BRPI0806921A2 - Endoglicanase ii modificada e métodos de uso - Google Patents

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "ENDOGLI- CANASE Il MODIFICADA E MÉTODOS DE USO".

REFERÊNCIAS CRUZADAS A PEDIDOS RELACIONADOS

O presente pedido reivindica o benefício e a prioridade do Pedi- 5 do Provisório US 60/881.280 depositado em 18 de janeiro de 2007 e ao Pe- dido Provisório US 60/881.626 depositado em 19 de janeiro de 2007, ambos os quais são aqui incorporados, na íntegra, a título de referência. DECLARAÇÃO QUANTO A DIREITOS A INVENÇÕES FEITAS SOB PES- QUISA E DESENVOLVIMENTO PATROCINADOS PELO GOVERNO FE- 10 DERAL.

Não aplicável.

CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção refere-se a uma endoglicanase Il modifica- da (EGII) derivada de Trichoderma reesei, composições que compreendem a dita EGII e métodos para tratar têxteis usando tais composições. Prepara- ções de enzimas originais são aqui fornecidas compreendendo uma enzima que exibe atividade de endoglicanase que tem um desempenho muito bom em aplicações industriais como composições de lavanderia, para biopoli- mento de têxteis recém-fabricados, para fornecer um visual desgastado de tecido ou vestuário de celulose, e para tratar polpa de papel. Ademais, a in- venção se refere a constructos de DNA que codificam tais enzimas, um mé- todo para fornecer um gene que codifica tais enzimas, um método para pro- duzir tais enzimas, preparações de enzimas que contêm tais enzimas e uso destas enzimas em diversas aplicações industriais. Assim, o presente pedido também fornece métodos aperfeiçoados para o tratamento de tecidos que contêm algodão e tecidos de celulose que não contêm algodão com celulase assim como os teecidos produzidos destes métodos. Em particular, os méto- dos aperfeiçoados da presente invenção compreendem contatar tecidos que contêm algodão e tecidos que não contêm algodão com uma solução aquo- sa contendo ume solução uô celuisse que compr66nde enzimas ds cbIuIssg EGll modificadas.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO Celulases ou enzimas celulíticas são enzimas envolvidas na hi- drólise de celulose. Na hidrólise de celulose nativa, sabe-se que existem três tipos principais de enzimas de celulase envolvidas, a saber, celobio- hidrolase (1,4-P-glicana celobio-hidrolase, EC 3.2.1.91), endo-P-1,4- 5 glicanase (endo-1,4-3-D-glicana 4-glicano-hidrolase, EC 3.2.1.4 e β- glicosidase (EC 3.2.1.21).

As celulases são sintetizadas por numerosos micro-organismos que incluem fungos, actinomicetas, mixobactérias e bactérias verdadeiras, mas também por plantas. Especialmente, endoglicanases de uma ampla va- riedade de especificidades foram identificadas.

Um uso industrial muito importante de enzimas celulíticas é o uso para tratamento de tecido ou têxtil celulósico, por exemplo, como ingre- dientes em composições detergentes ou composições de amaciantes de tecido, para biopolimento de um tecido novo (acabamento de vestimenta) e 15 para obtenção do visual (envelhecido) "stone-washed" de um tecido que contém celulose, especialmente denim, e diversos métodos para tal trata- mento já foram sugeridos.

Um objetivo da presente invenção é fornecer novas preparações de enzimas que possuem uma atividade celulítica substancial em condições 20 ácidas ou neutras e desempenho aperfeiçoado em processamento de polpa de papel, tratamento de têxteis, processos de lavanderia ou em alimentação animal; preferivelmente celulases novas, mais preferivelmente endoglicana- ses de bom desempenho, que são contempladas a serem produzíveis ou produzidas por técnicas recombinantes.

A maior parte dos tecidos de algodão e tecidos com misturas de

algodão recém-fabricados são de manuseio bastante árduo e rígido, a me- nos que sejam tratados com componentes de acabamento. Ademais, a su- perfície do tecido não é sempre macia devido a fibras emaranhadas, peque- nas, salientes das fibras individuais do algodão. Adicionalmente, após um 30 período relativamente curto de uso, grupos de fiapos aparecem na superfície dando uma aparência de "bolinhas" na superfície, o que faz com que o teci- do tenha um visual gasto, não atraente. Em tecidos de poliéster, este fenô- meno é chamado de "formação de bolinhas" e fornece uma aparência similar não atraente ao tecido. O termo "formação de bolinhas" também será aplica- do a tecidos celulósicos na atual aplicação.

Assim, uma característica útil das celulases no tratamento de 5 têxteis é sua capacidade de recondicionar tecidos usados, fazendo com que suas cores sejam mais vibrantes. Por exemplo, a lavagem repetida de teci- dos que contêm algodão resulta em acinzentamento do tecido que se acredi- ta ser devido às fibras desordenadas e rompidas, às vezes chamadas de "bolinhas", causado por ação mecânica. Esse acinzentamento é particular- 10 mente observável em tecidos coloridos. Assim, a capacidade da celulase de remover a camada superior desordenada do tecido e assim melhorar a apa- rência geral deste tecido é valorosa.

O tratamento com celulase das superfícies do tecido aumenta a qualidade do tecido no que diz respeito ao manuseio e aparência, sem perda 15 de molhabilidade do tecido. Os efeitos mais importantes compreendem me- nos emaranhamento e menor formação de bolinhas, maiores brilho e lustre, manuseio aperfeiçoado do tecido, maciez aumentada e durável e absorbân- cia de água aperfeiçoada. Refere-se a esses efeitos como efeitos de biopo- limento.

Apesar do conhecimento na técnica relacionada a diversas com-

posições de celulase, há uma necessidade contínua por novas celulases que possuam um espectro variado de características úteis em, por exemplo, tra- tar têxteis, como componentes em composições detergentes, tratar polpa e papel e converter biomassa.

As composições de celulase descritas aqui fornecem caracterís-

ticas aperfeiçoadas de desempenho, especialmente no processamento de têxteis.

BREVE SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Descobriu-se, surpreendentemente, que tratar artigos de celulo- se com uma composição de enzimas de celulase de Trichoderma que con- siste essencialmente em componentes de EGII modificada, oferece um de- sempenho superior se comparado às composições enriquecidas com endo- celulase. Através do uso das composições de enzimas específicas aqui des- critas, a remoção das bolinhas é mais eficaz, a abrasão é intensificada e a quantidade de destruição do tecido durante o tratamento com a enzima é reduzida, em comparação com as enzimas de celulase comerciais padrão, 5 atualmente utilizadas para tratar tecidos de algodão durante a fabricação. Portanto, a invenção consiste em um método para tratar tecidos de algodão utilizando composições de celulase específicas.

Em uma modalidade, a composição de enzimas de celulase consiste essencialmente em um componente de EGII modificada. Em um 10 aspecto, a composição de enzimas compreende pelo menos 80% de um componente de EGII modificada. Em um segundo aspecto, a composição de enzimas compreende pelo menos 90% de um componente de EGII modifi- cada. Em um terceiro aspecto, a composição de enzimas compreende pelo menos 95% de um componente de EGII modificada. Em um outro aspecto, a 15 composição de enzimas compreende pelo menos 97% de um componente de EGII modificada.

Em uma outra modalidade, o componente de EGII modificada é substancialmente puro.

Em uma outra modalidade, o componente de EGII modificada é formulado como uma composição de enzima de celulase. Em um aspecto, o componente de EGII modificada é uma parte de uma composição para tra- tamento. Em um segundo aspecto, o componente de EGII modificada é uma parte de uma composição detergente.

Em uma modalidade, um método para tratar tecidos celulósicos 25 utilizando composições de celulases específicas é fornecido. O método compreende as etapas de (a) contatar tal tecido que contém celulose com uma composição para tratamento que compreende uma quantidade eficaz de celulase; e (b) incubar tal tecido que contém celulose em contato com tal celulase sob condições eficazes para o tratamento do tecido. Em um aspec- 30 to, a celulase compreende um componente de EGII modificada.

Em uma outra modalidade, é fornecido um DNA isolado que co- difica a seqüência de aminoácidos da Figura 1. Em um aspecto, o DNA pos- sui a seqüência fornecida em SEQ ID N0:2.

Em uma modalidade, a invenção inclui um polinucleotídeo isola- do que tem uma seqüência que codifica EG2 modificada, uma seqüência que é complementar à seqüência que codifica o gene de egl2 e/ou uma 5 composição que compreende o polinucleotídeo. O polinucleotídeo pode ser mRNA, DNA, cDNA, DNA genômico ou um análogo antissenso destes.

Em outra modalidade, um polinucleotídeo de egl2 pode compre- ender uma molécula de ácido nucleico isolado que se hibridiza com o com- plemento do ácido nucleico de SEQ ID NO:2 sob condições de estringência de moderadas a altas, em que a molécula de ácido nucleico codifica um po- lipeptídeo de EG2 modificado que exibe atividade de endoglicanase.

Em outra modalidade, o polinucleotídeo tem pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 98% ou mais identidade de seqüência com a seqüência apresentada em SEQ ID NO:2 e codifica uma proteína EG2 modificada. Em 15 uma modalidade específica, o polinucleotídeo compreende uma seqüência que é substancialmente igual à SEQ ID NO:2. A invenção também contempla fragmentos do polinucleotídeo, preferivelmente que tenham pelo menos cer- ca de 15 a 30 nucleotídeos de comprimento.

Em um segundo aspecto, as proteínas ou polipeptídeos de EG2 modificados compreendem uma seqüência que tem pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 98% ou mais identidade de seqüência com a seqüência apresen- tada em SEQ ID NO:1.

Em um terceiro aspecto, a presente invenção se refere a uma constructo de ácidos nucleicos compreendendo a seqüência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo da invenção, operavelmente ligada a uma ou mais seqüências de controle que dirigem a produção do polipeptídeo em um hospedeiro adequado.

Em um quarto aspecto, a presente invenção se refere a um vetor de expressão recombinante que compreende a constructo de ácido nucleico da invenção.

A invenção também fornece vetores de expressão recombinan- tes que contêm uma seqüência de ácidos nucleicos que codifica EG2 modifi- cada ou um fragmento ou fração variante deste, operavelmente ligado a e- Iementos reguladores eficazes para a expressão da proteína no hospedeiro selecionado. Em um aspecto relacionado, a invenção inclui uma célula hos- pedeira que contém o vetor.

Em um quinto aspecto, a presente invenção se refere a uma cé-

lula hospedeira recombinante que compreende a constructo de ácido nuclei- co da invenção.

A invenção também inclui um método para produzir EG2 modifi- cada através de técnicas recombinantes, através do cultivo de células hos- 10 pedeiras procarióticas ou eucarióticas recombinantes, que compreendem a seqüência de ácido nucleico que codifica a EG2 modificada sob condições eficazes para promover a expressão da proteína, e subsequente recupera- ção da proteína da célula hospedeira ou do meio de cultura celular.

Em um sexto aspecto, a presente invenção se refere a um mé- todo para a produção de um polipeptídeo da invenção, método que compre- ende: (a) cultivar um micro-organismo capaz de produzir o polipeptídeo; e (b) recuperar o polipeptídeo.

Também são fornecidos aqui métodos analíticos para detectar ácidos nucleicos de EG2 e proteínas de EG2 modificada, que também são parte da invenção.

Outros objetos, características e vantagens da presente inven- ção se tornarão aparentes a partir da descrição detalhada que segue. Entre- tanto, deve ser entendido que a descrição detalhada e os exemplos específi- cos, embora indiquem modalidades preferíveis da invenção, são dados co- 25 mo ilustração somente, já que várias modificações e mudanças ainda no escopo e espírito da invenção se tornarão aparentes para um versado na técnica a partir desta descrição detalhada.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

Afigura 1 ilustra a seqüência de aminoácidos de EG2 modificada (SEQ ID NO:1) aqui descrita.

A figura 2 ilustra uma seqüência de nucleotídeos que codifica a seqüência de aminoácidos retratada na figura 1. A figura 3 é um alinhamento da EG2 publicada (Gene (1988) 63(1):11-22) (rotulada 'EG2-1988') com a seqüência de aminoácidos aqui descrita (rotulada 'mEG2').

As figuras 4 e 5 são esquemas do plasmídeo EGIIpTrex3 usado para expressar uma EGII modificada.

Afigura 6 é um SDS_PAGE de sobrenadantes concentrados de- rivados das cepas A e B de EGII de T. reesei (descrito nos exemplos 1 e 2).

Afigura 7 é uma representação gráfica dos resultados fornecidos na Tabela 1 da quantificação de fibra de superfície para a remoção de boli- nhas que segue o tratamento enzimático.

A figura 8 contém fotografias que mostram os resultados do tra- tamento enzimático na remoção das bolinhas.

Afigura 9 é uma representação gráfica dos resultados fornecidos na Tabela 2 de abrasão do tecido.

DESCRIÇÃO DETALHADA

A invenção será agora descrita em detalhes a título de referên- cia, usando somente as seguintes definições e exemplos. Todas as patentes e publicações, incluindo todas as seqüências descritas em tais patentes e publicações aqui referidas, são expressamente incorporadas a título de refe- rência.

A não ser que se defina o contrário, todos os termos técnicos e científicos utilizados aqui possuem os mesmos significados comumente en- tendidos por alguém com conhecimento ordinário no assunto ao qual essa invenção pertence. Singleton, et ai, DICTIONARY OF MICROBIOLOGY 25 AND MOLECULAR BIOLOGY, 2D ED., John Wiley and Sons, New York (1994), e Hale & Marham, THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIO- LOGY, Harper Perennial, NY (1991) fornecem a um versado na técnica um dicionário de diversos termos usados na invenção. Embora quaisquer méto- dos e materiais similares ou equivalentes àqueles descritos aqui possam ser 30 usados na prática ou teste da presente invenção, os materiais e métodos aqui descritos são preferidos. Faixas numéricas incluem os números que definem tais faixas. A não ser que seja indicado o contrário, ácidos nucleicos são escritos da esquerda para a direita em uma orientação 5' para 3'; se- qüências de aminoácidos são escritas da esquerda para a direita em uma orientação amino para carbóxi, respectivamente. Técnicos recorrem particu- larmente a Sambrook et ai, 1989, e Ausubel FM et al., 1993 para definições 5 e termos da técnica. Deve ser entendido que essa invenção não é limitada à metodologia, protocolos e reagentes em particular descritos, já que tais po- dem variar.

As faixas numéricas incluem os números que as definem.

A não ser que se indique o contrário, ácidos nucleicos são escri- tos da esquerda para a direita em uma orientação 5' para 3'; seqüências de aminoácidos são escritas da esquerda para a direita em uma orientação a- mino para carbóxi, respectivamente.

Os tópicos fornecidos aqui não são limitações dos vários aspec- tos ou modalidades da invenção, que podem ser tomados a título de refe- rência do relatório descritivo como um todo. Assim, os termos definidos ime- diatamente abaixo são mais bem definidos a título de referência no relatório descritivo como um todo.

Definições

"Tecido que contém algodão" significa tecidos costurados ou não costurados feitos de algodão puro ou misturas de algodão incluindo panos tecidos, malhas de algodão, denim de algodão, fios de algodão e similares. Quando misturas de algodão são empregadas, a quantidade de algodão no tecido deve ser de pelo menos cerca de 40% em peso de algodão; preferi- velmente mais de cerca de 60% em peso de algodão; e ainda mais preferi- velmente mais de cerca de 75% em peso de algodão. Quando empregado como misturas, o material acompanhante empregado no tecido pode incluir uma ou mais fibras que não são de algodão incluindo fibras sintéticas como fibras de poliamida (por exemplo, náilon 6 e náilon 66), fibras acrílicas (por exemplo, fibras de poliacrilonitrila) e fibras de poliéster (por exemplo, po- li(tereftalato de etileno), fibras de poli(álcool vinílico) (por exemplo, Vinylon), fibras de poli(cloreto de vinila), fibras de poli(cloreto de vinilideno), fibras de poliuretano, fibras de poliureia e fibras de aramida. "Tecido que contém celulose" significa qualquer tecido celulósico que contém algodão ou não ou mistura de celulose que contém algodão ou não incluindo celulósicos naturais e celulósicos artificiais (como juta, linho, rami, raiom, TENCEL®). Incluídos sob o cabeçalho de tecidos que contêm 5 celulose artificiais estão os tecidos regenerados que são bem-conhecidos da técnica como o raiom. Outros tecidos de celulose artificiais incluem fibras de celulose quimicamente modificadas (por exemplo, celulose derivatizada por acetato) e fibras de celulose tecidas com solvente (por exemplo, liocel). É claro que incluídos na definição de tecido que contém celulose estão quais- 10 quer vestuários ou fios feitos de tais materiais. De maneira similar, "tecido que contém celulose" inclui fibras têxteis feitas com tais materiais.

"Composição para tratamento" significa uma composição que compreende um componente de celulase EGII modificada que pode ser u- sada no tratamento de um tecido que contém celulose durante a fabricação. Tais tratamentos incluem, sem limitação, "stone-washing", remoção de boli- nhas, modificação de textura, tato e/ou aparência dos tecidos que contêm celulose ou outras técnicas utilizadas durante a fabricação de tecidos que contêm celulose. Adicionalmente, o tratamento no contexto desta invenção contempla a remoção de "algodão morto" de tecidos ou fibras celulósicas, ou seja, de algodão imaturo que é significativamente mais amorfo que algodão maduro. Sabe-se que algodão morto causa tingidura desigual. Adicionalmen- te, "composição para tratamento" significa uma composição que compreen- de um componente de celulase EGII modificada que pode ser usado na la- vagem de um tecido contendo celulase fabricado sujo. Por exemplo, a celu- Iase EGII modificada pode ser usada em uma composição detergente para lavagem. Composições detergentes úteis de acordo com a presente inven- ção incluem formulações especiais como composições para pré-lavagem, pré-enxágue e restauração de cor para uso doméstico. Composições para tratamento podem estar na forma de um concentrado que requer diluição ou na forma de uma solução diluída ou em uma forma que pode ser diretamen- te aplicada ao tecido que contém celulose.

A requerente atuaimente acredita que o padrão de ação da celu- Iase sobre tecidos que contêm celulase não difere significativamente se usa- do como uma composição para "stone-washing" durante a fabricação ou du- rante a lavagem de tecidos que contêm celulase fabricados sujos. Assim, propriedades aperfeiçoadas como abrasão, redeposição de tinta, perda de 5 resistências e tato melhorado conferidas por certa celulase ou misturas de celulases são obtidas tanto em processos detergentes quanto em processos de fabricação que incorporam celulase. É claro que formulações de compo- sições específicas para as várias aplicações têxteis da celulase, por exem- plo, "stone-washing" ou detergente para lavagem ou pré-enxágue podem 10 diferir devido às diferentes aplicações às quais as composições são direcio- nadas, conforme indicado aqui. Entretanto, o aperfeiçoamento efetuado pela adição da composição de celulase vai ser, em geral, consistente ao longo de cada uma das diversas aplicações têxteis.

"Composição para processo de envelhecimento ("stone- 15 washing") significa uma formulação para uso em "stone-washing" de tecidos que contêm celulose. Composições para "stone-washing" são utilizadas para modificar tecidos que contêm celulose antes da apresentação para venda ao consumidor, ou seja, durante o processo de fabricação, ao contrário de com- posições detergentes, que têm por objetivo limpar vestuário sujo.

"stone-washing" significa o tratamento de tecidos coloridos que

contém celulose com uma solução de celulase sob condições de agitação e cascateamento, ou seja, em uma máquina de lavar rotativa, que confere uma aparência de "stone-washed" ao denim. Métodos para conferir uma a- parência de "stone-washed" ao denim são descritos na Patente US 25 4.832.864, que é incorporada aqui a título de referência na íntegra. Em geral, técnicas de "stone-washing" têm sido aplicadas a um denim tingido.

"Composição detergente" significa uma mistura a qual se pre- tende usar em um meio de lavagem para lavar tecidos que contêm celulose, sujos. No contexto da presente invenção, tais composições podem incluir, 30 além de celulases e tensoativos, muitos aditivos incluindo, sem limitação, enzimas hidrolíticas adicionais, "builders", agentes alvejantes, agentes azu- Iantes e tintas fluorescentes, inibidores de formação de bolinhas, agentes mascaradores, ativadores de celulase, antioxidantes e solubilizadores. Tais composições são geralmente usadas para limpar vestuário sujo e não são usadas durante o processo de fabricação, ao contrário das composições pa- ra "stone-washing".

5 "Celulase redepositante" significa celulase em que a lavagem

tipo "stone-washing" enzimática ou outro tratamento nos tecidos que contêm celulose usando soluções de celulase, denim em particular, resulta em rede- posição da tinta no substrato. Este efeito frequentemente se refere como remanchamento. Tal remanchamento do tecido leva à "stone-washing" in- 10 completa pois ao invés do contraste azul em branco desejado, a redeposição resulta em azul sobre azul.

"Agente de superfície ativa tensoativo " significa tensoativos an- folíticos, aniônicos e não-iônicos bem-conhecidos por seu uso em composi- ções detergentes.

"Meio de lavagem" significa uma solução de lavagem aquosa

preparada pela adição de uma quantidade requerida de uma composição detergente à água. O meio de lavagem contém, em geral, uma quantidade do detergente eficaz para a limpeza.

O termo "EGII" conforme definido aqui se refere a um compo- nente tipo endoglicanase tipicamente derivado de, ou incorporando as carac- terísticas que identificam aqueles derivados de EGII de Trichoderma sp. No- ta-se que alguns autores se referiram previamente a EGII pela nomenclatura "EGIII", mas a nomenclatura atual usa o termo EGII. Vide, por exemplo, a discussão de Stalbrand et al., Applied and Environmental Microbiology, vol. 61, p. 1090-1097 (1995). De qualquer forma, a proteína de EGII aqui definida é substancialmente diferente da proteína de EGII em seu peso molecular, pl e pH ótimos. O termo "celulase de EGII" se refere a um componente de en- doglicanase derivado de Trichoderma spp. Caracterizado por um pH ótimo de cerca de 4,0 a 6,0, um ponto isoelétrico (pl) de cerca de 5,5, e um peso molecular de cerca de 48 quilodaltons. Preferivelmente, a celulase de EGII é derivada ou de Triehoderma reesei ou de Triehoderma viríde.

O termo "EGII modificada" conforme usado aqui significa a se- quência de aminoácidos mostrada na figura 1.

O termo "homologia percentual" é usado de maneira intercambi- ável com o termo "identidade percentual" aqui e se refere ao nível de identi- dade do ácido nucleico ou seqüência de aminoácidos entre a seqüência de 5 ácidos nucleicos que codifica a EGII modificada ou a seqüência de aminoá- cidos EGII modificada, quando alinhadas utilizando-se um programa de ali- nhamento de seqüências.

Por exemplo, conforme usado aqui, 80% de homologia significa o mesmo que 80% de identidade de seqüência determinado por um algorit- 10 mo definido, e assim, um homólogo de uma dada seqüência possui mais que 80% de identidade de seqüência sobre o comprimento de uma dada se- qüência. Níveis típicos de identidades de seqüência incluem, sem limitação, 80, 85, 90, 95, 98% ou mais de identidade de seqüência em relação a uma dada seqüência, por exemplo, a seqüência que codifica a EGII modificada, 15 conforme descrito aqui.

Programas computacionais exemplares que podem ser utiliza- dos para determinar a identidade entre duas seqüências incluem, sem limi- tação, o pacote de programas BLAST, por exemplo, BLASTN, BLASTX e TBLASTX, BLASTP e TBLASTN, disponível para o público na internet em 20 www.ncbi.nlm.nhi.gov/BLAST. Vide também, Altschul et a!., 1990 e Altschul etal., 1997.

Buscas de seqüências são tipicamente realizadas usando o pro- grama BLASTN quando se está avaliando uma dada seqüência de ácidos nucleicos em relação às seqüências de ácidos nucleicos nas seqüências de 25 DNA do GenBank e outros bancos de dados públicos. O programa BLASTX é preferível para procurar seqüências de ácidos nucleicos que foram traduzi- das em todos os quadros de leitura contra seqüências de aminoácidos no GenBank Protein Sequences e outros bancos de dados públicos. Tanto o BLASTN quanto o BLASTX são rodados utilizando-se parâmetros padrão de 30 uma penalidade de fenda aberta de 11,0 e uma penalidade de fenda esten- dida de 1,0, e usam a matriz BLOSUM-62 (Ver, por exemplo, Altschul et ai, 1997). Um alinhamento preferido das seqüências selecionadas afim de determinar a "identidade percentual" entre duas ou mais seqüências é reali- zado utilizando por exemplo o programa CLUSDAI-W no MacVector versão 6.5 operando com parâmetro padrões, incluindo "opengap penalty" de 100, 5 "extended gap penalty" de 0,1 e matriz de similaridade BLOSUM 3.0.

Uma "celulase componente" é um componente essencialmente livre de outros componentes de celulase, ocorrendo normalmente em um sistema de celulase produzido por um dado micro-organismo. O componente único pode ser um componente recombinante, ou seja, produzido pela clo- 10 nagem de uma seqüência de DNA que codifica o componente único e uma célula subsequente transformada com a seqüência de DNA e expressa em um hospedeiro, vide, por exemplo, A Patente US 5.654.193. Outros exem- plos de celulase componente incluem, sem limitação, aqueles descritos em JP 07203960-A e WO 92/06209. O hospedeiro é preferivelmente um hospe- 15 deiro heterólogo, mas o hospedeiro pode ser também, sob certas condições, um hospedeiro homólogo.

O termo "purificado", conforme utilizado aqui, também refere-se ã remoção de outros componentes, em particular outras proteínas e mais particularmente, outras enzimas presentes na célula que expressa a EGII 20 modificada. A EGII modificada pode ser "substancialmente pura", ou seja, livre de outros componentes do organismo no qual é produzida, ou seja, por exemplo, um organismo hospedeiro para EGII modificada produzida recom- binantemente. Em uma modalidade preferida, as EGII modificadas são pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% puras. 25 Em uma outra modalidade preferida, a EGII modificada é 100% pura.

A frase "tratamento de remoção de bolinhas" se refere aos tra- tamentos realizados durante o processo de fabricação ou na lavagem sub- sequente. Em ambos os casos, o tratamento é realizado através da adição de artigos de algodão a um aparelho de tingidura em jato horizontal ou verti- 30 cal rotativo, máquina de lavar, ou outro dispositivo que contenha o tecido, água, tampão, enzima de celulase e, opcionalmente, detergentes ou tensoa- tivos, ao mesmo tempo em que se fornecem a agitação e o cisaihamento ao tecido. O tratamento é frequentemente seguido por enxágüe com água para remover os produtos químicos gastos e detritos do tecido, incluindo fibriias soltas. Após o tratamento, o tecido é removido da máquina e secado.

O termo "polipeptídeo" conforme utilizado aqui se refere a um 5 composto feito por uma única cadeia de resíduos de aminoácidos ligados por ligações peptídicas. O termo "proteína" como utilizado aqui, é usado de maneira intercambiável com o termo "polipeptídeo".

O termo "molécula de ácido nucleico" inclui moléculas de RNA, DNA e cDNA. Deve ser entendido que, como resultado da degeneração do 10 código genético, uma multiplicidade de seqüências de nucleotídeos que co- dificam uma dada proteína como, por exemplo, uma EG2 modificada (ou quaisquer outras proteínas) pode ser produzida. A presente invenção con- templa cada possível seqüência de nucleotídeos variante que codifica EGII modificada, todas as quais são possíveis dada a degeneração do código 15 genético.

Uma seqüência ou constructo de ácido nucleico "heteróloga" possui uma parte da seqüência que não é nativa da célula na qual está ex- pressa. Heteróloga, no que diz respeito a uma seqüência de controle se refe- re a uma seqüência de controle (ou seja, promotor ou aperfeiçoador) que 20 não funciona na natureza na regulação do mesmo gene, cuja expressão está atualmente regulando. Em geral, seqüências de ácidos nucleicos não são endógenas à célula ou à parte do genoma na qual se encontram presentes, e foram adicionadas à célula por infecção, transfecção, transformação, mi- croinjeção, eletroporação ou similares. Uma constructo de ácidos nucleicos 25 pode conter uma combinação de seqüência de controle/seqüência de codifi- cação de DNA encontrada na célula nativa.

Como utilizado aqui, o termo "vetor" se refere a uma constructo de ácido nucleico projetada para transferência entre células hospedeiras di- ferentes. Um "vetor de expressão" se refere a um vetor que tem a capacida- 30 de de incorporar e expressar fragmentos de DNA heterólogo em uma célula estrangeira. Muitos vetores de expressão procarióticos e eucarióticos estão comercialmente disponíveis. A seleção de um vetor de expressão apropriado é de conhecimento de um versado na técnica.

Portanto, um "cassete de expressão" ou "vetor de expressão" é uma constructo de ácido nucleico gerada recombinantemente ou sintetica- mente, com uma série de elementos de ácidos nucleicos especificados que 5 permitem a transcrição de um ácido nucleico em particular em uma célula- alvo. O cassete de expressão recombinante pode ser incorporado em um plasmídeo, cromossomo, DNA mitocondrial, DNA plastídeo, vírus ou frag- mento de ácido nucleico. Tipicamente, a parte do cassete de expressão re- combinante de um vetor de expressão inclui, entre outras seqüências, uma 10 seqüência de ácido nucleico a ser transcrita e um promotor.

Como utilizado aqui, o termo "plasmídeo" refere-se a uma cons- tructo de DNA de fita dupla (ds) circular usado como um vetor de clonagem, e que forma um elemento genético autorreplicante extra-cromossômico em muitas bactérias e em alguns eucariotos.

Conforme utilizado aqui, o termo "seqüência de nucleotídeos que

codifica marcador selecionável" refere-se a uma seqüência de nucleotídeos que é capaz de expressão em células e em que a expressão do marcador selecionável confere às células que contêm o gene expresso a capacidade de crescer na presença de um agente seletivo correspondente, ou sob con- dições de crescimento seletivo correspondentes.

Como usado aqui, o termo "promotor" refere-se a uma seqüên- cia de ácidos nucleicos que funciona de modo a direcionar a transcrição de um gene à jusante. O promotor será geralmente apropriado à célula hospe- deira em que o gene alvo está sendo expresso. O promotor, junto com ou- 25 tras seqüências de ácidos nucleicos reguladores traducionais e transcricio- nais (também chamadas de "seqüências de controle") são necessários para a expressão de um dado gene. Em geral, as seqüências reguladoras tradu- cionais e transcricionais incluem, sem limitação, seqüências de promotores, sítios de ligação ribossômica, seqüências de início e parada transcricional, 30 seqüências de início e parada traducional e seqüências de intensificadores ou ativadores.

Um ácido nucleico é "operaveimente ligado" quando é posto em um relacionamento funcional com uma outra seqüência de ácidos nucleicos. Por exemplo, DNA que codifica um líder secretor é operavelmente ligado a DNA por um polipeptídeo se expresso como uma pré-proteína, a qual parti- cipa na secreção do polipeptídeo; um promotor ou intensificador é operavel- 5 mente ligado a uma seqüência de codificação se ela efetua a transcrição da seqüência, ou um sítio de ligação ribossômica é operavelmente ligado a uma seqüência de codificação se está posicionado de forma a facilitar a tradução. Em geral, "operavelmente ligado" significa que as seqüências de DNA que estão sendo ligadas são contíguas, e, no caso de um líder secretor, contíguo 10 e no quadro de leitura. Entretanto, intensificadores não necessitam ser con- tíguos. A ligação ocorre em locais de restrição convenientes. Se tais locais não existem, os adaptadores de oligonucleotídeos sintéticos ou Iigantes ou adaptadores para PCR são utilizados em conformidade com práticas con- vencionais.

Como utilizado aqui, o termo "gene" significa o segmento de

DNA envolvido na produção de uma cadeia de polipeptídeos, que pode inclu- ir ou não regiões que precedem ou que seguem a região de codificação, por exemplo, seqüências "líder" ou 5' não traduzidas (5' UTR) e seqüências "se- guidoras" ou 3' UTR, bem como seqüências interventoras (introns) entre segmentos de codificação individuais (exons).

Em geral, moléculas de ácido nucleico que codificam uma prote- ína original conforme descrição aqui ou uma análoga ou homóloga desta, vai hibridizar sob condições estringentes de moderadas a altas para a seqüên- cia de ácido nucleicos correspondente da proteína fornecida aqui. Entretan- 25 to, em alguns casos, uma nova seqüência de nucleotídeos que codifica a proteína que é empregada possui uma utilização de códon diferente, en- quanto a proteína codificada pela seqüência de nucleotídeos original que codifica uma proteína possui a mesma ou substancialmente a mesma se- qüência de aminoácidos que a proteína nativa. Por exemplo, a seqüência de 30 codificação pode ser modificada para facilitar a expressão mais rápida da proteína original em um sistema de expressão procariótico ou eucariótico em particuiar, em conformidade com a frequência com a qual um códon particu- Iar é utilizado pelo hospedeiro. Te'o et al., FEMS Microbiology Letters 190:13-19, (2000), por exemplo, descreve a otimização de genes para ex- pressão em fungos filamentosos.

Considera-se que uma seqüência de ácidos nucleicos é "seleti- 5 vãmente hibridizável" para uma seqüência de ácidos nucleicos de referência, se as duas seqüências se hibridizam especificamente uma para a outra sob condições de alta estringência e de lavagem de moderadas para altas. Con- dições de hibridização são baseadas na temperatura de fusão (Tm) de uma sonda ou complexo Iigante de ácido nucleico. Por exemplo, "estringência 10 máxima" normalmente ocorre a cerca de Tm-5°C (5o abaixo da Tm da son- da); "alta estringência" a cerca de 5 a 10° abaixo da Tm; "estringência inter- mediária" a cerca de 10 a 20° abaixo da Tm e "baixa estringência" a cerca de 20 a 25° abaixo da Tm.

Funcionalmente, condições de estringência máxima podem ser usadas para identificar seqüências apresentando estreita identididade ou quase-estreita identidade com a hibridização da sonda; enquanto condições de alta estringênica são usadas para identificar seqüências apresentando cerca de 80% ou mais de identidade de seqüência com a fenda.

Condições de hibridização de estringência alta e moderada são 20 bem-conhecidas da técnica (vide, por exemplo, Sambrook et al, MOLECU- LAR CLONING: A LABORATORY MANUAL (2a Edição), Cold Spring Harbor Press, Plainview, N. Y., 1989, Capítulos 9 e 11 , e Ausubel FM et al, CUR- RENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, New York, N.Y., 1993, expressamente incorporados aqui a título de referência). 25 Um exemplo de condições de alta estringência inclui hibridização a cerca de 42°C em formamida a 50%, 5X SSC, %X solução de Denhardt, SDS a 0,5% e 100 pg/mL de DNA veículo desnaturado seguido por duas lavagens em 2X SSC e SDS a 0,5% à temperatura ambiente e duas lavagens adicionais a 0,1 X SSC e SDS a 0,5% a 42°C.

Conforme utilizado aqui, "recombinante" inclui referência a uma

célula ou vetor que foi modificado pela introdução de uma seqüência de áci- do nucleico heteróloga ou que a célula é derivada de uma célula assim modi- ficada. Assim, por exemplo, células recombinantes expressam genes que não são encontrados em uma forma idêntica na forma nativa da célula (não recombinante) ou expressam genes nativos que, de outra forma, seriam ex- pressos anormalmente, sub-expressos ou simplesmente não seriam expres- sos como resultado de intervenção humana direta.

Como usados aqui, os termos "transformado", "estavelmente transformado" ou "transgênico" com referência a uma célula significa que a célula tem uma seqüência de ácidos nucleicos (heterólogos), não nativa, integrada em seu genoma ou como um plasmídeo epissômico que é mantido através de múltiplas gerações.

Como usado aqui, o termo "expressão" se refere ao processo pelo qual um polipeptídeo é produzido baseado na seqüência de ácido nu- cleico de um gene. O processo inclui tanto a transcrição quanto a tradução.

O termo "introduzido" no contexto da inserção de uma seqüência 15 de ácidos nucleicos em uma célula, significa "transfecção" ou "transforma- ção" ou "transdução" e inclui referência à incorporação de uma seqüência de ácidos nucleicos em uma célula eucariótica ou procariótica, em que a se- qüência de ácidos nucleicos pode ser incorporada ao genoma da célula (por exemplo, DNA de mitocôndria, plastídeo, plasmídeo ou cromossomo), con- 20 vertida em uma réplica autônoma ou expressa transientemente (por exem- plo, mRNA transfectado).

O termo "seqüência de sinal" refere-se a uma seqüência de ami- noácidos na parte terminal-N de uma proteína que facilita a secreção da forma madura da proteína fora da célula. À forma madura da proteína celular falta a seqüência de sinal que é clivada durante o processo de secreção.

O termo "célula hospedeira" significa uma célula que contém um vetor e que permite a replicação e/ou transcrição ou transcrição e tradução (expressão) da constructo de expressão. Células hospedeiras para uso na presente invenção podem ser células procarióticas, como E. coli ou células 30 eucarióticas como células de levedura, planta, insetos, anfíbios ou mamífe- ros. Em geral, células hospedeiras são fungos filamentosos.

O termo "fungos filamentosos" significa quaisquer e todos os fungos filamentosos reconhecidos por um versado na técnica. Um fungo pre- ferível é selecionado do grupo que consiste em Aspergillus, Trichoderma, Chrysosporium, Penicillium, Humicola, Neurospora ou formas sexuais alter- nativas destes como a Emericella, Hypocrea.

5 Como usado aqui, o termo "purificação" em geral se refere a

submeter células que contêm ácidos nucleicos ou proteínas à purificação biotérmica e/ou cromatografia em coluna.

Os termos "isolado" e "purificado" conforme são utilizados aqui, referem-se a um ácido nucleico ou a uma proteína dos quais pelo menos um componente aos quais são normalmente associados é removido.

No atual contexto, o termo "polipeptídeo substancialmente puro" significa uma preparação de polipeptídeos que contém no máximo 10% em peso de outros materiais polipeptídicos com os quais a preparação é nati- vamente associada (percentuais mais baixos de outros materiais polipeptídi- 15 cos são preferíveis, por exemplo, no máximo 8% em peso, no máximo 6% em peso, no máximo 5% em peso, no máximo 4% em peso, no máximo 3% em peso, no máximo 2% em peso, no máximo 1% em peso, no máximo 1/2% em peso). Assim, é preferível que o polipetídeo substancialmente puro seja pelo menos 92% puro, ou seja, que o polipeptídeo constitua pelo menos 20 92% do peso total do polipeptídeo puro, e percentuais mais altos são prefe- ríveis, tais quais pelo menos 94% puro, pelo menos 95% puro, pelo menos 96% puro, pelo menos 97% puro, pelo menos 98% puro, pelo menos 99% puro e pelo menos 99,5% puro. Os polipeptídeos aqui descritos se encon- tram preferivelmente em uma forma substancialmente pura. Particularmente, 25 é preferível que os polipeptídeos aqui descritos estejam em uma "forma es- sencialmente pura", ou seja, que a preparação de polipeptídeos seja essen- cialmente livre de outros materiais polipeptídicos com os quais a preparação é nativamente associada. Pode-se conseguir isto, por exemplo, através da preparação de um polipeptídeo por métodos recombinantes bem- 30 conhecidos. Aqui, o termo "polipeptídeo substancialmente puro" é sinônimo de termos como "polipeptídeo isolado" e "polipetídeo em uma forma isolada".

Como usado aqui, os termos "ativo" e "biologicamente ativo" se referem à atividade biológica associada a uma proteína em particular, como a atividade enzimática associada a uma protease. Segue que a atividade biológica de uma dada proteína se refere a qualquer atividade biológica normalmente atribuída àquela proteína por um versado na técnica.

Como usado aqui, o termo "enriquecido" significa que a proteína

original é encontrada em uma concentração maior em relação à concentra- ção de proteína original encontrada em uma composição de celulase fúngica natural ou do tipo selvagem.

Organismos Hospedeiros e Condições de Cultura As células usadas para expressar a EGII modificada, sem que

nenhum método em particular de expressão seja requerido, estão contem- pladas aqui.

A invenção proporciona células hospedeiras que foram transdu- zidas, transformadas ou transfectadas com um vetor de expressão que com- 15 preende uma seqüência de ácidos nucleicos que codifica a EGII modificada. As condições de cultura, tais como temperatura, pH e similares são aquelas previamente utilizadas para as células hospedeiras parentais antes da trans- dução, transformação ou transfecção e serão aparentes para um versado na técnica.

Em uma abordagem, uma célula de fungo filamentoso ou célula

de levedura é transfectada com um vetor de expressão que possui um pro- motor ou um fragmento de promotor biologicamente ativo ou um ou mais (por exemplo, uma série) de intensificadores que funciona na linha celular hospedeira, operavelmente ligado a um segmento de DNA que codifica uma 25 EGII modificada, de modo que a EGII modificada é expressa na linha celular. (i) Fungo Filamentoso

A presente invenção proporciona fungos filamentosos que com- preendem células que foram modificadas, selecionadas e cultivadas de uma maneira eficaz resultando na produção ou expressão da EGII modificada aperfeiçoada em relação ao fungo parental não-transformado corresponden- te.

Exemplos de espécies de fungos filamentosos parentais que po- dem ser tratadas e/ou modificadas para expressão de EGII modificada aper- feiçoada incluem, sem limitação, as Trichodermas, por exemplo, Trichoderma reesei, Trichoderma iongibrachiatum, Trichoderma viride, Trichoderma konin- gii\ Penicillium sp., Humieola sp., inclusive Humieola insolens; Aspergillus sp., Chrysosporium sp., Fusarium sp., Hypoerea sp., e EmerieeIIa sp.

Células que expressam EGII modificada são cultivadas sob con- dições tipicamente empregadas para cultivar a linhagem de fungos paren- tais. Geralmente, as células são cultivadas em um meio padrão que contém sais fisiológicos e nutrientes como descrito por Pourquie, J. et al., Biochemis- 10 try and Genetics of Cellulose Degradation, eds. Aubert, J. P. et al., Academic Press, pp. 71 86, 1988 e llmen, M. et al., Appl. Environ. Microbiol. 63:1298 1306, 1997. As condições de cultura também são padronizadas, por exem- plo, as culturas são incubadas a 28°C em agitadores de cultura ou fermenta- dores até que os níveis desejados de expressão de EGII modificada sejam 15 atingidos.

Condições de cultura preferidas para um dado fungo filamentoso podem ser encontradas na literatura científica e/ou na fonte dos fungos co- mo na American Type Culture Collection (ATCC; www.atcc.orq). Após o esta- belecimento do crescimento fúngico, as células são expostas a condições eficazes para causar ou permitir a superexpressão da EGII modificada.

Nos casos em que uma seqüência que codifica EGII modificada está sob o controle de um promotor induzível, o agente indutor, por exemplo, um açúcar, sal de metal ou antibióticos, é adicionado ao meio em uma con- centração eficaz para induzir expressão em alto nível da EGII modificada.

A presente invenção também contempla o uso de levedura como

célula hospedeira para a produção de EGII modificada. Diversos outros ge- nes que codificam enzimas eletrolíticas têm sido expressos em diversas ce- pas da levedura S. eerevisiae. Estes incluem seqüências que codificam duas endoglicanases (Penttila et ai., 1997), duas celobio-hidrolases (Penttila etal., 30 1988) e uma beta-glucosidase de Trichoderma reesei (Cummings e Fowler, 1996), uma xilanase de Aureobasidlium pullulans (Li e Ljungdahl, 1996), uma alfa-amilase de trigo (Rothstein et al., 1987), etc. Adicionalmente, um casse- te de gene de celulase que codifica a endo-[beta]-1,4-glicanase (END1) de Butirivibrio fibrisoivens, celobio-hidrolase (CBH1) de Phanerochaete chry- sosporium, a celodextrinase (CEL1) de Ruminococcus fiavefaeiens e a celo- biase (BgH) de Endomyees fibrilizer foram expressas com sucesso em uma 5 cepa de laboratório de S. eerevisiae (Van Rensburg et al., 1998).

Constructos de Ácidos Nucleicos/Vetores de Expressão

Fragmentos de polinucleotídeos que codificam uma EGII modifi- cada ("seqüências de ácidos nucleicos que codificam EGII modificada") po- dem ser incorporados aos vetores ou constructos de ácidos nucleicos, capa- 10 zes de introdução e replicação em um fungo filamentoso ou céluia de leve- dura. Os vetores e métodos aqui descritos são adequados para uso em célu- las hospedeiras para a expressão de uma EGII modificada. Qualquer vetor pode ser usado desde que seja replicável e viável nas células nas quais é introduzido. Um grande número de vetores e promotores adequados é co- 15 nhecido por um versado na técnica e estão disponíveis comercialmente. Ve- tores de clonagem e de expressão também são descritos por Sambrook et al., 1989, Ausubel F M et al., 1989, e Strathern et al., 1981, cada um aqui incorporado expressamente a título de referência. Vetores de expressão a- propriados para fungos são descritos por van den Hondel, C. A. M. J. J. etai.

>■- 20 (1991) In: Bennett, J. W. and Lasure, L. L. (eds.) More Gene Manipulations in Fungi. Academic Press, pp. 396 428. A seqüência de DNA apropriada pode ser inserida em uma plasmídeo ou vetor (coletivamente referidos aqui como "vetores") por diversos procedimentos. Em geral, a seqüência de DNA é in- serida em um sítio de restrição de endonuclease apropriado por procedimen- 25 tos padrões. Considera-se que tais procedimentos e procedimentos de sub- clonagem relacionados estão no escopo do conhecimento de um versado na técnica.

Fungos filamentosos recombinantes que compreendem a se- qüência que codifica uma EGII modificada podem ser produzidos pela intro- 30 dução de uma constructo de ácido nucleico heteróloga que compreende a seqüência que modifica a EGII modificada nas células de uma cepa selecio- nada dos fungos filamentosos. Uma vez que a forma desejada da seqüência de ácidos nuclei- cos de EGII modificada, homóloga, variante ou fragmento desta é obtido, ela pode ser modificada de várias maneiras. Quando a seqüência envolver regi- ões acompanhantes de não-codificação, as regiões acompanhantes poderão 5 ser sujeitas a ressecção, mutagênese, etc. Assim, transições, transversões, deleções e inserções podem ser realizadas na seqüência natural.

Uma seqüência que codifica eg/2 modificada pode ser inserida em um vetor adequado de acordo com técnicas recombinantes bem- conhecidas e usadas para transformar fungos filamentosos capazes de ex- 10 pressão de EGII modificada. Devido à inerente degeneração do código ge- nético, outras seqüências de ácidos nucleicos que codificam substancial- mente a mesma seqüência de aminoácidos ou funcionalmente equivalentes podem ser usadas para clonar e expressar EGII modificada. Portanto, deve ser notado que tais substituições nas regiões de codificação se enquadram 15 nas variantes de seqüências cobertas pela presente invenção. Quaisquer e todas essas variantes de seqüência podem ser usadas da mesma maneira que descrita aqui para uma seqüência de ácidos nucleicos que codifica EGII modificada parente.

A presente invenção também inclui constructos de ácido nucleico recombinantes que compreendem uma ou mais das seqüências de ácidos nucleicos que codificam EGII modificada descrita acima. A constructo com- preende um vetor, como um vetor de plasmídeo ou viral, no qual uma se- qüência da invenção foi inserida, orientada direta ou reversamente.

Constructos de ácido nucleico recombinante heterólogo podem 25 incluir a seqüência que codifica uma EGII modificada ou variante, fragmento ou variante splice desta: (i) em isolamento; (ii) em combinação com seqüên- cias de codificação adicionais; como seqüências que codificam peptídeos sinais ou proteínas de fusão, em que a seqüência que codifica a EGII é a seqüência de codificação dominante; (iii) em combinação com seqüências 30 de não-codificação, como introns e elementos de controle, como elementos finalizadores e promotores ou regiões não-traduzidas 3' e/ou 5', eficazes pa- ra a expressão da seqüência de codificação em um hospedeiro adequado; e/ou (iv) em um ambiente hospedeiro e/ou vetor em que a seqüência que codifica a EGII modificada é um gene heterólogo.

Em um aspecto da presente invenção, uma constructo de ácido nucleico, uma constructo de ácido nucleico heterólogo é empregada para 5 transferir uma seqüência de ácido nucleico que codifica EGII modificada em uma célula in vitro, com linhagens de fungos filamentosos e leveduras prefe- ridas estabelecidas. Para a produção de EGII modificada de longa duração e alto rendimento, a expressão estável é preferida. Segue que qualquer méto- do eficaz para gerar transformantes estáveis pode ser usado na prática da 10 invenção.

Vetores apropriados são tipicamente equipados com seqüências de ácidos nucleicos que codificam marcadores selecionáveis, sítios de inser- ção, e elementos de controle adequados, como seqüências de promotores e de terminadores. O vetor pode compreender seqüências reguladoras inclu- 15 indo, por exemplo, seqüências de não-codificação, como introns e elementos de controle, por exemplo, elementos de promotores e de terminadores ou regiões não traduzidas 5' e/ou 3', eficazes para a expressão da seqüência de codificação em células hospedeiras (e/ou em um ambiente de célula hospe- deira ou vetor em que uma seqüência que codifica um antígeno de proteína 20 solúvel modificada não é normalmente expressa), operavelmente ligados à seqüência de codificação. Um grande número de vetores e promotores ade- quados é conhecido por um versado na técnica, muitos dos quais estão dis- poníveis comercialmente e/ou são descritos por Sambrook, et ai, (supra).

Promotores exemplares incluem tanto promotores constitutivos quanto promotores induzíveis, exemplos dos quais incluem um promotor CMV, um promotor prematuro SV40, um promotor RSV, um promotor EF-

1 .alfa, um promotor que inclui o elemento tet responsivo (TRE) no sistema tet-on ou tet-off conforme descrito (CIonTech e Basf), o promotor de beta- actina e o promotor de metalotionina que podem supra-regular através da 30 adição de certos sais metálicos. Uma seqüência de promotor é uma seqüên- cia de DNA que é reconhecida pelo fungo filamentoso em particular para propósitos de expressão. É operavelmente ligada à seqüência de DNA que codifica um polipeptídeo de EGII modificada. Tal ligação compreende o posi- cionamento do promotor no que diz respeito ao códon de início da seqüência de DNA que codifica o polipeptídeo de EGII modificada nos vetores de ex- pressão descritos. A seqüência de promotores contém seqüências de contro- 5 Ie de transcrição e tradução que medeiam a expressão do polipeptídeo de EGII modificada. Exemplos incluem os promotores de Aspergillus niger, A awamori ou genes que codificam glicoamilase, alfa-amilase, alfa-glicosidase de A. oryzae; os genes de gpdA ou trpC de A. niduians; os genes cbhl ou trpl de Neurospora crassa; os genes que codificam a proteinase aspártica 10 de A. niger ou Rhizomucor mieher, T. reesei cbhl , cbh2, egl1 , egl2, ou ou- tros genes que codifiquem celulases.

A escolha do marcador selecionável apropriado vai depender da célula hospedeira, e marcadores apropriados para diferentes hospedeiros são bem-conhecidos da técnica. Genes de marcadores selecionáveis típicos 15 incluem argB de A. niduians ou T. reesei, amdS de A. niduians, pyr4 de Neu- rospora crassa ou T. reesei, pyrG de Aspergillus niger ou A. niduians. Mar- cadores selecionáveis exemplares adicionais incluem, sem limitação, trpc, trpl, oliC31, niaD ou Ieu2, os quais estão incluídos em constructos de ácido nucleico heterólogas usadas para transformar uma cepa mutante tais como 20 trp-, pyr-, Ieu- e similares.

Tais marcadores selecionáveis conferem aos transformantes a capacidade de usar um metabólito que não é normalmente metabolizado pelo fungo filamentoso. Por exemplo, o gene amdS de T. reesei que codifica a enzima acetamidase que permitem que células transformantes cresçam 25 em acetamida como fonte de nitrogênio. O marcador selecionável (por e- xemplo, pyrg) pode restaurara capacidade de uma cepa mutante auxotrófica de crescer em um meio mínimo seletivo ou o marcador selecionável (por exemplo, olic31) pode conferir aos transformantes a capacidade de crescer na presença de um fármaco ou antibiótico inibitório.

A seqüência que codifica o marcador selecionável é clonada em

qualquer plasmídeo adequado usando métodos normalmente empregados na técnica. Plasmídeos exemplo incluem pUC18, pBR322 e pUC100. A prática da presente invenção empregará, a não ser que se in- dique o contrário, técnicas convencionais de biologia molecular, microbiolo- gia, DNA recombinante e imunologia, as quais estão dentro do escopo da técnica. Tais técnicas são inteiramente explicadas na literatura. Vide, por e- 5 xemplo, Sambrook et al., 1989; Freshney, 1987; Ausubel, et al., 1993; e Co- Iigan et al., 1991. Todas as patentes, pedidos de patente, artigos e publica- ções mencionados são expressamente incorporados aqui a título de referên- cia.

Transformação de células hospedeiras A invenção também proporciona células e composições celula-

res que foram geneticamente modificadas de modo a compreender uma se- qüência de ácidos nucleicos que codifica EGII modificada fornecida de ma- neira exógena. Uma célula parental ou linha celular pode ser geneticamente modificada (ou seja, transduzida, transformada ou transfectada) com um ve- 15 tor de clonagem ou um vetor de expressão. O vetor pode estar, por exemplo, na forma de um plasmídeo, uma partícula viral, um fago, etc., conforme des- crição acima.

Diversos métodos podem ser usados para a distribuição de um vetor de expressão em células in vitro. Depois que um vetor adequado é construído, ele é usado para transformar cepas de fungos ou de levedura. Métodos gerais para a introdução de ácidos nucleicos em células para a ex- pressão seqüências de ácidos nucleicos heterólogas são conhecidas por alguém com conhecimento ordinário no assunto. Tais métodos incluem, sem limitação, eletroporação, microinjeção nuclear ou microinjeção em células únicas, fusão de protoplastos bacteriais com células intactas, uso de policá- tions, por exemplo, polibreno ou poliornitina; fusão de membranas com Ii- possomos, transfecção com Iipofectamina ou mediada por lipofecção; bom- bardeamento em alta velocidade com microprojéteis revestidos com DNA; incubação com um precipitado de DNA de fosfato de cálcio; transfecção me- diada por DEAE-Dextrana; infecção com ácidos nucleicos virais modificados e similares.

Métodos para a introdução de constructos de ácidos nucleicos heterólogas (vetores de expressão) em fungos filamentosos (por exemplo, T. reesei) incluem, sem limitação, o uso de uma pistola de genes ou de partícu- las, permeabilização das paredes das células dos fungos filamentosos antes do processo de transformação (por exemplo, pelo uso de altas concentra- 5 ções de álcali, por exemplo, CaCl.sub.2 ou acetato de lítio a 0,05 M a 0,4 M), fusão de protoplastos ou transformação mediada por agrobactéria. Um mé- todo exemplar para a transformação de fungos filamentosos por tratamento de protoplastos ou esferoplastos com polietileno glicol e CaCl.sub.2 é descri- to por Campbell, E. I. et al., Curr. Genet. 16:53 56, 1989 e Penttila, M. et al., 10 Gene, 63:11 22, 1988.

Adicionalmente, constructos de ácidos nucleicos heterólogas que compreendem uma seqüência de ácidos nucleicos que codificam a EGII modificada podem ser transcritas in vitro, e o RNA resultante introduzido em células hospedeiras por métodos bem-conhecidos, por exemplo, por injeção. Seguinte á introdução de uma constructo de ácidos nucleicos

heteróloga que compreende a seqüência que codifica a EGII modificada, as células geneticamente modificadas podem ser cultivadas em meio nutriente convencional conforme apropriado para ativar promotores, selecionar trans- formante ou amplificar a expressão de uma seqüência de ácidos nucleicos 20 que codifica EGII. As condições de cultura como temperatura, pH e simila- res, são aquelas previamente utilizadas para as células hospedeiras selecio- nadas para expressão, e são aparentes para um versado na técnica.

Considera-se, geralmente, que a progênie de células nas quais tais constructos de ácidos nucleicos heterólogas são introduzidas, compre- ende a seqüência de ácidos nucleicos que codifica EGII modificada encon- trada na constructo de ácidos nucleicos heteróloga.

Transformantes novos e úteis de fungos filamentosos como Tri- choderma reesei para uso na produção de composições de celulase são contempladas. A invenção inclui transformantes de fungos filamentosos es- 30 pecialmente fungos que compreendem a seqüência de EGII modificada ou que compreendem uma forma modificada da seqüência que codifica a EGII modificada. Transformantes estáveis de fungos filamentosos normalmente podem ser distinguidos de transformantes instáveis por sua taxa de cresci- mento mais rápida e pela formação de colônias circulares com bordas mais suaves que imperfeitas em meio de cultura sólido. Adicionalmente, em al- 5 guns casos, um teste adicional de estabilidade pode ser feito através do cul- tivo de transformantes em meio não seletivo sólido, seguido por colheita dos esporos deste meio de cultura e determinação do percentual destes esporos que serão subsequentemente germinados e cultivados no meio seletivo. Análise para Seqüências de Codificação de Ácido Nucleico de EGII Modifi- 10 cada e/ou Expressão de Proteína

Para avaliar a expressão da EGII modificada por uma linhagem de célula que foi transformada usando uma constructo de ácidos nucleicos que codificam EGII modificada, ensaios podem ser realizados em nível de proteína, em nível de RNAou através do uso de bioensaios funcionais parti- 15 culares à atividade e/ou produção da endoglicanase.

Em uma aplicação típica das seqüências de proteínas e ácidos nucleicos de EGII modificada descritas aqui, uma cepa geneticamente modi- ficada de fungo filamentoso, por exemplo, Trichoderma reesei, é engenhei- rada para produzir uma quantidade aumentada de EGII modificada. Tal fungo k· 20 filamentoso geneticamente modificado seria útil para a produção de um pro- duto de celulase com capacidade celulolítica aumentada. Em uma aborda- gem, isto é realizado pela introdução da seqüência de codificação de EGII modificada em um vetor adequado, por exemplo, um fungo filamentoso co- mo Trichoderma reesei.

25 Assim, a invenção inclui métodos para a expressão de EGII mo-

dificada em fungos filamentosos ou outros hospedeiros adequados pela in- trodução de um vertor de expressão contendo a seqüência de DNA que codi- fica EGII modificada nas células dos fungos filamentosos ou outros hospe- deiros adequados.

30 Em outro aspecto, a invenção inclui métodos para a expressão

de EGII modificada em fungos filamentosos ou outros hospedeiros adequa- dos. Tais modificações incluem uma diminuição ou a eliminação da expres- são, ou expressão de uma forma alterada de EGII modificada. Uma forma alterada de EGII modificada pode ter uma seqüência de aminoácidos altera- da ou uma seqüência de ácidos nucleicos alterada.

Em geral, ensaios realizados para analisar a expressão de EGII 5 modificada incluem Northern blotting, blotting por pontos (análise de DNAou RNA), RT-PCR (reação em cadeia de polimerase-transcriptase reversa), ou hibridização in situ, usando uma sonda marcada apropriada (com base na seqüência que codifica o ácido nucleico) e Southern blotting convencional e autorradiografia.

Adicionalmente, a produção e/ou expressão de EGII modificada

pode ser medida em uma amostra direta, por exemplo, por ensaios de ativi- dade, expressão e/ou produção da endoglicanase. Tais relatórios são descri- tos, por exemplo, por Shoemaker, S. P. e Brown, R. DJr. (Biochim. Biophys. Acta, 1978, 523:133 146; Schulein (1988) e nas Patentes US 5.246.853 e 15 US 5.475.101 , cada um destes é expressamente incorporado a título de refe- rência. A capacidade da EGII modificada de hidrolisar substratos insolúveis e solúveis isolados pode ser medida pelos ensaios descritos por Suurnakki et al. (2000) e Ortega et al. (2001). Substratos úteis para ensaiar atividades de celobio-hidrolase, endoglicanase ou beta-glicosidase incluem celulose crista- 20 lina, filtro de papel, celulose intumescida com ácido fosfórico, hidroxietil celu- lose, carboximetil celulose, celooligossacarídeos, metilumbeliferil lactosídeo, metilumbeliferil celobiosídeo, ortonitrofenil lactosídeo, paranitrofenil lactosí- deo, ortonitrofenil celobiosídeo, paranitrofenil celobiosídeo, ortonitrofenil gli- cosídeo, paranitrofenil glicosídeo, metilumbeliferil glicosídeo.

A atividade de endoglicanase pode ser determinada utilizando-se

hidrólise de carboximetil celulose (CMC) de acordo com o procedimento de Ghose, 1987, Pure and Appl. Chem. 59: 257-268 ou Wood, T. M., e Κ. M. Bhat, 1988, Methods for measuring cellulase activities. Methods Enzymol. 160:87-112. Em resumo, a atividade de endoglicanase pode ser determinada 30 in vitro utilizando-se CMC como substrato. Diluições apropriadas do caldo de cultura isento de células (atividade extracelular) ou do caldo que contém cé- lulas que foram perturbadas por ultrassom (atividade total) podem ser ensai- adas a 50°C em um tampão de acetato de sódio a 50mM (pH 4,8) contendo CMC de baixa viscosidade (10 g por litro). As reações foram finalizadas por aquecimento em banho de água em ebulição por de 5 a 10 minutos. Açúca- res redutores foram medidos usando um reagente de ácido 3,5-dinitro- 5 salicílico com glicose como padrão. Atividade enzimática (CMCase) é ex- pressa em micromols de açúcar redutor liberado por minuto (em unidades internacionais).

Adicionalmente, a expressão de proteína pode ser avaliada por métodos imunológicos, como coloração imuno-histoquímica das células, sec- 10 ções de tecido ou imunoensaio do meio de cultura dos tecidos, por exemplo, por Western blot ou ELISA. Tais imunoensaios podem ser utilizados para avaliar qualitativa e quantitativamente a expressão de EGII modificada. Os detalhes de tais métodos são conhecidos por um versado na técnica e vários dos reagentes para a prática de tais métodos estão disponíveis comercial- 15 mente.

Uma forma purificada de EGII modificada pode ser usada para produzir tanto anticorpos monoclonais quanto policlonais específicos para proteína expressa para uso em diversos imunoensaios. (Vide, por exemplo, Hu et al., 1991). Ensaios típicos incluem ELISA, imunoensaios competitivos, 20 radioimunoensaios, Western blot, ensaios de imunofluorescência indireta, e similares. Em geral, anticorpos e/ou kits comercialmente disponíveis podem ser usados para imunoensaio quantitativo do nível de expressão das proteí- nas de endoglicanase.

Métodos Para Purificação de uma EGII Modificada Em geral, uma celulase de EGII modificada produzida em cultura

de células é secretada no meio e pode ser purificada ou isolada, por exem- plo, através da remoção de componentes indesejados do meio de cultura de células. Entretanto, em alguns casos, uma celulase de EGII modificada pode ser produzida em uma forma celular que necessite de recuperação a partir 30 de um Iisato celular. Em tais casos, a celulase de EGII modificada é purifica- da das células nas quais foi produzida utilizando-se técnicas rotineiramente empregadas por versados na técnica. Exempios inciuem, sem limitação, cromatografia por afinidade (Tilbeurgh et al., 1984), métodos de cromatogra- fia por troca iônica (Goyal et al., 1991; Fliess et al., 1983; Bhikhabai et al., 1984; Ellouz et al., 1987), incluindo troca iônica usando materiais com alto poder de resolução (Medve et al., 1998), cromatografia por interação hidro- 5 fóbica (Tomaz e Queiroz, 1999) e fracionamento bifásico (Brumbauer et al., 1999).

Tipicamente, a celulase de EGII modificada é fracionada para segregar proteínas que possuem propriedades selecionadas, como afinidade de ligação a agentes Iigantes em particular, por exemplo, anticorpos ou re- ceptores; ou que possuem uma faixa de peso molecular selecionada, ou fai- xa de ponto isoelétrico.

Uma vez que obtida a expressão da celulase de EGII modifica- da, a celulase de EGII modificada assim produzida é purificada das células ou do meio de cultura. Exemplos de procedimentos adequados para tal puri- 15 ficação incluem os seguintes: cromatografia de coluna de afinidade de anti- corpos, cromatografia de troca iônica, precipitação de etanol, HPLC de fase reversa, cromatografia de sílica ou de uma resina trocadora de cátions com DEAE; cromofocagem, SDS-PAGE, precipitação de sulfato de amônio e fil- tração em gel utilizando, por exemplo, Sephadex G-75. Diversos métodos de 20 purificação de proteínas podem ser empregados e tais métodos são conhe- cidos na técnica, por exemplo, por Deutscher, 1990; Scopes, 1982. A etapa ou etapas de purificação selecionadas vão depender, por exemplo, da natu- reza do processo de produção usado e a proteína produzida em particular. Utilidade

Acredita-se que as condições do tratamento para remoção de

bolinhas usadas nos seguintes exemplos são consistentes com aquelas ge- ralmente usadas em remoção de bolinhas. Quando a remoção de bolinhas ocorre em um processo de fabricação típico, o tempo do tratamento para remoção de bolinhas é de cerca de 15 a cerca de 120 minutos; a temperatu- 30 ra do tratamento para remoção de bolinhas é de cerca de 35°C a cerca de 60°C, a razão de solução para tecido é de cerca de 2,5:1 a cerca de 10:1 em peso, e o pH é de cerca de 7,0 a cerca de 9,5. A quantidade de composição de tratamento utilizada para remo- ção de bolinhas depende da concentração da proteína ativa na composição de celulase, da quantidade dos artigos de algodão que estão sendo tratados, e da quantidade do efeito da remoção de bolinhas desejada e do tempo de 5 tratamento e outros parâmetros bem-conhecidos pelos versados na técnica. Quando utilizada para remoção de bolinhas em um processo de fabricação típico, a quantidade preferível de composição de tratamento geralmente está entre cerca de 2.000 e cerca de 100.0000 unidades de CMC de enzimas por quilograma de tecido, e mais preferivelmente, entre cerca de 10.000 e cerca 10 de 40.000 unidades de CMC por quilograma de tecido. Quando usada para remoção de bolinhas em uma lavagem típica, a quantidade preferível de composição de tratamento está em geral, na faixa de cerca de 200 a cerca de 40.000 unidades de CMC de enzima por quilograma de tecido e, mais preferivelmente, de cerca de 1.000 a cerca de 10.000 unidades de CMC por 15 quilograma de tecido.

Uma opção para controlar a ação das enzimas, que é recomen- dável, mas não exigida, é destruir a enzima após o tratamento através do aquecimento da solução a cerca de 70°C por 10 minutos, através da adição de químicos que destroem a atividade enzimática ou através da secagem k 20 imediata do tecido.

Métodos para Tratar Tecido Contendo Celulose Usando Enzimas de Celula- se de EGII Modificada.

Um aspecto desta invenção é uma composição para tratamento de têxtil que inclui a EGII modificada da presente invenção. Em outra moda- 25 lidade, a presente invenção se refere ao uso da EGII modificada da invenção no processo de biopolimento. O biopolimento é um tratamento específico da superfície dos fios que melhora a qualidade do tecido no que diz respeito ao manuseio e aparência. Os efeitos mais importantes do biopolimento podem ser caracterizados por menos fiapos e bolinhas, mais brilho/lustre, manuseio 30 aperfeiçoado do tecido, maciez aumentada e durável e absorbância de água alterada. O biopolimento normalmente ocorre no processamento úmido da fabricação de malhas e panos não tecidos. O processamento úmido com- preende etapas como as de, por exemplo, diminuição de tamanho, areamen- to, alvejamento, lavagem, tingidura/impressão e acabamento. Durante cada uma dessas etapas, o tecido é mais ou menos sujeito à ação mecânica. Em geral, após o pano ser formado em ponto de meia ou tecido, o pano segue 5 para a etapa de desmordentação, seguida por uma etapa de areamento, etc. Desmordentação é o ato de retirar mordente dos têxteis. Antes da tecelagem em teares mecânicos, fios deformados são frequentemente revestidos com amidos ou derivados de amidos para aumentar sua resistência à tração. A- pós a tecelagem, o revestimento de tamanho deve ser removido antes de 10 processamento posterior do tecido para garantir um resultado homogêneo e a prova de água. Sabe-se que para conseguir os efeitos do biopolimento, uma combinação de ação celulítica e mecânica é requerida. Também se sa- be que a "supermaciez" é atingida quando o tratamento com uma celulase é combinado com um tratamento convencional com agentes amaciantes. Con- 15 templa-se que o uso da EGII modificada da invenção para o biopolimento de tecidos celulósico é vantajoso, por exemplo, um polimento mais completo pode ser obtido. O biopolimento pode ser obtido pela aplicação do método descrito em, por exemplo, WO 93/20278.

Conforme notado acima, a presente invenção diz respeito a mé- todos para o tratamento de tecidos que contêm celulose com uma enzima de celulase de EGII modificada. O uso da composição de celulase de EGII mo- dificada dessa invenção fornece o resultado novo e surpreendente de se alcançar um nível relativamente alto de abrasão ao mesmo tempo em que se mantém um nível equivalente de remanchamento se comparado ao trata- mento com celulase do estado da técnica. Como o nível de abrasão atua como um indicador da qualidade e eficácia de técnicas de tratamento com celulase particulares, por exemplo, processo de envelhecimento ("stone- washing") ou lavagem, o uso da presente invenção fornece uma composição para tratamento de têxteis de qualidade surpreendentemente alta. No con- texto da lavagem, refere-se às vezes à abrasão como clarificação de cor, remoção de bolinhas ou biopolimento.

A presente invenção contempla especificamente o uso de celu- Iase de EGII modificada, sozinha ou em combinação com componentes de celulase adicionais, para atingir uma abrasão excelente quando comparada à celulase de EGII enriquecida. Adicionalmente, enzimas de celulase natu- rais que não possuem um domínio Iigante são contempladas como estando 5 dentro do escopo desta invenção. Também se contempla que os métodos da invenção proporcionarão aperfeiçoamentos adicionais aos tecidos contendo celulose, tratados, incluindo aperfeiçoamentos de tato e/ou aparência do te- cido.

A. Metodologia para o Processamento de Têxteis com Composições de Ce- 10 Iulase de EGII Modificada

De acordo com a presente invenção, as composições de celula- se de EGII modificadas descritas acima podem ser empregadas na fabrica- ção de têxteis, por exemplo, remoção de bolinhas, "stone-washing", etc. Pre- ferivelmente, a presente composição para o tratamento compreende uma 15 solução aquosa que contém uma quantidade eficaz de uma celulase de EGII modificada juntamente com outros ingredientes opcionais, por exemplo, um tampão, um tensoativo e um agente de areamento.

Em uma etapa de tratamento de remoção de bolinhas típica du- rante a fabricação de vestuário, tecido ou vestuário, água, tampão, detergen- k 20 tes e enzimas são adicionados a um aparelho de tingidura de jato vertical ou horizontal rotativo, máquina de lavar ou outro dispositivo que forneça agita- ção e cisalhamento ao tecido. O tratamento em geral usa condições nas fai- xas a seguir:

pH 3,5 a 6,0 25 Razão do licor 1:2 a 1:100

Temperatura: 30 a 70°C Dose de enzima: 50.000 a 500.000 U de CMC Tempo: 10 a 60 minutos Velocidade do tecido: 10 a 200 m/minuto 30 Condições alternativas incluem de 15 a 20 minutos a 35°C a

60°C a um pH de 4 a 6,5. A razão de licor para tecido normalmente está en- tre 2,5:1 e 20:1 em peso. A otimização das condições de tratamento é de conhecimento de um versado na técnica. A quantidade de enzima de celula- se adicionada tipicamente corresponde à atividade de células de cerca de

1.000 a 200.000 unidades de CMC por quilograma de tecido, baseado no método de ensaio de Ghose (1987). Após o tratamento, a enzima é frequen- 5 temente destruída por aquecimento da solução a 70°C por 10 minutos. O tecido é removido da máquina, secado, e preparado em rolos, às vezes após uma secagem adicional. Um sumário de publicações que descrevem em mais detalhes os tratamentos com celulase, convencionais, para a remoção de bolinhas de tecidos de algodão durante a fabricação é encontrado na Pa- 10 tente US 5.232.851 na coluna 1. Formulações especificamente contempla- das podem incluir proxel (1,2-benzisotiazolina) como um conservante ou an- tioxidante na faixa de 0,03 a 0,20%. Formulações especificamente contem- pladas podem incluir glicerol na faixa de 10 a 35%.

Para um tratamento de remoção de bolinhas durante uma etapa 15 de lavagem, a celulase é incluída em uma mistura detergente com muitos outros ingredientes. Os outros ingredientes podem incluir outras enzimas, como proteases, Iipases e celulases adicionais, bem como tensoativos, tam- pões, builders, alvejantes, agentes antirredeposição, alvejantes ópticos, an- tioxidantes (por exemplo, proxel) e solubilizadores.

É de conhecimento na técnica que um visual "stone-washed"

(abrasão localizada da cor) em tecido tingido, especialmente em tecido de- nim ou jeans, é possível ou por lavagem do denim ou jeans feito com tal te- cido na presença de pedra-pomes para prover o clareamento localizado de- sejado da cor do tecido, ou pelo tratamento enzimático do tecido, em particu- 25 Iar com enzimas celulíticas. O tratamento com uma EGII modificada da pre- sente invenção pode ser realizado sozinho como descrito na Patente US 4.832.864, juntamente com uma quantidade de pedra-pomes menor do que a requerida no processo tradicional, ou juntamente com perlita conforme descrito no WO 95/09225.

Uma quantidade eficaz de uma composição enzimática de celu-

lase de EGII modificada é uma concentração de enzima de celulase de EGII modificada suficiente para o propósito pretendido. Assim, uma "quantidade eficaz" de celulase de EGII modificada em uma composição de tratamento de acordo com a presente invenção é aquela quantidade que fornecerá o tratamento desejado, por exemplo, lavagem com pedras, remoção de boli- nhas, amaciamento, etc. A quantidade de celulase de EGII modificada em- 5 pregada também depende do equipamento utilizado, dos parâmetros de pro- cesso empregados (a temperatura da solução de tratamento de celulase de EGII modificada, o tempo de exposição à solução de celulase e similares) e da atividade da celulase (por exemplo, uma solução particular vai exigir uma menor concentração de celulase quando uma solução de celulase mais ativa 10 for usada se comparado a uma composição de celulase menos ativa). A concentração exata de celulase de EGII modificada pode ser prontamente determinada por um versado na técnica baseado nos fatores acima bem como nos resultados desejados. Preferivelmente, a composição de celulase de EGII modificada está presente em uma concentração de 1 a 1000 ppm, 15 mais preferivelmente de 10 a 400 ppm e, mais preferivelmente, de 20 a 100 ppm da proteína total.

Opcionalmente, um tampão é empregado na composição de tra- tamento de modo que a concentração do tampão seja suficiente para manter o pH da solução na faixa em que a celulase de EGII modificada empregada ^ 20 exiba atividade que, por sua vez, depende da natureza da celulase de EGII modificada empregada. A concentração exata do tampão empregado vai de- pender de diversos fatores prontamente detectados por um versado na téc- nica. Por exemplo, em uma modalidade preferida, o tampão e a concentra- ção do tampão são selecionados de modo a manter o pH da solução de ce- 25 Iulase de EGII modificada final dentro da faixa requerida para atividade ótima da celulase. Preferivelmente, a concentração do tampão na composição pa- ra lavagem com pedras é de cerca de 0,001 N ou superior. Tampões ade- quados incluem, por exemplo, citrato e acetato.

Além da celulase de EGII modificada e o tampão, a composição 30 de tratamento pode opcionalmente conter um tensoativo. Preferivelmente, o tensoativo está presente nos meios de lavagem diluído em uma concentra- ção maior que 100 ppm, preferivelmente de cerca de 200 a 15.000 ppm. Tensoativos adequados incluem quaisquer tensoativos compatíveis com a celulase e com o tecido incluindo, por exemplo, tensoativos aniônicos, não- iônicos e anfolíticos. Tensoativos aniônicos adequados para uso aqui inclu- em benzenossulfonatos de alquila linear ou ramificada; sulfato de éter alquila 5 ou alquenila que possuem grupos alquila ou grupos alquenila linear ou rami- ficada; sulfatos de alquila ou de alquenila; sulfonatos de olefina; alcanossul- fonatos e similares. Contraíons adequados para tensoativos aniônicos inclu- em íons de metais alcalinos como o sódio e o potássio; íons de metais alca- Iinoterrosos como cálcio e magnésio; íon amônio e alcanolaminas que pos- 10 suem de 1 a 3 grupos alcanol de 2 ou 3 carbonos. Tensoativos anfolíticos incluem sulfonatos de sais de amônio quaternário e tensoativos anfolíticos do tipo betaína. Tais tensoativos anfolíticos possuem na mesma molécula tanto o grupo carregado positivamente quanto o grupo carregado negativa- mente. Tensoativos não-iônicos geralmente compreendem éteres de polioxi- 15 alquileno, bem como alcanolamidas de ácidos graxos superiores ou um adu- to de óxido de alquileno deste e monoésteres de glicerina de ácido graxo. Misturas de tensoativos também podem ser empregadas de maneiras co- nhecidas na técnica.

Em uma modalidade preferida, uma composição de tratamento concentrada pode ser preparada para uso nos métodos aqui descritos. Tais concentrados conteriam quantidades concentradas da composição de celu- lase de EGII modificada descrita acima, tampões e tensoativos, preferivel- mente em uma solução aquosa. Quando assim formulada, o concentrado para tratamento pode ser prontamente diluído com água para preparar, de modo mais rápido e mais preciso, composições de tratamento de acordo com a presente invenção e possuindo a concentração exigida desses aditi- vos. Preferivelmente, tais concentrados compreenderão de cerca de 0,1 a cerca de 50% em peso de uma composição de celulase fúngica descrita a- cima (proteína); de cerca de 0,1 a cerca de 80% em peso de um tampão, de cerca de 0 a cerca de 50% em peso de um tensoativo; com água para ba- lanço. Quando os concentrados aquosos são formulados, esses concentra- dos podem ser diluídos de modo a atingir a concentração adequada dos componentes na solução de celulase de EGII modificada conforme indicada acima. Como é aparente, tais concentrados para tratamento permitirão uma fácil preparação da solução de celulase de EGII modificada bem como per- mitirão transporte exeqüível da concentração até o local de uso. O concen- 5 trado para tratamento pode estar em qualquer forma da técnica como, por exemplo, líquida, emulsão, gel ou pasta. Tais formas são bem-conhecidas por um versado na técnica.

Quando um concentrado para tratamento sólido é empregado, a composição de celulase pode estar na forma de grânulos, pó, aglomerado 10 ou disco sólido. Quando grânulos são utilizados, os grânulos são preferivel- mente formulados de modo a conter um agente protetor da celulose. Vide, por exemplo, WO 91/17235 e o intitulado "GRANULES CONTAINING BOTH AN ΕΝΖΥΜΕ AND AN ΕΝΖΥΜΕ PROTECTING AGENT AND DETERGENT COMPOSITIONS CONTAINING SUCH GRANULES", cujo pedido é aqui in- 15 corporado, na íntegra, a título de referência. Da mesma forma, os grânulos podem ser formulados de modo a conter materiais para reduzir a taxa de dissolução dos grânulos no meio de lavagem. Tais materiais e grânulos são revelados na Patente US 5.254.283, que é aqui incorporada, na íntegra, a título de referência.

k 20 Outros materiais também podem ser adicionados ou utilizados

com a composição de tratamento da presente invenção conforme desejado, incluindo pedras, pedra-pomes, cargas, solventes ativadores enzimáticos e outros agentes antirredeposição.

O tecido que contém celulose é contatado com a composição de 25 tratamento, que contém uma quantidade eficaz da enzima de celulase de EGII modificada, ou derivado, assim aproximando a enzima de celulase de EGII modificada com o tecido. Por exemplo, se a composição de tratamento é uma solução aquosa, o tecido pode ser diretamente encharcado na solu- ção. De maneira similar, quando a composição de tratamento for um concen- 30 trado, o concentrado é diluído em um banho em água com o tecido que con- tém celulose. Quando a composição de tratamento estiver em uma forma sólida, por exemplo, um gel para pré-iavagem ou bastão sólido, a composi- ção de tratamento pode ser contatada pela aplicação direta da composição no tecido ou na solução de lavagem.

O tecido que contém celulose é incubado com a solução de tra- tamento sob condições eficazes para permitir a ação enzimática que confere uma aparência de "stone-washed" ao tecido que contém celulose. Por e- xemplo, durante a "stone-washing", o pH, razão do licor, temperatura e tem- po de reação podem ser ajustados de modo a otimizar as condições sob as quais a composição de "stone-washing" age. "Condições eficazes" necessa- riamente se referem ao pH, razão do licor e temperatura que permitem que a enzima de celulase de EGII modificada reaja eficientemente com o tecido que contém celulose. As condições de reação para a celulase de EGII modi- ficada e, assim, as condições eficazes para as composições de tratamento da presente invenção, são substancialmente similares às dos métodos bem- conhecidos utilizados com outras celulases similares. Assim, as condições eficazes para o tratamento do tecido que contém celulose com uma compo- sição de tratamento que compreende uma EGII modificada de acordo com a presente invenção são substancialmente similares àquelas do estado da técnica e que usam composição de celulase do tipo selvagem. Portanto, está no escopo de um versado na técnica, maximizar as condições para o uso das composições de tratamento de acordo com a presente invenção.

As razões de licor durante o tratamento aqui empregado são em geral uma quantidade suficiente para atingir o efeito desejado no tecido celu- lósico e dependem do processo utilizado. Preferivelmente, as razões de licor são de cerca de 3:1 a cerca de 100:1, mais preferivelmente de cerca de 4:1 25 a cerca de 50:1 e, ainda mais preferivelmente, de cerca de 6:1 a cerca de 20:1.

As temperaturas de reação durante o tratamento com as presen- tes composições de tratamento dependem de dois fatores concorrentes. Primeiramente, temperaturas mais altas geralmente correspondem a cinéti- 30 cas de reação aperfeiçoadas, ou seja, reações mais rápidas, que permitem menores tempos de reação quando comparado aos tempos de reação exigi- dos em temperaturas mais baixas. Assim, as temperaturas de reação gerai- mente são de pelo menos IO0C ou mais elevadas. Em segundo lugar, a celu- lase é uma proteína que perde atividade depois de uma dada temperatura de reação, em que tal temperatura depende da natureza da celulase utiliza- da. Assim, se a temperatura de reação subir demais, a atividade celulítica é 5 perdida como um resultado da desnaturação da celulase. Portanto, as tem- peraturas máximas de reação empregadas aqui são de, em geral, 65°C. Em vista do acima exposto, as temperaturas de reação são de, em geral, cerca de 30°C a cerca de 65°C; preferivelmente de cerca de 35°C a cerca de 60°C e, mais preferivelmente, de cerca de 35°C a cerca de 55°C.

10 Tempos de reação dependem das condições específicas sob as

quais o tratamento ocorre. Por exemplo, pH, temperatura e concentração da celulase de EGII modificada afetarão o tempo de reação ótimo. Em geral, os tempos de reação são de cerca de 5 minutos a cerca de 5 horas, preferivel- mente de cerca de 10 minutos a cerca de 3 horas e, mais preferivelmente, 15 de cerca de 20 minutos a cerca de 1 hora.

Tecidos que contêm celulose tratados com os métodos descritos acima usando composições de celulase de EGII modificada (ou seja, com- posições de tratamento) de acordo com a presente invenção mostraram re- deposição de tinta reduzida, remoção de bolinhas aperfeiçoada e abrasão k 20 intensificada em comparação com o mesmo tecido que contém celulose tra- tado da mesma maneira com uma composição de celulase de EGII endoen- riquecida.

B. Metodologia para o Tratamento de Tecidos que Contêm Celulose com uma Composição Detergente Compreendendo Enzima de Celulase de EGII 25 Modificada.

De acordo com a presente invenção, as composições de celula- se de EGII modificada descritas acima podem ser empregadas como uma composição detergente. As composições detergentes de acordo com a pre- sente invenção são úteis como composições para pré-lavagem, composi- 30 ções para pré-enxágue ou para limpeza com detergente durante o ciclo de lavagem regular. Preferivelmente, a composição detergente da presente in- venção compreende uma quantidade eficaz de celulase de EGII modificada, um tensoativo e, opcionalmente, inclui outros componentes descritos abaixo.

Uma quantidade eficaz de celulase de EGII modificada empre- gada nas composições detergentes desta invenção é uma quantidade sufici- ente para conceder abrasão aperfeiçoada aos tecidos que contêm celulose.

5 Preferivelmente, a celulase de EGII modificada está em uma concentração de cerca de 0,001% a cerca de 25%, mais preferivelmente, de cerca de

0,02% a cerca de 10% em peso do detergente.

A concentração específica da enzima de celulase de EGII modi- ficada empregada na composição detergente é preferivelmente selecionada 10 de modo que na diluição no meio de lavagem, a concentração da enzima de celulase de EGII modificada esteja na faixa de cerca de 0,1 a cerca de 1000 ppm, preferivelmente de cerca de 0,2 ppm a cerca de 500 ppm e, mais pre- ferivelmente, de cerca de 0,5 ppm a cerca de 250 ppm da proteína total. As- sim, a quantidade específica de enzima de celulase de EGII modificada em- 15 pregada na composição detergente vai depender de quanto o detergente vai ser dissolvido em água de modo a formar uma solução de lavagem.

Em concentrações mais baixas de enzima de celulase de EGII modificada, ou seja, concentrações de enzima de EGII modificada menores que 20 ppm, a remanchamento ou redeposição diminuídos com a abrasão 20 de fibra de superfície equivalente em comparação com as composições do estado da técnica ficará evidente após lavagens repetidas. Em concentra- ções mais altas, ou seja, concentrações da enzima de celulase de EGII mo- dificada maiores que 40 ppm, a remanchamento ou redeposição diminuídos com remoção de fibras de superfície equivalente ficará evidente após uma 25 única lavagem.

As composições detergentes da presente invenção podem estar em qualquer forma conhecida na técnica, como por exemplo, diluentes líqui- dos, grânulos, emulsões, géis ou pastas. Tais formas são de conhecimento de um versado na técnica. Quando uma composição detergente sólida é 30 empregada, a celulase de EGII modificada é preferivelmente formulada co- mo grânulos. Preferivelmente, os grânulos podem ser formulados de modo a conter um agente protetor de celuiase. Vide, por exemplo, WO 91/17235 inti- tulado "GRANULES CONTAINING BOTH AN ΕΝΖΥΜΕ AND AN ΕΝΖΥΜΕ PROTECTING AGENT AND DETERGENT COMPOSITIONS CONTAINING SUCH GRANULES". Da mesma forma, o grânulo pode ser formulado de modo a conter materiais para reduzir a taxa de dissolução do grânulo no 5 meio de lavagem. Tais materiais e grânulos são descritos na Patente US 5.254.283, que é aqui incorporada, na íntegra, a título de referência.

As EGII modificadas da presente invenção são úteis na formula- ção de diversas composições detergentes. Numerosos compostos conheci- dos são tensoativos adequados em composições que compreendem a EGII 10 modificada da presente invenção. Esses incluem detergentes não-iônicos, aniônicos, catiônicos e zwiteriônicos, conforme mostrados na Patente US 4.404.128 de Barry J. Anderson e na Patente US 4.261.868 de Jiri Flora et al. Uma composição detergente adequada é descrita no Exemplo 7 da Pa- tente US 5.204.015. A técnica está familiarizada com diferentes formulações 15 que podem ser utilizadas como composições detergentes. Além das compo- sições detergentes típicas, é prontamente entendido que a EGII modificada da presente invenção pode ser usada para qualquer propósito para os quais celulase nativa ou selvagem são utilizadas. As variantes da presente inven- ção podem compreender desempenho aperfeiçoado em uma composição 20 detergente (se comparada ao tipo selvagem). Como utilizado aqui, desem- penho aperfeiçoado em um detergente é definido como um aumento na lim- peza de certas manchas sensíveis a enzimas, conforme determinado por avaliação habitual após um ciclo de lavagem-padrão.

A EGII da invenção pode ser formulada como detergentes em pó 25 e líquidos, conhecidos, tendo pH entre 6,5 e 12,0 em níveis de cerca de 0,01 a cerca de 5% (preferivelmente, 0,1% a 0,5%) em peso. Essas composições detergentes podem incluir também outras enzimas tais como proteases, ami- lases, celulases, lípases ou endoglicosidases conhecidas, bem como buil- ders e estabilizantes.

A adição de EGII modificada da invenção às composições deter-

gentes convencionais não cria qualquer limitação especial. Em outras pala- vras, qualquer temperatura e pH adequados para o detergente também são adequados para as presentes composições desde que o pH esteja na faixa acima, e a temperatura esteja abaixo da temperatura de desnaturação da EGII modificada descrita. Adicionalmente, a EGII modificada da invenção pode ser usada em uma composição detergente sem detergentes, seja sozi- 5 nha ou em combinação com builders e estabilizantes.

A presente invenção também se refere às composições deter- gentes que contêm a EGII modificada da invenção. As composições deter- gentes podem adicionalmente conter aditivos que são comumente utilizados em composições detergentes. Estes podem ser selecionados de, sem Iimita- 10 ção, alvejantes, tensoativos, builders, enzimas e catalisadores de alvejamen- to. Veja, por exemplo, a Patente US 6.268169. Para um versado na técnica, estarão prontamente aparentes os aditivos adequados para inclusão nas composições. A lista fornecida aqui não é de forma alguma completa e deve ser tomada somente a título de exemplo de aditivos adequados. Também 15 será prontamente aparente para um versado na técnica usar somente aditi- vos que sejam compatíveis com as enzimas e outros componentes da com- posição, por exemplo, o tensoativo.

Quando presentes, a quantidade de aditivos na composição de- tergente vai de cerca de 0,01% a cerca de 99,9%, preferivelmente de cerca de 1 % a cerca de 95% e, mais preferivelmente, de cerca de 1 % a cerca de 80%.

Ração Animal

A EGII modificada da presente invenção pode ser incluída na ração animal tal como parte dos aditivos para a ração animal, conforme des- crito, por exemplo, nas Patentes US 5.612.055, US 5.314.692 e US 5.147.642.

Aplicações de Polpa e de Papel

Na indústria de polpa para a fabricação de papel, a EGII modifi- cada da invenção pode ser vantajosamente aplicada, por exemplo, como a seguir:

Para descascamento: pré-tratamento com a EGII modificada po- de degradar a camada de câmbio antes do descascamento em tambores mecânicos, o que resulta em vantajosa economia de energia.

Para desfibração: tratamento de um material que contém fibras celulósicas com a EGII modificada antes do refinamento ou batedura pode resultar na redução do consumo de energia devido ao efeito hidrolisante da 5 celulase na superfície interfibrosa. O uso da EGII modificada pode resultar em economia de energia aperfeiçoada sem comparação com o uso de enzi- mas conhecidas, já que se acredita que a composição enzimática da inven- ção pode possuir uma maior capacidade de penetração nas paredes das fibras.

Para modificação das fibras, ou seja, aperfeiçoamento das pro-

priedades das fibras em que hidrólise parcial da parede da fibra é necessá- ria, a qual requer enzimas de maior penetração (por exemplo, para tornar fibras mais grossas mais flexíveis). Tratamento profundo das fibras ainda não foi possível até o momento para polpas de alto rendimento, por exem- 15 pio, polpas mecânicas ou misturas de polpas recicladas. Isso tem sido atri- buído à natureza da estrutura da parede das fibras, que impossibilita a pas- sagem de moléculas de enzimas devido à restrição física da matriz porosa da parede das fibras. Contempla-se que a presente endoglicanase é capaz de penetrar na parede da fibra.

Para aperfeiçoamento da drenagem. A drenabilidade de polpas

para a fabricação de papel pode ser aperfeiçoada através de tratamento da polpa com enzimas hídrolisantes, por exemplo, celulases. O uso da presente EGII modificada pode ser mais eficaz, por exemplo, resultando em um grau mais alto de feixes soltos de microfibrilas fortemente hidratadas nas frações 25 finas (que consistem em detritos de fibras) que limita a taxa de drenagem pelo bloqueio dos espaços ocos entre as fibras e na malha de fios da máqui- na de papel. A Canadian Standar Freeness (CSF) aumenta e o índice de drenagem de Schopper-Riegler diminui quando a polpa é submetida a trata- mento com celulase, vide, por exemplo, as Patentes US 4.923.565 e US 30 4.613.406.

Para ligação entre as fibras. Enzimas hidrolíticas são aplicadas na fabricação de polpa para a fabricação de papel para aperfeiçoar a ligação entre as fibras. As enzimas limpam as superfícies das fibras de impurezas como, por exemplo, detritos celulósicos, assim aperfeiçoando a área da celu- lose exposta anexada à parede das fibras, assim aperfeiçoando a capacida- de de ligação de hidrogênio entre fibras. A este processo também se dá o 5 nome de "dehornification". Papéis e pranchas produzidos com uma prepara- ção de enzima que contém celulase podem possuir uma resistência aumen- tada ou menor gramatura, uma superfície mais macia e uma imprimibilidade aperfeiçoada.

Para destingimento enzimático. Sabe-se que a hidrólise parcial 10 de papel reciclado durante a polpação através do uso de enzimas hidrolisan- tes como as celulases facilita a remoção e aglomeração de partículas de tin- ta. O uso da presente EGII modificada pode render uma soltura mais eficaz da tinta da estrutura da superfície e, assim, partículas de tintas são soltas de maneira mais eficaz. A aglomeração de partículas de tinta soltas também é 15 aperfeiçoada, devido a uma hidrólise mais eficiente de fragmentos celulósi- cos fixados às partículas de tinta que originam das fibras.

O tratamento de polpa lignocelulósica pode ser realizado, por exemplo, de acordo com o descrito em WO 91/14819, WO 91/14822, WO 92/17573 e WO 92/18688.

Degradação do Material Vegetal

Em ainda uma outra modalidade, a presente invenção se refere ao uso da EGII modificada e/ou uma composição enzimática de acordo com a invenção para degradar material vegetal como, por exemplo, paredes celu- lares.

Contempla-se que a EGII modificada e/ou composição enzimáti-

ca da presente invenção é útil na preparação de vinho ou suco de legumes ou frutas de modo a aumentar seu rendimento. A EGII modificada de acordo com a invenção também pode ser aplicada à hidrólise enzimática de vários materiais derivados de paredes celulares vegetais ou resíduos como, por 30 exemplo, resíduos agriculturais como palha de trigo, espigas de milho, plan- tas inteiras de milho, cascas de nozes, grama, cascos de legumes, cascos de feijão, grãos gastos, polpa de beterraba açucareira, e similares. O materi- al vegetal pode ser degradado de modo a aperfeiçoar diferentes tipos de processamento, facilitar a purificação ou extração de outros componentes, como purificação de beta-glicana ou oligômeros de beta-glicana de cereais, aumentar seus valores nutricionais, diminuir a capacidade de ligação com 5 água, aperfeiçoar a degradabilidade de resíduos de vegetais aquáticos, au- mentar a conversão de, por exemplo, grama e milho em ensilagem, etc.

Na descrição experimental que seguem, as seguintes abrevia- ções se aplicam: eq (equivalentes); M (Molar); μΜ (micromolar); N (Normal); mol (rnols); mmol (milimols); μιτιοΙ (micromols); nmol (nanomols); g (gramas); 10 mg (miligramas); kg (quilogramas); μg (microgramas); L (litros); ml_ (milili- tros); μΐ_ (microlitros); cm (centímetros); mm (milímetros); μΐη (micrômetros); nm (nanômetros); [grau] C. (graus Celsius); h (horas); min (minutos); seg (segundos); mseg (milissegundos); Ci (Curies) mCi (miliCuries); μΟΐ (micro- Curies); TLC (cromatografia em camada fina); Ts (tosila); Bn (benzila); Ph 15 (fenila); Ms (mesila); Et (etila), Me (metila).

EXEMPLOS

A presente invenção é descrita em mais detalhes nos exemplos seguintes, que não têm por objetivo limitar o escopo da invenção conforme reivindicada. As figuras anexadas devem ser consideradas partes integrais 20 do relatório descritivo da invenção. Todas as referências citadas aqui são especificamente incorporadas a título de referência para tudo que é descrito. Os seguintes exemplos são oferecidos a título de ilustração e não de limita- ção da invenção reivindicada.

Exemplo 1 Expressão de EGII

Este exemplo ilustra a constructo de células hospedeiras e ex- pressão da celulase de EGII modificada.

Uma cepa com baixa atividade celulolítica era desejada para aplicações de bioacabamento e lavagem de denim. Novas cepas foram construídas com algumas ou todas as celulases principais deletadas. Vide a Patente US 5.472.864 e WO 92/17574 para técnicas de deleção das celula- ses desejadas, por exempio, CBHi, CBHÍI, EGI e EGII. A cepa hospedeira utilizada foi a cepa de T. reesei RL-P37. A derivação e caracterização desta cepa foi previamente publicada (Sheir-Neiss e Montenecourt, 1984). É uma cepa superprodutora de celulase obtida como resultado de diversas etapas mutagênicas da cepa tipo selvagem (QM6a).

Para a Eg2A de T reesei, seqüências que codificam CBHI, C-

BHII foram inativadas por deleção ou rompimento através de técnicas de genética molecular.

Para a EG2B de T. reesei, seqüências que codificam CBHI, C- BHII, EGI e EGII foram inativadas por deleção ou rompimento através de técnicas de genética molecular.

EG2A e B de T. reesei foram transformadas com uma cópia úni- ca da seqüência de nucleotídeos mostrada na Figura 2 que foi colocada sob o controle do promotor de alta eficiência obtido a partir do gene que codifica CBHI.

Constructo do Cassete de Expressão de EGII

O gene de egl Il foi isolado utilizando PCR com iniciadores de- senhados de acordo com a seqüência de nucleotídeos publicada por Salo- heimo et al, 1988 contendo seqüências específicas do gene eg II. Sítios de restrição foram adicionados ao egl Il para permitir a inserção no vetor pTrex3 20 (vide a Patente US 6426410). Utilizando-se o iniciador de avanço, um sítio de Sac Il foi adicionado. Adicionalmente, os 10 últimos nucleotídeos do pro- motor de CBH1, que precedem diretamente a seqüência sinalizadora de CBH1, foram adicionados já que assim a expressão pode ser aumentada. Utilizando-se o iniciador reverso, um sítio de Asc I foi adicionado. As se- 25 quências de iniciadores de avanço e reverso são mostradas abaixo:

eg H/pnexSF: 5' \ccg^eggj ^tgegeatCj ^tgaacaagtccg^ggctceaty 3" Í3S- SaeH CBHlpRjmtster egOI

$'gfgcgcgc& totA€ttt«ttgcgagaeaegagctga«|f 3' {35-mer)

~V~.................

Asc I f II

A mistura de PCR continha os seguintes componentes: Iniciador de avanço (10μΜ) 1 μι; Iniciador reverso (10μΜ) 1 μΙ_; DNA (500 ng/μί) 1 μι.; dNTPs (10mM) 1 μΙ_; Tampão de Herculase 10Χ; 5 μΙ_ e polimerase de DNA Herculase; 0,5 μΙ_ (Cat Stratagene N0 60026) e água deionizada até um volume total de 50 μΙ_.

O protocolo de PCR foi o seguinte: Desnaturação inicial por 60 segundos a 94°C, 23 ciclos de desnaturação, anelamento e extensão de 30 segundos a 94°C; 30 segundos a 50°C; 90 segundos a 72°C, respectivamen- te e etapa de extensão final de 5 minutos a 72°C.

Os fragmentos de PCR foram analisados por eletroforese em agarose a 1%. Fragmentos com o tamanho esperado foram isolados utili- 10 zando-se o kit de Purificação por Extração em Gel (Qiagene Cat. No. 28706). Os fragmentos de PCR foram clonados em pTrex3 formando pEG2/pTrex3 (vide figuras 5 e 6) e transformados em células de E. coli DH5 alfa de máxima eficiência (Invitrogen No 18258012). A seqüência de nucleo- tídeos do DNA inserido foi determinada (vide Figura 2). pEG2/pTrex3 possui 15 a seguinte seqüência, em que letras maiúsculas denotam os nucleotídeos de plasmídeos de pTrex3 e as minúsculas denotam os nucleotídeos de EG2:

AAGGTTACTA CTACfTCTClS AGCTCTGTAC ATGTÜCGGTC QOGAÜCTAOQ 50

CGTATCOATG GCGCCftOCTG CMGCGGCCS CCTSCftGCCA CTTtSCASTCC 100

OGTGGAATTC TCACGGTGAA TGTAGGCClIf TTGT*«MTA GGÃATTCTGA 150

CTCMeCftCC CCCAACCTCC ATTACGCiSTC CKCCMlSfyS TTCCCMKSCA 2β0

CSTGftGTCATG 8CACTGTTCT OmATAQATT GGGGftGMST UeftCTTCOSC 25 S

CCAOMJCTGA AGGTCGCACA ACCGCATGATi ATABBSTOGS CAAOSGCAAft 300

AAMCACGTG GCTCACCGAA AAGCAftGATG TTTGC&ATOT AACATCCAÕO 35Θ

AftCCTQGATA CATCCftTCftT CACGCACGÂC CACTnmTC TGCTOGTAAA 400

CfCGTASTCS CCCTAftACOS AAGTGCGrTGG TAAKFCf AOi C6TGOGCCCC «5 Ci

TBTOSSfATA CTGCGTOTST CTTCTCTASG SGCCIiSTCTT TTCCCTTCCT 5«

CTAGTGTTGA ATTGTTTGTG TTGGMTCOS ABCTGTAACT ACiCTCTGAAT 5S0

CTCTGGAGAA TQGroGACTA ACGACTACCO TGCACCTGCA TCftTGTATAT 6 OOi

AATAeTGATC CTdAOAAOSG GGGTTrSGAS CftATGTOGQA CTTTGATGGT βδΦ

CATCAAAC1A AGAACGAAGA CGCCTCTT1T GCAftAGTTXT GTTTCGGCTA 700

CGGTGAAGAA CTQGATACTT GTTGTQTCTT CTGTGTATTT TTOTOGCAAO 750

AA0M3CCAG ASACAATCTA TTCMACACC MGCTTOCTC TTTTQAGCTA 800

maWÉró TGGGGTATAT ATCTAGAGrT GTõAftGTCOG TAATCCCGCT 850

GTATAGTAAT ACGAGTCGCA TCTAAATACT CCOAAGCTCC TGCGAACCOG SOO

GAGAATOSAG ATGTGCTGGA AASCTTCTAS CGASCOlCffA: AATTAG CATG SSG

MliGGCTATG AGAAATTCTG SAGAOSSCfT GTTGAATCAr GGCGTTCCAT 1000

TCTTCGftCAA GCAAAGCGTT ÍCGTCGCWST AGCAGGCACT CATTCCCGAA IOSO

AASACTCOGA GATTCCTAAG TAGCGATGGA ACCtXJAATAA TATAATAGGC 1100

AATACATTdA GTTGCCTCGA CGCTTSCAM GCAGGGGTAC TGAGCTTGGft IlSO

CftTAACTGTT CCGTACCCCA CCTCTTCTCA ACCtTTGflCG TTTCCCTGAT 220«

TCftSCSTACC CGTACAAGTC GTAATCACTA TTAACCCAQA CTGACCGGAC 125#

GTenrrccc. CTTOiTTTGG AGSAATAATG TCATTGCGAT GTGTAATTTC 13 SO

OCTSCTTGAC eSAerSSegiC TGTTÇSaSM? CCGftATGTAG GATTGTTATC U 50

CdACTCTGC TCGTAtiAGGC ATGTTGTGAA TÇTGTQTCGG GCAGGACAOS 1400

CCfCGAAGST TCfcOGGCAAG GGAAACCACC GATAGCAGTG TCTAGTAGCft M50

ACCTeTAAAS CCSCftftTGCA GCATCACTGG AAAATACAAA CCAATGGCTA LSftO

AAAGTACftTA AGTTAATGCC TAAAGAAOTC ATATACCAGC «GCTAATAAT ISSO

TSmCAATCft AGTGGCTAAA CGTACCOTAA TTTGCCmOG GGTTeTSeSe 1600

TTCCftSAAGC AftCSGCAAAG CCCCACTTCC CCACGTTTGT TXCSTCftCfC 3.650

^tCCAATClv CAGCTOGfGA TCCeCCAATT GGGTCCCTTG TW^TTCCSQ 1700

TGAAaTGAAft GAftSACAGAG GTAAOAAT6T CTGACTCGGA GCGTmGCA. 17SO TACAACCAAG OGOtGTGATG TATTTAGCCA GOGATGCTTG ATfl1QGRCGIlA TACTtSTATAe TGTAAAGTOS GCACTGAACA TCTCGGGCCC TOGQGCCTTC GCAAA.TGCAA. AGTCTGGTAG GCTGAGGOTA TGTGATAOGC ATAGAAAGAG AAGCTTAGCC TAAACGGAAT GAGCTAGTAG TTOfiAGGTCC GTGCCTCCCT ATCCTCCftGO AGACTTGTAC TCAACCJGCGG ACTGCGCATC gcagcgtcca taqtstatgg ccagtgtgga ggtattggtt cagcttgtfce gaceetcaafc actaçtatca ccacttcgac cagggctacc tcaaeaaget gatttgccgg cgttaacatc tgagt&cect tgtttectgg

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QAASGÍieACT CGGTTCTGAC AftCCATGiCTC CGCAAASOCG GTeCCSTCTT 5 300

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OT3CGCGATA TCMSTQCiATC CGSGGAQCCG GCGATTCCftft ATATCftftftGft 6100

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CGCATCTCCft ΟΑΑίΙΤββΑΑΪ TACXKfiAfGS AGTACfCPTSA QffiAATGGGQS 6200

GaSGCTGAAG JWSAftGGCCGG fi»SSftfcCT© GàCGCOVKIft T<SCGCOGftT 6250

TACGCCTACC GCTCSCGGTAC GGCATGAC® GTTCCOGTAC TATGGGmTe 6 3 Ofl

CCTCTtSTGAT CftACCTGCTG GAtTTCMISft GOGTGGTTGT TCCGGtfftOC 63 SO

TTTGCGGATA ASftACATCBA TAAGAAfflWF GAGAGTTtGft AiGGCGGfiAS 64 00

TGAGCTTGAT GCCCTCGTGC Μ^ΑΑβΑβΤΑ TGATCOGGftG GCGTACCATG 64 SO

GGGCACCGGT iTGCAGTOCAG GOTAtOGSfcC GGAGACTCMJ TGAAGAGAiGC 6500

ACGTTGGOGA TTGCAGAGGA Α6Τβ3ββΜ3 TTGETITOSftA ATGTGGTGAC 6 *>5 Q

TCCATAGCTA ATAAGTGTCA. GATAGOATT TGCftCAftBAA ATCAATACCA 6600

GCAACTGTAA ATAAGeGCTG Aft@®@BW3ÇMP ODCAT0CTAC SAAAGAGCftS «650

AftAAAAACCT GCCGTftGAAC CGftAGAGATft lKSWmroCfT CCATCTCTCA 67 0Θ

ΑΑΰβΛΑβΑΑ? CCCTTCAGGG iTTGCGTTTCC AGTCfJMSftCA CGTATAAOGG 6750

CftCftAGTGTC TCTCACCAftA iTGGGTTftTAT CTCAAATGfG ATCTAAOGiVF 6800

GOAMOCCCA GftATATCGAT CGCGCGCAQA TCCATATAfA GGCCCCOGGt 68 50

TftTAftTTACC TCAGGTCGAC GTCiCCATGOC CATTCQAATTi CGTAATGATG S 9 00

OTCSBEAQCTG TTTCCTGTGT GAftATTGTTA TCeGCTCACA ATTCCACACA 6950

ACATACGAGC CÇGAAGCATA AftGTGTAAAil CCIOTGGfGÇ CTftftiTGftGTG 7 0 OO

AGCTAACTCft CATTAATTGC GTfGCGCTCA CTGCCCGCfT TÇÇftGTOGGG 7050

AAACCTGfCG TGCCAGCTGC AiTAATGAftT CGGCCmCGC 60GGGGM»G 710C

GCGGtTTGCG TArTOGGOGC TCfTOOSCTC CCTCGCTCRC TGACTCGCTC TlSO

>■ - ΟβΟΤΟΘβΤΟΘ TTCGGCTSCG 6CGAG€GGTA TCAGCTCaCT CaaaGGCGG1T 7200

JULTACGtòTZA TCCACAGAAT CAGSSSATikA CGCAGGftAftG AACATGTOftS 7250

CftAAftQfGCCft GCAAAAQGCC AGGMCOSTft AAA&GGCCOe GTTGCT8GCG 7300

TWTTCCATA GGCTCCGCCC CCCTlftCGftG CATCACftAAft ATCGACGGfC 7350

AAGTCA0AGG TOGCGAAACC 0GACIW3GACT ATAAAjGATAC CAGGCGTTTÇ 7400

OGCClGeAAG CTCCCTWG CSCTCTCCTe TTCCGACCCT GCOGCTTACC 7450

GkSftTAECFGT CCGCCTTTCT CCCTTCGGGft AGCGTGGCGC TTTCTCftTAG 7500 CTCftOGCTGT AiSGTATCTCft GTTOSeWSTA GGTCGTTCGe TCCAAGCTGG

GCWKiTGCA CGAACCCCCC GTTCWCCCS ACOGCTGCGC ÇFTATCCGGT ?600

AACTATCG1'C TTGAGTCCAA CCOSSTMwa CftOSACTTAT CSCCACTGGC 7650

AGCAGCCACT GGTAACAGGA TTAGCftGAGC GAGGTATGTA GGCGGTGCTA 7700i

CAOA0TTCTT GAAGTGGTOG CCT»eTB,03 GCTACACTAG AAGAACAGTA 77Sfi

TTtGGTATCT GOSCTCH3C7 GAAGCCAGTT ACCTTCOGAA AAAGAOtTGG^ 7800

TAGCTCTTGA, TCCGGCAAAC AAACCACCGC TGGTAGCGGT GGTTTTfTfG 78S0

TTTGCAAGCA GCAGATTAOG CGCAOMAAA AAGGATCTCA AGAAfiATCCT 7900

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O vetor de expressão que contém o gene de egl Il de T. reesei, pEG2/pTrex3 (vide Figuras 5 e 6) foi digerido a fim de confirmar o tamanho correto de inserção. DNA de plasmídeo de um clone correto foi digerido com 5 Xbal para liberar o cassete de expressão que inclui cbhl promotor-eg/ ll-cbhl terminador-amdS. Esse cassete de 6 kb foi purificado por extração em aga- rose e transformado em T. reesei para render uma cepa referida por Eg2 B.

Métodos para a transformação de T. reesei com DNAde plasmí- deo adicionado de maneira exógena foram publicados (Penttila et al., 1986; 10 Gruber et al., 1990; Smith et al., 1991). Transformantes estáveis surgem da integração de DNA de plasmídeo nos cromossomos do hospedeiro. A inte- gração pode ocorrer em sítios do genoma que possuem homologia com uma região do DNA de plasmídeo ou pode ocorrer em sítios não-homólogos. Exemplo 2

Caracterização Bioquímica de Produtos de T. reesei Enriquecidos com EG2

O seguinte exemplo detalha como a EGII foi recuperada e carac- terizada.

EG2 B de uma cepa de T. reesei produziu uma EG2 modificada que foi cultivada em fermentadores por métodos conhecidos da técnica, o sobrenadante foi recuperado e concentrado utilizando-se métodos conheci- dos por um versado na técnica. O produto sobrenadante, a EG2 (EG2 B) modificada e IndiAge® Max L (EG2 A) foram concentrados para que tivessem a mesma quantidade de proteína de EG2. IndiAge® Max Lea EG2 modifica- 5 da foram formuladas ou com sorbitol a 13%, benzoato de sódio a 1,35% ou com glicerol a 13%, benzoato de sódio a 1,35%.

IndiAge® Max L foi formulada para proteína 124 g/L de proteína (correção por difusão A 280 nm). Resultados da densitometria (Amersham Biosciences) de um gel de SDS-PAGE indicaram que o componente princi- 10 pal deste sobrenadante era proteína de EG1 a 35% e de EG2 a 50%. A EG2 modificada foi formulada para proteína 78 g/L (correção por difusão A 280 nm). A densitometria (Amersham Biosciences) mostrou que este produto continha 96% de proteína EG2. Quando concentradas para conter a mesma quantidade de proteína de EG2, descobriu-se que IndiAge® Max Lea EG2 15 modificada tinham uma atividade de endoglicanase similar com base em um ensaio de CMC/DNS. IndiAge® Max L e EG2 modificada foram dosadas em atividade de CMC em testes de aplicações de bioacabamento e lavagem de denim (descritos abaixo).

Ensaio proteico - Corrigido por difusão A 280 nm é baseado na absorção intrínseca de proteínas devido à presença de aminoácidos aromá- ticos em suas composições (principalma ente tirosina e triptofano). Uma de- terminação mais precisa de se absorbância está com a correção por difusão devido à possível presença de substâncias interferentes na amostra.

Use uma cubeta de quartzo de 3 mL, adicione 3 mL de água Mi- 25 IiQ. Autozerar um espectrofotômetro de UVA/is (Perkin Elmer Lambda 35 ou Cary3) com um intervalo de dados de 1 nm, velocidade de escaneamento de 120 nm/min e corte de 0,5 nm). Diluição da amostra tal como com adição de 100 μί. em 3 mL de água renderá um A280 que ficará com entre 0,04 e 0,2 unidades de absorção. Adicione 100 μί da amostra diluída e misture. Esca- 30 near por um comprimento de onda de 650 a 250.

Correção por difusão foi realizada extrapolando a relação linear entre o logaritmo da absorbância observada vs. o logaritmo do comprimento de onda.

Concentrações foram calculadas considerando-se uma absor- bância molar de 0,94 AU M'1 cm "1 (calculada pelo software Vector NTI base- ado em uma seqüência de EG2). Espectros foram operados em triplicata em diluições diferentes.

Análises densitométricas foram feitas utilizando-se um instru- mento de escaneamento de imagens (Amersham Bioscience) e a análise em GeMD foi realizada utilizando o software ImageQuant TL v2005 (Amersham Bioscience).

Exemplo 3

Desempenho de Biopolimento

Este exemplo descreve diferenças na retirada e remoção de bo- linhas das superfícies das fibras que são encontradas quando produtos de celulase com uma composição diferente estão sendo usados em tecidos de 15 acabamento que contêm fibras celulósicas. Especialmente, este exemplo descreve que uma endoglicanase de EGII modificada tem uma remoção de fibras de superfície aperfeiçoada em comparação com a celulase de EGII endoenriquecida (IndiAge® Max L, da Genencor, Palo Alto, Califórnia).

Estas composições de celulase foram testadas quanto à capaci- dade de remover fibras e bolinhas da superfície de tecidos que contêm fibras celulósicas.

Especificamente, amostras de tecidos (malha de algodão esco- vado; um "interlock" de 100% de algodão fabricado por Intertex LLC (Garden grove, Califórnia), pintadas com azul real reativo e com um dos lados esco- 25 vados, foram tratadas em um aparelho de tingimento a jato Thies "mini-soft" (3 kg) (Thies, Coesfeld, Alemanha; www.thiestextilmaschinen.de) sob as se- guintes condições:

Tampão pH 5: diidrato de citrato de sódio (1 g/L e mono-hidrato de ácido cítrico (0,8 g/L)

Solução: 30 L de água

Tecido: 3 kg ± 0,1 kg

Razão do licor 1:10 (1 kg de tecido em 10 litros de água) Temperatura: 60°C

Dose enzimática: 113.176 ou 213.579 ou 318.830 unidades de

CMC

Tempo: 30 minutos 5 Velocidade do tecido: 100 m/minuto

Após o tratamento enzimático, a enzima foi desativada através da adição de 1 g de carbonato de sódio/L, elevando o pH a um valor maior que 9 a 60°C por 5 minutos. O tecido foi lavado duas vezes com 30 L de á- gua e secado em uma secadora doméstica.

10 A quantidade de bolinhas e fibras na superfície do tecido presen-

tes no tecido tratado foi quantificada através de pelo menos um de dois mé- todos (normalmente ambos). O primeiro método usou um videômetro, Vide- ometerLab 2 Image Analyser System (Videometer, Horsholm, Dinamarca; www.videometer.com). O analisador de imagens é equipado com um softwa- 15 re que quantifica a quantidade de bolinhas e fibras na superfície do tecido. Alternativamente, a quantidade de fiapos na superfície do tecido pode ser quantificada visualmente (por exemplo, método de teste ASTM D3512-02).

Resultados do videômetro são apresentados abaixo na Tabela 1. Veja também a Figura 7. Afigura 8 compreende fotos dos tecidos que foram k 20 tratados com a mesma atividade de enzimas de celulase que o utilizado para a avaliação visual.

Tabela 1 - Quantificação das fibras na superfície do tecido

Dose de enzimas de IndiAge® Max EGII modificada celulase (U) 113.176 5,51 5,66 213.579 6,07 6,16 318.830 6,34 6,52 Os valores da tabela expressam a quantidade de fibras na su- perfície do tecido. Quanto maior o número, menor a quantidade de bolinhas

25 e fibras na superfície do tecido.

Esses resultados indicam que a celulase de EGII modificada re- move pílulas e fibras na superfície do tecido (fiapos) mais eficazmente que a celulase IndiAge® MAX quando a mesma quantidade de unidades ativas é dosada em um processo de bioacabamento conforme descrito acima. Exemplo 4

Desempenho de Abrasão de Denim Esse exemplo ilustra as propriedades de acabamento de denim

aperfeiçoadas de uma composição de processamento têxtil com EGII modifi- cada. Um aumento no nível de abrasão é obtido quando se trata o tecido de denim com a composição de processamento têxtil com EGII modificada em comparação com a IndiAge® Max L sob as seguintes condições.

IndiAge® Max L e EG2 modificada foram comparadas em pro-

cesso de bioenvelhecimento de denim em uma lavadora de alto cisalhamen- to.

Pernas de denim foram tratadas com a IndiAge® Max Lea EG2 modificada em doses de 2.500, 5.00, 10.000 e 20.00 unidades de CMC por litro sob as seguintes condições:

Equipamento: Unimac (lavadora de carregamento frontal de 22,68 kg (50 libras))

Substratos de denim: 12 de tamanho reduzido (6 pernas de de- nim com fundo de enxofre/tingidas de índigo + 6 pernas de denim 100% tin- gidas de índigo como lastro) de Cone Mill

Enzimas: EG2 modificada e IndiAge® Max La 10138 unidades de CMC/g e 11674 unidades de CMC/g, respectivamente. Ambas formuladas com sorbitol a 13% e benzoato a 1,35%.

Razão da solução: 10:1 (3 kg de denim em 30 L de tampão)

pH: 5,0 + 0,1 (ajustado com tampão de ácido cítrico/fosfato dis-

sódico (DSP))

Temperatura: 55°C

Tempo de tratamento: 60 minutos

Duas lavagens com água seguidas pelo tratamento enzimático Para quantificar os níveis de remanchamento e abrasão após o

tratamento com celulose, 8 leituras de reflectômetros de cada perna de de- nim foram tomadas utilizando-se Chroma Meter CR-200 de Minolta. Qantifi- cação das performances de remanchamento e abrasão são expressas u- sando-se a coordenada CIELAB(-b*). Valores de CIE L* foram utilizados pa- ra quantificar a abrasão e CIE b* absoluto foi usado para quantificar o re- manchamento (CIE L*: quanto maior o valor de L*, maior a abrasão; CIE lb*l: 5 quanto maior o b* absoluto, maior o remanchamento).

Tabela 2. Comparação de A eB quanto à abrasão e remanchamento no de- nim.

Abrasão (CIE L) Remanchamento (CIE Lb*l) Dose μ/L (CMC IndiAge® EGII modifi¬ IndiAge® EGII modifi¬ U/L) Max L cada Max L cada 2.500 27,33 27,56 9,36 9,39 5.000 28,08 28,32 10,1 9,56 10.000 29,26 29,69 9,93 9,93 20.000 30,51 31,27 10,37 10,17 Esses resultados mostram que a composição de processamento de têxteis com EGII modificada possui propriedades abrasivas aperfeiçoadas em comparação com uma composição de processamento de têxteis com EGII endoenriquecida.

Entende-se que os exemplos e modalidades aqui descritas têm propósitos ilustrativos somente, e que várias modificações e mudanças se- rão sugeridas a versados na técnica e devem ser incluídas no espírito deste 15 pedido e no escopo das reivindicações em anexo. Todas as publicações, patentes e pedidos de patente aqui mencionados são incorporados, na ínte- gra, a título de referência para todos os propósitos.

Claims (26)

1. Celulase obtenível ou derivada de Trichoderma sp., que com- preende uma seqüência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO:1

2. Composição que compreende uma celulase conforme definida na reivindicação 1, ou um derivado desta que possui uma identidade de se- qüência de mais de 95%.

3. Composição, de acordo com a reivindicação 2, em que tal ce- lulase possui uma similaridade de seqüência de pelo menos 97%.

4. DNA isolado que codifica a celulase como definida na reivindi- cação 1.

5. DNA isolado compreendendo SEQ ID NO:2.

6. Vetor de expressão compreendendo o DNA como definido rei- vindicação 4.

7. Vetor de expressão compreendendo o DNA como definido na reivindicação 5.

8. Célula hospedeira transformada com o DNA como definido na reivindicação 4.

9. Célula hospedeira transformada com o DNA como definido na reivindicação 5.

10. Método para expressar uma celulase que compreende: (a) transformar um micro-organismo adequado com DNA que codifica uma seqüência de aminoácidos de como definida na reivindicação 6 ou 7; (b) preparar um caldo de fermentação que contém tal micro- organismo adequado sob condições adequadas para a expressão do dito DNA; (c) manter o dito caldo de fermentação por um tempo e sob as condições que permitam a expressão de uma quantidade desejada da dita celulase; e (d) coletar o dito caldo de fermentação, o qual contém a dita ce- lulase.

11. Composição detergente compreendendo a ceiulase como definida na reivindicação 1, 2 ou 3.

12. Método para o tratamento de têxteis compreendendo conta- tar o dito têxtil com a celulase como definida na reivindicação 1,2 ou 3.

13. Método para o tratamento de polpa baseada em celulose, que compreende contatar a dita polpa baseada em celulose com a celulase como definida na reivindicação 1, 2 ou 3.

14. Método para o tratamento de tecidos que contêm celulose com celulase compreendendo as etapas de: (a) contatar tal tecido que contém celulose com uma composição de tratamento que compreende uma quantidade eficaz de uma celulase de EGII modificada; e (b) incubar tal tecido que contém celulose em contato com a dita celulase de EGII sob condições eficazes para o tratamento do dito tecido.

15. Método, de acordo com a reivindicação 14, em que tal tecido que contém celulose compreende um tecido que contém algodão.

16. Método, de acordo com a reivindicação 15, em que o dito tecido que contém algodão compreende denim tingido.

17. Método, de acordo com a reivindicação 14, em que tal com- posição de tratamento compreende celulase de EGII modificada ou derivado de celulase de EGII modificada em uma concentração de cerca de0,1 a cer- ca de 1.000 ppm da proteína total.

18. Método, de acordo com a reivindicação 14, em que a dita composição de tratamento compreende celulase de EGII modificada ou deri- vado de celulase de EGII modificada em uma concentração de cerca de0,2 a cerca de 500 ppm da proteína total.

19. Método de acordo com a reivindicação 14, em que a dita ce- lulase de EGII modificada é derivada de um micro-organismo o qual é um fungo ou bactéria.

20. Método de acordo com a reivindicação 19, em que o dito fungo é Trichoderma sp.

21. Método, de acordo com a reivindicação 20, em que a dita Trichoderma sp. é Trichoderma longibracniatium.

22. Método, de acordo com a reivindicação 14, em que o dito método para tratamento compreende lavagem com pedras do tecido que contém celulose e tal composição de tratamento compreende uma composi- ção para lavagem com pedras.

23. Método, de acordo com a reivindicação 22, em que o dito tecido que contém celulose é colorido.

24. Método, de acordo com a reivindicação 23, em que o dito tecido colorido é denim tingido.

25. Método, de acordo com a reivindicação 14, em que tal méto- do para tratamento compreende lavar o tecido que contém celulose e tal composição de tratamento é uma composição detergente que compreende um tensoativo.

26. Método, de acordo com a reivindicação 25, em que o dito tensoativo compreende alquil fenois etoxilados ou álcoois não-iônicos etoxi- lados.