BRPI0807205A2 - Moduladores de ligantes esclerostina para tratamento de distúrbios relacionados ao osso - Google Patents

Moduladores de ligantes esclerostina para tratamento de distúrbios relacionados ao osso Download PDF

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BRPI0807205A2
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BR
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sclerostin
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ligand
antibody
lrp4
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Chris Xiangyang Lu
Shou-Ih Hu
Michaela Kneissel
Christine Halleux
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Novartis Ag
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Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MODULADORES DE LIGANTES ESCLEROSTINA PARA TRATAMENTO DE DISTÚRBIOS RELACIONADOS AO OSSO".
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO A osteoporose (OP) é um distúrbio esquelético sistêmico carac
terizada por pouca massa óssea e deterioração microarquitetônica do tecido ósseo, um conseqüente aumento da fragilidade óssea e suscetibilidade à fratura. É estimado que uma mulher com 50 anos de idade tem 50% de chance de apresentar uma fratura osteoporótica durante o seu período de 10 vida pós-menopausa. A síndrome osteoporótica é multifacetada, abrangendo distúrbios primários tais como a OP pós-menopausa ou relacionada à idade e condições secundárias que acompanham estados de doença ou medicações. A densidade mineral do osso diminuída (BMD) é o fator de risco mais importante para OP. Ela resulta de aquisição prejudicada de pico de massa 15 óssea na adolescência ou de perda óssea durante o envelhecimento.
A perda óssea pode ocorrer como o resultado de reabsorção óssea acelerada ou formação defeituosa de osso, dois processos que estão normalmente acoplados na vida adulta. A perda óssea rápida como resultado de deficiência de estrogênio e a reabsorção óssea acelerada é a causa 20 mais freqüente de OP, mas apenas cerca de um quarto de todas as mulheres na pós-menopausa precoce têm osteoporose por renovação aumentada do osso. Assim, a osteoporose é amplamente causada por fatores genéticos. Várias análises de integração identificaram genes que contribuem para aumentar a renovação óssea ou diminuir a massa óssea, mas é claro que um 25 defeito em um único gene não é responsável, por exemplo, pela OP pósmenopausa, a forma mais freqüente da doença (Ralston SH.(2003) Curr. Opin. Pharmacol. 3(3):286).
A prevalência atual de osteoporose é de 50,9 milhões de pacientes nos principais centros, esperada aumentar para 55,8 milhões em 2010 e 61,5 milhões em 2015. Há um aumento constante devido ao envelhecimento da população.
As terapias mais freqüentes para o tratamento de OP são baseI 2
adas na inibição da reabsorção óssea para prevenir a posterior perda óssea. A razão para isso é que a célula que reabsorve (degrada) o osso - o osteoclasto - é uma célula altamente especializada específica para o osso e os mecanismos principais no seu recrutamento e ativação foram identificados.
5 Osteoclastos são células de origem hematopoiética e que se desenvolvem a partir de células tronco na medula óssea; osteoclastos maduros funcionais são células multinucleadas e estão localizadas sobre as superfícies ósseas mineralizadas que essas células especializadas podem reabsorver.
A nova matriz óssea é formada pelos osteoblastos, cujo tronco é de linhagem mesenquimal. Essas células que formam osso têm três supostos destinos finais; elas sofrem apoptose (morte celular), tornam-se células de revestimento (células achatadas sobre a superfície óssea mineralizada) ou são capturadas na matriz óssea. As células diferenciadas irreversivelmente capturadas são chamadas de osteócitos, que são as células ósseas mais abundantes. Eles estão embebidos em intervalos regulares dentro da matriz óssea mineralizada e estão interligados uns com os outros através de longos processos celulares denominados dendritos, que estão acoplados aos osteócitos da vizinhança e às células ósseas sobre a superfície através de nexos. Eles são pensados ser os reguladores-chave da modelagem e remodelagem óssea, embora os mecanismos moleculares subjacentes não estejam completamente esclarecidos.
Embora a osteoporose tenha sido definida como um aumento no risco de fratura devido à massa óssea diminuída, nenhum dos tratamentos presentemente disponíveis para distúrbios esqueléticos pode aumentar 25 substancialmente a densidade óssea de adultos. Os princípios da terapêutica osteoporótica atual, ao contrário, são antirreabsortivos e são capazes de reduzir o risco de novas fraturas vertebrais em cerca de 35 a 60% (Haeuselmann HJ1 Rizzoli R (2003) Osteoporos. Int.; 14:2; Chesnut CH1 Ill et al (2004), J Bone Min Res; 19(8)). O risco de fratura de quadril é reduzido ape30 nas por um princípio terapêutico antirreabsortivo, o que resulta em cerca de 50% de redução no risco de fratura. Uma necessidade não satisfatoriamente preenchida que existe há muito tempo no campo é representada por fármacos capazes de aumentar a densidade óssea em adultos, particularmente nos ossos do punho, coluna vertebral e quadril que estão em risco na osteopenia e osteoporose. Consequentemente, como vários pacientes com OP já perderam uma quantidade substancial de massa óssea no momento do di5 agnóstico, há uma necessidade de desenvolver agentes que aumentem a massa óssea pela estimulação da formação de osso novo e que sejam capazes de reduzir o risco de fratura em mais do que 50%.
Por outro lado, há uma variedade de distúrbios ósseos associados com o crescimento ósseo excessivo e densidade mineral óssea (BMD) aberrantemente elevada, nos quais a formação e a deposição de osso excedem a reabsorção, resultando potencialmente em massa e resistência óssea patologicamente aumentadas. Por exemplo, a esclerosteose é um distúrbio recessivo que exibe massa óssea aumentada mesmo em portadores heterozigotos. Similarmente, indivíduos com síndrome de Simpson-Golabi-Behmel (SGBS) têm, tipicamente, um aspecto amplo, sólido e são caracterizados por ossos faciais alargados (por exemplo, que resultam na protrusão da mandíbula e ponte nasal alargada). Similarmente, a Doença de Van Buchem é uma doença recessiva autossômica caracterizada por crescimento esquelético excessivo. Essa doença é caracterizada por um espessamento simétrico de ossos, mais frequentemente encontrado como um osso da mandíbula alargado, mas também um alargamento do crânio, costelas, diáfise de ossos longos, assim como ossos tubulares das mãos e dos pés, resultando em densidade óssea cortical aumentada. As conseqüências clínicas do espessamento aumentado do crânio incluem paralisia do nervo facial causando perda da audição, problemas visuais, dor neurológica e, muito raramente, cegueira como uma conseqüência de atrofia óptica.
A presente invenção pretende fornecer composições, métodos de tratamento e métodos para o diagnóstico de distúrbios relacionados à densidade mineral óssea (BMD) anormal.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
A presente invenção provê métodos para tratar, melhorar os sintomas e proteger contra um distúrbio com densidade mineral óssea aberrante e/ou um distúrbio relacionado com esclerostina que compreendem administrar uma composição compreendendo um modulador da interação esclerostina-ligante, por exemplo, um modulador da interação da esclerostina:ligante de esclerostina. Tal modulador pode incluir um anticorpo, um Ar5 cabouço Semelhante a Anticorpo, uma molécula pequena, uma proteína quimérica ou de fusão, peptídeo, nucleotídeo mimético ou inibitório (por exemplo, RNAi) dirigidos contra (i) esclerostina; (ii) um Iigante de esclerostina; (iii) um sítio novo (por exemplo, um determinante epitópico recentemente criado) criado pela interação esclerostina: Iigante de esclerostina, ou (iv) um 10 complexo de proteína compreendendo qualquer um dos mesmos. As ditas composições incluem "composições farmacêuticas", como aqui definidas. "Distúrbio relacionado à esclerostina", "distúrbio aberrante da densidade mineral óssea" e "ligante de esclerostina" são expressões definidas aqui posteriormente.
Por meio de um exemplo não-limitante, a presente invenção for
nece métodos para tratar um distúrbio relacionado à esclerostina (por exemplo, osteoporose ou esclerosteose) e/ou um distúrbio aberrante da densidade mineral óssea pela administração de um modulador da esclerostina:ALPL, esclerostina:Frem2 ou interação de esclerostina:LRP4.
A presente invenção ainda fornece métodos para identificar um
agente capaz de modular a interação de esclerostina: ligante de esclerostina, cujo método compreende medir a alteração da interação de esclerostina com um ligante de esclerostina ocasionada pelo dito agente. Preferivelmente, o dito método compreende as etapas de: a) contatar a esclerostina com 25 um ligante de esclerostina na presença e na ausência de um agente de teste sob condições que permitam a interação do ligante de esclerostina com a esclerostina; e b) medir a interação do ligante de esclerostina com a esclerostina em ambas, a presença e a ausência do dito agente de teste em que (i) uma diminuição na interação do ligante de esclerostina com a esclerostina 30 na presença do agente de teste, em relação à interação na ausência do agente de teste, identifica o agente de teste como um antagonista da interação da esclerostina:ligante de esclerostina e em que (ii) um aumento na interação na presença do agente de teste, em relação à interação na ausência do agente de teste, identifica o agente de teste como um agonista da interação da esclerostina:ligante de esclerostina.
Por meio de um exemplo não-limitante, a presente invenção for5 nece métodos para identificar um agente capaz de modular a interação de esclerostina:LRP4, cujo método compreende medir a alteração da ligação de esclerostina a LRP4 ocasionada por tal agente. Em uma modalidade, o agente de teste se liga diretamente ou indiretamente a LRP4 e dessa maneira modula a interação esclerostina:LRP4. Em uma modalidade, o agente de 10 teste é uma molécula pequena. Em outra modalidade, o agente de teste é um nucleotídeo inibitório. Em outra modalidade ainda, o agente de teste é uma proteína de fusão que compreende a proteína LRP4.
As alterações na interação de esclerostina:ligante de esclerostina, atividade da proteína esclerostina ou do ligante de esclerostina e/ou atividade da via da esclerostina podem ser medidas por PCR, Taqman PCR, sistemas de apresentação em fago, eletroforese em gel, ensaio duplo'híbrido de levedura, ensaio com gene repórter, análise Northern ou Western, imunohistoquímica, uma câmara de cintilação convencional, uma gama-câmara, um rastreador retilíneo, um rastreador PET, um rastreador SPECT, um rastreador de MRI, um rastreador de RMN ou uma máquina de raios X. A alteração na esclerostina, na atividade de proteína do ligante de esclerostina e/ou na atividade da via da esclerostina pode ser detectada pela detecção de uma alteração na interação entre esclerostina.ligante de esclerostina, pela detecção de uma alteração na expressão ou nível de proteína esclerostina ou ligante de esclerostina ou pela detecção de uma alteração na expressão ou nível de proteína de uma ou mais proteínas da via da esclerostina, preferivelmente pela detecção de uma alteração na via de sinalização de Wnt. As células nas quais o acima descrito pode ser detectado podem ser ósseas, mesenquimais, de rim (por exemplo, HEK) ou de origem hematopoiética, podem ser células cultivadas ou podem ser obtidas de ou estarem dentro de um organismo transgênico. Tais organismos transgênicos incluem, mas não são limitados a camundongo, rato, coelho, ovelha, vaca ou primata. A presente invenção também fornece métodos para identificar um agente capaz de modular a interação de esclerostina:ligante de esclerostina, cujo método compreende medir a resposta de sinalização induzida pela interação de esclerostina:ligante de esclerostina na presença do dito agente 5 e compará-la com a resposta de sinalização induzida pela interação de esclerostina-ligante de esclerostina na ausência do dito agente. Preferivelmente, o dito método compreende as etapas de: a) contatar a esclerostina com um ligante de esclerostina na presença e na ausência de um agente de teste sob condições que permitam a interação do ligante de esclerostina com a 10 esclerostina; e b) medir uma resposta sinalizadora ou enzimática induzida pela interação de esclerostina-ligante de esclerostina, em que uma alteração na resposta na presença do agente de teste de pelo menos 10%, 20% ou 30% em comparação com a resposta na ausência do agente de teste indica que o agente de teste é capaz de modular a interação de esclerostina-ligante 15 de esclerostina. Preferivelmente, a resposta de sinalização medida na etapa b) é a resposta de sinalização de Wnt.
Um aumento na resposta de sinalização na presença do agente de teste de pelo menos 10%, 20% ou 30% em comparação com a resposta na ausência do agente de teste identifica o agente de teste como um agonis20 ta da interação de esclerostina-ligante de esclerostina. Uma diminuição na resposta de sinalização na presença do agente de teste de pelo menos 10%, 20% ou 30% em comparação com a resposta na ausência do agente de teste identifica o agente de teste como um antagonista da interação de esclerostina-ligante de esclerostina.
Por meio de um exemplo não-limitante, a presente invenção for
nece métodos para identificar um agente capaz de modular a interação de esclerostina:LRP4, cujo método compreende medir a resposta de sinalização induzida pela interação de esclerostina:LRP4 na presença do dito agente e compará-la com a resposta de sinalização induzida pela interação de 30 esclerostina:LRP4 na ausência do dito agente. Em uma modalidade, o agente de teste se liga diretamente ou indiretamente a LRP4 e, e dessa maneira, modula a interação de esclerostina:LRP4. Em uma modalidade, o agente de teste é uma molécula pequena. Em outra modalidade, o agente de teste é um nucleotídeo inibitório.
A presente invenção também fornece uma composição que compreende um agente capaz de modular a interação de esclerostinaligante de esclerostina de acordo com um método como descrito acima. As ditas composições incluem "composições farmacêuticas", como definidas aqui.
Os agentes preferidos capazes de modular o ligante de esclerostina são os anticorpos ou Estruturas Semelhantes a Anticorpo que se ligam especificamente ao dito ligante de esclerostina ou uma proteína funcional compreendendo uma porção que se liga a antígeno do dito anticorpo ou do dito Arcabouço Semelhante a Anticorpo.
A presente invenção também fornece métodos para diagnosticar um distúrbio relacionado à esclerostina e/ou um distúrbio aberrante da den15 sidade mineral óssea ou uma predisposição a um distúrbio relacionado à esclerostina e/ou um distúrbio aberrante da densidade mineral óssea em um indivíduo, compreendendo as etapas de (a) medir a interação de esclerostina-ligante de esclerostina no dito indivíduo e (b) comparar a interação na etapa (a) com a interação de esclerostina:ligante de esclerostina de um indi20 víduo saudável, uma diferença indicando um distúrbio relacionado à esclerostina ou predisposição a ele no dito indivíduo.
Por meio de exemplo não-limitante, a presente invenção fornece métodos para diagnosticar a osteoporose ou esclerosteose ou uma predisposição a elas, em um indivíduo pela (a) medida da ligação de esclerosti25 na:LRP4 no dito indivíduo e (b) comparação da ligação na etapa (a) com a ligação de esclerostina:LRP4 de um indivíduo saudável (isto é, aquele sem afecção ou predisposição para esclerosteose), uma diferença indicando osteoporose ou esclerosteose ou predisposição a elas no dito indivíduo.
A presente invenção fornece um método para identificação de um mimético do ligante de esclerostina, no qual o mimético tem efeito funcional igual, similar ou melhorado como a interação ligante de esclerostina com a esclerostina, cujo método compreende medir a interação com a esclerostina do candidato a mimético. Preferivelmente, o dito método compreende: (a) contatar a esclerostina com o candidato a mimético sob condições que permitam a interação do mimético com a esclerostina; e (b) medir a interação do mimético com a esclerostina, em que uma interação de pelo menos 5 10%, 20% ou 30% daquela observada para as várias interações de esclerostina:ligante de esclerostina descritas aqui distingue o candidato a mimético como um mimético de ligante de esclerostina da invenção.
Além disso, a presente invenção fornece um método para identificar um mimético de ligante de esclerostina, no qual o mimético tem efeito funcional igual, similar ou melhorado como a interação de ligante de esclerostina com esclerostina, cujo método compreende medir a resposta de sinalização induzida pela interação de esclerostina-mimético e compará-la com a resposta de sinalização induzida pelas interações de esclerostina:ligante de esclerostina aqui descritas. Preferivelmente, o dito método compreende: (a) contatar a esclerostina com um candidato a mimético sob condições que permitam a interação do mimético com a esclerostina; e (b) medir a resposta de sinalização induzida pela interação esclerostina-mimético, em que uma resposta de sinalização que é pelo menos 10%, 20% ou 30% daquela observada para as várias interações de esclerostina:ligante de esclerostina descritas aqui distingue o candidato a mimético como um mimético de ligante de esclerostina da invenção.
Por meio de um exemplo não-limitante, a presente invenção fornece métodos para identificar miméticos de LRP4 que têm efeitos funcionais iguais, similares ou melhorados como aqueles da interação entre LRP4 e esclerostina sob condições fisiológicas normais. Os ditos miméticos podem ser identificados pelo emprego dos métodos aqui descritos.
A presente invenção fornece ainda um siRNA capaz de modular a expressão de proteína, por exemplo, diminuindo a expressão de proteína em uma célula de mamífero, de um ligante de esclerostina.
A presente invenção também fornece uma composição que
compreende um mimético de ligante de esclerostina identificado de acordo com um método como aqui descrito. As ditas composições incluem "composições farmacêuticas" como aqui definidas.
A presente invenção fornece métodos para tratar, melhorar os sintomas e proteger contra um distúrbio relacionado à esclerostina e/ou um distúrbio aberrante da densidade mineral óssea, compreendendo administrar 5 uma composição que compreende um mimético de ligante de esclerostina, cujo mimético tem efeito funcional igual, similar ou melhorado como a interação de ligante de esclerostina com esclerostina aqui descrita. Os ditos miméticos podem ser facilmente identificados usando os métodos descritos acima (e aqui em detalhes adicionais). Em certas modalidades, o dito mimético po10 de ser um anticorpo ou Arcabouço Semelhante a Anticorpo ou seus fragmentos dirigidos contra o dito ligante de esclerostina (por exemplo, anticorpo ou fragmento anti-LRP4).
A presente invenção fornece, adicionalmente, um método para diagnosticar um distúrbio ou predisposição para um distúrbio relacionado à 15 esclerostina e/ou distúrbio aberrante da densidade mineral óssea em um indivíduo, compreendendo as etapas de: (a) obter a seqüência de nucleotídeos de um gene de ligante de esclerostina no dito indivíduo e (b) comparála com aquela de um indivíduo saudável, onde uma mutação no respectivo gene de ligante de esclerostina indica um distúrbio relacionado à esclerosti20 na e/ou um distúrbio aberrante da densidade mineral óssea ou uma predisposição a elas.
A presente invenção também fornece métodos para modular a interação entre esclerostina e um ligante de esclerostina. Por meio de um exemplo não-limitante, a presente invenção inclui métodos para modular a 25 interação entre a esclerostina e um ligante de esclerostina a fim de modular a atividade da via da esclerostina ou para modular os níveis de proteína de esclerostina ou ligante de esclerostina.
A presente invenção não está limitada à seqüência nativa de esclerostina ou a qualquer um dos Iigantes de esclerostina descritos aqui em detalhes. Além disso, os métodos e composições da presente invenção abrangem derivados e variantes de união de esclerostina ou qualquer um dos Iigantes de esclerostina descritos aqui em detalhes. Mesmo quando são empregadas porções ou fragmentos, essas porções ou fragmentos podem ter seqüências de aminoácidos alteradas.
A presente invenção fornece ainda um polipeptídeo solúvel, que compreende um fragmento de ligante de esclerostina, em que o dito polipep5 tídeo solúvel se liga especificamente ao ligante de esclerostina, por exemplo, a LRP4, ou a esclerostina. Em uma modalidade, o dito polipeptídeo solúvel consiste na porção extracelular de LRP4, preferivelmente o polipeptídeo que consiste em SEQ ID N0 3 (aa 21 a 1763 de LRP4).
A presente invenção também fornece um anticorpo ou Arcabouço Semelhante a Anticorpo ou uma proteína funcional que compreende uma porção que se liga ao antígeno do dito anticorpo ou do dito Arcabouço Semelhante a Anticorpo, em que o dito anticorpo ou Arcabouço Semelhante a Anticorpo ou proteína funcional se liga especificamente a um ligante de esclerostina. Em uma modalidade, o dito anticorpo ou Arcabouço Semelhante a Anticorpo ou proteína funcional inibe a ligação de esclerostina ao dito ligante de esclerostina. Em outra modalidade, o dito anticorpo ou Arcabouço Semelhante a Anticorpo ou proteína funcional modula a via de sinalização de Wnt, como medido em um ensaio baseado em célula. Em uma modalidade relacionada, o dito anticorpo ou Arcabouço Semelhante a Anticorpo ou proteína funcional se liga especificamente a LRP4 ou ALPL.
DESCRIÇÃO RESUMIDA DAS FIGURAS
Figura 1 mostra siRNAs anti-LRP4 e sua habilidade de reduzir a expressão de mRNA de LRP4.
Figura 2 mostra que a redução de expressão de mRNA de LRP4 reduz a habilidade da esclerostina de inibir a atividade "supertopflash" (STF) em células HEK293.
Figura 3 mostra um estudo de resposta à dose após a redução de expressão de mRNA de LRP4.
Figura 4a mostra o efeito da superexpressão de LRP4 sobre o "supertopflash" (STF) de Wntl induzido por Luc em células Hek293; Figura 4b mostra o efeito da superexpressão de LRP4 sobre a ação de esclerostina e Dkkl sobre o "supertopflash" (STF) de Wntl induzido por Luc em células Hek293; Figura 4c mostra o efeito da superexpressão de LRP4 e LRP5 sobre a ação de esclerostina e Dkkl sobre o "supertopflash" (STF) de Wntl induzido por Luc em células Hek293; Figura 4d mostra o efeito da superexpressão de LRP4 e LRP6 sobre a ação de esclerostina e Dkkl sobre o "supertopflash" (STF) de Wntl induzido por Luc em células Hek293.
Figura 5 mostra o efeito da superexpressão de LRP4 sobre o "supertopflash" (STF) de Wntl induzido por Luc em células C28a2; Figura 5b mostra o efeito da superexpressão de LRP4 sobre a ação de esclerostina e Dkkl sobre o "supertopflash" (STF) de Wntl induzido por Luc em células C28a2.
Figura 6 mostra o efeito de esclerostina sobre a atividade da fosfatase alcalina induzida pelo inibidor de GSK3beta em células MC3T3.
Figura 7 mostra o efeito de esclerostina sobre a atividade da fosfatase alcalina baseado em um ensaio acelular.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
Na presente descrição, a expressão "tratamento" inclui ambos os tratamentos profilático ou preventivo assim como o tratamento curativo ou supressor de doença, incluindo o tratamento de pacientes predispostos à doença (por exemplo, distúrbios relacionados à esclerostina e/ou distúrbios 20 aberrantes da densidade mineral óssea) assim como pacientes doentes. Essa expressão inclui também o tratamento para o retardo de progressão da doença.
Como usado aqui, "ligante de esclerostina" inclui, mas não está limitado às seguintes proteínas: Versicano (CSPG2), FREM2, Fibrilina 2 25 (FBN2), C6orf93, Sindecano-4 (Sdc4), Agrina (AGRN), Serpina2 (PN-1), LRP2, LRP4, LRP6, SLIT2, tenascina C1 TRIM26, TRIM41, glipicanol, fosfatase alcalina (ALPL) e receptor de IL-17. Em uma modalidade, LRP4 e ALPL referem-se a LRP4 e APLP humanos correspondentes que têm as SEQ ID N0:1 e 2 respectivamente.
"Interação de esclerostina:ligante de esclerostina" significa uma
interação direta ou indireta entre a esclerostina e um ligante de esclerostina como aqui definido. Exemplos não-limitantes de interações incluem a ligação física direta e a inibição estérica indireta.
Como usado aqui, "um distúrbio relacionado com a esclerostina" inclui distúrbios nos quais a densidade mineral óssea (BMD) está anormalmente e/ou patologicamente elevada em relação a indivíduos saudáveis, e 5 distúrbios nos quais a densidade mineral óssea (BMD) está anormalmente e/ou patologicamente diminuída em relação a indivíduos saudáveis. Distúrbios caracterizados por BMD elevada incluem, mas não estão limitados à esclerosteose, doença de Van Buchem, distúrbios de crescimento ósseo excessivo e síndrome de Simpson-Golabi-Behmel (SGBS). Distúrbios carac10 terizados por BMD diminuída e/ou fragilidade óssea incluem, mas não estão limitados à osteoporose primária e secundária, osteopenia, osteomalácia, osteogênese imperfeita (OI), necrose avascular (osteonecrose), fraturas e cicatrização de implantes (implantes dentários e implantes de costela), perda óssea devido a outros distúrbios (por exemplo, associada com infecção por 15 HIV, câncer ou artrite). Outros "distúrbios relacionados com a esclerostina" incluem, mas não são limitados à artrite reumatóide, osteoartrite, artrite e a formação e/ou presença de lesões osteolíticas.
Como usado aqui, "um distúrbio relacionado à esclerostina" inclui condições mediadas pela esclerostina ou associadas com ou caracterizo zadas por níveis aberrantes de esclerostina. Essas incluem cânceres e condições osteoporóticas (por exemplo, osteoporose ou osteopenia), algumas das quais se superpõem com os "distúrbios relacionados com a esclerostina" como definidos aqui. Cânceres relacionados com a esclerostina incluem mieIoma (por exemplo, mieloma múltiplo com lesões osteolíticas), câncer de 25 mama, câncer de cólon, melanoma, câncer hepatocelular, câncer epitelial, câncer de esôfago, câncer de cérebro, câncer de pulmão, câncer de próstata ou câncer pancreático, assim como quaisquer metástases desses.
Um "distúrbio relacionado à esclerostina" também pode incluir condições renais e cardiovasculares, devido pelo menos à expressão de esclerostina na vascularização renal e cardiovascular. Tais distúrbios incluem, mas não são limitados a distúrbios renais tais como doenças glomerulares (por exemplo, glomerulonefrite aguda e crônica, glomerulonefrite rapidamente progressiva, síndrome nefrótica, glomerulonefrite proliferativa focal, lesões glomerulares associadas com doença sistêmica, tais como lúpus eritematoso sistêmico, síndrome de Goodpasture, mieloma múltiplo, diabetes, doença do rim policístico, doença de célula falciforme e doenças inflamatórias crônicas), 5 doenças tubulares (por exemplo, necrose tubular aguda e insuficiência renal aguda, doença renal policística, espongiose medular renal, doença cística medular, diabetes nefrogênico e acidose tubular renal), doenças túbulointersticiais (por exemplo, pielonefrite, nefrite túbulo-intersticial induzida por fármaco e toxina, nefropatia hipercalcêmica e nefropatia hipocalêmica), insu10 ficiência renal aguda e rapidamente progressiva, insuficiência renal crônica, litíase renal, gota, doenças vasculares (por exemplo, hipertensão e nefroesclerose, anemia hemolítica microangiopática, doença renal ateroembólica, necrose cortical difusa e infartos renais) ou tumores (por exemplo, carcinoma de célula renal e nefroblastoma).
Os ditos distúrbios também incluem, mas não se limitam a dis
túrbios cardiovasculares como a doença cardíaca isquêmica (por exemplo, angina pectoris, infarto do miocárdio e doença cardíaca isquêmica crônica), doença cardíaca hipertensiva, cor pulmonale, doença cardíaca valvular (por exemplo, febre reumática e doença cardíaca reumática, endocardite, prolap20 so da válvula mitral e estenose valvar aórtica), doença cardíaca congênita (por exemplo, lesões obstrutivas valvular e vascular, defeito septal ventricuIar ou atrial e duto arterioso patente) ou doença do miocárdio (por exemplo, miocardite, cardiomiopatia congestiva e cardiomiopatia hipertrófica).
"Cura" como usado aqui significa levar à remissão do distúrbio, por exemplo, o distúrbio relacionado à esclerostina e/ou distúrbio aberrante da densidade mineral óssea ou da progressão dos seus episódios através de tratamento.
As expressões "profilaxia" ou "prevenção" significam impedir o aparecimento ou a recorrência de um distúrbio relacionado à esclerostina e/ou distúrbio aberrante da densidade mineral óssea, por exemplo, osteoporose, esclerosteose ou câncer.
Como usado aqui, "modular" indica a habilidade de controlar ou influenciar diretamente ou indiretamente e, por meio de exemplos nãolimitantes, pode significar alternativamente inibir ou estimular, agonizar ou antagonizar, impedir ou promover e reforçar ou enfraquecer.
Como usado aqui, uma "molécula orgânica pequena" ou "molécuia pequena", é um composto orgânico (ou um composto orgânico complexado com um composto inorgânico (por exemplo, um metal)) que tem um peso molecular menor do que 3 quilodaltons e preferivelmente menor do que 1,5 quilodaltons.
Como usado aqui, um gene "repórter" é usado alternativamente com a expressão "gene marcador" e é um ácido nucleico que é rapidamente detectável e/ou que codifica um produto de gene que é rapidamente detectável tal como a luciferase.
Seqüências de controle transcricional e traducional são seqüências de DNA regulatórias, tais como promotores, intensificadores, terminadores e semelhantes, que fornecem a expressão de uma seqüência codificadora em uma célula hospedeira. Em células eucarióticas, sinais de poliadenilação são seqüências de controle.
Uma "seqüência promotora" é uma região regulatória de DNA capaz de se ligar a RNA polimerase em uma célula e iniciar a transcrição de 20 uma seqüência codificadora a jusante (direção 3'). Para propósitos de definição da presente invenção, a seqüência promotora está ligada em sua terminação 3' pelo sítio de início da transcrição e se estende a montante (direção 5') para incluir o número mínimo de bases ou elementos necessários para iniciar a transcrição em níveis detectáveis acima do antecedente. Dentro da 25 seqüência promotora será encontrado um sítio de início da transcrição (convenientemente definido por exemplo, pelo mapeamento com a nuclease S1), assim como domínios de ligação de proteína (seqüências consenso) responsáveis pela ligação de RNA polimerase.
Uma seqüência codificadora está "sob o controle" de seqüências de controle da transcrição e da tradução em uma célula quando a RNA polimerase transcreve a seqüência codificadora em mRNA, que é então RNA trans-processado e traduzido na proteína codificada pela seqüência codificadora.
A frase "farmaceuticamente aceitável" refere-se a entidades moleculares e composições que são fisiologicamente toleráveis e não produzem, tipicamente, uma reação alérgica ou similar inesperadas, tais como 5 desconforto gástrico, vertigem e semelhantes, quando administradas a um humano. Preferivelmente, como usado aqui, a expressão "farmaceuticamente aceitável" significa aprovado pela agência reguladora do governo federal ou estadual ou relacionada na U.S. Pharmacopeia ou outra farmacopéia comumente reconhecida para uso em animais e mais particularmente em hu10 manos.
A expressão "veículo" refere-se a um diluente, adjuvante, excipiente ou veículo com o qual o composto é administrado. Tais veículos farmacêuticos podem ser líquidos estéreis, tais como água e óleos, incluindo aqueles de origem no petróleo, animal, vegetal ou sintética, tais como óleo de 15 amendoim, óleo de soja, óleo mineral, óleo de gergelim e semelhantes. A água ou soluções salinas aquosas e soluções aquosas de dextrose e glicerol são, preferivelmente, empregadas como veículos, particularmente para soluções injetáveis. Veículos farmacêuticos aceitáveis estão descritos em "Remington's Pharmaceutical Sciences" de E.W.Martin.
As frases "quantidade terapeuticamente eficaz" e "quantidade
eficaz" são usadas aqui para significar uma quantidade suficiente para reduzir em pelo menos 15 por cento, preferivelmente em pelo menos 50 por cento, mais preferivelmente em pelo menos 90 por cento e mais preferivelmente prevenir um déficit clinicamente significativo na atividade, função e resposta 25 do hospedeiro. Alternativamente, uma quantidade terapeuticamente eficaz é suficiente para causar uma melhora clinicamente significativa de uma condição/sintoma no hospedeiro.
"Agente" refere-se a todos os materiais que podem ser usados para preparar composições farmacêuticas e para diagnóstico ou que podem ser compostos, ácidos nucleicos (incluindo ácidos nucleicos inibitórios tais como shRNA, RNAi, etc.), anticorpos, Estruturas Semelhantes a Anticorpo, moléculas pequenas, polipeptídeos, fragmentos, isoformas, variantes ou outros materiais que podem ser independentemente usados para tais propósitos, todos de acordo com a presente invenção.
"Derivado" refere-se tanto a um composto, uma proteína ou polipeptídeo que compreende uma seqüência de aminoácidos de uma proteína 5 ou polipeptídeo parentais que tenham sido alterados pela introdução de substituições, deleções ou adições de resíduos de aminoácido ou um ácido nucleico ou nucleotídeo que tenham sido modificados pela introdução de substituições ou deleções, adições ou mutações de nucleotídeo. O ácido nucleico, nucleotídeo, proteína ou polipeptídeo derivados possuem uma fun10 ção similar ou idêntica à do polipeptídeo parental.
"Inibidores" ou "antagonistas" referem-se a moléculas inibitórias, incluindo aquelas identificadas usando os métodos de rastreamento da interação de esclerostina:ligante de esclerostina aqui descritos, de atividade de esclerostina e/ou ligante de esclerostina ou da atividade de proteínas ou vias 15 relacionadas (por exemplo, BMP, Wnt, etc.). Inibidores e antagonistas podem ser agentes que diminuem, bloqueiam ou previnem a sinalização através de uma via e/ou que previnem a formação de interações e complexos de proteína.
"Mimético", de acordo com a presente invenção, inclui mas não
• 20 é limitado a um polipeptídeo, um peptídeo, um lipídeo, um carboidrato, um nucleotídeo, uma molécula orgânica pequena e um anticorpo ou seu fragmento que se ligue ao antígeno. Miméticos podem ser usados para refletir (ou intensificar) a atividade de uma proteína, peptídeo ou polipeptídeo de interesse (por exemplo, esclerostina ou um ligante de esclerostina), a fim de, 25 por exemplo, replicar, agonizar ou potencializar os efeitos da interação de esclerostina-ligante de esclerostina.
Os miméticos candidatos podem ser compostos naturais ou sintéticos, incluindo, por exemplo, moléculas sintéticas pequenas, compostos contidos em extratos de células de animal, planta, bactéria ou fungo, assim 30 como de meio condicionado de tais células. Compostos miméticos podem ser determinados usando os métodos descritos abaixo. Miméticos podem ser gerados com base no conhecimento dos resíduos críticos de uma proteína, peptídeo, polipeptídeo em questão que podem mimetizar a função normal do polipeptídeo. Um mimético pode ter efeitos funcionais iguais, similares ou melhorados como o polipeptídeo, peptídeo ou proteína a partir do qual ele é designado.
A expressão "RNA de fita dupla" ou "dsRNA", como usada aqui,
refere-se a um complexo de moléculas de ácido ribonucleico que têm uma estrutura em duplex que compreende duas fitas de ácido nucleico antiparaleIas e substancialmente complementares, como definido acima. As duas fitas que formam a estrutura em duplex podem ser porções diferentes de uma 10 grande molécula de RNA ou elas podem ser moléculas de RNA separadas. Quando se separa moléculas de RNA, tais siRNA são geralmente referidos na literatura como siRNA ("RNA pequeno de interferência"). Quando as duas fitas são parte de uma molécula maior e, portanto, estão conectadas por uma cadeia ininterrupta de nucleotídeos entre a extremidade 3' de uma fita e 15 a extremidade 5' da outra fita correspondente que forma a estrutura em duplex, a cadeia que conecta o RNA é referida como uma "alça em forma de grampo", "RNA curto em forma de grampo" ou "shRNA". Quando as duas fitas são conectadas covalentemente por meios diferentes da cadeia ininterrupta de nucleotídeos entre a extremidade 3' de uma fita e a extremidade 5’ 20 da outra fita correspondente que forma a estrutura em duplex, a estrutura de conexão é referida como um "ligante". As fitas de RNA podem ter o mesmo ou um número diferente de nucleotídeos. O número máximo de pares de base é o número de nucleotídeos na fita mais curta do siRNA menos quaisquer projeções que estejam presentes no duplex. Além da estrutura em du25 plex, um siRNA pode compreender uma ou mais projeções de nucleotídeos. Além disso, como usado nesse pedido, "siRNA" pode incluir modificações químicas para ribonucleotídeos, incluindo modificações substanciais em múltiplos nucleotídeos e incluindo todos os tipos de modificações aqui descritas ou conhecidas na técnica. Qualquer uma de tais modificações, como usadas 30 em uma molécula tipo siRNA, são abrangidas como "siRNA' para os propósitos desse pedido e reivindicações.
Como usado aqui, uma "projeção de nucleotídeo" refere-se ao nucleotídeo não pareado ou nucleotídeos que se projetam da estrutura em duplex de um siRNA quando uma terminação 3' de uma fita do siRNA se .prolonga além da terminação 5' da outra fita ou vice-versa. "Coesão" ou "terminação coesiva" significa que não há nucleotídeos não pareados na 5 extremidade do siRNA, isto é, nenhum nucleotídeo projetado. Um siRNA "com terminação coesiva" é um siRNA que tem fita dupla ao longo de sua extensão completa, isto é, nenhum nucleotídeo se projeta em qualquer extremidade da molécula. Como esclarecimento, coberturas químicas ou porções químicas de não nucleotídeo conjugadas na terminação 3' ou na termi10 nação 5' de um siRNA não são consideradas para determinar se um siRNA tem uma projeção ou se tem terminação coesiva.
A expressão "fita antissense" refere-se à fita de um siRNA que inclui uma região que é substancialmente complementar a uma sequênciaalvo. Como usado aqui, a expressão "região de complementação" refere-se 15 a uma região sobre a fita antissense que é substancialmente complementar a uma seqüência, por exemplo, uma sequência-alvo, como definida aqui. Onde a região complementar não é totalmente complementar à sequênciaalvo, os não pareamentos são mais tolerados nas regiões terminais e, se presentes, estão geralmente em uma região ou regiões terminais, por exem
- 20 pio, dentro de 6, 5, 4, 3 ou 2 nucleotídeos da terminação 5’ e/ou 3'.
A expressão "fita sense", como usada aqui, refere-se a uma fita de siRNA que inclui uma região que é substancialmente complementar a uma região da fita antissense.
"Introduzir em uma célula", quando referir-se a um siRNA, signi25 fica facilitar a incorporação ou absorção em uma célula, como é compreendido por aqueles versados na técnica. A absorção ou incorporação de siRNA pode ocorrer através de processos celulares de difusão não assistida ou ativo ou com agentes ou dispositivos auxiliares. O significado dessa expressão não está limitado a células in vitro; um siRNA também pode ser "introduzido 30 em uma célula", cuja célula é parte de um organismo vivo. Em tal circunstância, a introdução em uma célula incluirá a liberação para o organismo. Por exemplo, para liberação in vivo, siRNA pode ser injetado em um local do tecido ou administrado sistemicamente. A introdução in vitro em uma célula inclui métodos conhecidos na técnica tais como eletroporação e lipofecção.
As expressões "silenciar" e "inibir a expressão de", à medida que elas se referem ao gene de SOST (isto é, o gene que codifica esclerostina), 5 aos genes que codificam Iigantes de esclerostina (por exemplo, os genes que codificam Versicano (CSPG2), FREM2, Fibrilina 2 (FBN2), C6orf93, Sindecano-4 (Sdc4), Agrina (AGRN), Serpina2 (PN-1), LRP2, LRP4, LRP6, SLIT2, tenascina C, TRIM26, TRIM41, glipicanol, fosfatase alcalina (ALPL) e receptor de IL-17 ou quaisquer genes envolvidos nas vias de sinalização de 10 esclerostina, BMP ou Wnt, referem-se aqui a supressão, pelo menos parcial, da expressão dos ditos genes, como manifestada por uma redução da quantidade de mRNA transcrito a partir de tais genes que podem ser isolados de uma primeira célula ou de um grupo de células nas quais os ditos genes são transcritos e que são ou foram tratadas tal que a expressão dos ditos genes 15 está inibida, em comparação com uma segunda célula ou grupo de células substancialmente idênticas à primeira célula ou grupo de células, mas que não são ou não foram assim tratadas (células de controle). O grau de inibição é geralmente expresso em termos de
(mRNA em células de controle)- (mRNA em células tratadas) · 100% (mRNA em células de controle)
Alternativamente, o grau de inibição pode ser dado em termos de uma redução de um parâmetro que está funcionalmente ligado ao gene de SOST, aos genes que codificam Iigantes de esclerostina ou quaisquer genes envolvidos na transcrição das vias de sinalização de esclerostina, BMP ou Wnt, por exemplo, a quantidade de proteína codificada pelos ditos genes que é secretada por uma célula ou o número de células que apresentam um certo fenótipo. Em princípio, o silenciamento do gene de SOST, dos genes que codificam Iigantes de esclerostina ou de quaisquer genes envolvidos nas vias de sinalização de esclerostina, BMP ou Wnt pode ser determinado em qualquer célula que expresse o alvo, tanto constitutivamente quanto por manipulação genética e por qualquer ensaio apropriado. Entretanto, quando é necessária uma referência a fim de determinar se um dado siRNA inibe a expressão do gene de SOST, dos genes que codificam Iigantes de esclerostina ou de quaisquer genes envolvidos nas vias de sinalização de esclerostina, BMP ou Wnt em um certo grau e por isso é abrangido pela presente invenção, o ensaio fornecido nos Exemplos abaixo servirá como tal referência.
Por exemplo, em certas circunstâncias, a expressão do gene de SOST, dos genes que codificam Iigantes de esclerostina ou de quaisquer genes envolvidos nas vias de sinalização de esclerostina, BMP ou Wnt é suprimida em pelo menos cerca de 20%, 25%, 35% ou 50% pela administra10 ção do oligonucleotídeo de fita dupla da invenção. Em algumas modalidades, os ditos genes são suprimidos em pelo menos cerca de 60%, 70% ou 80% pela administração do oligonucleotídeo de fita dupla da invenção. Em algumas modalidades, os ditos genes são suprimidos em pelo menos cerca de 85%, 90% ou 95% pela administração do oligonucleotídeo de fita dupla 15 da invenção.
A expressão "ligação" refere-se à associação física de um componente (por exemplo, esclerostina) com outro componente (por exemplo, ligante de esclerostina). Uma medida da ligação pode levar a um valor tal como uma constante de dissociação, uma constante de associação, taxa de associação e taxa de dissociação.
Como usada aqui, a expressão "condições que permitem a ligação..." refere-se a condições, por exemplo, de temperatura, concentração de sal, pH e concentração de proteína sob as quais a ligação ocorrerá. Condições de ligação exatas variarão dependendo da natureza do ensaio, por e25 xemplo, se o ensaio usa proteínas puras ou apenas proteínas parcialmente purificadas. As temperaturas para a ligação podem variar entre 15°C a 37°C, mas preferivelmente estarão entre a temperatura ambiente e cerca de 30°C. A concentração de esclerostina em uma reação de ligação também variará, mas será preferivelmente cerca de 10 pM a 10 nM (por exemplo, em uma 30 reação que usa componentes radiomarcados).
Conforme a expressão é usada aqui, a ligação é "específica" se ela ocorre com uma Kd de 1 mM ou menos, geralmente na faixa de 100 nM a 10 pM. Por exemplo, a ligação é específica se a Kd é 100 nM, 50 nM, 10 nM, 1 nM, 950 pM, 900 pM, 850 pM, 800 pM, 750 pM, 700 pM, 650 pM, 600 pM, 550 pM, 550 pM, 450 pM, 350 pM, 300 pM, 250 pM, 200 pM, 150 pM, 100 pM, 75 pM, 50 pM, 25 pM, 10 pM ou menos.
5 A presente invenção refere-se à descoberta de proteínas Iigan
tes para esclerostina (referidas aqui como "ligante(s) de esclerostina"). A esclerostina é capaz de inibir a deposição de osso quando ligada (ou interagindo de outra maneira com) com os ditos Iigantes de esclerostina e na ausência de tal ligação ou interação, a inibição de deposição de osso diminui 10 ou aumenta dependendo se o ligante atua como mediador ou inibidor da ação de esclerostina. A esclerostina é conhecida na técnica por modular outras proteínas e vias de sinalização. Por meio de exemplo, estudos mostraram que a esclerostina é capaz de funcionar como uma antagonista dependendo do contexto da sinalização da Proteína Morfogênica do Osso (BMP). 15 Além disso, a esclerostina também pode funcionar como um inibidor da via de sinalização de Wingless/INT (Wnt), possivelmente pela ligação aos correceptores LRP5 e LRP6 de Wnt.A habilidade de esclerostina em modular a formação de osso adulto pode ocorrer através da inibição da sinalização de Wnt, uma teoria suportada pela elevada superposição fenotípica em distúr20 bios humanos com supercrescimento de osso relacionados a mutações na esclerostina com perda da função e mutações em LRP5 com ganho de função.
Como a esclerostina é conhecida na técnica por modular outras proteínas e vias de sinalização, a modulação da interação de esclerosti25 na:ligante de esclerostina pode, igualmente, influenciar e, por outro lado, exercer efeitos sobre outras proteínas e vias de sinalização (por exemplo, Wnt e BMP). A modulação da interação de esclerostina:ligante de esclerostina (por exemplo, pelos métodos e composições da presente invenção) pode, portanto, resultar em níveis alterados de esclerostina ou em densidade ós30 sea aumentada ou diminuída e pode ser transposta para o tratamento de distúrbios relacionados à esclerostina ou distúrbios aberrantes da densidade mineral óssea, respectivamente. Isso é demonstrado aqui na seção de Exemplos.
Embora outros fatores tenham sido implicados na deposição de osso através das vias de sinalização de Wnt e BMP em estudos anteriores, as descobertas detalhadas aqui (e incorporadas na presente invenção) são 5 críticas por que elas revelam a modulação dessas vias pela interação de esclerostina:ligante de esclerostina. Em outras palavras, a interação de esclerostina:ligante de esclerostina é crítica a fim de ativar ou inibir a esclerostina, através do que ela é capaz de atingir suas atividades biológicas (por exemplo, inibição da deposição de osso).
Por meio de exemplo, a fibrilina 2 é um importante ligante de
esclerostina ou é parte de um complexo múltiplo que consiste em pelo menos esclerostina, como aqui descrito. Essa interação pode induzir um reenovelamento da esclerostina em uma conformação mais estável e/ou pode iniciar a interação funcional entre fibrilina-2 e a sinalização de BMP, forne15 cendo dessa maneira uma ligação entre a esclerostina e a sinalização de BMP. Do mesmo modo, a interação entre fibrilina 2 e esclerostina pode iniciar a interação funcional entre a fibrilina-2 e a sinalização de Wnt, fornecendo dessa maneira uma ligação entre a esclerostina e a sinalização de Wnt. Preparações de 15N-esclerostina revelam apenas 25% de organização por 20 RMN, presumivelmente devido ao enovelamento de esclerostina após a ligação com ligante(s) tais como a fibrilina 2.
Esses achados produzem os métodos e composições da presente invenção, que podem, entre outras coisas, tratar, prevenir e diagnosticar distúrbios relacionados com a esclerostina e/ou distúrbios aberrantes da 25 densidade mineral óssea. Por exemplo, distúrbios caracterizados por densidade mineral óssea aberrantemente baixa (por exemplo, osteoporose) podem ser prevenidos, tratados ou melhorados pela modulação (por exemplo, ruptura) da interação de esclerostina:ligante de esclerostina.
A ruptura da interação de esclerostina:fibrilina 2, por exemplo (através do uso de um anticorpo antifibrilina 2 ou nucleotídeo inibitório, por exemplo) pode ser usada para prevenir, tratar ou melhorar a osteoporose. Alternativamente, distúrbios caracterizados por densidade mineral óssea aberrantemente aumentada (por exemplo, osteoporose) podem ser prevenidos, tratados ou melhorados pela modulação (por exemplo, aumentando ou agonizando) a interação de esclerostina:ligante de esclerostina ou pela administração de um mimético de fibrilina 2 que tem o mesmo efeito ou um e5 feito funcional similar ao da fibrilina 2 ligada à esclerostina. O agonismo da interação de esclerostina:fibrilina 2, por exemplo (através do fornecimento de um mimético de fibrilina 2, por exemplo), de maneira a intensificar a ação da esclerostina, pode ser usado para prevenir, tratar ou melhorar a esclerosteose.
Além disso, em muitos casos, a interação entre esclerostina e
um ligante de esclerostina pode iniciar a interação funcional entre o ligante de esclerostina e a sinalização de BMP, formando dessa maneira uma ligação entre esclerostina e a sinalização de BMP. Igualmente, a interação de esclerostinailigante de esclerostina pode iniciar uma interação funcional en15 tre o ligante de esclerostina e a sinalização de Wnt, fornecendo dessa maneira um nexo entre a esclerostina e a sinalização de Wnt.
Por exemplo, a interação entre esclerostina e agrina pode iniciar a interação funcional entre agrina e a sinalização de BMP, formando dessa maneira uma ligação entre a esclerostina e a sinalização de BMP. Igualmen20 te, a interação de esclerostina-agrina pode iniciar a interação funcional entre agrina e a sinalização de Wnt, fornecendo dessa maneira um nexo entre a esclerostina e a sinalização de Wnt.
Esclerostina/SOST
A esclerostina, uma proteína codificada pelo gene de SOST, é 25 um regulador negativo potente da formação do osso secretada pelos osteócitos (N0 de acesso Swiss-Prot Q9BQB4). Devido à similaridade da esclerostina em sua estrutura com nó de cisteína com a família DAN de antagonistas de TGF-β, a esclerostina foi originalmente conjecturada ser meramente um antagonista da proteína morfogênica do osso (BMP) (Brunkow et al (2001) 30 Am J Hum Genet, 68:577-589); entretanto, sua habilidade em interagir diretamente com BMPs in vivo permanece especulativa.
A perda de esclerostina ou da expressão de SOST resulta em formação de osso descontrolada, por exemplo, como é o caso de esclerosteose (Brunkow et al (2001) Am J Hum Genet, 68(3):577). Pacientes afetados por esclerosteose sofrem por toda a vida de crescimento ósseo excessivo que resulta em massa óssea aumentada e resistente. Portadores hetero5 zigotos para esse distúrbio recessivo também apresentam massa óssea aumentada (Gardner et al., 2005 J Clin Endocrinol Metab. 90(12):6392). Esse fenótipo pode repetido em camundongos deficientes de SOST e sua superexpressão resulta em osteopenia (Loots et al. 2005 (Genome Res. 2005 15(7):928). Além disso, a doença de Van Buchem - uma cópia fenotípica de 10 esclerosteose - foi descoberta ser causada pela desregulação de SOST devido à deleção genômica de um intensificador ósseo de longo alcance (Loots et al. 2005 (Genome Res. 2005 15(7):928). Finalmente, estudos mostram que SOST é regulado negativamente pelo hormônio da paratireóide - o único clinicamente válido no princípio da formação do osso - através do intensi15 ficador ósseo durante a formação do osso (Keller, Kneissel 2005, Bone, 2005 37(2):148). Portanto, a inibição de esclerostina pode resultar em uma terapia ideal para a osteoporose.
Apesar de permanecer incerto como exatamente a esclerostina exerce sua ação como regulador negativo da formação de osso, estudos mostram que a esclerostina inibe a sinalização da proteína morfogênica do osso (BMP) e de Wingless/INT (WNT), ambas críticas para a formação do osso. A esclerostina é capaz de funcionar como antagonista da sinalização de BMP dependendo do contexto. Além disso, a esclerostina pode também funcionar como um inibidor da via de sinalização de Wnt, possivelmente pela ligação a Lrp5 e Lrp6 (Semenov MV, He X.. J Biol Chem. 2006; 281(50):3827) Wnt-correceptors in the presence of yet unindentified cofactor[s]. A hipótese de que a esclerostina possa impactar a formação de osso adulto pela inibição da sinalização de Wnt é suportada pela elevada superposição fenotípica em distúrbios relacionados com o supercrescimento do osso humano relacionados com mutações com perda de função de esclerostina e mutações com ganho de função de LRP5.
A esclerostina deve ter papéis adicionais durante a vida pósnatal. Pacientes com esclerosteose são excepcionalmente altos (Van Hul et al. (2001) European Journal of Radiology 40, 198) sugerindo um papel presumível para a esclerostina na biologia da cartilagem. Além disso, a esclerostina é expressa no rim implicando que ela possa desempenhar um papel 5 ainda não caracterizado nesse órgão (Balemans et al, 2001 Hum. Mol. Genet. 10(5):537, Balemans and Van Hul (2002) Developmental Biology 250, 231). Finalmente, ela mostrou ser expressa pelo menos durante o desenvolvimento embrionário no sistema cardiovascular (van Bezooijen et al. (2006) Dev Dyn. 2006;236(2):606).
Versicano (CSPG2)
Versicano é um membro da família Iecticano que inclui agrecano, neurocano e brevicano. É um grande proteoglicano de sulfato de condroitina. Seu domínio globular N-terminal (G1) se liga ao glicosaminoglicano hialuronano e seu domínio globular carbóxi-terminal (G3) consiste em dois 15 domínios semelhantes a EGF, um domínio semelhante a Iectina e um domínio semelhante a uma proteína reguladora de complemento. Quatro subtipos variantes (V0-V4) de versicano são conhecidos (Wight, TN (2002) Curr. Opin. Cell Biol.; 14(5):617-23). Versicano VO e V1 são clivados por ADAMTS1 e 4 (agrecanase-1) (Sandy, et al. (2001) J. Biol. Chem.; 276(16):13372-8) 20 (Russell et al. (2003) J. Biol. Chem.; 278(43):42330-9) e versicano V2 por ADAMTS4 (Westling et al. (2004) Biochem. J.; 377(pt. 3):787-95).
Versicano tem ampla distribuição tecidual. Nakamura et al estudaram a expressão de versicano em mandíbulas em desenvolvimento e patas traseiras. Baseado em seus resultados, eles propuseram o seguinte. 25 Versicano é expresso antes da diferenciação de osteoblastos e está localizado no osteóide durante a ossificação intramembranosa. Na ossificação endocondral, versicano é expresso em células do periósteo que cobrem a região osteogênica ativa sobre a superfície da cartilagem calcificada. Subsequentemente, os ossos são submetidos a um tipo ou outro de ossificação em 30 continuação com o processo seqüencial comum de desenvolvimento ósseo. A matriz óssea se expande e um osso trabeculado rico em versicano é formado. O mRNA e a proteína versicano são detectados nos osteoblastos, em populações confinadas de osteócitos assim como na matriz óssea. Conforme o osso trabeculado é alterado para osso lamelar, a expressão de versicano na matriz óssea é diminuída. O padrão de expressão temporal e espacial de mRNA de ADAMTS1, 4 e 5 é comparável àquele de versicano. Eles 5 teorizaram que osteoblastos e osteócitos podem estar envolvidos em ambas, a produção e a degradação de versicano, pela secreção de ADAMTSs (Nakamura et al. (2005) J. Histochem. Cytochem.; 53(12):1553-62). Finalmente, versicano e a sinalização de BMP estão ligados como mostrado pelo fato de que BMP-2 diminui pela metade a expressão do gene de versicano em célu10 Ias de discos intervertebrais de rato (Li et al. (2004) J. Spinal Disord. Tech.; 17(5):423-8).
Como descrito aqui em mais detalhes, versicano (CSPG, IPI00009802.1) foi identificado como um ligante de esclerostina na fração de sobrenadante de cultura de célula HEK293 de um ensaio de ligação de Puri15 ficação por Afinidade em Tandem. Versicano é considerado ser um ligante importante de esclerostina ou é parte de um complexo múltiplo que consiste pelo menos de esclerostina em uma conformação mais estável (modulando dessa maneira a ação de esclerostina). A interação de esclerostina :versicano também serve como o nexo entre a esclerostina e a sinalização 20 de Wnt.
FREM2
Frem2, codificado pelo gene my (gene de vesículas mieloencefálicas), é um componente proposto de ECM, relacionado a Fras 1 e Freml (Fras 1 relacionada à matriz extracelular) e considerado ser ortólogo à prote25 ína ECM3 de ouriço do mar. Seu arranjo de proteína predito consiste em um peptídeo de sinal N-terminal seguido por 13 domínios de proteoglicano de sulfato de condroitina arranjados seriadamente (CSPG), 5 domínios CALXp arranjados seriadamente, uma hélice transmembrana e uma cauda curta citoplasmática com um motivo de interação de consenso PDZ.
Uma mutação missense em Frem2 foi detectada em (/7?yUcl) ve
sicular mutante e em dois indivíduos com Síndrome de Fraser, uma malformação multissistêmica que compreende geralmente criptoftalmia, sindactiIia cutânea, anormalidades da orelha, agenesia renal e defeitos cardíacos congênitos. Interessantemente, camundongos myUo1 apresentam sindactilia cutânea ocasionalmente acompanhada por sindactilia óssea e polidactilia, A transição de nucleotídeo 5914G-»A, que resulta na substituição do aminoá5 cido E1972K foi identificada em duas famílias não relacionadas. Essa mutação ocorre no segundo dos cinco domínios CALXp consecutivos e substitui um resíduo que é conservado em todos os domínios CALXp conhecidos. Pesquisas de similaridade de seqüência mostraram que CALXP está relacionado com domínios de caderina, conhecidos por intercalar íons de cálcio 10 em uma bolsa negativamente carregada entre dois domínios consecutivos. A seqüência para alinhamentos de estrutura mostrou que Glu1972 está localizada na bolsa de ligação de Ca2+ na interface dos domínios 2 e 3 de CALXp e corresponde à posição conservada diretamente envolvida na coordenação de Ca2+. Isso sugere que a ligação do cálcio no motivo CALXp-caderina é 15 importante para o funcionamento normal de FREM2 (Jadeja S, et al (2005) Nat. Genet.; 37(5):520-5).
Como descrito aqui em mais detalhes, FREM2 (IPI00180707.7) foi identificado como um ligante de esclerostina, na fração de purificação de membrana de células HEK293 de um ensaio de ligação de Purificação por 20 Afinidade em Tandem. Frem2 é acreditada ser um importante ligante de esclerostina ou é parte de um complexo múltiplo que consiste pelo menos em esclerostina, cuja interação pode induzir um re-enovelamento de esclerostina em uma conformação mais estável (modulando dessa maneira a ação de esclerostina.
Fibrilina 2 (FBN2)
As glicoproteínas fibrilina 1 e 2 são os principais componentes estruturais das microfibrilas que se ligam ao cálcio extracelular com diâmetro médio de 10 nm. As fibrilinas partilham uma estrutura de multidomínio conservada com um alto grau de homologia de seqüência de aminoácidos. A 30 fibrilina-2 é composta por 47 domínios semelhantes a EGF, 43 dos quais têm seqüências consenso de ligação ao cálcio, interrompidas por 8 módulos contendo cisteína, que também são encontrados na proteína de ligação TGF-βΙ latente (LTBP), domínios C e N-terminal únicos e um pequeno domínio rico em glicina. A fibrilina-2 está localizada preferencialmente nos tecidos elásticos, tais como a cartilagem elástica e a camada média da aorta (Putnam et al (1995) Nat Genet.; 11(4):456-8). No osso, o mRNA de fibrilina-2, junto 5 com a fibrilina-1, é abundantemente expresso pelo osso trabecular humano derivado do fêmur proximal e pelos osteoblastos derivados de osso humano maduro em cultura primária (Kitahama et al. (2000) Bone; 27(1):61-7).
Mutações na fibrilina-2 resultam em aracnodactilia contratural (CCA), um distúrbio autossômico dominante que é caracterizado por aracnodactilia, dolicoestenomelia, escoliose, contraturas congênitas múltiplas e anormalidades dos pavilhões auriculares. CCA é fenotipicamente similar a Síndrome de Marfan, que resulta de uma mutação na fibrilina-1, mas que não afeta a aorta e os olhos. As mutações missense de FBN2 ocasionam a substituição de resíduos distintos de cisteína em repetições semelhantes a EGF separadas em dois pacientes com CCA (Putnam et al, 1995). Camundongos nulos para fibrilina-2 exibem um defeito de modelagem de membro na forma de sindactilia bilateral, primariamente devido à diferenciação mesenquimal defeituosa. A sindactilia está associada com uma matriz desorganizada, com expressão normal de gene de BMP. Camundongos duplamente heterozigotos para os alelos nulos Fbn2 e Bmp7 apresentam o fenótipo digital combinado (sindactilia e polidactilia) de ambos nulizigotos (Arteaga-Solis, et al. (2001) J.Cell Biol.; 154 (2):275-81). Como a polidactilia é uma característica de homozigose, não de heterozigose, camundongos nulos para BMP7 sugeriram interação funcional entre microfibrilas ricas em fibrilina-2 e a sinalização de BMP-7 durante a modelagem de membro,
A fibrilina-2 fornece o arcabouço estrutural que organiza as peças morfogenéticas no espaço intercelular do organismo em desenvolvimento. Essa função pode ser exercida pela ligação diretamente com fatores de crescimento inativos (tal como no caso do complexo TGF-β latente), indire30 tamente através da interação com outros componentes da matriz (tais como proteoglicanos) ou pela combinação de ambos os mecanismos (ArteagaSolis, supra). Recentemente, BMP-7 foi mostrada colocalizar com a fibrilina2 em camundongos nulos para fibrilina-1. (Gregory, et al. (2005) J.Biol.Chem.; 280 (30): 27970-80).
Como descrito aqui em mais detalhes, o precursor de fibrilina-2 (FBN2, IPI00019439) tem sido identificado como um ligante de esclerostina 5 na fração de purificação de membrana de células HEK293 em um ensaio de ligação por Purificação por Afinidade em Tandem. A fibrilina-2 é considerada ser um importante ligante de esclerostina ou é parte de um complexo múltiplo que consiste pelo menos em esclerostina. Essa ligação pode induzir um re-e nove lamento de esclerostina em uma conformação mais estável e pode 10 iniciar a interação funcional entre fibrilina-2 e a sinalização de BMP, formando dessa maneira uma ligação entre esclerostina e sinalização de BMP. Igualmente, a interação esclerostina- fibrilina 2 pode iniciar uma interação funcional entre a fibrilina-2 e a sinalização de Wnt, fornecendo dessa maneira um nexo entre esclerostina e sinalização de Wnt.
C6orf93
C6orf93 é uma proteína hipotética, também denominada homólogo de LTV1 (S. cerevisiae). Em humano, ela foi descrita inicialmente em 2002 no sistema do NIH MGC Program (Strausberg et al. (2002) PNAS; 99(26):16899-903). Em Saccharomyces cerevisiae, a proteína LTV1 com viabilidade em baixas temperaturas codifica uma proteína não essencial, não ribossômica. Cepas que carecem de LTV1 e YAR1 apresentam uma hipersensibilidade a vários estresses ambientais, como estresse osmótico e oxidativo, temperatura baixa e alta e a presença de certos inibidores de síntese de proteína revelando uma ligação desconhecida entre fatores de biogênese de ribossomo e sensibilidade ao estresse ambiental (Loar, et al. (2004) Genetics; 168(4): 1877-89). Ltvl interage geneticamente com o gene do fator de exportação de unidade ribossômica pequena Yrb2, sugerindo que Ltvl funciona como uma das várias proteínas adaptadoras possíveis que ligam o mecanismo de exportação nuclear com a subunidade pequena (Seiser, et al (2006) Genetics; 174(2):679-691).
Como descrito aqui em mais detalhes, C6orf93 (IPI0053032.1) foi descrito como um ligante de esclerostina na fração de purificação de membrana de HEK293 e UMR106 em um ensaio de ligação por Purificação por Afinidade em Tandem. C60rf93 é considerada ser um importante ligante de esclerostina ou é parte de um complexo múltiplo que consiste pelo menos em esclerostina. A interação de esclerostina:C6orf93 pode induzir um re5 enovelamento de esclerostina em uma conformação mais estável (modulando dessa maneira a ação de esclerostina) e pode iniciar a interação funcional entre C6orf93 e a sinalização de BMP ou Wnt, e serve como uma ligação entre esclerostina e essas vias. A interação de esclerostina:C6orf93 também é implicada na sensibilidade de osteócitos ao estresse ambiental.
Sindecano-4 (Sdc4)
Sindecano-1 a 4 são componentes da membrana integral de passagem única, membros da família de proteoglicano de sulfato de heparano. Cada sindecano tem um domínio citoplasmático curto, um domínio transmembrana de amplitude única e um domínio extracelular com sítios de acoplamento para três a cinco cadeias de glicosaminoglicanos, permitindo que eles conectem diretamente o ambiente pericelular com o interior celular. Sindecano-4, também chamado de anfiglicano ou riudocano, é um membro único devido à sua habilidade de ativar cascatas de sinalização intracelular e de formar sítios de adesão focal em células de mamífero. Ele se liga à fibronectina através de suas cadeias de glicosaminoglicanos, ativa PKCa e a pequena GTPase RhoA e junto com as integrinas, estabiliza sítios de adesão focal (Tkachenko E. et al. (2005) Circ. Res.;96(5):488-500). Em Xenopus, a fibronectina regula a habilidade de sindecano-4 de translocar Dsh para a membrana plasmática, um ponto de referência na ativação da sinalização não canônica de Wnt (Munoz R1 et al. (2006) Nat. Cell Biol., 8(5):492-500).
Sindecano-4 é abundantemente expresso em vários tipos de células, incluindo osteoblastos cranianos primários de rato onde a expressão de seu mRNA é regulada positivamente pelo tratamento com FGF2. Essa regulação positiva não é uma resposta imediata como sugerido pela redução 30 do mRNA de sindecano-4 que acompanha o tratamento com ciclo-heximida. A proliferação de osteoblasto e a mineralização, assim como a ativação de ERK, também são intensificadas por FGF2, mas especificamente diminuídas pelo pré-tratamento com anticorpo anti-sindecano-4 (Song SJ1 et al. (2007) J. Cell Biochem.; 100(2):402-411). Em células C2C12, sindecano-2 e sindecano-3 são .regulados positivamente por BMP-2 Gutierrez J, et al. (2006) J. Cell Physiol.; 206(1 ):58-67), entretanto sindecano-3 é um modulador negati5 vo da sinalização de BMP-2 durante a condrogênese (Fisher MC et al. (2006) Matrix Biol.; 25(1):27-39). Em Drosophila, sindecano se localiza em axônios em desenvolvimento, interage geneticamente e fisicamente com SLIT e Robo e promove a orientação axonal e de miotúbulo através da sinalização de SLIT/Robo (Johnson KG et al. (2004) Curr. Biol.; 14(6):499-504) 10 (Steigemann P. et al. (2004) Curr. Biol.; 14(3):225-30). Finalmente, sindecano-4 pode induzir estruturas semelhantes a filópodos em linfócitos B ativados quando semeados sobre anticorpos para sindecan-4 (Yamashita Y. et al.
(1999) J. Immunol.; 162(10):5940-8).
Como descrito aqui em mais detalhes, sindecano-4 (sdc4, I15 PI00199629.1) foi identificado como um ligante de esclerostina na fração sobrenadante de cultura de célula UMR106 de osteossarcoma de rato de um ensaio de ligação de Purificação por Afinidade em Tandem. Sindecano é acreditado ser um ligante importante de esclerostina (definido aqui como um "ligante de esclerostina") ou é parte de um complexo múltiplo que consiste 20 pelo menos em esclerostina, SLIT e sindecano-4. Essa ligação pode modular a iniciação de processos semelhantes a dendritos em osteócitos ou induzir e re-enovelamento de esclerostina em uma conformação mais estável e portanto regular a ação de esclerostina. Além disso, sindecano-4 pode servir como uma ligação entre a esclerostina e a sinalização de Wnt e/ou BMP.
SLIT2
SLIT2 é uma proteína secretada que atua como um indicador de direção molecular na migração celular e sua função é mediada pela interação com receptores homólogos circundantes. Ela é expressa na medula espinhal e está envolvida na formação precoce do eixo corporal e padronização celular do tubo neural.
Gremlin e Dan, que são estruturalmente relacionadas com a esclerostina, interagem fisicamente e funcionalmente com as proteínas Slitl e Slit2 e dessa maneira agem como inibidores da quimiotaxia de monócito (Chen et al. (2004) J. Immunol.;173(10):5914). Além disso, as proteínas Slit são Iigantes de alta afinidade do glipicano-1 proteoglicano de sulfato de he~ parano (Ronca et al. (2001) J. Biol. Chem.;276(31):29141), que também fo5 ram identificadas em experimentos descritos na presente invenção como Iigantes de esclerostina. Além de sindecano, também descrito na presente invenção, promove a orientação axonal e de miotúbulo pela sinalização slit/robô (Johnson KG et al., (2004) Curr. Biol. 14(6):499-504) (Steigemann P et al., (2004) Curr. Biol. 14(3):225-30).
SLIT2 (IPI00006288.1) foi identificada como um ligante de escle
rostina na fração de membrana de cultura de célula HEK293 de um ensaio de ligação de Purificação por Afinidade em Tandem. SLIT2 é acreditada ser um importante ligante de esclerostina (definida aqui como um "ligante de esclerostina") ou é parte de um complexo múltiplo que consiste pelo menos 15 em esclerostina, SLIT e possivelmente sindecano-4 e glipicano-1. Essa ligação pode modular a geração dos processos semelhantes a dendritos no osteócito ou induzir um re-enovelamento de esclerostina em uma conformação mais estável e portanto regular a ação de esclerostina. Além disso, SLIT2 serve como uma ligação entre a esclerostina e a sinalização de Wnt e/ou 20 BMP.
Glipicanol (Gpc1)
Glipicanos modulam encontros de Iigantes de proteínas extraceIulares com seus receptores atuando como correceptores. Eles são conhecidos por modular a sinalização de Wnt (Capurro et at. (2005), Cancer 25 Res.;65(14):6245) e a sinalização de BMP [por exemplo, pela interação com antagonistas de BMP] (Paine-Saunders et al. (2000) Dev Biol.;225(1):179). Por exemplo, mutações em glipicano3 resultam em várias síndromes que estão associadas com o crescimento ósseo excessivo. Por exemplo, a síndrome de crescimento excessivo de Simpson-Golabi-Behmel (Pilia et al. 30 (1996), Nat Genet. 12(3):241) é o resultado de perda do controle da sinalização de Wnt por Gpc3 (Song et al (2005); Biol Chem 280(3)2116).
Glipicanos são expressos por células da linhagem osteoblástica e têm sido sugeridos como moduladores potenciais da remodelagem óssea (Sheu et al (2002) J Bone Miner Res. 17(5):915).
Além disso, glipicano 1 se liga a SLIT (Ronca et al. (2001) J Biol Chem. 276(31 ):29141), que também é descrito na presente invenção como um ligante de esclerostina. Gpcl (IPI00137336.1) foi identificado como um ligante de esclerostina na fração de sobrenadante de cultura de célula UMR106 de um ensaio de ligação de Purificação por Afinidade em Tandem. Gpd é acreditado ser um importante ligante de esclerostina (definido aqui como um "ligante de esclerostina") ou é parte de um complexo múltiplo que consiste pelo menos em esclerostina, Gpd e possivelmente sindecano-4 e SLIT2. Essa ligação pode modular a geração dos processos semelhantes a dendritos no osteócito ou induzir um re-enovelamento de esclerostina em uma conformação mais estável e, portanto, regular a ação de esclerostina. Além disso, glipicanol serve como uma ligação entre a esclerostina e a sinalização de Wnt e/ou BMP.
Agrina (AGRN)
Agrina é um grande proteoglicano de sulfato de heparina da matriz extracelular, com um peso molecular de cerca de 600 kDa (núcleo da proteína com 200 kDa). O "splicing" alternativo de RNA mensageiro gera 20 uma isoforma que codifica uma seqüência de sinal clivada seguida pelo domínio amino-terminal de agrina resultando em uma forma secretada de agrina (NtA-agrina) e uma isoforma que contém uma terminação amino mais curta com um peptídeo de sinal interno, não clivado, convertendo a proteína para uma proteína transmembrana de tipo Il (TM-agrina). Ambas as isofor25 mas são expressas diferencialmente: NtA-agrina sendo expressa abundantemente na maioria do tecido que contém lamina basal e TM-agrina sendo expressa preferencialmente no sistema nervoso central (Burgess, et al.
(2000) J.Cell Biol.; 151 (1):41-52)(Neumann, et al. (2001) Mol.Cell Neurosci.; 17 (1):208-25). Recentemente foi mostrado que agrina é expressa em condrócitos de camundongo e se localiza dentro da placa de crescimento (Hausser et al. (2007) Histochem Cell Biol.; 127:363). Camundongos com deficiência de NtA-agrina fornecem a evidência de que a agrina é necessária para a agregação de receptores de acetilcolina durante o desenvolvimento pós-sináptico na junção neuromuscular do músculo esquelético (Gautam, et al. (1996) Cell.; 85 (4):525-35). Essa habilidade requer a tirosina quinase MuSK específica para receptor de músculo, como demonstrado pela simila5 ridade dos fenótipos de camundongo deficientes em agrina e MuSK (DeChiara, et al. (1996) Cell.; 85 (4):501-12). A superexpressão de agrina em células musculares esqueléticas de rato induz a formação de filopódios (Uhm, et al. (2001) J.Neurosci.; 21 (24):9678-89). Agrupamento induzido por anticorpo de TM-agrina endógena leva a formação aumentada de processos seme10 Ihantes a filopódios ao longo de axônios de neurônios centrais e periféricos (Annies, et al. (2006) Mol.Cell Neurosci.; 31 (3):515-24). A superexpressão e regulação negativa através de siRNA de TM-agrina em culturas de neurônios hipocampais sugerem que TM-agrina regula positivamente o número de filopódios no axônio em desenvolvimento pelo seu efeito sobre a iniciação e a 15 estabilização de filopódios (McCroskery, et al. (2006) Mol.Cell Neurosci.; 33(1): 15-28).
Como descrito aqui em mais detalhes, Agrina (IPI00374563.2) foi identificada como um ligante de esclerostina na fração de sobrenadante de cultura celular de HEK293 em um ensaio de ligação por Purificação por 20 Afinidade em Tandem. Agrina é considerada ser um importante ligante de esclerostina ou é parte de um complexo múltiplo que consiste pelo menos em esclerostina, a interação entre as quais é capaz de modular e estabilizar os processos semelhantes a filopódio no osteócito ou induzir um reenovelamento de esclerostina em uma conformação mais estável (modulan25 do dessa maneira a ação de esclerostina).
Serpina2(PN-1)
Serpina 2 codifica o inibidor da serpina peptidase, também denominada protease nexina I (PN-1) ou precursor de nexina derivado da glia (P17). Ela é uma proteína secretada de 43 kDa, membro da superfamília de 30 inibidor de serina protease (SERPIN) e foi descrita como sendo sintetizada pelos astrócitos, músculo liso, células endoteliais e fibroblastos (Scott, et al. (1985) J.Biol.Chem.;260 (11):7029-34)(Rosenblatt, et al. (1987) Brain Res.;415 (1):40-8)(Festoff, et al. (1991) J.Cell Physiol.;147(1):76- 86)(Bouton,etal.(2003)Arterioscler.Thromb.Vasc.Biol.;23(1):142-7). É uma inibidora potente de trombina e do ativador de plasminogênio urinário (uPA) e é um inibidor menos potente mais ainda eficaz de plasmina e tripsina 5 (Scott, et al. (1985) DNA Cell Biol.; 22 (2):95-105). O catabolismo eficiente de complexos de trombina-PN-1 é um mecanismo sinérgico que requer ambos, LRP-1 e heparinas: primeiro, os complexos de trombina-PN-1 são concentrados na superfície celular pelas heparinas e subsequentemente internalizados por LRP-1, antes de serem degradados pelas células (Knauer, et al. 10 (1997) J. Biol. Chem.; 272 (46):29039-45, Scott, et al.(2003) DNA Cell Biol.; 22(2):95-105).
Em fibroblastos embrionários de camundongo, uma internalização alternativa de complexos PN-1 é mediada por sindecano-1 e ativa a via de sinalização de Ras-ERK. PN-1 livre também pode ser internalizado (Li, et 15 al. (2006) J.Cell Biochem.; 99 (3):936-51). PN-1 regula a adesão, difusão e migração celular da musculatura lisa vascular (Richard, et al. (2006) J. Thromb. Haemost.; 4 (2):322-8). A expressão de PN-1 é regulada positivamente na musculatura esquelética humana por fatores relacionados à lesão como TNFalfa, TGFbeta e IL-1 (Mbebi, et al. (1999) J.Cell Physiol.; 179 20 (3):305-14). PN-1 também foi descrito ter envolvimento na extensão de axônio pela inibição de trombina (Farmer, et al. (1990) Dev.Neurosci.; 12 (2):73- 80). Finalmente, em células NIH3T3, PN-1 foi mostrado ser um gene-alvo de Prx2 conhecido por ser necessário para a esqueletogênese correta (Scott, et al.(2003) DNA Cell Biol.; 22(2):95-105).
Como descrito aqui em mais detalhes, PN-1 (IPI00203479.3) foi
identificado como um ligante de esclerostina na fração sobrenadante de cultura de célula UMR106 de um ensaio de ligação de Purificação por Afinidade em Tandem. PN-1 é acreditado ser um ligante importante de esclerostina ou é parte de um complexo múltiplo que consiste pelo menos em esclerostina, a 30 interação entre os quais é capaz de induzir um re-enovelamento de esclerostina em uma conformação mais estável (modulando,portanto a ação de esclerostina). A interação esclerostina:PN-1 também está implicada no crescimento externo de osteócito ou internalização e degradação de esclerostina. Proteína-2 relacionada ao receptor de lipoproteína de baixa densidade (LRP2, Megalina)
A família do receptor de lipoproteína de baixa densidade é uma classe de receptores de superfície celular altamente conservada com ampla função no transporte de material, internalização de macromoléculas da superfície celular e sinalização celular. Megalina é um receptor endocítico epitelial multiligante, que está bem caracterizado no rim e íleo adultos onde ele forma um complexo essencial para absorção de proteína, lipídeo e vitamina. Ele também é expresso sobre as superfícies apicais de células epiteliais que revestem regiões específicas dos tratos reprodutivos masculino e feminino e na vesícula seminal (rato) onde ele age como um receptor endocítico para a vesícula seminal. Camundongos "knockout" para megalina desenvolvem deficiência de vitamina D e doença óssea devido a uma inabilidade dos túbuIos proximais dos rins em capturar os complexos DBP/25-(OH)D3 do filtrado glomerular (Willnow et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 93, 8460). Da mesma maneira, camundongos "knockout" específicos para magalina renal têm deficiência plasmática severa de vitamina D, hipocalcemia e doença óssea grave, como o camundongo "knockout" completo para megalina (Leheste et al. (2003) FASEB J 17(2):247. Seus esqueletos são caracterizados por uma diminuição do conteúdo mineral ósseo, um aumento nas superfícies osteóides e ausência de atividade mineralizante. Esses aspectos são consistentes com osteomalácia como uma conseqüência de hipovitaminose D e demonstram a importância crucial da via de megalina para a homeostase sistêmica de cálcio e metabolismo ósseo.
LRP2 (IPI00024292.1) foi identificado como um ligante de esclerostina na fração de sobrenadante e de purificação de membrana de HEK293 em um ensaio de ligação de Purificação por Afinidade em Tandem. LRP2 é considerado ser um importante ligante de esclerostina ou é parte de 30 um complexo múltiplo que consiste pelo menos em esclerostina. A esclerostina é expressa no rim (Balemans e Van Hul (2002) Developmental Biology 250, 231). Consequentemente, LRP2 pode interagir com esclerostina no rim modulando aí, em uma ação ainda não caracterizada. Além disso, LRP2 pode estar envolvido na internalização de esclerostina no osso e subsequente degradação, modulando sua ação.
Proteína-4 relacionada ao receptor de lipoproteína de baixa densidade (LRP4, também conhecido como Meqf7)
Megf7 é um membro da família de receptor de lipoproteína de baixa densidade. Camundongos deficientes em LRP4 apresentam polissindactilia dos membros anteriores e posteriores. A sindactilia também é um aspecto típico de níveis anormais de esclerostina (ambos, a ausência de 10 esclerostina em pacientes com esclerosteose e a superexpressão de esclerostina em camundongos resultam em sindactilia). Ambas as proteínas LRP4 e esclerostina desempenham um papel na formação do sulco ectodérmico apical (ERA) e são expressas no dia 9,5 embrionário. Além disso, ambas, esclerostina e LRP4, podem antagonizar a sinalização de Wnt canônica. 15 (Johnson EB, et al. (2005) Hum Mol Genet. 14(22):3523)(Simon-Chazottes D, et al. (2006) Genomics 87(5):673)(Loots GG, et al. (2005) Genome Res. 15(7):928-35).
Como descrito aqui em mais detalhes,LRP4 (IPI00306851.3) foi identificado como um ligante de esclerostina na fração de membrana de cé20 lulas UMR106 e Hek293 de um ensaio de ligação de Purificação por Afinidade em Tandem. LRP4 é acreditado ser um ligante importante de esclerostina ou é parte de um complexo múltiplo que consiste pelo menos em esclerostina, a interação entre os quais é capaz de induzir um re-enovelamento de esclerostina em uma conformação mais estável (modulando,portanto, a ação 25 de esclerostina). Além disso, LRP4 mostrou agir como um intensificador da ação de esclerostina no seu papel como inibidora da sinalização de Wnt. Proteína-6 relacionada ao receptor de lipoproteína de baixa densidade (LRP6)
LRP6 é essencial para a via de sinalização de Wnt/beta catenina, atuando como um correceptor junto com Frizzled para Wnt. LRP6 se liga a DKK1 com alta afinidade. Essa interação com DKK1 bloqueia a sinalização de Wnt/beta catenina mediada por LRP6. Foi mostrado recentemente que a esclerostina - como DKK1 - atua in vitro como um ligante para LRP6 e dessa maneira inibe a sinalização de Wnt (Semenov et al (2005) J Biol Chem. 280(29):26770).
LRP6 (IPI00000203.1) foi identificado como um ligante de escle5 rostina na fração de membrana de cultura de célula Hek293 e UMR106 osteoblática de um ensaio de ligação de Purificação por Afinidade em Tandem. Esses achados sugerem que a esclerostina exerce parte de sua ação in vivo através da interação com LRP6. Isso também enfatiza a relevância dos achados dos experimentos de ensaio de ligação de Purificação por Afinidade 10 em Tandem e, portanto, é visto como um controle positivo.
Tenascina C
Tenascina C é uma grande proteína multimérica da matriz extracelular de 240 kDa, incluindo repetições heptavalentes, repetições semelhantes a EGF, domínios tipo Ill de fibronectina e um domínio globular ΟΙ 5 terminal partilhado com fibrinogênios. Tenascinas são sintetizadas primariamente por células em tecidos conectivos (Chiquet-Ehrismann R (2004) Int. J. Biochem. Cell Biol.; 36(6):986). Elas são classificadas como proteínas que modulam a adesão por que, ao contrário de outras proteínas da matriz extracelular, as tenascinas promovem apenas um acoplamento fraco e a dis20 persão celular é limitada (Orend G e Chiquet-Ehrismann R (2000) Exp. Cell Res.;261(1):104).
A tenascina-C pode impactar várias moléculas de sinalização intracelular, como FAK, RhoA, proteína quinase dependente de cGMP e 14-
3 tau. Ela pode se ligar diretamente e ativar um receptor de EGF (Chiquet25 Ehrismann R and Tucker RP (2004) Int.J.Biochem.Cell Biol.; 36 (6): 1085). Tenascina-C suporta a diferenciação de células cultivadas semelhantes a osteoblastos (Mackie EJ and Ramsey S (1996) J.Cell Sci.; 109 (Pt 6): 1597). Em ulna de rato, a detecção imuno-histoquímica mostra que apenas osteócitos dentro do osso novo formado em resposta à carga foram fortemente co30 rados para tenascina-C. Os osteócitos que se tornaram embebidos mais recentemente, isto é, aqueles mais perto da superfície do periósteo, não foram corados (Webb CM, et al (1997) J.Bone Miner.Res.; 12 (1):52). Tenascina-C influencia a sinalização de integrina e sindecano (Huang W, et al (2001) Cancer Res.; 61 (23):8586).
Em pacientes hipertensos, a tenascina-C é induzida em resposta a BMPR2s mutados (Ihida-Stansbury K, et al (2006) Am.J.Physiol Lung Cell 5 Mol.Physiol.; 291 (4):L694). A expressão de tenascina-C é suprimida por Wnt7a em cultura de célula de broto de pata de pinto de alta densidade (Stott NS, Jiang TX and Chuong CM (1999) J.Cell Physiol.; 180 (3):314), e em fibroblastos de embrião de pinto, TGFb induz a expressão de tenascina. (Pearson CA, et al (1988) EMBO J.; 7 (10):2977). Tenascina-C aumenta o 10 desenvolvimento axonal de neurônios granulosos cerebelares de rato através da interação com integrina alfa7beta1 (Mercado ML, et al (2004) J.Neurosci.; 24(1):238).
Como descrito aqui em mais detalhes, tenascina-C (IPI00403938.1) foi identificada como um ligante de esclerostina na fração de sobrenadante de cultura de células UMR106 de um ensaio de ligação de Purificação por Afinidade em Tandem. Tenascina-C é acreditada ser um ligante importante de esclerostina ou é parte de um complexo múltiplo que consiste pelo menos em esclerostina. Essa interação induz um reenovelamento de esclerostina em uma conformação mais estável e/ou inicia a interação funcional entre Tenascina-C e a sinalização de BMP, fornecendo dessa maneira uma ligação entre esclerostina e a sinalização de BMP. Igualmente, a interação entre tenascina-C e esclerostina inicia a interação funcional entre tenascina-C e a sinalização de Wnt, fornecendo desse modo uma ligação entre esclerostina e a sinalização de Wnt. Além disso, ela está envolvida no desenvolvimento de osteócitos ou uma combinação desses mecanismos.
Proteínas com Motivos Tripartidos (TRIM) (TRIM26. TRIM41)
A família da proteína com motivo tripartido (TRIM) é uma família em expansão de proteínas RING ("novo gene realmente interessante"), também conhecidas como proteínas RBCC já que elas contêm um motivo RBCC, que compreende um domínio RING, uma ou duas B-boxes e uma região de super-hélice predita. Proteínas TRIM/RBCC estão envolvidas em uma ampla faixa de processos biológicos, incluindo proliferação celular, diferenciação, desenvolvimento, oncogênese e apoptose. A presença do domínio RING e sua forte associação para ubiquitinação sugere um papel dessa família de proteína no processo de ubiquitinação. (Meroni G, et al. (2005) 5 Bioessays. 27 (11):1147)(Nisole S, et al. (2005) Nat.Rev.Microbiol. 3 (10):799).
Como descrito em mais detalhes aqui, TRIM26 (IPI00010948.2) foi identificada na fração de membrana de Hek293 de um ensaio de ligação de Purificação por Afinidade em Tandem e TRIM41 (IPI00414221.1) como 10 um ligante de esclerostina na fração de membrana de Hek293 e UMr106 de um ensaio de ligação de Purificação por Afinidade em Tandem. TRIM26 e TRIM41 são acreditadas serem importantes Iigantes de esclerostina ou parte de um complexo múltiplo que consiste em pelo menos esclerostina, entre as quais a interação é capaz de induzir a degradação de esclerostina. TRIM 15 junto com LRP2 pode estar envolvida na internalização de esclerostina e subsequente degradação.
Receptor de IL-17
O receptor de IL-17A (IL17RA) é uma proteína transmembrana de passagem única de aproximadamente 130 kDa e tem uma cauda cito20 plasmática extraordinariamente grande, Enquanto a citocina IL-17A é expressa apenas por células T, seu receptor é abundantemente expresso. Como conseqüência, IL-17 pode atuar sobre uma grande variedade de células para desencadear a expressão de efetores inflamatórios. A maioria desses efetores mostraram ter impacto sobre o metabolismo ósseo tanto pela 25 promoção da osteoclastogênese quanto por exercer um efeito protetor ósseo. (Gaffen SL (2004) Arthritis Res.Ther.; 6 (6):240).
A maioria dos fatores induzidos por IL-17 tendem a fazer reabsorção óssea. Por exemplo, IL-6 mostrou ser um fator contribuinte para a perda óssea mediada por estrogênio (Jilka RL et al. (1992) Scien30 ce;257(5066):88). Em camundongos que superexpressam IL-17, a erosão óssea é mediada por RANKL (Lubberts E et al. (2003) J. Immunol.;170(5):2655). IL-17 não está envolvida na regulação fisiológica da homeostase óssea devido a ausência de diferença na densidade mineral óssea, desenvolvimento esquelético assim como reabsorção óssea e parâmetros de formação óssea em camundongos IL-1T1' comparados com ninhadas de tipo selvagem. Entretanto, em um modelo induzido por LPS de destruição 5 óssea inflamatória, o nível de reabsorção óssea foi muito menos pronunciado e a formação de osteoclastos significativamente reduzida em camundongos IL-17'/_ comparados com camundongos de tipo selvagem, sugerindo que células Th17 estão envolvidas na osteoclastogênese mediada por célula T.
A indução de RANKL mediada por IL-17 e as citocinas inflamatórias, tais como TNFa e IL-1, foram sugeridas estar envolvidas naquele processo (Sato K et al. (2006) J Exp. Med.; 203(12):2673). IL-17 também é um indutor potente do recrutamento e ativação de neutrófilo, devido em grande parte à sua habilidade em promover secreção de quimiocina. Acredita-se que os neutrófilos contribuem para a destruição óssea durante a inflamação crônica. Entretanto, os neutrófilos são considerados geralmente ser protetores ósseos no contexto da perda óssea induzida por doença periodontal (Kantarci A, Oyaizu Z e Van Dyke TE (2003) J. Periodontol.; 74(1 ):66). A sinalização de IL-17RA é pouquíssimo definida. As vias implicadas podem incluir a via de NF-KB, a família C/EBP assim como MAPK e GSK3p envolvida na fosforilação de C/EBP, ERK1 e 2, JNK, p38 e PI-3K/Akt (Gaffen SL, et al. (2006) Vitam. Horm.;74:255-82.:255).
Como descrito em mais detalhes aqui, IL17RA (IPI00304993.3) foi identificado como um ligante de esclerostina na fração de membrana de Hek293 em um ensaio de ligação de Purificação por Afinidade em Tandem. 25 IL-17RA, ou IL-17RB, IL-17RC, IL-17RD e IL-17RE são acreditadas serem importantes Iigantes de esclerostina ou são parte de um complexo múltiplo que consiste pelo menos em esclerostina, cuja interação entre elas é capaz de induzir um re-enovelamento de esclerostina para uma conformação mais estável e/ou iniciar a interação funcional entre o receptor de IL-17 e a sinali30 zação de BMP, fornecendo dessa maneira uma ligação entre a esclerostina e a sinalização de BMP. Igualmente, a interação entre o receptor de IL-17 e a esclerostina inicia a interação funcional entre o receptor de IL-17 e a sinalização de Wnt, fornecendo dessa maneira uma ligação entre a esclerostina e a sinalização de Wnt. Além disso, ela está envolvida no desenvolvimento de osteócitos ou uma combinação desses mecanismos.
Fosfatase Alcalina (ALPL)
5 Na maioria dos mamíferos existem quatro isoenzimas diferentes:
placentária, semelhante à placentária, intestinal e tecidual não-específica (fígado/osso/rim, ALPL). Defeitos na fosfatase alcalina de fígado/osso/rim (ALPL) são a causa de hipofosfatasia infantil, uma doença metabólica herdada do osso caracterizada por mineralização óssea defeituosa, sugerindo 10 que ALPL desempenha um papel na mineralização do esqueleto (Fedde KN et al. (1999) JBMR 14(12):2015-2026).
ALPL é um marcador da formação óssea. Durante a osteogênese, a fosfatase alcalina não é detectada nos ósteo-progenitores. Sua expressão se inicia uma vez que a capacidade proliferativa das colônias de proteo15 blastos é perdida e a formação de nódulo é iniciada. A expressão é mantida desse ponto em diante (Liu et al. (1994) Devei. Biol. 166:220-234). Várias BMPs têm sido descritas como indutoras de fosfatase alcalina em células semelhantes a osteoblastos (Cheng H et al., (2003) J Bone Joint Surg. Am 85:1544-1552). Além disso, Rawadi G et al. (2003) mostraram que BMP-2
- 20 controla a expressão de fosfatase alcalina por uma alça autócrina de Wnt (JBMR 18(10)1842:1853).
Como descrito aqui em mais detalhes, ALPL (IPI00327143.1) foi identifica como ligante de esclerostina na fração sobrenadante de cultura de célula UMR106 de um ensaio de ligação de Purificação por Afinidade em 25 Tandem. ALPL é acredita ser um importante ligante de esclerostina ou é parte de um complexo múltiplo que consiste pelo menos em esclerostina. Além disso, SOST foi mostrada inibir diretamente a atividade enzimática de ALPL baseado em um ensaio acelular.
Ensaios de Rastreamento 30 A invenção fornece métodos (também referidos aqui como "en
saios de rastreamento") para identificar moduladores, por exemplo, candidatos ou compostos ou agentes de teste (um anticorpo, um Arcabouço semeIhante a Anticorpo, uma molécula pequena, proteína de fusão, peptídeo, mimético ou nucleotídeo inibitório (por exemplo, RNAi)) que se ligam à esclerostina ou a um ligante de esclerostina ou para proteínas membros de complexos relacionados e que tem um efeito estimulante ou inibidor sobre, por 5 exemplo, a atividade ou expressão de esclerostina.
Os ditos métodos incluem métodos para identificar candidatos ou compostos ou agentes de teste capazes de modular a interação de esclerostina:ligante de esclerostina, cujo método compreende medir a alteração da interação de esclerostina com um ligante de esclerostina, ocasionada por 10 tal agente. Preferivelmente, o dito método compreende as etapas de: a) contatar a esclerostina com um ligante de esclerostina na presença e na ausência de um agente de teste, sob condições que permitam a interação do ligante de esclerostina com a esclerostina; e b) medir a interação do ligante de esclerostina com esclerostina na presença e na ausência do dito agente de 15 teste, em que (i) uma diminuição na interação de esclerostina:ligante de esclerostina na presença do agente de teste, em relação à interação na ausência do agente de teste, identifica o agente de teste como um agonista da interação de esclerostina:ligante de esclerostina e em que (ii) um aumento na interação na presença do agente de teste, em relação à interação na ausên20 cia do agente de teste, identifica o agente de teste como um antagonista da interação de esclerostina-ligante de esclerostina.
A inibição da interação de esclerostina:ligante de esclerostina ocorre no caso de um antagonista, inibidor, modulador negativo ou regulador negativo de esclerostina ou de um ligante de esclerostina. O antagonista tem 25 o efeito de reduzir ou bloquear completamente a ligação do ligante de esclerostina com esclerostina. O antagonista pode diminuir a ligação de esclerostina a um ligante de esclerostina em pelo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% ou 90% na presença do antagonista, quando comparado com a ligação na ausência de antagonista ou em uma quantidade na média 30 entre quaisquer dois dos valores mencionados acima. Preferivelmente, o antagonista diminui a dita ligação em pelo menos 10%. A ligação pode ser determinada, por exemplo, pela medida da constante de ligação usando quaisquer métodos bioquímicos e/ou biofísicos aqui descritos.
Em uma modalidade, a presente invenção fornece métodos para identificar um agente capaz de modular a interação esclerostina:Frem2, cujo método compreende medir a alteração de esclerostina ligada a Frem2 oca5 sionada pelo dito agente. Em outra modalidade, a presente invenção fornece métodos para identificar um agente capaz de modular a interação esclerostina:Versicano (CSPG2), cujo método compreende medir a alteração de esclerostina ligada a Versicano ocasionada pelo dito agente. Em outra modalidade ainda, a presente invenção fornece métodos para identificar um agente 10 capaz de modular a interação esclerostina:Fibrilina 2 (FBN2) cujo método compreende medir a alteração de esclerostina ligada à Fibrilina 2 ocasionada pelo dito agente. Em outra modalidade ainda, a presente invenção fornece métodos para identificar um agente capaz de modular a interação escle
________rostina:C6orf93„cujo_método_compreende.medir a.alteração de esclerostina
ligada a C6orf93 ocasionada pelo dito agente. Em outra modalidade, a presente invenção fornece métodos para identificar um agente capaz de modular a interação esclerostina:Sindecano-4 (Sdc4), cujo método compreende medir a alteração de esclerostina ligada a Sindecano-4 ocasionada pelo dito agente. Em outra modalidade ainda, a presente invenção fornece métodos 20 para identificar um agente capaz de modular a interação esclerostina:Agrina (AGRN), cujo método compreende medir a alteração de esclerostina ligada à Agrina ocasionada pelo dito agente. Em outra modalidade ainda, a presente invenção fornece métodos para identificar um agente capaz de modular a interação esclerostina:Serpina2 (PN-1), cujo método compreende medir a 25 alteração de esclerostina ligada a Serpina2 ocasionada pelo dito agente.
Em ainda outra modalidade, a presente invenção fornece métodos para identificar um agente capaz de modular a interação de esclerostina:SLIT2, cujo método compreende medir a alteração de esclerostina ligada a SLIT2 ocasionada pelo dito agente. Em ainda outra modalidade, a presen30 te invenção fornece métodos para identificar um agente capaz de modular a interação de esclerostina.Glipicanol, cujo método compreende medir a alteração de esclerostina ligada a Glipicanol ocasionada pelo dito agente. Em ainda outra modalidade, a presente invenção fornece métodos para identificar um agente capaz de modular a interação de esclerostina:LRP2, cujo método compreende medir a alteração de esclerostina ligada a LRP2 ocasionada pelo dito agente. Em ainda outra modalidade, a presente invenção forne5 ce métodos para identificar um agente capaz de modular a interação de esclerostina:LRP4, cujo método compreende medir a alteração de esclerostina ligada a LRP4 ocasionada pelo dito agente. Em ainda outra modalidade, a presente invenção fornece métodos para identificar um agente capaz de modular a interação de esclerostina:LRP6, cujo método compreende medir a 10 alteração de esclerostina ligada a LRP6 ocasionada pelo dito agente. Em ainda outra modalidade, a presente invenção fornece métodos para identificar um agente capaz de modular a interação de esclerostina:Tenascina C, cujo método compreende medir a alteração de esclerostina ligada à Tenascina-C ocasionada- pelo-dito agente. Em ainda outra modalidade, a presente 15 invenção fornece métodos para identificar um agente capaz de modular a interação de esclerostina:TRIM26, cujo método compreende medir a alteração de esclerostina ligada a TRIM26 ocasionada pelo dito agente. Em ainda outra modalidade, a presente invenção fornece métodos para identificar um agente capaz de modular a interação de esclerostina:TRIM41, cujo método 20 compreende medir a alteração de esclerostina ligada a TRIM41 ocasionada pelo dito agente. Em ainda outra modalidade, a presente invenção fornece métodos para identificar um agente capaz de modular a interação de esclerostina: IL17-R, cujo método compreende medir a alteração de esclerostina ligada a IL17-R ocasionada pelo dito agente. Em ainda outra modalidade, a 25 presente invenção fornece métodos para identificar um agente capaz de modular a interação de esclerostina:ALPL, cujo método compreende medir a alteração de esclerostina ligada a ALPL ocasionada pelo dito agente.
O candidato ou composto ou agente de teste pode ser um anticorpo, um arcabouço semelhante a anticorpo, uma molécula pequena, proteína de fusão, peptídeo, mimético ou nucleotídeo inibitório (por exemplo, RNAi) direcionado contra (i) esclerostina; (ii) ligante de esclerostina; (iii) um sítio novo (por exemplo, um determinante epitópico recentemente criado) criado pela interação de esclerostina:ligante de esclerostina ou (iv) um complexo de proteína que compreende qualquer um dos mesmos.
Alterações na interação de esclerostina:ligante de esclerostina, atividade de proteína de esclerostina ou ligante de esclerostina e/ou ativida5 de da via de esclerostina podem ser medidas por PCR, Taqman PCR, sistemas de apresentação em fago, eletroforese em gel, ensaio com gene repórter, ensaio duplo híbrido de levedura, análise Northern ou Western, imuno-histoquímica, uma câmara de cintilação convencional, uma gamacâmara, um rastreador retilíneo, um rastreador PET, um rastreador SPECT, 10 um rastreador de MRI, um rastreador de RMN ou uma máquina de raios X. As alterações também podem ser medidas usando um método selecionado entre deslocamento do marcador, ressonância de plasma de superfície, transferência de energia por ressonância fluorescente (FRET) ou transferên
* cia de energia por ressonância bioluminescente (BRET), extinção de fluorescência e polarização de fluorescência.
A alteração na atividade de proteína de esclerostina ou ligante de esclerostina e/ou atividade da via de esclerostina pode ser detectada pela detecção de uma alteração na interação de esclerostina:ligante de esclerostina, pela detecção do nível de esclerostina:ligante de esclerostina ou pela 20 detecção de uma alteração no nível de uma ou mais proteínas da via de esclerostina. As células, nas quais o acima descrito pode ser detectado, podem ser de osso, mesenquimais, de rim (por exemplo, HEK) ou de origem hematopoiética, podem ser células cultivadas ou podem ser obtidas de ou podem estar dentro de um organismo transgênico. Tais organismos transgênicos 25 incluem, mas não são limitados a um camundongo, rato, coelho, ovelha, vaca ou primata.
Para os experimentos de rastreamento que envolvem alterações na interação de esclerostina-ligante de esclerostina, células que expressam a esclerostina ou Iigantes de esclerostina podem ser incubadas em tampão 30 de ligação com um ligante de esclerostina marcado na presença ou ausência de concentrações crescentes de um candidato a agente. Para validar e calibrar o ensaio, podem ser realizadas reações de competição de controle usando concentrações crescentes de ligante de esclerostina não marcado. Após a incubação, é realizada uma etapa de lavagem para remover ligante de esclerostina não ligado. O ligante de esclerostina marcado, ligado é medido como apropriado para o dado marcador (por exemplo, contagem de 5 cintilação, fluorescência, coloração de anticorpo, etc.). Uma diminuição de pelo menos 10% (por exemplo, pelo menos 20%, 30%, 40%, 50% ou 60%) na quantidade de ligante de esclerostina marcado ligado na presença do candidato a agente indica deslocamento de ligação pelo candidato a agente.
O candidato a agente pode ser considerado ligar especificamen10 te nesse ou em outros ensaios descritos aqui, se ele desloca pelo menos 10%,20%, 30%, 40%, 50%, 60% e, preferivelmente pelo menos 10% de ligante de esclerostina marcado (dose subsaturante de ligante de esclerostina) em uma concentração de 1 mM ou menos. É claro, os papéis de ligante de esclerostina e esclerostina podem ser alterados; o técnico experiente po15 de adaptar o método e assim a esclerostina é aplicada ao ligante de esclerostina na presença de várias concentrações de candidato a agente para determinar as alterações na interação de esclerostina:ligante de esclerostina.
As alterações da interação de esclerostina:ligante de esclerostina podem ser monitorizadas por ressonância de plasma de superfície (SPR). Os ensaios de ressonância de plasma de superfície podem ser usados como um método quantitativo para medir a ligação entre duas moléculas pela alteração na massa próxima a um sensor imobilizado, causada pela ligação ou perda de ligação do ligante de esclerostina da fase aquosa para a esclerostina imobilizada sobre o sensor. Essa alteração na massa é medida como unidade de ressonância versus o tempo após a injeção ou remoção do ligante de esclerostina ou candidato a agente e é medida usando um Biacore Biosensor (Biacore AB). A esclerostina pode ser imobilizada sobre um chip sensor (por exemplo, chip CM5 da classe de pesquisa; Biacore AB) de acordo com métodos descritos por Salamon et al. (Salamon et al., 1996, Biophys J. 71:283-294; Salamon et al., 2001, Biophys J. 80:1557-1567; Salamon et al., 1999, Trends Biochem Sei. 24:213-219, cada um dos quais está incorporado aqui por referência). Sarrio et al. demonstraram que SPR pode ser usada para detectar um ligante que se liga ao receptor de adenosina GPCR A(1) imobilizado em uma camada lipídica sobre o chip (Sarrio et al., 2000, Mol. Cell Biol. 20:5164-5174, incorporado aqui por referência). Condições para 5 ligação de ligante de esclerostina a esclerostina em um ensaio de SPR podem ser ajustadas por aquele versado na técnica usando as condições descritas por Sarrio et al. como ponto de partida.
SPR pode ensaiar inibidores de ligação em pelo menos duas maneiras. Primeiro, o ligante de esclerostina pode ser pré-ligado à esclerostina imobilizada, seguido pela injeção de um candidato a agente em uma concentração que varia de 0,1 nM a 1 μΜ. O deslocamento do ligante de esclerostina ligação pode ser quantificado, permitindo a detecção da ligação de inibidor. Alternativamente, a esclerostina ligada ao chip pode ser préincubada com o candidato a agente e estimulada com ligante de esclerostina. Uma diferença no ligante de esclerostina que se liga à esclerostina exposta ao inibidor em relação àquela sobre o chip não exposta ao inibidor demonstrará ligação ou deslocamento do ligante de esclerostina na presença do inibidor. Em qualquer ensaio, uma diminuição de 10% (por exemplo, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%) ou mais na quantidade de ligante de esclerostina ligado na presença de candidato a agente, em relação à quantidade de um ligante de esclerostina ligado na ausência de candidato a agente demonstrará que o candidato a agente inibe a interação de esclerostina e ligante de esclerostina. Embora a esclerostina esteja imobilizada acima, o técnico experiente pode adaptar prontamente o método, tal que o ligante de esclerostina seja o componente imobilizado.
Outro método para detectar a inibição de ligação de ligante de esclerostina à esclerostina usa a transferência de energia por ressonância fluorescente (FRET). FRET é um fenômeno quântico mecânico que ocorre entre um doador de fluorescência (D) e um aceptor de fluorescência (A) em 30 estreita proximidade um com o outro (geralmente <100 angstroms de separação) se o espectro de emissão de D se superpõe ao espectro de excitação de A. As moléculas a serem testadas, por exemplo, ligante de esclerostina e esclerostina, são marcadas com um par complementar de fluoróforos doador e aceptor. Apesar de intimamente ligados pela interação de esclerostina:ligante de esclerostina, a fluorescência emitida após a excitação do fluoróforo doador terá um comprimento de onda diferente daquele emitido em resposta àquele comprimento de onda de excitação quando o ligante de esclerostina e a esclerostina não estão ligados, fornecendo a quantificação de moléculas ligadas versus não ligadas pela medida da intensidade de emissão de cada comprimento de onda. Fluoróforos doadores com os quais se marca a esclerostina são bem-conhecidos na técnica. De interesse particular, são as variantes GPF de A. Victoria conhecidas como Cyan FP (CFP, Doador (D)) e Yellow FP, YFP, Aceptor (A)). Como um exemplo, a variante YFP pode ser feita como uma proteína de fusão com esclerostina. Vetores para a expressão de variantes de GFP como fusões (CIontech) assim como compostos Iigantes de esclerostina marcados com fluoróforo (Molecular Probes) são conhecidos na técnica.
A adição de um candidato a agente à mistura de ligante de esclerostina marcado e YFP-esclerostina resultará em uma inibição da transferência de energia evidenciada, por exemplo, por uma diminuição na fluorescência de YFP em relação à amostra sem o candidato a agente. Em um en20 saio que usa FRET para a detecção da interação de esclerostina:ligante de esclerostina, uma diminuição de 10% ou mais (por exemplo, igual ou maior do que 20%, 30%, 40%, 50%, 60%) na intensidade de emissão fluorescente no comprimento de onda do aceptor em amostras que contêm um candidato a agente, em relação a amostras sem o candidato a agente, indica que o 25 candidato a agente inibe a interação de esclerostina:ligante de esclerostina. Inversamente, um aumento de 10% ou mais(por exemplo, igual ou maior do que 20%, 30%, 40%, 50%, 60%) na intensidade de emissão fluorescente no comprimento de onda do aceptor em amostras que contêm um candidato a agente, em relação a amostras sem o candidato a agente, indica que o can30 didato a agente induz uma alteração conformacional e intensifica a interação de esclerostina:ligante de esclerostina.
Uma variação de FRET usa a extinção da fluorescência para monitorizar interações moleculares. Uma molécula no par interagente pode ser marcada com um fluoróforo e a outra com uma molécula que extingue a fluorescência do fluoróforo quando colocada em íntima justaposição com ele. Uma alteração na fluorescência após a excitação é indicativa de uma altera5 ção na associação das moléculas marcadas com o par fluoróforo:extintor. Geralmente, um aumento na fluorescência da esclerostina marcada é indicativo de que a molécula de ligante de esclerostina que abriga o extintor foi deslocada. É claro, um efeito similar pode surgir quando o ligante de esclerostina é marcado com o fluoróforo e a esclerostina abriga o extintor. Em 10 ensaios de extinção, um aumento de 10% ou mais (por exemplo, igual ou maior do que 20%, 30%, 40%, 50%, 60%) na intensidade de emissão fluorescente em amostras que contêm um candidato a agente, em relação a amostras sem o candidato a agente, indica que o candidato a agente inibe a interação de esclerostina:ligante de esclerostina. Inversamente, uma diminu15 ição de 10% ou mais (por exemplo, igual ou maior do que 20%, 30%, 40%, 50%, 60%) na intensidade de emissão fluorescente em amostras que contêm um candidato a agente, em relação a amostras sem o candidato a agente, indica que o candidato induz uma alteração conformacional e intensifica a interação de esclerostina:ligante de esclerostina.
Em adição a métodos de ressonância de plasma de superfície e
FRET, a medida da polarização da fluorescência é útil para quantificar a ligação. O valor da polarização da fluorescência para uma molécula fluorescentemente marcada depende do tempo de correlação rotacional ou taxa de rotação, Complexos, tais como aqueles formados pela esclerostina associa25 da com um ligante de esclerostina fluorescentemente marcado, têm valores de polarização mais elevados do que o ligante de esclerostina marcado não complexado. A inclusão de um candidato a agente da interação de esclerostina:ligante de esclerostina resulta em uma diminuição da polarização da fluorescência, em relação a uma mistura sem o candidato a agente, se o 30 candidato a agente rompe ou inibe a interação de esclerostina com o ligante de esclerostina. A polarização da fluorescência é bem adequada para a identificação de moléculas pequenas que rompem a formação de complexos. Uma diminuição de 10% ou mais (por exemplo, igual ou maior do que 20%, 30%, 40%, 50%, 60%) na polarização da fluorescência em amostras que contêm um candidato a agente, em relação à polarização da fluorescência em uma amostra sem o candidato a agente, indica que o candidato a agente 5 inibe a interação de esclerostina:ligante de esclerostina.
Outro sistema de detecção é a transferência de energia por ressonância bioluminescente (BRET), que usa a transferência luminosa entre proteínas de fusão que contêm uma Iuciferase bioluminescente e um aceptor de fluorescência. Em geral, uma molécula do par da interação de esclerosti10 na:ligante de esclerostina é fundida com uma Iuciferase (por exemplo, RenilIa Iuciferase (RIuc)) - um doador que emite luminosidade no comprimento de onda de ~395 nm na presença de um substrato de Iuciferase (por exemplo, DeepBIueC). A outra molécula do par é fundida com uma proteína aceptora de fluorescência que pode absorver luminosidade do doador e emitir Iumino15 sidade em um comprimento de onda diferente. Um exemplo de uma proteína fluorescente é GFP (proteína verde fluorescente) que emite luminosidade em ~510 nm. A adição de um candidato a agente a mistura de doador fundido com ligante de esclerostina e aceptor fundido com esclerostina resultará em uma inibição da transferência de energia evidenciada, por exemplo, por uma 20 diminuição na fluorescência do aceptor em relação a uma amostra sem candidato a agente. Em um ensaio usando BRET para a detecção da interação de esclerostina:ligante de esclerostina, uma diminuição de 10% ou mais (por exemplo, igual ou maior do que 20%, 30%, 40%, 50%, 60%) na intensidade de emissão de fluorescência no comprimento de onda do aceptor em amos25 tras que contêm um candidato a agente, em relação a amostras sem candidato a agente, indica que o candidato a agente inibe a interação de esclerostina:ligante de esclerostina. Inversamente, um aumento de 10% ou mais (por exemplo, igual ou maior do que 20%, 30%, 40%, 50%, 60%) na intensidade de emissão fluorescente no comprimento de onda do aceptor em amostras 30 que contêm um candidato a agente, em relação a amostras sem o candidato a agente, indica que o candidato induz uma alteração conformacional e intensifica a interação de esclerostina:ligante de esclerostina. Deve ficar compreendido que qualquer um dos ensaios de ligação aqui descritos pode ser realizado com um não Iigante de Iigante de esclerostina (por exemplo, agonista, antagonista, etc), por exemplo, uma molécula pequena identificada como aqui descrito ou miméticos de Iigante de es5 clerostina incluindo, mas não limitado a qualquer um peptídeo natural ou sintético, um polipeptídeo, um anticorpo ou seu fragmento que se ligue ao antígeno, um lipídeo, um carboidrato e uma pequena molécula orgânica.
Qualquer um dos ensaios de ligação descritos aqui pode ser usado para determinar a presença de um inibidor em uma amostra, por e10 xemplo, uma amostra de tecido, que se ligue à esclerostina ou que afete a ligação do Iigante de esclerostina com a esclerostina. Para fazer isso, a esclerostina é reagida com o Iigante de esclerostina na presença ou ausência da amostra e a ligação é medida como apropriado para o ensaio de ligação a ser usado. Uma diminuição de 10% ou mais (por exemplo, igual ou maior 15 do que 20%, 30%, 40%, 50%, 60%) na ligação de Iigante de esclerostina indica que a amostra contém um inibidor que modula a ligação de Iigante de esclerostina com a esclerostina. Os ensaios de ligação FRET e BRET descritos também podem ser usados para determinar a presença de um intensificador em uma amostra, por exemplo, uma amostra de tecido e a ligação é •20 medida como apropriado para o ensaio de ligação a ser usado. Um aumento de 10% ou mais (por exemplo, igual ou maior do que 20%, 30%, 40%, 50%, 60%) na ligação de Iigante de esclerostina indica que a amostra contém um intensificador que modula a ligação do Iigante de esclerostina à esclerostina.
Qualquer um dos ensaios descritos também pode ser usado pa25 ra determinar a presença de um inibidor em uma biblioteca de compostos. Os ensaios de ligação FRET e BRET descritos também podem ser usados para determinar a presença de um intensificador em uma biblioteca de compostos. Tais técnicas de rastreamento que usam, por exemplo, rastreamento de alto desempenho, são bem-conhecidos na técnica.
A presente invenção também fornece métodos para identificar
um agente capaz de modular a interação de esclerostina:ligante de esclerostina, cujo método compreende medir a resposta de sinalização induzida pela interação de esclerostina:ligante de esclerostina na presença do dito agente e compará-la com a resposta de sinalização induzida pela interação de esclerostina:ligante de esclerostina na ausência do dito agente. Preferivelmente, o dito método compreende as etapas de: a) contatar a esclerostina com 5 um Iigante de esclerostina na presença e na ausência de um agente de teste sob condições que permitem a interação de esclerostina:ligante de esclerostina; e b) medir a resposta de sinalização induzida pela interação de esclerostina:ligante de esclerostina, em que uma alteração na resposta na presença do agente de teste em pelo menos 10% comparada com a resposta 10 na ausência de agente de teste indica que o agente de teste é identificado como capaz de modular a interação de esclerostina:ligante de esclerostina.
Um aumento na resposta de sinalização na presença de um agente de teste em pelo menos 10% comparada com a resposta na ausência de agente de teste identifica o agente de teste como um agonista da intera15 ção de esclerostina:ligante de esclerostina. Uma diminuição na resposta de sinalização na presença de um agente de teste em pelo menos 10% comparada com a resposta na ausência de agente de teste identifica o agente de teste como um antagonista da interação de esclerostina:ligante de esclerostina.
Moduladores da interação de esclerostina:Iigante de esclerostina
(por exemplo, aqueles identificados pelos métodos da invenção) podem alterar a resposta de sinalização induzida pela interação de esclerostina:Iigante de esclerostina em pelo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% na presença do modulador, quando comparada à sinalização na 25 ausência de modulador ou por uma quantidade na faixa entre qualquer um de dois valores acima mencionados. Preferivelmente, o modulador altera a dita sinalização em pelo menos 10%. A alteração pode ser um aumento ou uma diminuição dependendo da atividade monitorizada. A sinalização pode ser determinada por métodos conhecidos na técnica, tais como por exemplo, 30 pela medida dos níveis de sinalização usando um construto repórter como descrito abaixo.
A presente invenção fornece métodos para identificar um agente capaz de modular a interação de esclerostina:Frem2, cujo método compreende medir a resposta de sinalização induzida pela interação de esclerostina:Frem2,.na presença do dito agente e compará-la com a resposta de sinalização induzida pela interação de esclerostina:Frem2 na ausência do dito 5 agente. Em uma modalidade, a presente invenção fornece métodos para identificar um agente capaz de modular a interação de esclerostina:Versicano, cujo método compreende medir a resposta de sinalização induzida pela interação de esclerostina:Versicano na presença do dito agente e compará-la com a resposta de sinalização induzida pela interação de es10 clerostina:Versicano na ausência do dito agente. Em outra modalidade, a presente invenção fornece métodos para identificar um agente capaz de modular a interação de esclerostina:Fibrilina 2, cujo método compreende medir a resposta de sinalização induzida pela interação de esclerostina: Fibrilina 2 na presença do dito agente e compará-la com a resposta de 15 sinalização induzida pela interação de esclerostina:Fibrilina 2 na ausência do dito agente. Em outra modalidade ainda, a presente invenção fornece métodos para identificar um agente capaz de modular a interação de esclerostina:C6orf93, cujo método compreende medir a resposta de sinalização induzida pela interação de esclerostina:C6orf93 na presença do dito agente e 20 compará-la com a resposta de sinalização induzida pela interação de esclerostina:C6orf93 na ausência do dito agente. Em outra modalidade, a presente invenção fornece métodos para identificar um agente capaz de modular a interação de esclerostina:Sindecano-4, cujo método compreende medir a resposta de sinalização induzida pela interação de esclerostina:Sindecano-4 25 na presença do dito agente e compará-la com a resposta de sinalização induzida pela interação de esclerostina:Sindecano-4 na ausência do dito agente. Em outra modalidade ainda, a presente invenção fornece métodos para identificar um agente capaz de modular a interação de esclerostina:Agrina, cujo método compreende medir a resposta de sinalização induzida pela inte30 ração de esclerostina:Agrina na presença do dito agente e compará-la com a resposta de sinalização induzida pela interação de esclerostina:Agrina na ausência do dito agente. Em outra modalidade, a presente invenção fornece métodos para identificar um agente capaz de modular a interação de esclerostina:Serpina2, cujo método compreende medir a resposta de sinalização induzida pela interação de esclerostina:Serpina2 na presença do dito agente e compará-la com a resposta de sinalização induzida pela interação de es5 clerostina:Serpina2 na ausência do dito agente.
Em ainda outra modalidade, a presente invenção fornece métodos para identificar um agente capaz de modular a interação de esclerostina:LRP2, cujo método compreende medir a resposta de sinalização induzida pela interação de esclerostina:LRP2 na presença do dito agente e compará10 Ia com a resposta de sinalização induzida pela interação de esclerostina:LRP2 na ausência do dito agente. Em ainda outra modalidade, a presente invenção fornece métodos para identificar um agente capaz de modular a interação de esclerostina:LRP4, cujo método compreende medir a resposta de sinalização induzida pela interação de esclerostina:LRP4 na presença do 15 dito agente e compará-la com a resposta de sinalização induzida pela interação de esclerostina:LRP4 na ausência do dito agente. Em ainda outra modalidade, a presente invenção fornece métodos para identificar um agente capaz de modular a interação de esclerostina:LRP6, cujo método compreende medir a resposta de sinalização induzida pela interação de esclerosti20 na:LRP6 na presença do dito agente e compará-la com a resposta de sinalização induzida pela interação de esclerostina:LRP6 na ausência do dito agente. Em ainda outra modalidade, a presente invenção fornece métodos para identificar um agente capaz de modular a interação de esclerostina:Glipicano 1, cujo método compreende medir a resposta de sinalização 25 induzida pela interação de esclerostina:Glipicano 1 na presença do dito agente e compará-la com a resposta de sinalização induzida pela interação de esclerostina:Glipicano 1 na ausência do dito agente. Em ainda outra modalidade, a presente invenção fornece métodos para identificar um agente capaz de modular a interação de esclerostina:SLIT2, cujo método compre30 ende medir a resposta de sinalização induzida pela interação de esclerostina:SLIT2 na presença do dito agente e compará-la com a resposta de sinalização induzida pela interação de esclerostina:SLIT2 na ausência do dito agente. Em ainda outra modalidade, a presente invenção fornece métodos para identificar um agente capaz de modular a interação de esclerostina:Tenascina C, cujo método compreende medir a resposta de sinalização induzida pela interação de esclerostina:Tenascina C na presença do dito 5 agente e compará-la com a resposta de sinalização induzida pela interação de esclerostina:Tenascina C na ausência do dito agente. Em ainda outra modalidade, a presente invenção fornece métodos para identificar um agente capaz de modular a interação de esclerostina:IL17-R, cujo método compreende medir a resposta de sinalização induzida pela interação de escle10 rostina:IL17-R na presença do dito agente e compará-la com a resposta de sinalização induzida pela interação de esclerostina:IL17-R na ausência do dito agente. Em ainda outra modalidade, a presente invenção fornece métodos para identificar um agente capaz de modular a interação de esclerostina:TRIM26, cujo método compreende medir a resposta de sinalização indu15 zida pela interação de esclerostina:TRIM26 na presença do dito agente e compará-la com a resposta de sinalização induzida pela interação de esclerostina :TRIM26 na ausência do dito agente. Em ainda outra modalidade, a presente invenção fornece métodos para identificar um agente capaz de modular a interação de esclerostina:TRIM41, cujo método compreende me•20 dir a resposta de sinalização induzida pela interação de esclerostina:TRIM41 na presença do dito agente e compará-la com a resposta de sinalização induzida pela interação de esclerostina:TRIM41 na ausência do dito agente. Em ainda outra modalidade, a presente invenção fornece métodos para identificar um agente capaz de modular a interação de esclerostina:ALPL, 25 cujo método compreende medir a resposta de sinalização induzida pela interação de esclerostina:ALPL na presença do dito agente e compará-la com a resposta de sinalização induzida pela interação de esclerostina:ALPL na ausência do dito agente.
A resposta de sinalização é preferivelmente a resposta da via de Wnt e/ou de BMP, em cujo caso um inibidor pode causar um aumento nas atividades das vias de Wnt e/ou BMP. A resposta de sinalização pode ser determinada, por exemplo, medindo os níveis de sinalização usando um construto repórter. Por exemplo, uma célula de mamífero adequada que apresenta um Iigante de esclerostina ou esclerostina pode ser transfectada com um construto repórter que compreende um promotor que é responsivo a Wnt e/ou BMP. Quando a esclerostina liga-se a um Iigante de esclerostina, 5 inibindo as vias de Wnt e/ou BMP, a expressão de uma proteína repórter é inibida, cuja redução pode ser medida, por exemplo, por imunoensaio, fluorescência, medida de luminosidade, etc., dependendo da natureza da proteína repórter. A expressão é medida na presença e ausência de um candidato a agente.
Por meio de um exemplo específico de um ensaio baseado em
célula para medir a sinalização de Wnt, um construto repórter pode ser um vetor repórter de SuperTOPFIash (STF) Iuciferase dependente de Wnt/βcatenina, contendo dez sítios de ligação a TCF, dirigindo a expressão de cintilação de luciferase. Isso junto com um vetor de expressão de Wnt (tal 15 como construtos de expressão para Wnt de camundongo) e um vetor de expressão de Renilla (dirigido por SV40, usado para normalização) pode ser transfectado para células Hek293 ou qualquer outra linhagem celular adequada. A célula transfectada leva a ativação do repórter STF-luciferase, cuja ativação pode ser bloqueada pela esclerostina.
A presente invenção fornece um método para identificar um mi
mético de Iigante de esclerostina, cujo mimético tem efeito funcional igual, similar ou aperfeiçoado como da interação de Iigante de esclerostina com esclerostina, em que o método compreende medir a interação com esclerostina por um candidato a mimético. Preferivelmente, o dito método compreen25 de: a) contatar a esclerostina com um candidato a mimético sob condições que permitam a interação do mimético com a esclerostina; e b) medir a interação do mimético com a esclerostina, em que a interação que é pelo menos 10% daquela observada para as várias interações de esclerostina:ligante de esclerostina aqui descritas, distinguem o candidato a mimético como miméti30 co de Iigante de esclerostina da invenção.
Além disso, a presente invenção fornece um método para identificar um mimético de ligante de esclerostina, cujo mimético tem efeito funcional igual, similar ou aperfeiçoado como a interação de Iigante de esclerostina com esclerostina, em que o método compreende medir a resposta de sinalização induzida pela interação de esclerostina:mimético e compará-la com a resposta de sinalização induzida pela interação de esclerostina:ligante 5 de esclerostina. Preferivelmente, o dito método compreende: a) contatar a esclerostina com um candidato a mimético sob condições que permitam a interação do mimético com a esclerostina; e b) medir a resposta de sinalização induzida pela interação de esclerostina:mimético, em que a resposta de sinalização que é pelo menos 10% daquela observada para as várias intera10 ções de esclerostina:ligante de esclerostina aqui descritas, distinguem o candidato a mimético como mimético de Iigante de esclerostina da invenção.
Por meio de um exemplo não-limitante, a presente invenção fornece métodos para identificar miméticos de Frem2 ou LRP4 que têm efeitos funcionais iguais, similares ou melhorados como aqueles da interação entre Frem2 ou LRP4 e esclerostina sob condições fisiológicas normais.
Um mimético de Iigante de esclerostina é um composto que tem efeito funcional igual, similar ou melhorado como a ligação de Iigante de esclerostina com esclerostina. Ele pode ser um composto que contém um arranjo de grupos funcionais geralmente com grupos adicionais hidrofóbicos 20 ou carregados para imitar a conformação ativa da região Iigante da estrutura nativa do Iigante de esclerostina. Deve ser entendido que um mimético de Iigante de esclerostina também pode incluir um Iigante de esclerostina nativo ou seu derivado.
De acordo com um aspecto da invenção, um mimético exibe pe25 Io menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% da ligação de um Iigante de esclerostina com esclerostina ou um valor na média entre quaisquer dois dos valores antes mencionados. Preferivelmente, o mimético exibe pelo menos 20% da atividade de ligação do Iigante de esclerostina com a esclerostina.
De acordo com um aspecto da invenção, um mimético exibe pe
lo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% da atividade de sinalização de um Iigante de esclerostina ou um valor na média entre quaisquer dois dos valores antes mencionados. Preferivelmente, o mimético exibe pelo menos 20% da atividade de sinalização do Iigante de esclerostina.
A medida da atividade de sinalização do mimético da interação com esclerostina pode ser realizada pelos métodos aqui descritos para ou5 tros ensaios, tais como SPR e FRET.
De acordo com uma modalidade da invenção, um mimético pode ser identificado por um método que compreende as etapas de: a) contatar a esclerostina com um candidato a mimético; e b) medir a resposta de sinalização induzida pela interação de esclerostina-mimético, em que uma res10 posta de sinalização que é pelo menos 10% (por exemplo, igual ou maior do que 20%, 30%, 40%, 50%, 60%) da resposta de sinalização medida para a interação de esclerostina:ligante de esclerostina indica que o candidato a mimético é identificado como um mimético de Iigante de esclerostina da invenção.
A resposta de sinalização é preferivelmente a resposta da via de
Wnt e/ou de BMP, em cujo caso um mimético pode causar uma diminuição das atividades da via de Wnt e/ou BMP comparada com o estado nãoestimulado. A resposta de sinalização pode ser determinada, por exemplo, pela medida dos níveis de sinalização usando um construto repórter como já 20 mencionado acima. Quando a esclerostina liga-se a um mimético de Iigante de esclerostina, inibindo a via de Wnt e/ou BMP, a expressão da proteína repórter é inibida, e tal redução pode ser medida, por exemplo, por imunoensaio, fluorescência, medida de luminosidade, etc., dependendo da natureza da proteína repórter. A expressão também pode ser medida para a interação 25 de esclerostina:ligante de esclerostina.
Qualquer um dos ensaios de ligação descritos pode ser usado para determinar a presença de um mimético em uma amostra, por exemplo, uma amostra de tecido, que se ligue a esclerostina. Para fazer isso, a esclerostina é reagida na presença e na ausência da amostra e a sinalização é 30 medida como apropriado para o ensaio a ser usado. Um aumento de 10% ou mais (por exemplo, igual ou maior do que 20%, 30%, 40%, 50%, 60%) na sinalização de esclerostina indica que a amostra contém um mimético que se liga a esclerostina.
Qualquer um dos ensaios de sinalização descritos também pode ser usado para determinar a presença de um mimético em uma biblioteca de compostos. Tais técnicas de rastreamento que usam, por exemplo, rastrea5 mento de alto rendimento são bem-conhecidas na técnica.
A presente invenção fornece adicionalmente um método para diagnosticar um distúrbio ou predisposição para um distúrbio relacionado com esclerostina e/ou distúrbio aberrante da densidade mineral óssea em um indivíduo, que compreende as etapas de: (a) obter uma seqüência de 10 nucleotídeos de um gene de Iigante de esclerostina no dito indivíduo, e (b) compará-la com aquela de um indivíduo saudável, onde uma mutação no próprio gene de Iigante de esclerostina indica um distúrbio relacionado a esclerostina ou uma predisposição a ele.
Mutações em SOST ou no gene que codifica um Iigante de es15 clerostina em um indivíduo podem ser indicativas do desenvolvimento de um distúrbio que se relaciona com massa óssea anormal e/ou podem ser usadas para fazer um diagnóstico. Tais mutações alteram as interações entre a esclerostina e o Iigante de esclerostina, por exemplo, causando um aumento ou diminuição na ligação e sinalização comparadas com um indivíduo sau20 dável.
Uma modalidade da presente invenção é um método para diagnosticar um distúrbio ou a suscetibilidade a um distúrbio que se relaciona com massa óssea anormal em um indivíduo, compreendo a etapa de obter a seqüência de nucleotídeos de DNA de SOST ou de gene que codifique um 25 Iigante de esclerostina no dito indivíduo e compará-la com aquela do indivíduo saudável, onde uma mutação na própria esclerostina ou no gene que codifica um Iigante de esclerostina indica um distúrbio que se relaciona com massa óssea anormal ou uma suscetibilidade a ele.
Outra modalidade da presente invenção é um método para diagnosticar um distúrbio ou a suscetibilidade a um distúrbio que se relaciona com massa óssea anormal em um indivíduo, compreendo a etapa de obter a seqüência de nucleotídeos de DNA de SOST ou de gene que codifique um Iigante de esclerostina no dito indivíduo e compará-la com aquela do indivíduo saudável, onde a presença de uma mutação que altere a ligação a esclerostina ou a um Iigante de esclerostina, respectivamente, em comparação com um indivíduo saudável indica um distúrbio que se relaciona com massa óssea anormal ou uma suscetibilidade a ele.
As mutações podem estar presentes nas porções não-traduzidas de um gene (por exemplo, nos íntrons, seqüências de controle, promotores) já que essas também levam a uma disfunção na proteína expressa. Tais mutações podem ser polimorfismos nucleares únicos (SNPs).
A mutação pode ter o efeito de diminuir a interação entre a es
clerostina e o Iigante de esclerostina. Em comparação com um indivíduo saudável, a ligação pode ser pelo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% e, preferivelmente, pelo menos 20% menor do que a ligação observada no indivíduo saudável. Onde é observado uma diminuição na Iiga15 ção, um distúrbio que se relaciona a massa óssea diminuída pode ser diagnosticado ou predito no caso de um Iigante de esclerostina que aumente a ação de esclerostina. Inversamente, no caso de um Iigante de esclerostina que diminua a ação de esclerostina, quando é observada uma diminuição na ligação é observada, um distúrbio que se relaciona com massa óssea au20 mentada pode ser diagnosticado ou predito.
A mutação pode ter o efeito de aumentar a resposta de sinalização das vias de Wnt e/ou BMP. Em comparação com um indivíduo saudável, a resposta de sinalização pode ser pelo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% e, preferivelmente, pelo menos 20% menor do que a res25 posta observada no indivíduo saudável. Onde é observado um aumento na resposta, pode ser diagnosticado ou predito um distúrbio que se relaciona com massa óssea aumentada.
Alternativamente, a mutação pode ter o efeito de aumentar a ligação entre um Iigante de esclerostina e a esclerostina. Em comparação com um indivíduo saudável, a ligação pode ser pelo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% e, preferivelmente, pelo menos 20% maior do que a ligação observada no indivíduo saudável. Onde é observado um aumento na ligação, um distúrbio que se relaciona a massa óssea diminuída pode ser diagnosticado ou predito no caso de um Iigante de esclerostina que aumente a ação de esclerostina. Inversamente, no caso de um Iigante de esclerostina que diminua a ação de esclerostina, quando é observada uma 5 diminuição na ligação é observada, um distúrbio que se relaciona com massa óssea aumentada pode ser diagnosticado ou predito.
A mutação pode ter o efeito de diminuir a resposta de sinalização das vias de Wnt e/ou BMP. Em comparação com um indivíduo saudável, a resposta de sinalização pode ser pelo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 10 60%, 70%, 80% e, preferivelmente, pelo menos 20% menor do que a resposta observada no indivíduo saudável. Onde é observada uma diminuição na resposta, pode ser diagnosticado ou predito um distúrbio que se relaciona com massa óssea diminuída.
Ensaios de ligação e sinalização estão dentro das práticas de rotina da pessoa experiente e estão descritos acima. Métodos de sequenciamento de genes específicos são bem-conhecidos e descritos, por exemplo, em Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1989).
Candidatos a Agentes e Compostos O candidato ou compostos ou agentes de teste empregados pe
la presente invenção podem ser obtidos usando qualquer uma das numerosas abordagens em métodos de biblioteca combinatória conhecidos na técnica, incluindo: bibliotecas biológicas; bibliotecas de fase de solução ou de fase sólida paralela endereçáveis espacialmente; métodos de biblioteca sin25 tética que requerem deconvolução; método de biblioteca "one-bead onecompound"; e métodos de biblioteca sintética que usam seleção por cromatografia de afinidade. A abordagem da biblioteca biológica é limitada a bibliotecas de peptídeo, enquanto que as quatro outras abordagens são aplicáveis a peptídeo, oligômero não peptídico ou bibliotecas de compostos de molécu30 Ia pequena (Lam et al., (1997) Anticancer Drug Des. 12:145).
Exemplos de métodos para a síntese de bibliotecas moleculares podem ser encontrados na técnica, por exemplo em: DeWitt et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 90: 6909; Erb et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 91: 11422; Zuckermann et al. (1994). J. Med. Chem. 37: 2678; Cho et al. (1993) Science 261: 1303; Carrell et al. (1994) Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33: 2059; Carell et al. (1994) Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33: 2061; e em 5 Gallop et al. (1994) J. Med. Chem. 37: 1233.
Bibliotecas de compostos podem ser apresentadas em solução(por exemplo, Houghten (1992) Biotechniques 13: 412), ou sobre esferas (Lam (1991) Nature 354: 82), chips (Fodor (1993) Nature 364: 555), bactérias (Ladner, U.S. Pat. N0 5,223,409), esporos (Ladner '409), plasmideos 10 (Cull et al. (1992) Proc Natl Acad Sci USA 89: 1865) ou sobre fago (Scott and Smith (1990) Science 249: 386); (Devlin (1990) Science 249: 404); (Cwirla et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sei. 87: 6378); (Felici (1991) J. Mol. Biol. 222: 301); (Ladner, supra).
Em uma modalidade, um ensaio é um ensaio baseado em célula 15 que compreende contatar uma célula que expressa um Iigante de esclerostina com um candidato ou composto ou agente de teste e determinar a habilidade do composto de teste de modular (por exemplo, estimular ou inibir) a atividade do dito Iigante de esclerostina. A determinação da habilidade do composto de teste em modular o Iigante de esclerostina pode ser obtida, por 20 exemplo, pela determinação da habilidade do candidato ou composto ou agente de teste para modular a interação de esclerostina:Iigante de esclerostina.
A determinação da habilidade do candidato ou composto ou agente de teste em modular um Iigante de esclerostina pode ser obtida, por 25 exemplo, pela determinação da ligação direta. Essas determinações podem ser obtidas, por exemplo, pelo acoplamento da proteína Iigante de esclerostina com um radioisótopo ou marcador enzimático tal que a ligação da proteína com um candidato ou composto ou agente de teste possa ser determinada pela detecção da proteína marcada no complexo. Por exemplo, molé30 cuias, por exemplo, proteínas, podem ser marcadas com 1251,35S, 14C ou 3H, tanto diretamente quanto indiretamente e o radioisótopo detectado pela contagem direta de radioemissão ou por contagem de cintilação. Alternativamente, as moléculas podem ser enzimaticamente marcadas com, por exemplo, peroxidase de rábano silvestre, fosfatase alcalina ou Iuciferase e o marcador enzimático detectado pela determinação da conversão de um substrato apropriado no produto.
5 Também está dentro do escopo desta invenção determinar a
habilidade do candidato ou composto ou agente de teste em modular um Iigante de esclerostina (ou a interação de esclerostinailigante de esclerostina) sem a marcação de qualquer um dos interagentes (McConneII et al. (1992) Science 257:1906). Como usado aqui, um "microfisiômetro" (por e10 xemplo, Cytosensor) é um instrumento analítico que mede a taxa na qual uma célula acidifica seu meio ambiente usando um sensor potenciométrico endereçável a Iuz (LAPS). Alterações nessa taxa de acidificação podem ser usadas como um indicador da interação entre o composto e o receptor.
Em outra modalidade, um ensaio da presente invenção é um 15 ensaio acelular no qual a proteína ou uma porção biologicamente ativa desta é contatada com um candidato ou composto ou agente de teste (por exemplo, ou um composto testado quanto a sua habilidade em modular um Iigante de esclerostina ou em modular a sinalização que resulta da interação de esclerostina:ligante de esclerostina) e a habilidade do composto de teste de se
- 20 ligar ao Iigante de esclerostina, ou porções biologicamente ativas desse, é determinada. A ligação do composto de teste às proteínas Iigantes de esclerostina pode ser determinada tanto diretamente quanto indiretamente como descrito acima.
Tal determinação pode ser obtida usando uma tecnologia tal 25 como a Análise de Interação Biomolecular (BIA) em tempo real. Sjolander et al, 1991 Anal. Chem. 63:2338:2345 e Szabo et al., 1995 Curr, Opin. Struct. Biol. 5:699-705. Como usado aqui, "BIA" é uma tecnologia para estudar interações bioespecíficas em tempo rela, sem marcação de qualquer dos interagentes (por exemplo, BIAcore). Alterações no fenômeno óptico da ressonân30 cia por plasma de superfície (SPR) podem ser usadas como uma indicação de reações em tempo real entre moléculas biológicas.
Em mais do que uma modalidade dos métodos de ensaio acima da presente invenção, pode ser desejável imobilizar a esclerostina ou um Iigante de esclerostina para facilitar a separação da proteína de formas complexadas das não-complexadas, assim como para acomodar a automação do ensaio. A ligação de um composto de teste a esclerostina ou a um Iigante 5 de esclerostina pode ser obtida em qualquer recipiente adequado para conter os reagentes. Exemplos de tais recipientes incluem placas de microtitulação, tubos de ensaio e tubos para microcentrifugação. Em uma modalidade, pode ser fornecida uma proteína de fusão que adiciona um domínio que permite que a proteína ligue-se a matriz. Por exemplo, glutationa-S10 transferase/proteínas quinase de fusão ou glutationa-S-transferase/proteínas de fusão-alvo podem ser adsorvidas sobre esferas de glutationa sefarose (Sigma Chemical, St. Louis, Mo) ou placas de microtitulação com glutationa derivatizada, que são então combinadas com o composto de teste ou o composto de teste e a esclerostina não-adsorvida ou uma proteína Iigante de 15 esclerostina e a mistura incubada sob condições condizentes com a formação de complexo (por exemplo, em condições fisiológicas de sal e pH). Após a incubação, as esferas ou os poços da placa de microtitulação são lavados para remover quaisquer componentes não-ligados, a matriz imobilizada no caso de esferas, e o complexo determinado tanto diretamente quanto indire20 tamente, por exemplo, como descrito acima. Alternativamente, os complexos podem ser dissociados da matriz e o nível de ligação determinado usando técnicas padronizadas.
Outras técnicas para imobilização de proteínas sobre matrizes também podem ser usadas nos ensaios de rastreamento da invenção. Por 25 exemplo, a esclerostina ou um Iigante de esclerostina podem ser imobilizados utilizando a conjugação de biotina e estreptavidina. Esclerostina ou proteína Iigante de esclerostina ou moléculas-alvo biotiniladas podem ser preparadas com biotina-NHS (N-hidroxi-succinimida) usando técnicas bemconhecidas (por exemplo, kit de biotinilação, Pierce Chemicals, Rockford, III.) 30 e imobilizadas nos poços de placas de 96 poços cobertos com estreptavidina (Pierce Chemical). Alternativamente, anticorpos que reagem com esclerostina ou proteína Iigante de esclerostina ou moléculas-alvo podem ser derivatizados para os poços da placa e a esclerostina não ligada ou proteína Iigante de esclerostina capturadas nos poços por conjugação com o anticorpo. Métodos para detectar tais complexos, além daqueles descritos acima para os complexos imobilizados com GST, incluem a imunodetecção de complexos 5 que usam anticorpos reativos com a esclerostina ou proteína Iigante de esclerostina ou moléculas-alvo.
Em outro aspecto da invenção, a esclerostina ou proteínas Iigantes de esclerostina podem ser usadas como "isca de proteína" em um ensaio de duplo híbrido ou ensaio de triplo híbrido (veja, por exemplo Pat. U.S. N0 10 5.283.317; Zervos et al., 1993 Cell 72:223-232; Madura et al., 1993 J. Biol. Chem. 268:12046-12054; Bartel et al., 1993 Biotechniques 14:920-924; Iwabuchi et al., 1993 Oncogene 8:1693-1696; e Brent W094/10300), para identificar outras proteínas que se ligam a esclerostina ou um Iigante de esclerostina. Tais proteínas que se ligam a esclerostina ou Iigante de esclerostina 15 também provavelmente estão envolvidas na propagação de sinais pelas proteínas esclerostina ou Iigante de esclerostina.
O sistema de duplo híbrido é baseado na natureza modular da maioria dos fatores de transcrição, que consistem em ligação de DNA separável e domínios de ativação. Resumidamente, o ensaio utiliza dois constru20 tos de DNA diferentes. Em um construto, o gene que codifica uma proteína esclerostina ou Iigante de esclerostina é fundido a um gene que codifica o domínio de ligação de DNA de um fator de transcrição conhecido (por exemplo, GAL-4). No outro construto, uma seqüência de DNA, de uma biblioteca de seqüências de DNA, que codifica uma proteína não-identificada ("presa" 25 ou "amostra") é fundida a um gene que codifica o domínio de ativação do fator de transcrição conhecido. Se as proteínas "isca" e "presa" são capazes de interagir, in vivo, formando um complexo dependente de quinase, a ligação de DNA e os domínios de ativação do fator de transcrição são colocados em íntima proximidade. Essa proximidade permite a transcrição de um gene 30 repórter (por exemplo, LacZ) que é operativamente ligado a um sitio regulatório transcricional responsivo ao fator de transcrição. A expressão do gene repórter pode ser detectada e as colônias de células que contêm o fator de transcrição funcional podem ser isoladas e usadas para se obter o gene clonado que codifica a esclerostina ou proteína Iigante de esclerostina que interage com a proteína. .
Essa invenção diz respeito ainda a novos agentes identificados pelos ensaios de rastreamento acima descritos. Consequentemente, está dentro do escopo dessa invenção usar um agente identificado como aqui descrito em um modelo animal apropriado. Por exemplo, um agente identificado como aqui descrito (por exemplo, um agente capaz de modular a interação de esclerostina:ligante de esclerostina) pode ser usado em um modelo animal para determinar a eficácia, toxicidade ou efeitos colaterais do tratamento com tal agente. Alternativamente, um agente identificado como aqui descrito pode ser usado em um modelo animal para determinar o mecanismo de ação de tal agente. Além disso, essa invenção diz respeito a usos de novos agentes identificados pelos ensaios de rastreamento acima descritos para tratamentos como aqui descritos.
Composições Farmacêuticas
Uma composição como descrita aqui pode ser uma composição farmacêutica. A invenção fornece composições farmacêuticas que compreendem: (i) um modulador (por exemplo, um modulador de molécula peque20 na) da interação de esclerostina:ligante de esclerostina, ou (ii) um mimético de Iigante de esclerostina de acordo com a invenção misturados com um veículo fisiologicamente compatível. Em adição aos ingredientes ativos, essas composições farmacêuticas podem conter uma quantidade significativa de um ou mais veículos farmaceuticamente aceitáveis, inorgânicos ou orgâ25 nicos, sólido ou líquido e diluentes fisiologicamente aceitáveis (tais como água, salina tamponada com fosfato ou salina) que podem ser usados farmaceuticamente.
As composições farmacêuticas de acordo com a invenção são adequadas para administração a um mamífero de sangue quente, especialmente um ser humano, (ou a células ou linhagens celulares derivadas de um animal de sangue quente, especialmente um ser humano, por exemplo, osteoblastos ou osteoclastos) para o tratamento, melhora, diagnóstico ou prevenção de um distúrbio relacionado a esclerostina e/ou um distúrbio aberrante da densidade mineral óssea.
As composições farmacêuticas de acordo com a invenção são aquelas para administração enteral, tal como nasal, retal ou oral, ou parente5 ral, tal como intramuscular ou intravenosa a mamíferos de sangue quente (especialmente um ser humano). A dose do ingrediente ativo depende da espécie de mamífero de sangue quente, do peso corporal, da idade e da condição individual, de dados farmacocinéticos individuais, da doença a ser tratada e do modo de administração. Por exemplo, a dose de um modulador 10 (por exemplo, modulador de molécula pequena) ou seu sal farmaceuticamente aceitável a ser administrada a mamíferos de sangue quente, por exemplo seres humanos de aproximadamente 70 kg de peso corporal, é preferivelmente entre aproximadamente 3 mg a aproximadamente 10 g, mais preferivelmente entre aproximadamente 10 mg a aproximadamente 1,5 g, o 15 mais preferivelmente entre cerca de 100 mg a cerca de 1000 mg/indivíduo/dia, dividida preferivelmente em 1 a 3 doses isoladas que podem, por exemplo, ter a mesma quantidade. Geralmente, crianças recebem a metade da dose do adulto.
Dosagens apropriadas também podem ser determinadas em testes, primeiro em um modelo animal apropriado e, subsequentemente na espécie a ser tratada. A quantidade e a freqüência da administração dependerão, é claro, de tais fatores como a natureza e a severidade da indicação a ser tratada, da resposta desejada, da condição do indivíduo a ser tratado e etc. As dosagens apropriadas estão dentro da faixa de cerca de 10 ng/kg/dia a cerca de 100 pg/kg/dia cada uma ou em combinação. Preferivelmente, uma dose de 100 ng/kg/dia a cerca de 1000 ng/kg/dia por 1 a 20 dias podem ser esperadas induzir um efeito biológico apropriado. Alternativamente, injeções em bolus entre cerca de 1 pg/kg/dia a cerca de 100 pg/kg/dia podem ser dadas, com intervalos de aproximadamente 4 dias para exercer efeitos antimicrobianos através do aumento das respostas imune e/ou inflamatória mediadas por macrófagos/monócitos.
As composições farmacêuticas compreendem entre aproximadamente 1% a aproximadamente 95%, preferivelmente entre aproximadamente 20% a aproximadamente 90% de ingrediente ativo. As composições farmacêuticas de acordo com a invenção podem estar, por exemplo, em forma de dosagem única, tais como na forma de ampolas, frascos, supositó5 rios, drágeas, comprimidos ou cápsulas.
As composições farmacêuticas da presente invenção são preparadas de uma maneira conhecida per se, por exemplo, por meio de dissolução, liofilização, mistura, granulação ou processos de confecção convencionais.
As soluções do ingrediente ativo, e também as suspensões, e
especialmente soluções ou suspensões isotônicas aquosas, são usadas preferivelmente, sendo possível, por exemplo no caso de composições Iiofilizadas que compreendem o ingrediente ativo sozinho ou junto com um veículo, por exemplo manitol, para tais soluções ou suspensões serem produzidas 15 antes do uso. As composições farmacêuticas podem ser esterilizadas e/ou podem compreender excipientes, por exemplo, conservadores, estabilizadores, agentes umidificadores e/ou emulsificantes, solubilizantes, sais para regulação da pressão osmótica e/ou tampões, e são preparadas de uma maneira conhecida per se, por exemplo por meio de processos de dissolu20 ção ou liofilização convencionais. As ditas soluções ou suspensões podem compreender substâncias que aumentam a viscosidade, tais como carboximetilcelulose de sódio, carboximetilcelulose, dextran, polivinilpirrolidona ou gelatina.
Suspensões em óleo compreendem como agente oleoso, óleos 25 vegetais sintéticos ou semissintéticos, convencionais para injeção. Podem ser especialmente mencionados como tal, ésteres líquidos de ácido graxo que contêm como componente ácido um ácido graxo de cadeia longa entre 8 a 22, especialmente entre 12 a 22 átomos de carbono, por exemplo, ácido láurico, ácido tridecílico, ácido mirístico, ácido pentadecílico, ácido palmítico, 30 ácido margárico, ácido esteárico, ácido araquídico, ácido beenico ou os ácidos insaturados correspondentes, por exemplo, ácido oleico, ácido elaídico, ácido erúcico, ácido brasídico ou ácido linoleico, se desejado com a adição de antioxidantes, por exemplo, vitamina E, β-caroteno ou 3,5-di-ter-butil-4- hidroxitolueno. O componente alcoólico desses ésteres de ácido graxo tem no máximo 6 átomos de carbono e é um mono- ou poli-hidróxi, por exemplo, um mono-, di- ou tri-hidróxi-álcool,por exemplo, metanol, etanol, propanol, 5 butanol, ou pentanol e seus isômeros, mas especialmente glicol e glicerol. Os seguintes exemplos de ésteres de ácido graxo são, portanto, mencionados: oleato de etila, miristato de isopropila, palmitato de isopropila, "Labrafil M 2375" (trioleato de polioxietileno glicerol, Gattefossé, Paris), "Miglyol 812" (triglicerídeo de ácidos graxos saturados com um comprimento de cadeia de 10 C8 a C12, Hüls AG, Alemanha), mas especialmente óleos vegetais tais como óleo de semente de algodão, óleo de amêndoas, azeite de oliva, óleo de mamona, óleo de gergelim, óleo de soja e mais especialmente óleo de amendoim.
As composições injetáveis são preparadas de uma maneira convencional sob condições estéreis; o mesmo se aplica a introdução das composições nas ampolas ou frascos e no fechamento dos recipientes.
As composições farmacêuticas para administração oral podem ser obtidas pela combinação do ingrediente ativo com veículos sólidos, se desejado granulando a mistura resultante e processando a mistura, se dese20 jado ou necessário, após a adição de excipientes apropriados, em comprimidos, núcleos de drágea ou cápsulas. Também é possível para eles serem incorporados em veículos plásticos que permitam aos ingredientes ativos se difundir ou serem liberados nas quantidades medidas.
Veículos adequados são especialmente preenchedores, tais co25 mo açúcares, por exemplo lactose, sacarose, manitol ou sorbitol, preparações de celulose e/ou fosfatos de cálcio, por exemplo fosfato tricálcico ou fosfato de hidrogênio e cálcio, e Iigantes tais como pastas de amido que usam por exemplo amido de milho, trigo, arroz ou batata, gelatina, tragacanto, metilcelulose, hidroxipropilmetilcelulose, carboximetilcelulose de sódio e/ou 30 polivinilpirrolidona e/ou, se desejado, desintegrantes tais como os amidos acima mencionados, e/ou amido de carboximetila, polivinilpirrolidona reticulada, agar, ácido algínico ou um sal desse, tal como alginato de sódio. Os excipientes são especialmente condicionadores de fluxo e lubrificantes, por exemplo ácido silícico, talco, ácido esteárico ou seus sais, tais como estearato de magnésio ou de cálcio e/ou polietileno glicol. Núcleos de drágeas são fornecidos com revestimentos adequados, opcionalmente entéricos, sendo 5 usados, entre outros, soluções concentradas de açúcar que podem compreender goma arábica, talco, polivinilpirrolidona, polietileno glicol e/ou dióxido de titânio, ou soluções de revestimento em solventes orgânicos adequados ou, para a preparação de revestimentos entéricos, soluções de preparações de celulose adequadas, tais como ftalato de etilcelulose ou ftalato de hidro10 xipropilmetilcelulose. As cápsulas são cápsulas preenchidas a seco feitas de gelatina e cápsulas seladas macias feitas de gelatina e um modelador, tal como glicerol ou sorbitol. As cápsulas preenchidas a seco podem compreender o ingrediente ativo na forma de grânulos, por exemplo, com cargas tais como lactose, ligantes, tais como amidos, e/ou lubrificantes, tais como 15 talco ou estearato de magnésio e, se desejado, estabilizadores. Nas cápsulas macias, o ingrediente ativo é preferivelmente dissolvido ou suspenso em excipientes oleoso adequados, tais como óleos graxos, óleo de parafina ou polietileno glicóis líquidos, sendo possível também serem adicionados estabilizadores e/ou agentes antibacterianos. Corantes ou pigmentos podem ser 20 adicionados aos comprimido ou revestimentos de drágea ou coberturas de gelatina, por exemplo para identificação de finalidade ou para indicar doses diferentes do ingrediente ativo.
Anticorpos
Ligantes de esclerostina podem ser usados como imunógenos 25 para gerar anticorpos usando técnicas padronizadas para a preparação de anticorpo policlonal e monoclonal. A proteína ou o polipeptídeo de extensão completa podem ser usados ou, alternativamente, a invenção fornece fragmentos de peptídeo antigênicos para uso como imunógenos. O peptídeo antigênico de uma proteína da invenção compreende pelo menos 8 (preferi30 velmente 10, 15, 20 ou 30) resíduos de aminoácido da seqüência de aminoácidos do Iigante de esclerostina e abrange um epitopo da proteína, tal que um anticorpo construído contra o peptídeo forma um complexo imune específico com a proteína.
Os epitopos preferidos abrangidos pelo peptídeo antigênico são regiões que estão localizadas sobre a superfície da proteína, por exemplo, regiões hidrofílicas. Gráficos de hidropatia ou análises similares podem ser 5 usados para identificar as regiões hidrofílicas.
Um imunógeno é usado, tipicamente, para preparar anticorpos pela imunização de um indivíduo adequado (por exemplo, coelho, cabra, camundongo ou outro mamífero). Uma preparação imunogênica apropriada pode conter, por exemplo, um polipeptídeo recombinantemente expresso ou 10 quimicamente sintetizado. A preparação pode, ainda, incluir um adjuvante, tal como adjuvante completo ou incompleto de Freund, ou um agente imunoestimulatório similar.
Como usado aqui, a expressão anticorpo refere-se a moléculas de imunoglobulinas e porções imunologicamente ativas de moléculas de i15 munoglobulinas, isto é, moléculas que contêm um sítio de ligação antigênico que se liga especificamente a um antígeno, tal como um Iigante de esclerostina. Anticorpo inclui uma molécula de imunoglobulina convencional, assim como seus fragmentos que também são especificamente reativos com o Iigante de esclerostina e/ou esclerostina. Anticorpos podem ser fragmentados
- 20 usando técnicas convencionais e os fragmentos rastreados quanto a utilidade da mesma maneira como descrito aqui abaixo para anticorpos inteiros. Exemplos de porções imunologicamente ativas de moléculas de imunoglobulina incluem fragmentos F(ab) e F(ab')2 que podem ser gerados pelo tratamento do anticorpo com uma enzima tal como pepsina. A invenção fornece 25 anticorpos policlonal e monoclonal. A expressão "anticorpo monoclonal" ou "composição de anticorpo monoclonal", como usada aqui refere-se a uma população de moléculas de anticorpo que contêm apenas uma espécie de um sítio de ligação a antígeno capaz de imunorreagir com um epitopo particular.
Anticorpos policlonais podem ser preparados como descrito aci
ma pela imunização de um indivíduoa adequado com um polipeptídeo da invenção como um imunógeno. O título de anticorpo no indivíduo imunizado pode ser monitorizado ao longo do tempo por técnicas padronizadas, tais como um ensaio imunossorvente ligado a enzima (ELISA) usando um polipeptídeo imobilizado. Se desejado, as moléculas de anticorpo podem ser isoladas de um mamífero (por exemplo, do sangue) e depois purificadas por técnicas bem-conhecidas, tais como cromatografia de proteína A para obter a fração IgG. Em um período apropriado após a imunização, por exemplo, quando os títulos de anticorpo específico estão mais elevados, as células que produzem anticorpo podem ser obtidas do indivíduo e usadas para preparar anticorpos monoclonais por técnicas padronizadas, tal como a técnica do hibridoma descrita originalmente por Kohler e Milstein (1975) Nature 256:495-497, a técnica do hibridoma de célula B humana (Kozbor et al. (1983) Immunol. Today 4:72), a técnica do hibridoma de EBV (Cole et al. (1985), Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp 7796) ou técnicas de trioma. A tecnologia para a produção de hibridomas é bem-conhecida (veja Current Protocols in Immunology (1994) Coligan et al. (Eds) John Wiley & Sons, Inc., New York, NY). As células de hibridoma que produzem um anticorpo monoclonal da invenção são detectadas pelo rastreamento dos sobrenadantes de cultura de hibridoma para anticorpos que se ligam ao polipeptídeo de interesse, por exemplo, usando um ensaio ELISA padronizado.
Como alternativa ao preparo de hibridomas que secretam anticorpo monoclonal, um anticorpo monoclonal dirigido contra um polipeptídeo da invenção pode ser identificado e isolado pelo rastreamento de uma biblioteca combinatória recombinante (por exemplo, uma biblioteca de apresenta25 ção em fago de anticorpo) com o polipeptídeo de interesse. Kits para gerar e rastrear bibliotecas de apresentação em fago estão comercialmente disponíveis (por exemplo, Pharmacia Recombinant Phage Antibody System, Número de Catálogo 27 9400 01; e o Stratagene SurfZAP™ Phage Display Kit, N0 de Catálogo 240612). Além disso, exemplos de métodos e reagentes parti30 cularmente adequados para uso no geração e rastreamento de biblioteca de apresentação em anticorpo podem ser encontrados em, por exemplo, Patente U.S. N0 5.223.409; Publicação PCT N0 WO 92/18619; Publicação PCT N0 WO 91/17271; Publicação PCT N0 WO 92/20791; Publicação PCT N0 WO 92/15679; Publicação PCT N0 WO 93/01288; Publicação PCT N0 WO 92/01047; Publicação PCT N0 WO 92/09690; Publicação PCT N0 WO 90/02809; Fuchs et al (1991) Bio/Technology 9:1370-1372; Hay et al. (1992) 5 Hum. Antibod. Hybridomas 3:81-85; Huse et al. (1989) Science 246:1275- 1281; Griffiths et al (1993) EMBO J. 12:725-734.
Além disso, anticorpos recombinantes, tais como anticorpos monoclonais quiméricos e humanizados, que compreendem ambas as porções humana e não-humana, que podem ser feitos usando técnicas de DNA re10 combinante padronizadas, estão dentro do escopo da invenção. Um anticorpo quimérico é uma molécula na qual as diferentes porções são derivadas de diferentes espécies de animal, tais como aquelas que têm uma região variável derivada de um mAb de murino e uma região constante de uma imunoglobulina humana. (Veja, por exemplo, Cabilly et al., Patente U.S. N0 15 4.816.567; e Boss et al., Patente U.S. N0 4.816.397, que estão incorporadas aqui pela referência em suas totalidades). Anticorpos humanizados são moléculas de anticorpo de espécies não-humanas que têm uma ou mais regiões determinantes de complementaridade (CDRs) de uma espécie nãohumana e uma região estrutural de uma molécula de imunoglobulina huma-20 na. (Veja, por exemplo, Queen, Patente U.S. N0 5.585.089, que está incorporada aqui por referência em sua totalidade). Tais anticorpos monoclonais quimérico e humanizado podem ser produzidos por técnicas de DNA recombinante conhecidas na técnica, por exemplo, usando métodos descritos na Publicação PCT N0 WO 87/02671; Pedido de Patente Europeu 184.187; Pe25 dido de Patente Europeu 171.496; Pedido de Patente Europeu 173.494; Publicação PCT N0 WO 86/01533; Patente U.S. N0 4.816.567; Pedido de Patente Europeu 125.023; Better et al. (1988) Science 240:1041-1043; Liu et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 84:3439-3443; Liu et al. (1987) J. Immunol. 139:3521 3526; Sun et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 84:214-218; 30 Nishimura et al. (1987) Canc. Res. 47:999-1005; Wood et al. (1985) Nature 314:446-449; e Shaw et al. (1988) J. Natl. Cancer Inst. 80:1553-1559); Morrison (1985) Science 229:1202-1207; Oi et al. (1986) Bio/Techniques 4:214; Patente U.S. N0 5.225.539; Jones et al. (1986) Nature 321:552-525; Verhoeyan et al. (1988) Science 239:1534; e Beidler et al. (1988) J. Immunol. 141:4053-4060.
Anticorpos completamente humanos são particularmente dese5 jáveis para o tratamento terapêutico de pacientes humanos. Tais anticorpos podem ser produzidos usando camundongos transgênicos que são incapazes de expressar genes de cadeia pesada e leve humanas. Os camundongos transgênicos são imunizados da maneira normal com um antígeno selecionado, por exemplo, todo ou uma porção de um polipeptídeo da invenção. 10 Os anticorpos monoclonais dirigidos contra o antígeno podem ser obtidos usando a tecnologia de hibridoma convencional. Os transgenes de imunoglobulina humana abrigados pelos camundongos transgênicos reorganizamse durante a diferenciação de célula B e subsequentemente sofrem mudança de classe e mutação somática. Assim, usando tal técnica, é possível pro15 duzir anticorpos IgG, IgA e IgE terapeuticamente úteis. Para uma visão geral dessa tecnologia para a produção de anticorpos humanos, veja Lonberg e Huszar (1995, Int. Rev. Immunol. 13:65-93). Para uma discussão detalhada dessa tecnologia para a produção de anticorpos humanos e anticorpos monoclonais humanos e protocolos para produção de tais anticorpos veja, por 20 exemplo, Patente U.S. N0 5.625.126; Patente U.S. N0 5.633.425; Patente U.S. N0 5.569.825; Patente U.S. N0 5.661.016 e Patente U.S. N0 5.545.806. Além disso, empresas tais como Abgenix, Inc. (Freemont, CA) podem ser contratadas para fornecer anticorpos humanos dirigidos contra um antígeno selecionado usando tecnologia similar àquela descrita acima.
Anticorpos completamente humanos que reconhecem um epito
po selecionado podem ser gerados usando uma técnica referida como "seleção orientada". Nessa abordagem, um anticorpo monoclonal não-humano selecionado, por exemplo, um anticorpo de camundongo, é usado para orientar a seleção de um anticorpo completamente humano que reconhece o mesmo epitopo. (Jespers et al. (1994) BlO/technology 12:899-903).
Um anticorpo dirigido contra um polipeptídeo da invenção (por exemplo, anticorpo monoclonal) pode ser usado para isolar o polipeptídeo por técnicas padronizadas, tais como cromatografia por afinidade ou imunoprecipitação. Além disso, tal anticorpo pode ser usado para detectar a proteína (por exemplo, em um Iisado celular ou sobrenadante celular) a fim de avaliar a abundância e o padrão de expressão do polipeptídeo. Os anticor5 pos também podem ser usados, diagnosticamente, para monitorizar os níveis de proteína em um tecido como parte de um procedimento de teste clínico, por exemplo, para determinar a eficácia de um dado regime de tratamento, por exemplo. A detecção pode ser facilitada pelo acoplamento do anticorpo com uma substância detectável. Exemplos de substâncias detec10 táveis incluem vários tipos de enzimas, grupos protéticos, materiais fluorescentes, materiais luminescentes, materiais bioluminescentes e materiais radioativos. Exemplos de enzimas adequadas incluem peroxidase de rábano silvestre, fosfatase alcalina, beta galactosidase ou acetilcoiinesterase; exemplos de complexos de grupos protéticos adequados incluem estreptavi15 dina/biotina e avidina/biotina; exemplo de materiais fluorescentes adequados incluem umbeliferona, fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, diclorotriazinilamina fluoresceína, cloreto de dansil ou ficoeritrina; um exemplo de um material Iuminescente inclui luminol; exemplos de materiais bioluminescentes incluem a luciferase, Iuciferina e equorin e exemplos de materi
- 20 ais radioativos adequados incluem 125I, 1311,35S ou 3H.
Arcabouços Similares a Anticorpos (por exemplo, Não-lmunoqlobulinas)
Uma grande variedade de estruturas ou arcabouços de anticorpo/imunoglobulina pode ser empregada de modo que o peptídeo resultante inclua pelo menos uma região de ligação que é específica para a proteína25 alvo. Tais estruturas ou arcabouços incluem os 5 principais idiotipos de imunoglobulinas humanas ou seus fragmentos (tais como aqueles descritos aqui em outra parte) e incluem imunoglobulinas de outra espécie de animal, preferivelmente tendo aspectos humanizados. Anticorpos de cadeia simples tais como aqueles identificados em camelídeos são de interesse particular nesse 30 aspecto. Novas estruturas, arcabouços e fragmentos continuam a ser descobertos e desenvolvidos por aqueles versados na técnica.
Em um aspecto, a invenção relaciona-se a geração de molécuIas de arcabouço baseado em não-imunoglobulina pelo rastreamento de bibliotecas de arcabouços de não-imunoglobulinas contra um Iigante de esclerostina. Para rastrear bibliotecas de arcabouços de não-imunoglobulinas, tecnologias de apresentação similares usadas para bibliotecas de anticorpo 5 incluindo, mas não limitadas a apresentação em fago, apresentação em ribossomo, apresentação em RNA ou apresentação em levedura, podem ser usadas. Em outro aspecto, a invenção relaciona-se a geração de anticorpo baseado em não-imunoglobulina usando arcabouços de nãoimunoglobulinas sobre os quais as CDRs da invenção são enxertadas. Es10 truturas ou arcabouços de não- imunoglobulina conhecidas ou futuras podem ser empregados, desde que eles compreendam uma região de ligação específica para a proteína-alvo. Tais compostos são conhecidos aqui como "polipeptídeos que compreendem uma região de ligação específica para o alvo" ou "Arcabouço Similar a Anticorpo". Estruturas ou arcabouços de não15 imunoglobulina conhecidos incluem, mas não são limitados a moléculas derivadas de fibronectina Ill tais como Adnectinas (fibronectina) (Adnexus Inc., Waltham, MA), anquirina (Molecular Partners AG, Zurique, Suiça), domínio de anticorpos (Domantis Ltda (Cambridge, MA) e Ablynx nv (Zwijnaarde, Bélgica)), Iipocalina (AnticaIin) (Pieris Proteolab AG, Freising, Alemanha), 20 imunofarmacêuticos modulares pequenos (Trubion Pharmaceuticals Inc., Seattle, WA), maxybodies (Avidia, Inc. (Mountain View1 CA)), Proteína A (Affibody AG, Suécia) e afilina (gama-cristalina ou ubiquitina) (Scil Proteins GmbH, Halle, Alemanha).
De acordo com a presente invenção, o anticorpo antiesclerostina 25 ou antiproteína Iigante de esclerostina ou seu fragmento ou o polipeptídeo que compreende uma região de ligação específica para esclerostina ou específica para o Iigante de esclerostina, não importando a estrutura ou arcabouço empregados, podem ser ligados, tanto covalentemente quanto nãocovalentemente, com uma porção adicional. A porção adicional pode ser um 30 polipeptídeo, um polímero inerte tal como PEG, uma molécula pequena, radioisótopo, metal, íon, ácido nucleico ou outro tipo de molécula biologicamente relevante. Tal construto, que pode ser conhecido como um imunoconjugado, imunotoxina ou similares, também está incluído no significado de anticorpo, fragmento de anticorpo ou polipeptídeo que compreende uma região de ligação específica para esclerostina ou específica para o Iigante de esclerostina, como usado aqui.
5 (i) Arcabouço baseado em Fibronectina tipo Ill
Os arcabouços baseados em fibronectina tipo Ill são baseados no domínio de fibronectina tipo Ill (por exemplo, o décimo módulo da fibronectina tipo Ill (domínio 10 Fn3)). O domínio de fibronectina tipo Ill tem 7 ou 8 fitas-beta que estão distribuídas entre as duas folhas-beta, que se acumu10 Iam uma sobre a outra para formar o núcleo da proteína, e contém também alças (análogas a CDRs) que conectam as fitas beta uma a outra e são expostas por solvente. Há pelo menos três de tais alças em cada margem do sanduíche de fita beta, onde a margem é o limite da proteína perpendicular à direção das fitas beta (US 6.818.418).
Esses arcabouços baseados em fibronectina não são uma imu
noglobulina, embora o enovelamento global seja intimamente relacionado àquele do menor fragmento funcional de anticorpo, a região variável da cadeia pesada, que compreende a unidade completa de reconhecimento de antígeno na IgG de camelo e lhama. Por causa dessa estrutura, o anticorpo -20 não-imunoglobulina mimetiza as propriedades de ligação ao antígeno que são similares em natureza e afinidade com aquelas de anticorpos. Esses arcabouços podem ser usados em uma estratégia de randomização e "shuffling" in vitro que é similar ao processo de maturação de anticorpos in vivo. Essas moléculas baseadas em fibronectina podem ser usadas como arca25 bouços, onde as regiões de alça da molécula podem ser substituídas por CDRs da invenção usando técnicas de clonagem padronizadas.
(ii) Parceiros Moleculares de Anguirina
A tecnologia é baseada no uso de proteínas com módulos de repetição derivados de anquirina como arcabouços para sustentar regiões variáveis que podem ser usadas para ligação a diferentes alvos. O módulo de repetição de anquirina é um polipeptídeo de 33 aminoácidos que consiste em duas hélices alfa-antiparalelas e uma volta. A ligação das regiões variáveis é bastante otimizada pela apresentação usando ribossomo.
(iii) Maxvbodies/Avímeros - Avidia
Avímeros são derivados da proteína que contém o domínio A natural tal como LRP-1. Esses domínios são usados na natureza para inte5 rações proteína-proteína e em humano mais de 250 proteínas são estruturalmente baseadas em domínios A. Avímeros consistem em vários monômeros de "domínio A" diferentes (2-10) ligados através de ligantes de aminoácidos. Podem ser criados avímeros que podem se ligar ao antígeno-alvo usando a metodologia descrita, por exemplo, em 20040175756; 10 20050053973; 20050048512 e 20060008844.
(iv) Proteína A - Affibodv
Ligantes de afinidade Affibody® são proteínas pequenas, simples compostas de um feixe de três hélices baseadas no arcabouço de um dos domínios de ligação a IgG de Proteína A. A Proteína A é uma proteína 15 de superfície da bactéria Staphylococcus aureus. Esse domínio de arcabouço consiste em 58 aminoácidos, 13 dos quais são randomizados para gerar bibliotecas de Affibody® com um grande número de variantes de Iigante (veja, por exemplo, US 5.831,012). Moléculas de Affibody® mimetizam anticorpos; elas têm um peso molecular de 6 kDa, comparado ao peso molecular 20 de anticorpos que é de 150 kDa. Apesar de seu pequeno tamanho, o sítio de ligação de moléculas de Affibody® é similar àquele de um anticorpo.
(v) Anticalins - Pieris
Anticalins® são produtos desenvolvidos pela companhia Pieris ProteoLab AG. Eles são derivados de lipocalinas, um amplo grupo de proteí25 nas pequenas e robustas que estão envolvidas geralmente no transporte fisiológico e armazenamento de compostos quimicamente sensíveis ou insolúveis. Várias lipocalinas naturais ocorrer em tecidos humanos e fluidos corporais.
A arquitetura da proteína é sugestiva de imunoglobulinas, com alças hipervariáveis sobre o topo de uma estrutura rígida. Entretanto, em contraste com anticorpos ou seus fragmentos recombinantes, as lipocalinas são compostas de uma cadeia única de polipeptídeos com 160 a 180 resíduos de aminoácidos, sendo apenas discretamente maior do que um domínio único de imunoglobulina.
O grupo de quatro alças que forma o sítio de ligação, mostra plasticidade estrutural pronunciada e tolera uma variedade de cadeias Iaterais. O sítio de ligação pode então ser remodelado em um processo exclusivo a fim de reconhecer as moléculas-alvo prescritas de forma diferente com alta afinidade e especificidade.
Uma proteína da família de lipocalina, a proteína de ligação a bilina (BBP) de Pieris Brassicae tem sido usada para desenvolver anticalinas pela mutagenização do grupo de quatro alças. Um exemplo de um pedido de patente que descreve "anticalinas" é PCT WO 199916873.
(vi) Afilina - Proteínas Scil
Moléculas de Affilin® são proteínas não-imunoglobulinas pequenas que são designadas para afinidades especiais dirigidas a proteínas e moléculas pequenas. Novas moléculas de Affilin® podem ser muito rapidamente selecionadas a partir de duas bibliotecas, cada uma das quais é baseada em um arcabouço de proteína diferente derivado de ser humano.
Moléculas de Affilin® não mostram qualquer homologia estrutural com proteínas imunoglobulinas. Proteínas Scil empregam dois arcabouços -20 de Affilin®, um dos quais é gama-cristalina, uma proteína estrutural de lente ocular humana e o outro é de proteínas da superfamília de "ubiquitina". Ambos os arcabouços humanos são muito pequenos, mostram estabilidade em temperatura alta e são quase resistentes a alterações de pH e agentes desnaturantes. Essa alta estabilidade é devida principalmente a estrutura ex25 pandida da folha-beta das proteínas. Exemplos de proteínas derivadas de gama-cristalina estão descritos na W0200104144 e exemplos de proteínas semelhantes a ubiquitina estão descritos na W02004106368.
Proteínas de Fusão
A invenção fornece proteínas quiméricas ou de fusão. Como usado aqui, uma "proteína quimérica" ou "proteína de fusão" compreende todo ou parte (preferivelmente biologicamente ativa) de um polipeptídeo da invenção operativamente ligada com um polipeptídeo heterólogo (isto é, um polipeptídeo diferente do mesmo polipeptídeo da invenção). Dentro de proteína de fusão, a expressão "operativamente ligada" é pretendida indicar que o polipeptídeo da invenção e o polipeptídeo heterólogo estão fundidos em fase um ao outro. O polipeptídeo heterólogo pode estar fundido a terminação N 5 ou a terminação C do polipeptídeo da invenção.
Uma proteína de fusão útil é uma proteína de fusão GST na qual o polipeptídeo da invenção está fundido na terminação C de seqüências de GST. Tais proteínas de fusão podem facilitar a purificação de um polipeptídeo recombinante da invenção.
Em outra modalidade, a proteína de fusão contém uma seqüên
cia de sinal heteróloga em sua terminação N. Por exemplo, a seqüência de sinal nativa de um polipeptídeo da invenção pode ser removida e substituída por uma seqüência de sinal de outra proteína. Por exemplo, a seqüência secretória gp67 da proteína do envelope de baculovírus pode ser usada co15 mo uma seqüência de sinal heteróloga (Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al., John Wiley & Sons, editores, 1992). Outros exemplos de seqüências de sinal heterólogas eucarióticas incluem as seqüências secretórias de melitina e a fosfatase alcalina placentária humana (Stratagene; La Jolla, Califórnia). Em outra modalidade, seqüências de sinal heterólogas 20 procarióticas úteis incluem o sinal secretório de phoA (Sambrook et al, supra) e o sinal secretório de proteína A (Pharmacia Biotech., Piscataway, Nova Jersey).
Em outra modalidade, a proteína de fusão é uma proteína de fusão de imunoglobulina na qual todo ou parte de um polipeptídeo da inven25 ção é fundido a seqüências derivadas de um membro da família de proteína imunoglobulina. As proteína de fusão de imunoglobulina da invenção podem ser incorporadas em composições farmacêuticas e administradas a um indivíduo para inibir uma interação entre um Iigante (solúvel ou ligado a membrana) e uma proteína sobre a superfície de uma célula (receptor), para su30 primir dessa maneira o sinal de transdução in vivo. A proteína de fusão de imunoglobulina pode ser usada para afetar a biodisponibilidade de um Iigante cognato de um polipeptídeo da invenção. A inibição da interação Iigante/receptor pode ser útil terapeuticamente, para tratar distúrbios proliferativos ou de diferenciação e para modular (por exemplo, promover ou inibir) a sobrevivência celular. Além disso, as proteínas de fusão de imunoglobulina da invenção podem ser usadas como imunógenos para produzir anticorpos diri5 gidos contra um polipeptídeo da invenção em um indivíduo, para purificar ligantes e em ensaios de rastreamento para identificar moléculas que inibem a interação de receptores com ligantes.
As proteínas quiméricas e de fusão da invenção podem ser produzidas pelas técnicas de DNA recombinante padronizadas. Em outra modalidade, o gene de fusão pode ser sintetizado por técnicas convencionais que incluem sintetizadores de DNA automatizados. Alternativamente, a amplificação por PCR de fragmentos de gene pode ser realizada usando iniciadores-âncora que dão início a projeções complementares entre dois fragmentos de gene consecutivos que podem ser, subsequentemente, anelados e reamplificados para gerar uma seqüência de gene quimérico (veja, por exemplo, Ausubel et al., supra). Além disso, vários vetores de expressão que estão comercialmente disponíveis já codificam uma proteína de fusão (por exemplo, um polipeptídeo de GST). Um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo da invenção pode ser clonado em tal vetor de expressão tal que a porção de fusão está ligada em fase ao polipeptídeo da invenção.
Um exemplo de tais proteínas de fusão é uma proteína de fusão que compreende a parte extracelular de LRP4, por exemplo, a parte extraceIular que consiste de SEQ ID N0 3. Um exemplo de tal proteína de fusão é o polipeptídeo de SEQ ID N0 4.
RNAi
A invenção fornece seqüências de ácido ribonucleico pequeno de interferência (siRNA), assim como composições e métodos para inibir a expressão de gene de SOST ou de genes que codificam ligantes de esclerostina em uma célula ou mamífero usando o siRNA. A invenção também 30 fornece composições e métodos para tratar condições patológicas e doenças em um mamífero causadas pela expressão aberrante do gene de SOST ou de genes que codificam ligantes de esclerostina ou causadas pela sinalização aberrante de vias das quais os ditos genes são membros essenciais, usando siRNA. siRNA dirige a degradação específica da seqüência de mRNA através de um processo conhecido como RNA de interferência (RNAi).
O siRNA da invenção compreende uma fita de RNA (a fita antis5 sense) que tem uma região que é menor do que 30 nucleotídeos em extensão, geralmente com 19 a 24 nucleotídeos de extensão, e é substancialmente complementar a pelo menos parte de um transcrito de mRNA do gene de SOST ou de genes que codificam ligantes de esclerostina. O uso desses siRNAs possibilita a degradação direcionada de mRNAs de genes que estão 10 implicados nas vias de sinalização de esclerostina, BMP ou Wnt.
As moléculas de siRNA de acordo com a presente invenção mediam a RNA de interferência ("RNAi"). A expressão "RNAi" é bem-conhecida na técnica e é comumente entendida significar a inibição de um ou mais genes-alvo em uma célula pelo siRNA com uma região que é complementar ao 15 gene-alvo. Vários ensaios são conhecidos na técnica para testar o siRNA quanto a sua habilidade em mediar RNAi (veja, por exemplo, Elbashir et al., Methods 26 (2002), 199-213). O efeito do siRNA de acordo com a presente invenção sobre a expressão de gene resultará tipicamente na inibição da expressão do gene-alvo em pelo menos 10%, 33%, 50%, 90%, 95% ou 99% 20 quando comparada com uma célula não-tratada com as moléculas de RNA de acordo com a presente invenção.
"siRNA" ou "ácido ribonucleico pequeno de interferência" de acordo com a invenção tem os significados conhecidos na técnica, incluindo os seguintes aspectos. O siRNA consiste em duas fitas de ribonucleotídeos 25 que hibridizam ao longa de uma região complementar sob condições fisiológicas. As fitas são separadas mas elas podem ser unidas por um Iigante molecular em certas modalidades. Os ribonucleotídeos individuais podem ser ribonucleotídeos não-modificados que ocorrem naturalmente, desoxiribonucleotídeos não-modificados que ocorrem naturalmente ou eles podem ser 30 quimicamente modificados ou sintéticos como aqui descrito em outra parte.
As moléculas de siRNA de acordo com a presente invenção compreendem uma região de fita dupla que é substancialmente idêntica a uma região do mRNA do gene-alvo. Uma região com 100% de identidade a seqüência correspondente do gene-alvo é adequada. Esse estado é referido como "totalmente complementar". Entretanto, a região também pode conter um, dois ou três não-pareamentos quando comparada a região correspondente do gene-alvo, dependendo da extensão da região do mRNA que é atingida e como tal pode não ser totalmente complementar. Em uma modalidade, as moléculas de RNA da presente invenção atingem especificamente um dado gene. A fim de atingir apenas o mRNA desejado, o siRNA reativo deve ter 100% de homologia ao mRNA-alvo e pelo menos 2 nucleotídeos não-pareados a todos os outros genes presentes na célula ou organismo. Métodos para analisar e identificar siRNas com identidade de seqüência suficiente a fim de inibir efetivamente a expressão de uma sequência-alvo específica são bem-conhecidas na técnica. A identidade de seqüência pode ser otimizada pela comparação de seqüência e algoritmos de alinhamento conhecidos na técnica (veja Gribskov e Devereux, Sequence Analysis Primer, Stockton Press, 1991 e as referencias aqui citadas) e calculando o percentual de diferença entre as seqüências de nucleotídeo, por exemplo, pelo algoritmo de Simth-Waterman como implementado no programa BESTFIT que usa parâmetros de default (por exemplo, University of Wisconsin Gene-20 tic Computing Group).
Outro fator que afeta a eficiência do RNAi reativo é a região-alvo do gene-alvo. A região de um gene-alvo eficaz para inibição pelo RNAi reativo pode ser determinada por experimentação. Uma região-alvo de mRNA adequada pode ser a região codificadora. As regiões não traduzidas também 25 são adequadas, tais como 5’-UTR, 3-UTR e junções de splice. Por exemplo, ensaios de transfecção como descritos em Elbashir S.M. et al., 2001 EMBO J., 20, 6877-6888 podem ser realizados para esse propósito. Vários outros ensaios e métodos adequados existem na técnica e são bem-conhecidos pela pessoa versada na técnica.
A extensão da região do siRNA complementar ao alvo, de acor
do com a presente invenção, pode estar entre 10 a 100 nucleotídeos, 14 a 22 nucleotídeos ou 15, 16, 17 ou 18 nucleotídeos. Onde houver nãopareamentos com a região-alvo correspondente, a extensão da região complementar é geralmente requerida ser um pouco mais longa.
Como o siRNA pode carregar terminações projetadas ( que podem ou não ser complementares ao alvo) ou nucleotídeos complementares 5 adicionais a si próprios mas não ao alvo, a extensão total de cada fita separada de siRNA pode ser de 10 a 100 nucleotídeos, 15 a 49 nucleotídeos, 17 a 30 nucleotídeos ou 19 a 25 nucleotídeos.
A frase "cada fita tem 49 nucleotídeos ou menos" significa que o número total de nucleotídeos consecutivos na fita, incluindo todos os nucleo10 tídeos modificados ou não-modificados, mas não incluindo quaisquer porções químicas que podem ser adicionadas na terminação 3' ou 5' da fita. Porções químicas curtas inseridas na fita não são contadas, mas um Iigante químico designado para unir duas fitas separadas não é considerado criar nucleotídeos consecutivos.
A frase "uma projeção de 1 a 6 nucleotídeos sobre pelo menos
uma das extremidade 5' ou extremidade 3'" refere-se a arquitetura do siRNA complementar que se forma a partir de duas fitas separadas sob condições fisiológicas. Se os nucleotídeos terminais são parte de uma região de fita dupla do siRNA, o siRNA é considerado com extremidades cegas. Se um ou 20 mais nucleotídeos não estão pareados sobre uma terminação, é criada uma projeção. A extensão da projeção é medida pelo número de nucleotídeos projetados. Os nucleotídeos projetados podem ser tanto na extremidade 5' quanto na extremidade 3' de cada fita.
O siRNA de acordo com a presente invenção confere um alta 25 estabilidade in vivo adequada para liberação oral pela inclusão de pelo menos um nucleotídeo modificado em pelo menos uma das fitas. Assim, o siRNA de acordo com a presente invenção contém pelo menos um ribonucleotídeo modificado ou não-natural. Uma extensa descrição de várias modificações químicas conhecidas estão expostas no pedido de patente publicado 30 PCT WO 200370918 e não serão repetidas aqui. Modificações adequadas para liberação oral estão descritas mais especificamente nos Exemplos e aqui na descrição. Modificações adequadas incluem, mas não são limitadas a modificações da porção açúcar (isto é, a posição 2' da porção açúcar, tal como por exemplo 2'-0-(2-metoxietil) ou 2'-MOE) (Martin et al., Helv. Chim. Acta, 1995, 78, 486-504) isto é, um grupo alcoxialcoxila) ou da porção de base (isto é, uma base não natural ou modificada que mantém a habilidade 5 de parear com outra base específica em uma cadeia de nucleotídeos alternativa). Outras modificações incluem as assim chamadas modificações de "estrutura" incluindo, mas não-limitadas a substituição do grupo fosfoéster (que conecta ribonucleotídeos adjacentes com, por exemplo, fosforotioatos, fosforotioatos quirais ou fosforoditioatos). Finalmente, modificações terminais 10 referidas às vezes aqui como 3' caps ou 5' caps podem ser significativas. Caps podem consistir em químicos mais complexos que são conhecidos por aqueles versados na técnica.
Em uma modalidade, a invenção fornece moléculas de ácido ribonucleico de fita dupla (dsRNA) para inibir a expressão do gene de SOST ou de genes que codificam ligantes de esclerostina. O dsRNA compreende pelo menos duas seqüências que são complementares uma a outra. O dsRNA compreende uma fita sense que compreende a primeira seqüência e uma fita antissense que compreende a segunda seqüência. A fita antisenso compreende uma seqüência de nucleotídeos que é substancialmente complementar a pelo menos parte de um mRNA que codifica o gene de SOST ou genes que codificam ligantes de esclerostina e a região de complementaridade tem menos do que 30 nucleotídeos de extensão, geralmente 19 a 24 nucleotídeos de extensão. O dsRNA, após contatar a célula que expressa o gene de SOST ou genes que codificam ligantes de esclerostina, inibe a expressão dos ditos genes em pelo menos 40%.
Em outra modalidade, a invenção fornece uma célula que compreende um dos dsRNAs da invenção. A célula é geralmente uma célula de mamífero, tal como a célula de um camundongo, rato, coelho, ovelha, vaca ou primata.
Em outra modalidade, a invenção fornece uma composição far
macêutica para inibir a expressão do gene de SOST ou de genes que codificam ligantes de esclerostina em um organismo, geralmente um indivíduo humano, compreendendo um ou mais dos dsRNA da invenção e um veículo farmaceuticamente aceitável ou veículo de liberação.
Em outra modalidade, a invenção fornece um método para inibir a expressão do gene de SOST ou de genes que codificam ligantes de escle5 rostina em uma célula, compreendendo as seguintes etapas:
(a) introduzir na célula um ácido ribonucleico de fita dupla (dsRNA), cujo dsRNA compreende pelo menos duas seqüências que são complementares uma a outra. O dsRNA compreende uma fita sense que compreende a primeira seqüência e uma fita antíssense que compreende a se
gunda seqüência. A fita antisenso compreende uma região de complementaridade que é substancialmente complementar a pelo menos parte de um mRNA que codifica esclerostina ou ligantes de esclerostina e em que a região de complementaridade tem menos do que 30 nucleotídeos de extensão, geralmente 19 a 24 nucleotídeos de extensão e em que o dsRNA, após o 15 contato com a célula que expressa o gene de SOST ou genes que codificam ligantes de esclerostina, inibe a expressão dos ditos genes em pelo menos 40%; e
(b) manter a célula produzida na etapa (a) por tempo suficiente para obter a degradação do transcrito de mRNA do gene de SOST ou genes
que codificam ligantes de esclerostina, inibindo dessa maneira a expressão dos ditos genes na célula.
Em outra modalidade, a invenção fornece métodos para tratar, prevenir ou manusear processos patológicos mediados pela sinalização de esclerostina, BMP ou Wnt, por exemplo, distúrbios relacionados a esclerosti25 na e/ou distúrbios aberrantes da densidade mineral óssea, compreendendo administrar a um paciente que necessite de tal tratamento, prevenção ou manuseio, uma quantidade terapeuticamente ou profilaticamente eficaz de um ou mais dos siRNAs da invenção.
Em outra modalidade, a invenção fornece vetores para inibir a expressão do gene de SOST ou de genes que codificam ligantes de esclerostina em uma célula, compreendendo uma seqüência regulatória operativamente ligada a uma seqüência de nucleotídeos que codifica pelo menos uma fita de um dos siRNA da invenção.
Compostos de ácido nucleico inibitório da presente invenção podem ser sintetizados por meios convencionais em um sintetizador de DNA automatizado comercialmente disponível, por exemplo, um sintetizador de 5 DNA/RNA da Applied Biosystems (Foster City, CA) modelo 380B, 392 ou 394 ou instrumento similar. A química com fosforoamidita pode ser empregada. Os compostos de ácido nucleico inibitório da presente invenção também podem ser modificados, por exemplo, podem ser usadas estruturas resistentes à nuclease tais como, por exemplo, fosforotioato, fosforoditioato, 10 fosforoamidato ou similares descritos em várias referências. A extensão do ácido nucleico inibitório deve ser suficiente para assegurar que a atividade biológica seja inibida. Assim, por exemplo, no caso de oligonucleotídeos antissense, deve ser suficientemente longa para assegurar que a ligação específica ocorrerá apenas com o polinucleotídeo-alvo desejado e não em outros 15 sítios fortuitos. O limite superior da extensão é determinado por vários fatores, incluindo a inconveniência e o custo de sintetizar e purificar oligômeros maiores do que 30 a 40 nucleotídeos de extensão, a maior tolerância de oligonucleotídeos mais longos a não pareamentos do que oligonucleotídeos mais curtos e similares. Preferivelmente, os oligonucleotídeos antissense da 20 invenção têm extensões na faixa entre cerca de 15 a 40 nucleotídeos. Mais preferivelmente, as porções de oligonucleotídeos têm extensões na faixa de cerca de 18 a 25 nucleotídeos.
Moléculas de RNA de fita dupla, isto é, RNA antisenso, também denominado RNA pequeno de interferência, podem ser usadas para inibir a 25 expressão de ácidos nucleicos par o gene de SOST ou genes que codificam ligantes de esclerostina. O RNA de interferência é um método no qual dúplices exógenos de RNA curto são administrados onde uma fita corresponde à região codificadora do mRNA-alvo (Elbashir et al. (2001) Nature 411:494). Após entrar nas células, as moléculas de siRNA causam não apenas a de30 gradação dos dúplices de RNA exógeno, mas também de RNAs de fita simples que têm seqüências idênticas, incluindo RNAs mensageiros endógenos. Consequentemente, siRNA pode ser mais potente e eficaz do que as metodologias tradicionais com RNA antissense já que a técnica é acreditada atuar através de um mecanismo catalítico. Moléculas de siRNA preferidas têm tipicamente entre 19 e 25 nucleotídeos de comprimento, preferivelmente cerca de 21 nucleotídeos de extensão. Estratégias eficazes para liberação 5 de siRNA em células-alvo incluem, por exemplo, a transdução usando transfecção física ou química.
Alternativamente, siRNAs podem ser expressos em células usando, por exemplo, vários cassetes de expressão do promotor Pollll que permitem a transcrição de siRNA funcional ou de seus precursores. Veja, por 10 exemplo, Scherr et al. (2003) Curr. Med. Chem. 10(3):245; Turki et al (2002) Hum. Gene Ther. 13(18):2197; Cornell et al., (2003) Nat. Struct. Biol. 10(2):91. A invenção também cobre outros RNAs pequenos capazes de mediar RNA de interferência (RNAi) tais como, por exemplo, micro-RNA (miRNA) e RNA curto em forma de grampo (shRNA).
A menos que definido de outra maneira, todos os termos técni
cos e científicos usados aqui têm o mesmo significado comumente compreendido por aquele versado na técnica a qual essa invenção pertence. Embora métodos e materiais similares ou equivalentes àqueles aqui descritos possam ser usados na prática ou na experimentação da invenção, os méto20 dos e materiais adequados estão descritos abaixo. Todas as publicações, pedidos de patente, patentes e outras referências aqui mencionadas estão incorporadas pela referência em suas totalidades. Em caso de conflito, o presente pedido, incluindo as definições, prevalecerá. Além disso, os materiais, métodos e exemplos são apenas ilustrativos e não pretendem ser Iimi25 tantes.
Os exemplos a seguir são meramente ilustrativos e não significam limitação do escopo das presentes reivindicações de forma alguma. EXEMPLOS
Exemplo 1: Descoberta de Associação entre Esclerostina e Ligantes de Esclerostina
A fim de identificar novos moduladores das vias de esclerostina, BMP e Wnt, aplicou-se um método de purificação por afinidade em tandem (TAP) sistemático a esclerostina. Como descrito em Riagaud et al. (Nat Biotechnol. (1999) 17(10):1030), Seraphin e Rigaud Pedido de patente WO 00/09716) cujos conteúdos estão incorporados por referência, o método de purificação TAP envolve a fusão do marcador de TAP a uma proteína-alvo 5 de interesse e a introdução do construto em um célula ou organismo hospedeiros cognatos.
O marcador de TAP é uma fusão em série de (i) unidades de Proteína A que se ligam a IgG de Staphilococcus aureus (ProtA); e (ii) o Peptídeo que se Liga a Calmodulina (CBP), separados por um sítio de cliva10 gem da protease TEV. Ele permite a purificação rápida de complexos a partir de um número relativamente pequeno de células sem o conhecimento prévio da composição, atividade ou função do complexo. Combinada com a espectrometria de massa, a estratégia TAP permite a identificação de proteínas que interagem com uma dada proteína-alvo.
Ambas esclerostinas N- e C-terminalmente marcadas foram ex
pressas em células HEK293T e em células osteoblásticas UMR-106 não tratadas ou tratadas com 50 ng/ml de BMP-2 por 4 e 20 horas. O marcador de TAP N-terminal contém, adicionalmente, uma seqüência artificial de sinalização para a proteína CD33. As células UMR-106 e HEK273T foram escolhi20 das desde que descobriu-se previamente que células UMR-106 e células relacionadas a HEK293 expressam mRNA de SOST endógeno. (Keller, H. e Kneissel, M (2005) Bone 37:148).
A localização subcelular apropriada de ambas as proteínas SOST marcadas para TAP foi monitorizada por imunofluorescência indireta. 25 Pré-testes demonstraram que quantidades suficientes de esclerostina marcada para TAP foram encontradas no preparado bioquímico de fração de membrana para iniciar a abordagem TAP. Posteriormente, ambos os construtos marcados de esclerostina foram encontrados serem secretados nos meios de um dos tipos celulares. O nível de expressão de esclerostina C30 TAP na fração de membrana de células UMR-106 foi achado ser insuficiente para a purificação por TAP. O processamento posterior daquelas amostras foi descontinuado. As células foram cultivadas em meio DMEM com FCS 10%. Para a estimulação, o meio foi substituído tanto por meio fresco contendo 50 ng/ml de BMP2 quanto por meio fresco apenas. As células foram estimuladas por 4 horas e 20 horas antes da coleta por separação mecânica, lavadas com excesso de PBS sobre gelo e Iisadas em tampão de imunoprecipitação.
O Iisado bruto foi submetido ao fracionamento subcelular para enriquecer em proteínas associadas a membrana.
A fração de membrana foi usada para realizar a purificação por TAP. Para a purificação de complexos de SOST secretados marcados para TAP, o sobrenadante de cultura celular foi coletado a partir de várias placas de cultura celular.
Foram realizadas purificações em triplicata para a fração de membrana, enquanto que as purificações de sobrenadante de cultura celular foram realizadas apenas uma única vez.
Os complexos de proteína purificada foram separados por 1D
SDS-PAGE e corados por coomassie blue coloidal. Bandas de gel inteiras foram sistematicamente cortadas em pedaços e as proteínas foram digeridas em gel com tripsina como descrito por Shevchenko (Shevshenko, A., Wilm M., Vorm O. & Mann M., Mass spectrometric sequencing of proteins silver20 stained polyacrylamide gels. Anal. Chem. 68, 850-858 (1996)). A identificação de proteína foi realizada por LC-MS/MS e os dados MS foram confrontados com uma versão interna selecionada do International Protein Index (IPI), mantido pelo EBI (Hinxton, UK). Os resultados das pesquisas nos bancos de dados foram lidos em um sistema de banco de dados para análise de 25 bioinformática posterior (incluindo submeter os bons resultados a análise Computer Aided Target Selection (CATS)).
Cerca de 100 proteínas são identificadas no total de ambas as linhagens celulares com um valor de E < 10, valor de R > 0,67.
Os bons resultados foram separados em uma lista resumida após serem filtrados contra proteínas ribossomais e proteínas de ligação a RNA e outras proteínas citoplasmáticas abundantes. A esclerostina pareceu mostrar uma propensão por proteínas que se ligam a RNA (cerca de 60 candidatas são separadas com um valor de E < 10). Os valores usados aqui são os seguintes:
IPI = Número de referência de proteína do banco de dados IPI R = Reprodutibilidade da identificação dentro do grupo de purificações em triplicata
E = Número total de pontos de entrada em que a proteína foi identificada pelas Purificações por Afinidade em Tandem para um dado grupo de dados de referência
MS = Número de peptídeos das respectivas proteínas que foi identificado por MS Tabela I - Lista Resumida de Purificação de Membrana IPI Nome Va¬ 293T 293T 293T 293T C- 293T C- 293T C- UMR- UMR-106 UMR-106 lor CD33 CD33 CD33 TAP TAP TAP 106 CD33 CD33 de BMP2 BMP2 BMP2 BMP2 CD33 BMP2 BMP2 E (4 h) (20h) (4 h) (20h) (4h) (20 h) Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor Valor R/MS R/MS R/MS R/MS R/MS R/MS R/MS R/MS R/MS IPI00414021.1(Humana) TRIM41 1 1 7 0,33 3 1 3 0,33 2 0,33 3 IPI00019439.1 (Humana) FBN2 1 0,33 1 1 2 IPI00006288.1 (Humana) SLIT2 1 0,67 3 0,33 1 IPI00304993.3(Humana) IL17R 1 0,67 2 0,33 1 0,67 1 IPI00010948.2(Humana) TRIM26 2 1 22 1 8 0,67 11 1 8 1 8 1 4 IPI00180707.7(Humana) FREM2 2 1 4 0,67 2 0,67 2 IPI00306851.3(Humana) LPR4 2 0,33 2 0,33 1 0,33 1 0,67 4 0,67 2 IPIOOI 53032.1 (Humana) C6orf3 3 0,67 10 1 4 1 12 0,33 3 0,33 2 1 5 067 6 0,33 2 IPI00000203.1 (Humana) LPR6 3 0,67 4 1 4 0,33 2 0,33 1 0,33 1 IPI00024292.1 (Humana) LPR2 5 0,67 2 0,33 1 Tabela Il - Lista Resumida de Purificação de Sobrenadante
IPI Nome Valor 293T 293T CD33 293T C- 293T C- UMR- UMR-106 UMR- UMR-106 de E CD33 BMP2 TAP TAP BMP2 106 CD33 BMP2 106 CTAP BMP2 (20h) (20h) CD33 (20 h) CTAP ' (20h) Valor Valor R/MS Valor Valor R/MS Valor Valor R/MS Valor Valor R/MS R/MS R/MS R/MS R/MS IPI00137336.1 (camundongo) Gpc 1 1 1 19 1 9 1 13 IPI00009802.1 (Humana) CSPG2 1 1 33 1 23 1 19 1 6 IPI00374563.2(Humana) AGRN 1 1 5 1 16 IPI00199629.1 (Rato) Sdc4 1 1 2 IPI00203479.3(Rato) Serpina2 1 1 1 1 3 IPI00403938.1 (Camundongo) TNC 5 1 3 1 4 1 4 1 4 IPI0002492.1(Humana) LRP2 5 1 9 IPI00327143.1 (Rato) Alpl 1 1 11 1 2 1 2 1 3 Como observado na Tabela I e na Tabela II, os seguintes parceiros de interação com a esclerostina foram identificados por essa abordagem: Versicano (CSPG2), FREM2, Fibrilina 2 (FBN2), C6orf93, Sindecano-4 (Sdc4), Agrina (AGRN)1 Serpina2 (PN-1), LRP2, LRP4, LRP6, SLIT2, tenas5 cina C, TRIM26, TRIM41, glipicanol, fosfatase alcalina (ALPL) e receptor de IL-17.
Tanto o efeito da regulação negativa (siRNA) ou da regulação positiva (superexpressão) do parceiro de interação sobre a ação de esclerostina no ensaio de Wnt1/STF foram testados em células HEK293 (células 10 de rim embrionário humano), C28a2 (linhagem celular de condrócitos humanos onde não se detectou esclerostina) e/ou UMR106 (células de osteosarcoma de rato), quanto um ensaio bioquímico foram realizados (exemplo:ALPL).
Exemplo 2: Dados de LPR4 Resumidamente, siRNAs foram rastreados contra LRP4 em um
ensaio repórter de sinalização (supertopflash (STF)) de Wnt induzido por Wntl em células HEK293. Todos os siRNAs contra LRP$ foram capazes de reduzir a expressão de mRNA de LRP4 (Figura 1). A redução de expressão de mRNA de LRP4 reduziu a habilidade da esclerostina de inibir a atividade 20 STF em células HEK293 (Figura 2). Um estudo de dose-resposta de esclerostina mostrou que, quando comparado ao controle, a redução de expressão de LRP4 resultou em um aumento de 5 vezes na IC50 de SOST em um ensaio STF/Wnt1 (Figura 3).
A superexpressão de LRP4 em células HEK293 diminuiu a sina25 lização de Wnt como medido pelo ensaio STF (Figura 4a). A superexpressão de LRP4 em células HEK293 resultou em uma diminuição de 5 vezes na IC50 de SOST comparada com células de controle que superexpressam apenas LRP5 (Figura 4c). A superexpressão de LRP4 junto com LRP6 em células HEK não teve efeito sobre a IC50 de Dkk 1, mas resultou em um au30 mento de 20 vezes na IC50 de SOST comparada com células de controle que superexpressam apenas LRP6 (Figura 4d). Esses dados demonstram que LRP4 é um facilitador específico da ação de esclerostina em células HEK.
A superexpressão de LRP4 em células C28a2 sem SOST induziu uma diminuição de 2,5 vezes na sinalização canônica de Wnt como medido pelo ensaio STF em células transitoriamente transfectadas com LRP5 5 (figura 5a). A superexpressão de LRP4 e LRP5 em células C28a2 não teve efeito sobre a IC50 Dkk 1 mas resultou em uma diminuição de 16 vezes a IC50 de SOST comparada com células de controle que superexpressam apenas LRP5 (figura 5b). A eficácia da ação de SOST em 600 nm foi aumentada entre 52% a 72%. Esses dados demonstram, portanto, que LRP4 é um 10 facilitador da ação de esclerostina em células C28a2, embora não afete a atividade de DKK 1. Baseado nesses achados, LRP4 é especulada ser um importante parceiro de interação para esclerostina, intensificando a ação de esclerostina. Consequentemente, a modulação dessa interação pode fornecer novos meios de inibir a ação de esclerostina em tecidos esqueléticos.
Exemplo 3: Dados de Fosfatase Alcalina
O efeito de esclerostina sobre a fosfatase alcalina foi, adicionalmente, testado em um ensaio de fosfatase alcalina baseado em célula em células MC3T3. Esse ensaio é baseado na detecção da atividade da fosfatase alcalina endógena pela medida espectrofotometricamente da defosforilação de fosfato de p-nitrofenila. Para testar se esclerostina poderia inibir a fosfatase alcalina a jusante de BMP, Wnt e LRP5/6, o efeito de esclerostina sobre a fosfatase alcalina induzida pelo inibidor de GK3beta foi testado (Figura 6). A esclerostina diminuiu a fosfatase alcalina induzida por LiCI e a fosfatase alcalina induzida pelo GSK-3 Inhibitor IX (Calbiochem N0 361550). Testou-se então o efeito da esclerostina sobre a própria ALPL em um ensaio acelular, baseado na detecção de fluorescência da defosforilação de fosfato de 4-metilumbeliferil (Figura 7). Um estudo de dose-resposta de esclerostina mostrou que, quando comparado com o controle, altas concentrações de esclerostina inibem a atividade da fosfatase alcalina. Esses dados sugerem um efeito inibitório direto de SOST sobre a atividade da fosfatase alcalina.
A presente invenção não está limitada no escopo pelas modalidades específicas aqui descritas. De fato, várias modificações da invenção em adição àquelas aqui descritas ficarão claras para aqueles versados na técnica a partir da descrição anterior e das figuras que a acompanham. Tais modificações são pretendidas cair dentro do escopo das reivindicações ane- xas.
Várias publicações são citadas aqui, cujas descrições estão in
corporadas por referência em suas totalidades.

Claims (46)

1. Uso de um modulador de um Iigante de esclerostina selecionado de Versicano (CSPG2), FREM2, Fibrilina 2 (FBN2), C6orf93, Sindecano-4 (Sdc-4), Agrina (AGRN), Serpina2 (PN-1), LRP2, LRP6, SLIT2, tenascina C1 TRIM26, TRIM41, glipicanol, receptor de IL-17, fosfatase alcalina (ALPL) e LRP4, caracterizado pelo fato de ser na preparação de uma composição farmacêutica para tratar um distúrbio patológico que é mediado pela esclerostina ou que está associado com um nível anormal de esclerostina.
2. Uso, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o modulador é um agente que se liga especificamente ao dito Iigante de esclerostina.
3. Uso, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o modulador é um agente que inibe a ligação de esclerostina ao dito Iigante de esclerostina.
4. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o modulador é um agente que modula a via de sinalização de Wnt como medido por um ensaio baseado em célula.
5. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o modulador é um anticorpo ou uma proteína funcional que compreende uma porção que se liga ao antígeno do dito anticorpo.
6.Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que o dito distúrbio patológico é um distúrbio aberrante da densidade mineral óssea, por exemplo osteoporose ou esclerosteose.
7.Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que o dito distúrbio patológico é câncer, por exemplo, mieloma múltiplo com lesões osteolíticas.
8. Método para identificar um agente capaz de modular a interação de esclerostina:ligante de esclerostina, em que o Iigante de esclerostina é um de Versicano (CSPG2), FREM2, Fibrilina 2 (FBN2), C6orf93, Sindecano-4 (Sdc-4), Agrina (AGRN), Serpina2 (PN-1), LRP2, LRP6, SLIT2, tenascina C1 TRIM26, TRIM41, glipicanol, receptor de IL-17, fosfatase alcalina (ALPL) e LRP4, caracterizado pelo fato de que compreende: a) contatar a esclerostina com um Iigante de esclerostina na presença e na ausência de um agente de teste sob condições que permitam a interação do Iigante de esclerostina com esclerostina; e b) medir a interação do Iigante de esclerostina com esclerostina em ambas, a presença e a ausência do dito agente de teste, em que (i) uma diminuição na interação de esclerostina:ligante de esclerostina na presença do agente de teste, em relação a interação na ausência do agente de teste, identifica o agente de teste (1) como um agonista da interação de esclerostina:ligante de esclerostina quando o Iigante de esclerostina ligado diminui a ação de esclerostina e (2) como um antagonista da interação de esclerostina:ligante de esclerostina quando o Iigante de esclerostina ligado aumenta a ação da esclerostina, e em que (ii) um aumento na interação na presença do agente de teste, em relação a interação na ausência do agente de teste, identifica o agente de teste (1) como um como um antagonista da interação de esclerostina:ligante de esclerostina quando o Iigante de esclerostina ligado diminui a ação de esclerostina e (2) como um agonista da interação de esclerostina:ligante de esclerostina quando o Iigante de esclerostina ligado aumenta a ação da esclerostina.
9. Método para identificar um agente capaz de modular a interação de esclerostina:ligante de esclerostina, em que o Iigante de esclerostina é um de Versicano (CSPG2), FREM2, Fibrilina 2 (FBN2), C6orf93, Sindecano-4 (Sdc-4), Agrina (AGRN), Serpina2 (PN-1), LRP2, LRP6, SLIT2, tenascina C, TRIM26, TRIM41, glipicanol, receptor de IL-17, fosfatase alcalina (ALPL) e LRP4, caracterizado pelo fato de que compreende: a) contatar a esclerostina com um Iigante de esclerostina na presença e na ausência de um agente de teste sob condições que permitam a interação do Iigante de esclerostina com esclerostina; e b) medir a sinalização ou uma resposta enzimática induzida pela interação de esclerostina:ligante de esclerostina, em que uma alteração na resposta na presença do agente de teste de pelo menos 10%, 20% ou 30%, comparada com a resposta na ausência do agente de teste, indica que o agente de teste é identificado como capaz de modular a interação de esclerostina:ligante de esclerostina.
10. Método, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que a atividade de sinalização de Wnt é medida como a resposta de sinalização.
11. Modulador de um Iigante de esclerostina, caracterizado pelo fato de ser identificado pelo método, como definido em qualquer uma das reivindicações 6 a 10, em que o dito modulador é um anticorpo ou uma proteína funcional que compreende uma porção que se liga ao antígeno do dito anticorpo ou um siRNA.
12. Anticorpo ou proteína funcional, caracterizado pelo fato de que compreende uma porção que se liga ao antígeno do dito anticorpo, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ou proteína funcional se liga especificamente ao Iigante de esclerostina selecionado entre o grupo que consiste em Versicano (CSPG2), FREM2, Fibrilina 2 (FBN2), C6orf93, Sindecano-4 (Sdc-4), Agrina (AGRN), Serpina2 (PN-1), LRP2, LRP6, SLIT2, tenascina C, TRIM26, TRIM41, glipicanol, receptor de IL-17, fosfatase alcalina (ALPL) e LRP4.
13. Anticorpo ou proteína funcional, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que inibe a ligação de esclerostina ao dito Iigante de esclerostina.
14. Anticorpo ou proteína funcional, de acordo com a reivindicação 12 ou 13, caracterizado pelo fato de que o dito anticorpo ou proteína funcional module a via de sinalização de Wnt, como medido em um ensaio baseado em célula.
15. Anticorpo ou proteína funcional, de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 14, caracterizado pelo fato de que o dito Iigante de esclerostina é LRP4.
16. Anticorpo ou proteína funcional, de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 14, caracterizado pelo fato de que o dito Iigante de esclerostina é ALPL.
17. Modulador, anticorpo ou proteína funcional, de acordo com qualquer uma das reivindicações 11 a 16, caracterizado pelo fato de ser para uso como um fármaco para o tratamento de um distúrbio aberrante da densidade mineral óssea ou um câncer.
18. Modulador, anticorpo ou proteína funcional, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que o dito distúrbio aberrante da densidade mineral óssea é osteoporose ou esclerosteose.
19. Modulador, anticorpo ou proteína funcional, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que o dito câncer é um mieloma.
20. Modulador, anticorpo ou proteína funcional, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que o dito mieloma é um mieloma múltiplo com lesões osteolíticas.
21. Uso de modulador, anticorpo ou proteína funcional, como definido em qualquer uma das reivindicações 11 a 16, caracterizado pelo fato de ser na preparação de uma composição farmacêutica para o tratamento de um distúrbio aberrante da densidade mineral óssea ou um câncer.
22. Uso, de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que o dito distúrbio aberrante da densidade mineral óssea é osteoporose ou esclerosteose.
23. Uso, de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que o dito câncer é um mieloma.
24. Uso, de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de que o dito mieloma é um mieloma múltiplo com lesões osteolíticas.
25. siRNA, caracterizado pelo fato de ser capaz de diminuir a expressão em uma célula de mamífero de um Iigante de esclerostina selecionado do grupo que consiste em Versicano (CSPG2), FREM2, Fibrilina 2 (FBN2), C6orf93, Sindecano-4 (Sdc-4), Agrina (AGRN), Serpina2 (PN-1), LRP2, LRP6, SLIT2, tenascina C, TRIM26, TRIM41, glipicanol, receptor de IL-17, fosfatase alcalina (ALPL) e LRP4.
26. siRNA, de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de que o dito Iigante de esclerostina é LRP4.
27. siRNA, de acordo com a reivindicação 25 ou 26, para uso como um fármaco, para o tratamento de um distúrbio aberrante da densidade mineral óssea ou câncer.
28. Uso de siRNA, como definido em qualquer uma das reivindicações 25 a 26, caracterizado pelo fato de ser na preparação de uma composição farmacêutica para o tratamento de um distúrbio aberrante da densidade mineral óssea ou um câncer.
29. Método para diagnosticar um distúrbio aberrante da densidade mineral óssea ou predisposição a um distúrbio aberrante da densidade mineral óssea em um indivíduo, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de a) medir a interação de esclerostina:ligante de esclerostina no dito indivíduo, e b) comparar a dita interação da etapa a) com a interação de esclerostina:ligante de esclerostina de um indivíduo saudável, uma diferença nas interações observadas entre o indivíduo e o indivíduo saudável indicando um distúrbio aberrante da densidade mineral óssea ou predisposição a ele no dito indivíduo, em que o Iigante de esclerostina é um de Versicano (CSPG2), FREM2, Fibrilina 2 (FBN2), C6orf93, Sindecano-4 (Sdc-4), Agrina (AGRN), Serpina2 (PN-1), LRP2, LRP6, SLIT2, tenascina C, TRIM26, TRIM41, glipicanol, receptor de IL-17, fosfatase alcalina (ALPL) e LRP4.
30. Método para identificar um mimético de Iigante de esclerostina, cujo mimético tem efeito funcional igual, similar ou melhorado como a interação de Iigante de esclerostina com esclerostina, em que o Iigante de esclerostina é um de Versicano (CSPG2), FREM2, Fibrilina 2 (FBN2), C6orf93, Sindecano-4 (Sdc-4), Agrina (AGRN), Serpina2 (PN-1), LRP2, LRP6, SLIT2, tenascina C1 TRIM26, TRIM41, glipicanol, receptor de IL-17, fosfatase alcalina (ALPL) e LRP4, caracterizado pelo fato de que compreende: a) contatar a esclerostina com um candidato a mimético sob condições que permitam a interação do mimético com a esclerostina; e b) medir a interação do mimético com a esclerostina, em que a interação de pelo menos 10% daquela observada para as várias interações de esclerostina:ligante de esclerostina descritas aqui, distingue o candidato a mimético como um mimético de Iigante da esclerostina da invenção.
31. Método de acordo com a reivindicação 29, caracterizado pelo fato de que a dita interação é medida pela resposta de sinalização de Wnt induzida pela interação de esclerostina:mimético.
32. Peptídeo solúvel, caracterizado pelo fato de que compreende um fragmento de um Iigante de esclerostina que se liga especificamente a esclerostina, em que o Iigante de esclerostina é um de Versicano (CSPG2), FREM2, Fibrilina 2 (FBN2), C6orf93, Sindecano-4 (Sdc-4), Agrina (AGRN), Serpina2 (PN-1), LRP2, LRP6, SLIT2, tenascina C1 TRIM26, TRIM41, glipicanol, receptor de IL-17, fosfatase alcalina (ALPL) e LRP4.
33. Polipeptídeo solúvel, de acordo com a reivindicação 32, caracterizado pelo fato de que inibe a ligação do Iigante de esclerostina com a esclerostina.
34. Polipeptídeo solúvel, de acordo com a reivindicação 32 ou 33, caracterizado pelo fato de que compreende um fragmento que se ligue a esclerostina de LRP4.
35. Polipeptídeo solúvel, de acordo com a reivindicação 33, caracterizado pelo fato de ser um fragmento de LRP4 que consiste da porção extracelular de LRP4, preferivelmente o polipeptídeo que consiste de SEQ ID N°3.
36. Uso de um polipeptídeo solúvel, como definido em qualquer uma das reivindicações 32 a 35, caracterizado pelo fato de ser na preparação de uma composição farmacêutica para para tratar um distúrbio aberrante da densidade mineral óssea.
37. Uso, de acordo com a reivindicação 36, caracterizado pelo fato de que o distúrbio aberrante da densidade mineral óssea é osteoporose.
38. Uso, de acordo com a reivindicação 36, caracterizado pelo fato de que o distúrbio aberrante da densidade mineral óssea é esclerosteose.
39. Método para diagnosticar um distúrbio aberrante da densidade mineral óssea ou uma predisposição a um distúrbio relacionado com a esclerostina em um indivíduo, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: a) obter a seqüência de nucleotídeos de um gene de Iigante de esclerostina no dito indivíduo e, b) compará-la com aquela de um indivíduo saudável, onde uma mutação no respectivo gene de Iigante de esclerostina indica um distúrbio relacionado a esclerostina ou uma predisposição a ele, em que o Iigante de esclerostina é um de Versicano (CSPG2), FREM2, Fibrilina 2 (FBN2), C6orf93, Sindecano-4 (Sdc-4), Agrina (AGRN), Serpina2 (PN-1), LRP2, LRP6, SLIT2, tenascina C, TRIM26, TRIM41, glipicanol, receptor de IL-17, fosfatase alcalina (ALPL) e LRP4.
40. Método para diagnosticar um distúrbio relacionado com a esclerostina ou uma predisposição a um distúrbio relacionado com a esclerostina em um indivíduo, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: a) medir a interação de esclerostina:ligante de esclerostina no dito indivíduo, e b) comparar a dita interação da etapa a) com a interação de esclerostina:ligante de esclerostina de um indivíduo saudável, uma diferença nas interações observadas entre o indivíduo e o indivíduo saudável indicando um distúrbio relacionado a esclerostina ou predisposição a ele no dito indivíduo, em que o Iigante de esclerostina é um de Versicano (CSPG2), FREM2, Fibrilina 2 (FBN2), C6orf93, Sindecano-4 (Sdc-4), Agrina (AGRN), Serpina2 (PN-1), LRP2, LRP6, SLIT2, tenascina C, TRIM26, TRIM41, glipicanol , receptor de IL-17, fosfatase alcalina (ALPL) e LRP4.
41. Método para diagnosticar um distúrbio relacionado com a esclerostina ou uma predisposição a um distúrbio relacionado com a esclerostina em um indivíduo, caracterizado pelo fato de compreende as etapas de: a) obter a seqüência de nucleotídeos de um gene de Iigante de esclerostina no dito indivíduo, em que o Iigante de esclerostina é um de Versicano (CSPG2), FREM2, Fibrilina 2 (FBN2), C6orf93, Sindecano-4 (Sdc-4), Agrina (AGRN), Serpina2 (PN-1), LRP2, LRP6, SLIT2, tenascina C, TRIM26, TRIM41, glipicanol, receptor de IL-17, fosfatase alcalina (ALPL) e LRP4 b) compará-la com aquela de um indivíduo saudável, onde uma mutação no respectivo gene de Iigante de esclerostina indica um distúrbio relacionado a esclerostina ou uma predisposição a ele.
42. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende um modulador de um Iigante de esclerostina selecionado de Versicano (CSPG2), FREM2, Fibrilina 2 (FBN2), C6orf93, Sindecano-4 (Sdc4), Agrina (AGRN), Serpina2 (PN-1), LRP2, LRP6, SLIT2, tenascina C, TRIM26, TRIM41, glipicanol, receptor de IL-17, fosfatase alcalina (ALPL) e LRP4.
43. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende um modulador de um Iigante de esclerostina, como definido na reivindicação 11.
44. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende um anticorpo ou uma proteína funcional, como definida em qualquer uma das reivindicações 12 a 16.
45. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende um siRNA, como definido na reivindicação 25 ou 26.
46. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende um peptídeo solúvel, como definido em qualquer uma das reivindicações 32 a 35.
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