYY y TFF, y aun mas preferiblemente para cualquier de polipeptidos inmunomoduladores, citocinas, factores de crecimiento o interleucinas, tal como, muy preferiblemente para hIL-10. Los valores asi medidos para las secuencias de acido nucleico ensayadas indican la actividad o resistencia de los promotores potenciales comprendidos dentro 15 de dichas secuencias. Un experto en la tecnica tambien entiende que, para asegurar, la naturaleza comparativa de tales ensayos de la actividad promotora, deben mantenerse unas condiciones distintas de las secuencias de acido nucleico ensayadas sobre el mismo o, idealmente, los mismos entre los diferentes ensayos. Dichas condiciones pueden comprender, a modo de ejemplo, la cantidad de la construccion indicadora introducida en las celulas, el metodo de transformacion usado en dicha introduccion, el numero y sitio de integracion de dichas construcciones 20 indicadoras en el genoma de las celulas receptoras ensayadas, y/o el estado (por ejemplo, fase de crecimiento, por ejemplo, preferiblemente fase de crecimiento exponencial) de las celulas huesped receptoras en el momento de la medicion, etc. Un modo ejemplar de medir la resistencia de un promotor en celulas receptoras de Lactococcus lactis usando hIL-10 como el gen expresado, se indica en el Ejemplo 2. Un modo ejemplar adicional de medir la resistencia de un promotor en celulas receptoras de Lactococcus lactis y Lactobacillus casei usando GLP2 como el 25 gen expresado, se indica en los Ejemplos 3 y 4. Modos incluso mas preferibles de medir la fuerza de un promotor en celulas receptoras de Lactococcus lactis, usando ahora GLP1, hPYY, hIL-10 y TFF como los genes expresados, se indican en los Ejemplos 5-9. Los experimentos usando Lactobacillus casei como celulas receptoras dan lugar a resultados similares (no representados).

30 Por consiguiente, un promotor (1), que dice que es "mas fuerte" que otro promotor (2), mostrara una actividad significativamente mayor segun se evalua por los ensayos adecuados, por ejemplo, los descritos en el parrafo anterior, por ejemplo, el ensayo como se ilustra en los Ejemplos 2 a 9. Una actividad significativamente mayor se refiere a un hallazgo estadisticamente significativo de mayor actividad para el promotor (1), por ejemplo, preferiblemente con p <0,5 o p <0,05.

35

La actividad del promotor (1) puede ser mayor que la actividad del promotor (2) en cualquier medida y, preferiblemente, la actividad del promotor (1) puede ser mayor que la actividad del promotor (2) en al menos el 1 % del valor de la actividad del promotor (2), por ejemplo, en al menos el 2 %, al menos el 3 % o al menos el 4 %, mas preferiblemente en al menos el 5 %, por ejemplo, en al menos el 6 %, al menos el 7 %, al menos el 8 % o al menos 40 el 9 %, incluso mas preferiblemente en al menos el 10 %, por ejemplo, en al menos el 15 %, aun mas preferiblemente en al menos el 20 %, por ejemplo, en al menos el 30 % o al menos el 40 %, incluso mas preferiblemente en al menos el 50 %, por ejemplo, al menos el 60 %, al menos el 70 %, al menos el 80 % o al menos el 90 %, y en ejemplos muy preferidos adicionales en al menos el 100 %, al menos el 150 %, al menos el 200 %, al menos el 250 %, al menos el 300 %, al menos el 400 %, o al menos el 500 % del valor de la actividad del promotor 45 (2); o en ejemplos muy preferidos adicionales, la actividad del promotor (1) puede ser al menos 10 veces mas alta que la actividad del promotor (2), tal como al menos aproximadamente 50 veces, al menos aproximadamente 100 veces, al menos aproximadamente 500 veces o al menos aproximadamente 1000 veces mas alta.

Por consiguiente, para realizar variantes o fragmentos funcionales de promotores, especialmente de promotores 50 desvelados por la presente invencion, el experto sabra preparar dichas variantes (por ejemplo, por mutagenesis dirigida o aleatoria) o fragmentos (por ejemplo, por truncamiento 5' y/o 3', por ejemplo, por digestion de restriccion o PCR) y ensayar dichas variantes o fragmentos para determinar su actividad promotora como anteriormente. No obstante, a modo de orientacion adicional y no de limitacion, se aprecia que los promotores bacterianos a menudo incluyen secuencias de consenso adyacentes a las posiciones -10 y - 35. Por consiguiente, los fragmentos 55 funcionales de promotores bacterianos, por ejemplo, de Lactococcus, pueden comprender preferiblemente al menos secuencias correspondientes a las posiciones en los promotores nativos de aproximadamente -10 a aproximadamente -35, mas preferiblemente de aproximadamente -8 a aproximadamente -40, incluso mas preferiblemente de aproximadamente -5 a aproximadamente -40 o de aproximadamente -5 a aproximadamente -45, y aun mas preferiblemente de aproximadamente -2 o -1 a aproximadamente -50. Ademas, las variantes funcionales

de promotores bacterianos, por ejemplo, Lactococcus, pueden comprender preferiblemente secuencias de consenso adyacentes a las posiciones -10 y -35 como estan presentes en los promotores homologos nativos o como se conoce en la tecnica.

5 Una "union operativa" es una union en la que las secuencias de ADN reguladoras y la secuencia de ADN que se busca expresar estan conectadas de tal manera para permitir la expresion.

Por ejemplo, las secuencias de ADN, tales como, por ejemplo, preferiblemente un promotor y un marco de lectura abierto heterologo, se dice que estan unidas operativamente si la naturaleza del enlace entre las secuencias no (1) 10 da como resultado la introduccion de una mutacion por cambio de marco de lectura, (2) interfiere con la capacidad del promotor para dirigir la transcripcion del marco de lectura abierto, o (3) interfiere con la capacidad del marco de lectura abierto de transcribirse por la secuencia de la region promotora.

En una realizacion preferida ejemplar, dicho promotor puede situarse aguas arriba, es decir, 5', del marco o marcos 15 de lectura abiertos a los que esta unido operativamente.

La naturaleza precisa de las regiones reguladoras necesarias para la expresion puede variar de un organismo a otro, pero en general, incluiran una region promotora que, en los procariotas, contiene tanto el promotor (que dirige el inicio de la transcripcion del ARN), asi como las secuencias de ADN que, cuando se transcriben al ARN, senalaran 20 el inicio de la sintesis de proteinas. Dichas regiones normalmente incluiran las secuencias no codificantes 5' implicadas en el inicio de la transcripcion y la traduccion, tal como la caja Pribnow (vease, caja TATA), secuencia Shine-Dalgarno, y similares.

Ventajosamente, el codon de inicio de la traduccion respectivo con el que un promotor dado de la invencion se 25 asocia normalmente en la naturaleza, puede no incluirse en los acidos nucleicos recombinantes de la invencion, tal como para impedir el inicio de la traduccion de dichos codones. Por ejemplo, el extremo 3' del promotor puede truncarse en la posicion -1 o aguas arriba de la misma; como alternativa, el codon de inicio de la traduccion puede mutarse (por ejemplo, de ATG a un codon diferente); etc. Aun como alternativa, dicho codon de inicio de la traduccion nativo puede estar presente, y tambien posiblemente, varios codones posteriores (por ejemplo, 30 preferiblemente <20, mas preferiblemente <10, aun mas preferiblemente <5, por ejemplo, como mucho 1, 2, 3 o 4) del marco de lectura abierto asociado al promotor determinado en la naturaleza, y un marco de lectura abierto heterologo de interes puede fusionarse al mismo dentro del marco para producir un producto de fusion.

La expresion "marco de lectura abierto" u ORF, se refiere a una sucesion de tripletes nucleotidicos codificantes que 35 parten de un codon de inicio de la traduccion (preferiblemente ATG) y que cierran en un codon de terminacion de la traduccion (por ejemplo, TAA, TAG o TGA) y que no contienen ningun codon de terminacion de la traduccion dentro del marco interno, y potencialmente capaces de codificar un polipeptido. Por lo tanto, la expresion puede ser sinonima con "secuencia codificante" como se usa en la tecnica. En el acido nucleico recombinante de la invencion, los codones de inicio de la traduccion de uno o mas ORF pueden asociarse tipicamente a secuencias reguladoras 40 que controlan el inicio de la traduccion, por ejemplo, con la secuencia Shine-Dalgarno. Tambien se sabe que en las bacterias, incluyendo Lactococcus, pueden crearse unidades multi-cistronicas que contienen dos o mas ORF secuenciales controlados por un promotor aguas arriba comun, asociado los codones de inicio de la traduccion aguas abajo a dichas secuencias que controlan dicho inicio de la traduccion.

45 El termino "heterologo", cuando se refiere a la relacion entre un ORF dado y un promotor, significa que normalmente dicho promotor no esta asociado a este, es decir, normalmente no controla la transcripcion de dicho ORF en la naturaleza. En otras palabras, la asociacion se crea por tecnicas de ADN recombinante en los acidos nucleicos recombinantes de la invencion.

50 El termino "Lactococcus" se refiere generalmente al genero Lactococcus e incluye cualquier taxon (por ejemplo, especies, subespecies, cepa) clasificado como perteneciente a este en la tecnica. A modo de ejemplo, Lactococcus incluye las especies Lactococcus garvieae, Lactococcus lactis, Lactococcus piscium, Lactococcus plantarum y Lactococcus raffinolactis, y cualquier subespecies y cepas de las mismas.

55 En realizaciones preferidas de la invencion, Lactococcus es Lactococcus lactis. Lactococcus lactis incluye, sin limitacion, Lactococcus lactis ssp. cremoris, Lactococcus lactis ssp. hordniae, Lactococcus lactis ssp. lactis, Lactococcus lactis ssp. bv. diacetylactis.

En realizaciones adicionalmente preferidas de la invencion, Lactococcus lactis es Lactococcus lactis ssp. cremoris o

Lactococcus lactis ssp. lactis, mas preferiblemente Lactococcus lactis ssp. lactis, e incluye cualquier cepa de la misma, tal como, por ejemplo, Lactococcus lactis ssp. cremoris SK11 o Lactococcus lactis ssp. lactis MG1363.

En realizaciones preferidas, el promotor (P) se obtiene a partir de Lactococcus como se ha definido anteriormente, 5 mas preferiblemente a partir de los taxones preferidos de Lactococcus como se ha definido anteriormente, esp. en los dos parrafos anteriores.

Cuando se dice que un promotor (P) es mas fuerte que el promotor thyA de Lactococcus lactis en Lactococcus, esto significa que es mas fuerte en al menos uno, y potencialmente en mas de uno o en todos los taxones de 10 Lactococcus (por ejemplo, especies, subespecies o cepas). Preferiblemente, un promotor (P) puede ser asi de fuerte en al menos Lactococcus lactis. Tambien preferiblemente, un promotor (P) puede ser asi de fuerte en al menos Lactococcus lactis ssp. cremoris y Lactococcus lactis ssp. lactis, mas preferiblemente en al menos Lactococcus lactis ssp. lactis.

15 La expresion "timidilato sintasa" se refiere a la enzima EC 2.1.1.45 y "gen timidilato sintasa (thyA) de Lactococcus lactis” representa un gen que codifica dicha enzima en Lactococcus lactis. La secuencia del gen thyA de varios taxones de Lactococcus lactis se ha descrito, tal como, por ejemplo, a partir de MG1363 de Lactococcus lactis ssp. lactis (Ross y col., 1990; Steidler y col., 2003; Genbank acceso: AF462070), IL1403 de Lactococcus lactis ssp. lactis (Bolotin y col., 2001; Genbank GenelD: 1115198) y SK11 Lactococcus lactis ssp. cremoris (Genbank acceso: 20 NC_008527, locus LACR_1631, ID gen del genoma: 4434110). Un experto en la tecnica es capaz de identificar y aislar homologos del gen thyA a partir de taxones adicionales de Lactococcus lactis.

Por lo tanto, el promotor del gen thyA se refiere a un promotor nativo de cualquier gen thyA como se define en el presente documento. A modo de ejemplo, un promotor thyA dado puede referirse a una secuencia de acido nucleico 25 de aproximadamente -500 a aproximadamente +50 del gen thyA correspondiente (representando +1 el primer nucleotido del codon de inicio de la traduccion de un gen thyA dado); y a modo de ejemplos preferidos adicionales, de aproximadamente -500 a aproximadamente +20, de aproximadamente -500 a aproximadamente +10, de aproximadamente -500 a aproximadamente +5, de aproximadamente -500 a aproximadamente +2, o de -500 a aproximadamente -1; de aproximadamente -400 a aproximadamente +50,

de aproximadamente de aproximadamente

aproximadamente 30 aproximadamente aproximadamente aproximadamente aproximadamente

-400 a aproximadamente +20, -400 a aproximadamente +5,

de

-400 a aproximadamente +10, de -400 a aproximadamente +2 o de

-400 a aproximadamente -1; de aproximadamente -300 a aproximadamente +50

de aproximadamente de aproximadamente

-300 a aproximadamente +20,

aproximadamente -300 a aproximadamente +5,

35 aproximadamente -300 a aproximadamente -1; de aproximadamente aproximadamente -200 a aproximadamente +20, de aproximadamente

aproximadamente -200 a aproximadamente +5,

de

-300 a aproximadamente +10, de 300 a aproximadamente +2 o de -200 a aproximadamente +50.

-200 a aproximadamente +10 200 a aproximadamente +2 o de

de

de

de

de aproximadamente

aproximadamente -200 a aproximadamente -1; o de aproximadamente -100 a aproximadamente +50

aproximadamente -100 a aproximadamente +20, de aproximadamente -100 a aproximadamente +10, de

40 aproximadamente -100 a aproximadamente +5, de aproximadamente -100 a aproximadamente +2 o de

aproximadamente -100 a aproximadamente -1; en la medida en que dicha secuencia muestra aproximadamente la

misma, y preferiblemente la misma fuerza que el promotor thyA en la naturaleza.

Preferiblemente, el promotor thyA para su uso como referencia en la presente invencion, es el promotor del gen thyA 45 de MG1363 de Lactococcus lactis ssp. lactis, y un promotor de la invencion es mas fuerte con respecto al mismo como se ha definido anteriormente.

En un ensayo ejemplar, descrito en el Ejemplo 2 y basado en Steidler y col. 2003 (ibid.), el promotor thyA de MG1363 de L. lactis ssp. lactis, dirige la expresion de IL-10 humana al integrarse en una unica copia en el locus thyA 50 en la cepa MG1363 de 6,5 ng/1 x 109 bacterias. Por consiguiente, un promotor de la invencion que es mas fuerte que el promotor thyA puede conseguir, en dicho ensayo, una expresion de hIL-10 mayor de 6,5 ng/1 x 109 bacterias, preferiblemente >7 ng/1 x 109 bacterias, por ejemplo, >8 ng/1 x 109 o >9 ng/1 x 109 bacterias, incluso mas preferiblemente >10 ng/1 x 109 bacterias, por ejemplo, >11 ng/1 x 109 bacterias, >12 ng/1 x 109 bacterias, >13 ng/1 x 109 bacterias o >14 ng/1 x 109 bacterias, aun mas preferiblemente >15 ng/1 x 109 bacterias, aun mas preferiblemente 55 >20 ng/1 x 109 bacterias, por ejemplo, >25 ng/1 x 109 bacterias, >30 ng/1 x 109 bacterias, >35 ng/1 x 109 bacterias o >40 ng/1 x 109 bacterias, y mucho mas preferiblemente >50 ng/1 x 109 bacterias o mas, por ejemplo, >100 ng/1 x 109 bacterias; y en ejemplos muy preferidos adicionales >200 ng/1 x 109 bacterias, tales como >500 ng/1 x 109 bacterias, o >1000 ng/1 x 109 bacterias, o >2000 ng/1 x 109 bacterias, o >5000 ng/1 x 109 bacterias.

En ensayos ejemplares adicionales, por ejemplo, como se describe en los Ejemplos 3 y 4, la cepa MG1363 o L.casei comprende el vector pT1 NX, en el que el promotor thyA de MG1363 de L. lactis ssp. lactis dirige la expresion del gen GLP-2 humano. Por consiguiente, un promotor de la invencion, por ejemplo, el promotor PhllA, es mas fuerte que el promotor thyA cuando equivalentes de 1 ml de cultivos cultures se cosechan al final de la fase logaritmica, se 5 carga en SDS-PAGE y se analizan por transferencia de Western, la cantidad de GLP-2 expresado a traves del promotor de la invencion es mayor que a traves del promotor thyA. Se describen ensayos ejemplares adicionales en los Ejemplos 5 a 9.

En una realizacion relacionada, por lo tanto, la invencion tambien proporciona un acido nucleico recombinante que 10 comprende un promotor (P) unido operativamente a uno o mas marcos de lectura abiertos heterologos al promotor (P), por ejemplo, un gen GLP-2, un gen hIL-10, un gen GLP-1, un gen hPYY o un gen TTF, donde el promotor (P) se escoge entre el grupo que comprende o que consiste en los promotores nativos de genes de Lactococcus enumerados en los puntos 1) a 53) en la seccion Resumen, preferiblemente los promotores nativos de genes de Lactococcus enumerados en los que el promotor (P) se escoge entre el grupo que consiste en los promotores 15 nativos de genes de 1) ARN polimerasa dirigida a ADN, subunidad beta'/subunidad 160 kD (rpoC), 3) ferritina de union a hierro no hemo (dpsA), 4) piruvato cinasa (pyk), 5) glutaminil-ARNt sintetasas (gltX), 6) fosfopiruvato hidratasa (eno), 9) dipeptidasa PepV (pepV), 12) gliceraldehido-3-fosfato deshidrogenasa (gapB), 13) acetato cinasa (ackA), 18) fructosa bisfosfato aldolasa (fbaA), 20) superoxido dismutasa (sodA), 21) proteina ribosomal S12 (rpsL) y proteina ribosomal S7 (rpsG), 22) proteina ribosomal L18 (rplR) y proteina ribosomal S5 (rpsE) y proteina ribosomal 20 L30/L7E (rpmD), 24) proteina ribosomal L19 (rplS), 26) proteina ribosomal L10 (rplJ), 28) proteina de union de ADN tipo HU (hllA),), 29) proteina ribosomal 50S L28 (rpmB), 30) componente IIB del sistema fosfotransferasa (ptcB), como se define en la Tabla 1 en el punto 1) a 53), incluso mas preferiblemente, el promotor enumerado en los puntos 1), 3)-6), 9), 12), 13), 18), 20)-22), 24), 26), y 28)-30) de la Tabla 1, incluso mas preferiblemente, el promotor PhllA enumerado en el punto 28), el promotor PdpsA enumerado en el punto 3), el promotor PpepV enumerado en 25 el punto 9), o el promotor PsodA enumerado en el punto 20), y variantes funcionales y fragmentos funcionales de dichos promotores nativos. Tambien se prefiere que el promotor (P) se escoja entre el grupo que comprende o que consiste en los acidos nucleicos expuestos en la SEQ ID NO: 1, 3 a 6, 9, 12, 13, 18, 20 a 22, 24, 26, 28 a 54, 160, 163 a 165, 167, 169, 171 a 180, y variantes funcionales y fragmentos funcionales de dichos promotores nativos.

30 Dichas designaciones son evidentes para un experto e indican genes especificos de diversos taxones de Lactococcus (por ejemplo, especies, subespecies y cepas), tales como los taxones preferidos de Lactococcus que se han descrito anteriormente. No obstante, en virtud de orientacion adicional, la Tabla 1 que se indica a continuacion menciona numeros de ID de gen unicos que identifican dichos genes como la forma aislada de Lactococcus lactis ssp. cremoris SK11 (numero de acceso al Genbank para una secuencia genomica de longitud 35 completa de SK11: NC_008527) y ssp. lactis MG1363. Los numeros de ID de gen identifican de forma unica dichos genes en la base de datos "Entrez Gene" de NCBI (
www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fccgi?db=gene) como se describe en Maglott y col. 2005. En base a esto, un experto puede identificar y aislar homologos de dichos genes a partir de taxones adicionales de Lactococcus distintos de SK11 y/o MG1363, por ejemplo, las especies, subespecies y cepas preferidas como se indica en el presente documento. "Homologos" como se usa en el presente documento, 40 se refiere a secuencias, esp. de genes, de dos o mas taxones diferentes que son similares (por ejemplo, preferiblemente, pueden ser sustancialmente identicas como se define en el presente documento) como resultado de originarse a partir de un ancestro comun. Los homologos de los genes anteriores de SK11 y/o MG1363 cumplen preferiblemente la misma funcion en otros taxones de Lactococcus.

45 Un experto en la tecnica puede identificar y aislar promotores nativos que controlan la expresion de los genes enumerados en la Tabla 1 de SK11 y/o MG1363 u homologos de los mismos a partir de taxones de Lactococcus adicionales (incluyendo promotores que controlan la expresion de genes que se encuentran en unidades de transcripcion multi-cistronica y, por lo tanto, no pueden contener un promotor directamente aguas arriba de su codon de inicio de la traduccion, tal como es el caso en SK11 y/o MG1363, a modo de ilustracion, para rpsL - rpsG, 50 dirigiendo el promotor aguas arriba de rpsL la transcripcion de ambos; o para rplR - rpsE - rpmD, dirigiendo el promotor aguas arriba de rpsL la transcripcion de todos; o para rpID - rplW - rplB, dirigiendo el promotor aguas arriba de rplD la transcripcion de todos; o para rpsS - rplU - rplP - rplN, dirigiendo el promotor aguas arriba de rpsS la transcripcion de todos; o para rpsM, dirigiendo un promotor aguas arriba de un gen aguas arriba infA que codifica un factor de inicio de la traduccion 1 (IF-1) la transcripcion de rpsM) siguiendo las ensenanzas de esta memoria 55 descriptiva y usando el conocimiento comun en la tecnica.

En una realizacion preferida, la invencion proporciona un acido nucleico recombinante que comprende un promotor (P) unido operativamente a uno o mas marcos de lectura abiertos heterologos al promotor (P), donde el promotor (P) se escoge entre el grupo que comprende o que consiste en los promotores nativos de los genes de Lactococcus

enumerados en los puntos 1) a 30) en la seccion Resumen (es decir, los primeros 30 genes en la Tabla 1), incluso mas preferiblemente el promotor enumerado en los puntos 1), 3)-6), 9), 12), 13), 18), 20)-22), 24), 26), y 28)-30) de la Tabla 1, incluso mas preferiblemente el promotor PhllA enumerado en el punto 28), el promotor de la proteina tipo ferritina de union a ADN (protector del dano oxidativo) (dps) enumerado en el punto 3), el promotor de Xaa-His 5 dipeptidasa (argE o pep V) enumerado en el punto 9), o el promotor superoxido dismutasa (sodA) enumerado en el punto 20), y variantes funcionales y fragmentos funcionales de dichos promotores nativos.

En una realizacion preferida, la invencion proporciona un acido nucleico recombinante que comprende un promotor (P) unido operativamente a uno o mas marcos de lectura abiertos heterologos al promotor (P), donde el promotor (P) 10 se escoge entre el grupo que comprende o que consiste en los acidos nucleicos expuestos en la SEQ ID NO: 1 a 54 y 157 a 180, y homologos de los mismos, incluso mas preferiblemente, SEQ ID NO: 1, 3 a 6, 9, 12, 13, 18, 20 a 22, 24, 26, 28 a 54, 160, 163 a 165, 167, 169, 171 a 180, y variantes funcionales y fragmentos funcionales de dichos promotores nativos, incluso mas preferiblemente, SEQ iD NO: 1, 3 a 6, 9. 12, 13, 18, 20 a 22, 24, 26, 28 a 30, 160, 163 a 165, 167, 169 y 171, y variantes funcionales y fragmentos funcionales de dichos promotores nativos, 15 preferiblemente las SEQ ID NO: 28, 3, 9, 158 y/o 20, y variantes funcionales y fragmentos funcionales de los mismos.

Dichas secuencias SEQ ID NO: 1 a 54 y 157 a 180, representan promotores nativos ejemplares, pero no limitantes, asociados a la expresion de los genes enumerados en los puntos 1) a 53) anteriores (como se indica en mas detalle 20 en la Tabla 1) en MG1363 de Lactococcus lactis ssp. lactis y/o SK11 de Lactococcus lactis ssp. cremoris. Por consiguiente, estos promotores y homologos de los mismos (esp. de taxones de Lactococcus distintos de MG1363 y/o SK11) y variantes funcionales y derivados funcionales de los mismos, pueden ser utiles en los acidos nucleicos recombinantes de la invencion para realizar la expresion de marcos de lectura abiertos utiles en celulas huesped, preferiblemente en celulas huesped bacterianas, incluso mas preferiblemente en Lactococcus, aun mas 25 preferiblemente en Lactococcus lactis, todavia mas preferiblemente en Lactococcus lactis ssp. lactis, tal como en una cepa ejemplar preferida MG1363.

En una realizacion preferida adicional, el promotor (P) se escoge entre el grupo que comprende o que consiste en los acidos nucleicos expuestos en las SEQ ID NO: 1 a 54, y 157 a 180, mas preferiblemente las SEQ ID NO: 1, 3 a 30 6, 9. 12, 13, 18, 20 a 22, 24, 26, 28 a 54, 160, 163 a 165, 167, 169, 171 a 180, incluso mas preferiblemente, las SEQ ID NO: 1, 3 a 6, 9,12, 13, 18, 20 a 22, 24, 26, 28 a 30, 160, 163 a 165, 167, 169 y 171, mucho mas preferiblemente las SEQ ID NO: 28, 3, 9, 158 y/o 20, y homologos de los mismos, variantes funcionales y/o fragmentos funcionales de los mismos.

35 Aun en una realizacion preferida adicional, el promotor (P) se escoge entre el grupo que comprende o que consiste en los acidos nucleicos expuestos en las SEQ ID NO: 1 a 30, y 157 a 171, mas preferiblemente las SEQ ID NO: 28, 3, 9, 158 y/o 20, y variantes funcionales y fragmentos funcionales de los mismos.

En otra realizacion preferida, los acidos nucleicos recombinantes de la invencion comprenden adicionalmente una 40 secuencia terminadora de la transcripcion 3' con respecto a dichos uno o mas marcos de lectura abiertos. Por ejemplo, si unicamente esta presente un marco de lectura abierto, la secuencia terminadora puede situarse ventajosamente aguas abajo, es decir, 3', del mismo. Si el acido nucleico recombinante contiene dos o mas ORF, por ejemplo, ordenados sucesivamente y que forman juntos una unidad de transcripcion multicistronica, el terminador de la transcripcion puede situarse ventajosamente 3' con respecto al ORF mas aguas abajo.

45

La expresion "terminador de la transcripcion" se refiere a un elemento de secuencia al final de una unidad transcripcional que senala la terminacion de la transcripcion. Preferiblemente, un terminador de la transcripcion para su uso en la presente invencion, senalara la terminacion de la transcripcion en celulas huesped destinadas para su uso con los acidos nucleicos recombinantes de la invencion, tales como, por ejemplo, en celulas huesped 50 bacterianas, incluso mas preferiblemente en Lactococcus, aun mas preferiblemente en Lactococcus lactis. Las tecnicas para la identificacion y el aislamiento de los terminadores adecuados, por ejemplo, terminadores de Lactococci, se conocen en la tecnica (por ejemplo, vease van der Vossen y col., 1985), ya que son terminadores ejemplares, por ejemplo, vease van der Vossen y col., (1992), etc.

55 En una realizacion preferida adicional, los acidos nucleicos recombinantes de la invencion comprenden adicionalmente un operador configurado para controlar la transcripcion del promotor (P). Como se usa en el presente documento, el termino "operador" se refiere a una secuencia nucleotidica, preferiblemente una secuencia de ADN, que controla el inicio y/o el mantenimiento de la transcripcion de una secuencia de un promotor.

Tfpicamente, un operador puede colocarse en general entre un promotor y una secuencia aguas abajo, cuya transcripcion controlan los promotores. Normalmente, un operador es capaz de unir un polipeptido represor, por lo que reduce la transcripcion de dicho promotor. Un represor util puede alternar entre un estado en el que se une al operador, y un estado en el que no, y dicha alternancia puede controlarse ventajosamente por una condicion 5 externa, por ejemplo, una sustancia externa o un metabolito en particular. Por consiguiente, en las celulas huesped que comprenden un represor compatible, la inclusion de un operador en el acido nucleico de la invencion puede permitir controlar la actividad del promotor y la expresion del mismo. Los operadores-sistemas de represor ejemplares incluyen, por ejemplo, el sistema lac y tambien vease, por ejemplo, Nauta y col. (1996), o el sistema de biosintesis de histidina (vease, por ejemplo, Delorme y col., 1999). Las secuencias de operador pueden obtenerse 10 generalmente a partir de cromosomas bacterianos.

En una realizacion preferida adicional, los acidos nucleicos recombinantes de la invencion comprenden adicionalmente secuencias configuradas para realizar la insercion de dichos acidos nucleicos recombinantes en el genoma, por ejemplo, un cromosoma, de una celula huesped.

15

En un ejemplo particularmente preferido, la insercion de los acidos nucleicos de la invencion en sitios particulares dentro de un genoma, por ejemplo, un cromosoma, de una celula huesped puede facilitarse por recombinacion homologa. Por ejemplo, los acidos nucleicos recombinantes de la invencion pueden comprender una o mas regiones de homologia para dicho sitio de integracion dentro del genoma, por ejemplo, un cromosoma, de la celula huesped. 20 La secuencia en dicho sitio del genoma, por ejemplo, un cromosoma, puede ser natural, es decir, como aparece en la naturaleza, o puede ser una secuencia exogena introducida por ingenieria genetica anterior.

Por ejemplo, dicha region o regiones de homologia pueden ser de al menos 50 pb, preferiblemente al menos 100 pb, por ejemplo, al menos 200 pb, mas preferiblemente al menos 300 pb, por ejemplo, al menos 400 pb, incluso mas 25 preferiblemente al menos 500 pb, por ejemplo, al menos 600 pb o al menos 700 pb, aun mas preferiblemente al menos 800 pb, por ejemplo, al menos 900 pb, o al menos 1000 pb o mas.

En un ejemplo preferido, pueden incluirse dos regiones de homologia, una flanqueando cada lado de la unidad o unidades de expresion presentes en los acidos nucleicos de la invencion. Dicha configuracion puede insertar 30 ventajosamente las secuencias relevantes, es decir, las que realizan la expresion de los marcos de lectura abiertos de interes a partir de los promotores de la invencion, en las celulas huesped. En general, se conocen en la tecnica maneras de realizar la recombinacion homologa, especialmente en huespedes bacterianos, y seleccionar los recombinantes. Un metodo ejemplar y preferido es, por ejemplo, el de Steidler y col. (2003) para introducir secuencias exogenas en el locus thyA de Lactococcus.

35

Por lo tanto, en una realizacion preferida, la invencion tambien proporciona el acido nucleico recombinante al integrarse en el genoma, por ejemplo, un cromosoma, preferiblemente un cromosoma bacteriano, mas preferiblemente un cromosoma Lactococcus. Dicha integracion puede obtenerse en una celula huesped transformada con dicho acido nucleico recombinante o un vector que comprende la misma, como se describe en otra 40 parte en esta memoria descriptiva.

En una realizacion preferida, el uno o mas marcos de lectura abiertos unidos a un promotor de la invencion en los acidos nucleicos de la invencion codifican un polipeptido.

45 Como puede apreciarse, la esencia de la invencion se refiere principalmente a promotores novedosos y sus usos, y la naturaleza de dichos productos de expresion, preferiblemente polipeptidos, no se limita de ningun modo.

No obstante, las celulas huesped que comprenden marcos de lectura abiertos controlados por el promotor de Lactococcus se han indicado como medios para la produccion in vitro (veanse, por ejemplo, el documento US 50 5.559.007; Steidler y col., 1995; Wells y col., 1993B) y la administracion in vivo (vease, por ejemplo, los documentos WO 97/14806; WO 01/02570; Steidler y col., 2003; Steidler y col., 2000) de polipeptidos relevantes de origen virico, procariota o eucariota, incluyendo polipeptidos utiles en la prevencion o terapia de una enfermedad en el hombre y animales.

55 Por consiguiente, en una realizacion, dichos uno o mas marcos de lectura abiertos de los acidos nucleicos recombinantes de la invencion pueden codificar un producto de expresion, preferiblemente, un polipeptido, capaz de provocar una respuesta terapeutica en un sujeto, preferiblemente en un sujeto humano o animal.

En una realizacion particularmente util, ejemplar y no limitante, dichos uno o mas marcos de lectura abiertos de los

acidos nucleicos recombinantes de la invencion pueden codificar un antigeno y/o un polipeptido no vacinogeno terapeuticamente activo.

Como se usa en el presente documento, el termino "antigeno" se refiere generalmente a una sustancia que provoca 5 una respuesta inmunitaria, que incluye respuesta inmunitaria humoral y/o inmunitaria celular, y que es capaz de unirse con un producto, por ejemplo, un anticuerpo o un linfocito T, de la respuesta inmunitaria. Por lo tanto, en un ejemplo preferido, un antigeno requiere que el sujeto al que se le administra posea un sistema inmunologico funcional para provocar una respuesta fisiologica de dicho sujeto. El "antigeno" de la presente invencion tambien incluye "auto-antigenos" que no provocan una respuesta inmunitaria en un individuo sano, pero lo haran en una 10 persona que padece una enfermedad autoinmune, es decir, el fracaso de un organismo para reconocer sus propias partes constituyentes (abajo con respecto al nivel sub-molecular) como "propias", que da como resultado una respuesta inmunitaria contra sus propias celulas y tejidos. Cualquier enfermedad que sea resultado de tal respuesta inmunitaria aberrante se denomina una enfermedad autoinmune. Por consiguiente, el "antigeno" de la presente invencion tambien incluye una proteina (fisiologicamente activa) que no provocara una respuesta inmunitaria en un 15 individuo sano, pero que lo hara en una persona geneticamente deficiente en dicha proteina. Ademas, el "antigeno" de la presente invencion tambien incluye un alergeno que no provocara una respuesta inmunitaria en un individuo sano, pero que lo hara en una persona que padece una enfermedad alergica.

Un antigeno de acuerdo con la invencion puede obtenerse a partir de cualquier polipeptido para el que una 20 respuesta inmunitaria en un sujeto humano o animal sera terapeuticamente util, por ejemplo, de un patogeno, por ejemplo, de un patogeno virico, procariota (por ejemplo, bacteriano) o eucariota, de una proteina no fisiologica (por ejemplo, una proteina derivada de tejido canceroso), de un alergeno (por ejemplo, para provocar una tolerancia inmunitaria), etc. Un antigeno tambien puede ser un metabolito de una proteina. Como un ejemplo, el antigeno puede ser un polisacarido, un lipido u otro. Los promotores fuertes que se describen aqui, pueden conducir la 25 expresion de las enzimas necesarias para sintetizar o ensamblar dicho polisacarido, lipido u otro.

La expresion "un polipeptido no vacinogeno terapeuticamente activo" se refiere generalmente a un polipeptido que, en un sujeto humano o animal al que se administra, no provoca una respuesta inmunitaria contra si mismo, y es capaz de conseguir un efecto terapeutico. Por lo tanto, el efecto terapeutico de tal polipeptido se esperara que este 30 directamente unido a su propia funcion biologica natural, de manera que puede conseguir efectos particulares en un cuerpo de un sujeto; en lugar de producir un efecto terapeutico actuando como un antigeno inmunogeno y/o inmunoprotector en el sujeto. Por lo tanto, el polipeptido no vacinogeno terapeuticamente activo debe ser biologicamente activo en su forma expresada o, al menos, debe convertirse en la forma biologicamente activa una vez liberado de la celula huesped que lo expresa. Preferiblemente, dicha forma biologicamente activa de dicho 35 polipeptido puede mostrar una conformacion secundaria y, preferiblemente, tambien terciaria que sea la misma o estrechamente analoga a su configuracion nativa.

Preferiblemente, el polipeptido no vacinogeno terapeuticamente activo tambien es no toxico y no patogeno.

40 En una realizacion preferida, el polipeptido no vacinogeno terapeuticamente activo puede obtenerse a partir de un ser humano o animal, y puede corresponder preferiblemente al mismo taxon que el sujeto humano o animal al que se va a administrar.

Los ejemplos no limitantes de polipeptidos no vacinogenos terapeuticamente activos adecuados incluyen los que 45 son capaces de funcionar localmente o sistemicamente, por ejemplo, es un polipeptido capaz de ejercer actividades endocrinas que afectan el metabolismo local o de todo el cuerpo y/o el polipeptido o polipeptidos biologicamente activos son aquellos capaces de regular las actividades de las celulas pertenecientes al sistema inmunohematopoyetico y/o uno o mas polipeptidos biologicamente activos son aquellos capaces de afectar la viabilidad, el crecimiento y la diferenciacion de una variedad de celulas normales o neoplasicas en el cuerpo o de 50 afectar la regulacion inmunologica o la induccion de respuestas inflamatorias de fase aguda a lesiones e infecciones y/o uno o mas polipeptidos biologicamente activos son aquellos capaces de mejorar o inducir resistencia a la infeccion de las celulas y los tejidos mediante quimiocinas que actuan sobre sus receptores en la celula diana, o la proliferacion de celulas epiteliales o la promocion de la cicatrizacion de heridas y/o uno o mas polipeptidos biologicamente activos modulan la expresion o la produccion de sustancias por las celulas en el cuerpo.

55

Los ejemplos especificos de dichos polipeptidos incluyen, sin limitacion, insulina, hormona del crecimiento, prolactina, calcitonina, hormona luteinizante, hormona paratiroidea, somatostatina, hormona estimulante de las tiroides, polipeptido intestinal vasoactivo, citocinas tales como IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, cualquiera de IL-14 a IL-32, GM-CSF, M-CSF, SCF, IFNs, EPO, G-CSF, LIF, OSM, CNTF, GH, PRL, la familia

TNF de las citocinas, por ejemplo, TNFa, TNFb, CD40, CD27 o ligandos FAS, la familia IL-1 de las citocinas, la familia del factor de crecimiento de fibroblastos, los factores de crecimiento derivados de plaquetas, factores de crecimiento transformantes y factores de crecimiento de nervios, la familia del factor de crecimiento epidermico de citocinas, la insulina relacionada con citocinas, etc. Como alternativa, el polipeptido terapeuticamente activo puede 5 ser un receptor o antagonista para los polipeptidos terapeuticamente activos como se definen anteriormente. Los ejemplos especfficos adicionales de tales polipeptidos adecuados se enumeran, en el documento WO 96/11277, pagina 14, lfneas 1-30; en el documento wO 97/14806, pagina 12, lfnea 1 a pagina 13, lfnea 27; o el documento US 5.559.007, col. 8, lfnea 31 a col. 9, lfnea 9. Preferiblemente, el polipeptido adecuado es el peptido IL-10, por ejemplo, la IL-10 humana (hIL-10), por ejemplo, como se ilustra en el Ejemplo 2, 5 o 9.

10

En una realizacion preferida, el polipeptido adecuado es un peptido Trefoil, tal como TTF1, TTF2 y/o TTF3. Se han identificado tres miembros de esta familia de peptidos trefoil en seres humanos y se designan originalmente: pS2 (gen inducible de estrogenos de cancer de mama, Lefebvre, 1993), SP (peptido espasmolftico) e ITF (factor trefoil intestinal). En la presente nomenclatura, pS2 se renombra como TFF1, SP como TFF2 y ITF como TFF3 (vease, por 15 ejemplo, Wong y col., 1999). Esta nueva nomenclatura se usa a lo largo del presente texto. En seres humanos, ratones y ratas, TFF1 y TFF2 se encuentran predominantemente en el estomago, mientras que TFF3 se encuentra predominantemente en el duodeno y el colon. Se cree que TFF1 actua a traves del receptor de superficie celular (Tan y col., 1997). Wong y col. (1999) proporcionan una revision reciente de los peptidos trefoil. Los peptidos trefoil se secretan por las celulas epiteliales del moco y son estables en un entorno acido. Estos peptidos contribuyen a la 20 proteccion de la mucosa (formacion de un gel sobre el epitelio) y estan implicados probablemente en la reparacion de la mucosa danada por la estimulacion de migracion epitelial (Playford y col., 1996). La produccion de peptidos trefoil aumenta localmente en regiones en las que se produce un dano, tal como ulceras gastricas y colitis (Wright y col., 1990). Babyatsky y col. (1996) han mostrado que la administracion de peptidos trefoil recombinantes reduce el dano en estos lugares. En contradiccion con la mayorfa de las protefnas que son importantes para la proteccion de 25 la mucosa (tal como el factor del crecimiento epidermico), la mayorfa de los estudios han demostrado que los peptidos trefoil causan poca o ninguna proliferacion (Playford y col., 1996).

En otra realizacion preferida, el polipeptido adecuado es el peptido PYY, por ejemplo, el PYY humano (hPYY), e incluso mas preferiblemente la variante hPYY Gly9 (3-36) como se ilustra en el Ejemplo 7.

30

En una realizacion preferida adicional, el polipeptido adecuado es el peptido tipo glucagon 1 (GLP-1 o GLP1), por ejemplo, el GLP-1 humano (hGLP-1), e incluso mas preferiblemente la variante hGLP-1 Glicina 8 (7-36) como se ilustra en el Ejemplo 8. En una realizacion preferida, el polipeptido adecuado es el peptido tipo glucagon 2 (GLP-2 o GLP2). El gen proglucagon humano (GenBank acc. n.° NM_002054) codifica una prepro-protefna que se escinde en 35 cuatro peptidos maduros distintos, incluyendo peptido tipo glucagon 2 (GLP-2). GLP-2 administrado externamente produce varios efectos en los individuos, por ejemplo, en seres humanos, incluyendo crecimiento intestinal, mejora de la funcion intestinal, reduccion de la ruptura osea y neuroproteccion. GLP-2 puede actuar de forma endocrina para unir el crecimiento intestinal y el metabolismo con la ingesta de nutrientes. GLP-2, y analogos relacionados, pueden ser tratamientos para el sfndrome del intestino corto, enfermedad de Crohn, osteoporosis y como terapia 40 adyuvante durante quimioterapia por cancer. Preferiblemente, el gen GLP-2 se adapta al uso del codon preferido en Lactococcus, por ejemplo, L. lactis. Preferiblemente, el gen codifica la secuencia aminoacfdica

HADGSFSDEMNTILDNLAARDFINWLIQTKITD.

45 En otra realizacion preferida, el gen codifica un analogo de GLP-2 humano maduro con una sustitucion de alanina a glicina en la posicion 2, que se muestra que reduce la susceptibilidad a la degradacion por dipeptidil peptidasa-IV

(Booth y col., 2004), por ejemplo, el gen codifica la secuencia aminoacfdica

HGDGSFSDEMNTILDNLAARDFINWLIQTKITD.

50 En una realizacion incluso mas preferida, el gen GLP-2 esta adaptado al uso del codon preferido en Lactococcus y comprende una sustitucion de alanina a glicina en la posicion 2, por ejemplo, la secuencia nucleotfdica de h[Gly2]GLP-2:

CACGGTGATGGTTCATTTTCAGATGAAATGAACACTATCCTTGATAACCTTGCTGCTCGTGATTTTAT

CAACTGGCTTATCCAAACTAAAATCACTGATTAA.

Por consiguiente, en una realizacion, el acido nucleico recombinante de la invencion codifica un antfgeno y/o un polipeptido no vacinogeno terapeuticamente activo, en el que dicho antfgeno es capaz de provocar una respuesta inmunitaria, preferiblemente una respuesta inmunitaria protectora, en un sujeto humano o animal, y/o dicho

polipeptido no vacinogeno terapeuticamente activo es capaz de producir un efecto terapeutico en un sujeto humano o animal.

El documento WO 97/14806 desvela especificamente adicionalmente la co-expresion de antigenos con moleculas 5 estimuladoras de la respuesta inmune, tales como, por ejemplo, interleucinas, por ejemplo, IL-2 o IL-6, mediante bacterias. Por consiguiente, tambien se contempla tal co-expresion usando los promotores de la invencion.

En una realizacion preferida adicional, el marco de lectura abierto de acuerdo con la invencion comprende adicionalmente una secuencia que codifica una senal de secrecion en fase con un polipeptido codificado por el ORF. 10 Esto permite ventajosamente la secrecion del polipeptido expresado a partir de la celula huesped y puede facilitar de esta manera, por ejemplo, el aislamiento o la administracion.

Tipicamente, una secuencia senal de secrecion representa un segmento de aproximadamente 16 a aproximadamente 35 aminoacidos, que contiene normalmente aminoacidos hidrofobos que se embeben en la 15 membrana bicapa lipidica, y permiten de este modo la secrecion de una secuencia proteica o peptidica adjunta de la celula huesped, y que normalmente se escinde de esta proteina o peptido. Preferiblemente, la secuencia senal de secrecion puede estar activa de este modo en una celula huesped destinada para su uso con el acido nucleico que comprende dicha secuencia senal, por ejemplo, una celula huesped bacteriana, preferiblemente una bacteria de acido lactico, mas preferiblemente Lactococcus, incluso mas preferiblemente Lactococcus lactis. Las secuencias 20 senal de secrecion en celulas huesped adecuadas se conocen en la tecnica; las secuencias senal de Lactococcus ejemplares incluyen las de usp45 (vease, el documento US 5.559.007) y otros, vease, por ejemplo, Perez-Martinez y col. (1992); Sibakov y col. (1991). Preferiblemente, la secuencia senal se situa entre la secuencia promotora y el ORF, es decir, la secuencia senal se situa 3' de la secuencia promotora y precede al ORF del polipeptido de interes. En una realizacion preferida, la secuencia senal codifica la secuencia aminoacidica MKKKIISAlL MSTVILSAAA 25 PLSGVYA (usp45).

Los presentes inventores descubrieron sorprendentemente que la combinacion del promotor PhIIA con una secuencia senal de usp45 mutada da como resultado una produccion y secrecion controlable adicional del polipeptido de interes. En particular, el mutante comprende una asparagina (N) en la posicion 4 en lugar de una 30 lisina (K). En una realizacion preferida, la secuencia senal codifica la secuencia aminoacidica MKKNIISAIL MSTVILSAAA PLSGVYADTN.

En una realizacion preferida adicional, la presente invencion se refiere a acido nucleico recombinante como se define en el presente documento, en la que dicho acido nucleico recombinante comprende:

35

(a) PdpsA, usp45 y hIL-10 (sAGX0012); PdpsA, usp45N4 y hIL-10; PpepV, usp45 y hIL-10 (sAGX0018); PpepV, usp45N4 y hIL-10; PsodA, usp45 y hIL-10 (sAGX0029); PsodA, usp45N4 y hIL-10; PhIIA, usp45 y hIL-10 (sAGX0037); PhIIA, usp45N4 y hIL-10;

(b) PdpsA, usp45N4 y hTFF1; PdpsA, usp45 y hTFF1; PpepV, usp45N4 y hTFF1; PpepV, usp45 y hTFF1;

40 PsodA, usp45N4 y hTFF1; PsodA, usp45 y hTFF1; PhIIA, usp45N4 y hTFF1 (sAGX0048); PhIIA, usp45 y

hTFF1 (sAGX0049);

(c) PdpsA, usp45N4 y hTFF3; PdpsA, usp45 y hTFF3 (sAGX0048); PpepV, usp45N4 y hTFF3; PpepV, usp45 y hTFF3; PsodA, usp45N4 y hTFF3; PsodA, usp45 y hTFF3; PhIIA, usp45N4 y hTFF3 (saGx0057); PhIIA, usp45 y hTFF3;

45 (d) PdpsA, usp45N4 y hPYY; PdpsA, usp45 y hPYY(sAGX0048); PpepV, usp45N4 y hPYY; PpepV, usp45 y

hPYY; PsodA, usp45N4 y hPYY; PsodA, usp45 y hPYY; PhIIA, usp45N4 y hPYY (sAGX0057); PhIIA, usp45 y hPYY; PhIIA, usp45 y hPYY G9 (3-36) (sAGX0213);

(e) PdpsA, usp45N4 y GLP-1; PdpsA, usp45 y GLP-1; PpepV, usp45N4 y GLP-1; PpepV, usp45 y GLP-1; PsodA, usp45N4 y gLp-1 ; PsodA, usp45 y GLP-1; PhIIA, usp45N4 y GLP-1; PhIIA, usp45 y gLp-1 ;

50 (f) PdpsA, usp45N4 y GLP-2; PdpsA, usp45 y GLP-2; PpepV, usp45N4 y GLP-2; PpepV, usp45 y GLP-2;

PsodA, usp45N4 y GLP-2; PsodA, usp45 y GLP-2; PhIIA, usp45N4 y GLP-2; o PhIIA, usp45 y GLP-2.

En un aspecto adicional, la invencion se refiere a un vector que comprende el acido nucleico recombinante de la invencion.

55

Como se usa en el presente documento, "vector" se refiere a una molecula de acido nucleico, tipicamente ADN, en la que se pueden insertar y clonar, es decir, propagar, fragmentos de acidos nucleicos. Por lo tanto, un vector contendra tipicamente uno o mas sitios de restriccion unicos, y puede tener capacidad de replicacion autonoma en un organismo huesped o vehiculo definido de tal manera que la secuencia clonada es reproducible. Los vectores

pueden incluir, sin limitacion, plasmidos, fagemidos, bacteriofagos, vectores derivados de bacteriofagos, PAC, BAC, acidos nucleicos lineales, por ejemplo, ADN lineal, etc., segun sea adecuado (vease, por ejemplo, Sambrook y col. 1989; Ausubel 1992).

5 Los factores de importancia en la seleccion de un vector particular, por ejemplo, un plasmido, incluyen, entre otros: la facilidad con la que las celulas receptoras que contienen el vector pueden reconocerse y seleccionarse entre las celulas receptoras que no contienen el vector; el numero de copias del vector que se desean en un huesped particular; y si es deseable poder "intercambiar" el vector entre las celulas huesped de diferentes especies. Los vectores procariotas preferidos incluyen plasmidos tales como los que tienen capacidad de replicacion en E. coli 10 (tales como, por ejemplo, pBR322, ColEI, pSC101, pUC19, etc.). Dichos plasmidos se describen en, por ejemplo, Sambrook y col., 1989; Ausubel 1992. Los vectores particularmente preferidos pueden ser los que son capaces de replicar en E. coli (u otras bacterias Gram negativas), asi como en otra celula huesped de interes, tal como en una bacteria Gram positiva, una bacteria de acido lactico, preferiblemente Lactococcus, mas preferiblemente Lactococcus lactis (vease, por ejemplo, Kok y col. (1984). Otros vectores preferidos pueden ser aquellos capaces de 15 replicarse y/o intercambiarse entre una o mas bacterias Gram positivas, pero no en bacterias Gram negativas. En una realizacion preferida, el vector es pT1NX como se describe por Steidler y col., (1998), que se incorpora especificamente por referencia en el presente documento.

En un aspecto adicional, la invencion proporciona una celula huesped transformada con el acido nucleico 20 recombinante y/o con el vector de la invencion. Por ejemplo, dicha transformacion puede ser util para la propagacion y mantenimiento de dicho acido nucleico o vectores.

Como alternativa, o ademas, y ventajosamente, una celula huesped transformada sera capaz de transcribir el marco o marcos de lectura abiertos del acido nucleico de la invencion usando los promotores de la invencion y, 25 preferiblemente, expresar los productos de expresion, preferiblemente uno o mas polipeptidos, codificados por dichos marcos de lectura abiertos.

Por lo tanto, en un aspecto adicional, la invencion proporciona el uso del acido nucleico recombinante o vector de la invencion para conseguir la expresion de productos de expresion, preferiblemente uno o mas polipeptidos, 30 codificados por dichos marcos de lectura abiertos, en una celula huesped. Preferiblemente, los productos de expresion, por ejemplo, polipeptidos, pueden ser heterologos, es decir, exogenos, a dicha celula huesped.

Preferiblemente, una celula huesped sera una celula procariota, por ejemplo, una celula bacteriana, mas preferiblemente una bacteria no patogena y/o no invasiva, aun mas preferiblemente una bacteria Gram-positiva, 35 todavia mas preferiblemente una bacteria de acido lactico (por ejemplo, Lactococcus spp., Streptococcus spp., Lactobacillus spp., Leuconostoc spp., Pediococcus spp., Brevibacterium spp., Propionibacterium spp. o Bifidobacterium spp.), muy preferiblemente una bacteria de Lactococcus, y mucho mas preferiblemente una bacteria de Lactococcus lactis, por ejemplo, como se ha definido anteriormente; en la medida en que los promotores de la invencion estan activos adecuadamente en dichas celulas huesped.

40

El acido nucleico recombinante o el vector de la invencion pueden estar presentes en la celula huesped de manera extra-cromosomica, preferentemente con replicacion autonoma usando un propio origen de replicacion, o puede estar integrado en el ADN genomico bacteriano, por ejemplo, un cromosoma bacteriano, por ejemplo, en el cromosoma de Lactococcus. En este ultimo caso, una o varias copias de dicho acido nucleico pueden integrarse, 45 preferiblemente una unica copia; la integracion puede tener lugar en un sitio al azar del cromosoma o, como se ha descrito anteriormente, en un sitio predeterminado del mismo, preferiblemente en un sitio predeterminado, tal como, en un ejemplo preferido no limitante, en el locus thyA de Lactococcus, por ejemplo, de Lactococcus lactis, por ejemplo, como se describe por Steidler y col., (2003), que se incorpora especificamente por referencia en el presente documento.

50

Por consiguiente, en un aspecto adicional, la invencion proporciona una celula huesped que comprende un acido nucleico recombinante, como se define en el presente documento, en el que dicho promotor (P) esta presente en el cromosoma de dicha celula huesped, y en el que dicho promotor (P) esta unido operativamente a uno o mas marcos de lectura abiertos heterologos a dicho promotor (P), mas preferiblemente, dicho promotor (P) comprende 55 adicionalmente una secuencia senal, preferiblemente usp45 o usp45N4, mas preferiblemente dicho promotor (P) comprende adicionalmente un operador configurado para controlar la transcripcion de dicho promotor (P), e incluso mas preferiblemente, el promotor (P) se escoge entre el grupo que consiste en los acidos nucleicos expuestos en las SEQ ID NO: 1, 3 a 6, 9, 12, 13, 18, 20 a 22, 24, 26, 28 a 54, 160, 163 a 165, 167, 169, 171 a 180, y homologos de los mismos, y variantes funcionales y fragmentos funcionales de los mismos.

En un aspecto adicional, la invencion proporciona una celula huesped como se define en el presente documento, en la que dicho uno o mas marcos de lectura abiertos codifican un polipeptido capaz de provocar una respuesta terapeutica o respuesta inmunogena en un sujeto, preferiblemente en un sujeto humano o animal, preferiblemente 5 dichos uno o mas marcos de lectura abiertos codifican un antigeno y/o un polipeptido no vacinogeno terapeuticamente activo, incluso mas preferiblemente dicho antigeno es capaz de provocar una respuesta inmunitaria, preferiblemente una respuesta de tolerancia inmunitaria, en un sujeto humano o animal, y/o dicho polipeptido no vacinogeno terapeuticamente activo es capaz de producir un efecto terapeutico en un sujeto humano o animal. En un aspecto preferido adicional, la invencion proporciona una celula huesped como se define en el 10 presente documento, en la que dicho polipeptido no vacinogeno terapeuticamente activo es hIL-10, GLP-2, GLP-1, TFF o hPYY. En otro aspecto preferido mas, la invencion proporciona una celula huesped como se define en el presente documento, en la que dicho antigeno es capaz de provocar una respuesta inmunitaria y se usa como una vacuna en un sujeto humano o animal, y/o.

15 En una realizacion preferida adicional, la presente invencion se refiere a una celula huesped como se define en el presente documento, en la que dicha celula huesped comprende:

(a) PdpsA, usp45 y hIL-10 (sAGX0012); PdpsA, usp45N4 y hIL-10; PpepV, usp45 y hIL-10 (sAGX0018); PpepV, usp45N4 y hIL-10; PsodA, usp45 y hIL-10 (sAGX0029); PsodA, usp45N4 y hIL-10; PhIIA, usp45 y

20 hIL-10 (sAGX0037); PhIIA, usp45N4 y hIL-10;

(b) PdpsA, usp45N4 y hTFF1; PdpsA, usp45 y hTFF1; PpepV, usp45N4 y hTFF1; PpepV, usp45 y hTFF1; PsodA, usp45N4 y hTFF1; PsodA, usp45 y hTFF1; PhIIA, usp45N4 y hTFF1 (sAGX0048); PhIIA, usp45 y hTFF1 (sAGX0049);

(c) PdpsA, usp45N4 y hTFF3; PdpsA, usp45 y hTFF3 (sAGX0048); PpepV, usp45N4 y hTFF3; PpepV,

25 usp45 y hTFF3; PsodA, usp45N4 y hTFF3; PsodA, usp45 y hTFF3; PhIIA, usp45N4 y hTFF3 (saGx0057);

PhIIA, usp45 y hTFF3;

(d) PdpsA, usp45N4 y hPYY; PdpsA, usp45 y hPYY(sAGX0048); PpepV, usp45N4 y hPYY; PpepV, usp45 y hPYY; PsodA, usp45N4 y hPYY; PsodA, usp45 y hPYY; PhIIA, usp45N4 y hPYY (sAGX0057); PhIIA, usp45 y hPYY; PhIIA, usp45 y hPYY G9 (3-36) (sAGX0213);

30 (e) PdpsA, usp45N4 y GLP-1; PdpsA, usp45 y GLP-1; PpepV, usp45N4 y GLP-1; PpepV, usp45 y GLP-1;

PsodA, usp45N4 y gLp-1 ; PsodA, usp45 y GLP-1; PhIIA, usp45N4 y GLP-1; PhIIA, usp45 y gLp-1 ;

(f) PdpsA, usp45N4 y GLP-2; PdpsA, usp45 y GLP-2; PpepV, usp45N4 y GLP-2; PpepV, usp45 y GLP-2; PsodA, usp45N4 y GLP-2; PsodA, usp45 y GLP-2; PhIIA, usp45N4 y GLP-2; o PhIIA, usp45 y GLP-2.

35 En un aspecto adicional, la invencion proporciona un metodo para la expresion recombinante de un producto de expresion, preferiblemente un polipeptido, de interes que comprende:

a) cultivar la celula huesped que comprende un acido nucleico recombinante o vector de la invencion, donde dicho uno o mas marcos de lectura abiertos codifican el producto de expresion, preferiblemente un

40 polipeptido, de interes, y

b) aislar el producto de expresion, preferiblemente un polipeptido, de interes producido por la celula huesped en dicho cultivo.

Un experto en la tecnica conoce generalmente y puede optimizar adicionalmente las condiciones de cultivo, por 45 ejemplo, temperatura, presencia y concentracion los nutrientes necesarios, oxigenacion, agitacion, inoculacion, etc. que permiten la expresion de los polipeptidos en las celulas huesped, preferiblemente las celulas huesped de la invencion.

Un experto en la tecnica tambien conoce y puede optimizar adicionalmente las tecnicas de purificacion para el 50 aislamiento de los productos de expresion, tales como, preferiblemente polipeptidos, expresados por dichas celulas huesped. Por ejemplo, las tecnicas adecuadas de aislamiento de proteinas pueden implicar la lisis del organismo huesped (por ejemplo, cuando el polipeptido se acumula intracelularmente), por ejemplo, por alteracion mecanica o enzimatica de la pared celular, y la eliminacion de los residuos celulares, o la recogida del sobrenadante (por ejemplo, cuando los polipeptidos se secretan), la eliminacion de los componentes distintos de proteinas, tal como el 55 ADN y los lipopolisacaridos, precipitacion de sulfato de amonio, cromatografia de exclusion de tamano, por ejemplo, para enriquecer la proteina deseada, cromatografia de afinidad, etc.

En un aspecto adicional, la invencion proporciona el uso de la celula huesped transformada con el acido nucleico recombinante y/o el vector de la invencion para la fabricacion de un medicamento para la administracion del

producto o productos de expresion, preferiblemente uno o mas polipeptidos, codificados por el uno o mas marcos de lectura abiertos comprendidos dentro de dicho acido nucleico recombinante para un ser humano o animal.

En un aspecto relacionado, la invencion proporciona un metodo para la administracion de un polipeptido codificado 5 por el uno o mas marcos de lectura abiertos comprendidos dentro del acido nucleico recombinante de la invencion para un ser humano o animal que necesita el mismo, que comprende administrar a dicho ser humano o animal una cantidad terapeuticamente eficaz de celulas huesped transformadas con dicho acido nucleico y/o vector de la invencion. El animal puede ser preferiblemente un mamifero, tal como, por ejemplo, animales domesticos, animales de granja, animales de zoologico, animales deportivos, mascotas y animales experimentales, tales como perros, 10 gatos, cobayas, conejos, ratas, ratones, caballos, ganado, vacas; primates tales como simios, monos, orangutanes y chimpances; canidos, tales como perros y lobos; felinos, tales como gatos, leones y tigres; equinos, tales como caballos, burros y cebras; animales destinados a la alimentacion, tales como vacas, cerdos y ovejas; ungulados, tales como ciervos y jirafas; roedores, tales como ratones, ratas, hamsteres y cobayas; etc.

15 Como se usa en el presente documento, los terminos "tratar" o "tratamiento" se refieren tanto al tratamiento terapeutico y profilactico como a medidas preventivas, donde el objetivo es prevenir o ralentizar (disminuir) un cambio o trastorno fisiologico indeseado. Un "ser humano o animal que necesita tratamiento" incluye uno que pudiera beneficiarse del tratamiento de una afeccion dada.

20 La expresion "cantidad terapeuticamente eficaz" se refiere a una cantidad de una sustancia o composicion terapeutica eficaz para tratar una enfermedad o trastorno en un sujeto, por ejemplo, un ser humano o animal, es decir, para obtener un efecto local o sistemico y un rendimiento deseado. A modo de ejemplo, una cantidad terapeuticamente eficaz de bacterias puede comprender al menos 1 bacteria, o al menos 10 bacterias, o al menos 102 bacterias, o al menos 103 bacterias, o al menos 104 bacterias, o al menos 105 bacterias, o al menos 25 106 bacterias, o al menos 107 bacterias, o al menos 108 bacterias, o al menos 109, o al menos 1010, o al menos 1011, o al menos 1012, o al menos 1013, o al menos 1014, o al menos 1015, o mas celulas huesped, por ejemplo, bacterias, por ejemplo, en una dosis individual o repetida.

Las celulas huesped de la presente invencion pueden administrarse en solitario o en combinacion con uno o mas 30 compuestos activos. Estos ultimos pueden administrarse antes, despues o simultaneamente con la administracion de dichas celulas huesped.

Existen varias divulgaciones de la tecnica anterior sobre la administracion de antigenos y/o polipeptidos terapeuticamente activos, y debe apreciarse que tales divulgaciones pueden modificarse de manera mas ventajosa 35 con los promotores fuertes de la presente invencion. A modo de ejemplo y no de limitacion, la administracion bacteriana de interleucinas, particularmente IL-10, para el tratamiento de la colitis (por ejemplo, vease el documento WO 00/23471), la administracion de antigenos como vacunas (por ejemplo, documento WO 97/14806), la administracion de GLP-2 y analogos relacionados, pueden usarse para tratar una enfermedad del intestino delgado, enfermedad de Crohn, osteoporosis y como terapia adyuvante durante la quimioterapia de cancer, etc. Ademas, 40 puede usarse la administracion bacteriana de peptidos trebol para tratar enfermedades del tubo digestivo (vease, por ejemplo, el documento WO 01/02570). En particular, el uso de proteinas o peptidos trebol para el tratamiento de trastornos de y danos al tubo digestivo, incluyendo la boca, el esofago, el estomago y el intestino grueso y delgado, asi como para la proteccion y tratamiento de tejidos que se encuentran fuera del tubo digestivo, se describen en los documentos WO 97/38712 y WO 92/14837. Estas proteinas pueden usarse para tratar lesiones en estas areas o 45 para inhibir la formacion de lesiones. Estas lesiones pueden causarse por: terapia de radiacion o quimioterapia para el tratamiento de cancer, cualquier otro farmaco que incluya alcohol que dane el tubo digestivo, una exposicion accidental a radiacion o a una sustancia caustica, infeccion, un trastorno digestivo, incluyendo, pero sin limitacion, dispepsia no ulcerosa, gastritis, ulcera peptica o duodenal, cancer gastrico, linfoma MALT, sindrome de Menetier, enfermedad por reflujo gastroesofagico, enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa y colitis aguda de origen quimico, 50 bacteriano o desconocido. Los peptidos trefoil son particularmente utiles para tratar la colitis aguda. Se preven aplicaciones terapeuticas adicionales que usan los promotores y celulas huesped de la invencion.

Los ejemplos no limitantes adicionales de los tipos de enfermedades tratables en seres humanos o animales por administracion de polipeptidos terapeuticos de acuerdo con la invencion incluyen, pero sin limitacion, por ejemplo, 55 enfermedades inflamatorias del intestino, incluyendo enfermedad de Crohn y colitis ulcerosa (tratables con, por ejemplo, IL-Ira o IL-10 o peptidos trefoil); enfermedades autoinmunes, incluyendo, pero sin limitacion, psoriasis, artritis reumatoide, lupus eritematoso (tratables con, por ejemplo, IL-Ira o IL-10 o el auto-antigeno relevante); enfermedades alergicas, incluyendo, pero sin limitacion, asma, alergias alimentarias, (tratables con el alergeno relevante); enfermedad celiaca (tratable con alergenos del gluten); trastornos neurologicos incluyendo, pero sin

limitacion, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson y esclerosis lateral amiotrofica (tratables con, por ejemplo, factor neurotrofico derivado del cerebro y factor neurotrofico ciliar); cancer (tratable con, por ejemplo, IL-1, factores estimuladores de colonias o interferon-W); osteoporosis (tratable con, por ejemplo, factor del crecimiento transformante f3); diabetes (tratable con, por ejemplo, insulina); enfermedad cardiovascular (tratable con, por 5 ejemplo, activador del plasminogeno tisular); aterosclerosis (tratable con, por ejemplo, citocinas y antagonistas de citocinas); hemofilia (tratable con, por ejemplo, factores de coagulacion); enfermedad hepatica degenerativa (tratable con, por ejemplo, factor de crecimiento de hepatocitos o interferon a); enfermedades pulmonares, tal como fibrosis quistica (tratables con, por ejemplo, alfa antitripsina); obesidad; infecciones por patogenos, por ejemplo, infecciones viricas o bacterianas (tratables con varias de las composiciones o antigenos que se han mencionado anteriormente); 10 etc.

El lector experto apreciara que las enfermedades que se mencionan especificamente en el presente documento son unicamente ejemplares y su mencion no se limita en ningun modo para limitar el uso de los reactivos proporcionados por la invencion, por ejemplo, los promotores, acidos nucleicos, vectores y celulas huesped de la invencion, a estas 15 enfermedades particulares. En su lugar, un lector experto entiende que los reactivos de la invencion pueden usarse para expresar en principio, cualquier producto de expresion, preferiblemente polipeptidos, de interes, que pueden tener relevancia terapeutica no solo en las mencionadas, sino tambien en diversas enfermedades o afecciones adicionales en seres humanos y animales. En consecuencia, una vez se ha escogido o determinado para una dolencia determinada un producto de expresion adecuado, preferiblemente un polipeptido, por ejemplo, un antigeno 20 y/o un polipeptido no vacinogeno terapeuticamente activo, un experto sera capaz de conseguir su expresion, aislamiento y/o administracion usando los reactivos de la invencion.

La invencion tambien contempla el tratamiento de enfermedades en otros animales, incluyendo perros, caballos, gatos y aves. Las enfermedades en perros incluyen, pero sin limitacion, moquillo canino (paramyxovirus), hepatitis 25 canina (tos de las perreras por adenovirus Cav-1 o laringotraqueitis (adenovirus Cav-2), enteritis canina infecciosa (coronavirus) y enteritis hemorragica (parvovirus).

Las enfermedades en gatos incluyen, pero sin limitacion, rinotraqueitis virica (herpesvirus), enfermedad calicivirus felino (calicivirus), peritonitis infecciosa felina (parvovirus) y leucemia felina (virus de la leucemia felina). Tambien se 30 contemplan otras enfermedades viricas en caballos y aves como tratables usando los metodos y composiciones de la invencion. Para este fin, se preferira particularmente el uso de microorganismos que expresan interferones recombinantes.

En un aspecto adicional, por lo tanto, la invencion proporciona una composicion farmaceutica que comprende la 35 celula huesped transformada con el acido nucleico y/o el vector de la invencion.

Preferiblemente, dicha formulacion comprende una cantidad terapeuticamente eficaz de las celulas huesped de la invencion y un vehiculo farmaceuticamente aceptable, es decir, una o mas sustancias de vehiculo farmaceuticamente aceptables y/o aditivos, por ejemplo, tampones, vehiculos, excipientes, estabilizantes, etc.

40

La expresion "farmaceuticamente aceptable" como se usa en el presente documento, es coherente con la tecnica y significa compatible con los otros ingredientes de una composicion farmaceutica y no perjudiciales para el receptor de la misma.

45 Las celulas huesped recombinantes de la invencion pueden suspenderse en una formulacion farmaceutica para su administracion al ser humano o animal que tiene la enfermedad a tratar. Dichas formulaciones farmaceuticas incluyen, pero sin limitacion, celulas huesped vivas y un medio adecuado para su administracion. Las celulas huesped recombinantes pueden liofilizarse en presencia de excipientes comunes, tales como lactosa, otros azucares, estearato alcalino y/o alcalinoterreo, carbonato y/o sulfato (por ejemplo, estearato de magnesio, carbonato 50 sodico y sulfato sodico), caolin, silice, saporiferos y aromas.

Las celulas huesped liofilizadas de esta manera pueden prepararse en forma de capsulas, comprimidos, granulos y polvos, cada uno de los cuales puede administrarse por la via oral.

55 Como alternativa, algunas bacterias recombinantes pueden prepararse como suspensiones acuosas en medios adecuados, o las bacterias liofilizadas pueden suspenderse en un medio adecuado justo antes de su uso, incluyendo dicho medio los excipientes a los que se hace referencia en el presente documento y otros excipientes, tales como glucosa, glicina y sacarinato sodico.

Para la administracion por via oral, pueden formularse formas de dosificacion por via oral gastro-resistentes, cuyas formas de dosificacion pueden incluir ademas compuestos que proporcionan la liberacion controlada de las celulas huesped y de ese modo proporcionan la liberacion controlada de la proteina deseada codificada en las mismas. Por ejemplo, la forma de dosificacion por via oral (incluyendo comprimidos, perlas, granulados, polvos) puede estar 5 recubierta con una fina capa de excipiente (normalmente polimeros, derivados celulosicos y/o materiales lipofilos) que resiste la disolucion o la ruptura en el estomago, pero no en el intestino, permitiendo de ese modo el transito a traves del estomago a favor de la desintegracion, la disolucion y la absorcion en el intestino.

La forma de dosificacion por via oral puede disenarse para permitir la liberacion lenta de las celulas huesped y de la 10 proteina recombinante de las mismas, por ejemplo como de liberacion controlada, de liberacion sostenida, de liberacion prolongada, comprimidos o capsulas de accion sostenida. Estas formas de dosificacion normalmente contienen excipientes convencionales y bien conocidos, tales como excipientes lipofilos, polimericos, celulosicos, insolubles, hinchables. Las formulaciones de liberacion controlada ademas pueden usarse para cualquier otro sitio de administracion, que incluye administracion intestinal, colon, bioadhesion o sublingual (es decir, administracion por 15 la mucosa dental) y administracion bronquial. Cuando las composiciones de la invencion son para administrarse por via rectal o vaginal, las formulaciones farmaceuticas pueden incluir supositorios y cremas. En este caso, las celulas huesped se suspenden en una mezcla de excipientes comunes que incluyen ademas lipidos. Cada una de las formulaciones mencionadas anteriormente se conocen bien en la tecnica y se describen, por ejemplo, en las siguientes referencias: Hansel y col. (1990), Chien (1992), Prescott y col. (1989), y Cazzaniga y col. (1994).

20

Preferiblemente, una formulacion de enema puede usarse para la administracion rectal. El termino "enema" se usa para incluir las preparaciones liquidas destinadas para uso rectal. El enema normalmente puede suministrarse en envases de dosis unica y contiene uno o mas principios activos disueltos o dispersados en agua, glicerol o macrogoles u otros disolventes adecuados.

25

Por lo tanto, de acuerdo con la invencion, en una realizacion preferida, las celulas huesped recombinantes que codifican un gen deseado pueden administrarse al animal o humano a traves de la mucosa, por ejemplo, una ruta oral, nasal, rectal, vaginal o bronquial puede ser una cualquiera de las formulaciones del estado de la tecnica aplicable a la ruta especifica. La dosificacion de las celulas huesped para la administracion variara dependiendo de 30 cualquier numero de factores que incluyen el tipo de bacteria y el gen codificado de este modo, el tipo y gravedad de la enfermedad a tratar y la ruta de administracion a usar.

Por lo tanto, no se pueden definir dosis precisas para cada realizacion de la invencion, pero seran facilmente evidentes para los expertos en la tecnica una vez armados con la presente invencion. La dosificacion puede 35 determinarse de cualquier manera caso a caso mediante la medicion de las concentraciones a nivel del suero de la proteina recombinante despues de la administracion de un numero predeterminado de celulas, usando metodos bien conocidos, tales como los conocidos como ELISA o Biacore (veanse los ejemplos). El analisis del perfil cinetico y la semivida de la proteina recombinante suministrada proporciona informacion suficiente para permitir la determinacion de un intervalo de dosificacion eficaz para las celulas huesped transformadas.

40

En una realizacion, cuando las celulas huesped expresan un antigeno, la invencion puede proporcionar ademas una vacuna.

El termino "vacuna" identifica una composicion farmaceuticamente aceptable que, cuando se administra en una 45 cantidad eficaz a un sujeto humano o animal, es capaz de inducir anticuerpos frente a un inmunogeno comprendido en la vacuna y/o provoca inmunidad protectora en el sujeto.

La vacuna de la invencion comprendera las celulas huesped transformadas con los acidos nucleicos o vectores de la invencion y opcionalmente, ademas, un excipiente. Dichas vacunas tambien pueden comprender un adyuvante, es 50 decir, un compuesto o composicion que mejora la respuesta inmunitaria a un antigeno. Los adyuvantes incluyen, pero sin limitacion, adyuvante de Freund completo, adyuvante de Freund incompleto, saponina, genes minerales, tales como hidroxido de aluminio, sustancias de superficie activa, tal como lisolecitina, polioles pluronicos, polianiones, peptidos, emulsiones de aceite o hidrocarburo, y adyuvantes humanos farmaceuticamente aceptables potencialmente utiles, tal como BCG (bacilo Calmetle-Guerin) y Corynebacterium parvum.

55

En realizaciones preferidas adicionales, la presente invencion se refiere al uso de una celula huesped como se define en el presente documento para la fabricacion de un medicamento para la administracion de un polipeptido codificado por uno o mas de dichos marcos de lectura abiertos del acido nucleico recombinante para un ser humano o animal, preferiblemente dicho polipeptido es un antigeno y/o un polipeptido no vacinogeno terapeuticamente

activo, preferiblemente hIL-10, GLP-2, GLP-1, TFF o hPYY como se ha definido anteriormente. La presente invencion se refiere adicionalmente a una composicion farmaceutica que comprende la celula huesped como se define en el presente documento. Ademas, la presente invencion se refiere adicionalmente a una celula huesped como se define en el presente documento, para su uso como un medicamento.

5

10 Ejemplos

Materiales usados en los ejemplos

GM17

15

- Caldo M17 (Oxoid CM0817) preparado de acuerdo con las instrucciones del fabricante, pero sin anadir azucares.

- glucosa al 20 % (Merck 1.08337) esterilizada por filtracion (Stericup-GV 0,22 pm PVDF Millipore CGVU05RE).

20 - Caldo GM17: M17 complementado con glucosa al 0,5 %.

GM17T es GM17 complementado con timidina 200 pM (Sigma #T9250)

GM17E es GM17, complementado con 5 pg/ml de eritromicina (Sigma #E6376) por dilucion de 25 mg/ml de eritromicina en solucion madre de etanol al 96 %.

25 BM9

- Casitona al 10 % (Difco 225930) autoclave durante 15 min a 121 °C.

- NaHCO3 0,5 M (Merck 1.06329) esterilizado por filtracion (Stericup-GV 0,22 pm PVDF Millipore CGVU05RE).

30 - Na2CO3 0,5 M (Merck 1.06392) esterilizado por filtracion (Stericup-GV 0,22 pm PVDF Millipore

CGVU05RE).

- MgSO4 1 M (Merck 1.05886) autoclave durante 15 min a 121 °C.

- CaCl2 100 mM (Merck 1.02382) autoclave durante 15 min a 121 °C.

- Sales 10xM9 (Difco 248510) autoclave durante 15 min a 121 °C. Diluir 10 x en agua esteril para

35 obtener sales M9.

- 10 ml de BM9: Anadir los diferentes componentes en el mismo orden que se describe a continuacion.

* 1 ml de sales 10x M9

* 500 pl de casitona al 10 %

40 * 250 pl de glucosa al 20 %

* 7,75 ml de agua

* 500 pl de NaHCOs 0,5 M

* 500 pl de Na2COs 0,5 M

45 Mezclar apropiadamente y anadir los siguientes componentes:

* 20 pl de MgSO4 1 M

* 10 pl de CaCl2 100 mM

50 BM9T es BM9 complementado con timidina 200 pM (Sigma #T9250)

BM9E es BM9, complementado con 5 pg/ml de eritromicina (Sigma #E6376) por dilucion de 25 mg/ml de eritromicina en solucion madre de etanol al 96 %.

ELISA

55

IL10 - Kit BD OptEIA Human IL-10 ELISA II; Cat. n.°: 550613; BD Biosciences;
www.bdbiosciences.com TFF-1 - ELISA Sandwich

- anticuerpo de revestimiento: anticuerpo monoclonal de raton TFF1 (M02), clon 3H5 (Abnova Cat.

n.2: H00007031-M02)

- anticuerpo de deteccion: anti-hTFF1 policlonal de raton (Alpha Diagnostics Cat. n.°: TFF12-A;
www.4adi.com)

- conjugado: anti conejo-HRP (Southern Biotech Cat. n.°: 4050-05;
www.southernbiotech.com)

5 - sustrato: TMB

TFF-3 ELISA Sandwich

- anticuerpo de revestimiento: anticuerpo monoclonal de raton 4408 contra TFF-3 (R&D Systems Cat. n.°: MAB4408;
www.rndsystems.co)

10 - anticuerpo de deteccion: monoclonal de raton biotinilado en laboratorio 15C6 contra TFF-3

(Calbiochem Cat. n.°: 585350;
www.calbiochem.com)

- conjugado: Estreptavidina-HRP (Cat. n.°: 554066; BD Biosciences;
www.bdbiosciences.com)

- sustrato: TMB

15 PYY Kit comercial: Peptido YY Total (PYY) ELISA; Cat. n.°: DSL-10-33600; Diagnostic System Laboratories, Inc.;
www.dslabs.com

GLP-1 Kit comercial: Peptido tipo glucagon 1 (Activo) kit ELISA; Cat. N°: EGLP-35K; Linco Research;
www.millipore.com

20 Ejemplo 1 Aislamiento de promotores fuertes de Lactococcus lactis

Se identificaron proteinas fuertemente expresadas en MG1363 de Lactococcus lactis ssp. lactis usando el metodo de Antelmann y col. (2000).

25 En resumen, se identificaron proteinas altamente expresadas por abundantes puntos de proteina en un gen 1 D (figura 2). Las bandas de proteina indicadas se digirieron con tripsina y las mezclas peptidicas se analizaron en modo LC-MS/MS en el espectrometro de masas de trampa de iones (Esquire HCT, Bruker). Los espectros (unicamente se mantuvieron 250 espectros MS/MS por realizacion para el analisis de datos) se analizaron por MASCOT con el bando de datos de proteinas de Lactococcus lactis subsp. cremoris sk11 (Genbank NC_008527). 30 Los peptidos con una puntuacion Mascot por encima de la puntuacion umbral de identidad se identifican con una probabilidad del 95 %. Cuantos mas peptidos se obtienen de la misma proteina, mas fiable es la identificacion.

Este analisis produjo una lista de proteinas altamente abundantes y los genes correspondientes (Tabla 1 anterior, y figura 1). En base a lo presente, se identifican y se aislan secuencias aguas arriba de los genes indicados (SEQ ID 35 NO: 1 a 54 y 157 a 180) con sus propias secuencias Shine Dalgarno (SD). Para la mayor parte de los promotores, esto se hace por PCR en ADN cromosomico de MG1363 de Lactococcus lactis. A modo de ejemplo, los cebadores usados para amplificar secuencias promotoras correspondientes a los genes enumerados en los puntos 1) a 30) anteriormente, se muestran en la Tabla 2. Asimismo, los cebadores adecuados pueden seleccionarse en base a la informacion genomica disponible para los promotores correspondientes a los genes enumerados en los puntos 31) a 40 53) anteriormente. Los promotores para eno, tbp y lacE tambien se sintetizaron, usando oligonucleotidos (oligos en la Tabla 3).

Ejemplo 2 Actividad promotora

45 Se concibio una estrategia que permitio la subclonacion de los diversos promotores frente al gen hIL-10 secretable (figura 3). La subclonacion se realizo de manera que los casetes de expresion de hIL-10 se flanqueasen por secuencias diana. Esta estructura permite una doble recombinacion homologa alrededor del gen thyA y, por lo tanto, la integracion cromosoma, basicamente como se describe en Steidler y col. 2003 anteriormente y el documento WO 02/090551.

50

Esquematicamente, la estrategia se describe con referencia a la figura 3:

A) Usando los cebadores apropiados, los promotores se aislan por PCR de ADN cromosomico de MG1363 de L. lactis; B) los promotores se unen a regiones flanqueantes relevantes (region diana aguas arriba 55 parcial, hIL-10 parcial) por PCR de hibridacion; C y D) Los productos unidos se subclonan en un plasmido

condicionalmente no replicante usando los sitios de endonucleasa de restriccion posicionados apropiadamente (Ncol + Afllll o, como alternativa, Ncol + BstEII). Esto completo tanto la region diana aguas arriba como hIL-10. E) Se introducen construcciones de promotor en MG1363 de L. lactis por recombinacion aguas arriba y aguas abajo consecutiva. La integracion cromosomica se realiza a traves de

un procedimiento de dos etapas. Tras la introduccion del plasmido no replicante en la cepa de origen de MG1363 de L. lactis, una primera recombinacion homologa en la secuencia diana aguas arriba o aguas abajo puede seleccionarse en medios selectivos que contienen eritromicina. La segunda recombinacion homologa en la diana alternativa se selecciona por la ausencia de thyA. F) Estructura cromosomica final 5 donde thyA se reemplaza por hIL-10.

Los transgenes integrados cromosomicamente se evaluan para determinar los niveles de expresion de hIL-10 secretable (es decir, hIL-10 proporcionado dentro del marco con una secuencia senal de secrecion de Lactococcus, por ejemplo, usp45 o similar) en referencia a otras cepas de Lactococcus basicamente como en Steidler y col. 10 (2003); Self-containing Lactococcus strain, documento WO 02/090551 y descrito en resumen en el presente documento: las diversas cepas de Lactococcus lactis se estrian en una unica colonia y se prepara un precultivo inoculando 1 colonia en GM17 (M17, Oxoid, Hampshire, Reino Unido, complementado con glucosa al 0,5 %) e incubacion durante 16 h a 30 °C. Estos precultivos se inoculan 1/25 en 5 ml de GM y se incuban durante 4 h a 30 °C. Las celulas se recogen por centrifugacion y se suspenden de nuevo en 5 ml de BM9 recien preparado (composicion 15 en Tabla 4). Estas suspensiones celulares e incuban durante 3 h a 30 °C. Las celulas bacterianas se eliminan por centrifugacion y los sobrenadantes se transfieren a tubos frescos. El contenido de hIL-10 de los sobrenadantes se determina por ELISA y las proteinas de hIL-10 se visualizan analizando el equivalente de 1 ml de cultivo por transferencia de western (western blot).

20 Incluso despues de repetidos intentos y diferentes estrategias de clonacion, no fue posible subclonar diversas secuencias promotoras. Las secuencias promotras subclonadas con exito se resumen en la Tabla 12.

Ejemplo 3 Resistencia del promotor

25 Despues de identificar varios promotores, se ensayaron varias construcciones de promotor en una serie adicional de experimentos. Ademas, para establecer si la actividad promotora es independiente del gen indicador, se disenaron construcciones indicadoras que comprendian el gen GLP-2.

El gen proglucagon humano (GenBank acc. n.° NM_002054) codifica una preproproteina que se escinde en cuatro 30 peptidos maduros distintos, incluyendo el peptido tipo glucagon 2 (GLP-2). Se diseno un gen para h[Gly2]GLP-2 codificado en el uso de codon preferencial de L. lactis. Este gen codifica un analogo de GLP-2 humano maduro con una alanina con respecto a una sustitucion glicina en la posicion 2, que se demostro que reducia la susceptibilidad a la degradacion por dipeptidil peptidasa-IV (Booth y col., 2004). El gen sintetico se ensamblo usando la metodologia del estado de la tecnica basicamente como se describe por Stemmer y col. (1995), que se incorpora en el presente 35 documento por referencia.

El fragmento resultante se fusiono a la senal de secrecion de usp45 (van Asseldonk, y col., 1990). La construccion de fusion se puso aguas abajo de una serie de promotores lactococicos: P1 (Waterfield, y col., 1995), PthyA (promotor de timidilato sintasa) y PhIIA (promotor de proteina de union a ADN nucleoide bacteriano/proteina de 40 union a ADN HU; SEQ ID NO: 28).

Esta estrategia produjo fragmentos que pudieron subclonarse como EcoRI-Xbal para P1 (pT1 GLP2) o fragmentos EcoRI-Spel (todas las demas construcciones) en el plasmido abierto por EcoRI-Spel pT1NX (Steidler y col., 1998; figura 4).

45

Se proporciona un resumen de los diversos plasmidos en la Tabla 5. Se verifico la secuencia de todos los plasmidos, despues se lo cual se transformaron en MG1363 de L. lactis usando el metodo de Gasson (1983).

La expresion y secrecion de GLP-2 se documento en extractos proteicos de las diversas cepas obtenidas en 50 paralelo. En resumen, los cultivos saturados se diluyeron 25 veces, se cultivaron en un medio de crecimiento tamponado adecuadamente y se cosecharon al final de la fase logaritmica. Se cargaron equivalentes de 1 ml de cultivo en SDS-PAGE y se analizaron por transferencia de Western. El GLP-2 se detecto por inmunotransferencia con un anticuerpo anti-GLP-2 de conejo policlonal (Abcam, Cambridge, Reino Unido). El anticuerpo secundario era una IgG anti-conejo de cabra (Southern Biotechnology Associates, Birmingham, AL) acoplada a fosfatasa alcalina. 55 La actividad enzimatica se revelo con sustrato NBT/BCIP (Roche Diagnostics, Basel, Suiza).

A partir de estos datos puede concluirse que el promotor PhIIA es extremadamente fuerte.

Ejemplo 4 Influencia de la secuencia senal

Para controlar los niveles de expresion, incluyendo la produccion y la secrecion, se construyo una serie de mutantes de usp45, que se ensayaron en primer lugar junto con el promotor PhllA de 28).

5 Sorprendentemente, un mutante de usp45 por el que se intercambio lisina en la posicion 4 por asparagina (usp45 N4), dio como resultado un aumento drastico de la produccion y secrecion de h[Gly2]GLP-2 (PhIIAN4GLP2) con respecto a la expresion dirigida al promotor thyA y el promotor P1 (figura 5A). Ademas, estos transformantes eran extremadamente estables. La construccion integrada en el genoma de L. lactis proporciona tambien una produccion y secrecion sustancialmente aumentada. La expresion de la construccion indicadora en Lactobacillus casei 10 proporciona basicamente los mismos resultados que en L. lactis.

A continuacion, se introdujo esta mutacion en usp45 aguas abajo del promotor P1 y el promotor thyA, generando los plasmidos pT1N4GLP2 y pThyAN4GLP2, respectivamente. Sorprendentemente, la mutacion tuvo poco efecto en la produccion de h[Gly2]GLP-2 regulada por el promotor P1, pero se suprimio por completo la produccion de 15 h[Gly2]GLP-2 en el control de transcripcion del promotor thyA (figura 5B).

A partir de estos datos es obvio que el promotor PhllA junto con la secuencia senal uspN4 es sumamente adecuado para controlar la expresion de genes.

20 Ejemplo 5 Resistencia del promotor ensayada por la expresion de interleucina-10 humana (hIL-10)

Se ensayaron varias construcciones de promotores en una serie de experimentos. Ademas, para establecer si la actividad promotora es independiente del gen indicador, se disenaron construcciones indicadoras en las que se generaron casetes de expresion que contenian los promotores bajo investigacion, frente a la senal de secrecion de 25 usp45 (van Asseldonk y col., 1990) fusionadas a un gen hIL-10 sintetico (vease tambien el Ejemplo 2). En este caso, la construccion de fusion se puso aguas debajo de una serie de promotores lactococicos: PthyA (promotor de timidilato sintasa, cepas sAGX0005 y Thy12), promotor PdpsA (proteina tipo ferritina de union a ADN, sEq ID NO: 3, sAGX0012), PpepV (promotor de Xaa-His dipeptidasa SEQ ID NO: 158, cepa sAGX0018), PsodA (promotor de superoxido dismutasa, SEQ ID NO: 20 sAGX0029) y PhIIA (promotor de proteina de union a ADN nucleoide 30 bacteriano/proteina de union a ADN HU; SEQ ID NO: 28, cepa sAGX0037).

Todos los casetes de expresion se integraron en el locus thyA del cromosoma MG1363 de L. lactis por recombinacion homologa dual, por lo que el gen thyA se elimino (una estrategia similar a la aplicada para la construccion de Thy12 (Steidler y col., 2003) pero sin hacer uso del plasmido auxiliar pVE6007, como se muestra en 35 la figura 3. Esto hace que todas las secuencias de ADN fuera de los casetes de expresion de hIL-10 sean identicas. Se proporciona un resumen de la estructura y la posicion de los casetes de expresion de hIL-10 en las diversas cepas en la figura 6. Los casetes de expresion de hIL-10 (promotor, senal de secrecion de usp45, hIL-10) de las cepas descritas aqui se verificaron por secuencia.

40 Las diversas cepas ensayadas se estriaron en una unica colonia en placas de GM17T de agar solido. Las colonias individuales se inocularon en GM17T y se cultivaron durante una noche hasta saturacion. Las diluciones apropiadas de estos cultivos se cultivaron previamente durante 4 horas en GM17T. Las bacterias se recogieron por centrifugacion y se incubaron adicionalmente durante 3 horas en un medio de cultivo tamponado (BM9T). Las bacterias se eliminaron por centrifugacion y a partir de este sobrenadante limpio, las muestras se recogieron para su 45 analisis. Las muestras se analizaron por analisis ELISA especifico para hIL-10. Los niveles de expresion se dan en la figura 7. Todos los datos se dan como las medias de las mediciones individuales. La resistencia del promotor relativa se da en la Tabla 6.

Para excluir el impacto de las diferentes caracteristicas de crecimiento entre cepas, se determinaron unidades 50 formadoras de colonias (UFC) al final de un experimento de expresion como se ha descrito anteriormente, y se calculo la produccion de hIL-10 por 109 UFC para las diversas cepas. Este experimento muestra que no se observo ninguna tasa de crecimiento sustancialmente diferente y que, segun se determino a partir de la expresion de hIL-10, PhIIA es aproximadamente 4 veces mas fuerte que PthyA (figura 8 y Tabla 7).

55 A partir de estos datos, puede concluirse que PdpsA, PpepV, PsodA y PhIIA son extremadamente fuertes y muy competentes para dirigir la expresion de los genes heterologos.

Ejemplo 6 Resistencia del promotor ensayada por la expresion del factor trefoil humano (TFF)

Despues de identificar promotores potencialmente fuertes, se ensayaron varias construcciones de promotor en una serie adicional de experimentos. Ademas, para establecer si la actividad promotora es independiente del gen indicador, se disenaron construcciones indicadoras en las que se generaron casetes de expresion que contenian los promotores bajo investigacion, frente a la senal de secrecion de usp45 de tipo silvestre (ts) (van Asseldonk y col., 5 1990) o mutante del mismo (mut; incluyendo Usp45 N4 en el que la lisina en la posicion 4 se sustituyo por asparagina) fusionadas a un gen hTFFI o hTFF3 sintetico. Las construcciones de fusion se pusieron aguas debajo de una serie de promotores lactococicos: PthyA (promotor de timidilato sintasa, cepas sAGX0041 y sAGX0043), promotor PdpsA (proteina tipo ferritina de union a ADN, SEQ ID NO: 3, cepa sAGX0059), y PhllA (promotor de proteina de union a ADN nucleoide bacteriano/proteina de union a ADN HU; SEQ ID NO: 28, cepas sAGX0048, 10 sAGX0049 y sAGX0057). Todos los casetes de expresion se integraron en el locus thyA del cromosoma MG1363 de L. lactis por recombinacion homologa dual, por lo que el gen thyA se elimino (una estrategia similar a la aplicada para la construccion de Thy12 (Steidler y col., 2003) pero sin hacer uso del plasmido auxiliar pVE6007, como se muestra en la figura 3. Esto hace que todas las secuencias de ADN fuera de los casetes de expresion de TFF sean identicas. Se proporciona un resumen de la estructura y posicion de los casetes de expresion de TFF en las diversas 15 cepas en la figura 9 y la Tabla 8. Los casetes de expresion de TFF (promotor, senal de secrecion, TFF) de las cepas descritas aqui se verificaron por secuencia.

Las diversas cepas ensayadas se estriaron en una unica colonia en placas de GM17T de agar solido. Las colonias individuales se inocularon en GM17T y se cultivaron durante una noche hasta saturacion. Las diluciones apropiadas 20 de estos cultivos se cultivaron previamente durante 4 horas en GM17T. Las bacterias se cosecharon por centrifugacion y se incubaron adicionalmente durante 3 horas en un medio de cultivo tamponado (BM9T). Las bacterias se eliminaron por centrifugacion y a partir de este sobrenadante limpio, las muestras se recogieron para su analisis. Las muestras se analizaron por ELISA especifico para hTFF. Los niveles de expresion se proporcionan en la figura 10. Las muestras de las cepas de expresion de hTFF1 tambien se analizaron por transferencia de Western 25 especifica para hTFF1 (figura 11). Todos los datos se proporcionan como la media de tres mediciones individuales. La resistencia del promotor relativa se da en la Tabla 8.

Acorde con el Ejemplo 4, los datos en la figura 10 muestran que el mutante Usp45 N4 no es responsable de una expresion mejorada de hTFF3 por sAGX0057, pero proporciona un nivel adicional de expresion de control.

30

Los PdpsA, PpepV y PsodA puestos frente a las construcciones de expresion de hTFF1 y hTFF3 tambien muestran una mejor expresion con respecto a PthyA.

A partir de estos datos, puede concluirse que PdpsA, PpepV, PsodA y PhllA son extremadamente fuertes y muy 35 competentes para dirigir la expresion de genes heterologos.

Ejemplo 7 Resistencia del promotor ensayada por la expresion de los aminoacidos 3-36 de la variante Gly9 de peptido YY humano (hPYY G9 (3-36))

40 Despues de identificar promotores potencialmente fuertes, se ensayaron varias construcciones de promotor en una serie adicional de experimentos. Ademas, para establecer si la actividad promotora es independiente del gen indicador, se disenaron construcciones indicadoras en las que se generaron casetes de expresion que contenian los promotores bajo investigacion, frente a la senal de secrecion de usp45 (van Asseldonk y col., 1990) fusionadas a un gen hPYY G9 (3-36) sintetico. La construccion de fusion se puso aguas abajo de una serie de promotores 45 lactococicos: P1 (Waterfield y col., 1995) (plasmido pAGX0211); PthyA (promotor de timidilato sintasa, plasmido pAGX0212), y PhllA (promotor de proteina de union a ADN nucleoide bacteriano/proteina de union a ADN HU; SEQ ID NO: 28, plasmido pAGX0213). Todos los casetes de expresion se insertaron como fragmentos EcoRl-Spel en el plasmido pT 1 NX (Schotte y col., 2000). Esto hace que todas las secuencias de ADN fuera de los casetes de expresion, incluyendo el origen de replicacion y la resistencia a eritromicina, sean identicas par los plasmidos 50 anteriores. Se proporciona un resumen de la estructura de los diversos plasmidos de expresion en la figura 12 y la Tabla 9. Los casetes de expresion de hPYY (promotor, senal de secrecion de usp45, PYY) de las cepas descritas aqui se verificaron por secuencia.

El vector de expresion vacio pT1 NX, asi como todos los plasmidos de expresion de hPYY G9 (3-36) se 55 transformaron en MG1363 de L. lactis. Las cepas resultantes se estriaron en una unica colonia en placas de GM17E de agar solido. Las colonias individuales se inocularon en GM17E y se cultivaron durante una noche hasta saturacion. Las diluciones apropiadas de estos cultivos se cultivaron previamente durante 4 horas en GM17E. Las bacterias se cosecharon por centrifugacion y se incubaron adicionalmente durante 3 horas en un medio de cultivo tamponado (BM9E). Las bacterias se eliminaron por centrifugacion y a partir de este sobrenadante limpio, las

muestras se recogieron para su analisis. Las muestras se analizaron por ELISA especifico para hPYY. Los niveles de expresion se proporcionan en la figura 13. La resistencia del promotor relativa se da en la Tabla 9.

Los PdpsA, PpepV y PsodA situados frente a la senal de secrecion de usp45 (van Asseldonk y col., 1990) fusionada 5 a un gen hPYY G9 (3-36) sintetico, tambien muestran una mejor expresion con respecto a la expresion dirigida de PthyA.

A partir de estos datos, puede concluirse que PdpsA, PpepV, PsodA y PhllA son extremadamente fuertes y muy competentes para dirigir la expresion de genes heterologos.

10

Ejemplo 8 Resistencia del promotor ensayada por la expresion de los aminoacidos 7-36 de la variante Gly8 de peptido tipo glucagon 1 humano (hGLP-1 G8 (7-36))

Despues de identificar promotores potencialmente fuertes, se ensayaron varias construcciones de promotor en una 15 serie adicional de experimentos. Ademas, para establecer si la actividad promotora es independiente del gen indicador, se disenaron construcciones indicadoras en las que se generaron casetes de expresion que contenian los promotores bajo investigacion, frente a la senal de secrecion de usp45 (van Asseldonk y col. 1990) fusionadas a un gen hGLP-1 G8 (7-36) sintetico. La variante Gly8 de GLP-1 muestra una susceptibilidad reducida hacia la escision proteolitica por dipeptidil peptidasa VI (Deacon y col., 1998). La construccion de fusion se puso aguas debajo de dos 20 promotores lactococicos: PthyA (promotor de timidilato sintasa, plasmido pAGX0233), y PhllA (promotor de proteina de union a ADN nucleoide bacteriano/proteina de union a ADN HU; SEQ ID NO: 28, plasmido pAGX0234). Todos los casetes de expresion se insertaron como fragmentos EcoRI-Spel en el plasmido pT1 NX (Schotte y col., 2000). Esto hace que todas las secuencias de ADN fuera de los casetes de expresion, incluyendo el origen de replicacion y la resistencia a eritromicina, sean identicas par los plasmidos anteriores. Se proporciona un resumen de la estructura 25 de los diversos plasmidos de expresion en la figura 14 y la Tabla 10. Los casetes de expresion de Gly8 de GLP-1 (promotor, senal de secrecion de usp45, GLP-1 Gly8) de las cepas descritas aqui se verificaron por secuencia. El vector de expresion vacio pT1 NX, asi como todos los plasmidos de expresion de hGLP-1 G8 (7-36) se transformaron en MG1363 de L. lactis. Las cepas resultantes se estriaron en una unica colonia en placas de GM17E de agar solido. Las colonias individuales se inocularon en GM17E y se cultivaron durante una noche hasta 30 saturacion. Las diluciones apropiadas de estos cultivos se cultivaron previamente durante 4 horas en GM17E. Las bacterias se cosecharon por centrifugacion y se incubaron adicionalmente durante 3 horas en un medio de cultivo tamponado (BM9E). Las bacterias se eliminaron por centrifugacion y a partir de este sobrenadante limpio, las muestras se recogieron para su analisis. Las muestras se analizaron por ELISA especifico para hGLP-1. Los niveles de expresion se proporcionan en la figura 15. La resistencia del promotor relativa se da en la Tabla 10.

35

Ejemplo 9 Resistencia del promotor ensayada por la expresion de interleucina-10 humana (hIL-10)

Se ensayaron varias construcciones de promotor en una serie adicional de experimentos. Ademas, para establecer si la actividad promotora es independiente del gen indicador, se disenaron construcciones indicadoras en las que se 40 generaron casetes de expresion que contenian los promotores bajo investigacion, frente a la senal de secrecion de usp45 (van Asseldonk y col. 1990) fusionadas a un gen hIL-10 sintetico. La construccion de fusion se puso aguas abajo de una serie de promotores lactococicos (figura 16 y Tabla 11).

Todos los casetes de expresion se integraron en el locus thyA del cromosoma MG1363 de L. lactis por 45 recombinacion homologa dual, por lo que el gen thyA se elimino (una estrategia similar a la aplicada para la construccion de Thy12 (Steidler y col., 2003) pero sin hacer uso del plasmido auxiliar pVE6007). Esto hace que todas las secuencias de ADN fuera de los casetes de expresion de hIL-10 sean identicas. Se representa en la figura 16 un resumen generalizado de la estructura y posicion de los casetes de expresion de hIL-10 presentes en las diversas cepas (comunmente designadas "sAGX00xx"). Los casetes de expresion de hIL-10 (promotor, senal de 50 secrecion de usp45, hIL-10) de las cepas descritas aqui se verificaron por secuencia.

Las diversas cepas ensayadas se estriaron en una unica colonia en placas de GM17T de agar solido. Las colonias individuales se inocularon en GM17T y se cultivaron durante una noche hasta saturacion. Las diluciones apropiadas de estos cultivos se cultivaron previamente durante 4 horas en GM17T. Las bacterias se cosecharon por 55 centrifugacion y se incubaron adicionalmente durante 3 horas en un medio de cultivo tamponado (BM9T). Las bacterias se eliminaron por centrifugacion y a partir de este sobrenadante limpio, las muestras se recogieron para su analisis. Las muestras se analizaron por ELISA especifico para hIL-10. Los niveles de expresion se proporcionan en la figura 17. Todos los datos se proporcionan como la media de tres mediciones individuales. La resistencia del promotor relativa se da en la Tabla 11.

A diferencia del analisis proteomico y transcriptomico proyectado, la resistencia y la competencia de un promotor particular que dirige la expresion de los genes heterologos siguen siendo inesperadas.

5 Tabla 1.

Gen Numero

ID de gen MG1363 ID de gen SK11 Proteina correspondiente como se comento en MG1363 Nombre del gen MG1363 Nombre del gen SK11 Secuencia promotora ejemplar (SEQ ID NO)

1)

4798573 4432638 ARN polimerasa dirigida a AdN, subunidad beta'/subunidad 160 kD rpoC LACR_1980 1

2)

4798827 4432639 ARN polimerasa dirigida a AdN, subunidad beta/subunidad 140 kD rpoB rpoB 2, 157

3)

4798207 4434445 ferritina de union a hierro no hemo dpsA LACR_2311 3

4)

4797791 4433214 piruvato cinasa pyk LACR 1456 4

5)

4798062 4433965 glutamil-ARNt sintetasas qltX gltX 5

6)

4797432 4433058 fosfopiruvato hidratasa eno eno 6

7)

4797464 4433379 glutamina sintetasa glnA LACR 2512 7

8)

4797312 4433380 represor de glutamina sintetasa glnR LACR_2513 8

9)

4798910 4432071 dipeptidasa PepV pepV LACR 0908 9, 158

10)

4797781 4433907 subunidad beta de ATP sintasa tipo F0F1 (subunidad beta de ATP sintasa F1) atpD LACR_1933 10

11)

4797899 4433798 3-fosfoglicerato cinasa pgk pgk 11

12)

4797877 4432135 gliceraldehido-3-fosfato deshidrogenasa gapB LACR_2555 12, 159

13)

4798785 4432332 acetato cinasa ackA1 LACR 2295 13, 160

14)

4796577 4432366 3-oxoacil-(acil-vehiculo- proteina) sintasa II fabF LACR_0825 14

15)

4797984 4432365 3-cetoacil-(acil-vehiculo- proteina) reductasa fabG fabG 15, 161

fabG1

16)

4797865 4434231 ARN polimerasa dirigida a AdN, subunidad alfa/subunidad 40 kD rpoA LACR_2375 16

17)

4798484 4432446 Prolina dipeptidasa pepQ LACR 1813 17,162

18)

4798307 4434211 fructosa-bisfosfato aldolasa fbaA LACR 2168 18,163

19)

4798643 4433237 proteina ribosomal 30S S4 rpsD rpsD 19

20)

4796682 4433052 superoxido dismutasa sodA LACR 0458 20

21)

4799037 (rpsL) 4433371 (rpsL) proteina ribosomal 30S S12 (rpsL) y proteina ribosomal 30S S7 (rpsG/LACR_2596)) rpsL rpsL 21, 164

4797556 (rPsG)

4433370 (LACR 2596) rpsG LACR_2596

4799022 (rpIR) 4433741 (LACR 2385) proteina ribosomal 50S L18 (rpIR/LACR 2385) y proteina ribosomal 30S S5 (rpsE/LACR_2384) y proteina ribosomal 50s L30/L7E (rpmD) rpIR LACR_2385

22)

4798090 (rpsE) 4433740 (LACR 2384) rpsE LACR_2384 22,165

4797873 (rpmD) 4433739 (rpmD) rpmD rpmD

23)

4798265 4434424 S-ribosilhomocisteinasa luxS LACR 0270 23

24)

4798969 4432986 proteina ribosomal 50S L19 rpIS rpIS 24

25)

4798819 4434232 proteina ribosomal 30S S11 rpsK LACR 2376 25, 168 154)

26)

4797191 4433166 proteina ribosomal 50S L10 rpJ rplJ 26, 169

27)

4797926 4433165 protefna ribosomal 50S L7/L12 rpIL LACR_1386 27, 170

28)

4797353 4433712 protefna de union de ADN tipo HU hllA LACR 0525 (hup) 28

29)

4797103 4433888 protefna ribosomal 50S L28 rpmB LACR 0198 29

30)

4797109 4433007 componente IIB del sistema fosfotransferasa ptcB LACR_0465 30, 170

31)

4798114 4432141 Subunidad alfa ATP sintasa de tipo F0F1 atpA LACR_1935 31, 172

32)

4797024 4433016 protefna de union a ATP de transporte de union a azucar multiple msmK LACR_0474 32, 173

33)

4798130 4434638 subunidad alfa de componente E1 del complejo acetoina deshidrogenasa (acoA) pdhA LACR_0051 33; 174

34)

4797264 4432815 protefna de division celular ftsA LACR 2057 34, 175

35)

4798554 4434372 UDP-galactopiranosa mutasa g lf1 LACR 0219 35

36)

4796852 4433097 glutamil aminopeptidasa pepA LACR 0433 36

37)

4798279 4433301 protefna relacionada con deshidrogenasa predicha llmg-0272 LACR_0268 37, 176

38)

4797347 4432587 protefna ribosomal 30S S2 rpsB rpsB 38, 177

39)

4798807 4433762 factor de inicio de la traduccion 3 (IF-3) infC LACR_0436 39, 178

4798524 (rpID) 4433828 (rpID) protefna ribosomal 50S L4 (rpID) y protefna ribosomal 50S L23 (rplW) y protefna ribosomal 50S L2(rpIB) rplD rpID

40)

4798431 (rpIW) 4433827 (rplW) rplW rplW 40, 179

4798645 (rplb) 4433826 (rplB) rplb rplB

41)

4797346 4433100 cadena beta de fenilalanil- ARNt sintetasa pheT LACR_0436 41

42)

4799077 4433204 factor de elongacion de la transcripcion GreA greA LACR_0660 42

43

43)

4796752 4432931 subunidad proteasa de Clp proteasa dependiente de ATP clpP clpP 44

44)

4797213 4433738 protefna ribosomal 50S L15 rplo LACR 2382 45

45)

4798439 4433280 protefna ribosomal 50S L11 rplK rplK 46

46)

4797933 4433743 protefna ribosomal 30S S8 rpsH LACR 2387 47

47)

4797761 4432457 protefna ribosomal 50S L21 rpU rpLU 48

48)

4798259 4433733 protefna ribosomal 30S S13 rpsM rpsM 49

4797839 (rpsS) 4433825 (rpsS) protefna ribosomal 30S S19 (rpsS) y protefna ribosomal 50S L22 (rpIV) y protefna ribosomal 50S L16 (rpIP) y ribosomal 50S 50

49)

4798792 (rpIV) 4433824 (rpIV) rpsS rpsS

protefna ribosomal L22 (rp/V)

rplV rplV

4798472 (rpIP)

4433822 (rpIP) protefna ribosomal L16 (rpIP) rplP rplP

4799034 (rpIN) 4433748 (LACR 2392) protefna ribosomal L14 (rpIN) rplN LACR_2392

50)

4798419 4433829 protefna ribosomal 30S S10 rpsJ LACR 2402 51

51)

4798582 4433103 co-chaperonina GroES groES groES 52, 180

52)

4797891 4433747 protefna ribosomal 50S L24 rplX rplX 53

53)

4797916 4432598 revolvasa de union de Hollyday putativa (MG1363) IImg_0151 LACR_0137 54

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

14

15

16

17

18

19

20

21

22

23

24

25

______________________________Tabla 2____________________________________________

Amplificada con cebadores Directo (SEQ ID NO)

Inverso (SEQ ID NO)

GTTCAGAAACTGCCTGATGGATTTTGTAATTAATATTTTGAGATTTATTTACTGAC (55)

CATTAAAATAGCTGAGATAATCTTTTTTTTCAATTCTTTCTCCACTTCTAATAAATTTAAC (56)

___________GTTCAGAAACT GCCT GATGGGCT AGAT AAGCCTT GAAAATTTC (57)___________

CATT AAAAT AGCT GAGAT AATCTTTTTTTT CAAGT GTTTT CTCCT CT ATTTTTT AG (58)

_______GGTTCAGAAACT GCCT GAT GGACT AAT CT ATACGAAAATT GATTTT GAAT G (59)_______

CATT AAAAT AGCTGAGAT AAT CTTTTTTTTCAT AACTAACCTCCATTTTTT AAAT ATT A (60)

____________GTTCAGAAACT GCCT GATGGCT AAGTTACT GCAAAT CT GTTT C (61)____________

CATT AAAAT AGCTGAGAT AAT CTTTTTTTTCATTTT GT GTTTTT CTCCT AT AAT G (62)

____________GTTCAGAAACTGCCTGATGGGATAAATTTCACTGACGCAAGC (63)____________

CATT AAAAT AGCTGAGAT AAT CTTTTTTTTCATTTT AATCCAATT CTCCT CATT G (64)

______GTTCAGAAACTGCCTGATGGAAATTAAGGATAGATTTTTTCTATCCTTTTTC (65)_______

CATT AAAAT AGCTGAGAT AAT CTTTTTTTTCATTTT AGT CTCCTT ATT ATTTTT AAGTGCG (66)

___________GTTCAGAAACTGCCTGATGGATTTGGTTGACATAATTTGTCAAG (67)___________

CATT AAAAT AGCT GAGAT AATCTTTTTTTT CAT GCTTT ACT CTCCTAGTT AAATTTT C (68)

________GTTCAGAAACT GCCT GATGGCAAATAAAAAGAACT GAT GT GAGAAAATC (69)________

_______CATT AAAAT AGCT GAGAT AATCTTTTTTTT CAT AGAGCGTCTT AATT CACG (70)_______

_______GTT CAGAAACTGCCTGAT GGGAT ATT AT CTTT ATCCTCCTT AT AT AT AATC (71)_______

_______CATT AAAAT AGCT GAGAT AATCTTTTTTTT CAT AAT CTTCTCCTT GAAGT AG (72)_______

________GTT CAGAAACTGCCTGAT GGTT ACT GT CAAACATT ATT CT CAAT GTT AC (73)________

CATT AAAAT AGCTGAGAT AAT CTTTTTTTTCATTTTT AAGCT AAT CAGT AAAAATTT AC (74)

_______________GTTCAGAAACT GCCT GATGGGTT GCTTAGCAAAGCT C (75)_______________

CATT AAAAT AGCTGAGAT AAT CTTTTTTTTCATTT GGAAAAATTCTCCTT AT AAG (76)

___________GTT CAGAAACTGCCTGAT GGGAAT AAAAATT ACT GTCAGCCTGC (77)___________

CATT AAAAT AGCT GAGAT AATCTTTTTTTT CATTAGT AGTTTCCTCCTT ATAGGG (78)

________GTTCAGAAACT GCCT GATGGAAATAAAAAATTATTGGCT AGTCT GTCAG (79)________

CATT AAAAT AGCT GAGAT AATCTTTTTTTT CAT GTTT AAT AAACCTTCCTT GAATTT G (80)

GTT CAGAAACTGCCTGAT GGATT GCT CATTT AT AAATTTT GAAATT AAGAAGG (81)

CATT AAAAT AGCTGAGAT AAT CTTTTTTTTCAT ATTTTT ATCCTTCTT AATTT CAAAATTT AT AAAT G

_______________________________________(82)_______________________________________

_____________GTTCAGAAACT GCCT GATGGGGAGAAAGGAATT GAGTTCG (83)_____________

CATT AAAAT AGCT GAGAT AATCTTTTTTTT CATT ATTT AT AAGAT GT GAGCCC (84)

___________GTT CAGAAACTGCCTGAT GGTT AGT CACT CTT GT CACT AATCAC (85)___________

CATT AAAAT AGCT GAGAT AATCTTTTTTTT CAT GT AT GTT CTCCT CT AAAGCG (86)

________GTTCAGAAACTGCCTGATGGCTATCCTCTTTCTTTTCTTTTTATTCATAG (87)________

CATT AAAAT AGCTGAGAT AAT CTTTTTTTTCAAAATGGTTCCTCCAAT ATT AAT G (88)

________GTT CAGAAACTGCCTGAT GGGAT AAGATT AAT AGTTTT AGCT ATT AAT C (89)________

_______CATT AAAAT AGCT GAGATAATCTTTTTTTTCATTTCAAAATTCCTCCGAAT A (90)_______

_________GTTCAGAAACT GCCT GATGGGCTTTTCTT GACAAAAT AAGGATTTTT G (91)_________

CATT AAAAT AGCT GAGAT AATCTTTTTTTT CAT AATTT ATGTCCTCCAAAT ATTTT ATTT G (92)

__________GTT CAGAAACTGCCTGAT GGAAAT CAAAT CATTT GGCAAT GATTTC (93)__________

CATT AAAAT AGCT GAGAT AATCTTTTTTTT CAT AGT AATT CTCCTTTT AAGAT GT G (94)

____________GTT CAGAAACTGCCTGAT GGCT CAAAAT AT AAGCTT AATCGC (95)____________

CATT AAAAT AGCTGAGAT AAT CTTTTTTTTCATTTT ACT GT CT GCTTTTT AT ATTTTTCC (96)

________________GTTCAGAAACT GCCT GATGGGCGTCGGGCTTGCG (97)________________

CATTAAAATAGCTGAGATAATCTTTTTTTTCACAATTCTACCTCTATATTATTTTAAATTTC (98)

___________GTTCAGAAACT GCCT GATGGCTACAAACGCTTT ACT GAAAACG (99)___________

CATT AAAAT AGCT GAGAT AATCTTTTTTTT CAT AAAAT AT AT GAT ACAAAACTCAGC (100)

_________GTTCAGAAACT GCCT GATGGCAGCATT AAGAT AAAGAGTTAT GAGC (101)_________

_______CATT AAAAT AGCT GAGAT AATCTTTTTTTT CATTTTTTT CTCCT CTT GCCC (102)_______

__________GTT CAGAAACTGCCTGAT GGT AAAT CAT AAAACCT CT GT CAGAGG (103)__________

CATTAAAATAGCTGAGATAATCTTTTTTTTCAAGCAAAAGTACCTCCTTAAAAATTTC (104)

26

GTT CAGAAACTGCCTGAT GGAAT AGAAGAT ATTTTT CAGT AGAT AT AG (105)

CATTAAAATAGCTGAGATAATCTTTTTTTTCATTTTTTTACCTCCATTTTATTTTGG (106)

27

GTTCAGAAACTGCCTGATGGTTATAAGCAACATCACTTATATCGG (107)

CATT AAAAT AGCT GAGAT AATCTTTTTTTT CATTTT AAT ATTCTCCTATT AATTTTTT AG (108)

28

GTTCAGAAACT GCCT GATGGAAAACGCCTT AAAAT GGCATTTT G (109)

CATT AAAAT AGCTGAGAT AAT CTTTTTTTTCATTTT AGAAAT GTCCTCCATTT G (110)

29

GTT CAGAAACTGCCTGAT GGCAAAAGCTT GATTTTTTT ATTT GAAAAAT G (111)

CATT AAAAT AGCTGAGAT AAT CTTTTTTTTCATT AT ATTT ACCTCCCATT AGAATTTTT AT G (112)

30

GTTCAGAAACT GCCT GATGGT AAATTTGTTCCAAAT GAAGAAACAAAT A (113)

CATT AAAAT AGCT GAGAT AATCTTTTTTTT CAT AATT ATTT CTCCTT ATTCTT AACG (114)

153

TGGATATTTTTTATAAATCTGG (155)

CATGAAATTTTCCTATCTTTTTTAATTC (156)

Tabla 3

Secuencia promotora (SEQ ID NO en la Tabla 1)

Sintetizada con oligos Oligo (SEQ ID NO)

6

AAATT AAGGAT AGATTTTTT (115)

AT AAT AAT GAAAAAGGAT AGAAAAAATCTATCCTT AATTT (116)

CT ATCCTTTTT CATT ATT ATT CAAAT GAT AAAATTT CAAA (117)

AAAAGGTTTT GCGCTT ACATTTT GAAATTTT AT CATTT GA (118)

ATGTAAGCGCAAAACCTTTT GAAGTTT AGGTTT GCGAAGA (119)

AAAGATTTTT CAAGT GAAAAT CTTCGCAAACCTAAACTT C (120)

TTTT CACTT GAAAAAT CTTT CAAAAAATAGT AAAAT CAAA (121)

GTCTGCACT CTT AATACAT CTTT GATTTT ACTATTTTTT G (122)

GAT GT ATT AAGAGT GCAGACGCACTT AAAAAT AAT AAGGAGACT AAAAT G (123)

CATTTT AGTCTCCTT ATT ATTTTT AAGTGC (124)

18

AGAGGGTT CAGAAACTGCCTGATGGGAT AAGATT AAT AGT (125)

TTT AGCTATT AAT CTTTTTTT ATTTTT ATTT AAGAAT GGC (126)

TT AAT AAAGCGGTT ACTTT GGATTTTT GT GAGCTT GGACT (127)

AGAAAAAAACTT CACAAAAT GCT AT ACT AGGTAGGTAAAA (128)

AAAT ATTCGGAGGAATTTT GAAAT GAAAAAAAAGATT ATC (129)

TCAGCT ATTTT AAT GTCTAC (130)

GT AGACATT AAAATAGCT GAGAT AAT CTTTTTTTTCATTT (131)

CAAAATTCCTCCGAAT ATTTTTTT ACCTACCT AGT AT AGC (132)

ATTTT GT GAAGTTTTTTTCT AGTCCAAGCTCACAAAAATC (133)

CAAAGT AACCGCTTT ATT AAGCCATT CTT AAAT AAAAAT A (134)

AAAAAAGATT AAT AGCT AAAACT ATT AAT CTTATCCCATC (135)

AGGCAGTTTCTGAACCCTCT (136)

30

GGGTTCAGAAACT GCCTGATGGT AAATTTGTTCCAAATGA (137)

AGAAACAAAT ATTT CAAAATCCT ACT ATTT GAT AGT AGGA (138)

TTTTT AAT AT ATT AGTCCAAAAGCT CAAAAAGGCT GATTT (139)

AAAGCAGAT GAGT AGACTTTTCAATT ATTTT GT AAAGCAC (140)

TTT CAAAAAAAT AGAT AACGCTT GCATT AT GAAAAT GAAA (141)

ACGTT AT AATT ATTTTT AT AAAGAACGTT AAATT AT AAAA (142)

CGTT AAGAAT AAGGAGAAAT AATT AT GAAAAAAAAGATT A (143)

TCTCAGCT ATTTT AAT GTCT (144)

AGACATT AAAATAGCT GAGAT AAT CTTTTTTTT CAT AATT (145)

ATTT CTCCTT ATT CTT AACGTTTT AT AATTT AACGTTCTT (146)

TAT AAAAAT AATT ATAAC GTTTT CATTTT CATAATGCAAG (147)

CGTT AT CT ATTTTTTT GAAAGT GCTTT ACAAAAT AATT GA (148)

AAAGT CT ACT CAT CT GCTTT AAAT CAGCCTTTTT GAGCTT (149)

TT GGACT AAT AT ATT AAAAATCCT ACT AT CAAAT AGT AGG (150)

ATTTT GAAAT ATTT GTTT CTT CATTT GGAACAAATTT ACC (151)

ATCAGGCAGTTTCTGAACCC (152)

Tabla 4. Composicion de BM9:

# ml

BM9

1000

sales 10x M9

100

casitona al 10 % (Difco, BD Biosciences San Jose, CA USA)

50

glucosa al 20 %

25

agua

772

NaHCOs 1 M

25

Na2COs 1 M

25

MgSO4 1 M

2

CaCl2 100 mM

1

5 Las sales 10x M9 es por litro: 60 g de Na2HPO4, 30 g de KH2PO4, 10 g de NI-UCl, 5 g de NaCl.

Tabla 5 Resumen de los diversos plasmidos y sus constituyentes.

Plasmidos

Promotor Li'der de secrecion Gen Referencia

pTREX1

P1 - - Wells y col., 1996

pT1NX

P1 usp45 - Steidler y col., 1998b

pT1GLP2

P1 usp45 h[Gly2]GLP-2 Este trabaio

pThyAGLP2

PthyA usp45 h[Gly2]GLP-2 Este trabajo

pT1N4GLP2

P1 usp45 N4 h[Gly2]GLP-2 Este trabajo

pThyAN4GLP2

PthyA usp45 N4 h[Gly2]GLP-2 Este trabajo

phllAN4GLP2

PhllA usp45 N4 h[Gly2]GLP-2 Este trabajo

Tabla 6

Promotor

Resistencia del promotor relativa Cepa Referencia

thyA

1 Thy12 [2]

sAGX0005 este trabajo

PdpsA

1,6 sAGX0012 este trabajo

PpepV

1,7 sAGX0018 este trabajo

PsodA

1,3 sAGX0029 este trabajo

PhllA

3 sAGX0037 este trabajo

5 Resistencia relativa de los diversos promotores ensayada como se evaluo mediante la medicion de la expresion de hIL-10 de las cepas indicadas. [2]: Steidler y col., 2003.

Tabla 7

Cepa

Conc. media hlL 10 (ng/109 Resistencia relativa del Densidad bacteriana (x109

celulas)

promotor UFC/ml)

MG1363

0 0 4,1

sAGX0005

7,3 1 4,8

sAGX0037

29,1 4 4,2

10 Resistencia del promotor relativa en funcion de las unidades formadoras de colonias (UFC).

Tabla 8

Promotor

usp45 Gen Expresion relativa Cepa Referencia

PthyA

ts hTFF1 1 sAGX0041 este trabajo

PhllA

mut hTFF1 2,3 sAGX0049 este trabajo

PhllA

ts hTFF1 6,5 sAGX0048 este trabajo

PthyA

ts hTFF3 1 sAGX0043 este trabajo

PdpsA

ts hTFF3 1,2 sAGX0059 este trabajo

PhllA

mut hTFF3 7,5 sAGX0057 este trabajo

Resumen de las diversas cepas de expresion de TFF usadas en este estudio y niveles de expresion relativos de TFF 15 secretado de las cepas indicadas.

Tabla 9

Plasmido

Promotor Gen Expresion relativa Referencia

pT1NX

P1 - 0 [3]

pAGX0211

P1 hPYY G9 (3-36) 1 este trabajo

pAGX0212

PthyA hPYY G9 (3-36) 1,4 este trabajo

pAGX0213

PhllA hPYY G9 (3-36) 6,3 este trabajo

Resumen de las diversas cepas de expresion de hPYY G9 (3-36) usadas en este estudio y niveles de expresion 20 relativos de hPYY G9 (3-36) secretado de los plasmidos indicados. Todos los plasmidos estaban presentes en MG1363 de L. lactis. [3]: Schotte y col., 2000.

Tabla 10

Plasmido

Promotor Gen Expresion relativa Referencia

pT1NX

P1 - 0 [2]

pAGX0233

PthyA GLP-1 G8 (7-36) 1 este trabaio

pAGX0234

PhllA GLP-1 G8 (7-36) 3 este trabaio

Resumen de las diversas cepas de expresion de hGLP-1 G8 (7-36) usadas en este estudio y niveles de expresion relativos de hGLP-1 G8 (7-36) secretado de los plasmidos indicados. Todos los plasmidos estaban presentes en L. 5 lactis MG1363. [3]: Schotte y col., 2000

Tabla 11

Promotor

Cepa hIL-10 (ng/ml) Resistencia del promotor relativa SEQ ID Referencia

PthyA

sAGX0005 Thy12 27,74 1,000 153 este trabajo [2]

PpepQ

sAGX0026 26,39 0,951 17 este trabajo

PinfA

sAGX0033 16,20 0,584 25 este trabajo

Ppgk

sAGX0020 14,58 0,526 11 este trabajo

PatpD

sAGX0019 6,08 0,219 10 este trabajo

PrpsD

sAGX0028 5,70 0,205 19 este trabajo

Pluxs

sAGX0031 4,00 0,144 23 este trabajo

PglnR

sAGX0017 3,03 0,109 8 este trabajo

PrpoB

sAGX0011 0,59 0,021 2 este trabajo

PrpIL

sAGX0035 0,50 0,018 27 este trabajo

PrpoA

sAGX0025 0,24 0,009 16 este trabajo

PfabF

sAGX0023 0,20 0,007 14 este trabajo

PglnA

sAGX0016 0,06 0,002 7 este trabajo

PfabG

sAGX0024 0,02 0,001 15 este trabajo

Resistencia relativa de los diversos promotores segun se evaluo midiendo la expresion de hIL-10 de las cepas 10 indicadas.

Tabla 12 Secuencias promotoras subclonadas con exito

Cepa

SEQ ID Promotor

sAGX0005

153 PthyA

sAGX0011

2 PrpoB

sAGX0012

3 PdpsA

sAGX0016

7 PglnA

sAGX0017

8 PglnR

sAGX0018

9 PpepV

sAGX0019

10 PatpD

sAGX0020

11 Ppgk

sAGX0023

14 PfabF

sAGX0024

15 PfabG

sAGX0025

16 PrpoA

sAGX0026

17 PpepQ

sAGX0028

19 PrpsD

sAGX0029

20 PsodA

sAGX0031

23 Pluxs

sAGX0033

25 PinfA

sAGX0035

27 PrpIL

sAGX0037

28 PhllA

REFERENCIAS

15

Altschul et al. (1990) J Mol Biol 215: 403-10;

Antelmann et al. (2000) J Bacteriol 182: 4478-90;

Babyatsky M. W., de Beaumont M., Thim L., Podolsky D. K. (1996). Oral trefoil peptides protect against ethanol- and indomethacin-induced gastric injury in rats. Gastroenterology 110, 489-497;

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

Bolotin et al. (2001) "The complete genome sequence of the lactic acid bacterium Lactococcus lactis ssp. lactis IL1403" Genome Res 11: 731 -753;

Booth et al. (2004) Cell Prolif 37(6): 385-400;

Cazzaniga et al. (1994) "Oral delayed release system for colonic specific delivery" Int. J. Pharm.i08:7';

Chien (1992) "Novel drug delivery system" 2nd edition, M. Dekker;

Deacon CF, Knudsen LB, Madsen K, Wiberg FC, Jacobsen O, Holst JJ. (1998) "Dipeptidyl peptidase IV resistant analogues of glucagon-like peptide-1 which have extended metabolic stability and improved biological activity" Diabetologia Mar;41 (3):271-8;

Delorme et al. (1999) J Bacteriol 181 (7): 2026-37;

Gasson (1983) J Bacteriol 154: 1-9;

Hansel et al. (1990) "Pharmaceutical dosage forms and drug delivery systems" 5th edition, William and Wilkins;

Kok et al. (1984) Appl Environ Microbiol 48(4): 726-31;

Nauta et al. (1996) Mol Microbiol 19(6): 1331-41;

Maglott et al. (2005), Entrez Gene: gene-centered information at NCBI. Nucleic Acids Res. 33 (Database Issue): D54-D58;

Perez-Martinez et al. (1992) Mol Gen Genet 234: 401 -11;

Playford RJ, Marchbank T, Goodlad RA, Chinery RA, Poulsom R, Hanby AM (1996). Transgenic mice that overexpress the human trefoil peptide pS2 have an increased resistance to intestinal damage. Proc Natl Acad Sci USA. 93, 2137-2142;

Prescott et al. (1989) Novel drug delivery, J. Wiley & Sons;

Ross et al. (1990) "Cloning and characterisation of the thymidylate synthase gene from Lactococcus lactis ssp. lactis." Appl Environ Microbiol 56: 2156-2163;

Schotte L, Steidler L, Vandekerckhove J, Remaut E. (2000) "Secretion of biologically active murine interleukin-10 by Lactococcus lactis". Enzyme and Microbial Technology 27:761-765;

Sibakov et al. (1991) Appl Environ Microbiol 57(2): 341-8;

Steidler et al. (1995) "Secretion of biologically active murine interleukin-2 by Lactococcus lactis subsp. lactis." Appl Environ Microbiol 61 (4): 1627-9;

Steidler et al. (1998) "Mucosal delivery of murine interleukin-2 (IL-2) and IL-6 by recombinant strains of Lactococcus lactis coexpressing antigen and cytokine." Infect Immun 66(7): 3183-9;

Steidler et al. (2000) Science 289:1352-5

Steidler L, Neirynck S, Huyghebaert N, Snoeck V, Vermeire A, Goddeeris B, Cox E, Remon JP, Remaut E. (2003) "Biological containment of genetically modified Lactococcus lactis for intestinal delivery of human interleukin 10" Nat Biotechnol 21:785-789;

Stemmer, et al. (1995) Gene 164(1 49-53;

Tan X.-D, Hsueh W., Chang H., Wei, K.R. and Gonzalez-Crussi F. (1997) Characterization of a putative receptor for intestinal trefoil factor in rat small intestine: Identification by in situ binding and ligand blotting. Biochem. Biophys. Res. Comunications 237, 673-677.

Tatusova and Madden (1999) FEMS Microbiol Lett 174: 247-250;

van Asseldonk M, Rutten G, Oteman M, Siezen RJ, de Vos WM, Simons G (1990) "Cloning of usp45, a gene encoding a secreted protein from Lactococcus lactis subsp. lactis MG1363" Gene 95(1 ):155-160; van der Vossen et al. (1985). Appl Environ Microbiol 50: 540-2; van der Vossen et al. (1992) Appl Environ Microbiol 58: 3142-9;

Waterfield NR, Le Page RW, Wilson PW, Wells JM. (1995) "The isolation of lactococcal promoters and their use in investigating bacterial luciferase synthesis in Lactococcus lactis" Gene 165(1 ):9-15;

Wells et al. (1993A) Appl Environ Microbiol 59: 3954-9;

Wells et al. (1993B) Mol Microbiol 8(6): 1155-62;

Wong, W.M. (1999). Trefoil peptides. Gut 44: 890-895.

Wright N.A., Poulsom R., Stamp G.W., Hall P.A., Jeffery R.E., Longcroft J., Rio M.C., Tomasetto C and Chambon P. (1990). Epidermal growth factor (EGF/URO) induces expression of regulatory peptides in damaged human gastrointestinal tissues. J. Pathol. 162, 279-284.

Claims (34)

1. REIVINDICACIONES

   1. Un acido nucleico recombinante que comprende un promotor nativo de un gen para la proteina de union a ADN tipo HU (PhIIA) de una especie Lactococcus como se expone en la SEQ ID NO: 28, o un homologo o

   5 una variante funcional o fragmento funcional del mismo, en el que el homologo o variante funcional o fragmento funcional el mismo es al menos un 95 % identico al promotor como se expone en la SEQ ID NO: 28, unido operativamente a un marco de lectura abierto heterologo al promotor, comprendiendo dicho marco de lectura abierto una secuencia que codifica un polipeptido, y que comprende adicionalmente una secuencia que codifica una secuencia de senal usp45 o usp45N4 5' aguas arriba de dicha secuencia que codifica el polipeptido.

   10
2. 2. El acido nucleico recombinante de acuerdo con la reivindicacion 1, que comprende adicionalmente

   - una secuencia terminadora de la transcripcion 3' con respecto a dicho marco de lectura abierto;

   - un operador configurado para controlar la transcripcion de dicho promotor PhIIA; y/o

   15 - secuencias configuradas para realizar la insercion de dicho acido nucleico recombinante en el cromosoma

   de una celula huesped, preferiblemente por recombinacion homologa.
3. 3. El acido nucleico recombinante de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, en el que dicho marco de lectura abierto codifica un polipeptido capaz de provocar una respuesta terapeutica o inmunogena

   20 en un sujeto, preferiblemente en un sujeto humano o animal.
4. 4. El acido nucleico recombinante de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que dicho marco de lectura abierto codifica un antigeno y/o un polipeptido no vacinogeno terapeuticamente activo.

   25 5. El acido nucleico recombinante de acuerdo con la reivindicacion 4, en el que dicho antigeno es capaz

   de provocar una respuesta inmunitaria en un sujeto humano o animal.
5. 6. El acido nucleico recombinante de acuerdo con la reivindicacion 4, en el que dicho polipeptido no vacinogeno terapeuticamente activo es capaz de producir un efecto terapeutico en un sujeto humano o animal.

   30
6. 7. El acido nucleico recombinante de acuerdo con la reivindicacion 4, en el que dicho antigeno es capaz de provocar una respuesta inmunitaria y de usarse como una vacuna en un sujeto humano o animal.
7. 8. El acido nucleico recombinante de acuerdo con la reivindicacion 4, en el que dicho polipeptido no 35 vacinogeno terapeuticamente activo es hIL-10, GLP-2, GLP-1, TFF o hPYY.
8. 9. El acido nucleico recombinante de acuerdo con la reivindicacion 4, en el que dicho acido nucleico recombinante comprende:

   40 (a) PhIIA, usp45 y hIL-10; PhIIA, usp45N4 y hIL-10;

   (b) PhIIA, usp45N4 y hTFFI; PhIIA, usp45 y hTFFI;

   (c) PhIIA, usp45N4 y hTFF3; PhIIA, usp45 y hTFF3;

   (d) PhIIA, usp45N4 y hPYY; PhIIA, usp45 y hPYY; PhIIA, usp45 y hPYY G9 (3-36);

   (e) PhIIA, usp45N4 y GLP-1; PhIIA, usp45 y GLP-1;

   45 (f) PhIIA, usp45N4 y GLP-2; o PhIIA, usp45 y GLP-2.
9. 10. El acido nucleico recombinante de acuerdo con la reivindicacion 4, en el que dicho polipeptido no vacinogeno terapeuticamente activo es TFF.

   50 11. El acido nucleico recombinante de acuerdo con la reivindicacion 4, en el que dicho acido nucleico

   recombinante comprende PhIIA, usp45 y hTFFI.
10. 12. Un vector que comprende el acido nucleico recombinante como se ha definido en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en el que preferiblemente, dicho vector se obtiene a partir de pT 1 NX.

    55
11. 13. Una celula huesped transformada con el acido nucleico recombinante como se ha definido en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, o con el vector de la reivindicacion 12.
12. 14. Una celula huesped de acuerdo con la reivindicacion 13, transformada con el acido nucleico recombinante como

    se ha definido en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, o con el vector de la reivindicacion 12, en la que dicho polipeptido no vacinogeno terapeuticamente activo es TFF.
13. 15. Una celula huesped de acuerdo con la reivindicacion 14, transformada con el acido nucleico 5 recombinante como se ha definido en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, o con el vector de la reivindicacion

    12, en la que dicho acido nucleico recombinante comprende PhllA, usp45 y hTFFI.
14. 16. Una celula huesped que comprende un acido nucleico recombinante, como se ha definido en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en la que dicho promotor PhllA esta presente en el cromosoma de dicha

    10 celula huesped, y en la que dicho promotor esta unido operativamente a un marco de lectura abierto heterologo a dicho promotor.
15. 17. La celula huesped de acuerdo con la reivindicacion 16, en la que dicho promotor PhllA comprende adicionalmente un operador configurado para controlar la transcripcion de dicho promotor.

    15
16. 18. La celula huesped de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 16 o 17, en la que dicho marco de lectura abierto codifica un polipeptido capaz de provocar una respuesta terapeutica o respuesta inmunogena en un sujeto, preferiblemente en un sujeto humano o animal.

    20 19. La celula huesped de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 16 a 18, en la que dicho marco

    de lectura abierto codifica un antigeno y/o un polipeptido no vacinogeno terapeuticamente activo.
17. 20. La celula huesped de acuerdo con la reivindicacion 19, en la que

    25 - dicho antigeno es capaz de provocar una respuesta inmunitaria, en un sujeto humano o animal,

    - dicho polipeptido no vacinogeno terapeuticamente activo es capaz de producir un efecto terapeutico en un sujeto humano o animal;

    - dicho polipeptido no vacinogeno terapeuticamente activo es hlL-10, GLP-2, GLP-1, TFF o hPYY,

    - dicho antigeno es capaz de provocar una respuesta inmunitaria y de usarse como una vacuna en un

    30 sujeto humano o animal.
18. 21. La celula huesped de acuerdo con la reivindicacion 19, en la que dicha celula huesped comprende:

    (a) PhllA, usp45 y hlL-10; PhllA, usp45N4 y hlL-10;

    35 (b) PhllA, usp45N4 y hTFFl; PhllA, usp45 y hTFFl;

    (c) PhllA, usp45N4 y hTFF3; PhllA, usp45 y hTFF3;

    (d) PhllA, usp45N4 y hPYY; PhllA, usp45 y hPYY; PhllA, usp45 y hPYY G9 (3-36);

    (e) PhllA, usp45N4 y GLP-1; PhllA, usp45 y GLP-1;

    (f) PhllA, usp45N4 y GLP-2; o PhllA, usp45 y GLP-2.

    40
19. 22. La celula huesped de acuerdo con la reivindicacion 19, en la que dicho polipeptido no vacinogeno terapeuticamente activo es tFf.
20. 23. La celula huesped de acuerdo con la reivindicacion 19, que comprende PhllA, usp45 y hTFFl.

    45
21. 24. La celula huesped de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 13 a 23, que es una bacteria no patogena y no invasiva, preferiblemente una bacteria Gram-positiva, mas preferiblemente una bacteria de acido lactico, incluso mas preferiblemente una bacteria Lactococcus o una bacteria Lactobacillus y mucho mas preferiblemente una bacteria Lactococcus lactis o Lactobacillus casei.

    50
22. 25. La celula huesped de acuerdo con la reivindicacion 24, en la que la celula huesped es Lactococcus lactis.
23. 26. La celula huesped de acuerdo con la reivindicacion 24 o 25, en la que la celula huesped se 55 Lactococcus lactis y en la que dicho polipeptido no vacinogeno terapeuticamente activo es TFF.
24. 27. La celula huesped de acuerdo con la reivindicacion 24 o 25, en la que la celula huesped es Lactococcus lactis que comprende PhllA, usp45 y hTFFl.
25. 28. Uso del acido nucleico recombinante de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, o el vector de la

    reivindicacion 12 para conseguir la expresion de un producto de expresion codificado por dicho marco de lectura abierto, en una celula huesped in vitro.

    5 29. Una composicion farmaceutica que comprende la celula huesped como se ha definido en cualquiera

    de las reivindicaciones 13 a 27.
26. 30. Una composicion farmaceutica de acuerdo con la reivindicacion 29, en la que la celula huesped es Lactococcus lactis.

    10
27. 31. Una composicion farmaceutica de acuerdo con la reivindicacion 29 o 30, en la que la celula huesped es Lactococcus lactis y en la que dicho polipeptido no vacinogeno terapeuticamente activo es TFF.
28. 32. Una composicion farmaceutica de acuerdo con la reivindicacion 29 que comprende PhllA, usp45 y 15 hTFFI.
29. 33. Una celula huesped de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 13 a 27 para su uso como un medicamento.

    20 34. La celula huesped para su uso como un medicamento de acuerdo con la reivindicacion 33, en la que

    la celula huesped es Lactococcus lactis.
30. 35. La celula huesped para su uso como un medicamento de acuerdo con la reivindicacion 33 o 34, en la que la celula huesped es Lactococcus lactis y en la que dicho polipeptido no vacinogeno terapeuticamente activo es

    25 TFF.
31. 36. La celula huesped para su uso como un medicamento de acuerdo con la reivindicacion 33 que comprende PhllA, usp45 y hTFFI.

    30 37. Uso de la celula huesped como se ha definido en cualquiera de las reivindicaciones 13 a 27 para la

    fabricacion de un medicamento para la administracion del polipeptido codificado por dicho marco de lectura abierto del acido nucleico recombinante para un ser humano o animal.
32. 38. Uso de la celula huesped para la fabricacion de un medicamento de acuerdo con la reivindicacion 37, 35 en el que la celula huesped es Lactococcus lactis.
33. 39. Uso de la celula huesped para la fabricacion de un medicamento de acuerdo con la reivindicacion 37 o 38, en el que la celula huesped es Lactococcus lactis y en el que dicho polipeptido no vacinogeno terapeuticamente activo es TFF.

    40
34. 40. Uso de la celula huesped para la fabricacion de un medicamento de acuerdo con la reivindicacion 37, en el que la celula huesped comprende PhllA, usp45 y hTFFI.