BRPI0807086A2 - Fitases variantes de buttiauxella sp. com propriedades alteradas - Google Patents

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "FITASES VARIANTES DE BUTTIAUXELLA SP. COM PROPRIEDADES ALTERADAS".

CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção refere-se a fitases variantes de Buttiauxella 5 spp., a ácidos nucleicos que codificam as fitases e a um método de expres- são heteróloga. As fitases englobadas pela invenção podem ser usadas em aplicações industriais, incluindo métodos para liquefação de amido, fermen- tações de álcool e para intensificar a digestão de fosfato em alimentos e ra- ções para animais.

ANTECEDENTES DA INVENCAO

O fósforo (P) é um elemento essencial para o crescimento. Uma quantidade substancial do fósforo encontrado em rações convencionais para gado, por exemplo, grãos de cereais, farinha de sementes oleaginosas e em produtos que se originam de sementes, está na forma de fosfato que está 15 covalentemente ligado em uma molécula conhecida como fitato. A biodispo- nibilidade do fósforo nessa forma em geral é muito baixa para não-ruminan- tes, como aves e suínos, porque estes não dispõem de enzimas digestivas para separar o fósforo da molécula de fitato.

Várias conseqüências importantes da incapacidade de não-rumi- 20 nantes de utilizarem fitato podem ser indicadas. Por exemplo, incorrem-se em custos quando fósforo inorgânico (por exemplo, fosfato de dicálcio, fosfa- to desfluorado) ou produtos animais (por exemplo, carne e farinha de ossos, farinha de peixe) são adicionados para atender às exigências nutricionais de fósforo dos animais. Além disso, o fitato pode se ligar ou quelar inúmeros 25 minerais (por exemplo, cálcio, zinco, ferro, magnésio e cobre) no trato gas- trointestinal, tornando-os, dessa forma, indisponíveis para absorção. Além disso, a maior parte do fitato presente na ração atravessa o trato gastrointes- tinal, elevando a quantidade de fósforo no esterco. Isso leva a uma carga de fósforo ecológico aumentada no ambiente.

Descobriu-se que a fitase microbiana, como um aditivo de ração,

melhora a biodisponibilidade do fósforo de fitato em dietas típicas para não-rumi- nantes (vide, por exemplo, Cromwell, et ai, 1993). O resultado é uma menor necessidade de adicionar fósforo inorgânico a rações para animais, assim como menores níveis de fósforo no esterco excretado (vide, por exemplo, Kornegay, et ai, 1996). Além de aditivo de ração, as fitases podem ser usa- das para a produção de frações alimentares de baixa fitina. Por exemplo, as 5 fitases podem ser usadas na moagem a úmido de grãos para a produção de, por exemplo, licor de infusão de milho de baixa fitina e glúten de milho de baixa fitina ou em um processo de moagem a seco em combinação com en- zimas de hidrólise de amido para a produção de glicose e álcoois (por e- xemplo, etanol).

A despeito da vantagem de se usar fitases nessas aplicações,

surpreendentemente poucas fitases conhecidas ganharam ampla aceitação nas indústrias de rações, liquefação de amido e fermentação de álcool. As razões para isso variam de enzima para enzima. As preocupações típicas se referem aos altos custos de fabricação e/ou baixa estabilidade/atividade da 15 enzima no ambiente da aplicação desejada. Inúmeros critérios enzimáticos têm de ser atendidos por uma fitase se tiver de ser atrativa para uso disse- minado em aplicações industriais. Os critérios enzimáticos mais importantes incluem uma elevada atividade específica global, um baixo pH ótimo, resis- tência a proteases gastrointestinais e termoestabilidade.

A termoestabilidade é um dos pré-requisitos mais importantes

para uma aplicação bem sucedida da fitase como uma enzima alimentar e para uso em processos de liquefação de amido, porque a fitase na razão e/ou processos é exposta a elevadas temperaturas. Por exemplo, em pro- cessos de peletização de ração, as temperaturas estão entre 60 e 95°C e, 25 em processos de liquefação de amido, as temperaturas estão entre 75 e 120°C.

A seqüência de DNA de um gene de Buttiauxella sp P1-29, que codifica uma fitase, foi apresentado na WO 06/043178, publicado em 27 de abril de 2006. Faz-se referência à SEQ ID NO: 1 e à SEQ ID NO: 2 e à se- 30 quência de aminoácidos do gene de fitase de Buttiauxella sp P1-29 (SEQ ID NO: 3) aí apresentadas. Com base em várias propriedades intrínsecas, a fitase de Buttiauxella sp P1-29 representou um excelente ponto de partida a partir do qual se começar um programa de mutagênese para uma fitase ter- moestável para várias aplicações comerciais. A WO 06/043178 apresenta inúmeras variantes da fitase de Buttiauxella sp P1-29 (veja, por exemplo, a tabela 1). Pelo menos uma variante apresentada na WO 06/043178 e aqui 5 designada como BP-11 foi adicionalmente modificada. A presente invenção se refere a variantes com propriedades alteradas, como propriedades aper- feiçoadas, incluindo, mas não limitadas a, a) melhor termoestabilidade, b) atividade específica aumentada e/ou c) atividade específica aumentada com retenção da termoestabilidade, em comparação com a fitase de Buttiauxella 10 sp P1 -29 ou com a variante BP-11.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Em um aspecto, a invenção se refere a uma fitase que é o pro- duto de expressão de uma seqüência de DNA com mutação que codifica uma fitase, a seqüência de DNA com mutação sendo derivada de um pre- cursor da fitase de Buttiauxella spp. Em uma modalidade, a fitase é derivada de Buttiauxella sp. cepa P1-29.

Em um aspecto adicional, a invenção refere-se a uma variante de fitase, a dita variante compreendendo uma substituinção correspondente às posições A122, D125, T167, F197, T209, A211, K240, A242, S281, Q289, A294 e N303 em uma fitase derivada de Buttiauxella sp. cepa P1-29.

Em outro aspecto, a invenção se refere a uma fitase isolada compreendendo uma substituição correspondente às posições A122, D125, T167, F197, T209, A211, K240, A242, S281, Q289, A294 e N303 da SEQ ID NO: 1 e com pelo menos 95% de identidade de seqüência inclusive com as 25 substituições variantes dos resíduos de aminoácidos 34 - 446 da SEQ ID NO: 1. Em uma modalidade, a substituição compreende A122T, D125A, T167I, F197S, T209K, A211P, K240E, A242S, S281L, Q289Y, A294E e N303K da SEQ ID NO: 1. Em outra modalidade, a substituição corresponde às posições R51, R55, T58, K59, D125, R127, K164, N239, G248, T252, 30 E255, E276, H286, F290, M293, N303, H339, D340, T341 e/ou D361 da SEQ ID NO: 1.

Em um aspecto adicional, a invenção se refere a uma variante da fitase designada por BP-11, a dita variante compreendendo uma substitu- ição correspondente às posições R24, R28, T31, K32, D98, R100, K137, N212, G221, T225, E228, E249, H259, F263, M266, N276, H312, D313, T314 e/ou D334 da SEQ ID NO: 4. Em uma modalidade, a variante de BP-11 5 tem uma substituição em uma posição correspondente a D98. Em uma mo- dalidade preferida, a substituição é D98A.

Em ainda outro aspecto, a invenção refere-se a um polipeptídio com atividade de fitase, que compreende a SEQ ID NO: 3. Em uma modali- dade, a invenção se refere a um polipeptídio com atividade de fitase consis- ti 0 tindo na seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO: 3.

Em um aspecto adicional, a invenção se refere a um DNA isola- do que codifica uma variante de fitase englobada pela invenção e vetores de expressão incluindo o dito DNA.

Em ainda outro aspecto, a invenção se refere a uma variante de 15 Buttiauxella sp. com características de fitase aperfeiçoadas. Em uma moda- lidade, a característica de fitase aperfeiçoada será uma melhor estabilidade térmica em comparação com uma Buttiauxella sp. nativa e, mais especifica- mente, a fitase de Buttiauxella sp. derivada da cepa P1-29. Em outras moda- lidades, a variante terá características aperfeiçoadas em comparação com 20 BP-11.

Em outros aspectos, a invenção se refere a composições de en- zima compreendendo uma proteína com atividade de fitase, em que a com- posição de enzima é usada em aplicações comerciais. Em uma modalidade, a composição de enzima pode ser uma composição de ração para animais. 25 Em outras modalidades, a composição de enzima pode ser usada em pro- cessos de hidrólise de amido (por exemplo, liquefação). Em modalidades adicionais, uma composição de enzima compreendendo uma fitase engloba- da pela invenção incluirá enzimas adicionais, como glucamilases, alfa amila- ses, protease, celulases e combinações das mesmas.

Em um aspecto, a presente invenção se refere a um meio de

fermentação incluindo uma fitase de Buttiauxella ou sua variante de uma cultura de células fúngicas filamentosas. Em um aspecto, as células fúngicas filamentosas são células de Trichoderma, como T. reesei. Em um aspecto, a fitase tem uma seqüência de aminoácidos com pelo menos 75% de identi- dade de seqüência com SEQ ID NO: 1, como SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 3.

5 Em um aspecto adicional, a presente invenção se refere a méto-

dos para a produção de uma fitase em uma célula hospedeira fúngica fila- mentosa por transformação de uma célula hospedeira fúngica filamentosa com um construto de DNA incluindo um promotor com atividade transcricio- nal na célula hospedeira fúngica filamentosa operacionalmente ligado a um polinucleotídeo heterólogo que codifique uma fitase com atividade de fitase e com uma seqüência de aminoácidos com pelo menos 75% de identidade de seqüência à SEQ ID NO: 1, cultivo da célula hospedeira fúngica filamentosa em um meio de cultura adequado, para permitir a expressão da dita fitase, e produção da fitase. O método também pode incluir a recuperação da fitase produzida. Em uma modalidade, a célula hospedeira fúngica filamentosa é uma célula de Trichoderma, como T. reesei. Em um aspecto, a fitase tem pelo menos 95% de identidade de seqüência de aminoácidos com a SEQ ID NO: 1. Em um aspecto adicional, a fitase tem a seqüência de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 3. Em outro aspecto, a invenção é uma célula de Trichoderma obtida de acordo com o método delineado acima.

BREVE DESCRICÃO DOS DESENHOS

A figura 1A representa um polipeptídio codificado pelo gene de fitase de Buttiauxella P1-29 (BP-WT) SEQ ID NO: 1), incluindo a seqüência de sinal nativa e a proteína madura (SEQ ID NO: 2). A seqüência de sinal está sublinhada.

A figura 1B representa a proteína madura da variante BP-11 sem uma seqüência de sinal, mas incluindo etiquetas His N-terminais (SEQ ID NO: 4). A variante BP-11 tem uma substituição de 11 resíduos de aminoáci- dos quando alinhada com a BP-WT. Essas substituições estão ressaltadas e sublinhadas na figura.

A figura 1C representa a proteína madura da variante de fitase de Buttiauxella (BP-17) (SEQ ID NO: 3). A variante BP-17 tem as mesmas substituições de 11 aminoácidos que a BP-11 mais uma (1) substituição adi- cional, que está ressaltada e sublinhada na figura.

A figura 2 ilustra o vetor de expressão pCDP(SHOK) conforme mais detalhadamente descrito no Exemplo 3.

A figura 3 mostra a comparação do perfil de pH de BP-17 ex-

pressada em E. coli e BP-WT, conforme mais detalhadamente descrito no Exemplo 3.

A figura 4 mostra a resistência a pepsina de BP-WT e do mutan- te BP-17, conforme mais detalhadamente descrito no Exemplo 3.

A figura 5 ilustra o construto de fusão pTREX4/fitase, conforme

mais detalhadamente descrito no Exemplo 4.

A figura 6 ilustra o construto direto pTREX4/fitase, conforme mais detalhadamente descrito no Exemplo 6.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO A menos que aqui definido de outra forma, todos os termos téc-

nicos e científicos aqui usados têm o mesmo significado que o comumente entendido por aqueles versados na técnica a que pertence esta invenção. Singleton, et ai, DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY, 2a Ed., John Wiley and Sons, New York (1994), e Hale & Marham, 20 THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY, Harper Perennial, NY (1991), apresentam àqueles versados na técnica um dicionário genérico de muitos dos termos usados nesta invenção.

Embora quaisquer métodos e materiais similares ou equivalen- tes aos aqui descritos possam ser usados na prática ou teste da presente 25 invenção, descrevem-se os métodos e materiais preferidos. As faixas numé- ricas são inclusivas dos números que definem a faixa. A menos que indicado de outra forma, as seqüências de ácidos nucleicos são escritas da esquerda para a direita, na orientação 5’ para 3’; as seqüências de aminoácidos são escritas da esquerda para a direita na orientação amino para carbóxi, res- 30 pectivamente.

Os cabeçalhos aqui apresentados não são limitações dos vários aspectos ou modalidades da invenção que possam ser tidos por referência ao relatório como um todo. Portanto, os termos definidos imediatamente a- baixo são mais detalhadamente definidos por referência ao relatório como um todo.

Definições:

Conforme aqui usado, o termo "fitase" ou "atividade de fitase" se

refere a uma proteína ou polipeptídio que seja capaz de catalisar a hidrólise de fitato em (1) mioinositol e/ou (2) seus mono-, di-, tri-, tetra- e/ou pentafos- fatos e (3) fosfato inorgânico. Por exemplo, enzimas com atividade catalítica conforme definida na Comissão de Enzimas EC número 3.1.3.8 ou EC nú- mero 3.1.3.26.

O termo "uma fitase de Buttiauxella spp.", conforme aqui usado, refere-se a uma proteína fitase obtida de uma Buttiauxella spp. Em uma mo- dalidade, a fitase de Buttiauxella spp. compreende a seqüência de aminoá- cidos de NCIMB (Coleções Nacionais de Bactérias Marinhas e Alimentares 15 Industriais, Escócia, RU) número de acesso NCIMB 41248. Em uma modali- dade preferida, uma fitase de Buttiauxella spp. compreende a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 ou os resíduos de aminoácidos 34 a 446 de SEQ ID NO: 1.

O termo "correspondendo a uma fitase de Buttiauxella spp.", conforme aqui usado, refere-se a uma enzima com as mesmas característi- cas funcionais de uma fitase de Buttiauxella spp., mas não necessariamente obtida de uma fonte de Buttiauxella spp.

O termo "Buttiauxella" se refere a um gênero de bactérias gram negativas, facultativamente anaeróbicas, da família Enterobacteriaceae, e 25 Buttiauxella spp inclui B. agrestis, B. brennerase, B. ferragutiae, B. gaviniae, B. izardii, B. noackiae e B. warmboldiae. Cepas de espécies de Buttiauxella são disponíveis, por exemplo, na Coleção Americana de Cultura de Tipo (ATCC) e DSMZ, o Centro Alemão de Recursos Naturais Para Material Bio- lógico.

O termo "fitase de tipo selvagem" ou "tipo selvagem" se refere a

uma enzima com uma seqüência de aminoácidos encontrada na natureza.

O termo "variante de fitase de Buttiauxella spp." significa uma enzima fitase com uma seqüência de aminoácidos derivada da seqüência de aminoácidos de uma fitase de origem ou fitase precursora, mas diferindo em pelo menos uma substituição, inserção e/ou deleção de aminoácido que são chamadas em conjunto de mutações.

O termo "fitase madura" se refere a uma fitase após o proces-

samento do sinal, como remoção de seqüências de sinal de secreção.

O termo "BP-11" designa uma fitase compreendendo a seqüên- cia de aminoácidos das posições 7 a 419 de SEQ ID NO: 4. BP-11 é uma virante da fitase de Buttiauxella spp. de tipo selvagem com SEQ ID NO: 1.

O termo "BP-17" designa uma fitase compreendendo a seqüên-

cia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3.

"Proteína", conforme aqui usado, inclui proteínas, polipeptídios e peptídios. Conforme será percebido por aqueles versados na técnica, as se- qüências de ácidos nucleicos da invenção, conforme definidas abaixo e aqui mais detalhadamente descritas, podem ser usadas para gerar seqüências de proteínas.

Os termos "resíduo de aminoácido equivalente a", "aminoácido correspondendo a" e seus equivalentes gramaticais são aqui usados para se referirem a um resíduo de aminoácido de uma proteína com uma posição e 20 um efeito similares aos indicados na seqüência de aminoácidos particular de uma proteína particular. Aqueles versados na técnica reconhecerão a equi- valência de resíduos específicos em proteínas fitase comparáveis.

"Porcentagem de identidade de seqüência", com relação a duas seqüências de aminoácidos ou polinucleotídeos, refere-se à porcentagem de 25 resíduos que são idênticos nas duas seqüências quando as seqüências são alinhadas de maneira ótima. Assim, 80% de identidade de seqüência de a- minoácidos significa que 80% dos aminoácidos em duas seqüências de poli- peptídios alinhadas de maneira ótima são idênticos. A porcentagem de iden- tidade pode ser determinada, por exemplo, por uma comparação direta da 30 informação de seqüência entre duas moléculas por alinhamento das se- qüências, contagem do número exato de correspondências entre as duas seqüências alinhadas, divisão pelo comprimento da seqüência mais curta e multiplicação do resultado por 100. Programas de computador prontamente disponíveis podem ser usados para auxiliar na análise, como ALIGN, Da- yhoff, M.O. em "Atlas of Protein Sequence and Structure", M.O. Dayhoff ed., Suppl. 3:353-358, National Biomedical Research Foundation, Washington, 5 DC, que adapta o algorimo de homologia local de Smith e Waterman (1981) Advances in Appl. Math. 2:482-489, para análise de peptídios. Programas para determinar a identidade de seqüência de nucleotídeos estão disponíveis no Pacote de Análise de Seqüência Wisconsin, Versão 8 (disponíveis na Genetics Computer Group, Madison, Wl), por exemplo, os programas BESTFIT, FASTA 10 e GAP, que também se baseiam no algoritmo de Smith e Waterman. Esses programas são prontamente utilizados com os parâmetros predeterminados recomendados pelo fabricante e descritos no Pacote de Análise de Seqüên- cia Wisconsin acima mencionado. Um exemplo de um algoritmo que é ade- quado para determinar a similaridade de seqüência é o algoritmo BLAST, 15 que é descrito em Altschul, et ai, J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990). O softwa- re para realizar análises BLAST é de domínio público pelo Centro Nacional de Informação Biotecnológica (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/).

O termo "propriedade" ou seus equivalentes gramaticais no con- texto de um polipeptídio, conforme aqui usado, refere-se a qualquer caracte- 20 rística ou atributo de um polipeptídio que possa ser selecionado ou detecta- do. Essas propriedades incluem, mas não se limitam a, estabilidade oxidati- va, especificidade de substrato, atividade catalítica, estabilidade térmica, perfil de atividade de pH e capacidade de ser secretado.

Os termos "termicamente estável" e "termoestável" se referem a fitases da presente invenção que retenham uma quantidade especificada de atividade enzimática após exposição a temperatura elevada.

O termo "estabilidade aumentada", no contexto de uma proprie- dade como termoestabilidade, refere-se a uma atividade enzimática mantida de maneira elevada com o tempo em comparação com outras fitases.

Os termos "polinucleotídeo" e "ácido nucleico", usados aqui de

maneira intercambiável, referem-se a uma forma polimérica de nucleotídeos de qualquer comprimento, quer ribonucleotídeos, quer desoxirribonucleotí- deos. Esses termos incluem, mas não se limitam a, DNA de fila simples, du- pla ou tripla, DNA genômico, cDNA, RNA, híbrido de DNA-RNA ou uma po- límero compreendendo bases purina e pirimidina, ou outras bases nucleotí- dicas naturais, química, bioquimicamente modificadas, não-naturais ou deri- vatizadas.

Conforme aqui usado, o termo "gene" se refere a um polinucleo- tídeo (por exemplo, um segmento de DNA) que codifique um polipeptídio e inclua regiões precedendo e seguindo as regiões codificadoras, assim como seqüências intervenientes (introns) entre segmentos codificadores individu- ais (exons).

Conforme aqui usados, os termos "construto de DNA", "DNA transformador" e "vetor de expressão" são usados de maneira intercambiá- vel para se referirem a DNA usado para introduzir seqüências em uma célula ou organismo hospedeiro. O DNA pode ser gerado in vitro por PCR ou qual- 15 quer outra técnica adequada conhecida por aqueles versados na técnica. O construto de DNA, DNA transformador ou cassete de expressão recombi- nante pode ser incorporado em um plasmídio, cromossomo, DNA mitocon- drial, DNA plastídico, vírus ou fragmento de ácido nucleico. Tipicamente, a parte de cassete de expressão recombinante de um vetor de expressão, 20 construto de DNA ou DNA transformador inclui, entre outras seqüências, uma seqüência de ácido nucleico a ser transcrita e um promotor. Em moda- lidades preferidas, os vetores de expressão têm a capacidade de incorporar e expressar fragmentos de DNA heterólogos em uma célula hospedeira.

Conforme aqui usado, o termo "vetor" se refere a um construto de polinucleotídeo projetado para introduzir ácidos nucleicos em um ou mais tipos de células. Os vetores incluem vetores de clonagem, vetores de ex- pressão, vetores lançadores, plasmídios, cassetes e similares.

Conforme aqui usado no contexto da introdução de uma se- qüência de ácido nucleico em uma célula, o termo "introduzido" se refere a qualquer método adequado para transferir a seqüência de ácido nucleico para uma célula. Esses métodos para introdução incluem, mas não se limi- tam a, fusão de protoplastos, transfecção, transformação, conjugação e transdução e incluem referências à incorporação de uma seqüência de ácido nucleico em uma célula eucariótica ou procariótica em que a seqüência de ácido nucleico possa ser incorporada no genoma da célula (por exemplo, cromossomo, plasmídio, plastídio ou DNA mitocondrial), convertido em um 5 réplicon autônomo ou transitoriamente expressado (por exemplo, mRNA transfectado).

O termo "alinhamento ótimo" se refere ao alinhamento que pro- porciona a maior contagem de porcentagem de identidade.

Os termos "proteína" e "polipeptídio" são aqui usados de manei- 10 ra intercambiável. Na presente descrição e reivindicações, usam-se os códi- gos convencionais de uma letra e de três letras para resíduos de aminoáci- dos. O código de 3 letras para aminoácidos, conforme definido de acordo com a Comissão Conjunta IUPAC-IUB Para Nomenclatura Bioquímica (JCBN). Também deve-se entender que um polipeptídio pode ser codificado 15 por mais de uma seqüência de nucleotídeos, devido à degeneração do códi- go genético.

Variantes da invenção são descritas pela seguinte nomenclatura: [resíduo de aminoácido original/posição/resíduo de aminoácido substituinte], Por exemplo, a substituição de arginina (R) por ácido glutâmico (E) na posi- ção 51 da SEQ ID NO: 1 é representada como R51E. Quando mais de um aminoácido é substituído em uma dada posição, a substituição é represen- tada como 1) R51E, R51A, R51H ou R51W; 2) R51E, A, H ou W ou c) R51/E/A/H/W. Quando uma posição adequada para substituição é aqui iden- tificada sem um aminoácido específico sugerido, deve-se entender que qualquer resíduo de aminoácido pode substituir o resíduo de aminoácido presente na posição. Quando uma variante de fitase contém uma deleção em comparação com outras fitases, a deleção é indicada com "*". Por exem- plo, uma deleção na posição R51 é representada como R51*. Uma deleção de dois ou mais aminoácidos consecutivos é indicada, por exemplo, como (51 a 54)*.

Uma "pró-sequência" é uma seqüência de aminoácidos entre a seqüência de sinal e a proteína madura que é necessária para a secreção da proteína. A clivagem da pró-sequência resultará em uma proteína ativa madura.

O termo "seqüência de sinal" ou "peptídio de sinal" refere-se a qualquer seqüência de nucleotídeos e/ou aminoácidos que possa participar 5 na secreção das formas maduras ou precursoras da proteína. Essa definição de seqüência de sinal é funcional, pretendendo incluir todas as seqüências de aminoácidos codificadas pela parte N-terminal do gene da proteína que participem para efetuar a secreção da proteína. Frequentemente, mas não universalmente, estão ligadas à parte N-terminal de uma proteína ou à parte 10 N-terminal de uma proteína precursora.

"Cepa hospedeira" ou "célula hospedeira" se refere a um hospe- deiro adequado para um vetor de expressão compreendendo DNA de acor- do com a presente invenção.

Os termos "derivado de" e "obtido de" se referem a não apenas 15 uma fitase produzida ou produzível por uma cepa do organismo em questão, mas também a uma fitase codificada por uma seqüência de DNA isolada dessa cepa e produzida em um organismo hospedeiro contendo essa se- qüência de DNA. Além disso, o termo se refere a uma fitase que seja codifi- cada por uma seqüência de DNA de origem sintética e/ou de cDNA e que 20 tenha as características identificadoras da fitase em questão.

O termo "isolado", "recuperado" ou "purificado" se refere a um material que esteja removido de seu ambiente original.

Uma "ração" e um "alimento" significam, respectivamente, qual- quer dieta, refeição ou similar natural ou artificial ou componentes dessas refeições destinados a ou adequados para serem comidos, ingeridos, digeri- dos por um animal ou um ser humano, respectivamente.

Um "aditivo alimentar ou de ração" é um composto essencial- mente puro ou uma composição de múltiplos componentes destinada a ou adequada para ser adicionada a um alimento ou ração. Normalmente com- 30 preende um ou mais compostos como vitaminas, minerais ou enzimas inten- sificadoras de ração e veículos e/ou excipientes adequados e normalmente é apresentado em uma forma que seja adequada para adição a uma ração animal.

O termo "liquefação de amido" refere-se a um processo pelo qual o amido é convertido em dextrinas de cadeias mais curtas e menos vis- cosas.

O termo "fitase de Buttiauxella nativa (fitase de n-Buttiauxella)"

refere-se a uma fitase de Buttiauxella produzida pela expressão endógena da fitase de Buttiauxella. Por exemplo, o termo "fitase de n-Buttiauxella" sig- nifica a expressão endógena de uma fitase de Buttiauxella (isto é, SEQ ID NO: 1) de uma espécie de Buttiauxella.

Os termos "fitase de Buttiauxella recombinante (fitase de r-

Buttiauxella)", "fitase de Buttiauxella expressada de maneira recombinante" e "fitase de Buttiauxella produzida de maneira recombinante" referem-se a uma seqüência de proteína fitase de Buttiauxella madura ou variante que seja produzida em uma célula hospedeira pela expressão de um polinucleo- 15 tídeo heterólogo. Por exemplo, o termo "fitase de r-Buttiauxella" significa que a fitase de Buttiauxella (isto é, SEQ ID NO: 1, 2 ou 3) é expressada em um hospedeiro no qual tenha sido introduzido um polinucleotídeo que codifique a fitase de Buttiauxella ou uma variante.

Um "promotor" é uma seqüência reguladora que esteja envolvida na ligação a RNA polimerase para iniciar a transcrição de um gene.

"Sob controle transcricional" é um termo bem entendido na téc- nica, que indica que a transcrição de uma seqüência polinucleotídica, nor- malmente uma seqüência de DNA, depende de estar operacionalmente liga- da a um elemento que contribua para o início da ou promova a transcrição. "Sob controle de tradução" é um termo bem entendido na técni-

ca, que indica um processo regulatório que ocorre depois que o mRNA tenha sido formado.

Conforme aqui usado quando se descrevem proteínas e genes que os codificam, o termo para o gene está em itálico (por exemplo, o gene que codifica a fitase de Buttiauxella). O termo para a proteína em geral não está em itálico, e a primeira letra em geral é maiúscula.

O termo "operacionalmente ligado" se refere à justaposição em que os elementos estão em um arranjo que os permite estar funcionalmente relacionados. Por exemplo, um promotor está operacionalmente ligado a uma seqüência codificadora se controlar a transcrição da seqüência.

O termo "marcador seletivo" se refere a um gene capaz de ex- 5 pressão em um hospedeiro que permita uma fácil seleção dos hospedeiros que contêm um ácido nucleico ou vetor introduzido. Exemplos de marcado- res selecionáveis incluem, mas não se limitam a, antimicrobianos (por e- xemplo, higromicina, bleomicina ou cloranfenicol) e/ou genes que confiram uma vantagem metabólica, como uma vantagem nutricional, à célula hospe- 10 deira.

O termo "heterólogo" com referência a um polinucleotídeo ou a uma proteína se refere a um polinucleotídeo ou proteína que não ocorra na- turalmente em uma célula hospedeira.

O termo "endógeno" com referência a um polinucleotídeo ou a uma proteína se refere a um polinucleotídeo ou proteína que ocorra natural- mente em uma célula hospedeira.

Os termos "recuperado", "isolado" e "separado", conforme aqui usados, referem-se a um composto, proteína, célula, ácido nucleico ou ami- noácido que seja removido de pelo menos um componente ao qual esteja naturalmente associado.

Conforme aqui usados, os termos "transformado", "transformado de maneira estável" e "transgênico", usados com referência a uma célula, significam que a célula tem uma seqüência de ácido nucleico não-nativa (por exemplo, heteróloga) integrada a seu genoma ou como um plasmídio epis- somai que é mantido através de múltiplas gerações.

Conforme aqui usado, o termo "expressão" se refere ao proces- so pelo qual um polipeptídio é produzido com base na seqüência de ácidos nucleicos de um gene. O processo inclui tanto transcrição, quanto tradução.

Embora quaisquer métodos e materiais similares ou equivalen- tes aos aqui descritos possam ser usados na prática ou teste da presente invenção, métodos e materiais exemplificativos e preferidos são agora des- critos. Todas as publicações aqui mencionadas são aqui incorporadas por referência para expor e descrever os métodos e/ou materiais com relação aos quais as publicações são citadas.

Outras definições de termos podem aparecer no decorrer do re- latório. Antes de as modalidades exemplificativas serem descritas em maio- 5 res detalhes, deve-se entender que esta invenção não se limita às modali- dades particulares descritas, pois estas, evidentemente, variam. Também se deve entender que a terminologia aqui usada é apenas para fins de descri- ção de modalidades particulares e não pretende ser limitativa, pois o âmbito da presente invenção será limitado apenas pelas reivindicações anexas.

Quando se apresenta uma faixa de valores, deve-se entender

que cada valor intermediário, até um décimo da unidade do limite inferior, a menos que o contexto determine claramente de outra forma, entre os limites superior e inferior dessa faixa, também é especificamente apresentado. Ca- da faixa menor entre qualquer valor mencionado ou valor intermediário em 15 uma faixa mencionada e qualquer outro valor mencionado ou intermediário nessa faixa mencionada está englobada na invenção. Os limites superior e inferior dessas faixas menores podem ser independentemente incluídos ou excluídos da faixa, e cada faixa em que qualquer, nenhum ou ambos os limi- tes estejam incluídos nas faixas menores também está englobada pela in- 20 venção, sujeita a qualquer limite especificamente excluído na faixa mencio- nada. Quando a faixa mencionada inclui um ou ambos os limites, faixas que excluam qualquer um ou ambos os limites incluídos também estão incluídas na invenção.

Deve-se notar que, conforme aqui usado e nas reivindicações 25 anexas, as formas singulares "um", "uma", "o" e "a" incluem os respectivos plurais, a menos que o contexto claramente determine de outra forma. As- sim, por exemplo, a referência a "um gene" inclui uma pluralidade desses agentes candidatos, e a referência a "a célula" inclui a referência a uma ou mais células e seus equivalentes conhecidos por aqueles versados na técni- 30 ca, e assim por diante.

As publicações aqui discutidas são apresentadas apenas por sua exposição anterior à data de depósito do presente pedido. Nada aqui deve ser tomado como uma admissão de que a presente invenção não ante- ceda a essa publicação em virtude de invenção anterior.

Enzimas fitase/variantes:

Enzimas fitase usadas como enzimas de origem ou precursoras 5 incluem uma fitase de Buttiauxella sp. e aquelas enzimas correspondentes a uma fitase de Buttiauxella sp. Em algumas modalidades, a fitase de Buttiau- xella sp. de origem compreende a seqüência de aminoácidos de NCIMB (Coleções Nacionais de Bactérias Marinhas e Alimentares Industriais, Escó- cia, RU) número de acesso NCIMB 41248. Em algumas modalidades, a fita- 10 se de Buttiauxella sp. de origem compreende a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 ou os resíduos de aminoácidos 34 a 446 da SEQ ID NO: 1 (por exemplo, SEQ ID NO: 2). Em algumas modalidades, a fitase de Buttiau- xella sp. de origem é derivada de B. agrestis, B. brennerase, B. ferragutiae,

B. gaviniae, B. izardii, B. noackiae e B. warmboldiae. Faz-se referência ao 15 WO 2006/043178, que é aqui especificamente incorporado por referência e que descreve fitases obteníveis ou derivadas de uma fitase de Buttiauxella sp. de origem e fitases correspondentes a uma enzima fitase de Buttiauxella sp.. Em algumas modalidades, uma fitase de Buttiauxella sp. de tipo selva- gem tem pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 20 90%, pelo menos 93%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% e pelo menos 99% de identidade de seqüência de aminoácidos com o polipeptídio da SEQ ID NO: 1 ou o polipeptídio da SEQ ID NO: 2.

A presente invenção se refere a fitases variantes (por exemplo, 25 fitases variantes de Buttiauxella sp.). Especificamente, o WO 2006/043178 descreve a mutagênese de uma enzima fitase de tipo selvagem com a se- qüência aqui apresentada como SEQ ID NO: 3 e chamada no presente pe- dido de SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 2. Inúmeras mutações preferidas são ensinadas na WO 2006/043178. Uma fitase variante conterá pelo menos 30 uma substituição, deleção ou inserção de aminoácido, com substituições de aminoácidos sendo particularmente preferidas. A substituição, inserção ou deleção de aminoácidos pode ocorrer em qualquer resíduo dentro do peptí- dio da fitase. Uma variante de fitase da presente invenção é uma variante que não tenha uma seqüência de aminoácidos idêntica à seqüência de ami- noácidos da presente SEQ ID NO: 2.

Em modalidades preferidas da presente invenção, a variante 5 compreenderá uma substituição correspondendo às posições A122, D125, T167, F197, T209, A211, K240, A242, S281, Q289, A294 e N303 em uma fitase de Buttiauxella sp. e, mais especificamenbte, correspondendo às ditas posições equivalentes na SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades, a substi- tuição compreende qualquer um dos 19 aminoácidos restantes correspon- 10 dendo a A, C, D, E, F, G, Η, I, K, L , Μ, N, P, Q, R, S, T, V, W ou Y. Em al- gumas modalidades, a variante compreende as seguintes substituições de aminoácidos: A122T, D125A, T167I, F197S, T209K, A211P, K240E, A242S, S281L, Q289Y, A294E e N303K correspondendo à SEQ ID NO: 1.

Em algumas modalidades, a fitase é uma variante da fitase de- signada por BP-11, a dita variante BP-11 compreendendo os resíduos de aminoácidos 7 a 419 da SEQ ID NO: 4. BP-11 é uma variante da BP-WT (SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 2).

Em algumas modalidades, a dita variante da fitase BP-11 com- preende pelo menos uma substituição correspondendo às posições R24, R28, T31, K32, D98, R100, K137, N212, G221, T225, E228, E249, H259, F263, M266, N276, H312, D313, T314 e/ou D334 da SEQ ID NO: 4 ou uma seqüência com pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% e pelo menos 99% de identidade de seqüência de aminoácidos, incluindo as substituições variantes dos resíduos aminoácidos 7 - 419 da SEQ ID NO: 4. Em algumas modalidades, a variante incluirá mais de uma substituição, por exemplo, duas, três, quatro ou mais substituições. Em outra modalidade, a variante de BP-11 tem uma substituição na posição corres- pondendo a D98. Embora a substituição possa ser de qualquer um dos 19 aminoácidos restantes, em uma modalidade preferida, a substituição é D98A. Em modalidades adicionais, a variante BP-11 com uma substituição correspondendo à posição D98 incluirá uma ou mais substituições do grupo que corresponde às posições R24, R28, T31, K32, R100, K137, N212, G221, Τ225, Ε228, Ε249, Η259, F263, Μ266, Ν276, Η312, D313, Τ314 e/ou D334 da SEQ ID NO: 4. Em algumas modalidades, a variante tem uma atividade igual ou maior que a fitase BP-11.

Em uma modalidade particularmente preferida, a variante de fi- 5 tase compreende o polipeptídio da SEQ ID NO: 3. Em outra modalidade, a variante de fitase consiste no polipeptídio da SEQ ID NO: 3.

Em algumas modalidades, a variante de acordo com a invenção, incluindo uma substituição de aminoácido nas posições A122, D125, T167, F197, T209, A211, K240, A242, S281, Q289, A294 e N303 da SEQ ID NO: 10 1, também compreenderá uma fitase com pelo menos 90%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94% e pelo menos 95% de identidade de seqüência, incluindo as substituições variantes, com os resíduos de aminoá- cidos 34 a 446 da fitase de tipo selvagem de SEQ ID NO: 1.

Em algumas modalidades, uma variante de acordo com a inven- 15 ção incluirá, além de uma substituição correspondendo às posições A122, D125, T167, F197, T209, A211, K240, A242, S281, Q289, A294 e N303 da SEQ ID NO: 1, uma ou mais substituições correspondendo aos resíduos de aminoácidos 59, 70, 193, 204, 221, 223, 225, 268, 336 e 351. Em algumas modalidades, a variante incluirá as substituições correspondendo a K59E, 20 N70Y, H193R, T204I, S221N, D223E, G225A, A268V, I336F e N351 de SEQ ID NO: 1.

Em algumas modalidades, uma variante de acordo com a inven- ção incluirá um fragmento funcional. Um fragmento funcional significa uma parte da fitase de Buttiauxella spp. que retenha a função enzimática, de pre- 25 ferência que o fragmento retenha essencialmente a mesma quantidade de função enzimática ou uma quantidade maior de função enzimática em com- paração com o polipeptídio de fitase do qual foi derivado. Em algumas mo- dalidades, a variante que é um fragmento incluirá uma substituição corres- pondendo às posições A122, D125, T167, F197, T209, A211, K240, A242, 30 S281, Q289, A294 e N303 da SEQ ID NO: 1 e pelo menos 350, pelo menos 375 ou pelo menos 400 resíduos de aminoácidos da SEQ ID NO: 1. Em al- gumas modalidades, uma variante de acordo com a invenção (por exemplo, SEQ ID NO: 3) será um fragmento com pelo menos 350, pelo menos 375 ou pelo menos 400 resíduos de aminoácidos.

As variantes podem ser preparadas por mutagênese aleatória, mutagênese de saturação de sítio e mutagênese específica para sítio de 5 nucleotídeos no DNA que codifica a proteína fitase, usando-se um cassete ou mutagênese de PCR ou outras técnicas bem-conhecidas na técnica, para produzir variantes que possam ser, depois disso, produzidas em cultura ce- lular. Faz-se referência a Morinaga et al., (1984) Biotechnology 2: 646-649; Nelson e Long, (1989) Analytical Biochem., 180: 147-151, e Sarkar e Som- 10 mer (1990) Biotechniques 8: 404-407. Fragmentos de proteína fitase variante também podem ser preparados por síntese in vitro usando-se técnicas esta- belecidas.

Polinucleotídeos:

A presente invenção também engloba polinucleotídeos que codi- fiquem as fitases variantes de acordo com a invenção. Aqueles versados na técnica estão cientes de que, devido à degeneração do código genético, po- dem-se produzir seqüências de nucleotídeos em que o uso do códon de tri- pleto para alguns dos aminoácidos codificados por uma seqüência original tenha sido alterado, produzindo, dessa forma, uma seqüência de nucleotí- deos diferentes, mas que codifique a mesma fitase que a seqüência de nu- cleotídeos original. Por exemplo, uma seqüência de nucleotídeos com uma alteração na terceira posição do códon de tripleto para todos os códons de tripleto seria cerca de 66% idêntica à seqüência original; entretanto, a se- qüência de nucleotídeos emendada codificaria a mesma fitase (por exemplo, com a mesma seqüência de aminoácidos primária).

Podem-se obter polinucleotídeos por procedimentos padroniza- dos conhecidos na técnica, por exemplo, a partir de DNA clonado (por e- xemplo, uma "biblioteca" de DNA), por síntese química, por clonagem de cDNA, por PCR (patente norte-americana n° 4.683.202 ou Saiki et al., (1988) 30 239: 487-491), por métodos sinteticamente estabelecidos (Beucage et al., (1981) Tetrahedron Letters 22: 1859 - 1869, e Matthes et al., (1984) EMBO J. 3: 801-895) ou pela clonagem de DNA genômico, ou seus fragmentos, substancialmente purificado de uma célula desejada, como Buttiauxella sp. (veja, por exemplo, Sambrook et al., 2001, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 3a Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York; Glober, DM e Hames, BD (Eds.), 1995, DNA Cloning 1: A Practi- 5 cal Approach and DNA Cloning 2: A Practical Approach, Oxford University Press, Oxford). Seqüências de ácidos nucleicos derivadas de DNA genômi- co, e seus derivados, podem conter regiões regulatórias, além de regiões codificadoras.

Tabela 1: Seqüência polinucleotídica de BP-WT

TTTCACATAGCAAACAACAACGAGACGAACTCGACGTTACCGCTTTGCTT

CTGGAGTATATTTATCAGACTCAAACACCCCAAAGAAAAGAGGCTGTAAA

TGACGATCTCTGCGTTTAACCGCAAAAAACTGACGCTTCACCCTGGTCTG

TTCGTAGCACTGAGCGCCATATTTTCATTAGGCTCTACGGCCTATGCCAA

CGACACTCCCGCTTCAGGCTACCAGGTTGAGAAAGTGGTAATACTCAGCC

GCCACGGGGTGCGAGCACCAACCAAAATGACACAGACCATGCGCGACGTA

ACACCTAATACCTGGCCCGAATGGCCAGTAAAATTGGGTTATATCACGCC

ACGCGGTGAGCATCTGATTAGCCTGATGGGCGGGTTTTATCGCCAGAAGT

TTCAACAACAGGGCATTTTATCGCAGGGCAGTTGCCCCACACCAAACTCA

ATTTATGTCTGGGCAGACGTTGATCAGCGCACGCTTAAAACTGGCGAAGC

TTTCCTGGCAGGGCTTGCTCCGGAATGTCATTTAACTATTCACCACCAGC

AGGACATCAAAAAAGCCGATCCGCTGTTCCATCCGGTGAAAGCGGGCACC

TGTTCAATGGATAAAACTCAGGTCCAACAGGCCGTTGAAAAAGAAGCTCA

AACCCCCATTGATAATCTGAATCAGCACTATATTCCCTTTCTGGCCTTGA

TGAATACGACCCTCAACTTTTCGACGTCGGCCTGGTGTCAGAAACACAGC

GCGGATAAAAGCTGTGATTTAGGGCTATCCATGCCGAGCAAGCTGTCGAT

AAAAGATAATGGCAACAAAGTCGCTCTCGACGGGGCCATTGGCCTTTCGT

CTACGCTTGCTGAAATTTTCCTGCTGGAATATGCGCAAGGGATGCCGCAA

GCGGCGTGGGGGAATATTCATTCAGAGCAAGAGTGGGCGTCGCTACTGAA

ACTGCATAACGTCCAGTTTGATTTGATGGCACGCACGCCTTATATCGCCA

GACATAACGGCACGCCTTTATTGCAGGCCATCAGCAACGCGCTGAACCCG AATGCCACCGAAAGCAAACTGCCTGATATCTCACCTGACAATAAGATCCT GTTTATTGCCGGACACGATACCAATATTGCCAATATCGCAGGCATGCTCA ACATGCGCTGGACGCTACCTGGGCAACCCGATAACACCCCTCCGGGCGGC GCTTTAGTCTTTGAGCGTTTGGCCGATAAGTCAGGGAAACAATATGTTAG CGTGAGCATGGTGTATCAGACTCTCGAGCAGTTGCGCTCCCAAACACCAC TTAGCCTTAATCAACCTGCGGGAAGCGTACAGCTAAAAATTCCTGGCTGT AACGATCAGACGGCTGAAGGATACTGCCCGCTGTCGACGTTCACTCGCGT GGTTAGCCAAAGCGTGGAACCAGGCTGCCAGCTACAGTAAATATCAGACA AAAAAAATGCCGCTCGCGATTAAGCGAACGGCATTACTTCCTAGCTTCCC AGCTCGGATTAGCATGGCGAGAGCCGAAAAACTT (SEQ ID N0:5)

Deve-se notar que as seqüências polinucleotídicas apresentadas na WO 2006/043178 (SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 2) serão úteis para se obterem fragmentos de polinucleotídeos idênticos ou homólogos a partir de outras cepas que codifiquem enzimas com atividade fitase. A seqüência po- 5 linucleotídica (SEQ ID NO: 5) que compõe o gene de fitase de Buttiauxella P1-29 (BP-WT) é ilustrada abaixo na tabela 1. A seqüência polinucleotídica (SEQ ID NO: 14) que compõe o gene de fitase da variante BP-17 é mostrada na tabela 2 abaixo.

Tabela 2: Seqüência polinucleotídica de BP-17

AACGACACCCCCGCCAGCGGCTACCAGGTCGAGAAGGTCGTCATCCTCAGCCGCCA

CGGCGTCCGCGCCCCTACCAAGATGACCCAGACCATGCGCGACGTCACCCCCAACA

CCTGGCCCGAGTGGCCCGTCAAGCTCGGCTACATCACCCCTCGCGGCGAGCACCTC

ATCAGCCTCATGGGCGGCTTCTACCGCCAGAAGTTCCAGCAGCAGGGCATCCTCAG

CCAGGGCTCGTGCCCCACCCCCAACAGCATCTACGTCTGGACTGACGTCGCCCAGC

GCACCCTCAAGACCGGCGAGGCCTTCCTCGCCGGCCTCGCCCCCCAGTGCGGCCTC

ACCATCCACCACCAGCAGAACCTCGAGAAGGCCGACCCCCTCTTCCACCCCGTCAA

GGCCGGCATCTGCAGCATGGACAAGACCCAGGTCCAGCAGGCCGTCGAGAAGGAGG

CCCAGACCCCCATCGACAACCTCAACCAGCACTACATCCCCAGCCTCGCCCTCATG

AACACCACCCTCAACTTCAGCAAGAGCCCCTGGTGCCAGAAGCACAGCGCCGACAA

GAGCTGCGACCTCGGCCTCAGCATGCCCAGCAAGCTCAGCATCAAGGACAACGGCA ACGAGGTCTCCCTCGACGGCGCTATCGGCCTCAGCTCCACCCTCGCCGAGATCTTC CTCCTCGAGTACGCCCAGGGCATGCCTCAGGCCGCCTGGGGCAACATCCACAGCGA GCAGGAGTGGGCCCTCCTCCTCAAGCTCCACAACGTCTACTTCGACCTCATGGAGC GCACCCCCTACATCGCCCGCCACAAGGGCACCCCCCTCCTCCAGGCCATCAGCAAC GCCCTCAACCCCAACGCCACCGAGAGCAAGCTCCCCGACATCAGCCCCGACAACAA GATCCTCTTCATCGCCGGCCACGACACCAACATCGCCAACATCGCCGGCATGCTCA ACATGCGCTGGACCCTCCCCGGCCAGCCCGACAACACCCCCCCTGGCGGCGCTCTC GTCTTTGAGCGCCTCGCCGACAAGTCCGGCAAGCAGTACGTCAGCGTCAGCATGGT CTACCAGACCCTCGAGCAGCTCCGCAGCCAGACCCCCCTCAGCCTCAACCAGCCTG CCGGCAGCGTCCAGCTCAAGATCCCCGGCTGCAACGACCAGACCGCCGAGGGCTAC TGCCCCCTCAGCACCTTCACCCGCGTCGTCAGCCAGAGCGTCGAGCCCGGCTGCCA GCTCCAGTAA (SEQ ID NO: 14)

Propriedades:

Em algumas modalidades, uma fitase variante de acordo com a invenção terá propriedades alteradas. De preferência, uma variante de acor- do com a invenção terá propriedades aperfeiçoadas. Em algumas modalida- 5 des, as propriedades alteradas, por exemplo, aperfeiçoadas serão especifi- cidade de substrato, atividade catalítica, estabilidade térmica, perfil de ativi- dade de pH, atividade específica e/ou capacidade de liberar grupos fosfato do fitato.

Em algumas modalidades, uma variante englobada pela inven- 10 ção terá estabilidade térmica aumentada em comparação com uma fitase de origem (por exemplo, BP-WT ou BP-11). Em algumas modalidades, a varian- te terá uma diferença de estabilidade térmica (TD) de pelo menos 1,5, pelo menos 2,0, pelo menos 2,5, pelo menos 3,0, pelo menos 5,0, pelo menos 8,0, pelo menos 10,0, pelo menos 15,0, pelo menos 18,0 e pelo menos 20,0 15 em comparação com BP-WT ou BP-11.

Em algumas modalidades, uma variante englobada pela inven- ção (por exemplo, BP-17) terá um aumento de termoestabilidade de pelo menos 3°C, pelo menos 5°C, pelo menos 10°C, pelo menos 12°C, pelo me- nos 15°C e pelo menos 20°C a um pH de 4,5, 5,0, 5,5 ou 6,0. Mais especifi- 20 camente, uma variante da invenção (por exemplo, BP-17) será termoestável a cerca de 65°C, a cerca de 70°C, a cerca de 75°C, a cerca de 80°C ou mais. Em algumas modalidades, uma fitase de acordo com a invenção é considerada termoestável se a enzima retiver mais de 50% de sua atividade após a exposição a uma temperatura especificada durante 10 minutos a pH 5,5.

Em algumas modalidades, uma variante terá uma estabilidade

proteolítica mais elevada (atividade residual). A estabilidade proteolítica po- de ser determinada pelos métodos apresentados na WO 2006/043178, e se faz referência específica ao seu exemplo 12. Em algumas modalidades, a variante englobada pela invenção terá uma atividade residual de pelo menos 10 45%, pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70% e pelo menos 85%.

Em algumas modalidades, a variante de fitase terá uma ativida- de específica maior que 100%, maior que 105%, maior que 110% e também maior que 120% de uma fitase de origem ou sua variante termoestável (por 15 exemplo, BP-WT, SEQ ID NO: ou BP-11) a um pH 4,0, a um pH 4,5 e a um pH 5,0. Em algumas modalidades, a variante terá pelo menos 5%, pelo me- nos 10%, pelo menos 15%, pelo menos 20% e pelo menos 25% mais ativi- dade específica em comparação com a fitase BP-11 ou a fitase BP-WT (SEQ ID NO: 2). Em algumas modalidades, uma variante englobada pela 20 invenção reterá essencialmente o mesmo nível de termoestabilidade que BP-WT ou BP-11, mas terá um aumento na atividade específica sob essen- cialmente as mesmas condições (por exemplo, pH).

Em algumas modalidades, a fitase variante de acordo com a in- venção terá uma atividade específica de pelo menos 100 U/mg, pelo menos 25 200 U/mg, pelo menos 300 U/mg, pelo menos 350 U/mg, pelo menos 400 U/mg, pelo menos 450 U/mg, pelo menos 500 U/mg, pelo menos 600 U/mg, pelo menos 700 U/mg, pelo menos 800 U/mg, pelo menos 900 U/mg, pelo menos 1.000 U/mg e pelo menos 1.200 U/mg, em que a atividade específica é determinada por incubação da fitase em uma solução contendo fitase a 2 30 mM, de CaCI2 a 0,8 mM em 200 mM de tampão acetato de sódio a pH 3,5, conforme detalhado no exemplo 1 do WO 2006/043178. Em algumas moda- lidades, a atividade específica é determinada a um pH ótimo de 4,0. Em algumas modalidades, uma fitase variante englobada pela invenção terá uma razão de atividade específica, quando comparada à fitase codificada pela SEQ ID NO: 5, de pelo menos 110, pelo menos 120 e pelo menos 130.

5 Em algumas modalidades, o pH de atividade máxima será pelo

menos 0,1, pelo menos 0,15, pelo menos 0,2, pelo menos 0,25, pelo menos 0,3, pelo menos 0,5, pelo menos 0,6, pelo menos 0,7, pelo menos 0,8 e pelo menos 1,0 unidade de pH menor que o da fitase de Buttiauxella sp. corres- pondente (por exemplo, SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 2), ou pelo menos 10 0,1, pelo menos 0,15, pelo menos 0,2, pelo menos 0,25, pelo menos 0,3, pelo menos 0,5, pelo menos 0,6, pelo menos 0,7, pelo menos 0,8 e pelo me- nos 1,0 unidade de pH menor que o da fitase BP-11. Em algumas modalida- des, uma variante englobada pela invenção terá atividade na faixa de pH 2,0 a 6,0 e, em algumas modalidades, uma atividade máxima em torno de pH 15 4,0 a pH 5,5 e também em torno de pH 4,0 a pH 4,5.

Em algumas modalidades, a variante englobada pela invenção pode ser usada em um método de produção de um composto de fosfato, compreendendo o tratamento de um fitato com uma fitase variante engloba- da pela invenção (por exemplo, BP-17). O fitato pode ser mioinositol, di-, tri-, 20 tetra- e/ou pentafosfatos. Outros fosfatos orgânicos adequados incluem te- trafosfatos de inositol e oligofosfatos de inositol.

Produção de fitase em células hospedeiras:

Em algumas modalidades, a invenção apresenta um método de produção de uma enzima com atividade fitase, compreendendo: (a) o forne- 25 cimento de uma célula hospedeira transformada com um vetor de expressão compreendendo um polinucleotídeo que codifique uma enzima fitase varian- te de acordo com a invenção, a dita variante compreendendo pelo menos uma modificação de pelo menos um resíduo de aminoácido conforme aqui descrito; (b) o cultivo da célula hospedeira transformada sob condições ade- 30 quadas para que a célula hospedeira produza a fitase; e (c) a recuperação da fitase.

Em algumas modalidades, o vetor de expressão compreenderá um polinucleotídeo que codifique uma fitase compreendendo uma seqüência de aminoácidos com uma substituição nos resíduos de aminoácidos corres- pondentes às posições A122, D125, T167, F197, T209, A211, K240, A242, S281, Q289, A294 e N303 da SEQ ID NO: 1, e, em outras modalidades, a 5 substituição corresponde a A122T, D125A, T167I, F197S, T209K, A211P, K240E, A242S, S281L, Q289Y, A294E e N303K da SEQ ID NO: 1. Em al- gumas modalidades, o vetor de expressão compreende um polinucleotídeo que codifica uma fitase variante compreendendo uma substituição corres- pondente às posições R24, R28, T31, K32, D98, R100, K137, N212, G221, 10 T225, E228, E249, H259, F263, M266, N276, H312, D313, T314 e/ou D334 da SEQ ID NO: 4. Em outras modalidades, o vetor inclui um polinucleotídeo que codifica uma fitase compreendendo a SEQ ID NO: 3.

Em algumas modalidades da invenção, a cepa hospedeira é ge- neticamente manipulada para expressar fitases heterólogas ou variantes com atividade de fitase de acordo com a presente invenção.

Células hospedeiras

Células hospedeiras utilizáveis para a produção de uma fitase englobada pela invenção incluem células bacterianas, células fúngicas e cé- lulas vegetais. As células hospedeiras incluem tanto as células, quanto a 20 descendência das células e protoplastos criados a partir das células que possam ser usados para produzir uma fitase variante de acordo com a in- venção.

Em algumas modalidades, as células hospedeiras são células fúngicas e, de preferência, células hospedeiras fúngicas filamentosas. O 25 termo "fungos filamentosos" se refere a todas as formas filamentosas da subdivisão Eumycotina (veja, Alexopoulos, C. J. (1962), INTRODUCTORY MYCOLOGY, Wiley, New York). Esses fungos se caracterizam por um micé- Iio vegetativo com uma parede celular composta de quitina, celulose e outros polissacarídeos complexos. Os fungos filamentosos da presente invenção 30 são morfológica, fisiológica e geneticamente distintos de leveduras. A células de origem fúngica filamentosa pode ser uma célula incluindo, mas não limi- tada a, Trichoderma sp. (por exemplo, Trichoderma reesei, a forma assexu- ada de Hypocrea jecorina, anteriormente classificada como T. Iongibrachia- tum, Trichoderma viride, Trichoderma koningii, Trichoderma harzianum); Pnicillium sp., Humicola sp. (por exemplo, H. insolens, H. Ianuginosa e H. grisea); Chrysosporium sp. (por exemplo, C. lucknowense), Gliocladium sp., 5 Aspergillus sp. (por exemplo, A. oryzae, A. niger, A. sojae, A. japonicus, A. nidulans e A. awamori), Fusarium sp. (por exemplo, F. roseum, F. graminum, F. cerealis, F. oxysporium e F. venenatum), Neurospora sp. (N. crassa), Hy- pocrea sp., Mucor sp. (M. miehei), Rhizopus sp. e Emericella sp. (vide tam- bém Innis et al., (1985) Sei. 228: 21-26). Cepas de Aspergillus utilizáveis pa- 10 ra expressão das fitases (e/ou alfa amilases) da invenção são apresentadas, por exemplo, em Ward et al. (1993) Appl. Microbiol. Biotechnol. 39: 738-743 e Goedegebuur et al., (2002) Curr. Gene 41: 89-98. Em algumas modalida- des, o hospedeiro é uma cepa de Trichoderma e, particularmente, uma cepa de T. reesei. Cepas de T. reesei são conhecidas e exemplos não-limitativos 15 incluem, por exemplo, ATCC n° 13631, ATCC n° 26921, ATCC n° 56764, ATCC n° 56765, ATCC n° 56767 e NRRL 15709. Em algumas modalidades, a cepa hospedeira é um derivado de RL-P37. RL-P37 é apresentada em Sheir-Neiss etal. (1984) Appl. Microbiol. Biotechnology 20: 46-53.

Em algumas modalidades, as células hospedeiras erão células 20 bacterianas gram-positivas. Exemplos não-limitativos incluem cepas de S- treptomyces (por exemplo, S. lividans, S. coelicolor e S. griseus) e Bacillus. Conforme aqui usado, "o gênero Bacillus" inclui todas as espécies dentro do gênero "Bacillus", conforme é sabido por aqueles versados na técnica, inclu- indo, mas não limitados a, B. subtilis, B. licheniformis, B. lentus, B. brevis, B. 25 stearothermophilus, B. alkalophilus, B. amyloliquefaciens, B. clausii, B. halodu- rans, B. megaterium, B. coagulans, B. eirculans, B. Iautus e B. thuringiensis.

Em algumas modalidades, a célula hospedeira é uma cepa bac- teriana gram-negativa, como E. coli ou Pseudomonas sp.

Em outras modalidades, as células hospedeiras podem ser célu- Ias de levedura, como Saccharomyces, Schizosaccharomyces sp., Pichia sp. ou Candida sp.

Em algumas modalidades, a cepa hospedeira pode ter sido pre- viamente manipulada mediante engenharia genética. Em algumas modalida- des, vários genes nativos da célula hospedeira fúngica terão sido inativados. Esses genes incluem, por exemplo, genes que codificam enzimas celulolíti- cas, como endoglucanases (EG) e exocelobioidrolases (CBH) (por exemplo, 5 cbhl, cbh2, egl1, egl2 e egl3). Por exemplo, a patente norte-americana n° 5.650.322 apresenta cepas derivativas de RL-P37 com deleções no gene cbhl e no gene cbh2 (vide, por exemplo, a patente norte-americana n° 5.847.276 e WO 05/001036).

Em outras modalidades, a célula hospedeira pode ser uma célu- 10 Ia vegetal, e a invenção é aplicável tanto a plantas dicotiledôneas (por e- xemplo, tomate, batata, soja, algodão e tabaco), quanto a plantas monocoti- ledôneas, incluindo, mas não limitadas a, monocotiledôneas gramináceas, como trigo (Triticum spp.), arroz (Oryza spp.), cevada (Hordeum spp.), aveia (Avena spp.), centeio (Secale spp.), milho (Zea mays), sorgo (Sorghum spp.) 15 e painço (Pennisetum spp.).

Vetores

Vetores utilizáveis incluindo construtos de DNA que compreen- dam um polinucleotídeo que codifique uma fitase da invenção e métodos de transformação de células hospedeiras são bem-conhecidos na técnica, e se podem usar técnicas e metodologia padronizadas.

De acordo com a invenção, um construto de DNA compreen- dendo ácido nucleico que codifique uma fitase variante englobada pela in- venção é construído para transferir e/ou expressar a variante em uma célula hospedeira. Em uma modalidade, o construto de DNA é transferido para 25 uma célula hospedeira por um vetor de expressão que compreende seqüên- cias regulatórias (por exemplo, promotores, sítios de ligação a ribossomo, seqüências de início e de parada de tradução, seqüências de início e de pa- rada de tradução, intensificadores, seqüências ativadoras, seqüências de expressão específica para células, seqüências de sinal e/ou terminadores) 30 operacionalmente ligadas à seqüência codificadora da fitase variante.

Um vetor de expressão compreendendo um construto de DNA com um polinucleotídeo que codifique uma fitase variante pode ser qualquer vetor que seja capaz de replicação autônoma em um dado organismo hos- pedeiro fúngico ou de integração no DNA do hospedeiro. Em algumas moda- lidades, o vetor de expressão é um plasmídio ou um bacteriófago. Em algu- mas modalidades, o vetor de expressão é pré-montado e contém seqüências 5 requeridas para transcrição de alto nível e um marcador selecionável. Em algumas modalidades, a região codificadora do gene de fitase variante ou de parte dele é inserida nesse vetor de expressão de finalidades gerais, de mo- do que esteja sob o controle transcricional das seqüências promotoras e terminadoras do construto de expressão. Em algumas modalidades, genes 10 ou partes deles são inseridos a jusante do promotor de cbhl forte.

Resumidamente, com relação à produção de uma fitase em cé- lulas hospedeiras fúngicas, faz-se referência a Sambrook et al., (1989) su- pra, Ausubel (1987) supra, van den Hondel et al. (1991) em Bennett e Lasu- re (Eds.) MORE GENE MANIPULATIONS IN FUNGI, Academic Press 15 (1991) pp. 70 - 76 e 396 - 428; Nunberg et al., (1984) Mol. Cell Biol. 4: 2306-2315; Boel et al., (1984) EMBO J. 3: 1581-1585; Finkelstein em BIO- TECHNOLOGY OF FILAMENTOUS FUNGI, Finkelstein et al. Eds., Butter- worth-Heinemann, Boston, MA (1992), Cap. 6; Kinghorn et al. (1992) APPLI- ED MOLECULAR GENETICS OF FILAMENTOUS FUNGI, Blackie Academic 20 and Professional, Chapman e Hall, Londres; Kelley et al., (1985) EMBO J. 4: 475-479; Penttila et al., (1987) Gene 61: 155-164; e patente norte-americana n° 5.874.276. Uma lista de vetores adequados pode ser encontrada no Catálogo de Cepas do Centro de Estoque Genético de Fungos (FGSC, www em fgsc.net). Vetores adequados incluem aqueles obtidos, por exemplo, na Invitrogen Life 25 Technologies e Promega. Vetores específicos adequados para uso em célu- las hospedeiras fúngicas incluem vetores como pFB6, pBR322, pUC18, pUCIOO, pDON®201, pDONR®221, pENTR®, pGEM®3Z e pGEM®4Z.

Em algumas modalidades, o vetor pode ser qualquer vetor que, quando introduzido em uma célula hospedeira fúngica, seja integrado no genoma da célula e seja replicado. Alguns exemplos não-limitativos desses vetores são apresentados no Catálogo de Cepas do Centro de Estoque Ge- nético de Fungos (FGSC, <www.fgsc.net>). Exemplos adicionais de vetores de expressão e/ou integração adequados são apresentados em Sambrook et al., (1989) supra, Ausubel (1987) supra, van den Hondel et al. (1991) em Bennett e Lasure (Eds.) MORE GENE MANIPULATIONS IN FUNGI, Aca- demic Press (1991) pp. 70 - 76 e 396 - 428, e na patente norte-americana 5 n° 5.874.276. Vetores particularmente úteis incluem pTREX, pFB6, pBR322, pUC18, pUCIOO e pENTR/D. Plasmídios adequados para uso em células bacterianas incluem pBR322 e pUC19, que permitem a replicação em E. coli, e pE194, por exemplo, que permite a replicação em Bacillus.

Em algumas modalidades, ácidos nucleicos que codifiquem a 10 fitase variante englobada pela invenção são operacionalmente ligados a um promotor adequado, que mostre atividade transcricional na célula hospedei- ra. Em geral, a expressão da fitase variante é realizada sob qualquer promo- tor adequado conhecido ou que venha a ser descoberto na técnica. Em al- gumas modalidades, a fitase variante é expressada sob um promotor nativo 15 do hospedeiro. Em algumas modalidades, a variante de fitase é expressada sob um promotor heterólogo que seja ativo na célula hospedeira. Por exem- plo, se for usada uma célula de Trichoderma como a célula hospedeira, o promotor é, de preferência, ativo em uma célula hospedeira de Trichoderma.

Em algumas modalidades, o promotor é um promotor constituti- vo ou induzível. Um "promotor constitutivo" é um promotor que seja ativo sob a maioria das condições ambientais e de desenvolvimento. Um promotor "induzível" ou "reprimível" é um promotor que seja ativo sob regulação ambi- ental ou de desenvolvimento. Em algumas modalidades, os promotores são induzíveis ou reprimíveis devido a alterações em fatores ambientais, incluin- do, mas não limitados a, disponibilidade de carbono, nitrogênio ou outro nu- triente, temperatura, pH, omolaridade, presença de metal(ais) pesado(s), concentração de inibidor(es), estresse ou uma combinação dos precedentes, conforme se sabe na técnica. Em algumas modalidades, os promotores in- duzíveis ou reprimíveis são induzíveis ou reprimíveis por fatores metabóli- cos, como o nível de certas fontes de carbono, o nível de certas fontes de energia, o nível de certos catabólitos, ou uma combinação dos precedentes, conforme se sabe na técnica. Em uma modalidade, o promotor é um que seja nativo da célula hospedeira. Por exemplo, quando T. reesei ê o hospe- deiro, o promotor é um promotor nativo de T. reesei, como o promotor cbhl, que está depositado no GenBank sob o Número de Acesso D86235.

Exemplos não-limitativos adequados de promotores incluem c- bh1, cbh2, egl1, egl2, egl3, egl4, egl5, xynl e xyn2, promotor do gene da fosfatase ácida (phoA) reprimível de P. chrysogenus (veja, por exemplo, Graessle et al., (1997) Appl. Environ. Microbiol., 63: 753-756), promotor PCK1 reprimível por glicose (veja, por exemplo, Leuker et al., (1997), Gene, 192: 235-240), promotor MET3 induzível por maltose, reprimível por glicose (veja Liu et al., (2006), Eukary. Cell, 5: 638-649), promotor pKi e promotor cpcl. Outros exemplos de promotores utilizáveis incluem promotores de ge- nes da glucoamilase de A. awamori e A. niger (veja, por exemplo, Nunberg et al., (1984) Mol. Cell Biol. 4: 2306-2315, e Boel et al., (1984) EMBO J. 3: 1581-1585). Da mesma forma, podem ser utilizados os promotores do gene xln1 de T. reesei (veja, por exemplo, EPA 137280A1).

Em algumas modalidades, o promotor é um promotor sensível à temperatura. De preferência, a atividade do promotor sensível à temperatura é reprimida por temperatura elevada. Em algumas modalidades, o promotor é um promotor reprimido por catabólito ou um promotor reprimido por altera- 20 ções na osmolaridade. Em algumas modalidades, o promotor é induzível ou reprimível pelos níveis de polissacarídeos, dissacarídeos ou monossacarí- deos presentes no meio de cultura.

Em algumas modalidades, a seqüência codificadora da fitase variante está operacionalmente ligada a uma seqüência de sinal. A sequên- 25 cia de sinal não é crítica para a invenção, mas pode ser qualquer seqüência de sinal que seja ativa como uma seqüência de sinal na célula hospedeira. O DNA que codifica a seqüência de sinal pode ser o que está naturalmente associado à célula hospedeira, promotor ou fitase. Em algumas modalida- des, a seqüência de sinal está naturalmente associada ao gene da fitase 30 variante a ser expressado. Em modalidades adicionais, uma seqüência de sinal e uma seqüência de promotor que compõem um construto de DNA ou vetor a ser introduzido em uma célula hospedeira fúngica são derivadas da mesma fonte. Por exemplo, em algumas modalidades, a seqüência de sinal é a seqüência de sinal cbhl que está operacionalmente ligada a um promo- tor cbhl.

Em algumas modalidades, o vetor de expressão também inclui 5 uma seqüência de término de transcrição a jusante do gene estrutural, para proporcionar uma terminação eficiente. Em algumas modalidades, a se- qüência de término e a seqüência de promotor são derivadas da mesma fon- te. Em outras modalidades, a seqüência de término é homóloga à célula hospedeira. Uma seqüência de término particularmente adequada é a cbhl, 10 derivada de uma cepa de Trichoderma e, particularmente, de T. reesei. Ou- tros terminadores fúngicos utilizáveis incluem o terminador do gene de glu- coamilase de A. niger ou A. awamori (veja, por exemplo, Nunberg et al. (1984) supra, e Boel et ai, (1984) supra).

Em algumas modalidades, o vetor de expressão inclui um mar- 15 cador selecionável. Exemplos de marcadores selecionáveis preferidos inclu- em aqueles que conferem resistência antimicrobiana (por exemplo, higromi- cina e fleomicina). Marcadores seletivos nutricionais também encontram uso na presente invenção, incluindo aqueles marcadores conhecidos na técnica como amdS, argB e pyr4. Marcadores utilizáveis em sistemas de vetor para 20 transformação de Trichoderma são conhecidos na técnica (veja, por exem- plo, Finkelstein, capítulo 6 em BIOTECHNOLOGY OF FILAMENTOUS FUNGI, Finkelstein et al. Eds. Butterworth-Heinemann, Boston, MA (1992), Cap. 6; e Kinghorn et ai (1992) APPLIED MOLECULAR GENETICS OF FI- LAMENTOUS FUNGI, Blackie Academic and Professional, Chapman e Hall, 25 Londres). Em algumas modalidades, o marcador seletivo é o gene amdS, que codifica a enzima acetamidase, permitindo que céulas transformadas cresçam com acetamida como fonte de nitrogênio. O uso do gene amdS de A. nidulans como um marcador seletivo é descrito, por exemplo, em Kelley et al., (1985) EMBO J. 4: 475-479, e Penttila et ai, (1987) Gene 61: 155-164.

Métodos usados para ligar o construto de DNA compreendendo

um polinucleotídeo que codifique uma variante de fitase, um promotor, um terminador e outras seqüências e para inseri-las em um vetor adequado são bem-conhecidos na técnica. A ligação em geral é realizada por ligação em sítios de restrição convenientes. Se esses sítios não existirem, elos oligonu- cleotídicos sintéticos são usados de acordo com a prática convencional (ve- ja, por exemplo, Sambrook (1989) supra, e Bennett e Lasure, MORE GENE 5 MANIPULATIONS IN FUNGI, Academic Press (1991) pp. 70 - 76). Além disso, os vetores podem ser construídos usando-se técnicas de recombinação conhecidas (por exemplo, Invitrogen LifeTechnoIogies, GatewayTecnoIogy). Transformação, expressão e cultura de células hospedeiras

A introdução de um construto de DNA ou vetor em uma célula 10 hospedeira inclui técnicas como transformação, eletroporação, microinjeção nuclear, transdução, transfecção (por exemplo, transfecção mediada por Ii- pofecção e mediada por DEAE-Dextrina), incubação com precipitado de DNA por fosfato de cálcio, bombardeamento de alta velocidade com micro- projéteis revestidos com DNA e fusão de protoplastos.

Métodos de transformação para Aspergillus e Trichoderma são

descritos, por exemplo, em Yelton et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 81: 1470-1474; Berka et al., (1991) em Applications of Enzyme Biotechno- Iogy1 Eds. Kelly e Baldwin, Plenum Press (NY); Cao et al., (2000) Sei. 9: 991- 1001; Campbell et al., (1989) Curr. Genet. 16: 53-56; Pentilla et al., (1987) 20 Gene 61: 155-164); de Groot et al., (1998) Nat. Biotechnol. 16: 839-842; pa- tentes norte-americanas n° 6.022.725 e 6.268.328 e patente europeia 238.023. A expressão de proteína heteróloga em Trichoderma é descrita nas patentes norte-americanas n° 6.022.725 e 6.268.328; Harkki et al. (1991); Enzyme Microb. Technol. 13: 227-233; Harkki et al., (1989) Bio Technol. 7: 25 596-603; patentes europeias 244.234 e 215.594; e Nevalainen et al., "The Molecular Biology of Trichoderma and its Application to the Expression of Both Homologous and Heterologous Genes", em MOLECULAR INDUSTRI- AL MYCOLOGY, Eds. Leong e Berka, Marcel Dekker Inc., NY (1992) pp. 129-148). Faz-se referência também ao WO 96/00787 e a Bajar et ai, (1991) 30 Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88: 8202-28212 para a transformação de cepas de Fusarium.

Também são conhecidos métodos para a preparação de cons- trutos de DNA utilizáveis na transformação de plantas e métodos para a transformação de plantas. Alguns desses métodos incluem transferência de gene mediada por Agrobacterium tumefaciens, bombardeamento com mi- croprojéteis, transformação de protoplastos mediada por PEG1 eletroporação 5 e similares. Faz-se referência, por exemplo, às patentes norte-americanas n° 5.780.708, 6.803.499 e 6.777.589, Fromm et al. (1990) Biotechnol. 8: 833- 839, Potrykus et al. (1985) Mol. Gen. Genet. 199: 169-177, Brisson et al., (1984) Nature 310: 511-514, Takamatsu et al., (1987) EMBO J. 6: 307-311, Coruzzi et al., (1984) EMBO J. 3: 1671-1680, Broglie et al (1984) Science 10 224: 838-843, Winter J e Sinibaldi RM (1991) Results Probl Cell Differ 17: 85-105, Hobbs S ou Murry LE (1992) em McGraw Hill Yearbook of Science and Technology, McGraw Hill, New York, NY, pp. 191-196, e Weissbach e Weissbach (1988) Methods for Plant Molecular Biology, Academic Press, New York, NY1 pp. 421-463. As células transformadas podem ser cultivadas 15 usando-se técnicas padronizadas, sob condições adequadas, em fermenta- ções de pequena escala ou grandes escala por cultivo em frasco de agitação (incluindo fermentações contínuas, por bateladas e por bateladas com ali- mentação), em fermentadores laboratoriais ou industriais, com meio ade- quado contendo sais fisiológicos e nutrientes (veja, por exemplo, Pourquie, 20 J. et al., BIOCHEMISTRY AND GENETICS OF CELLULOSE DEGRADATION, eds. Aubert, J. P. et al., Academic Press, pp. 71-86, 1988, e llmen, M. et al., (1997) Appl. Environ. Microbiol. 63: 1298-1306). Meios comercialmente pre- parados comuns (por exemplo, caldo de Extrato de Levedura Malte (YM), caldo de Luria Bertani (LB) e caldo de Sabouraud Dextrose (SD)) encontram 25 uso na presente invenção. Condições de cultura preferidas para células fún- gicas filamentosas são conhecidas na técnica e podem ser encontradas na literatura científica e/ou na fonte dos fungos, como a Coleção Americana de Cultura de Tipo (ATCC) e Centro de Estoque Genético de Fungos.

Em algumas modalidades, constroem-se transformantes geneti- camente estáveis com sistemas de vetor em que o ácido nucleico que codifi- ca uma variante de fitase esteja integrado de maneira estável em um cro- mossomo da célula hospedeira. Os transformantes são, então, purificados por técnicas conhecidas.

Em um exemplo não-limitativo, transformantes estáveis incluindo um marcador amdS são distinguidos de transformantes instáveis por sua taxa de crescimento mais rápida e pela formação de colônias circulares com 5 um contorno liso, em vez de serrilhado, em meio de cultura sólido contendo acetamida. Além disso, em alguns casos, conduz-se um teste de estabilida- de adicional por cultivo dos transformantes em meio não-seletivo sólido (isto é, medio desprovido de acetamida), colheita de esporos desse meio de cul- tura e determinação da porcentagem desses esporos que subsequentemen- 10 te germinam e crescem em meio seletivo contendo acetamida. Alternativa- mente, outros métodos conhecidos na técnica podem ser usados para sele- cionar transformantes.

Em uma modalidade específica, a preparação de Trichoderma sp. para transformação envolve a preparação de protoplastos a partir de mi- 15 célios fúngicos (veja Campbell et al., (1989) Curr. Genet. 16: 53-56). Em al- gumas modalidades, os micélios são obtidos de esporos vegetativos germi- nados. Os micélios são tratados com uma enzima que digere a parede celu- lar, resultando em protoplastos. Os protoplastos são, então, protegidos pela presença de um estabilizador osmótico no meio de suspensão. Esses estabi- 20 Iizadores incluem sorbitol, manitol, cloreto de potássio, sulfato de magnésio e similares. Normalmente, a concentração desses estabilizadores varia entre 0,8 M e 1,2 M. É preferível usar uma solução de sorbitol a cerca de 1,2 M no meio de suspensão.

Depois de ter sido estabelecido o crescimento fúngico, as célu- 25 Ias transformadas são expostas a condições eficazes para causar ou permitir a expressão de variantes de fitase conforme aqui definidas. Em casos em que a seqüência codificadora de variante de fitase está sob o controle de um promotor induzível, o agente indutor (por exemplo, um açúcar, sal metálico ou antimicrobiano) é adicionado ao meio a uma concentração eficaz para 30 induzir a expressão. Ensaios para expressão/atividade de fitase

Para se avaliar a expressão de variantes de fitase com atividade de fitase por uma linhagem celular que tenha sido transformada com um po- linucleotídeo heterólogo que codifique uma variante de fitase com atividade 5 de fitase englobada pela invenção, podem-se realizar ensaios no nível de proteínas, no nível de RNA ou com o uso de bioensaios funcionais particula- res para atividade e/ou produção de fitase. Em geral, os ensaios emprega- dos incluem Northern blotting, dot blotting (análise de DNA ou RNA), RT- PCR (reação em cadeia de polimerase com transcriptase reversa) ou hibridi- 10 zação in situ usando uma sonda apropriadamente marcada (com base na seqüência codificadora do ácido nucleico) e Southern blotting convencional e autorradiografia.

Além disso, a produção e/ou expressão de uma variante de fitase com atividade de fitase pode ser medida em uma amostra diretamente, por e- 15 xemplo, por ensaios que meçam diretamente a atividade de fitase (FTU) pela liberação de fosfato inorgânico. O fosfato inorgânico forma um complexo amarelo com reagente de molibdato/vanadato ácido, e o complexo amarelo foi medido a um comprimento de onda de 415 nm em um espectrofotômetro, e a libera- ção de fosfato inorgânico foi quantificada com uma curva-padrão de fosfato. 20 Uma unidade de fitase (FTU) é a quantidade de enzima que libera 1 micro- mol de fosfato inorgânico de fitato por minuto sob as condições de reação dadas no Padrão Europeu (CEN/TC 327,2005-TC327WI 003270XX).

Além disso, a expressão do gene pode ser avaliada por métodos imunológicos, como coloeração imuno-histoquímica de células, seções de 25 tecidos ou imunoensaio de meio de cultura de tecido, por exemplo, por Wes- tern blot ou ELISA. Esses imunoensaios podem ser usados para avaliar qua- litativa e quantitativamente a expressão de uma fitase. Os detalhes desses métodos são conhecidos por aqueles versados na técnica, e muitos reagen- tes para a prática desses métodos são comercialmente disponíveis.

Ensaios para atividade de fitase são bem-conhecidos na técnica,

e um exemplo é um ensaio clássico de liberação de fosfato inorgânico de- senvolvido por Fiske e SubbaRow, Journal of Biological Chemistry 66: 375- 392 (1925). Uma variação desse método é encontrada em Mitchell et al., Microbiol. 143: 245-252 (1997). Um método alternativo é descrito em FOOD CHEMICALS CODEX1 4a Edição, Comitê do Código de Substâncias Quími- cas de Alimentos, Instituto de Medicina, National Academy Press, Washing- 5 ton, DC, 1996, nas páginas 809-810. Cada uma dessas referências é aqui incorporada. Em inúmeros desses ensaios, realiza-se, então, uma colorime- tria usando-se um espectrofotômetro, com comparação a controles de con- centração conhecida de fosfato inorgânico (P,) e/ou controles produzidos por reações com enzimas com atividade de fitase conhecida. Uma Unidade de 10 atividade é determinada como a quantidade de amostra de enzima requerida para liberar 1 pmol de Pj por minuto do fitato, sob condições de reação defi- nidas. Também se faz referência às patentes norte-americanas n° 6.221.644 e 6.139.902.

Em algumas modalidades da invenção, as variantes de fitase com atividade de fitase expressadas por um hospedeiro Trichoderma ou As- pergillus serão de mais de 1 grama de proteína por litro (g/L), mais de 2 g/L, mais de 5 g/L, mais de 10 g/L, mais de 20 g/L, mais de 25 g/L, mais de 30 g/L, mais de 50 e também mais de 100 g/L de meio de cultura.

Recuperação da proteína Os polipeptídios produzidos por expressão das seqüências de

ácidos nucleicos desta invenção podem ser recuperadas ou isoladas da fer- mentação de culturas celulares e substancialmente purificadas de várias maneiras, de acordo com técnicas bem estabelecidas na técnica. Aqueles versados na técnica são capazes de selecionar as técnicas de isolamento e 25 purificação mais apropriadas. A fitase da invenção pode ser recuperada do meio de cultura ou de Iisados de células hospedeiras. Se ligada a membra- na, pode ser liberada da membrana usando-se uma solução detergente a- dequada (por exemplo, Triton-X 100) ou por clivagem enzimática. As células empregadas na expressão da fitase podem ser rompidas por vários meios 30 físicos ou químicos, como ciclos de congelamento-descongelamento, soni- cação, ruptura mecânica ou agentes de Iise celular. Pode ser desejável puri- ficar a fitase das proteínas ou polipeptídios da célula recombinante. Os se- guintes procedimentos são exemplificativos de procedimentos de purificação adequados: por fracionamento em uma coluna de troca de íons; precipitação em etanol; HPLC de fase reversa; cromatografia em sílica ou em uma resina de troca de cátions, como DEAE; cromatofocalização; SDS-PAGE; precipita- 5 ção com sulfato de amônio; filtração em gel usando, por exemplo, Sephadex G-75; colunas de proteína A Sepharose para remover contaminantes; e co- lunas de quelação de metais para se ligarem a formas marcadas no epítopo da fitase. Vários métodos de purificação de proteínas podem ser emprega- dos, e esses métodos são conhecidos na técnica e descritos, por exemplo, 10 em Deutscher, METHODS IN ENZYMOLOGY, 182 (1990); Scopes, PROTE- IN PURIFICATION: PRINCIPLES AND PRACTICE, Springer-Verlag, New York (1982). A(s) etapa(s) de purificação selecionada(s) dependerá(ão), por exemplo, da natureza do processo de produção usado e da forma particular da fitase produzida.

Em geral, uma variante de fitase (incluindo fitase de n-

Buttiauxella ou fitase de r-Buttiauxella) produzida em cultura celular é secre- tada no meio e pode ser purificada ou isolada, por exemplo, por remoção de componentes indesejáveis do meio de cultura celular. Em alguns casos, a variante de fitase pode ser produzida em uma forma celular que necessite de 20 recuperação de um Iisado celular. Nesses casos, a enzima é purificada das células nas quais foi produzida usando-se técnicas rotineiramente emprega- das por aqueles versados na técnica. Exemplos incluem, mas não se limitam a, cromatografia de afinidade (veja, por exemplo, Tilbeurgh et al., (1984) FEBS Lett. 16: 215); métodos cromatográficos de troca de íons (veja, por 25 exemplo, Goyal et al., (1991) Biores. Technol. 36: 37; Fliess et al., (1983) Eur. J. Appl. Microbiol. Biotechnol. 17: 314; Bhikhabhai et al. (1984) J. Appl. Biochem. 6: 336; e Ellouz et al., (1987) Chromatography 396: 307), incluindo a troca de íons usando materiais com alto poder de resolução (veja, por e- xemplo, Medve et al., (1998) J. Chromatography A 808: 153); cromatografia 30 de interação hidrofóbica (veja, por exemplo, Tomaz e Queiroz, (1999) J. C- hromatography A 865: 123); partição em duas fases (veja, por exemplo, Brumbauer et al., (1999) Bioseparation 7: 287); precipitação com etanol; H- PLC de fase reversa; cromatografia em sílica ou em uma resina de troca de íons como DEAE; cromatofocalização; SDS-PAGE; precipitação com sulfato de amônio; e/ou filtração em gel usando, por exemplo, Sephadex G-75. Fermentações

5 Em algumas modalidades da presente invenção, células fúngi-

cas que expressam variantes de fitase heterólogas são cultivadas sob condi- ções de fermentação por bateladas ou contínua. Uma fermentação por bate- ladas clássica é um sistema fechado, em que a composição do meio é esta- belecida no início da fermentação e não é submetida a alterações artificiais 10 durante a fermentação. Assim, no início da fermentação, o meio é inoculado com o(s) organismo(s) desejado(s). Nesse método, permite-se que a fer- mentação ocorra sem a adição de qualquer componente ao sistema. Tipica- mente, uma fermentação por bateladas se qualifica como uma "batelada" com relação à adição da fonte de carbono, e frequentemente se fazem tenta- 15 tivas de controlar fatores como pH e concentração de oxigênio. As composi- ções de metabólitos e de biomassa do sistema de batelada mudam constan- temente até o momento em que se pára a fermentação. Em culturas por ba- teladas, as células progridem de uma fase de retardamento estática para uma fase de alto crescimento logarítmico e, finalmente, para uma fase esta- 20 cionária, em que a taxa de crescimento é diminuída ou interrompida. Se não tratadas, as células na fase estacionária finalmente morrem. Em geral, as células na fase logarítmica são responsáveis pela maior parte da produção do produto final.

Uma variação do sistema de bateladas-padrão é o sistema de 25 "fermentação por bateladas com alimentação", que também encontra uso na presente invenção. Nessa variação de um sistema de bateladas típico, o substrato é adicionado em incrementos com o progredir da fermentação. Sistemas de bateladas com alimentação são úteis quando a repressão de catabólitos é capaz de inibir o metabolismo das células e quando é desejável 30 ter quantidades limitadas de substrato no meio. A medição da concentração real de substrato em sistemas de bateladas com alimentação é difícil e, por- tanto, é estimada com base em alterações de fatores mensuráveis, como pH, oxigênio dissolvido e pressão parcial de gases expelidos, como CO2. As fermentações por bateladas e por bateladas com alimentação são comuns e bem-conhecidas na técnica.

A fermentação contínua é um sistema aberto ao qual um meio 5 de fermentação definido é adicionado continuamente a um biorreator, e uma quantidade igual de meio condicionado é removida simultaneamente para processamento. A fermentação contínua em geral mantém as culturas a uma alta densidade constante, em que as células estão principalmente no cres- cimento de fase logarítmica.

A fermentação contínua permite a modulação de um fator ou

qualquer número de fatores que afetem o crescimento celular e/ou a concen- tração de produto final. Por exemplo, em uma modalidade, um nutriente Iimi- tativo, como a fonte de carbono ou a fonte de nitrogênio, é mantido a uma taxa fixa, e todos os outros parâmetros são deixados moderar. Em outros 15 sistemas, inúmeros fatores que afetem o crescimento podem ser alterados continuamente, ao passo que a concentração celular, medida pela turvação do meio, é mantida constante. Sistemas contínuos procuram manter condi- ções de crescimento em estado constante. Assim, a perda de células devida à remoção do meio tem de ser equilibrada contra a taxa de crescimento ce- 20 Iular na fermentação. Métodos de modulação dos nutrientes e de fatores de crescimento para processos de fermentação contínua, assim como técnicas para maximizar a taxa de formação de produto são bem-conhecidos na téc- nica da microbiologia industrial.

Aplicações e métodos de uso Em uma modalidade da invenção, apresenta-se uma composi-

ção de enzima compreendendo pelo menos uma fitase de acordo com a in- venção. Composições de acordo com a invenção podem ser preparadas de acordo com métodos conhecidos na técnica e podem estar na forma de uma composição líquida ou seca.

Composições líquidas não precisam conter nada além da enzi-

ma fitase, que pode ser uma forma substancialmente purificada ou não- purificada, de preferência em uma forma substancialmente purificada. Nor- malmente, entretanto, também se adiciona um estabilizador, como glicerol, sorbitol ou monopropilenoglicol. A composição líquida também pode com- preender um ou mais outros aditivos, como sais, açúcares, conservantes, agentes de ajuste de pH (isto é, agentes de tamponamento), proteínas ou 5 fitato (um substrato da fitase). Composições líquidas típicas são suspensões aquosas ou à base de óleo.

Composições secas podem ser composições secadas por pulve- rização, caso em que a composição não precisa conter nada além da enzi- ma em uma forma seca. Normalmente, entretanto, as composições secas 10 são chamadas de granulados, que podem ser prontamente misturados com, por exemplo, componentes de alimentos ou de rações ou, mais preferivel- mente, formar um componente de uma pré-mistura. O tamanho de patícula dos granulados de enzima é, de preferência, compatível com o dos outros componentes da mistura.

Em algumas modalidades, uma composição de enzima incluindo

uma fitase variante englobada pela invenção será opcionalmente usada em combinação com qualquer uma ou combinação das seguintes enzimas: glu- coamilases, alfa amilases, proteases, pululanases, isoamilases, celulases, hemicelulases, xilanases, ciclodextrina glicotransferases, lipases, fitases, lacases, oxidases, esterases, cutinases, outras fitases e suas combinações.

Em algumas modalidades, a composição de fitase é uma com- posição de alimento ou ração para animais. Uma composição de alimento ou ração para animais pode compreender uma fitase a uma concentração de 10 a 15.000 U/kg de ração ou alimento (por exemplo, de 100 a 5.000 U/kg, 200 25 - 2.000 U/kg e também 500 - 1.000 U/kg). A composição de fitase pode ser usada como um aditivo que seja ativo no trato digestivo de animais de cria- ção, como avez e suínos, e animais de fazendas aquáticas, incluindo peixes e camarões. A presente invenção considera um método para a produção de um alimento ou ração para animais, caracterizado pelo fato de que a fitase 30 de acordo com a invenção é misturada com o dito alimento ou ração para animais. As composições líquidas podem ser adicionadas a um alimento ou ração depois de sua peletização opcional. Em algumas modalidades, a ração para animais compreenderá um ou mais dos seguintes componentes: a) cereais, como grãos pequenos (por exemplo, trigo, cevada, centeio, aveia e suas combinações) e/ou grãos grandes, como milho ou sorgo; b) produtos de cereais, como farinha de glú- 5 ten de milho, Solúveis de Grãos Secos de Destilarias (DDGS), farelo de tri- go, trigo de qualidade inferior, aparas de trigo, farelo de arroz, cascas de arroz, cascas de aveia, palmiste e polpa de frutas cítricas; c) proteína obtida de fontes como soja, girassol, amendoim, tremoços, ervilhas, favas, algodão,

I

canola, farinha de peixe, proteína plasmática seca, farinha de carne e ossos, proteína de batata, soro de leite, copra, gergelim; d) óleos e gorduras obtidas de fontes vegetais e animais; e) minerais e vitaminas; f) suplementos, como enzimas, betaína, sabores, óleos essenciais, promotores do crescimento de antibióticos, coccidiostáticos, pró-bióticos e pré-bióticos.

Também se apresenta um método para a redução dos níveis de fósforo no esterco de animais, caracterizado pelo fato de que um animal é alimentado com uma ração para animais de acordo com a invenção, em uma quantidade eficaz para converter o fitato contido na dita ração para animais.

Além disso, as composições de fitase englobadas pela invenção podem ser usadas em um método de hidrólise de amido. A composição de fitase pode ser adicionada durante uma etapa de liquefação de amido, uma etapa de sacarificação e/ou durante uma etapa de fermentação. Usam-se alfa-amilases para degradar as ligações 1-4 do amido durante processos industriais de hidrólise de amido usando material vegetal reduzido, como grãos moídos, como matéria-prima (por exemplo, fermentação de bebidas e panificação). As amilases são requeridas para degradar o amido, e a obten- ção de uma atividade adequada dessas enzimas às vezes é problemática. Sabe-se há algum tempo que o fitato tem um efeito inibidor sobre amilases. Consequentemente, composições de enzima compreendendo uma fitase de a- cordo com a invenção podem ser usadas em processos de hidrólise de amido para reduzir o efeito inibidor do fitato sobre alfa amilase (EP 0 813607B).

Fitases, fitato e derivados de fitato de fosfato mais baixo encon- tram muitos outros usos em produtos para cuidados pessoais, produtos mé- dios e produtos alimentares e nutricionais, assim como várias aplicações industriais, particularmente nas técnicas de limpeza, têxteis, litográficas e químicas.

Os exemplos a seguir são oferecidos apenas para fins ilustrativos e 5 não se destinam a limitar o âmbito da presente invenção de forma alguma. PARTE EXPERIMENTAL Abreviações

Na exposição e seção experimental que se segue, aplicam-se as seguintes abreviações: 0C (graus centígrados); rpm (revoluções por minuto); 10 H2O (água); dH20 (água desionizada); DIH2O (água desionizada, filtração por Milli-Q); aa ou AA (aminoácido); pb (pares de bases); kb (quilopares de bases); kD (quilodaltons); g (gramas); pg (microgramas); mg (miligramas); pL (microlitros); mL (mililitros); mm (milímetros); pm (micrômetros); M (mo- lar); mM (milimolar); μΜ (micromolar); U (unidades); V (volts); PM (peso mo- 15 lecular); s (segundo/segundos); min (minuto/minutos); h (hora/horas); solu- ção AMM (H2SO4 a 7,5 N, molibdato de amônio a 15 mM e acetona (1:1:2)); ABS (absorbância); EtOH (etanol); PPS (solução salina fisiológica); m/v (massa/volume); e MTP (placa de microtitulação).

Os seguintes ensaios e métodos são usados nos exemplos a- presentados abaixo:

Os métodos usados para fornecer as variantes são descritos abaixo. Entretanto, deve-se notar que diferentes métodos podem ser usados para fornecer variantes de uma molécula de origem, e a invenção não se limita aos métodos usados nos exemplos. Pretende-se que qualquer meio 25 adequado para a preparação de variantes e seleção de variantes possa ser usado.

Buttiauxella sp. cepa P1-29 foi depositada na NCIMB sob o nú- mero de acesso 41248. O isolamento dessa cepa de material vegetal e a identificação taxonômica são descritos na WO 2006/043178 (veja os Exem- 30 pios 1 a 4). Além disso, a clonagem de DNA cromossômico, amplificação e expressão do gene de fitase de Buttiauxella sp. cepa P1-29 em E. coli tam- bém são descritas (veja os Exemplos 5 - 6). A fitase de Buttiauxella sp. cepa Ρ1-29 descrita na WO 2006/043178 também é aqui chamada de BP-WT, e se faz referência às presentes SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 2.

Ensaio de atividade enzimática de fitase

Esses ensaios foram realizados em 2 sistemas de tampão. Para pH 4,0 a 5,5, usaram-se tampões de acetato de sódio. Esses foram prepara- dos por titulação de 250 mM de acetato de sódio com HCI até o valor de pH indicado. Os tampões para pH 2,0 a 3,5 foram preparados por titulação de 250 mM de glicina com HCI até o valor de pH indicado. O ensaio a pH 4,0 foi usado como um padrão. Além do tampão, a mistura de reação continha 6 mM de fitato e 1,0 mM de CaCI2 e 0,05 mg/mL de BSA. Deixou-se que as reações se processassem durante 1 h a 37°C. A liberação de fosfato foi me- dida usando-se um ensaio de molibdato, como o exposto em Heinonen et al. (Heinonen, J. K., Lahti, R. J., Anal. Biochem. 113(2), 313-317, (1981)). Re- sumidamente, 200 μΙ_ de solução AMM recém-preparada foram adicionados a 100 pL de mistura de reação em cada poço da placa de microtitulação. A absorbância a 390 nm foi medida não antes de 10 min e não depois de 30 min após a adição do reagente AMM. A quantidade de fosfato foi determina- da por construção de uma curva de calibração com solução de fosfato de concentrações conhecidas. Os valores de absorção específica (A280) de variantes de fitase foram calculados com base na composição de aminoáci- dos da proteína usando-se o software Vector NTI (Invitrogen).

Ensaio de Atividade Específica

A atividade da fitase foi determinada em placas de microticula- ção usando-se um ensaio enzimático acoplado: as preparações de enzima 25 foram diluídas em tampão de diluição (50 mM de acetato de sódio, 0,05% de Pluronic F-68, 1 mg/mL de BSA). A 5 pL da solução enzimática, adiciona- ram-se 75 pL de mistura de ensaio de fitase (500 mM de glicina/HCI, pH 4,0, 10,67 mM de fitato, 1 mM de CaCI2, 0,05% (p/v) de Pluronic F-68). O ensaio foi incubado 1 h a 37°C. Então, 10 pL do ensaio foram misturados com 40 pL 30 da mistura de ensaio de detecção (1 M de Tris/HCI, pH 7,0, 0,01% (v/v) de Triton X-100, 25 pM de ADHP (MoBiTec, Gõttingen, Alemanha), 0,25 U/mL de maltosefosforilase, 0,3125 mM de maltose, 1,5625 U/mL de glicose oxi- dase, 0,3125 U/mL de peroxidase de rábano, 1 mM de EDTA, 0,35 mg/mL de BSA) e incubados 1 h a 37°C. A reação foi interrompida pela adição de 30 pL de catalase a 2.700 U/mL em H2O. A fluorescência a 595 nm foi, en- tão, medida usando-se 535 nm como comprimento de onda de excitação. A 5 quantidade de fosfato foi determinada usando-se uma curva de calibração com soluções de fosfato de concentrações conhecidas.

A determinação da proteína foi feita por medição da absorção a A280nm. Os valores de absorção específica (A280) de variantes de fitase foram calculados com base nas composições de aminoácidos da proteína usando-se o método de Gill e von Hippel (Anal. Biochem. 182: 319-326 (1989)).

Termoestabilidade

A termoestabilidade de variantes foi caracterizada pela tempera- tura de inativação da enzima. A temperatura de inativação foi determinada 15 por medição da atividade residual da enzima fitase após incubação durante 10 min a diferentes temperaturas e subsequente resfriamento à temperatura ambiente. A temperatura de inativação é a temperatura em que a atividade residual é de 50% em comparação à atividade residual após incubação pela mesma duração sob as mesmas condições à temperatura ambiente. Para se 20 determinar a temperatura correspondente a 50% de atividade residual, foram computadas interpolações e extrapolações a partir dos dados de atividade medidos, quando apropriado. As diferenças de termoestabilidade em 0C fo- ram calculadas por subtração das temperaturas de inativação de duas enzi- mas entre si.

Purificação dos mutantes BP-11

A purificação foi realizada por cultivo de Bacillus subtilis, trans- formado com um plasmídio que codifica BP-11, em frascos de agitação a 37°C e 160 rpm, usando-se meio LB padrão com a adição de 20 mg/L de neomicina. Nesse estágio, o meio de cultura acumulava uma quantidade 30 significativa de atividade de fitase. Cerca de 2 L do caldo de cultura foram ajustados a pH 8,0, filtrados e aplicados a uma coluna cheia com 10 mL de resina Ni-NTA Sepharose (Qiagen). A coluna foi lavada com 50 mM de tam- pão Tris-HCI, 300 mM de NaCI, pH 8,0, até que a OD280 caísse abaixo de 0,05. Subsequentemente, a fitase ligada foi eluída com o mesmo tampão contendo 250 mM de cloridrato de imidazol. O eluído foi dialisado contra 50 mM de tampão acetato de sódio, pH 5,0, e armazenado a 4°C. A solução de 5 enzima foi, então, aplicada a uma coluna Resource S equilibrada com 20 mM de tampão acetato de sódio, pH 5,0, e a eluição foi realizada usando-se um gradiente de sal de 0 a 1 M de NaCI por 10 volumes de coluna. Opcio- nalmente, o eluído foi dialisado contra 20 mM de tampão acetato de sódio, pH 5,0, antes de se armazenar a 4°C.

Estabilidade a pepsina

A estabilidade a pepsina dessas variantes foi caracterizada por atividades residuais medidas a pH 3,5, 37°C, após incubação com pepsina, em comparação com condições de controle (atividade residual = atividade após a incubação com pepsina/atividade após incubação sob condições de controle. A incubação com pepsina foi realizada durante 2 horas a pH 2,0,

0,25 mg/mL de pepsina, 1 mM de CaCI2 e 5 mg/mL de BSA a 37°C. As con- dições de controle foram 2 horas a pH 5,0, 1 mM de CaCI2 e 5 mg/mL de BSA a 37°C.

Nos exemplos que se seguem, os resíduos de aminoácidos na seqüência de variantes de fitase são numerados de acordo com a seqüência de BP-WT (SEQ ID NO: 1), a menos que indicado de outra forma.

Exemplo 1 - Geração e caracterização de variantes de fitase

Em geral, as variantes de fitase foram construídas por mutagê- nese da seqüência de nucleotídeos SEQ ID NO: 5 usando-se métodos de 25 mutagênese, como os métodos apresentados em Morinaga et al. (Biotechno- Iogy (1984) 2, pp. 646-649); em Nelson e Long (Analytical Biochemistry (1989), 180, pp. 147-151); ou o protocolo de Mutagênese de Limiar de Erro descrito na WO 92/18645. Outro método adequado para PCR mutagênica é apresentado por Cadwell e Joyce (PCR Methods Appl. 3 (1994), 136-140).

As variantes da enzima fitase foram caracterizadas após expressão

heteróloga em um ou mais dos seguintes hospedeiros de expressão: Escherichia coli K12; Bacillus subtilis; Saccharomyces cerevisiae. Foram derivadas variantes de fitase que diferiam em uma ou mais posições de aminoácidos da SEQ ID NO:

1, incluindo duas posições, três posições, quatro posições, cinco posições, seis posições, sete posições, oito posições, nove posições, dez posições, onze posi- ções, doze posições. Quando apropriado, realizaram-se rodadas iterativas de 5 mutagênese. Seguindo-se os protocolos descritos na WO 2006/043178, várias mutações foram observadas na BP-WT. Em particular, observou-se um mutante, A122T/D125A/T167I/F197S/T209K/A211P/K240E/A242S/S281L/Q289Y/A294E/ N303K, designado por BP-11, com maior termoestabilidade com relação a BP-WT (veja os resíduos de aminoácidos 7 -419 da SEQ ID NO: 4, que cor- 10 responde a SEQ ID NO: 6).

Exemplo 2 - Variantes de BP-11

Três estratégias diferentes foram usadas para se obterem vari- antes de BP-11, que incluíram mutagênese aleatória, mutagênese direcio- nada e mutagênese de saturação de sítio.

A. A mutagênese aleatória e a triagem de alta produção foram

realizadas de acordo com os ensinamentos descritos em WO 2006/043178 para a obtenção de mutantes de BP-WT, como BP-11.

Uma variante específica de BP-11 obtida por esse método foi designada por BP-19. BP-19 difere de BP-11 por uma substituição na posi- ção 54 (Y54H), 84 (S84G), 190 (S190G), 220 (I220V) e 289 (N289D), cor- respondendo a SEQ ID NO: 4.

Usando-se o ensaio acima descrito para medir a atividade espe- cífica, determinou-se que BP-19 tem uma atividade específica a pH 4,0 que é 26% maior que a da BP-11, e se faz referência à Tabela 3.

B. A mutagênese direcionada de três resíduos específicos foi

realizada na estrutura principal da BP-WT e na estrutura principal da BP-11, que correspondem às posições G221S, T225M e N276R da SEQ ID NO: 4. O mutante BP-15 foi obtido a partir da estrutura principal da BP-WT, e o mu- tante BP-16 foi obtido a partir da estrutura principal da BP-11. A atividade específica com relação às fitases de origem é descrita na Tabela 3.

C. Realizaram-se bibliotecas de mutagênese de saturação de sítio com base na molécula da variante BP-11 em várias posições. As posi- ções incluíram R24, R28, T31, K32, D98, R100, K137, N212, G221, T225, E228, H259, F263, M266, N276, H312, D313, T314 e D334 da SEQ ID NO: 4. As bibliotecas foram inicialmente triadas quanto a uma atividade aperfei- çoada em uma triagem de alta produção e, então, algumas variantes foram 5 triadas quanto à atividade específica, conforme acima descrito. A variante selecionada foi adicionalmente purificada a cerca de 97% de pureza e anali- sada quanto à atividade específica. Duas variantes na posição D98 fornece- ram atividade específica aperfeiçoada (D98A e D98Q). O mutante com ala (A) em invés de asp (D) (D98A) foi isolado e designado por BP-17 (veja a 10 SEQ ID NO: 3). O mutante com gin (Q) em vez de asp (D) (D98Q) foi isolado e designado por BP-20.

As variantes de BP-11, que incluem BP-16, BP-17, BP-18, BP-

19 e BP-20, foram todas testadas conforme acima descrito para a atividade de fitase.

Tabela 3

Atividade específica (U/mq, pH 4.0. 97% de pureza da enzima)

VARIANTE Atividade específica Atividade específi¬ Atividade específi¬ (U/mg) ca (% de atividade ca (% da atividade da BP-WT) de BP-11) BP-WT (P1-29) 936 100 142 BP-11 632 70 100 BP-15 790 85 121 BP-16 760 74 106 BP-17 1017 109 156 BP-18 1005 107 153 BP-19 822 88 126 BP-20 840 93 133 Exemplo 3 - Expressão de BP-17 em E. coli

A seqüência de DNA do mutante BP-17 foi modificada para ex- pressão em E. coli por inclusão de seqüências de DNA que codificam a se- quência de sinal da fitase de Buttiauxella de tipo selvagem, seguida por uma "etiqueta 6xHis" e da seqüência codificada correspondente ao mutante BP17 da fitase madura de Buttiauxella. Usando-se métodos de engenharia genéti- ca padronizados, essa seqüência de nucleotídeos foi inserida entre o promo- tor do gene dps de E. coli e o terminador de transcrição do gene tufA, tam- bém derivado de E. coli.

5 O cassete de expressão foi inserido entre os sítios de restrição

Sacl e Apal do vetor de E. coli pCR 2.1 (Invitrogen), resultando no plasmídio pCDP(SHOK). A estrutura do vetor de expressão pCDP(SHOK) é ilustrada na figura 2.

E. coli cepa XL-BIue MRF’ transformada com pCDP(SHOK) foi cultivada em frascos de agitação a 37°C e 200 rpm usando-se meio LB pa- drão com a adição de 50 mg/L de canamicina. Nesse estágio, o meio de cul- tura acumulou uma quantidade significativa de atividade de fitase, que não era detectável na cepa receptora transformada com pCR2.1 e cultivada no mesmo meio. Cerca de 2 L desse caldo de cultura foram ajustados a pH 8,0 e aplicados a uma coluna cheia com 25 mL de Ni-NTA agarose (Invitrogen). A coluna foi lavada com 20 mM de tampão Tris-HCI, pH 8,0, até que a OD2eo caísse abaixo de 0,05, seguido por eluição da fitase ligada com o mesmo tampão contendo 200 mM de cloridrato de imidazol. O eluído foi dialisado contra 20 mM de tampão acetato de sódio, pH 5,5, e armazenado a 4°C ou congelado a -20°C. Nenhuma perda de atividade foi observada com conge- lamento-descongelamento repetidos.

Os perfis de pH da BP-17 expressada em E. coli da fitase de Buttiauxella de tipo selvagem (BP-WT) foram medidos da seguinte maneira. Soluções contendo 250 mM de acetato de sódio e 7,5 mM de fitato de sódio 25 ajustadas a pH 6, 5,5, 4,5, 4,25, 4,0, 3,75, 3,5 com ácido clorídrico foram usadas para construir os perfis de pH na faixa de pH 3,5 a pH 6,0. A ativida- de das enzimas a valores de pH de 3,0 a 2,5 foi medida em soluções de substrato contendo 250 mM de glicina e 7,5 mM de fitato de sódio ajustadas ao pH indicado com ácido clorídrico. Descobriu-se (figura 3) que o perfil de 30 pH da BP-17 produzida em E. coli desviava significativamente do perfil de pH da fitase de Buttiauxella de tipo selvagem.

As enzimas (diluídas a cerca de 30 U/mL) foram tratadas com diferentes concentrações de pepsina em 0,25 M de tampão glicina-cloridrato, pH 2,0, contendo 3 mg/mL de BSA a 37°C durante 2 horas. Após a incuba- ção, a atividade restante foi ensaiada a pH 5,5. Conforme mostrado na figura 4, BP-17 é essencialmente estável à pepsina. A alta estabilidade à pepsina 5 da BP-17 está em contraste com a estabilidade muito baixa à pepsina da fitase de Buttiauxella de tipo selvagem, que é degradada de maneira essen- cialmente completa por 1 pg/mL de pepsina (figura 4).

Nos exemplos 4 a 8, fitase de Buttiauxella de tipo selvagem e variante foram expressadas diretamente ou como uma proteína de fusão em Trichoderma reesei. Em todos os casos, níveis de expressão muito fortes foram observados a mais de 10 g/L.

Exemplo 4 - Construção e expressão de fitase de Buttiauxella de tipo selva- gem em T. reesei como uma proteína de fusão sem um sítio Kex2

DNA que codifica o quadro de leitura aberta de fitase de Buttiau- 15 xella de tipo selvagem foi sintetizado pela GENEART AG (BioPark Josef- Engert-Str. 11, D-93053 Regensburg, Alemanha). Os sítios de restrição Spel e Ascl foram incluídos para fins de clonagem (veja a tabela 4, SEQ ID NO: 8). O quadro de leitura aberta da fitase (SEQ ID NO: 8) foi inserido no vetor, pTrex4, nos sítios Spel e Ascl (veja a figura 5). O construto resultante foi

biolisticamente transformado em uma cepa derivada de T. reesei usando-se o Sistema de Distribuição de Partículas Biolistic PDS-1000/He da Bio-Rad (Hercules, CA). O protocolo de transformação usado foi conforme descrito por Foreman (WO 2005/001036). Depois de se obterem transformantes es- táveis, esses transformantes foram cultivados em culturas de frasco de agi- 25 tação para análise de expressão da proteína fitase de Buttiauxella, conforme delineado por Foreman (WO 2005/001036). Os protocolos de análise de transformação e expressão da WO 2005/001036 são aqui incorporados por referência em sua inteireza. Depois de vários dias de crescimento em placas de MM acetamida, transformantes que apresentavam morfologia estável fo- 30 ram inoculados em frascos de agitação de 250 mL contendo 30 mL de meio Proflo. O meio Proflo contém 30 g/L de a-lactose, 6,5 g/L de (NH4)2SO4, 2 g/L de KH2PO4, 0,3 g/L de MgS04.7H20, 0,2 g/L de CaCI2, 1 mL/L de solu- ção de sal de elemento residual 1000X, 2 mL/L de Tween 80 a 10%, 22,5 g/L de farinha de semente de algodão Proflo (Traders Protein, Mênfis, TN) e

0,72 g/L de CaC03. Depois de dois dias de crescimento a 28°C e 225 rpm, 10% da cultura Proflo foram transferidos para um frasco de agitação de 250 mL contendo 30 mL de Meio Definido de Lactose. A composição do Meio Definido de Lactose é a seguinte: 5 g/L de (NH4)2SO4, 33 g/L de tampão PIPPS, 9 g/L de aminoácidos, 4,5 g/L de KH2PO4, 1 g/L de MgS04.7H20, 5 mL/L de antiespumante Mazu DF60-P (mazur Chemicals, Gurnee1 IL), 1 mL/L de solução de sal de elemento residual 1000X, pH 5,5. 40 mL/L de so- lução de lactose a 40% (p/v) foram adicionados ao meio após esterilização. Os frascos de agitação com Meio Definido de Lactose foram incubados a 28°C, 225 rpm, durante 2 a 3 dias. Amostras do sobrenadante da cultura foram misturadas com um volume apropriado de tampão de amostra 4X Nu- PAGE (Invitrogen Carlsbad1 CA) com agente redutor e submetidas a eletro- forese em gel de poliacrilamida (PAGE) usando-se géis pré-fundidos de Nu- PAGE a 4 a 12% e tampão de operação MOPS (Invitrogen Carlsbad1 CA). Os géis foram tingidos para detecção de protéina com Corante Simply Blue (Invitrogen Carlsbad1 CA). Uma banda de proteína com uma massa molecu- lar aparente de aproximadamente 96 kDa foi observada no gel tingido. A massa molecular esperada da proteína de fusão é de aproximadamente 96 kDa. Verificou-se que a proteína era expressada a mais de 10 g/L.

Tabela 4: Seqüência de DNA de fitase de Buttiauxella de tipo selvagem con- tendo um sítio Spel na extremidade 5’ e um sítio Ascl na extremidade 3’.

ACTAGTAACGACACCCCCGCCAGCGGCTACCAGGTCGAGAAGGTCGTCATCCTCAG

CCGCCACGGAGTCCGCGCCCCCACCAAGATGACCCAGACCATGCGCGACGTCACCC

CCAACACCTGGCCCGAGTGGCCCGTCAAGCTCGGCTACATCACCCCCCGCGGCGAG

CACCTCATCAGCCTCATGGGCGGCTTCTACCGCCAGAAGTTCCAGCAGCAGGGCAT

CCTCAGCCAGGGCTCGTGTCCCACCCCCAACAGCATCTATGTCTGGGCCGACGTCGA

CCAGCGCACCCTCAAGACCGGCGAGGCCTTCCTCGCCGGCCTCGCCCCCCAGTGCG

GCCTCACCATCCACCACCAGCAGAACCTCGAGAAGGCCGACCCCCTCTTCCACCCC

GTCAAGGCCGGCACCTGCAGCATGGACAAGACCCAGGTCCAGCAGGCCGTCGAGA

AGGAGGCCCAGACCCCCATCGACAACCTCAACCAGCACTACATCCCCTTCCTCGCC

CTCATGAACACCACCCTCAACTTCAGCACCAGCGCCTGGTGCCAGAAGCACAGCGC

CGACAAGAGCTGCGACCTCGGCCTCAGCATGCCCAGCAAGCTCAGCATCAAGGACA

ACGGC AACAAGGTCGCCCTCGACGGCGCTATCGGCCTCAGCTCCACCCTCGCCGAG ATCTTCCTCCTCGAGTACGCCCAGGGCATGCCTCAGGCTGCCTGGGGCAACATCCAC

AGCGAGCAGGAGTGGGCCAGCCTCCTCAAGCTCCACAACGTCCAGTTCGACCTCAT

GGCCCGCACCCCCTACATCGCCCGCCACAACGGCACCCCCCTCCTCCAGGCCATCA

GCAACGCCCTCAACCCCAACGCCACCGAGAGCAAGCTCCCCGACATCAGCCCCGAC

AACAAGATCCTCTTCATCGCCGGCCACGACACCAACATCGCCAACATCGCCGGCAT

GCTCAACATGCGCTGGACCCTCCCCGGCCAGCCCGACAACACCCCCCCCGGCGGCG

CTCTCGTCTTTGAGCGCCTCGCCGACAAGTCCGGC AAGCAATATGTCTCTGTCAGCA

TGGTCTACCAGACCCTCGAGCAGCTCCGCAGCCAGACCCCCCTCAGCCTCAACCAG

CCCGCCGGCAGCGTCCAGCTCAAGATCCCCGGCTGCAACGACCAGACCGCCGAGGG

CTACTGCCCCCTCAGCACCTTCACCCGCGTCGTCAGCCAGAGCGTCGAGCCCGGCTG

CCAGCTCCAGTAAGGCGCGCC (SEQ ID N0:8)

Exemplo 5 - Construção e expressão de fitase de Buttiauxella de tipo selva- gem em T. reesei como uma proteína de fusão com um sítio Kex2

O quadro de leitura aberta de fitase de Buttiauxella de tipo selvagem foi amplificado por reação em cadeia de polimerase (PCR) usando-se o DNA 5 sintetizado pela GENEART como o molde (veja a Tabela 4, SEQ ID NO: 8). A máquina de PCR usada foi uma Peltier Thermal Cycler PTC-200 (MJ Research). A DNA polimerase usada na PCR foi a HERcuIase (Stratagene). Os iniciadores usados para amplificar o quadro de leitura aberta da fitase foram o iniciador SK667 (direto)

5’ CACTACTAGTGTCGCTGTGGAGAAGCGCAACGACACCCCCGCCAG 3’ (SEQ ID NO: 9) e o iniciador SK664 5’ GAGTTCGGCGCGCCTTACTGGA 3’ (SEQ ID NO: 13). O iniciador direto continha a seqüência de aminoácidos VAVEKR (SEQ ID NO: 10) para uma clivagem eficiente pela protease Kex2, juntamente com um sítio Spel para fins de clonagem. As condições de PCR 15 para amplificação do quadro de leitura aberta da fitase de Buttiauxella de tipo selvagem foram as seguintes: Etapa 1: 94°C durante 1 min. Etapa 2: 94°C durante 30 s. Etapa 3: 58°C durante 30 s. Etapa 4: 72°C durante 1 min. As Etapas 2, 3 e 4 foram repetidas por mais 24 ciclos. Etapa 5: 72°C durante 5 min. Etapa 6: 4°C para armazenamento. O produto de PCR foi purificado 20 usando-se o Kit de Purificação em Gel Qiaquick (Qiagen) e digerido com as enzimas de restrição Spel e Ascl (Roche). O DNA digerido foi purificado u- sando-se o Kit de Purificação de PCR Qiaquick e ligado no vetor pTrex4 nos sítios Spel e Ascl (veja a figura 5). A reação de ligação foi transformada em células de E. coli quimicamente competentes TOP 10 (Invitrogen). Veja o 25 Exemplo 4 para a transformação e identificação da expressão de proteína. Uma banda de proteína com uma massa molecular aparente de aproxima- damente 96 kDa foi observada no gel tingido. A massa molecular esperada da proteína de fusão é de aproximadamente 96 kDa. A proteína foi expres- sada em mais de 10 g/L.

Exemplo 6 - Construção e expressão de fitase de Buttiauxella de tipo selva- 5 gem em T. reesei como um construto direto

O quadro de leitura aberta de fitase de Buttiauxella de tipo sel- vagem foi amplificado por reação em cadeia de polimerase (PCR) usando-se o DNA sintetizado pela GENEART como o molde (veja a Tabela 5, SEQ ID NO: 6). A máquina de PCR usada foi uma Peltier Thermal Cycler PTC-200 10 (MJ Research). A DNA polimerase usada na PCR foi a HERcuIase (Strata- gene). Os iniciadores usados para amplificar o quadro de leitura aberta da fitase foram o iniciador SK680 (direto)

5’CACCATGCAGACCTTCGGTGCTTTTCTCGTTTCCTTCCTCGCCGCCAG CGGCCTGGCCGCGGCCAACGACACCCCCGCCAGC 3’ (SEQ ID NO: 11) e o iniciador SK6 5’ CCTTACTGGAGCTGGCAG 3’ (SEQ ID NO: 12). O ini- ciador direto continha quatro nucleotídeos adicionais (seqüência - CACC) na extremidade 5’, que eram requeridos para clonagem no vetor pENTRY/D- TOPO (Invitrogen). As condições de PCR para amplificação do quadro de leitura aberta da fitase de Buttiauxella de tipo selvagem foram as seguintes: Etapa 1: 94°C durante 1 min. Etapa 2: 94°C durante 30 s. Etapa 3: 58°C du- rante 30 s. Etapa 4: 72°C durante 1 min. As Etapas 2, 3 e 4 foram repetidas por mais 24 ciclos. Etapa 5: 72°C durante 5 min. Etapa 6: 4°C para armaze- namento. O produto de PCR foi purificado usando-se o Kit de Purificação em Gel Qiaquick (Qiagen). O produto de PCR purificado foi inicialmente clonado no vetor pENTRY/D TOPO (Invitrogen) e transformado em células de E. coli quimicamente competentes TOP 10 (Invitrogen). Um vetor pENTR/D-TOPO com a seqüência correta do quadro de leitura aberta da fitase foi recombina- do com o vetor pTrex3g usando-se LR clonase Il (Invitrogen), de acordo com as instruções dos fabricantes (veja a figura 6). O construto resultante foi transformado, e a expressão de proteína foi identificada como no Exemplo 4. A massa molecular esperada da proteína de fusão é de aproximadamente 46 kDa. A proteína foi expressada em mais de 10 g/L. Exemplo 7 - Construção e expressão da fitase variante de Buttiauxella BP- 17 em T. reesei como uma proteína de fusão com um sítio Kex2

O DNA que codifica o quadro de leitura aberta da variante BP-17 foi sintetizado pela GENEART AG (BioPark Josef-Engert-Str. 11, D-93053 5 Regensburg, Alemanha) (veja a Tabela 5, SEQ ID NO: 7). A seqüência de aminoácidos VAVEKR (SEQ ID NO: 10) foi incluída para a clivagem pela protease Kex2 da proteína de fusão, juntamente com os sítios de restrição Sepl e Ascl para fins de clonagem. O quadro de leitura aberta da fitase (SEQ ID NO: 7) foi inserido no vetor, pTrex4, nos sítios Spel e Ascl (veja a figura 10 5). O construto resultante foi transformado e expressado como no Exemplo

4. A massa molecular esperada da proteína de fusão é de aproximadamente 96 kDa. A proteína foi expressada em mais de 10 g/L.

Tabela 5: Seqüência de DNA da variante BP-17 de fitase de Buttiauxella contendo um sítio Sepl na extremidade 5’ e um sítio Ascl na extremidade 3’.

ACTAGTGTCGCCGTGGAGAAGCGCAACGACACCCCCGCCAGCGGCTACCAGGTCGA

GAAGGTCGTCATCCTCAGCCGCCACGGCGTCCGCGCCCCTACCAAGATGACCCAGA

CCATGCGCGACGTCACCCCCAACACCTGGCCCGAGTGGCCCGTCAAGCTCGGCTAC

ATCACCCCTCGCGGCGAGCACCTCATCAGCCTCATGGGCGGCTTCTACCGCCAGAA

GTTCCAGCAGCAGGGCATCCTCAGCCAGGGCTCGTGCCCCACCCCCAACAGCATCT

ACGTCTGGACCGACGTCGCCCAGCGCACCCTCAAGACCGGCGAGGCCTTCCTCGCC

GGCCTCGCCCCCCAGTGCGGCCTCACCATCCACCACCAGCAGAACCTCGAGAAGGC

CGACCCCCTCTTCCACCCCGTCAAGGCCGGCATCTGCAGCATGGACAAGACCCAGG

TCCAGCAGGCCGTCGAGAAGGAGGCCCAGACCCCCATCGACAACCTCAACCAGCAC

TACATCCCCAGCCTCGCCCTCATGAACACCACCCTCAACTTCAGCAAGAGCCCCTGG

TGCCAGAAGCACAGCGCCGACAAGAGCTGCGACCTCGGCCTCAGCATGCCCAGCAA

GCTCAGCATCAAGGACAACGGCAACGAGGTCTCCCTCGACGGCGCTATCGGCCTCA

GCTCCACCCTCGCCGAGATCTTCCTCCTCGAGTACGCCCAGGGCATGCCTCAGGCCG

CCTGGGGCAACATCCACAGCGAGCAGGAGTGGGCCCTCCTCCTCAAGCTCCACAAC

GTCTACTTCGACCTCATGGAGCGCACCCCCTACATCGCCCGCCACAAGGGCACCCCC

CTCCTCCAGGCCATCAGCAACGCCCTCAACCCCAACGCCACCGAGAGCAAGCTCCC

CGACATCAGCCCCGACAACAAGATCCTCTTCATCGCCGGCCACGACACCAACATCG

CCAACATCGCCGGCATGCTCAACATGCGCTGGACCCTCCCCGGCCAGCCCGACAAC

ACCCCCCCTGGCGGCGCTCTCGTCTTTGAGCGCCTCGCCGACAAGTCCGGC AAGCA

GTACGTCAGCGTCAGCATGGTCTACCAGACCCTCGAGCAGCTCCGCAGCCAGACCC

CCCTCAGCCTCAACCAGCCTGCCGGCAGCGTCCAGCTCAAGATCCCCGGCTGCAAC

GACCAGACCGCCGAGGGCTACTGCCCCCTCAGCACCTTCACCCGCGTCGTCAGCCA

GAGCGTCGAGCCCGGCTGCCAGCTCCAGTAAGGCGCGCC (SEQ ID NO: 7).

Exemplo 8 - Construção e expressão da variante BP-17 de fitase de Buttiau- xella em T. reesei como um construto direto

O quadro de leitura aberta da variante BP-17 de fitase de Buttiauxel- Ia foi amplificado por reação em cadeia de polimerase (PCR) usando-se o DNA sintetizado pela GENEART como o molde (veja a Tabela 5, SEQ ID NO: 7). A máquina de PCR usada foi uma Peltier Thermal Cycler PTC-200 (MJ Research). A DNA polimerase usada na PCR foi a HERcuIase (Stratagene). Os iniciadores usados para amplificar o quadro de leitura aberta da fitase foram o iniciador 5 SK680 (direto)

5’CACCAT GCAGACCTT CGGT GCTTTT CTCGTTTCCTTCCT CGCCGCCAGCGGCCT GGCCGCGGCCAACGACACCCCCGCCAGC 3’ (SEQ ID NO: 11) e o iniciador SK6 5’ CCTTACTGGAGCTGGCAG 3’ (SEQ ID NO: 12). O iniciador direto continha quatro nucleotídeos adicionais (seqüência - CACC) na extremidade 5’, que 10 eram requeridos para clonagem no vetor pENTRY/D-TOPO (Invitrogen). As condições de PCR para amplificação do quadro de leitura aberta da fitase de Buttiauxella de tipo selvagem foram as seguintes: Etapa 1: 94°C durante 1 min. Etapa 2: 94°C durante 30 s. Etapa 3: 58°C durante 30 s. Etapa 4: 72°C durante 1 min. As Etapas 2, 3 e 4 foram repetidas por mais 24 ciclos. Etapa 15 5: 72°C durante 5 min. Etapa 6: 4°C para armazenamento. O produto de PCR foi purificado usando-se o Kit de Purificação em Gel Qiaquick (Qiagen). O produto de PCR purificado foi inicialmente clonado no vetor pENTRY/D TOPO (Invitrogen) e transformado em células de E. coli quimicamente com- petentes TOP 10 (Invitrogen). Um vetor pENTR/D-TOPO com a seqüência 20 correta do quadro de leitura aberta da fitase foi recombinado com o vetor pTrex3g usando-se LR clonase Il (Invitrogen), de acordo com as instruções dos fabricantes (veja a figura 6). O construto resultante foi transformado, e a expressão foi identificada como no Exemplo 4. Uma banda de proteína com uma massa molecular aparente de aproximadamente 46 kDa foi observada 25 no gel tingido. A massa molecular esperada da proteína de fusão é de apro- ximadamente 46 kDa. A proteína foi expressada em mais de 10 g/L.

Claims (31)

1. Variante de fitase isolada, a dita variante compreendendo uma substituição correspondente às posições A122, D125, T167, F197, T209, A211, K240, A242, S281, Q289, A294 e N303 da SEQ ID NO: 1 e com pelo menos 95% de identidade de seqüência inclusive com as substituições vari- antes dos resíduos de aminoácidos 34 - 446 da SEQ ID NO: 1.

2. Fitase, como definida na reivindicação 1, em que a dita varian- te compreende uma substituição correspondente às posições A122, D125, T167, F197, T209, A211, K240, A242, S281, Q289, A294 e N303 da SEQ ID NO: 1.

3. Fitase, como definida na reivindicação 1, em que a substitui- ção também compreende A122T, D125A, T167I, F197S, T209K, A211P, K240E, A242S, S281L, Q289Y, A294E e N303K e tem pelo menos 95% de identidade de seqüência inclusive com as substituições variantes dos resí- duos de aminoácidos 34 - 446 da SEQ ID NO: 1.

4. Fitase, como definida na reivindicação 1, em que a variante tem a seqüência de SEQ ID NO: 3.

5. Variante de uma fitase de Buttiauxella sp, em que a variante consiste em uma substituição correspondente às posições A122, D125, T167, F197, T209, A211, K240, A242, S281, Q289, A294 e N303 da SEQ ID NO: 1.

6. Variante de fitase isolada, a dita variante compreendendo uma substituição correspondente às posições R24, R28, T31, K32, D98, R100, K137, N212, G221, T225, E228, E249, H259, F263, M266, N276, H312, D313, T314 e/ou D334 da SEQ ID NO: 4.

7. Variante de fitase, como definida na reivindicação 6, em que a substituição corresponde à posição D98 da SEQ ID NO: 4.

8. Variante de fitase, em que a variante compreende 98% de identidade de seqüência com as posições dos resíduos de aminoácidos 34 - 446 da SEQ ID NO: 1 e compreende uma substituição nas posições A122, D125, T167, F197, T209, A211, K240, A242, S281, Q289, A294 e N303 da SEQ ID NO: 1.

9. DNA que codifica a fitase como definida na reivindicação 1.

10. DNA que codifica a fitase cmo definida na reivindicação 6.

11. Vetor de expressão compreendendo o DNA como definido na reivindicação 9.

12. Célula hospedeira transformada com o vetor de expressão como definido na reivindicação 11.

13. Variante de fitase, de acordo com a reivindicação 1, com maior estabilidade térmica em comparação com a fitase da SEQ ID NO:2.

14. Composição de enzima compreendendo a fitase como defi- nida na reivindicação 1.

15. Composição de enzima compreendendo a fitase como defi- nida na reivindicação 6.

16. Composição de enzima, de acordo com a reivindicação 14, em que a dita composição é uma composição de ração para animais.

17. Composição de enzima, de acordo com a reivindicação 14, em que a dita composição é usada em um processo de liquefação de amido.

18. Composição de enzima, de acordo com a reivindicação 14, em que a dita composição é usada em um processo de fermentação de ál- cool.

19. Composição de enzima, de acordo com a reivindicação 14, compreendendo adicionalmente uma enzima selecionada do grupo glucoa- milase, alfa amilase, proteases, celulases, xilanases e suas combinações.

20. Meio de fermentação compreendendo a fitase como definida na reivindicação 1, produzida por uma cultura de células fúngicas filamento- sas.

21. Meio de fermentação, como definida na reivindicação 20, em que as células fúngicas filamentosas são células de Trichoderma.

22. Meio de fermentação, como definida na reivindicação 21, em que as células de Trichoderma são de T. reesei.

23. Meio de fermentação, de acordo com a reivindicação 20, em que a fitase compreende a seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO: 3.

24. Método para a produção de uma fitase em uma célula hos- pedeira, compreendendo: a) a transformação de uma célula hospedeira com um construto de DNA que inclua um promotor com atividade transcricional na célula hos- pedeira operacionalmente ligado a um polinucleotídeo heterólogo que codifi- que uma fitase com uma seqüência de aminoácidos com pelo menos 75% de identidade de seqüência com a SEQ ID NO: 3, b) o cultivo da célula hospedeira transformada em um meio de cultura adequado para permitir a expressão da dita fitase, e c) a produção da fitase.

25. Método, de acordo com a reivindicação 24, em que a célula hospedeira é uma célula fúngica, uma célula bacteriana ou uma célula vege- tal.

26. Método, de acordo com a reivindicação 25, em que a célula fúngica é uma célula de levedura ou uma célula fúngica filamentosa.

27. Método, de acordo com a reivindicação 24, compreendendo adicionalmente a recuperação da fitase produzida.

28. Método, de acordo com a reivindicação 26, em que a célula hospedeira é uma célula hospedeira fúngica filamentosa, e a célula hospe- deira fúngica filamentosa é uma célula de Trichoderma.

29. Método, de acordo com a reivindicação 28, em que a célula de Trichoderma é uma célula de T. reesei.

30. Método, de acordo com a reivindicação 24, em que a fitase tem pelo menos 95% de identidade de seqüência com a SEQ ID NO: 3.

31. Método, de acordo com a reivindicação 30, em que a fitase tem a seqüência da SEQ ID NO: 3.