BRPI0807519A2 - Método de produzir metionina em corinebactérias através de supra-expressão das enzimas da via das pentoses-fosfato - Google Patents

Método de produzir metionina em corinebactérias através de supra-expressão das enzimas da via das pentoses-fosfato Download PDF

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Description

\ Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MÉTODO DE PRODUZIR METIONINA EM CORINEBACTÉRIAS ATRAVÉS DE SUPRA- EXPRESSÃO DAS ENZIMAS DA VIA DAS PENTOSES-FOSFATO".
CAMPO DA INVENÇÃO 5 A presente invenção refere-se a micro-organismos e métodos
para produzir L-metionina. Em particular, a presente invenção refere-se a um método de produzir metionina em bactérias corineformes aumentando a quantidade e/ou atividade de pelo menos uma enzima da via das pentoses- fosfato. A presente invenção também refere-se a bactérias corineformes em 10 que a quantidade e/ou atividade de pelo menos duas enzimas da via das pentoses-fosfato é/são aumentada(s).
ANTECEDENTES
Correntemente, a produção anual mundial de metionina é cerca de 500.000 toneladas. Metionina é o primeiro aminoácido Iimitativo em cria- ção de alimentação avícula e, devido a isto, principalmente aplicado como suplemento alimentar.
Em contraste com outros aminoácidos industriais, a metionina é aplicada quase exclusivamente como um racemato de D e L-metionina que é produzida por síntese química. Considerando que os animais podem meta- 20 bolizar ambos os estereoisômeros de metionina, alimentação direta da mis- tura racêmica quimicamente produzida é possível (D1MeIIo e Lewis, Effect of Nutrition Deficiencies in Animais: Amino Acids, Rechgigl (Ed.), CRC Hand- book Series in Nutrition and Food, 441-490, 1978).
Porém, ainda há um grande interesse em substituir a produção 25 química existente por um processo biotecnológico produzindo exclusivamen- te L-metionina. Isto é devido ao fato que em níveis mais baixos de suple- mentação, L-metionina é uma fonte melhor de aminoácidos de enxofre que D-metionina (Katz e Baker (1975) Poult. Sei. 545: 1667-74). Além disso, o processo químico usa químicas bastante perigosas e produz fluxos residuais 30 substanciais. Todas estas desvantagens de produção química poderiam ser evitadas por um processo biotecnológico eficiente.
Produção fermentativa de químicas finas tais como aminoácidos, compostos aromáticos, vitaminas e cofatores, é hoje tipicamente realizada em micro-organismos tais como Corynebacterium glutamicum (C. glutami- cum), Escherichia eoli (E. eoli), Saccharomyees eerevisiae (S. eerevisiae), Schizzosaceharomyes pombe (S. pombe), Piehia pastoris (P. pastoris), As- pergilius niger, Bacilius subtiiis, Ashbya gossypii ou Glueonobaeter oxydans.
Aminoácidos, tais como glutamato, são desse modo produzidos usando métodos de fermentação. Para estes propósitos, certos micro- organismos tais como Eseheriehia eoli (E. eoli) e Corynebaeterium glutami- cum (C. glutamicum) provaram ser particularmente adequados. A produção 10 de aminoácidos através de fermentação também tem inter alia a vantagem que apenas L-aminoácidos são produzidos e que químicas ambientalmente problemáticas, tais como solventes visto que são tipicamente usados na sín- tese química, são evitadas.
Algumas tentativas na técnica anterior para produzir químicas finas tais como aminoácidos, lipídios, vitaminas ou carboidratos em micro- organismos tais como E. eoli e C. glutamicum tentaram alcançar esta meta, por exemplo, aumentando a expressão dos genes envolvidos nas vias bios- sintéticas das respectivas químicas finas.
Tentativas para aumentar a produção, por exemplo, de Iisina suprarregulando a expressão dos genes que estão envolvidos na via biossin- tética de produção de Iisina são, por exemplo, descritas no WO 02/10209, WO 2006008097, W02005059093 ou em Cremer et al. (Appl. Environ. Mi- crobiol, (1991), 57(6), 1746-1752).
Porém, permanece uma necessidade forte para identificar outros alvos nas vias metabólicas que possam ser usados para beneficamente in- fluenciar a produção de metionina em micro-organismos tais como C. gluta- micum.
OBJETIVO E SUMÁRIO DA INVENÇÃO
Em vista desta situação, é um objetivo da presente invenção for- necer bactérias corineformes que podem ser usadas para produzir L- metionina. É um outro objetivo da presente invenção fornecer métodos que podem ser usados para produzir L-metionina em bactérias corineformes. Estes e outros objetivos, como eles ficarão evidentes da descri- ção resultante, são solucionados pela presente invenção como descrita nas reivindicações independentes. As reivindicações dependentes referem-se a algumas das modalidades preferidas da invenção.
5 Em um aspecto, a invenção diz respeito a um método de produ-
zir L-metionina (também designada como metionina) em pelo menos uma bactéria corineforme em que a dita bactéria corineforme é derivada por mo- dificação genética de um organismo de partida de modo que a dita bactéria corineforme exibe uma quantidade e/ou atividade mais alta de pelo menos 10 uma enzima da via das pentoses-fosfato comparado ao organismo de parti- da.
A quantidade e/ou atividade de uma enzima da via das pento- ses-fosfato pode(m) ser aumentada(s) comparado a um organismo de parti- da aumentando o número de cópias de seqüências de ácido nucleico que 15 codificam a dita enzima. O número de cópias de seqüências de ácido nuclei- co que codificam uma enzima da via das pentoses-fosfato pode ser aumen- tado usando, por exemplo, vetores de replicação autônoma que compreen- dem as seqüências de ácido nucleico que codificam a dita enzima, e/ou por integração cromossômica das cópias adicionais de seqüências de ácido nu- 20 cleico que codificam a dita enzima no genoma do organismo de partida.
Um aumento da quantidade e/ou atividade de uma enzima da via das pentoses-fosfato pode ser também alcançado aumentando a transcrição e/ou translação de uma seqüência de ácido nucleico que codifica a dita en- zima. Um aumento de transcrição pode ser atingido mediante o uso de pro- 25 motores fortes e/ou elementos intensificadores. Um aumento na translação pode ser alcançado se o uso do códon das seqüências de ácido nucleico que codificam as ditas enzimas for aperfeiçoado para a expressão no orga- nismo hospedeiro ou se sítios de ligação e os sítios de iniciação de transla- ção melhorados para ribossoma forem instalados na região a montante da 30 seqüência de codificação de um gene.
A atividade de uma enzima da via das pentoses-fosfato pode ser também aumentada comparado a um organismo de partida mediante a in- tradução de mutações nos genes que codificam as ditas enzimas que au- mentam a atividade das ditas enzimas ou por mecanismos reguladores ne- gativos de transporte tais como inibição de retroalimentação ou aumentando a taxa de giro enzimática da enzima.
Em algumas das modalidades preferidas da invenção, a quanti-
dade e/ou atividade das enzimas da via das pentoses-fosfato é/são aumen- tada^) comparado a um organismo de partida por combinações dos méto- dos acima mencionados.
Em uma das modalidades preferidas, a invenção refere-se a um 10 método de produzir metionina em bactérias corineformes, em que a quanti- dade e/ou atividade de pelo menos transcetolase (tkt), transaldolase (tal), glicose-6-fosfato desidrogenase (zwf), o gene ocpa, Iactonase ou 6-fosfo- gliconato-desidrogenase (6PGDH) é/são aumentada(s) comparado a um organismo de partida.
Outras modalidades preferidas da invenção referem-se a méto-
dos para produzir metionina em bactérias corineformes, em que a quantida- de e/ou atividade de pelo menos transcetolase e 6-fosfo-g Iiconato- desidrogenase ou glicose-6-fosfato desidrogenase e 6-fosfo-gliconato- desidrogenase é/são aumentada(s) comparado a um organismo de partida. Em uma das modalidades mais preferidas da invenção, a quan-
tidade e/ou atividade de transcetolase e 6-fosfo-gliconato-desidrogenase é/são aumentada(s) comparado a um organismo de partida substituindo os respectivos promotores endógenos com um promotor forte, sendo preferi- velmente Psod- Em uma outra elaboração deste último aspecto da invenção, 25 as seqüências de ácido nucleico são usadas que codificam para versões mutadas de transcetolase, transaldolase, glicose 6-fosfato desidrogenase, a proteína opca e 6-fosfo-gliconato-desidrogenase que ou são menos propen- sas aos mecanismos reguladores negativos e/ou exibem um giro enzimático mais alto comparado às respectivas enzimas do tipo selvagem.
Outro aspecto da presente invenção refere-se a uma bactéria
corineforme, que é derivada por modificação genética de um organismo de partida de modo que a dita bactéria corineforme exibe uma quantidade e/ou atividade mais aita de pelo menos duas enzimas da via das pentoses-fosfato comparado ao organismo de partida.
A quantidade e/ou atividade das ditas pelo menos duas enzimas pode(m) ser aumentada(s) comparado a um organismo de partida pelas a- 5 bordagens acima mencionadas, isto é, aumentando o número de cópias de seqüências de ácido nucleico que codificam as ditas enzimas, aumentando a transcrição e/ou translação das seqüências de ácido nucleico que codificam as ditas enzimas e/ou introduzindo mutações nas seqüências de ácido nu- cleico que codificam as ditas enzimas que levam às versões mais ativas das 10 respectivas enzimas.
Em uma modalidade preferida, a invenção refere-se a uma bac- téria corineforme em que a quantidade e/ou atividade de pelo menos trans- cetolase e 6-fosfo-gliconato-desidrogenase, ou de pelo menos glicose-6- fosfato-desidrogenase e 6-fosfo-gliconato-desidrogenase é/são aumenta- da(s) comparado ao organismo de partida.
Em uma das modalidades mais preferidas, uma bactéria corine- forme é caracterizada em que a quantidade e/ou atividade de transcetolase e 6-fosfo-gliconato-desidrogenase é/são aumentada(s) comparado a um or- ganismo de partida, preferivelmente substituindo seu respectivo promotor endógeno com um promotor forte tal como Psod-
Em uma outra elaboração deste aspecto anterior da presente invenção, as seqüências de ácido nucleico de transcetolase e 6-fosfo- gliconato-desidrogenase codificam versões mutadas destas enzimas que são menos propensas aos mecanismos reguladores negativos e/ou exibem 25 um giro enzimático mais alto comparado às respectivas enzimas do tipo sel- vagem.
Em todas as modalidades acima mencionadas da invenção, uma bactéria corineforme é selecionada que é preferivelmente selecionada das espécies de Corynebacterium glutamicum. Uma cepa de C. glutamicum pre- 30 ferida que pode ser usada para o propósito da presente invenção é uma ce- pa do tipo selvagem tal como ATCC13032 ou uma cepa que já foi aperfeiço- ada para produção de metionina. Tais cepas posteriores exibirão alterações genéticas tais como aquelas de DSM17322, M2014 ou OM469 sendo descri- tas abaixo ou como sendo descritas no W02007012078.
Em um aspecto da presente invenção, os métodos e bactérias corineformes de acordo com a presente invenção permitem produzir pelo 5 menos 2%, pelo menos 5%, pelo menos 10% ou pelo menos 20%, preferi- velmente pelo menos 30%, pelo menos 40% ou pelo menos 50%, e mais preferivelmente pelo menos um fator de 2, pelo menos um fator de 5 e pelo menos um fator de 10 mais metionina comparado ao organismo de partida. LEGENDA DA FIGURA 10 Figura 1 esquematicamente descreve plasmídeos pCLIK int
sacB PSOD TKT e pCLIK int sacB PSOD 6PGDH.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
Em um aspecto, a presente invenção refere-se a um método de produzir metionina em pelo menos uma bactéria corineforme, em que a dita 15 bactéria corineforme é derivada por modificação genética de um organismo de partida de modo que a dita bactéria corineforme exibe uma quantidade e/ou atividade mais alta de pelo menos uma enzima da via das pentoses- fosfato comparado ao organismo de partida.
Outra modalidade da presente invenção refere-se a uma bacté- ria corineforme que é derivada por modificação genética de um organismo de partida de modo que a dita bactéria corineforme exibe uma quantidade e/ou atividade mais alta de pelo menos duas enzimas da via das pentoses- fosfato comparado ao organismo de partida.
Foi surpreendentemente descoberto que o aumento da quanti- 25 dade e/ou atividade das enzimas que não estão diretamente envolvidas na via metabólica para síntese de metionina pode levar à produção aumentada de metionina em bactérias corineformes. Desse modo, os inventores da pre- sente invenção observam que se supraexpressa pelo menos uma enzima da via das pentoses-fosfato tal como transcetolase ou 6-fosfo-gliconato- 30 desidrogenase em bactérias corineformes uma quantidade mais alta de me- tionina é produzida comparado a uma situação onde nenhuma destas duas enzimas não são expressadas acima de seus níveis endógenos típicos em bactérias corineformes.
Antes de vários aspectos e algumas das modalidades preferidas da invenção serem descritos em mais detalhes, as definições a seguir são fornecidas que deverão ter o significado indicado ao longo da descrição da invenção, a menos que explicitamente do contrário indicado pelo respectivo contexto.
Bactérias corineformes compreendem espécies tais como Cory- nebacterium glutamicum, Corynebacterium jeikeum, Corynebacterium aceto- glutamicum, Corynebacterium acetoacidophilum, Corynebacterium thermo- aminogenes, Corynebacterium melasseeola e Corynebaeterium effiziens. Uma espécie preferida é C. glutamicum.
Em modalidades preferidas da invenção, as bactérias corinefor- mes podem ser derivadas do grupo de cepas que compreendem C. glutami- cum ATCC13032, C. glutamicum KFCC10065, C. glutamicum ATCC21608, 15 C. acetoglutamicum ATCC15806, C. acetoacidophilum ATCC13870, C. thermoaminogenes FERMBP-1539, C. melasseeola ATCC17965, C. effiziens DSM 44547 e C. effiziens DSM 44549, como também cepas que são deriva- das das mesmas, por exemplo, por mutagênese e seleção clássicas ou atra- vés de mutagênese dirigida.
Outras cepas particularmente preferidas de C. glutamicum po-
dem ser selecionadas do grupo compreendendo ATCC13058, ATCC13059,
ATCC13060, ATCC21492, ATCC21513, ATCC21526, ATCC21543, ATCC13287, ATCC21851, ATCC21253, ATCC21514, ATCC21516, ATCC21299, ATCC21300, ATCC39684, ATCC21488, ATCC21649, ATCC21650, ATCC19223, ATCC13869, ATCC21157, ATCC21158, ATCC21159, ATCC21355, ATCC31808, ATCC21674, ATCC21562, ATCC21563, ATCC21564, ATCC21565, ATCC21566, ATCC21567, ATCC21568, ATCC21569, ATCC21570, ATCC21571, ATCC21572, ATCC21573, ATCC21579, ATCC19049, ATCC19050, ATCC19051, ATCC19052, ATCC19053, ATCC19054, ATCC19055, ATCC19056, ATCC19057, ATCC19058, ATCC19059, ATCC19060, ATCC19185, ATCC13286, ATCC21515, ATCC21527, ATCC21544, ATCC21492, NRRL Β8183, NRRL W8182, B12NRRLB12416, NRRLB12417, NRRLB12418 e NRRLB11476.
A abreviação KFCC representa Korean Federation of Culture Collection, ATCC representa American-Type Strain Culture Collection e a abreviação DSM representa Deutsche Sammlung von Mikroorganismen. A abreviação NRRL representa coletânea de culturas de ARS Northern Regio- nal Research Laboratory, Peorea, EL, EUA.
Para o propósito da presente invenção, uma cepa do tipo selva- gem preferida é C. glutamicum ATCC13032.
Particularmente preferidos são micro-organismos de Corynebac-
terium glutamicum que já são capazes de produzir metionina. Portanto, ce- pas que exibem alterações genéticas tendo um efeito similar, tal como DSM17322; M2014 ou OM469 sendo descritas abaixo, são particularmente preferidas.
O termo "organismo de partida" dentro do contexto da presente
invenção refere-se a uma bactéria corineforme que é usada para modifica- ção genética para aumentar a quantidade e/ou atividade de pelo menos uma enzima da via das pentoses-fosfato como descrito abaixo.
Os termos "modificação genética" e "alteração genética" como 20 também suas variações gramaticais dentro do significado da presente inven- ção são intencionados significar que um micro-organismo foi modificado por meio de tecnologia de gene para expressar uma quantidade alterada de uma ou mais proteínas que podem estar naturalmente presentes no respectivo micro-organismo, uma ou mais proteínas que não estão naturalmente pre- 25 sentes no respectivo micro-organismo, ou uma ou mais proteínas com uma atividade alterada em comparação às proteínas do respectivo micro- organismo não-modificado. É considerado que um micro-organismo não- modificado é um "organismo de partida", a alteração genética deste resulta em um micro-organismo de acordo com a presente invenção.
O organismo de partida pode ser desse modo uma cepa de C.
glutamicum do tipo selvagem tal como ATCC13032.
Porém, o organismo de partida pode ser também preferívelmen- te, por exemplo, uma cepa de C. glutamicum que já foi aperfeiçoada para produção de metionina.
Um tal organismo de partida produtor de metionina pode, por exemplo, ser derivado de uma bactéria corineforme do tipo selvagem e pre- 5 ferivelmente de uma bactéria de C. glutamicum do tipo selvagem contendo alterações genéticas pelo menos em um dos genes a seguir: asl/br, homfbr e metH, em que as alterações genéticas levam à supraexpressão de qualquer um destes genes, assim resultando na produção aumentada de metionina com relação à metionina produzida na ausência das alterações genéticas. 10 Em uma modalidade preferida, um tal organismo iniciador de produção de metionina conterá alterações genéticas simultaneamente em asl/br, homfbr e metH assim resultando em produção aumentada de metionina com relação à metionina produzida na ausência das alterações genéticas.
Nestes organismos de partida, as cópias endógenas de ask e hom são tipicamente alteradas nos alelos resistentes de retroalimentação que não estão mais sujeitos à inibição de retroalimentação pela lisina, treo- nina, metionina ou por uma combinação destes aminoácidos. Isto pode ser feito por mutação e seleção ou por substituições genéticas definidas dos ge- nes por com alelos mutados que codificam para proteínas com inibição de retroalimentação reduzida ou diminuída. Uma cepa de C. glutamicum que inclui estas alterações genéticas são, por exemplo, DSM17322 de C. gluta- micum. A pessoa versada na técnica estará atenta que alterações genéticas alternativas àquelas sendo descritas abaixo para geração de C. glutamicum DSM17322 podem ser usadas também para alcançar supraexpressão de SSkfbr, homfbr e metH.
Para o propósito da presente invenção, asl/br denota um aspar- tato cinase resistente à retroalimentação. Homfbr denota uma homosserina desidrogenase resistente à retroalimentação. MetH denota uma metionina sintase dependente de vitamina B12.
Em outra modalidade preferida, um organismo de partida produ-
tor de metionina pode ser derivado de uma bactéria corineforme do tipo sel- vagem e preferivelmente de uma bactéria de C. glutamicum do tipo selva- gem que contém alterações genéticas em pelo menos um dos genes a se- guir: a SlZbr, homfbr, metH, metA (também referido como metX), metY (tam- bém referido como metZ), e Iiskmutad°, em que as alterações genéticas levam à supraexpressão de qualquer um destes genes, assim resultando em pro- 5 dução aumentada de metionina com relação à metionina produzida na au- sência das alterações genéticas. Em uma modalidade preferida, um tal or- ganismo iniciador de produção de metionina conterá alterações genéticas simultaneamente em ask!br homfbr, metH, metA (também referido como metX), metY (também referido como metZ), e IislZriutado assim resultando em 10 produção aumentada de metionina com relação à metionina produzida na ausência das alterações genéticas.
Nestes organismos de partida, as cópias endógenas de ask, hom e hsk são tipicamente substituídas por aSkfbr, homfbr e Iiskmutado como descrito acima para aslZbr e homfbr. Uma cepa de C. glutamicum que inclui 15 estas alterações genéticas são, por exemplo, M2014 de C. glutamicum. A pessoa versada na técnica estará atenta que alterações genéticas alternati- vas àquelas especificamente sendo descritas abaixo para geração de M2014 de C. glutamicum podem ser usadas também alcançar supraexpressão de aslZbr, homfbr, metH, metA (também referido como metX), metY (também re- 20 ferido como metZ), e Iiskmutad0.
Para o propósito da presente invenção, metA denota uma ho- mosserina succiniltransferase, por exemplo, de E. eoli. MetY denota uma O- Acetil-homosserina sulfidrilase. Iiskmutado denota uma homosserina cinase que foi mutada para reduzir a atividade enzimática. Isto pode ser alcançado 25 trocando treonina com serina ou alanina em uma posição que corresponde a T190 de hsk da SEQ ID No. 19. Como alternativa ou adicionalmente, pode- se substituir o códon de começo ATG com um códon de começo TTG. Tais mutações levam a uma redução na atividade enzimática da proteína hsk re- sultante comparado o gene de hsk não-mutado.
Em outra modalidade preferida, um organismo de partida produ-
tor de metionina pode ser derivado de uma bactéria corineforme do tipo sel- vagem e preferivelmente de uma bactéria de C. glutamicum do tipo selva- gem contendo alterações genéticas em pelo menos um dos genes a seguir: ask?br, homfbr, metH, metA (também referido como metX), metY (também re- ferido como metZ), Iisl^utado e metF em que as alterações genéticas levam à supraexpressão de qualquer um destes genes, em combinação com as alte- 5 rações genéticas em pelo menos um dos genes a seguir: mcbR e metQ em que as alterações genéticas diminuem a expressão de qualquer um destes genes onde a combinação resulta em produção de metionina aumentada pelo micro-organismo com relação à produção de metionina na ausência da combinação. Em uma modalidade preferida, um tal organismo iniciador de 10 produção de metionina conterá alterações genéticas simultaneamente em asíZbr homfbr, metH, metA (também referido como metX), metY (também refe- rido como metZ), ^sZfmuiacto e metF em que as alterações genéticas levam à supraexpressão de qualquer um destes genes, em combinação com as alte- rações genéticas em mcbR e metQ em que as alterações genéticas diminu- 15 em a expressão de qualquer um destes genes onde a combinação resulta em produção de metionina aumentada pelo micro-organismo com relação à produção de metionina na ausência da combinação.
Nestes organismos de partida, as cópias endógenas de ask, hom e hsk são tipicamente substituídas como descrito acima enquanto as 20 cópias endógenas de mcbR e metQ são tipicamente de modo funcional rom- pidas ou deletadas. Uma cepa de C. Glutamicum incluindo estas alterações genéticas é, por exemplo, OM469 de C. glutamicum. A pessoa versada na técnica estará atenta que alterações genéticas alternativas àquelas especifi- camente sendo descritas abaixo para geração de OM469 de C. glutamicum 25 podem ser usadas também para alcançar supraexpressão de aslZbr, homfbr, metH, metA (também referido como metX), metY (também referido como metZ), hskmutad0 e metF e expressão reduzida de mcbR e metQ.
Para o propósito da presente invenção, metF denota uma N5,10- metileno-tetra-hidrofolato reductase (EC 1.5.1.20). McbR denota um regula- dor transcricional do tipo TetR do metabolismo de enxofre (n° de acesso do Genbank: AAP45010). MetQ denota uma lipoproteína Iigadora de D- metionina. O termo "enzima da via das pentoses-fosfato" no contexto da presente invenção refere-se ao conjunto de sete enzimas que participam na via das pentoses-fosfato de acordo com os livros padrão de ensino. Uma visão geral das vias metabólicas tais como a via das pentoses-fosfato pode 5 ser encontrada na Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (http://www.genome.jp/kegg/). Esta base de dados também fornece visão geral sobre as modificações específicas das espécies das vias metabólicas. Para o propósito da presente invenção, as enzimas a seguir formam parte da via das pentoses-fosfato:
· Glicose-6-fosfato-desidrogenase (zwf, g6pdh) (EC 1.1.1.49)
• 6-fosfo-glucono-lactonase (6pgl) (EC 3.1.1.31)
• 6-fosfo-gliconato-desidrogenase (6pgdh) (EC 1.1.1.44)
• Ribulose-5-fosfato epimerase (rpe) (EC 5.1.3.1)
• Ribose-5-fosfato isomerase (rpi) (EC 5.3.1.6.)
· Transcetolase (tkt) (EC 2.2.1.1.)
• Transaldolase {tal) (EC 2.2.1.2.)
O termo "aumentando a quantidade" de pelo menos uma enzima da via das pentoses-fosfato comparada a um organismo de partida, no con- texto da presente invenção, significa que uma bactéria corineforme é geneti- camente modificada para expressar uma quantidade mais alta de pelo me- nos uma das enzimas da via das pentoses-fosfato supracitadas. É para ser entendido que aumentando a quantidade de pelo menos uma enzima da via das pentoses-fosfato refere-se a.uma situação onde a quantidade de enzima funcional é aumentada. É considerado que uma enzima da via das pentoses- fosfato no contexto da presente invenção é funcional se for capaz de catali- sar a respectiva reação. Há várias opções para aumentar a quantidade de uma enzima em bactérias corineformes que são bem-conhecidas à pessoa versada na técnica. Estas opções incluem aumentar o número de cópias das seqüências de ácido nucleico que codificam as enzimas supracitadas, au- mentando a transcrição e/ou translação de tais seqüências de ácido nuclei- co. Estes várias opções serão debatidas em mais detalhes abaixo.
O termo "aumentando a atividade" de pelo menos uma enzima da via das pentoses-fosfato refere-se à situação que pelo menos uma muta- ção é introduzida nas respectivas seqüências do tipo selvagem da enzima supracitada que leva à produção de mais metionina comparada a uma situa- ção onde a mesma quantidade de enzima do tipo selvagem é expressada.
5 Produção aumentada como uma questão de introduzir versões mutadas de enzimas da via das pentoses-fosfato pode ser uma conseqüência, por e- xemplo, da inibição reduzida de retroalimentação. Desse modo, enzimas são conhecidas por reduzir sua atividade catalítica se, por exemplo, o produto final for produzido pela via metabólica em que a enzima participa em um 10 grau suficiente. É bem-conhecido que pode-se reprimir tal inibição de retroa- limentação introduzindo, por exemplo, substituições, inserções ou deleções de aminoácidos aos respectivo sítios de ligação reguladores nas enzimas. Tais versões resistentes à retroalimentação ou insensíveis à retroalimenta- ção da enzima continuarão exibindo uma atividade alta, portanto, até mesmo 15 quando uma quantidade de, por exemplo, um metabólito tiver sido produzido que do contrário infrarregularia a atividade da enzima. Além disso, a ativida- de de uma enzima pode ser aumentada introduzindo mutações que aumen- tam o giro catalítico de uma enzima.
É conhecido que as enzimas do PPP são reguladas no nível en- zimático através de moléculas pequenas (F Neidhardt, JL Ingraham, KB Low, B Magasanik, M Schaechter e HE Umbarger, eds. Em: Escherichia eoli and Salmonella typhimurium. Cellular and Molecular Biology, American Soci- ety for Microbiology, Washington, DC (1987). Estas enzimas incluem a glico- se-6-fosfato desidrogenase e 6-fosfogluconato desidrogenase que foram mostradas ser reguladas pela inibição através de efetores tais como NADP, NADPH, ATP, frutose 1,6-bis-fosfato (Fru1,6P2), 3-fosfato de D- gliceraldeído, 4-fosfato de eritrose e 5-fosfato de ribulose (Rib5P) e similares como descritos em S Moritz et al (Eur. J. Biochem. (2000), 267, 3442-52) e Onishi et al. (Micorbiol. Lett. (2005), 242, 265-74). Com este conhecimento à mão, a pessoa versada pode identificar, por exemplo, os sítios de ligação para os efetores acima mencionados e introduzir mutações nestes sítios que ou aumentarão ou diminuirão a afinidade da enzima para o respectivo regu- lador. Dependendo do efeito do regulador, a atividade enzimática pode ser aumentada.
Desse modo, o termo "aumentando a atividade" de pelo menos uma enzima refere-se à situação onde são introduzidas mutações na se- 5 quência do tipo selvagem de quaisquer das enzimas da via das pentoses- fosfato supracitadas para reduzir os mecanismos reguladores negativos tais como inibição de retroalimentação e/ou aumento do giro catalítico da enzi- ma.
Claro que as abordagens de aumentar a quantidade e/ou ativi- 10 dade de pelo menos uma enzima podem ser combinadas. Desse modo, por exemplo, é possível substituir a cópia endógena de pelo menos uma enzima da via das pentoses-fosfato em bactérias corineformes com um mutante que codifica para a versão insensível à retroalimentação das mesmas. Se trans- crição desta cópia mutada for determinada sob o controle do promotor forte, 15 a quantidade e a atividade da respectiva enzima é aumentada. É entendido que neste caso a enzima ainda deve ser capaz de catalisar a reação em que usualmente participa.
Com respeito às enzimas para as quais a quantidade e/ou ativi- dade é/são para ser aumentada(s) de acordo com a presente invenção, po- de-se usar as seqüências de ácido nucleico endógenas da respectiva bacté-
t·
ria corineforme e preferivelmente de C. glutamicum ou pode-se usar homó- logos funcionais das mesmas de outros organismos.
Desse modo, pode-se, por exemplo, aumentar a quantidade de glicose-6-fosfato desidrogenase em C. glutamicum supraexpressando a res- 25 pectiva seqüência de C. glutamicum, ou de um vetor de replicação autônoma ou de uma cópia cromossômica adicionalmente inserida (vide abaixo) ou pode-se usar as enzimas correspondentes de, por exemplo, Bacillus subtilis ou E. eoli e supraexpressar a enzima, por exemplo, mediante o uso de um vetor autonomamente replicável.
Em algumas circunstâncias, pode ser preferível usar as enzimas
endógenas, como a seqüência de codificação endógena, por exemplo, de C. glutamicum já está aperfeiçoada com respeito ao seu uso de códon para expressão em C. glutamicum.
Em uma modalidade preferida da invenção, a quantidade e/ou atividade de pelo menos uma enzima da via das pentoses-fosfato é/são au- mentada^) em C. glutamicum.
Em uma outra elaboração deste aspecto da invenção, usa-se as
respectivas seqüências de C. glutamicum para aumentar a quantidade e/ou atividade de pelo menos uma enzima da via das pentoses-fosfato.
A seqüência de ácido nucleico de C. glutamicum, glicose-6- fosfato-desidrogenase é descrita na SEQ ID NO. 1. A seqüência de aminoá- cido correspondente é descrita na SEQ ID NO. 2. O número de acesso do banco de genes (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) é CgM576.
A seqüência de ácido nucleico para 6-fosfogluconolactonase é descrita na SEQ ID NO. 3. A seqüência de aminoácido correspondente é descrita na SEQ ID NO. 4. O número de acesso do banco de genes é Ο- Ι 5 gl1578.
A seqüência de ácido nucleico para 6-fosfo-gliconato- desidrogenase é descrita na SEQ iD NO. 5. A seqüência de aminoácido é descrita na SEQ ID NO. 6. O número de acesso do banco de genes é C- gl1452.
A seqüência de ácido nucleico para ribulose-5-fosfato epimerase
é descrita na SEQ ID NO. 7. A seqüência de aminoácido é descrita na SEQ ID NO. 8. O número de acesso do banco de genes é CgH 598.
A seqüência de ácido nucleico para ribose-5-fosfato isomerase é descrita na SEQ ID NO. 9. A seqüência de aminoácido é descrita na SEQ ID NO. 10. O número de acesso do banco de genes é Cgl2423.
A seqüência de ácido nucleico para transcetolase de C. glutami- cum é descrita na SEQ ID NO. 11. A seqüência de aminoácido é descrita na SEQ ID NO. 12. O número de acesso do banco de genes é CgM 574.
A seqüência de ácido nucleico de transaldolase de C. glutami- cum é descrita na SEQ ID NO. 13. A seqüência de aminoácido correspon- dente é descrita na SEQ ID NO. 14. O número de acesso do banco de genes é Cgl1575. Os homólogos funcionais correspondentes para as enzimas de C. glutamicum supracitadas da via das pentoses-fosfato podem ser facilmen- te identificados pela pessoa versada para outros organismos por análises de homologia. Isto pode ser feito determinando a porcentagem de identidade 5 entre as seqüências de aminoácido ou de ácido nucleico para homólogos putativos e as seqüências para os genes ou proteínas codificadas por elas (por exemplo, seqüências de ácido nucleico para transcetolase, glicose-6- fosfato desidrogenase, 6-fosfo-gliconato desidrogenase e quaisquer dos ou- tros genes e proteínas mencionados acima ou abaixo codificados pelas 10 mesmas).
Porcentagem de identidade pode ser determinada, por exemplo, através de inspeção visual ou usando homologia com base em algoritmo.
Por exemplo, para determinar a porcentagem de identidade de duas seqüências de aminoácido, o algoritmo alinhará as seqüências para 15 propósitos ótimos de comparação (por exemplo, intervalos podem ser intro- duzidos na seqüência de aminoácido de uma proteína para alinhamento óti- mo com a seqüência de aminoácido de outra proteína). Os resíduos de ami- noácido nas posições de aminoácido correspondentes são depois compara- dos. Quando uma posição em uma seqüência for ocupada pelo mesmo resí- 20 duo de aminoácido que a posição correspondente na outra, então as molé- culas são idênticas naquela posição. A porcentagem de identidade entre as duas seqüências é uma função do número de posições idênticas comparti- lhadas pelas seqüências (isto é, % identidade = N0 de posições idênticas/N° total de posições multiplicado por 100).
Vários programas de computação são conhecidos na técnica
para estes propósitos. Por exemplo, porcentagem de identidade de duas seqüências de ácido nucleico ou de aminoácido pode ser determinada com- parando a informação de seqüência usando o programa de computação GAP descrito por Devereux et al. (1984) Nucl. Acids. Res., 12:387 e disponí- 30 vel da University of Wisconsin Genetics Computer Group (UWGCG). Porcen- tagem de identidade pode ser também determinada alinhando duas seqüên- cias de ácido nucleico ou de aminoácido usando o programa Basic Local Alignment Search Tool (BLAST®) (como descrito por Tatusova et al. (1999) FEMS Microbiol. Lett., 174:247.
Na data de depósito deste pedido de patente, um pacote de software padrão que fornece o programa BLAST pode ser encontrado no sítio de rede de BLAST do NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/). Por exemplo, se usar-se quaisquer dos SEQ IDs acima mencionados, pode-se executar uma pesquisa BLAST com base na seqüência de ácido nucleico ou seqüência de amino e identificar homólogos estritamente relacionados das respectivas enzimas, por exemplo, em E. eoli, S. cervisiae, Bacillus subtilis, etc. Por exemplo, para alinhamentos de seqüência de ácido nucleico usando o programa BLAST®, os ajustes predefinidos são como segue: recompensa para emparelhamento é 2, penalidade para disparidade é -2, penalidades de intervalo aberto e de intervalo de extensão são respectivamente 5 e 2, gap.times.dropoff é 50, expectativa é 10, tamanho de palavra é 11, e filtro é OFF.
Pesquisas e análise de seqüências comparáveis podem ser e- xecutadas na base de dados de EMBL (http://www.embl.org) ou na página inicial de Expasy (http://www.expasy.org/). Todas as pesquisas de seqüên- cias acima são tipicamente executadas com os parâmetros predefinidos co- 20 mo eles são pré-instalados pelos provedores de base de dados na data de depósito do presente pedido de patente. Pesquisas de homologia podem também ser habitualmente executadas usando programas de software tais como o software de gene a laser de DNA Star, Inc., Madison, Winconsin, EUA, usando o método de CLUSTAL (Higgins et al. (1989), Comput. Appl. 25 Biosci., 5(2) 151).
A pessoa versada entende que duas proteínas provavelmente executarão a mesma função (por exemplo, fornecer a mesma atividade en- zimática) se elas compartilharem um certo grau de identidade como descrito acima. Um limite inferior típico no nível de aminoácido é tipicamente pelo 30 menos cerca de 25% de identidade. No nível de ácido nucleico, o limite infe- rior é tipicamente pelo menos 45%.
Graus de identidade preferidos para ambos os tipos de sequên- cias são peio menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 60% ou menos cerca de 70%. Níveis de identidade mais preferidos são pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 90% ou pelo menos cerca de 95%. Estes ní- veis de identidade são considerados ser significativos.
5 Como aqui usado, os termos "homologia" e "homólogo" não são
limitados a designar proteínas tendo um antepassado genético comum teóri- co, mas incluem proteínas que podem ser geneticamente não-relacionadas que foram, não obstante, evoluídas para executar funções similares e/ou têm estruturas similares. O requerimento que os homólogos deveriam ser funcio- 10 nais significa que os homólogos aqui descritos abrangem proteínas tendo substancialmente a mesma atividade que a proteína de referência. Para qeu proteínas tenham homologia funcional, não é requerido necessariamente que elas tenham identidade significativa em suas seqüências de aminoácido, mas, do contrário, proteínas tendo homologia funcional são assim definidas 15 tendo atividades similares ou idênticas, por exemplo, atividades enzimáticas.
Preferivelmente, uma enzima de outro organismo que, por e- xemplo, as bactérias corineformes hospedeiras que serão consideradas ser um homólogo funcional apresenta pelo menos similaridade significativa, isto é, cerca de 50% de identidade de seqüência no nível de aminoácido, e cata- 20 lisa a mesma reação que sua contraparte na bactéria corineforme. Homólo- gos funcionais que fornecem a mesma atividade enzimática e compartilham um grau mais alto de identidade tal como pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80% ou pelo menos cerca de 90% de identidade de seqüência no nível de aminoácido são homólogos 25 funcionais preferidos também.
A pessoa versada na técnica sabe que aquele pode também u- sar fragmentos ou versões mutadas das enzimas acima mencionadas de bactérias corineformes e de seus homólogos funcionais em outros organis- mos contanto que estes fragmentos e versões mutadas exibam o mesmo 30 tipo de atividade funcional. Fragmentos funcionalmente ativos típicos exibi- rão deleções N-terminais e/ou C-terminais enquanto as versões mutadas tipicamente compreendem deleções, inserções ou mutações de ponto. A título de exemplo, uma seqüência de E. eoli será considerada para codificar para um homólogo funcional de glicose-6-fosfato- desidrogenase de C. glutamicum se exibir os níveis de identidade supracita- dos no nível de aminoácido para SEQ ID NO. 2 e exibir a mesma atividade 5 enzimática. Um exemplo é a contraparte de E. eoli (número de acesso do Genbank AP_002472. Pode-se também usar fragmentos ou, por exemplo, mutantes de ponto destas seqüências contanto que as proteínas resultantes ainda catalisem o mesmo tipo de reação que as enzimas de comprimento total.
De acordo com a presente invenção, aumentando a quantidade
e/ou atividade de pelo menos uma enzima da via das pentoses-fosfato per- mite a produção melhorada de metionina em bactérias corineformes.
Produção melhorada de metionina em bactérias corineformes significa inter alia aumentar a eficiência da síntese de metionina como tam- bém aumentar a quantidade de metionina produzida.
O termo "eficiência da síntese de metionina" descreve o rendi- mento de carbono da metionina. Esta eficiência é calculada como uma por- centagem da entrada de energia que entrou no sistema na forma de um substrato de carbono. Ao longo da invenção, este valor é dado por valores 20 percentuais ((mol de metionina) (mol de substrato de carbono ('1 x 100). O termo "eficiência aumentada da síntese de metionina" desse modo refere-se a uma comparação entre o organismo de partida e a bactéria corineforme atual em que a quantidade e/ou atividade de pelo menos uma das enzimas da via das pentoses-fosfato foi/foram aumentada(s).
Fontes de carbono preferidas de acordo com a presente inven-
ção são açúcares tais como mono-, di- ou polissacarídeos. Por exemplo, açúcares selecionados do grupo compreendendo glicose, frutose, hanose, galactose, ribose, sorbose, lactose, maltose, sucrose, rafinose, amido ou celulose podem servir como fontes de carbono particularmente preferidas.
Os métodos e bactérias corineformes de acordo com a invenção
podem ser também usados para produzir mais metionina comparado ao or- ganismo de partida. Os métodos e bactérias corineformes de acordo com a invenção podem ser também usados para produzir metionina a uma taxa mais rápida comparado ao organismo de partida. Se1 por exemplo, um período de produ- ção típico for considerado, os métodos e bactérias corineformes permitirão 5 produzir metionina a uma taxa mais rápida, isto é, a mesma quantidade de metionina será produzida em um ponto de tempo prematuro comparado ao organismo de partida. Isto particularmente solicita a fase de crescimento Io- garítmico.
Métodos e bactérias corineformes de acordo com a invenção 10 permitem produzir pelo menos cerca de 3 g de metionina/l de volume de cul- tura se a cepa for incubada em incubações em frascos agitados. Uma titula- ção de pelo menos cerca de 4 g de metionina/l de volume de cultura, pelo menos cerca de 5 g de metionina/l de volume de cultura ou pelo menos cer- ca de 7 g de metionina/l de volume de cultura pode ser preferida se a cepa 15 for incubada em incubações em frascos agitados. Um valor mais preferido soma pelo menos cerca de 10 g de metionina/l de volume de cultura e até mesmo mais preferivelmente para pelo menos cerca de 20 g de metionina/l de massa de célula se a cepa for incubada em incubações em frascos agita- dos.
Métodos e bactérias corineformes de acordo com a invenção
permitem produzir pelo menos cerca de 25 g de metionina/l de volume de cultura se a cepa for incubada em experimentos de fermentação usando um fermentador de fonte de carbono agitado e alimentado. Uma titulação de pe- lo menos cerca de 30 g de metionina/l de volume de cultura, pelo menos 25 cerca de 35 g de metionina/l de volume de cultura ou pelo menos cerca de 40 g de metionina/l de volume de cultura pode ser preferida se a cepa for incubada em experimentos de fermentação usando um fermentador de fonte de carbono agitado e alimentado. Um valor mais preferido soma pelo menos cerca de 50 g de metionina/l de volume de cultura e até mesmo mais preferi- 30 velmente pelo menos cerca de 60 g de metionina/l de massa de célula se a cepa for incubada em experimentos de fermentação usando um fermentador de fonte de carbono agitado e alimentado. Em uma modalidade preferida, os métodos e micro-organismos da invenção permitem aumentar a eficiência da síntese de metionina e/ou a quantidade de metionina e/ou a titulação e/ou a taxa da síntese de metionina em comparação ao organismo de partida em pelo menos cerca de 2%, pelo 5 menos cerca de 5%, pelo menos cerca de 10% ou pelo menos cerca de 20%. Em modalidades preferidas, a eficiência da síntese de metionina e/ou a quantidade de metionina e/ou a titulação e/ou a taxa é/são aumentada(s) comparado ao organismo de partida em pelo menos cerca de 30%, pelo me- nos cerca de 40%, ou pelo menos cerca de 50%. Até mesmo mais preferido 10 é um aumento de pelo menos cerca de fator 2, pelo menos cerca de fator 3, pelo menos cerca de fator 5 e pelo menos cerca de fator 10. Porém, já pode ser considerado que um aumento de cerca de 5% é uma melhoria significati- va.
De acordo com a presente invenção, produção de metionina em bactérias corineformes pode ser melhorada se a quantidade e/ou atividade de pelo menos uma das sete enzimas supracitadas for(em) aumentada(s) em comparação a um respectivo organismo de partida.
Em um aspecto, é preferido aumentar a quantidade e/ou ativida- de de transaldolase, glicose-6-fosfato-desidrogenase ou 6-fosfo-gliconato- desidrogenase. Até mesmo mais preferivelmente, isto é feito em C. glutami- cum.
Se a quantidade e/ou atividade de glicose-6-fosfato desidroge- nase for(em) para ser aumentada(s) em C. glutamicum, a pessoa versada estará atenta que deve também aumentar concomitantemente a quantidade 25 e/ou atividade da proteína de OCPA para a qual a seqüência de codificação fica localizada 3' do gene para glicose-6-fosfato desidrogenase no genoma em C. glutamicum. OCPA deveria ser concomitantemente supraexpressado uma vez que parece funcionar como uma plataforma na qual glicose-6- fosfato desidrogenase funcional é montada (Moritz et al (vide supra)). A se- 30 quência de ácido nucleico de OCPA de C. glutamicum é descrita na SEQ ID NO. 15. A seqüência de aminoácido correspondente é descrita na SEQ ID NO. 16. O número de acesso do banco de genes é CgM 577. Em outra modalidade, a quantidade e/ou atividade de pelo me- nos duas enzimas da via de pentose fosfato é/são aumentada(s) em compa- ração a um respectivo organismo de partida.
Em uma modalidade preferida, a quantidade e/ou atividade de 5 transcetolase e glicose-6-fosfato-desidrogenase, transcetolase e 6-fosfo- gliconato-desidrogenase ou glicose-6-fosfato-desidrogenase e 6-fosfo- gliconato-desidrogenase é/são aumentada(s) concomitantemente. Em uma outra elaboração deste aspecto posterior, isto é feito em C. glutamicum.
Em um aspecto da invenção, pode ser preferido aumentar con- comitantemente a quantidade e/ou atividade de transcetolase, glicose-6- fosfato-desidrogenase e 6-fosfo-gliconato-desidrogenase. Isto pode ser pre- ferivelmente feito em C. glutamicum.
Se a quantidade e/ou atividade de pelo menos quatro enzimas da via das pentoses-fosfato for(em) para ser aumentada(s) em bactérias co- 15 rineformes, isto é, preferivelmente feito concomitantemente aumentando a quantidade e/ou atividade de transcetolase, transaldolase, glicose-6-fosfato- desidrogenase e 6-fosfo-gliconato-desidrogenase. Isto pode ser preferivel- mente feito em C. Glutamicum.
A quantidade e/ou atividade das combinações de enzimas prefe- ridas supracitadas da via das pentoses-fosfato é/são preferivelmente aumen- tada^) em C. glutamicum. Para este fim, pode-se usar uma cepa do tipo selvagem tal como ATCC13032 ou uma cepa que carrega outras modifica- ções genéticas para aumentar e melhorar a síntese de metionina.
Uma tal cepa pode, por exemplo, expressar uma homosserina 25 desidrogenase resistente à retroalimentação (homfbr). Uma tal cepa pode também expressar o aspartato cinase resistente à retroalimentação (aslZbr). Um tal cepa pode exibir expressão adicionalmente aumentada de metionina sintase (metH). Uma cepa que é adequada para a produção de metionina e que superexpressa uma homosserina desidrogenase resistente à retroali- 30 mentação, um aspartato cinase resistente à retroalimentação e metionina sintase é, por exemplo, a DSM17322 acima mencionada do Exemplo.
Outras cepas de partida de C. glutamicum que podem ser prefe- rivelmente usadas para o propósito da presente invenção carregam as modi- ficações acima mencionadas de DSM17322 e são também aperfeiçoadas com respeito à síntese de metionina. Tais cepas podem, por exemplo, ex- pressar níveis aumentados de uma homosserina cinase mutada (Iiskmutad0), 5 uma homosserina succiniltransferase (metA), e uma O-Acetil-homosserina sulfidrilase (metY). Uma cepa que carrega todas estas alterações genéticas é, por exemplo, M2014 do Exemplo 1. Um organismo de partida particular- mente promissor em C. glutamicum para o propósito da presente invenção, portanto exibirá níveis aumentados de metH, metY e metA, homfbr, ask?br e 10 Iiskmutad0.
Um exemplo de uma homosserina desidrogenase resistente à retroalimentação carrega uma mutação de S393F na posição 393 da SEQ ID NO. 17. Este homfbr mostra inibição de retroalimentação reduzida através de treonina e/ou metionina. Um exemplo de um aspartato cinase 15 resistente à retroalimentação carrega uma mutação de T3111 na posição 311 da SEQ ID NO. 18. Esta asl/br mostra inibição de retroalimentação reduzida através de Iisina e/ou treonina. Uma homosserina cinase que carrega a mu- tação funcional acima mencionada carrega uma mutação T190A na posição 190 da SEQ ID NO. 19 ou uma mutação T190S na posição 190 ou um códon 20 de começo TTG.
O organismo de partida de C. glutamicum que pode carregar as alterações genéticas acima mencionadas tais como M2014 pode ser tam- bém melhorado excluindo as seqüências de ácido nucleico para o regulador negativo (mcbR) (Rey, D., et al. (2005) Mol. Microbiol., 56. 871-887, Rey, D., 25 et al. (2003) J. Biotechnol., 103, 51-65, US2005074802) e a lipoproteína Ii- gadora de D-metionina (metQ) como também aumentando expressão de N5,10-metileno-tetra-hidrofolato reductase (metF). Uma cepa corresponden- te é descrita no Exemplo 5 como OM469. Cepas que exibem alterações ge- néticas que são idênticas ou comparáveis com aquelas DSM17322, M2014 30 ou OM469 podem ser preferidas como organismo de partida de C. glutami- cums.
Pode-se aumentar a quantidade de uma enzima da via das pen- toses-fosfato em uma bactéria corineforme, por exemplo, aumentando o nú- mero de cópias de gene, isto é, o número de cópias da seqüência de ácido nucleico que codifica a dita enzima, aumentando a transcrição, aumentando a translação, e/ou uma combinação dos mesmos.
5 A pessoa versada na técnica está familiarizada com o tipo de
alterações genéticas que são necessários para aumentar o número de có- pias de gene das seqüências de ácido nucleico, aumentar a transcrição e/ou aumentar a translação.
Em geral, pode-se aumentar o número de cópia de uma sequên- 10 cia de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo expressando um vetor na bactéria corineforme que compreende a seqüência nucléica que codifica o dito polipeptídeo. Tais vetores podem ser replicáveis de forma autônoma de forma que eles podem ser estavelmente mantidos dentro da bactéria corine- forme. Vetores típicos para expressar polipeptídeos e enzimas da via das 15 pentoses-fosfato em C. glutamicum incluem pCliK pB e pEKO como descri- tos em Bott, M. e Eggeling, L., eds. Handbook of Corynebacterium glutami- cum. CRC Press LLC, Boca Raton, FL; Deb, J. K. et al. (FEMS Microbiol. Lett. (1999), 175(1), 11-20), Kirchner O. et al. (J. Biotechnol. (2003), 104 (1- 3), 287-299), W02006069711 e no W02007012078.
Em outra abordagem para aumentar o número de cópias de se-
qüências de ácido nucleico que codificam um polipeptídeo em uma bactéria corineforme, pode-se integrar cópias adicionais das seqüências de ácido nucleico que codificam tais polipeptídeos no cromossomo de C. glutamicum. Integração cromossômica pode, por exemplo, ocorrer no Iocus onde a cópia endógena do respectivo polipeptídeo está localizada. Adicional e/ou alterna- tivamente, multiplicação cromossômica de polipeptídeo que codifica as se- qüências de ácido nucleico pode ocorrer em outros Ioci no genoma de uma bactéria corineforme. No caso de C. glutamicum, há vários métodos conhe- ' cidos à pessoa versada na técnica para aumentar o número de cópias de gene através de integração cromossômica. Um tal método faz uso, por e- xemplo, do vetor pK19 sacB e foi descrito em detalhes na publicação de Scháfer A, et al. J Bacteriol. 1994 176(23): 7309-7319. Outros vetores para integração cromossômica de seqüências de ácido nucleico de codificação de polipeptídeo incluem ou pCLIK int sacB como descrito no W02005059093 ou W02007011845.
Aumento da quantidade de pelo menos uma enzima da via das 5 pentoses-fosfato pode ser também alcançado aumentando a transcrição das seqüências de ácido nucleico que codificam as respectivas enzimas. Trans- crição aumentada conduzirá a mais mRNA e por fim a uma quantidade mais alta de proteína transladada.
A pessoa versada na técnica está atenta que pode aumentar a 10 transcrição de uma seqüência de codificação em bactérias corineformes a- través de numerosas abordagens. Desse modo, pode-se aumentar a trans- crição usando promotores fortes e/ou elementos intensificadores fortes. Po- de-se também usar ativadores transcricionais tais como, por exemplo, aptâ- meros ou supraexpressar fatores de transcrição. O uso de promotores fortes 15 pode ser preferido no contexto da presente invenção.
É considerado que um promotor é um "promotor forte" no con- texto da presente invenção se ele provê um grau mais alto de transcrição para uma seqüência de ácido nucleico que codifica um respectivo polipeptí- deo que o promotor endógeno que precede a respectiva seqüência de ácido nucleico na situação do tipo selvagem.
Para o propósito da presente invenção, pode ser considerado o uso do promotor a seguir: PSod (SEQ ID NO. 20), Pgr0ES (SEQ ID NO. 21), Peftu (SEQ ID NO. 22) e XpR (SEQ ID NO. 23). Estes promotores são co- mumente usados em C. glutamicum supraexpressando polipeptídeos e a resistência dos promotores é considerada ter a ordem a seguir:
Pxr > Peftu > Psod > PgroES·
A pessoa versada na técnica está bem atenta sempre que pode não ser desejável usar promotores mais fortes tais como Xpr da lista supraci- tada. Em alguns casos pode ser necessário e suficiente, por exemplo, ape- 30 nas ligeiramente aumentar a quantidade de uma primeira enzima enquanto seria desejável aumentar a quantidade de uma segunda enzima tanto quan- to possível. Em uma tal situação, desse modo pode-se substituir os promoto- ).. *
res endógenos da primeira e segunda enzimas em C. glutamicum com Peftu e Xpr1 respectivamente. Além de usar promotores fortes transcricionalmente ativos, escolha e seqüência do assim chamado sítio de ligação ribossômico pode aumentar a quantidade de uma enzima significativamente tal como a- 5 quelas descritas acima. Por exemplo, seqüências de 5' adjacentes ao códon de começo tal como 15 bp a montante do códon de começo influencia a ati- vidade enzimática profundamente e pode ser encontradas nas seqüências de Peftu (SEQ ID NO. 22), PgroES (SEQ ID NO. 21), Psod (SEQ ID NO. 20) e λΡΚ (SEQ ID NO. 23).
Melhoria de translação pode ser alcançada, por exemplo, otimi-
zando o uso do códon das seqüências de ácido nucleico que codificam para as respectivas enzimas. Se usar as seqüências de ácido nucleico das enzi- mas hospedeiras, adaptação do uso do códon tipicamente não é necessária mas pode ser também aplicada. Se porém, a quantidade de por exemplo 15 glicose-6-fosfato-desidrogenase (e OCPA) for para ser aumentada através de supraexpressão da respectiva enzima de E. eoli em C. glutamicum, pode ser de valor considerar adaptar a seqüência de codificação da enzima de E. eoli ao uso de códon de C. glutamicum.
Em algumas modalidades da invenção, é preferido aumentar o 20 número de cópias das seqüências de ácido nucleico que codificam as enzi- mas da via das pentoses-fosfato integrando as respectivas seqüências de ácido nucleico às cópias múltiplas na posição do gene endógeno no cromos- somo da respectiva bactéria corineforme e preferivelmente em C. glutami- cum. Esta abordagem usualmente preserva a integridade genômica do ge- 25 noma tanto quanto possível.
A pessoa versada na técnica, claro, também visará uma combi- nação das abordagens acima mencionadas e desse modo considerará, por exemplo, aumentar a quantidade de glicose-6-fosfato-desidrogenase usando o promotor forte Psod e concomitantemente aumentando o número de cópia de gene para glicose-6-fosfato-desidrogenase em C. glutamicum.
Alguns dos genes que codificam para enzimas da via das pento- ses-fosfato são organizados em C. glutamicum em um óperon. Este óperon compreende os genes para transcetolase, 6-fosfo-glucono-lactonase, glico- se-6-fosfato-desidrogenase e o gene chamado OCPA. O gene para 6-fosfo- gliconato-desidrogenase não faz parte deste óperon em C. glutamicum.
De acordo com algumas das modalidades preferidas supracita- 5 das da invenção, é preferido aumentar a quantidade e/ou atividade de com- binações de transcetolase e 6-fosfo-gliconato-desidrogenase, transcetolase e glicose-6-fosfato-desidrogenase como também glicose-6-fosfato- desidrogenase e 6-fosfo-gliconato-desidrogenase. O aumento concomitante destas três enzimas é também preferido.
Em vista da estrutura genômica e localização destas três enzi-
mas em C. glutamicum, uma modalidade preferida da presente invenção refere-se, portanto, a métodos e organismos de C. glutamicum para produzir metionina na qual o promotor endógeno precedendo o gene de transcetolase em C. glutamicum é substituído por um promotor forte definido acima.
Em uma modalidade até mesmo mais preferida da presente in-
venção, o promotor endógeno que precede transcetolase em C. glutamicum é substituído com um promotor forte como definido acima, e a quantidade e/ou atividade de 6-fosfo-gliconato-desidrogenase é/são aumentada(s) como descrito acima. Usando uma tal abordagem, é possível alcançar um aumen- 20 to da quantidade das enzimas transcetolase, glicose-6-fosfato- desidrogenase e 6-fosfo-gliconato-desidrogenase opcionalmente em C. glu- tamicum fazendo modificações genéticas mínimas.
Foi também descoberto que pode preferivelmente usar o promo- tor de Psod ao substituir o promotor endógeno que precede o gene de trans- 25 cetolase em C. glutamicum, visto que este promotor assegura atividade transcricional eficiente para o propósito de aumentar a quantidade de trans- cetolase e os outros genes do óperon da via de pentose fosfato em C. glu- tamicum para produzir metionina. Similarmente, se aumentar a quantidade de 6-fosfo-gliconato-desidrogenase mediante o uso de um promotor forte, o 30 promotor de Psod é preferido.
Em uma modalidade particularmente preferida, a presente in- venção desse modo refere-se a um organismo de C. glutamicum em que o promotor endógeno que precede tkt em C. glutamicum é substituído por um promotor forte e em que o promotor endógeno que precede o gene de 6- fosfo-gliconato-desidrogenase é substituído por um promotor forte, o promo- tor forte preferivelmente sendo Psod- 5 Foi exposto acima que a atividade das enzimas da via das pen-
toses-fosfato pode ser aumentada introduzindo mutações nas seqüências de codificação destas enzimas que levam, por exemplo, às versões resistentes à retroalimentação das respectivas enzimas. Exemplos específicos para transcetolase, glicose-6-fosfato-desidrogenase e 6-fosfo-gliconato- desidrogenase serão fornecidos abaixo.
No caso de transcetolase de C. glutamicum, uma mutação de alanina em uma posição que corresponde a A293 da SEQ ID N0 12 para R e/ou alanina em uma posição que corresponde a A327 da SEQ ID N0 12 pa- ra T a troca leva a uma enzima com atividade enzimática melhorada. A pes- 15 soa versada na técnica poderá desenvolver outras mutações ou alternativas com base na informação fornecida.
Uma modalidade particularmente preferida da presente invenção refere-se a micro-organismos e métodos em que a atividade e quantidade das enzimas da via das pentoses-fosfato em C. glutamicum são aumentadas substituindo o promotor endógeno em frente ao gene de transcetolase de C.
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glutamicum com um promotor forte e preferivelmente com o promotor de Psod- Nesta modalidade, a transcetolase pode também carregar uma muta- ção que forneça o mesmo efeito que a mutação A293R e/ou A327T acima mencionada.
Alternativa e/ou adicionalmente, o gene de glicose-6-fosfato-
desidrogenase pode carregar mutações proveem um efeito similar que as mutações A293R e A327T supracitadas para transcetolase. Estas mutações podem ser, mas não são limitadas às posições que correspondem às posi- ções 243, e/ou 261, e/ou 288, e/ou 289, e/ou 371 da SEQ ID No. 2. Estas 30 posições podem ser mutadas de modo que a proteína resultante carregue outros aminoácidos que A243, A261, Q288, L289, V371 tais como mas não limitados a T243, P261, A288, R289, A371. Em uma outra elaboração desta modalidade preferida da pre- sente invenção, a quantidade e atividade da 6-fosfo-gliconato-desidrogenase em C. glutamicum é aumentada. A quantidade é preferivelmente aumentada usando um promotor forte, e preferivelmente por Psod- A atividade é aumen- 5 tada introduzindo mutações na seqüência de codificação do gene para 6- fosfo-gliconato-desidrogenase que fornece um efeito similar como as muta- ções A293R e A327T supracitadas em transcetolase. Em 6-fosfogluconato desidrogenase (SEQ ID No. 6), os aminoácidos que correspondem às posi- ções 150, 209, 269, 288, 329, 330 e/ou 353 da SEQ ID No. 6 podem ser mu- 10 tados de modo que a proteína resultante carregue outros aminoácidos que P150, R209, R269, A288, D329, V330, S353 tais como mas não limitados a 150S, 209P, 269K, 288R, 329G, 330L, 353F.
A pessoa versada na técnica sabe introduzir tais mutações de ponto nas seqüências endógenas, por exemplo, de C. glutamicum. Isto pode 15 ser alcançado, por exemplo, por integração cromossômica de uma seqüên- cia de ácido nucleico modificada que codifica para a versão mutada, por e- xemplo transcetolase, no Iocus natural da transcetolase em C. glutamicum. Integração cromossômica no Iocus original pode ser alcançada de acordo com o método de Scháfer A, et al. J Bacteriol. 1994 176(23): 7309-7319 e 20 W02007011845. Pode-se, claro, também usar, por exemplo, seqüências derivadas do gene que codifica para transcetolase de E. coli que carrega a mutação. Neste caso, a mutação deveria ser introduzida em uma posição que corresponde, por exemplo, à posição 293 e/ou 327 da SEQ ID NO. 12.
A presente invenção desse modo em geral refere-se a métodos 25 para aumentar a síntese de metionina em bactérias corineformes como tam- bém bactérias corineformes com síntese de metionina aumentada. Ambos os aspectos da invenção são caracterizados em que a quantidade e/ou ativi- dade das enzimas da via das pentoses-fosfato é/são aumentada(s). No que diz respeito aos métodos de acordo com a invenção, a quantidade e/ou ati- 30 vidade de pelo menos uma enzima da via das pentoses-fosfato é/são au- mentada^) em bactérias corineformes. No tocante às bactérias corinefor- mes, a invenção visa que a quantidade e/ou atividade de pelo menos duas I
das enzimas da via das pentoses-fosfato seja(m) aumentada(s).
Em modalidades preferidas da presente invenção, as quantida- des de enzimas da via das pentoses-fosfato são aumentadas em C. glutami- cum substituindo o promotor endógeno em frente ao gene de transcetolase 5 com um promotor forte que preferivelmente é o promotor de Psod- Em um outro desenvolvimento desta modalidade preferida, a quantidade de 6-fosfo- gliconato-desidrogenase é adicionalmente elevada, que pode ser também alcançada usando um promotor forte. Em modalidades que são até mesmo mais preferidas, não apenas substituir os promotores endógenos em frente 10 ao gene de transcetolase, mas um também introduzir mutações nas seqüên- cias de codificação do gene de transcetolase e opcionalmente do gene de glicose-6-fosfato-desidrogenase que adicionalmente aumenta a atividade destas enzimas. Um outro desenvolvimento deste aspecto preferido da in- venção inclui a característica pela qual a quantidade de 6-fosfo-gliconato- 15 desidrogenase é aumentada em C. glutamicum por exemplo substituindo o promotor de 6-fosfo-gliconato-desidrogenase endógeno com um promotor forte, preferivelmente com Psod e que a atividade de 6-fosfo-gliconato- desidrogenase é aumentada introduzindo as mutações acima descritas. Es- tas alterações genéticas preferidas podem ser introduzidas em qualquer ce- 20 pa de C. glutamicum. Se uma cepa do tipo selvagem for usada, ATCC13032
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pode ser preferida. Porém, em algumas modalidades é preferido usar cepas que já são consideradas que são os produtores de metionina, tais como DSM17322. Outras cepas preferidas incluem o tipo de alterações genéticas como descritas acima, isto é, um aumento de metY, metA, metH, hskfbr, 25 asrfbr e hommutad0. Uma cepa de C. glutamicum que carrega alterações gené- ticas correspondentes é, por exemplo, M2014. Tais cepas podem ser tam- bém melhoradas por deleção do regulador de mcbR, infrarregulação de metQ e aumento da expressão de metF. Uma cepa que reflete alterações ' genéticas correspondentes é OM469.
30 Tabela 1 abaixo dá uma visão geral sobre os números de aces-
so do Genbank das enzimas da via das pentoses-fosfato para organismos diferentes. Tabela 2 fornece números de acesso do Genbank de algumas das outras enzimas mencionadas acima para organismos diferentes.
Tabela 1 - Enzimas da via das pentoses-fosfato
Enzima Número de acesso do banco de genes Organismo Glicose-6- Cgl1576, BAB98969, NCgl1514, NCgl1514, Corynebac- fosfato- cg1778, CE1696, DIP1304, jk0994, terium glu¬ desidroge- RHA1_ro07184, nfa35750, MSMEG_3101, tamicum e nase Mmcs_2412, MAPI 176c, Mb1482c, MT1494, similares Rv1447c, SAV6313, AceM 124, SC01937, MAV_3329, Lxxl 1590, BL0440, Arth_2094, Tfu_2005, itte weitere angeben Proteína de Cgl1577, NP_738307.1, NP_939658.1, Corynebac- OPCA YP_250777.1, YP_707105.1, YP_119788.1, terium glu¬ ZP_01192082.1, NP_335942.1, ZP_01276169.1, tamicum e NP_215962.1, ZP_01684361.1, YP_887415.1, similares ZP_01130849.1, YP_062111.1, ZP_00615668.1, YP_953530.1, ZP_00995403.1, YP_882512.1, NP_960109.1, YP_290062.1, YP_831573.1, NP_827488.1, YP_947837.1, NP_822945.1, NP_626203.1, NP_630735.1, CAH10103.1, ZP_00120910.2, NP_695642.1, YP_909493.1, YP 872881.1, YP 923728.1, YP_056265.1, ZP_01648612.1, ZP_01430762.1, ZP_00569428.1, YP_714762.1, YP_480751.1, NP_301492.1, YP_642845.1, ZP_00767699.1 6- CgH 578, NCgM 516, NCgII 516, cg1780, Corynebac- fosfogluco- CE1698, DIP1306, Mmcs_2410, MSMEG_3099, terium glu¬ nolactonase Mb1480c, MT1492, Rv1445c, MAV_3331, tamicum e RHA1_ro07182, nfa35770, MAPI 174c, ML0579, similares jk0996, Tfu_2007, FRAAL4578, SAV6311, SC01939, SCC22.21, TW464 6-fosfo- CgM452, BAB98845, NCgM396, cgl1452, NC- Corynebac- gliconato- g!1396, cg 1643, DIP1213, CE1588, jk0912, terium glu¬ desidroge- RHA1_ro07246, nfa11750, Mmcs_2812, MS- tamicum e nase MEG_3632, MT1892, Rv1844c, MAV_2871, similares MAPI 557c, ML2065, SAV724, SC00975, SC- BAC19F3.02, BL0444, Lxx17380, Arth_2449, Mb1875c, OB0185 Bitte weitere angeben Enzima Número de acesso do banco de genes Organismo Ribuiose-5- CgM 598, cg1801, CE1717, DIP1320, MS- Corynebac- P- MEG_3066, Mb1443, MT1452, Rv1408, terium glu¬ epimerase MAV_3370, ML0554, jk1011, MAP1135, tamicum e RHA1_ro07167, Mmcs_2385, nfa36030, similares SC01464, SAV6880, FRAAL5223, AceM276, BL0753 Ribose-5-Ρ- Cgl2423, cg2658, CE2318, DIP1796, nfa13270, Corynebac- isomerase jk0541, RHA1_ro01378, MSMEG_4684, terium glu¬ Mmcs_3599, Mb2492c, Rv2465c, MT2540, tamicum e ML1484, MAV_1707, MAP2285C, SC02627, similares SAV5426, Tfu_2202, Arth_2408, PPA1624, Francci3_1162 Transceto¬ CgM 574, YP_225858, cg1774, CE1694, Corynebac- lase DIP1302, jk0992, nfa35730, RHA1_ro07186, terium glu¬ MSMEG_3103, MAPI 178c, ML0583, tamicum e MAV_3327, Mb1484c, MT1496, Rv1449c, similares Mmcs_2414, Tfu_2002, Arth_2097, Lxx11620, SAV1766, SC01935, AceM 127 Transaldo- CgM575, cg1776, CE1695, DIP1303, jk0993, Corynebac- Iase Mmcs_2413, MSMEG_3102, MAPI 177c, terium glu¬ RHA1_ro07185, MAV_3328, Mb1483c, Rv1448c, tamicum e MT1495, nfa35740, ML0582, Arth_2096, similares Lxxl 1610, SAV1767, Tfu_2003, SC01936, Francci3_1648 Tabela 2 - Enzimas de organismos produtores de metionina
Enzima Número de acesso do banco de genes Organis¬ mo Metileno Cgl2171, CE2066, cg2383, DIP1611, jk0737, C. gluta¬ tetra- RHA1_ro01105, nfa17400, Tfu_1050, Acel_0991, micum e hidrofolato SAV6100, SC02103, FRAAL2163, Francci3_1389, similares reductase aq_1429, TTC1656, TTHA0327, ELM 0095, (metF) CT1368, Sala_0035, DP1612, Pcar_1732 sintase de CgH 507, CE1637, cg1701, DIP1259, C. gluta¬ metionina RHA1_ro00859, nfa31930, Rv2124c, Mb2148c, micum e dependente ML1307, SC01657, Tfu_1825, SAV6667, Ar- similares de th_3627, AceM 174, MT2183, GOX2074, tll1027, cob(l)alami GbCGDNIH1_0151, Rru_A1531, alr0308, slr0212 na (metH) O-acetil- Cgl0653, NCgl0625, cg0755, CE0679, DIP0630, C. gluta¬ homosseri- jk1694, MAP3457, Mb3372, MT3443, Rv3340, micum e na sulf- nfa35960, Lxx18930, Tfu_2823, CAC2783, similares hidroiase GK0284, BH2603, Imo0595, Iin0604, (metY) LMOf2365_0624, ABC0432, TTE2151, BT2387, STH2782, str0987, stu0987, BF1406, SH0593, BF1342, lp_2536, L75975, OB3048, BL0933, LIC11852, LA2062, BMAA1890, BPSS0190, SMU.1173, BB1055, PP2528, PA5025, PB- PRB1415, GSU1183, RPA2763, WS1015, TM0882, VP0629, BruAb1_0807, BMEI1166, BR0793, CPS_2546, XC_1090, XCC3068, plu3517, PMT0875, SYNW0851, Pro0800, CT0604, NE1697, RB8221, bll1235, syc1143_c, ACIAD3382, ebA6307, RSc1562, Daro_2851, DP2506, DR0873, MA2715, PMM0642, PMN2A_0083, IL2014, SP01431, ECA0820, A- GR_C_2311, Atu1251, mlr8465, SMcOI 809, CV1934, SPBC428.11, PM0738, S01095, SAR11_1030, PFL_0498, CTC01153, BA_0514, BCE5535, BAS5258, GBAA5656, BA5656, BCZK5104, TTHA0760, TTC0408, BC5406, BT9727_5087, HH0636, YLR303W, ADL031W, CJE1895, spr1095, rrnAC2716, orfl 9.5645, Cj1727c, VNG2421G, PSPPHJ663, X001390, Psyr_1669, PSPT03810, MCA2488, TDE2200, Enzima Número de acesso do banco de genes Organis¬ mo FN1419, PG0343, Psyc_0792, MS1347, CC3168, Bd3795, MM3085, 389.Í00003, NMB1609, SAV3305, NMA1808, GOX1671, APE1226, XAC3602, NG01149, ZM00676, SC04958, I- pl0921, Ipg0890, Ipp0951, EF0290, BPP2532, CBU2025, BP3528, BLÍ02853, BL02018, BG12291, CG5345-PA, HP0106, ML0275, jhp0098, At3g57050, 107869, HI0086, NTHI0100, SpyM3_0133, SPsOI36, spyM18_0170, M6_Spy0192, SE2323, SERP0095, SPyOI 72, PAB0605, DDB0191318, ST0506, F22B8.6, PT01102, CPE0176, PD1812, XF0864, SAR0460, SACOL0503, SA0419, Ta0080, PF1266, MW0415, SAS0418, SS02368, PAE2420, TK1449, 1491, TVN0174, PH1093, VF2267, Saci_0971, W11364, CMT389C, W3008 Aspartato Cgl0251, NCgl0247, CE0220, DIP0277, jk1998, C. gluta¬ cinase (ask) nfa3180, Mb3736c, MT3812, Rv3709c, ML2323, micum e MAP0311C, Tfu_0043, Francci3_0262, SC03615, similares SAV4559, Lxx03450, PPA2148, CHY_1909, MCA0390, cbdb_A1731, TWT708, TW725, Gmet_1880, DET1633, GSU1799, Moth_1304, T- cr_1589, Mfla_0567, HCH_05208, PSPPH_3511, Psyr_3555, PSPT01843, CV1018, STH1686, NMA1701, Tbd_0969, NMB1498, Pcar_1006, Da- ro_2515, Csal_0626, Tmden_1650, PA0904, PP4473, Sde_1300, HH0618, NG00956, ACI- AD1252, PFL_4505, ebA637, Noc_0927, WS1729, Pcryo_1639, Psyc_1461, Pfl_4274, LIC12909, LA0693, Rru_A0743, NE2132, RB8926, Cj0582, Nmul_A1941, SYN_02781, TTHA0534, CJE0685, BURPS1710b_2677, BPSL2239, BMA1652, RSc1171, TTC0166, RPA0604, BTHJ1945, B- pro_2860, Rmet_1089, Reut_A1126, RPD_0099, Bxe_A1630, Bcepl 8194_A5380, aq_1152, RPB_0077, Rfer_1353, RPC_0514, BH3096, BLÍ02996, BL00324, amb1612, tlr1833, jhpl 150, blr0216, Dde_2048, BB1739, BPP2287, BP1913, DVU1913, Nwi_0379, ZM01653, Jann_3191, Enzima Número de acesso do banco de genes Organis¬ mo HP1229, Saro_3304, Nham_0472, CBU_1051, slr0657, SP03035, Synpcc7942_1001, BG10350, BruAb1_1850, BAB1_1874, BMEI0189, BT9727_1658, syc0544_d, BR1871, gll1774, BC1748, mll3437, BCE1883, ELM 4545, RSP 1849, BCZK1623, BAS1676, BA_2315, GBAA1811, BA1811, Ava_3642, alr3644, PSHA- a0533, AGR_L_1357, Atu4172, Iin1198, BH04030, PMT9312_1740, SMc02438, CYA_1747, RHE_CH03758, lmo1235, LMOf2365_1244, PMN2A_1246, CC0843, Pro1808, BQ03060, PMT0073, Syncc9902_0068, GOX0037, CYB_0217 Homosseri- Cgl0652, CE0678, CE0678, cg0754, DIP0623, C. gluta¬ na succinil- jk1695, nfa9220, RHA1_ro06236, MAP3458, micum e transferase MAV_4316, MSMEG_1651, Mmcs_1207, ML0682, similares (metA) Mb3373, Rv3341, MT3444, Tfu_2822, Arth_1318, Francci3_2831, Lxx18950, FRAAL4363, Cag_1206, Adeh_1400, Plut_0593, CT0605, CHY 1903, Moth_1308, Ava_4076, STH1685, SRU_0480, Mbur_0798, Mhun_2201, RPC_4281 Msp_0676 Homosseri- CgM 183, CE1289, cg1337, DIP1036, jk1352, C. gluta¬ na desidro- nfa10490, RHA1_ro01488, MSMEG_4957, micum e genase Mmcs_3896, MAV_1509, Mb1326, Rv1294, similares (hom) MT1333, MAP2468C, ML1129, SAV2918, SC05354, FRAAL5951, Francci3_3725, Tfu_2424, Acel_0630 Homosseri- CgM 184, cg0307, CE0221, DIP0279, jk1997, C. gluta¬ na cinase RHA1_ro04292, nfa3190, Mmcs_4888, MS- micum e (hsk) MEG_6256, MAP0310c, MAV_0394, Mb3735c, similares MT3811, Rv3708c, Acel_2011, ML2322, PPA0318, Lxx03460, SC02640, SAV5397, CC3485 Lipoprotei- YP 224930, NP_599871, NP_737241, C. gluta¬ na Iigante NP_938985, NP_938984, YP_701727, micum e de D- YP_251505, YP_120623, YP_062481, YP_056445, similares metionina ZP_00121548, NP_696133, YP_034633, (metQ) YP_034633, YP_081895, ZP_00390696, Enzima Número de acesso do banco de genes Organis¬ mo YP_016928, YP_026579, NP_842863, YP_081895, ZP_00240243, NP_976671 mcbR cg3253, CE2788, DIP2274, jk0101, nfa21280, C. gluta¬ MSMEG_4517Lxx16190, SC04454, micum e Bcepl 8194_A3587, Bamb_0404, Bcen2424_0499, similares Bcen_2606, Ava_4037, BTHJ2940, RHA1_ro02712, BMA10299_A1735, BMA- SAVP1_A0031, BMA2807, BURPS1710b_3614 Os números de acesso acima são os números de acesso oficiais
do Genbank ou são sinônimos aos números de acesso que têm referência cruzada no Genbank. Estes números podem ser pesquisados e encontrados em http://www.ncbi.nlm.nih.gov/.
5 Uma visão geral é dada abaixo para como aumentar e diminuir a
quantidade e/ou atividade de poiipeptídeos e genes em C. glutamicum. A pessoa versada na técnica pode confiar esta informação ao pôr as modali- dades além daquelas descritas nos exemplos abaixo em prática. AUMENTANDO OU INTRODUZINDO A QUANTIDADE E/OU ATIVIDADE Com respeito em aumentar a quantidade, dois cenários básicos
podem ser diferenciados. No primeiro cenário, a quantidade da enzima é aumentada por expressão de uma versão exógena da respectiva proteína. No outro cenário, expressão da proteína endógena é aumentada influenci- ando a atividade, por exemplo, do elemento dos sítios de ligação ribossômi- 15 co de promotor e/ou intensificadores e/ou outras atividades reguladoras que regulam as atividades das respectivas proteínas em um nível transcricional, translacional ou pós-translacional.
Desse modo, o aumento da atividade e da quantidade de uma proteína pode ser alcançado por meio de rotas diferentes, por exemplo tro- 20 cando mecanismos reguladores inibidores no nível transcricional, translacio- nal, e de proteína ou por aumento da expressão do gene de um ácido nucle- ico que codifica para estas proteínas comparado com o organismo de parti- da, por exemplo induzindo transcetolase endógena por um promotor forte e/ou introduzindo ácidos nucleicos que codificam para transcetolase. Em uma modalidade, o aumento da quantidade e/ou atividade das enzimas da Tabela 1 ou Tabela 2 é alcançada introduzindo ácidos nu- cleicos que codificam as enzimas da Tabela 1 ou Tabela 2 nas bactérias co- rineformes, preferivelmente C. glutamicum.
Em princípio, toda proteína de organismos diferentes com uma
atividade enzimática das proteínas listadas na Tabela 1 ou 2, pode ser usa- da. Com seqüências de ácido nucleico genômicas de tais enzimas de fontes eucarióticas contendo íntrons, seqüências de ácido nucleico já processadas como os cDNAs correspondentes são para ser usadas no caso como o or- 10 ganismo hospedeiro não é capaz ou não pode ser feito capaz de realizar o splicing dos mRNAs correspondentes. Todos os ácidos nucleicos menciona- dos na descrição podem ser, por exemplo, uma seqüência de RNA, DNA ou de cDNA.
De acordo com a presente invenção, aumentando ou introduzin- do a quantidade de uma proteína tipicamente compreende as etapas a se- guir:
a) produção de um vetor compreendendo as seqüências de áci- do nucleico a seguir, preferivelmente seqüências de DNA, em orientação 5'- 3':
- uma seqüência de promotor funcional nos organismos da in-
venção
- operativamente ligado a uma seqüência de DNA que codifica para uma proteína da este por exemplo Tabela 1, homólogos funcionais, fragmentos funcionais ou versões mutadas funcionais dos mesmos - uma seqüência de terminação funcional nos organismos da
invenção
b) transferência do vetor da etapa a) para os organismos da in- venção tais como C. glutamicum e, opcionalmente, integração nos respecti- vos genomas.
Como exposto acima, fragmentos funcionais refere-se a frag-
mentos de seqüências de ácido nucleico que codificam para enzimas, por exemplo, da Tabela 1 ou 2, a expressão destas ainda leva às proteínas ten- do atividade enzimática da respectiva proteína de comprimento total.
O método supracitado pode ser usado para aumentar a expres- são das seqüências de DNA que codificam para enzimas, por exemplo, da Tabela 1 ou fragmentos funcionais dos mesmos. O uso de tais vetores com- 5 preendendo seqüências reguladoras, como as seqüências promotoras e de terminação, é conhecido à pessoa versada na técnica. Além disso, a pessoa versada na técnica sabe como um vetor da etapa a) pode ser transferido para organismos tais como C. glutamicum e que as propriedades que um vetor tem que ter podem ser integradas em seus genomas.
De acordo com a presente invenção, um aumento da expressão
de gene de um ácido nucleico que codifica uma enzima da Tabela 1 ou 2 é também entendido ser a manipulação da expressão das respectivas enzimas endógenas de um organismo, em particular de C. glutamicum. Isto pode ser alcançado, por exemplo, alterando a seqüência de DNA de promotor para 15 genes que codificam estas enzimas. Uma tal alteração, que causa uma taxa de expressão alterada, preferivelmente aumentada, destas enzimas, pode ser alcançada por substituição com promotores fortes e através de deleção e/ou inserção das seqüências de DNA.
Uma alteração da seqüência de promotor dos genes endógenos usualmente causa uma alteração da quantidade expressa do gene e portan- to também uma alteração da atividade detectável na célula ou no organismo.
Além disso, uma expressão alterada e aumentada, respectiva- mente, de um gene endógeno pode ser alcançada por uma proteína regula- dora que não ocorre no organismo transformado e que interage com o pro- 25 motor destes genes. Um tal regulador pode ser uma proteína quimérica que consiste em um domínio de ligação de DNA e um domínio ativador de trans- crição, como por exemplo descrito em WO 96/06166.
Uma outra possibilidade para aumentar a atividade e o conteúdo dos genes endógenos é suprarregular os fatores de transcrição envolvidos na transcrição dos genes endógenos, por exemplo, por meio de supraex- pressão. As medidas para supraexpressão dos fatores de transcrição são conhecidas à pessoa versada na técnica. A expressão de enzimas endógenas tais como aqueles da Tabe- la 1 pode ser regulada, por exemplo, por meio da expressão de aptâmeros que especificamente ligam às seqüências de promotor dos genes. Depen- dendo do aptâmero que liga às regiões de promotor estimulantes ou repres- 5 soras, a quantidade das enzimas da Tabela 2 pode ser, por exemplo, au- mentado.
Além disso, uma alteração da atividade dos genes endógenos pode ser alcançada por mutagênese direcionada das cópias de gene endó- genas.
Uma alteração dos genes endógenos que codificam para as en-
zimas da Tabela 1, por exemplo, pode ser também alcançada influenciando as modificações pós-translacionais das enzimas. Isto pode ocorrer por e- xemplo regulando a atividade das enzimas como glicose-6-fosfato cinases ou desidrogenaseases envolvidas na modificação pós-translacional das en- 15 zimas por meio de medidas correspondentes como supraexpressão ou si- Ienciamento de gene.
Em outra modalidade, uma enzima pode ser melhorada em efi- ciência, ou sua região de controle alostérica destruída de modo que inibição de retroalimentação da produção do composto é impedida. Similarmente, 20 uma enzima degradante pode ser deletada ou modificada por substituição, deleção, ou adição de modo que sua atividade degradante é minorada para a enzima desejada da Tabela 1 sem prejudicar a viabilidade da célula. Em cada caso, o rendimento geral, taxa de produção ou quantidade de metioni- na é aumentada.
É também possível que tais alterações nas proteínas, por exem-
plo, da Tabela 1, possa melhorar a produção de outras químicas finas tais como outros compostos contendo enxofre como cisteína ou glutationa, ou- tros aminoácidos, vitaminas, cofatores, nutracêuticos, ácidos nucleicos, nu- cleosídeos, e trealose. Metabolismo de qualquer um composto pode ser en- 30 trelaçado com outras vias biossintéticas e degradantes dentro da célula, e cofatores, intermediários, ou substratos necessários em uma via podem ser providos ou limitados por outra tal via. Portanto, modulando a atividade de uma ou mais das proteínas da Tabela 1, a quantidade, eficiência e taxa das outras químicas finas, além de metionina, podem ser positivamente impacta- das.
Estas estratégias acima mencionadas para aumentar ou introdu- zir a quantidade e/ou atividade das enzimas da Tabela 1 não são significa- das ser limitativas; variações destas estratégias serão facilmente evidentes a um versado na técnica.
REDUZINDO A QUANTIDADE E/OU ATIVIDADE DAS ENZIMAS
Foi exposto acima que pode ser preferido usar organismo de partida que já foi aperfeiçoado para a produção de metionina. Em C. gluta- micum pode-se, por exemplo, infrarregular a atividade de metQ.
Para reduzir a quantidade e/ou atividade das enzimas, várias estratégias estão disponíveis.
A expressão de enzimas endógenas tais como aquelas da Tabe- 15 Ia 2 pode ser, por exemplo, regulada por meio da expressão de aptâmeros que especificamente ligam às seqüências de promotor dos genes. Depen- dendo do aptâmero que liga às regiões de promotor estimulantes ou repres- soras, a quantidade e desse modo, neste caso, a atividade, das enzimas da Tabela 2 pode ser por exemplo reduzida.
Aptâmeros podem também ser projetados de certo modo para
especificamente ligar às enzimas em si e reduzir a atividade das enzimas por exemplo ligando ao centro catalítico das respectivas enzimas. A expres- são de aptâmeros é usualmente alcançada por supraexpressão com base em vetor (vide acima) e é, como também o projeto e a seleção dos aptâme- 25 ros, bem-conhecida à pessoa versada na técnica (Famulok et ai, (1999) Curr Top Microbiol Immunol., 243,123-36).
Além disso, uma diminuição da quantidade e da atividade das enzimas endógenas da Tabela 2 pode ser alcançada por meio de várias me- didas experimentais que são bem-conhecidas à pessoa versada na técnica. 30 Estas medidas estão usualmente resumidas sob o termo "silenciamento de gene". Por exemplo, a expressão de um gene endógeno pode ser silenciada transferindo um vetor supracitado que tem uma seqüência de DNA que codi- fica para a enzima ou partes da mesma em ordem antissenso para organis- mos tais como C. glutamicum. Isto é com base no fato que a transcrição de um tal vetor na célula leva a um RNA que pode hibrida com o mRNA trans- crito pelo gene endógeno e portanto impede sua translação.
Em princípio, a estratégia antissenso pode ser acoplada com um
método de ríbozima. Ribozimas são seqüências de RNA cataliticamente ati- vas que, se acopladas às seqüências antissenso, cataliticamente clivam as sequências-alvo (Tanner et al., (1999) FEMS Microbiol Rev. 23 (3), 257-75). Isto pode intensificar a eficiência de uma estratégia antissenso.
Para criar um micro-organismo recombinante homólogo, um ve-
tor é preparado contendo pelo menos uma porção de gene que codifica para uma enzima da Tabela 1 à qual uma deleção, adição ou substituição foi in- troduzida para assim alterar, por exemplo, funcionalmente romper, o gene endógeno.
Em uma modalidade, o vetor é projetado de modo que, em re-
combinação homóloga, o gene endógeno seja rompido funcionalmente (isto é, já não codifica uma proteína funcional). Alternativamente, o vetor pode ser projetado de modo que, em recombinação homóloga, o gene endógeno seja mutado ou do contrário alterado mas ainda codifica a proteína funcional, por 20 exemplo, a região reguladora a montante pode ser alterada para assim alte- rar a expressão das enzimas endógenas, por exemplo, da Tabela 2. Esta abordagem pode ter a vantagem que expressão de uma enzima não é aboli- da completamente, mas reduzida para o nível mínimo requerido. A pessoa versada sabe que vetores podem ser usados para substituir ou excluir se- 25 quências endógenas. Para. C. glutamicum, tais vetores incluem pK19 e p- CLIK int sacB. Uma descrição específica para romper seqüências cromos- sômicas em C. glutamicum é fornecida abaixo.
Além disso, repressão de gene é possível reduzindo a quantida- de de fatores de transcrição.
Fatores que inibem a própria proteína-alvo podem ser também
introduzidos em uma célula. Os fatores de ligação de proteína podem ser, por exemplo, os aptâmeros supracitados (Famulok et al., (1999) Curr Top λ.*
Microbiol lmmunol. 243, 123-36).
Como outros fatores de ligação de proteína, a expressão destes pode causar uma redução da quantidade e/ou da atividade das enzimas da tabela 1, anticorpos enzima-específicos podem ser considerados. A produ- 5 ção de anticorpos enzima-específicos recombinantes tais como anticorpos de cadeia simples é conhecida na técnica. A expressão de anticorpos é tam- bém conhecida da literatura (Fiedler et al., (1997) Immunotechnology 3, 205- 216; Maynard e Georgiou (2000) Annu. Rev. Biomed. Eng. 2, 339-76).
As técnicas mencionadas são bem-conhecidas à pessoa versa- 10 da na técnica. Portanto, o versado também sabe o tamanho típico que umas construções de ácido nucleico usadas, por exemplo, para os métodos antis- senso têm que ter e que complementaridade, homologia ou identidade as respectivo seqüências de ácido nucleico têm que ter. Os termos complemen- taridade, homologia, e identidade são conhecidos à pessoa versada na téc- 15 nica.
O termo complementaridade descreve a capacidade de uma mo- lécula de ácido nucleico para hibridar com outra molécula de ácido nucleico devido às ligações de hidrogênio entre as duas bases complementares. A pessoa versada na técnica sabe que duas moléculas de ácido nucleico não 20 têm que exibir uma complementaridade de 100% para serem capazes de hibridarem entre si. Uma seqüência de ácido nucleico que é hibridada com outra seqüência de ácido nucleico é preferivelmente pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, preferivelmente pelo menos 70%, particularmente preferido pelo menos 80%, também particularmente 25 preferido pelo menos 90%, em particular preferido pelo menos 95% e mais preferivelmente pelo menos 98 ou 100%, respectivamente, complementar com a dita outra seqüência de ácido nucleico.
A hibridação de uma seqüência antissenso com uma seqüência de mRNA endógena tipicamente ocorre in vivo sob condições celulares ou in vitro. De acordo com a presente invenção, hibridação é realizada in vivo ou in vitro sob condições que são rigorosas o bastante para assegurar uma hi- bridação específica. Condições de hibridação rigorosas in vitro são conhecidas à pessoa versada na técnica e podem ser tiradas da literatura (vide, por e- xemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Press (2001)). O termo "hibridação específica" refere-se ao caso em que uma mo- 5 lécula liga-se preferencialmente a uma certa seqüência de ácido nucleico sob condições rigorosas, se esta seqüência de ácido nucleico faz parte de uma mistura complexa de, por exemplo, moléculas DNA ou de RNA.
O termo "condições rigorosas", portanto, refere-se às condições sob as quais uma seqüência de ácido nucleico liga-se preferencialmente a uma sequência-alvo, mas não, ou pelo menos até uma extensão significati- vamente reduzida, a outras seqüências.
Condições rigorosas são dependentes das circunstâncias. Se- qüências mais longas especificamente hibridam-se em temperaturas mais altas. Em geral, condições rigorosas são escolhidas em um tal modo que a 15 temperatura de hibridação fique cerca de 5°C abaixo do ponto de fundição (Tm) da seqüência específica com uma resistência iônica definida e um valor de pH definido. Tm é a temperatura (com um valor de pH definido, uma re- sistência iônica definida e uma concentração de ácido nucleico definida) na qual 50% das moléculas que são complementares a uma sequência-alvo 20 hibridam-se com a dita sequência-alvo. Tipicamente, condições rigorosas compreendem concentrações de sal entre 0,01 e 1,0 M íons de sódio (ou íons de outro sal) e um valor de pH entre 7,0 e 8,3. A temperatura é pelo menos 30°C para moléculas curtas (por exemplo, para tais moléculas com- preendendo entre 10 e 50 ácidos nucleicos). Além disso, condições rigoro- 25 sas podem compreender a adição de agentes desestabilizantes como, por exemplo, formamida. Hibridação típica e tampões de lavagem são da com- posição a seguir.
Solução de Pré-hibridação:
0,5% SDS 5x SSC
NaPO4 a 50 mM, pH 6,8 0,1% Na-pirofosfato 5x reagente de Denhardt 100 μ9/β5ρβπτΐ3 de salmão Solução de hibridação:
Solução de Pré-hibridacão 1x106 cpm/ml de sonda (5-10 min 95°C)
20x SSC:
NaCI a 3 M
citrato de sódio a 0,3 M ad pH 7 com HCI 50x reagente de Denhardt:
5 g Ficoll
5 g polivinilpirrolidona 5 g Albumina de Soro Bovino ad 500 ml A. dest.
Um procedimento típico para a hibridação é como segue:
Opcional: lavar Blot 30 min em 1x SSC / 0,1% SDS a 65°C
Pré-hibridação: pelo menos 2 h a 50-55°C Hibridação: durante noite a 55-60°C Lavagem: 05 min 2x SSC / 0,1% SDS
Temperatura de hibridação
30 min 2x SSC / 0,1 % SDS
Temperatura de hibridação
30 min IxSSC/0,1% SDS
Temperatura de hibridação 45 min 0,2x SSC / 0,1% SDS 65°C
5 min O1IxSSC temperatura ambiente
Para propósitos antissenso, complementaridade em comprimen- tos de seqüência de 100 ácidos nucleicos, 80 ácidos nucleicos, 60 ácidos nucleicos, 40 ácidos nucleicos e 20 ácidos nucleicos pode bastar. Compri- mentos de ácidos nucleicos mais longos certamente também bastaram. Uma aplicação combinada dos métodos supracitados é também concebível.
Se, de acordo com a presente invenção, as seqüências de DNA forem usadas, que são operativamente ligadas em orientação 5-3' a um promotor ativo no organismo, vetores podem, em geral, ser construídos que, após a transferência para as células do organismo, permitem a supraexpres- são da seqüência de codificação ou causam a supressão ou competição e 5 bloqueio das seqüências de ácido nucleico endógenas e as proteínas ex- pressas das mesmas, respectivamente.
A atividade de uma enzima particular pode ser também reduzida supraexpressando um mutante não-funcional da mesma no organismo. Des- se modo, um mutante não-funcional que não é capaz de catalisar a reação 10 em questão, mas que é capaz de ligar, por exemplo, o substrato ou cofator, pode, por via de supraexpressão competir a enzima endógena e, portanto, inibir a reação. Outros métodos para reduzir a quantidade e/ou atividade de uma enzima em uma célula hospedeira são bem-conhecidos à pessoa ver- sada na técnica.
De acordo com a presente invenção, as enzimas não-funcionais
têm essencialmente as mesmas seqüências de ácido nucleico e seqüências de aminoácido, respectivamente, como enzimas funcionais e funcionalmente fragmentos das mesmas, mas têm, em algumas posições, mutações de pon- to, inserções ou deleções de ácidos nucleicos ou aminoácidos, que têm o 20 efeito que a enzima não-funcional não é apenas em uma extensão muito limitada capaz de catalisar a respectiva reação. Estas enzimas não- funcionais podem não ser misturadas com as enzimas que ainda são capa- zes de catalisar a respectiva reação, mas que não são mais reguladas por retroalimentação. De acordo com a presente invenção, o termo "enzima não- 25 funcional" não compreende tais proteínas tendo nenhuma homologia de se- qüência substancial para as respectivas enzimas funcionais no nível de ami- noácido e nível de ácido nucleico, respectivamente. Proteínas incapazes de catalisar as respectivas reações e não tendo nenhuma homologia de se- qüência substancial com a respectiva enzima são, portanto, por definição, 30 não significadas pelo termo "enzima não-funcional" da presente invenção. Enzimas não-funcionais são, dentro do escopo da presente invenção, tam- bém referidas como enzimas inativadas ou inativas. λ.*
Portanto, enzimas não-funcionais, por exemplo, da Tabela 2 de acordo com a presente invenção que carregam as mutações de ponto, in- serções, e/ou deleções supracitadas são caracterizadas por uma homologia de seqüência substancial às enzimas do tipo selvagem, por exemplo, da Ta- 5 bela 2 de acordo com a presente invenção ou partes funcionalmente equiva- lentes das mesmas. Para determinar uma homologia de seqüência substan- cial, os graus de identidade acima descritos são para ser aplicados. VETORES E CÉLULAS HOSPEDEIRAS
Um aspecto da invenção refere-se a vetores, preferivelmente vetores de expressão, contendo umas seqüências de ácido nucleico como mencionadas acima. Como aqui usado, o termo "vetor" refere-se a uma mo- lécula de ácido nucleico capaz de transportar outro ácido nucleico ao qual foi ligado.
Um tipo de vetor é um "plasmídeo" que se refere a uma alça de DNA de fita dupla circular à qual segmentos de DNA adicionais podem ser ligados. Outro tipo de vetor é um vetor viral, em que segmentos de DNA adi- cionais podem ser ligados no genoma viral.
Certos vetores são capazes de replicação autônoma em uma célula hospedeira à qual eles são introduzidos (por exemplo, vetores bacte- 20 rianos que têm uma origem bacteriana de replicação e vetores mamíferos epissomais). Outros vetores são integrados no genoma de uma célula hos- pedeira sob introdução na célula hospedeira, e assim são replicados junto com o genoma hospedeiro. Além disso, certos vetores são capazes de dire- cionar a expressão dos genes aos quais eles são operativamente ligados.
Tais vetores são referidos aqui como "vetores de expressão".
Em geral, vetores de expressão de utilidade nas técnicas de DNA recombinante são frequentemente na forma de plasmídeos. No presen- te relatório descritivo, "plasmídeo" e "vetor" podem ser usados alternada- mente como o plasmídeo é a forma mais comumente usada de vetor. Po- 30 rém, é intencionado que a invenção inclua outras formas de vetores de ex- pressão, tais como vetores virais que servem funções equivalentes.
Os vetores de expressão recombinantes da invenção podem compreender um ácido nucleico como mencionado acima em uma forma adequada para expressão do respectivo ácido nucleico em uma célula hos- pedeira que significa que os vetores de expressão recombinantes incluem uma ou mais seqüências reguladoras, selecionadas em base das células 5 hospedeiras a serem usadas para expressão que é operativamente ligada à seqüência de ácido nucleico a ser expressada.
Para o propósito da presente invenção, uma ligação operativa é entendida ser o arranjo seqüencial de promotor, seqüência de codificação, terminador e, opcionalmente, outros elementos reguladores em um tal modo que cada um dos elementos reguladores podem cumprir sua função, de a- cordo com sua determinação, ao expressar a seqüência de codificação.
Dentro de um vetor de expressão recombinante, "operavelmente ligado" é desse modo intencionado significar que a seqüência de ácido nu- cleico de interesse é ligada à(s) sequência(s) reguladora(s) de uma maneira 15 que permite a expressão da seqüência de ácido nucleico (por exemplo, em um sistema de transcrição/translação in vitro ou em uma célula hospedeira quando o vetor for introduzido na célula hospedeira). O termo "seqüência reguladora" é intencionado incluir os promotores, sítios de ligação de repres- sor, sítios de ligação de ativador, intensificadores e outros elementos de con- 20 trole de expressão (por exemplo, terminadores ou outros elementos da es- trutura secundária de mRNA). Tais seqüências reguladoras são descritas, por exemplo, em Goeddel; Gene Expression Technology: Methods in Enzy- mology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990). Seqüências regulado- ras incluem aquelas que direcionam expressão constitutiva de uma sequên- 25 cia de ácido nucleico em muitos tipos de células hospedeiras e aquelas que dirigem a expressão da seqüência de ácido nucleico apenas em certas célu- las hospedeiras. Seqüências reguladoras preferidas são, por exemplo, pro- motores tais como cos-, tac-, trp-, tet-, trp-, tet-, Ipp-, lac-, Ipp-lac-, laclq-, T7-, T5-, T3-, moça-, trc-, ara-, SP6-, arny, SP02, SOD, EFTu, EFTs, GroEL, 30 Metz (todos de C. glutamicum) que são usados preferivelmente em bacté- rias. É também possível usar promotores artificiais. Será apreciado por al- guém de habilidade usual na técnica que o projeto do vetor de expressão pode depender de tais fatores como a escolha da célula hospedeira a ser transformada, o nível de expressão de proteína desejado, etc. Os vetores de expressão da invenção podem ser introduzidos em células hospedeiras para assim produzir proteínas ou peptídeos, incluindo proteínas ou peptídeos de fusão, codificados pelas seqüências de ácido nucleico supracitadas.
Expressão das proteínas em procariotos é mais frequentemente realizada com vetores contendo promotores constitutivos ou induzíveis que direcionam a expressão das proteínas de fusão ou de não-fusão.
Vetores de fusão acrescentam vários aminoácidos a uma proteí- na codificada neles, usualmente para o término amino da proteína recombi- nante mas também para o término C ou fundido dentro das regiões adequa- das nas proteínas. Tais vetores de fusão tipicamente servem três 4 propósi- tos: 1) aumentar a expressão da proteína recombinante; 2) aumentar a solu- bilidade da proteína recombinante; e 3) auxiliar na purificação da proteína recombinante agindo como um Iigante na purificação por afinidade 4) forne- cer um "marcador" para detecção posterior da proteína. Frequentemente, nos vetores de expressão de fusão, um sítio de clivagem proteolítico é intro- duzido na junção da metade de fusão e da proteína recombinante para per- mitir separação da proteína recombinante da metade de fusão subsequente para purificação da proteína de fusão. Tais enzimas, e suas seqüências de reconhecimento de cognato, incluem Fator Xa1 trombina e enterocinase.
Vetores de expressão de fusão típicos incluem pGEX (Pharma- cia Biotech Inc; Smith, D. B. e Johnson, K. S. (1988) Gene 67: 31-40), pMAL (New England Biolabs, Beverly, MA) e pRIT5 (Pharmacia, Piscataway, NJ) que fundem GIutationA S-transferase (GST), proteína Iigadora E de maltose, ou proteína A, respectivamente.
Exemplos de vetores de expressão de não-fusão induzíveis a- dequados para bactérias corineformes incluem pHM1519, pBLI, pSA77 ou pAJ667 (Pouwels et al., eds. (1985) Cloning Vectors. Elsevier: Nova Iorque 30 IBSN 0 444 904018). Exemplos de vetores ponte de C. glutamicum e E. coli adequados são por exemplo pK19, pClik5aMCS pCLIKint sacB ou pode ser encontrado em Eikmanns et al (Gene. (1991) 102, 93-8) e nas publicações e pedidos de patente a seguir (Scháfer A, et al. J Bacteriol. 1994 176: 7309- 7319, Bott1 M., e Eggeling, L., eds. Handbook of Corynebacterium glutami- cum. CRC Press LLC, Boca Raton, FL W02006069711, W02006069711). Para outros sistemas de expressão adequados para células procarióticas e 5 eucarióticas vide capítulos 16 e 17 de Sambrook, J. et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 3a ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY1 2003.
DNA de vetor pode ser introduzido em procariótico por meio de técnicas transformação ou transfecção convencionais. Como aqui usado, os termos "transformação" e "transfecção", "conjugação" e "transdução" são intencionados a referir-se a uma variedade de técnicas reconhecidas na téc- nica para introduzir ácido nucleico estranho (por exemplo, DNA ou RNA line- ar (por exemplo, um vetor Iinearizado ou uma construção de gene sozinho sem um vetor) ou ácido nucleico na forma de um vetor (por exemplo, um plasmídeo, fago, fasmídeo, fagemídeo, transpóson ou outro DNA em uma célula hospedeira, incluindo co-precipitação de fosfato de cálcio ou de clore- to de cálcio, transfecção mediada por DEAE-dextrano, lipofecção, compe- tência natural, transferência mediada por químicas, ou eletroporação. Méto- dos adequados para transformar ou transfeccionar células hospedeiras po- dem ser encontrados em Sambrook, et al. (Molecular Cloning : A Laboratory Manual. 3a ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Labora- tory Press, Cold Spring Harbor, NY, 2003), e outros manuais de laboratório.
A fim de identificar e selecionar estes integrantes, um gene que codifica um marcador selecionável (por exemplo, resistência a antibióticos) é 25 em geral introduzido nas células hospedeiras juntamente com o gene de in- teresse. Marcadores selecionáveis preferidos incluem aqueles que conferem resistência a fármacos, tais como G418, higromicina, canamicina, tetracicli- na, cloranfenicol, ampicilina e metotrexato. Ácido nucleico que codifica um marcador selecionável pode ser introduzido em uma célula hospedeira no 30 mesmo vetor como que codificando as seqüências de ácido nucleico supra- citadas modificadas ou podem ser introduzidos em um vetor separado. Célu- las estavelmente transfeccionadas com o ácido nucleico introduzido podem ser identificadas através de seleção de fármaco (por exemplo, células que incorporaram o gene marcador selecionável sobreviverão, enquanto as ou- tras células morrerão).
Em outra modalidade, micro-organismos recombinantes podem 5 ser produzidos que contém sistemas selecionados que permitem expressão regulada do gene introduzido. Por exemplo, inclusão de uma das seqüências de ácido nucleico supracitadas em um vetor que a coloca sob controle do Iac óperon permite expressão do gene apenas na presença de IPTG. Tais sis- temas reguladores são bem-conhecidos na técnica.
Outro aspecto da invenção diz respeito a organismos ou células
hospedeiras às quais um vetor de expressão recombinante da invenção foi introduzido. Os termos "célula hospedeira" e "célula hospedeira recombinan- te" são usados alternadamente aqui. É entendido que tais termos não só referem-se à célula em questão particular mas também à progênie ou pro- 15 gênie potencial de uma tal célula. Porque certas modificações podem ocorrer em gerações sucessivas devido à mutação ou influências ambientais, tal progênie não pode, de fato, ser idêntico à célula-pai, mas ainda é incluída dentro do escopo do termo como aqui usado.
CRESCIMENTO DE MEIOS DE C. Glutamicum E CONDIÇÕES DE CUL- TURA
Um ensinamento pedagógico geral e dado abaixo sobre o cultivo de C. glutamicum. Adaptações serão óbvias à pessoa versada cuja informa- ção correspondente pode ser recuperada de livros de ensino padrões para cultivo de E. coli.
Corineibactérias geneticamente modificadas são tipicamente
cultivadas em meios de crescimento sintéticos ou naturais. Vários meios de crescimento diferentes para corineibactérias são bem-conhecidos e facil- mente disponíveis (Lieb et al. (1989) Appi Microbioi Biotechnoi, 32: 205- 210; von der Osten et al. (1998) Biotechnology Letters, 11: 11-16; Patente 30 DE 4.120.867; Liebl(1992) "The Genus Corynebacterium, in: The Procaryo- tes, Volume II, Balows, A., et al., eds. Springer-Verlag).
Estes meios consistem em uma ou mais fontes de carbono, fon- tes de nitrogênio, sais inorgânicos, vitaminas e elementos de traço. Fontes de carbono preferidas são açúcares, tais como mono, di, ou polissacarídeos. Por exemplo, glicose, frutose, manose, galactose, ribose, sorbose, ribose, lactose, maltose, sucrose, rafinose, amido ou celulose servindo como fontes 5 de carbono muito boas.
É também possível prover açúcar aos meios por meio de com- postos complexos tais como melado ou outros subprodutos de refinamento do açúcar. Pode ser também vantajoso prover misturas de fontes de carbono diferentes. Outras possíveis fontes de carbono são álcoois e ácidos orgâni- 10 cos, tais como metanol, etanol, ácido acético ou ácido láctico. Fontes de ni- trogênio são compostos de nitrogênio usualmente orgânicos ou inorgânicos, ou materiais contendo estes compostos. Fontes de nitrogênio exemplares incluem gás de amônia ou sais de amônia, tais como NH4CI ou (NH4)2SO4, NH4OH, nitrato, uréia, aminoácidos ou fontes de nitrogênio complexas como 15 licor de maceração de milho, farinha de feijão de soja, proteína de feijão de soja, extrato de levedura, extrato de carne e similares.
Compostos de sais inorgânicos que podem ser incluídos nos meios incluem os sais de cloreto, fósforo ou sulfato de cálcio, magnésio, só- dio, cobalto, molibdênio, potássio, manganês, zinco, cobre e ferro. Compos- 20 tos quelantes podem ser acrescentados ao meio para manter os íons de me- tal na solução. Compostos quelantes particularmente úteis incluem di- hidroxifenóis, como catecol ou protocatechuato, ou ácidos orgânicos, tais como ácido cítrico. É típico para os meios também conterem outros fatores de crescimento, tais como vitaminas ou promotores de crescimento, exem- 25 pios destes incluem biotina, riboflavina, tiamina, ácido fólico, ácido nicotínico, pantotenato e piridoxina. Fatores de crescimento e sais frequentemente ori- ginam-se de componentes de meios complexos tais como extrato de levedu- ra, melado, licor de maceração de milho e similares. A composição exata dos compostos de meios depende fortemente do experimento imediato e é 30 decidida individualmente para cada caso específico. Informação acerca da otimização dos meios está disponível no livro de ensino "Applied Microbiol. Physiology, A Practical Approach (Eds. P. M. Rhodes, P. F. Stanbury, IRL Press (1997) págs. 53-73, ISBN 0 19 963577 3). É também possível selecio- nar meios de crescimento de fornecedores comerciais, como padrão 1 (Merck) ou BHI (infusão de cérebro-coração, DIFCO) ou outros.
Todos os componentes dos meios deveriam ser esterilizados, ou 5 através de calor (20 minutos a 0,15 mPa (1,5 bar) e 121 °C) ou através de filtração estéril. Os componentes podem ser esterilizados juntos ou, se ne- cessário, separadamente.
Todos os componentes dos meios podem estar presentes no começo de crescimento, ou eles podem ser opcionalmente adicionados con- tinuamente ou em modo de batelada. Condições de cultura são separada- mente definidas para cada experimento.
A temperatura deveria ser em uma faixa entre 15°C e 45°C. A temperatura pode ser mantida constante ou pode ser alterada durante o ex- perimento. O pH do meio pode ser na faixa de 5 a 8,5, preferivelmente ao 15 redor de 7,0, e pode ser mantido pela adição de tampões aos meios. Um tampão exemplar para este propósito é um tampão de fosfato de potássio. Tampões sintéticos tais como MOPS, HEPES, ACES e similares podem ser alternativa ou simultaneamente usados. É também possível manter um pH de cultura constante através da adição de NaOH ou NH4OH durante o cres- 20 cimento. Se os componentes complexos do meio forem utilizados tais como extrato de levedura, a necessidade de tampões adicionais pode ser reduzi- da, devido ao fato que muitos compostos complexos têm capacidades de tamponamento altas. Se um fermentador for utilizado para cultivar os micro- organismos, o pH pode ser também controlado usando amônia gasosa.
O tempo de incubação usualmente é em uma faixa de várias
horas a vários dias. Este tempo é selecionado para permitir a quantidade máxima de produto acumular-se no caldo. Os experimentos de crescimento descritos podem ser realizados em uma variedade de vasos, tais como pla- ' cas de microtitulação, tubos de vidro, frascos de vidro ou vidro ou fermento- 30 res de metal de tamanhos diferentes. Para triar um número grande de clo- nes, os micro-organismos deveriam ser cultivados em placas de microtítula- ção, tubos de vidro ou frascos agitados, ou com ou sem septos. Preferivel- mente frascos agitados de 100 ml ou 250 ml são usados, enchidos com 10% (em volume) do meio de crescimento requerido. Os frascos deveriam ser agitados em um agitador rotativo (amplitude 25 mm) usando uma faixa de velocidade de 100 a 300 rpm. Perdas de evaporação podem ser diminuídas 5 pela manutenção de uma atmosfera úmida; alternativamente, uma correção matemática para perdas de evaporação deveria ser executada.
Se clones geneticamente modificados forem testados, um clone de controle inalterado ou um clone de controle contendo o plasmídeo básico sem qualquer inserção deve ser também testado. O meio é inoculado a uma 10 OD6OO de 0,5 a 1,5 usando células crescidas em placas de ágar, tais como placas CM (10 g/l glicose, 2,5 g/l NaCI, 2 g/l uréia, 10 g/l polipeptona, 5 g/l extrato de levedura, 5 g/l extrato de carne, 2 g/l uréia, 10 g/l polipeptona, 5 g/l extrato de levedura, 5 g/l extrato de carne, 22 g/l ágar, pH 6,8 com NaOH a 2M) que tinham sido incubadas a 30°C. Inoculação dos meios é realizada 15 por qualquer introdução de uma suspensão de solução salina das células de C. glutamicum das placas CM ou adição de uma pré-cultura líquida desta bactéria. Outros métodos de incubação podem ser tirados de W02007012078.
MÉTODOS GERAIS
Protocolos para métodos gerais podem ser encontrados em
Handbook on Corynebacterium glutamicum, (2005) eds.: L. Eggeling, M. Bott., Boca Raton, CRC Press, em Martin et al. (Biotechnology (1987) 5, 137-146 ), Guerrero et al. (Gene (1994), 138, 35-41), Tsuchiya e Morinaga (Biotechnology (1988), 6, 428-430), Eikmanns et al. (Gene (1991), 102, 93- 25 98), EP 0 472 869, US 4,601,893, Schwarzer e Pühler (Biotechnology (1991), 9, 84-87, Reinscheid et al. (Applied and Environmental Microbiology (1994), 60,126-132), LaBarre et al. (Journal of Bacteriology (1993), 175, 1001-1007), WO 96/15246, Malumbres et al. (Gene (1993), 134, 15-24), em JP-A-10-229891, em Jensen e Hammer (Biotechnology and Bioengineering 30 (1998), 58,191-195), Makrides (Microbiological Reviews (1996), 60, 512-538) em W02006069711, em W02007012078 e nos livros de ensino bem- conhecidos de biologia genética e molecular. » 54
CEPAS. MEIOS E PLASMÍDEOS
Cepas podem ser tiradas, por exemplo da lista a seguir:
ATCC 13032 de Corynebacterium glutamicum,
ATCC 15806 de Corynebacterium acetoglutamicum,
ATCC 13870 de Corynebaeterium acetoaeidophilum,
FERM BP-1539 de Corynebaeterium thermoaminogenes,
ATCC 17965 de Corynebaeterium melasseeola,
ATCC 14067 de Brevibaeterium flavum,
ATCC 13869 de Brevibaeterium Iaetofermentum, e ATCC 14020 de Brevibaeterium divarieatum ou cepas que foram derivadas das mesmas tais como KFCC10065, DSM 17322 ambas de Corynebacteri- um glutamicum, ou ATCC21608 de Corynebacterium glutamicum. TECNOLOGIA DE DNA RECOMBINANTE
Protocolos podem ser encontrados em: Sambrook, J., Fritsch, E. F., e Maniatis, T., em Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3a edição (2001) Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, Vol. 1, 2, 3, e Handbook on Corynebacterium glutamicum (2005) eds. L. Eggeling, M. Bott., Boca Raton, CRC Press.
QUANTIFICAÇÃO DE AMINOÁCIDOS E INTERMEDIÁRIOS DE METIONI- NAi
A análise é feita por HPLC (Agilent 1100, Agilent, Waldbronn, Alemanha) com um cartucho de guarda e uma coluna de Synergi 4 μηη (MAX-RP 80 Á, 150 * 4,6 mm) (Phenomenex, Aschaffenburg, Alemanha). Antes da injeção os analitos são derivatizados usando o-ftaldialdeído (OPA) 25 e mercaptoetanol como agente redutor (2-MCE). Adicionalmente grupos sul- fidrila são bloqueados com ácido iodoacético. A separação é realizada a uma taxa de fluxo de 1 ml/min usando NaH2PO4 a 40 mM (eluente A, pH = 7,8, ajustado com NaOH) como polar e uma mistura de água e metanol (100 /1) como fase não-polar (eluente B). O gradiente a seguir é aplicado: come- 30 ço 0% B; 39 min 39% B; 70 min 64% B; 100% B por 3,5 min; 2 min 0% B para equilibração. A derivatização à temperatura ambiente é automatizada como descrita abaixo. Inicialmente 0,5 μΙ de 0,5% de 2-MCE em bicina (a 0,5 Μ, pH 8,5) é misturado com 0,5 μΙ de extrato de célula. Subsequentemente 1,5 μΙ de 50 mg/ml de ácido iodoacético em bicina (a 0,5 M, pH 8,5) é adi- cionado, seguido por adição de 2,5 μΙ de tampão de bicina (a 0,5 M, pH 8,5). A derivatização é feita adicionando 0,5 μΙ de 10 mg/ml de reagente de OPA 5 dissolvido em 1/45/54 v/v/v de 2-MCE/MeOH/bicina (a 0,5 M, pH 8,5). Por fim a mistura é diluída com 32 μΙ de H2O. Entre cada uma das etapas de pi- petação acima há um tempo de espera de 1 min. Um volume total de 37,5 μΙ é depois injetado sobre a coluna. Note que os resultados analíticos podem ser melhorados significativamente, se a agulha do classificador automática 10 for limpa periodicamente durante (por exemplo, dentro de tempo de espera) e após a preparação de amostra. A detecção é executada por um detector de fluorescência (excitação de 340 nm, emissão 450 nm, Agilent, Wald- bronn, Alemanha). Para quantificação de ácido aminobutírico (ABA) foi como padrão interno.
DEFINIÇÃO DO PROTOCOLO DE RECOMBINACÃO
A seguir será descrito como uma cepa de C. glutamicum com eficiência aumentada de produção de metionina pode ser construída imple- mentando as descobertas das predições acima. Antes da construção da ce- pa ser descrita, uma definição de um evento/protocolo de recombinação é dada que será usada a seguir.
"Campbell in", como aqui usado, refere-se a um transformante de uma célula hospedeira original em que uma molécula de DNA de fita du- pla circular inteira (por exemplo, um plasmídeo sendo com base em pCLIK int sacB ou pK19 integrado em um cromossomo por um evento de recombi- 25 nação homólogo simples (um evento crossover), e que efetivamente resulta na inserção de uma versão Iinearizada da dita molécula de DNA circular em uma primeira seqüência de DNA do cromossomo que é homóloga a uma primeira seqüência de DNA da dita molécula de DNA circular. "Campbelled in" refere-se à seqüência de DNA Iinearizada que foi integrada no cromos- 30 somo do transformante "Campbell in". Um "Campbell in" contém uma dupli- cação da primeira seqüência de DNA homóloga, cada cópia desta inclui e circunda uma cópia do ponto crossover de recombinação homóloga. O nome vem do Professor Alan Campbell que primeiro propôs este tipo de recombi- nação.
"Campbell out", como aqui usado, refere-se a uma célula que descende de um transformante "Campbell in" em que um segundo evento de 5 recombinação homóloga (um evento crossover) ocorreu entre uma segunda seqüência de DNA que é contida no DNA inserido Iinearizado do DNA "Campbelled in", e uma segunda seqüência de DNA de origem cromossômi- ca que é homóloga à segunda seqüência de DNA da dita inserção Iineariza- da, o segundo evento de recombinação resultando na deleção (retirada) de 10 uma porção da seqüência de DNA integrada, mas, importantemente, tam- bém resultando em uma porção (esta pode ser tão pequena quanto uma ij- nica base) do Campbelled integrado no DNA que permanece no cromosso- mo, de modo que comparado à célula hospedeira original, a célula "Camp- bell out" contém uma ou mais alterações intencionais no cromossomo (por 15 exemplo, uma substituição de base simples, substituições de base múltiplas, inserção de um gene heterólogo ou seqüência de DNA, inserção de uma cópia adicional ou cópias de um gene homólogo ou um gene homólogo mo- dificado, ou inserção de uma seqüência de DNA que compreende mais que um destes exemplos acima mencionados listados acima).
Uma célula ou cepa "Campbell out" é usualmente, mas não ne-
cessariamente, obtida por uma contrasseleção junto de um gene que é con- tido em uma porção (a porção sendo desejada ser retirada) da seqüência de DNA "Campbelled in", por exemplo o gene sacB de Bacillus subtilis que é letal quando expresso em uma célula que é crescida na presença de cerca 25 de 5% a 10% de sucrose. Ou com ou sem uma contrasseleção, uma célula "Campbell out" desejada pode ser obtida ou identificada tirando para a célula desejada, usando qualquer fenótipo tirável, tal como, mas não limitado a, morfologia de colônia, cor de colônia, presença ou ausência de resistência a antibiótico, presença ou ausência de uma seqüência de DNA dada por rea- 30 ção em cadeia de polimerase, presença ou ausência de uma auxotrofia, pre- sença ou ausência de uma enzima, hibridação de ácido nucleico de colônia, triagem de anticorpo, etc.. O termo "Campbell in" e "Campbell out" podem ser também usados como verbos em vários tempos para referirem-se ao método ou processo descrito acima.
É entendido que os eventos de recombinação homóloga que levam a um "Campbell in" ou "Campbell out" podem ocorrer em uma faixa de 5 bases de DNA dentro da seqüência de DNA homóloga, e uma vez que as seqüências homólogas são idênticas umas às outras pelo menos parte desta faixa, não é usualmente possível especificar exatamente onde o evento de crossover ocorreu. Em outras palavras, não é possível especificar precisa- mente que seqüência foi originalmente do DNA inserido, e qual foi original- 10 mente do DNA cromossômico. Além disso, a primeira seqüência de DNA homóloga e a segunda seqüência de DNA homóloga são usualmente sepa- radas por uma região de não-homologia parcial, e é esta região de não- homologia que permanece depositada em um cromossomo da célula "Campbell out".
Para viabilidade, em C. glutamicum, as primeira e segunda se-
qüências de DNA homólogas típicas de pelo menos cerca de 200 pares de base em comprimento, e pode ser até vários mil pares de base em compri- mento, porém, desde que o procedimento possa ser feito para trabalhar com seqüências mais curtas ou mais longas. Por exemplo, um comprimento para 20 as primeira e segunda seqüências homólogas pode variar de cerca de 500 a 2000 bases, e a obtenção de um "Campbell out" de um "Campbell in" é facili- tada dispondo para as primeira e as segundas seqüências homólogas ser cerca do mesmo comprimento, preferivelmente com uma diferença de me- nos de 200 pares de base e mais preferivelmente com o mais curto dos dois 25 sendo pelo menos 70% do comprimento do mais longo em pares de base. Uma descrição do método de Campbell in e out pode ser tirada de W02007012078.
EXEMPLOS
Os experimentos a seguir demonstram como a supraexpressão de transcetolase de C. glutamicum leva à produção de metionina aumenta- da. Estes exemplos não são intencionados de maneira alguma, porém, a limitar a invenção. EXPERIMENTOS DE FRASCOS AGITADOS E ENSAIO DE HPLC
Experimentos de frascos agitados foram executados com o meio de melado padrão, com cepas em duplicata ou quadruplicata. Meio de mela- do continha em um litro de meio: 40 g de glicose; 60 g de melado; 20 g de (NH4)2SO4; 0,4 g de MgS04*7H20; 0,6 g de KH2PO4; 10 g de extrato de le- vedura (DIFCO); 5 ml de treonina a 400 mM; 2 mg de FeSO4.7H20; 2 mg de MnSO4-H2O; e 50 g de CaCO3 (Riedel-de Haen), com o volume composto de ddH20. O pH foi ajustado para 7,8 com 20% de NH4OH, 20 ml de meio con- tinuamente agitado (para manter CaCO3 suspenso) foi acrescentados a 250 ml de frascos agitados de Bellco com septos e os frascos foram submetidos à autoclave por 20 min. Subsequente ã submissão em autoclave, 4 ml de "solução 4B" foram adicionados por litro do meio de base (ou 80 μΙ / frasco). A "solução 4B" continha por litro: 0,25 g de cloridrato de tiamina (vitamina B1), 50 mg de cianocobalamina (vitamina B12), 25 mg de biotina, 1,25 g de cloridrato de piridoxina (vitamina B6) e foi tamponada com KPO4 a 12,5 mM, pH 7.0 para dissolver a biotina, e foi esterilizado em filtro. Culturas foram crescidas em frascos com septos cobertos com papel Bioshield presos por bandas de borracha durante 48 horas a 28°C ou 30°C e a 200 ou 300 rpm em um agitador de piso New Brunswick Scientific. As amostras foram tiradas em 24 horas e/ou 48 horas. As células foram removidas por centrifugação seguido por diluição do sobrenadante com um volume igual de 60% de ace- tonitrila e depois filtração de membrana da solução usando colunas de giro de 0,45 μιτι Centricon. Os filtrados foram ensaiados usando HPLC para as concentrações de metionina, glicina mais homosserina, O-acetil- homosserina, treonina, isoleucina, lisina, e outros aminoácidos indicados.
Para o ensaio de HPLC, sobrenadantes filtrados foram diluídos 1:100 com Na2EDTA a 1 mM filtrado em 0,45 pm e 1 μΙ da solução foi deri- vatizado com reagente OPA (AGILENT) em tampão de Borato (NaBO3 a 80 mM, EDTA a 2,5 mM, pH 10,2) e injetados sobre uma coluna de AA-ODS de 30 200 x 4,1 mm de 5 μ Hypersil operada em uma HPLC série Agilent 1100 e- quipada com um detector de fluorescência G1321A (AGILENT). O compri- mento de onda de excitação foi 338 nm e o comprimento de onda de emis- são monitorado foi 425 nm. Soluções padrão de aminoácido foram cromato- grafadas e usadas para determinar os tempos de retenção e áreas de pico padrão para os vários aminoácidos. Chem Station1 o pacote de software as- sociado fornecido por Agilent, foi usado para controle do instrumento, aquisi- 5 ção dos dados e manipulação dos dados. O hardware era um computador HP Pentium 4 que suporta Microsoft Windows NT 4.0 atualizado com um Microsoft Service Pack (SP6a).
EXPERIMENTO 1 - GERAÇÃO PA CEPA M2014
Cepa de ATCC 13032 de C. glutamicum foi transformado com 10 DNA A (também referido como pH273) (SEQ ID NO: 24) e "Campbelled in" para render uma cepa "Campbell in". A cepa "Campbell in" foi depois "Campbelled out" para render uma cepa "Campbell out", M440 contendo um gene que codifica uma enzima de homosserina desidrogenase resistente à retroalimentação (homfbr). A proteína de homosserina desidrogenase resul- 15 tante incluiu uma alteração de aminoácido onde S393 foi alterado para F393 (referido como Hsdh S393F).
A cepa M440 foi subsequentemente transformada com DNA B (também referido como pH373) (SEQ ID NO: 25) para render uma cepa "Campbell in". A cepa "Campbell in" é depois "Campbelled out" para render 20 uma cepa "Campbell out", M603 contendo um gene que codifica uma enzima de aspartato cinase resistente à retroalimentação (as/rfbr) (codificada por IysC). Na proteína de aspartato cinase resultante, T311 foi alterado para 1311 (referido como LysC T3111).
Foi descoberto que a cepa M603 produziu cerca de Iisina a 17,4 mM, enquanto a cepa de ATCC13032 não produziu nenhuma quantidade mensurável de lisina. Adicionalmente, a cepa M603 produziu cerca de ho- mosserina a 0,5 mM, comparado a nenhuma quantidade mensurável produ- zida pela cepa de ATCC13032, como sumarizado na Tabela 3. Tabela 3: quantidades de homosserina, O-acetil-homosserina, metionina e
Iisina produzidas pelas cepas ATCC13032 e M603.
Cepa Homosserina O-acetil homos¬ Metionina Lisina (mM) serina (mM) (mM) (mM) ATCC13032 0,0 0,4 0,0 0,0 M603 0,5 0,7 0,0 17,4 A cepa M603 foi transformada com DNA C (também referido
como pH304) (SEQ ID NO:26) para render uma cepa "Campbell in" que foi 5 depois "Campbelled out" para render uma cepa "Campbell out", M690. A ce- pa M690 continha um promotor Pgr0Es a montante do gene de metH (referido como metH de P497). A seqüência do promotor de P497 é descrita na SEQ ID NO: 21. A cepa M690 produziu cerca de Iisina a 77,2 mM e cerca de ho- mosserina a 41,6 mM, como mostrado abaixo na Tabela 4.
Tabela 4: quantidades de homosserina, O-acetil homosserina. metionina e Iisina produzidas pelas cepas M603 e M690.
Cepa Homosserina O-acetil homos¬ Metionina Lisina (mM) serina (mM) (mM) (mM) M603 0,5 0,7 0,0 17,4 M690 41,6 0,0 0,0 77,2 A cepa M690 foi subsequentemente mutagenizada como segue:
uma cultura durante a noite de M603, crescida em meio de BHI (BECTON DICKINSON), foi lavada em tampão de citrato a 50 mM, pH 5,5, tratada por 20 min a 30°C com N-metil-N-nitrosoguanidina (10 mg/ml em citrato a 50 mM, pH 5,5). Após tratamento, as células foram lavadas novamente em tampão de citrato a 50 mM, pH 5,5 e banhadas em um meio contendo os ingredientes a seguir: (todas as quantidades mencionados são calculadas para 500 ml de meio) 10 g de (NH4)2SO4; 0,5 g de KH2PO4; 0,5 g de K2HPO4; 0,125 g de MgS04*7H20; 21 g de MOBS; 50 mg de CaCI2; 15 mg de ácido protocatechuico; 0,5 mg de biotina; 1 mg de tiamina; e 5 g/l de D,L- etionina (SIGMA CHEMICALS, CATÁLOGO #E5139), ajustado em pH 7,0 com KOH. Além disso o meio continha 0,5 ml de uma solução de metal de traço composto de: 10 g/l de FeS04*7H20; 1 g/l de MnS04*H20; 0,1 g/l de ZnS04*7H20; 0,02 g/l de CuSO4; e 0,002 g/l de NiCI2*6H20, todos dissolvi- dos em HCI a 0,1 M. O meio final foi esterilizado através de filtração e ao meio, 40 ml de solução a 50% de glicose estéril (40 ml) e ágar estéril para uma concentração final de 1,5% foram adicionados. O meio contendo ágar final foi vertido nas placas de ágar e foi marcado como meio de etionina mí- 5 nima. As cepas mutagenizadas foram esparramadas nas placas (etionina mínima) e incubadas durante de 3 a 7 dias a 30°C. Clones que cresceram no meio foram isolados e re-corridos no mesmo meio de etionina mínima. Vá- rios clones foram selecionados para análise de produção de metionina.
Produção de metionina foi analisada como segue. Cepas foram 10 crescidas em meio de Cm-ágar durante dois dias a 30°C que continham: 10 g/l de D-glicose, 2,5 g/l de NaCI; 2 g/l de uréia; 10 g/l de Bacto Peptone (DIF- CO); 5 g/l de Extrato de Levedura (DIFCO); 5 g/l de Extrato de carne de boi (DIFCO); 22 g/l de Ágar (DIFCO); e que foi submetido à autoclave por 20 min a cerca de 121 °C.
Após as cepas estarem crescidas, as células foram raspadas e
ressuspensas em NaCI a 0,15 M. Para a cultura principal, uma suspensão de células raspadas foi adicionada a uma OD de partida de 600 nm a cerca de 1,5 a 10 ml de Meio Il (vide abaixo) junto com 0,5 g de CaC03 sólido e submetido à autoclave (RIEDEL DE HAEN) e as células foram incubadas em 20 um frasco agitado de 100 ml sem septos por 72 h em uma plataforma agita- dora orbital a cerca de 200 rpm a 30°C. Meio Il continha: 40 g/l de sucrose; 60 g/l de açúcar total de melado (calculado para o conteúdo de açúcar); 10 g/l de (NH4)2SO4; 0,4 g/l de MgS04*7H20; 0,6 g/l de KH2PO4; 0,3 mg/l de tiamina*HCI; 1 mg/l de biotina; 2 mg/l de FeSO4; e 2 mg/l de MnSO4. O meio 25 foi ajustado para pH 7,8 com NH4OH e submetido à autoclave a cerca de 1210C durante cerca de 20 min). Após submissão à autoclave e esfriamento, vitamina B12 (cianocobalamina) (SIGMA CHEMICALS) foi adicionada de uma solução de matéria-prima estéril em filtro (200 Mg/ml) para uma concen- tração final de 100 Mg/l.
As amostras foram tiradas do meio e ensaiadas para conteúdo
de aminoácido. Aminoácidos produzidos, incluindo metionina, foram deter- minados usando o método de aminoácido Agilent em um Sistema de HPLC Agilent 1100 Série LC. (AGILENT). Uma derivatização de pré-coluna da a- mostra com orto-ftalaldeído permitiu a quantificação dos aminoácidos produ- zidos após separação em uma coluna AA de Hypersil (AGILENT).
Clones que mostraram uma titulação de metionina que era pelo 5 menos duas vezes que em M690 foram isolados. Um tal clone, usado em outros experimentos, foi nomeado M1197 e foi depositado no dia 18 de maio de 2005, na coletânea de cepa de DSMZ como número de cepa DSM 17322. Produção de aminoácido por esta cepa foi comparada à pela cepa M690, como sumarizado abaixo na Tabela 5.
Tabela 5: quantidades de homosserina, O-acetil-homosserina, metionina e Iisina produzidas pelas cepas M690 e M1197.
Cepa Homosserina O-acetil- Metionina Lisina (mM) homosserina (mM) (mM) (mM) M690 41,6 0,0 0,0 77,2 M1179 26,4 1,9 0,7 79,2 A cepa M1197 foi transformada com DNA F (também referido como pH399, SEQ ID NO: 27) para render uma cepa "Campbell in" que foi subsequentemente "Campbelled out" para render a cepa M1494. Esta cepa
contém uma mutação no gene para a homosserina cinase que resulta em uma alteração de aminoácido na enzima de homosserina cinase resultante de T190 para A190 (referido como HskTI 90A). Produção de aminoácido pe- la cepa M1494 foi comparada à produção pela cepa M1197, como sumari- zado abaixo na Tabela 6.
Tabela 6: quantidades de homosserina, O-acetil-homosserina, metionina e Iisina produzidas pelas cepas M1197 e M1494.
Cepa Homosserina O-acetil- Metionina Lisina (mM) homosserina (mM) (mM) (mM) M1197 26,4 1,9 0,7 79,2 M1494 18,3 0,2 2,5 50,1 A cepa M1494 foi transformada com DNA D (também referida como pH484, SEQ ID NO:28) para render uma cepa "Campbell in" que foi subsequentemente "Campbelled out" para render a cepa M1990. A cepa Μ1990 supraexpressa um alelo de metY usando um promotor groES e um promotor EFTU (Tu) de fator de alongamento (referido como metY de P497 P1284)· A seqüência do promotor de P497P1284 é exposta na SEQ ID NO: 29. A produção de aminoácido pela cepa M1494 foi comparada à produção pela 5 cepa M1990, como sumarizado abaixo na Tabela 7.
Tabela 7: quantidades de homosserina. O-acetil-homosserina, metionina e Iisina produzidas pelas cepas M1494 e M1990.
Cepa Homosserina O-acetil- Metionina Lisina (mM) homosserina (mM) (mM) (mM) M1494 18,3 0,2 2,5 50,1 M1990 18,2 0,3 5,6 48,9 A cepa M1990 foi transformada com DNA E (também referido
como pH 491, SEQ ID NO: 30) para render uma cepa "Campbell in" que foi 10 depois "Campbelled out" para render uma cepa "Campbell out" M2014. A cepa M2014 supraexpressa um alelo de metA usando um promotor de supe- róxido dismutase (referido como metA de P3119). A seqüência do promotor de P3119 é exposta na SEQ ID NO: 20. Produção de aminoácido pela cepa M2014 foi comparada à produção pela cepa M1990, como sumarizado abai- 15 xo na Tabela 8.
Tabela 8: quantidades de homosserina. O-acetil-homosserina. metionina e Iisina produzidas pelas cepas M1494 e M1990.
Cepa Homosserina O-acetil- Metionina Lisina (mM) homosserina (mM) (mM) (mM) M1990 18,2 0,3 5,6 48,9 M2014 12,3 1,2 5,7 49,2 EXPERIMENTO 2 - DELECÃO DE mcbR DE M2014
Plasmídeo PH429 contendo uma deleção de RXA00655, (SEQ ID No. 31) foi usado para introduzir a deleção de mcbR em C. glutamicum por meio de integração e excisão (vide WO 2004/050694 A1).
Plasmídeo PH429 foi transformado na cepa M2014 com seleção para resistência à canamicina (Campbell in). Usando contrasseleção de sacB, os derivados sensíveis à canamicina da cepa transformada foram iso- lados que presumivelmente tinham perdido o plasmídeo integrado através de excisão (Campbell out). A cepa transformada produziu derivados sensíveis à canamicina que fizeram colônias pequenas e colônias maiores. Colônias de ambos os tamanhos foram tiradas por PCR para detectar a presença de de- leção de mcbR. Nenhuma das colônias maiores continha a deleção, enquan- 5 to que de 60 a 70% das colônias menores continham a deleção de mcbR esperada.
Quando um isolado original foi corrido para colônias simples em placas de BHI1 uma mistura de colônias minúsculas e pequenas apareceu. Quando as colônias minúsculas foram recorridas em BHI1 mais uma vez uma 10 mistura de colônias minúsculas e pequenas apareceu. Quando as colônias pequenas foram recorridas em BHI, o tamanho da colônia foi usualmente pequeno e uniforme. Os dois isolados de colônia simples pequena, chama- dos OM403-4 e OM403-8, foram selecionados para outro estudo.
Experimentos com frasco agitado (Tabela 9) mostraram que 15 OM403-8 produziu pelo menos duas vezes a quantidade de metionina que M2014-pai. Esta cepa também produziu menos que um quinto da quantidade de Iisina que M2014, sugerindo uma diversão do fluxo de carbono de semi- aldeído de aspartato para homosserina. Uma terceira diferença notável foi um aumento maior que 10 vezes na acumulação de isoleucina por OM403 20 com relação a M2014. Culturas foram crescidas durante 48 horas em meio
de melado padrão.
Tabela 9: produção de aminoácido por isolados da cepa de OM4Q3 em cultu- ras de frasco agitado inoculadas com células recentemente crescidas
Cepa Tamanho Deleção Met Lys Hse+GI Ile da colônia AmcbR (g/i) (g/l) y (g/l) (g/l) M2014 Grande nenhuma 0,2 2,4 0,3 0,04 0,2 2,5 0,3 0,03 0,2 2,4 0,3 0,03 0,4 3,1 0,4 0,03 OM4Q3-8 Pequena ARXA0655 1,0 0,3 0,8 0,8 1,0 0,3 0,8 0,8 0,9 0,3 0,8 0,8 1,0 0,3 0,8 0,6 Também como mostrado na Tabela 10, houve uma diminuição maior que 15 vezes na acumulação de O-acetil-homosserina por OM403 com relação a M2014. A explanação mais provável para este resultado é que a maioria da O-acetil-homosserina que acumula em M2014 está sendo convertida para metionina, homocisteína, e isoleucina em OM403. Culturas 5 foram crescidas durante 48 horas em meio de melado padrão.
Tabela 10: produção de aminoácido por dois isolados de OM4Q3 em culturas de frasco agitado inoculadas com células recentemente crescidas.
Cepa Deleção Met OAc-Hse Ile AmcbR (g/i) (g/i) (g/i) M2014 Nenhuma 0,4 3,4 0,1 0,4 3,2 0,1 OM403-4 ARXA0655 1,7 0,2 0,3 1,5 0,1 0,3 OM4Q3-8 ARXA0655 2,2 <0,05 0,6 2,5 <0,05 0,6 EXPERIMENTO 3 - DIMINUINDO EXPRESSÃO DE metQ
Para diminuir a importação de metionina em OM403-8, o promo- 10 tor e porção 5' do gene metQ foram deletados. O gene metQ codifica uma subunidade de um complexo de importação de metionina que é requerido para o complexo funcionar. Isto foi realizado usando a técnica padrão de Campbelling in e Campbelling out com plasmídeo pH449 (SEQ ID NO: 32). OM403-8 e OM456-2 foram ensaiados para produção de metionina em en- 15 saios de frasco agitado. Os resultados (Tabela 11) mostram que OM456-2 produziu mais metionina que OM403-8. Culturas foram crescidas durante 48 horas em meio de melado padrão.
Tabela 11: ensaios em frasco agitado de OM456-2
Cepa vetor [Met] [Lys] [Gly/Hse] [OAcHS] [He] (g/i) (g/D (g/D (g/D (g/l) OM403-8 nenhum 4,0 0,8 2,2 0,4 1,9 3,9 0,6 2,2 0,4 1,9 OM456-2 nenhum 4,2 0,4 2,3 0,4 2,3 4,3 0,5 2,4 0,4 2,3 EXPERIMENTO 4 - CONSTRUÇÃO DE OM469
Uma cepa referida como OM469 foi construída que incluiu tanto deleção de metQ como supraexpressão de metF substituindo o promotor de metF com o promotor de Pr Iambda de fago em OM456-2. Isto foi realizado 5 usando a técnica padrão de Campbelling in e Campbelling out com plasmí- deo pOM427 (SEQ ID NO 33). Quatro isolados de OM469 foram ensaiados para produção de metionina em ensaios de cultura com frasco agitado onde todos eles produziram mais metionina que OM456-2, como mostrado na Ta- bela 12. Culturas foram crescidas durante 48 horas em meio de melado pa- 10 drão contendo treonina a 2 mM.
Tabela 12: ensaios em frasco agitado de OM469. um derivado de OM456-2 contendo o promotor de Pr Iambda de fago no lugar do promotor de metF.
Cepa promo- MetQ [Met] [Lys] [Gly/Hs [OAcHS] [lie] torde (g/l) (g/l) e] (g/l) (g/l) (g/l)
metF
OM428-2 λρκ nativo 4,5 0,5 2,6 0,4 2,6 4,6 0,4 2,6 0,3 2,5 OM456-2 Nativo AmetQ 4,2 0,4 2,4 0,3 2,5 4,2 0,5 2,4 0,3 2,5 OM469-1 λρκ AmetQ 5,0 0,5 2,7 0,4 3,1 -2 4,9 0,5 2,7 0,4 2,8 -3 4,8 0,4 2,6 0,4 2,7 -4 4,7 0,5 2,6 0,4 2,8 EXPERIMENTO 5 - CONSTRUÇÃO DE M2543
A cepa OM469-2 foi transformada através de eletroporação com o plasmídeo pCLIK5A int sacB PSD TKT como descrito na SEQ ID NO. 34 (figura 1a)). Isto foi realizado usando a técnica padrão de Campbelling in e Campbelling out.
Isolados de OM 469 PSOD TKT que eram M2543 marcada fo- ram ensaiados para produção de metionina em ensaios de cultura com fras- co agitado onde eles produziram mais metionina que OM469-2. Os resulta- dos da cepa M2543 são mostrados na Tabela 13.
Tabela 13. ensaios com frasco agitado de OM469 e M2543
Cepa pias- genes Met [Met] [Lys] [Gly] [Hse] [AHs] [lie]
mí- no plasmí- (mM) (mM) (mM) (mM) (mM) (mM)) deo deo
OM469-2 Nenhum 14 3,4 16 1,7 0,3 11,8
M2543 #_Nenhum 20,4 1,9 21,8 0,8 <0,1 12,4
EXPERIMENTO 6 - CONSTRUÇÃO DE CEPAS CONTENDO UM PROMO- TOR E / OU MUTAÇÕES NA 6-FOSFOGLUCONATO DESIDROGENASE A cepa OM469-2 ou M2543 foi transformada por eletroporação
com o plasmídeo pCLIK5A PSODH661 PSOD6PGDH como descrito na SEQ ID No. 35 (figura 1b). Isto foi realizado usando a técnica padrão de Campbel- Iing in e Campbelling out. As cepas resultantes continham apenas o promo- tor Psod ou o promotor juntamente com uma ou duas mutações como descri- tas na tabela 14.
Isolados de M2543 PSOD 6PGDH que são GK 1508, 1511 e GK1513 marcados foram ensaiados para produção de metionina em ensaios de cultura com frasco agitado onde eles produziram mais metionina que M2543. Os resultados são mostrados na Tabela 14.
Tabela 14. ensaios com frasco agitado de OM469 e M2543
Cepa Promotor introduzido Mutação [Met] (mM)
M2543 Nenhum Nenhum 21,6 GK1508 Psod P150S, S353F 24,6 GK1511 Psod Nenhum 24,7 GK1513 Psod P150S 25,9 120
180
240
300
360
420
480
540
600
660
720
780
840
900
68
LISTAGEM DE SEQÜÊNCIAS
<110> <120> <130> <150> <151> <160> <170> <210> <211> <212> <213> <220> <221> <222> <223> <4 00>
BASF Aktiengesellschaft
BASF Aktiengesellschaft
B 8571 / DB
EP 07 102 257.9
19.02.2007
35
PatentIn versão 3.3 1
1545
DNA
Corynebacterium glutamicum
seqüência de ácido nucléico (1)..(1545)
glucose-6-fosfato-desidrogenase 1
gtgagcacaa acacgacccc ctccagctgg acaaacccac tgcgcgaccc gcaggataaa cgactccccc gcatcgctgg cccttccggc atggtgatct tcggtgtcac tggcgacttg gctcgaaaga agctgctccc cgccatttat gatctagcaa accgcggatt gctgccccca ggattctcgt tggtaggtta cggccgccgc gaatggtcca aagaagactt tgaaaaatac gtacgcgatg ccgcaagtgc tggtgctcgt acggaattcc gtgaaaatgt ttgggagcgc ctcgccgagg gtatggaatt tgttcgcggc aactttgatg atgatgcagc tttcgacaac ctcgctgcaa cactcaagcg catcgacaaa acccgcggca ccgccggcaa ctgggcttac tacctgtcca ttccaccaga ttccttcaca gcggtctgcc accagctgga gcgttccggc atggctgaat ccaccgaaga agcatggcgc cgcgtgatca tcgagaagcc tttcggccac aacctcgaat ccgcacacga gctcaaccag ctggtcaacg cagtcttccc agaatcttct gtgttccgca tcgaccacta tttgggcaag gaaacagttc aaaacatcct ggctctgcgt tttgctaacc agctgtttga gccactgtgg aactccaact acgttgacca cgtccagatc accatggctg aagatattgg cttgggtgga cgtgctggtt actacgacgg catcggcgca gcccgcgacg tcatccagaa ccacctgatc cagctcttgg ctctggttgc catggaagaa ccaatttctt tcgtgccagc gcagctgcag gcagaaaaga tcaaggtgct ctctgcgaca aagccgtgct acccattgga taaaacctcc gctcgtggtc agtacgctgc cggttggcag 960 ggctctgagt tagtcaaggg acttcgcgaa gaagatggct tcaaccctga gtccaccact 1020 gagacttttg cggcttgtac cttagagatc acgtctcgtc gctgggctgg tgtgccgttc 1080 tacctgcgca ccggtaagcg tcttggtcgc cgtgttactg agattgccgt ggtgtttaaa 1140 gacgcaccac accagccttt cgacggcgac atgactgtat cccttggcca aaacgccatc 1200 gtgattcgcg tgcagcctga tgaaggtgtg ctcatccgct tcggttccaa ggttccaggt 1260 tctgccatgg aagtccgtga cgtcaacatg gacttctcct actcagaatc cttcactgaa 1320 gaatcacctg aagcatacga gcgcctcatt ttggatgcgc tgttagatga atccagcctc 1380 ttccctacca acgaggaagt ggaactgagc tggaagattc tggatccaat tcttgaagca 1440 tgggatgccg atggagaacc agaggattac ccagcgggta cgtggggtcc aaagagcgct 1500 gatgaaatgc tttcccgcaa cggtcacacc tggcgcaggc cataa 1545 <210> 2
<211> 514
<212> PRT
<213> Corynebacterium glutamicum <220>
<221> seqüência de aminoácido
<222> (I) .. (514)
<223> glucose-6-fosfato-desidrogenase
<4 00> 2
Met Ser Thr Asn Thr Thr Pro Ser Ser Trp Thr Asn Pro Leu Arg Asp 15 10 15
Pro Gln Asp Lys Arg Leu Pro Arg Ile Ala Gly Pro Ser Gly Met Val 20 25 30
He Phe Gly Val Thr Gly Asp Leu Ala Arg Lys Lys Leu Leu Pro Ala 35 40 45
Ile Tyr Asp Leu Ala Asn Arg Gly Leu Leu Pro Pro Gly Phe Ser Leu 50 55 60
Val Gly Tyr Gly Arg Arg Glu Trp Ser Lys Glu Asp Phe Glu Lys Tyr 65 70 75 80
Val Arg Asp Ala Ala Ser Ala Gly Ala Arg Thr Glu Phe Arg Glu Asn 85 90 95 Val Trp Glu Arg Leu Ala Glu Gly Met Glu Phe Val Arg Gly Asn Phe 100 105 110
Asp Asp Asp Ala Ala Phe Asp Asn Leu Ala Ala Thr Leu Lys Arg Ile 115 120 125
Asp Lys Thr Arg Gly Thr Ala Gly Asn Trp Ala Tyr Tyr Leu Ser Ile 130 135 140
Pro Pro Asp Ser Phe Thr Ala Val Cys His Gln Leu Glu Arg Ser Gly 145 150 155 160
Met Ala Glu Ser Thr Glu Glu Ala Trp Arg Arg Val Ile Ile Glu Lys 165 170 175
Pro Phe Gly His Asn Leu Glu Ser Ala His Glu Leu Asn Gln Leu Val 180 185 190
Asn Ala Val Phe Pro Glu Ser Ser Val Phe Arg Ile Asp His Tyr Leu 195 200 205
Gly Lys Glu Thr Val Gln Asn Ile Leu Ala Leu Arg Phe Ala Asn Gln 210 215 220
Leu Phe Glu Pro Leu Trp Asn Ser Asn Tyr Val Asp His Val Gln Ile 225 230 235 240
Thr Met Ala Glu Asp Ile Gly Leu Gly Gly Arg Ala Gly Tyr Tyr Asp 245 250 255
Gly Ile Gly Ala Ala Arg Asp Val Ile Gln Asn His Leu Ile Gln Leu 260 265 270
Leu Ala Leu Val Ala Met Glu Glu Pro Ile Ser Phe Val Pro Ala Gln 275 280 285
Leu Gln Ala Glu Lys Ile Lys Val Leu Ser Ala Thr Lys Pro Cys Tyr 290 295 300
Pro Leu Asp Lys Thr Ser Ala Arg Gly Gln Tyr Ala Ala Gly Trp Gln 305 310 315 320
Gly Ser Glu Leu Val Lys Gly Leu Arg Glu Glu Asp Gly Phe Asn Pro 325 330 335
Glu Ser Thr Thr Glu Thr Phe Ala Ala Cys Thr Leu Glu Ile Thr Ser 340 345 350 10
15
Arg Arg Trp Ala Gly Val Pro Phe Tyr Leu Arg Thr Gly Lys Arg Leu 355 360 365
Gly Arg Arg Val Thr Glu Ile Ala Val Val Phe Lys Asp Ala Pro His 370 375 380
Gln Pro Phe Asp Gly Asp Met Thr Val Ser Leu Gly Gln Asn Ala Ile 385 390 395 400
Val Ile Arg Val Gln Pro Asp Glu Gly Val Leu Ile Arg Phe Gly Ser 405 410 415
Lys Val Pro Gly Ser Ala Met Glu Val Arg Asp Val Asn Met Asp Phe 420 425 430
Ser Tyr Ser Glu Ser Phe Thr Glu Glu Ser Pro Glu Ala Tyr Glu Arg 435 440 445
Leu Ile Leu Asp Ala Leu Leu Asp Glu Ser Ser Leu Phe Pro Thr Asn 450 455 460
Glu Glu Val Glu Leu Ser Trp Lys Ile Leu Asp Pro Ile Leu Glu Ala 465 470 475 480
Trp Asp Ala Asp Gly Glu Pro Glu Asp Tyr Pro Ala Gly Thr Trp Gly 485 490 495
Pro Lys Ser Ala Asp Glu Met Leu Ser Arg Asn Gly His Thr Trp Arg
20
25
30
Arg Pro <210> <211> <212> <213> <220> <221> <222> <223> <400>
500 505
3
708
DNA
Corynebacterium glutamicum
510
seqüência de ácido nucléico (1)..(708)
6-fosfogluconolactonase 3
atggttgatg tagtacgcgc acgcgatact gaagatttgg ttgcacaggc tgcctccaaa ttcattgagg ttgttgaagc agcaactgcc aataatggca ccgcacaggt agtgctcacc
60
120 240
300
360
420
480
540
600
660
708
72
ggtggtggcg ccggcatcaa gttgctggaa aagctcagcg ttgatgcggc tgaccttgcc tgggatcgca ttcatgtgtt cttcggcgat gagcgcaatg tccctgtcag tgattctgag tccaatgagg gccaggctcg tgaggcactg ttgtccaagg tttctatccc tgaagccaac attcacggat atggtctcgg cgacgtagat cttgcagagg cagcccgcgc ttacgaagct gtgttggatg aattcgcacc aaacggcttt gatcttcacc tgctcggcat gggtggcgaa ggccatatca actccctgtt ccctcacacc gatgcagtca aggaatcctc cgcaaaggtc atcgcggtgt ttgattcccc taagcctcct tcagagcgtg caactctaac ccttcctgcg gttcactccg caaagcgcgt gtggttgctg gtttctggtg cggagaaggc tgaggcagct gcggcgatcg tcaacggtga gcctgctgtt gagtggcctg ctgctggagc taccggatct gaggaaacgg tattgttctt ggctgatgat gctgcaggaa atctctaa <210> 4 <211> 235 <212> PRT <213> Corynebacterium glutamicum <220> <221> seqüência de aminoácido <222> (1)·-(235) <223> 6-fosfogluconolactonase <400> 4 Met Val Asp Val Val Arg Ala Arg . Asp Thr Glu Asp Leu Val Ala Gln 1 5 10 15 Ala Ala Ser Lys Phe Ile Glu Val Val Glu Ala Ala Thr Ala Asn Asn 20 25 30 Gly Thr Ala Gln Val Val Leu Thr Gly Gly Gly Ala Gly Ile Lys Leu 35 40 45 Leu Glu Lys Leu Ser Val Asp Ala . Ala Asp Leu Ala Trp Asp Arg Ile 50 55 60 His Val Phe Phe Gly Asp Glu Arg Asn Val Pro Val Ser Asp Ser Glu 65 70 75 80 Ser Asn Glu Gly Gln Ala Arg Glu Ala Leu Leu Ser Lys Val Ser Ile 85 90 95 Pro Glu Ala Asn Ile His Gly Tyr Gly Leu Gly Asp Val Asp Leu Ala 10
15
20
25
30
100 105
Glu Ala Ala Arg Ala Tyr Glu Ala Val Leu Asp 115 120
Gly Phe Asp Leu His Leu Leu Gly Met Gly Gly 130 135
Ser Leu Phe Pro His Thr Asp Ala Val Lys Glu 145 150 155
Ile Ala Val Phe Asp Ser Pro Lys Pro Pro Ser 165 170
Thr Leu Pro Ala Val His Ser Ala Lys Arg Val 180 185
Gly Ala Glu Lys Ala Glu Ala Ala Ala Ala Ile 195 200
Ala Val Glu Trp Pro Ala Ala Gly Ala Thr Gly 210 215
Leu Phe Leu Ala Asp Asp Ala Ala Gly Asn Leu
110
Glu Phe Ala Pro Asn 125
Glu Gly His Ile Asn 140
Ser Ser Ala Lys Val 160
Glu Arg Ala Thr Leu 175
Trp Leu Leu Val Ser 190
Val Asn Gly Glu Pro 205
Ser Glu Glu Thr Val 220
225
<210>
<211>
<212>
<213>
<220>
<221>
<222>
<223>
<400>
230 235
5
1455
DNA
Corynebacterium glutamicum
seqüência de ácido nucléico (I) . . (1455)
6-fosfo-gluconato-desidrogenase
5
atgactaatg gagataatct cgcacagatc ggcgttgtag aacctcgccc gcaacttcgc ccgcaacggc aacactgtcg gacaaaaccg acaagctcat cgccgatcac ggctccgaag accgtcgaag agttcgtagc atccctggaa aagccacgcc gctggtaacg ccaccgacgc agtcatcaac cagctggcag atcatcatcg acggcggcaa cgccctctac accgacacca
gcctagcagt
ctgtctacaa
gcaacttcat
gcgccatcat
atgccatgga
ttcgtcgcga
aatgggctca
ccgcagcact
cccttctgca
catggttcag
cgaaggcgac
gaaggaaatc
60
120
180
240
300
360 480
540
600
660
720
780
840
900
960
1020
1080
1140
1200
1260
1320
1380
1440
1455
74
tccgcacgcg gtctccactt cgtcggtgct aacggcccat ccatcatgcc tggtggccca cttgagtcca tcgctgccaa cgttgacggc ggcgccggcc acttcgtcaa gatggtccac atcggcgagg cataccacct tctccgctac gaggttttca aggaatggaa cgcaggcgac gaggttctct cccaggtgga tgctgaaacc gctgcaggtc agaagggcac cggacgttgg gctaccaccg gcatcggcga agctgttttc cgcgctgcag cacagggcaa cctacctgca gtggacaagg cacagttcgt cgaagacgtt gcttacgcac agggcttcga cgagatcaag gaccctcgcg acctcgctac catctggcgc aaccgcatcg tcgaagcata cgatgcaaac tacttcaaga gcgagctcgg cgacctcatc acccagcttg gcctgccaat cccagtgttc cgtgcagagc gtctgccagc agccctgatc acctacaagc gcatcgacaa ggatggctcc gaggttgaag cttaa <210> 6 <211>
<212>
<213>
<220>
<221>
<222>
<223>
<220>
<221>
<222>
<223>
<400>
ggtatctccg gcggcgaaga aggcgcactc gcaaagtcct acgagtccct cggaccactg accccatgtg tcacccacat cggcccagac aacggcatcg agtacgccga catgcaggtc gcagcaggca tgcagccagc tgaaatcgct ctggattcct acctcatcga aatcaccgca ggcaagccac taatcgacgt catcgttgac accgtcaagg ctgctcttga tctgggtatt gcacgtgcac tctccggcgc aaccagccag ggtgtcctca ccgatctgga agcacttggc cgccgtgcac tgtacgcatc caagcttgtt gctggctccg acgagaacaa ctgggacgtt ggcggctgca tcattcgcgc taagttcctc gctgaacttg agtccctgct gctcgatcct gattcatggc gtcgcgtgat tgtcaccgcc gcttcctccc tgtcctacta cgacagcctg caaggacagc gcgacttctt cggtgcgcac ttccacaccg agtggtccgg cgaccgctcc 484
PRT
Corynebacterium glutamicum
seqüência de aminoácido (I)··(483)
fosfo-gluconato-desidrogenase
seqüência de aminoácido (1)..(484)
fosfo-gluconato-desidrogenase
6 Met Thr Asn Gly Asp Asn Leu Ala Gln Ile Gly Val Val Gly Leu Ala 15 10 15
Val Met Gly Ser Asn Leu Ala Arg Asn Phe Ala Arg Asn Gly Asn Thr 20 25 30
Val Ala Val Tyr Asn Arg Ser Thr Asp Lys Thr Asp Lys Leu Ile Ala 35 40 45
Asp His Gly Ser Glu Gly Asn Phe Ile Pro Ser Ala Thr Val Glu Glu 50 55 60
Phe Val Ala Ser Leu Glu Lys Pro Arg Arg Ala Ile Ile Met Val Gln 65 70 75 80
Ala Gly Asn Ala Thr Asp Ala Val Ile Asn Gln Leu Ala Asp Ala Met 85 90 95
Asp Glu Gly Asp Ile Ile Ile Asp Gly Gly Asn Ala Leu Tyr Thr Asp 100 105 110
Thr Ile Arg Arg Glu Lys Glu Ile Ser Ala Arg Gly Leu His Phe Val 115 120 125
Gly Ala Gly Ile Ser Gly Gly Glu Glu Gly Ala Leu Asn Gly Pro Ser 130 135 140
Ile Met Pro Gly Gly Pro Ala Lys Ser Tyr Glu Ser Leu Gly Pro Leu 145 150 155 160
Leu Glu Ser Ile Ala Ala Asn Val Asp Gly Thr Pro Cys Val Thr His 165 170 175
Ile Gly Pro Asp Gly Ala Gly His Phe Val Lys Met Val His Asn Gly 180 185 190
Ile Glu Tyr Ala Asp Met Gln Val Ile Gly Glu Ala Tyr His Leu Leu 195 200 205
Arg Tyr Ala Ala Gly Met Gln Pro Ala Glu Ile Ala Glu Val Phe Lys 210 215 220
Glu Trp Asn Ala Gly Asp Leu Asp Ser Tyr Leu Ile Glu Ile Thr Ala 225 230 235 240
Glu Val Leu Ser Gln Val Asp Ala Glu Thr Gly Lys Pro Leu Ile Asp 245 250 255 Val Ile Val Asp Ala Ala Gly Gln Lys Gly Thr Gly Arg Trp Thr Val 260 265 270
Lys Ala Ala Leu Asp Leu Gly Ile Ala Thr Thr Gly Ile Gly Glu Ala 275 280 285
Val Phe Ala Arg Ala Leu Ser Gly Ala Thr Ser Gln Arg Ala Ala Ala 290 295 300
Gln Gly Asn Leu Pro Ala Gly Val Leu Thr Asp Leu Glu Ala Leu Gly 305 310 315 320
Val Asp Lys Ala Gln Phe Val Glu Asp Val Arg Arg Ala Leu Tyr Ala 325 330 335
Ser Lys Leu Val Ala Tyr Ala Gln Gly Phe Asp Glu Ile Lys Ala Gly 340 345 350
Ser Asp Glu Asn Asn Trp Asp Val Asp Pro Arg Asp Leu Ala Thr Ile 355 360 365
Trp Arg Gly Gly Cys Ile Ile Arg Ala Lys Phe Leu Asn Arg Ile Val 370 375 380
Glu Ala Tyr Asp Ala Asn Ala Glu Leu Glu Ser Leu Leu Leu Asp Pro 385 390 395 400
Tyr Phe Lys Ser Glu Leu Gly Asp Leu Ile Asp Ser Trp Arg Arg Val 405 410 415
Ile Val Thr Ala Thr Gln Leu Gly Leu Pro Ile Pro Val Phe Ala Ser 420 425 430
Ser Leu Ser Tyr Tyr Asp Ser Leu Arg Ala Glu Arg Leu Pro Ala Ala 435 440 445
Leu Ile Gln Gly Gln Arg Asp Phe Phe Gly Ala His Thr Tyr Lys Arg 450 455 460
Ile Asp Lys Asp Gly Ser Phe His Thr Glu Trp Ser Gly Asp Arg Ser 465 470 475 480
Glu Val Glu Ala
<210> 7
<211> 660 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <220>
<221> seqüência de ácido nucléico
<222> (1)..(660)
<223> ribulose-5-fosfato epimerase
<4 00> 7
atggcacaac gtactccact aatcgcccca tccattcttg ctgctgattt ctcccgctta 60 ggggagcagg tgttggctgt tcctgatgct gactggattc acgtcgacat catggacgga 120 cacttcgttc caaacttgag ctttggcgcg gatatcacag ctgcggtcaa ccgcgttacg 180 gacaaagaac tagacgtcca cctgatgatc gaaaacccag agaagtgggt ggacaactac 240 atcgacgctg gcgcggactg cattgttttc cacgttgaag ccaccgaagg tcacgttgag 300 ttggctaagt acatccgttc caagggtgtg cgtgcaggtt tctccctgcg ccctggaact 360 cccatcgagg attacttgga tgacctcgag cacttcgatg aagtcatcgt catgagcgtc 420 gagcctggat tcggtggcca aagcttcatg cctgaacaac tggaaaaggt tcgtaccctg 480 cgcaaggtca tcgatgagcg cggtctgaac accgtcatcg agatcgacgg cggcattagc 540 gccaagacca tcaagcaggc tgccgacgct ggcgtggatg ccttcgttgc aggttccgct 600 gtgtacggcg ctgaggatcc caacaaggcg atccaggagt tgcgagcact cgcgcagtaa 660 <210> 8 <211> 219
<212> PRT
<213> Corynebacterium glutamicum
<220>
<221> seqüência de aminoácido
<222> (1)··(219)
<223> ribulose-5-fosfato epimerase
<400> 8
Met Ala Gln Arg Thr Pro Leu Ile Ala Pro Ser Ile Leu Ala Ala Asp 15 10 15
Phe Ser Arg Leu Gly Glu Gln Val Leu Ala Val Pro Asp Ala Asp Trp 20 25 30
Ile His Val Asp Ile Met Asp Gly His Phe Val Pro Asn Leu Ser Phe 35 40 45 10
15
20
25
30
Gly Ala Asp Ile Thr Ala Ala Val Asn Arg Val Thr Asp Lys Glu Leu 50 55 60
Asp Val His Leu Met Ile Glu Asn Pro Glu Lys Trp Val Asp Asn Tyr 65 70 75 80
Ile Asp Ala Gly Ala Asp Cys Ile Val Phe His Val Glu Ala Thr Glu 85 90 95
Gly His Val Glu Leu Ala Lys Tyr Ile Arg Ser Lys Gly Val Arg Ala 100 105 110
Gly Phe Ser Leu Arg Pro Gly Thr Pro Ile Glu Asp Tyr Leu Asp Asp 115 120 125
Leu Glu His Phe Asp Glu Val Ile Val Met Ser Val Glu Pro Gly Phe 130 135 140
Gly Gly Gln Ser Phe Met Pro Glu Gln Leu Glu Lys Val Arg Thr Leu 145 150 155 160
Arg Lys Val Ile Asp Glu Arg Gly Leu Asn Thr Val Ile Glu Ile Asp 165 170 175
Gly Gly Ile Ser Ala Lys Thr Ile Lys Gln Ala Ala Asp Ala Gly Val 180 185 190
Asp Ala Phe Val Ala Gly Ser Ala Val Tyr Gly Ala Glu Asp Pro Asn 195 200 205
Lys Ala Ile Gln Glu Leu Arg Ala Leu Ala Gln 210 215
<210> <211> <212> <213> <220> <221> <222> <223> <4 00>
9
474
DNA
Corynebacterium glutamicum
seqüência de ácido nucléico (1)··(474)
ribose-5-fosfato isomerase 9
atgcgcgtat accttggagc agaccacgct ggtttcgaaa ctaaaaatgc aatcgcagaa 60 10
15
20
25
30
caccttaagg cccacggcca cgaagtgatc gactgcggag cccacaccta tgatgcagaa 120 gatgactacc cagccttctg catcgaagca gctagccgca cagtaaacga cccaggctca 180 ctcggcatcg tcctgggtgg atccggaaac ggcgagcaga tcgccgccaa caaggtcaag 240 ggtgcacgtt gtgcacttgc ttggtctgtt gaaactgcac gcctcgcccg cgagcacaac 300 aatgcgaacc tcatcggcat cggcggccgc atgcactcag aggaagaggc attggcaatt 360 gtcgacgcct tcctcgagca ggaatggagc aacgccgagc gccaccagcg tcgtatcgac 420 atcctcgctg attacgagcg cactggaatc gcacctgtcg ttcctaacga ataa 474 <210>
<211>
<212>
<213>
<220>
<221>
<222>
<223>
<400>
10
157
PRT
Corynebacterium glutamicum
seqüência de aminoácido (I)·.(157)
ribose-5-fosfato isomerase 10
Met Arg Val Tyr Leu Gly Ala Asp His Ala Gly 10
Ala He Ala Glu His Leu Lys Ala His Gly His 20 25
Gly Ala His Thr Tyr Asp Ala Glu Asp Asp Tyr 35 40
Glu Ala Ala Ser Arg Thr Val Asn Asp Pro Gly 50 55
Leu Gly Gly Ser Gly Asn Gly Glu Gln Ile Ala 65 70 75
Gly Ala Arg Cys Ala Leu Ala Trp Ser Val Glu 85 90
Arg Glu His Asn Asn Ala Asn Leu Ile Gly Ile 100 105
Ser Glu Glu Glu Ala Leu Ala Ile Val Asp Ala 115 120
Phe Glu Thr Lys Asn 15
Glu Val Ile Asp Cys 30
Pro Ala Phe Cys Ile 45
Ser Leu Gly Ile Val 60
Ala Asn Lys Val Lys 80
Thr Ala Arg Leu Ala 95
Gly Gly Arg Met His 110
Phe Leu Glu Gln Glu 125 120
180
240
300
360
420
480
540
600
660
720
780
840
900
960
1020
1080
1140
80
Trp Ser Asn Ala Glu Arg His Gln Arg Arg Ile Asp Ile Leu Ala Asp 130 135 140
Tyr Glu Arg Thr Gly Ile Ala Pro Val Val Pro Asn Glu 145 150 155
<210> 11 <211> 2103
<212> DNA
<213> Corynebacterium glutamicum
<220>
<221> sequencia de ácido m <222> (1)..(2103) <223> transcetolase <4 00> 11 ttgaccacct tgacgctgtc acctgaactt gattggtccg atgtggacac caaggctgta gtagaaaact gtggctccgg ccacccaggc accttgtacc agcgggttat gaacgtagat cgcttcgttc tttcttgtgg ccactcctct ggattcggcc ttgagatgga tgacctgaag ggacaccctg agtaccgcca caccaagggc ggtcttgcat ctgcagttgg tatggccatg ccaaccgctg ctgagggcga atccccattc ggtgacctgc aggaaggtgt cacctctgag ggcaacctca tcgtgttctg ggatgacaac gctttcaacg aggacgttgt tgctcgttac gaggctggcg aggacgttgc agcaatcgaa aagcgaccta ccttcatccg cgttcgcacc aacaccggtg ctgtgcacgg tgctgctctt gagcttggat tcgatcctga ggctcacttc cgctccctcg cagagcgcgc tgcacagaag tgggcagctg ccaaccctga gaacaaggct ccagcgggct acgctgacga gctcccaaca éico
caggcgctca ctgtacgcaa ttacccctct gacactgttc gtgtcctcgc tgcagacgct accgcaatga gcctggctcc ccttgcatac ccacaggaca ccaactgggc aggccgtgac ttgacccagt acatccagct ttacttgggt gctctgcgca cctgggattc cttgacccca gttgagatca ccactggccc tcttggccag gctgctcgtc gtgagcgtgg cctattcgac gaccaccaca tctacgtcat tgcttctgat gcatcctcca tcgctggcac ccagcagctg cgcatctcca tcgaagacaa cactgagatc aaggcttacg gctggcagac cattgaggtt gctgcagtgg ctgaggctaa gaaggacacc atcatcggct tcccagctcc aactatgatg ggcgcagctg aggttgcagc aaccaagact gcgatcgacg atgaggttat cgctcacacc aaggctgcat ggcaggtcaa gttcgatgag ctgttcgatc gcctgaactc ccgtgagctt tgggatgcag atgagaaggg cgtcgcaact cgtaaggctt ccgaggctgc acttcaggca ctgggcaaga cccttcctga gctgtggggc 1200 ggttccgctg acctcgcagg ttccaacaac accgtgatca agggctcccc ttccttcggc 1260 cctgagtcca tctccaccga gacctggtct gctgagcctt acggccgtaa cctgcacttc 1320 ggtatccgtg agcacgctat gggatccatc ctcaacggca tttccctcca cggtggcacc 1380 cgcccatacg gcggaacctt cctcatcttc tccgactaca tgcgtcctgc agttcgtctt 1440 gcagctctca tggagaccga cgcttactac gtctggaccc acgactccat cggtctgggc 1500 gaagatggcc caacccacca gcctgttgaa accttggctg cactgcgcgc catcccaggt 1560 ctgtccgtcc tgcgtcctgc agatgcgaac gagaccgccc aggcttgggc tgcagcactt 1620 gagtacaagg aaggccctaa gggtcttgca ctgacccgcc agaacgttcc tgttctggaa 1680 ggcaccaagg agaaggctgc tgaaggcgtt cgccgcggtg gctacgtcct ggttgagggt 1740 tccaaggaaa ccccagatgt gatcctcatg ggctccggct ccgaggttca gcttgcagtt 1800 aacgctgcga aggctctgga agctgagggc gttgcagctc gcgttgtttc cgttccttgc 1860 atggattggt tccaggagca ggacgcagag tacatcgagt ccgttctgcc tgcagctgtg 1920 accgctcgtg tgtctgttga agctggcatc gcaatgcctt ggtaccgctt cttgggcacc 1980 cagggccgtg ctgtctccct tgagcacttc ggtgcttctg cggattacca gaccctgttt 2040 gagaagttcg gcatcaccac cgatgcagtc gtggcagcgg ccaaggactc cattaacggt 2100 taa 2103 <210> 12
<211> 700
<212> PRT
<213> Corynebacterium glutamicum <220>
<221> seqüência de aminoácido
<222> (I)..(700)
<223> transcetolase
<400> 12
Met Thr Thr Leu Thr Leu Ser Pro Glu Leu
10
Asn Tyr Pro Ser Asp Trp Ser Asp Val Asp
20 25
Val Arg Val Leu Ala Ala Asp Ala Val Glu
35 40
Gln Ala Leu Thr Val Arg 15
Thr Lys Ala Val Asp Thr 30
Asn Cys Gly Ser Gly His 45 Pro Gly Thr Ala Met Ser Leu Ala Pro Leu Ala Tyr Thr Leu Tyr Gln
50 55 60
Arg Val Met Asn Val Asp Pro Gln Asp Thr Asn Trp Ala Gly Arg Asp
65 70 75 80
Arg Phe Val Leu Ser Cys Gly His Ser Ser Leu Thr Gln Tyr Ile Gln
85 90 95
Leu Tyr Leu Gly Gly Phe Gly Leu Glu Met Asp Asp Leu Lys Ala Leu
100 105 110
Arg Thr Trp Asp Ser Leu Thr Pro Gly His Pro Glu Tyr Arg His Thr
115 120 125
Lys Gly Val Glu Ile Thr Thr Gly Pro Leu Gly Gln Gly Leu Ala Ser 130 135 140
Ala Val Gly Met Ala Met Ala Ala Arg Arg Glu Arg Gly Leu Phe Asp 145 150 155 160
Pro Thr Ala Ala Glu Gly Glu Ser Pro Phe Asp His His Ile Tyr Val
165 170 175
Ile Ala Ser Asp Gly Asp Leu Gln Glu Gly Val Thr Ser Glu Ala Ser 180 185 190
Ser Ile Ala Gly Thr Gln Gln Leu Gly Asn Leu Ile Val Phe Trp Asp 195 200 205
f
Asp Asn Arg Ile Ser Ile Glu Asp Asn Thr Glu Ile Ala Phe Asn Glu 210 215 220
Asp Val Val Ala Arg Tyr Lys Ala Tyr Gly Trp Gln Thr Ile Glu Val 225 230 235 240
Glu Ala Gly Glu Asp Val Ala Ala Ile Glu Ala Ala Val Ala Glu Ala
245 250 255
Lys Lys Asp Thr Lys Arg Pro Thr Phe Ile Arg Val Arg Thr Ile Ile 260 265 270
Gly Phe Pro Ala Pro Thr Met Met Asn Thr Gly Ala Val His Gly Ala 275 280 285
Ala Leu Gly Ala Ala Glu Val Ala Ala Thr Lys Thr Glu Leu Gly Phe 290 295 300 Asp Pro Glu Ala His Phe Ala Ile Asp Asp Glu Val Ile Ala His Thr 305 310 315 320
Arg Ser Leu Ala Glu Arg Ala Ala Gln Lys Lys Ala Ala Trp Gln Val 325 330 335
Lys Phe Asp Glu Trp Ala Ala Ala Asn Pro Glu Asn Lys Ala Leu Phe 340 345 350
Asp Arg Leu Asn Ser Arg Glu Leu Pro Ala Gly Tyr Ala Asp Glu Leu 355 360 365
Pro Thr Trp Asp Ala Asp Glu Lys Gly Val Ala Thr Arg Lys Ala Ser 370 375 380
Glu Ala Ala Leu Gln Ala Leu Gly Lys Thr Leu Pro Glu Leu Trp Gly 385 390 395 400
Gly Ser Ala Asp Leu Ala Gly Ser Asn Asn Thr Val Ile Lys Gly Ser 405 410 415
Pro Ser Phe Gly Pro Glu Ser Ile Ser Thr Glu Thr Trp Ser Ala Glu 420 425 430
Pro Tyr Gly Arg Asn Leu His Phe Gly Ile Arg Glu His Ala Met Gly 435 440 445
Ser Ile Leu Asn Gly Ile Ser Leu His Gly Gly Thr Arg Pro Tyr Gly 450 455 460
Gly Thr Phe Leu Ile Phe Ser Asp Tyr Met Arg Pro Ala Val Arg Leu 465 470 475 480
Ala Ala Leu Met Glu Thr Asp Ala Tyr Tyr Val Trp Thr His Asp Ser 485 490 495
Ile Gly Leu Gly Glu Asp Gly Pro Thr His Gln Pro Val Glu Thr Leu 500 505 510
Ala Ala Leu Arg Ala Ile Pro Gly Leu Ser Val Leu Arg Pro Ala Asp 515 520 525
Ala Asn Glu Thr Ala Gln Ala Trp Ala Ala Ala Leu Glu Tyr Lys Glu 530 535 540
Gly Pro Lys Gly Leu Ala Leu Thr Arg Gln Asn Val Pro Val Leu Glu
545
550
555
560 Gly Thr Lys Glu Lys Ala Ala Glu Gly Val Arg Arg Gly Gly Tyr Val 565 570 575
Leu Val Glu Gly Ser Lys Glu Thr Pro Asp Val Ile Leu Met Gly Ser 580 585 590
Gly Ser Glu Val Gln Leu Ala Val Asn Ala Ala Lys Ala Leu Glu Ala 595 600 605
Glu Gly Val Ala Ala Arg Val Val Ser Val Pro Cys Met Asp Trp Phe 610 615 620
Gln Glu Gln Asp Ala Glu Tyr Ile Glu Ser Val Leu Pro Ala Ala Val 625 630 635 640
Thr Ala Arg Val Ser Val Glu Ala Gly Ile Ala Met Pro Trp Tyr Arg 645 650 655
Phe Leu Gly Thr Gln Gly Arg Ala Val Ser Leu Glu His Phe Gly Ala 660 665 670
Ser Ala Asp Tyr Gln Thr Leu Phe Glu Lys Phe Gly Ile Thr Thr Asp 675 680 685
Ala Val Val Ala Ala Ala Lys Asp Ser Ile Asn Gly 690 695 700
<210> 13
<211> 1083
<212> DNA
<213> Corynebacterium glutamicum
<220>
<221> seqüência de ácido nucléico
<222> (1)..(1083)
<223> Transaldolase
<4 00> 13
atgtctcaca ttgatgatct tgcacagctc ggcacttcca cttggctcga cgacctctcc 60 cgcgagcgca ttacttccgg caatctcagc caggttattg aggaaaagtc tgtagtcggt 120 gtcaccacca acccagctat tttcgcagca gcaatgtcca agggcgattc ctacgacgct 180 cagatcgcag agctcaaggc cgctggcgca tctgttgacc aggctgttta cgccatgagc 240 atcgacgacg ttcgcaatgc ttgtgatctg ttcaccggca tcttcgagtc ctccaacggc 300 tacgacggcc gcgtgtccat cgaggttgac ccacgtatct ctgctgaccg cgacgcaacc 360
ctggctcagg ccaaggagct gtgggcaaag gttgatcgtc caaacgtcat gatcaagatc 420
cctgcaaccc caggttcttt gccagcaatc accgacgctt tggctgaggg catcagcgtt 480
aacgtcacct tgatcttctc cgttgctcgc taccgcgagg tcatcgctgc gttcatcgag 540
ggcatcaagc aggctgctgc aaacggccac gacgtctcca agatccactc tgtggcttcc 600
ttcttcgtct cccgcgtcga cgttgagatc gacaagcgcc tcgaggcaat cggatccgat 660
gaggctttgg ctctgcgcgg caaggcaggc gttgccaacg ctcagcgcgc ttacgctgtg 720
tacaaggagc ttttcgacgc cgccgagctg cctgaaggtg ccaacactca gcgcccactg 780
tgggcatcca ccggcgtgaa gaaccctgcg tacgctgcaa ctctttacgt ttccgagctg 840
gctggtccaa acaccgtcaa caccatgcca gaaggcacca tcgacgcggt tctggagcag 900
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180
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480
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134
<223> Plasmídeo pCLIK5A PSODH661 PSOD 6PGDH
<4 00> 35 cgcgtcgccg aaaccgatga cagcgcggcc tagtgcaggt tcgcgaccat cctcagcgag gagatcaaaa tcagtctctg agatctgatc ttctggaaag tcctgcttgg cgtaatcaat atcgtggcct tgcttggaca ggtagccacc gattttcgct cccctgggtg ccatggcatc gcctgctgcg gcgaggtttc gccagcgctg atctgtgagc tctttccatg tagtcatggt atggtgcgca gtgtggttcg tgcgacgact agatgggtgc ggccacctag ctgaatcggc acagcagaaa tgaagtcggt gttgttgttg atcatgctgg cgactgatcc agtggattcg aagcccacca cttgcaggtg cttggatgcc tcgatggtgg tgtagcgcag ccccagattg gcttcaagtt cgtctgtggt taaagctctg tcttggggtt gatcatcgcg ggaagtcata ggattttcac ctcctgtgac ctggtaaaat aggccgattt tgctgacacc gggcttagct ccgataaata ggtcggctga aaaatttcgt gaggtgtcgc accaagtact tttgcgaagc tgctcggtgc ggaaacctac gaaaggattt catgactaat ggagataatc tcgcacagat aaacctcgcc cgcaacttcg cccgcaacgg tgacaaaacc gacaagctca tcgccgatca aaccgtcgaa gagttcgtag catccctgga ggctggtaac gccaccgacg cagtcatcaa catcatcatc gacggcggca acgccctcta ctccgcacgc ggtctccact tcgtcggtgc caacggccca tccatcatgc ctggtggctc gcttgagtcc atcgctgcca acgttgacgg atcggcgccc agtgcgcggt gaatgttggc aaagcccatg acgttgccgg cggagacaat aacagagaga tctcccacca cccagcgaac caggatggga tcaaggtctg tgcctagaac gatgcgtccc tggccgcagc cagcatccaa aatgaggcgg gcttcgccgt aaatatcatt cgcgtagttt tctgagtgcg ctgggttgtt gcccgagtat agggctactt gttcagcacc tctccgcggt gggtgcattc gatctgccac gttgcttcgg ccacgatgac accggagctc atgccgacga ccatttttcc aggggcggaa gcgatggcgg cgtagacacc accgttgacc acgtgaagtt cgctgaccac ccggccgggc cggtcgaggc cataattggc gttgttgagt gtggcggcaa gttctgcaag cgaaagcaga attaattact ctagtcggcc taaaatggtt cgccactacc cccaaatggt cacacctttt gccaattatt ccgggcttgt gacccgctac tgcaatatca acaaaaaggc ctatcattgg gccatctgac ggattttcaa aagatgtata tttacccatg ccgtcaagta cgatcaataa cggcgttgta ggcctagcag taatgggctc caacactgtc gctgtctaca accgcagcac cggctccgaa ggcaacttca tcccttctgc aaagccacgc cgcgccatca tcatggttca ccagctggca gatgccatgg acgaaggcga caccgacacc attcgtcgcg agaaggaaat tggtatctcc ggcggcgaag aaggcgcact agcaaagtcc tacgagtccc tcggaccact caccccatgt gtcacccaca tcggcccaga cggcgccggc cacttcgtca agatggtcca catcggcgag gcataccacc ttctccgcta tgaggttttc aaggaatgga acgcaggcga agaggttctc tcccaggtgg atgctgaaac 5 cgctgcaggt cagaagggca ccggacgttg tgctaccacc ggcatcggcg aagctgtttt
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15
20
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25
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15
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Claims (30)

1. Método de produzir metionina em bactérias corineformes, ca- racterizado pelo fato de que compreende a etapa de, cultivar pelo menos uma bactéria corineforme que seja derivada através de modificação genética de um organismo de partida de modo que a dita bactéria corineforme apresente uma quantidade e/ou atividade aumen- tada^) de pelo menos uma enzima da via das pentoses-fosfato comparado ao organismo de partida.
2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a quantidade e/ou atividade de pelo menos transcetolase, tran- saldolase, glicose-6-fosfato-desidrogenase ou 6-fosfo-gliconato- desidrogenase é/são aumentada(s) comparado ao organismo de partida.
3. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a quantidade e/ou atividade de pelo menos transcetolase e glicose-6-fosfato-desidrogenase, transcetolase e 6-fosfo-g Iiconato- desidrogenase ou glicose-6-fosfato-desidrogenase e 6-fosfo-g Iiconato- desidrogenase é/são aumentada(s) comparado ao organismo de partida.
4. Método de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que a quantidade e/ou atividade de pelo menos transcetolase, glico- se-6-fosfato-desidrogenase e 6-fosfo-gliconato-desidrogenase é/são aumen- tada(s) comparado ao organismo de partida.
5. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 4, caracterizado pelo fato de que a quantidade e/ou atividade da(s) dita(s) enzima(s) é/são aumentada(s) aumentando o número de cópias das se- quências de ácido nucleico que codificam as ditas enzimas, aumentando a transcrição e/ou translação das seqüências de ácido nucleico que codificam as ditas enzimas, introduzindo mutações nas seqüências de ácido nucleico que codificam as ditas enzimas ou uma combinação dos mesmos.
6. Método de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o número de cópias de gene é aumentado usando vetores de replicação autônomos compreendendo as seqüências de ácido nucleico que codificam as ditas enzimas e/ou por integração cromossômica de cópias adi- cionais das seqüências de ácido nucleico que codificam as ditas enzimas no genoma do organismo de partida.
7. Método de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que a transcrição é aumentada usando promotores fortes.
8. Método de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que o promotor forte é selecionado do grupo que compreende Peftu. PgroES. PsOD 6 ΡλR·
9. Método de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que o promotor PSod é usado.
10. Método de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que a quantidade e/ou atividade de transcetolase e 6-fosfo-gliconato- desidrogenase é/são aumentada(s) comparado a um organismo de partida substituindo seus respectivos promotores endógenos com um promotor forte que é preferivelmente Psod-
11. Método de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que transcetolase carrega pelo menos uma mutação em uma posi- ção que corresponde à posição 293 ou 327 da SEQ ID N0 12 e em que 6- fosfo-gliconato-desidrogenase carrega pelo menos uma mutação em uma posição que corresponde à posição 150, 209, 269, 288, 329, 330 ou 353 da SEQ ID N0 6.
12. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 e 11, caracterizado pelo fato de que a quantidade e/ou atividade de transce- tolase e 6-fosfo-gliconato-desidrogenase é/são aumentada(s) comparado a um organismo de partida substituindo seus respectivos promotores endóge- nos com um promotor forte que é preferivelmente Psod, em que transcetola- se carrega pelo menos uma mutação em uma posição que corresponde à posição 293 ou 327 da SEQ ID No. 12 e em que 6-fosfo-gliconato- desidrogenase carrega pelo menos uma mutação em uma posição que cor- responde à posição 150, 209, 269, 288, 329, 330 ou 353 da SEQ ID No. 6.
13. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 12, caracterizado pelo fato de que a bactéria corineforme é selecionada do grupo que compreende as espécies Corynebacterium glutamicum, Cory- nebacterium acetoglutamicum, Corynebacterium jeikeum, Corynebacterium acetoaeidophilum, Corynebacterium thermoaminogenes, Corynebaeterium melasseeoia e Corynebaeterium effiziens.
14. Método de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pe- Io fato de que uma cepa de C. glutamieum é usada.
15. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 14, caracterizado pelo fato de que pelo menos cerca de 2%, pelo menos cerca de 5%, pelo menos cerca de 10%, pelo menos cerca de 20%, preferi- velmente pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 50% e mais preferivelmente pelo menos cerca de fator 2, pelo me- nos cerca de fator 5 e pelo menos cerca de fator 10 mais metionina são pro- duzidos comparado ao organismo de partida.
16. Bactéria corineforme, caracterizada pelo fato de que é deri- vada através de modificação genética de um organismo de partida de modo que a dita bactéria corineforme apresenta uma quantidade aumentada e/ou atividade de pelo menos duas enzimas da via das pentoses-fosfato compa- rada ao organismo de partida.
17. Bactéria corineforme de acordo com a reivindicação 16, ca- racterizada pelo fato de que a quantidade e/ou atividade de pelo menos transcetolase e glicose-6-fosfato-desidrogenase, transcetolase e 6-fosfo- gliconato-desidrogenase, ou glicose-6-fosfato-desidrogenase e 6-fosfo- gliconato-desidrogenase é/são aumentada(s) comparado ao organismo de partida.
18. Bactéria corineforme de acordo com a reivindicação 17, ca- racterizada pelo fato de que a quantidade e/ou atividade de pelo menos transcetolase, glicose-6-fosfato-desidrogenase e 6-fosfo-g Iiconato- desidrogenase é/são aumentada(s) comparado ao organismo de partida.
19. Bactéria corineforme de acordo com qualquer uma das rei- vindicações de 16 a 18, caracterizada pelo fato de que a quantidade e/ou atividade da(s) dita(s) enzima(s) é/são aumentada(s) aumentando o número de cópias das seqüências de ácido nucleico que codificam as ditas enzimas, aumentando a transcrição e/ou a translação dos genes que codificam as di- tas enzimas, introduzindo mutações nas seqüências de ácido nucleico que codificam as ditas enzimas ou uma combinação dos mesmos.
20. Bactéria corineforme de acordo com a reivindicação 19, ca- racterizada pelo fato de que o número de cópias de gene é aumentado u- sando vetores de replicação autônomos compreendendo a seqüência de ácido nucleico que codifica as ditas enzimas e/ou por integração cromossô- mica de cópias adicionais das seqüências de ácido nucleico que codificam as ditas enzimas no genoma do organismo de partida.
21. Bactéria corineforme de acordo com a reivindicação 19, ca- racterizada pelo fato de que a transcrição é aumentada usando promotor forte.
22. Bactéria corineforme de acordo com a reivindicação 21, ca- racterizada pelo fato de que o promotor forte é selecionado do grupo que compreende PEftu, PgroEs, Psod e ΡλΚ.
23. Bactéria corineforme de acordo com a reivindicação 22, ca- racterizada pelo fato de que o promotor Psod é usado.
24. Bactéria corineforme de acordo com a reivindicação 21, ca- racterizada pelo fato de que a quantidade e/ou atividade de transcetolase e 6-fosfo-gliconato-desidrogenase é/são aumentada(s) comparado a um orga- nismo de partida substituindo seus respectivos promotores endógenos com um promotor forte que é preferivelmente Psod-
25. Bactéria corineforme de acordo com a reivindicação 19, ca- racterizada pelo fato de que transcetolase carrega pelo menos uma mutação em uma posição que corresponde à posição 293 ou 327 da SEQ ID No. 12 e em que 6-fosfo-gliconato-desidrogenase carrega pelo menos uma mutação em uma posição que corresponde à posição 150, 209, 269, 288, 329, 330 ou 353 da SEQ ID No. 6.
26. Bactéria corineforme de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 24 e 25, caracterizada pelo fato de que a quantidade e/ou ativi- dade de transcetolase e 6-fosfo-gliconato-desidrogenase é/são aumenta- da^) comparado a um organismo de partida substituindo seus respectivos promotores endógenos com um promotor forte que é preferivelmente Psod, em que a transcetolase carrega pelo menos uma mutação em uma posição que corresponde à posição 293 ou 327 da SEQ ID N0 12 e em que 6-fosfo- gliconato-desidrogenase carrega pelo menos uma mutação em uma posição que corresponde à posição 150, 209, 269, 288, 329, 330 ou 353 da SEQ ID N0 6.
27. Bactéria corineforme de acordo com qualquer uma das rei- vindicações de 16 a 26, caracterizada pelo fato de que a bactéria corinefor- me é selecionada do grupo que compreende as espécies Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium aeetoglutamieum, Corynebaeterium jeikeum, Corynebaeterium acetoaeidophiium, Corynebaeterium thermoaminogenes, Corynebaeterium meiasseeola e Corynebaeterium effiziens.
28. Bactéria corineforme de acordo com a reivindicação 27, ca- racterizada pelo fato de que uma cepa de C. glutamicum é usada.
29. Bactéria corineforme de acordo com qualquer uma das rei- vindicações de 16 a 28, caracterizada pelo fato de que pelo menos cerca de 2%, pelo menos cerca de 5%, pelo menos cerca de 10%, pelo menos cerca de 20%, preferivelmente pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 50% e mais preferivelmente pelo menos cerca de fator 2, pelo menos cerca de fator 5 e pelo menos cerca de fator 10 mais metionina são produzidos comparado ao organismo de partida.
30. Uso de uma bactéria corineforme, como definida em qual- quer uma das reivindicações de 16 a 29, caracterizado pelo fato de ser para produzir metionina.
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