BRPI0806695A2 - Composições e métodos para aumentar a tolerância à produção de produtos químicos produzidos por microorganismos - Google Patents

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "COM- POSIÇÕES E MÉTODOS PARA AUMENTAR A TOLERÂNCIA À PRO- DUÇÃO DE PRODUTOS QUÍMICOS PRODUZIDOS POR MICROORGAN- ISMOS".

PEDIDOS RELACIONADOS

Esse pedido reivindica o benefício sob 35 U.S. C. $119(e) de pedido de patente provisório No. de série U.S. 60/880.108 depositado em 12 de janeiro de 2007, aqui incorporado a título de referência em sua totalidade. PESQUISA DE FUNDO FEDERAL As modalidades descritas aqui foram sustentadas em parte por

concessão BES0228584 junto à National Science Foundation. O governo norte-americano pode possuir alguns direitos para praticar a presente inven- ção.

CAMPO

A presente invenção refere-se em geral a métodos, composições

e usos para aumentar a tolerância e/ou produção de ácidos orgânicos e ál- coois por microorganismos. Esse pedido também refere-se geralmente a métodos, composições e usos de vetores para aumentar a produção de áci- dos orgânicos ou álcoois por um microorganismo. Algumas modalidades re- 20 ferem-se a composições e métodos para aumentar a tolerância a ácido 3- hidroxipropiônico como um meio para aumentar a produção de ácido 3- hidroxipropiônico (3-HP) por bactérias. Em outras modalidades, as composi- ções e métodos referem-se à regulação de uma ou mais moléculas inibido- ras ou moléculas intensificadoras de uma supervia de corismato de um mi- 25 croorganismo para aumentar a tolerância à produção de ácido orgânico pelo microorganismo.

ANTECEDENTES

Os custos do petróleo aumentaram muito nos últimos anos. Mui- tos especialistas acreditam agora que tais aumentos de custo continuarão e que a capacidade de produção de petróleo irá atingir seu máximo em um futuro próximo. Fontes alternativas de materiais de baixo custo para a pro- dução de combustíveis e outros produtos químicos devem ser desenvolvi- das. A biorrefinação procura desenvolver recursos renováveis, tal como, re- síduos agrícolas ou urbanos, para tais propósitos. O modelo básico envolve a conversão de material residual (por exemplo, milho) em açúcares (por e- xemplo, hexoses, pentoses) que pode ser fermentado por organismos elabo- 5 rados para produzir produtos de valor agregado, tais como, combustíveis (por exemplo, etanol ou hidrogênio) ou produtos químicos de base (por e- xemplo, monômeros/polímeros). Embora ainda haja muita discussão com relação à viabilidade comercial a longo prazo de etanol como um substituto de gasolina, rotas biológicas para a produção de produtos químicos de base 10 foram comprovadas como alternativas economicamente atraentes para rotas petroquímicas convencionais. Como um exemplo, a colaboração durante uma década da Dupont/Genencor levou a Dupont a investir no desenvolvi- mento de um processo à base de 800.000 litros de E. coli para a produção de 1,3 propanodiol (um produto estimado em $5-8 bilhões/ano).

Os ácidos orgânicos representam uma plataforma importante de

produtos químicos de biorrefinação futuros. Em um relatório liberado pelo National Renewable Energy Laboratory, oito ácidos orgânicos diferentes fo- ram classificados entre os 12 produtos químicos de biorrefinação mais im- portantes de alto valor que incluem ácido 3-hidroxipropiônico (3-HP). Ainda 20 há a necessidade de gerar rapidamente esses produtos químicos de biorre- finação em métodos eficientes de baixo custo.

SUMÁRIO

As presentes modalidades concernem métodos e composições para aumentar a tolerância à produção de composto orgânico por microor- 25 ganismos. Algumas modalidades concernem aumentar a tolerância a produ- tos químicos de biorrefinação. Em outras modalidades, as composições e métodos concernem a produção de ácido 3-hidroxipropiônico (3-HP). Os mi- croorganismos contemplados de uso aqui podem incluir, porém sem caráter limitativo, E. coli.

Os produtos da via podem incluir, porém sem caráter limitativo,

um ou mais entre corismato, tirosina, fenilalanina, triptofano, folato, ubiqui- nona. meniauinona. chiquimato. D-Eritrose-4-fosfato. 3-deóxi-D-arabino- heptulosonato-7-fosfato, 3-desidroquinato, 3-deidro-chiquimato, chiquimato, chiquimato-3-fosfato, 5-enolpiruvil-chiquimato-3-fosfato, corismato, isocoris- mato, prefenato, fenilpiruvato, para-hidroxifenilpiruvato, L-fenilalanina, L- tirosina, 2,3-di-hidro-2,3-di-hidroxibenzoato, 2,3-di-hidroxibenzoato, entero- bactina, 2-succinil-6-hidróxi-2,4-ciclo-hexadieno-1-carboxilato, o- succinibenzoato, o-succinilbenzoil-coA, 1,4-di-hidróxi-2-naptoato, menaqui- nona, antranilato, N-(5’-fosforibosil)-antranilato, 1-(o-carboxifenilamino)-1’- desoxirribulose-5’-fosfato, indol-3-glicerol-fosfato, indol, L-triptofano, 4- amino-4-desoxicorismato, para-aminobenzoato, 7,8-di-hidropteroato, 7,8-di- hidrofolato, tetra-hidrofolato, 4-hidroxibenzoato, 3-octaprenil-4- hidroxibenzoato, 2-octaprenilfenol, 2,2-octaprenil-6-hidroxifenol, 2-octaprenil- 6-metóxifenol, 2-octaprenil-6-metóxi- 1 ,4-benzoquinona, 2-octaprenil-3- metil-6-metóxi 1,4-benzoquinona, 3-demetilubiquinona-8 ou isozimas da ubi- quinona-8,3-deóxi-D-arbino-heptulosonato-7-fosfato sintase (DAHPS) ou uma mistura desses.

Algumas modalidades concernem uma composição para aumen- tar a tolerância à produção de 3-HP por um microorganismo incluindo um vetor que possui um ou mais elementos genéticos capazes de modular a supervia de corismato do microorganismo onde a modulação da supervia de 20 corismato aumenta a tolerância de 3-HP pelo microorganismo. Em outras modalidades, a composição pode incluir intermediários da supervia de co- rismato. Ainda em outras modalidades, a composição pode incluir um ou mais produtos ou precursores da via.

Os produtos da via podem incluir, porém sem caráter limitativo, 25 um ou mais entre corismato, tirosina, fenilalanina, triptofano, folato, ubiqui- nona, meniquinona, isozimas da 3-deóxi-D-arbino-heptulosonato-7-fosfato sintase (DAHPS), chiquimato, D-Eritrose-4- fosfato, 3-deóxi-D-arabino- heptulosonato-7-fosfato, 3-desidroquinato, 3-deidro-chiquimato, chiquimato, chiquimato-3 -fosfato, 5-enolpiruvil-chiquimato-3-fosfato, corismato, isoco- 30 rismato, prefenato, fenilpiruvato, para-hidroxifenilpiruvato, L-fenilalanina, L- tirosina, 2,3-di-hidro-2,3-di-hidroxibenzoato, 2,3-di-hidroxibenzoato, entero- bactina, 2-succinil-6-hidróxi-2.4-ciclo-hexadieno-1 -carboxilato, o- succinibenzoato, o- succinilbenzoil-coA, 1,4-di-hidróxi-2-naptoato, menaqui- nona, antranilato, N-(5’-fosforibosil)-antranilato, 1-(o-carboxifenilamino)-1’- deóxirribulose-5’-fosfato, indol-3-glicerol-fosfato, indol, L-triptofano, 4-amino-

4-desoxicorismato, para-aminobenzoato, 7,8-di-hidropteroato, 7,8-di- 5 hidrofolato, tetra-hidrofolato, 4-hidroxibenzoato, 3-octaprenil-4- hidroxibenzoato, 2-octaprenilfenol, 2,2-octaprenil-6-hidroxifenol, 2-octaprenil- 6-metóxifenol, 2-octaprenil-6-metóxi-1,4-benzoquinona, 2-octaprenil-3-metil- 6-metóxi-1,4-benzoquinona, 3-demetilubiquinona-8 ou ubiquinona-8.

Outras modalidades incluem composições para aumentar a tole- rância à produção de ácido 3-hidroxipropiônico (3-HP) por um microorganis- mo incluindo, porém sem caráter limitativo, um ou mais compostos capazes de modular as supervias de corismato do microorganismo onde a indução das supervias de corismato aumentam a produção de 3-HP pelo microorga- nismo. De acordo com essas modalidades, as composições podem incluir, porém sem caráter limitativo, um ou mais intermediários, ou composições capazes de aumentar e/ou reduzir a produção de um ou mais intermediários da supervia de corismato. Outras composições podem incluir um ou mais precursores ou composições para aumentar e/ou reduzir a produção de um ou mais precursores da supervia de corismato. Algumas modalidades podem incluir adicionalmente, porém sem caráter limitativo, um ou mais compostos selecionados a partir de um ou mais entre corismato, tirosina, fenilalanina, triptofano, folato, ubiquinona, meniquinona, chiquimato, D-Eritrose-4-fosfato, 3-deóxi-D-arabino-heptulosonato-7-fosfato, 3-desidroquinato, 3-deidro- chiquimato, chiquimato, chiquimato-3-fosfato, 5-enolpiruvil-chiquimato-3- fosfato, corismato, isocorismato, prefenato, fenilpiruvato, para- hidroxifenilpiruvato, L-fenilalanina, L-tirosina, 2,3-di-hidro-2,3-di- hidroxibenzoato, 2,3-di-hidroxibenzoato, enterobactina, 2-succinil-6-hidróxi-

2.4-ciclo-hexadieno-1 -carboxilato, o-succinibenzoato, o-succinilbenzoil-coA,

1.4-di-hidróxi-2-naptoato, menaquinona, antranilato, N-(5’-fosforibosil)- antranilato, 1-(o-carboxifenilamino)-1’-desoxirribulose-5’-fosfato, indol-3-

glicerol-fosfato, indol, L-triptofano, 4-amino-4-desoxicorismato, para- aminobenzoato, 7,8-di-hidropteroato, 7,8- di-hidro folato, tetra-hidrofolato. 4- hidroxibenzoato, 3-octaprenil-4-hidroxibenzoato, 2- octaprenilfenol, 2,2- octaprenil-6-hidroxifenol, 2-octaprenil-6-metóxifenol, 2- octaprenil-6-metóxi-

1,4-benzoquinona, 2-octaprenil-3-metil-6-metóxi 1,4-benzoquinona, 3- demetilubiquinona-8 ou isozimas da ubiquinona-8,3-deóxi-D-arbino- 5 heptulosonato-7-fosfato sintase (DAHPS) ou uma mistura desses. Outras modalidades podem incluir compostos que induzem uma ou mais enzimas da supervia de corismato no microorganismo. Outros compostos exemplifica- tivos podem incluir um ou mais vetores capazes de modular a supervia de corismato introduzida em um microorganismo de produção de ácido orgâni- 10 co.

Algumas modalidades incluem composições para modular a tole- rância de produção de ácido 3-hidroxipropiônico (3-HP) por um microorga- nismo incluindo; um ou mais compostos capazes de modular a supervia de corismato pelo microorganismo onde a indução da supervia de corismato aumenta a produção de 3-HP pelo microorganismo.

Algumas modalidades concernem composições incluindo, porém sem caráter limitativo, um ou mais compostos, incluindo, porém sem caráter limitativo, corismato, tirosina, fenilalanina, triptofano, folato, ubiquinona, me- niquinona, chiquimato, D-Eritrose-4-fosfato, 3-deóxi-D-arabino- 20 heptulosonato-7-fosfato, 3-desidroquinato, 3-deidro-chiquimato, chiquimato, chiquimato-3-fosfato, 5-enolpiruvil-chiquimato-3-fosfato, corismato, isocoris- mato, prefenato, fenilpiruvato, para-hidroxifenilpiruvato, L-fenilalanina, L- tirosina, 2,3-di-hidro-2,3-di-hidroxibenzoato, 2,3-di-hidroxibenzoato, entero- bactina, 2-succinil-6-hidróxi-2,4-ciclo-hexadieno-1 -carboxilato, o- 25 succinibenzoato, o-succinilbenzoil-coA, 1,4- di-hidróxi-2-naptoato, menaqui- nona, antranilato, N-(5’-fosforibosil)-antranilato, 1-(o-carboxifenilamino)-r- desoxirribulose-5’-fosfato, indol-3-glicerol-fosfato, indol, L-triptofano, A- amino-4-desoxicorismato, para-aminobenzoato, 7,8-di-hidropteroato, 7,8-di- hidrofolato, tetra-hidrofolato, 4-hidroxibenzoato, 3-octaprenil-4- 30 hidroxibenzoato, 2-octaprenilfenol, 2,2-octaprenil-6-hidroxifenol, 2-octaprenil- 6-metóxifenol, 2-octaprenil-6-metóxi-1,4-benzoquinona, 2-octaprenil-3-metil- 6-metóxi 1,4-benzoquinona, 3-demetilubiquinona-8 ou isozimas da ubiquino- na-8,3-deóxi-D-arbino-heptulosonato-7-fosfato sintase (DAHPS) ou uma mis- tura desses.

Outras modalidades incluem métodos para aumentar a tolerân- cia de produção de um ácido orgânico por um microorganismo incluindo, 5 porém sem caráter limitativo, inibir repressores capazes de afetar a supervia de corismato no microorganismo. De acordo com essas modalidades, outros compostos capazes de aumentar a produção ou tolerância a ácidos orgâni- cos ou álcool podem ser combinados ou adicionados separadamente a qualquer cultura contemplada aqui. Ademais, contempla-se aqui que os mé- 10 todos e composições descritos podem ser usados em combinação com ou- tras tecnologias de produção de 3-HP conhecidas na técnica.

De acordo com qualquer uma dessas modalidades, um ou mais compostos e/ou composições podem ser introduzidos em um microorganis- mo onde o composto e/ou composição é capaz de modular a supervia de 15 corismato e aumentar a tolerância do microorganismo à produção de 3-HP. Ademais, contempla-se aqui que os métodos e composições podem ser combinados com qualquer outro método conhecido para aumentar a tolerân- cia ou produção de um ácido orgânico em um microorganismo.

Algumas modalidades podem incluir métodos para aumentar a 20 produção e/ou tolerância à produção de um ácido orgânico por um microor- ganismo compreendendo: a) obter um ou mais compostos capazes de mo- dular aspectos de supervia de corismato pelo microorganismo. Em algumas modalidades, a modulação das supervias de corismato aumenta a tolerância à produção de 3-HP pelo microorganismo: e b) introduzir os compostos em 25 uma cultura do microorganismo.

Algumas modalidades concernem a produção ou tolerância au- mentada ao ácido orgânico, 3-HP. De acordo com essas modalidades, um ou mais compostos contemplados aqui para aumentar a tolerância ou produ- ção de 3-HP podem incluir, porém sem caráter limitativo, a composição 30 compreende um ou mais intermediários da supervia de corismato seleciona- dos entre D-Eritrose-4-fosfato, 3-deóxi-D-arabino-heptulosonato-7-fosfato, 3- desidroquinato, 3-deidro-chiquimato. chiquimato, chiquimato-3-fosfato, 5- enolpiruvil-chiquimato-3-fosfato, corismato, isocorismato, prefenato, fenilpi- ruvato, para-hidroxifenilpiruvato, L-fenilalanina, L-tirosina, 2,3-di-hidro-2,3-di- hidroxibenzoato, 2,3-di-hidroxibenzoato, enterobactina, 2-succinil-6-hidróxi-

2.4-ciclo-hexadieno-1-carboxilato, o-succinibenzoato, o-succinilbenzoil-coA, 1,4-di-hidróxi-2-naptoato, menaquinona, antranilato, N-(5’-fosforibosil)-

antranilato, 1-(o-carboxifenilamino)-1 ’-desoxirribulose-5’-fosfato, indol-3- glicerol-fosfato, indol, L-triptofano, 4-amino-4-desoxicorismato, para- aminobenzoato, 7,8-di-hidropteroato, 7,8-di-hidrofolato, tetra-hidrofolato, 4- hidroxibenzoato, 3-octaprenil-4-hidroxibenzoato, 2- octaprenilfenol, 2,2- octaprenil-6-hidroxifenol, 2-octaprenil-6-metóxifenol, 2-octaprenil-6-metóxi-

1.4-benzoquinona, 2-octaprenil-3-metil-6-metóxi 1,4-benzoquinona, 3- demetilubiquinona-8, ubiquinona-8 e uma combinação ou mistura de dois ou mais desses.

Ainda outras modalidades incluem métodos para aumentar a produção de um ácido orgânico, tal como ácido 3-hidroxipropiônico (3-HP), por um microorganismo compreendendo colocar uma cultura de microorga- nismos em contato com uma composição compreendendo um ou mais com- postos de supervias de corismato e/ou um ou mais compostos capazes de modular as supervias de corismato. De acordo com essas modalidades, um ou mais compostos podem incluir um vetor possuindo um ou mais elementos genéticos capazes de modular, tal como, aumentar ou reduzir a supervia de corismato. Algumas modalidades contempladas aqui referem-se ao uso de outros compostos, esses compostos podem incluir um vetor possuindo um ou mais elementos genéticos capazes de aumentar os componentes a ju- sante da supervia de corismato para aumentar tolerância a 3-HP em um mi- croorganismo.

Em algumas modalidades, os métodos para aumentar a produ- ção e/ou tolerância de ácido 3-hidroxipropiônico (3-HP) por um microorga- nismo podem incluir, porém sem caráter limitativo, supervias de corismato de 30 manipulação genética no microorganismo. Algumas dessas manipulações genéticas da supervia de corismato em um microorganismo são seleciona- das a partir da modulação da supervia de corismato em um microorganismo adicionando-se um vetor para introduzir novo material genético; inserção genética, divisão ou remoção de material genético existente; mutação de material genético e uma combinação desses. As manipulações genéticas podem incluir a indução de um ou mais entre precursor de supervia de co- 5 rismato, corismato, tirosina, fenilalanina, triptofano, folato, ubiquinona, meni- quinona, isozimas da 3-deóxi-D-arbino-heptulosonato-7-fosfato sintase (DAHPS), chiquimato ou uma mistura desses.

Algumas modalidades podem ser combinadas com outros méto- dos ou composições conhecidas na técnica para aumentar a tolerância à produção de ácido orgânico em um microorganismo. Em outras modalida- des, os métodos e composições podem ser combinados com processos de seleção de cepa para identificar as cepas capazes de produzir e/ou tolerar concentrações aumentadas de 3-HP. Por exemplo, como referido aqui, Aná- lises Multiescala de Enriquecimentos de Biblioteca (SCALEs) podem ser u- sadas para identificar genes conferindo adaptação aumentada em seleções de fluxo contínuo. Essas seleções podem se basear na presença ou ausên- cia de um composto seletivo, tal como, um ou mais ácidos orgânicos ou ál- coois de interesse. Algumas modalidades concernem a seleção com aumen- to de ácido orgânico, por exemplo, ácido 3-hidroxipropiônico (3-HP) em ní- veis inibidores. Esses processos de seleção podem se basear em SCALES separadamente ou em combinação com outras tecnologias de seleção, por exemplo, outras tecnologias genômicas.

Em algumas modalidades, os kits são contemplados aqui. Em algumas modalidades, um kit para aumentar a produção de um ácido orgâ- 25 nico em um microorganismo pode incluir, porém sem caráter limitativo, um ou mais compostos capazes de modular a supervia de corismato; e um ou mais recipientes. De acordo com essas modalidades, um kit que pode incluir um ou mais compostos é selecionado a partir de corismato, tirosina, fenilala- nina, triptofano, folato, ubiquinona, meniquinona, isozimas da 3-deóxi-D- 30 arbino-heptulosonato-7-fosfato sintase (DAHPS), chiquimato, precursor da supervia de corismato, uma ou mais enzimas da supervia de corismato D- Eritrose-4-fosfato, 3-deóxi-D-arabino-heptulosonato-7-fosfato, 3- desidroquinato, 3-deidro-chiquimato, chiquimato, chiquimato-3-fosfato, 5 - enolpiruvil-chiquimato-3-fosfato, corismato, isocorismato, prefenato, fenilpi- ruvato, para-hidroxifenilpiruvato, L-fenilalanina, L-tirosina, 2,3- di-hidro-2,3-di- hidroxibenzoato, 2,3-di-hidroxibenzoato, enterobactina, 2-succinil-6-hidróxi- 2,4-ciclo-hexadieno-1-carboxilato, o-succinibenzoato, o-succinilbenzoil-coA,

1.4-di-hidróxi-2-naptoato, menaquinona, antranilato, N-(5’-fosforibosil)- antranilato, 1 -(o-carboxifenilamino)-l ’-desoxirribulose-5’-fosfato, indol-3- glicerol-fosfato, indol, L-triptofano, 4-amino-4-desoxicorismato, para- aminobenzoato, 7,8-di-hidropteroato, 7,8-di-hidrofolato, tetra-hidrofolato, 4-

hidroxibenzoato, 3-octaprenil-4-hidroxibenzoato, 2- octaprenilfenol, 2,2- octaprenil-6-hidroxifenol, 2-octaprenil-6-metóxifenol, 2-octaprenil-6-metóxi-

1.4-benzoquinona, 2-octaprenil-3-metil-6-metóxi 1,4-benzoquinona, 3- demetilubiquinona-8, ubiquinona-8 e uma combinação ou mistura de dois ou mais desses.

Em algumas modalidades, um kit para aumentar a produção de

um ácido orgânico em um microorganismo pode incluir, porém sem caráter limitativo, um ou mais compostos capazes de modular a supervia de coris- mato onde a modulação envolve níveis intracelulares de um ou mais inter- mediários da supervia de corismato selecionados partir de D-Eritrose-4- 20 fosfato, 3 -deóxi-D-arabino-heptulosonato-7-fosfato, 3-desidroquinato, 3- deidro-chiquimato, chiquimato, chiquimato-3-fosfato, 5-enolpiruvil- chiquimato-3-fosfato, corismato, isocorismato, prefenato, fenilpiruvato, para- hidroxifenilpiruvato, L-fenilalanina, L-tirosina, 2,3-di-hidro-2,3-di- hidroxibenzoato, 2,3-di-hidroxibenzoato, enterobactina, 2- succinil-6-hidróxi- 25 2,4-ciclo-hexadieno-1-carboxilato, o-succinibenzoato, o-succinilbenzoil-coA,

1.4-di-hidróxi-2-naptoato, menaquinona, antranilato, N-(5’-fosforibosil)- antranilato, 1-(o-carboxifenilamino)-1 ’-desoxirribulose-5’-fosfato, indol-3- glicerol-fosfato, indol, L-triptofano, 4-amino-4-desoxicorismato, para- aminobenzoato, 7,8-di-hidropteroato, 7,8-di-hidrofolato, tetra-hidrofolato, 4-

hidroxibenzoato, 3-octaprenil-4-hidroxibenzoato, 2-octaprenilfenol, 2,2- octaprenil-6-hidroxifenol, 2- octaprenil-6-metóxifenol, 2-octaprenil-6-metóxi-l ,4-benzoquinona, 2-octaprenil-3-metil-6-metóxi-1.4-benzoquinona, 3- demetilubiquinona-8, ubiquinona-8 e uma combinação ou mistura de dois ou mais desses.

Os versados na técnica irão perceber que embora os métodos e composições sejam descritos em termos de modalidades para a aplicação de tolerância aumentada à produção de 3-HP em microorganismos, esses também podem ser úteis com outros tipos de tolerância a ácidos orgânicos em microorganismos.

DESCRIÇÃO DE MODALIDADES ILUSTRATIVAS

Os seguintes desenhos formam parte do presente relatório des- critivo e são incluídos para ilustrar adicionalmente algumas modalidades. As modalidades podem ser melhor entendidas a título de referência a um ou mais desses desenhos em combinação com a descrição detalhada de moda- lidades específicas apresentadas aqui.

As Figuras 1A-1D representam esquemas de análise multiescala ampla de genoma a partir da seleção de 3-HP. A) representa o sinal associ- ado à escala de 1000 (bp) de par de bases; B) representa o sinal associado à escala de 2000 bp, C) representa o sinal associado à escala de 4000 bp e D) representa o sinal associado à escala maior que 8000 bp.

A Figura 2A representa um gráfico histograma exemplificativo de sete vias que contribuem para a adaptação na presença de 3-HP.

A Figura 3 A representa um esquema exemplificativo de uma supervia de corismato.

A Figura 3B representa um gráfico de barras exemplificativo da alteração na adaptação (aumento na taxa de crescimento) associada ao aumento no número de cópias dos genes associados à supervia de corisma- to, como designado.

A Figura 4 representa um gráfico de barras exemplificativo do crescimento de microorganismos na presença ou ausência de moléculas orgânicas adicionadas de maneira exógena ou combinações de moléculas. Definições

Como usado aqui, "um" ou "uma" pode significar um ou mais de

um item. Como usado aqui, "modular" ou "modulando" ou "modulação" pode significar alterar, aumentar ou reduzir.

DESCRIÇÃO DETALHADA

Nas seguintes seções, várias composições e métodos exemplifi- 5 cativos são descritos para detalhar diversas modalidades da invenção. Se tornará óbvio para um versado na técnica que praticar as várias modalidades não requer o emprego de todos ou mesmo alguns detalhes específicos des- critos aqui, porém, especialmente aquelas concentrações, tempos, tempera- tura e outros detalhes específicos podem ser modificadas através de expe- 10 rimentação rotineira. Em alguns casos, os métodos ou componentes bem conhecidos não foram incluídos na descrição.

De acordo com as presentes modalidades, pode-se empregar biologia molecular convencional, microbiologia e técnicas de DNA recombi- nante dentro da habilidade do elemento versado na técnica. Tais técnicas 15 são explicadas de forma geral na literatura. (Veja, por exemplo, Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.; Ani- mal Cell Culture, R. I. Freshney, ed., 1986).

Biorrefinação envolve o desenvolvimento de processos eficazes 20 para a conversão de fontes renováveis de carbono e energia em produtos químicos de base de grande volume. O Departamento de Energia dos Esta- dos Unidos (USDOE) publicou uma lista de prioridade de produtos químicos de bloco de construção para tentativas futuras de biorrefinação, essa inclui, por exemplo, ácido 3-hidroxipropiônico (3-HP). A produção anterior foi reali- 25 zada através do desenvolvimento de hospedeiros recombinantes que con- vertem glicose em 3-HP. Foi proposto que titragens finais de 3-HP de pelo menos 100 g/L são necessárias para garantir a viabilidade econômica para produção industrial, porém, com 10 g/L nessas culturas pode-se inibir o crescimento.

Diversas estratégias genéticas diferentes foram investigadas

para a produção de 3-HP em E. coli, esse é um organismo hospedeiro atra- ente devido a sua ampla faixa de fonte de nutrientes {por exemplo, pento- ses), crescimento rápido e capacidade de ser facil e geneticamente modifi- cado quando comparado com organismos alternativos. Um problema foi a baixa tolerância à produção em larga escala de compostos orgânicos por um microorganismo. Geralmente, o teor de composto orgânico aumentado se 5 torna tóxico ao microorganismo. Há a necessidade de aumentar a produção e tolerância à produção de ácido orgânico e álcool por microorganismos.

A Análise Escalar de Enriquecimento de Biblioteca (SCALEs), é uma abordagem ampla genômica de alta resolução que pode ser usada para monitorar o enriquecimento e diluição de clones individuais dentro de uma 10 população de biblioteca genômica. Esse método inclui a criação de bibliote- cas genômicas representativas com tamanho de inserto variado, crescimen- to de clones em ambientes seletivos, interrogação da população selecionada utilizando microarranjos e uma análise multiescala matemática para identifi- car o(s) gene(s) para tal número de cópias aumentado melhorar a adaptação 15 total. Esse método foi empregado para desenvolver a técnica de seleção de cepa dirigida referente a fenótipos de ácido orgânico, por exemplo, fenótipos de tolerância a 3-HP (dados não mostrados). O trabalho anterior identificou diversos mecanismos para aliviar a toxicidade do produto incluindo: forma- ção de biofilme, permeabilidade alterada, transporte aumentado, modificação 20 de produto ou utilização de carbono e alterações metabólicas específicas. Em algumas modalidades, os métodos procuram avaliar a inibição devido aos efeitos metabólicos específicos do estresse por ácido orgânico, por e- xemplo, estresse por 3-HP, dentro da célula relacionada à via biossintética de corismato.

Algumas modalidades concernem biorrefinação, biomassa (por

exemplo, culturas, árvores, granas, resíduos culturais, resíduos florestais) e utilizam conversão biológica, fermentação, conversão química e catálise pa- ra gerar e usar compostos orgânicos. Esses compostos orgânicos podem ser então subsequentemente convertidos em produtos químicos derivados 30 valiosos. Entretanto, os ácidos orgânicos podem ser tóxicos por natureza e, desse modo, inibidores dos organismos de produção em baixos níveis. Para otimizar a produção dos intermediários de ácido orgânico, a tolerância elabo- rada ao ácido orgânico pode ser um fator. Isso pode ser realizado ao forne- cer moléculas exógenas para aumentar a produção ou inibir a expressão de uma molécula não-permissiva permitindo, assim, níveis aumentados de pro- dução. Uma vez que há produtos químicos de base em um ambiente compe- 5 titivo, a otimização pode ser necessária para viabilidade econômica de bior- refinação. Portanto, as composições e métodos descritas aqui referem-se à identificação de cepas bacterianas e regiões genéticas dentro de moléculas que aumentam a produção ou tolerância aos compostos orgânicos para uso em produtos de bioprodução e sistemas.

Superviadecorismato

A supervia de corismato é uma via metabólica primária essencial para a viabilidade celular. Por exemplo, o corismato é o precursor comum a inúmeros aminoácidos aromáticos (tirosina, fenilalanina, triptofano) e vitami- nas (folato, ubiquinona e meniquinona) exigidos para viabilidade celular. Em 15 um exemplo mais particular, as isozimas da 3-deóxi-D-arbino- heptulosona- to-7-fosfato sintase (DAHPS) ativas na primeira etapa da síntese de corisma- to (aroF, aroG, aroH) mostram retroinibição significativa de grupos de ami- noácidos aromáticos produzidos a jusante. Em uma modalidade, a supervia de corismato pode ser inibida pelo estresse por 3-HP, que pode ser parcial- 20 mente aliviado pela adição de um produto a jusante da supervia de corisma- to ao meio de crescimento. Em uma modalidade mais particular, o produto a jusante pode ser chiquimato. A adição de cada produto a jusante de coris- mato mostra uma regeneração pelo menos parcial de crescimento específico e densidade celular final. Em uma modalidade particular, a adição de chi- 25 quimato podem resultar em uma regeneração de cerca de 20% de cresci- mento comparado com o crescimento de ocorrência natural, indicando que a inibição pode ocorrer antes da formação de chiquimato, resultando em um grupo de aminoácidos e vitaminas reduzido dentro da célula.

Em várias modalidades, o crescimento pode ser aumentado ao identificar um gene que, com expressão modulada, pode aumentar a tole- rância e/ou produção de um composto orgânico. Em algumas modalidades, a modulação pode incluir um aumento na expressão ou atividade de um ou mais genes da supervia de corismato. Em outras modalidades, a modulação pode incluir uma redução na expressão ou atividade de um ou mais genes da supervia de corismato. Em outras modalidades, a modulação da supervia de corismato pode incluir uma combinação de aumento da expressão e/ou 5 atividade de alguns genes ao mesmo tempo em que reduz a expressão e/ou atividade de outros genes. Em algumas modalidades, os genes capazes de alterar a supervia de corismato podem incluir genes que alteram a formação de um intermediário da via e/ou alteram os precursores da via. Contempla-se aqui que a manipulação genética pode incluir, aumentar e/ou reduzir o fluxo 10 de intermediários através da supervia de corismato.

As seleções genéticas usadas para detectar compostos indivi- duais geralmente procedem com uma célula de cada vez. As seleções estão relacionadas à viabilidade em um ambiente específico. Portanto, em uma modalidade, os organismos bacterianos que demonstram crescimento ou 15 tolerância aumentada a um ácido orgânico podem ser selecionados e a regi- ão genética que afeta o crescimento, produção e/ou tolerância identificada. Em algumas modalidades, a seleção de uma região genética que codifica tirosina demonstrou produção aumentada e/ou tolerância de uma molécula de ácido orgânico produzida em uma bactéria.

Algumas modalidades concernem modular a supervia de coris-

mato capaz de aumentar a tolerância de produção do composto orgânico em um microorganismo. De acordo com essas modalidades, a expressão de algumas moléculas dentro dessa via é capaz de aumentar a tolerância de um composto orgânico ao modular a expressão de genes da via. Essa nova 25 estratégia de tolerância irá permitir a produção aumentada de compostos orgânicos, tal como, 3-HP. Por exemplo, as cepas já elaboradas para produ- zir 3-HP podem ser modificadas ao modular um ou mais genes na supervia de corismato descritos aqui para aumentar a tolerância da cepa de modo a produzir 3-HP. Ademais, esses métodos podem ser usados em conjunto 30 com a tecnologia SCALEs (Pedido Provisório número U.S. 60/611.377 depo- sitado em 20 de setembro de 2004 e Pedido de Patente No. US 11/231.018 depositado em 20 de setembro de 2005, ambos intitulados: "Mixed-Librarv Parallel Gene Mapping Quantitation Microarray Technique for Genome Wide Identification of Trait Conferring Genes" aqui incorporados a título de refe- rência em sua totalidade), para alterações genéticas de organismos e para estratégias de seleção genética.

Em algumas modalidades, a manipulação genética de microor-

ganismos pode ser usada para realizar alterações genéticas desejadas po- dendo resultar em fenótipos desejados e pode ser realizada através de inú- meras técnicas. Essas técnicas incluem, porém sem caráter limitativo, utili- zar: i) um vetor para introduzir o novo material genético; ii) inserção genética, 10 divisão ou remoção de material genético existente, bem como; iii) mutação de material genético; ou quaisquer combinações de i, ii e iii, resultando em alterações genéticas desejadas com busca fenotípica desejada. Um vetor pode incluir, porém sem caráter limitativo, qualquer elemento genético usado para introduzir o novo material genético em um organismo. Esses vetores 15 podem incluir, porém sem caráter limitativo, um plasmídeo de qualquer nú- mero de cópias, um elemento integrável que integra qualquer cópia no ge- noma, um vírus, fago ou fagomídeo. Em outras modalidades, inserções ge- néticas, divisões ou remoções podem ser incluídas como parte da inserção de um novo elemento genético no genoma, transcrição por divisão ou função 20 reguladora normal através da inserção podendo afetar grandes regiões do genoma além daquelas no sítio de inserção e a deleção ou remoção de uma região do genoma. Esses podem ser realizados com técnicas que incluem, porém sem caráter limitativo, nocautes ou mutações dirigidas, substituições genéticas, transposons, mutagênese aleatória ou uma combinação desses. 25 As mutações podem ser dirigidas ou aleatórias, utilizando quaisquer técnicas que exigem vetores, inserções, divisões ou remoções, além daquelas que incluem, porém sem caráter limitativo, mutagênese propensa a erros ou diri- gida através de PCR, cepas de mutantes e metagênese aleatória, mediante qualquer técnica conhecida.

Em algumas modalidades, SCALEs pode ser usada para monito-

rar o enriquecimento e diluição de clones individuais dentro de uma popula- ção de biblioteca aenômica. Esse método inclui a criação de bibliotecas ge- nômicas representativas com tamanho de inserto variado, crescimento de clones em ambientes seletivos, interrogação da população selecionada utili- zando microarranjos e uma análise multiescala matemática para identificar o(s) gene(s) para que o número de cópias aumentado melhore a adaptação total.

Ademais, algumas modalidades contempladas aqui referem-se à inibição da expressão ou atividade de um gene repressor correspondente a um gene intensificador (por exemplo, um gene que aumenta a produção ou aumenta a tolerância á produção de um ácido orgânico por um microorga- 10 nismo). Em outras modalidades, os clones que conduzem uma deleção na região TyrR (região de gene repressor da tirosina), a região repressora cor- respondente à vias de Tirosina e Corismato, pode ser usada para aumentar os grupos tirosina. A combinação desse repressor com outras mutações de via de corismato poderia resultar na alteração de grupos intermediários rela- 15 cionados à produção de chiquimato aumentada e tolerância aumentada a 3- HP correspondente. Em algumas modalidades, uma região genética equiva- lente, correspondente ou incluindo cerca de 50% ou cerca de 60% ou cerca de 70% ou ainda cerca de 80% ou cerca de 90% da região de gene com va- riação de 2736799-2738100 (clone da Tirosina A) em culturas MACH1 e/ou 20 região de gene com variação de 2736700-2739223 (clone da Tirosina A) po- de ser usada aqui para aumentar a produção ou tolerância à produção de 3- HP por um microorganismo. Ademais, contempla-se aqui que uma muta- ção/deleção dentro de uma região genética, correspondente ou incluindo cerca de 50 %, cerca de 60%, cerca de 70%, cerca de 80% ou cerca de 90% 25 da região de gene com variação de 1384744-1386285 (clone da Tirosina R) pode ser usada aqui para aumentar a produção ou tolerância à produção de 3-HP por um microorganismo. Em uma modalidade, um ou mais muta- ções/deleções podem estar dentro de uma região genética que codifica um repressor capaz de reprimir qualquer aminoácido produzido na supervia de 30 corismato, por exemplo, tirosina. Nota: a porcentagem contemplada aqui pode incluir regiões não-contíguas.

Em um método exemplificativo, a análise de adaptação de via identificou múltiplas vias, cada uma exercendo uma função na inibição de crescimento específica em níveis aumentados de 3-HP, inclusive a supervia de corismato e a supervia de biossíntese de histidina, purina e pirimidina (PRPP) (veja, por exemplo, Figura 2). Essa metodologia quantitativa ampla 5 genômica permitiu a identificação de vias metabólicas totais associada à ini- bição do crescimento devido ao estresse por 3-HP.

Algumas modalidades concernem composições para aumentar a tolerância ao ácido 3-hidroxipropiônico (3-HP) por um microorganismo que compreende; um ou mais compostos capazes de modular a supervia de co- rismato do microorganismo onde a modulação da supervia de corismato au- menta a tolerância de 3-HP. Em algumas modalidades, a composição inclui um intermediário da supervia de corismato. Em outras modalidades, a com- posição inclui um precursor para a supervia de corismato. Ainda em outras modalidades, a composição inclui modular o fluxo da supervia de corismato. Em algumas modalidades, modular pode significar aumentar ou reduzir a expressão ou atividade de um ou mais genes da supervia de corismato. De acordo com essas modalidades, um ou mais compostos podem induzir uma enzima da supervia de corismato no microorganismo. Em outras modalida- des, o composto pode incluir um vetor que possui um elemento genético ca- paz de modular a supervia de corismato.

As composições e métodos de uso contemplados aqui podem incluir, porém sem caráter limitativo, um ou mais intermediários da supervia de corismato selecionados a partir de D-Eritrose-4-fosfato, 3-deóxi-D- arabino-heptulosonato-7-fosfato, 3-desidroquinato, 3-deidro-chiquimato, chi- 25 quimato, chiquimato-3-fosfato, 5-enolpiruvil-chiquimato-3-fosfato, corismato, isocorismato, prefenato, fenilpiruvato, para-hidroxifenilpiruvato, L- fenilalanina, L-tirosina, 2,3-di-hidro-2,3-di-hidroxibenzoato, 2,3-di- hidroxibenzoato, enterobactina, 2-succinil-6-hidróxi-2,4-ciclo-hexadieno-1 - carboxilato, o-succinibenzoato, o-succinilbenzoil-coA, 1,4-di-hidróxi-2- 30 naptoato, menaquinona, antranilato, N-(5’-fosforibosil)-antranilato, 1-(o- carboxifenilamino)- 1’-desoxirribulose-5’-fosfato, indol-3-glicerol-fosfato, in- dol, L-triptofano. 4-amino-4-desoxicorismato, para-aminobenzoato, 7,8-di- hidropteroato, 7,8-di-hidrofolato, tetra-hidrofolato, 4-hidroxibenzoato, 3- octaprenil-4-hidroxibenzoato, 2-octaprenilfenol, 2,2-octaprenil-6-hidroxifenol,

2-octaprenil-6-metóxifenol, 2-octaprenil-6-metóxi-1,4-benzoquinona, 2- octaprenil-3-metil-6-metóxi-1,4-benzoquinona, 3-demetilubiquinona-8, ubi- quinona-8 ou uma combinação ou mistura de dois ou mais desses.

As composições e métodos de uso contemplados aqui podem incluir, porém sem caráter limitativo, um ou mais precursores da supervia de corismato selecionados a partir de D-Eritrose-4-fosfato, 3-deóxi-D-arabino- heptulosonato-7-fosfato, 3-desidroquinato, 3-deidro-chiquimato, chiquimato, 10 chiquimato-3-fosfato, 5-enolpiruvil-chiquimato-3-fosfato, corismato, isocoris- mato, prefenato, fenilpiruvato, para-hidroxifenilpiruvato, L-fenilalanina, L- tirosina, 2,3-di-hidro-2,3-di-hidroxibenzoato, 2,3-di-hidroxibenzoato, entero- bactina, 2-succinil-6-hidróxi-2,4-ciclo-hexadieno-1 -carboxilato, o- succinibenzoato, o-succinilbenzoil-coA, 1,4-di-hidróxi-2-naptoato, menaqui- 15 nona, antranilato, N-(5’-fosforibosil)-antranilato, 1-(o-carboxifenilamino)-1’- desoxirribulose-5’-fosfato, indol-3-glicerol-fosfato, indol, L-triptofano, A- amino-4-desoxicorismato, para-aminobenzoato, 7,8-di-hidropteroato, 7,8-di- hidrofolato, tetra-hidrofolato, 4-hidroxibenzoato, 3-octaprenil-4- hidroxibenzoato, 2-octaprenilfenol, 2,2-octaprenil-6-hidroxifenol, 2-octaprenil- 20 6-metóxifenol, 2-octaprenil-6-metóxi-1,4-benzoquinona, 2-octaprenil-3-metil- 6-metóxi-1,4-benzoquinona, 3-demetilubiquinona-8, ubiquinona-8 e uma combinação, ou mistura de dois ou mais desses.

As composições e métodos de uso contemplados aqui podem incluir, porém sem caráter limitativo, uma ou mais composições que são ca- 25 pazes de alterar os níveis intracelulares de um ou mais intermediários da supervia de corismato selecionados a partir de D-Eritrose-4-fosfato, 3- deóxi- D-arabino-heptulosonato-7-fosfato, 3-desidroquinato, 3-desidro-chiquimato, chiquimato, chiquimato-3 -fosfato, 5 -enolpiruvil-chiquimato-3-fosfato, coris- mato, isocorismato, prefenato, fenilpiruvato, para-hidroxifenilpiruvato, L- 30 fenilalanina, L-tirosina, 2,3-di-hidro-2,3-di-hidroxibenzoato, 2,3-di- hidroxibenzoato, enterobactina, 2-succinil-6-hidróxi-2,4-ciclo-hexadieno-1 - carboxilato, o-succinibenzoato, o-succinilbenzoil-coA, 1.4-di-hidróxi-2- naptoato, menaquinona, antranilato, N-(5’-fosforibosil)-antranilato, 1-(o- carboxifenilamino)-1 ’-desoxirribulose-5’-fosfato, indol-3-glicerol-fosfato, indol, L-triptofano, 4-amino-4-desoxicorismato, para-aminobenzoato, 7,8-di- hidropteroato, 7,8-di-hidrofolato, tetra-hidrofolato, 4-hidroxibenzoato, 3- 5 octaprenil-4-hidroxibenzoato, 2-octaprenilfenol, 2,2-octaprenil-6-hidroxifenol,

2-octaprenil-6-metóxifenol, 2-octaprenil-6-metóxi-1,4-benzoquinona, 2- octaprenil-3-metil-6-metóxi-1,4-benzoquinona, 3-demetilubiquinona-8, ubi- quinona-8 e uma combinação ou mistura de dois ou mais desses.

As composições e métodos de uso contemplados aqui podem incluir, porém sem caráter limitativo, uma ou mais composições capazes de alterar os níveis intracelulares de um ou mais precursores da supervia de corismato selecionados a partir de D-Eritrose-4-fosfato, 3-deóxi-D-arabino- heptulosonato-7-fosfato, 3-desidroquinato, 3-desidro-chiquimato, chiquimato, chiquimato-3-fosfato, 5-enolpiruvil-chiquimato-3-fosfato, corismato, isocoris- mato, prefenato, fenilpiruvato, para-hidroxifenilpiruvato, L-fenilalanina, L- tirosina, 2,3-di-hidro-2,3-di-hidroxibenzoato, 2,3-di-hidroxibenzoato, entero- bactina, 2-succinil-6-hidróxi-2,4-ciclo-hexadieno-1 -carboxilato, o- succinibenzoato, o-succinilbenzoil-coA, 1,4-di-hidróxi-2-naptoato, menaqui- nona, antranilato, N-(5’-fosforibosil)-antranilato, 1-(o-carboxifenilamino)-1’- desoxirribulose-5’-fosfato, indol-3-glicerol-fosfato, indol, L-triptofano, 4- amino-4-desoxicorismato, para-aminobenzoato, 7,8-di-hidropteroato, 7,8-di- hidrofolato, tetra-hidrofolato, 4-hidroxibenzoato, 3-octapreníl-4- hidroxibenzoato, 2-octaprenilfenol, 2,2-octaprenil-6-hidroxifenol, 2-octaprenil- 6-metóxifenol, 2-octaprenil-6-metóxi-1,4-benzoquinona, 2-octaprenil-3-metil- 6-metóxi 1,4-benzoquinona, 3-demetilubiquinona-8, ubiquinona-8 e uma combinação ou mistura de dois ou mais desses.

As composições e métodos de uso contemplados aqui podem incluir, porém sem caráter limitativo, um ou mais compostos selecionados a partir de corismato, tirosina, fenilalanina, triptofano, folato, ubiquinona, meni- 30 quinona, isozimas da 3-deóxi-D-arbino-heptulosonato-7-fosfato sintase (DAHPS), chiquimato, D-Eritrose-4-fosfato, 3-deóxi-D-arabino- heptulosonato-7-fosfato, 3-desidroquinato, 3-desidro-chiquimato. chiquimato. chiquimato-3-fosfato, 5-enolpiruvil-chiquimato-3-fosfato, corismato, isocoris- mato, prefenato, fenilpiruvato, para-hidroxifenilpiruvato, L-fenilalanina, L- tirosina, 2,3-di-hidro-2,3- di-hidroxibenzoato, 2,3-di-hidroxibenzoato, entero- bactina, 2-succinil-6-hidróxi-2,4-ciclo-hexadieno-1 -carboxilato, o- 5 succinibenzoato, o-succinilbenzoil-coA, 1,4-di-hidróxi-2-naptoato, menaqui- nona, antranilato, N-(5’-fosforibosil)-antranilato, 1-(o-carboxifenilamino)-1’- desoxirribulose-5’-fosfato, indol-3-glicerol-fosfato, indol, L-triptofano, 4- amino-4-desoxicorismato, para-aminobenzoato, 7,8-di-hidropteroato, 7,8-di- hidro folato, tetra-hidrofolato, 4-hidroxibenzoato, 3-octaprenil-4- 10 hidroxibenzoato, 2-octaprenilfenol, 2,2-octaprenil-6-hidroxifenol, 2-octaprenil- 6-metóxifenol, 2-octaprenil-6-metóxi-1,4-benzoquinona, 2-octaprenil-3-metil- 6-metóxi 1,4-benzoquinona, 3-demetilubiquinona-8 ou ubiquinona-8.

Em algumas modalidades, as composições e métodos de uso aqui podem concernir o uso de um composto que modula uma ou mais en- 15 zimas da supervia de corismato no microorganismo. Em algumas modalida- des, as composições e método de uso aqui podem concernir o uso de um composto que modula um ou mais compostos ao introduzir um ou mais veto- res tendo elemento(s) genético(s) capaz(es) de alterar os metabólitos da su- pervia de corismato. Em algumas modalidades, as composições e métodos 20 de uso aqui podem concernir um ou mais compostos capazes de modular uma alteração genética que altera os metabólitos na supervia de corismato.

Outras modalidades concernem as composições ou métodos de uso para aumentar a produção de ácido 3-hidroxipropiônico (3-HP) por um microorganismo utilizando um ou mais compostos capazes de aumentar a 25 tolerância do microorganismo ao 3-HP, onde a composição induz a tolerân- cia a pelo menos 30g/L de 3-HP. Outras modalidades contempladas incluem a tolerância a pelo menos 35 g/L de 3-HP; a pelo menos 40g/L 3-HP; a pelo menos 1,2 vez o 3-HP de uma composição de ocorrência natural, a pelo menos 1,4 vez o 3-HP de uma composição de ocorrência natural; a pelo 30 menos 1,6 vez o 3-HP de uma composição de ocorrência natural, onde a composição de ocorrência natural possui pouca ou nenhuma supervia de corismato alterando as composições ou métodos. Outros métodos exemplificatívos contemplados aqui concernem em aumentar a produção ou tolerância à produção de um ácido orgânico por um microorganismo compreendendo, modular a supervia de corismato no microorganismo. De acordo com esses métodos exemplificatívos, modular a 5 supervia de corismato no microorganismo pode incluir introduzir um compos- to no microorganismo capaz de modular a supervia de corismato. Outros métodos contemplados para aumentar a produção ou tolerância à produção de um ácido orgânico por um microorganismo podem incluir: obter um ou mais compostos capazes de modular intermediários das supervias de coris- 10 mato pelo microorganismo, onde a modulação das supervias de corismato aumenta a produção ou tolerância ao ácido orgânico pelo microorganismo; e introduzir os compostos em uma cultura do microorganismo. Em algumas modalidades mais particulares o ácido orgânico é 3-HP ou uma composição de 3-HP.

Em algumas modalidades, os compostos podem ser seleciona-

dos a partir de um ou mais entre corismato, tirosina, fenilalanina, triptofano, folato, ubiquinona, meniquinona, isozimas da 3-deóxi-D-arbino- heptulosonato-7-fosfato sintase (DAHPS), chiquimato, D-Eritrose-4-fosfato,

3-deóxi-D-arabino-heptulosonato-7-fosfato, 3-desidroquinato, 3-desidro- chiquimato, chiquimato, chiquimato-3-fosfato, 5-enolpiruvil-chiquimato-3- fosfato, corismato, isocorismato, prefenato, fenilpiruvato, para- hidroxifenilpiruvato, L-fenilalanina, L-tirosina, 2,3-di-hidro-2,3-di- hidroxibenzoato, 2,3-di-hidroxibenzoato, enterobactina, 2-succinil-6-hidróxi-

2.4-ciclo-hexadieno-1 -carboxilato, o-succinibenzoato, o-succinilbenzoil-coA, 1,4-di-hidróxi-2-naptoato, menaquinona, antranilato, N-(5’-fosforibosil)-

antranilato, 1 -(o-carboxifenilamino)-l ’-desoxirribulose-5’-fosfato, indol-3- gliceroi-fosfato, indol, L-triptofano, 4-amino-4-desoxicorismato, para- aminobenzoato, 7,8-di-hidropteroato, 7,8-di-hidrofolato, tetra-hidrofolato, A- hidroxibenzoato, 3-octaprenil-4-hidroxibenzoato, 2-octaprenilfenol, 2,2- octaprenil-6-hidroxifenol, 2- octaprenil-6-metóxifenol, 2-octaprenil-6-metóxi-

1.4-benzoquinona, 2-octaprenil-3- metil-6-metóxi-1,4-benzoquinona, 3- demetilubiquinona-8, ubiquinona-8 ou uma combinação ou mistura de dois ou mais desses.

Em algumas modalidades contempladas aqui, as composições de 3-HP podem conter uma mistura de 3-HP, e opcionalmente, um ou mais entre ácido 3,3-dioxoproprínico e ácido acrílico.

Alguns métodos exemplificatívos contemplados aqui concernem

aumentar a produção ou tolerância á produção de um ácido orgânico por um microorganismo incluindo: obter um ou mais compostos capazes de modular os precursores de supervias de corismato pelo microorganismo onde a indu- ção das supervias de corismato aumenta a produção ou tolerância ao ácido 10 orgânico pelo microorganismo; e introduzir os compostos em uma cultura do microorganismo.

Em alguns métodos mais particulares, aumentar a produção de ácido 3-hidroxipropiônico (3-HP) por um microorganismo pode incluir colocar uma cultura de microorganismo em contato com uma composição compre- endendo um ou mais compostos de supervia de corismato ou capazes de modular a supervia de corismato. De acordo com essas modalidades, o composto pode incluir um vetor contendo um elemento genético capaz de modular a supervia de corismato. Outros métodos exemplificatívos para au- mentar a produção e/ou tolerância de ácido 3-hidroxipropiônico (3-HP) por um microorganismo podem incluir manipular geneticamente as supervias de corismato no microorganismo. A manipulação genética da supervia de co- rismato como contemplado aqui pode incluir alterar a expressão genética de um ou mais genes envolvidos na supervia de corismato em um microorga- nismo adicionando um vetor para introduzir o novo material genético; inser- ção genética, divisão ou remoção de material genético existente; mutação de material genético ou uma combinação de dois ou mais desses.

As inserções genéticas exemplificativas incluem modular os ní- veis intracelulares de um ou mais entre corismato, tirosina, fenilalanina, trip- tofano, folato, ubiquinona, meniquinona, isozimas da 3-deóxi-D-arbino- heptulosonato-7-fosfato sintase (DAHPS), chiquimato, D-Eritrose-4-fosfato,

3-deóxi-D-arabino-heptulosonato-7-fosfato, 3- desidroquinato, 3-desidro- chiquimato, chiquimato. chiquimato-3 -fosfato, 5-enolpiruvil-chiquimatq-3- fosfato, corismato, isocorismato, prefenato, fenilpiruvato, para- hidroxifenilpi- ruvato, L-fenilalanina, L-tirosina, 2,3-di-hidro-2,3-di-hidroxibenzoato, 2,3-di- hidroxibenzoato, enterobactina, 2-succinil-6-hidróxi-2,4-ciclo-hexadieno-1 - carboxilato, o-succinibenzoato, o-succinilbenzoil-coA, 1,4-di-hidróxi-2- 5 naptoato, menaquinona, antranilato, N-(5’-fosforibosil)-antranilato, 1-(o- carboxifenilamino)-1 ’-desoxirribulose-5’-fosfato, indol-3-glicerol-fosfato, indol, L-triptofano, 4-amino- 4-desoxicorismato, para-aminobenzoato, 7,8-di- hidropteroato, 7,8-di-hidrofolato, tetra-hidrofolato, 4-hidroxibenzoato, 3- octaprenil-4-hidroxibenzoato, 2-octaprenilfenol, 2,2-octaprenil-6-hidroxifenol, 10 2-octaprenil-6-metóxifenol, 2-octaprenil-6-metóxi-1,4-benzoquinona, 2- octaprenil-3-metil-6-metóxi 1 ,4-benzoquinona, 3-demetilubiquinona-8, ubi- quinona-8 e uma combinação ou mistura de dois ou mais desses.

Em algumas modalidades, os kits são contemplados para uso de composições e métodos contemplados aqui. Algumas modalidades incluem kits para aumentar a produção de um ácido orgânico em um microorganismo compreendendo; um ou mais compostos capazes de modular as supervias de corismato; e um ou mais recipientes. De acordo com essas modalidades, os kits de uso aqui podem proporcionar alteração da supervia de corismato ou composições suplementares capazes de alterar o fluxo da supervia de corismato em um microorganismo de uso para produzir 3-HP. Algumas mo- dalidades podem incluir, porém sem caráter limitativo, um ou mais compos- tos selecionados a partir de corismato, tirosina, fenilalanina, triptofano, folato, ubiquinona, meniquinona, isozimas da 3-deóxi-D-arbino-heptulosonato-7- fosfato sintase (DAHPS), chiquimato, D-Eritrose-4-fosfato, 3-deóxi-D- arabino-heptulosonato-7-fosfato, 3-desidroquinato, 3-desidro-chiquimato, chiquimato, chiquimato-3-fosfato, 5-enolpiruvil-chiquimato-3-fosfato, corisma- to, isocorismato, prefenato, fenilpiruvato, para-hidroxifenilpiruvato, L- fenilalanina, L-tirosina, 2,3-di-hidro-2,3-di-hidroxibenzoato, 2,3-di- hidroxibenzoato, enterobactina, 2-succinil-6-hidróxi-2,4-ciclo-hexadieno-1 - carboxilato, o-succinibenzoato, o-succinilbenzoil-coA, 1,4-di-hidróxi-2- naptoato, menaquinona, antranilato, N-(5’- fosforibosil)-antranilato, 1-(o- carboxifenilaminoV 1’-desoxirribulose-5’-fosfato. indol-3-qlicerol-fosfato, in- dol, L-triptofano, 4-amino-4-desoxicorismato, para-aminobenzoato, 7,8-di- hidropteroato, 7,8-di-hidrofolato, tetra-hidrofolato, 4-hidroxibenzoato, 3- octaprenil-4-hidroxibenzoato, 2-octaprenilfenol, 2,2-octaprenil-6-hidroxifenol, 2- octaprenil-6-metóxifenol, 2-octaprenil-6-metóxi-1,4-benzoquinona, 2- 5 octaprenil-3- metil-6-metóxi-1,4-benzoquinona, 3-demetilubiquinona-8, ubi- quinona-8 e uma combinação ou mistura de dois ou mais desses.

Em algumas modalidades contempladas aqui, as composições podem incluir uma composição capaz de modular o fluxo de metabólitos a- través da supervia de corismato, para aumentar e/ou reduzir a produção de 10 metabólito através da via. Em alguns exemplos, o aumento no fluxo pode ser de D-eritrose-4-fosfato a chiquimato; e/ou de chiquimato a corismato; e/ou de corismato a para-aminobenzoato; e/ou de corismato a ubiquinona; e/ou de corismato a triptofano; e/ou de corismato a prefenato; e/ou de corismato a isocorismato; e/ou de para-aminobenzoato a tetra-hidrofolato; e/ou de prefe- 15 nato a L-fenilalanina; e/ou de prefenato a Tirosina; e/ou de isocorismato a enterobactina de isocorismato a meniquinona; e/ou de tirosina a tiamina.

Em algumas modalidades, manipulações genéticas podem ser realizadas para alterar as concentrações intracelulares de intermediários na supervia de corismato. De acordo com essas modalidades, essa via pode 20 ser retroinibida causando uma redução em um ou mais intermediários parti- culares podendo-se prever uma redução na retroinibição e, desse modo, aumentar o fluxo através da supervia de corismato e a disponibilidade dos produtos a jusante que foram mostrados para aumentar a tolerância a 3-HP. Em algumas modalidades, a manipulação genética pode ser usada para re- 25 duzir a quantidade de um intermediário da supervia de corismato e essa re- dução pode resultar em um aumento na tolerância de 3-HP por microorga- nismos.

Contempla-se que um ou mais genes da supervia de corismato usados nos métodos e composições podem incluir todo ou parte do gene para modular a via. Por exemplo, talvez 30 porcento de um gene ou mais, 50 porcento de um gene ou mais, 70 porcento de um gene ou mais, ou 80 por- cento de um gene ou mais. ou 90 porcento de um qene ou mais, ou ainda 100 porcento de um gene ou mais podem ser usados nos métodos e com- posições contemplados aqui para aumentar a tolerância a 3-HP em um mi- croorganismo (veja, por exemplo, o gene Tyr A). Em algumas modalidades os oligonucleotídeos que compreendem pelo menos 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32,

33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, ou mais nucleotídeos contíguos com uma seqüên- cia selecionada de genes envolvidos na supervia de corismato são contem- plados. Ademais, métodos de combinação que utilizam manipulação genéti- ca e outros métodos de indução de tolerância são contemplados.

A tolerância a 3-HP é importante visto que a tolerância aumen-

tada pode resultar em produtividades e titulações aumentadas em uma fer- mentação comercial para produzir 3-Hp. O modelo de fermentação básico envolve a conversão de material residual ou matéria-prima de açúcar reno- vável (por exemplo, milho) em açúcares (por exemplo, hexoses, pentoses) 15 que podem ser fermentados por organismos elaborados para produzir produ- tos com maior valor agregado, tais como, combustíveis (por exemplo, etanol ou hidrogênio) ou produtos químicos de base (por exemplo, monôme- ros/polímeros), tal como, 3-HP. O 3-HP pode ser convertido em produtos químicos de alto valor que podem ser interessantes para a indústria química, 20 biotecnologia, vestuário e possivelmente indústria de cuidados com a saúde incluindo novos polímeros e materiais, bem como produtos químicos com vasto campo de atuação tradicionais, tais como, ácido acrílico, acrilamida, metil-acrilato, 1,3 propanodiol.

Ácidos Nucleicos

Os ácidos nucleicos dentro do escopo contemplados aqui podem

ser feitos por meio de qualquer técnica conhecida por um versado na técni- ca. Exemplos de ácidos nucleicos, particularmente oligonucleotídeos sintéti- cos, podem incluir um ácido nucleico feito por síntese química in vitro utili- zando fosfotriéster, fosfito ou química com fosforamidita e técnicas em fase 30 sólida através de intermediários de H-fosfonato desoxinucleosídeo. Em al- gumas modalidades, as seqüências de ácido nucleico contempladas aqui podem ser aeradas e podem ser modificadas. Exemplos de seqüências de ácido nucleico modificadas incluem aquelas que podem ser modificadas a- pós reações de amplificação, tais como, a PCR® ou a síntese de oligonu- cleotídeos. Exemplos de ácidos nucleicos biologicamente produzidos inclu- em a produção de ácido nucleico recombinante em células vivas, tal como, a produção de vetor de DNA recombinante em bactérias.

Nucleobase, nucleosídeo e simulações de nucleotídeo ou deri- vados são bem conhecidos na técnica, e foram descritos. Nucleobases de purina e pirimidina incluem purinas e pirimidinas naturalmente ocorrentes e derivados e simulações dessas. Essas incluem, porém sem caráter Iimitati- 10 vo, purinas e pirimidinas substituídas por um ou mais grupos alquila, carbo- xialquila, amino, hidroxila, halogênio (por exemplo, flúor, cloro, bromo ou io- do), tiol ou alquiltiol. Os substituintes de alquila podem compreender de cer- ca de 1, 2, 3, 4 ou 5 a cerca de 6 átomos de carbono.

Exemplos de purinas e pirimidinas contemplados para modificar ácidos nucleicos produzidos aqui podem incluir, porém sem caráter limitati- vo, deazapurinas, 2,6-diaminopurina, 5- fluorouracil, xantina, hipoxantina, 8- bromoguanina, 8-cloroguanina, bromotimina, 8-aminoguanina, 8- hidroxiguanina, 8-metilguanina, 8-tioguanina, azaguaninas, 2-aminopurina,

5-etilcitosina, 5-metilcitosina, 5-bromouracil, 5-etiluracil, 5-iodouracil, 5- 20 clorouracil, 5-propiluracil, tiouracil, 2-metiladenina, metiltioadenina, N ,N- dimetiladenina, azaadeninas, 8-bromoadenina, 8-hidroxiadenina, 6- hidroxiaminopurina, 6-tiopurina, 4-(6-amino-hexil/citosina), e similares. Ade- mais, os derivados ou simulações de purina e pirimidina podem ser usados como substituições de base em qualquer método descrito aqui.

Para aplicações onde os segmentos de ácido nucleico são in-

corporados em vetores, tais como, plasmídeos, cosmídeos ou vírus, esses segmentos podem ser combinados com outras seqüências de DNA, tais co- mo, promotores, sinais de poliadenilação, sítios de enzima de restrição, sí- tios de clonagem múltipla, outros segmentos de codificação e similares, de 30 modo que seu comprimento total possa variar de maneira considerável. Con- templa-se que um fragmento de ácido nucleico de quase qualquer compri- mento pode ser empregado, com o comprimento total, de preferência, limita- do pela facilidade de preparação e uso no protocolo de DNA recombinante pretendido.

Em algumas modalidades, os segmentos de DNA que codificam um gene específico podem ser introduzidos em células hospedeiras recom- 5 binantes e empregados para expressar uma proteína estrutural ou regulado- ra específica. Alternativamente, por meio da aplicação de técnicas de enge- nharia genética, subparcelas ou derivados de genes selecionados podem ser empregadas. As regiões a montante contendo regiões reguladoras, tais como, regiões de promotor podem ser isoladas e subsequentemente empre- 10 gadas para expressão de um gene selecionado ou segmento de gene sele- cionado.

Onde um produto de expressão for gerado, é possível que a se- qüência de ácido nucleico seja variada ao mesmo tempo em que mantém a capacidade de codificar o mesmo produto.

Amplificação

A amplificação também pode ser útil no processo iterativo para gerar múltiplas cópias de uma determinada seqüência de ácido nucleico. Dentro do escopo, a amplificação pode ser realizada por qualquer meio co- nhecido na técnica.

Iniciadores

O iniciador, como necessário aqui, pretende incluir qualquer áci- do nucleico que é capaz de ativar a síntese de um ácido nucleico inicial em um processo modelo-dependente. Tipicamente, os iniciadores são oligonu- cleotídeos com cerca de 5-100 pares de base de comprimento, porém se- 25 quências maiores podem ser empregadas. Os iniciadores podem ser propor- cionados em forma de cadeia dupla ou cadeia simples.

Em algumas modalidades, a amplificação de uma região aleató- ria é produzida ao misturar quantidades equimolares de cada base de nitro- gênio (A,C1G e T) em cada posição para criar um grande número de permu- 30 tações (por exemplo, onde "n" é o comprimento de cadeia oligo) em um segmento muito curto. Isso proporciona possibilidades mais abundantes pa- ra encontrar seqüências de ácido nucleico de alta afinidade quando compa- rado com 10,9 a 1011 variantes de anticorpos murinos produzidos por um único camundongo.

Inúmeros processos modelo-dependentes estão disponíveis pa- ra amplificar seqüências marcadoras presentes em uma determinada amos- 5 tra de modelo. Um dos métodos de amplificação mais conhecidos é a reação em cadeia da polimerase (referida como PCR) que é descrita em detalhes na Patente Nos. U.S. 4.683.195, 4.683.202 e 4.800.159, incorporada aqui a título de referência em sua totalidade.

Em outras modalidades, outros métodos de amplificação de áci- 10 dos nucleicos incluem, porém sem caráter limitativo, a reação em cadeia da Iigase ("LCR"), métodos de amplificação isotérmica Qbeta Replicase, e Am- plificação por Deslocamento de Fita (SDA), bem como outros métodos co- nhecidos na técnica. Ainda outros métodos de amplificação podem ser usa- dos de acordo com as modalidades descritas aqui. Outros procedimentos de 15 amplificação de ácidos nucleicos podem incluir sistemas de amplificação ba- seada em transcrição (TAS), inclusive amplificação baseada em seqüência de ácido nucleico (NASBA). Em alguns métodos descritos, as seqüências de ácido nucleico podem ser preparadas para amplificação por extração de fe- nol/clorofórmio padrão, desnaturação térmica de uma amostra clínica, trata- 20 mento com tampão de Iise e colunas mini-spin para isolamento de DNA e RNA ou extração de cloreto de guanidínio de RNA. Em uma reação cíclica isotérmica, os RNA's são submetidos à transcrição reversa em DNA de ca- deia dupla e mais uma vez submetidos à transcrição com uma polimerase, tal como, 11 ou SP6.

As polimerases e Transcriptases Reversas incluem, porém sem

caráter limitativo, DNA Polimerases termoestáveis: OnmiBaseTM. Sequen- cing Enzyme Pfu DNA Polymerase Taq DNA Polymerase Taq DNA Polyme- rase, Sequencing Grade TaqBead .TM. Hot Start Polymerase AmpIiTaq Gold Tfl DNA Polymerase Tli DNA Polymerase Tth DNA Polymerase DNA 30 POLYMERASES: DNA Polymerase I, Klenow Fragment, Exonuclease Minus DNA Polymerase I DNA Polymerase I Large (KIenow) Fragment Terminal Deoxvnucleotidvl Transferase T4 DNA Polvmerase Reverse Transcriptases: AMV Reverse Transcriptase M-MLV Reverse Transcriptase.

Em algumas modalidades, pode ser desejável incorporar um marcador nas seqüências de ácido nucleico, produtos de amplificação, son- das ou iniciadores. Inúmeros marcadores diferentes podem ser usados, in- 5 clusive, porém sem caráter limitativo, fluoróforos, cromóforos, radioisótopos, marcadores enzimáticos, anticorpos, quimiluminescentes, eletroluminescen- tes e marcadores de afinidade.

Exemplos de marcadores de afinidade contemplados aqui, po- dem incluir, porém sem caráter limitativo, um anticorpo, um fragmento de anticorpo, uma proteína receptora, um hormônio, biotina, DNP, e qualquer molécula de polipeptídeo/proteína que se liga a um marcador de afinidade.

Exemplos de marcadores enzimáticos incluem, porém sem cará- ter limitativo, urease, fosfatase alcalina ou peroxidase. Os substratos de indi- cador colorimétrico podem ser empregados com tais enzimas para propor- cionar um meio de detecção visível ao olho humano ou espectrofotometri- camente visível.

Os seguintes fluoróforos descritos aqui incluem, porém sem ca- ráter limitativo, Alexa 350, Alexa 430, AMCA, BODIPY 630/650, BODIPY 650/665, BODIPY-FL, BODIP Y-R6G, BODIPY-TMR, BODIPY-TRX, Casca- 20 de Blue, Cy2, Cy3, Cy5,6-FAM, Fluorescein, HEX, 6-JOE, Oregon Green 488, Oregon Green 500, Oregon Green 514, Pacific Blue, REG, Rhodamine Green, Rhodamine Red, ROX, TAMRA, TET, Tetrametilrhodamine e Texas Red.

Eletroforese de Gel

Em algumas modalidades, a eletroforese de gel pode ser usada

para separar, purificar parcialmente ou purificar um componente identificado ou contemplado aqui utilizando métodos padrão conhecidos na técnica.

A separação por eletroforese se baseia em métodos conhecidos na técnica. As amostras separadas dessa maneira podem ser visualizadas por coloração e quantificação, em termos relativos, utilizando densitômetros que monitoram continuamente a densidade fotométrica da cepa resultante. O eletrólito pode ser contínuo (um único tampão) ou descontínuo, onde uma amostra é empilhada por meio de descontinuidade de tampão, antes de en- trar no gel de separação/tampão de separação.

Técnicas Cromatográficas

Alternativamente, técnicas cromatográficas podem ser emprega- das para realizar a separação. Há muitos tipos de cromatografia que podem ser usados, por exemplo: adsorção, divisão, troca iônica e peneira molecu- lar, e muitas técnicas especializadas para utilizá-los incluindo cromatografia em coluna, papel, camada delgada e gás.

Técnicas Microfluidícas As técnicas microfluidícas incluem separação em uma platafor-

ma, tais como, microcapilares, projetadas por ACLARA BioSciences Inc., ou os circuitos integrados líquidos LabChip® feitos por Caliper Technologies Inc. Essas platformas microfluídicas exigem apenas volumes em nanolitro da amostra, ao contrário dos volumes em microlitros exigidos por outras tecno- 15 Iogias de separação. A miniaturização de alguns processos envolve realizar a análise genética utilizando técnicas microfluídicas conhecidas.

Liberação de Ácido Nucleico Formulações Lipossômicas

Em algumas amplas modalidades da invenção, os oligo ou poli- 20 nucleotídeos e/ou vetores de expressão podem ser aprisionados em um Ii- possoma. Os Iipossomas são estruturas vesiculares caracterizadas por uma membrana bicamada de fosfolipídeo e um meio aquoso interno. Os Iiposso- mas multilamelares possuem múltiplas camadas lipídicas separadas por meio aquoso. Os componentes lipídicos são submetidos a autorrearranjo 25 antes da formação de estruturas fechadas e aprisionam água e solutos dis- solvidos entre as bicamadas lipídicas (Ghosh and Bachhawat, 1991). Tam- bém são contemplados complexos de ácido nucleico-lipídeo catiônicos, tais como, complexos de ácido nucleico de lipofectamina.

Em algumas modalidades da invenção, o Iipossoma pode ser complexado com um vírus hemaglutinante (HVJ). Isso foi mostrado para faci- litar a fusão com a membrana celular e promover a entrada celular de DNA encapsulado em Iipossoma (Kaneda et al, 1989). Em outras modalidades, o Iipossoma pode ser complexado ou empregado em conjunto com proteínas cromossômicas não-histona nucleares (HMG 1) (Kato et al., 1991). Ainda em modalidades adicionais, o Iipossoma pode ser complexado ou empregado em conjunto com HVJ e HMG1. Com isso, tais vetores de expressão foram 5 empregados de maneira bem sucedida na transferência e expressão de um polinucleotídeo in vitro e in vivo, então esses são aplicáveis na presente in- venção. Onde um promotor bacteriano for empregado no constructo de DNA, também será desejável incluir dentro do Iipossoma uma polimerase bacteri- ana adequada.

"Lipossoma" é um termo genérico que inclui uma variedade de

veículos lipídicos separados e multilamelares formados pela geração de bi- camadas lipídicas encerradas. Os fosfolipídeos são usados para preparar os Iipossomas de acordo com a presente invenção e podem transportar uma carga positiva líquida, uma carga negativa líquida ou são neutros. O dicetil 15 fosfato pode ser empregado para conferir uma carga negativa aos Iiposso- mas, e estearilamina pode ser usada para conferir uma carga positiva aos lipossomas.

Os lipídeos adequados para uso de acordo com a presente in- venção podem ser obtidos a partir de fontes comerciais. Por exemplo, dimi- 20 ristil fosfatidilcolina ("DMPC") pode ser obtido junto à Sigma Chemical Co., dicetil fosfato ("DCP") é obtido junto à K & K Laboratories (Plainview, NY); colesterol ("Chol") é obtido junto à Calbiochem Behring; dimiristil fosfatidilgli- cerol ("DMPG") e outros lipídeos podem ser obtidos junto à Avanti Polar Li- pids, Inc. (Birmingham, Ala.). As soluções de estoque de lipídeos em cloro- 25 fórmio, clorofórmio/metanol ou t-butanol podem ser armazenadas a cerca de 20°C. De preferência, clorofórmio é usado como o único solvente visto que esse é mais facilmente evaporado do que o metanol.

Os fosfolipídeos de fontes naturais, tais como, fosfatidilcolina de ovo ou soja, ácido fosfatídico cerebral, fosfatidilinositol cerebral ou vegetal, cardiolipina de coração e fosfatidiletanolamina vegetal ou bacteriana, de pre- ferência, não são usados como o fosfatídeo primário, ou seja, constituindo 50% ou mais da composição de fosfatídeo total, devido à instabilidade e va- zamento dos Iipossomas resultantes.

Os Iipossomas usados de acordo com as modalidades aqui po- dem ser feitos por métodos diferentes. O tamanho dos Iipossomas varia de- pendendo do método de síntese. Um iipossoma suspenso em uma solução 5 aquosa está geralmente no formato de uma vesícula esférica, possuindo uma ou mais camadas concêntricas de moléculas bicamada lipídicas. Cada camada consiste em um arranjo paralelo de moléculas representado pela fórmula XY, onde X é uma porção hidrofílica e Y é uma porção hidrofóbica. Em suspensão aquosa, as camadas concêntricas são arranjadas de modo 10 que as porções hidrofílicas tendam a permanecer em contato com uma fase aquosa e as regiões hidrofóbicas tendam a se autoassociar. Por exemplo, quando as fases aquosas estiverem presentes tanto dentro como fora do Iipossoma, as moléculas lipídicas irão formar uma bicamada, conhecida co- mo lamela, do arranjo XY YX.

Os Iipossomas dentro do escopo aqui podem ser preparados de

acordo com técnicas de laboratório conhecidas.

Em algumas modalidades, a dioleoilfosfatidilcolina lipídica é em- pregada. Os oligonucleotídeos resistentes à nuclease foram misturados com lipídeos na presença de excesso de butanol. A mistura foi agitada no vórtex 20 antes de ser congelada em um banho de acetona/gelo seco. A mistura con- gelada foi Iiofilizada e hidratada com salina tamponada com Hepes (1 mM de Hepes, 10 mM de NaCI, pH 7,5) durante a noite, e então os Iipossomas fo- ram sonicadas em um sonicador durante 10 a 15 min. O tamanho dos oligo- nucleotídeos lipossômicos variou tipicamente entre 200 e 300 nm de diâme- 25 tro como determinado pelo dimensionador (sizer) de partícula sebmicron de auto diluição submicron particle sizer autodilute modelo 370 (Nicomp, Santa Barbara, CA).

Mutagênese Sítio-Específica

A mutagênese sítio-específica é uma técnica útil na preparação de peptídeos individuais ou proteínas ou peptídeos equivalentes biologica- mente funcionais, através da mutagênese específica do DNA subjacente. A técnica proporciona ainda uma rápida capacidade de preparar e testar vari- antes de seqüência, incorporando uma ou mais das considerações anterio- res, ao introduzir uma ou mais alterações de seqüência nucleotídica no DNA. A mutagênese-sítio específica permite a produção de mutantes através do uso de seqüências de oligonucleotídeo específicas que codificam a sequên- 5 cia de DNA da mutação desejada, bem como um número suficiente de nu- cleotídeos adjacentes, para fornecer uma seqüência iniciadora de tamanho suficiente e complexidade de seqüência para formar um duplex estável em ambos os lados da junção de deleção que é atravessada. Um iniciador de cerca de 15 a 30 nucleotídeos de comprimento pode ser usado, com cerca 10 de 5 a 10 resíduos em ambos os lados da junção da seqüência que é altera- da.

Em geral, a técnica de mutagênese sítio-específica é bem co- nhecida. Conforme será avaliado, a técnica geralmente emprega um vetor bacteriófago que está presente tanto em uma forma de cadeia simples como 15 cadeia dupla. Os vetores típicos úteis em mutagênese sítio-dirigida incluem vetores, tal como, o fago M 13. Esses vetores de fago estão comercialmente disponíveis e seu uso é geralmente bem conhecido pelos versados na técni- ca. Os plasmídeos de cadeia dupla também são rotineiramente empregados em mutagênese sítio-dirigida, isso elimina a etapa de transferência do gene 20 de interesse de um fago para um plasmídeo.

Em geral, a mutagênese sítio-dirigida pode ser realizada, primei- ro, ao obter um vetor de cadeia simples ou fundir as duas cadeias de um vetor de cadeia dupla que inclui dentro de sua seqüência uma seqüência de DNA que codifica a proteína desejada. Um iniciador de oligonucleotídeo do- 25 tado da seqüência modificada desejada é sinteticamente preparado. Esse iniciador pode ser então temperado com a preparação de DNA de cadeia simples e submetido a enzimas de polimerização de DNA, tal como, frag- mento Klenow da polimerase I de E. coli, para completar a síntese da cadeia dotada de mutação. Assim, um heteroduplex é formado onde uma cadeia 30 codifica a seqüência não-modificada original e a segunda cadeia dotada da mutação desejada. Esse vetor heteroduplex é então usado para transformar as células apropriadas, tais como, células de E. coli e os clones que são se- lecionados incluem vetores recombinantes dotados do arranjo de seqüência modificado.

A preparação de variantes de seqüência do gene selecionado utilizando mutagênese sítio-dirigida é proporcionada como um meio para 5 produzir espécies potencialmente úteis e não pretende ser limitativa, visto que há outras maneiras pelas quais variantes de seqüência de genes podem ser obtidos. Por exemplo, os vetores recombinantes que codificam o gene desejado podem ser tratados com agentes mutagênicos, tal como, hidroxi- lamina, para obter variantes de seqüência.

Proteínas Expressas ou Fragmentos Dessas

Exemplos de sistemas de expressão conhecidos pelos versados na técnica incluem bactérias, tal como, E. coli, levedura, tal como, Pichia pastoris, baculovírus e sistemas de expressão de mamíferos, tais como, em células Cos ou CHO. Um gene completo pode ser expresso ou, alternativa- 15 mente, fragmentos do gene que codificam partes do polipeptídeo podem ser produzidos.

Em algumas aplicações amplas aqui, uma seqüência genética que codifica um polipeptídeo é analisada para detectar seqüências trans- membrana putativas. Tais seqüências são tipicamente muito hidrofóbicas e 20 são facilmente detectadas pelo uso de software de análise de seqüência pa- drão, tal como, Mac Vector (IBI, New Haven, CT). A presença de seqüências transmembrana é geralmente deletéria quando uma proteína recombinante for sintetizada em diversos sistemas de expressão, especialmente E. coli, visto que resulta na produção de agregados insolúveis que são difíceis de se 25 renaturar na conformação nativa da proteína. A deleção de seqüências transmembrana tipicamente não alteram de maneira significativa a confor- mação da estrutura protéica restante.

Para expressar uma proteína ou peptídeo codificado recombi- nante, seja mutante ou de ocorrência natural, de acordo com a presente descrição alguém poderia preparar um vetor de expressão que inclui se- qüências de ácido nucleico sob o controle de, ou operativamente ligadas a, um ou mais promotores. Para colocar uma seqüência de codificação "sob o controle de um promotor, alguém pode posicionar a extremidade 5’ do sitio de iniciação de transcrição do quadro de leitura transcricional geralmente entre cerca de 1 e cerca de 50 nucleotídeos "a jusante" (por exemplo, 3’) do promotor selecionado. O promotor "a montante" estimula a transcrição do DNA e promove a expressão da proteína recombinante codificada.

Muitas técnicas estão disponíveis para construir os vetores de expressão contendo os ácidos nucleicos adequados e seqüências de contro- le transcricional/translacional para realizar a expressão de proteína ou peptí- deo em uma variedade de sistemas de expressão de hospedeiro. Os tipos 10 de células disponíveis para expressão incluem, porém sem caráter limitativo, bactérias, tais como, E. coli e B. subtilis transformadas por vetores de ex- pressão de DNA de bacteriófago recombinante, DNA de plasmídeo ou DNA de cosmídeo.

Alguns exemplos de hospedeiros procarióticos são cepas RR1 de E. coli, LE392 E. coli, E. coli B, E. coli X 1776 (ATCC No. 31537) bem como E. coli W3110 (F-, lambda-, prototrophic, ATCC No. 273325); bacilos, tais como, Bacillus subtilis; e outras enterobacteriaceae, tais como, Salmo- nella typhimurium, Serratia marcescens, e várias espécies de Pseudomonas.

Em geral, os vetores plasmidiais contendo replicon e seqüências de controle que são derivadas de espécies compatíveis com a célula hospe- deira são usados em conjunto com esses hospedeiros. O vetor geralmente transporta um sítio de replicação, bem como seqüências de marcação que são capazes de proporcionar seleção fenotípica em células transformadas. Por exemplo, E. coli é geralmente transformada utilizando pBR322, um plasmídeo derivado de uma espécie de E. coli. pBR322 contém genes para resistência a ampicilina e tetraciclina e, desse modo, proporcionar meios fá- ceis para identificar células transformadas. O plasmídeo pBR, ou outro plasmídeo microbial ou fago também deve conter, ou ser modificado para conter, promotores que podem ser usados pelo organismo microbial para expressão de suas próprias proteínas.

Ademais, os vetores de fago contendo replicon e seqüências de controle que são compatíveis com o microorganismo hospedeiro podem ser usados como vetores de transformação em conjunto com esses hospedei- ros. Por exemplo, o fago Iambda GEMTM-11 pode ser utilizado para formar um vetor de fago recombinante que pode ser usado para transformar células hospedeiras, tal como, E. coli LE392.

Os vetores úteis adicionais incluem vetores pIN (Inouye et al,

1985); e vetores pGEX, para uso na geração de proteínas de fusão solúveis de glutationa S transferase (GST) para purificação e separação ou clivagem posterior. Outras proteínas de fusão adequadas são aquelas com β galacto- sidase, ubiquitina, ou similares.

Os promotores que são mais comumente usados em construção

de DNA recombinante incluem a β-lactamase (penicilinase), sistemas promo- tores de Iactose e triptofano (trp). Embora esses sejam os mais comumente usados, outros promotores microbiais foram descobertos e utilizados, e deta- lhes com relação a suas seqüências de nucleotídeo foram publicados, permi- 15 tindo que os versados na técnica os liguem funcionalmente com vetores plasmidiais.

Outros promotores adequados, que possuem a vantagem adi- cional de transcrição controlada por condições de crescimento, incluem a região de promotor para álcool desidrogenase 2, isocitocromo C1 fosfatase 20 ácida, enzimas degradativas associadas com metabolismo de nitrogênio, e a gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase anteriormente mencionada, e enzimas responsáveis pela utilização de maltose e galactose.

Além dos microorganismos, culturas de células derivadas de or- ganismos multicelulares também podem ser usadas como hospedeiros. Em princípio, qualquer cultura celular é viável, seja de cultura de vertebrados ou invertebrados.

Supervia de corismato e Tirosina

Contempla-se aqui que uma região de codificação moduladora de aminoácido de microorganismos podem ser importante para aumentar a produção ou tolerância à produção de ácido orgânico pelo microorganismo. Em um método exemplificativo, as regiões genéticas que codificam enzimas biossintéticas de tirosina e a região genética aue codifica um repressor de genes envolvidos na produção de tirosina podem ser manipuladas para au- mentar a tolerância ou produção de ácido orgânico por um microorganismo.

Em algumas modalidades, tirosina adicionada de maneira exó- gena pode ser adicionada a uma cultura bacteriana capaz de produzir 3-HP.

Em algumas modalidades particulares, as concentrações de tirosina podem ser cerca de 0,05mM a cerca de 0,5 mM. Em um exemplo, 0,2mM de tirosina foi adicionado a uma cultura e o aumento na produção de 3-HP foi de cerca de 35%.

As modalidades particulares da presente invenção referem-se a oligonucleotídeos que compreendem pelo menos 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33,

34, 35, 36, 37, 38, 39 ou 40 nucleotídeos contíguos com uma seqüência se- lecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, e SEQ ID NO:6 TyrA (essa se- quência inclui 50 bp a montante e a jusante do desenho de iniciador):

SEQ ID NO:1 TCAGGATCTG AACGGGCAGC TGACGGCTCG CGTGGCTTAA GAGGTTT

SEQ ID NO:2: TTATG GTT GCT GAA TTG ACC GCA TTA CGC GAT CAA ATT GAT GAA GTC GAT AAA GCG CTG CTG AAT TTA TTA GCG AAG CGT CTG GAA CTG GTT GCT GAA GTG GGC GAG GTG AAA AGC CGC TTT GGA CTG CCT ATT TAT GTT CCG GAG CGC GAG GCA TCT ATG TTG GCC TCG CGT CGT GCA GAG GCG GAA GCT CTG GGT GTA CCG CCA GAT CTG ATT GAG GAT GTT TTG CGT CGG GTG ATG CGT GAA TCT TAC TCC AGT GAA AAC GAC AAA GGA TTT AAA ACA CTT TGT CCG TCA CTG CGT CCG GTG GTT ATC GTC GGC GGT GGC GGT CAG ATG GGA CGC CTG TTC GAG AAG ATG CTG ACC CTC TCG GGT TAT CAG GTG CGG ATT CTG GAG CAA CAT GAC TGG GAT CGA GCG GCT GAT ATT GTT GCC GAT GCC GGA ATG GTG ATT GTT AGT GTG CCA ATC CAC GTT ACT GAG CAA GTT ATT GGC AAA TTA CCG CCT TTA CCG AAA GAT TGT ATT CTG GTC GAT CTG GCA TCA GTG AAA AAT GGG CCA TTA CAG GCC ATG CTG GTG GCG CAT GAT GGT CCG GTG CTG GGG CTA CAC CCG ATG TTC GGT CCG GAC AGC GGT AGC CTG GCA AAG CAA GTT GTG GTC TGG TGT GAT GGA CGT AAA CCG GAA GCA TAC CAA TGG TTT CTG GAG CAA ATT CAG GTC TGG GGC GCT CGG CTG CAT CGT ATT AGC GCC GTC GAG CAC GAT CAG AAT ATG GCG TTT ATT CAG GCA CTG CGC CAC TTT GCT ACT TTT GCT 5 TAC GGG CTG CAC CTG GCA GAA GAA AAT GTT CAG CTT GAG CAA CTT CTG GCG CTC TCT TCG CCG ATT TAC CGC CTT GAG CTG GCG ATG GTC GGG CGA CTG TTT GCT CAG GAT CCG CAG CTT TAT GCC GAC ATC ATT ATG TCG TCA GAG CGT AAT CTG GCG TTA ATC AAA CGT TAC TAT AAG CGT TTC GGC GAG GCG ATT GAG TTG CTG GAG 10 CAG GGC GAT AAG CAG GCG TTT ATT GAC AGT TTC CGC AAG GTG GAG CAC TGG TTC GGC GAT TAC GCA CAG CGT TTT CAG AGT GAA AGC CGC GTG TTA TTG CGT CAG GCG AAT GAC AAT CGC CAG TAA

SEQ ID NO: 3 TAATCCAGTG CCGGATGATT CACATCATCC GGCACCTTTT CATCAG GTTG SEQ ID NO:4 TCAGGATCTG AACGGGCAGC TGACGGCTCG

CGTGGCTTAA GAGGTTTTTA TGGTT GCT GAA TTG ACC GCA TTA CGC GAT CAA ATT GAT GAA GTC GAT AAA GCG CTG CTG AAT TTA TTA GCG AAG CGT CTG GAA CTG GTT GCT GAA GTG GGC GAG GTG AAA AGC CGC TTT GGA CTG CCT ATT TAT GTT CCG GAG CGC GAG GCA 20 TCT ATG TTG GCC TCG CGT CGT GCA GAG GCG GAA GCT CTG GGT GTA CCG CCA GAT CTG ATT GAG GAT GTT TTG CGT CGG GTG ATG CGT GAA TCT TAC TCC AGT GAAAAC GAC AAA GGA TTT AAAACA CTT TGT CCG TCA CTG CGT CCG GTG GTT ATC GTC GGC GGT GGC GGT CAG ATG GGA CGC CTG TTC GAG AAGATG CTG ACC CTC TCG GGT 25 TAT CAG GTG CGG ATT CTG GAG CAA CAT GAC TGG GAT CGA GCG GCT GAT ATT GTT GCC GAT GCC GGAATG GTG ATT GTT AGT GTG CCAATC CAC GTT ACT GAG CAA GTT ATT GGC AAA TTA CCG CCT TTA CCGAAA GAT TGT ATT CTG GTC GAT CTG GCA TCA GTGAAAAAT GGG CCA TTA CAG GCC ATG CTG GTG GCG CAT GAT GGT CCG GTG 30 CTG GGG CTA CAC CCG ATG TTC GGT CCG GAC AGC GGT AGC CTG GCAAAG CAA GTT GTG GTC TGG TGT GAT GGA CGT AAA CCG GAA GCA TAC CAA TGG TTT CTG GAG CAAATT CAG GTC TGG GGC GCT CGG CTG CAT CGT ATT AGC GCC GTC GAG CAC GAT CAG AAT ATG GCG TTT ATT CAG GCA CTG CGC CAC TTT GCT ACT TTT GCT TAC GGG CTG CAC CTG GCA GAA GAAAAT GTT CAG CTT GAG CAA CTT CTG GCG CTC TCT TCG CCGATT TAC CGC CTT GAG CTG GCG ATG GTC GGG CGA CTG TTT GCT CAG GAT CCG CAG CTT TAT GCC GAC ATC ATT ATG TCG TCA GAG CGT AAT CTG GCG TTAATC AAA CGT TAC TAT AAG CGT TTC GGC GAG GCGATT GAG TTG CTG GAG CAG GGC GAT AAG CAG GCG TTT ATT GAC AGT TTC CGC AAG GTG GAG CAC TGG TTC GGC GAT TAC GCA CAG CGT TTT CAG AGT GAAAGC CGC GTG TTA TTG CGT CAG GCG AAT GAC AAT CGC CAG TAA TA- ATCCAGTG CCGGATGATT CACATCATCC GGCACCTTTT CATCAGGTTG SEQ ID NO: 5 TyrR e SEQ ID NO: 6 possui TyrR com os dois iniciadores em cada extremidade.

SEQ ID NO: 5 ATGCGTCTGG AAGTCTTTTG TGAAGACCGA CTCGGTCTGA CCCGCGAATT ACTCGATCTA CTCGTGCTAA GAGG- CATTGA TTTACGCGGT ATTGAGATTG ATCCCATTGG GCGAATCTAC CTCAATTTTG CTGAACTGGA GTTTG AG AGT TTCAGCAGTC TGATGGCCGA AATACGCCGT ATTGCGGGTG TTACCGATGT GCG- TACTGTC CCGTGGATGC CTTCCGAACG TGAGCATCTG GCGTTGAGCG CGTTACTGGA GGCGTTGCCT GAACCTGTGC TCTCTGTCGA TATGAA- AAGC AAAGTGGATA TGGCGAACCC GGCGAGCTGT CAGCTTTTTG GGCAAAAATT GGATCGCCTG CGCAACCATA CCGCCGCACA ATTGAT- TAAC GGCTTTAATT TTTTACGTTG GCTGGAAAGC GAACCGCAAG ATTCGCATAA CGAGCATGTC GTTATTAATG GGCAGAATTT CCTGATG- GAG ATTACGCCTG TTT ATCTTC A GGATGAAAAT GATCAACACG TCCTGACCGG TGCGGTGGTG ATGTTGCGAT CAACGATTCG TATGGGCCGC CAGTTGCAAA ATGTCGCCGC CCAGG ACGTC AGCGCCTTCA GTCAAATTGT CGCCGTCAGC CCGAAAATGA AG- CATGTTGT CGAACAGGCG CAGAAACTGG CGATGCTAAG CGCGCCGCTG CTGATTACGG GTGACACAGG TACAGGTAAA GATCTCTTTG CCTACGCCTG CCATCAGGCA AGCCCCAGAG CGGG- CAAACC TTACCTGGCG CTGAACTGTG CGTCTATACC GGAAGATGCG GTCGAGAGTG AACTGTTTGG TCATGCTCCG GAAGGGAAGA AAG- GATTCTT TGAGCAGGCG AACGGTGGTT CGGTGCTGTT GGATGAAATA GGGGAAATGT CACCACGGAT GCAGGCGAAA TTACTGCGTT TCCTTA- ATGA TGGCACTTTC CGTCGGGTTG GCGAAGACCA TGAGGTGCAT 5 GTCGATGTGC GGGTGATTTG CGCTACGCAG AAGAATCTGG TCGA- ACTGGT GCAAAAAGGC ATGTTCCGTG AAGATCTCTA TTATCGTCTG AACGTGTTGA CGCTCAATCT GCCGCCGCTA CGTGACTGTC CGCAG- GACAT CATGCCGTTA ACTGAGCTGT TCGTCGCCCG CTTTGCCGAC GAGCAGGGCG TGCCGCGTCC GAAACTGGCC GCTGACCTGA A- 10 TACTGTACT TACGCGTTAT GCGTGGCCGG GAAATGTGCG GCAGTTA- AAG AACG CTATCT ATCGCGCACT G AC AC AACTG GACGGTTATG AGCTGCGTCC ACAGGATATT TTGTTGCCGG ATTATGACGC CGCA- ACGGTA GCCGTGGGCG AAGATGCGAT GGAAGGTTCG CTGGACGAAA TCACCAGCCG TTTTGAACGC TCGGTATTAA CCCAGCTTTA TCGCAAT- 15 TAT CCCAGCACGC GCAAACTGGC AAAACGTCTC GGCGTTTCAC A- TACCGCGAT TGCCAATAAG TTGCGGGAAT ATGGTCTGAG TCAGAA- GAAG AACGAAGAGTAA

A seqüência de AroF é:

SEQ ID NO:6 ATGCAAAAAG ACGCGCTGAA TAACGTACAT ATTACCGACG AACAG GTTTT AATG ACTCCG GAACAACTGA AGGCCGCTTT TCCATTGAGC CTGCAACAAG AAGCCCAGAT TGCT- GACTCG CGTAAAAGCA TTTCAGATAT TATCGCCGGG CGCGATCCTC GTCTGCTGGT AGTATGTGGT CCTTGTTCCA TTCATGATCC GGAA- ACTGCT CTGGAATATG CTCGTCGATT TAAAGCCCTT GCCGCAGAGG TCAGCGATAG CCTCTATCTG GTAATGCGCG TCTATTTTGA AAA- ACCCCGT ACCACTGTCG GCTGGAAAGG GTTAATTAAC GATCCCCATA TGGATGGCTC TTTTGATGTA GAAGCCGGGC TGCAGATCGC GCGTAA- ATTG CTGCTTGAGC TGGTGAATAT GGGACTGCCA CTGGCGACGG AAGCGTTAGA TCCGAATAGC CCGCAATACC TGGGCGATCT GTT- TAGCTGG TCAGCAATTG GTGCTCGTAC AACGGAATCG CAAACTCACC GTGAAATGGC CTCCGGGCTT TCCATGCCGG TTGGTTTTAA AAACGG- CACC GACGGCAGTC TGGCAACAGC AATTAACGCT ATGCGCGCCG CCGCCCAGCC GCACCGTTTT GTTG G CATTA ACCAGGCAGG GCAGGTTGCG TTGCTACAAA CTCAGGGGAA TCCGGACGGC CATGT- GATCC TGCGCGGTGG TAAAGCGCCG AACTATAGCC CTGCGGATGT TGCGCAATGT GAAAAAGAGA TG GAACAG G C GGGACTGCGC 5 CCGTCTCTGA TGGTAGATTG CAGCCACGGT AATTCCAATA AAGAT- TATCG CCGTCAGCCT GCGGTGGCAG AATCCGTGGT TGCTCAAATC AAAGATGGCA ATCGCTCAAT TATTGGTCTG ATGATCGAAA GTAA- TATCCA CGAGGGCAAT CAGTCTTCCG AGCAACCGCG CAGTGAAATG AAATACGGTG TATCCGTAAC CGATGCCTGC ATTAGCTGGG AAAT- 10 GACCGA TGCCTTGCTG CGTGAAATTC ATCAGGATCT GAACGGGCAG CTGACGGCTC GCGTGGCTTAA EXEMPLOS

Os seguintes exemplos são incluídos para demonstrar algumas modalidades. Deve ser avaliado pelos versados na técnica que os métodos 15 descritos nos exemplos a seguir representam métodos descobertos pelos inventores para operarem bem na prática de modalidades descritas aqui, e desse modo podem ser considerados para constituir modos exemplificatívos para sua prática. Entretanto, os versados na técnica devem, em considera- ção com a presente descrição, avaliar que muitas alterações podem ser fei- 20 tas em algumas modalidades que são descritas e ainda obterem um resulta- do parecido ou similar sem que se abandone o espírito e escopo da presente invenção.

Materiais e Métodos

Bactérias, Plasmídeos e Meios Alguns métodos referem-se a Escherichia coli K12 (ATCC #

29425) de ocorrência natural usada para a preparação de DNA genômico. As bibliotecas genômicas foram construídas utilizando o pSMART-LCKAN (Lucigen, Middleton, Wl). As bibliotecas foram introduzidas na cepa Escheri- chia coli Machl-T1R (Invitrogen, Carlsbad, CA.) para seleções como anteri- 30 ormente detalhado. Mach1-T1R contendo vetor vazio pSMART-LCKAN foram usados em todos os estudos de controle. As curvas de crescimento foram feitas em Meio Mínimo MOPS. Neste exemplo, a concentração de antibiótico é 20 ug de canamicina/mL.

Construção de Biblioteca Genômica

As culturas de E. coli K12 foram cultivadas durante a noite em 500 ml de LB a 37°C a uma densidade óptica de 1,0 medida por absorbância 5 a 600nm (OD6oo)· O DNA foi extraído utilizando um kit de Purificação de DNA Genômico (por exemplo, Qiagen) de acordo com as instruções do fabricante. Cinco amostras contendo 50 ug de DNA genômico purificado foram digeri- das utilizando duas enzimas de restrição blunt-cutter: Alul e Rsal (por exem- plo, Invitrogen). Ambas as enzimas possuem quatro seqüências de identifi- 10 cação de par de bases e são usadas em conjunto para garantir uma diges- tão aleatória do DNA genômico. As reações de digestão foram realizadas com um volume total de 50 uL. As reações continham 1 unidade de Rsal, 1 unidade de Alu 1, 50mM de Tris-HCI (pH 8,0), e 10 mM de MgCI2 e foram incubadas a 37°C durante 1, 2, 5, 10 e 15 minutos, respectivamente. O DNA 15 parcialmente digerido foi imediatamente misturado e separado com base no tamanho utilizando eletroforese em gel de agarose. Os fragmentos de DNA de 0,5, 1, 2, 4, e mais de 8 kb foram cortados do gel e purificados com Gel Extraction Kit (por exemplo, Qiagen).

A pureza dos fragmentos de DNA foi quantificada utilizando ab- sorbância UV, cada um com uma razão de absorbância A260/A280 >1,7. A ligação do DNA purificado, fragmentado com os vetores pSMART-Kan foi realizada com o Kit CIoneSMART (Lucigen) de acordo com as instruções do fabricante. O produto de ligação foi então eletroporado em E. coli 10 GF' Eli- te Electrocompetent Cells (Lucigen), semeado em LB+canamicina, e incuba- do a 37°C durante 24 horas. As culturas de diluição com 1/1000 do volume de transformação original semeadas em LB+canamicina em triplicata para determinar a eficiência de transformação e números de transformante. As placas de diluição foram feitas em triplicata para determinar uma contagem precisa do número de transformantes para garantir uma biblioteca genômica representativa.

As colônias foram colhidas raspando delicadamente as placas em meio TB. As culturas foram imediatamente ressuspensas por vórtex, e alocadas em culturas de estoque de refrigerador de 15-1 mL com uma con- centração de glicerol final de 15 %v/p. O restante da cultura foi peletizado por centrifugação durante 15 minutos a 3000 rpm. O DNA de plasmídeo foi extraído. Para confirmar os tamanhos de inserção e números de transfor- 5 mante positivos, os plasmídeos foram isolados de clones aleatórios para ca- da tamanho de biblioteca utilizando, por exemplo, um kit Qiaprep Spin Mini- Prep de Qiagen (Valencia, CA). Os plasmídeos purificados foram então ana- lisados por PCR ou digestão com enzimas de restrição. A PCR utilizando os iniciadores SL1 (SEQ ID NO: 7: 5’-CAG TCC AGT TAC GCT GGA GTC-3’) e 10 SR2 (SEQ ID NO: 8: 5-GGT CAG GTA TGA TTT AA A TGG TCA GT) foi realizada em oito clones das bibliotecas de inserção de 0,5, 1, e 2 kbp. As digestões com enzima de restrição com a enzima EcorV foram realizadas por oito clones das bibliotecas de inserção de 2, 4 e 8 kbp. O exame por ele- troforese mostrou que o número exigido de colônias continham uma inserção 15 do tamanho esperado para representação adequada, quimeras não estavam presentes.

Transformação de Biblioteca de DNA

O DNA plasmidial purificado de cada biblioteca foi introduzido em MACH1®-T1R(lnvitrogen) por eletroporação. As culturas MACH1®-T1R se 20 tornaram eletrocompetentes por um procedimento de lavagem com glicerol padrão em gelo a uma concentração final de 1011 células/ml (Sanbrook et al.). Um volume de 1/1000 das transformações originais foi semeado em LB+canamicina em triplicata para determinar a eficiência de transformação e números de transformantes adequados. As culturas originais foram combi- 25 nadas e diluídas em 100 ml com meio mínimo MOPS + canamicina e incu- badas a 37°C durante 6 horas ou até atingir um OD6oo de 0,20.

Seleções

Em um método exemplificativo, quatro bibliotecas genômicas representativas foram criadas a partir do DNA genômico de E. coli K12 com tamanhos de inserto definidos de 1, 2, 4 e 8 kb. A mistura de biblioteca transformada foi dividida em dois tubos com tampa de rosca de 15 mL com uma concentração final de 20 α/L 3-HP (TCI America) neutralizada em pH 7 com 10 M de NaOH. A densidade celular das culturas de seleção foi monito- rada à medida que essas se aproximam de um OD6oo final de 0,3-0,4. As culturas de seleção originais foram subsequentemente usadas para inocular outra série de meio mínimo MOPS + canamicina+3-ΗΡ de 15 mL como parte 5 de uma estratégia de seleção de lote repetido. As culturas de lote repetido contendo 3-HP foram monitoradas e inoculadas durante um período de 60 horas para aumentar a concentração de clones que exibem crescimento aumentado na presença de 3-HP. As amostras foram obtidas semeando-se

1 mL da população selecionada em placas seletivas com cada lote. O DNA plasmidial foi extraído de cada amostra, então, hibridizado em arranjos Affy- metrix E. coli Antisense GeneChip® (Affymetrix, Santa Clara, CA).

Análise de Dados

software, o pacote de software SCALEs, (Pedido de Patente US No. 11/231.018 depositado em 20 de setembro de 2005, incorporado aqui a título de referência em sua totalidade). As contribuições de adaptação de elemen- tos genômicos específicos foram calculadas a partir do enriquecimento de cada região como uma fração da população selecionada, como anteriormen- te descrito (Lynch, M., Warnecke, TE, Gill, RT, SCALEs: multiscale analysís of líbrary enrichment. Nature Methods, 2007, 4(87-93), aqui incorporado a título de referência em sua totalidade). Os elementos genéticos e sua adap- tação correspondente foram então segregados por via metabólica com base nas suas classificações de EcoCyc (ecocyc.org). Essa matriz de adaptação foi usada para calcular tanto a adaptação de via (W) como frequência de enriquecimento encontrada na população selecionada.

1

Frequência = número de genes de frequência de via metabólica

genes totais na via As redundâncias de atribuição de via foram identificadas por uma ordem de ciassiíicação iniciai de adaptação de via, seguidas por uma

A análise de dados foi realizada utilizando-se um pacote de

n

W

patkway atribuição específica de elementos genéticos associados com múltiplas vias à via primária identificada na primeira classificação, e remoção subsequente dos valores de adaptação específicos de gene das vias secundárias. Confirmações de Crescimento 5 As culturas noturnas de Machl-HR + pSMART LC-KAN foram

inoculadas em 5 mL de LB + canamicina. As curvas de crescimento foram construídas por inoculação em tubos com tampa de rosca de 15mL contendo suplementos (Tabela 1) e 15 mL de Meio Mínimo MOPS + canamicina +3- HP da cultura noturna. As culturas foram incubadas a 37°C e a densidade 10 óptica foi monitorada a um OD6oo >0,2. As culturas foram diluídas a um OD600=O,2 exato e foram usadas para inocular culturas contendo 15 mL de Meio Mínimo MOPS + canamicina+3-ΗΡ (pH=7,0) em uma densidade óptica inicial de 0,40 para minimizar os efeitos de crescimento em fase estacioná- ria. A densidade óptica foi monitorada e registrada durante toda a faixa de 15 crescimento microaeróbico em meio mínimo, ou até um OD600 final de 0,5- 0,6. Os parâmetros de crescimento foram avaliados em termos de cresci- mento específico, OD6oo na culminação da fase de crescimento (aproxima- damente 14 horas), e OD600 em conclusão de fase de crescimento máximo e OD600 final (24 h). Para atender as limitações intermediárias específicas, su- 20 plementos de via de corismato associados foram adicionados a concentra- ções finais listadas na Tabela 1.

Construção de clone

A PCR foi usada para amplificar o DNA genômico de E. coli K12 correspondente à região aroF-tyrA com iniciadores designados para incluir o 25 promotor aroFp a montante e os terminadores transcricionais independentes de rho. A ligação do DNA purificado, fragmentado com os vetores de pS- MART-canamicina foi realizada com o Kit CIoneSMART (Lucigen, Middleton, Wl) de acordo com as instruções do fabricante. O produto de ligação foi en- tão transformado em MACH1-T1R quimicamente competente (Invitrogen, 30 Carlsbad, CA), semeado em LB + canamicina e incubado a 37°C durante 24 horas. Para confirmar a inserção de transformantes positivos, os plasmídeos foram isolados de clones utilizando um Kit Qiaprep Spin MiniPrep de Qiagen (Valencia, CA) e sequenciados (Macrogen, South Korea).

EXEMPLO 1

Em um método exemplificativo, uma seleção foi realizada duran- te 8 lotes de transferência em série com um gradiente de redução de 3-HP durante 60 horas. A população inicial foi compreendida de cinco bibliotecas genômicas de E. coli K12 representativas que foram transformadas em MA- CH1-TR e cultivadas em fase exponencial média correspondente a condi- ções microaeróbicas (OD6oo~0,2). Os tempos de transferência de lote foram mantidos como parâmetros variáveis que foram ajustados conforme neces- sário para evitar um ambiente de seleção limitado de nutrientes. As amostras foram obtidas na culminação de cada lote na seleção, como descrito acima, e foram adicionalmente analisadas com o software SCALEs para decompor os sinais de microarranjo em clones de biblioteca correspondentes e calcular o enriquecimento relativo de regiões específicas ao longo do tempo. Desse modo, a ampla adaptação de genoma (ln(Xj/Xi0)) foi medida com base nos padrões de enriquecimento específico de região para a seleção na presença de um ácido orgânico industrialmente relevante, 3-HP.

A Figura 1 representa gráficos de ampla análise multiescala de genoma da seleção de 3-HP. Cada pico mostra o sinal (fração da população 20 selecionada) representado pela região genômica correspondente. Os gráfi- cos são representados como círculos devido ao cromossoma circular de E. coli, a posição genômica aumenta no sentido horário em torno de cada círcu- lo com o primeiro e último par de bases do genoma ao meio dia. Cada gráfi- co A, B, C e D representa o sinal associado com as Escalas de 1000 bp, 25 2000 bp, 4000 bp e 8000 bp, respectivamente. Os números em torno dos círculos correspondem a genes que codificam componentes da supervia de corismato. Esses genes estavam sobre regiões genômicas que mostraram um enriquecimento considerável na seleção de 3-HP.

Uma vantagem da abordagem de SCALEs é a capacidade de controlar de maneira quantitativa a adaptação de uma população clonal na duração de seleção. A adaptação de clones individuais pode ser então seg- mentada por pene e adicionalmente categorizada por via, criando um amplo espectro de genoma da adaptação de via contribuindo para a tolerância a 3- HP total. Utilizando-se esse método, diversas vias metabólicas importantes foram identificadas incluindo a maioria dos clones que contribuem para a- daptação ao sistema (Figura 2). A Figura 2 representa os resultados de a- 5 daptação de via das 7 principais vias que contribuem para a adaptação total. A supervia de corismato foi identificada como a maior contribuição de adap- tação total bem como a maior frequência de elementos genéticos contidos na população selecionada, com 19 elementos genéticos identificados nos 10% da população que exibe adaptação aumentada (Figura 3A). A Figura 3 10 A representa a supervia de corismato de E. coli. Os níveis de enriquecimento de genes encontrados em 10% dos clones são realçados. Adicionalmente, 33 genes envolvidos na supervia de corismato exibiram ganhos de adapta- ção significativos e todos os 57 genes mostraram algum nível de enriqueci- mento durante a seleção. Assim, os clones contendo elementos genéticos 15 que codificam as enzimas necessárias a jusante de corismato demonstraram aumentos de adaptação significativos na presença de níveis inibidores de 3- HP. Essa descoberta indica que a inibição de crescimento observada asso- ciada com uma cultura na presença de 3-HP é o resultado de uma interrup- ção da via biossintética de corismato.

A Figura 3A representa um esquema da supervia de corismato.

Os intermediários são marcados ou, de outro modo, indicados na junção das setas. Os nomes dos genes que codificam a função enzimática (setas) estão escritos próximos às setas correspondentes. A retroinibição negativa de pro- dutos ou intermediários na via é mostrada como setas cinzas.

Inibição de Via de Corismato

Para confirmar essas descobertas, o meio de cultura foi suple- mentado com produtos sintetizados a jusante de corismato. A adição de ca- da produto estimulou individualmente o crescimento, confirmando adicional- mente que a inibição está ocorrendo na, ou antes da síntese de corismato 30 (Figura 3B). A Figura 3B representa confirmações de crescimento: adição de produtos a jusante de corismato alivia parcialmente a inibição de crescimen- to confirmada pelo crescimento específico aumentado (preto) e ODeon au- mentado na culminação da fase de crescimento (cinza). Entretanto, aumen- tar a suplementação de diversos produtos a jusante (tirosina, fenilalanina, triptofano) resulta na retroinibição da primeira etapa realizada da supervia de corismato e irá, portanto, reduzir a formação de outros produtos a jusante 5 inclusive ubiquinona, meniquinona e tetra-hidrofolato e limitar os benefícios de crescimentos associados. Aqui, a adição de derivados de corismato ao meio de crescimento na ausência de 3-HP tem pouco ou nenhum efeito be- néfico sobre o crescimento específico ou densidade celular final, confirman- do ainda que a suplementação é 3-HP dependente. Para investigar adicio- 10 nalmente a inibição observada, o intermediário de via de corismato central, chiquimato foi fornecido de maneira extracelular e resultou em um aumento de 20% em crescimento específico (Figura 3B).

A Figura 3B representa métodos exemplificativos para ilustrar a adaptação (taxa de crescimento aumentada na presença de 3-HP) associa- da com cópia aumentada de genes na supervia de corismato.

Ademais, na primeira etapa da via de corismato, Eritrose-4- fos- fato (E-4-P) reage com fosfoenoIpiruvato (PEP) para formar 3-deóxi-D- arbino-heptulosonato-7-fosfato. E-4-P é exigido por diversas vias importan- tes, inclusive a ramificação não-oxidativa da via pentose fosfato e a biossín- 20 tese de piridoxal-5’-fosfato (vitamina B6). Uma descoberta significa que o grupo Ε-4-não é limitado e que uma inibição ocorre mais provavelmente en- tre a formação de E-4-P e chiquimato. Em outro experimento, ribose, histidi- na e nucleotídeos foram adicionados ao meio de crescimento individualmen- te. Essas moléculas são subprodutos da biossíntese de histidina, purina e 25 pirimidina, supervia (PRPP), que também contribui com adaptação significa- tiva para a análise da via (Figura 3B)

Retroinibição Interrompida

Por meio do uso da metodologia SCALEs, inúmeros alvos gené- ticos para aliviar a inibição de crescimento da presença de 3-HP foram iden- tificados. Especificamente, como mostrado na Figura 2, a cópia aumentada do operon tyrA-aroF resultou em enriquecimento significativo durante as se- leções, tornando essa região genética um alvo atraente. Um clone foi cons- truído contendo o operon tyrA-aroF e foi cultivado na presença de 20 g/L 3- HP. A cópia aumentada dessa região aliviou parcialmente a inibição de cres- cimento, conferindo um aumento de 15% no crescimento específico. Embora essa região mostre ganhos de adaptação significativos, o aumento associa- 5 do na produção de tirosina e fenilalanina inibiu a primeira etapa na via de corismato. Um método para contornar esse controle inerente foi obter um mutante aroH resistente de retroalimentação induzível que irá aumentar a conversão de E-4-P ao mesmo tempo em que mantém a atividade na pre- sença de grupos crescentes de produtos a jusante, desse modo, aliviando- 10 se a inibição de crescimento devido à síntese prejudica de subprodutos ne- cessário da via de corismato. O crescimento do mutante aroH na presença de 20 g/L 3-HP resultou em um aumento significativo no crescimento especí- fico. Ademais, a concentração inibidora mínima de 24 horas de 3-HP (a con- centração mínima para interromper o crescimento visível em 24 horas) em 15 meio mínimo M9 aumentou de 25 g/L de um controle de vetor a 40g/L de um clone de E. coli que expressa esse mutante aroH. Em algumas modalidades aqui, contempla-se que o mutante aroH pode ser útil separadamente, ou em combinação com outras manipulações genéticas ou seleção para aumentar a tolerância de produção de 3-HP em microorganismos.

Essa inibição de crescimento descrita acima pode afetar ácidos

aromáticos a jusante, tirosina, fenilalanina e triptofano. De acordo com essa inibição de crescimento, grupos aumentados desses aminoácidos reduzem a atividade das ísozimas DAHPS correspondentes à primeira etapa realizada da supervia de corismato. Esse exemplo indica que a tolerância aumentada 25 não é específica para aumentar as concentrações de cada grupo intermediá- rio, porém pode ser obtida pela modulação dos grupos. Em um método e- xemplificativo, a suplementação do meio de crescimento com fenilalanina tem efeitos prejudiciais sobre o crescimento específico na presença de 3-HP enquanto a adição de tirosina tem um efeito benéfico. Isso ilustra o conceito 30 que uma tolerância ótima de 3-HP poderia ser obtida ao modular as concen- trações de produto reduzindo os grupos fenilalanina enquanto aumenta-se simultaneamente os grupos tirosina para permitir uma atividade ótima da enzima DAHPS. Uma modalidade exemplificativa refere-se à modulação de concentrações de produto da supervia de corismato reduzindo a fenilalanina em combinação com níveis aumentados de tirosina para permitir uma ativi- dade ótima da enzima DAHPS.

5 A Figura 4 representa a confirmação de crescimento utilizando

componentes exemplificativos a jusante de corismato na supervia de coris- mato para reduzir a inibição de crescimento. O crescimento específico au- mentado é ilustrado em preto enquanto OD6oo aumentado na culminação da fase de crescimento é ilustrado em cinza. Contempla-se aqui que um ou 10 mais produtos a jusante da supervia de corismato podem ser usados para aumentar a tolerância a 3-HP em um microorganismo. De acordo com esses usos, um ou mais produtos a jusante podem ser suplementados para cultu- ras de microorganismos.

A composição de 3-HP obtida, por exemplo, junto à TCI America 15 para seleções de biblioteca iniciais e todas as confirmações de crescimento subsequentes podem conter quantidades variáveis de contaminação por á- cido acrílico. Uma concentração inibidora mínima de ácido acrílico para crescimento de E. coli Machl em meio mínimo foi determinada para estar em tomo de 0,6 g/L. Sustentando-se que o mecanismo de tolerância especí- 20 fico da supervia de corismato é exclusivo para toxicidade de 3-HP, as con- centrações inibidoras mínimas de ácido acrílico foram determinadas para serem 0,6 g/L de E. coli Machl desenvolvida em meio mínimo suplementado com a adição de chiquimato ou homocisteína. Adicionalmente, a concentra- ção inibidora mínima foi determinada para ser 0,6 g/L dos mutantes aroH 25 resistentes à retroalimentação desenvolvidos em meio mínimo. Esses dados sustentam que concentrações aumentadas de qualquer intermediário envol- vido na supervia de corismato aumentam a tolerância específica à toxicidade de 3-HP e esse não é afetado pela contaminação por ácido acrílico de com- posições de 3-HP.

Nos exemplos descritos aqui, a adição de produtos a jusante do

corismato ao meio de crescimento aumentou o crescimento específico, con- firmando que a inibição do crescimento e produção de ácido orgânico pode ocorrer devido às limitações de aminoácidos relacionados ao corismato e vitaminas essenciais. O chiquimato suplementar também causou um aumen- to substancial no crescimento, indicando que a inibição está ocorrendo antes do chiquimato na via de biossíntese de corismato. Estudos adicionais suge- 5 rem que a inibição ocorre entre a formação de Eritrose-4-fosfato e chiquima- to. As descobertas apresentadas acima ajudam muito superar o desafio de criar uma cepa tolerante a 3-HP para uso como um hospedeiro recombinan- te.

Nos exemplos descritos aqui, os desafios da expressão ou adi- ção de elementos genéticos contendo genes na supervia de corismato de- monstram um crescimento específico aumentado na presença de 3-HP au- mentando, desse modo, a tolerância à produção de 3-HP.

Tabela 1: Suplementação de meio e efeitos de crescimento associados comparada com controle de vetor vazio._

Suplementação Concentração % de Aumento de Cresci¬ mento Específico Nenhuma N/A 0 Tirosina 0,4 mM 9 Fenilalanina 0,4 mM 10 T riptofano 0,1 mM 1 Para-hidroxibenzoato 0,2 mM 10 Para-aminbenzoato 0,2 mM 17 2,3-di-hidroxibenzoato 0,2 mM 9 Combinação* 16 Chiquimato 0,4 mM 20 Piridoxina 2 mM 0 *Combinação inclui: tirosina, fenilalanina, para-hidroxibenzoato, para- aminobenzoato e 2,3 di-hidroxibenzoato nas concentração acima.

Todas as COMPOSIÇÕES e/ou MÉTODOS e/ou APARELHOS descritos e reivindicados aqui podem ser feitas e executadas sem experi- mentação indevida em consideração com a presente descrição. Embora as comnosicões e métodos seiam descritas em termos de modalidades nreferi-

I ·> J I das, se tornará óbvio para os versados na técnica que variações podem ser aplicadas às COMPOSIÇÕES e/ou MÉTODOS e/ou APARELHOS e nas etapas ou na seqüência de etapas dos métodos descritos aqui sem que se abandone o conceito, espírito e escopo da presente invenção. Mais especifi- 5 camente, se tornará obvio que alguns agentes que são química e fisiologi- camente relacionados podem ser substituídos pelos agentes descritos aqui, embora resultados parecidos ou similares possam ser obtidos. Todos tais substitutos e modificações similares óbvios para os versados na técnica são considerados dentro do espírito, escopo e conceito como definido pelas rei- 10 vindicações em anexo.

Claims (31)

1. Composição para aumentar a tolerância ao ácido 3-hidroxi- propiônico (3-HP) por meio de um microorganismo compreendendo; um ou mais compostos capazes de modular uma supervia de corismato do micro- organismo em que a modulação da supervia de corismato aumenta a tole- rância de 3-HP.

2. Composição, de acordo com a reivindicação 1, em que a composição compreende um intermediário da supervia de corismato.

3. Composição, de acordo com a reivindicação 1, em que a composição compreende um precursor para a supervia de corismato.

4. Composição, de acordo com a reivindicação 1, em que a composição compreende modular o fluxo através da supervia de corismato.

5. Composição, de acordo com a reivindicação 1, compreenden- do ainda um composto selecionado entre um ou mais de corismato, tirosina, fenilalanina, triptofano, folato, ubiquinona, meniquinona, isozimas 3-deóxi-D- arbino-heptulosonato-7-fosfato sintase (DAHPS), chiquimato, ou uma mistu- ra desses.

6. Composição, de acordo com a reivindicação 1, em que o composto induz uma enzima da supervia de corismato no microorganismo.

7. Composição, de acordo com a reivindicação 1, em que o composto compreende um vetor tendo um elemento genético capaz de mo- dular a supervia de corismato.

8. Composição, de acordo com a reivindicação 2, em que a composição compreende um ou mais intermediários da supervia de corisma- to selecionados a partir de D-Eritrose-4-fosfato, 3-deóxi-D-arabino-heptu- losonato-7-fosfato, 3-desidroquinato, 3-desidro-chiquimato, chiquimato, chi- quimato-3-fosfato, 5-enolpiruvil-chiquimato-3-fosfato, corismato, isocorisma- to, prefenato, fenilpiruvato, para-hidroxifenilpiruvato, L-fenilalanina, L-tirosina, 2,3-di-idro-2,3-di-hidroxibenzoato, 2,3-di-hidroxibenzoato, enterobactina, 2- succinil-6-hidróxi-2,4-ciclo-hexadieno-1-carboxilato, o-succinibenzoato, o- succinilbenzoil-coA, 1,4-di-hidróxi-2-naptoato, menaquinona, antranilato, N- (5’-fosforibosil)-antranilato. 1 -(o-carboxifenilamino)-l ’-desoxirribulose-5’- fosfato, indol-3-glicerol-fosfato, indol, L-triptofano, 4-amino4-deóxicorismato, para-aminobenzoato, 7,8-di-hidropteroato, 7,8-di-hidrofolato, tetra- hidrofolato, 4-hidroxibenzoato, 3-octaprenil-4-hidroxibenzoato, 2- octaprenilfenol, 2,2-octaprenil-6-hidroxifenol, 2-octaprenil-6-metóxifenol, octaprenil-6-metóxi-1,4-benzoquinona, 2-octaprenil-3-metil-6-metóxil,4- benzoquinona, 3-demetilubiquinona-8, ubiquinona-8 ou uma combinação, ou mistura de, dois ou mais desses.

9. Composição, de acordo com a reivindicação 3, em que a composição compreende um ou mais precursores da supervia de corismato selecionados entre D-Eritrose-4-fosfato, 3-deóxi-D-arabino-heptulosonato-7- fosfato, 3-desidroquinato, 3-desidro-chiquimato, chiquimato, chiquimato-3- fosfato, 5-enolpiruvil-chiquimato-3-fosfato, corismato, isocorismato, prefena- to, fenilpiruvato, para-hidroxifenilpiruvato, L-fenilalanina, L-tirosina,2,3-di- idro-2,3-di-hidroxibenzoato, 2,3-di-hidroxibenzoato, enterobactina,2-succinil- 6-hidróxi-2,4-ciclo-hexadieno-1-carboxilato, o-succinibenzoato, o- succinilbenzoil-coA, 1,4-di-hidróxi-2-naptoato, menaquinona, antranilato, N- (5’-fosforibosil)-antranilato, 1 -(o-carboxifenilamino)-l ’-desoxirribulose-5’- fosfato, indol-3-glicerol-fosfato, indol, L-triptofano, 4-amino-4- desoxicorismato, para-aminobenzoato, 7,8-di-hidropteroato, 7,8-di- hidrofolato, tetra-hidrofolato, 4-hidroxibenzoato, 3-octaprenil-4- hidroxibenzoato, 2-octaprenilfenol, 2,2-octaprenil-6-hidroxifenol,2-octaprenil-6-metóxifenol, 2-octaprenil-6-metóxi-1,4-benzoquinona, 2-octaprenil3-metil-6-metóxi 1,4-benzoquinona, 3-demetilubiquinona-8, ubiquinona-8 ou uma combinação, ou mistura de dois ou mais desses.

10. Composição, de acordo com a reivindicação 1, em que a composição é capaz de alterar os níveis intracelulares de um ou mais inter- mediários da supervia de corismato selecionada a partir de D-Eritrose-4- fosfato, 3-desóxi-D-arabino-heptulosonato-7-fosfato, 3-desidroquinato, 3- desidro-chiquimato, chiquimato, chiquimato-3-fosfato, 5-enolpiruvil- chiquimato-3-fosfato, corismato, isocorismato, prefenato, fenilpiruvato, para- hidroxifenilpiruvato, L-fenilalanina, L-tirosina, 2,3-di-idro-2,3-di- hidroxibenzoato, 2,3-di-hidroxibenzoato, enterobactina, 2-succinil-6-hidróxi- . 2.4-ciclo-hexadieno-1-carboxilato, o-succinibenzoato, o-succinilbenzoil-coA, 1.4-di-hidróxi-2-naptoato, menaquinona, antranilato, N-(5’-fosforibosil)- antranilato, 1-(o-carboxifenilamino)-1 ’-desoxirribulose-5’-fosfato, indol-3- glicerol-fosfato, indol, L-triptofano, 4-amino-4-desoxicorismato, para- aminobenzoato, 7,8-di-hidropteroato, 7,8-di-hidrofolato, tetra-hidrofolato, 4- hidroxibenzoato, 3-octaprenil-4-hidroxibenzoato, 2-octaprenilfenol, 2,2- octaprenil-6-hidroxifenol, 2-octaprenil-6-metóxifenol, 2-octaprenil-6-metóxi- 1.4-benzoquinona, 2-octaprenil-3-metil-6-metóxi 1,4-benzoquinona, 3- demetilubiquinona-8, ubiquinona-8 ou uma combinação, ou mistura de dois ou mais desses.

11. Composição, de acordo com a reivindicação 1, em que a composição é capaz de alterar os níveis intracelulares de um ou mais pre- cursores da supervia de corismato selecionados a partir de D-Eritrose-4- fosfato, 3-desóxi-D-arabino-heptulosonato-7-fosfato, 3-desidroquinato, 3- desidro-chiquimato, chiquimato, chiquimato-3-fosfato, 5-enolpiruvil- chiquimato-3-fosfato, corismato, isocorismato, prefenato, fenilpiruvato, para- hidroxifenilpiruvato, L-fenilalanina, L-tirosina, 2,3-d i-id ro-2,3-d i- hidroxibenzoato, 2,3-di-hidroxibenzoato, enterobactina, 2-succinil-6-hidróxi- 2.4-ciclo-hexadieno-1 -carboxilato, o-succinibenzoato, o-succinilbenzoil-coA, 1,4-di-hidróxi-2-naptoato, menaquinona, antranilato, N-(5’-fosforibosil)- antranilato, 1 -(o-carboxifenilamino)-l ’-desoxirribulose-5’-fosfato, indol-3- glicerol-fosfato, indol, L-triptofano, 4-amino-4-desoxicorismato, para- aminobenzoato, 7,8-di-hidropteroato, 7,8-di-hidrofolato, tetra-hidrofolato, 4- hidroxibenzoato, 3-octaprenil-4-hidroxibenzoato, 2-octaprenilfenol, 2,2- octaprenil-6-hidroxifenol, 2-octaprenil-6-metóxifenol, 2-octaprenil-6-metóxi- 1.4-benzoquinona, 2-octaprenil-3-metil-6-metóxi 1,4-benzoquinona, 3- demetilubiquinona-8, ubiquinona-8 ou uma combinação, ou uma mistura de dois ou mais desses.

12. Composição, de acordo com a reivindicação 1, compreen- dendo ainda um composto selecionado a partir de um ou mais entre coris- mato, tirosina, fenilalanina, triptofano, folato, ubiquinona, meniquinona, iso- zimas 3-desóxi-D-arbino-heptulosonato-7-fosfato sintase (DAHPS), chiqui- mato, D-Eritrose-4-fosfato, 3-desóxi-D-arabino-heptulosonato-7-fosfato, 3- desidroquinato, 3-desidro-chiquimato, chiquimato, chiquimato-3-fosfato, 5- enolpiruvil-chiquimato-3-fosfato, corismato, isocorismato, prefenato, fenilpi- ruvato, para-hidroxifenilpiruvato, L-fenilalanina, L-tirosina, 2,3-di-idro-2,3-di- hidroxibenzoato, 2,3-di-hidroxibenzoato, enterobactina, 2-succinil-6-hidróxi2.4-ciclo-hexadieno-1 -carboxilato, o-succinibenzoato, o-succinilbenzoil-coA,1.4-di-hidróxi-2-naptoato, menaquinona, antranilato, N-(5’-fosforibosil)- antranilato, l-(o-carboxifenilamino)- 1’-desoxirribulose-5’-fosfato, indol-3- glicerol-fosfato, indol, L-triptofano, 4-amino-4-desoxicorismato, para- aminobenzoato, 7,8-di-hidropteroato, 7,8-di-hidrofolato, tetra-hidrofolato, 4- hidroxibenzoato, 3-octaprenil-4-hidroxibenzoato, 2-octaprenilfenol, 2,2- octaprenil-6-hidroxifenol, 2-octaprenil-6-metóxifenol, 2-octaprenil6-metóxi1.4-benzoquinona, 2-octaprenil-3-metil-6-metóxi 1,4-benzoquinona, 3- demetilubiquinona-8 ou ubiquinona-8 ou mistura desses ou combinação desses.

13. Composição, de acordo com a reivindicação 1, em que o composto modula uma enzima da supervia de corismato no microorganismo.

14. Composição, de acordo com a reivindicação 1, em que o composto compreende um vetor que possui um ou mais elementos genéti- cos capazes de alterar os metabólitos da supervia de corismato.

15. Composição, de acordo com a reivindicação 1, em que o composto induz uma alteração genética capaz de alterar os metabólitos na supervia de corismato.

16. Composição para aumentar a produção de ácido 3- hidroxipropiônico (3-HP) por meio de um microorganismo compreendendo; um ou mais compostos capazes de aumentar a tolerância do microorganis- mo a 3-HP, em que a composição induz a tolerância a pelo menos 30g/L.

17. Método para aumentar a produção ou tolerância para a pro- dução de um ácido orgânico por meio de um microorganismo compreenden- do, modular a supervia de corismato no microorganismo.

18. Método, de acordo com a reivindicação 17, em que a modu- lação da supervia de corismato no microorganismo compreende introduzir um composto no microorganismo capaz de modular a supervia de corismato.

19. Método para aumentar a tolerância para a produção de um ácido orgânico por meio de um microorganismo compreendendo: a) obter um ou mais compostos capazes de modular intermediá- rios de supervias de corismato pelo microorganismo em que a indução das supervias de corismato aumenta a produção e/ou tolerância do ácido orgâni- co pelo microorganismo; e b) introduzir os compostos em uma cultura do microorganismo.

20. Método, de acordo com a reivindicação 19, em que o ácido orgânico compreende uma mistura de 3-HP, e opcionalmente, um ou mais entre ácido 3,3-dioxoproprínico e ácido acrílico.

21. Método, de acordo com a reivindicação 19, em que os com- postos são selecionados a partir de um ou mais entre corismato, tirosina, fenilalanina, triptofano, folato, ubiquinona, meniquinona, isozimas 3-desóxi- D-arbino-heptulosonato-7-fosfato sintase (DAHPS), chiquimato, D-Eritrose-4- fosfato, 3-desóxi-D-arabino-heptulosonato-7-fosfato, 3-desidroquinato, 3- desidro-chiquimato, chiquimato, chiquimato-3-fosfato, 5-enolpiruvil- chiquimato-3-fosfato, corismato, isocorismato, prefenato, fenilpiruvato, para- hidroxifenilpiruvato, L-fenilalanina, L-tirosina, 2,3-d i-id ro-2,3-d i- hidroxibenzoato, 2,3-di-hidroxibenzoato, enterobactina, 2-succinil-6-hidróxi- 2.4-ciclo-hexadieno-1 -carboxilato, o-succinibenzoato, o-succinilbenzoil-coA, 1.4-di-hidróxi-2-naptoato, menaquinona, antranilato, N-(5’-fosforibosil)- antranilato, 1 -(o-carboxifenilamino)-l ’-desoxirribulose-5’-fosfato, indol-3- glicerol-fosfato, indol, L-triptofano, 4-amino-4-desoxicorismato, para- aminobenzoato, 7,8-di-hidropteroato, 7,8-di-hidrofolato, tetra-hidrofolato, 4- hidroxibenzoato, 3-octaprenil-4-hidroxibenzoato, 2-octaprenilfenol, 2,2- octaprenil-6-hidroxifenol, 2-octaprenil-6-metóxifenol, 2-octaprenii-6-metóxi- 1.4-benzoquinona, 2-octaprenil-3-metil-6-metóxil,4-benzoquinona, 3- demetilubiquinona-8, ubiquinona-8 ou uma combinação ou mistura de dois ou mais desses.

22. Método, de acordo com a reivindicação 19, em que o ácido orgânico compreende uma mistura de 3-HP, e opcionalmente, um ou mais entre ácido 3,3-dioxoproprínico e ácido acrílico.

23. Método para aumentar a tolerância para a produção de um ácido orgânico por meio de um microorganismo compreendendo: a) obter um ou mais compostos capazes de modular os precur- sores de supervias de corismato pelo microorganismo em que a indução das supervias de corismato aumenta a tolerância do ácido orgânico pelo micro- organismo; e b) introduzir os compostos em uma cultura do microorganismo.

24. Método, de acordo com a reivindicação 23, em que o ácido orgânico compreende uma mistura de 3-HP, e opcionalmente, um ou mais entre ácido 3,3-dioxoproprínico e ácido acrílico.

25. Método para aumentar a produção de ácido 3- hidroxipropiônico (3-HP) por meio de um microorganismo compreendendo colocar uma cultura de microorganismo em contato com uma composição compreendendo um ou mais compostos de supervia de corismato ou capaz de modular a supervia de corismato.

26. Método, de acordo com a reivindicação 25, em que o com- posto compreende um vetor que possui um ou mais elementos genéticos capazes de modular a supervia de corismato.

27. Método para aumentar a produção e/ou tolerância de ácido3-hidroxipropiônico (3-HP) por um microorganismo compreendendo manipu- lar geneticamente as supervias de corismato no microorganismo.

28. Método, de acordo com a reivindicação 27, em que a mani- pulação genética da supervia de corismato em um microorganismo é sele- cionada a partir da alteração da expressão genética de um ou mais genes envolvidos na supervia de corismato em um microorganismo adicionando um vetor para introduzir um novo material genético; inserção genética, dissolu- ção ou remoção de material genético existente; mutação de material genéti- co ou uma combinação de dois ou mais desses.

29. Método, de acordo com a reivindicação 27, em que a inser- ção genética compreende modular os níveis intracelulares de um ou mais entre corismato. tirosina, fenilalanina, triptofano, folato, ubiquinona, meniqui- nona, isozimas 3-desóxi-D-arbino-heptulosonato-7-fosfato sintase (DAHPS), chiquimato, D-Eritrose-4-fosfato, 3-desóxi-D-arabino-heptulosonato-7- fosfato, 3-desidroquinato, 3-desidro-chiquimato, chiquimato, chiquimato-3- fosfato, 5-enolpiruvil-chiquimato-3-fosfato, corismato, isocorismato, prefena- to, fenilpiruvato, para-hidroxifenilpiruvato, L-fenilalanina, L-tirosina, 2,3-di- idro-2,3-di-hidroxibenzoato, 2,3-di-hidroxibenzoato, enterobactina, 2-succinil- 6-hidróxi-2,4-ciclo-hexadieno-1 -carboxilato, o-succinibenzoato, o- succinilbenzoil-coA, 1,4-di-hidróxi-2-naptoato, menaquinona, antranilato, N- (5’-fosforibosil)-antranilato, 1 -(o-carboxifenilamino)-l ’-desoxirribulose-5’- fosfato, indol-3-glicerol-fosfato, indol, L-triptofano, 4-amino-4- desoxicorismato, para-aminobenzoato, 7,8-di-hidropteroato, 7,8-di-idro fola- to, tetra-hidrofolato, 4-hidroxibenzoato, 3-octaprenil-4-hidroxibenzoato, 2- octaprenilfenol, 2,2-octaprenil-6-hidroxifenol, 2-octaprenil-6-metóxifenol, 2- octaprenil-6-metóxi-1 ,4-benzoquinona, 2-octaprenil-3-metil-6-metóxi 1,4- benzoquinona, 3-demetilubiquinona-8, ubiquinona-8 ou uma combinação, ou mistura de dois ou mais desses.

30. Kit para aumentar a tolerância para a produção de um ácido orgânico em um microorganismo compreendendo; um ou mais compostos capazes de modular a supervia de corismato do microorganismo; e um ou mais recipientes, sendo que um ou mais compostos são capazes de aumen- tar a tolerância do ácido orgânico.

31. Kit, de acordo com a reivindicação 30, em que um ou mais compostos são selecionados a partir de corismato, tirosina, fenilalanina, trip- tofano, folato, ubiquinona, meniquinona, isozimas 3-desóxi-D-arbino- heptulosonato-7-fosfato sintase (DAHPS), chiquimato, D-Eritrose-4-fosfato, 3-desóxi-D-arabino-heptulosonato-7-fosfato, 3-desidroquinato, 3-desidro- chiquimato, chiquimato, chiquimato-3-fosfato, 5-enolpiruvil-chiquimato-3- fosfato, corismato, isocorismato, prefenato, fenilpiruvato, para- hidroxifenilpiruvato, L-fenilalanina, L-tirosina, 2,3-d i-id ro-2,3-d i- hidroxibenzoato, 2,3-di-hidroxibenzoato, enterobactina, 2-succinil-6-hidróxi- 2.4-ciclo-hexadieno-1-carboxilato, o-succinibenzoato, o-succinilbenzoil-coA, 1.4-di-hidróxi-2-naptoato, menaquinona, antranilato, N-(5’-fosforibosil)- antranilato, 1 -(o-carboxifenilamino)-l ’-desoxirribulose-5’-fosfato, indol-3- glicerol-fosfato, indol, L-triptofano, 4-amino-4-desoxicorismato, para- aminobenzoato, 7,8-di-hidropteroato, 7,8-di-hidrofolato, tetra-hidrofolato, 4- hidroxibenzoato, 3-octaprenil-4-hidroxibenzoato, 2-octaprenilfenol, 2,2- octaprenil-6-hidroxifenol, 2-octaprenil-6-metóxifenol, 2-octaprenil-6-metóxi- 1,4-benzoquinona, 2-octaprenil-3-metil-6-metóxil,4-benzoquinona, 3- demetilubiquinona-8, ubiquinona-8 ou uma combinação, ou mistura de dois ou mais desses.