BRPI0807062A2 - Processo de produção de ácido láctico por fermentação de um meio autossuficiente à base de suco verde de cana - Google Patents

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "PROCESSO DE PRODUÇÃO DE ÁCIDO LÁCTICO POR FERMENTAÇÃO DE UM MEIO AUTOSSUFICIENTE À BASE DE SUCO VERDE DE CANA".

Domínio da invenção 5 A presente invenção refere-se ao ácido láctico ou ácido hidróxi-

2-propanóico que é um ácido carboxílico α-hidroxilado que pode ser produ- zido por fermentação. Outras vias de obtenção do ácido láctico são conheci- das pelo versado na técnica, via transformações químicas de reagentes pro- venientes da petroquímica tais como a hidrólise da lactonitrila, ela própria 10 obtida no início de acetaldeído, a cloração e a hidrólise de ácido propiônico ou ainda a nitração do propeno.

O ácido láctico existe sob duas formas diaestereoisoméricas: ácido L(+) e D(-) láctico e encontra a cada dia novas aplicações, desde a utilização clássica como conservador alimentar até novos desenvolvimentos tais como a síntese de solventes, pesticidas, herbicidas, polímeros biode- gradáveis, ...

No entanto, em razão do reforço crescente dos critérios de qua- lidade exigidos e a necessidade de atingir custos de produção compatíveis com o mercado das comodidades, é crucial poder reduzir os custos das ma- térias primas ao mesmo tempo em que se assegura uma qualidade compatí- vel com as aplicações mais exigentes.

Estado da técnica

A pureza de um ácido láctico é, entre outras coisas, avaliada por um teste de estabilidade térmica que consiste em medir a coloração (escala 25 APHA em unidade Hazen) do produto depois de aquecimento em refluxo a 200°C durante 2 h. Se o ácido láctico resfriado em temperatura ambiente depois desse teste tiver uma coloração inferior a 50 Hazen, ele será conside- rado como estável ao calor. No entanto, não é raro encontrar no mercado aplicações especiais que necessitam de uma coloração depois de aqueci- 30 mento inferior a 20 Hazen, e mesmo a 10 Hazen.

O ácido láctico, por exemplo, que serve de matéria prima para a produção de ácido poliláctico, deve apresentar uma pureza bastante elevada e um índice de termoestabilidade muito baixo da ordem de 0 - 50 Hazen e preferencialmente de 0 - 20 Hazen. Ele corresponde a um grau "polímero".

A produção de ácido láctico por fermentação pode ser realizada por um micro-organismo produtor de ácido láctico a um meio que contém 5 uma fonte de carbono fermentescível purificado, sais minerais (fonte de ni- trogênio, de fosfato, de enxofre e de oligoelementos tais como o zinco, o magnésio, o manganês, ...) e uma fonte de nitrogênio orgânico composta por aminoácidos livres ou ligados sob a forma de oligopeptídeos e de peptídeos de vitaminas e de traços de cofatores enzimáticos. Também é conhecido 10 que os micro-organismos habitualmente utilizados dos gêneros Lactobacil- lus, Bacillus e Sporolactobacillus não podem crescer e produzir ácido láctico de maneira industrial sem a adição de uma tal fonte de nitrogênio orgânico, que sua composição seja definida ou que se trate de um extrato natural.

Exemplos de substratos carbonados que respeitam essas espe- cificações são os açúcares purificados de beterrabas, de cana e os xaropes de glicose refinados que provêm da hidrólise do amido de milho, trigo, batata e outros.

Exemplos de fontes de nitrogênio orgânico que respeitam as es- pecificações citadas mais acima são os autolisados e os hidrolisados de Ie- 20 vedura, os hidrolisados de proteínas vegetais (triptona de soja, peptona de glúten, ...) e animais (peptona de caseína, ...) e também os subprodutos so- lúveis de têmpera de trigo e de milho. Essas fontes de nitrogênio orgânico são vendidas a preços relativamente elevados, o que agrava bastante o cus- to de fabricação do ácido láctico. Fontes de nitrogênio orgânico definidas, 25 reconstituídas a partir de aminoácidos, de vitaminas e de promotores de crescimento purificados podem também ser utilizadas, mas com custos ain- da superiores.

Para diminuir os custos de produção, o ácido láctico por fermen- tação pode também ser obtido adicionando-se um micro-organismo a uma fonte de açúcares fermentescíveis, econômicos, não refinados, constituída por intermediários ou por subprodutos da indústria agrícola (xarope de ami- do, lactossoro, suco verde de cana, melaço, bagaço de cana hidrolisado, ...) adicionado de nitrogênio orgânico tal como subprodutos solúveis de têmpera de trigo e/ou extratos de leveduras.

Impurezas orgânicas estão presentes em quantidades grandes nessas fontes de açúcares não refinados. Essa quantidade de impurezas orgânicas (fora glicídios) pode ser medida analisando-se, para isso, a quan- tidade de nitrogênio orgânico de uma amostra a qual é expressa em g/kg e é medida pelo método Kjeldhal.

Essas impurezas orgânicas podem ser de origem vegetal ou a- inda ser o resultado de reações de caramelização ou de reações de Mailard 10 que intervém por ocasião das diferentes etapas de tratamento do vegetal. Elas podem ser álcoois, ácidos orgânicos, aldeídos, produtos de degradação dos açúcares (furanos, pironas, ciclopentenos, ácidos orgânicos, aldeídos, compostos sulfurados, pirróis, piridinas, imidazóis, pirazinas, oxazóis, tiazóis, ...), das proteínas e vitaminas.

No entanto, nessas fontes de açúcares não refinados, algumas

das impurezas, tais como os furfurais e os hidroximetilfurfurais, são conheci- dos por inibir o crescimento de certos micro-organismos e desacelerar os processos de bioconversão como a fermentação láctica. Assim, Payot e ou- tros (1998) mostraram que o melaço de beterraba continha alguns compos- tos inibidores de crescimento para Bacillus Coagulans.

É feita menção da utilização de um meio à base de suco verde de cana e dos extratos de levedura (3 g/l) para a produção de ácido láctico por fermentação a partir de leveduras de vinho geneticamente modificadas. No entanto, essas leveduras não são homofermentárias e têm um rendimen- to carbonado (ácido láctico produzido sobre açúcar consumido) de 61%.

A purificação industrial de um ácido láctico de grau termoestável, a partir de um suco de fermentação rico em ácido láctico, pode ser realizada por diferentes tecnologias que compreendem em geral etapas comuns:

• clarificação do mosto de fermentação: (centrifugação, flocula- ção/filtração, microfiltração, ...);

• eliminação dos íons (eletrodiálise, resinas, extração líqui- do/líquido, ...); • eliminação da cor e outras impurezas (nanofiltração, carvão

ativo,

• concentração/destilação do ácido láctico, essas etapas deven- do ser acopladas de maneira a obter um rendimento elevado;

· outras técnicas podem também ser utilizadas como a cristali-

zação.

Algumas das impurezas presentes nas fontes de açúcares não refinados têm pesos moleculares e curvas de tensões de vapores próximas daquelas do ácido láctico (tal como o 5-hidroximetilfurfural), o que as torna 10 difíceis de separar do ácido láctico. Outras são ácidos orgânicos e não pode- rão ser separadas eficazmente do ácido láctico por processos clássicos tal como por exemplo a eletrodiálise, a cristalização ou ainda a extração líquido- líquido.

É assim reconhecido que a produção industrial de ácido láctico 15 estável ao calor - e especialmente de grau "polímero" deve ser realizada a partir de um meio de fermentação que contém um baixo teor em impurezas. A presença de impurezas orgânicas tais como ácidos orgânicos, aldeídos e álcoois no suco de fermentação torna o ácido láctico difícil e caro de purifi- car.

Um exemplo da dificuldade de produzir um ácido láctico de qua-

lidade estável ao calor a partir de uma fonte de substrato carbonado não re- finado é dado pelo documento WO 2006/001034 A2. Esse documento des- creve a produção de ácido poliláctico por fermentação de fontes de carbono econômicas, provenientes da agricultura como o melaço de cana por cepas 25 do gênero Lactobacillus. A fim de obter um crescimento e uma produtividade suficiente, uma fonte de nitrogênio orgânico exógeno (subprodutos solúveis de têmpera de milho e pasta de levedura) é adicionada ao meio. O processo descreve claramente que o ácido láctico purificado obtido a partir de melaço de cana-de-açúcar tem uma cor castanho. A purificação é realizada depois 30 de formação do dímero cíclico do ácido láctico (o láctido) a partir de uma solução impura de ácido láctico concentrada. Isto tem como conseqüência a formação de numerosos subprodutos que provêm das reações das impure- zas entre si e com o ácido láctico. Para purificar esse láctido, o documento descreve uma recristalização em solvente à base de acetato de etila e não menciona rendimento de recuperação de láctido purificado. Ora, é conhecido pelo versado na técnica que o láctido sob suas formas L, D e meso é solúvel 5 parcialmente no acetato de etila, acarretando uma perda grande de produto e maus rendimentos de produção.

Por ocasião da produção de açúcar a partir da cana, o açúcar é primeiro extraído da cana por extração mecânica ou difusão. O suco extraído dessa etapa é chamado abaixo de "suco verde de cana". Esse suco verde 10 de cana é, em seguida, carbonatado e filtrado para extrair as impurezas não solúveis e os ânions orgânicos. O filtrado é finalmente concentrado por eva- poração e dá um xarope de açúcar que é chamado abaixo de "xarope de cana bruto". Esse xarope pode ser invertido (hidrólise da sacarose em glico- se e frutose) para dar "xarope de cana bruto invertido" ou cristalizado dire- 15 tamente e dar o que é chamado abaixo de "açúcar de cana bruto" ou ainda purificado e cristalizado para dar por um lado o "açúcar de cana refinado" e um subproduto carregado de impurezas "o melaço de cana".

O açúcar pode ser produzido a partir da beterraba por um pro- cesso similar. O açúcar é primeiro extraído da beterraba por extração mecâ- 20 nica ou difusão. O suco extraído dessa etapa é chamado abaixo de "suco de difusão de beterraba". Esse suco é então carbonatado e filtrado para extrair as impurezas não solúveis e os ânions orgânicos. O filtrado é então concen- trado por evaporação e dá um xarope de açúcar que é chamado abaixo de "xarope de beterraba bruto". Esse xarope pode ser cristalizado diretamente e 25 dar o que é chamado abaixo de "açúcar de beterraba bruto" ou ser purificado e cristalizado para dar por um lado o "açúcar de beterraba refinado" e um subproduto carregado de impurezas "o melaço de beterraba".

Assim, até hoje, era admitido pelo versado na técnica que a pro- dução industrial de um ácido láctico estável ao calor, a partir de açúcar, ne- cessitava da utilização de um meio preparado a partir de açúcar purificado, de um substrato orgânico nitrogenado e de minerais.

Breve Descrição da Invenção De tudo o que precede, resulta que até agora a produção de á- cido láctico de grau estável ao calor, que responde aos critérios de qualidade do mercado, (alimentar, farmacêutico, cosmético) necessita que seja reali- zada uma fermentação láctica em um meio:

- de composição e preparação complexa que compreende nu-

merosos ingredientes a misturar em quantidades muito precisas e que ne- cessita da intervenção de um preparador qualificado;

- de preço geralmente elevado (açúcar purificado, fonte de nitro- gênio orgânico rico, nutrimentos minerais puros).

Com a preocupação de desenvolver um processo que permita

responder melhor às restrições práticas e econômicas, a requerente consta- tou de maneira surpreendente que esse objetivo podia ser atingido por um processo que consiste em uma fermentação láctica por micro-organismos do gênero Bacilos e/ou Esporolactobacilos, de um meio autossuficiente prepa- 15 rado a partir de suco verde de cana sem adição de outros nutrimentos orgâ- nicos e inorgânicos, ou ainda a partir de um meio composto por derivados de suco verde de cana, rico em matérias orgânicas nitrogenadas (como o xaro- pe bruto de cana) sem adição de outros nutrimentos orgânicos.

Um meio de fermentação que compreende, como fonte de glicí- 20 dios, um extrato vegetal ou um derivado de extrato vegetal é considerado como autossuficiente para a fermentação de um micro-organismo, se ele permite que esse último cresça e produza seus metabólitos sem adição de outros nutrimentos orgânicos que não sejam aqueles presentes no extrato vegetal ou do derivado de extrato vegetal utilizado como fonte de glicídios.

O ácido láctico produzido por fermentação pode então ser purifi-

cado pelas técnicas descritas no estado da técnica (concentração, destila- ção, cristalização, troca de íons, ...) a fim de produzir um ácido láctico está- vel ao calor.

Descrição Detalhada da Invenção Depois de longas pesquisas sobre numerosos substratos carbo-

nados e numerosas cepas microbianas produtoras de ácido láctico, a reque- rente descobriu de maneira surpreendente que o suco verde de cana e seus derivados (xarope de cana bruto, xarope de cana bruto invertido, suco verde de cana concentrado, suco verde de cana seco, ...):

- continham naturalmente os açúcares e os promotores orgâni- cos de crescimento e de produtividade necessários a certos micro-

organismos industriais que pertencem aos gêneros Bacillus e/ou Sporolacto- bacillus para a fermentação láctica;

- não continham compostos capazes de inibir o crescimento dos micro-organismos dos gêneros Bacillus e/ou Sporolactobaciilus;

- não continham impurezas que impedem a produção de um áci- do láctico de alta pureza pelos processos de purificação e mais especial- mente aqueles que compreendem uma evaporação e/ou uma destilação e/ou cristalização e/ou troca de íons;

- que o suco verde de cana continha também os sais minerais necessários para o crescimento do micro-organismo.

Essas propriedades inesperadas do suco verde de cana e seus

derivados que contêm matérias orgânicas nitrogenadas (xarope de cana bru- to, xarope de cana bruto invertido, suco verde de cana concentrado, suco verde de cana seco, ...) são exploradas nessa invenção que descreve um processo original de produção de um ácido láctico estável ao calor a partir desses meios.

Essas descobertas são surpreendentes visto que nossas pes- quisas também mostraram que os derivados não refinados da beterraba não eram autossuficientes, e, portanto, necessitavam da adição de um substrato nitrogenado orgânico para que certos micro-organismos que pertencem aos

gêneros Bacillus e Sporolactobaciilus para a fermentação láctica possam atingir produtividades equivalentes àquelas observadas em meio industrial clássico. Essas observações estão descritas nos exemplos.

Além disso, como também descrito nos exemplos, o suco verde de cana e seus derivados que contêm matérias orgânicas nitrogenadas não constituem meios autossuficientes para todos os micro-organismos produto- res de ácido láctico.

Essas descobertas são ainda mais surpreendentes visto que além de ser um meio autossuficiente para certos micro-organismos dos gê- neros Bacillus e/ou Sporolactobaciilus, o meio de final de fermentação pode ser purificado pelas técnicas clássicas de evaporação, de destilação, de cris- talização e/ou de troca de íons, em um ácido láctico estável ao calor e de 5 grau "polímero" que responde aos critérios de qualidade do mercado (ali- mentar, farmacêutico, cosmético, industrial). O que não é, por exemplo, o caso para o melaço de cana-de-açúcar.

A originalidade da qual fez parte a requerente reside na escolha dessa matéria prima como fonte, ao mesmo tempo, de açúcar econômico, de minerais e de nitrogênio orgânico contrariamente a outras pesquisas efe- tuadas sobre açúcares econômicos como o melaço, aos quais é adicionada uma fonte de nitrogênio orgânico como extratos de leveduras.

A utilização do suco verde de cana bruto ou purificado, líquido ou sólido como meio de fermentação autossuficiente como descrito acima permite reduzir drasticamente os custos de produção do ácido láctico e facili- ta a preparação dos meios de fermentação.

A utilização do suco verde de cana bruto ou clarificado permite evitar a utilização de energia para evaporar a água por ocasião de sua con- centração ou sua cristalização, e assim reduzir de grande maneira o consu- mo de energia e a poluição ambiental.

O processo permite também evitar as perdas em glicídios devi- das à purificação do açúcar de cana (principalmente melaço). O rendimento global de produção de ácido láctico a partir da cana-de-açúcar é assim supe- rior. De fato, 1 tonelada de cana-de-açúcar contém 150 a 180 kg de açúcar

mas os processos atuais de produção só permitem produzir cerca de 120 kg de açúcar de cana purificado, ou seja cerca de 120 kg de ácido láctico de- pois de fermentação. A utilização direta do suco verde de cana ou de seus derivados permitirá a utilização da quase totalidade do açúcar presente na cana-de-açúcar e portanto produzir entre 150 e 180 kg de ácido láctico de- 30 pois de fermentação, ou seja, um aumento da quantidade de ácido láctico produzida de 20 a 30 %.

O processo permite também eliminar a etapa de clarificação do suco verde de cana. Essa etapa consiste em precipitar as impurezas orgâni- cas com cal formando, assim, sais insolúveis de cálcio. Depois de numero- sas pesquisas, foi descoberto que a etapa de separação da biomassa seja por floculação, por microfiltração, por nanofiltração ou por qualquer outra 5 técnica, tornava inútil a clarificação do suco verde de cana. Isso simplifica bastante o processo global de produção de ácido láctico a partir da cana-de- açúcar.

Outros detalhes e particularidades da invenção, dados abaixo a título de exemplos não limitativos, se destacam da descrição como algumas formas possíveis de sua realização.

Exemplo 1: Produção de um suco verde seco de cana

O suco verde seco de cana pode ser produzido, por exemplo, pela técnica seguinte. O suco verde de cana é extraído da cana por extração mecânica em um moinho. O suco é em seguida filtrado a 10 μιτι para extrair as impurezas não solúveis.

A composição do suco verde obtido é dada na tabela 1.

Tabela 1: Composição do suco verde de cana

Teor em média em g/l Sacarose 160 Glicose 5,7 Frutose 5,7 Proteínas 0,95 Amido 0,12 Gomas 1 Ceras 0,24 K20 1 CaO 0,4 MgO 0,53 P205 0,76 Si02 6,7 S03 1 Ácidos orgânicos (aconítico, cítrico, ...) 5,7 Diversos (fibras, colóides, clorofila, polifenóis, ...) 30 O filtrado (18% de matéria seca) é nesse caso concentrado em um evaporador a 70°C e sob 70 KPa (700 mbars) para atingir 85% de maté- ria seca.

O concentrado de suco verde de cana pode ser enviado a quen- 5 te para um atomizador a 150°C sob 12,5 KPa (125 mbars) ou ser misturado com 5% de suco verde seco de cana (como suporte de nucleação) e enviado a quente para um tambor-secador a 150°C sob 12,5 KPa (125 mbars) para dar um produto seco.

Exemplo 2: Cultura de Bacillus coagulans em diversas fontes de açúcar Uma cultura de Bacillus Coagulans (LMG 17452), foi cultivada

em reatores BBraun 21 Biostat B em um dos meios de fermentação descrito na tabela 2, a 52°C e mantido a pH 6,2 com leite de Ca(OH)2 25% em peso. A cultura foi mantida em rotina transferindo-se 250 ml transferindo-se 250 ml da cultura a cada 24 h para um novo fermentador que contém 750 ml de 15 meio. A velocidade de produção de ácido láctico, ou produtividade em grama por litro e por hora, foi acompanhada durante 5 fermentações sem interrup- ção em 8 meios de composições diferentes (na figura 1, cada coluna é re- presentativa da média dos resultados dos 5 ensaios).

Na figura 1, é possível claramente observar que as fermenta- ções realizadas nos meios B (suco verde de cana seco sem sais e sem "Ye- ast Extract" ou extrato de levedura) e D (xarope bruto de cana sem "Yeast Extract" mas com sais) têm produtividades de ácido láctico semelhantes às fermentações no meio A (açúcar branco com "Yeast Extract" e sais).

Além disso, os resultados mostram, sem ambigüidades, que as fermentações nos meios C (xarope bruto de cana sem "Yeast Extract" e sem sais), assim como as fermentações nos meios EeF (suco de difusão de be- terraba) e G e H, (xarope bruto de beterraba) dão produtividades inferiores às fermentações realizadas nos meios A, B e D.

Tabela 2: Composição dos meios de cultura testados no exemplo 2

30 Ingredientes em g/l A B C D E F G H Sacarose 180 0 0 0 0 0 0 0 Suco verde de cana 0 200 0 0 0 0 0 0 seco Xarope bruto de 0 0 300 300 0 0 0 0 cana Suco de difusão 0 0 0 0 200 200 0 0 de beterraba seco Xarope bruto de 0 0 0 0 0 0 300 300 beterraba "Yeast Extract" 5 0 0 0 0 0 0 0 K2HP04 0.5 0 0 0,5 0 0,5 0 0,5 KH2P04 0,5 0 0 0,5 0 0,5 0 0,5 MgS04.7H20 0,2 0 0 0,2 0 0,2 0 0,2 MnCI2,4H20 0,03 0 0 0,03 0 0,03 0 0,03 (NH4)CI 1 0 0 1 0 1 0 1 FeCI3.6H20 0,01 0 0 0,01 0 0,01 0 0,01 Exemplo 3: Cultura de Bacillus Coagulans em suco verde de cana seco de origens geográficas diferentes

De maneira a estabelecer se a origem geográfica do suco verde de cana tinha uma influência sobre a produtividade em ácido láctico de Bacil- 5 Ius Coagulans (LMG 17452), essa bactéria foi cultivada em um meio consti- tuído unicamente de água e de suco verde de cana seco de origens diversas (Austrália, México, Brasil, Cuba) a 50 g/l a 52°C e mantido a pH 6,2 com leite de Ca(OH)2 25% em peso. A cultura foi mantida em rotina transferindo-se 250 ml da cultura a cada 24 h para um novo fermentador que contém 750 ml 10 de meio. A velocidade de produção de ácido láctico foi acompanhada duran- te 5 fermentações sem interrupção (na figura 2, cada coluna é representativa da média dos resultados dos 5 ensaios).

Na figura 2, os resultados mostram claramente que as produtivi- dades em ácido láctico são semelhantes (entre 0,9 g/1h e 1,1 g/1 h) qualquer que seja a origem geográfica da cana-de-açúcar. <· Exemplo 4: Purificação do ácido láctico produzido a partir de xarope de cana bruto com sais Fermentação

Bacillus Coagulans (LMG 17452) foi cultivada em um reator B- 5 Braun 50 I em um meio de fermentação (idêntico ao meio D do exemplo 2, mas uma concentração em substrato carbonado de 75 g/l no lugar de 300 g/l) constituído de xarope bruto de cana (65% em sacarose) com sais a 52°C e mantido a pH 6,2 com um leite de Ca(OH)2 25% em peso. Os resultados são dados na tabela 3.

10 Tabela 3: Resultados da fermentação

Produtividade em Concentração Relação volume Rendimento áci¬ ácido láctico g/1 h final em ácido final/volume ini¬ do láctico produ¬ láctico g/l cial (diluição com zido sobre saca¬ cal) rose inicial (g/g) 1 44 1,05 0,95 O suco de fermentação obtido foi purificado de acordo com o processo descrito abaixo.

Purificação de baixa concentração ,15 Depois de ter floculado a biomassa e de tê-la filtrado, o suco cla-

rificado é acidificado por adição progressiva de ácido sulfúrico concentrado de maneira a precipitar o cálcio sob a forma de CaS04. O CaS04 é então separado por filtração.

O suco é então pré-purificado em uma coluna de carvão ativo. O 20 percolado é alimentado em uma coluna trocadora de íons, cheia com uma resina catiônica forte (tipo Bayer Lewatit S 2528). Uma vez que a retirada dos cátions foi realizada, o suco é alimentado em uma coluna cheia de uma resina aniônica de basicidade média (tipo Bayer sob a referência Lewatitt S 4328). O ácido láctico obtido apresenta então as características seguintes:

25 · Coloração APHA: 200 Hazen

• Teor em ácido láctico: 45 g/l

• Teor em cátion: < 50 meq/l • Teor em ânion: < 50 meq/l Purificação de alta concentração

O suco purificado acima é concentrado a 80% em um evapora- dor de filme corrente antes de ser alimentado de modo contínuo em um eva- porador feito de vidro borossilicatado de filme fino mecanicamente agitado com condensador interno. Os parâmetros de concentrações são de 100°C para as paredes e uma pressão absoluta de 10 KPa (100 mbars).

O ácido láctico é finalmente destilado a 1 KPa (10 mbars) e 130°C nesse mesmo evaporador.

O ácido láctico produzido por essa purificação respeita as carac-

terísticas (tabela 4) de um ácido láctico estável ao calor. De fato, a solução fresca tem uma coloração de 11 Hazen e sua coloração depois de aqueci- mento atinge 15 Hazen.

O ácido láctico produzido por essa purificação respeita as espe-

cificações de um ácido láctico de alta pureza utilizável para a fabricação de láctido e de ácido poliláctico.

Tabela 4: Características do ácido láctico purificado obtido a partir de uma solução de ácido láctico que provém da fermentação por Bacillus Coagulans (LMG 17452) de um meio composto de xarope de cana bruto

20

Teor em ácido láctico % peso 90,5 Pureza estereoquímica L-ácido láctico %L/(%L+%D) 99,5% Cor (solução fresca) Hazen 11 Cor depois de aquecimento (200°C, 2 h) Hazen 15 A fim de demonstrar a adequação do ácido láctico produzido pa- ra a produção de ácido poliláctico foram lançados os ensaios seguintes. Síntese do láctido e teste de polimerizacão

O ácido láctico obtido acima (-250 g) é introduzido em um balão agitado e aquecido a 160°C. A fim de facilitar a extração rápida do composto volátil, a unidade é colocada progressivamente sob vácuo, a pressão varian- do entre pressão atmosférica e 15 KPa (150 mbars) durante cerca de 10 h. O ácido láctico polimeriza para formar um prepolímero caracterizado por uma massa molecular de 1500 dáltons.

O prepolímero obtido acima é introduzido em um balão aquecido por uma calota aquecedora a 220-250°C e agitado por um chip magnético. O octoato de estanho é então introduzido dentro do balão a 1% em peso em relação à quantidade de prepolímero introduzido.

O balão é encimado por um refluxo a 180-200°C, em seguida por um condensador resfriado a 80-1OO0C e finalmente por um balão de recolhi- mento dos condensados. Tudo é colocado sob vácuo entre 1 e 2 KPa (10 e mbars). O láctido impuro recolhido dentro do balão dos condensados é purificado duas vezes por recristalização em uma relação 1 : 1 com tolueno.

Os cristais de láctido purificado são recuperados por filtração e secados sob vácuo em um rotavapor.

O láctido purificado dessa maneira apresenta as características

seguintes:

- L-láctido: 99,8%

- meso-láctido: 0,2%

- acidez residual: <10 meq/kg

- teor em água: 49 ppm

Uma pequena quantidade do produto purificado obtido acima (10 g) foi introduzida em um tubo de ensaio sob varredura de nitrogênio (vários ensaios foram lançados em paralelo). Depois de solubilização da mistura (100°C) uma solução de octoato de estanho foi adicionada de modo a res- peitar uma relação molar dímero/catalisador de 4500. Uma vez que a solu- ção está bem homogeneizada, ela é mergulhada em um banho de óleo no qual a temperatura é termostatizada a 180°C. Depois de uma hora de sínte- se, os tubos de ensaios são retirados e quebrados de modo a recuperar po- límeros bem rígidos e opacos. Os polímeros obtidos foram analisados por GPC no clorofórmio a 35°C e massas moleculares em número compreendi- das entre 80.000 e 100.000 foram medidas (as massas moleculares deter- minadas com base em uma calibração PS são corrigidas sobre uma base absoluta utilizando-se para isso uma calibração universal).

Esse exemplo mostra, portanto, que é possível atingir um ácido 10

15

láctico de qualidade "polímero" utilizando-se para isso, como substrato car- bonado de fermentação do xarope bruto de cana.

Exemplo 5: Purificação do ácido láctico produzido a partir de melaço de ca- na-de-açúcar

No exemplo 2, foi mostrado que, contrariamente aos derivados da beterraba, os derivados da cana permitiam, sob a forma de um meio au- tossuficiente, obter uma fermentação láctica comparável a meios industriais clássicos. Nesse exemplo, será mostrado que certos derivados da cana, a- inda que autossuficientes, não permitem produzir um ácido láctico de quali- dade estável ao calor.

Bacillus Coagulans (LMG 17452) foi cultivada em um reator B- Braun 50 I em um meio de fermentação (idêntico ao meio D do exemplo 2 com uma concentração em substrato carbonado de 75 g/l no lugar de 300 g/l) constituído de melaço de cana-de-açúcar (60% em sacarose) com sais, a 52°C e mantido a pH 6,2 com um leite de Ca(OH)2 25% em peso. Os resul- tados são dados na tabela 5.

Tabela 5: Resultados da fermentação

Produtividade Concentração Relação volume Rendimento áci¬ em ácido láctico final em ácido final/volume ini¬ do láctico produ¬ g/1h láctico g/l cial (diluição com zido sobre saca¬ cal) rose inicial (g/g) 1 40 1,05 0,94 20

25

O suco de fermentação obtido foi purificado de acordo com o mesmo procedimento que o exemplo 4.

O produto seguinte foi obtido depois de purificação de baixa concentração:

• Coloração APHA: 200 Hazen

• Teor em ácido láctico: 45 g/l

• Teor em cátion: < 50 meq/l

• Teor em ânion: < 50 meq/l

Em contrapartida, de maneira surpreendente, o ácido láctico 10

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produzido pela purificação de alta concentração não respeita as especifica- ções de um ácido láctico de alta pureza utilizável para a fabricação de láctido e de ácido poliláctico. De fato, a solução fresca já tem uma coloração de 70 Hazen e sua coloração depois de aquecimento atinge 230 Hazen.

É portanto surpreendente que no caso do exemplo 4, a utilização de xarope de cana bruto como fonte de carbono e de nitrogênio orgânico para a fermentação permita obter um ácido láctico de alta pureza (termoes- tável).

Tabela 6: Características do ácido láctico purificado obtido a par- tir de uma solução de ácido láctico que provém da fermentação por Bacillus Coagulans (LMG 17452) de um meio composto de melaço de cana-de- açúcar

Teor em ácido láctico % peso 90,2 Cor (solução fresca) Hazen 70 Cor depois de aquecimento (200°C, 2 h) Hazen 230 25

Exemplo 6: Ensaio de fermentação de xarope bruto de cana com outros micro-organismos

Diferentes cepas foram cultivadas em reatores BBraun 2 I em um meio de fermentação (ver o exemplo 4) constituído por xarope bruto de cana (65% em sacarose) com sais a 52°C e mantido a pH 6,2 com um leite de Ca(OH)2 25% em peso. Os resultados são dados na tabela 7.

Na tabela 7 abaixo é possível ver que o xarope de cana não é um meio autossuficiente para todos os micro-organismos produtores de áci- do láctico, mas somente para alguns entre os quais certas espécies de Bacil- Ius e Sporolactobacillus.

Tabela 7: Fermentação do xarope bruto de cana a partir de mi- cro-organismos produtores de ácido láctico Origem Produtivi¬ Pureza Ácido dade estereoquí- láctico (g/1h) mica final (% em L) produzido (g) Bacillus Coagulans LMG 1 99 45 17452 Bacillus Coagulans LMG 1 99 40 19808 Sporolactobacillus DSM 0,5 1 20 Inulinus 20348 Bacillus Smithii DSM 0,5 97 20 459 Lactobacillus DSM 0 - 0 Plantarum 2601 Lactobacillus DSM 0 - 0 Coryniformis 20004 Exemplo 7: Melhoria da fermentação enriquecendo-se o meio de fermentação com extrato de levedura

Como descrito nos exemplos acima, o meio de fermentação au- tossuficiente preparado a partir de suco verde de cana e fermentado com Bacillus Coagulans (LMG 17452) permite uma produtividade em ácido láctico comparável a meios complexos preparados a partir de açúcares purificados, de minerais e de uma fonte de nitrogênio orgânico.

Observa-se que essa produtividade podia ainda ser melhorada (+ 20%) adicionando para isso uma fonte de nitrogênio orgânico exógeno (extrato de levedura a 0,5 g/l) a esse meio preparado a partir de suco verde de cana.

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A invenção se refere a um processo de produção de ácido lácti- co por fermentação de um extrato de cana-de-açúcar ou de derivados de extratos de cana-de-açúcar com o auxílio de micro-organismos. Esse pro- cesso é caracterizado pelos micro-organismos de fermentação que perten- cem aos gêneros Bacillus, Sporolactobacillus ou suas misturas, e pelo meio de fermentação que é autossuficiente.

Esse processo compreende de modo preferido pelo menos uma etapa de purificação do ácido láctico proveniente da fermentação. A purifica- ção compreende de preferência pelo menos uma etapa escolhida entre a evaporação, a destilação, a cristalização ou a utilização de resinas trocado- ras de íons.

Os micro-organismos são automaticamente escolhidos entre as espécies Bacillus Coagulans, Bacillus Smithii, Sporolactobacillus Inulinus ou suas misturas.

O processo produz um ácido estável ao calor.

A cana-de-açúcar ou o derivado da cana-de-açúcar tem vantajo- samente uma concentração em nitrogênio orgânico superior a 0,02 g/kg de 15 meio de fermentação. O extrato da cana-de-açúcar é de preferência escolhi- do entre o suco verde de cana, o xarope bruto de cana, o xarope bruto de cana invertido, o açúcar de cana bruto ou seus derivados. O extrato de cana- de-açúcar ou os derivados de extratos de cana-de-açúcar se apresentam de preferência sob a forma líquida ou sob a forma de sólido seco.

O derivado de extrato de cana-de-açúcar é obtido por um méto-

do de concentração vantajosamente escolhido entre a atomização, a evapo- ração, a cristalização ou a centrifugação.

O meio de fermentação é, em um modo de realização, enrique- cido por autolisados e hidrolisados de levedura, hidrolisados de proteínas vegetais ou animais, ou por subprodutos solúveis de têmpera de trigo ou de milho.

O meio é, em um modo de realização, enriquecido com um açú- car purificado escolhido entre a glicose, a maltose, a frutose, a xilose ou a sacarose.

O extrato de cana-de-açúcar ou os derivados de extratos de ca-

na-de-açúcar é, em um modo de realização, esterilizado de maneira mecâni- ca, térmica ou química antes de fermentação.

Claims (12)

1. Processo de produção de ácido láctico por fermentação de um extrato de cana-de-açúcar ou de derivados de extratos de cana-de-açúcar com o auxílio de micro-organismos, caracterizado pelo fato de que: a) os micro-organismos da fermentação pertencem aos gêneros Bacillus, Sporolactobacillus ou suas misturas; b) o meio de fermentação que é autossuficiente.

2. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que ele compreende pelo menos uma etapa de purificação do ácido láctico proveniente da fermentação.

3. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que a purificação compreende pelo menos uma etapa escolhida entre a evaporação, a destilação, a cristalização ou a utilização de resinas trocadoras de íons.

4. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que os micro-organismos são esco- lhidos entre as espécies Bacillus Coagulans, Bacillus Smithii, Sporolactoba- cillus Inulinus ou suas misturas.

5. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que o ácido láctico produzido é es- tável ao calor.

6. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que a cana-de-açúcar ou o derivado da cana-de-açúcar tem uma concentração em nitrogênio orgânico superior a 0,02 g/kg de meio de fermentação.

7. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que o extrato da cana-de-açúcar é escolhido entre o suco verde de cana, o xarope bruto de cana, o xarope bru- to de cana invertido, o açúcar de cana bruto ou seus derivados.

8. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que o extrato de cana-de-açúcar ou os derivados de extratos de cana-de-açúcar se apresentam, de preferência, sob a forma líquida ou sob a forma de sólido seco.

9. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que o derivado de extrato de cana- de-açúcar é obtido por um método de concentração escolhido entre a atomi- zação, a evaporação, a cristalização ou a centrifugação.

10. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que o meio de é enriquecido por au- tolisados e hidrolisados de levedura, hidrolisados de proteínas vegetais ou animais, ou por subprodutos solúveis de têmpera de trigo ou de milho.

11. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que o meio é enriquecido com um açúcar purificado escolhido entre a glicose, a maltose, a frutose, a xilose ou a sacarose.

12. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que o extrato de cana-de-açúcar ou os derivados de extratos de cana-de-açúcar é esterilizado de maneira mecâ- nica, térmica ou química antes de fermentação.