JP3661995B2 - 放線菌類により産生されるセルラーゼとその産生方法 - Google Patents
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Description
【０００１】
関連出願の説明
本出願は１９９７年１１月１９日に出願され、ここに完全に引用される、米国特許出願第０８／９７４０４２号の一部継続出願である。
【０００２】
発明の背景
A.技術分野
本発明は、放線菌類により産生し得るセルラーゼ組成物、そのようなセルラーゼの産生方法およびそのようなセルラーゼの使用に関するものである。本発明はさらに、例えば、洗剤組成物の添加物として、セルロース含有織物および繊維のようなテキスタイルの処理において、動物用飼料の添加物として、ベーキング(baking)の加工助剤として、パルプおよび紙の処理において、および高フルクトースのコーンシロップまたはエタノールの産生のためのでんぷんの処理において、セルラーゼを加えると利点があると従来技術において知られている組成物中の新しいセルラーゼの使用に関するものである。
【０００３】
B.技術の背景
セルラーゼは、セルロース中のβ―D―グルコシド結合を加水分解できる酵素である。セルロース分解酵素は従来、３つの主要種：エンドグルカナーゼ、エキソグルカナーゼまたはセロビオヒドロラーゼ、およびβ―グルコシダーゼ（Knowles,J.et al.,(1987),TIBTECH5,255-261）；に分類され、多数の細菌、酵母および真菌によって産生されることが知られている。
【０００４】
セルロース分解酵素の使用に関して発達してきた方法の中で重要なものは、（生物）エタノール産生のための（木）セルロースパルプの糖への分解、‘ストーンウォッシング’および‘バイオポリッシング’のようなテキスタイルの処理、および洗剤組成物におけるものを含む方法である。従ってセルラーゼは、汚れの除去、すなわちクリーニングのための洗剤組成物に有用であることが知られている。例えば、英国特許出願第２０７５０２８号、同第２０９５２７５号および同第２０９４８２６号は、洗剤がセルラーゼを含むとクリーニング効果が改善されることを示している。さらに、英国特許出願第１３５８５９９号は、綿含有織物の手触りの粗さを減じるために洗剤中にセルラーゼを使用することを説明している。
【０００５】
テキスタイルの処理におけるセルラーゼの別の有用な特徴は、色をより鮮やかにすることによって使用した織物を回復させる能力である。例えば、綿含有織物を繰返し洗うと織物が灰色の色合いになるが、これは機械的作用によって引き起こされる、時に“ピル（pills）”と称される分断されて乱雑になった小繊維によるものと考えられている。この灰色の色合いは、特に色のついた織物で目立つ。したがって、繊維の乱雑な一番上の層を取り除き、ゆえに織物の全体的な外観を改善できるというセルラーゼの能力は、有用である。
【０００６】
セルラーゼの主な用途である洗剤は、一般にアルカリ性条件下で作用するので、セルラーゼはpH７からpH１０までで優れた活性を有することが強く必要とされる。フミコラインソレン(Humicola insolens)およびトリコデルマリーセイ(Trichoderma reesei)からのような特徴のある真菌類のセルラーゼは、中性から低いアルカリ性のpHまでで十分に作用する。さらに、高アルカリ性pHでセルラーゼ活性を示す多くの酵素は、例えば国際特許出願公開第WO９６/３４０９２号および同第WO９６/３４１０８号に示されているように、バチルス属(Bacillus)および他の原核生物から単離されている。従って、真菌性および細菌性セルラーゼのどちらも、徹底的に研究されてきた。しかしながら、放線菌類から単離される、セルラーゼの第３グループは、少し注意を引いただけである。Wilson et al.,Critical Reviews in Biotechnology,Vol.12,pp.45-63(1992)は、サーモモノスポラフスカ(Thermomonospora fusca)、サーモモノスポラカーバタ(Thermomonospora curvata)、およびミクロビスポラビスポラ(Microbispora bispora)から産生したセルラーゼを研究し、これらのセルラーゼの多くが広い範囲のpH特性およびすぐれた温度安定性を示すことを説明した。同様に、Nakai et al.,Agric.Biol.Chem.,Vol.51,pp.3061-3065(1987)およびNakai et al.,Gene,Vol.65,pp.229-238(1988)は、アルカリ性の最適pHおよび優れた温度安定性を有するストレプトミセス(Streptomyces)菌株のKSM−９から、アルカリ耐性セルラーゼのcasAを例示している。
【０００７】
放線菌類からのいくつかの例を含む、所望の特性を有する多くのセルラーゼ組成物に関する従来技術における知識にもかかわらず、例えばテキスタイルの処理において、洗剤組成物の成分として、パルプおよび紙の処理において、動物用飼料の補給物として、ベーキングの加工助剤として、およびバイオマスの変換において有用な、様々の範囲の特性を有する新しいセルラーゼが、引き続き必要とされている。本出願人は、そのような特性を補足し、セルラーゼのそのような既知の方法において有用な、特定のセルラーゼを発見した。
【０００８】
発明の概要
本発明の目的は、洗剤に使用するために有用な温度およびpH特性を有する新しい放線菌類由来のセルラーゼ組成物を提供することにある。
【０００９】
本発明の別の目的は、織糸、織物、および衣服において所望の質を作り出すようにテキスタイルの処理に有用な特性を有する新しい放線菌類由来のセルラーゼ組成物を提供することにある。
【００１０】
本発明のもう１つの目的は、動物用飼料の添加物として、ベーキングの助剤として、パルプおよび紙の処理において、およびバイオマスの低減においての使用に有用な特性を有する新しい放線菌類由来のセルラーゼを提供することにある。
【００１１】
本発明のさらなる目的は、組換え宿主細胞からの異種（heterologous）発現を経てそのような新しい放線菌類由来のセルラーゼ組成物を産生する方法を提供することにある。
【００１２】
本発明のさらに別の目的は、本発明の新しいセルラーゼ組成物の工業的な産生を容易にするDNAおよびアミノ酸配列を提供することにある。
【００１３】
本発明のさらに別の目的は、洗剤において、テキスタイルの処理において、飼料の助剤として、およびパルプおよび紙の処理においての使用に優れた特性を有する新しいセルラーゼを提供することにある。
【００１４】
本発明によると、放線菌類または前記セルラーゼの誘導体から得られる新しいセルラーゼが提供される。好ましくは本発明のセルラーゼは、図１（配列番号１）によるアミノ酸配列、またはそれに対して５０％以上の配列同一性、好ましくは７０％以上の配列同一性、さらに好ましくは９０％以上の配列同一性を有する誘導体を含む。
【００１５】
別の実施の形態によると、本発明のセルラーゼをコードするDNAを有する組成物が提供される。好ましくは該DNAは、図２（配列番号２）によるアミノ酸配列、またはそれに対して７６％以上の配列同一性、好ましくは８０％以上の配列同一性、さらに好ましくは９０％以上の配列同一性を有する誘導体およびそれにより産生されたセルラーゼをコードする。本発明はさらに、適切な条件下で、図２に示されるDNAから得られるDNAプローブにハイブリッド形成するDNA、およびそれにより産生されるセルラーゼを実施の形態とする。
【００１６】
本発明のさらに別の実施の形態によると、本発明によるセルラーゼをコードするDNAで適切な微生物を形質転換する方法、および該形質転換された微生物から本発明によるセルラーゼを産生する方法が提供される。
【００１７】
本発明の特に好ましい実施の形態においては、成熟したセルラーゼは放線菌類に由来し、SDS-PAGE上で測定すると約３６kDの分子量を有する（以下で３６kDのセルラーゼと称する）。成熟した約３６kDのセルラーゼは、約５．９の計算された等電点、およびCMC上で４０℃で約８、６０℃で約７の最適pHを有する。本発明のセルラーゼは、少なくともpH５からpH１０までの広い活性範囲を有し、４０℃よりも６０℃において高い活性を示す。
【００１８】
発明の詳細な説明
“誘導体”とは、天然タンパク質のCおよびN末端の一方または両方への１つ以上のアミノ酸の付加、天然アミノ酸配列の１つまたは多数の異なる部位での１つ以上のアミノ酸の置換、天然タンパク質の一方または両方の末端あるいはアミノ酸配列の１つ以上の部位での１つ以上のアミノ酸の欠失、または天然アミノ酸配列の１つ以上の部位での１つ以上のアミノ酸の挿入によって、天然タンパク質から誘導されたタンパク質を意味する。酵素誘導体の調製は好ましくは、天然タンパク質をコードするDNA配列の修飾、適切な宿主への該DNA配列の形質転換、および誘導酵素を形成するために修飾したDNA配列の発現により達成される。本発明の誘導体は、前駆体酵素のアミノ酸配列（例えば本発明による野生型または天然状態の酵素）と比較して変化したアミノ酸配列を有するペプチドを有し、該ペプチドは前駆体酵素の特有の酵素の性質を保有しているが、いくつかの特定の側面では特性が変化している。例えば変化したセルラーゼは、最適pHまたは温度耐性が増加するかもしれないが、特有のセルロース分解活性は保有している。
【００１９】
“宿主細胞”とは、本発明による組換えDNAベクターの宿主および発現媒体として作用できる細胞を意味する。本発明による好ましい実施の形態においては、“宿主細胞”はバチルス属の細胞を意味する。
【００２０】
“DNA構成体”または“DNAベクター”とは、上述された新しいセルラーゼまたはセルラーゼ誘導体のどれでもコードする１つ以上のDNA断片を有するヌクレオチド配列を意味する。
【００２１】
本発明の特に好ましい実施の形態においては、成熟したセルラーゼは放線菌類に由来し、SDS-PAGE上で測定すると約３６kDの分子量を有する（ここでは３６kDのセルラーゼと称する）。成熟した約３６kDのセルラーゼは、約４．５の計算された等電点、およびCMC上で４０℃で約８、６０℃で約７の最適pHを有する。本発明のセルラーゼは、少なくともpH５からpH１０までの広い活性範囲を有し、４０℃よりも６０℃において高い活性を示す。
【００２２】
３６kDのセルラーゼのアミノ酸配列をコードする遺伝子は、様々なライブラリ (GenBank,Swiss-Prot,EMBL and PIR)の利用可能な配列データと比較することによって分析した。本発明のDNA配列によってコードされるセルラーゼを、公表されたまたは既知のセルラーゼ遺伝子配列によってコードされるセルラーゼと比較するためのデータベースの検索が、系統発生の近縁種を決定するために行われた。発見された最も高い相同性は、アスペルギルスアクレエアテス(Aspergillus aculeatus)からのエンドグルカナーゼ▲１▼、セルロモナスヒミ(Cellulomonas fimi)からのエキソセロビオヒドロラーゼ、およびクロストリジウムセルロボラン(Clostridium cellulovorans)からのエンドグルカナーゼCに対してであった。Pearson＆Lipman,Proc.Nat.Acad.Sci.,Vol.85,pp.2444-2448(1988)によって示されているようにTFastAプログラムを使用すると、約３６kDのセルラーゼは、アスペルギルスアクレエアテスからのエンドグルカナーゼ▲１▼に対して２４２残基の重複中３５．１％の配列が同一、セルロモナスヒミからのエキソセロビオヒドロラーゼに対して１１２残基の重複中４８．２%の配列が同一、およびクロストリジウムセルロボランからのエンドグルカナーゼCに対して１１４アミノ酸の重複中４４．７％の配列が同一であることが示された。TFastAデータ検索プログラムは、Sequence Analysis Software Package Version 6.0(Genetic Computer Group,Univ.Wisconsin Biotechnology Center,Madison,Wisconsin 53705)において工業的に利用できる。３６kDのセルラーゼをコードするDNA配列を、公表されているデータベースのDNA配列と比較することにより、最も近い相同性は、放線菌ロケイ(rochei)からのeglSをコードする遺伝子に対して（８２３塩基対の重複中７５．８％が同一）、および放線菌リビダン(lividans)からのcelBをコードする遺伝子に対して（７６５塩基対の重複中７４．９％が同一）であることが示される。
したがって本発明は、図１(配列番号１)によるアミノ酸配列を有するセルラーゼ、またはそれに対して５０％以上の配列同一性、好ましくは７０％以上の配列同一性、最も好ましくは９０％以上の配列同一性を有する誘導体を含む。同様に、本発明はさらに、図２(配列番号２)によるDNA、またはそれに対して７６％以上の配列同一性、好ましくは８０％以上の配列同一性、最も好ましくは９０％以上の配列同一性を有する誘導体を含む。
【００２３】
ここで、所定の断片と遺伝子のどちらがここに記載されるセルラーゼに相当し、したがって本発明の範囲に含まれるのかを分析するために、ハイブリッド形成を使用する。ハイブリッド形成アッセイは、実質的に以下のものである：例えば、製造者の使用説明書によるEcoR▲１▼,Hind▲３▼,BamH▲１▼,Cla▲１▼,Kpn▲１▼,Mlu▲１▼,Spe▲１▼,Bgl▲２▼,Nco▲１▼,Xba▲１▼,Xho▲１▼およびXma▲１▼（New England Biolabs,Inc.,Beverly,MA and Boehringer Mannheimによって提供される）などの制限酵素での切断によって、特定の標的源からのゲノムDNAを断片化する。次に、DNA断片の分画がサイズによって目に見えるように、試料をアガロースゲル（例えば０．８％のアガロース）を通して電気泳動する。ゲルを蒸留水で簡単に洗浄し、次に適切な溶液（例えば０．２５MのHCl）中で穏やかに振盪して脱プリン化し、３０分間穏やかに振盪して変性し、続いて３０分間（例えば０．４MのNaOH中で）穏やかに振盪して変性する。ゲルをpH７．０の１．５M NaCl、１M Tris中に置き、３０分間穏やかに振盪する再生段階を含めてもよい。次にDNAを適切な陽性電荷膜、例えばMaximum Strength Nytran Plus膜(Schleicher＆Schuell,Keene,N.H.)上に、転移溶液（例えば６×SSC(900mM NaCl,90mMクエン酸三ナトリウム）を使用して転移する。通常約２時間かそれ以上で転移が完了した後、洗浄液（例えば２×SSC[２×SSC=300mM NaCl,30mM trisodium citrate]）を使用して膜を洗浄した後室温で風乾する。次に膜を、（約２時間かそれ以上）適切なプレハイブリッド形成溶液（例えば、１００ml中にホルムアミド２０−５０ mls、２０×SSPE(１×SSPE=０．１８M NaCl,１mM EDTA,１０mM NaH2PO4,pH７．７)２５mls、２０％SDS２．５mls、１０mg/mlの剪断へリング精子DNA１mlを含有する水溶液） 中でプレハイブリッド形成する。当業者にとって自明であるように、プレハイブリッド形成溶液中のホルムアミドの量は、従来の方法によって得られる反応の性質によって異なってもよい。したがってホルムアミドの量を少なくすると、より多くのホルムアミドを使用する同じ工程よりも、ハイブリッド形成した分子を認識する点で、より完成したゲルになる。一方で、強いハイブリッド形成バンドは、より多くのホルムアミドを使用することにより容易に目で認識できる。
【００２４】
図２の配列から得られる、通常１００塩基から１０００塩基までの長さのDNAプローブは、アガロースゲルでの電気泳動によって分離され、断片はゲルから切り取られ、切り取られたアガロースから取り出される。次に、この精製されたDNAの断片を、（例えば、DNAにP32を組み込むために製造者の説明書によってMegaprime labeling system(Amersham International plc,Buckinghamshire,England)を使用し）、標識する。標識されたプローブを、５分間９５℃まで加熱して変性させ、上述の膜を含むプレハイブリッド形成溶液にすばやく加える。ハイブリッド形成反応は、適切な時間および適切な条件下、例えば穏かに振盪しながら３７℃で１８時間、行わなければならない。膜を洗浄し（例えば２×SSC/０．３％SDS中で）、次に適切な洗浄溶液および穏かな攪拌で洗浄する。所望のストリンジェンシーは、膜（フィルター）が洗浄される条件に依存する。
【００２５】
特に、所定の反応のストリンジェンシー（すなわち、ハイブリッド形成の成功に必要な相同性の度合い）は、ハイブリッド形成の後にサザンブロットからフィルタを洗浄する条件に依存するだろう。ここに定義するように、“低ストリンジェンシー”条件は、１５分間２０℃で０．２×SSC/０．１％SDSの溶液を使用したサザンブロットからのフィルターの洗浄を含む。“標準ストリンジェンシー”条件は、３０分間３７℃で０．２×SSC/０．１％SDSの溶液を使用した２度目のサザンブロットからのフィルターの洗浄を含む洗浄工程をさらに有する。
【００２６】
本発明はまた、セルラーゼを産生する方法を明らかにする。ソーダレイク（soda lake）試料をスクリーニングして適切なセルラーゼ産生有機体を単離することよってセルラーゼを産生することが可能である。前記有機体は、そのような放線菌類を増殖させるために知られている方法により増殖させることができる。しかしながら、適切なセルラーゼ産生菌株を単離するよりも、ここに提供されるセルラーゼをコードするDNAで適切な宿主細胞を形質転換させる遺伝工学技術を使用して本発明によるセルラーゼを少量だけ産生し、生じた組換え微生物を宿主細胞の増殖とセルラーゼの発現に適切な状況下で培養するほうがより効果的である。第１段階として、染色体DNAを、例えばサイトウおよびミウラの方法（Saito＆Miura,Biochim.Biophys.Acta.,Vol.72,pp.619(1963)）または類似した方法によって供与体の放線菌菌株から得てもよい。このようにして得られる染色体DNAの制限酵素開裂により、アルカリ性セルラーゼ遺伝子を含有するDNA断片を与が得られる。この目的のために、前記遺伝子領域を開裂しないなら、どの制限酵素を使用してもよい。あるいは、酵素濃度または培養時間を、部分的な切断しかできないように低くするなら、前記遺伝子を開列する制限酵素を使用してもよい。好ましい制限エンドヌクレアーゼはSau3Aである。生じた切断混合物から適切な断片（４kbから１０kbまで）を単離し、DNA構成体を使用して適切な宿主細胞を形質転換するのに使用してもよい。
【００２７】
本発明のセルラーゼをコードする遺伝子は、λ―ファージ（発現）ベクターおよび大腸菌（E.coli）宿主細胞を使用してクローン化できる。（あるいは、保護領域上で設計されたコンセンサス（consensus）プライマーを使用するポリメラーゼ連鎖反応（PCR）クローニングを使用してもよい）。E.coliでの第１のクローニング工程の後、本発明によるセルラーゼ遺伝子は、バチルス属またはストレプトミセス種のような産業上より好ましい発現宿主、アスペルギルス属(Aspergillus)またはトリコデルマ属のような糸状真菌、あるいはサッカロミセス属(Saccharomyces)のような酵母に転移できる。これらの宿主有機体で得られる高レベルの発現および分泌は、後にセルラーゼをそこから回収できる発酵培地でのセルラーゼの蓄積を可能にする。
【００２８】
セルラーゼは、必要であれば細胞分裂の後に、遠心分離またはろ過により培地から細胞を分離し、例えば硫酸アンモニウムのような塩によって上澄またはろ液のタンパク様の成分を沈殿させ、続いて、例えばイオン交換クロマトグラフィ、アフィニティクロマトグラフィ、または同様の従来技術において知られている方法のような様々なクロマトグラフィ法によって精製する各工程を含む従来の方法によって培地から回収してもよい。本発明によるアルカリ性のセルラーゼの産生のために、セルロース由来のエネルギー源を含有する培地を使用してアルカリ性の条件下で培養するのが好ましい。
【００２９】
好ましくは、発現宿主細胞はバチルス種を含み、より好ましくはバチルスリケニフォルミス(licheniformis)または枯草菌を含む。特に好ましい実施の形態においては、形質転換宿主は、産生物のセルラーゼが発酵液またはその凝縮液中でタンパク分解を受けないことを確実にするために、プロテアーゼ遺伝子を欠失する。プロテアーゼ欠失バチルス属菌株の好ましい一般的な形質転換および発現プロトコルは、ここに引用される、フェラーリ等の米国特許第５２６４３６６号に提供されている。アスペルギルスにおける形質転換および発現は、ここに引用される、ベルカ等の米国特許第５３６４７７０号に記載されている。本出願人は、本発明の遺伝子のバチルス属への形質転換は、天然の調節機構を使用する時に生じる発現の点から不十分または効果的でないことを発見した。したがって、バチルス種へ形質転換する時、標準の既知バチルス属由来シグナル配列および他の調節配列と組み合わせてaprEプロモータを使用することが好ましい。形質転換宿主細胞がアスペルギルスの時、好ましいプロモータはglaAである。
【００３０】
本発明によるテキスタイルの処理は、セルラーゼを有する組成物を使用するテキスタイルの処理またはクリーニングを考慮している。そのような処理は、ストーンウォッシュ、セルロース含有織物の手触り、感触および/または外観の変更、またはセルロース含有織物を製造またはクリーニング/修復するときに使用する他の技術を有するが、それに限定されるものではない。さらに、本発明の範囲内での処理は、セルロースの織物または繊維からの“未熟な”または“死んだ”綿の除去を考慮している。未熟な綿は、成熟した綿よりかなり不定形であり、例えばむらのある染色などより低い質の織物の原因になる。本発明で考慮されている組成物はさらに、汚れた製品のセルロース含有織物の洗浄に使用するセルラーゼ組成物を有している。例えば、セルラーゼは洗濯物のための洗剤組成物に使用してもよい。本発明による有用な洗剤組成物は、予洗、浸置き、および家庭用の色回復組成物などの特別な配合物を有している。ここに記載されているように、そのような処理組成物は、希釈を必要とする濃縮液の形態、希釈液の形態、またはセルロース含有織物に直接施せる形態でもよい。テキスタイルのセルラーゼ処理の一般的な処理技術は、例えば欧州特許出願公開第２２００１６号および英国特許出願第１３６８５９９号および同第２０９５２７５号に記載されている。
【００３１】
本発明によるセルロース物質の処理はさらに、従来技術において知られている目的のための動物用飼料、紙および/またはパルプ、食物、および穀物の処理を考慮に入れている。例えば、セルラーゼは動物用飼料の価値をあげ、木材パルプの排水性を改善し、食物生産を高め、湿気のある製粉工程でも乾燥した製粉工程でも穀物中の繊維を減らすことが知られている。
【００３２】
本発明による処理は、例えば緩衝剤、界面活性剤、および/または洗毛剤を含む他の任意の成分とともに、効果的な量のセルラーゼを含有する水溶液を調製することを備えている。セルラーゼ酵素組成物の効果的な量は、意図される目的に十分なセルラーゼ酵素の濃度である。したがって、例えば本発明によるストーンウォッシュ組成物におけるセルラーゼの“効果的な量”とは、所望の効果、例えば縫い目および織物の布に使い古したおよび色あせた外観を作製することを提供する量である。同様に、セルロース含有織物の手触りおよび/または外観を改善するために意図される組成物におけるセルラーゼの“効果的な量”とは、手触りの改善、例えば織物の滑らかさの改善、または外観の改善、例えば織物の外観の鮮明さを下げる傾向がある毛玉および小繊維の除去などの適度な改善をする量である。使用されるセルラーゼの量は、使用される装置、使用される工程のパラメータ（セルラーゼ処理溶液の温度、セルラーゼ溶液にさらす時間等）、およびセルラーゼ活性（例えば特定の溶液は、より活性の高いセルラーゼ組成物を使うと、より活性の低いセルラーゼ組成物を使うときに比べて低いセルラーゼ濃度しか必要としない）にも依存する。テキスタイルの処理のために加える水性の処理溶液中のセルラーゼの的確な濃度は、上述の要因並びに所望の結果に基づいて、当業者によって容易に決定できる。ストーンウォッシュ工程では、セルラーゼは通常、水性処理溶液中において好ましくは約０．５ppmから約５０００ppmまでの範囲、最も好ましくは約１０ppmから約２００ppmまでの範囲の全タンパク質の濃度である。セルロース含有織物の手触りおよび/または外観の改善のための組成物においては、セルラーゼは通常、水性処理溶液中において約０．１ppmから約２０００ppmまでの範囲、最も好ましくは約０．５ppmから約２００ppmまでの範囲の全タンパク質の濃度である。
【００３３】
好ましい処理の実施の形態においては、緩衝剤の濃度が、使用されるセルラーゼがその性質に依存する活性を示す範囲内で水溶液のpHを維持するのに十分であるように、緩衝剤を処理組成物に使用する。使用される緩衝剤の的確な濃度は、当業者が容易に考慮できるいくつかの要因に依存する。例えば、好ましい実施の形態においては、緩衝剤並びに緩衝剤の濃度は、最適なセルラーゼ活性のために必要なpH範囲内に最終的なセルラーゼ溶液のpHを維持するように選択される。本発明のセルラーゼの最適なpHの範囲の測定は、よく知られている技術によって確かめられる。セルラーゼの活性範囲内のpHにおける適切な緩衝剤は、この分野の当業者によく知られている。
【００３４】
セルラーゼと緩衝剤に加えて、前記処理組成物は必要に応じて界面活性剤を含有してもよい。適切な界面活性剤は、例えば陰イオン、非イオン、および両性電解質の界面活性剤を含む、セルラーゼおよび織物と相溶性のある界面活性剤を含む。ここで使用する適切な陰イオンの界面活性剤は、直鎖状のまたは側鎖のあるアルキルベンゼンスルホン酸塩；直鎖状のまたは側鎖のあるアルキル基またはアルケニル基を有するアルキルまたはアルケニルエーテル硫酸塩；アルキルまたはアルケニル硫酸塩；オレフィンスルホン酸塩；アルカンスルホン酸塩等を含む。陰イオンの界面活性剤に適切な対イオンは、ナトリウムおよびカリウムのようなアルカリ金属イオン；カルシウムおよびマグネシウムのようなアルカリ土類金属イオン；アンモニウムイオン；および、炭素数が２または３の、１から３までのアルカノール基を有するアルカノールアミンを含む。両性電解質の界面活性剤は、第４アンモニウム塩硫酸塩、およびベタイン型の両性電解質の界面活性剤を含む。そのような両性電解質の界面活性剤は、同じ分子内に陽性および陰性の両方の荷電基を有している。非イオンの界面活性剤は通常、ポリオキシアルキレンエーテル、並びに高級脂肪酸のアルカノールアミドまたはそれにアルキレンオキシド付加物がついたものおよび脂肪酸のグリセリンモノエステルを有する。界面活性剤の混合物も当業者に知られる方法で使用できる。
【００３５】
濃縮したセルラーゼ組成物は、ここで記載する方法において使用するために調製することができる。そのような濃縮液は、好ましくは水溶液中に、上述のセルラーゼ組成物、緩衝剤および界面活性剤の濃縮量を含有している。そのように配合されるとセルラーゼ濃縮液は、個々の成分の必要な濃度を有するセルラーゼ調製物をすばやく正確に調製するように水で容易に希釈することができる。水性の濃縮液が配合されると、これらの濃縮液は、上述のようなセルラーゼ溶液中の成分の必要な濃度に達するように希釈することができる。容易に分かるように、そのようなセルラーゼ濃縮液により、セルラーゼ溶液の容易な配合、並びに使用される場所への組成物の便利な輸送が可能になる。処理濃縮液は、例えば液体、乳液、ゲル、またはペーストのような、従来技術において知られている形態にすることができる。そのような形態は、当業者によく知られている。
【００３６】
固体状のセルラーゼ濃縮を使用する場合、セルラーゼ組成物は粒子、粉末、凝集体、または固体の円板でもよい。粒子は、洗浄液への粒子の溶解速度を下げる物質を含有するように配合される。そのような物質および粒子は、ここに引用される米国特許第５２５４２８３号に開示されている。
【００３７】
可能性のある組成物の使用に依存して、石、軽石、充填剤、溶媒、酵素活性化剤、および再付着防止剤を含む他の物質もまた所望のように、本発明のセルラーゼ組成物とともに、またはその中で使用できる。
【００３８】
実施例としてストーンウォッシュ法を詳細に記述するが、記述されているパラメータは、他の用途、すなわち織物の手触りおよび/または外観の改善のために、当業者によって容易に変更される。処理組成物をストーンウォッシュ組成物と混合し、それによりセルラーゼ酵素を織物に近接させることにより、セルロース含有織物を効果的な量のセルラーゼを含有する、セルラーゼ含有ストーンウォッシュ組成物と接触させる。続いて、セルラーゼおよび繊維を含有する水溶液を攪拌する。処理組成物が水溶液なら、織物は溶液に直接浸される。同様に、ストーンウォッシュ組成物が濃縮液のときは、濃縮液を希釈してセルロース含有織物とともに容器に入れる。ストーンウォッシュ組成物が、例えば予洗ゲルまたは固体の棒材のように固体形状のときは、ストーンウォッシュ組成物は、組成物を織物または洗浄液に直接施すことにより接触させてもよい。
【００３９】
セルロース含有織物は、酵素作用がセルロース含有織物にストーンウォッシュされた外観を与えるのに有効な条件下、ストーンウォッシュ溶液でインキュベートする。ストーンウォッシュ中に、例えばpH、溶液の割合、温度、および反応時間を、ストーンウォッシュ組成物が作用する条件を最適化するために調節してもよい。“効果的な条件”は、セルラーゼ酵素がセルロース含有織物と効果的に反応する、この場合はストーンウォッシュ効果を作り出す事、を可能にするｐＨ、溶液の割合、および温度に必然的に関係する。本発明によるストーンウォッシュ組成物を使用するために条件を最適にするのは、当業者にとって当然である。
【００４０】
ここで使用されているストーンウォッシュ中の溶液の割合、すなわち織物の重量に対するストーンウォッシュ組成物溶液（すなわち洗浄液）の重量の割合は、通常デニム織物に所望のストーンウォッシュ効果を達成するのに十分な量であり、使用される工程に依存する。好ましくは溶液の割合は、約４：１から約５０：１まで、より好ましくは約５：１から約２０：１まで、最も好ましくは約１０：１から約１５：１までである。
【００４１】
本発明のストーンウォッシュ組成物によるストーンウォッシュ中の反応温度は、２つの対抗する要因によって決定される。第１に、温度を上げると通常反応速度論を高める、すなわち反応を早くし、これは低い温度で必要とされる反応時間に比べて反応時間を減らすことを可能にする。したがって、反応温度は通常、少なくとも約１０℃以上である。第２に、セルラーゼは所定の反応温度を越えると活性を失うタンパク質であり、その温度は使用されるセルラーゼの性質に依存する。したがって、反応温度を高くしすぎると、セルロース分解活性はセルラーゼの変性の結果として失われる。従来技術におけるセルラーゼの使用に標準的な温度は通常、３５℃から６５℃までの範囲であり、この条件は本発明のセルラーゼにも適切であると思われるが、最適な温度条件は、使用される特定のセルラーゼに関してよく知られている技術によって確かめるべきである。
【００４２】
反応時間は、ストーンウォッシュが行われる特定の条件に依存する。例えばセルラーゼのpH、温度および濃度の全てにより、最適な反応時間が生み出される。通常、反応時間は約５分から約５時間まで、好ましくは約１０分から約３時間まで、より好ましくは約２０分から約１時間までの範囲である。
【００４３】
本発明のさらに別の好ましい実施の形態によると、本発明のセルラーゼは、洗剤組成物に使用してもよい。本発明による洗剤組成物は、予洗組成物、浸置き組成として、または通常の洗浄またはすすぎ中のクリーニングに、有用である。好ましくは、本発明の洗剤組成物は、効果的な量のセルラーゼ、界面活性剤を有し、必要に応じて、以下に示す他の成分を有してもよい。
【００４４】
本発明の洗剤組成物において使用されるセルラーゼの効果的な量は、セルロース含有織物上でセルラーゼによって生じることが知られている所望の効果、例えば毛玉取り、やわらか仕上げ、非毛玉加工、表面繊維除去、非汚れ加工およびクリーニング、などを与えるのに十分な量である。好ましくは、洗剤組成物中のセルラーゼは、洗剤の約１０ppmから約２００００ppmまでの範囲の濃度で使用する。
【００４５】
洗剤組成物において使用されるセルラーゼ酵素の濃度は好ましくは、洗浄液への希釈に基づいて、セルラーゼ酵素の濃度が全タンパク質の約０．０１ppmから約１０００ppmまでの範囲、好ましくは約０．０２ppmから約５００ppmまでの範囲、最も好ましくは約０．５ppmから約２５０ppmまでの範囲になるように選択する。洗剤組成物において使用されるセルラーゼ酵素の量は、洗剤が洗浄液を作成するように水に加えられて希釈される程度に依存する。
【００４６】
本発明の洗剤組成物は、例えば液体、粒子、乳液、ゲル、またはペーストのような、従来技術において知られている形状でもよい。そのような形状は当業者によく知られている。固体の洗剤組成物を使用する時は、セルラーゼは好ましくは粒子の形状をしている。好ましくは粒子は、セルラーゼ保護物質を付加的に含有するように配合される。粒子は、粒子の洗浄液への溶解速度を減らす物質を含有するように配合しても差し支えない。そのような物質および粒子は、ここに引用される米国特許第５２５４２８３号に開示されている。
【００４７】
本発明の洗剤組成物は、表面活性物質、すなわち、洗剤組成物における使用でよく知られている、陰イオン、非イオンおよび両性電解質の界面活性剤を含む界面活性剤を使用する。
【００４８】
本発明の洗剤組成物において使用する適切な陰イオンの界面活性剤は、直鎖状のまたは側鎖のあるアルキルベンゼンスルホン酸塩；直鎖状のまたは側鎖のあるアルキル基またはアルケニル基を有するアルキルまたはアルケニルエーテル硫酸塩；アルキルまたはアルケニル硫酸塩；オレフィンスルホン酸塩；およびアルカンスルホン酸塩を含む。陰イオンの界面活性剤に適切な対イオンは、ナトリウムおよびカリウムのようなアルカリ金属イオン；カルシウムおよびマグネシウムのようなアルカリ土類金属イオン；アンモニウムイオン；および、炭素数が２または３の、１から３までのアルカノール基を有するアルカノールアミンを含む。両性電解質の界面活性剤は、第４アンモニウム塩硫酸塩、およびベタイン型の両性電解質の界面活性剤を含む。そのような両性電解質の界面活性剤は、同じ分子内に陽性および陰性の両方の荷電基を有している。非イオンの界面活性剤は通常、ポリオキシアルキレンエーテル、並びに高級脂肪酸のアルカノールアミドまたはそれにアルキレンオキシド付加物がついたものおよび脂肪酸のグリセリンモノエステル等を有する。本発明における使用に適切な界面活性剤は、ここに引用される、英国特許出願第２０９４８２６A号に開示されている。そのような界面活性剤の混合物も使用することができる。界面活性剤または界面活性剤の混合物は通常、本発明の洗剤組成物において、全洗剤組成物の約１重量％から約９５重量％までの範囲、好ましくは全洗剤組成の約５重量％から約４５重量％までの範囲の量で使用される。セルラーゼ組成物および界面活性剤に加えて、本発明の洗剤組成物も、必要に応じて以下の成分を１つ以上含有することができる。
【００４９】
セルラーゼ以外のヒドロラーゼ
適切なヒドロラーゼとしては、エステル結合に作用するカルボキシレートエステルヒドロラーゼ、チオエステルヒドロラーゼ、リン酸モノエステルヒドロラーゼ、およびリン酸ジエステルヒドロラーゼ；グリコシル化合物に作用するグリコシドヒドロラーゼ；N―グリコシル化合物を加水分化する酵素；エーテル結合に作用するチオエステルヒドロラーゼ；およびペプチド結合に作用するa―アミノ―アシル―ペプチドヒドロラーゼ、ペプチジル―アミノ酸ヒドロラーゼ、アシル―アミノ酸ヒドロラーゼ、ジペプチドヒドロラーゼ、およびペプチジル―ペプチドヒドロラーゼが挙げられる。それらの中で好ましいのは、カルボキシレートエステルヒドロラーゼ、グリコシドヒドロラーゼ、およびペプチジル―ペプチドヒドロラーゼである。適切なヒドロラーゼとしては、（１）ペプシン、ペプシンB、レンニン、トリプシン、キモトリプシンA、キモトリプシンB、エラスターゼ、エンテロキナーゼ、カテプシンC、パパイン、キモパパイン、フィシン、トロンビン、フィブリノリシン、レニン、サブチリシン、アスペルギルスペプチダーゼA、コラゲナーゼ、クロストリジオペプチダーゼB、カリクレイン、ガストリシン、カテプシンD、ブロメリン、ケラチナーゼ、キモトリプシンC、ペプシンC、アスペルギルスペプチダーゼB、ウロキナーゼ、カルボキシペプチダーゼAおよびB、およびアミノペプチダーゼのようなペプチジル―ペプチドヒドロラーゼに属するプロテアーゼ；（２）α―アミラーゼ、β―アミラーゼ、グルコアミラーゼ、インベルターゼ、リゾチーム、ペクチナーゼ、キチナーゼ、およびデキストラナーゼのようなグリコシドヒドロラーゼ（必須成分であるセルラーゼはこの群から除かれている）が挙げられる。これらの中で好ましいのは、α―アミラーゼおよびβ―アミラーゼである。それらは酸性で、中性の系に作用するが、細菌から得られるもの；（３）カルボキシルエステラーゼ、リパーゼ、ペクチンエステラーゼ、およびクロロフィラーゼを含むカルボキシレートエステルヒドロラーゼは、アルカリ性の系で高い活性を示す。それらの中で特に効果的なのは、リパーゼである。
【００５０】
セルラーゼ以外のヒドロラーゼは、目的に必要なだけ洗剤組成物に入れられる。好ましくは、精製したタンパク質に関して０．００１重量%から５重量％までの範囲、より好ましくは０．０２重量%から３重量％までの範囲で入れられる。この酵素は、粗酵素だけからなる粒子の形状で、または洗剤組成物中の他の成分と組合せて、使用される。粗酵素の粒子は、精製された酵素が粒子の中で０．００１重量%から５０重量％までの範囲になる量で使用される。粒子は、０．００２重量%から２０重量%までの範囲、好ましくは０．１重量%から１０重量％までの範囲で使用される。セルラーゼと同様に、これらの粒子は、酵素保護物質および溶解遅延剤を含有するように作成してもよい。
【００５１】
陽イオンの界面活性剤および長鎖脂肪酸塩
そのような陽イオンの界面活性剤および長鎖脂肪酸塩は、飽和または不飽和脂肪酸塩、アルキルまたはアルケニルエーテルカルボン酸塩、α―スルホ脂肪酸塩またはエステル、アミノ酸型界面活性剤、リン酸エステル界面活性剤、３から４までのアルキル置換基を有する第４アンモニウム塩、および１つまでのフェニル置換アルキル置換基を有する。好ましい陽イオンの界面活性剤および長鎖脂肪酸塩は、ここで引用される英国特許出願第２０９４８２６A号に開示されている。その組成物は、そのような陽イオンの界面活性剤および長鎖脂肪酸塩を約１重量%から約２０重量％まで含有していてもよい。
【００５２】
研磨剤
A. 二価金属イオン封鎖剤
前記組成物は、以下の化合物：リン酸塩、ホスホン酸塩、ホスホノカルボン酸塩、アミノ酸の塩、アミノポリアセチレート高分子電解質、非解離ポリマ、ジカルボン酸塩、およびアルミノケイ酸塩の、アルカリ金属塩およびアルカノールアミン塩からなる群より選択される１つ以上のビルダーの組成物を、約０重量%から約５０重量％まで含有してもよい。好ましい二価金属イオン封鎖剤は、ここで引用される英国特許出願第２０９４８２６A号に開示されている。
【００５３】
B. アルカリまたは無機電解質
前記組成物は、アルカリまたは無機電解質としての以下の化合物：ケイ酸塩、炭酸塩、および硫酸塩並びに、トリエタノールアミン、ジエタノールアミン、モノエタノールアミン、およびトリイソプロパノールアミンのような有機アルカリの１つ以上のアルカリ金属塩の組成物に基づき、約１重量%から約５０重量％まで、好ましくは約５重量%から約３０重量％までを含有してもよい。
【００５４】
再付着防止剤
前記組成物は、再付着防止剤としての以下の化合物：ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、およびカルボキシメチルセルロースの１つ以上を約０．１重量%から約５重量％まで含有してもよい。
【００５５】
それらの中で、カルボキシメチルセルロースおよび/またはポリエチレングリコールと本発明のセルラーゼ組成物の組合せは、特に有用な汚れ除去組成物を提供する。
【００５６】
漂白剤
過硫酸カリウム、過炭酸ナトリウム、過ホウ酸ナトリウム、硫酸ナトリウム/過酸化水素付加物、および塩化ナトリウム/過酸化水素付加物および/またはスルホン酸フタロシアニンの亜鉛またはアルミニウム塩のような感光性の漂白染料、のような漂白剤と組み合わせた本発明のセルラーゼを使用すると、さらに洗浄効果が改善される。同様に、欧州特許第６８４３０４号に記載されている漂白剤および漂白触媒を使用してもよい。
【００５７】
青味剤および蛍光染料
必要なら、様々の青味剤および蛍光染料を前記組成物に含んでもよい。好ましい青味剤および蛍光染料は、ここで引用される英国特許出願第２０９４８２６A号に開示されている。
【００５８】
ケーキング防止剤
以下のケーキング防止剤：p―トルエンスルホン酸塩、キシレンスルホン酸塩、酢酸塩、スルホコハク酸塩、タルク、細かく砕いたシリカ、非結晶のシリカ、土、ケイ酸カルシウム（Micro-Cell of Johns Manville Co.）、炭酸カルシウム、および酸化マグネシウムを、粉末状の洗剤に混合してもよい。
【００５９】
酸化防止剤
酸化防止剤は、例えば第３―ブチル―ヒドロキシトルエン、４，４’―ブチリデンビス（６―第３―ブチル―３―メチルフェノール）、２，２’―ブチリデンビス（６―第３―ブチル―４―メチルフェノール）、モノスチレンクレゾール、ジスチレンクレゾール、モノスチレンフェノール、ジスチレンフェノール、および１，１―ビス（４―ヒドロキシ―フェニル）シクロヘキサンを有する。
【００６０】
可溶化剤
可溶化剤は、例えばエタノールのような低級アルコール、ベンゼンスルホン酸塩、p―トルエンスルホン酸塩のような低級アルキルベンゼンスルホン酸塩、プロピレングリコールのようなグリコール、アセチルベンゼンスルホン酸塩、アセトアミド、ピリジンジカルボン酸アミド、安息香酸塩、および尿素を有する。
【００６１】
本発明の洗剤組成物は、酸性からアルカリ性まで広いpH範囲で使用することができる。好ましい実施の形態においては、本発明の洗剤組成物は、５以上から約１２までのpHを有する弱酸性、中性、またはアルカリ性の洗剤洗浄媒質中で使用することができる。
【００６２】
上述の成分の他に、所望なら本発明の洗剤組成物とともに、香料、緩衝剤、防腐剤、染料等を使用できる。そのような成分は、従来技術でこれまで使用されてきた量で使用される。
【００６３】
本発明で使用される洗剤の主成分が粉末の形状の場合、吹きつけ乾燥法および造粒法を含むどの既知の調製法によって調製してもよい。特に、吹きつけ乾燥法、凝集法、乾燥攪拌法、または非塔式経路（non-tower route）法によって得られる洗剤の主成分が好ましい。吹きつけ乾燥法によって得られる洗剤の主成分は、調製条件に関して限定されない。吹きつけ乾燥法によって得られる洗剤の主成分は、界面活性物質およびビルダーのような耐熱性成分の水性スラリーを熱した場所に吹き付けることによって得られる中空の粒子である。吹きつけ乾燥の後、香料、酵素、漂白剤、無機アルカリ性ビルダーを加えてもよい。吹きつけ乾燥造粒または凝集法によって得られるような高密度の粒状洗剤の主成分とともに、主成分の調製の後、様々の成分を加えてもよい。
【００６４】
洗剤の主成分が液体の場合、均質の溶液または不均質のコロイド分散のどちらでもよい。洗剤中のセルラーゼによるカルボキシメチルセルロースの分解を防ぐために、カルボキシメチルセルロースは組成物に加える前に粒状化するかコーティングするのが望ましい。
【００６５】
本発明の洗剤組成物は、従来どおり使用される温度、反応時間、および液体の割合で、産業上のおよび家庭での使用において、セルロース含有織物、例えば汚れた織物とともにインキュベートしてもよい。
【００６６】
本発明による洗剤は、十分な活性が存在して所望の改善であるやわらか仕上げ、毛玉取り、非毛玉加工、表面繊維除去、または洗浄を提供する中間pHにおいて適切な溶液中、予洗として追加で配合してもよい。洗剤組成物が、液体、スプレー、ゲル、またはペーストの浸置き（例えば予洗または前処理）組成物の場合、セルラーゼ酵素は通常、浸置きまたは前処理組成物の総重量に基づいて、約０．０００１重量％から約１重量％までで使用される。その様な組成物では、界面活性剤を必要に応じて使用してもよく、使用する場合通常、浸置きの総重量に基づいて約０．００５重量％から約２０重量％までの濃度で存在する。組成物の残りは、浸置きで使用される従来の成分、すなわち従来の濃度での希釈液、緩衝剤、他の酵素（プロテアーゼ）等を含む。
【００６７】
ここに記載されるセルラーゼ酵素を有する組成物は、それだけで色あせた織物に色を戻すのに適切な組成物（例えばここで引用される米国特許第４７３８６８２号を参照）として家庭用に、並びに、汚れの除去においておよび毛玉取り、非毛玉加工のために、使用できると考えられる。
【００６８】
本発明によるセルラーゼの使用は、飼料添加物、およびパルプおよび紙の処理において特に効果的である。これらの付加的な産業上の方法は、例えば国際特許出願公開第WO９５/１６３６０号およびフィンランド国特許第８７３７２号にそれぞれ記載されている。
【００６９】
本発明およびそれについての利点をさらに説明するために、以下の特定の実施例はそれらが本発明を説明するために提供されたものであり、発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではないということの理解とともに提供される。
【００７０】
実施例
実施例１
セルラーゼ産生微生物のアルカリ性の土および水の試料からの単離
アルカリ性の泥の試料を４%(w/v)NaCl：１%(w/v)Na２CO３５ml中に懸濁させ、激しく振盪した。同じ溶液の連続的な希釈液を、リファンピシン５０μg ml−１を含有するpH１０の土抽出寒天培地上で培養した。
【００７１】
土抽出寒天培地は以下のように調製した：１kgの庭土を１リットルの脱塩水中に懸濁させる。懸濁液を、１２０℃で２０分間加圧滅菌する。懸濁液をガラス繊維フィルタ（Whatman,GF/A）上でろ過し、固体を脱塩水（１×２００ml、１×１００ml）で２度洗浄する。ろ液を水で１リットルにする。 凝固のために加えた２%(w/v)の寒天を有する８%(w/v)NaCl：２%(w/v)Na２CO３の滅菌溶液と、同体積の滅菌したろ液を混合する。
【００７２】
プレートを、蒸発を防ぐために密閉した箱の中で数週間、３０℃でインキュベートした。プレートは定期的に実体顕微鏡で検査し、０．３%(w/v)カルボキシメチルセルロースを含有するアルカリ性の寒天培地に微小コロニーを移した。プレートの１つを０．１%(w/v)コンゴレッド（Congo Red）に１５分間浸すことにより、デュプリケート培養を使用してセルラーゼ活性を検出した。プレートは、１M NaClで３０分間汚れを取り除いた。コロニーの周りに透明な区域を示す菌株を、微生物を産生する可能性のあるセルラーゼとして選択した。
【００７３】
透明な区域を示す菌株は、国際特許出願公開第WO９６/３４１０８号（８ページ）に記載されているように２５ml中で発酵させ、その後CMCを加えた。
【００７４】
上述の方法を使用し、本発明によるセルラーゼを産生する菌株を単離し、さらに糸状バクテリアと認めた。外観および部分的な１６s rRNA遺伝子配列分析（実施例４）に基づいて、微生物をストレプトミセス属の種類と分類した。
【００７５】
セルラーゼを産生する菌株を形態学的に検査した。pH１０で土抽出寒天培地上で培養すると、最初小さくて丸い輝く透明のコロニーは、数日後、白色から灰色がかった白色の気菌糸になった。アルカリ性の寒天培地上では、菌株は成熟すると、気菌糸を産生する、乾いて堅い、クリーム色の、不透明なコロニーを形成する。顕微鏡下では菌株は、断片が不規則な杆状体、分離した胞子、および連鎖した胞子になる、広く枝分かれした偽菌糸体を示す。
【００７６】
実施例２
セルラーゼの DNA の単離、形質転換、および発現
実施例１によって単離したアルカリ性の放線菌類菌株を、E.coli.での発現クローニングのための供与体菌株として選択した。染色体DNAを、Saito＆Miura,Biochim.Biophys.Acta.,Vol.72,pp.619-629(1963)に記載されている方法によって単離した。
【００７７】
単離された染色体DNAを、提供者によって推薦される条件下、反応緩衝剤（Gibco BRL Life Technologies,Gaithersburg,Md.,USA）を使用して３７℃で１時間、連続的に希釈した酵素溶液を使用して制限酵素Sau3Aによって部分的に切断した。切断された DNAをアガロースゲル電気泳動によって分離し、好ましい断片（２kbから６kbまで）を、供給者（QIAGEN Inc.,Chatsworth,CA,USA）によって記載されるプロトコルによりQIAquick Gel Extraction Kitを使用してゲルから単離する。
【００７８】
アルカリ耐性放線菌類菌株のゲノム遺伝子ライブラリは、pUC１９由来のプラスミド中で作製される（Yanisch-Perron,C.et al.,(1985)Gene 33:103）。組換え型クローンは、Wood et al.,Meth.Enzym.,Vol.160,pp.59-74(1988)によって記載されているように、寒天拡散法によってスクリーニングする。コロニーの周りに透明な区域を示す菌株を単離する。セルラーゼ産生組換え体のプラスミドDNAを、提供者（QIAGEN Inc.）によって記載されたプロトコルによりQIAprep Plasmid Kitを使用して単離する。３．５kbの断片のヌクレオチド配列は、公開されているデータベースに対するFastA検索によって、既知の保存されたセルラーゼの配列に類似性を有する配列が同定されるまで、両端から測定する。保存された配列の測定に基づいて、遺伝子の残りの部分を塩基配列決定する。
【００７９】
単離された遺伝子は、２７のアミノ酸のシグナル配列を含む３７１のアミノ酸を有する前駆体タンパク質をコードする１１７３塩基対を含有する。成熟したタンパク質は、３４４のアミノ酸、推定３５７６６の分子量、および５．９の等電点からなる。前記セルラーゼをコードする遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号２）および成熟したセルラーゼの推定アミノ酸配列（配列番号１）が図１および図２に示されている。
【００８０】
上述のように調製された構造遺伝子をコードするセルラーゼ遺伝子のDNA断片を、ベクターpHPLT（図４参照）でクローン化した。このベクターは、バチルスリケニフォルミスの熱安定アミラーゼ遺伝子のプロモータおよびシグナル配列を含有し、バチルス属で高い発現を導出する（図５参照）。コンピテントバチルス宿主細胞の形質転換を、単離された組換えセルラーゼ産生バチルス属のクローンを使用して行い、クローン化されたセルラーゼの産生に好ましい条件下で培養した。
【００８１】
実施例３
セルラーゼの精製
実施例２からのセルラーゼ産生バチルスリケニフォルミスのクローンを、Trypton Soya Broth(Oxoid CM129)３%、２０μg/mlのネオマイシンを有する複合培地中で培養した。精製は、以下のようにして行ってもよい：発酵液を、遠心分離（８０００rpm）により培養液から分離する。上澄中のセルラーゼを、硫酸アンモニウム（６５%の飽和度）で沈殿させる。沈殿物を、７mS/cmの導電率が達成されるまで、pH７の２５mMリン酸緩衝液と５mMのEDTAに溶解する。この溶液をQ-Sepharose FF（直径５cm、長さ１０cm）Anion Exchange カラムに入れ、その後カラムを、０．２AUの吸光度になるまで、pH７の２５mMリン酸緩衝液と５mMのEDTAで洗浄する。pH７の２５mMリン酸塩中で、０Mから０．５Mまでの濃度勾配のNaClを８０分間カラムに注ぎ、続いて０．５Mから１Mまでの濃度勾配のNaClを１０分間加える。溶出は、最初の濃度勾配でしてもよい。溶出の後、カラムを１MのNaOHで洗浄し（上向きに）、pH７の２５mMリン酸緩衝剤と５mMのEDTAで再び平衡させる。
【００８２】
実施例４
セルラーゼ産生放線菌類からの１６ S rDNA の説明
実施例２および実施例３のセルラーゼを産生する、実施例１において単離された供与体の有機体の１６S-rDNAの最初の４００bpsのヌクレオチド配列を得た。これを図６に提供する（配列番号３）。この配列は、公開されているデータベース中の配列との比較を提供するFastA配列分析ソフトウェアパッケージを使用して分析した。分析の結果は、最も近い近縁種は、４６５塩基対の重複中９５．５%の１６S rDNA同一性を有するストレプトミセスサーモベオラセウス(thermoveolaceous)であった。菌株の部分的な１６S rDNA断片の同一性のパーセンテージは、菌株が放線菌類の未知の種を表すことを強く示している。得られた１６S rRNA配列の分析に基づいて（実施例１の外観と組合せて）、微生物をストレプトミセス類の種と分類した。
【００８３】
実施例５
本発明によるセルラーゼの特性
本発明による約３６kDのセルラーゼのpH/温度の特性を測定するために、セルラーゼの活性を様々のpHおよび温度値においてCMCで測定した。この工程は、基質としてカルボキシメチルセルロース（CMC）を使用する、（全）セルラーゼ活性を測定する比色定量法である。セルラーゼは、高いpHおよび温度で“PAHBAH”と反応する還元糖を遊離させる。この反応生成物は、分光光度計で測定できる。活性は、グルコースの検定曲線を使用して測定した。
【００８４】
化学物質： −低粘度CMC（Sigma C-5678,batch#23HO244）
−p-ヒドロキシ安息香酸ヒドラジド（“PAHBAH”,Sigma H-9882）
−D-グルコースモノヒドレート（Boom 8342）
−NaH2PO4*１aq（Merck 6346）
−H3PO4（85%;Merck 573）
−クエン酸*1aq（Merck 244）
−4N NaOH
−0.5N HCl
インキュベート緩衝剤 A （ 0.01M リン酸塩）：
1.38gのNaHPO4*1aqを、800mlの脱塩水(demi water)に溶解する。pHを4NのNaOHで7に調節し、混合液を脱塩水で1000mlにした。最後にpHをチェックし、必要なら調節した。この緩衝剤は、酵素試料の溶解および希釈に使用した。
【００８５】
インキュベート緩衝剤 B （ 0.1M クエン酸塩＋ 0.1M リン酸塩）：
23.06gのH3PO4を、脱塩水に溶解し200mlの体積にした（=1M）。42gのクエン酸を、脱塩水に溶解し200mlの体積にした（=1M）。20mlのクエン酸溶液を20mlのリン酸と混合し、脱塩水で150mlにした。pHを4NのNaOHで（4から10までの範囲に）調節し、体積を脱塩水で200mlにした。この緩衝剤は、基質製剤の溶解に使用した。
【００８６】
インキュベート緩衝剤 C （ 0.05M クエン酸塩＋ 0.05M リン酸塩）：
インキュベート緩衝剤Bを、脱塩水で1:1に希釈した。pHをチェックし、必要なら補正した。この溶液は、グルコース検定曲線に使用した。
【００８７】
基質製剤（ 1% ）：
強く攪拌しながら1gのCMCを100mlの脱塩水にゆっくりと加えた。激しい攪拌を少なくとも１時間続け、次にウルトラチュラックス（ultraturrax）で３０秒間処理した。
【００８８】
酵素溶液：
酵素試料を、約0.05U/mlの活性になるまで、インキュベート緩衝剤Aに溶解し希釈した（グルコース検定曲線）。
【００８９】
染料試薬（ 5% ）：
5gのPAHBAHを、0.5NのHCl 80mlに溶解し、溶液を0.5NのHClで100mlにした。使用前に、PAHBAH溶液１に対し0.5NのNaOHを４の割合で希釈した。
【００９０】
検定曲線：
保存溶液#1：1000mgのグルコースを100mlの脱塩水に溶解した（10mg/ml）。保存溶液#2：0.5mlの保存溶液#1を、当該pHのインキュベート緩衝剤C 9.5mlで希釈した（0.5ml）。
【００９１】
以下の滴定表を使用した：
【表１】
アッセイ工程：
（１） 標準グルコース、対照試料、試料、およびブランクの試験管を基質（1%）０．５mlおよび所望のpHのインキュベート緩衝剤Bで満たし、所望の温度の浴槽中に置いた；
（２） 溶液を１０分間プレインキュベートした；
（３） １５秒ごとに１００μlの標準グルコース、対照試料、または試料を基質とともに試験管に加えた；
（４） 溶液を３秒間ボルテックスし、浴槽に戻した；
（５） それぞれの試料を３０分間インキュベートした；
（６） ３mlのPAHBAH試薬を加えることにより、酵素反応を停止した；
（７） 生じた溶液を３秒間ボルテックスし、浴槽の外のラックに置いた；
（８） 全ての試験管が停止したら、１００μlの試料を当該ブランク試験管に加え、３秒間ボルテックスした；
（９） 試料を、１５分間沸騰した浴槽中に置いた；
（１０）生じた試料を５分間から１０分間冷たい水道水で冷却し、３秒間再びボルテックスした；
（１１）混合液の吸光度を、水を対照として４１０nmで測定した。
【００９２】
結果が図３に示されている。図３に示されているように３６kDのセルラーゼの最適pHは４０℃で約８、６０℃で約７である。
【図面の簡単な説明】
【図１】 本発明による約３６kDのセルラーゼの推定アミノ酸配列を示す図。コードされた文字は、IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Comission (GenBank Patentln User Manual，PC−DOS／MS−DOS Version,November 1990に示されている)による(配列番号１)
【図２】 本発明による約３６kDのセルラーゼをコードするDNA配列を示す図(配列番号２)
【図３】 ４０℃と６０℃における、本発明による約３６kDのセルラーゼのpH/活性を示すグラフ
【図４】 pHPLTベクターを示す図
【図５】 pHP11AG8ベクターを示す図
【図６】 本発明のセルラーゼが得られる放線菌類の16s RNA配列を示す図(配列番号３)
【配列表】
関連出願の説明
本出願は１９９７年１１月１９日に出願され、ここに完全に引用される、米国特許出願第０８／９７４０４２号の一部継続出願である。
【０００２】
発明の背景
A.技術分野
本発明は、放線菌類により産生し得るセルラーゼ組成物、そのようなセルラーゼの産生方法およびそのようなセルラーゼの使用に関するものである。本発明はさらに、例えば、洗剤組成物の添加物として、セルロース含有織物および繊維のようなテキスタイルの処理において、動物用飼料の添加物として、ベーキング(baking)の加工助剤として、パルプおよび紙の処理において、および高フルクトースのコーンシロップまたはエタノールの産生のためのでんぷんの処理において、セルラーゼを加えると利点があると従来技術において知られている組成物中の新しいセルラーゼの使用に関するものである。
【０００３】
B.技術の背景
セルラーゼは、セルロース中のβ―D―グルコシド結合を加水分解できる酵素である。セルロース分解酵素は従来、３つの主要種：エンドグルカナーゼ、エキソグルカナーゼまたはセロビオヒドロラーゼ、およびβ―グルコシダーゼ（Knowles,J.et al.,(1987),TIBTECH5,255-261）；に分類され、多数の細菌、酵母および真菌によって産生されることが知られている。
【０００４】
セルロース分解酵素の使用に関して発達してきた方法の中で重要なものは、（生物）エタノール産生のための（木）セルロースパルプの糖への分解、‘ストーンウォッシング’および‘バイオポリッシング’のようなテキスタイルの処理、および洗剤組成物におけるものを含む方法である。従ってセルラーゼは、汚れの除去、すなわちクリーニングのための洗剤組成物に有用であることが知られている。例えば、英国特許出願第２０７５０２８号、同第２０９５２７５号および同第２０９４８２６号は、洗剤がセルラーゼを含むとクリーニング効果が改善されることを示している。さらに、英国特許出願第１３５８５９９号は、綿含有織物の手触りの粗さを減じるために洗剤中にセルラーゼを使用することを説明している。
【０００５】
テキスタイルの処理におけるセルラーゼの別の有用な特徴は、色をより鮮やかにすることによって使用した織物を回復させる能力である。例えば、綿含有織物を繰返し洗うと織物が灰色の色合いになるが、これは機械的作用によって引き起こされる、時に“ピル（pills）”と称される分断されて乱雑になった小繊維によるものと考えられている。この灰色の色合いは、特に色のついた織物で目立つ。したがって、繊維の乱雑な一番上の層を取り除き、ゆえに織物の全体的な外観を改善できるというセルラーゼの能力は、有用である。
【０００６】
セルラーゼの主な用途である洗剤は、一般にアルカリ性条件下で作用するので、セルラーゼはpH７からpH１０までで優れた活性を有することが強く必要とされる。フミコラインソレン(Humicola insolens)およびトリコデルマリーセイ(Trichoderma reesei)からのような特徴のある真菌類のセルラーゼは、中性から低いアルカリ性のpHまでで十分に作用する。さらに、高アルカリ性pHでセルラーゼ活性を示す多くの酵素は、例えば国際特許出願公開第WO９６/３４０９２号および同第WO９６/３４１０８号に示されているように、バチルス属(Bacillus)および他の原核生物から単離されている。従って、真菌性および細菌性セルラーゼのどちらも、徹底的に研究されてきた。しかしながら、放線菌類から単離される、セルラーゼの第３グループは、少し注意を引いただけである。Wilson et al.,Critical Reviews in Biotechnology,Vol.12,pp.45-63(1992)は、サーモモノスポラフスカ(Thermomonospora fusca)、サーモモノスポラカーバタ(Thermomonospora curvata)、およびミクロビスポラビスポラ(Microbispora bispora)から産生したセルラーゼを研究し、これらのセルラーゼの多くが広い範囲のpH特性およびすぐれた温度安定性を示すことを説明した。同様に、Nakai et al.,Agric.Biol.Chem.,Vol.51,pp.3061-3065(1987)およびNakai et al.,Gene,Vol.65,pp.229-238(1988)は、アルカリ性の最適pHおよび優れた温度安定性を有するストレプトミセス(Streptomyces)菌株のKSM−９から、アルカリ耐性セルラーゼのcasAを例示している。
【０００７】
放線菌類からのいくつかの例を含む、所望の特性を有する多くのセルラーゼ組成物に関する従来技術における知識にもかかわらず、例えばテキスタイルの処理において、洗剤組成物の成分として、パルプおよび紙の処理において、動物用飼料の補給物として、ベーキングの加工助剤として、およびバイオマスの変換において有用な、様々の範囲の特性を有する新しいセルラーゼが、引き続き必要とされている。本出願人は、そのような特性を補足し、セルラーゼのそのような既知の方法において有用な、特定のセルラーゼを発見した。
【０００８】
発明の概要
本発明の目的は、洗剤に使用するために有用な温度およびpH特性を有する新しい放線菌類由来のセルラーゼ組成物を提供することにある。
【０００９】
本発明の別の目的は、織糸、織物、および衣服において所望の質を作り出すようにテキスタイルの処理に有用な特性を有する新しい放線菌類由来のセルラーゼ組成物を提供することにある。
【００１０】
本発明のもう１つの目的は、動物用飼料の添加物として、ベーキングの助剤として、パルプおよび紙の処理において、およびバイオマスの低減においての使用に有用な特性を有する新しい放線菌類由来のセルラーゼを提供することにある。
【００１１】
本発明のさらなる目的は、組換え宿主細胞からの異種（heterologous）発現を経てそのような新しい放線菌類由来のセルラーゼ組成物を産生する方法を提供することにある。
【００１２】
本発明のさらに別の目的は、本発明の新しいセルラーゼ組成物の工業的な産生を容易にするDNAおよびアミノ酸配列を提供することにある。
【００１３】
本発明のさらに別の目的は、洗剤において、テキスタイルの処理において、飼料の助剤として、およびパルプおよび紙の処理においての使用に優れた特性を有する新しいセルラーゼを提供することにある。
【００１４】
本発明によると、放線菌類または前記セルラーゼの誘導体から得られる新しいセルラーゼが提供される。好ましくは本発明のセルラーゼは、図１（配列番号１）によるアミノ酸配列、またはそれに対して５０％以上の配列同一性、好ましくは７０％以上の配列同一性、さらに好ましくは９０％以上の配列同一性を有する誘導体を含む。
【００１５】
別の実施の形態によると、本発明のセルラーゼをコードするDNAを有する組成物が提供される。好ましくは該DNAは、図２（配列番号２）によるアミノ酸配列、またはそれに対して７６％以上の配列同一性、好ましくは８０％以上の配列同一性、さらに好ましくは９０％以上の配列同一性を有する誘導体およびそれにより産生されたセルラーゼをコードする。本発明はさらに、適切な条件下で、図２に示されるDNAから得られるDNAプローブにハイブリッド形成するDNA、およびそれにより産生されるセルラーゼを実施の形態とする。
【００１６】
本発明のさらに別の実施の形態によると、本発明によるセルラーゼをコードするDNAで適切な微生物を形質転換する方法、および該形質転換された微生物から本発明によるセルラーゼを産生する方法が提供される。
【００１７】
本発明の特に好ましい実施の形態においては、成熟したセルラーゼは放線菌類に由来し、SDS-PAGE上で測定すると約３６kDの分子量を有する（以下で３６kDのセルラーゼと称する）。成熟した約３６kDのセルラーゼは、約５．９の計算された等電点、およびCMC上で４０℃で約８、６０℃で約７の最適pHを有する。本発明のセルラーゼは、少なくともpH５からpH１０までの広い活性範囲を有し、４０℃よりも６０℃において高い活性を示す。
【００１８】
発明の詳細な説明
“誘導体”とは、天然タンパク質のCおよびN末端の一方または両方への１つ以上のアミノ酸の付加、天然アミノ酸配列の１つまたは多数の異なる部位での１つ以上のアミノ酸の置換、天然タンパク質の一方または両方の末端あるいはアミノ酸配列の１つ以上の部位での１つ以上のアミノ酸の欠失、または天然アミノ酸配列の１つ以上の部位での１つ以上のアミノ酸の挿入によって、天然タンパク質から誘導されたタンパク質を意味する。酵素誘導体の調製は好ましくは、天然タンパク質をコードするDNA配列の修飾、適切な宿主への該DNA配列の形質転換、および誘導酵素を形成するために修飾したDNA配列の発現により達成される。本発明の誘導体は、前駆体酵素のアミノ酸配列（例えば本発明による野生型または天然状態の酵素）と比較して変化したアミノ酸配列を有するペプチドを有し、該ペプチドは前駆体酵素の特有の酵素の性質を保有しているが、いくつかの特定の側面では特性が変化している。例えば変化したセルラーゼは、最適pHまたは温度耐性が増加するかもしれないが、特有のセルロース分解活性は保有している。
【００１９】
“宿主細胞”とは、本発明による組換えDNAベクターの宿主および発現媒体として作用できる細胞を意味する。本発明による好ましい実施の形態においては、“宿主細胞”はバチルス属の細胞を意味する。
【００２０】
“DNA構成体”または“DNAベクター”とは、上述された新しいセルラーゼまたはセルラーゼ誘導体のどれでもコードする１つ以上のDNA断片を有するヌクレオチド配列を意味する。
【００２１】
本発明の特に好ましい実施の形態においては、成熟したセルラーゼは放線菌類に由来し、SDS-PAGE上で測定すると約３６kDの分子量を有する（ここでは３６kDのセルラーゼと称する）。成熟した約３６kDのセルラーゼは、約４．５の計算された等電点、およびCMC上で４０℃で約８、６０℃で約７の最適pHを有する。本発明のセルラーゼは、少なくともpH５からpH１０までの広い活性範囲を有し、４０℃よりも６０℃において高い活性を示す。
【００２２】
３６kDのセルラーゼのアミノ酸配列をコードする遺伝子は、様々なライブラリ (GenBank,Swiss-Prot,EMBL and PIR)の利用可能な配列データと比較することによって分析した。本発明のDNA配列によってコードされるセルラーゼを、公表されたまたは既知のセルラーゼ遺伝子配列によってコードされるセルラーゼと比較するためのデータベースの検索が、系統発生の近縁種を決定するために行われた。発見された最も高い相同性は、アスペルギルスアクレエアテス(Aspergillus aculeatus)からのエンドグルカナーゼ▲１▼、セルロモナスヒミ(Cellulomonas fimi)からのエキソセロビオヒドロラーゼ、およびクロストリジウムセルロボラン(Clostridium cellulovorans)からのエンドグルカナーゼCに対してであった。Pearson＆Lipman,Proc.Nat.Acad.Sci.,Vol.85,pp.2444-2448(1988)によって示されているようにTFastAプログラムを使用すると、約３６kDのセルラーゼは、アスペルギルスアクレエアテスからのエンドグルカナーゼ▲１▼に対して２４２残基の重複中３５．１％の配列が同一、セルロモナスヒミからのエキソセロビオヒドロラーゼに対して１１２残基の重複中４８．２%の配列が同一、およびクロストリジウムセルロボランからのエンドグルカナーゼCに対して１１４アミノ酸の重複中４４．７％の配列が同一であることが示された。TFastAデータ検索プログラムは、Sequence Analysis Software Package Version 6.0(Genetic Computer Group,Univ.Wisconsin Biotechnology Center,Madison,Wisconsin 53705)において工業的に利用できる。３６kDのセルラーゼをコードするDNA配列を、公表されているデータベースのDNA配列と比較することにより、最も近い相同性は、放線菌ロケイ(rochei)からのeglSをコードする遺伝子に対して（８２３塩基対の重複中７５．８％が同一）、および放線菌リビダン(lividans)からのcelBをコードする遺伝子に対して（７６５塩基対の重複中７４．９％が同一）であることが示される。
したがって本発明は、図１(配列番号１)によるアミノ酸配列を有するセルラーゼ、またはそれに対して５０％以上の配列同一性、好ましくは７０％以上の配列同一性、最も好ましくは９０％以上の配列同一性を有する誘導体を含む。同様に、本発明はさらに、図２(配列番号２)によるDNA、またはそれに対して７６％以上の配列同一性、好ましくは８０％以上の配列同一性、最も好ましくは９０％以上の配列同一性を有する誘導体を含む。
【００２３】
ここで、所定の断片と遺伝子のどちらがここに記載されるセルラーゼに相当し、したがって本発明の範囲に含まれるのかを分析するために、ハイブリッド形成を使用する。ハイブリッド形成アッセイは、実質的に以下のものである：例えば、製造者の使用説明書によるEcoR▲１▼,Hind▲３▼,BamH▲１▼,Cla▲１▼,Kpn▲１▼,Mlu▲１▼,Spe▲１▼,Bgl▲２▼,Nco▲１▼,Xba▲１▼,Xho▲１▼およびXma▲１▼（New England Biolabs,Inc.,Beverly,MA and Boehringer Mannheimによって提供される）などの制限酵素での切断によって、特定の標的源からのゲノムDNAを断片化する。次に、DNA断片の分画がサイズによって目に見えるように、試料をアガロースゲル（例えば０．８％のアガロース）を通して電気泳動する。ゲルを蒸留水で簡単に洗浄し、次に適切な溶液（例えば０．２５MのHCl）中で穏やかに振盪して脱プリン化し、３０分間穏やかに振盪して変性し、続いて３０分間（例えば０．４MのNaOH中で）穏やかに振盪して変性する。ゲルをpH７．０の１．５M NaCl、１M Tris中に置き、３０分間穏やかに振盪する再生段階を含めてもよい。次にDNAを適切な陽性電荷膜、例えばMaximum Strength Nytran Plus膜(Schleicher＆Schuell,Keene,N.H.)上に、転移溶液（例えば６×SSC(900mM NaCl,90mMクエン酸三ナトリウム）を使用して転移する。通常約２時間かそれ以上で転移が完了した後、洗浄液（例えば２×SSC[２×SSC=300mM NaCl,30mM trisodium citrate]）を使用して膜を洗浄した後室温で風乾する。次に膜を、（約２時間かそれ以上）適切なプレハイブリッド形成溶液（例えば、１００ml中にホルムアミド２０−５０ mls、２０×SSPE(１×SSPE=０．１８M NaCl,１mM EDTA,１０mM NaH2PO4,pH７．７)２５mls、２０％SDS２．５mls、１０mg/mlの剪断へリング精子DNA１mlを含有する水溶液） 中でプレハイブリッド形成する。当業者にとって自明であるように、プレハイブリッド形成溶液中のホルムアミドの量は、従来の方法によって得られる反応の性質によって異なってもよい。したがってホルムアミドの量を少なくすると、より多くのホルムアミドを使用する同じ工程よりも、ハイブリッド形成した分子を認識する点で、より完成したゲルになる。一方で、強いハイブリッド形成バンドは、より多くのホルムアミドを使用することにより容易に目で認識できる。
【００２４】
図２の配列から得られる、通常１００塩基から１０００塩基までの長さのDNAプローブは、アガロースゲルでの電気泳動によって分離され、断片はゲルから切り取られ、切り取られたアガロースから取り出される。次に、この精製されたDNAの断片を、（例えば、DNAにP32を組み込むために製造者の説明書によってMegaprime labeling system(Amersham International plc,Buckinghamshire,England)を使用し）、標識する。標識されたプローブを、５分間９５℃まで加熱して変性させ、上述の膜を含むプレハイブリッド形成溶液にすばやく加える。ハイブリッド形成反応は、適切な時間および適切な条件下、例えば穏かに振盪しながら３７℃で１８時間、行わなければならない。膜を洗浄し（例えば２×SSC/０．３％SDS中で）、次に適切な洗浄溶液および穏かな攪拌で洗浄する。所望のストリンジェンシーは、膜（フィルター）が洗浄される条件に依存する。
【００２５】
特に、所定の反応のストリンジェンシー（すなわち、ハイブリッド形成の成功に必要な相同性の度合い）は、ハイブリッド形成の後にサザンブロットからフィルタを洗浄する条件に依存するだろう。ここに定義するように、“低ストリンジェンシー”条件は、１５分間２０℃で０．２×SSC/０．１％SDSの溶液を使用したサザンブロットからのフィルターの洗浄を含む。“標準ストリンジェンシー”条件は、３０分間３７℃で０．２×SSC/０．１％SDSの溶液を使用した２度目のサザンブロットからのフィルターの洗浄を含む洗浄工程をさらに有する。
【００２６】
本発明はまた、セルラーゼを産生する方法を明らかにする。ソーダレイク（soda lake）試料をスクリーニングして適切なセルラーゼ産生有機体を単離することよってセルラーゼを産生することが可能である。前記有機体は、そのような放線菌類を増殖させるために知られている方法により増殖させることができる。しかしながら、適切なセルラーゼ産生菌株を単離するよりも、ここに提供されるセルラーゼをコードするDNAで適切な宿主細胞を形質転換させる遺伝工学技術を使用して本発明によるセルラーゼを少量だけ産生し、生じた組換え微生物を宿主細胞の増殖とセルラーゼの発現に適切な状況下で培養するほうがより効果的である。第１段階として、染色体DNAを、例えばサイトウおよびミウラの方法（Saito＆Miura,Biochim.Biophys.Acta.,Vol.72,pp.619(1963)）または類似した方法によって供与体の放線菌菌株から得てもよい。このようにして得られる染色体DNAの制限酵素開裂により、アルカリ性セルラーゼ遺伝子を含有するDNA断片を与が得られる。この目的のために、前記遺伝子領域を開裂しないなら、どの制限酵素を使用してもよい。あるいは、酵素濃度または培養時間を、部分的な切断しかできないように低くするなら、前記遺伝子を開列する制限酵素を使用してもよい。好ましい制限エンドヌクレアーゼはSau3Aである。生じた切断混合物から適切な断片（４kbから１０kbまで）を単離し、DNA構成体を使用して適切な宿主細胞を形質転換するのに使用してもよい。
【００２７】
本発明のセルラーゼをコードする遺伝子は、λ―ファージ（発現）ベクターおよび大腸菌（E.coli）宿主細胞を使用してクローン化できる。（あるいは、保護領域上で設計されたコンセンサス（consensus）プライマーを使用するポリメラーゼ連鎖反応（PCR）クローニングを使用してもよい）。E.coliでの第１のクローニング工程の後、本発明によるセルラーゼ遺伝子は、バチルス属またはストレプトミセス種のような産業上より好ましい発現宿主、アスペルギルス属(Aspergillus)またはトリコデルマ属のような糸状真菌、あるいはサッカロミセス属(Saccharomyces)のような酵母に転移できる。これらの宿主有機体で得られる高レベルの発現および分泌は、後にセルラーゼをそこから回収できる発酵培地でのセルラーゼの蓄積を可能にする。
【００２８】
セルラーゼは、必要であれば細胞分裂の後に、遠心分離またはろ過により培地から細胞を分離し、例えば硫酸アンモニウムのような塩によって上澄またはろ液のタンパク様の成分を沈殿させ、続いて、例えばイオン交換クロマトグラフィ、アフィニティクロマトグラフィ、または同様の従来技術において知られている方法のような様々なクロマトグラフィ法によって精製する各工程を含む従来の方法によって培地から回収してもよい。本発明によるアルカリ性のセルラーゼの産生のために、セルロース由来のエネルギー源を含有する培地を使用してアルカリ性の条件下で培養するのが好ましい。
【００２９】
好ましくは、発現宿主細胞はバチルス種を含み、より好ましくはバチルスリケニフォルミス(licheniformis)または枯草菌を含む。特に好ましい実施の形態においては、形質転換宿主は、産生物のセルラーゼが発酵液またはその凝縮液中でタンパク分解を受けないことを確実にするために、プロテアーゼ遺伝子を欠失する。プロテアーゼ欠失バチルス属菌株の好ましい一般的な形質転換および発現プロトコルは、ここに引用される、フェラーリ等の米国特許第５２６４３６６号に提供されている。アスペルギルスにおける形質転換および発現は、ここに引用される、ベルカ等の米国特許第５３６４７７０号に記載されている。本出願人は、本発明の遺伝子のバチルス属への形質転換は、天然の調節機構を使用する時に生じる発現の点から不十分または効果的でないことを発見した。したがって、バチルス種へ形質転換する時、標準の既知バチルス属由来シグナル配列および他の調節配列と組み合わせてaprEプロモータを使用することが好ましい。形質転換宿主細胞がアスペルギルスの時、好ましいプロモータはglaAである。
【００３０】
本発明によるテキスタイルの処理は、セルラーゼを有する組成物を使用するテキスタイルの処理またはクリーニングを考慮している。そのような処理は、ストーンウォッシュ、セルロース含有織物の手触り、感触および/または外観の変更、またはセルロース含有織物を製造またはクリーニング/修復するときに使用する他の技術を有するが、それに限定されるものではない。さらに、本発明の範囲内での処理は、セルロースの織物または繊維からの“未熟な”または“死んだ”綿の除去を考慮している。未熟な綿は、成熟した綿よりかなり不定形であり、例えばむらのある染色などより低い質の織物の原因になる。本発明で考慮されている組成物はさらに、汚れた製品のセルロース含有織物の洗浄に使用するセルラーゼ組成物を有している。例えば、セルラーゼは洗濯物のための洗剤組成物に使用してもよい。本発明による有用な洗剤組成物は、予洗、浸置き、および家庭用の色回復組成物などの特別な配合物を有している。ここに記載されているように、そのような処理組成物は、希釈を必要とする濃縮液の形態、希釈液の形態、またはセルロース含有織物に直接施せる形態でもよい。テキスタイルのセルラーゼ処理の一般的な処理技術は、例えば欧州特許出願公開第２２００１６号および英国特許出願第１３６８５９９号および同第２０９５２７５号に記載されている。
【００３１】
本発明によるセルロース物質の処理はさらに、従来技術において知られている目的のための動物用飼料、紙および/またはパルプ、食物、および穀物の処理を考慮に入れている。例えば、セルラーゼは動物用飼料の価値をあげ、木材パルプの排水性を改善し、食物生産を高め、湿気のある製粉工程でも乾燥した製粉工程でも穀物中の繊維を減らすことが知られている。
【００３２】
本発明による処理は、例えば緩衝剤、界面活性剤、および/または洗毛剤を含む他の任意の成分とともに、効果的な量のセルラーゼを含有する水溶液を調製することを備えている。セルラーゼ酵素組成物の効果的な量は、意図される目的に十分なセルラーゼ酵素の濃度である。したがって、例えば本発明によるストーンウォッシュ組成物におけるセルラーゼの“効果的な量”とは、所望の効果、例えば縫い目および織物の布に使い古したおよび色あせた外観を作製することを提供する量である。同様に、セルロース含有織物の手触りおよび/または外観を改善するために意図される組成物におけるセルラーゼの“効果的な量”とは、手触りの改善、例えば織物の滑らかさの改善、または外観の改善、例えば織物の外観の鮮明さを下げる傾向がある毛玉および小繊維の除去などの適度な改善をする量である。使用されるセルラーゼの量は、使用される装置、使用される工程のパラメータ（セルラーゼ処理溶液の温度、セルラーゼ溶液にさらす時間等）、およびセルラーゼ活性（例えば特定の溶液は、より活性の高いセルラーゼ組成物を使うと、より活性の低いセルラーゼ組成物を使うときに比べて低いセルラーゼ濃度しか必要としない）にも依存する。テキスタイルの処理のために加える水性の処理溶液中のセルラーゼの的確な濃度は、上述の要因並びに所望の結果に基づいて、当業者によって容易に決定できる。ストーンウォッシュ工程では、セルラーゼは通常、水性処理溶液中において好ましくは約０．５ppmから約５０００ppmまでの範囲、最も好ましくは約１０ppmから約２００ppmまでの範囲の全タンパク質の濃度である。セルロース含有織物の手触りおよび/または外観の改善のための組成物においては、セルラーゼは通常、水性処理溶液中において約０．１ppmから約２０００ppmまでの範囲、最も好ましくは約０．５ppmから約２００ppmまでの範囲の全タンパク質の濃度である。
【００３３】
好ましい処理の実施の形態においては、緩衝剤の濃度が、使用されるセルラーゼがその性質に依存する活性を示す範囲内で水溶液のpHを維持するのに十分であるように、緩衝剤を処理組成物に使用する。使用される緩衝剤の的確な濃度は、当業者が容易に考慮できるいくつかの要因に依存する。例えば、好ましい実施の形態においては、緩衝剤並びに緩衝剤の濃度は、最適なセルラーゼ活性のために必要なpH範囲内に最終的なセルラーゼ溶液のpHを維持するように選択される。本発明のセルラーゼの最適なpHの範囲の測定は、よく知られている技術によって確かめられる。セルラーゼの活性範囲内のpHにおける適切な緩衝剤は、この分野の当業者によく知られている。
【００３４】
セルラーゼと緩衝剤に加えて、前記処理組成物は必要に応じて界面活性剤を含有してもよい。適切な界面活性剤は、例えば陰イオン、非イオン、および両性電解質の界面活性剤を含む、セルラーゼおよび織物と相溶性のある界面活性剤を含む。ここで使用する適切な陰イオンの界面活性剤は、直鎖状のまたは側鎖のあるアルキルベンゼンスルホン酸塩；直鎖状のまたは側鎖のあるアルキル基またはアルケニル基を有するアルキルまたはアルケニルエーテル硫酸塩；アルキルまたはアルケニル硫酸塩；オレフィンスルホン酸塩；アルカンスルホン酸塩等を含む。陰イオンの界面活性剤に適切な対イオンは、ナトリウムおよびカリウムのようなアルカリ金属イオン；カルシウムおよびマグネシウムのようなアルカリ土類金属イオン；アンモニウムイオン；および、炭素数が２または３の、１から３までのアルカノール基を有するアルカノールアミンを含む。両性電解質の界面活性剤は、第４アンモニウム塩硫酸塩、およびベタイン型の両性電解質の界面活性剤を含む。そのような両性電解質の界面活性剤は、同じ分子内に陽性および陰性の両方の荷電基を有している。非イオンの界面活性剤は通常、ポリオキシアルキレンエーテル、並びに高級脂肪酸のアルカノールアミドまたはそれにアルキレンオキシド付加物がついたものおよび脂肪酸のグリセリンモノエステルを有する。界面活性剤の混合物も当業者に知られる方法で使用できる。
【００３５】
濃縮したセルラーゼ組成物は、ここで記載する方法において使用するために調製することができる。そのような濃縮液は、好ましくは水溶液中に、上述のセルラーゼ組成物、緩衝剤および界面活性剤の濃縮量を含有している。そのように配合されるとセルラーゼ濃縮液は、個々の成分の必要な濃度を有するセルラーゼ調製物をすばやく正確に調製するように水で容易に希釈することができる。水性の濃縮液が配合されると、これらの濃縮液は、上述のようなセルラーゼ溶液中の成分の必要な濃度に達するように希釈することができる。容易に分かるように、そのようなセルラーゼ濃縮液により、セルラーゼ溶液の容易な配合、並びに使用される場所への組成物の便利な輸送が可能になる。処理濃縮液は、例えば液体、乳液、ゲル、またはペーストのような、従来技術において知られている形態にすることができる。そのような形態は、当業者によく知られている。
【００３６】
固体状のセルラーゼ濃縮を使用する場合、セルラーゼ組成物は粒子、粉末、凝集体、または固体の円板でもよい。粒子は、洗浄液への粒子の溶解速度を下げる物質を含有するように配合される。そのような物質および粒子は、ここに引用される米国特許第５２５４２８３号に開示されている。
【００３７】
可能性のある組成物の使用に依存して、石、軽石、充填剤、溶媒、酵素活性化剤、および再付着防止剤を含む他の物質もまた所望のように、本発明のセルラーゼ組成物とともに、またはその中で使用できる。
【００３８】
実施例としてストーンウォッシュ法を詳細に記述するが、記述されているパラメータは、他の用途、すなわち織物の手触りおよび/または外観の改善のために、当業者によって容易に変更される。処理組成物をストーンウォッシュ組成物と混合し、それによりセルラーゼ酵素を織物に近接させることにより、セルロース含有織物を効果的な量のセルラーゼを含有する、セルラーゼ含有ストーンウォッシュ組成物と接触させる。続いて、セルラーゼおよび繊維を含有する水溶液を攪拌する。処理組成物が水溶液なら、織物は溶液に直接浸される。同様に、ストーンウォッシュ組成物が濃縮液のときは、濃縮液を希釈してセルロース含有織物とともに容器に入れる。ストーンウォッシュ組成物が、例えば予洗ゲルまたは固体の棒材のように固体形状のときは、ストーンウォッシュ組成物は、組成物を織物または洗浄液に直接施すことにより接触させてもよい。
【００３９】
セルロース含有織物は、酵素作用がセルロース含有織物にストーンウォッシュされた外観を与えるのに有効な条件下、ストーンウォッシュ溶液でインキュベートする。ストーンウォッシュ中に、例えばpH、溶液の割合、温度、および反応時間を、ストーンウォッシュ組成物が作用する条件を最適化するために調節してもよい。“効果的な条件”は、セルラーゼ酵素がセルロース含有織物と効果的に反応する、この場合はストーンウォッシュ効果を作り出す事、を可能にするｐＨ、溶液の割合、および温度に必然的に関係する。本発明によるストーンウォッシュ組成物を使用するために条件を最適にするのは、当業者にとって当然である。
【００４０】
ここで使用されているストーンウォッシュ中の溶液の割合、すなわち織物の重量に対するストーンウォッシュ組成物溶液（すなわち洗浄液）の重量の割合は、通常デニム織物に所望のストーンウォッシュ効果を達成するのに十分な量であり、使用される工程に依存する。好ましくは溶液の割合は、約４：１から約５０：１まで、より好ましくは約５：１から約２０：１まで、最も好ましくは約１０：１から約１５：１までである。
【００４１】
本発明のストーンウォッシュ組成物によるストーンウォッシュ中の反応温度は、２つの対抗する要因によって決定される。第１に、温度を上げると通常反応速度論を高める、すなわち反応を早くし、これは低い温度で必要とされる反応時間に比べて反応時間を減らすことを可能にする。したがって、反応温度は通常、少なくとも約１０℃以上である。第２に、セルラーゼは所定の反応温度を越えると活性を失うタンパク質であり、その温度は使用されるセルラーゼの性質に依存する。したがって、反応温度を高くしすぎると、セルロース分解活性はセルラーゼの変性の結果として失われる。従来技術におけるセルラーゼの使用に標準的な温度は通常、３５℃から６５℃までの範囲であり、この条件は本発明のセルラーゼにも適切であると思われるが、最適な温度条件は、使用される特定のセルラーゼに関してよく知られている技術によって確かめるべきである。
【００４２】
反応時間は、ストーンウォッシュが行われる特定の条件に依存する。例えばセルラーゼのpH、温度および濃度の全てにより、最適な反応時間が生み出される。通常、反応時間は約５分から約５時間まで、好ましくは約１０分から約３時間まで、より好ましくは約２０分から約１時間までの範囲である。
【００４３】
本発明のさらに別の好ましい実施の形態によると、本発明のセルラーゼは、洗剤組成物に使用してもよい。本発明による洗剤組成物は、予洗組成物、浸置き組成として、または通常の洗浄またはすすぎ中のクリーニングに、有用である。好ましくは、本発明の洗剤組成物は、効果的な量のセルラーゼ、界面活性剤を有し、必要に応じて、以下に示す他の成分を有してもよい。
【００４４】
本発明の洗剤組成物において使用されるセルラーゼの効果的な量は、セルロース含有織物上でセルラーゼによって生じることが知られている所望の効果、例えば毛玉取り、やわらか仕上げ、非毛玉加工、表面繊維除去、非汚れ加工およびクリーニング、などを与えるのに十分な量である。好ましくは、洗剤組成物中のセルラーゼは、洗剤の約１０ppmから約２００００ppmまでの範囲の濃度で使用する。
【００４５】
洗剤組成物において使用されるセルラーゼ酵素の濃度は好ましくは、洗浄液への希釈に基づいて、セルラーゼ酵素の濃度が全タンパク質の約０．０１ppmから約１０００ppmまでの範囲、好ましくは約０．０２ppmから約５００ppmまでの範囲、最も好ましくは約０．５ppmから約２５０ppmまでの範囲になるように選択する。洗剤組成物において使用されるセルラーゼ酵素の量は、洗剤が洗浄液を作成するように水に加えられて希釈される程度に依存する。
【００４６】
本発明の洗剤組成物は、例えば液体、粒子、乳液、ゲル、またはペーストのような、従来技術において知られている形状でもよい。そのような形状は当業者によく知られている。固体の洗剤組成物を使用する時は、セルラーゼは好ましくは粒子の形状をしている。好ましくは粒子は、セルラーゼ保護物質を付加的に含有するように配合される。粒子は、粒子の洗浄液への溶解速度を減らす物質を含有するように配合しても差し支えない。そのような物質および粒子は、ここに引用される米国特許第５２５４２８３号に開示されている。
【００４７】
本発明の洗剤組成物は、表面活性物質、すなわち、洗剤組成物における使用でよく知られている、陰イオン、非イオンおよび両性電解質の界面活性剤を含む界面活性剤を使用する。
【００４８】
本発明の洗剤組成物において使用する適切な陰イオンの界面活性剤は、直鎖状のまたは側鎖のあるアルキルベンゼンスルホン酸塩；直鎖状のまたは側鎖のあるアルキル基またはアルケニル基を有するアルキルまたはアルケニルエーテル硫酸塩；アルキルまたはアルケニル硫酸塩；オレフィンスルホン酸塩；およびアルカンスルホン酸塩を含む。陰イオンの界面活性剤に適切な対イオンは、ナトリウムおよびカリウムのようなアルカリ金属イオン；カルシウムおよびマグネシウムのようなアルカリ土類金属イオン；アンモニウムイオン；および、炭素数が２または３の、１から３までのアルカノール基を有するアルカノールアミンを含む。両性電解質の界面活性剤は、第４アンモニウム塩硫酸塩、およびベタイン型の両性電解質の界面活性剤を含む。そのような両性電解質の界面活性剤は、同じ分子内に陽性および陰性の両方の荷電基を有している。非イオンの界面活性剤は通常、ポリオキシアルキレンエーテル、並びに高級脂肪酸のアルカノールアミドまたはそれにアルキレンオキシド付加物がついたものおよび脂肪酸のグリセリンモノエステル等を有する。本発明における使用に適切な界面活性剤は、ここに引用される、英国特許出願第２０９４８２６A号に開示されている。そのような界面活性剤の混合物も使用することができる。界面活性剤または界面活性剤の混合物は通常、本発明の洗剤組成物において、全洗剤組成物の約１重量％から約９５重量％までの範囲、好ましくは全洗剤組成の約５重量％から約４５重量％までの範囲の量で使用される。セルラーゼ組成物および界面活性剤に加えて、本発明の洗剤組成物も、必要に応じて以下の成分を１つ以上含有することができる。
【００４９】
セルラーゼ以外のヒドロラーゼ
適切なヒドロラーゼとしては、エステル結合に作用するカルボキシレートエステルヒドロラーゼ、チオエステルヒドロラーゼ、リン酸モノエステルヒドロラーゼ、およびリン酸ジエステルヒドロラーゼ；グリコシル化合物に作用するグリコシドヒドロラーゼ；N―グリコシル化合物を加水分化する酵素；エーテル結合に作用するチオエステルヒドロラーゼ；およびペプチド結合に作用するa―アミノ―アシル―ペプチドヒドロラーゼ、ペプチジル―アミノ酸ヒドロラーゼ、アシル―アミノ酸ヒドロラーゼ、ジペプチドヒドロラーゼ、およびペプチジル―ペプチドヒドロラーゼが挙げられる。それらの中で好ましいのは、カルボキシレートエステルヒドロラーゼ、グリコシドヒドロラーゼ、およびペプチジル―ペプチドヒドロラーゼである。適切なヒドロラーゼとしては、（１）ペプシン、ペプシンB、レンニン、トリプシン、キモトリプシンA、キモトリプシンB、エラスターゼ、エンテロキナーゼ、カテプシンC、パパイン、キモパパイン、フィシン、トロンビン、フィブリノリシン、レニン、サブチリシン、アスペルギルスペプチダーゼA、コラゲナーゼ、クロストリジオペプチダーゼB、カリクレイン、ガストリシン、カテプシンD、ブロメリン、ケラチナーゼ、キモトリプシンC、ペプシンC、アスペルギルスペプチダーゼB、ウロキナーゼ、カルボキシペプチダーゼAおよびB、およびアミノペプチダーゼのようなペプチジル―ペプチドヒドロラーゼに属するプロテアーゼ；（２）α―アミラーゼ、β―アミラーゼ、グルコアミラーゼ、インベルターゼ、リゾチーム、ペクチナーゼ、キチナーゼ、およびデキストラナーゼのようなグリコシドヒドロラーゼ（必須成分であるセルラーゼはこの群から除かれている）が挙げられる。これらの中で好ましいのは、α―アミラーゼおよびβ―アミラーゼである。それらは酸性で、中性の系に作用するが、細菌から得られるもの；（３）カルボキシルエステラーゼ、リパーゼ、ペクチンエステラーゼ、およびクロロフィラーゼを含むカルボキシレートエステルヒドロラーゼは、アルカリ性の系で高い活性を示す。それらの中で特に効果的なのは、リパーゼである。
【００５０】
セルラーゼ以外のヒドロラーゼは、目的に必要なだけ洗剤組成物に入れられる。好ましくは、精製したタンパク質に関して０．００１重量%から５重量％までの範囲、より好ましくは０．０２重量%から３重量％までの範囲で入れられる。この酵素は、粗酵素だけからなる粒子の形状で、または洗剤組成物中の他の成分と組合せて、使用される。粗酵素の粒子は、精製された酵素が粒子の中で０．００１重量%から５０重量％までの範囲になる量で使用される。粒子は、０．００２重量%から２０重量%までの範囲、好ましくは０．１重量%から１０重量％までの範囲で使用される。セルラーゼと同様に、これらの粒子は、酵素保護物質および溶解遅延剤を含有するように作成してもよい。
【００５１】
陽イオンの界面活性剤および長鎖脂肪酸塩
そのような陽イオンの界面活性剤および長鎖脂肪酸塩は、飽和または不飽和脂肪酸塩、アルキルまたはアルケニルエーテルカルボン酸塩、α―スルホ脂肪酸塩またはエステル、アミノ酸型界面活性剤、リン酸エステル界面活性剤、３から４までのアルキル置換基を有する第４アンモニウム塩、および１つまでのフェニル置換アルキル置換基を有する。好ましい陽イオンの界面活性剤および長鎖脂肪酸塩は、ここで引用される英国特許出願第２０９４８２６A号に開示されている。その組成物は、そのような陽イオンの界面活性剤および長鎖脂肪酸塩を約１重量%から約２０重量％まで含有していてもよい。
【００５２】
研磨剤
A. 二価金属イオン封鎖剤
前記組成物は、以下の化合物：リン酸塩、ホスホン酸塩、ホスホノカルボン酸塩、アミノ酸の塩、アミノポリアセチレート高分子電解質、非解離ポリマ、ジカルボン酸塩、およびアルミノケイ酸塩の、アルカリ金属塩およびアルカノールアミン塩からなる群より選択される１つ以上のビルダーの組成物を、約０重量%から約５０重量％まで含有してもよい。好ましい二価金属イオン封鎖剤は、ここで引用される英国特許出願第２０９４８２６A号に開示されている。
【００５３】
B. アルカリまたは無機電解質
前記組成物は、アルカリまたは無機電解質としての以下の化合物：ケイ酸塩、炭酸塩、および硫酸塩並びに、トリエタノールアミン、ジエタノールアミン、モノエタノールアミン、およびトリイソプロパノールアミンのような有機アルカリの１つ以上のアルカリ金属塩の組成物に基づき、約１重量%から約５０重量％まで、好ましくは約５重量%から約３０重量％までを含有してもよい。
【００５４】
再付着防止剤
前記組成物は、再付着防止剤としての以下の化合物：ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、およびカルボキシメチルセルロースの１つ以上を約０．１重量%から約５重量％まで含有してもよい。
【００５５】
それらの中で、カルボキシメチルセルロースおよび/またはポリエチレングリコールと本発明のセルラーゼ組成物の組合せは、特に有用な汚れ除去組成物を提供する。
【００５６】
漂白剤
過硫酸カリウム、過炭酸ナトリウム、過ホウ酸ナトリウム、硫酸ナトリウム/過酸化水素付加物、および塩化ナトリウム/過酸化水素付加物および/またはスルホン酸フタロシアニンの亜鉛またはアルミニウム塩のような感光性の漂白染料、のような漂白剤と組み合わせた本発明のセルラーゼを使用すると、さらに洗浄効果が改善される。同様に、欧州特許第６８４３０４号に記載されている漂白剤および漂白触媒を使用してもよい。
【００５７】
青味剤および蛍光染料
必要なら、様々の青味剤および蛍光染料を前記組成物に含んでもよい。好ましい青味剤および蛍光染料は、ここで引用される英国特許出願第２０９４８２６A号に開示されている。
【００５８】
ケーキング防止剤
以下のケーキング防止剤：p―トルエンスルホン酸塩、キシレンスルホン酸塩、酢酸塩、スルホコハク酸塩、タルク、細かく砕いたシリカ、非結晶のシリカ、土、ケイ酸カルシウム（Micro-Cell of Johns Manville Co.）、炭酸カルシウム、および酸化マグネシウムを、粉末状の洗剤に混合してもよい。
【００５９】
酸化防止剤
酸化防止剤は、例えば第３―ブチル―ヒドロキシトルエン、４，４’―ブチリデンビス（６―第３―ブチル―３―メチルフェノール）、２，２’―ブチリデンビス（６―第３―ブチル―４―メチルフェノール）、モノスチレンクレゾール、ジスチレンクレゾール、モノスチレンフェノール、ジスチレンフェノール、および１，１―ビス（４―ヒドロキシ―フェニル）シクロヘキサンを有する。
【００６０】
可溶化剤
可溶化剤は、例えばエタノールのような低級アルコール、ベンゼンスルホン酸塩、p―トルエンスルホン酸塩のような低級アルキルベンゼンスルホン酸塩、プロピレングリコールのようなグリコール、アセチルベンゼンスルホン酸塩、アセトアミド、ピリジンジカルボン酸アミド、安息香酸塩、および尿素を有する。
【００６１】
本発明の洗剤組成物は、酸性からアルカリ性まで広いpH範囲で使用することができる。好ましい実施の形態においては、本発明の洗剤組成物は、５以上から約１２までのpHを有する弱酸性、中性、またはアルカリ性の洗剤洗浄媒質中で使用することができる。
【００６２】
上述の成分の他に、所望なら本発明の洗剤組成物とともに、香料、緩衝剤、防腐剤、染料等を使用できる。そのような成分は、従来技術でこれまで使用されてきた量で使用される。
【００６３】
本発明で使用される洗剤の主成分が粉末の形状の場合、吹きつけ乾燥法および造粒法を含むどの既知の調製法によって調製してもよい。特に、吹きつけ乾燥法、凝集法、乾燥攪拌法、または非塔式経路（non-tower route）法によって得られる洗剤の主成分が好ましい。吹きつけ乾燥法によって得られる洗剤の主成分は、調製条件に関して限定されない。吹きつけ乾燥法によって得られる洗剤の主成分は、界面活性物質およびビルダーのような耐熱性成分の水性スラリーを熱した場所に吹き付けることによって得られる中空の粒子である。吹きつけ乾燥の後、香料、酵素、漂白剤、無機アルカリ性ビルダーを加えてもよい。吹きつけ乾燥造粒または凝集法によって得られるような高密度の粒状洗剤の主成分とともに、主成分の調製の後、様々の成分を加えてもよい。
【００６４】
洗剤の主成分が液体の場合、均質の溶液または不均質のコロイド分散のどちらでもよい。洗剤中のセルラーゼによるカルボキシメチルセルロースの分解を防ぐために、カルボキシメチルセルロースは組成物に加える前に粒状化するかコーティングするのが望ましい。
【００６５】
本発明の洗剤組成物は、従来どおり使用される温度、反応時間、および液体の割合で、産業上のおよび家庭での使用において、セルロース含有織物、例えば汚れた織物とともにインキュベートしてもよい。
【００６６】
本発明による洗剤は、十分な活性が存在して所望の改善であるやわらか仕上げ、毛玉取り、非毛玉加工、表面繊維除去、または洗浄を提供する中間pHにおいて適切な溶液中、予洗として追加で配合してもよい。洗剤組成物が、液体、スプレー、ゲル、またはペーストの浸置き（例えば予洗または前処理）組成物の場合、セルラーゼ酵素は通常、浸置きまたは前処理組成物の総重量に基づいて、約０．０００１重量％から約１重量％までで使用される。その様な組成物では、界面活性剤を必要に応じて使用してもよく、使用する場合通常、浸置きの総重量に基づいて約０．００５重量％から約２０重量％までの濃度で存在する。組成物の残りは、浸置きで使用される従来の成分、すなわち従来の濃度での希釈液、緩衝剤、他の酵素（プロテアーゼ）等を含む。
【００６７】
ここに記載されるセルラーゼ酵素を有する組成物は、それだけで色あせた織物に色を戻すのに適切な組成物（例えばここで引用される米国特許第４７３８６８２号を参照）として家庭用に、並びに、汚れの除去においておよび毛玉取り、非毛玉加工のために、使用できると考えられる。
【００６８】
本発明によるセルラーゼの使用は、飼料添加物、およびパルプおよび紙の処理において特に効果的である。これらの付加的な産業上の方法は、例えば国際特許出願公開第WO９５/１６３６０号およびフィンランド国特許第８７３７２号にそれぞれ記載されている。
【００６９】
本発明およびそれについての利点をさらに説明するために、以下の特定の実施例はそれらが本発明を説明するために提供されたものであり、発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではないということの理解とともに提供される。
【００７０】
実施例
実施例１
セルラーゼ産生微生物のアルカリ性の土および水の試料からの単離
アルカリ性の泥の試料を４%(w/v)NaCl：１%(w/v)Na２CO３５ml中に懸濁させ、激しく振盪した。同じ溶液の連続的な希釈液を、リファンピシン５０μg ml−１を含有するpH１０の土抽出寒天培地上で培養した。
【００７１】
土抽出寒天培地は以下のように調製した：１kgの庭土を１リットルの脱塩水中に懸濁させる。懸濁液を、１２０℃で２０分間加圧滅菌する。懸濁液をガラス繊維フィルタ（Whatman,GF/A）上でろ過し、固体を脱塩水（１×２００ml、１×１００ml）で２度洗浄する。ろ液を水で１リットルにする。 凝固のために加えた２%(w/v)の寒天を有する８%(w/v)NaCl：２%(w/v)Na２CO３の滅菌溶液と、同体積の滅菌したろ液を混合する。
【００７２】
プレートを、蒸発を防ぐために密閉した箱の中で数週間、３０℃でインキュベートした。プレートは定期的に実体顕微鏡で検査し、０．３%(w/v)カルボキシメチルセルロースを含有するアルカリ性の寒天培地に微小コロニーを移した。プレートの１つを０．１%(w/v)コンゴレッド（Congo Red）に１５分間浸すことにより、デュプリケート培養を使用してセルラーゼ活性を検出した。プレートは、１M NaClで３０分間汚れを取り除いた。コロニーの周りに透明な区域を示す菌株を、微生物を産生する可能性のあるセルラーゼとして選択した。
【００７３】
透明な区域を示す菌株は、国際特許出願公開第WO９６/３４１０８号（８ページ）に記載されているように２５ml中で発酵させ、その後CMCを加えた。
【００７４】
上述の方法を使用し、本発明によるセルラーゼを産生する菌株を単離し、さらに糸状バクテリアと認めた。外観および部分的な１６s rRNA遺伝子配列分析（実施例４）に基づいて、微生物をストレプトミセス属の種類と分類した。
【００７５】
セルラーゼを産生する菌株を形態学的に検査した。pH１０で土抽出寒天培地上で培養すると、最初小さくて丸い輝く透明のコロニーは、数日後、白色から灰色がかった白色の気菌糸になった。アルカリ性の寒天培地上では、菌株は成熟すると、気菌糸を産生する、乾いて堅い、クリーム色の、不透明なコロニーを形成する。顕微鏡下では菌株は、断片が不規則な杆状体、分離した胞子、および連鎖した胞子になる、広く枝分かれした偽菌糸体を示す。
【００７６】
実施例２
セルラーゼの DNA の単離、形質転換、および発現
実施例１によって単離したアルカリ性の放線菌類菌株を、E.coli.での発現クローニングのための供与体菌株として選択した。染色体DNAを、Saito＆Miura,Biochim.Biophys.Acta.,Vol.72,pp.619-629(1963)に記載されている方法によって単離した。
【００７７】
単離された染色体DNAを、提供者によって推薦される条件下、反応緩衝剤（Gibco BRL Life Technologies,Gaithersburg,Md.,USA）を使用して３７℃で１時間、連続的に希釈した酵素溶液を使用して制限酵素Sau3Aによって部分的に切断した。切断された DNAをアガロースゲル電気泳動によって分離し、好ましい断片（２kbから６kbまで）を、供給者（QIAGEN Inc.,Chatsworth,CA,USA）によって記載されるプロトコルによりQIAquick Gel Extraction Kitを使用してゲルから単離する。
【００７８】
アルカリ耐性放線菌類菌株のゲノム遺伝子ライブラリは、pUC１９由来のプラスミド中で作製される（Yanisch-Perron,C.et al.,(1985)Gene 33:103）。組換え型クローンは、Wood et al.,Meth.Enzym.,Vol.160,pp.59-74(1988)によって記載されているように、寒天拡散法によってスクリーニングする。コロニーの周りに透明な区域を示す菌株を単離する。セルラーゼ産生組換え体のプラスミドDNAを、提供者（QIAGEN Inc.）によって記載されたプロトコルによりQIAprep Plasmid Kitを使用して単離する。３．５kbの断片のヌクレオチド配列は、公開されているデータベースに対するFastA検索によって、既知の保存されたセルラーゼの配列に類似性を有する配列が同定されるまで、両端から測定する。保存された配列の測定に基づいて、遺伝子の残りの部分を塩基配列決定する。
【００７９】
単離された遺伝子は、２７のアミノ酸のシグナル配列を含む３７１のアミノ酸を有する前駆体タンパク質をコードする１１７３塩基対を含有する。成熟したタンパク質は、３４４のアミノ酸、推定３５７６６の分子量、および５．９の等電点からなる。前記セルラーゼをコードする遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号２）および成熟したセルラーゼの推定アミノ酸配列（配列番号１）が図１および図２に示されている。
【００８０】
上述のように調製された構造遺伝子をコードするセルラーゼ遺伝子のDNA断片を、ベクターpHPLT（図４参照）でクローン化した。このベクターは、バチルスリケニフォルミスの熱安定アミラーゼ遺伝子のプロモータおよびシグナル配列を含有し、バチルス属で高い発現を導出する（図５参照）。コンピテントバチルス宿主細胞の形質転換を、単離された組換えセルラーゼ産生バチルス属のクローンを使用して行い、クローン化されたセルラーゼの産生に好ましい条件下で培養した。
【００８１】
実施例３
セルラーゼの精製
実施例２からのセルラーゼ産生バチルスリケニフォルミスのクローンを、Trypton Soya Broth(Oxoid CM129)３%、２０μg/mlのネオマイシンを有する複合培地中で培養した。精製は、以下のようにして行ってもよい：発酵液を、遠心分離（８０００rpm）により培養液から分離する。上澄中のセルラーゼを、硫酸アンモニウム（６５%の飽和度）で沈殿させる。沈殿物を、７mS/cmの導電率が達成されるまで、pH７の２５mMリン酸緩衝液と５mMのEDTAに溶解する。この溶液をQ-Sepharose FF（直径５cm、長さ１０cm）Anion Exchange カラムに入れ、その後カラムを、０．２AUの吸光度になるまで、pH７の２５mMリン酸緩衝液と５mMのEDTAで洗浄する。pH７の２５mMリン酸塩中で、０Mから０．５Mまでの濃度勾配のNaClを８０分間カラムに注ぎ、続いて０．５Mから１Mまでの濃度勾配のNaClを１０分間加える。溶出は、最初の濃度勾配でしてもよい。溶出の後、カラムを１MのNaOHで洗浄し（上向きに）、pH７の２５mMリン酸緩衝剤と５mMのEDTAで再び平衡させる。
【００８２】
実施例４
セルラーゼ産生放線菌類からの１６ S rDNA の説明
実施例２および実施例３のセルラーゼを産生する、実施例１において単離された供与体の有機体の１６S-rDNAの最初の４００bpsのヌクレオチド配列を得た。これを図６に提供する（配列番号３）。この配列は、公開されているデータベース中の配列との比較を提供するFastA配列分析ソフトウェアパッケージを使用して分析した。分析の結果は、最も近い近縁種は、４６５塩基対の重複中９５．５%の１６S rDNA同一性を有するストレプトミセスサーモベオラセウス(thermoveolaceous)であった。菌株の部分的な１６S rDNA断片の同一性のパーセンテージは、菌株が放線菌類の未知の種を表すことを強く示している。得られた１６S rRNA配列の分析に基づいて（実施例１の外観と組合せて）、微生物をストレプトミセス類の種と分類した。
【００８３】
実施例５
本発明によるセルラーゼの特性
本発明による約３６kDのセルラーゼのpH/温度の特性を測定するために、セルラーゼの活性を様々のpHおよび温度値においてCMCで測定した。この工程は、基質としてカルボキシメチルセルロース（CMC）を使用する、（全）セルラーゼ活性を測定する比色定量法である。セルラーゼは、高いpHおよび温度で“PAHBAH”と反応する還元糖を遊離させる。この反応生成物は、分光光度計で測定できる。活性は、グルコースの検定曲線を使用して測定した。
【００８４】
化学物質： −低粘度CMC（Sigma C-5678,batch#23HO244）
−p-ヒドロキシ安息香酸ヒドラジド（“PAHBAH”,Sigma H-9882）
−D-グルコースモノヒドレート（Boom 8342）
−NaH2PO4*１aq（Merck 6346）
−H3PO4（85%;Merck 573）
−クエン酸*1aq（Merck 244）
−4N NaOH
−0.5N HCl
インキュベート緩衝剤 A （ 0.01M リン酸塩）：
1.38gのNaHPO4*1aqを、800mlの脱塩水(demi water)に溶解する。pHを4NのNaOHで7に調節し、混合液を脱塩水で1000mlにした。最後にpHをチェックし、必要なら調節した。この緩衝剤は、酵素試料の溶解および希釈に使用した。
【００８５】
インキュベート緩衝剤 B （ 0.1M クエン酸塩＋ 0.1M リン酸塩）：
23.06gのH3PO4を、脱塩水に溶解し200mlの体積にした（=1M）。42gのクエン酸を、脱塩水に溶解し200mlの体積にした（=1M）。20mlのクエン酸溶液を20mlのリン酸と混合し、脱塩水で150mlにした。pHを4NのNaOHで（4から10までの範囲に）調節し、体積を脱塩水で200mlにした。この緩衝剤は、基質製剤の溶解に使用した。
【００８６】
インキュベート緩衝剤 C （ 0.05M クエン酸塩＋ 0.05M リン酸塩）：
インキュベート緩衝剤Bを、脱塩水で1:1に希釈した。pHをチェックし、必要なら補正した。この溶液は、グルコース検定曲線に使用した。
【００８７】
基質製剤（ 1% ）：
強く攪拌しながら1gのCMCを100mlの脱塩水にゆっくりと加えた。激しい攪拌を少なくとも１時間続け、次にウルトラチュラックス（ultraturrax）で３０秒間処理した。
【００８８】
酵素溶液：
酵素試料を、約0.05U/mlの活性になるまで、インキュベート緩衝剤Aに溶解し希釈した（グルコース検定曲線）。
【００８９】
染料試薬（ 5% ）：
5gのPAHBAHを、0.5NのHCl 80mlに溶解し、溶液を0.5NのHClで100mlにした。使用前に、PAHBAH溶液１に対し0.5NのNaOHを４の割合で希釈した。
【００９０】
検定曲線：
保存溶液#1：1000mgのグルコースを100mlの脱塩水に溶解した（10mg/ml）。保存溶液#2：0.5mlの保存溶液#1を、当該pHのインキュベート緩衝剤C 9.5mlで希釈した（0.5ml）。
【００９１】
以下の滴定表を使用した：
【表１】
（１） 標準グルコース、対照試料、試料、およびブランクの試験管を基質（1%）０．５mlおよび所望のpHのインキュベート緩衝剤Bで満たし、所望の温度の浴槽中に置いた；
（２） 溶液を１０分間プレインキュベートした；
（３） １５秒ごとに１００μlの標準グルコース、対照試料、または試料を基質とともに試験管に加えた；
（４） 溶液を３秒間ボルテックスし、浴槽に戻した；
（５） それぞれの試料を３０分間インキュベートした；
（６） ３mlのPAHBAH試薬を加えることにより、酵素反応を停止した；
（７） 生じた溶液を３秒間ボルテックスし、浴槽の外のラックに置いた；
（８） 全ての試験管が停止したら、１００μlの試料を当該ブランク試験管に加え、３秒間ボルテックスした；
（９） 試料を、１５分間沸騰した浴槽中に置いた；
（１０）生じた試料を５分間から１０分間冷たい水道水で冷却し、３秒間再びボルテックスした；
（１１）混合液の吸光度を、水を対照として４１０nmで測定した。
【００９２】
結果が図３に示されている。図３に示されているように３６kDのセルラーゼの最適pHは４０℃で約８、６０℃で約７である。
【図面の簡単な説明】
【図１】 本発明による約３６kDのセルラーゼの推定アミノ酸配列を示す図。コードされた文字は、IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Comission (GenBank Patentln User Manual，PC−DOS／MS−DOS Version,November 1990に示されている)による(配列番号１)
【図２】 本発明による約３６kDのセルラーゼをコードするDNA配列を示す図(配列番号２)
【図３】 ４０℃と６０℃における、本発明による約３６kDのセルラーゼのpH/活性を示すグラフ
【図４】 pHPLTベクターを示す図
【図５】 pHP11AG8ベクターを示す図
【図６】 本発明のセルラーゼが得られる放線菌類の16s RNA配列を示す図(配列番号３)
【配列表】
Claims (21)
- （i）配列番号１のアミノ酸配列からなるセルラーゼ、（ii）配列番号１のアミノ酸配列において１または数個のアミノ酸が欠失、置換、または付加されたアミノ酸配列からなり、かつセルロース分解活性を有するセルラーゼ、および（iii）配列番号１のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつセルロース分解活性を有するセルラーゼより成る群から選択される単離セルラーゼ。
- 配列番号１のアミノ酸配列からなることを特徴とする請求項１記載のセルラーゼ。
- （i）配列番号２のＤＮＡ配列、（ii）配列番号２の配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するＤＮＡ配列、または（iii）配列番号１のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列によってコードされており、かつセルロース分解活性を有する単離セルラーゼ。
- 配列番号２のＤＮＡ配列によってコードされていることを特徴とする請求項３記載のセルラーゼ。
- 配列番号２の配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するＤＮＡ配列によってコードされていることを特徴とする請求項３記載のセルラーゼ。
- 放線菌類から得られることを特徴とする請求項１または３記載のセルラーゼ。
- ＳＤＳ−ＰＡＧＥで測定して３６ｋＤの分子量、５．９の計算等電点、およびカルボキシメチルセルロース上での４０℃で８、６０℃で７の最適ｐＨを有することを特徴とする請求項６記載のセルラーゼ。
- 請求項１から７いずれか１項記載の単離セルラーゼを含む組成物。
- 洗剤組成物であることを特徴とする請求項８記載の組成物。
- 動物飼料の添加物であることを特徴とする請求項８記載の組成物。
- 織物の処理のための組成物であることを特徴とする請求項８記載の組成物。
- パルプおよび紙の処理のための組成物であることを特徴とする請求項８記載の組成物。
- 請求項１から７いずれか１項記載のセルラーゼをコードするＤＮＡ分子。
- 請求項１３記載のＤＮＡ分子を含む発現ベクター。
- ａｐｒＥプロモーターまたはｇｌａＡプロモーターをさらに含むことを特徴とする請求項１４記載の発現ベクター。
- 請求項１４または１５記載の発現ベクターで形質転換した宿主細胞。
- ストレプトミセス種(Streptomyces spp)またはバチルス種(Bacillus spp)であることを特徴とする請求項１６記載の宿主細胞。
- アスペルギルス属(Aspergillus)またはトリコデルマ属(Trichoderma)の糸状菌、あるいはサッカロミセス属(Saccharomyces)の酵母であることを特徴とする請求項１６記載の宿主細胞。
- 請求項１から７いずれか１項記載のセルラーゼを産生する方法であって、
請求項１６から１８いずれか１項記載の形質転換した宿主細胞を、前記セルラーゼをコードするＤＮＡの発現に適した条件下で増殖させ；
得られた前記セルラーゼを含む水性混合物を回収する；工程を含むことを特徴とする方法。 - 前記セルラーゼを前記水性混合物から精製する工程を更に含むことを特徴とする請求項１９記載の方法。
- 前記宿主細胞がストレプトミセス種(Streptomyces spp)またはバチルス種(Bacillus spp)であることを特徴とする請求項１９または２０記載の方法。
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