BRPI0613660A2 - microorganismo, cassete de expressão de metl, vetor, métodos para produzir metionina, licopeno, nìveis incrementados de um carotenóide desejado, pelo menos dois compostos em um processo de fermentação, um composto carotenóide desejado, pelo menos dois compostos em um processo de fermentação, um composto carotenóide, e um produto quìmico fino contendo enxofre, e para incrementar a capacidade de produção de metionina em um microorganismo, e, sequência de dna - Google Patents

microorganismo, cassete de expressão de metl, vetor, métodos para produzir metionina, licopeno, nìveis incrementados de um carotenóide desejado, pelo menos dois compostos em um processo de fermentação, um composto carotenóide desejado, pelo menos dois compostos em um processo de fermentação, um composto carotenóide, e um produto quìmico fino contendo enxofre, e para incrementar a capacidade de produção de metionina em um microorganismo, e, sequência de dna Download PDF

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Abstract

MICROORGANISMO, CASSETE DE EXPRESSãO DE METI, VETOR, MéTODOS PARA PRODUZIR METIONINA, LICOPENO, NìVEIS INCRMENTADOS DE UM CAROTENóIDE DESEJADO, PELO MENOS DOIS COMPOSTOS EM UM PROCESSO DE FERMENTAçãO, UM COMPOSTO CAROTENóIDE, E UM PRODUTO QUìMICO FINO CONTENDO ENXOFRE, E PARA INCREMENTAR A CAPACIDADE DE PRODUçãO DE METIONINA EM UM MICROORGANISMO, E, SEQUêNCIA DE DNA. A presente invenção refere-se a microorganismos aperfeiçoados e métodos para a produção de metionina e outros químicos finos contendo enxofre usando o gene meti de bacillus subtilis ou um gene relacionado com meti. Em algumas concretizações da presente invenção, o gene meti ou outro gene é integrado de uma maneira que permite a co-produção de um composto solúvel em água, como metionina ou outro aminoácido e um composto carotenóide.

Description

"MICROORGANISMO, CASSETE DE EXPRESSÃO DE MetIj VETORs MÉTODOS PARA PRODUZIR METIONINA, LICOPENO, NÍVEIS INCREMENTADOS DE UM CAROTENÓIDE DESEJADO, PELO MENOS DOIS COMPOSTOS EM UM PROCESSO DE FERMENTAÇÃO, UM COMPOSTO CAROTENÓIDE, E UM PRODUTO QUÍMICO FINO CONTENDO ENXOFRE, E PARA INCREMENTAR A CAPACIDADE DE PRODUÇÃO DE METIONINA EM UM MICROORGANISMO, E, SEQÜÊNCIA DE DNA" Pedidos relacionados
Este pedido reivindica o benefício de prioridade relativamente ao Pedido de Patente Provisional dos E.U.A. n°: 60/700,557, depositado em18 de julho de 2005, e Pedido de Patente Provisional dos E.U.A. n°:60/713905, depositado em 1 de setembro de 2005, ambos intitulados "Use of a Bacillus MetI Gene to improve Methionine Production in Microorganisms," sendo que o inteiro teor de cada um é incorporado aqui por referência.
Adicionalmente, este pedido relaciona-se com o Pedido de Patente Provisional dos E.U.A. n°: 60/700.698, depositado em 18 de julho de2005, e Pedido de Patente Provisional dos E.U.A. n°: 60/713.907, depositado em 1 de setembro de 2005, ambos intitulados "Use of Dimethyl Disulfide for methionine Production in Microorganisms,"sendo que o inteiro teor de cada um é incorporado aqui por referência.
Este pedido também está relacionado ao Pedido de Patente Provisional dos E.U.A. n0:, 60/700.699, depositado em 18 de julho de 2005, e Pedido de Patente Provisional dos E.U.A. n° 60/714.042, depositado em 1 de setembro de 2005, ambos intitulados "Methionine Producing Recombinant Microorganism" sendo que o inteiro teor de cada um é incorporado aqui por referência.
Fundamentos da invenção
A biossíntese de químicos finos contendo enxofre, por exemplo, metionina, homocisteína, S-adenosilmetionina, glutationa, coenzima A,coenzima M, micotiol, cisteína, biotina, tiamina, e ácido lipóico, ocorre em células via processos metabólicos naturais. Estes compostos, referidos coletivamente como "químicos finos contendo enxofre", incluem ácidos orgânicos, aminoácidos tanto proteinogênicos como também não- proteinogênicos, vitaminas, e cofatores, e são usados em muitos ramos da indústria, incluindo indústrias de alimentos, rações animais, cosméticos e farmacêutica. Estes compostos podem ser produzidos potencialmente numa grande escala por meio do cultivo de microorganismos, como bactérias, e em particular bactérias Coryneform, que foram desenvolvidas para produzir e secretar grandes quantidades da substância desejada.
Existe uma necessidade de processos de produção aperfeiçoados para químicos finos contendo enxofre, como metionina, devido à grande importância destes químicos numa grande gama de indústrias. Sumário da invenção
A presente invenção refere-se a microorganismos e métodos aperfeiçoados (p. ex., biossínteses microbianas, fermentação microbiana) para a produção de metionina e outros químicos finos contendo enxofre. Em particular, os presentes inventores verificaram que determinadas enzimas úteis envolvidas em vias biossintéticas de metionina em, p. ex., Bacillus, não são sujeitas à inibição de feedback de metionina. Mais especificamente, demonstra-se aqui que gene meti de Bacillus, quando expresso em níveis acima dos normais ou expresso constitutivamente ou introduzido (via, p. ex., transformação) em um microorganismo heterólogo, permite a produção incrementada de metionina.
A presente invenção refere-se, portanto, a microorganismos recombinantes apresentando a capacidade de produzir mais efetivamente metionina. Estes microorganismos podem empregar a via de trans-sulfuração ou a via de sulfidrilação direta, sendo que, introduzindo-se um gene, como gene meti de Bacillus, obtém-se níveis incrementados de produção de metionina. Em microorganismos exemplares, enzimas endógenas sujeitas à inibição de feedback de metionina são complementadas, adicionadas a, ou evitadas por meio da introdução de uma enzima resistente a feedback de metionina, proporcionando, com isso, produção incrementada de metionina. Em determinadas concretizações da presente invenção, usa-se microorganismos que apresentam uma via biossintética de metionina que é à base de trans-sulfuração que sofreu ablação ou diminuída. Estes organismos podem produzir metionina apenas através da via de sulfidrilação direta e, portanto, são particularmente apropriados para a produção incrementada de metionina usando-se meti de Bacillus introduzido exogenamente. Em algumas concretizações, esta invenção refere-se a microorganismos recombinantes que não apresentam MetB ou MetC, ou os apresentam reprimidos, sendo que um microorganismo é desregulado para meti. Em algumas concretizações, microorganismos recombinantes desregulados para meti não apresentam MetB ou incluem MetB reprimido.
O meti, no caso de alguns microorganismos recombinantes compreendidos por esta revelação é um MetI de Bacillus, como por exemplo, meti de Bacillus subtilis.
Em algumas concretizações, microorganismos recombinantes da presente invenção pertencem ao gênero Corynebacteriumt como, por exemplo, Corynebacterium glutamicum.
A desregulação de meti pode ser obtida por meio de um ou mais métodos aqui descritos e aqueles conhecidos na técnica. Em algumas concretizações, a desregulação de Meti é alcançada por meio de superexpressão do gene meti.
Esta invenção também compreende cassetes de expressão, por exemplo, um cassete de expressão de meti, compreendendo o gene meti ligado operacionalmente a um promotor heterólogo e, opcionalmente, um sítio de ligação ribossômica.
Em algumas concretizações, um promotor usado em um cassete de meti é um promotor P15.
Esta invenção também compreende vetores para a superexpressão de meti. Em algumas concretizações, um vetor compreende um cassete de expressão de Meti, como descrito aqui.
Em algumas concretizações, microorganismos recombinantes aqui descritos incluem um cassete de expressão de meti. Em algumas concretizações, microorganismos são reprimidos com relação a MetB e MetC além de incluir um cassete de expressão de meti.
Esta invenção refere-se adicionalmente a um método para produzir metionina, por meio do cultivo de um microorganismo recombinante que é reprimido, ou que não apresenta MetB e MetC e é desregulado para MetI, em condições tais que metionina seja produzida. Uma etapa adicional de isolar a metionina pode ser incluída em um método para produzir metionina.
Em algumas concretizações, métodos para incrementar a capacidade de produção de metionina em um microorganismo produtor de metionina são descritos aqui, sendo que referidos métodos incluem desregular meti no microorganismo, incrementando, com isso, a capacidade de produção de metionina do microorganismo.
Em algumas concretizações descreve-se um método para incrementar a capacidade de produção de metionina em a microorganismo apresentando inibição de feedback de metionina, sendo que referido método incluir desregular meti para aliviar a inibição de feedback de metionina, incrementando com isto a capacidade de produção de metionina do microorganismo.
Em algumas concretizações, a capacidade de produção de metionina é incrementada em pelo menos 20 % relativamente a um microorganismo de controle.
Em outras concretizações adicionais, a capacidade de produção de metionina é incrementada em pelo menos 30 % relativamente a um microorganismo de controle.
Adicionalmente, em algumas concretizações, a capacidade de produção de metionina é incrementada em pelo menos 40 % relativamente a um microorganismo de controle.
Também se compreende microorganismos recombinantes que apresentam uma capacidade incrementada para a produção de metionina, no entanto, não incluem MetI desregulado. Em outra concretização, instalação de um gene MetI heterólogo em a microorganismo é realizado de tal forma que o microorganismo manipulado resultante produz um segundo composto útil, por exemplo, um composto carotenóide, como licopeno ou astaxantina, como um subproduto, de tal forma que dois compostos úteis podem ser co-produzidos. Em outra concretização, um organismo é engenheirado para co-produzir um primeiro composto, como um aminoácido (por exemplo, incluindo embora sem limitação, metionina, lisina, ácido glutâmico, treonina, isoleucina, fenilalanina, tirosina, triptofano, alanina, cisteína, leucina, homosserina, homocisteína, etc.) ou um outro composto não-carotenóide de interesse comercial (por exemplo, incluindo embora sem limitação, metano, hidrogênio, ácido láctico, 1,2-propano diol, 1,3-propano diol, etanol, metanol, propanol, acetona, butanol, ácido acético, ácido propiônico, ácido cítrico, ácido itacônico, glucosamina, glicerol, açúcares, vitaminas, enzimas terapêuticas, de pesquisa e industriais, proteínas terapêuticas, de pesquisa e industriais, e vários sais de qualquer um dos compostos listados acima) e um segundo composto incluindo um composto carotenóide de interesse comercial (por exemplo, incluindo embora sem limitação, licopeno, astaxantina, β- caroteno, luteína, zeaxantina, cantaxantina, decaprenoxantina, e bixina, etc.). Em uma concretização preferida, o primeiro composto é separado como um gás ou é secretado em um meio de cultura enquanto que o segundo composto carotenóide permanece na massa de células.
A presente invenção refere-se adicionalmente a técnicas aperfeiçoadas de engenharia genética, i.e. construções de vetores, que facilitam a transferência de seqüências de ácido nucleico em microorganismos-alvos. Um aspecto dos métodos e materiais aperfeiçoados aqui compreende vetores de expressão recombinante inéditos capazes de transformar células e causar, com isso, a expressão de seqüências desejadas de ácido nucleico. De preferência, estas seqüências de ácido nucleico compreendem genes que facilitam ou aperfeiçoam vias biossintéticas do microorganismo-alvo de tal forma que a produção de uma substância desejada é obtida, modificada ou incrementada. Referidos genes podem codificar enzimas ou proteínas envolvidas na biossíntese de, p. ex., químicos finos contendo enxofre, como metionina. Em concretizações preferidas da presente invenção a enzima é uma O-acetil-homosserina sulfidrilase, O-succinil- homosserina sulfidrilase ou enzima similar envolvida na produção biossintética de metionina.
Em determinadas concretizações da presente invenção, os vetores de expressão recombinantes compreendem cassetes de integração. As cassetes de expressão recombinantes são úteis para a integração de seqüências de ácido nucleico em regiões genômicas específicas, desejadas, de um organismo-alvo. Em determinadas concretizações da presente invenção, vetores de expressão recombinantes compreendendo cassetes de integração foram projetados de tal forma que seqüências de genes específicas são rompidas pelo cassete de integração e seqüências de ácido nucleico heterólogas inseridas. Estas seqüências heterólogas podem codificar proteínas ou enzimas desejadas (p. ex., enzimas biossintéticas de metionina).
Concretiza-se também aqui métodos e materiais aperfeiçoados úteis para seleção eficiente de organismos recombinantes compreendendo características desejadas. Em determinadas concretizações a seleção é seleção colorimétrica. Em concretizações preferidas, a seleção colorimétrica é obtida modificando-se níveis de produção de compostos carotenóides, como, por exemplo, licopeno, astaxantina, β-caroteno, luteína, zeaxantina, cantaxantina, decaprenoxantina, e bixina, e análogos em células-alvo. Assim, a presente invenção proporciona material e métodos para modificar recombinantemente o óperon de biossíntese carotenóide e proporcionar, com isso, transformantes geneticamente engenheirados que podem ser selecionados com base em alterações fenotípicas relacionadas com a produção de carotenóides (p. ex., alteração de cor).
A presente invenção refere-se adicionalmente a projetos inéditos de vetor de expressão para introduzir seqüências de ácido nucleico opcionalmente compreendendo seqüências gênicas em microorganismos.
Composições produzidas de acordo com as metodologias descritas acima também são caracterizadas como o são microorganismos usados em referidas metodologias.
Breve descrição dos desenhos
Figura 1. proporciona uma ilustração gráfica da via biossintética de metionina usada nos microorganismos da invenção.
Figura 2. é uma representação gráfica de dados experimentais derivados do Exemplo 2 mostrando as sensibilidades relativas de Met Y de C. glutamicum e de Met I de B. subtilis à inibição de metionina.
Figura 3. é uma representação esquemática do plasmídeo pOM284 para integração de um cassete compreendendo o gene metI.
Figura 4. é uma representação esquemática do óperon de biossíntese carotenóide presente em Corynebacterium glutamicum.
Figura 5. é uma representação esquemática do plasmídeo pOM246 para integração de um cassete compreendendo o gene metI. Figura 6. é uma representação esquemática da via biossintética carotenóide de C. glutamicum.
Figura 7 A-C ilustra um alinhamento de seqüências múltiplas (MSA5 multiple sequence alignment) da seqüência de aminoácidos de MetI de Bacillus subtilis apresentada na SEQ ID NO:2 com relação às cinqüenta seqüências mais próximas encontradas no banco de dados GENBANK® do NCBL As SEQ ID NOs: de 26 a 75 correspondem a seqüências de aminoácidos da proteína hipotética de Bacillus subtilis (GENBANKDN0 de acesso NPJ389069.1) (SEQ ID NO:26), enzima dependente de fosfato- piridoxal do metabolismo de Cys/Met de BaciUus Heheniformis (GENBANK® n° de acesso AAU22849.1) (SEQ ID NO:27), clone ATCC 14580 de Bacillus licheniformis (GENBANK® n° de acesso YP_090888.1) (SEQ ID NO:28) gama-sintase de cistationina de GeoBacillus kaustophilus (GENBANK® n° de acesso YP_146719.1) (SEQ ID NO:29), gama-sintase de cistationina de Baeillus halodurans (GENBANK® n° de acesso BAB05346.1) (SEQ ID NO:30), beta-liase de cistationina de Bacillus eereus (GENBANK® n° de acesso YP 085587.1) (SEQ ID NO:31), gama-sintase de cistationina de Bacillus eereus (GENBANK® n° de acesso ZP_00238525.1) (SEQ ID NO:32), beta-liase de cistationina de Bacillus thuringiensis (GENBANK® n° de acesso YP_038316.1) (SEQ ID NO:33), beta-liase de cistationina de Bacillus anthraeis (GENBANK® n° de acesso YP_021123.1) (SEQ ID NO:34), beta-liase de cistationina de BaciUus eereus ATCC 10987 (GENBANK® n° de acesso NP_980629.1) (SEQ ID NO:35), gama-sintase de cistationina de BaciUus eereus ATCC 14579 (GENBANK® n° de acesso NP 833967.1) (SEQ ID NO:36), subespécies de Pasteurella mitoeida (GENBANK® n° de acesso NP_245932.1) (SEQ ID NO:37), cistationina gama-sintase/ beta-liase de cistatioína de Hemophilus somnus C0G0626 (GENBANK® n° de acesso ZP_00132603.1) (SEQ ID NO:38), proteína de MetC de Manheimia suceinieiprodueens (GENBANK® n° de acesso YP_088819.1) (SEQ ID ΝΟ:39), cistationina gama-sintase/cistatioína beta- liase de Hemophilus somnus 0G0626 (GENBANK® n° de acesso ZP__00122714.1) (SEQ ID N0:40), gama-sintase de cistationina de Hemophilus influenzae (GENBANK® n° de acesso NP_438259.1) (SEQ ID NO:41)s gama sintase de cistationina (GENBANK® n° de acesso P44502) (SEQ ID NO:42), cistationina gama-sintase/ beta-liase de cistationina de Hemophilus influenzae C0G0626 (GENBANK® n° de acesso ZP 00322320.1) (SEQ ID NO:43), cistationina gama-sintase/cistationina beta-liase de Hemophilus influenzae C0G0626 (GENBANK® n° de acesso ψ ZP__00157594.2) (SEQ ID NO:44), cistationina gama-sintase/cistationina beta-liase de Hemophilus influenzae C0G0626 (GENBANK® n° de acesso ZP_00154815.2) (SEQ ID NO:45), cistationina gama-sintase de Bacillus clausii (GENBANK® n° de acesso YP_175363.1) (SEQ ID NO:46), /cistationina gama-sintase/cistationina beta-liase de ActinoBacillus pleuropneumoniae C0G0626 (GENBANK® n° de acesso ZP_00134030.2) (SEQ ID NO:47), cistationina beta/gama-liase de histeria monocytogenes (GENBANK® n° de acesso YP_014300.1) (SEQ ID NO:48), cistationina beta/gama-liase de Listeria monocytogenes (GENBANK® n° de acesso ZP 00234337.1) (SEQ ID NO:49), proteína hipotética de histeria9b monocytogenes lmol680 (GENBANK® n° de acesso NP_465205.1) (SEQ ID NO:50), proteína hipotética de histeria innocua Iinl788 (GENBANK® n° de acesso NP_471124.1) (SEQ ID NO:51), cistationina gama-sintase de Clostridium acetobutylicum (GENBANK® n° de acesso NP_347010.1) (SEQ ID NO:52), cistationina gama-sintase de Symbiobacterium thermophilium (GENBANK® n° de acesso YP_076192.1) (SEQ ID NO:53), O-succinil- homosserina (tiol)-liase de hactoBacillus plantarum (GENBANK® n° de acesso NP_786043.1) (SEQ ID NO:54), proteína da família de enzimas de trans-sulfuração de Staphylococcus epidermis (GENBANK® n° de acesso YP_187637.1) (SEQ ID NO:55), Staphylococeus epidermis ATCC 12228 (GENBANK® n° de acesso NPJ765934.1) (SEQ ID NO:56), cistationina beta-liase/cistationina gama-sintase de Clostridium thermocellum COG00626 (GENBANK® n° de acesso ZP_00313823.1) (SEQ ID NO:57), cistationina beta-liase/cistationina gama-sintase de Moorella thermoacetica COG00626 (GENBANK® n° de acesso ZP_0030849.1) (SEQ ID NO:58), cistationina gama-sintase de Streptococcus thermophilus (GENBANK® n° de acessoYP_140770.1) (SEQ ID NO:59), cistationina gama-sintase de Streptocoeeus pneumoniae (GENBANK® n° de acesso NPJ358970.1) (SEQ ID N0:60), cistationina beta-liase de Geobaeter sulfurredueens (GENBANK® n° de acesso NP_951998.1) (SEQ ID NO:61), cistationina beta-liase/cistationina gama-sintase de Geobaeter metalliredueens COGOOÓ26 (GENBANK® n° de acesso ZP_00298719.1) (SEQ ID NO:62), proteína da família de trans-sulfurização de Streptoeoceus pneumoniae (GENBANK® n° de acesso NP_345975.1) (SEQ ID N0:63), cistationina gama-sintase de Streptococcus anginosus (GENBANK® n° de acesso BAC41490.1) (SEQ ID NO:64), cistationina gama-sintase putativa de Streptaeoeeus mutans (GENBANK® n° de acesso AAN59314.1) (SEQ ID NO:65), cistationina gama-liase de Bacillus liehenformis (GENBANK® n° de acesso AAU24359.1) (SEQ ID NO:66), cistationina gama-sintase de Qb Lactoeoceus laetis (GENBANK® n° de acesso NP_268074.1) (SEQ ID NO:67), enzima dependente de PLP de metabolismo de Cys/Met de Staphylococeus aureus (GENBANK® n° de acesso CAG42106.1) (SEQ ID NO:68), proteína da família de enzimas de trans-sulfurização de Staphylococcus aureus (GENBANK® n° de acesso YP_185322.1) (SEQ ID NO:69), enzima dependente de PLP de metabolismo de Cys/met de Staphyloeoeeus aureus (GENBANK® n° de acesso CAG39379.1) (SEQ ID N0:70), cistationina gama-sintase de Helieobacter hepatieus (GENBANK® n° de acesso AAP76659.1) (SEQ ID NO: 71), cistationina beta- liase/cistationina gama-sintase de Enteroeoceus faeeium C0G0Q626 (GENBANK® n° de acesso ZP_00285445.1) (SEQ ID NO:72), cistationina beta-liase/cistationina gama-sintase de Anabaena variabilis COGO0626 (GENBANK® n° de acesso ZP__00351535.1) (SEQ ID NO:73), cistationina beta-liase/cistationina gama-sintase de Streptococcus suis COGO0626 (GENBANK® n° de acesso ZP_00332320.1) (SEQ ID NO:74), e cistationina gama sintase de Lactococcus lactis (GENBANK® n° de acesso NP_266937.1) (SEQ ID NO:75). O alinhamento foi gerado usando programa ClustalW MSA no Servidor GenomeNet CLUSTALW no Instituto para Pesquisa Química, Universidade de Kyoto. Usou-se os parâmetros a seguir: Alinhamento pareado, Tamanho de K-tuplo (palavra) = 1, Tamanho da janela = 5, Penalidade de intervalo [Gap Penalty] = 3, Número de diagonais de topo = 5, Método de classificação = Percentual; Alinhamento múltiplo, Penalidade de intervalo aberto = 10, Penalidade de extensão de intervalo = 0,0, Transição de peso = Não, Resíduos hidrofílicos = Gly, Pro, Ser, Asn, Asp, Gln, Glu, Arg e Lys, Intervalos hidrofóbicos = sim; e Matriz de classificação = BLOSUM. Descrição detalhada da invenção
A presente invenção baseia-se, pelo menos em parte, na descoberta de que determinadas enzimas/genes de Bacillus genes na biossíntese de metionina não são sujeitas à inibição de feedback de metionina. Estes genes, quando usados em microorganismos heterólogos, acentuam a via biossintética endógena de metionina, proporcionando com isso microorganismos recombinantes capazes de maior produção de metionina.
Existem duas vias alternativas para a adição de átomos de enxofre aos substratos precursores na síntese da metionina em microorganismos (ver Figura 1). E. coli, p. ex., usa uma via de transsulfuração, enquanto que outros microorganismos, como Saccharomyces cerevisiae e Corynebaeterium glutamicum desenvolveram adicionalmente uma via de sulfidrilação direta. Embora muitos microorganismos usem transsulfuração ou sulfidrilação direta, mas não ambas, C. glutamicum emprega ambas as vias para a síntese de metionina.
As vias de transsulfuração e de sulfidrilação direta iniciam, ambas, ou com O-acetil-homosserina ou O-succinil-homosserina, e resultam no intermediário homocisteína, um precursor para metionina. Na via de transsulfuração, cisteína é o doador de enxofre que contribui para a formação de cistationina, uma reação catalisada pela enzima MetB (cistationina-gama- sintase). Cistationina é clivada subseqüentemente a homocisteína e pirivato, em uma reação catalisada por MetC (cistationa-beta-liase). Na via de sulfidrilação direta que emprega O-acetil-homosserina, MetY (O-acetil- homosserina sulfidrilase) catalisa a adição direta de sulfeto a O-acetil- homosserina para formar homocisteína. Produção de homocisteína diretamente de O-succinil-homosserina é realizada de forma similar por MetZ (O-succinil-homosserina sulfidrilase). Em parte do estado da técnica, os termos MetY e MetZ são usados intercambiavelmente, em parte porque MetY é conhecido por ser ativo na O-succinil-homosserina adicionalmente a seu substrato normal, O-acetil-homosserina (Hwang et aL, (2002) J. Bacteriol184:1277-1286).
Diversos experimentos realizados pelos presentes inventores indicaram que a atividade de MetY é uma etapa limitadora de taxa na biossíntese de metionina em cepas de Corynebacterium engenheiradas em favor da via de sulfidrilação direta (com um metB reprimido), por exemplo, os fundos de cepa relacionados M2014 e OM99 (McbR+). Em particular, O- acetil-homosserina, um dos substratos para MetY, acumula-se em níveis relativamente elevados em cepas contendo o plasmídeo replicante H357, que expressa metA (por vezes referido como metX) e metY. Adicionalmente, sabe-se a partir de ensaios com enzimas que MetY é sensível à inibição de feedback por metionina. Uma publicação recente (Auger et ai., 2002 Mierobiology 148: 507-518) caracteriza o gene de BaciUus subtilis, Meti, que codifica uma O-acetil-homosserina sulfidrilase que realiza a mesma função que MetY de C. glutamicum. É interessante observar que a enzima meti também apresenta substancial atividade similar a MetB, cistationina-gama- sintase (ver Tabela 1). Adicionalmente, o genoma de B. subtilis não contém homólogo de MetB diferente de MetI It e, portanto, presume-se que meti realiza as funções de ambos, MetY e MetB, em seu hospedeiro nativo. A hipótese é suportada pelo fato de que meti de B. subtilis complementa um auxotrófico de metB" de E. coli. Na maior parte ou mesmo em todos os outros microorganismos que foram estudados até aqui, a atividade similar a MetY tem feedback inibido pela metionina, enquanto que a atividade de MetB não o é. Assim, pode-se inferir que MetI de Bacillus evoluiu para tornar-se resistente à inibição de metionina para funcionar eficientemente na via similar a MetB.
Tabela 1. Atividades específicas de MetZ, MetB, e Meti.
<table>table see original document page 14</column></row><table>
A presente invenção proporciona microorganismos recombinantes que foram engenheirados geneticamente para expressar uma enzima biossintética heteróloga de metionina.
Adicionalmente, a presente invenção proporciona vetores de expressão recombinantes úteis para inserir seqüências heterólogas de ácido nucleico no óperon carotenóide de, p. ex., Corynebacterium. Estes vetores recombinantes podem compreendem adicionalmente cassetes de integração que objetivam seqüências específicas de ácido nucleico do óperon carotenóide, p. ex., seqüências codificadoras de proteína ou reguladoras de expressão. Adicionalmente, estes vetores e cassetes de integração podem ser usados para modificar o óperon de tal forma que a produção de carotenóides no organismo-alvo resulte em alteração fenotípica, p. ex., alteração de pigmentação do organismo e alteração do(s) carotenóide(s) produzidos. Isto permite a co-produção de um carotenóide desejável juntamente com um aminoácido desejado, como, por exemplo, metionina, lisina, ácido glutâmico, treonina, isoleucina, fenilalanina, tirosina, triptofano, alanina, leucina, cisteína, e análogos.
Para que a presente invenção possa ser mais facilmente compreendida, determinados termos são definidos aqui inicialmente.
A expressão "via biossintética" ou "processo biossintético" é usado aqui significando um processo in vivo ou in vitro com que uma molécula ou composto de interesse é produzido como um resultado de uma das várias reações bioquímicas. De uma maneira geral, iniciando com uma molécula precursora, um processo biossintético prototípico envolve a ação de uma ou várias enzimas funcionando de uma maneira em etapas para produzir uma molécula ou composto de interesse. O produto final constitui-se usualmente de uma molécula contendo carbono. Moléculas ou compostos de interesse compreendem p. ex. moléculas orgânicas pequenas, aminoácidos, peptídeos, cofatores celulares, vitaminas, nucleotídeos, e entidades químicas similares. Moléculas ou compostos de interesse compreendem adicionalmente químicos finos contendo enxofre, como metionina, homocisteína, S- adenosilmetionina, glutationa, cisteína, biotina, tiamina, micotióis, coenzima A, coenzima M, e ácido lipóico. Em determinados casos, uma enzima ou enzimas que funcionam em uma via biossintética podem ser reguladas por meio de produtos químicos gerados no processo. Nesses casos, afirma-se que existe uma alça de feedback, sendo que concentrações crescentes de um produto acabado ou intermediário modificam o nível, funcionamento, ou atividade de enzimas na via. Por exemplo, o produto final de um processo biossintético pode atuar regulando para baixo a atividade de uma enzima no processo biossintético e, com isto, diminuir a taxa em que um produto final desejado é produzido. Situações, como estas são freqüentemente indesejáveis, p. ex., em processos fermentativos em grande escala usados na indústria para a produção de moléculas ou compostos de interesse. Os métodos e materiais da presente invenção são dirigidos, pelo menos em parte, para aperfeiçoar escala industrial, produção fermentativa de compostos de interesse. Um exemplo típico de uma alça de feedback ocorre na produção de metionina descrita abaixo.
O termo "via biossintética de metionina" inclui a via biossintética envolvendo enzimas biossintéticas de metionina (p. ex., polipeptídeos codificados por genes que codificam enzima biossintética), compostos (p. ex., precursores, substratos, intermediários ou produtos), cofatores e análogos usados na formação ou síntese de metionina. O termo "via biossintética de metionina" inclui a via biossintética levando à síntese de metionina em um microorganismo (p. ex., in vivo) e também a via biossintética levando à síntese de metionina in vitro. Figura 1 ilustra uma representação esquemática da via biossintética da metionina. Como delineado na figura 1, síntese de metionina de oxaloacetato (OAA) prossegue via os intermediários, aspartato, aspartato (aspartila) fosfato e aspartato semialdeído. Aspartato semialdeído é convertido a homosserina por meio de homosserina desidrogenase (o produto do gene hom, também conhecido como thrA, metL, hdh, hsd, entre outros nomes em outros organismos). As etapas subseqüentes na síntese da metionina podem prosseguir através da via de transsulfuração e/ou a via de sulfidrilação direta.
O termo "enzima biossintética de metionina" inclui qualquer enzima usada na formação de um composto (p. ex., intermediário ou produto) da via biossintética da metionina. "Enzima biossintética de metionina" inclui enzimas envolvidas em p. ex., a "via de transsulfuração" e na "via de sulfidrilação direta", vias alternativas para a síntese de metionina. Por exemplo, E.coli, usa uma via de transsulfuração, enquanto que outros microorganismos, como Saccharomyces eerevisiae desenvolveram uma via de sulfidrilação direta.
"Enzimas biossintéticas de metionina" compreendem todas as enzimas normalmente encontradas em microorganismos que contribuem para a produção de metionina. Elas incluem enzimas envolvidas em, por exemplo, a via de transsulfuração, sendo que homocisteína é formada de cisteína e O- acetil-homosserina ou cisteína e O-succinil-homosserina. Na via de transsulfuração, homosserina é convertida, ou a O-acetil-homosserina por homosserina acetiltransferase (o produto do gene metX) e a adição de acetila CoA, ou a O-succinil-homosserina por meio da adição de succinila CoA e o produto de um gene metA (homosserina succiniltransferase). Doação de um grupo enxofre de cisteína a, ou O-acetil-homosserina ou O-succinil- homosserina por meio de cistationina-gama-sintase, o produto do gene metB, produz cistationina. Cistationina é então convertida a homocisteína por cistationina beta-liase, o produto do gene metC (também referido como o gene aecD em alguns organismos). Enzimas biossintéticas de metionina também compreendem enzimas na via de sulfidrilação direta, sendo que uma enzima com atividade de O-acetil-homosserina sulfidrilase (p. ex. o gene metY de Corynebaeterium - algumas vezes também referido como o gene metZ) converte O-acetil-homosserina a homocisteína em um processo de uma só etapa usando sulfeto como uma fonte de átomos de enxofre. Homocisteína também pode ser formada na via de sulfidrilação direta por meio da adição direta de sulfeto a O-succinil-homosserina por meio de O-succinil- homosserina sulfidrilase, o produto do gene metZ.
Independentemente da via usada, a via de transsulfuração ou a via de sulfidrilação direta, metionina é subseqüentemente produzida de homocisteína por meio da adição de um grupo metila por meio de metionina sintase dependente de vitamina B12 (o produto do gene metH) ou metionina sintase independente de vitamina B12 (o produto do gene metE).
A presente invenção refere-se, em parte, às enzimas envolvidas na produção de metionina (enzimas biossintéticas de metionina) em bactérias gram positivas como concretizado nos gêneros Bacillus e Corynebacterium. Enzimas biossintéticas exemplares de metionina presentes em microorganismos são proporcionadas na Figura 1. Estas enzimas incluem, p. ex. aspartato quinase, aspartato semialdeído desidrogenase, homosserina desidrogenase, homosserina acetiltransferase (presente, p. ex. em Bacillus subtilis e C. glutamicum), homosserina succiniltransferase (presente, p. ex., em Eseherichia coli), O-acetil-homosserina sulfidrilase, O-succinil- homosserina sulfidrilase, cistationina γ-sintases, cistationina β-liase, metileno tetraidrofolato redutase, metionina sintase dependente de vitamina B12 e metionina sintase independente de cobalamina.
Como descrito aqui, uma enzima "MetI" apresenta: (1) tanto atividade de O-acetil-homosserina sulfidrilase (também conhecido como O- acetil-homosserina sulfidrolase; O-acetil-homosserina tioliase;) e atividade de cistationina-gama-sintase, e opcionalmente também atividade como uma O- succinil-homosserina sulfidrilase (também conhecido como O-succinil- homosserina sulfidrolase; O-succinil-homosserina tioliase) e uma cistationina- gama-sintase; (2) possui pelo menos cerca de 65 % de identidade de seqüências com a seqüência de aminoácidos do metI de Bacillus subtilis apresentada como SEQ ID NO:2 compreendendo uma O-acetil-homosserina sulfidrilase ou uma O-succinil-homosserina sulfidrilase que é substancialmente resistente à inibição por metionina.
O termo "microorganismo manipulado" inclui um microorganismo que foi engenheirado (p. ex., engenheirado geneticamente) ou modificado de tal forma que o microorganismo apresenta pelo menos uma enzima da via biossintética da metionina modificada numa quantidade ou estrutura tal que a produção de metionina é incrementada. Modificação ou manipulação de referidos microorganismos pode ser de acordo com qualquer metodologia aqui descrita incluindo, embora sem limitação, desregulação de uma via biossintética e/ou superexpressão de pelo menos uma enzima biossintética. Uma enzima "engenheirada" (p. ex., uma enzima biossintética "engenheirada") inclui uma enzima, cuja expressão, produção, ou atividade foi alterada ou modificada de tal forma que pelo menos um precursor a jusante ou a montante, substrato ou produto da enzima seja alterado ou modificado (p. ex., uma relação, um nível alterado ou modificado, etc. de precursor, substrato e/ou produto), por exemplo, em comparação com uma enzima naturalmente ocorrente ou de tipo selvagem. Uma enzima "engenheirada" também inclui uma em que a resistência à inibição, p. ex., inibição de feedback, por um ou mais produtos ou intermediários foi incrementada. Por exemplo, uma enzima que é capaz de funcionar enzimaticamente de maneira eficiente na presença de, p. ex., metionina.
Em algumas concretizações, genes compreendidos por esta invenção são derivados de Bacillus. O termo "derivado de BaciUus" ou "derivado-dç-Bacillus" inclui um gene que é encontrado naturalmente em microorganismos do gênero Bacillus. Em algumas concretizações, genes da presente invenção são derivados de um microorganismo selecionado do grupo que consiste de Bacillus subtilis, Bacillus lentimorbus, Bacillus lentus, Bacillus firmus, Bacillus pantothenticus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus cereus, Bacillus circulans, Bacillus coagulans, Bacillus Hcheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus pumilus, Bacillus thuringiensis, Bacillus anthracis, Bacillus halodurans, e outras espécies de Bacillus de Grupo 1, por exemplo, como caracterizado pelo tipo de rRNA 16S. Em outras concretizações adicionais, um gene é derivado de Bacillus brevis ou Bacillus stearothermophilus. Em algumas concretizações, genes da presente invenção são derivados de um microorganismo selecionado do grupo que consiste de Bacillus licheniformis, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus subtilis, e Bacillus pumilus. Em algumas concretizações, o gene é derivado de BaciUus subtilis (p. ex., é derivado de Bacillus subtilis). Os termos "derivado de Bacillus subtilis" e "derivado-de-3acz7/tts subtilis" são usados intercambiavelmente aqui e incluem um gene que é encontrado naturalmente no microorganismo Bacillus subtilis. Inclui-se no escopo da presente invenção genes derivados de Bacillus (p. ex., gemes derivados de B. subtilis), por exemplo, genes meti de Bacillus ou B. subtilis.
O termo "gene," como usado aqui, inclui uma molécula de ácido nucleico (p. ex., uma molécula de DNA ou segmento da mesma) que, em um organismo, pode ser separado de outro gene ou outros genes, por DNA intergênico (i.e., DNA interveniente ou espaçador que flanqueia naturalmente o gene e/ou separa genes no DNA cromossômico do organismo). Alternativamente, um gene pode superpor-se ligeiramente a outro gene (p. ex., a ponta 3' de um primeiro gene que se superpõe à ponta 5' de um segundo gene), os genes superpostos separados de outros genes por DNA intergênico. Um gene pode dirigir a síntese de uma enzima ou outra molécula de proteína (p. ex., pode compreender seqüências codificantes, por exemplo, uma matriz de leitura aberta (ORF, open reading frame) contígua que codifica uma proteína) ou pode ser, ela mesma, funcional no organismo. Um gene em um organismo, pode ser aglomerado em um óperon, como definido aqui, sendo que referido óperon é separado de outros genes e/ou óperons pelo DNA intergênico. Um "gene isolado", como usado aqui, inclui um gene que é substancialmente livre de seqüências que flanqueiam naturalmente o gene no DNA cromossômico do organismo do qual o gene é derivado (i.e., é livre de seqüências codificantes adjacentes que codificam uma segunda proteína ou proteína distinta, seqüências estruturais adjacentes ou análogos) e inclui opcionalmente seqüências reguladoras a 5' e 3', por exemplo, seqüências promotoras e/ou seqüências terminadoras. Em uma concretização, um gene isolado inclui predominantemente seqüências codificantes para uma proteína (p. ex., seqüências que codificam Bacillus proteínas). Em outra concretização, um gene isolado inclui seqüências codificantes para uma proteína (p. ex., para uma proteína de Bacillus) e seqüências reguladoras adjacentes a 5' e/ou 3' do DNA cromossômico do organismo do qual o gene é derivado (p. ex., seqüências reguladoras de Bacillus adjacentes a 5' e/ou 3'). De preferência, um gene isolado contém menos de cerca de 10 kb, 5 kb, 2 kb, 1 kb, 0,5 kb, 0,2 kb, 0,1 kb, 50 bp, 25 bp ou 10 bp de seqüências de nucleotídeos que flanqueiam naturalmente o gene no DNA cromossômico do organismo do qual o gene é derivado.
O termo "óperon" inclui pelo menos dois genes adjacentes ou ORFs, opcionalmente superpondo em seqüência na ponta 5' ou 3' de pelo menos um gene ou ORF. O termo "óperon" inclui uma unidade coordenada de expressão gênica que contém um promotor e possivelmente um elemento regulador associado com um ou mais ORFs ou genes adjacentes (p. ex., genes estruturais que codificam enzimas, por exemplo, enzimas biossintéticas). Expressão dos genes pode ser regulada coordenadamente, por exemplo, por meio de proteínas reguladoras que se ligam ao elemento regulador ou por meio de anti-terminação de transcrição. Os genes de um óperon (p. ex., genes H, estruturais) podem ser transcritos dando um mRNA simples que codifica todas as proteínas.
Vários aspectos da invenção são descritos de maneira mais detalhada nas subseções a seguir.
I. Métodos e microorganismos para a produção incrementada de metionina em Microorganismos heterólogos
C. glutamicum compreende duas vias para a síntese de metionina, a via de sulfidrilação direta e a via de trans-sulforação, (ver Figura 1). As vias usam O-acetil-homosserina e dão homocisteína, um precursor para metionina. Na via de transsulfuração, O-acetil-homosserina é convertida a l
cistationa por MetB na presença de cisteína. Cistationina é subseqüentemente clivada a homocisteína e pirivato, em uma reação catalisada por MetC. Na via de sulfidrilação direta MetY catalisa a adição direta de sulfeto a O-acetil- homosserina para formar homocisteína. Como descrito acima, acredita-se que a atividade de Met Y seja uma etapa limitadora de taxa em microorganismos que usam a via de sulfidrilação direta.Tabela II ilustra diversas enzimas na via biossintética de metionina.
Tabela II: Enzimas na via biossintética de metionina e os genes que as
o
codificam
<table>table see original document page 22</column></row><table> A presente invenção proporciona a modificação de
microorganismos, por exemplo, através do uso de engenharia genética de tal ) modo que os microorganismos modificados sejam capazes de produção incrementada de metionina. Mais especificamente, em algumas concretizações, métodos de engenharia genética envolvem a introdução de um gene heterólogo ou genes que codificam enzimas que funcionam em vias biossintéticas endógenas, de tal forma que a produção de metionina é modificada ou incrementada. De preferência, a enzima é resistente à inibição de feedback de metionina. A expressão "resistente à inibição de feedback de metionina," como usado aqui, refere-se a uma enzima que é capaz de funcionar enzimaticamente com uma significativa atividade na presença de metionina. Uma enzima que é resistente à inibição de feedback de metionina pode funcionar significativamente na presença de, por exemplo, de 1 a 10 μΜ, de 10 a 100 μΜ ou de 100 μΜ a 1 mM de metionina. Em algumas concretizações da presente invenção, uma enzima de interesse é capaz de funcionar a concentrações de 1 a 10 mM, 10 a 100 mM ou concentrações ainda maiores de metionina. A presente invenção particularmente compreende enzima resistente a feedback de metioninas que estão envolvidas nas vias biossintéticas ou processos que resultam na produção de metionina.
A presente invenção proporciona métodos de produzir níveis incrementados de metionina a partir de microorganismos. Como usado aqui, a expressão "nível incrementado de produção de metionina" refere-se a um nível ou quantidade de metionina maior (p. ex. 5 % mais, 10 % mais, 15 % mais, 20 % mais, 30 % mais, 40 % mais, ou mais) do que produzidos por um microorganismo não-modificado ou outro microorganismo de controle vantajoso. Em concretizações exemplares, o nível de produção de metionina é pelo menos 50 %, 60 % ou 70 % maior do que aquele produzido por um microorganismo não-modificado ou outro microorganismo de controle vantajoso. Em outras concretizações adicionais, o nível de produção é pelo menos cerca de 100 % maior (i.e. 2 vezes, 3 vezes, 4 vezes, 5 vezes ou ainda 10 vezes maior, ou acima disto) do que aquele produzido por um microorganismo não-modificado ou outro microorganismo de controle vantajoso. Valores e faixas incluídos em e/ou intermediários apresentados aqui também se destinam a serem compreendidos pela invenção. Em concretizações exemplares, níveis incrementados de produção de metionina também devem compreender quantidades produzidas acima de um nível basal determinado por microorganismos que não foram engenheirados geneticamente para expressar uma enzima biossintética heteróloga resistente a metionina.
Assim, a presente invenção proporciona um método de produzir metionina, compreendendo cultivar um "microorganismo produtor de metionina". Um "microorganismo produtor de metionina" é qualquer microorganismo capaz de produzir metionina, p. ex., bactérias, levedura, fungos, Archaea, etc. Em uma concretização, o microorganismo produtor de metionina pertence ao gênero Corynebacterium ou Brevibacterium. Em outra concretização, o microorganismo produtor de metionina é Corynebacterium glutamicum. Em outra concretização adicional, o microorganismo produtor de metionina é selecionado do grupo que consiste de: Escheriehia coli ou Brevibaeterium relacionadas, Bacillus subtilis ou Bacillus relacionados, Saceharomyces eerevisiae ou cepas de levedura relacionadas.
A presente invenção baseia-se, pelo menos em parte, na
descoberta de que determinadas cepas de C. glutamicum podem ser engenheiradas geneticamente de forma a expressar enzimas que são resistentes à inibição de feedback de metionina, contornando e/ou adicionando à metionina endógena enzimas sensíveis a feedback, p. ex., o produto do gene metY e/ou metZ. Os genes heterólogos introduzidos em microorganismos incluem, por exemplo, Meti, uma enzima apresentando atividade de O-acetil homosserina sulfidrilase atividade e cistationa-gama sintase in vitro, ou apresentando atividade de O-succinil homosserina sulfidrilase e atividade de cistationa -gama sintase, sendo que a atividade de O-acetil homosserina sulfidrilase ou O-succinil homosserina sulfidrilase é resistente à inibição de feedback de metionina.
II. Microorganismos recombinantes
A presente invenção proporciona microorganismos para uso na
produção de químicos finos. Em uma concretização, um microorganismo da
presente invenção é um organismo Gram positivo (p. ex., um microorganismo
que conserva corante básico, por exemplo, violeta cristal, devido à presença
de uma parede Gram-positiva envolvendo o microorganismo). Em algumas
concretizações, o microorganismo é um microorganismo pertencente ao
gênero selecionado do grupo que consiste de BaeiUus, Brevibaeterium, Cornyebacterium, LactoBacillus, Lactocoeei e Streptomyees. Em outras concretizações adicionais, o microorganismo é do gênero Corynebaeterium. Adicionalmente, em algumas concretizações, o microorganismo é selecionado do grupo que consiste de Corynebaeterium glutamieum, Corynebaeterium effieiens, Corynebacterium Iiliumt Corynebaeterium diphtheriae, Corynebaeterium pseudotubereulosis e Corynebaeterium pyogenes.
Aspectos exemplares da invenção proporcionam microorganismos recombinantes, em particular, microorganismos recombinantes incluindo vetores ou genes (p. ex., genes mutados e/ou de tipo φ) selvagem) como descrito aqui. Como usado aqui, o termo "microorganismo recombinante" inclui um microorganismo (p. ex., bactérias, células de levedura, células fungicas, etc.) que foi alterado, modificado ou engenheirado geneticamente (p. ex., engenheirado geneticamente) de tal forma a apresentar um fenótipo e/ou genótipo alterado, modificado ou diferente (p. ex., quando a modificação genética afeta codificação de seqüências de ácido nucleico do microorganismo) em comparação com o microorganismo naturalmente ocorrente de que se derivou. As alterações genéticas aqui descritas podem ser realizadas, por exemplo, por meio manipulação de seqüências de DNA in vitro ou por meio de métodos genéticos clássicos de acasalamento, transdução,
transformação, etc.
Em algumas concretizações, o microorganismo é um Gram negativo organismo (exclui corante básico). Em outras concretizações, o microorganismo é um microorganismo pertencente ao gênero selecionado do grupo que consiste de Salmonella, Eseheriehia, Klebsiella, Serratia, e Proteus. Em outras concretizações adicionais, o microorganismo pertence ao gênero Eseheriehia, por exemplo, Eseheriehia eoli. Em algumas concretizações, o microorganismo pertence ao gênero Saccharomyces (p. ex., S. cerevisiae).
Em determinadas concretizações, um microorganismo recombinante é modificado ou engenheirado de tal forma que pelo menos uma enzima não nativa biossintética de metionina é expressa ou superexpressa. Os termos "superexpresso" e "superexpressão" incluem expressão de um produto gênico (p. ex., uma enzima biossintética) constitutivamente ou em um nível maior do que aquele expresso antes da modificação ou manipulação do microorganismo ou em um microorganismo comparável que ainda não foi engenheirado. Em algumas concretizações, o microorganismo pode ser projetado ou engenheirado geneticamente para superexpressar um nível de produto gênico maior do que aquele expresso em φ) um microorganismo comparável que não foi engenheirado.
Em algumas concretizações, um microorganismo pode ser engenheirado fisicamente ou ambientalmente para superexpressar um nível de produto gênico maior do que aquele expresso antes da manipulação do microorganismo ou em um microorganismo comparável que não foi engenheirado. Por exemplo, um microorganismo pode ser tratado com ou cultivado na presença de um agente conhecido ou suspeito de incrementar a transcrição de um gene particular e/ou a tradução de um produto gênico particular de tal forma que a transcrição e/ou a tradução sejam acentuadas ou incrementadas. Alternativamente, um microorganismo pode ser cultivado a uma temperatura selecionada de forma a incrementar a transcriçao de um gene particular e/ou a tradução de um produto gênico particular de tal forma que a transcrição e/ou a tradução sejam acentuadas ou incrementadas.
Engenharia genética pode incluir, embora sem limitação, alteração ou modificação de seqüências reguladoras ou sítios associados com expressão de um gene particular (p. ex., por meio de adição de promotores fortes, promotores constitutivos, promotores induzíveis ou promotores múltiplos ou por meio de remoção de seqüências reguladoras de tal forma que a expressão seja constitutiva), modificação da localização cromossômica de um gene particular, alteração de seqüências de ácido nucleico adjacentes a um gene particular, como um sítio de ligação de ribossoma, incremento do número de cópias de um gene particular, modificação de proteínas (p. ex., proteínas reguladoras, supressores, acentuadores, ativadores transcricionais e análogos) envolvidos na transcrição de um gene particular e/ou na tradução de um produto gênico particular, ou quaisquer outros meios convencionais de desregular a expressão de um gene particular que são rotineiros na técnica (incluindo embora sem limitação, o uso de moléculas de ácido nucleico anti- sentido, por exemplo, para bloquear a expressão de repressor ou proteínas biossintéticas e/ou o uso de alelos mutadores, p. ex., alelos bacterianos que acentuam a variabilidade genética e aceleram, por exemplo, mutação adaptativa). Engenharia genética também pode incluir deleção de um gene, por exemplo, para bloquear uma via ou remover um repressor.
Em determinadas concretizações, um microorganismo da invenção é um microorganismo "Campbell in" ou "Campbell out" (ou célula ou transformante). Como usado aqui, a expressão transformante "Campbell in" deve significar um transformante de uma célula hospedeira original em que uma molécula de DNA inteira de filamento duplo e circular (por exemplo, um plasmídeo) integrou-se no cromossomo da célula por meio de um evento de recombinação homóloga (um cruzamento em evento), e que resulta efetivamente na inserção de uma versão linearizada da molécula de DNA circular em uma primeira seqüência de DNA do cromossomo que é homóloga a uma primeira seqüência de DNA da molécula de DNA circular. A expressão "Campbelled in" refere-se à seqüência de DNA linearizada que foi integrada no cromossomo do transformante "Campbell in". Um transformante "Campbell in" contém uma duplicação da primeira seqüência de DNA homóloga, que inclui e envolve o ponto de crossover de recombinante homólogo.
"Campbell out" refere-se à célula descendente de um transformante "Campbell in", em que um segundo evento de recombinação homóloga (um evento de cross-out) ocorreu entre uma segunda seqüência de DNA que está contida no DNA inserido linearizado do DNA "Campbelled in" e uma segunda seqüência de DNA de origem cromossômica, que é homóloga à segunda seqüência de DNA do inserto linearizado, o segundo evento de recombinação resultando na deleção (descarte) de uma porção da seqüência de DNA integrada, porém, é importante realçar, também resultando em uma porção (isto pode ser tão pouco quanto uma base simples) da seqüência de DNA integrada remanescente no cromossomo, de tal forma que, em comparação com a célula hospedeira original, a célula "Campbell out" contém uma ou mais alterações intencionais no cromossomo (por exemplo, uma substituição de base simples, substituições de bases múltiplas, inserção de um gene heterólogo ou seqüência de DNA heteróloga, inserção de uma cópia ou cópias adicionais de um gene homólogo ou um gene homólogo modificado, ou inserção de uma seqüência de DNA compreendendo mais do que um destes exemplos previamente indicados listados acima).
Uma célula ou cepa "Campbell out" é obtida usualmente, mas não necessariamente, por meio de uma contra-seleção contra um gene que se encontra contido em uma porção (a porção que se deseja descartar) da seqüência de DNA "Campbelled in", por exemplo, o gene sacB do Bacillus subtilis, que é letal quando expresso em uma célula que é desenvolvida na presença de cerca de 5 % a 10 % de sacarose. Seja com ou sem uma contra- seleção, uma desejada célula "Campbell out" pode ser obtida ou identificada por meio de seleção quanto à célula desejada, usando-se um fenótipo selecionável, como, embora sem limitação, morfologia da colônia, cor da colônia, presença ou ausência de resistência a antibióticos, presença ou ausência de uma dada seqüência de DNA por meio de reação em cadeia de polimerase, presença ou ausência de uma auxotrofia, presença ou ausência de uma enzima, hibridização de ácido nucleico de colônia, e assim por diante.
Os eventos de recombinação homóloga que levam a um "Campbell in" ou "Campbell out" podem ocorrer numa faixa de bases de DNA dentro da seqüência de DNA homóloga, e como as seqüências homólogas serão idênticas entre si em pelo menos parte desta faixa, usualmente não é possível especificar exatamente onde ocorreu o evento de cross-over. Em outras palavras, não é possível especificar precisamente qual seqüência foi originalmente do DNA inserido, e qual foi originalmente do DNA cromossômico. Além disso, a primeira seqüência de DNA homóloga e segunda seqüência de DNA homóloga são separadas usualmente por uma região de não-homologia parcial, e é esta região de não-homologia que permanece depositada no cromossomo da célula "Campbell out".
Visando a praticidade, em C. glutamicum, primeira e segunda seqüências de DNA homóloga têm comprimentos de pelo menos cerca de 200 pares de bases, e podem apresentar comprimentos de até vários milhares de pares de bases, no entanto, o procedimento pode ser operado com seqüências mais curtas ou mais longas. Um comprimento preferido para a primeira e segunda seqüências homólogas é de cerca de 500 a 2000 bases, e a obtenção de um "Campbell out" de um "Campbell in" é facilitado dispondo-se a primeira e segunda seqüências homólogas a um comprimento aproximadamente idêntico, de preferência, com uma diferença inferior a 200 pares de bases e, da forma mais preferível, sendo que a mais curta das duas é de pelo menos 70 % do comprimento da mais longa em pares de bases.
III. O gene MetI e seus homólogos
Em Bacillus subtilis, os genes meti e metC encontram-se
localizados no óperon metIC recentemente elucidado (Auger et ai,(2002)
Microbiology 148:507-518). Anteriormente, o gene meti de B. subtilis foi
denominado yjcl e metC denominado yjcJ. A transcrição do óperon metIC
em B. subtilis é regulado pela fonte de enxofre. Quando cisteína ou sulfato é a
única fonte de enxofre a transcrição é elevada, enquanto que quando a única
fonte de enxofre é metionina, sua transcrição é baixa. Mediante comparação de homologia das seqüências de proteína, as enzimas meti e MetC pertencem à família de proteínas de cistationina gama sintase que inclui cistationina gama-sintase, cistationina beta-liase, cistationina gama-liase e O-acetil-homosserina sulfidrilase. A família é diferenciada pela unidade repetitiva de aminoácidos [DQ]- [LIVMF]-X3-[STAGC]-[STAGCI]-T-K-[FYWQ]-[LIVMF]-X-G-[HQ]- [SGNH] (SEQ ID NO: 76) que compreende um radical lisina que é crítico para a ligação do cofator comum fosfato de piridoxal. A enzima MetC apresenta cistationina beta-liase, enquanto que, meti apresenta ambos, atividade de O-acetil-homosserina sulfidrilase e cistationina gama sintase ou atividade de O-succinil-homosserina sulfidrilase e cistationina gama sintase.
A presente invenção refere-se a enzimas apresentando uma atividade de O-acetil-homosserina sulfidrilase e/ou atividade de O-succinil- homosserina sulfidrilase. A presente invenção também se refere a enzimas que apresentam atividade de cistationa gama sintetase. Em determinadas concretizações, a invenção compreende enzimas que apresentam ambas as atividades, de O-acetil-homosserina sulfidrilase e de cistationa gama sintetase. Em outras concretizações, a presente invenção compreende enzimas que apresentam atividade de O-succinil homosserina sulfidrilase. Em outras concretizações adicionais, a presente invenção compreende ambas, atividade de O-succinil homosserina sulfidrilase e de cistationa gama sintetase.
A presente invenção compreende enzimas apresentando homologia funcional e estrutural com a enzima meti de B. subtilis. Por "homologia funcional" compreende-se, p. ex., que a enzima homóloga apresenta a capacidade de atuar de uma maneira enzimática que é substancialmente similar à enzima meti, i.e como um mediador resistente a metionina da sulfidrilação bioquímica de O-acetil-homosserina para produzir homocisteína ou como um mediador resistente à metionina da sulfidrilação bioquímica de O-succinil-homosserina para produzir homocisteína. No sentido usado aqui os termos "homologia" e "homólogo" não se limitam a designar proteínas apresentando um ancestral genético teórico comum, mas inclui proteínas que podem ser geneticamente não relacionadas que, no entanto, evoluíram para realizar funções similares e/ou apresentam estruturas similares. Homologia funcional com a enzima meti de B. subtilis também compreende enzimas que apresentam a característica de atuarem como uma cistationa gama sintetase, sendo que a cistationina é produzida de cisteína e O-succinil-homosserina ou sendo que a cistationina é produzida de cisteína e O-acetil-homosserina. Para que proteínas apresentem homologia funcional, φ) não é necessário que apresentem identidade significativa em suas seqüências de aminoácidos, mas, ao invés, proteínas apresentando homologia funcional são definidas assim por apresentarem atividades similares ou idênticas, p. ex., atividades enzimáticas. De forma similar, proteínas com homologia estrutural são definidas como apresentando estrutura primária (seqüência) ou estrutura análoga secundária, terciária (ou quaternária), mas não requerem necessariamente identidade de ácido nucleico ou aminoácidos. Em determinados casos, homólogos estruturais podem incluir proteínas ou conservar homologia estrutural apenas no sítio ativo ou substrato sítio de ligação da proteína.
C^) Adicionalmente à homologia estrutural e funcional, a presente
invenção compreende adicionalmente proteínas apresentando identidade pelo menos parcial de ácido nucleico ou de aminoácidos com a enzima meti de B. subtilis. Para determinar o percentual de identidade parcial de duas seqüências de aminoácidos ou de dois ácidos nucleicos, as seqüências são alinhadas para fins de comparação ótima (p. ex., é possível introduzir intervalos na seqüência de uma proteína ou ácido nucleico para alinhamento ótimo com a outra proteína ou ácido nucleico). Os radicais de aminoácidos ou nucleotídeos nas posições de aminoácidos correspondentes ou posições de nucleotídeos correspondentes são então comparados. Quando uma posição em uma seqüência é ocupada pelo mesmo radical de aminoácido ou nucleotídeo como a posição correspondente no outro, então as moléculas são idênticas naquela posição. O percentual de identidade entre as duas seqüências é uma função do número de posições idênticas compartilhadas pelas seqüências (i.e., % de identidade y = n° de posições idênticas/n° total de posições multiplicado por 100). Percentual de identidade também podem ser determinados por meio de alinhamento de duas seqüências de nucleotídeos usando o programa de ferramentas básicas de pesquisa de alinhamento local (BLASTs basic local alignment search tools).
Assim, um aspecto da invenção refere-se a moléculas de ácido nucleico isoladas (p. ex., cDNAs, DNAs, ou RNAs) compreendendo uma seqüência de nucleotídeos codificando uma proteína (ou porções biologicamente ativas dos mesmos) idêntica à enzima meti de B. subtilis. Em algumas concretizações, a molécula de ácido nucleico isolada da invenção compreende uma seqüência de nucleotídeos que hibridiza com ou é pelo menos cerca de 50 %, de preferência, pelo menos cerca de 60 %, mais preferivelmente pelo menos cerca de 70 %, 80 % ou 90 %, e, ainda mais preferivelmente, pelo menos cerca de 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % ou mais idêntica à seqüência de nucleotídeos de meti de B. subtilis como apresentado na SEQID NO: 1, ou uma porção da mesma.
Em algumas concretizações, a molécula de ácido nucleico isolada codifica uma proteína ou porção da mesma, sendo que a proteína ou porção da mesma inclui uma seqüência de aminoácidos que é suficientemente similar ou idêntica à seqüência de aminoácidos de meti de B. subtilis de tal forma que a proteína ou porção da mesma apresenta a atividade de uma O- acetil-homosserina sulfidrilase e cistationina gama sintase ou O-succinil- homosserina sulfidrilase e cistationina gama sintase. De preferência, a proteína ou porção da mesma codificada pela molécula de ácido nucleico é resistente ou apresenta sensibilidade reduzida à inibição de feedback de metionina. Em uma concretização, a proteína codificada pela molécula de ácido nucleico é pelo menos cerca de 50 %, de preferência, pelo menos cerca de 60 %, e mais preferivelmente pelo menos cerca de 70 %, 80 %, ou 90 % e, da forma mais preferível, pelo menos cerca de 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, ou 99 % ou mais idêntica à seqüência de aminoácidos de meti de B. subtilis como apresentado na SEQ TD NO: 2, ou uma porção da mesma.
A presente invenção também compreende técnicas bem conhecidas na técnica úteis para a engenharia genética das proteínas aqui descritas para produzir enzimas com características aperfeiçoadas ou modificadas. Por exemplo, encontra-se bem dentro dos ensinamentos disponíveis na técnica como modificar uma proteína de tal forma que a proteína apresente afinidade de ligação incrementada ou diminuída com o substrato. Também pode ser vantajoso, e dentro dos ensinamentos da técnica, projetar uma proteína que apresenta taxas enzimáticas incrementadas ou diminuídas. Particularmente no caso de enzimas multifuncionais, pode ser útil realizar ajuste fino de maneira diferencial das várias atividades de uma proteína para desempenhar optimamente em circunstâncias especificadas. Adicionalmente, a capacidade de modular a sensibilidade de uma enzima à inibição de feedback (p. ex. por metionina) pode ser realizada por meio de alteração seletiva de aminoácidos envolvidos na coordenação de metionina ou outros cofatores que podem estar envolvidos em feedback negativo ou positivo. Adicionalmente, engenharia genética compreende eventos associados com a regulação de expressão nos níveis tanto de transcrição como de tradução. Por exemplo, quando um óperon completo ou parcial é usado para clonagem e expressão, seqüências reguladoras p. ex. seqüências promotoras ou acentuadoras do gene podem ser modificadas de tal forma que eles proporcionem níveis desejados de transcrição. Demonstrou-se também que BaciUus contém seqüências reguladoras transcricionais, p. ex., caixas [boxes] S, que são sensíveis a produtos da via biossintética da metionina (p. ex., S-adenosila metionina) que se encontram a jusante. De forma similar, estas unidades repetitivas de ácido nucleico podem ser modificadas para proporciona níveis desejados de enzima, p. ex., expressão de metI.
IV. Moléculas de ácido nucleico recombinantes e vetores
A presente invenção proporciona adicionalmente moléculas de ácido nucleico recombinantes (p. ex., moléculas de DNA recombinantes) que incluem genes aqui descritos (p. ex., genes isolados), de preferência, genes de BaciUus, mais preferivelmente genes de Bacillus subtilis, ainda mais preferivelmente, genes biossintéticos meti de Bacillus subtilisomnâ. O termo "molécula de ácido nucleico recombinante" inclui uma molécula de ácido nucleico (p. ex., uma molécula de DNA) que foi alterada, modificada ou engenheirada de tal forma que difere, com relação à seqüência de nucleotídeos da molécula de ácido nucleico nativa ou natural de que a molécula de ácido nucleico se derivou (p. ex., por meio de adição, deleção ou substituição de um ou mais nucleotídeos). De preferência, a molécula de ácido nucleico recombinante (p. ex., uma molécula de DNA recombinante) inclui um gene isolado da presente invenção ligado operacionalmente a seqüências reguladoras. A expressão "ligado operacionalmente a seqüência(s) reguladora(s)" significa que pelo menos uma porção (usualmente da região codificante de proteína mais ou menos vários pares de bases, p. ex., 2, 3, 4 ou mais pares de bases) da seqüência de nucleotídeos do gene de interesse é ligada à(s) seqüência(s) reguladora(s) de uma maneira que permite a expressão (p. ex., expressão acentuada, incrementada, constitutiva, basal, atenuada, diminuída ou reprimida) do gene, de preferência, expressão de um produto gênico codificado pelo gene (p. ex., quando a molécula de ácido nucleico recombinante é incluída em um vetor recombinante, como definido aqui, e é introduzida em um microorganismo). O termo "ácido nucleico heterólogo" é usado aqui para referir a seqüências de ácido nucleico que não estão presentes tipicamente em um organismo-alvo. Elas também podem compreender seqüências de ácido nucleico já presentes em uma cepa de tipo selvagem de um organismo-alvo, mas não encontrada normalmente em uma região genética particular de um organismo-alvo de interesse. De forma similar, o termo "gene heterólogo" refere-se a um gene ou uma disposição de um gene não presente em uma cepa de tipo selvagem de um organismo-alvo. Ácidos nucleicos heterólogos e genes heterólogos compreendem geralmente moléculas de ácido nucleico recombinantes. O ácido nucleico heterólogo ou gene heterólogo pode ou não compreender modificações (p. ex., por meio de adição, deleção ou substituição de um ou mais nucleotídeos).
O termo "seqüência reguladora" inclui seqüências de ácido nucleico que afetam (p. ex., modulam ou regulam) expressão de outras seqüências de ácido nucleico (i.e., genes). Em uma concretização, uma seqüência reguladora é incluída em uma molécula de ácido nucleico recombinante em uma orientação e/ou posição similar ou idêntica relativa a um gene de interesse particular como é observado para a seqüência reguladora e gene de interesse como ocorre na natureza, p. ex., em uma orientação e/ou posição nativa. Por exemplo, um gene de interesse pode ser incluído em uma molécula de ácido nucleico recombinante ligada operacionalmente a uma seqüência reguladora que acompanha ou é adjacente ao gene de interesse no organismo natural (p. ex., ligada operacionalmente a seqüências reguladoras "nativas" (p. ex., ao promotor "nativo"). Alternativamente, um gene de interesse pode ser incluído em uma molécula de ácido nucleico recombinante ligada operacionalmente a uma seqüência reguladora que acompanha ou que é adjacente a outro gene (p. ex., um diferente) do organismo natural. Alternativamente, um gene de interesse pode ser incluído em uma molécula de ácido nucleico recombinante ligada operacionalmente a uma seqüência reguladora de um organismo diferente, relacionado potencialmente de maneira meramente distante. Por exemplo, seqüências reguladoras de outros micróbios (p. ex. seqüências reguladoras bacterianas de outras espécies, seqüências reguladoras de bacteriófagos e análogos) pode ser ligadas operacionalmente a um gene de interesse particular.
Em algumas concretizações, uma seqüência reguladora é uma seqüência reguladora que é uma seqüência não-nativa ou não-naturalmente ocorrente (p. ex., uma seqüência que foi modificada, mutada, substituída, derivada, ou deletada, incluindo seqüências que são sintetizadas quimicamente). Seqüências reguladoras exemplares incluem promotores, acentuadores, sinais de terminação, sinais de anti-terminação e outros elementos de controle de expressão (p. ex., seqüências a que RNA polimerase, repressores ou indutores se ligam e/ou sítios de ligação para proteínas reguladoras transcricionais e/ou de tradução, incluindo por exemplo, seqüências no mRNA transcrito). Referidas seqüências reguladoras são bem conhecidas na técnica, e encontram-se descritas, por exemplo, em Sambrook, J., Fritsh, E. F., e Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2a ed., Cold Spring de Harbor Laboratory, Cold Spring de Harbor Laboratory Press, Cold Spring de Harbor, NY, 1989. Seqüências reguladoras incluem aquelas que dirigem a expressão constitutiva de uma seqüência de nucleotídeos em a microorganismo (p. ex., promotores constitutivos e O) promotores constitutivos fortes), aquelas que dirigem expressão induzível de uma seqüência de nucleotídeos em a microorganismo (p. ex., promotores induzíveis, por exemplo, promotores induzíveis de xilose) e aquelas que atenuam ou reprimem a expressão de uma seqüência de nucleotídeos em a microorganismo (p. ex., sinais de atenuação ou seqüências repressoras). Também se compreende no escopo da presente invenção como regular expressão de um gene de interesse por meio de remoção ou deleção de seqüências reguladoras. Por exemplo, seqüências envolvidas na regulação negativa de transcrição podem ser removidas de tal forma que a expressão de um gene de interesse seja acentuada. Em algumas concretizações, uma molécula de ácido nucleico recombinante da presente invenção inclui um gene ou seqüência de ácido nucleico que codifica pelo menos um produto gênico bacteriano (p. ex., uma enzima biossintética de metionina) ligada operacionalmente a um promotor ou seqüência promotora. Promotores exemplares da presente invenção incluem promotores de Corynebacterium e/ou promotores de bacteriófagos (p. ex., bacteriófagos que infectam Corynebacterium). Em uma concretização, um promotor é um promotor de Corynebacterium, de preferência, um promotor forte de Corynebacterium (p. ex., um promotor associado com um gene de manutenção bioquímico, p. ex., um gene de manutenção expresso de maneira relativamente elevada em Corynebacterium). Em outra concretização, um promotor é um promotor de bacteriófago. Em algumas concretizações, o promotor é do bacteriófago de B. subtilis SPOl ou o bacteriófago λ de E. coli. Em algumas concretizações, um promotor é selecionado dentre um promotor Pi5 ou P49? apresentando, por exemplo, as seguintes seqüências respectivas: (SEQ ID NO:3), e (SEQ ID NO:4). Promotores adicionais incluem o promotor tef (o fator de alongamento de tradução (TEF), o promotor sod (peróxido dismutase), e promotor pyc (o promotor de pirivato carboxilase (PYC)), que promovem expressão de alto n nível em Corynebacterium (p. ex., Corynebacterium glutamicum). Exemplos adicionais de promotores, por exemplo, para uso em microorganismos Gram positivos incluem, embora sem limitação, promotores amy e SP01. Adicionalmente, para uso em microorganismos tanto Gram negativos como também Gram positivos, é possível usar promotores incluindo, embora sem limitação to, cos, tac, trp, tet, trp-tet, lpp, lac, lpp-lac, lacIQ, T7, T5, T3, gal, trc, ara, SP6, λ-PR ou λ-PL.
Em outra concretização, uma molécula de ácido nucleico recombinante da presente invenção inclui uma seqüência terminadora ou seqüências terminadoras (p. ex., seqüências terminadoras de transcrição). O termo "seqüências terminadoras" inclui seqüências reguladoras que servem para terminar transcrição de mRNA. Seqüências terminadoras (ou seqüências terminadoras em tandem) podem servir adicionalmente para estabilizar mRNA (p. ex., por meio de adição de estrutura ao mRNA), por exemplo, contra nucleases.
Em outra concretização adicional, uma molécula de ácido nucleico recombinante da presente invenção inclui seqüências que permitem detecção do vetor contendo referidas seqüências (i.e., marcadores detectáveis e/ou selecionáveis), por exemplo, genes que codificam seqüências de resistência a antibióticos ou que superam mutações auxotróficas, por exemplo, trpC, marcadores de drogas, marcadores fluorescentes, e/ou marcadores colorimétricos (p. ex., lacZ/β- galactosidase).
Em outra concretização adicional, uma molécula de ácido nucleico recombinante da presente invenção inclui um sítio de ligação de ribossoma (RBS) nativo (encontrado associado com o gene de tipo selvagem) ou um artificial ou híbrido ou composto ou uma seqüência que é transcrita em um RBS artificial. O termo "sítio de ligação de ribossoma (RBS) artificial" inclui um sítio em uma molécula de mRNA (p. ex., codificado no DNA) a que um ribossoma se liga (p. ex., para iniciar a tradução) que difere de um RBS Qf) nativo (p. ex., um RBS encontrado em um gene naturalmente ocorrente) em pelo menos um nucleotídeo. Em algumas concretizações, RBSs artificiais incluem cerca de 5 a 6, de 7 a 8, de 9 a 10, de 11 a 12, de 13 a 14, de 15 a 16, de 17 a 18, de 19 a 20, de 21 a 22, de 23 a 24, de 25 a 26, de 27 a 28, de 29 a 30 ou mais nucleotídeos dos quais cerca de 1 a 2, de 3 a 4, de 5 a 6, de 7 a 8, de 9 a 10, de 11 a 12, de 13 a 15 ou mais diferem do RBS nativo. Em algumas concretizações, RBS seqüências incluem RBSI, (SEQ ID NO: 5 tctagaAGGAGGAGAAAACatg) e RBS 1284 (SEQ ID NO: 6: tctagaCC AGGAGGACATACAgtg) como descrito e usado nos vetores da presente invenção, (ver Tabela III). Tabela III. Plasmídeos projetados para expressar meti de B. subtilis integrado em crtEb em C. slutamicum.
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A presente invenção proporciona adicionalmente vetores (p. ex., vetores recombinantes) que incluem moléculas de ácido nucleico (p. ex., genes heterólogos, seqüências de ácido nucleico heterólogas ou moléculas de ácido nucleico recombinantes compreendendo referidos genes) como descrito aqui. O termo "vetor recombinante" inclui um vetor (p. ex., plasmídeo, fago, fagomídeo, vírus, cosmídeo ou outro vetor de ácido nucleico purificado) que foi alterado, modificado ou engenheirados de tal forma que contém mais, menos ou diferentes seqüências de ácido nucleico do que aquelas na molécula de ácido nucleico nativa ou natural de que o vetor recombinante se derivou. Em algumas concretizações, o vetor recombinante inclui um gene codificando enzima biossintética ou molécula de ácido nucleico recombinante incluindo referido gene, ligada operacionalmente a seqüências reguladoras, por exemplo, seqüências promotoras, seqüências terminadoras e/ou sítios de ligação de ribossomas (RBSs) artificiais, como definido aqui. Em outra concretização, um vetor recombinante da presente invenção inclui seqüências que acentuam a replicação em bactérias (p. ex., seqüências de origem de replicação). Em uma concretização, seqüências acentuadoras de replicação funcionam em E. coli. Em outra concretização, seqüências acentuadoras de replicação são derivadas de pBR322.
Em outra concretização adicional, um vetor recombinante da presente invenção inclui seqüências de resistência a antibióticos. O termo "seqüências de resistência a antibióticos" inclui seqüências que promovem ou conferem resistência a antibióticos no organismo hospedeiro (p. ex., Corynebacterium). Em uma concretização, as seqüências de resistência a antibióticos são selecionadas do grupo que consiste de seqüências cat (resistência ao cloranfenicol), seqüências tet (resistência à tetraciclina), seqüências erm (resistência à eritromicina), seqüências neo (resistência à neomicina), seqüências kan (resistência à canamicina), amp (seqüências de β- lactama de resistência a antibióticos), e seqüências spec (resistência à espectinomicina). Vetores recombinantes da presente invenção podem incluir adicionalmente seqüências de recombinação homólogas (p. ex., seqüências projetadas para permitir recombinação do gene de interesse no cromossomo do organismo hospedeiro). Por exemplo, seqüências bioAD, bioB, ou crtEb podem ser usadas como alvo de homologia para recombinação no cromossomo do hospedeiro. Alguém com prática na técnica perceberá adicionalmente que o projeto de um vetor pode ser adaptado dependendo de fatores tais como a escolha do microorganismo a ser engenheirado geneticamente, o nível de expressão de produto gênico desejado e análogos. V. Biossíntese de carotenóides e o óperon carotenóide
Carotenóides são o nome geral para um grupo de hidrocarbonetos alifáticos solúveis em gordura que também podem conter um ou mais átomos de oxigênio, consistindo de uma espinha dorsal de poliisopreno modificada que pode atuar causando pigmentação. Eles provém das vias biossintéticas isoprenóides gerais e são sintetizados por plantas, algas, alguns fungos e bactérias. Presentemente, sabe-se que mais de 600 carotenóides ocorrem naturalmente. Carotenóides realizam diversas funções além de proporcionar coloração característica. Carotenóides podem proporcionar proteção antioxidativa, por exemplo, proteção contra os efeitos de radicais e oxigênio singleto. Durante a fotossíntese, carotenóides podem transferir energia radiante absorvida para moléculas de clorofila numa função coletadora de luz, dissipar energia em excesso via ciclo de xantófilos em plantas superiores e determinadas algas, e extinguir clorofilas em estado excitado diretamente. Carotenóides também poderiam proporcionar proteção contra radiação nociva, como luz ultravioleta. Recentemente, o papel estrutural de carotenóides como a cola molecular de determinados complexos de proteína-pigmento fotossintéticos tornou-se evidente, β-caroteno e compostos relacionados estruturalmente servem como o precursor para a Vitamina A, retina, e ácido retinóico em mamíferos, desempenhando com isso papéis essenciais na nutrição, visão, e diferenciação celular, respectivamente. (Krubasik, P. et ah (2001) Eur. J. Biochem. 268:3702-3708; Armstrong G.A., (1994) J. Bacteriol 176:4795-4802)
Muitos carotenóides contêm uma espinha dorsal de hidrocarboneto linear com C40 que inclui várias duplas ligações conjugadas, usualmente entre de 3 a 15. Em determinadas bactérias, no entanto, carotenóides com C45 e C50 também são produzidos. Decaprenoxantina produzida em C. glutamicum é um exemplo de um carotenóide com C50 (Krubasik, ibid). O número e a disposição de duplas ligações amplamente presentes determinam as propriedades espectrais de um dado carotenóide, que absorve tipicamente luz entre 400 e 500 nm. A primeira etapa única para o ramo carotenóide da biossíntese de isoprenóides é a condensação de cauda-a- cauda de duas moléculas do intermediário pirofosfato de geranilgeranila com C20 (GGPP) para formar fitoeno (ver Figura 6). Este hidrocarboneto acíclico é o primeiro carotenóide com C40 e é comum a todos os organismos carotegênicos com C40. Dependendo do organismo, o fitoeno é então convertido a neurosporeno ou licopeno. Após este intermediário, vias biossintéticas em organismos carotegênicos divergem, dando a variedade de carotenóides presentes na natureza. (Armstgrong, G. A. et al{1996) FASEB J. 10, 228-237).
A síntese de carotenóides é obtida através da ação progressiva de várias enzimas que funcionam de uma maneira coordenada dando intermediário e moléculas finais. Por exemplo, em C. glutamicum, cinco enzimas funcionam para produzir o carotenóide decaprenoxantina (ver Figura 6). O óperon carotenóide é um candidato atraente para técnicas de engenharia genética por diversas razões. A produção de carotenóides é industrialmente significativa porque a utilidade de moléculas, como luteína, astaxantina, licopeno e beta caroteno, etc. é de há muito conhecida e há potencial crescente para as moléculas como aditivos ou suplementos nutricionais. Por exemplo, o uso de licopeno como um antioxidante e agente anticâncer tem sido o objeto de pesquisa recente. O óperon pode ser facilmente engenheirado para produzir carotenóides de vários estruturas baseadas em proporcionar e/ou regular a produção de enzimas responsáveis pelas etapas na via biossintética dos carotenóides de um organismo. Adicionalmente, o óperon ou organismo pode ser engenheirado de forma a incrementar a produção de enzimas úteis para a produção de um carotenóide desejado.
Adicionalmente, o óperon pode ser usado como um veículo para a introdução de seqüências de ácido nucleico exógenas através do uso de cassetes de integração. Referidas cassetes de integração compreendem seqüências de ácido nucleico homólogas com seqüências do óperon endógenas. Através de eventos recombinativos, o cassete de integração insere a seqüência exógena no óperon carotenóide do organismo-alvo. A seqüência de ácido nucleico pode codificar uma proteína de interesse ou ela pode conter seqüência não-codificante usada, p. ex., para alterar, romper ou aumentar o funcionamento do óperon carotenóide.
A presente invenção refere-se adicionalmente a vetores de expressão recombinantes que podem integrar, no óperon carotenóide (ver Figura 3) de Corynebacterium. O óperon carotenóide é uma unidade genética compreendendo vários genes e elementos reguladores de genes responsáveis pela produção de carotenóides. Em particular, os inventores desenvolveram vetores de expressão compreendendo cassetes de integração que são úteis para a introdução de ácidos nucleicos heterólogos ou genes heterólogos no óperon carotenóide. Os inventores projetaram as cassetes de integração de tal forma que genes específicos ou seqüências reguladoras do óperon carotenóide possam ser objetivados para rompimento. O rompimento de genes específicos ou seqüências reguladoras do óperon carotenóide proporciona diferentes resultados fenotípicos dependendo de que etapa da via carotenóide é rompida ou alterada. C. glutamicum normalmente proporciona colônias de cor amarela devido à síntese de decaprenoxantina. Por exemplo, um bloco precoce na via proporciona colônias brancas, e um bloco na licopeno elongase (codificada no lócus crtEb) proporciona colônias róseas. Aqui, a cor rosa é um resultado do acúmulo de licopeno em lugar de decaprenoxantina. Finalmente, uma inserção em marR, que codifica um regulador negativo putativo do óperon carotenóide, proporciona níveis mais elevados de carotenóides totais, resultando em colônias de cor mais escura ou mais intensa. Os inventores demonstram adicionalmente aqui que o rompimento tanto do lócus de licopeno elongase (crtEb) e o lócus marR proporciona significativamente a produção incrementada de licopeno.
Considerado de maneira conjunta, as descobertas aqui descritas proporcionam a geração de microorganismos recombinantes que produzem simultaneamente níveis incrementados tanto de metionina como de licopeno ou outro composto carotenóide. Isto proporciona uma vantagem distinta devido à economia de se usar um organismo para a produção incrementada de dois compostos industrialmente significativos. O carotenóide pode ser obtido, com ou sem purificação adicional da massa de células residuais da fermentação.
Adicionalmente, vetores da invenção são úteis para facilitar a engenharia genética de microorganismos, porque as alterações de cores que acompanham diversas etapas de manipulação podem auxiliar a identificar os eventos moleculares desejados.
IV. Cultivar e fermentar microorganismos recombinantes Microorganismos da invenção são particularmente vantajosos para a produção de químicos finos, p. ex., enxofre contendo químicos finos. Microorganismos e também processos de fermentação que proporcionam referidos microorganismos, são projetados, de preferência, para a produção aperfeiçoada ou acentuada de químicos finos, p. ex., químicos finos contendo enxofre.
Aperfeiçoamentos de processo podem relacionar-se com métodos relativos a aspectos técnicos da fermentação, como por exemplo, agitação e fornecimento de oxigênio, ou devido à composição de meio nutriente, como, por exemplo, concentração de açúcar durante a fermentação, ou a técnicas de isolamento usadas na purificação do produto, por exemplo, por meio de cromatografia de troca de íon.
Meios para incrementar a produção de substâncias desejadas, p. ex. químicos finos contendo enxofre, incluem aperfeiçoar intrinsecamente a titulação da produção ou o rendimento de um microorganismo através de, p. ex., engenharia genética. A produção de uma substância desejada (p. ex. químicos finos contendo enxofre) pode ser incrementada modificando-se níveis de expressão de uma enzima (ou enzimas) envolvidas na biossíntese da substância de interesse. Isto pode ser obtido por meio de, por exemplo, modificação de seqüências promotoras ou acentuadoras responsáveis por impelir a expressão da enzima biossinteticamente importante. Adicionalmente, seqüências promotoras ou acentuadoras exógenas podem ser introduzidas recombinantemente e conferir níveis de expressão preferidos de uma proteína ou enzima endógena. Em alguns casos, as seqüências reguladoras inseridas permitem a expressão constitutiva ou induzível de uma proteína-alvo. Produção de níveis incrementados de uma substância desejada também pode ser obtida por meio da introdução de genes modificados recombinantemente que expressam proteínas com características aperfeiçoadas. Em determinados casos, os genes que codificam proteínas nativas são engenheirados de tal forma que as proteínas resultantes apresentam características desejadas, por exemplo, maior afinidade por substrato ou taxa de reação mais rápida. Outra maneira de se obter produção incrementada ou aperfeiçoada de uma substância desejada é através de introdução recombinante de genes heterólogos. Inserção de genes heterólogos pode ter o benefício de suplementar ou suplantar uma enzima nativa e, com isso, efetuar a produção de um produto particularmente desejado de uma via bioquímica. Em determinados casos pode ser vantajoso inibir a expressão de um gene nativo e introduzir um gene heterólogo, desta forma aperfeiçoando a produção de uma substância desejada, genes heterólogos também podem ser introduzidos de tal forma a gerar a produção de uma substância inédita no microorganismo-alvo.
É particularmente interessante, no aperfeiçoamento da produção de substâncias desejadas em microorganismos, o desenvolvimento de técnicas inéditas de engenharia genética para facilitar a modificação de um organismo-alvo. De uma maneira geral, seqüências de ácido nucleico heterólogas são inseridas em organismos-alvo através do uso de vetores de ácido nucleico recombinantes. Estes vetores podem ser autonomamente replicantes e existem episomicamente ou eles podem ser projetados de tal forma que a seqüência heteróloga seja inserida no genoma de células hospedeiras. Adicionalmente, é possível, e vantajoso em determinados casos, projetar vetores que integram sítio especificamente. Vetores de integração como estes podem realizar uma função duas vezes: Eles inseriram um gene heterólogo desejado e, simultaneamente, proporcionara a ablação da função de uma seqüência gênica-alvo nativa. O desenvolvimento adicional de vetores, como estes proporcionam meios para facilitar a geração de microorganismos recombinantes úteis para a produção de substâncias desejadas, como químicos finos contendo enxofre.
O termo "cultivar" inclui manter e/ou desenvolver um microorganismo vivo da presente invenção (p. ex., manter e/ou desenvolver uma cultura ou cepa). Em uma concretização, um microorganismo da invenção é cultivado em meio líquido. Em outra concretização, um microorganismo da invenção é cultivado em meio sólido ou meio semi-sólido. Em algumas concretizações, um microorganismo da invenção é cultivado em um meio (p. ex., um meio líquido, estéril) compreendendo nutrientes essenciais ou benéficos para a manutenção e/ou o crescimento do microorganismo (p. ex., fontes de carbono ou substrato de carbono, por exemplo, carboidrato, hidrocarbonetos, óleos, gorduras, ácidos graxos, ácidos orgânicos, e álcoois; fontes de nitrogênio, por exemplo, peptona, extratos de levedura, extratos de carne, extratos de malte, uréia, sulfato de amônio, cloreto de amônio, nitrato de amônio e fosfato de amônio; fontes de fósforo, por exemplo, ácido fosfórico, seus sais de sódio e potássio; elementos em traços, por exemplo, magnésio, ferro, manganês, cálcio, cobre, zinco, boro, molibdênio, e/ou sais de cobalto; e também fatores de crescimento, como aminoácidos, vitaminas, promotores de crescimento e análogos).
De preferência, microorganismos da presente invenção são cultivados em pH controlado. O termo "pH controlado" inclui qualquer pH que resulta em produção do produto desejado (p. ex., metionina e/ou licopeno). Em uma concretização microorganismos são cultivados em um pH de cerca de 7. Em outra concretização, microorganismos são cultivados em um pH entre 6,0 e 8,5. O pH desejado pode ser mantido por meio de qualquer número de métodos conhecidos por aqueles com prática na técnica.
Em algumas concretizações, microorganismos da presente invenção são cultivados sob aeração controlada. O termo "aeração controlada" inclui aeração suficiente (p. ex., suprimento de oxigênio) resultando na produção do produto desejado (p. ex., metionina e/ou licopeno). Em uma concretização, a aeração é controlada regulando-se os níveis de oxigênio na cultura, por exemplo, regulando-se a quantidade de oxigênio dissolvido em meio de cultura. Por exemplo, em algumas concretizações, aeração da cultura é controlada pelo menos parcialmente por meio de agitação da cultura. A agitação pode ser proporcionada por meio de uma hélice ou equipamento de agitação mecânico similar, girando-se o agitando-se o vaso de cultura (p. ex., tubo ou frasco) ou por meio de diversos equipamentos de bombeamento. A aeração pode ser controlada adicionalmente pela passagem de ar estéril ou oxigênio através do meio (p. ex., através da mistura de fermentação). Da mesma forma, microorganismos da presente invenção são cultivados, de preferência, sem excesso de espumação (p. ex., via adição de agentes anti-espumantes).
Além disso, microorganismos da presente invenção podem ser cultivados sob temperaturas controladas. O termo "temperatura controlada" inclui qualquer temperatura que resulta na produção do produto desejado (p. ex., metionina e/ou carotenóide). Em uma concretização, temperaturas controladas incluem temperaturas entre 15°C e 95°C. Em outra concretização, temperaturas controladas incluem temperaturas entre 15°C e 70°C. Em algumas concretizações, temperaturas are entre 20°C e 55°C, mais preferivelmente entre 28°C e 44°C.
Microorganismos podem ser cultivados (p. ex., mantidos e/ou desenvolvidos) em meio líquido e, de preferência, são cultivados, seja continuamente ou intermitentemente, por meio de métodos de cultivo convencionais, como cultura parada, cultura em tubo de ensaio, cultura agitada (p. ex., cultura agitada rotativa, cultura em frasco agitado, etc.), cultura com centrifugação aerada, ou fermentação. Em uma concretização preferida, os microorganismos são cultivados em frascos agitados. Em uma concretização mais preferida, os microorganismos são cultivados em um fermentador (p. ex., um processo de fermentação). Processos de fermentação da presente invenção incluem, embora sem limitação, processos de bateladas, bateladas alimentadas e contínuos ou métodos de fermentação. A expressão "processo em batelada" ou "fermentação em batelada" refere-se a um sistema em que a composição de meios, nutrientes, aditivos suplementais e análogos é ajustada no início da fermentação e não submetida a alteração durante a fermentação, no entanto, é possível realizar tentativas para controlar fatores, como pH e concentração de oxigênio para prevenir acidificação de meio em excesso e/ou morte de microorganismos. A expressão fermentação por meio de "processo em batelada alimentada" ou "batelada alimentada" refere-se a uma fermentação em batelada com a condição adicional de que um ou mais substratos ou suplementos sejam adicionados (p. ex., adicionados ΙφΟ incrementalmente ou continuamente) à medida que a fermentação progride. A * expressão "processo contínuo" ou "fermentação contínua" refere-se a um
sistema em que um meio de fermentação definido é adicionado continuamente em um fermentador e uma quantidade igual de meio usado ou "condicionado" é removida simultaneamente, de preferência, para recuperação do produto desejado (p. ex., metionina e/ou carotenóide). Uma variedade de referidos processos foi desenvolvida e é bem conhecida na técnica.
A expressão "cultivar em condições de tal forma que um composto desejado é produzido" inclui manter e/ou desenvolver microorganismos em condições (p. ex., temperatura, pressão, pH, duração, fto etc.) apropriadas ou suficientes para se obter a produção do composto desejado ou para se obter rendimentos desejados do composto particular que está sendo produzido. Por exemplo, o cultivo é continuado durante um tempo suficiente para produzir a quantidade desejada de um composto (p. ex., metionina e/ou carotenóide). De preferência, o cultivo é continuado durante um tempo suficiente para se atingir substancialmente produção vantajosa do composto (p. ex., um tempo suficiente para se atingir uma concentração vantajosa de metionina e/ou carotenóide). Em uma concretização, o cultivo é continuado durante cerca de 12 a 24 horas. Em outra concretização, o cultivo é continuado durante cerca de 24 a 36 horas, 36 a 48 horas, 48 a 72 horas, 72 a 96 horas, 96 a 120 horas, 120 a 144 horas, ou acima de 144 horas. Em outras concretizações adicionais, microorganismos são cultivados em condições de tal forma que pelo menos cerca de 1 a 5 g/l ou de 5 a 10 g/l de composto sejam produzidos em cerca de 48 horas, ou pelo menos cerca de 10 a 20 g/l de composto em cerca de 72 horas. Em outra concretização adicional, microorganismos são cultivados em condições de tal forma que pelo menos cerca de 5 a 20 g/l de composto sejam produzidos em cerca de 36 horas, pelo menos cerca de 20 a 30 g/l de composto sejam produzidos em cerca de 48 horas, ou pelo menos cerca de 30 a 50 ou 60 g/l de composto em cerca de 72 horas.
A metodologia da presente invenção pode incluir adicionalmente uma etapa de recuperar um composto desejado (p. ex., metionina e/ou carotenóide). O termo "recuperar" um composto desejado inclui extrair, colher, isolar ou purificar o composto do meio de cultura ou massa de células. A recuperação do composto pode ser realizada de acordo com qualquer metodologia convencional de isolamento ou purificação conhecida na técnica incluindo, embora sem limitação, tratamento com uma resina convencional (p. ex., resina de troca de ânion ou de cátion, resina de adsorção não-iônica, etc.), tratamento com um adsorvente convencional (p.
ex., carvão ativado, ácido silícico, silica-gel, celulose, alumina, etc.), alteração de pH, extração com solvente (p. ex., com um solvente convencional, como um álcool, acetato de etila, hexano e análogos), diálise, filtração, concentração, cristalização, recristalização, ajuste do pH, liofilização e análogos.
Em alguns casos, é preferível que um composto desejado da presente invenção é "extraído", "isolado" ou "purificado" de tal forma que a preparação resultante seja substancialmente isenta de outros componentes de meio (p. ex., isenta de componentes de meio e/ou subprodutos de fermentação). A expressão "substancialmente isenta de outros componentes de meio" inclui preparações do composto desejado em que o composto é separado de componentes de meio ou subprodutos de fermentação da cultura de que é produzido. Em uma concretização, a preparação apresenta mais de cerca de 80 % (em peso seco) do composto desejado (p. ex., menos de cerca de 20 % de outros componentes de meio ou subprodutos de fermentação), mais preferivelmente mais de cerca de 90 % do composto desejado (p. ex., menos de cerca de 10 % de outros componentes de meio ou subprodutos de fermentação), ainda mais preferivelmente mais de cerca de 95 % do composto desejado (p. ex., menos de cerca de 5 % de outros componentes de meio ou subprodutos de fermentação), e, da forma mais preferível, mais de cerca de 98-99 % do composto desejado (p. ex., menos de cerca de 1 a 2 % outros componentes de meio ou subprodutos de fermentação).
Em uma concretização alternativa, o composto desejado não é purificado do meio de cultura ou microorganismo, por exemplo, quando o microorganismo é biologicamente não-perigoso (p. ex., seguro). Por exemplo, toda a cultura (ou sobrenadante de cultura) ou massa de células pode ser usada como uma fonte de produto (p. ex., produto bruto). Em uma concretização, a cultura (ou sobrenadante de cultura) é usada sem modificação. Em outra concretização, a cultura (ou sobrenadante de cultura) é concentrada. Em outra concretização adicional, a cultura (ou sobrenadante de cultura) é secada ou liofilizada. Em outra concretização adicional a massa de células (após separação do sobrenadante de cultura) é secado, liofilizado, ou usado diretamente, por exemplo, como um aditivo alimentício. O produto obtido por meio da presente invenção pode incluir adicionalmente a químico fino contendo enxofre, p. ex., metionina, outros componentes do caldo de fermentação e massa de células, p. ex. fosfatos, carbonatos, carboidratos remanescentes, biomassa, componentes de meio complexos, carotenóides, etc.
Em algumas concretizações, um método de produção da presente invenção resulta em produção do composto desejado com um rendimento significativamente alto. A expressão "rendimento significativamente alto" inclui um nível de produção ou rendimento que é suficientemente elevado ou acima do que é usual para métodos de produção comparáveis, por exemplo, que é elevada a um nível suficiente para produção comercial do produto desejado (p. ex., produção do produto a um custo comercialmente exeqüível). Em uma concretização, a invenção proporciona um método de produção que inclui cultivar um microorganismo recombinante em condições de tal forma que o produto desejado (p. ex., metionina e/ou carotenóide) seja produzida a um nível maior do que 2 g/l para um produto solúvel, como metionina, ou acima de 0,1 mg/l para um produto fracamente solúvel (p. ex. um carotenóide). Em outra concretização, a invenção proporciona um método de produção que inclui cultivar um microorganismo recombinante em condições de tal forma que o produto desejado (p. ex., metionina) seja produzido a um nível superior a 10 g/l, e quando presente, o composto carotenóide a um nível de 1 mg/l ou maior. Em outra concretização, a invenção proporciona um método de produção que inclui cultivar um microorganismo recombinante em condições de tal forma que o produto desejado (metionina) seja produzido a um nível superior a 20 g/l. Em outra concretização adicional, a invenção proporciona um método de produção que inclui cultivar um microorganismo recombinante em condições de tal forma que o produto desejado (metionina) seja produzido a um nível superior a 30 g/1. Em outra concretização adicional, a invenção proporciona um método de produção que inclui cultivar um microorganismo recombinante em condições de tal forma que o produto desejado (p. ex., metionina) seja produzido a um nível superior a 40 g/l. Em outra concretização adicional, a invenção proporciona um método de produção que inclui cultivar um microorganismo recombinante em condições de tal forma que o produto desejado (p. ex., metionina) seja produzido a um nível superior a 50 g/l. Em outra concretização adicional, a invenção proporciona um método de produção que inclui cultivar um microorganismo recombinante em condições de tal forma que o produto desejado (p. ex., metionina) seja produzido a um nível superior a 60 g/l. A invenção proporciona adicionalmente um método de produção para produzir o composto desejado e que envolve cultivar um microorganismo recombinante em condições tais a produzir um nível significativamente elevado do composto dentro de um intervalo de tempo comercialmente desejável.
Dependendo da enzima biossintética ou da combinação de enzimas biossintéticas engenheiradas, pode ser desejável ou necessário proporcionar (p. ex., introduzir) microorganismos da presente invenção pelo menos um precursor biossintético de tal forma que o composto ou compostos desejados sejam produzidos. Os termos "precursor biossintético" e "precursor" incluem um agente ou composto que, quando proporcionado, colocado em contato com, ou incluído no meio de cultura de um microorganismo, serve para acentuar ou incrementar a biossíntese do produto desejado.
Outro aspecto da presente invenção inclui processos de biotransformação que proporcionam os microorganismos recombinantes aqui descritos. O termo "processo de biotransformação", também referido aqui como "processos de bioconversão", inclui processos biológicos, o que resulta na produção (p. ex., transformação ou conversão) de substratos e/ou compostos intermediários apropriados em um produto desejado (p. ex., metionina e/ou carotenóide).
O(s) microorganismo(s) e/ou enzimas usados nas reações de biotransformação encontram-se numa forma que lhes permite realizar sua função intencionada (p. ex., produzir um composto desejado). Os microorganismos podem ser células inteiras, ou podem ser apenas aquelas porções das células necessárias para se obter o resultado final desejado. Os microorganismos podem ser suspensos (p. ex., numa solução apropriada, como meios ou soluções tamponadas), enxaguados (p. ex., enxaguados livrando-se o meio de cultura do microorganismo), secados com acetona, imobilizados (p. ex., com gel de poliacrilamida ou k-carragenano ou sobre suportes sintéticos, por exemplo, pérolas, matrizes e análogos), fixados, reticulados ou permeablizados (p. ex., apresentar paredes e/ou membranas permeabilizadas de tal forma que compostos, por exemplo, substratos, intermediários ou produtos possam atravessar com mais facilidade referida parede ou membrana).
Esta invenção é ilustrada adicionalmente pelos exemplos a seguir que não deveriam ser interpretados como limitantes. Os teores de todas as referências, patentes e pedidos de patentes publicados indicados em todo este pedido são incorporados aqui por referência.
Exemplo 1. Instalação do gene de meti de BaciUus subtilis em cepas de C. glutainicum.
Um clone do gene de meti de B. subtilis foi obtido por meio de reação em cadeia de polimerase e expresso em várias cepas de C. glutamicum produtoras de metionina. Após amplificar meti por meio de PCR, construiu-se quatro plasmídeos diferentes para expressar constitutivamente meti após integração no lócus crtEb (ver Exemplo 3). Dois promotores, P497 e P15, foram combinados com dois sítios de ligação de ribossomas, RBS1, e RBS 1284, dando quatro combinações, que se encontram listadas na Tabela 2. Um plasmídeo representativo deste conjunto, pOM284, é ilustrado na Figura 3. Todos os plasmídeos complementaram um mutante de metB de E. colL
Todos os quatro plasmídeos foram transformados em OM99 (descritos no pedido de patente copendente, 60/700.699 "Microorganismos recombinantes produtores de metionina", depositado em 18 de julho de 2005). Quatro isolados de cada uma das cepas Campbell-in foram avaliados para produção de metionina em frascos agitados usando-se um meio baseado em melaços (Tabela IV). Todos os quatro plasmídeos levam a um incremento na produção de metionina. O maior aperfeiçoamento proveio de pOM284, que contém meti expresso de Pi5 e RBS1. Neste caso, a produção de metionina aumentou de cerca de 1,6 g/l a cerca de 2,2 g/l, ou cerca de 37 %. Este aumento foi interpretado como sendo devido a um aumento da atividade específica da atividade similar a MetY, a atividade similar a MetB, ou à resistência a feedback, ou a alguma combinação destes. Ensaios com enzimas de O-acetil-homosserina sulfidrilase em extratos brutos de metB" de E. coli contendo pOM284 mostraram que meti foi, efetivamente, resistente à inibição por meio de metionina a concentrações de até 10 mM (ver Exemplo 2).
Tabela IV. Produção de metionina por derivados de OM99 contendo plasmídeos de meti Campbelled-in desenvolvidos durante 48 horas em frascos agitados em meio de melacos. Todas as titulações são dadas em
O
Campbelled-out dando uma nova cepa denominada OM134C. Em frascos agitados, OM134C deu um aumento de 40 % na produção de metionina relativa a OM99, que foi similar àquela do intermediário Campbelled-in,
gramas por litro.
<table>table see original document page 54</column></row><table>
O derivado de OM99 transformado com pOM284 foi OM99/pOM284 (Tabela V). A titulação de O-acetil-homosserina de OMl 34C diminuiu de cerca de 1,2 g/l a cerca de 0,3 g/l, que é que consiste com a presença de uma O-acetil-homosserina sulfidrilase mais ativa e/ou uma cistationina sintase mais ativa.
Tabela V. Produção de metionina por OM134C um derivado Campbelled-out de OM99 contendo P1. RBSl meti integrado em crtEb. desenvolvido durante 48 horas em frascos agitados em meio de melacos. <table>table see original document page 55</column></row><table> Todas as titulacoes são dadas em gramas por litro.
Seqüências de vários promotores úteis na construção de cepas da presente invenção são apresentadas na SEQ ID NO:16 (promotor P1284); SEQ ID NO: 17 (promotor P3119); SEQ ID NO:18 (promotor fago lambda PR); e SEQ ID NO: 19 (promotor fago lamdda PL)- Adicionalmente, a seqüência de aminoácidos da proteína de meti de Bacillus subtilis foi usada para pesquisar as seqüências mais próximas conhecidas. Figura 7A-C ilustra alinhamentos de seqüências múltiplas entre a proteína de meti de B. subtilis (SEQ ID NO:2) e cinqüenta seqüências mais próximas (SEQ ID NOs:26-75), por meio de identidade de seqüências, encontrado no banco de dados GENBANK® da NCBI.
Exemplo 2. Determinação da atividade da enzima de O-acetil-homosserina sulfidrilase de MetY de Corvnebacterium Qlutamicum e meti de Bacillus subtilis como uma função da concentração de metionina.
O gene meti codificado no vetor de transporte plasmídico pOM284 de E. eoli - C.glutamicum (SEQ ID: 12), e o gene metY codificado no vetor de transporte plasmídico pH357 de E. eoli - C.glutamicum (SEQ ID:15), foram transformados por meio de tecnologia de transformação convencional na cepa CGSC4896 de E. eoli deficiente de metB do Coli Genetic Stock Center (Yale University, E.U.A.) e foram selecionados por meio de crescimento sobre LB mais 25 mg/l de canamicina. A cepa de E. coli transformada contendo pOM284 desenvolvida em meio de glucose mínimo que não apresenta metionina, demonstrando que meti pode usar O-succinil-
homosserina como um substrato.
Cepas de E. coli portando o gene meti ou metY foram desenvolvidos em meio LB líquido com 25 mg/l de canamicina. Células foram colhidas e lisados de células de pelotas foram obtidos usando-se o protocolo Ribolyzer e máquina (Hybaid, UK). Extratos de células foram ^ centrifugados para se obter uma fração de sobrenadante solúvel de proteína citosólica. O método para determinar a atividade de O-acetil-homosserina sulfidrilase em extratos de células foi realizado essencialmente como descrito em Yamagata, Methods in Enzymology, 1987, vol. 143 pp. 479-480. Adicionou-se extratos de células a um tamponador de 100 mM de KH2PO4 (pH 7,2) contendo 5 mM de O-acetil-homosserina e 200 μΜ de fosfato de piridoxal. Para a análise do efeito de metionina na atividade enzimática, adicionou-se L-metionina às concentrações mM finais indicadas. A reação foi iniciada por meio de adição de solução de sulfeto de Na a uma concentração final de 4 mM. Após uma incubação de 15 minutos a 30°C, a reação foi OlO terminada e acidificada por meio de adição de 1/10 volume de 30 % de ácido tricloroacético. Após centrifiigação (5 minutos a 13.000 rpm) para remover proteína precipitada realizou-se incubação sob pressão atmosférica reduzida em um evaporador Speed-Vac para depletar H2S residual. A solução depletada de sulfeto foi reagida com cianeto e nitroprusseto como descrito em Yamagata supra. Absorção a 520 nm foi determinada e teve o fundo corrigido.
Atividades enzimáticas na presença de metionina são expressas como valores relativos em comparação com as atividades na ausência de adição de metionina, que é ajustada em 1 (ver Figura 2). A cepa de E. coli CGSC4896 sem a adição de DNA plasmídico não mostrou atividade enzimática de O-acetil-homosserina sulfidrilase.
Fica claro a partir dos resultados ilustrados na Figura 2 que a atividade de O-acetil-homosserina sulfidrilase da enzima de meti de Bacillus subtilis é resistente à inibição por meio de metionina de até pelo menos 10 mM de metionina, enquanto que a atividade de O-acetil-homosserina sulfidrilase da enzima de MetY de C. glutamicum é inibiu por meio de metionina na faixa de 2,5 a 10 mM, com uma inibição de 50 % a cercajie 5 mM. 5 mM é uma concentração de metionina que existe provavelmente no citoplasma de células que são engenheiradas para superproduzir metionina. k10 Exemplo 3. Aperfeiçoamento da atividade de O-acetil-homosserina sulfidrilase e O-succinil-homosserina sulfidrilase de enzima de meti in vivo
Embora meti de B. subtilis apresenta atividade de O-acetil- homosserina sulfidrilase em um ensaio de enzima in Vitro9 como ilustrado nos exemplos 1 e 2 acima, a atividade in vivo de meti não foi suficiente para suportar o crescimento de uma cepa de E. coli ou de C. glutamicum que não
apresentou a via de transsulfuração.
Plasmídeo pOM150 (SEQ ID N0:.20) foi construído substituindo-se o cassete Pi5 meti de pOM284 (SEQ ID NO: 12) para o cassete P497metY de pH357 (SEQ ID NO:15).
Ϊ A cepa de E. coli MW001 (metB, metC162::TnlO) foi
construída por Pl vir transdução do alelo metC162::TnlO da cepa de E. coli CGSC 7435 em CGSC 4896 (metB) e selecionando-se quanto à resistência à tetraciclina. MW001 não apresenta a via de transsulfuração e tampouco a via de sulfidrilação direta para síntese de metionina. A cepa de C. glutamicum OM175 foi construída deletando-se
porções de metB, metC, e metY de OM99, usando-se Campbelling in e Campbelling out serial de plasmídeos pH216 (SEQ ID NO: 21), pOM115 (SEQ ID NO: 22), e pH215 (SEQ ID NO: 23), respectivamente. OM175 não apresenta a via de transsulfuração e tampouco a via de sulfidrilação direta para síntese de metionina.
MWOOl e OMl 75 foram transformados, cada um, com pOM150, selecionando-se quanto à resistência à canamicina a 25 mg/l. Os transformantes foram aplicados por meio de filamento em placas de Petri contendo meio isento de metionina, como (descrito no Pedido de Patente Provisional dos E.U.A. 60/700.557, depositado em 18 de julho de 2005, incorporado aqui por referência. Nenhum transformante desenvolveu-se em meio isento de metionina, embora a atividade de sulfidrilação de meti in vitro tenha sugerido que os transformantes deveriam ser dotados com a via de sulfidrilação direta por meio de Meti.
Para incrementar a atividade de sulfidrilação direta in vivo de Meti, a cepa MWOOl/pOMISO foi submetida a mutagênese [sob] ultravioleta e seleção quanto ao crescimento em placas isentas de metionina. Cepas mutantes que se desenvolveram bem foram isoladas. DNA plasmídico foi isolado de vários mutantes independentes e os DNAs plasmídicos purificados foram retransformados em MWOOl e OM 175 não tratados. Plasmídeos isolados de vários mutantes diferentes proporcionaram transformantes em ambas as espécies (MW001 e OM175) que se desenvolveram sobre meio isento de metionina, e os transformantes de MWOOl daqueles plasmídeos desenvolveram-se na mesma taxa que os isolados de mutantes originais, mostrando que a mutação que conferiu crescimento foi transmitida por plasmídeo.
Dois dos novos plasmídeos mutantes foram denominados pOM150*-2 e pOM150*-14, respectivamente. Determinou-se a seqüência de DNA da região de meti de ambos os plasmídeos, e ambos continham a mesma mutação de base simples que alteraram o códon serina (AGC) na posição de aminoácido 308 de meti (contando o códon iniciador ATG como o aminoácido número um) até um códon asparagina (AAC). É digno de nota que o MetY5 que apresenta atividade de sulfidrilação direta, contém asparagina na posição de aminoácido homóloga, sendo que, como um resultado, a mutação identificada nos plasmídeos pC)M150* tornou a seqüência de meti mais similar a MetY.
Um plasmídeo denominado pOM148*-l (SEQ ID NO: 24) é relacionado com pC>M150*-14 que contém a mesmo cassete P]5metl (S308N) que pOM150*-14, mas nenhum gene metIX. Diferentemente de pOM150*-2, que foi isolado em MWOOl, pOM148*-l foi isolado originalmente em OMl 75 após mutagênese [com] ultravioleta, seleção sobre placas isentas de metionina, isolamento do plasmídeo, e transformação em OMl 75 e MWOOl não-tratados. A cepa de E. coli MW001/pOM148*-l, que produz presumivelmente O-succinil-homosserina, mas não O-acetil-homosserina, ainda cresce bem em meio isento de metionina.
Considerados em conjunto, estes resultados levam à conclusão de que a nova versão mutante de meti (S308N) aumentou a atividade de O- acetil-homosserina sulfidrilase e de O-succinilhomoserme sulfidrilase in vivo tanto em C. glutamicum como em E. coli, que é útil para incrementar a biossíntese de metionina.
Exemplo 4. Desenvolvimento de vetores para integrar cassetes de expressão gênica no óperon biossintético carotenóide de C, glutamicum.
Colônias de C. glutamicum tornam-se amarelas tipicamente após 48 horas sobre placas mínimas ou ricas. Esta cor amarela é reportada devido ao acúmulo de carotenóide C50, decaprenoxantina (Krubasik et ah,2001, Eur. J; Biochem. 268:3702-8). As enzimas que catalisam a biossíntese de decaprenoxantina a partir dos precursores isoprenóides são codificadas por um único óperon que foi caracterizado por mutagênese de transposon, clonagem, e seqüenciamento (Krubasik et al, ibid). Nós predissemos que este óperon (Figura 4) não foi essencial para C. glutamicum, de modo que seria um lócus vantajoso e potencialmente útil para inserção de cassetes de expressão gênica. Em particular, inserções em locais específicos no óperon poderiam alterar a via carotenóide, o que, por sua vez, poderia levar à alteração de cores nas colônias. Por exemplo, um bloco precoce na via poderia levar a colônias brancas, e um bloco precoce na via poderia levar a colônias brancas, e um bloco na licopeno elongase poderia levar ao acúmulo de licopeno em lugar de decaprenoxantina, o que poderia tornar as colônias róseas ao invés de amarelo. Finalmente, uma inserção em marR, que codifica um regulador negativo putativo do óperon carotenóide^ o que poderia levar a níveis mais elevados de carotenóides, o que poderia tornar as colônias de cor mais escura ou mais intensa.
Dois conjuntos de vetores de integração foram projetados para integrar cassetes em crtEb (licopeno elongase) ou marR (regulador negativo). Um membro de cada conjunto continha um módulo de expressão P497-IacZ, e o outro continha um módulo de expressão P497-IacZ. Um representante destes vetores, pOM246 (P15-IacZ em crtEb) é mostrado na Figura 5 (SEQ ID NO:14). O conjunto de quatro vetores encontra-se resumido na Tabela VI. A integração das cassetes em crtEb produziu colônias rosas, o que tornou mais difícil recolher "Campbell outs", o que conservou o inserto desejado.
Insertos em marR produziram colônias que apresentaram uma cor amarela mais escura do que o parental. Uma combinação de inserção em marR e inserção em crtEb leva a um aumento na produção de licopeno. Exemplo 5. Co-produção de um composto não-carotenóide e um composto carotenóide.
Como discutido aqui, os plasmídeos e cepas aqui descritos, adicionalmente a serem úteis na construção de cepas, podem ser usados em métodos para incrementar o valor comercial de um processo de fermentação por meio de co-produção de um aminoácido, ou outro composto não- carotenóide de interesse comercial, juntamente com um composto carotenóide. Assim, por exemplo, cepa OM134C (ver Exemplo 1) produz tanto metionina como também licopeno. A metionina é secretada no meio de uma cultura líquida, enquanto que o licopeno permanece ligado à massa de células. Após centrifugação, as células formam um pellet rosa, e o licopeno contido ali pode ser extraído, por exemplo, por meio de suspensão das células em uma mistura de metanolxlorofórmio (1:1 em volume). Para algumas aplicações, por exemplo, astaxantina para ração de salmão, a massa de células pode ser simplesmente secada a um sólido ou pó e misturada com a ração para proporcionar uma fonte de carotenóide, proteína, e vitaminas.
Carotenóides (por exemplo, embora sem limitação, licopeno, astaxantina, β-caroteno, luteína, zeaxantina, cantaxantina, decaprenoxantina, e bixina, etc.) podem ser obtidos correspondentemente da massa de células dispendidas de C. glutamicum ou outras fermentações em que o primeiro produto é um aminoácido ou outro composto não-carotenóide, economizando com isto o custo de uma fermentação dedicada apenas à produção de carotenóides. Inserções aqui descritas levam a um aumento dos níveis de carotenóides, o que torna o carotenóide economicamente atraente para colheita como um subproduto. Carotenóides diferentes de licopeno e decaprenoxantina também podem ser produzidos por meio de introdução dos genes biossintéticos apropriados, de fontes bem conhecidas na técnica, usando-se técnicas bem conhecidas na técnica, por exemplo, genes para a biossíntese de astaxantina e beta-caroteno podem ser obtidos por meio de PCR de Phaffia rhodozyma ou Xanthophyllomyces dendrorhous (Verdoes et ai. (2003) Appl Env. Microbiol 69:3728-3738, ou de Erwinia uredovora e Agrobaeterium aurantiaeum (Miura et ai. (1998) Appl Env. Mierobiol 64:1226-1229). Os genes necessários para converter licopeno a beta-caroteno, astaxantina, etc. podem ser obtidos a partir das fontes mencionadas acima, ou de outras fontes apropriadas, e expressos simplesmente em C. glutamicum como descrito aqui para meti ou como um óperon, ou como parte de um óperon.
Sem desejar ater-nos à teoria, considera-se que métodos aqui descritos podem ser estendidos à produção de aminoácidos diferentemente de metionina, ou compostos diferentes de aminoácidos, ou compostos não- carotenóides e carotenóides diferentes de decaprenoxantina e licopeno, e usando-se outros organismos adicionalmente a C. glutamicum. Adicionalmente, métodos compreendidos por esta invenção podem ser usados para a co-produção de um aminoácido ou outro composto não-carotenóide e um composto carotenóide em uma reação de fermentação simples. Exemplos de outros aminoácidos incluem, embora sem limitação, lisina, ácido glutâmico, treonina, isoleucina, leucina, alanina, fenilalanina, tirosina, triptofano, cisteína, homosserina, homocisteína, e seus sais. Exemplos de outros carotenóides incluem, embora sem limitação, β-caroteno, astaxantina, luteína, zeaxantina, cantaxantina, e bixina. Qualquer organismo que pode ser engenheirado para superproduzir um aminoácido também pode ser engenheirado de forma a co-produzir um carotenóide. Em geral, a titulação do aminoácido será maior do que aquela do carotenóide, e a quantidade do fluxo de carbono no carotenóide será suficientemente pequena para que não se venha a obter o impacto maior sobre a titulação do aminoácido. Da mesma forma, em alguns casos, a produção ou superprodução de um carotenóide acentuará efetivamente a titulação do aminoácido que está sendo produzido, porque o carotenóide dará alguma proteção ao organismo produtor contra dano oxidativo. Exemplos de organismos diferentes de C. glutamicum que podem ser engenheirados para co-produzir um composto não-carotenóide juntamente com um composto carotenóide incluem outros gêneros e espécies de bactérias, leveduras, fungos filamentosos, Archaea, e plantas. A única exigência é que o organismo seja capaz de ser engenheirado para produzir os dois compostos em níveis comercialmente atraentes.
Adicionalmente, o incremento do valor de uma fermentação mediante co-produção de um carotenóide (um segundo composto) pode ser estendido a organismos e fermentações em que o primeiro composto de interesse é um composto diferente de um aminoácido. Referidos compostos incluem, por exemplo, embora sem limitação, metano, hidrogênio, ácido láctico, 1,2-propano diol, 1,3-propano diol, etanol, metanol, propanol, acetona, butanol, ácido acético, ácido propiônico, ácido cítrico, ácido itacônico, glucosamina, glicerol, açúcares, vitaminas, enzima terapêuticas, enzimas de pesquisa e enzimas industriais, proteínas terapêuticas, proteínas de pesquisa e industriais, e vários sais de qualquer um dos compostos listados acima. É de conhecimento geral na técnica que referidos compostos podem ser produzidos por meio de fermentação, e que organismos podem ser engenheirados, selecionados, ou submetidos a triagem para superproduzir referidos compostos a níveis comercialmente atraentes. Valores V adicionais podem ser adicionados ao processo de fermentação por meio de co-produção de um carotenóide que se liga à massa de células ou a um material que pode ser separado de material solúvel após rompimento das células. Em muitos casos, mas não em todos, o primeiro composto de interesse será solúvel em água em pelo menos 0,5 g/l e secretado no sobrenadante de cultura, e o segundo composto de interesse, por exemplo, um carotenóide, será fracamente solúvel em água e permanecerá ligado à massa de células ou a material concentrável da cultura ou de células rompidas por meio de centrifugação ou outros meios (por exemplo, evaporação, filtração, ultrafiltraçao, etc.). Em alguns casos, o primeiro composto será um gás, como metano ou hidrogênio que pode ser facilmente separado do carotenóide.
Exemplo 6. Incremento adicional da produção de carotenóides.
Como discutido acima no Exemplo 4, a produção de carotenóides pode ser incrementada criando um alelo não-funcional (por exemplo, uma inserção, deleção, ou mutação pontual) em um gene que codifica um regulador negativo da biossíntese de carotenóides, como o gene marR em C. glutamicum. Esta abordagem leva à transcrição constitutiva de um óperon ou gene biossintético carotenóide. No entanto, um aumento adicional do nível de síntese de carotenóide pode ser obtida instalando-se um promotor que é mais forte do que o promotor nativo (mesmo em seu estado des-reprimido) a montante do óperon ou gene carotenóide. Plasmídeo pOM163 (SEQ ID NO:25) é um exemplo de um plasmídeo que pode ser usado para instalar o promotor constitutivo Pi5 forte (SEQ ID NO: 3) de uma maneira que acopla funcionalmente o promotor ao óperon de biossíntese carotenóide de C. glutamicum. A integração da porção funcional de pOM163 em uma cepa de C. glutamicum por meio de Campbelling in e Campbelling out também remove o promotor de óperon crt, nativo, reprimível com MarR, φ e uma porção do gene marR, e instala um cassete P497 specR que confere resistência à espectinomicina em transformantes de C. glutamicum.
Plasmídeo pOM163 foi integrado na cepa OM469 (ver Pedido de Patente dos E.U.A. relacionado BGI 180) dando a cepa OM609K. Em frascos agitados usando-se meio de melaços, como descrito nos Pedidos de Patentes Provisionais dos E.U.A. 60/714.042 e 60/700.699, incorporados aqui por referência, OM469 e OM609K produziram cerca de 2,1 e 2,0 gramas de metionina por litro, respectivamente, e estimadamente 0,6 e 4,3 mg de decaprenoxantina por grama de peso seco de células, repectivamente, após uma extração do pellet de células com metanolrclorofórmio (1:1 em volume). © Plasmídeo pOM163 foi integrado na cepa OMl82, que é uma
cepa similar a OMl 34C descrito acima, pelo fato de que é um derivado de M2014 (ver Pedidos de Patentes Provisionais dos E.U.A. relacionados60/714.042 e 60/700.699 ) que contém uma rompimento do gene crtEb e, portanto, produz licopeno em lugar de decaprenoxantina. A cepa resultante é referida como OM6IOK. Em frascos agitados usando-se meio de melaços (como descrito nos Pedidos de Patentes Provisionais dos E.U.A. 60/714.042 e60/700.699), OM182 e OM6IOK produziram cerca de 1,1 e 0,9 grama de metionina por litro, respectivamente, e uma estimativa de 0,3 e 5,7 mg de licopeno por grama de peso seco de células, respectivamente, após uma extração do pellet de células com metanolxlorofórmio (1:1 em volume). Tabela VI. Sumário de vetores projetados para integrar no óperon carotenóide de C. zlutamicum <table>table see original document page 65</column></row><table>
A descrição será melhor compreendida à luz dos ensinamentos das referências indicadas na descrição e que são incorporadas por referência. As concretizações na descrição proporcionam uma ilustração de concretizações nesta revelação e não deveriam ser interpretadas como limitando seu escopo. A pessoa versada na técnica reconhecerá facilmente muitas outras concretizações compreendidas por esta revelação. Todas as publicações e patentes indicadas e as seqüências identificadas por meio de números de acesso ou números de referência de bancos de dados nesta revelação são incorporados integralmente por referência. Na medida em que o material incorporado por referência contradiz ou é inconsistente com a presente descrição, a presente descrição precede qualquer material do tipo referido. A citação de quaisquer referências aqui contidas não é uma admissão de que referidas referências são estado da técnica com relação à presente revelação.
Exceto se indicado de outra forma, todos os números que expressam quantidades de ingredientes, cultura de células, condições de tratamento, etc como usados na descrição, incluindo reivindicações, devem ser compreendidos como sendo modificados em todos os casos pelo termo "cerca de". Assim, exceto se indicado de outra forma ao contrário, os parâmetros numéricos são aproximações e podem variar dependendo das propriedades desejadas que se deseja obter com a presente invenção. Exceto se indicado de outra forma, o termo "pelo menos" que precede uma série de elementos deve ser compreendido como referindo a cada elemento na série. Aqueles versados na técnica perceberão, ou serão capazes de determinar, mediante o emprego de nada mais do que experimentação de rotina, muitos equivalentes para as concretizações específicas da invenção aqui descrita.
Referidos equivalentes devem ser compreendidos pelas reivindicações a seguir.
o LISTAGEM DAS SEQÜÊNCIAS
<110> BASF AG
<120> USO DE UM GENE METI DE BACILLUS PARA INCREMENTAR A PRODUÇÃO DE METIONINA EM MICROORGANISMOS
<130> BGI-179
<140> <141>
<150> 60/713,905 <151> 2005-09-01
<150> 60/700,557 <151> 2005-07-18
<160> 76
<170> PatentIn Ver. 3.3
<210> 1 <211> 1122
<212> DNA
<213> Bacillus subtilis <400> 1
atgtcacagc acgttgaaac gaaattagct caaattggga accgtagcga tgaagtcacg 60 ggaacagtga gtgctcctat ctatttatca acagcatacc gccacagagg gatcggagaa 120 tctaccggat ttgattatgt ccgcacaaaa aatccgacac gccagcttgt tgaggacgcg 180 atcgctaact tagaaaacgg cgcgagaggg cttgccttta gttcgggaat ggctgctatc 240 caaacgatta tggcgctgtt taaaagcgga gatgaactga tcgtttcatc ggacctatat 300 ggcggcacgt accgtttatt tgaaaatgaa tggaaaaaat acggattgac ttttcattat 360 gatgatttca gcgatgagga ctgtttacgc tctaagatta cgccgaatac aaaagcggtg 420 tttgtggaaa cgccgacaaa ccccctcatg caggaggcgg acattgaaca tattgcccgg 480 attacaaagg agcacggtct tctgctgatc gtagataata cattttatac accggtcttg 540 cagcggccgc ttgagctggg agctgacatt gtcattcaca gcgcaaccaa gtatttaggc 600 gggcataacg atctgcttgc tggacttgtc gtggtgaagg atgagcggct cggagaggaa 660 atgtttcagc atcaaaatgc aatcggcgcc gtcctgccgc catttgattc gtggcttctg 720 atgagaggaa tgaagacgct gagcctcaga atgcgccagc atcaggcaaa cgcgcaggag 780 cttgcggcgt ttttagaaga gcaggaagaa atttcggatg tgctgtatcc cggaaaaggc 840 ggcatgctgt ccttccgtct gcaaaaagaa gaatgggtca atccgttttt aaaagcactg 900 aagaccattt gttttgcaga aagcctcggc ggggtggaaa gctttattac ataccctgcg 960 acccagacgc acatggatat tcctgaagag atccgcatcg caaacggggt gtgcaatcgg 1020 ttgctgcgct tttctgtcgg tattgaacat gcggaagatt taaaagagga tctaaaacag 1080 gcattatgtc aggtcaaaga gggagctgtt tcatttgagt aa 1122
<210> 2 <211> 373 <212> PRT
<213> Bacillus subtilis
<400> 2
Met Ser Gln His Val Glu Thr Lys Leu Ala Gln Ile Gly Asn Arg Ser 15 10 15
Asp Glu Val Thr Gly Thr Val Ser Ala Pro Ile Tyr Leu Ser Thr Ala 20 25 30 Tyr Arg His Arg Gly Ile Gly Glu Ser Thr Gly Phe Asp Tyr Val Arg 35 40 45
Thr Lys Asn Pro Thr Arg Gln Leu Val Glu Asp Ala Ile Ala Asn Leu 50 55 60
Glu Asn Gly Ala Arg Gly Leu Ala Phe Ser Ser Gly Met Ala Ala Ile 65 70 75 80
Gln Thr Ile Met Ala Leu Phe Lys Ser Gly Asp Glu Leu Ile Val Ser 85 90 95
Ser Asp Leu Tyr Gly Gly Thr Tyr Arg Leu Phe Glu Asn Glu Trp Lys 100 105 110
Lys Tyr Gly Leu Thr Phe His Tyr Asp Asp Phe Ser Asp Glu Asp Cys 115 120 125
Leu Arg Ser Lys Ile Thr Pro Asn Thr Lys Ala Val Phe Val Glu Thr 130 135 140
Pro Thr Asn Pro Leu Met Gln Glu Ala Asp Ile Glu His Ile Ala Arg 145 150 155 160
Ile Thr Lys Glu His Gly Leu Leu Leu Ile Val Asp Asn Thr Phe Tyr 165 170 175
Thr Pro Val Leu Gln Arg Pro Leu Glu Leu Gly Ala Asp Ile Val Ile 180 185 190
His Ser Ala Thr Lys Tyr Leu Gly Gly His Asn Asp Leu Leu Ala Gly 195 200 205
Leu Val Val Val Lys Asp Glu Arg Leu Gly Glu Glu Met Phe Gln His 210 215 220
Gln Asn Ala Ile Gly Ala Val Leu Pro Pro Phe Asp Ser Trp Leu Leu 225 230 235 240
Met Arg Gly Met Lys Thr Leu Ser Leu Arg Met Arg Gln His Gln Ala 245 250 255
Asn Ala Gln Glu Leu Ala Ala Phe Leu Glu Glu Gln Glu Glu Ile Ser 260 265 270
Asp Val Leu Tyr Pro Gly Lys Gly Gly Met Leu Ser Phe Arg Leu Gln 275 280 285
Lys Glu Glu Trp Val Asn Pro Phe Leu Lys Ala Leu Lys Thr Ile Cys 290 295 300
Phe Ala Glu Ser Leu Gly Gly Val Glu Ser Phe Ile Thr Tyr Pro Ala 305 310 315 320
Thr Gln Thr His Met Asp Ile Pro Glu Glu Ile Arg Ile Ala Asn Gly 325 330 335
Val Cys Asn Arg Leu Leu Arg Phe Ser Val Gly Ile Glu His Ala Glu 340 345 350
Asp Leu Lys Glu Asp Leu Lys Gln Ala Leu Cys Gln Val Lys Glu Gly 355 360 365 Ala Val Ser Phe Glu 370
<210> 3
<211> 195
<212> DNA
<213> Seqüência artificial
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<223> Descrição de Seqüência artificial: Seqüência promotora sintética
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gctattgacg acagctatgg ttcactgtcc accaaccaaa actgtgctca gtaccgccaa 60 tatttctccc ttgaggggta caaagaggtg tccctagaag agatccacgc tgtgtaaaaa 120 ttttacaaaa aggtattgac tttccctaca gggtgtgtaa taatttaatt acaggcgggg 180 gcaaccccgc ctgtt 195
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<211> 156
<212> DNA
<213> Seqüência artificial
<220>
<223> Descrição de Seqüência artificial: Seqüência promotora sintética
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ccttaaagtt tggctgccat gtgaattttt agcaccctca acagttgagt gctggcactc 60 tcgggggtag agtgccaaat aggttgtttg acacacagtt gttcacccgc gacgacggct 120 gtgctggaaa cccacaaccg gcacacacaa aatttt 156
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<212> DNA
<213> Seqüência artificial
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<223> Descrição de Seqüência artificial: Oligonucleotideo sintético
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tctagaagga ggagaaaaca tg 22
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<212> DNA
<213> Seqüência artificial
<220>
<223> Descrição de Seqüência artificial: Oligonucleotideo sintético
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tctagaccag gaggacatac agtg 24
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<212> DNA
<213> Seqüência artificial <220>
<223> Descrição de Seqüência artificial: Seqüência de vetor sintética
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<210> 8 <211> 12383 <212> DNA <213> Seqüência artificial <220> <223> Descrição de Seqüência artificial: Seqüência de vetor sintética
<400> 8 ggatcggcgg ccagggccct catgagatat cgagtcagcg ctgtattgcc cgtgaagttg 60 atggtgtttc cgctgccctg ctgggtggga ttggaggtgt aatcaatgaa ccaaccagga 120 gttccggtgc cagtgagatc aaataccacg cggtcaaagc cactgtgaga gccaatccga 180 acatcggtga ccatgagctg gagtcttcat tgcaggcgca tcaggtcgga tgctacatcg 240 gcttcgccca atgcggttgg gccggtggaa gcttcgttgg acaactgtgc gccatccgca 300 gttgcggaca tagtttgggt tacagaagaa gcatcgttgg tggtggaatt ggaggttcca 360 caacccgcaa gagtcaacgc gctagcgccg acaatcgcta gagtcttcag gcgggcacga 420 tgctttgaat gagaagttgg ctgcacaatc atgcacacac cgtaaccctg ggtcaccccc 480 gaaacctaag caagacgccc aatttcgctc aatcgtgaac gaattgttgt aattcgtctt 540 aaaaacgcca ggagacgtga aaattacaga caccccagac atcagatgga ggcggcgata 600 ctagggtaga ggacatgact cttcgctgtt ctgacgtcaa tgttgaaccc ctgccgggaa 660 cggcaaaaac aggttctggg tttgttctcc ttgaacatgc tggctcgtgg agccgtgatg 720 ttttagacgg cggaacattt gatcctgagt tgactgatca attgaagagg cacctgaaag 780 cttccggaat gggtctgcaa ttaattagga agccgggaag ggagggtcga aacgtcgaaa 840 agcataatct ttttctcgtt tttgctgagg cctcaattat tgagcacctg gtggtggacg 900 cgccggctga tgttttggat cttgatttaa gcgggccggg caaaaacaat gcgcagcgca 960 tggatgatcc gatgctgctg atttgtacgc attcgaagcg cgatgtgtgc tgcgcgatca 1020 aggggcgtcc gctggcagct gccgtggagc cacaatttgg gccgctgcat gtgtgggagg 1080 cttcgcacac caagggccac cgttttgcgc catcgatgct gctcatgccg tggaattact 1140 cttatggcct acttgatgag gccgaaaccg tgcagctttt ccaaggcgcg ttggacaaca 1200 aactcttcct gccgggcaac cgtggccgag gaaccttaga tgctcgtggc caggttgcag 1260 aaattgccgt ggcggaagct ttcggcgagg cggttgctcc tgcgagtttg caggttgaat 1320 tcgaagatga ttctgttttg gttactcatc aacgcatcga ggtcgacggc gtggtgtcct cgtgggtggc taggcaagtt acagaactga ttgctattag cagtatcgtt atcacagcac tccaactgcg attagcctgt tcacaactgg taaatacgta agttagaatc gcaatcccga ctaacacagc agctagtaaa taaagtacta ttacagtggc aattgagctg cggccgcaca gctgtgtcga ccttaaagtt tggctgccat gctggcactc tcgggggtag agtgccaaat gacgacggct gtgctggaaa cccacaaccg gcttgttgat acactaatgc ttttatatag ctgacgtaag attacgggtc gaccgggaaa cagcacatcc ccctttcgcc agctggcgta cccaaca.gt tgcgcagcctg aatggcgaat cggtgccgga aagctggctg gagtgcgatc caaactggca gatgcacggt tacgatgcgc cggtcaatcc gccgtttgtt cccacggaga atgttgatga aagctggcta caggaaggcc cggcgtttca tctgtggtgc aacgggcgct cgtctgaatt tgacctgagc gcatttttac tgctgcgttg gagtgacggc agttatctgg ttttccgtga cgtctcgttg ctgcataaac ccactcgctt taatgatgat ttcagccgcg gcgagttgcg tgactaccta cgggtaacag ccagcggcac cgcgcctttc ggcggtgaaa gcgtcacact acgtctgaac gtcgaaaacc tctatcgtgc ggtggttgaa ctgcacaccg gcgatgtcgg tttccgcgag gtgcggattg cgttgctgat tcgaggcgtt aaccgtcacg atgagcagac gatggtgcag gatatcctgc gctgttcgca ttatccgaac catccgctgt atgtggtgga tgaagccaat attgaaaccc atgatccgcg ctggctaccg gcgatgagcg gtaatcaccc gagtgtgatc atctggtcgc acgacgcgct gtatcgctgg atcaaatctg gcggcggagc cgacaccacg gccaccgata aagaccagcc cttcccggct gtgccgaaat gagagacgcg cccgctgatc ctttgcgaat gtttcgctaa atactggcag gcgtttcgtc gggactgggt ggatcagtcg ctgattaaat acggcggtga ttttggcgat acgccgaacg ttgccgaccg cacgccgcat ccagcgctga agttccgttt atccgggcaa accatcgaag ataacgagct cctgcactgg atggtggcgc tgcctctgga tgtcgctcca caaggtaaac cggagagcgc cgggcaactc tggctcacag ggtcagaagc cgggcacatc agcgcctggc tgacgctccc cgccgcgtcc cacgccatcc gcatcgagct gggtaataag cgttggcaat tgtggattgg cgataaaaaa caactgctga cgctggataa cgacattggc gtaagtgaag aacgctggaa ggcggcgggc cattaccagg atacacttgc tgatgcggtg ctgattacga ccttatttat cagccggaaa acctaccgga ttgatgttga agtggcgagc gatacaccgc tggcgcaggt agcagagcgg gtaaactggc accgccttac tgccgcctgt tttgaccgct cgtacgtctt cccgagcgaa aacggtctgc cacaccagtg gcgcggcgac ttccagttca tggaaaccag ccatcgccat ctgctgcacg gtttccatat ggggattggt ggcgacgact agctgagcgc cggtcgctac cattaccagt
ccgatgggcg cacgtgggtt gtggagcttg 1380 cgtgtggtga tcagccgaaa actggaaaag 1440 tcggataaaa gcagagttat atctgatgaa 1500 caacaaagta gttcagccac aggaaaactt 1560 catctgtaat gttccaaaat cgtgcggcat 1620 tgatccacgc cggattaggc aaagtagtga 1680 ctgaaagccg aatggctcca cgcgccccaa 1740 gcgatcccag aggaaatatc ctctggggtc 1800 gtgaattttt agcaccctca acagttgagt 1860 aggttgtttg acacacagtt gttcacccgc 1920 gcacacacaa aatttttcta gagatcccca 1980 ggaaaaggtg gtgaactact gtggaagtta 2040 accctggcgt tacccaactt aatcgccttg 2100 atagcgaaga ggcccgcacc gatcgccctt 2160 ggcgctttgc ctggtttccg gcaccagaag 2220 ttcctgaggc cgatactgtc gtcgtcccct 2280 ccatctacac caacgtaacc tatcccatta 2340 atccgacggg ttgttactcg ctcacattta 2400 agacgcgaat tatttttgat ggcgttaact 2460 gggtcggtta cggccaggac agtcgtttgc 2520 gcgccggaga aaaccgcctc gcggtgatgg 2580 aagatcagga tatgtggcgg atgagcggca 2640 cgactacaca aatcagcgat ttccatgttg 2700 ctgtactgga ggctgaagtt cagatgtgcg 2760 tttctttatg gcagggtgaa acgcaggtcg 2820 ttatcgatga gcgtggtggt tatgccgatc 2880 cgaaactgtg gagcgccgaa atcccgaatc 2940 ccgacggcac gctgattgaa gcagaagcct 3000 aaaatggtct gctgctgctg aacggcaagc 3060 agcatcatcc tctgcatggt caggtcatgg 3120 tgatgaagca gaacaacttt aacgccgtgc 3180 ggtacacgct gtgcgaccgc tacggcctgt 3240 acggcatggt gccaatgaat cgtctgaccg 3300 aacgcgtaac gcgaatggtg cagcgcgatc 3360 tggggaatga atcaggccac ggcgctaatc 3420 tcgatccttc ccgcccggtg cagtatgaag 3480 ttatttgccc gatgtacgcg cgcgtggatg 3540 ggtccatcaa aaaatggctt tcgctacctg 3600 acgcccacgc gatgggtaac agtcttggcg 3660 agtatccccg tttacagggc ggcttcgtct 3720 atgatgaaaa cggcaacccg tggtcggctt 3780 atcgccagtt ctgtatgaac ggtctggtct 3840 cggaagcaaa acaccagcag cagtttttcc 3900 tgaccagcga atacctgttc cgtcatagcg 3960 tggatggtaa gccgctggca agcggtgaag 4020 agttgattga actgcctgaa ctaccgcagc 4080 tacgcgtagt gcaaccgaac gcgaccgcat 4140 agcagtggcg tctggcggaa aacctcagtg 4200 cgcatctgac caccagcgaa atggattttt 4260 ttaaccgcca gtcaggcttt ctttcacaga 4320 cgccgctgcg cgatcagttc acccgtgcac 4380 cgacccgcat tgaccctaac gcctgggtcg 4440 ccgaagcagc gttgttgcag tgcacggcag 4500 ccgctcacgc gtggcagcat caggggaaaa 4560 ttgatggtag tggtcaaatg gcgattaccg 4620 atccggcgcg gattggcctg aactgccagc 4680 tcggattagg gccgcaagaa aactatcccg 4740 gggatctgcc attgtcagac atgtataccc 4800 gctgcgggac gcgcgaattg aattatggcc 4860 acatcagccg ctacagtcaa cagcaactga 4920 cggaagaagg cacatggctg aatatcgacg 4980 cctggagccc gtcagtatcg gcggaatttc 5040 tggtctggtg tcaaaaataa taataaccgg 5100 gcaggccatg tctgcccgta tttcgcgtaa agggcttttc ttttaccggt accagctcag tactgctcca aggatctgac tggccatgcc catcgctgct gaaggagatg ttccagtgat gtgagtagaa gatgttagag catcgataaa tgaataagca atcactgcta gcactgagag aaatatgaaa agaataacta ggaaaggaat gctgtgggaa cttttcggta gcacggcccc atcagattcg taatcaaaaa catcgttgat aaaaaatacg atgcctagcc aaaacagcca cagaccaaag gggtaggcgg tattgatcca tcttattttt tccatcatga ctacggcttt gtagtgatgc ttccattggc gatggtgggt ttaaacatat ttccaggcaa ccatagggca aaaagatcct ctagggggat taaaccgagc ccaaagagat cagcccaaac catgaggtta agggcactga cagcggtgat tggtaaaagt aataggacca tggctattgc taaaaaagga cctcgggagt ggtagttggt tggaaagtat cgggtttttt aggcagtggt gctttaagcc tgatgtagca gaggaagaat aagaaaaaaa taataccgga cataaacgct gagtctccgc tatcccataa aagaaatcca atatatgcag ggcggaagaa cgctagcttc caacggtggt ggagagtacc tagataaata aaggccataa tatcgatgat agggatcaaa atttaatgat taggcggcaa tggttcggct cacgcgtccc gaagcggaac acgtagaaag ccagtccgca ctactgggct atctggacaa gggaaaacgc tgggcttaca tggcgatagc tagactgggc gccagctggg gcgccctctg gtaaggttgg cttgccgcca aggatctgat ggcgcagggg atcgtttcgc atgattgaac aagatggatt gaggctattc ggctatgact gggcacaaca ccggctgtca gcgcaggggc gcccggttct gaatgaactg caggacgagg cagcgcggct cgcagctgtg ctcgacgttg tcactgaagc gccggggcag gatctcctgt catctcacct tgatgcaatg cggcggctgc atacgcttga gaaacatcgc atcgagcgag cacgtactcg tctggacgaa gagcatcagg ggctcgcgcc catgcccgac ggcgaggatc tcgtcgtgac ggtggaaaat ggccgctttt ctggattcat ctatcaggac atagcgttgg ctacccgtga tgaccgcttc ctcgtgcttt acggtatcgc tcgccttctt gacgagttct tctgagcggg acgcccaacc tgccatcacg agatttcgat ttcggaatcg ttttccggga cgccggctgg gagttcttcg cccacgctag tttaaactgc aggatctgga tttcgatcac ggcacgatca gggccttgat gttacccgag agcttggcac gtggatgacc ttttgaatga cctttaatag aggtcccctt ttttatttta aaaatttttt tgctgcccgc aaacgggctg ttctggtgtt cttcaggttt gccggctgaa agcgctattt gggaggcgtc actggctccc gtgttgtcgg tttcaggctg tctatgtgtg actgttgagc atgttctagt tgctttgttt tactggtttc atctgttaca ttgtcgatct gttcatggtg aagctctgat gtatctatct tttttacacc ctttgatatc taacggtgaa cagttgttct gatagataca agagccataa gaacctcaga gtgtggttcg ttgtttttgc gtgagccatg
ggggatccgc cctcccgcac gctttgcggg 5160 attagcttcc cggtctgcat taacatcctg 5220 ccacaagaaa aaggatccca gtgctatcca 5280 cgttgcaccg attaatgcag gtgaagtgaa 5340 ggggcgttct ttaaaacgca atttcggtgc 5400 tgtcagccat aaagacgaca tccaggtgcc 5460 tgttgagata gccgaggccc ataacagtgt 5520 ctcgacgccg cctttgcggg gattacgcat 5580 accatacatg gcgatgttat acgggataag 5640 gtcaatctct cctgcattta ataggtaggc 5700 gctaatgggg cgagatgaca atagaattag 5760 tctggctcag attgcgtggt ggtggatcta 5820 aaggaatggt gtggacgttt tttcctgcgt 5880 ggaatcagaa gtactgcgaa gagcggatag 5940 caaatgccaa ggtgctgggt atcgccatat 6000 tcaaatatga tagttaggga acatagggta 6060 ttaggtgttc cagactgcag ctttaagaca 6120 atgcttataa aaatataagt catggttcaa 6180 cgcgctgtgg tgtgagggga gactttttac 6240 ataatgctgc tgccgaggta aggttgaggg 6300 gttcttcaat gggcatatgg ggtgcaaggt 6360 gataaaaagt gccagtaata atgccaaata 6420 cacctaccga aagaattgct cgtaacggat 6480 cgcacaaagc catgcaccca atgagaacta 654 0 aaatatcgct atcttgctca ttttgtgaaa 6600 cgtatgaggt cttttgagat ggtgtcgttt 6660 gggatttaaa 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tctcttcact aaaaactaat tctaattttt 9420 cgcttgagaa cttggcatag tttgtccact ggaaaatctc aaagccttta accaaaggat 9480 tcctgatttc cacagttctc gtcatcagct ctctggttgc tttagctaat acaccataag 9540 cattttccct actgatgttc atcatctgag cgtattggtt ataagtgaac gataccgtcc 9600 gttctttcct tgtagggttt tcaatcgtgg ggttgagtag tgccacacag cataaaatta 9660 gcttggtttc atgctccgtt aagtcatagc gactaatcgc tagttcattt gctttgaaaa 9720 caactaattc agacatacat ctcaattggt-ctaggtgatt ttaatcacta taccaattga 9780 gatgggctag tcaatgataa ttactagtcc ttttcctttg agttgtgggt atctgtaaat 9840 tctgctagac ctttgctgga aaacttgtaa attctgctag accctctgta aattccgcta 9900 gacctttgtg tgtttttttt gtttatattc aagtggttat aatttataga ataaagaaag 9960 aataaaaaaa gataaaaaga atagatccca gccctgtgta taactcacta ctttagtcag 10020 ttccgcagta ttacaaaagg atgtcgcaaa cgctgtttgc tcctctacaa aacagacctt 10080 aaaaccctaa aggcttaagt agcaccctcg caagctcggg caaatcgctg aatattcctt 10140 ttgtctccga ccatcaggca cctgagtcgc tgtctttttc gtgacattca gttcgctgcg 10200 ctcacggctc tggcagtgaa tgggggtaaa 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<223> Descrição de Seqüência artificial: Seqüência de vetor sintética
<400> 9
ggatcggcgg ccagggccct catgagatat cgagtggatt tgtgcaaaac tttcaggtgt 60 gcgatgcatg agaatctgcc caataaaatt aagtttgcct cggcgataga ggtctccgtc 120 aataacatcg tcatgaacca aaagggaaaa atgcagtagt tctaaagcca ctgctacctg 180 taaaacggtg ttgagtttga cctcaatgtc atcgtctaca agcgtgttgt atagccccag 240 tagcattcga gggcggatta acttgccacc tcgcaaagct tggaaagcag catctaggca 300 ggtacggaac tctggttgat atgtgctgca ctgttgagat agcgaagcgc agatgcggtt 360 tagttcccga taaatctcat cattgaaatc aagatcagga tgagttgaat gttctgtggt 420 gattgtcatg ccattgtcca ttcgagtatc acacggccag ttatctcgca aaaattccca 480 atcgttgtat atggcgcttt attttgatga agtacagaaa gtgtgaattt gggtccataa 540 aaataatgtg cctacaagaa atttatagta tcccatgagt taatattttt aaaaataaac 600 tttatctgac tttgtagaaa aaggtgatta ctatgctgaa tatgcaggaa ccagataaaa 660 tccatccggc agaacctaca cttcgtaata tttatgacgt taaaactagt gatcccaaaa 720 gtgaattagt tgatcgttct ggcatgtcgg aagaagacat tgcgcaaatt gggcggctaa 780 tgaaatcgtt ggccagtctt cgcgatgtgg aacgtagtat tggtgaagcc tcggcacgtt 840 atatggagct aagtgcccct gatatgcgag ctttgcacta tttgattgtg gcgggcaatg 900 cgggcgaagt ggtgactcca ggaatgcttg gagctgcggc cgcttcgcga agcttgtcga 960 ccgaaacagc agttataagg catgaagctg tccggttttt gcaaaagtgg ctgtgactgt 1020 aaaaagaaat cgaaaaagac cgttttgtgt gaaaacggtc tttttgtttc cttttaacca 1080 actgccataa ctcgaggcta ttgacgacag ctatggttca ctgtccacca accaaaactg 1140 tgctcagtac cgccaatatt tctcccttga ggggtacaaa gaggtgtccc tagaagagat 1200 ccacgctgtg taaaaatttt acaaaaaggt attgactttc cctacagggt gtgtaataat 1260 ttaattacag gcgggggcaa ccccgcctgt tctagagatc cccagcttgt tgatacacta 1320 atgcttttat atagggaaaa ggtggtgaac tactgtggaa gttactgacg taagattacg 1380 ggtcgaccgg gaaaaccctg gcgttaccca acttaatcgc cttgcagcac atcccccttt 1440 cgccagctgg cgtaatagcg aagaggcccg caccgatcgc ccttcccaac agttgcgcag 1500 cctgaatggc gaatggcgct ttgcctggtt tccggcacca gaagcggtgc cggaaagctg 1560 gctggagtgc gatcttcctg aggccgatac tgtcgtcgtc ccctcaaact ggcagatgca 1620 cggttacgat gcgcccatct acaccaacgt aacctatccc attacggtca atccgccgtt 1680 tgttcccacg gagaatccga cgggttgtta ctcgctcaca tttaatgttg atgaaagctg 1740 gctacaggaa ggccagacgc gaattatttt tgatggcgtt aactcggcgt ttcatctgtg 1800 gtgcaacggg cgctgggtcg gttacggcca ggacagtcgt ttgccgtctg aatttgacct 1860 gagcgcattt ttacgcgccg gagaaaaccg cctcgcggtg atggtgctgc gttggagtga 1920 cggcagttat ctggaagatc aggatatgtg gcggatgagc ggcattttcc gtgacgtctc 1980 gttgctgcat aaaccgacta cacaaatcag cgatttccat gttgccactc gctttaatga 2040 tgatttcagc cgcgctgtac tggaggctga agttcagatg tgcggcgagt tgcgtgacta 2100 cctacgggta acagtttctt tatggcaggg tgaaacgcag gtcgccagcg gcaccgcgcc 2160 tttcggcggt gaaattatcg atgagcgtgg tggttatgcc gatcgcgtca cactacgtct 2220 gaacgtcgaa aacccgaaac tgtggagcgc cgaaatcccg aatctctatc gtgcggtggt 2280 tgaactgcac accgccgacg gcacgctgat tgaagcagaa gcctgcgatg tcggtttccg 2340 cgaggtgcgg attgaaaatg gtctgctgct gctgaacggc aagccgttgc tgattcgagg 2400 cgttaaccgt cacgagcatc atcctctgca tggtcaggtc atggatgagc agacgatggt 2460 gcaggatatc ctgctgatga agcagaacaa ctttaacgcc gtgcgctgtt cgcattatcc 2520 gaaccatccg ctgtggtaca cgctgtgcga ccgctacggc ctgtatgtgg tggatgaagc 2580 caatattgaa acccacggca tggtgccaat gaatcgtctg accgatgatc cgcgctggct 2640 accggcgatg agcgaacgcg taacgcgaat ggtgcagcgc gatcgtaatc acccgagtgt 2700 gatcatctgg tcgctgggga atgaatcagg ccacggcgct aatcacgacg cgctgtatcg 2760 ctggatcaaa tctgtcgatc cttcccgccc ggtgcagtat gaaggcggcg gagccgacac 2820 cacggccacc gatattattt gcccgatgta cgcgcgcgtg gatgaagacc agcccttccc 2880 ggctgtgccg aaatggtcca tcaaaaaatg gctttcgcta cctggagaga cgcgcccgct 2940 gatcctttgc gaatacgccc acgcgatggg taacagtctt ggcggtttcg ctaaatactg 3000 gcaggcgttt cgtcagtatc cccgtttaca gggcggcttc gtctgggact gggtggatca 3060 gtcgctgatt aaatatgatg aaaacggcaa cccgtggtcg gcttacggcg gtgattttgg 3120 cgatacgccg aacgatcgcc agttctgtat gaacggtctg gtctttgccg accgcacgcc 3180 gcatccagcg ctgacggaag caaaacacca gcagcagttt ttccagttcc gtttatccgg 3240 gcaaaccatc gaagtgacca gcgaatacct gttccgtcat agcgataacg agctcctgca 3300 ctggatggtg gcgctggatg gtaagccgct ggcaagcggt gaagtgcctc tggatgtcgc 3360 tccacaaggt aaacagttga ttgaactgcc tgaactaccg cagccggaga gcgccgggca 3420
actctggctc acagtacgcg tagtgcaacc gaacgcgacc gcatggtcag aagccgggca 3480
catcagcgcc tggcagcagt ggcgtctggc ggaaaacctc agtgtgacgc tccccgccgc 3540
gtcccacgcc atcccgcatc tgaccaccag cgaaatggat ttttgcatcg agctgggtaa 3600
taagcgttgg caatttaacc gccagtcagg ctttctttca cagatgtgga ttggcgataa 3660
aaaacaactg ctgacgccgc tgcgcgatca gttcacccgt gcaccgctgg ataacgacat 3720
tggcgtaagt gaagcgaccc gcattgaccc taacgcctgg gtcgaacgct ggaaggcggc 3780
gggccattac caggccgaag cagcgttgtt gcagtgcacg gcagatacac ttgctgatgc 3840
ggtgctgatt acgaccgctc acgcgtggca gcatcagggg aaaaccttat ttatcagccg 3900
gaaaacctac cggattgatg gtagtggtca aatggcgatt accgttgatg ttgaagtggc 3960
gagcgataca ccgcatccgg cgcggattgg cctgaactgc cagctggcgc aggtagcaga 4020
gcgggtaaac tggctcggat tagggccgca agaaaactat cccgaccgcc ttactgccgc 4080
ctgttttgac cgctgggatc tgccattgtc agacatgtat accccgtacg tcttcccgag 4140
cgaaaacggt ctgcgctgcg ggacgcgcga attgaattat ggcccacacc agtggcgcgg 4200
cgacttccag. ttcaacatca gccgctacag tcaacagcaa ctgatggaaa ccagccatcg 4260
ccatctgctg cacgcggaag aaggcacatg gctgaatatc gacggtttcc atatggggat 4320
tggtggcgac gactcctgga gcccgtcagt atcggcggaa tttcagctga gcgccggtcg 4380
ctaccattac cagttggtct ggtgtcaaaa ataataataa ccgggcaggc catgtctgcc 4440
cgtatttcgc gtaaggggat ccgccctccc gcacgctttg cgggagggct tttcttttac 4500
cggtaccagc tcaccttaag ctttccccgg catctgtaac aaagacgctt aataggctag 4560
aaaaaggtgg gcatattgtt cgtaatgtgc accccgtcga ccgcagggct ttcgccctca 4620
tggtcactga tgccactcgt ggagaggcga tgcggacgct tggtaagcat caggcgcgtc 4680
gttttgatgc tgctaaacga ttaactccac aagagcgtga agtggttatc cgattccttc 4740
aggatatggc acaggagtta tcccttaata atgcaccatg gctcaacacg gagtagatga 4800
ccatctacgt taattaaagt gtgcagagcg gagtggcggt gtttaagcca cctgtcgctg 4860
ggactgtaat gaatgcgcat ggccaccacc cactgtcctc tgtaatgttc cgaacgtgag 4920
accattggtc actactgagc tgtggcgtgc gggatagtat aaatcctgag gaccggcttg 4980
ggctgccgac gattgctagt gaataatcat cttcgatata ggtcacgcgg tagtttgctt 5040
gattgtcttc actctgaaat ggaatacctg ggaagctaac ctttaatgaa gcattggaaa 5100
ctactttagc gctgccttca ataactgaag gcccaaagaa agtgccacac ttatttgtta 5160
cagagattgt gtccgagtcg atcacgccgt aatcagcggt aacgtcatgt gagcactgta 5220
aagagaatgg ttggggaatt gctgcgactt gataccactt gcctttgtag cgttctaggt 5280
caatgctatt ttcaatttcg ggcagcgcta ggttttcagg aaccgaactt aggttagata 5340
cctgcgagga gccacctgca agtcgtccgc cgtcaaaaat gtcttgggct tgtgccgtgg 5400
atatcccgaa aagtgaaatg gctgcgagta gtgctgtggt gacaagtttg cttgaaatgc 5460
gcataaagca aatcctttct tcatgtttat attaactcaa tagttattac ttctaaaagt 5520
atagtagata gttgtggatg ggtgaagaat ttcatagaaa tcgcactcga ttcactaaag 5580
acccaagagt aaaatcccag gatttgctta tacttgcgct catggataat caacttcgtc 5640
ccactttgca ttatcaagct caaaacccgc accctcacgc gtcccgggat ttaaatcgct 5700
agcgggctgc taaaggaagc ggaacacgta gaaagccagt ccgcagaaac ggtgctgacc 5760
ccggatgaat gtcagctact gggctatctg gacaagggaa aacgcaagcg caaagagaaa 5820
gcaggtagct tgcagtgggc ttacatggcg atagctagac tgggcggttt tatggacagc 5880
aagcgaaccg gaattgccag ctggggcgcc ctctggtaag gttgggaagc cctgcaaagt 5940
aaactggatg gctttcttgc cgccaaggat ctgatggcgc aggggatcaa gatctgatca 6000
agagacagga tgaggatcgt ttcgcatgat tgaacaagat ggattgcacg caggttctcc 6060
ggccgcttgg gtggagaggc tattcggcta tgactgggca caacagacaa tcggctgctc 6120
tgatgccgcc gtgttccggc tgtcagcgca ggggcgcccg gttctttttg tcaagaccga 6180
cctgtccggt gccctgaatg aactgcagga cgaggcagcg cggctatcgt ggctggccac 6240
gacgggcgtt ccttgcgcag ctgtgctcga cgttgtcact gaagcgggaa gggactggct 6300
gctattgggc gaagtgccgg ggcaggatct cctgtcatct caccttgctc ctgccgagaa 6360
agtatccatc atggctgatg caatgcggcg gctgcatacg cttgatccgg ctacctgccc 6420
attcgaccac caagcgaaac atcgcatcga gcgagcacgt actcggatgg aagccggtct 6480
tgtcgatcag gatgatctgg acgaagagca tcaggggctc gcgccagccg aactgttcgc 6540
caggctcaag gcgcgcatgc ccgacggcga ggatctcgtc gtgacccatg gcgatgcctg 6600
cttgccgaat atcatggtgg aaaatggccg cttttctgga ttcatcgact gtggccggct 6660
gggtgtggcg gaccgctatc aggacatagc gttggctacc cgtgatattg ctgaagagct 6720
tggcggcgaa tgggctgacc gcttcctcgt gctttacggt atcgccgctc ccgattcgca 6780
gcgcatcgcc ttctatcgcc ttcttgacga gttcttctga gcgggactct ggggttcgaa 6840
atgaccgacc aagcgacgcc caacctgcca tcacgagatt tcgattccac cgccgccttc 6900
tatgaaaggt tgggcttcgg aatcgttttc cgggacgccg gctggatgat cctccagcgc 6960
ggggatctca tgctggagtt cttcgcccac gctagtttaa actgcggatc agtgagggtt 7020
tgtaactgcg ggtcaaggat ctggatttcg atcacggcac gatcatcgtg cgggagggca 7080 agggctccaa ggatcgggcc ttgatgttac aggggaattg atccggtgga tgaccttttg aattggggac cctagaggtc ccctttttta aagcataacg ggttttgctg cccgcaaacg gaatcgcaga tccggcttca ggtttgccgg tgattttttc cccacgggag gcgtcactgg aagcagcatc gcctgtttca ggctgtctat caggtgttca atttcatgtt ctagttgctt tgttacatgc tgttcatctg ttacattgtc accaaaaact cgtaaaagct ctgatgtatc tatggacagt tttccctttg atatctaacg tcttgatgct tcactgatag atacaagagc ccagtatgtt ctctagtgtg gttcgttgtt gatcatgctt actttgcatg tcactcaaaa ttgcagttaa agcatcgtgt agtgtttttc taatggttgt tggtattttg tcaccattca cgagatccat ttgtctatct agttcaactt gcttatcaac caccaatttc atattgctgt aaacccattg gttaagcctt ttaaactcat taaattcatc aaggctaatc tctatatttg ttaataacca ctcataaatc ctcatagagt gattatattt tatgaatttt tttaactgga ctaattctaa tttttcgctt gagaacttgg ctttaaccaa aggattcctg atttccacag ctaatacacc ataagcattt tccctactga tgaacgatac cgtccgttct ttccttgtag cacagcataa aattagcttg gtttcatgct catttgcttt gaaaacaact aattcagaca cactatacca attgagatgg gctagtcaat tgggtatctg taaattctgc tagacctttg ctgtaaattc cgctagacct ttgtgtgttt atagaataaa gaaagaataa aaaaagataa cactacttta gtcagttccg cagtattaca tacaaaacag accttaaaac cctaaaggct cgctgaatat tccttttgtc tccgaccatc attcagttcg ctgcgctcac ggctctggca cttttatgga ttcatgcaag gaaactaccc tcagggcgtt ttatggcggg tctgctatgt ttcctgccct ctgattttcc agtctgacca actggctaat gcacccagta aggcagcggt gcattttctt ttgcgttttt atttgttaac tttgacaaca gatgttttct tgcctttgat ttgtttgtct gcgtagaatc ctctgtttgt tttcgcttga ggtacagcga agtgtgagta catttttaac acaaggccag ttttgttcag aacataacca agcatgtaaa tatcgttaga gcgggagtca gtgaacaggt accatttgcc ttcatctgtt actgtgttag atgcaatcag atcgtttagc tcaatcatac cgagagcgcc gctttgcaga agtttttgac tttcttgacg tttgttaaat aaagattctt cgccttggta tactaagtat ttgtggcctt tatcttctac gcctgagctg tagttgcctt catcgatgaa accgtcaaag attgatttat aatcctctac tgatacgtta acttgtgcag ttgtcagtgt agtgtagaat aaacggattt ttccgtcaga tgtttggtct tttaggatag aatcatttgc gccagcgttt ttccagctgt caatagaagt cgatgtgtca tccgcatttt taggatctcc atagtttgcg acagtgccgt cagcgttttg ttttgcagaa gagatatttt taattgtgga atttttttgc tgttcaggga tttgcagcat tgtttcctta tatggctttt ggttcgtttc
ccgagagctt ggcacccagc ctgcgcgagc 7140 aatgaccttt aatagattat attactaatt 7200 ttttaaaaat tttttcacaa aacggtttac 7260 ggctgttctg gtgttgctag tttgttatca 7320 ctgaaagcgc tatttcttcc agaattgcca 7380 ctcccgtgtt gtcggcagct ttgattcgat 7440 gtgtgactgt tgagctgtaa caagttgtct 7500 tgttttactg gtttcacctg ttctattagg 7560 gatctgttca tggtgaacag ctttaaatgc 7620 tatctttttt acaccgtttt catctgtgca 7680 gtgaacagtt gttctacttt tgtttgttag 7740 cataagaacc tcagatcctt ccgtatttag 7800 tttgcgtgag ccatgagaac gaaccattga 7860 attttgcctc aaaactggtg agctgaattt 7920 ttagtccgtt acgtaggtag gaatctgatg 7980 tttttatctg gttgttctca agttcggtta 8040 ggaaaatcaa cgtatcagtc gggcggcctc 8100 aagtgtttaa atctttactt attggtttca 8160 ggtagttatt ttcaagcatt aacatgaact 8220 ccttgtgagt tttcttttgt gttagttctt 8280 atttgttttc aaaagactta acatgttcca 8340 aaagataagg caatatctct tcactaaaaa 8400 catagtttgt ccactggaaa atctcaaagc 8460 ttctcgtcat cagctctctg gttgctttag 8520 tgttcatcat ctgagcgtat tggttataag 8580 ggttttcaat cgtggggttg agtagtgcca 8640 ccgttaagtc atagcgacta atcgctagtt 8700 tacatctcaa ttggtctagg tgattttaat 8760 gataattact agtccttttc ctttgagttg 8820 ctggaaaact tgtaaattct gctagaccct 8880 tttttgttta tattcaagtg gttataattt 8940 aaagaataga tcccagccct gtgtataact 9000 aaaggatgtc gcaaacgctg tttgctcctc 9060 taagtagcac cctcgcaagc tcgggcaaat 9120 aggcacctga gtcgctgtct ttttcgtgac 9180 gtgaatgggg gtaaatggca ctacaggcgc 9240 ataatacaag aaaagcccgt cacgggcttc 9300 ggtgctatct gactttttgc tgttcagcag 9360 cttcggatta tcccgtgaca ggtcattcag 9420 atcatcaaca ggcttagttt aaacccatcg 9480 tgttaattgt ccttgttcaa ggatgctgtc 9540 gttcagcagg aagctcggcg caaacgttga 9600 catatagctt gtaatcacga cattgtttcc 9660 agtaaaggtt acatcgttag gatcaagatc 9720 cggcttgtat gggccagtta aagaattaga 9780 cgtaatgccg tcaatcgtca tttttgatcc 9840 gttcatttta aagacgttcg cgcgttcaat 9900 cggtttcatc acttttttca gtgtgtaatc 9960 gtttgctaac tcagccgtgc gttttttatc 10020 gaagaatgat gtgcttttgc catagtatgc 10080 gccatcttca gttccagtgt ttgcttcaaa 10140 gtagtgagga tctctcagcg tatggttgtc 10200 ctgctgtaca ttttgatacg tttttccgtc 10260 accgttgatg ttcaaagagc tgtctgatgc 10320 ttgtttgccg taatgtttac cggagaaatc 10380 tgtaaatgtg gctgaacctg accattcttg 10440 atcgaatttg tcgctgtctt taaagacgcg 10500 ttcgccgact ttttgataga acatgtaaat 10560 ggctaatgca aagacgatgt ggtagccgtg 10620 taatggccag ctgtcccaaa cgtccaggcc 10680 cgaatcaaat tcagaaactt gatatttttc 10740 atcatggcgt gtaatatggg aaatgccgta 10800 tttcgcaaac gcttgagttg cgcctcctgc 10860 cagcagtgcg gtagtaaagg ttaatactgt cgttcatgtc tcctttttta tgtactgtgt tgaagatggc aagttagtta cgcacaataa ccaaagtata cactttgccc tttacacatt cccgcgcgat ttacttttcg acctcattct tattttcctc ttttgtttga tagaaaatca aactaaaaaa tctatctgtt tcttttcatt ggcataaagt tgccttttta atcacaattc ataatagtga acggcaggta tatgtgatgg
tgcttgtttt gcaaactttt tgatgttcat 10920 tagcggtctg cttcttccag ccctcctgtt 10980 aaaaagacct aaaatatgta aggggtgacg 11040 ttaggtcttg cctgctttat cagtaacaaa 11100 attagactct cgtttggatt gcaactggtc 11160 taaaaggatt tgcagactac gggcctaaag 11220 ctctgtattt tttatagttt ctgttgcatg 11280 agaaaatatc ataatatctc atttcactaa 11340 gttaaaaa 11378
<210> 10 <211> 10322 <212> DNA
<213> Seqüência artificial
<220>
<223> Descrição de Seqüência artificial: Seqüência de plasmídeo sintética
<400> 10
ggatcggcgg ccagggecct catgagatat cgagtcagcg ctgtattgcc cgtgaagttg 60 atggtgtttc cgctgccctg ctgggtggga ttggaggtgt aatcaatgaa ccaaccagga 120 gttccggtgc cagtgagatc aaataccacg cggtcaaagc cactgtgaga gccaatccga 180 acatcggtga ccatgagctg tgcaggcgca tcaggtcgga gagtcttcat tgctacatcg 240 gcttcgccca atgcggttgg gccggtggaa gcttcgttgg acaactgtgc gccatccgca 300 gttgcggaca tagtttgggt tacagaagaa gcatcgttgg tggtggaatt ggaggttcca 360 caacccgcaa gagtcaacgc gctagcgccg acaatcgcta gagtcttcag gcgggcacga 420 tgctttgaat gagaagttgg ctgcacaatc atgcacacac cgtaaccctg ggtcaccccc 480 gaaacctaag caagacgccc aatttcgctc aatcgtgaac gaattgttgt aattcgtctt 540 aaaaacgcca ggagacgtga aaattacaga caccccagac atcagatgga ggcggcgata 600 ctagggtaga ggacatgact cttcgctgtt ctgacgtcaa tgttgaaccc ctgccgggaa 660 cggcaaaaac aggttctggg tttgttctcc ttgaacatgc tggctcgtgg agccgtgatg 720 ttttagacgg cggaacattt gatcctgagt tgactgatca attgaagagg cacctgaaag 780 cttccggaat gggtctgcaa ttaattagga agccgggaag ggagggtcga aacgtcgaaa 840 agcataatct ttttctcgtt tttgctgagg cctcaattat tgagcacctg gtggtggacg 900 cgccggctga tgttttggat cttgatttaa gcgggccggg caaaaacaat gcgcagcgca 960 tggatgatcc gatgctgctg atttgtacgc attcgaagcg cgatgtgtgc tgcgcgatca 1020 aggggcgtcc gctggcagct gccgtggagc cacaatttgg gccgctgcat gtgtgggagg 1080 cttcgcacac caagggccac cgttttgcgc catcgatgct gctcatgccg tggaattact 1140 cttatggcct acttgatgag gccgaaaccg tgcagctttt ccaaggcgcg ttggacaaca 1200 aactcttcct gccgggcaac cgtggccgag gaacctfaga tgctcgtggc caggttgcag 1260 aaattgccgt ggcggaagct ttcggcgagg cggttgctcc tgcgagtttg caggttgaat 1320 tcgaagatga ttctgttttg gttactcatc ccgatgggcg cacgtgggtt gtggagcttg 1380 aacgcatcga ggtcgacggc gtggtgtcct cgtgtggtga tcagccgaaa actggaaaag 1440 cgtgggtggc taggcaagtt acagaactga tcggataaaa gcagagttat atctgatgaa 1500 ttgctattag cagtatcgtt atcacagcac caacaaagta gttcagccac aggaaaactt 1560 tccaactgcg attagcctgt tcacaactgg catctgtaat gttccaaaat cgtgcggcat 1620 taaatacgta agttagaatc gcaatcccga tgatccacgc cggattaggc aaagtagtga 1680 ctaacacagc agctagtaaa taaagtacta ctgaaagccg aatggctcca cgcgccccaa 1740 ttacagtggc aattgagctg cggccgcaca gcgatcccag aggaaatatc ctctggggtc 1800 gctgtgtcga ccttaaagtt tggctgccat gtgaattttt agcaccctca acagttgagt 1860 gctggcactc tcgggggtag agtgccaaat aggttgtttg acacacagtt gttcacccgc 1920 gacgacggct gtgctggaaa cccacaaccg gcacacacaa aatttttcta gaaggaggag 1980 aaaacatgtc acagcacgtt gaaacgaaat tagctcaaat tgggaaccgt agcgatgaag 2040 tcacgggaac agtgagtgct cctatctatt tatcaacagc ataccgccac agagggatcg 2100 gagaatctac cggatttgat tatgtccgca caaaaaatcc gacacgccag cttgttgagg 2160 acgcgatcgc taacttagaa aacggcgcga gagggcttgc ctttagttcg ggaatggctg 2220 ctatccaaac gattatggcg ctgtttaaaa gcggagatga actgatcgtt tcatcggacc 2280 tatatggcgg cacgtaccgt ttatttgaaa atgaatggaa aaaatacgga ttgacttttc 2340
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<210> 11
<211> 10324
<212> DNA
<213> Seqüência artificial
<220>
<223> Descrição de Seqüência artificial: Seqüência de plasmideo sintética
<400> 11
ggatcggcgg ccagggccct catgagatat cgagtcagcg ctgtattgcc cgtgaagttg 60 atggtgtttc cgctgccctg ctgggtggga ttggaggtgt aatcaatgaa ccaaccagga 120 gttccggtgc cagtgagatc aaataccacg cggtcaaagc cactgtgaga gccaatccga 180 acatcggtga ccatgagctg tgcaggcgca tcaggtcgga gagtcttcat tgctacatcg 240 gcttcgccca atgcggttgg gccggtggaa gcttcgttgg acaactgtgc gccatccgca 300 gttgcggaca tagtttgggt tacagaagaa gcatcgttgg tggtggaatt ggaggttcca 360 caacccgcaa gagtcaacgc gctagcgccg acaatcgcta gagtcttcag gcgggcacga 420 tgctttgaat gagaagttgg ctgcacaatc atgcacacac cgtaaccctg ggtcaccccc 480 gaaacctaag caagacgccc aatttcgctc aatcgtgaac gaattgttgt aattcgtctt 540 aaaaacgcca ggagacgtga aaattacaga caccccagac atcagatgga ggcggcgata 600 ctagggtaga ggacatgact cttcgctgtt ctgacgtcaa tgttgaaccc ctgccgggaa 660 cggcaaaaac aggttctggg tttgttctcc ttgaacatgc tggctcgtgg agccgtgatg 720 ttttagacgg cggaacattt gatcctgagt tgactgatca attgaagagg cacctgaaag 780 cttccggaat gggtctgcaa ttaattagga agccgggaag ggagggtcga aacgtcgaaa 840 agcataatct ttttctcgtt tttgctgagg cctcaattat tgagcacctg gtggtggacg 900 cgccggctga tgttttggat cttgatttaa gcgggccggg caaaaacaat gcgcagcgca 960
tggatgatcc gatgctgctg atttgtacgc attcgaagcg cgatgtgtgc tgcgcgatca 1020 aggggcgtcc gctggcagct gccgtggagc cacaatttgg gccgctgcat gtgtgggagg 1080 cttcgcacac caagggccac cgttttgcgc catcgatgct gctcatgccg tggaattact 1140 cttatggcct acttgatgag gccgaaaccg tgcagctttt ccaaggcgcg ttggacaaca 1200 aactcttcct gccgggcaac cgtggccgag gaaccttaga tgctcgtggc caggttgcag 1260 aaattgccgt ggcggaagct ttcggcgagg cggttgctcc tgcgagtttg caggttgaat 1320 tcgaagatga ttctgttttg gttactcatc ccgatgggcg cacgtgggtt gtggagcttg 1380 aacgcatcga ggtcgacggc gtggtgtcct cgtgtggtga tcagccgaaa actggaaaag 1440 cgtgggtggc taggcaagtt acagaactga tcggataaaa gcagagttat atctgatgaa 1500 ttgctattag cagtatcgtt atcacagcac caacaaagta gttcagccac aggaaaactt 1560 tccaactgcg attagcctgt tcacaactgg catctgtaat gttccaaaat cgtgcggcat 1620 taaatacgta agttagaatc gcaatcccga tgatccacgc cggattaggc aaagtagtga 1680 ctaacacagc agctagtaaa taaagtacta ctgaaagccg aatggctcca cgcgccccaa 1740 ttacagtggc aattgagctg cggccgcaca gcgatcccag aggaaatatc ctctggggtc 1800 gctgtgtcga ccttaaagtt tggctgccat gtgaattttt agcaccctca acagttgagt 1860 gctggcactc tcgggggtag agtgccaaat aggttgtttg acacacagtt gttcacccgc 1920 gacgacggct gtgctggaaa cccacaaccg gcacacacaa aatttttcta gaccaggagg 1980 acatacagtg tcacagcacg ttgaaacgaa attagctcaa attgggaacc gtagcgatga 2040 agtcacggga acagtgagtg ctcctatcta tttatcaaca gcataccgcc acagagggat 2100 cggagaatct accggatttg attatgtccg cacaaaaaat ccgacacgcc agcttgttga 2160 ggacgcgatc gctaacttag aaaacggcgc gagagggctt gcctttagtt cgggaatggc 2220 tgctatccaa acgattatgg cgctgtttaa aagcggagat gaactgatcg tttcatcgga 2280 cctatatggc ggcacgtacc gtttatttga aaatgaatgg aaaaaatacg gattgacttt 2340 tcattatgat gatttcagcg atgaggactg tttacgctct aagattacgc cgaatacaaa 2400 agcggtgttt gtggaaacgc cgacaaaccc cctcatgcag gaggcggaca ttgaacatat 2460 tgcccggatt acaaaggagc acggtcttct gctgatcgta gataatacat tttatacacc 2520 ggtcttgcag cggccgcttg agctgggagc tgacattgtc attcacagcg caaccaagta 2580 tttaggcggg cataacgatc tgcttgctgg acttgtcgtg gtgaaggatg agcggctcgg 2640 agaggaaatg tttcagcatc aaaatgcaat cggcgccgtc ctgccgccat ttgattcgtg 2700 gcttctgatg agaggaatga agacgctgag gcaggagctt gcggcgtttt tagaagagca aaaaggcggc atgctgtcct tccgtctgca agcactgaag accatttgtt ttgcagaaag ccctgcgacc cagacgcaca tggatattcc caatcggttg ctgcgctttt ctgtcggtat aaaacaggca ttatgtcagg tcaaagaggg cgctggaaac ccagctcgtg cacaatccat gtgtaccgat tcagcacgcc tcaggatccc gttccagtga tcgttgcacc gattaatgca gcatcgataa aggggcgttc tttaaaacgc agcactgaga gtgtcagcca taaagacgac aggaaaggaa ttgttgagat agccgaggcc agcacggccc cctcgacgcc gcctttgcgg acatcgttga taccatacat ggcgatgtta caaaacagcc agtcaatctc tcctgcattt gtattgatcc agctaatggg gcgagatgac actacggctt ttctggctca gattgcgtgg cgatggtggg taaggaatgg tgtggacgtt accatagggc aggaatcaga agtactgcga ttaaaccgag ccaaatgcca aggtgctggg ccatgaggtt atcaaatatg atagttaggg ttggtaaaag tttaggtgtt ccagactgca ctaaaaaagg aatgcttata aaaatataag ttggaaagta tcgcgctgtg gtgtgagggg tgctttaagc cataatgctg ctgccgaggt taagaaaaaa agttcttcaa tgggcatatg tgagtctccg cgataaaaag tgccagtaat aatatatgca gcacctaccg aaagaattgc ccaacggtgg tcgcacaaag ccatgcaccc aaaggccata aaaatatcgc tatcttgctc aatttaatga tcgtatgagg tcttttgaga tcacgcgtcc cgggatttaa atcgctagcg gccagtccgc agaaacggtg ctgaccccgg agggaaaacg caagcgcaaa gagaaagcag ctagactggg cggttttatg gacagcaagc ggtaaggttg ggaagccctg caaagtaaac tggcgcaggg gatcaagatc tgatcaagag caagatggat tgcacgcagg ttctccggcc tgggcacaac agacaatcgg ctgctctgat cgcccggttc tttttgtcaa gaccgacctg gcagcgcggc tatcgtggct ggccacgacg gtcactgaag cgggaaggga ctggctgcta tcatctcacc ttgctcctgc cgagaaagta catacgcttg atccggctac ctgcccattc gcacgtactc ggatggaagc cggtcttgtc gggctcgcgc cagccgaact gttcgccagg ctcgtcgtga cccatggcga tgcctgcttg tctggattca tcgactgtgg ccggctgggt gctacccgtg atattgctga agagcttggc tacggtatcg ccgctcccga ttcgcagcgc ttctgagcgg gactctgggg ttcgaaatga gagatttcga ttccaccgcc gccttctatg acgccggctg gatgatcctc cagcgcgggg gtttaaactg cggatcagtg agggtttgta cggcacgatc atcgtgcggg agggcaaggg gagcttggca cccagcctgc gcgagcaggg acctttaata gattatatta ctaattaatt aaaaattttt tcacaaaacg gtttacaagc gttctggtgt tgctagtttg ttatcagaat aagcgctatt tcttccagaa ttgccatgat cgtgttgtcg gcagctttga ttcgataagc gactgttgag ctgtaacaag ttgtctcagg
cctcagaatg cgccagcatc aggcaaacgc 2760 ggaagaaatt tcggatgtgc tgtatcccgg 2820 aaaagaagaa tgggtcaatc cgtttttaaa 2880 cctcggcggg gtggaaagct ttattacata 2940 tgaagagatc cgcatcgcaa acggggtgtg 3000 tgaacatgcg gaagatttaa aagaggatct 3060 agctgtttca tttgagtaaa cacaattgga 3120 ttaaaacaga cggcggaacc ggggcagtca 3180 agtgctatcc acatcgctgc tgaaggagat 3240 ggtgaagtga agtgagtaga agatgttaga 3300 aatttcggtg ctgaataagc aatcactgct 3360 atccaggtgc caaatatgaa aagaataact 3420 cataacagtg tgctgtggga acttttcggt 3480 ggattacgca tatcagattc gtaatcaaaa 3540 tacgggataa gaaaaaatac gatgcctagc 3600 aataggtagg ccagaccaaa ggggtaggcg 3660 aatagaatta gtcttatttt ttccatcatg 3720 tggtggatct agtagtgatg cttccattgg 3780 ttttcctgcg tttaaacata tttccaggca 3840 agagcggata gaaaagatcc tctaggggga 3900 tatcgccata tccaaagaga tcagcccaaa 3960 aacatagggt aagggcactg acagcggtga 4020 gctttaagac aaataggacc atggctattg 4080 tcatggttca acctcgggag tggtagttgg 4140 agacttttta ccgggttttt taggcagtgg 4200 aaggttgagg gtgatgtagc agaggaagaa 4260 gggtgcaagg ttaataccgg acataaacgc 4320 aatgccaaat atatcccata aaagaaatcc 4380 tcgtaacgga tggcggaaga acgctagctt 4440 aatgagaact aggagagtac ctagataaat 4500 attttgtgaa atatcgatga tagggatcaa 4560 tggtgtcgtt ttaggcggca atggttcggc 4620 ggctgctaaa ggaagcggaa cacgtagaaa 4680 atgaatgtca gctactgggc tatctggaca 4740 gtagcttgca gtgggcttac atggcgatag 4800 gaaccggaat tgccagctgg ggcgccctct 4860 tggatggctt tcttgccgcc aaggatctga 4920 acaggatgag gatcgtttcg catgattgaa 4980 gcttgggtgg agaggctatt cggctatgac 5040 gccgccgtgt tccggctgtc agcgcagggg 5100 tccggtgccc tgaatgaact gcaggacgag 5160 ggcgttcctt gcgcagctgt gctcgacgtt 5220 ttgggcgaag tgccggggca ggatctcctg 5280 tccatcatgg ctgatgcaat gcggcggctg 5340 gaccaccaag cgaaacatcg catcgagcga 5400 gatcaggatg atctggacga agagcatcag 5460 ctcaaggcgc gcatgcccga cggcgaggat 5520 ccgaatatca tggtggaaaa tggccgcttt 5580 gtggcggacc gctatcagga catagcgttg 5640 ggcgaatggg ctgaccgctt cctcgtgctt 5700 atcgccttct atcgccttct tgacgagttc 5760 ccgaccaagc gacgcccaac ctgccatcac 5820 aaaggttggg cttcggaatc gttttccggg 5880 atctcatgct ggagttcttc gcccacgcta 5940 actgcgggtc aaggatctgg atttcgatca 6000 ctccaaggat cgggccttga tgttacccga 6060 gaattgatcc ggtggatgac cttttgaatg 6120 ggggacccta gaggtcccct tttttatttt 6180 ataacgggtt ttgctgcccg caaacgggct 6240 cgcagatccg gcttcaggtt tgccggctga 6300 tttttcccca cgggaggcgt cactggctcc 6360 agcatcgcct gtttcaggct gtctatgtgt 6420 tgttcaattt catgttctag ttgctttgtt 6480 ttactggttt cacctgttct attaggtgtt acatgctgtt catctgttac attgtcgatc 6540 tgttcatggt gaacagcttt aaatgcacca aaaactcgta aaagctctga tgtatctatc 6600 ttttttacac cgttttcatc tgtgcatatg gacagttttc cctttgatat ctaacggtga 6660 acagttgttc tacttttgtt tgttagtctt gatgcttcac tgatagatac aagagccata 6720 agaacctcag atccttccgt atttagccag tatgttctct agtgtggttc gttgtttttg 6780 cgtgagccat gagaacgaac cattgagatc atgcttactt tgcatgtcac tcaaaaattt 6840 tgcctcaaaa ctggtgagct gaatttttgc agttaaagca tcgtgtagtg tttttcttag 6900 tccgttacgt aggtaggaat ctgatgtaat ggttgttggt attttgtcac cattcatttt 6960 tatctggttg ttctcaagtt cggttacgag atccatttgt ctatctagtt caacttggaa 7020 aatcaacgta tcagtcgggc ggcctcgctt atcaaccacc aatttcatat tgctgtaagt 7080 gtttaaatct ttacttattg gtttcaaaac ccattggtta agccttttaa actcatggta 7140 gttattttca agcattaaca tgaacttaaa ttcatcaagg ctaatctcta tatttgcctt 7200 gtgagttttc ttttgtgtta gttcttttaa taaccactca taaatcctca tagagtattt 7260 gttttcaaaa gacttaacat gttccagatt atattttatg aattttttta actggaaaag 7320 ataaggcaat atctcttcac taaaaactaa ttctaatttt tcgcttgaga acttggcata 7380 gtttgtccac tggaaaatct caaagccttt aaccaaagga ttcctgattt ccacagttct 7440 cgtcatcagc tctctggttg ctttagctaa tacaccataa gcattttccc tactgatgtt 7500 catcatctga gcgtattggt tataagtgaa cgataccgtc cgttctttcc ttgtagggtt 7560 ttcaatcgtg gggttgagta gtgccacaca gcataaaatt agcttggttt catgctccgt 7620 taagtcatag cgactaatcg ctagttcatt tgctttgaaa acaactaatt cagacataca 7680 tctcaattgg tctaggtgat tttaatcact ataccaattg agatgggcta gtcaatgata 7740 attactagtc cttttccttt gagttgtggg tatctgtaaa ttctgctaga cctttgctgg 7800 aaaacttgta aattctgcta gaccctctgt aaattccgct agacctttgt gtgttttttt 7860 tgtttatatt caagtggtta taatttatag aataaagaaa gaataaaaaa agataaaaag 7920 aatagatccc agccctgtgt ataactcact actttagtca gttccgcagt attacaaaag 7980 gatgtcgcaa acgctgtttg ctcctctaca aaacagacct taaaacccta aaggcttaag 8040 tagcaccctc gcaagctcgg gcaaatcgct gaatattcct tttgtctccg accatcaggc 8100 acctgagtcg ctgtcttttt cgtgacattc agttcgctgc gctcacggct ctggcagtga 8160 atgggggtaa atggcactac aggcgccttt tatggattca tgcaaggaaa ctacccataa 8220 tacaagaaaa gcccgtcacg ggcttctcag ggcgttttat ggcgggtctg ctatgtggtg 8280 ctatctgact ttttgctgtt cagcagttcc tgccctctga ttttccagtc tgaccacttc 8340 ggattatccc gtgacaggtc attcagactg gctaatgcac ccagtaaggc agcggtatca 8400 tcaacaggct tagtttaaac ccatcggcat tttcttttgc gtttttattt gttaactgtt 8460 aattgtcctt gttcaaggat gctgtctttg acaacagatg ttttcttgcc tttgatgttc 8520 agcaggaagc tcggcgcaaa cgttgattgt ttgtctgcgt agaatcctct gtttgtcata 8580 tagcttgtaa tcacgacatt gtttcctttc gcttgaggta cagcgaagtg tgagtaagta 8640
aaggttacat cgttaggatc aagatccatt tttaacacaa ggccagtttt gttcagcggc 8700 ttgtatgggc cagttaaaga attagaaaca taaccaagca tgtaaatatc gttagacgta 8760 atgccgtcaa tcgtcatttt tgatccgcgg gagtcagtga acaggtacca tttgccgttc 8820 attttaaaga cgttcgcgcg ttcaatttca tctgttactg tgttagatgc aatcagcggt 8880 ttcatcactt ttttcagtgt gtaatcatcg tttagctcaa tcataccgag agcgccgttt 8940 gctaactcag ccgtgcgttt tttatcgctt tgcagaagtt tttgactttc ttgacggaag 9000 aatgatgtgc ttttgccata gtatgctttg ttaaataaag attcttcgcc ttggtagcca 9060 tcttcagttc cagtgtttgc ttcaaatact aagtatttgt ggcctttatc ttctacgtag 9120 tgaggatctc tcagcgtatg gttgtcgcct gagctgtagt tgccttcatc gatgaactgc 9180 tgtacatttt gatacgtttt tccgtcaccg tcaaagattg atttataatc ctctacaccg 9240 ttgatgttca aagagctgtc tgatgctgat acgttaactt gtgcagttgt cagtgtttgt 9300 ttgccgtaat gtttaccgga gaaatcagtg tagaataaac ggatttttcc gtcagatgta 9360 aatgtggctg aacctgacca ttcttgtgtt tggtctttta ggatagaatc atttgcatcg 9420 aatttgtcgc tgtctttaaa gacgcggcca gcgtttttcc agctgtcaat agaagtttcg 9480 ccgacttttt gatagaacat gtaaatcgat gtgtcatccg catttttagg atctccggct 9540 aatgcaaaga cgatgtggta gccgtgatag tttgcgacag tgccgtcagc gttttgtaat 9600 ggccagctgt cccaaacgtc caggcctttt gcagaagaga tatttttaat tgtggacgaa 9660 tcaaattcag aaacttgata tttttcattt ttttgctgtt cagggatttg cagcatatca 9720 tggcgtgtaa tatgggaaat gccgtatgtt tccttatatg gcttttggtt cgtttctttc 9780 gcaaacgctt gagttgcgcc tcctgccagc agtgcggtag taaaggttaa tactgttgct 9840 tgttttgcaa actttttgat gttcatcgtt catgtctcct tttttatgta ctgtgttagc 9900 ggtctgcttc ttccagccct cctgtttgaa gatggcaagt tagttacgca caataaaaaa 9960 agacctaaaa tatgtaaggg gtgacgccaa agtatacact ttgcccttta cacattttag 10020 gtcttgcctg ctttatcagt aacaaacccg cgcgatttac ttttcgacct cattctatta 10080 gactctcgtt tggattgcaa ctggtctatt ttcctctttt gtttgataga aaatcataaa 10140 aggatttgca gactacgggc ctaaagaact aaaaaatcta tctgtttctt ttcattctct 10200 gtatttttta tagtttctgt tgcatgggca taaagttgcc tttttaatca caattcagaa 10260 aatatcataa tatctcattt cactaaataa tagtgaacgg caggtatatg tgatgggtta 10320 aaaa 10324
<210> 12 <211> 10470 <212> DNA
<213> Seqüência artificial
<220>
<223> Descrição de Seqüência artificial: Seqüência de vetor sintética <400> 12
ggatcggcgg ccagggccct catgagatat cgagtcagcg ctgtattgcc cgtgaagttg 60 atggtgtttc cgctgccctg ctgggtggga ttggaggtgt aatcaatgaa ccaaccagga 120 gttccggtgc cagtgagatc aaataccacg cggtcaaagc cactgtgaga gccaatccga 180 acatcggtga ccatgagctg tgcaggcgca tcaggtcgga gagtcttcat tgctacatcg 240 gcttcgccca atgcggttgg gccggtggaa gcttcgttgg acaactgtgc gccatccgca 300 gttgcggaca tagtttgggt tacagaagaa gcatcgttgg tggtggaatt ggaggttcca 360 caacccgcaa gagtcaacgc gctagcgccg acaatcgcta gagtcttcag gcgggcacga 420 tgctttgaat gagaagttgg ctgcacaatc atgcacacac cgtaaccctg ggtcaccccc 480 gaaacctaag caagacgccc aatttcgctc aatcgtgaac gaattgttgt aattcgtctt 540 aaaaacgcca ggagacgtga aaattacaga caccccagac atcagatgga ggcggcgata 600 ctagggtaga ggacatgact cttcgctgtt ctgacgtcaa tgttgaaccc ctgccgggaa 660 cggcaaaaac aggttctggg tttgttctcc ttgaacatgc tggctcgtgg agccgtgatg 720 ttttagacgg cggaacattt gatcctgagt tgactgatca attgaagagg cacctgaaag 780 cttccggaat gggtctgcaa ttaattagga agccgggaag ggagggtcga aacgtcgaaa 840 agcataatct ttttctcgtt tttgctgagg cctcaattat tgagcacctg gtggtggacg 900 cgccggctga tgttttggat cttgatttaa gcgggccggg caaaaacaat gcgcagcgca 960 tggatgatcc gatgctgctg atttgtacgc attcgaagcg cgatgtgtgc tgcgcgatca 1020 aggggcgtcc gctggcagct gccgtggagc cacaatttgg gccgctgcat gtgtgggagg 1080 cttcgcacac caagggccac cgttttgcgc catcgatgct gctcatgccg tggaattact 1140 cttatggcct acttgatgag gccgaaaccg tgcagctttt ccaaggcgcg ttggacaaca 1200 aactcttcct gccgggcaac cgtggccgag gaaccttaga tgctcgtggc caggttgcag 1260 aaattgccgt ggcggaagct ttcggcgagg cggttgctcc tgcgagtttg caggttgaat 1320 tcgaagatga ttctgttttg gttactcatc ccgatgggcg cacgtgggtt gtggagcttg 1380 aacgcatcga ggtcgacggc gtggtgtcct cgtgtggtga tcagccgaaa actggaaaag 1440 cgtgggtggc taggcaagtt acagaactga tcggataaaa gcagagttat atctgatgaa 1500 ttgctattag cagtatcgtt atcacagcac caacaaagta gttcagccac aggaaaactt 1560 tccaactgcg attagcctgt tcacaactgg catctgtaat gttccaaaat cgtgcggcat 1620 taaatacgta agttagaatc gcaatcccga tgatccacgc cggattaggc aaagtagtga 1680 ctaacacagc agctagtaaa taaagtacta ctgaaagccg aatggctcca cgcgccccaa 1740 ttacagtggc aattgagctg cggccgcttc gcgaagcttg tcgaccgaaa cagcagttat 1800 aaggcatgaa gctgtccggt ttttgcaaaa gtggctgtga ctgtaaaaag aaatcgaaaa 1860 agaccgtttt gtgtgaaaac ggtctttttg tttcctttta accaactgcc ataactcgag 1920 gctattgacg acagctatgg ttcactgtcc accaaccaaa actgtgctca gtaccgccaa 1980 tatttctccc ttgaggggta caaagaggtg tccctagaag agatccacgc tgtgtaaaaa 2040 ttttacaaaa aggtattgac tttccctaca gggtgtgtaa taatttaatt acaggcgggg 2100 gcaaccccgc ctgttctaga aggaggagaa aacatgtcac agcacgttga aacgaaatta 2160 gctcaaattg ggaaccgtag cgatgaagtc acgggaacag tgagtgctcc tatctattta 2220 tcaacagcat accgccacag agggatcgga gaatctaccg gatttgatta tgtccgcaca 2280 aaaaatccga cacgccagct tgttgaggac gcgatcgcta acttagaaaa cggcgcgaga 2340 gggcttgcct ttagttcggg aatggctgct atccaaacga ttatggcgct gtttaaaagc 2400 ggagatgaac tgatcgtttc atcggaccta tatggcggca cgtaccgttt atttgaaaat 2460 gaatggaaaa aatacggatt gacttttcat tatgatgatt tcagcgatga ggactgttta 2520 cgctctaaga ttacgccgaa tacaaaagcg gtgtttgtgg aaacgccgac aaaccccctc 2580 atgcaggagg cggacattga acatattgcc cggattacaa aggagcacgg tcttctgctg 2640 atcgtagata atacatttta tacaccggtc ttgcagcggc cgcttgagct gggagctgac 2700 attgtcattc acagcgcaac caagtattta ggcgggcata acgatctgct tgctggactt 2760 gtcgtggtga aggatgagcg gctcggagag gaaatgtttc agcatcaaaa tgcaatcggc 2820 gccgtcctgc cgccatttga ttcgtggctt ctgatgagag gaatgaagac gctgagcctc 2880 agaatgcgcc agcatcaggc aaacgcgcag gagcttgcgg cgtttttaga agagcaggaa 2940 gaaatttcgg atgtgctgta tcccggaaaa gaagaatggg tcaatccgtt tttaaaagca ggcggggtgg aaagctttat tacataccct gagatccgca tcgcaaacgg ggtgtgcaat catgcggaag atttaaaaga ggatctaaaa gtttcatttg agtaaacaca attggacgct aacagacggc ggaaccgggg cagtcagtgt ctatccacat cgctgctgaa ggagatgttc aagtgaagtg agtagaagat gttagagcat tcggtgctga ataagcaatc actgctagca aggtgccaaa tatgaaaaga ataactagga acagtgtgct gtgggaactt ttcggtagca tacgcatatc agattcgtaa tcaaaaacat ggataagaaa aaatacgatg cctagccaaa ggtaggccag accaaagggg taggcggtat gaattagtct tattttttcc atcatgacta ggatctagta gtgatgcttc cattggcgat cctgcgttta aacatatttc caggcaacca cggatagaaa agatcctcta gggggattaa gccatatcca aagagatcag cccaaaccat tagggtaagg gcactgacag cggtgattgg taagacaaat aggaccatgg ctattgctaa ggttcaacct cgggagtggt agttggttgg tttttaccgg gttttttagg cagtggtgct ttgagggtga tgtagcagag gaagaataag gcaaggttaa taccggacat aaacgctgag ccaaatatat cccataaaag aaatccaata aacggatggc ggaagaacgc tagcttccaa agaactagga gagtacctag ataaataaag tgtgaaatat cgatgatagg gatcaaaatt gtcgttttag gcggcaatgg ttcggctcac gctaaaggaa gcggaacacg tagaaagcca atgtcagcta ctgggctatc tggacaaggg cttgcagtgg gcttacatgg cgatagctag cggaattgcc agctggggcg ccctctggta tggctttctt gccgccaagg atctgatggc gatgaggatc gtttcgcatg attgaacaag gggtggagag gctattcggc tatgactggg ccgtgttccg gctgtcagcg caggggcgcc gtgccctgaa tgaactgcag gacgaggcag ttccttgcgc agctgtgctc gacgttgtca gcgaagtgcc ggggcaggat ctcctgtcat tcatggctga tgcaatgcgg cggctgcata accaagcgaa acatcgcatc gagcgagcac aggatgatct ggacgaagag catcaggggc aggcgcgcat gcccgacggc gaggatctcg 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ggcggcatgc tgtccttccg tctgcaaaaa 3000 ctgaagacca tttgttttgc agaaagcctc 3060 gcgacccaga cgcacatgga tattcctgaa 3120 cggttgctgc gcttttctgt cggtattgaa 3180 caggcattat gtcaggtcaa agagggagct 3240 ggaaacccag ctcgtgcaca atccatttaa 3300 accgattcag cacgcctcag gatcccagtg 3360 cagtgatcgt tgcaccgatt aatgcaggtg 3420 cgataaaggg gcgttcttta aaacgcaatt 3480 ctgagagtgt cagccataaa gacgacatcc 3540 aaggaattgt tgagatagcc gaggcccata 3600 cggccccctc gacgccgcct ttgcggggat 3660 cgttgatacc atacatggcg atgttatacg 3720 acagccagtc aatctctcct gcatttaata 3780 tgatccagct aatggggcga gatgacaata 3840 cggcttttct ggctcagatt gcgtggtggt 3900 ggtgggtaag gaatggtgtg gacgtttttt 3960 tagggcagga atcagaagta ctgcgaagag 4020 accgagccaa atgccaaggt gctgggtatc 4080 gaggttatca aatatgatag ttagggaaca 4140 taaaagttta ggtgttccag actgcagctt 4200 aaaaggaatg cttataaaaa tataagtcat 4260 aaagtatcgc gctgtggtgt gaggggagac 4320 ttaagccata atgctgctgc cgaggtaagg 4380 aaaaaaagtt cttcaatggg catatggggt 4440 tctccgcgat aaaaagtgcc agtaataatg 4500 tatgcagcac ctaccgaaag aattgctcgt 4560 cggtggtcgc acaaagccat gcacccaatg 4620 gccataaaaa tatcgctatc ttgctcattt 4680 taatgatcgt atgaggtctt ttgagatggt 4740 gcgtcccggg atttaaatcg ctagcgggct 4800 gtccgcagaa acggtgctga ccccggatga 4860 aaaacgcaag cgcaaagaga aagcaggtag 4920 actgggcggt tttatggaca gcaagcgaac 4980 aggttgggaa gccctgcaaa gtaaactgga 5040 gcaggggatc aagatctgat caagagacag 5100 atggattgca cgcaggttct ccggccgctt 5160 cacaacagac aatcggctgc tctgatgccg 5220 cggttctttt tgtcaagacc gacctgtccg 5280 cgcggctatc gtggctggcc acgacgggcg 5340 ctgaagcggg aagggactgg ctgctattgg 5400 ctcaccttgc tcctgccgag aaagtatcca 5460 cgcttgatcc ggctacctgc ccattcgacc 5520 gtactcggat ggaagccggt cttgtcgatc 5580 tcgcgccagc cgaactgttc gccaggctca 5640 tcgtgaccca tggcgatgcc tgcttgccga 5700 gattcatcga ctgtggccgg ctgggtgtgg 5760 cccgtgatat tgctgaagag cttggcggcg 5820 gtatcgccgc tcccgattcg cagcgcatcg 5880 gagcgggact ctggggttcg aaatgaccga 5940 tttcgattcc accgccgcct tctatgaaag 6000 cggctggatg atcctccagc gcggggatct 6060 aaactgcgga tcagtgaggg tttgtaactg 6120 acgatcatcg tgcgggaggg caagggctcc 6180 ttggcaccca gcctgcgcga gcaggggaat 6240 ttaatagatt atattactaa ttaattgggg 6300 attttttcac aaaacggttt acaagcataa 6360 tggtgttgct agtttgttat cagaatcgca 6420 gctatttctt ccagaattgc catgattttt 6480 ttgtcggcag ctttgattcg ataagcagca 6540 gttgagctgt aacaagttgt ctcaggtgtt 6600 tggtttcacc tgttctatta ggtgttacat 6660 catggtgaac agctttaaat gcaccaaaaa 6720 ctcgtaaaag ctctgatgta tctatctttt gttttccctt tgatatctaa cggtgaacag cttcactgat agatacaaga gccataagaa ttctctagtg tggttcgttg tttttgcgtg ttactttgca tgtcactcaa aaattttgcc aaagcatcgt gtagtgtttt tcttagtccg gttggtattt tgtcaccatt catttttatc atttgtctat ctagttcaac ttggaaaatc accaccaatt tcatattgct gtaagtgttt tggttaagcc ttttaaactc atggtagtta tcaaggctaa tctctatatt tgccttgtga cactcataaa tcctcataga gtatttgttt tttatgaatt tttttaactg gaaaagataa aatttttcgc ttgagaactt ggcatagttt aaaggattcc tgatttccac agttctcgtc ccataagcat tttccctact gatgttcatc accgtccgtt ctttccttgt agggttttca aaaattagct tggtttcatg ctccgttaag ttgaaaacaa ctaattcaga catacatctc caattgagat gggctagtca atgataatta tgtaaattct gctagacctt tgctggaaaa tccgctagac ctttgtgtgt tttttttgtt aagaaagaat aaaaaaagat aaaaagaata tagtcagttc cgcagtatta caaaaggatg agaccttaaa accctaaagg cttaagtagc attccttttg tctccgacca tcaggcacct cgctgcgctc acggctctgg cagtgaatgg gattcatgca aggaaactac ccataataca ttttatggcg ggtctgctat gtggtgctat ctctgatttt ccagtctgac cacttcggat atgcacccag taaggcagcg gtatcatcaa ttttgcgttt ttatttgtta actgttaatt cagatgtttt cttgcctttg atgttcagca ctgcgtagaa tcctctgttt gtcatatagc gaggtacagc gaagtgtgag taagtaaagg acacaaggcc agttttgttc agcggcttgt caagcatgta aatatcgtta gacgtaatgc cagtgaacag gtaccatttg ccgttcattt ttactgtgtt agatgcaatc agcggtttca gctcaatcat accgagagcg ccgtttgcta gaagtttttg actttcttga cggaagaatg ataaagattc ttcgccttgg tagccatctt atttgtggcc tttatcttct acgtagtgag tgtagttgcc ttcatcgatg aactgctgta agattgattt ataatcctct acaccgttga taacttgtgc agttgtcagt gtttgtttgc ataaacggat ttttccgtca gatgtaaatg cttttaggat agaatcattt gcatcgaatt ttttccagct gtcaatagaa gtttcgccga catccgcatt tttaggatct ccggctaatg cgacagtgcc gtcagcgttt tgtaatggcc aagagatatt tttaattgtg gacgaatcaa gctgttcagg gatttgcagc atatcatggc tatatggctt ttggttcgtt tctttcgcaa cggtagtaaa ggttaatact gttgcttgtt tctccttttt tatgtactgt gttagcggtc gcaagttagt tacgcacaat aaaaaaagac tacactttgc cctttacaca ttttaggtct atttactttt cgacctcatt ctattagact tcttttgttt gatagaaaat cataaaagga aatctatctg tttcttttca ttctctgtat gttgcctttt taatcacaat tcagaaaata gaacggcagg tatatgtgat gggttaaaaa
ttacaccgtt ttcatctgtg catatggaca 6780 ttgttctact tttgtttgtt agtcttgatg 6840 cctcagatcc ttccgtattt agccagtatg 6900 agccatgaga acgaaccatt gagatcatgc 6960 tcaaaactgg tgagctgaat ttttgcagtt 7020 ttacgtaggt aggaatctga tgtaatggtt 7080 tggttgttct caagttcggt tacgagatcc 7140 aacgtatcag tcgggcggcc tcgcttatca 7200 aaatctttac ttattggttt caaaacccat 7260 ttttcaagca ttaacatgaa cttaaattca 7320 gttttctttt gtgttagttc ttttaataac 7380 tcaaaagact taacatgttc cagattatat 7440 ggcaatatct cttcactaaa aactaattct 7500 gtccactgga aaatctcaaa gcctttaacc 7560 atcagctctc tggttgcttt agctaataca 7620 atctgagcgt attggttata agtgaacgat 7680 atcgtggggt tgagtagtgc cacacagcat 7740 tcatagcgac taatcgctag ttcatttgct 7800 aattggtcta ggtgatttta atcactatac 7860 ctagtccttt tcctttgagt tgtgggtatc 7920 cttgtaaatt ctgctagacc ctctgtaaat 7980 tatattcaag tggttataat ttatagaata 8040 gatcccagcc ctgtgtataa ctcactactt 8100 tcgcaaacgc tgtttgctcc tctacaaaac 8160 accctcgcaa gctcgggcaa atcgctgaat 8220 gagtcgctgt ctttttcgtg acattcagtt 8280 gggtaaatgg cactacaggc gccttttatg 8340 agaaaagccc gtcacgggct tctcagggcg 8400 ctgacttttt gctgttcagc agttcctgcc 8460 tatcccgtga caggtcattc agactggcta 8520 caggcttagt ttaaacccat cggcattttc 8580 gtccttgttc aaggatgctg tctttgacaa 8640 ggaagctcgg cgcaaacgtt gattgtttgt 8700 ttgtaatcac gacattgttt cctttcgctt 8760 ttacatcgtt aggatcaaga tccattttta 8820 atgggccagt taaagaatta gaaacataac 8880 cgtcaatcgt catttttgat ccgcgggagt 8940 taaagacgtt cgcgcgttca atttcatctg 9000 tcactttttt cagtgtgtaa tcatcgttta 9060 actcagccgt gcgtttttta tcgctttgca 9120 atgtgctttt gccatagtat gctttgttaa 9180 cagttccagt gtttgcttca aatactaagt 9240 gatctctcag cgtatggttg tcgcctgagc 9300 cattttgata cgtttttccg tcaccgtcaa 9360 tgttcaaaga gctgtctgat gctgatacgt 9420 cgtaatgttt accggagaaa tcagtgtaga 9480 tggctgaacc tgaccattct tgtgtttggt 9540 tgtcgctgtc tttaaagacg cggccagcgt 9600 ctttttgata gaacatgtaa atcgatgtgt 9660 caaagacgat gtggtagccg tgatagtttg 9720 agctgtccca aacgtccagg ccttttgcag 9780 attcagaaac ttgatatttt tcattttttt 9840 gtgtaatatg ggaaatgccg tatgtttcct 9900 acgcttgagt tgcgcctcct gccagcagtg 9960 ttgcaaactt tttgatgttc atcgttcatg 10020 tgcttcttcc agccctcctg tttgaagatg 10080 ctaaaatatg taaggggtga cgccaaagta 10140 tgcctgcttt atcagtaaca aacccgcgcg 10200 ctcgtttgga ttgcaactgg tctattttcc 10260 tttgcagact acgggcctaa agaactaaaa 10320 tttttatagt ttctgttgca tgggcataaa 10380 tcataatatc tcatttcact aaataatagt 10440
10470 <210> 13 <211> 10484 <212> DNA
<213> Seqüência artificial
<220>
<223> Descrição de Seqüência artificial: Seqüência de plasmídeo sintética
<400> 13
ggatcggcgg
atggtgtttc
tgtaatcaat
agccactgtg
ggagagtctt
tggacaactg
tggtggtgga
ctagagtctt
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catgagatat gaggacatac ggagttccgg cgaacatcgg tcggcttcgc gcagttgcgg ccacaacccg cgatgctttg cccgaaacct cttaaaaacg atactagggt gaacggcaaa atgttttaga aagcttccgg aaaagcataa acgcgccggc gcatggatga tcaaggggcg aggcttcgca actcttatgg acaaactctt cagaaattgc aattcgaaga ttgaacgcat aagcgtgggt gaattgctat ctttccaact cattaaatac tgactaacac caattacagt tataaggcat aaaagaccgt gagaccctgc ggattcagta gcttatcaca ccacgatcta attgggaacc gcataccgcc ccgacacgcc gcctttagtt gaactgatcg aaaaaatacg aagattacgc gaggcggaca gataatacat attcacagcg gtgaaggatg ctgccgccat cgccagcatc tcggatgtgc tgggtcaatc gtggaaagct
cgagtcagcg
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acggggtgtg caatcggttg ctgcgctttt 3180 aagaggatct aaaacaggca ttatgtcagg 3240 cacaattgga cgctggaaac ccagctcgtg 3300 ggggcagtca gtgtaccgat tcagcacgcc 3360 tgaaggagat gttccagtga tcgttgcacc 3420 agatgttaga gcatcgataa aggggcgttc 3480 aatcactgct agcactgaga gtgtcagcca 3540 aagaataact aggaaaggaa ttgttgagat 3600 acttttcggt agcacggccc cctcgacgcc 3660 gtaatcaaaa acatcgttga taccatacat 3720 gatgcctagc caaaacagcc agtcaatctc 3780 ggggtaggcg gtattgatcc agctaatggg 3840 ttccatcatg actacggctt ttctggctca 3900 cttccattgg cgatggtggg taaggaatgg 3960 tttccaggca accatagggc aggaatcaga 4020 tctaggggga ttaaaccgag ccaaatgcca 4Ò80 tcagcccaaa ccatgaggtt atcaaatatg 4140 acagcggtga ttggtaaaag tttaggtgtt 4200 atggctattg ctaaaaaagg aatgcttata 4260 tggtagttgg ttggaaagta tcgcgctgtg 4320 taggcagtgg tgctttaagc cataatgctg 4380 agaggaagaa taagaaaaaa agttcttcaa 4440 acataaacgc tgagtctccg cgataaaaag 4500 aaagaaatcc aatatatgca gcacctaccg 4560 acgctagctt ccaacggtgg tcgcacaaag 4620 ctagataaat aaaggccata aaaatatcgc 4680 tagggatcaa aatttaatga tcgtatgagg 4740 atggttcggc tcacgcgtcc cgggatttaa 4800 cacgtagaaa gccagtccgc agaaacggtg 4860 tatctggaca agggaaaacg caagcgcaaa 4920 atggcgatag ctagactggg cggttttatg 4980 ggcgccctct ggtaaggttg ggaagccctg 5040 aaggatctga tggcgcaggg gatcaagatc 5100 catgattgaa caagatggat tgcacgcagg 5160 cggctatgac tgggcacaac agacaatcgg 5220 agcgcagggg cgcccggttc tttttgtcaa 5280 gcaggacgag gcagcgcggc tatcgtggct 5340 gctcgacgtt gtcactgaag cgggaaggga 5400 ggatctcctg tcatctcacc ttgctcctgc 5460 gcggcggctg catacgcttg atccggctac 5520 catcgagcga gcacgtactc ggatggaagc 5580 agagcatcag gggctcgcgc cagccgaact 5640 cggcgaggat ctcgtcgtga cccatggcga 5700 tggccgcttt tctggattca tcgactgtgg 5760 catagcgttg gctacccgtg atattgctga 5820 cctcgtgctt tacggtatcg ccgctcccga 5880 tgacgagttc ttctgagcgg gactctgggg 5940 ctgccatcac gagatttcga ttccaccgcc 6000 gttttccggg acgccggctg gatgatcctc 6060 gcccacgcta gtttaaactg cggatcagtg 6120 atttcgatca cggcacgatc atcgtgcggg 6180 tgttacccga gagcttggca cccagcctgc 6240 cttttgaatg acctttaata gattatatta 6300 tttttatttt aaaaattttt tcacaaaacg 6360 caaacgggct gttctggtgt tgctagtttg 6420 tgccggctga aagcgctatt tcttccagaa 6480 cactggctcc cgtgttgtcg gcagctttga 6540 gtctatgtgt gactgttgag ctgtaacaag 6600 ttgctttgtt ttactggttt cacctgttct 6660 attgtcgatc tgttcatggt gaacagcttt 6720 tgtatctatc ttttttacac cgttttcatc 6780 ctaacggtga acagttgttc tacttttgtt 6840 aagagccata agaacctcag atccttccgt 6900 atttagccag tatgttctct agtgtggttc cattgagatc atgcttactt tgcatgtcac gaatttttgc agttaaagca tcgtgtagtg ctgatgtaat ggttgttggt attttgtcac cggttacgag atccatttgt ctatctagtt ggcctcgctt atcaaccacc aatttcatat gtttcaaaac ccattggtta agccttttaa tgaacttaaa ttcatcaagg ctaatctcta gttcttttaa taaccactca taaatcctca gttccagatt atattttatg aattttttta taaaaactaa ttctaatttt tcgcttgaga caaagccttt aaccaaagga ttcctgattt ctttagctaa tacaccataa gcattttccc tataagtgaa cgataccgtc cgttctttcc gtgccacaca gcataaaatt agcttggttt ctagttcatt tgctttgaaa acaactaatt tttaatcact ataccaattg agatgggcta gagttgtggg tatctgtaaa ttctgctaga gaccctctgt aaattccgct agacctttgt taatttatag aataaagaaa gaataaaaaa ataactcact actttagtca gttccgcagt ctcctctaca aaacagacct taaaacccta gcaaatcgct gaatattcct tttgtctccg cgtgacattc agttcgctgc gctcacggct aggcgccttt tatggattca tgcaaggaaa ggcttctcag ggcgttttat ggcgggtctg cagcagttcc tgccctctga ttttccagtc attcagactg gctaatgcac ccagtaaggc ccatcggcat tttcttttgc gtttttattt gctgtctttg acaacagatg ttttcttgcc cgttgattgt ttgtctgcgt agaatcctct gtttcctttc gcttgaggta cagcgaagtg aagatccatt tttaacacaa ggccagtttt attagaaaca taaccaagca tgtaaatatc tgatccgcgg gagtcagtga acaggtacca ttcaatttca tctgttactg tgttagatgc gtaatcatcg tttagctcaa tcataccgag tttatcgctt tgcagaagtt tttgactttc gtatgctttg ttaaataaag attcttcgcc ttcaaatact aagtatttgt ggcctttatc gttgtcgcct gagctgtagt tgccttcatc tccgtcaccg tcaaagattg atttataatc tgatgctgat acgttaactt gtgcagttgt gaaatcagtg tagaataaac ggatttttcc ttcttgtgtt tggtctttta ggatagaatc gacgcggcca gcgtttttcc agctgtcaat gtaaatcgat gtgtcatccg catttttagg gccgtgatag tttgcgacag tgccgtcagc caggcctttt gcagaagaga tatttttaat tttttcattt ttttgctgtt cagggatttg gccgtatgtt tccttatatg gcttttggtt tcctgccagc agtgcggtag taaaggttaa gttcatcgtt catgtctcct tttttatgta cctgtttgaa gatggcaagt tagttacgca gtgacgccaa agtatacact ttgcccttta aacaaacccg cgcgatttac ttttcgacct ctggtctatt ttcctctttt gtttgataga ctaaagaact aaaaaatcta tctgtttctt tgcatgggca taaagttgcc tttttaatca cactaaataa tagtgaacgg caggtatatg
gttgtttttg cgtgagccat gagaacgaac 6960 tcaaaaattt tgcctcaaaa ctggtgagct 7020 tttttcttag tccgttacgt aggtaggaat 7080 cattcatttt tatctggttg ttctcaagtt 7140 caacttggaa aatcaacgta tcagtcgggc 7200 tgctgtaagt gtttaaatct ttacttattg 7260 actcatggta gttattttca agcattaaca 7320 tatttgcctt gtgagttttc ttttgtgtta 7380 tagagtattt gttttcaaaa gacttaacat 7440 actggaaaag ataaggcaat atctcttcac 7500 acttggcata gtttgtccac tggaaaatct 7560 ccacagttct cgtcatcagc tctctggttg 7620 tactgatgtt catcatctga gcgtattggt 7680 ttgtagggtt ttcaatcgtg gggttgagta 7740 catgctccgt taagtcatag cgactaatcg 7800 cagacataca tctcaattgg tctaggtgat 7860 gtcaatgata attactagtc cttttccttt 7920 cctttgctgg aaaacttgta aattctgcta 7980 gtgttttttt tgtttatatt caagtggtta 8040 agataaaaag aatagatccc agccctgtgt 8100 attacaaaag gatgtcgcaa acgctgtttg 8160 aaggcttaag tagcaccctc gcaagctcgg 8220 accatcaggc acctgagtcg ctgtcttttt 8280 ctggcagtga atgggggtaa atggcactac 8340 ctacccataa tacaagaaaa gcccgtcacg 8400 ctatgtggtg ctatctgact ttttgctgtt 8460 tgaccacttc ggattatccc gtgacaggtc 8520 agcggtatca tcaacaggct tagtttaaac 8580 gttaactgtt aattgtcctt gttcaaggat 8640 tttgatgttc agcaggaagc tcggcgcaaa 8700 gtttgtcata tagcttgtaa tcacgacatt 8760 tgagtaagta aaggttacat cgttaggatc 8820 gttcagcggc ttgtatgggc cagttaaaga 8880 gttagacgta atgccgtcaa tcgtcatttt 8940 tttgccgttc attttaaaga cgttcgcgcg 9000 aatcagcggt ttcatcactt ttttcagtgt 9060 agcgccgttt gctaactcag ccgtgcgttt 9120 ttgacggaag aatgatgtgc ttttgccata 9180 ttggtagcca tcttcagttc cagtgtttgc 9240 ttctacgtag tgaggatctc tcagcgtatg 9300 gatgaactgc tgtacatttt gatacgtttt 9360 ctctacaccg ttgatgttca aagagctgtc 9420 cagtgtttgt ttgccgtaat gtttaccgga 9480 gtcagatgta aatgtggctg aacctgacca 9540 atttgcatcg aatttgtcgc tgtctttaaa 9600 agaagtttcg ccgacttttt gatagaacat 9660 atctccggct aatgcaaaga cgatgtggta 9720 gttttgtaat ggccagctgt cccaaacgtc 9780 tgtggacgaa tcaaattcag aaacttgata 9840 cagcatatca tggcgtgtaa tatgggaaat 9900 cgtttctttc gcaaacgctt gagttgcgcc 9960 tactgttgct tgttttgcaa actttttgat 10020 ctgtgttagc ggtctgcttc ttccagccct 10080 caataaaaaa agacctaaaa tatgtaaggg 10140 cacattttag gtcttgcctg ctttatcagt 10200 cattctatta gactctcgtt tggattgcaa 10260 aaatcataaa aggatttgca gactacgggc 10320 ttcattctct gtatttttta tagtttctgt 10380 caattcagaa aatatcataa tatctcattt 10440 tgatgggtta aaaa 10484
<210> 14 <211> 12531
<212> DNA
<213> Seqüência artificial
<220>
<223> Descrição de Seqüência artificial: Seqüência de vetor sintética
<400> 14
ggatcggcgg ccagggccct catgagatat cgagtcagcg ctgtattgcc cgtgaagttg 60 atggtgtttc cgctgccctg ctgggtggga ttggaggtgt aatcaatgaa ccaaccagga 120 gttccggtgc cagtgagatc aaataccacg cggtcaaagc cactgtgaga gccaatccga 180 acatcggtga ccatgagctg tgcaggcgca tcaggtcgga gagtcttcat tgctacatcg 240 gcttcgccca atgcggttgg gccggtggaa gcttcgttgg acaactgtgc gccatccgca 300 gttgcggaca tagtttgggt tacagaagaa gcatcgttgg tggtggaatt ggaggttcca 360 caacccgcaa gagtcaacgc gctagcgccg acaatcgcta gagtcttcag gcgggcacga 420 tgctttgaat gagaagttgg ctgcacaatc atgcacacac cgtaaccctg ggtcaccccc 480 gaaacctaag caagacgccc aatttcgctc aatcgtgaac gaattgttgt aattcgtctt 540 aaaaacgcca ggagacgtga aaattacaga caccccagac atcagatgga ggcggcgata 600 ctagggtaga ggacatgact cttcgctgtt ctgacgtcaa tgttgaaccc ctgccgggaa 660 cggcaaaaac aggttctggg tttgttctcc ttgaacatgc tggctcgtgg agccgtgatg 720 ttttagacgg cggaacattt gatcctgagt tgactgatca attgaagagg cacctgaaag 780 cttccggaat gggtctgcaa ttaattagga agccgggaag ggagggtcga aacgtcgaaa 840 agcataatct ttttctcgtt tttgctgagg cctcaattat tgagcacctg gtggtggacg 900 cgccggctga tgttttggat cttgatttaa gcgggccggg caaaaacaat gcgcagcgca 960 tggatgatcc gatgctgctg atttgtacgc attcgaagcg cgatgtgtgc tgcgcgatca 1020 aggggcgtcc gctggcagct gccgtggagc cacaatttgg gccgctgcat gtgtgggagg 1080 cttcgcacac caagggccac cgttttgcgc catcgatgct gctcatgccg tggaattact 1140 cttatggcct acttgatgag gccgaaaccg tgcagctttt ccaaggcgcg ttggacaaca 1200 aactcttcct gccgggcaac cgtggccgag gaaccttaga tgctcgtggc caggttgcag 1260 aaattgccgt ggcggaagct ttcggcgagg cggttgctcc tgcgagtttg caggttgaat 1320 tcgaagatga ttctgttttg gttactcatc ccgatgggcg cacgtgggtt gtggagcttg 1380 aacgcatcga ggtcgacggc gtggtgtcct cgtgtggtga tcagccgaaa actggaaaag 1440 cgtgggtggc taggcaagtt acagaactga tcggataaaa gcagagttat atctgatgaa 1500 ttgctattag cagtatcgtt atcacagcac caacaaagta gttcagccac aggaaaactt 1560 tccaactgcg attagcctgt tcacaactgg catctgtaat gttccaaaat cgtgcggcat 1620 taaatacgta agttagaatc gcaatcccga tgatccacgc cggattaggc aaagtagtga 1680 ctaacacagc agctagtaaa taaagtacta ctgaaagccg aatggctcca cgcgccccaa 1740 ttacagtggc aattgagctg cggccgcttc gcgaagcttg tcgaccgaaa cagcagttat 1800 aaggcatgaa gctgtccggt ttttgcaaaa gtggctgtga ctgtaaaaag aaatcgaaaa 1860 agaccgtttt gtgtgaaaac ggtctttttg tttcctttta accaactgcc ataactcgag 1920 gctattgacg acagctatgg ttcactgtcc accaaccaaa actgtgctca gtaccgccaa 1980 tatttctccc ttgaggggta caaagaggtg tccctagaag agatccacgc tgtgtaaaaa 2040 ttttacaaaa aggtattgac tttccctaca gggtgtgtaa taatttaatt acaggcgggg 2100 gcaaccccgc ctgttctaga gatccccagc ttgttgatac actaatgctt ttatataggg 2160 aaaaggtggt gaactactgt ggaagttact gacgtaagat tacgggtcga ccgggaaaac 2220 cctggcgtta cccaacttaa tcgccttgca gcacatcccc ctttcgccag ctggcgtaat 2280 agcgaagagg cccgcaccga tcgcccttcc caacagttgc gcagcctgaa tggcgaatgg 2340 cgctttgcct ggtttccggc accagaagcg gtgccggaaa gctggctgga gtgcgatctt 2400 cctgaggccg atactgtcgt cgtcccctca aactggcaga tgcacggtta cgatgcgccc 2460 atctacacca acgtaaccta tcccattacg gtcaatccgc cgtttgttcc cacggagaat 2520 ccgacgggtt gttactcgct cacatttaat gttgatgaaa gctggctaca ggaaggccag 2580 acgcgaatta tttttgatgg cgttaactcg gcgtttcatc tgtggtgcaa cgggcgctgg 2640 gtcggttacg gccaggacag tcgtttgccg tctgaatttg acctgagcgc atttttacgc 2700 gccggagaaa accgcctcgc ggtgatggtg ctgcgttgga gtgacggcag ttatctggaa 2760 gatcaggata tgtggcggat gagcggcatt ttccgtgacg tctcgttgct gcataaaccg 2820 actacacaaa tcagcgattt ccatgttgcc actcgcttta atgatgattt cagccgcgct 2880 gtactggagg ctgaagttca gatgtgcggc gagttgcgtg actacctacg ggtaacagtt 2940 tctttatggc agggtgaaac gcaggtcgcc agcggcaccg cgcctttcgg cggtgaaatt 3000 atcgatgagc gtggtggtta tgccgatcgc gtcacactac gtctgaacgt cgaaaacccg 3060 aaactgtgga gcgccgaaat cccgaatctc tatcgtgcgg tggttgaact gcacaccgcc 3120 gacggcacgc tgattgaagc agaagcctgc gatgtcggtt tccgcgaggt gcggattgaa 3180 aatggtctgc tgctgctgaa cggcaagccg ttgctgattc gaggcgttaa ccgtcacgag 3240 catcatcctc tgcatggtca ggtcatggat gagcagacga tggtgcagga tatcctgctg 3300 atgaagcaga acaactttaa cgccgtgcgc tacacgctgt gcgaccgcta cggcctgtat ggcatggtgc caatgaatcg tctgaccgat cgcgtaacgc gaatggtgca gcgcgatcgt gggaatgaat caggccacgg cgctaatcac gatccttccc gcccggtgca gtatgaaggc atttgcccga tgtacgcgcg cgtggatgaa tccatcaaaa aatggctttc gctacctgga gcccacgcga tgggtaacag tcttggcggt tatccccgtt tacagggcgg cttcgtctgg gatgaaaacg gcaacccgtg gtcggcttac cgccagttct gtatgaacgg tctggtcttt gaagcaaaac accagcagca gtttttccag accagcgaat acctgttccg tcatagcgat gatggtaagc cgctggcaag cggtgaagtg. ttgattgaac tgcctgaact accgcagccg cgcgtagtgc aaccgaacgc gaccgcatgg cagtggcgtc tggcggaaaa cctcagtgtg catctgacca ccagcgaaat ggatttttgc aaccgccagt caggctttct ttcacagatg ccgctgcgcg atcagttcac ccgtgcaccg acccgcattg accctaacgc ctgggtcgaa gaagcagcgt tgttgcagtg cacggcagat gctcacgcgt ggcagcatca ggggaaaacc gatggtagtg gtcaaatggc gattaccgtt ccggcgcgga ttggcctgaa ctgccagctg ggattagggc cgcaagaaaa ctatcccgac gatctgccat tgtcagacat gtataccccg tgcgggacgc gcgaattgaa ttatggccca atcagccgct acagtcaaca gcaactgatg gaagaaggca catggctgaa tatcgacggt tggagcccgt cagtatcggc ggaatttcag gtctggtgtc aaaaataata ataaccgggc ggatccgccc tcccgcacgc tttgcgggag tagcttcccg gtctgcatta acatcctgta acaagaaaaa ggatcccagt gctatccaca ttgcaccgat taatgcaggt gaagtgaagt ggcgttcttt aaaacgcaat ttcggtgctg tcagccataa agacgacatc caggtgccaa ttgagatagc cgaggcccat aacagtgtgc cgacgccgcc tttgcgggga ttacgcatat catacatggc gatgttatac gggataagaa caatctctcc tgcatttaat aggtaggcca taatggggcg agatgacaat agaattagtc tggctcagat tgcgtggtgg tggatctagt ggaatggtgt ggacgttttt tcctgcgttt aatcagaagt actgcgaaga gcggatagaa aatgccaagg tgctgggtat cgccatatcc aaatatgata gttagggaac atagggtaag aggtgttcca gactgcagct ttaagacaaa gcttataaaa atataagtca tggttcaacc cgctgtggtg tgaggggaga ctttttaccg aatgctgctg ccgaggtaag gttgagggtg tcttcaatgg gcatatgggg tgcaaggtta taaaaagtgc cagtaataat gccaaatata cctaccgaaa gaattgctcg taacggatgg cacaaagcca tgcacccaat gagaactagg atatcgctat cttgctcatt ttgtgaaata tatgaggtct tttgagatgg tgtcgtttta gatttaaatc gctagcgggc tgctaaagga aacggtgctg accccggatg aatgtcagct
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gcgcaaagag aaagcaggta gcttgcagtg ggcttacatg gcgatagcta gactgggcgg 7020 ttttatggac agcaagcgaa ccggaattgc cagctggggc gccctctggt aaggttggga 7080 agccctgcaa agtaaactgg atggctttct tgccgccaag gatctgatgg cgcaggggat 7140 caagatctga tcaagagaca ggatgaggat cgtttcgcat gattgaacaa gatggattgc 7200 acgcaggttc tccggccgct tgggtggaga ggctattcgg ctatgactgg gcacaacaga 7260 caatcggctg ctctgatgcc gccgtgttcc ggctgtcagc gcaggggcgc ccggttcttt 7320 ttgtcaagac cgacctgtcc ggtgccctga atgaactgca ggacgaggca gcgcggctat 7380 cgtggctggc cacgacgggc gttccttgcg cagctgtgct cgacgttgtc actgaagcgg 7440 gaagggactg gctgctattg ggcgaagtgc cggggcagga tctcctgtca tctcaccttg 7500 ctcctgccga gaaagtatcc atcatggctg atgcaatgcg gcggctgcat acgcttgatc 7560 cggctacctg cccattcgac caccaagcga aacatcgcat cgagcgagca cgtactcgga 7620 tggaagccgg tcttgtcgat caggatgatc tggacgaaga gcatcagggg ctcgcgccag 7680 ccgaactgtt cgccaggctc aaggcgcgca tgcccgacgg cgaggatctc gtcgtgaccc 7740 atggcgatgc ctgcttgccg aatatcatgg tggaaaatgg ccgcttttct ggattcatcg 7800 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taacaagttg tctcaggtgt tcaatttcat gttctagttg ctttgtttta ctggtttcac 8700 ctgttctatt aggtgttaca tgctgttcat ctgttacatt gtcgatctgt tcatggtgaa 8760 cagctttaaa tgcaccaaaa actcgtaaaa gctctgatgt atctatcttt tttacaccgt 8820 tttcatctgt gcatatggac agttttccct ttgatatcta acggtgaaca gttgttctac 8880 ttttgtttgt tagtcttgat gcttcactga tagatacaag agccataaga acctcagatc 8940 cttccgtatt tagccagtat gttctctagt gtggttcgtt gtttttgcgt gagccatgag 9000 aacgaaccat tgagatcatg cttactttgc atgtcactca aaaattttgc ctcaaaactg 9060 gtgagctgaa tttttgcagt taaagcatcg tgtagtgttt ttcttagtcc gttacgtagg 9120 taggaatctg atgtaatggt tgttggtatt ttgtcaccat tcatttttat ctggttgttc 9180 tcaagttcgg ttacgagatc catttgtcta tctagttcaa cttggaaaat caacgtatca 9240 gtcgggcggc ctcgcttatc aaccaccaat ttcatattgc tgtaagtgtt taaatcttta 9300 cttattggtt tcaaaaccca ttggttaagc cttttaaact catggtagtt attttcaagc 9360 attaacatga acttaaattc atcaaggcta atctctatat ttgccttgtg agttttcttt 9420 tgtgttagtt cttttaataa ccactcataa atcctcatag agtatttgtt ttcaaaagac 9480 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tctttttcgt gacattcagt tcgctgcgct cacggctctg gcagtgaatg ggggtaaatg 10380 gcactacagg cgccttttat ggattcatgc aaggaaacta cccataatac aagaaaagcc 10440 cgtcacgggc ttctcagggc gttttatggc gggtctgcta tgtggtgcta tctgactttt 10500 tgctgttcag cagttcctgc cctctgattt tccagtctga ccacttcgga ttatcccgtg 10560 acaggtcatt cagactggct aatgcaccca gtaaggcagc ggtatcatca acaggcttag 10620 tttaaaccca tcggcatttt cttttgcgtt tttatttgtt aactgttaat tgtccttgtt 10680 caaggatgct gtctttgaca acagatgttt tcttgccttt gatgttcagc aggaagctcg 10740 gcgcaaacgt tgattgtttg tctgcgtaga atcctctgtt tgtcatatag cttgtaatca 10800 cgacattgtt tcctttcgct tgaggtacag cgaagtgtga gtaagtaaag gttacatcgt 10860 taggatcaag atccattttt aacacaaggc cagttttgtt cagcggcttg tatgggccag 10920 ttaaagaatt agaaacataa ccaagcatgt aaatatcgtt agacgtaatg ccgtcaatcg 10980 tcatttttga tccgcgggag tcagtgaaca ggtaccattt gccgttcatt ttaaagacgt 11040 tcgcgcgttc aatttcatct gttactgtgt tagatgcaat cagcggtttc atcacttttt 11100 tcagtgtgta atcatcgttt agctcaatca taccgagagc gccgtttgct aactcagccg 11160 tgcgtttttt atcgctttgc agaagttttt gactttcttg acggaagaat gatgtgcttt 11220 tgccatagta tgctttgtta aataaagatt cttcgccttg gtagccatct tcagttccag 11280 tgtttgcttc aaatactaag tatttgtggc ctttatcttc tacgtagtga ggatctctca 11340 gcgtatggtt gtcgcctgag ctgtagttgc cttcatcgat gaactgctgt acattttgat 11400 acgtttttcc gtcaccgtca aagattgatt tataatcctc tacaccgttg atgttcaaag 11460 agctgtctga tgctgatacg ttaacttgtg cagttgtcag tgtttgtttg ccgtaatgtt 11520 taccggagaa atcagtgtag aataaacgga tttttccgtc agatgtaaat gtggctgaac 11580 ctgaccattc ttgtgtttgg tcttttagga tagaatcatt tgcatcgaat ttgtcgctgt 11640 ctttaaagac gcggccagcg tttttccagc tgtcaataga agtttcgccg actttttgat 11700 agaacatgta aatcgatgtg tcatccgcat ttttaggatc tccggctaat gcaaagacga 11760 tgtggtagcc gtgatagttt gcgacagtgc cgtcagcgtt ttgtaatggc cagctgtccc 11820 aaacgtccag gccttttgca gaagagatat ttttaattgt ggacgaatca aattcagaaa 11880 cttgatattt ttcatttttt tgctgttcag ggatttgcag catatcatgg cgtgtaatat 11940 gggaaatgcc gtatgtttcc ttatatggct tttggttcgt ttctttcgca aacgcttgag 12000 ttgcgcctcc tgccagcagt gcggtagtaa aggttaatac tgttgcttgt tttgcaaact 12060 ttttgatgtt catcgttcat gtctcctttt ttatgtactg tgttagcggt ctgcttcttc 12120 cagccctcct gtttgaagat ggcaagttag ttacgcacaa taaaaaaaga cctaaaatat 12180 gtaaggggtg acgccaaagt atacactttg ccctttacac attttaggtc ttgcctgctt 12240 tatcagtaac aaacccgcgc gatttacttt tcgacctcat tctattagac tctcgtttgg 12300 attgcaactg gtctattttc ctcttttgtt tgatagaaaa tcataaaagg atttgcagac 12360 tacgggccta aagaactaaa aaatctatct gtttcttttc attctctgta ttttttatag 12420 tttctgttgc atgggcataa agttgccttt ttaatcacaa ttcagaaaat atcataatat 12480 ctcatttcac taaataatag tgaacggcag gtatatgtga tgggttaaaa a 12531
<210> 15 <211> 8554 <212> DNA
<213> Seqüência artificial
<220> <223> Descrição de Seqüência artificial: Seqüência de vetor sintética
<400> 15
tcgagaggcc tgacgtcggg cccggtaccg ttgctcgctg atctttcggc ttaacaactt 60 tgtattcaat cagtcgggca tagaaagaaa acgcaatgat ataggaacca actgccgcca 120 aaaccagcca cacagagttg attgtttcgc cacgggagaa agcgattgct ccccaaccca 180 ccgccgcgat aaccccaaag acaaggagac caacgcgggc ggtcggtgac attttagggg 240 acttcttcac gcctactgga aggtcagtag cgttgctgta caccaaatca tcgtcattga 300 tgttgtcagt ctgttttatg gtcacgatct ttactgtttt ctcttcgggt cgtttcaaag 360 ccactatgcg tagaaacagc gggcagaaac tgtgtgcaga aatgcatgca gaaaaaggaa 420 agttcggcca gatgggtgtt tctgtatgcc gatgatcgga tctttgacag ctgggtatgc 480 gacaaatcac cgagagttgt taattcttaa caatggaaaa gtaacattga gagatgattt 540 ataccatcct gcaccattta gagtggggct agtcataccc ccataaccct agctgtacgc 600 aatcgatttc aaatcagttg gaaaaagtca agaaaattac ccgagacata tgcggcttaa 660 agtttggctg ccatgtgaat ttttagcacc ctcaacagtt gagtgctggc actctcgagg 720 gtagagtgcc aaataggttg tttgacacac agttgttcac ccgcgacgac ggctgtgctg 780 gaaacccaca accggcacac acaaaatttt tctcatggag ggattcatca tgccaaagta 840 cgacaattcc aatgctgacc agtggggctt tgaaacccgc tccattcacg caggccagtc 900 agtagacgca cagaccagcg cacgaaacct tccgatctac caatccaccg ctttcgtgtt 960 cgactccgct gagcacgcca agcagcgttt cgcacttgag gatctaggcc ctgtttactc 1020 ccgcctcacc aacccaaccg ttgaggcttt ggaaaaccgc atcgcttccc tcgaaggtgg 1080 cgtccacgct gtagcgttct cctccggaca ggccgcaacc accaacgcca ttttgaacct 1140 ggcaggagcg ggcgaccaca tcgtcacctc cccacgcctc tacggtggca ccgagactct 1200 attccttatc actcttaacc gcctgggtat cgatgtttcc ttcgtggaaa accccgacga 1260 ccctgagtcc tggcaggcag ccgttcagcc aaacaccaaa gcattcttcg gcgagacttt 1320 cgccaaccca caggcagacg tcctggatat tcctgcggtg gctgaagttg cgcaccgcaa 1380 cagcgttcca ctgatcatcg acaacaccat gctcggcgca gacgttgtcg tcgcttccct actgggcggc gtgcttatcg acggcggaaa gccagtattc ccctacttcg tcactccaga ccttggtgca ccagccttcg gcctcaaggt caccctctcc gcattcaacg catgggctgc cctggagcgc cacaacgaaa acgccatcaa ggtggaaaag gttaacttcg caggcctgaa gcttggcctg aagtacaccg gctccgttct ggcttgggca tttatcgacg ccctgaagct tcgctccctc gttgttcacc cagcaaccac ggcacgcgcg ggcgttaccc agtccaccgt tgatatcatc gctgacctcg aaggcggctt ggatatcgtc gagagctgcc aattattccg aagtactttt gcgaagcgcc atctgacgga aacctacgaa aggatttttt acccatgccc caagcgatcg gtgatgtctc caccgaagcc tatcaccgct ggggtgaata ccgcgtagat gaacacgccc tcactggaga ttccaacgca ggcaaagcca tcaacactga tatttactgc aacggttcca ccggacctgg ctccatgcat cccgccacgt ccattcgtga tcaggtaaac atcaccacgg tcgccgcagt acttggtggt gccgcaatgt acccagaaac tgttggcgca agcgcctggc aaatcggcat tcaatccgcc tggcacgaag gcaactacta cgaatccggc cgacgcatcg cccacctcac ctaccgtggc aaagcccaaa agaacgaaaa cccactcggt gtggaatcct acttggacta ccaagcagac tacgtcttgc tcaccgacgc cctcaaccgc aacaaggcac tcgaatccat caaagttcca ttgtacccct accaccagca agaacacctc gcaaaaatcg tatcccctgt cggccacgat cgcatcgtga ggaacttctt cagcctcatc atcgagttct acatctaaca tatgactagt ctcttctgcg ttaattaaca attgggatcc ctgctaaagg aagcggaaca cgtagaaagc gaatgtcagc tactgggcta tctggacaag agcttgcagt gggcttacat ggcgatagct accggaattg ccagctgggg cgccctctgg gatggctttc ttgccgccaa ggatctgatg aggatgagga tcgtttcgca tgattgaaca ttgggtggag aggctattcg gctatgactg cgccgtgttc cggctgtcag cgcaggggcg cggtgccctg aatgaactgc aggacgaggc cgttccttgc gcagctgtgc tcgacgttgt gggcgaagtg ccggggcagg atctcctgtc catcatggct gatgcaatgc ggcggctgca ccaccaagcg aaacatcgca tcgagcgagc tcaggatgat ctggacgaag agcatcaggg caaggcgcgc atgcccgacg gcgaggatct gaatatcatg gtggaaaatg gccgcttttc ggcggaccgc tatcaggaca tagcgttggc cgaatgggct gaccgcttcc tcgtgcttta cgccttctat cgccttcttg acgagttctt gaccaagcga cgcccaacct gccatcacga aggttgggct tcggaatcgt tttccgggac ctcatgctgg agttcttcgc ccacgctagc gcacagatgc gtaaggagaa aataccgcat ctcgctgcgc tcggtcgttc ggctgcggcg acggttatcc acagaatcag gggataacgc aaaggccagg aaccgtaaaa aggccgcgtt
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<220> <223> Descrição de Seqüência artificial: Seqüência de plasmídeo sintética
<400> 24
ttgatcagcg gccgcttcgc gaagcttgtc gaccgaaaca gcagttataa ggcatgaagc 60 tgtccggttt ttgcaaaagt ggctgtgact gtaaaaagaa atcgaaaaag accgttttgt 120 gtgaaaacgg tctttttgtt tccttttaac caactgccat aactcgaggc tattgacgac 180 agctatggtt cactgtccac caaccaaaac tgtgctcagt accgccaata tttctccctt 240 gaggggtaca aagaggtgtc cctagaagag atccacgctg tgtaaaaatt ttacaaaaag 300 gtattgactt tccctacagg gtgtgtaata atttaattac aggcgggggc aaccccgcct 360 gttctagaag gaggagaaaa catgtcacag cacgttgaaa cgaaattagc tcaaattggg 420 aaccgtagcg atgaagtcac gggaacagtg agtgctccta tctatttatc aacagcatac 480 cgccacagag ggatcggaga atctaccgga tttgattatg tccgcacaaa aaatccgaca 540 cgccagcttg ttgaggacgc gatcgctaac ttagaaaacg gcgcgagagg gcttgccttt 600 agttcgggaa tggctgctat ccaaacgatt atggcgctgt ttaaaagcgg agatgaactg 660 atcgtttcat cggacctata tggcggcacg taccgtttat ttgaaaatga atggaaaaaa 720 tacggattga cttttcatta tgatgatttc agcgatgagg actgtttacg ctctaagatt 780 acgccgaata caaaagcggt gtttgtggaa acgccgacaa accccctcat gcaggaggcg 840 gacattgaac atattgcccg 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aaattattac acaccctgta gggaaagtca 1320 ggatctcttc tagggacacc tctttgtacc 1380 cacagttttg gttggtggac agtgaaccat 1440 gttggttaaa aggaaacaaa aagaccgttt 1500 ttacagtcac agccactttt gcaaaaaccg 1560 gaagcggccg cacagcgatc ccagaggaaa 1620 agtttggctg ccatgtgaat ttttagcacc 1680 gtagagtgcc aaataggttg tttgacacac 1740 gaaacccaca accggcacac acaaaatttt 1800 cgaacaaatt aataaagtga aaaaaatact 1860 tacttacatg tttggatcag gagttgagag 1920 tttagtcgtc gtatctgaac cattgacaga 1980 tagacctatt tcaaaaaaaa taggagataa 2040 tattattcag caagaaatgg taccgtggaa 2100 agaatggtta caagagcttt atgaacaagg 2160 tttaaccata atgctttacc aagcaaaacg 2220 cttagaggaa ttactacctg atattccatt 2280 gtcagaggaa ttaatagata attatcagga 2340 ccgtatgatt ttaactatgg acacgggtaa 2400 agtggctgaa tcttctccat tagaacatag 2460 tcttggagag aatattgaat ggactaatga 2520 taacagatta aaaaaattat aaaaaaattg 2580 ttttgtttta ttatttaata tttgggaaat 2640 aaacaataaa cccttgcata gggggatcga 2700 ccgcacgctt tgcgggaggg cggtaccagc 2760 aaagacgctt aataggctag aaaaaggtgg 2820 ccgcagggct 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5 10 15
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Arg Gly Ile Gly Glu Ser Thr Gly Phe Asp Tyr Val Arg 40 45
Pro Thr Arg Gln Leu Val Glu Asp Ala Ile Ala Asn Leu
55 60
Ala Arg Gly Leu Ala Phe Ser Ser Gly Met Ala Ala Ile
70 7 5 80
Met Ala Leu Phe Lys Ser Gly Asp Glu Leu Ile Val Ser
85 90 95
Tyr Gly Gly Thr Tyr Arg Leu Phe Glu Asn Glu Trp Lys
100 105 110
Leu Thr Phe His Tyr Asp Asp Phe Ser Asp Glu Asp Cys
120 125
Lys Ile Thr Pro Asn Thr Lys Ala Val Phe Val Glu Thr 135 140
Pro Leu Met Gln Glu Ala Asp Ile Glu His Ile Ala Arg
150 155 160
Glu His Gly Leu Leu Leu Ile Val Asp Asn Thr Phe Tyr 165 170 175
Thr Pro Val Leu Gln Arg Pro Leu Glu Leu Gly Ala Asp Ile Val Ile 180 185 190
His Ser Ala 195
Leu Val Val 210
Thr Lys Tyr Leu Gly Gly His Asn Asp Leu Leu Ala Gly 200 205
Val Lys Asp Glu Arg Leu Gly Glu Glu Met Phe Gln His 215 220 Gln Asn Ala Ile Gly Ala Val Leu Pro Pro Phe Asp Ser Trp Leu Leu 225 230 235 240
Met Arg Gly Met Lys Thr Leu Ser Leu Arg Met Arg Gln His Gln Ala
245 250 255
Asn Ala Gln Glu Leu Ala Ala Phe Leu Glu Glu Gln Glu Glu Ile Ser
260 265 270
Asp Val Leu Tyr Pro Gly Lys Gly Gly Met Leu Ser Phe Arg Leu Gln
275 280 285
Lys Glu Glu Trp Val Asn Pro Phe Leu Lys Ala Leu Lys Thr Ile Cys 290 295 300
Phe Ala Glu Ser Leu Gly Gly Val Glu Ser Phe Ile Thr Tyr Pro Ala
305 310 315 320
Thr Gln Thr His Met Asp Ile Pro Glu Glu Ile Arg Ile Ala Asn Gly
325 330 335
Val Cys Asn Arg Leu Leu Arg Phe Ser Val Gly Ile Glu His Ala Glu 340 345 350
Asp Leu Lys Glu Asp Leu Lys Gln Ala Leu Cys Gln Val Lys Glu Gly 355 360 365
Ala Val Ser Phe Glu 370
<210> 27 <211> 374
<212> PRT
<213> Bacillus lícheniformis <400> 27
Met Thr Glu His Val Gln Thr Thr Leu Ala Gln Ile Gly Asn Arg Ser 15 10 15
Asp Glu Ile Thr Gly Thr Val Asn Pro Pro Val Tyr Phe Ser Ser Ala
20 25 30
Tyr Arg His Lys Gly Ile Gly Glu Ser Thr Gly Phe Asp Tyr Ile Arg 35 40 45
Thr Lys Asn Pro Thr Arg Gln Leu Val Glu Asp Ala Ile Ala Lys Leu
50 55 60
Glu Gly Gly Thr Arg Gly Phe Ala Phe Ser Ser Gly Met Ala Ala Ile
65 70 75 80
Gln Thr Ile Met Ala Leu Phe Gln Ser Gly Asp Glu Leu Ile Val Ser
85 90 95
Ser Asp Leu Tyr Gly Gly Thr Tyr Arg Leu Phe Glu Asn Glu Trp Lys
100 105 HO
Lys Tyr Gly Leu Arg Phe Leu Tyr Asp Asp Phe Ser Asp Glu Asp Cys 115 120 125
Ile Lys Ser Lys Ile Thr Asp Asn Thr Lys Ala Leu Phe Val Glu Thr 130 135 140
Pro Thr Asn Pro Leu Met Gln Glu Ala Asp Ile Gln Lys Ile Ala Gln 145 150 155 160
Ile Ala Lys Glu Asn Asp Leu Leu Leu Ile Val Asp Asn Thr Phe Tyr 165 170 175
Thr Pro Val Leu Gln Arg Pro Ile Glu Leu Gly Ala Asp Leu Val Ile 180 185 190
His Ser Ala Thr Lys Tyr Leu Gly Gly His Asn Asp Leu Leu Ala Gly 195 200 205
Leu Val Val Ala Lys Gly Glu Glu Leu Ser Glu Glu Met Phe Gln His 210 215 220
Gln Asn Ala Ile Gly Ala Val Leu Ser Pro Phe Asp Ser Trp Leu Leu 225 230 235 240
Met Arg Gly Leu Lys Thr Leu Ala Leu Arg Met Arg Gln His Gln Glu 245 250 255
Asn Ala Arg Glu Leu Ala Ala Phe Leu Glu Glu Gln Glu Glu Ile Ala 260 265 270
Asp Val Leu Tyr Pro Gly Lys Gly Gly Met Leu Ser Phe Arg Val Gln 275 280 285
Lys Glu Glu Trp Val Asn Pro Phe Leu Lys Asn Leu Lys Thr Ile Cys 290 295 300
Phe Ala Glu Ser Leu Gly Gly Val Glu Ser Phe Ile Thr Tyr Pro Ala 305 310 315 320
Thr Gln Thr His Met Asp Ile Pro Glu Asp Ile Arg Ile Ala Asn Gly 325 330 335
Val Cys Asn Arg Leu Leu Arg Phe Ser Val Gly Ile Glu His Val Ser 340 345 350
Asp Leu Lys Gln Asp Leu Lys Ala Ala Leu Glu Lys Val Lys Gly Glu 355 360 365
Ala Val Pro His Glu Ser 370
<210> 28
<211> 387
<212> PRT
<213> Bacillus lícheniformis
<400> 28
Met Lys Lys Gly Phe Leu Leu Phe Lys Gly Trp Cys His Met Thr Glu 1 5 10 15
His Val Gln Thr Thr Leu Ala Gln Ile Gly Asn Arg Ser Asp Glu Ile 20 25 30
Thr Gly Thr Val Asn Pro Pro Val Tyr Phe Ser Ser Ala Tyr Arg His 35 40 45 Lys Gly Ile Gly Glu Ser Thr Gly Phe Asp Tyr Ile Arg Thr Lys Asn
50 55 60
Pro Thr Arg Gln Leu Val Glu Asp Ala Ile Ala Lys Leu Glu Gly Gly
65 70 75 80
Thr Arg Gly Phe Ala Phe Ser Ser Gly Met Ala Ala Ile Gln Thr Ile
85 90 95
Met Ala Leu Phe Gln Ser Gly Asp Glu Leu Ile Val Ser Ser Asp Leu 100 105 HO
Tyr Gly Gly Thr Tyr Arg Leu Phe Glu Asn Glu Trp Lys Lys Tyr Gly 115 120 125
Leu Arg Phe Leu Tyr Asp Asp Phe Ser Asp Glu Asp Cys Ile Lys Ser 130 135 140
Lys Ile Thr Asp Asn Thr Lys Ala Leu Phe Val Glu Thr Pro Thr Asn
145 150 155 160
Pro Leu Met Gln Glu Ala Asp Ile Gln Lys Ile Ala Gln Ile Ala Lys 165 170 175
Glu Asn Asp Leu Leu Leu Ile Val Asp Asn Thr Phe Tyr Thr Pro Val 180 185 190
Leu Gln Arg Pro Ile Glu Leu Gly Ala Asp Leu Val Ile His Ser Ala
195 200 205
Thr Lys Tyr Leu Gly Gly His Asn Asp Leu Leu Ala Gly Leu Val Val
210 215 220
Ala Lys Gly Glu Glu Leu Ser Glu Glu Met Phe Gln His Gln Asn Ala 225 230 235 240
Ile Gly Ala Val Leu Ser Pro Phe Asp Ser Trp Leu Leu Met Arg Gly 245 250 255
Leu Lys Thr Leu Ala Leu Arg Met Arg Gln His Gln Glu Asn Ala Arg
260 265 270
Glu Leu Ala Ala Phe Leu Glu Glu Gln Glu Glu Ile Ala Asp Val Leu
275 280 285
Tyr Pro Gly Lys Gly Gly Met Leu Ser Phe Arg Val Gln Lys Glu Glu 290 295 300
Trp Val Asn Pro Phe Leu Lys Asn Leu Lys Thr Ile Cys Phe Ala Glu
305 310 315 320
Ser Leu Gly Gly Val Glu Ser Phe Ile Thr Tyr Pro Ala Thr Gln Thr 325 330 335
His Met Asp Ile Pro Glu Asp Ile Arg Ile Ala Asn Gly Val Cys Asn 340 345 350
Arg Leu Leu Arg Phe Ser Val Gly Ile Glu His Val Ser Asp Leu Lys 355 360 365
Gln Asp Leu Lys Ala Ala Leu Glu Lys Val Lys Gly Glu Ala Val Pro 370 375 380 His Glu Ser 385
<210> 29 <211> 367
<212> PRT
<213> GeoBacillus kaustophilus
<400> 29
Met Glu Lys Leu Glu Thr Leu Leu Ala Gln Ile Gly Asn Arg Ser Glu 15 10 15
Thr Val Thr Gly Thr Val Asn Pro Pro Val Tyr Phe Ser Thr Ala Tyr
20 25 30
Arg His Ala Gly Ile Gly Glu Ser Thr Gly Phe Asp Tyr Ile Arg Thr 35 40 45
Gly Asn Pro Thr Arg Lys Ile Val Glu Glu Ala Ile Ala Arg Leu Glu
50 55 60
Gly Gly Asp Gln Gly Tyr Ala Phe Ser Ser Gly Met Ala Ala Ile Gln
65 70 75 80
Thr Val Leu Ala Leu Phe Glu Ser Gly Asp Glu Phe Leu Val Ser Ala 85 90 95
Asp Leu Tyr Gly Gly Thr Tyr Arg Leu Phe Glu Arg Gly Trp Arg Lys 100 105 HO
Tyr Gly Leu Gly Phe His Tyr Val Asp Phe Ala Asp Leu Ala Ala Val 115 120 125
Glu Ala Cys Ile Thr Glu Lys Thr Lys Ala Ile Phe Leu Glu Thr Pro 130 135 140—··
Thr Asn Pro Leu Met His Glu Thr Asp Ile Arg Ala Val Ser Glu Phe
145 150 155 160
Ala Lys Arg His Gly Leu Leu Leu Ile Val Asp Asn Thr Phe Tyr Thr
165 170 175
Pro Val Leu Gln Arg Pro Ile Glu Gln Gly Ala Asp Ile Val Ile His 180 185 190
Ser Ala Thr Lys Tyr Leu Gly Gly His Asn Asp Val Leu Ala Gly Leu 195 200 205
Val Val Ala Lys Gly Glu Glu Leu Cys Gln Arg Leu Ala Glu Tyr Gln
210 215 220
Asn Ala Ile Gly Ala Val Leu Ser Pro Phe Asp Ser Trp Leu Leu Ile 225 230 235 240
Arg Gly Met Lys Thr Leu Ala Leu Arg Met Arg Gln His Glu Glu Asn 245 250 255
Ala Lys Arg Ile Ser Ala Phe Leu Arg Glu His Glu Asp Val Thr Asp 260 265 270
Val Leu Tyr Pro Gly Arg Gly Gly Met Leu Ser Phe Arg Ile Ala Asp 275 280 285
Glu Lys Trp Val Asn Gly Phe Leu Lys Ser Leu Arg Leu Ile Thr Phe 290 295 300
Ala Glu Ser Leu Gly Gly Val Glu Ser Phe Ile Thr Tyr Pro Ala Thr
305 310 315 320
Gln Thr His Ala Asp Ile Pro Glu Glu Ile Arg Ile Gln Asn Gly Ile
325 330 335
Cys Asn Arg Leu Leu Arg Phe Ser Val Gly Ile Glu His Ala Asp Asp 340 345 350
Leu Ile Ala Asp Leu Ala Gln Ala Leu Lys Asn Met Lys Glu Val 355 360 365
<210> 30 <211> 378
<212> PRT
<213> Bacillus halodurans
<400> 30
Met Asn Arg Lys Glu Leu Glu Thr Ala Leu Val Gln Ile Gly Asn Arg 1 5 10 15
Met Asp Asp Arg Thr Gly Ala Ile Asn Thr Pro Val Tyr Phe Ser Thr 20 25 30
Ala Tyr Arg His Ser Gly Ile Gly Glu Ser Thr Gly Tyr Asp Tyr Ala 35 40 45
Arg Thr Gly Asn Pro Thr Arg Glu Val Leu Glu Lys Ala Ile Ala Thr
50 55 60
Leu Glu Asn Gly Asp Gln Gly Phe Ala Cys Ser Ser Gly Met Ala Ala
65 70 75 80
Ile Gln Thr Val Phe Ser Leu Phe Gln Ser Gly Asp Glu Ile Ile Ala 85 90 95
Ser Gln Asp Leu Tyr Gly Gly Thr Tyr Arg Leu Phe Glu Gly Gly Trp 100 105 HO
Lys Lys Trp Gly Leu Ser Phe Ser Tyr Ala Asp Pro Arg Asn Leu Ala
115 120 125
Ala Leu Glu Gln Gln Ile Thr Glu Lys Thr Arg Ala Leu Phe Ile Glu 130 135 140
Thr Pro Thr Asn Pro Leu Met Gln Glu Ala Asn Ile Arg Glu Leu Ala
145 150 155 160
Ala Leu Ala Asn Lys His Gly Leu Leu Leu Ile Val Asp Asn Thr Phe 165 170 175
Tyr Thr Pro Leu Leu Gln Gln Pro Leu Asn Glu Gly Thr His Ile Val 180 185 190
Ile His Ser Ala Ser Lys Tyr Leu Gly Gly His Asn Asp Val Ile Ala 195 200 205 Gly Leu Ile Val Ala Lys Gly Gln Glu Leu Cys Glu Gln Ile Ala Tyr
210 215 220
Tyr His Asn Gly Ile Gly Gly Thr Leu Ser Ala Phe Asp Ser Trp Leu
225 230 235 240
Leu Ile Arg Gly Met Lys Thr Leu Ala Leu Arg Met Glu Gln His Gln 245 250 255
Asn Asn Ala Arg Ala Ile Ala Ser Tyr Leu Glu Lys His Glu Gly Val 260 265 270
Thr Asp Val Leu Tyr Pro Gly Arg Gly Gly Met Leu Ser Phe Arg Ile 275 280 285
Gln Ser Glu Ser Trp Val Asn Pro Phe Leu Gln Ser Leu Lys Leu Ile
290 295 300
Ser Phe Ala Glu Ser Leu Gly Gly Val Glu Ser Leu Met Thr Tyr Pro
305 310 315 320
Ala Thr Gln Thr His Ala Asp Ile Pro Glu Asp Val Arg Ile Ala Asn 325 330 335
Gly Val Cys Asn Arg Leu Leu Arg Phe Ser Val Gly Ile Glu His Val
340 345 350
Gly Asp Leu Ile Ala Asp Leu Asp Gln Ala Phe Asn Arg Val Ile Glu 355 360 365
Gln Ser Ala Val Lys Gly Ser Glu Ala Gln 370 375
<210> 31 <211> 370 <212> PRT
<213> Bacillus cereus
<400> 31
Met Ser Thr Ile Glu Thr Lys Leu Ala Gln Ile Gly Asn Arg Ser Glu 15 10 15
Thr Thr Thr Gly Thr Val Asn Pro Pro Val Tyr Phe Ser Thr Ala Tyr 20 25 30
Arg His Glu Gly Ile Gly Lys Ser Thr Gly Phe Asp Tyr Ser Arg Thr 35 40 45
Gly Asn Pro Thr Arg Gly Leu Leu Glu Gln Ala Ile Ala Asp Leu Glu 50 55 60
Tyr Gly Glu Gln Gly Tyr Ala Cys Ser Ser Gly Met Ala Ala Val Leu
65 70 75 80
Leu Val Leu Ser Leu Phe Arg Ser Gly Asp Glu Leu Ile Val Ser Glu 85 90 95
Asp Leu Tyr Gly Gly Thr Tyr Arg Leu Phe Ser Glu His Glu Lys Lys 100 105 110
Trp Asn Val Arg Cys Arg Tyr Val Asn Thr Gln Ser Ile Lys Gln Ile 115 120 125 Glu Gln Ala Ile Thr Thr Glu Thr Lys Ala Ile Phe Ile Glu Thr Pro
130 135 140
Thr Asn Pro Leu Met Gln Val Thr Asp Ile Ala Ala Val Ala Thr Val
145 150 155 160
Ala Lys Arg His Gly Leu Leu Leu Ile Val Asp Asn Thr Phe Tyr Thr
165 170 175
Pro Tyr Ile Gln Gln Pro Leu Thr Glu Gly Ala Asp Ile Val Leu His
180 185 190
Ser Ala Thr Lys Tyr Leu Gly Gly His Asn Asp Val Leu Ser Gly Leu 195 200..................205
Val Val Ala Lys Gly Lys Glu Leu Cys Glu Glu Ile Ala His Tyr His
210 215 220
Asn Ala Ser Gly Ala Val Leu Ser Pro Phe Asp Ser Trp Leu Leu Ile
225 230 235 240
Arg Gly Met Lys Thr Leu Ala Leu Arg Met Arg Gln His Glu Glu Asn
245 250 255
Ala Lys Ala Val Val Ala Tyr Leu Asn Asp Glu Asp Gly Val Thr Asp
260 265 270
Val Phe Tyr Pro Gly Arg Gly Gly Met Ile Ser Phe Arg Leu Lys Asp
275 280 285
Glu Glu Trp Ile Asn Pro Phe Leu Gln Ser Leu Ser Leu Ile Thr Phe
290 295 300
Ala Glu Ser Leu Gly Gly Val Glu Ser Leu Met Thr Tyr Pro Ala Thr 305 310 315 320
Gln Thr His Ala Asp Ile Pro Glu Glu Ile Arg Thr Ala Asn Gly Val
325 330 335
Cys Asn Arg Leu Leu Arg Phe Ser Val Gly Ile Glu Asn Ser Asn Asp
340 345 350
Leu Ile Gln Asp Leu Gln Gln Ala Ile Lys Leu Val Lys Glu Gly Val 355 360 365
Arg Ile 370
<210> 32 <211> 370 <212> PRT
<213> Bacillus cereus <400> 32
Met Ser Thr Ile Glu Thr Lys Leu Ala Gln Ile Gly Asn Arg Ser Glu 15 10 15
Thr Thr Thr Gly Thr Val Asn Pro Pro Val Tyr Phe Ser Thr Ala Tyr
20 25 30
Arg His Glu Gly Ile Gly Gln Ser Thr Gly Phe Asp Tyr Ser Arg Thr 35
40
45
Gly Asn Pro Thr Arg Gly Leu Leu Glu Gln Ala Ile Ala Asp Leu Glu 50 55 60
Tyr Gly Glu Gln Gly Tyr Ala Cys Ser Ser Gly Met Ala Ala Val Leu
65 70 75 80
Leu Val Leu Ser Leu Phe Arg Ser Gly Asp Glu Leu Ile Val Ser Glu 85 90 95
Asp Leu Tyr Gly Gly Thr Tyr Arg Leu Phe Ser Glu His Glu Lys Lys 100 105 110
Trp Asn Val Arg Cys Arg Tyr Val Asn Thr Gln Ser Ile Lys Gln Ile
115 120 125
Glu Gln Ala Ile Thr Thr Glu Thr Lys Ala Ile Phe Ile Glu Thr Pro
130 135 140
Thr Asn Pro Leu Met Gln Val Thr Asp Ile Ala Ala Val Ala Thr Val
145 150 155 160
Ala Lys Arg His Gly Leu Leu Leu Ile Val Asp Asn Thr Phe Tyr Thr 165 170 175
Pro Tyr Ile Gln Gln Pro Leu Thr Glu Gly Ala Asp Ile Val Leu His 180 185 190
Ser Ala Thr Lys Tyr Leu Gly Gly His Asn Asp Val Leu Ser Gly Leu
195 200 205
Val Val Ala Lys Gly Lys Glu Leu Cys Glu Glu Ile Ala His Tyr His
210 215 220
Asn Ala Ser Gly Ala Val Leu Ser Pro Phe Asp Ser Trp Leu Leu Ile
225 230 235 240
Arg Gly Met Lys Thr Leu Ala Leu Arg Met Arg Gln His Glu Glu Asn
245 250 255
Ala Lys Ala Val Val Ala Tyr Leu Asn Asp Glu Asp Gly Val Thr Asp 260 265 270
Val Phe Tyr Pro Gly Arg Gly Gly Met Ile Ser Phe Arg Leu Gln Asp 275 280 285
Glu Thr Trp Ile Asn Pro Phe Leu Gln Ser Leu Ser Leu Ile Thr Phe
290 295 300
Ala Glu Ser Leu Gly Gly Val Glu Ser Leu Met Thr Tyr Pro Ala Thr
305 310 315 320
Gln Thr His Ala Asp Ile Pro Glu Asp Ile Arg Thr Ala Asn Gly Val 325 330 335
Cys Asn Arg Leu Leu Arg Phe Ser Val Gly Ile Glu Asn Ser Asn Asp 340 345 350
Leu Ile Gln Asp Leu Gln Gln Ala Ile Lys Leu Val Lys Glu Gly Val 355 360 365 Arg Ile 370
<210> 33 <211> 370 <212> PRT
<213> Bacillus thuringiensis
<400> 33
Met Ser Thr Ile Glu Thr Lys Leu Ala Gln Ile Gly Asn Arg Ser Glu 15 10 15
Thr Thr Thr Gly Thr Val Asn Thr Pro Val Tyr Phe Ser Thr Ala Tyr
20 25 30
Arg His Glu Gly Ile Gly Lys Ser Thr Gly Phe Asp Tyr Ser Arg Thr
35 40 45
Gly Asn Pro Thr Arg Gly Leu Leu Glu Gln Ala Ile Ala Asp Leu Glu
50 55 60
Tyr Gly Glu Gln Gly Tyr Ala Cys Ser Ser Gly Met Ala Ala Val Leu
65 70 75 80
Leu Val Leu Ser Leu Phe Arg Ser Gly Asp Glu Leu Ile Val Ser Glu 85 90 95
Asp Leu Tyr Gly Gly Thr Tyr Arg Leu Phe Ser Glu His Glu Lys Lys 100 105 HO
Trp Asn Val Arg Cys Arg Tyr Val Asn Thr Gln Ser Ile Lys Gln Ile 115 120 125
Glu Gln Ala Ile Thr Thr Glu Thr Lys Ala Ile Phe Ile Glu Thr Pro
130 135 140
Thr Asn Pro Leu Met Gln Val Thr Asp Ile Ala Ala Val Ala Thr Val
145 150 155 160
Ala Lys Arg His Gly Leu Leu Leu Ile Val Asp Asn Thr Phe Tyr Thr 165 170 175
Pro Tyr Ile Gln Gln Pro Leu Thr Glu Gly Ala Asp Ile Val Leu His 180 185 190
Ser Ala Thr Lys Tyr Leu Gly Gly His Asn Asp Val Leu Ser Gly Leu 195 200 205
Val Val Ala Lys Gly Lys Glu Leu Cys Glu Glu Ile Ala His Tyr His
210 215 220
Asn Ala Ser Gly Ala Val Leu Ser Pro Phe Asp Ser Trp Leu Leu Ile
225 230 235 240
Arg Gly Met Lys Thr Leu Ala Leu Arg Met Arg Gln His Glu Glu Asn 245 250 255
Ala Lys Ala Val Val Ala Tyr Leu Asn Asp Glu Asp Gly Val Thr Asp 260 265 270
Val Phe Tyr Pro Gly Arg Gly Gly Met Ile Ser Phe Arg Leu Lys Asp 275 280 285 Glu Thr Trp Ile Asn Pro Phe Leu 290 295
Ala Glu Ser Leu Gly Gly Val Glu
305 310
Gln Thr His Ala Asp Ile Pro Glu 325
Cys Asn Arg Leu Leu Arg Phe Ser
340
Leu Ile Gln Asp Leu Gln Gln Ala
355 360
Arg Ile 370
Gln Ser Leu Ser Leu Ile Thr Phe
300
Ser Leu Met Thr Tyr Pro Ala Thr
315 320
Glu Ile Arg Thr Ala Asn Gly Val
330 335
Val Gly Ile Glu Asn Ser Asn Asp
345 350
Ile Lys Leu Val Lys Glu Gly Val 365
<210> 34 <211> 370 <212> PRT
<213> Bacillus anthracis
<400> 34
Met Ser Thr Ile Glu Thr Lys Leu Ala Gln Ile Gly Asn Arg Ser Glu 15 10 15
Thr Thr Thr Gly Thr Val Asn Pro Pro Val Tyr Phe Ser Thr Ala Tyr
20 25 30
Arg His Glu Gly Ile Gly Lys Ser Thr Gly Phe Asp Tyr Ser Arg Thr 35 40 45
Gly Asn Pro Thr Arg Gly Leu Leu Glu Gln Ala Ile Ala Asp Leu Glu
50 55 60
Tyr Gly Glu Gln Gly Tyr Ala Cys Ser Ser Gly Met Ala Ala Val Leu
65 70 75 80
Leu Val Leu Ser Leu Phe Arg Ser Gly Asp Glu Leu Ile Val Ser Glu 85 90 95
Asp Leu Tyr Gly Gly Thr Tyr Arg Leu Phe Ser Glu His Glu Lys Lys 100 105 110
Trp Asn Val Arg Cys Arg Tyr Val Asn Thr Gln Ser Ile Lys Gln Ile 115 120 125
Glu Gln Ala Ile Thr Thr Glu Thr Lys Ala Ile Phe Ile Glu Thr Pro 130 135 140
Thr Asn Pro Leu Met Gln Val Thr Asp Ile Ala Ala Val Ala Thr Val
145 150 155 160
Ala Lys Arg His Gly Leu Leu Leu Ile Val Asp Asn Thr Phe Tyr Thr 165 170 175
Pro Tyr Ile Gln Gln Pro Leu Thr Glu Gly Ala Asp Ile Val Leu His
180 185 190
Ser Ala Thr Lys Tyr Leu Gly Gly His Asn Asp Val Leu Ser Gly Leu 195
200
205
Val Val Ala Lys Gly Lys Glu Leu Cys Glu Glu Ile Ala His Tyr His
210 215 220
Asn Ala Ser Gly Ala Val Leu Ser Pro Phe Asp Ser Trp Leu Leu Ile
225 230 235 240
Arg Gly Met Lys Thr Leu Ala Leu Arg Met Arg Gln His Glu Lys Asn 245 250 255
Ala Lys Ala Val Val Ala Tyr Leu Asn Asp Glu Asp Gly Val Thr Asp 260 265 270
Val Phe Tyr Pro Gly Arg Gly Gly Met Ile Ser Phe Arg Leu Lys Asp 275 280 285
Glu Thr Trp Ile Asn Pro Phe Leu Gln Ser Leu Ser Leu Ile Thr Phe
290 295 300
Ala Glu Ser Leu Gly Gly Val Glu Ser Leu Met Thr Tyr Pro Ala Thr
305 310 315 320
Gln Thr His Ala Asp Ile Pro Glu Glu Ile Arg Thr Ala Asn Gly Val 325 330 335
Cys Asn Arg Leu Leu Arg Phe Ser Val Gly Ile Glu Asn Ser Asn Asp 340 345 350
Leu Ile Gln Asp Leu Gln Gln Ala Ile Lys Leu Val Lys Glu Gly Val 355 360 365
Arg Ile 370
<210> 35 <211> 370 <212> PRT
<213> Bacillus cereus
<400> 35
Met Ser Thr Ile Glu Thr Lys Leu Ala Gln Ile Gly Asn Arg Ser Glu 15 10 15
Thr Thr Thr Gly Thr Val Asn Pro Pro Val Tyr Phe Ser Thr Ala Tyr
20 25 30
Arg His Glu Gly Ile Gly Lys Ser Thr Gly Phe Asp Tyr Ser Arg Thr 35 40 45
Gly Asn Pro Thr Arg Gly Leu Leu Glu Gln Ala Ile Ala Asp Leu Glu
50 55 60
Cys Gly Glu Gln Gly Tyr Ala Cys Ser Ser Gly Met Ala Ala Val Leu
65 70 75 80
Leu Val Leu Ser Leu Phe Arg Ser Gly Asp Glu Leu Ile Val Ser Glu 85 90 95
Asp Leu Tyr Gly Gly Thr Tyr Arg Leu Phe Ser Glu His Glu Lys Lys 100 105 HO Trp Asn Val Arg Cys Arg Tyr Val Asn Thr Gln Ser Ile Lys Gln Ile
115 120 125
Glu Gln Ala Ile Thr Thr Lys Thr Lys Ala Ile Phe Ile Glu Thr Pro
130 135 140
Thr Asn Pro Leu Met Gln Val Thr Asp Ile Ala Ala Val Ala Thr Val 145 150 155 160
J
Ala Lys Arg His Gly Leu Leu Leu Ile Val Asp Asn Thr Phe Tyr Thr 165 170 175
Pro Tyr Ile Gln Gln Pro Leu Thr Glu Gly Ala Asp Ile Val Leu His 180 185_________________________________190
O
o
Ser Ala Thr Lys Tyr Leu Gly Gly His Asn Asp Val Leu Ser Gly Leu
195 200 205
Val Val Ala Lys Gly Lys Glu Leu Cys Glu Glu Ile Ala His Tyr His
210 215 220
Asn Ala Ser Gly Ala Val Leu Ser Pro Phe Asp Ser Trp Leu Leu Ile
225 230 235 240
Arg Gly Met Lys Thr Leu Ala Leu Arg Met Arg Gln His Glu Glu Asn 245 250 255
Ala Lys Ala Val Val Ala Tyr Leu Asn Asp Glu Asp Gly Val Thr Asp 260 265 270
Val Phe Tyr Pro Gly Arg Gly Gly Met Ile Ser Phe Arg Leu Lys Asp
275 280 285
Glu Thr Trp Ile Asn Pro Phe Leu Gln Ser Leu Ser Leu Ile Thr Phe
290 295 300
Ala Glu Ser Leu Gly Gly Val Glu Ser Leu Met Thr Tyr Pro Ala Thr
305 310 315 320
Gln Thr His Ala Asp Ile Pro Glu Glu Ile Arg Thr Ala Asn Gly Val 325 330 335
Cys Asn Arg Leu Leu Arg Phe Ser Val Gly Ile Glu Asn Ser Asn Asp 340 345 350
Leu Ile Gln Asp Leu Gln Gln Ala Val Lys Leu Val Lys Glu Gly Val 355 360 365
Arg Ile 370
<210> 36 <211> 370 <212> PRT
<213> Bacillus cereus
<400> 36
Met Ser Thr Ile Glu Thr Lys Leu Ala Gln Ile Gly Asn Arg Ser Glu 15 10 15
Thr Thr Thr Gly Thr Val Asn Pro Pro Val Tyr Phe Ser Thr Ala Tyr 20
25
30
Arg His Glu Gly Ile Gly Lys Ser Thr Gly Phe Asp Tyr Ser Arg Thr 35 40 45
Gly Asn Pro Thr Arg Gly Leu Leu Glu Gln Ala Ile Ala Asp Leu Glu
50 55 60
Tyr Gly Glu Gln Gly Tyr Ala Cys Ser Ser Gly Met Ala Ala Val Leu
65 70 75 80
Leu Val Leu Ser Leu Phe Arg Ser Gly Asp Glu Leu Ile Val Ser Glu 85 90 95
Asp Leu Tyr Gly Gly Thr Tyr Arg Leu Phe Ser Glu His Glu Lys Lys
100 105 HO
Trp Asn Val Arg Cys Arg Tyr Val Asn Thr Gln Ser Ile Lys Gln Ile
115 120 125
Glu Gln Ala Ile Thr Thr Glu Thr Lys Ala Ile Phe Ile Glu Thr Pro 130 135 140
Thr Asn Pro Leu Met Gln Val Thr Asp Ile Ala Ala Val Ala Thr Val 145 150 155 160
Ala Lys Arg Asn Gly Leu Leu Leu Ile Val Asp Asn Thr Phe Tyr Thr
165 170 175
Pro Tyr Ile Gln Gln Pro Leu Thr Glu Gly Ala Asp Ile Val Leu His
180 185 190
Ser Ala Thr Lys Tyr Leu Gly Gly His Asn Asp Val Leu Ser Gly Leu 195 200 205
Val Val Ala Lys Gly Lys Glu Leu Cys Glu Glu Ile Ala His Tyr His
2io 215 -------------2-20
Asn Ala Ser Gly Ala Val Leu Ser Pro Phe Asp Ser Trp Leu Leu Ile
225 230 235 240
Arg Gly Met Lys Thr Leu Ala Leu Arg Met Arg Gln His Glu Glu Asn
245 250 255
Ala Lys Ala Val Val Ala Tyr Leu Asn Asp Glu Asp Gly Val Thr Asp
260 265 270
Val Phe Tyr Pro Gly Arg Gly Gly Met Ile Ser Phe Arg Leu Lys Asp 275 280 285
Glu Ala Trp Ile Asn Pro Phe Leu Gln Ser Leu Ser Leu Ile Thr Phe 290 295 300
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Cys Asn Arg Leu Leu Arg Phe Ser Val Gly Ile Glu Asn Ser Asn Asp
340 345 350
Leu Ile Gln Asp Leu Lys Gln Ala Ile Lys Leu Val Lys Glu Gly Val 355 360 365
Arg Ile 370
<210> 37 <211> 369 <212> PRT
<213> Pasteurella multocida
<400> 37
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Thr Arg Thr Lys Asn Pro Thr Arg Ser Val Leu Glu Glu Thr Ile Ala
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305 310 315 320
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355 360 365
Asn
<210> 38 <211> 369 <212> PRT
<213> Haemophilus somnus <400> 38
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15 10 15
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20 25 30
Thr Ala Tyr Ala His His Gly Ile Gly Glu Ser Thr Gly Phe Asp Tyr 35 40 ------------4-5 ......
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50 55 60
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65 70 75 80
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165 170 175
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Leu Val Gly Leu Ile Val Ala Lys Gly Gln Glu Ile Cys Asp Arg Leu
Tyr Tyr Ile Gln Asn Gly Ala Gly Pro Val Leu Ser Pro Phe Asp Ser
Trp Leu Thr Ile Arg Gly Met Lys Thr Leu Ala Leu Arg Met Glu Arg
His Gln Lys Asn Ala Gln Glu Leu
Gln Val Lys Asp Val Leu Tyr Pro
Arg Leu Gln Asn Glu Asn Trp Val
Leu Ile Thr Phe Ala Glu Ser Leu
Tyr Pro Ala Thr Gln Thr His Met
Ala Arg Gly Val Cys Asn Arg Leu Asn Val Glu Asp Ile Lys Ala Asp
Lys
Ala Asn Phe Leu Arg Glu Gln Pro
Asn Lys Gly Gly Met Leu Ser Phe
Asn Pro Phe Leu Lys Ala Met Lys
Gly Gly Thr Glu Ser Phe Ile Thr
Asp Ile Pro Glu Val Glu Arg Val
Leu Arg Phe Ser Val Gly Leu Glu
Leu Leu Gln Ala Phe Ser Gln Leu
<210> 39
<211> 369 <212> PRT
<213> Mannheimia succiniciproducens
<400> 39
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Lys Ser Asp Ala Arg Thr Gly Ala Thr Ala Tyr Gly His Arg Gly Ile Thr Arg Thr Lys Asn Pro Thr Arg
Lys Leu Glu Asn Gly Asp Gln Gly
Ala Ile Gln Val Leu Met Thr Leu
Ile Leu Ala Gln Ala Gly Asn
Val Ser Thr Pro Ile Phe Leu Ser
Gly Glu Ser Thr Gly Phe Asp Tyr Leu Val Leu Glu Glu Thr Ile Ala
Phe Ala Phe Ser Ser Gly Met Ala
Phe Thr Ala Pro Asp Glu Trp Ile 85
90
95
Val Ser Ser Asp Val Tyr Gly Gly Thr Tyr Arg Leu Leu Asp Phe Ala 100 105 HO
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210 215 220
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225 230 235 240
Trp Leu Thr Ile Arg Gly Leu Lys Thr Leu Ala Leu Arg Met Glu Arg
245 250 255
His Gln Ala Asn Ala Ala Ala Ile Ala Glu Phe Leu Lys Ala Gln Pro
260 265 270
Gln Val Lys Asp Val Leu Tyr Pro Asn Lys Gly Gly Met Leu Ser Phe
275 280 285
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Leu Ile Thr Phe Ala Glu Ser Leu Gly Gly Thr Glu Ser Phe Ile Thr
305 310 315 320
Tyr Pro Thr Thr Gln Thr His Met Asp Ile Pro Ala Glu Glu Arg Ile
325 330 335
Ala Arg Gly Val Thr Asn Asp Leu Leu Arg Phe Ser Val Gly Leu Glu
340 345 350
Asn Val Glu Asp Ile Lys Ala Asp Leu Ala Gln Ala Phe Ala Gln Phe 355 360 365
Lys
<210> 40 <211> 369 <212> PRT
<213> Haemophilus somnus
<400> 40 Met Thr Gln Gln Tyr Ala Leu Asp Thr Leu Leu Ala Gln Thr Gly Asn 15 10 15
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O
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Gln Val Lys Asp Val Leu Tyr Pro Asn Lys Gly Gly Met Leu Ser Phe
275 280 285
Arg Leu Gln Asn Glu Asn Trp Val Asn Pro Phe Leu Lys Ala Met Lys
290 295 300
Leu Ile Thr Phe Ala Glu Ser Leu Gly Gly Thr Glu Ser Phe Ile Thr
305 310 315 320
Tyr Pro Ala Thr Gln Thr His Met Asp Ile Pro Glu Val Glu Arg Val 325 330 335 Ala Arg Gly Val Cys Asn Arg Leu Leu Arg Phe Ser Val Gly Leu Glu 340 345 350
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<210> 41 <211> 381 <212> PRT
<213> Haemophilus influenzae
<400> 41
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<213> Haemophilus influenzae <400> 42
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Gln Val Glu Ser Val Leu Tyr Pro Asn Lys Gly Gly Met Leu Ser Phe 275 280 285
Arg Leu Gln Asp Glu Ala Trp Val Asn Thr Phe Leu Lys Ser Ile Lys
290 295 300
Leu Ile Thr Phe Ala Glu Ser Leu Gly Gly Thr Glu Ser Phe Ile Thr 305 310 315 320
Tyr Pro Ala Thr Gln Thr His Met Asp Ile Pro Glu Ser Glu Arg Val 325 330 335
Ala Arg Gly Ile Thr Asn Thr Leu Leu Arg Phe Ser Val Gly Ile Glu 340 345 350
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Lys
<210> 43 <211> 369 <212> PRT
<213> Haemophilus influenzae
<400> 43
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50 55 60
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Val Ser Ser Asp Val Tyr Gly Gly Thr Tyr Arg Leu Leu Asp Phe Ser
Tyr Lys Asn Asn Asn Ser Val Lys Pro Val Tyr Val Asn Thr Ala Ser Ala Ser Ala Ile Glu Ala Ala Ile Asn Pro Asn Thr Lys Ala Ile Phe
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Ile Ala Lys Leu Ala Lys Lys His Asn Leu Met Leu Ile Val Asp Asn
Thr Phe Leu Thr Pro Val Leu Ser Arg Pro Leu Asp Leu Gly Ala Asp
Val Val Ile His Ser Gly Thr Lys Tyr Ile Ala Gly His Asn Asp Ala
Leu Val Gly Leu Ile Val Ala Lys Gly Gln Glu Leu Cys Asp Arg Ile
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Leu Ile Thr Phe Ala Glu Ser Leu Gly Gly Thr Glu Ser Phe Ile Thr
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Lys
<210> 44 <211> 369 <212> PRT <213> Haemophilus <400> 44
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Lys
<210> 45 <211> 369 <212> PRT
<213> Haemophilus influenzae
<400> 45
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20 25 30
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195 200 205
Leu Val Gly Leu Ile Val Ala Lys Gly Gln Glu Leu Cys Asp Arg Ile
210 215 220
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Lys
<210> 46 <211> 368 <212> PRT
<213> Bacillus clausii <400> 46
Met Glu Lys Arg Ala Glu Thr Ile Leu Ala Gln Ile Gly Asn Arg Arg
1 5 10 15
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Gln Ile Val Leu Ser Leu Phe Glu Gln Gly Asp Gly Ile Ile Cys Ser
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Thr Pro Leu Leu Gln Lys Pro Leu Thr Glu Gly Ala Asp Ile Val Ile 180 185 190
His Ser Ala Thr Lys Tyr Leu Gly Gly His Asn Asp Val Val Ala Gly 195 200 205
Leu Ile Val Ala Lys Gly Ala Asp Leu Cys Glu Arg Leu Ala Tyr Tyr 210 215 220
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Asp Ile Val Ala Asp Leu Leu Gln Ala Ile Ala Ala Ala Lys Lys Ser 355 360 365
<210> 47 <211> 380 <212> PRT
<213> ActinoBacillus pleuropneumoniae
<400> 47
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15 10 15
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Leu Ser Thr Ala Tyr Gly Arg Gly Gly Leu Gly Glu Ser Thr Gly Trp 35 40 45
Asp Tyr Ile Arg Thr Lys Asn Pro Thr Arg Ala Val Leu Glu Gln Gly
50 55 60
Ile Ala Asp Leu Glu Gly Gly Asp Ala Gly Phe Ala Met Ala Ser Gly 65
70
75
80
Met Ala Ala Ile Gln Leu Val Met Ser Leu Phe Lys Ala Pro Asp Glu
85 90 95
Trp Ile Ile Ser Ser Asp Val Tyr Gly Gly Ser Tyr Arg Leu Phe Asp
100 105 HO
Phe Ser His Lys His His Asn Thr Val Lys Pro Val Tyr Val Asn Thr
115 120 125
Ala Asp Leu Ala Ala Ile Glu Ala Ala Ile Thr Pro Asn Thr Lys Ala 130 135 140
Ile Phe Val Glu Thr Pro Ser Asn Pro Leu Met Glu Glu Cys Asp Val
145 150 155 160
Asp Ala Ile Ser Lys Ile Ala Lys Lys His Asn Leu Met Leu Ile Val 165 170 175
Asp Asn Thr Phe Leu Thr Pro Ile Leu Phe Arg Pro Ile Glu His Gly
180 185 190
Ala Asp Ile Val Ile His Ser Ala Thr Lys Tyr Leu Ser Gly His Asn 195 200 205
Asp Val Leu Ala Gly Leu Ile Val Ala Lys Asp Ser Glu Ala Thr Lys
210 215 220
Asn Glu Ala Gly Gln Lys Leu Ser Glu Arg Leu Phe Tyr Phe Gln Asn
225 230 235 240
Cys Ala Gly Ala Val Leu Ser Pro Phe Asp Ser Tyr Leu Ala Val Arg 245 250 255
Gly Leu Lys Thr Leu Ala Leu Arg Met Glu Arg His Gln Ser Asn Ala
260 265 270
Thr Glu Leu Ala Arg Phe Leu Ser Glu Gln Pro Glu Ile Glu Cys Val
275 280 285
Leu Tyr Ser Gly Lys Ser Gly Met Leu Ser Phe Arg Leu Gln Lys Glu 290 295 300
Glu Trp Val Pro Lys Phe Leu Lys Ala Ile Lys Leu Ile Thr Phe Ala
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Glu Ser Leu Gly Gly Thr Glu Ser Phe Ile Thr Tyr Pro Ser Thr Gln
325 330 335
Thr His Met Asp Ile Pro Glu Ala Glu Arg Ile Ala Arg Gly Ile Thr
340 345 350
Asn Asn Leu Leu Arg Phe Ser Val Gly Leu Glu His Val Glu Asp Leu
355 360 365
Lys Val Asp Leu Arg Gln Ala Phe Gly Gln Leu Lys 370 375 380
<210> 48 <211> 374 <212> PRT <213> Listeria monocytogenes
<400> 48
Met Ala Lys Leu Lys Gln Glu Thr Ile Ala Ala Gln Ile Gly Asn Arg 1 5 10 15
Lys Cys Glu Arg Thr Gly Ala Val Asn Met Pro Val Tyr Phe Ser Thr 20 25 30
Ala Tyr Gln His Ala Asp Leu Gly Val Ser Thr Gly Tyr Asp Tyr Thr 35 40 45
Arg Thr Gly Asn Pro Thr Arg Asp Ala Leu Gln Glu Ala Leu Ala Glu 50 55 60
Leu Glu Asn Gly Thr His Ala Phe Ala Thr Ser Ser Gly Met Ser Ala 65 70 75 80
Ile Gln Leu Val Phe Gln Leu Phe Lys Thr Gly Glu His Ile Ile Ser 85 90 95
Ser Gln Asp Leu Tyr Gly Gly Thr Phe Arg Tyr Phe Glu Gln Phe Gly 100 105 110
Ala Gln Tyr Asn Ile Gly Phe Ser Tyr Trp Asp Gly Ala Glu Ile Ala 115 120 125
Asp Leu Glu Lys Leu Val Arg Pro Glu Thr Lys Ala Ile Phe Ile Glu 130 135 140
Thr Pro Thr Asn Pro Leu Met Gln Glu Thr Asp Ile Ala Ala Val Ser 145 150 155 160
Glu Trp Ala Gly Ala His Asp Leu Leu Val Ile Val Asp Asn Thr Phe 165 170 175
Tyr Thr Pro Ile Leu Gln Gln Pro Leu Thr Leu Gly Ala Asp Ile Val 180 185 190
Ile His Ser Ala Thr Lys Tyr Leu Gly Gly His Asn Asp Val Leu Ala 195 200 205
Gly Ala Val Ile Val Lys Glu Glu Arg Leu Gly Asn Phe Phe Phe Asn 210 215 220
Gln Leu Asn Ala Thr Gly Ala Val Leu Ser Pro Phe Asp Ser Trp Leu 225 230 235 240
Leu Ile Arg Gly Leu Lys Thr Leu Val Leu Arg Val Arg Gln His Gln 245 250 255
Ala Asn Ala Glu Lys Ile Ala Ala Phe Leu Glu Ser His Glu Leu Val 260 265 270
Glu Glu Val Arg Tyr Pro Gly Arg Gly Gly Met Ile Ser Phe Phe Ile 275 280 285
Gln Asp Ala Ala Leu Val Ser Pro Leu Leu Lys Glu Leu Glu Leu Phe 290 295 300
Thr Phe Ala Glu Ser Leu Gly Gly Val Glu Ser Leu Ile Thr Tyr Pro 305 310 315 320 Thr Thr Gln Thr His Ala Asp Ile 325
Gly Leu Thr Asp Lys Leu Leu Arg
340
Glu Asp Leu Ile Ala Asp Leu Ser 355 360
Gly Val Ser Ala Arg Gly 370
Pro Glu Glu Leu Arg Asn Ser Tyr 330 335
Ile Ser Val Gly Ile Glu Ala Ser
345 350
Lys Ala Leu Asp Ala Val Leu Glu 365
<210> 49
<211> 374 _________________________________ ..
<212> PRT
<213> Listeria monocytogenes
<400> 49
Met Ala Lys Leu Lys Gln Glu Thr Ile Ala Ala Gln Ile Gly Asn Arg 15 10 15
Lys Cys Glu Arg Thr Gly Ala Val Asn Met Pro Val Tyr Phe Ser Thr 20 25 30
Ala Tyr Gln His Ala Asp Leu Gly Val Ser Thr Gly Tyr Asp Tyr Thr 35 40 45
Arg Thr Gly Asn Pro Thr Arg Asp Ala Leu Gln Glu Ala Leu Ala Glu 50 55 60
Leu Glu Asn Gly Thr His Ala Phe Ala Thr Ser Ser Gly Met Ser Ala
65 70 75 80
Ile Gln Leu Val Phe Gln Leu Phe Lys Thr Gly Glu His Ile Ile Ser 85 90 95
Ser Gln Asp Leu Tyr Gly Gly Thr Phe Arg Tyr Phe Glu Gln Phe Gly 100 105 110
Ala Gln Tyr Gln Ile Gly Phe Ser Tyr Trp Asp Gly Ala Glu Ile Thr 115 120 125
Asp Leu Glu Lys Leu Ile Arg Pro Glu Thr Lys Ala Ile Phe Ile Glu
130 135 140
Thr Pro Thr Asn Pro Leu Met Gln Glu Thr Asp Ile Ala Thr Val Ala
145 150 155 160
Lys Trp Ala His Ala His Asp Leu Leu Val Ile Val Asp Asn Thr Phe 165 170 175
Tyr Thr Pro Val Leu Gln Gln Pro Leu Ser Leu Gly Ala Asp Ile Val 180 185 190
Ile His Ser Ala Thr Lys Tyr Leu Gly Gly His Asn Asp Val Leu Ala 195 200 205
Gly Ala Val Ile Val Lys Glu Glu Lys Leu Gly Lys Phe Phe Phe Asp 210 215 220
Gln Leu Asn Ala Thr Gly Thr Val Leu Ser Pro Phe Asp Ser Trp Leu 225 230 235 240 Leu Ile Arg Gly Leu Lys Thr Leu Val Leu Arg Val Arg Gln His Gln 245 250 255
Ala Asn Ala Gln Lys Ile Ala Ala Phe Leu Glu Glu His Lys Leu Val 260 265 270
Glu Glu Val Arg Tyr Pro Gly Arg Gly Gly Met Ile Ser Phe Phe Ile 275 280 285
Arg Asp Ala Ala Leu Val Ser Pro Leu Leu Lys Glu Leu Glu Leu Phe 290 295 300
Thr Phe Ala Glu Ser Leu Gly Gly Val Glu Ser Leu Ile Thr Tyr Pro 305 310 315 320
Thr Thr Gln Thr His Ala Asp Ile Pro Val Glu Leu Arg Asn Ser Tyr 325 330 335
Gly Leu Thr Asp Lys Leu Leu Arg Ile Ser Val Gly Ile Glu Ala Ser 340 345 350
Glu Asp Leu Ile Ala Asp Leu Ser Lys Ala Leu Asp Ala Val Leu Glu 355 360 365
Glu Val Ser Ala Arg Gly 370
<210> 50
<211> 374
<212> PRT
<213> Listeria monocytogenes
<400> 50
Met Ala Lys Leu Lys Gln Glu Thr Ile Ala Ala Gln Ile Gly Asn Arg 1 5 10 15
Lys Cys Glu Arg Thr Gly Ala Val Asn Met Pro Val Tyr Phe Ser Thr 20 25 30
Ala Tyr Gln His Ala Asp Leu Gly Val Ser Thr Gly Tyr Asp Tyr Thr 35 40 45
Arg Thr Gly Asn Pro Thr Arg Asp Ala Leu Gln Glu Ala Leu Ala Glu 50 55 60
Leu Glu Asn Gly Thr His Ala Phe Ala Thr Ser Ser Gly Met Ser Ala 65 70 75 80
Ile Gln Leu Val Phe Val Phe Gln Leu Phe Lys Thr Gly Glu His Ile Ile Ser 85 90 95
Ser Gln Asp Leu Tyr Gly Gly Thr Phe Arg Tyr Phe Glu Gln Phe Gly 100 105 110
Ala Gln Tyr Gln Ile Gly Phe Ser Tyr Trp Asp Gly Ala Glu Ile Ala 115 120 125
Asp Leu Glu Lys Leu Ile Arg Pro Glu Thr Lys Ala Ile Phe Ile Glu 130 135 140
Thr Pro Thr Asn Pro Leu Met Gln Glu Thr Asp Ile Ala Thr Val Ala 145 150 155 160
Lys Trp Ala His Ala His Asp Leu Leu Val lie Val Asp Asn Thr Ph 165 170 175
Tyr Thr Pro Val Leu Gin C-lh Pro Leu Ser Leu Gly Ala Asp lie Va 180 185 190
lie His Ser Ala Thr Lys Tyr Leu Gly Gly His Asn Asp Val Leu A1 195 200 205
Gly Ala Val lie Val Lys Glu Glu Lys Leu Gly Lys Phe Phe Phe Asp 210 215 220
Gin Leu Asn Ala Thr Gly Thr Val Leu Ser Pro Phe Asp Ser Trp Leu 225 230 235 240
Leu lie Arg Gly Leu Lys Thr Leu Val Leu Arg Val Arg Gin His Gin 245 250 255
Ala Asn Ala Gin Lys lie Ala Ala Phe Leu Glu Glu His Lys Leu Val 260 265 270
Glu Glu Val Arg Tyr Pro Gly Arg Gly Gly Met He Ser Phe Phe lie 275 280 285
Arg Asp Ala Ala Leu Val Ser Pro Leu Leu Lys Glu Leu Glu Leu Phe 290 295 300
Thr Phe Ala Glu Ser Leu Gly Gly Val Glu Ser Leu I.l.e Thr Tyr Pro 305 310 315 320
Thr Thr Gin Thr His Ala Asp lie Pro Val Glu Leu Arg Asn Ser Tyr 325 330 335
Gly Leu Thr Asp Lys Leu Leu Arg lie Ser Val Gly lie Glu Ala Ser 340 345 350
Glu Asp Leu lie Ala Asp Leu Ser Lys Ala Leu Asp Ala Val Leu Glu 355 360 365
Glu Val Ser Ala Arg Gly 370
<210> 51
<211> 374
<212> PRT
<213> Listeria innocua
<400> 51
Met Ala Lys Lou lys Gin Glu Thr lie Ala Ala Gin lie Gly Asn Arg 1 5 10 15
Lys Cys Glu Arg Thr Gly Ala Val Asn Met Pro Val Tyr Phe Ser Thr 20 25 30
Ala Tyr Gin His Ala Asp Leu Gly Val Ser Thr Gly Tyr Asp Tyr Thr 35 40 45
Arg Thr Gly Asn Pro Thr Arg Asp Ala Leu Gin Glu Ala Leu Ala Glu 50 55 60 Leu Glu Asn Gly Thr His Ala Phe Ala Thr Ser Ser Gly Met Ser Ala 65 70 75 80
Ile Gln Leu Val Phe Gln Leu Phe Lys Thr Gly Glu His Ile Ile Ser 85 90 95
Ser Gln Asp Leu Tyr Gly Gly Thr Phe Arg Tyr Phe Glu Gln Phe Gly
100 105 110
Ala Gln Tyr Gln Ile Gly Phe Ser Tyr Trp Asp Gly Ala Asn Val Asn 115 120 125
Asp Leu Glu Lys Leu Val Arg Pro Glu Thr Lys Ala Ile Phe Ile Glu
130 135 140
Thr Pro Thr Asn Pro Leu Met Gln Glu Thr Asp Ile Ala Ser Val Ser 145 150 155 160
Arg Trp Ala His Ala Asn Asp Leu Leu Val Ile Val Asp Asn Thr Phe 165 170 175
Tyr Thr Pro Val Leu Gln Gln Pro Leu Thr Leu Gly Ala Asp Ile Val 180 185 190
Val His Ser Ala Thr Lys Tyr Leu Gly Gly His Asn Asp Val Leu Ala
195 200 205
Gly Ala Val Ile Val Lys Glu Glu Trp Leu Gly Lys Phe Phe Phe Asp 210 215 220
Gln Leu Asn Ala Thr Gly Thr Val Leu Ser Pro Phe Asp Ser Trp Leu 225 230 235 240
Leu Ile Arg Gly Leu Lys Thr Leu Val Leu Arg Val Arg Gln His Gln 245 250 255
Ala Asn Ala Glu Lys Ile Ala Ala Phe Leu Glu Glu His Glu Leu Val 260 265 270
Glu Glu Val Arg Tyr Pro Gly Arg Gly Gly Met Ile Ser Phe Phe Ile
275 280 285
Lys Asp Ala Ala Leu Val Ser Pro Leu Leu Lys Glu Leu Glu Leu Phe
290 295 300
Thr Phe Ala Glu Ser Leu Gly Gly Val Glu Ser Leu Ile Thr Tyr Pro 305 310 315 320
Thr Thr Gln Thr His Ala Asp Ile Pro Leu Glu Leu Arg Asn Ser Tyr 325 330 335
Gly Leu Thr Asp Lys Leu Leu Arg Ile Ser Val Gly Ile Glu Ala Ser
340 345 350
Glu Asp Leu Ile Ala Asp Leu Ser Lys Ala Leu Asp Ala Val Leu Lys 355 360 365
Gly Val Thr Ala Arg Gly 370
<210> 52 <211> 384 <212> PRT
<213> Clostridium acetobutylicum <400> 52
Met Gly Glu Ile Asp Cys Arg Asn Phe Glu Thr Lys Ala Val His Gly
Glu Ser Gly Phe Glu Ser Arg Thr Gly Ala Ile Ser Tyr Pro Ile Tyr
Glri Ser Ser Thr Phe Arg His Glu Gly Leu Asn Lys Gly Thr Gly Tyr
Asp Tyr Ser Arg Thr Gly Asn Pro Thr Arg Asp Glu Val Glu Lys Thr
Val Ala Ala Leu Glu Asn Gly Arg Ala Cys Leu Ala Tyr Ser Ser Gly
Met Ala Ala Ile Ser Ser Val Leu Thr Ile Phe Lys Gly Gly Asp His
Ile Ile Val Ser Asp Asp Leu Tyr Gly Gly Thr Tyr Arg Ile Phe Glu
Glu Ile Tyr Glu His Tyr Gly Ile Glu Val Thr Tyr Thr Asp Thr Thr
Ser Thr Glu Asn Ile Glu Lys Glu Leu Arg Glu Asn Thr Lys Ala Ile
Tyr Leu Glu Thr Pro Thr Asn Pro Leu Met Lys Ile Thr Asp Ile Arg
Glu Val Ser Lys Leu Ala Lys Glu His Asn Thr Leu Leu Ile Val Asp
Asn Thr Phe Met Thr Pro Tyr Tyr Gln Lys Pro Leu Glu Leu Gly Ala
Asp Ile Val Leu His Ser Gly Thr Lys Tyr Leu Cys Gly His Asn Asp
Ala Leu Ala Gly Phe Val Ile Leu Asn Asp Glu Arg Leu Ile Glu Lys
Leu Arg Phe Ile Gln Asn Ser Val Gly Ala Val Leu Ala Pro Phe Asp
Ser Trp Leu Ile Leu Arg Gly Ile Lys Thr Leu His Ile Arg Leu Asp
Arg Gln Gln Glu Asn Ala Ile Lys Ile Ala Asn Phe Leu Lys Lys His
Lys Lys Ile Thr Lys Val Leu Tyr Pro Gly Leu Glu Glu His Val Gly
His Asp Ile Leu Lys Ser Glu Ala Ser Gly Phe Gly Ala Met Ile Ser
Phe Tyr Val Asp Ser Lys Glu Thr Val Glu Lys Val Leu Glu Ser Val Lys Val Ile Ile Phe Ala Glu Ser Leu Gly Gly Val Glu Ser Leu Ile 325 330 335
Thr Tyr Pro Tyr Thr Gln Thr His Ala Asp Ile Pro Asp Asp Ile Arg 340 345 350
Lys Arg Leu Gly Val Thr Asp Lys Leu Leu Arg Phe Ser Val Gly Ile 355 360 365
Glu Asn Val Asp Asp Leu Ile Lys Asp Leu Asp Lys Ala Leu Gln Ala 370 375 380
<210> 53 <211> 359 <212> PRT <213> Symbiobacterium thermophilum
<400> 53
Met Lys Leu Asp Thr Val Leu Val His Ala Gly Val Arg Arg Asp Pro 1 5 10 15
Ala Tyr Gly Ala Val Ser Val Pro Val Tyr Gln Ser Ala Thr Phe Gln 20 25 30
His Pro Ala Leu Gly Glu Ser Thr Gly Tyr Asp Tyr Ser Arg Ser Gly 35 40 45
Asn Pro Thr Arg Ala Ala Leu Glu Glu Ala Leu Ala Arg Ala Glu Gly 50 55 60
Gly Ala Arg Ala Leu Ala Phe Ala Ser Gly Met Ala Ala Leu Thr Cys 65 70 75 80
Ala Leu Gly Leu Phe Gly Pro Gly Asp His Leu Val Val Thr Glu Asp 85 90 95
Leu Tyr Gly Gly Thr Tyr Arg Leu Leu Glu Gln Val Leu Ala Leu Pro 100 105 110
His Thr Tyr Ala Asp Thr Ala Asp Leu Asp Ala Val Arg Ala Ala Ile 115 120 125
Arg Pro Asp Thr Arg Ala Val Leu Val Glu Ser Leu Thr Asn Pro Arg 130 135 140
Met Lys Arg Ala Asp Val Ala Ala Leu Ala Gly Leu Cys Arg Ala His 145 150 155 160
Gly Leu Leu Leu Ile Val Asp Asn Thr Phe Leu Thr Pro Trp Leu Cys 165 170 175
Arg Pro Leu Glu Leu Gly Ala Asp Ile Val Val His Ser Ala Thr Lys 180 185 190
Tyr Leu Ala Gly His Asn Asp Val Val Ala Gly Ala Leu Ile Thr Arg 195 200 205
Asp Thr Ala Leu Gly Asp Arg Leu Ser Phe Leu Gln Asn Ala Val Gly 210 215 220
Ser Val Leu Gly Pro Gln Asp Ser Trp Leu Val Leu Arg Gly Leu Lys 225 230 235 240
Thr Leu Ala Leu Arg Met Glu Arg His Gln Gln Asn Ala Ala Arg Ile 245 250 255
Ala Ala Trp Leu Arg Glu His Pro Arg Val Glu Glu Val Leu Tyr Pro 260 265 270
Gly Val Gly Gly Met Leu Ser Phe Thr Val Thr Glu Pro Ser Leu Val 275 280 285
Pro Gln Val Leu Arg Arg Val Lys. Leu Ile Leu Phe Ala Glu Ser Leu 290 295 300
Gly Gly Val Glu Ser Leu Ile Thr Phe Pro Trp Thr Gln Thr His Ala 305 310 315 320
Asp Met Pro Glu Glu Val Arg Arg Arg Leu Gly Ile Thr Asp Arg Leu 325 330 335
Leu Arg Leu Ser Val Gly Ile Glu Asp Ala Asp Asp Leu Ile Ala Asp 340 345 350
Leu Ala Gln Ala Leu Glu Gly 355
<210> 54
<211> 373
<212> PRT
<213> LactoBacillus plantarum
<400> 54
Met Thr Lys Gln Ala Glu Lys Leu His Ile Glu Thr Arg Leu Ala Gln 15 10 15
Ala Gly Asn Arg Ser Asp Asp Glu Lys Thr Gly Ala Ile Ser Ala Pro 20 25 30
Ile Tyr Leu Ser Thr Ala Tyr Arg His Ala Gly Leu Gly Gln Ser Thr 35 40 45
Gly Phe Asp Tyr Pro Arg Glu Ala Gln Pro Thr Arg Cys Ile Leu Glu 50 55 60
Arg Val Leu Ala Glu Met Glu His Gly Ile Ala Ala Tyr Ala Leu Thr 65 70 75 80
Ser Gly Met Ala Ala Ile Gln Leu Val Phe Thr Leu Phe Asn Ser Gly 85 90 95
Asp Lys Ile Ile Val Ser Asp Asp Leu Tyr Gly Gly Ser Tyr Arg Phe 100 105 110
Phe Asp Leu Leu His Asp His Tyr His Leu Asp Phe Ala Val Trp Asp 115 120 125
Gly Gln Asp Gln Ala Thr Leu Ala Ala Leu Ala Asp Asp Gln Thr Val 130 135 140 Ala Leu Trp Leu Glu Thr Pro Ser Asn Pro Thr Met Lys Val Ile Asp 145 150 155 160
Ile Thr Ala Thr Ala Ala Thr Ala His Ala His Asp Leu Lys Leu Ile 165 170 175
Val Asp Asn Thr Phe Tyr Thr Pro Leu Ile Gln Lys Pro Leu Asp Leu 180 185 190
Gly Ala Asp Ile Val Val His Ser Ala Thr Lys Tyr Leu Ala Gly His 195 200 205
Asn Asp Val Leu Ala Gly Ala Val Val Val Lys Ser Gln Ala Asp Ala 210 215 220
Asp Ala Leu Glu Phe Asn Leu Val Thr Thr Gly Ala Val Leu Asp Pro 225 230 235 240
Phe Asp Ala Trp Leu Leu Leu Arg Ser Leu Lys Thr Leu Pro Leu Arg 245 250 255
Leu His Gln Gln Glu Ala Asn Ala Gln Glu Leu Val Thr Val Leu Glu 260 265 270
Ala Asp Glu His Val Glu Arg Val Leu Tyr Ser Gly Arg Gly Gly Met 275 280 285
Ile Ser Phe Tyr Leu Ala Thr Gly Thr Asp Val Asp Thr Phe Leu Arg 290 295 300
Ala Leu Asn Val Ile Ser Phe Ala Glu Ser Leu Gly Gly Val Glu Ser 305 310 315 320
Leu Leu Thr Val Pro Ala Val Gln Thr His Ala Asp Leu Thr Glu Glu 325 330 335
Gln Arg Gln Ser Lys Gly Ile Thr Ala Asn Leu Leu Arg Leu Ser Val 340 345 350
Gly Ile Glu Asn Ser Ala Asp Leu Ala Ala Asp Leu Lys Gln Ala Leu 355 360 365
Ile Arg Ala Thr Lys 370
<210> 55
<211> 367
<212> PRT
<213> Staphylococcus epidermidis
<400> 55
Met Lys Asp Thr Asp Leu Ala Gln Ile Ala Leu Thr Gln Asp His Thr 1 5 10 15
Gly Ala Ile Ala Asn Pro Ile Tyr Leu Ser Thr Ala Tyr Gln His Pro 20 25 30
His Leu Gly Glu Ser Thr Gly Tyr Asp Tyr Thr Arg Thr Lys Asn Pro 35 40 45
Thr Arg Thr Ala Phe Glu Glu Ala Phe Ala Gln Leu Glu Lys Gly Ile 50 55 60
Ala Ser Phe Ala Thr Ser Ser Gly Met Ala Ala Ile Glri Leu Ile Cys
65 70 75 80
Asn Ile Phe Lys Pro Gly Asp Glu Ile Leu Val Ala Phe Asp Leu Tyr 85 90 95
Gly Gly Thr Phe Arg Leu Phe Asp Phe Tyr Glu Lys Gln Tyr Gly Leu 100 105 110
Lys Phe Lys Tyr Val Asp Phe Leu Asn Tyr Glu Glu Val Glu Lys Asn
115 120 125
Ile Thr Pro Gln Thr Arg Ala Leu Phe Ile Glu Pro Ile Ser Asn Pro 130 135 140
Gln Met Ile Glu Ile Asp Val Glu Thr Tyr Tyr Ile Leu Ser Lys Lys
145 150 155 160
His Gln Leu Leu Thr Ile Ile Asp Asn Thr Phe Leu Thr Pro Tyr Leu 165 170 175
Ser Thr Pro Leu Glu Glu Gly Ala Asp Ile Val Leu His Ser Ala Thr 180 185 190
Lys Tyr Ile Gly Gly His Asn Asp Val Leu Ala Gly Val Val Thr Val 195 200 205
Lys Asp Ala Gln Leu Ala Glu Gln Leu Asn Gln Phe His Asn Met Ile 210 215 220
Gly Ala Thr Leu Ser Pro Leu Asp Ser Tyr Leu Leu Gln Arg Gly Leu
225 230 235 240
Lys Thr Leu His Leu Arg Ile Glu Arg Ser Gln Glu Asn Ala Gln Lys
245 250 255
Leu Ala Gln Arg Cys Arg Gln Ser 260
Ser Gly Arg Thr Gly Met Leu Ser
275 280
Val Ala Lys Phe Leu Glu Asn Leu 290 295
Leu Gly Gly Thr Glu Thr Phe Ile
305 310
Val Asp Met Pro Asp Glu Glu Lys 325
Leu Ile Arg Leu Ser Val Gly Ile
340
Asp Ile Ile Gln Ala Leu Glu Asn 355 360
Asp Ser Ile Asp Glu Val Leu Tyr
265 270
Leu Arg Leu Asn Gln Ala Tyr Ser 285
Glu Ile Cys Ile Phe Ala Glu Ser
300
Thr Phe Pro Tyr Thr Gln Thr His
315 320
Asp Lys Arg Gly Ile Asp Glu Tyr 330 335
Glu Asp Tyr Asn Asp Ile Glu Ala
345 350
Ser Lys Val Gly Val Ile Ser 365
<210> 56 <211> 367 <212> PRT <213> Staphylococcus epidermidis
<400> 56
Met Lys Asp Thr Asp Leu Ala Gln Ile Ala Leu Thr Gln Asp His Thr
Gly Ala Ile Val Asn Pro Ile Tyr Leu Ser Thr Ala Tyr Gln His Pro
His Leu Gly Glu Ser Thr Gly Tyr Asp Tyr Thr Arg Thr Lys Asn Pro
Thr Arg Thr Ala Phe Glu Glu Ala Phe Ala Gln Leu Glu Lys Gly Ile
Ala Ser Phe Ala Thr Ser Ser Gly Met Ala Ala Ile Gln Leu Ile Cys
Asn Ile Phe Lys Pro Gly Asp Glu Ile Leu Val Ala Phe Asp Leu Tyr
Gly Gly Thr Phe Arg Leu Phe Asp Phe Tyr Glu Lys Gln Tyr Gly Leu
Lys Phe Lys Tyr Val Asp Phe Leu Asn Tyr Glu Glu Val Glu Lys Asn Ile Thr Pro Gln Thr Arg Ala Leu Phe Ile Glu Pro Ile Ser Asn Pro Gln Met Ile Glu Ile Asp Val Glu Pro Tyr Tyr Ile Leu Ser Lys Lys
His Gln Leu Leu Thr Ile Ile Asp Asn Thr Phe Leu Thr Pro Tyr Leu
Ser Thr Pro Leu Glu Glu Gly Ala Asp Ile Val Leu His Ser Ala Thr
Lys Tyr Ile Gly Gly His Asn Asp Val Leu Ala Gly Val Val Thr Val
Lys Asp Ala Gln Leu Ala Glu Gln Leu Asn Gln Phe His Asn Met Ile
Gly Ala Thr Leu Ser Pro Leu Asp Ser Tyr Leu Leu Gln Arg Gly Leu
Lys Thr Leu His Leu Arg Ile Glu Arg Ser Gln Glu Asn Ala Gln Lys Leu Ala Gln Arg Cys Arg Gln Ser Asp Ser Ile Asp Glu Val Leu Tyr
Ser Gly Arg Thr Gly Met Leu Ser Leu Arg Leu Asn Gln Ala Tyr Ser
Val Ala Lys Phe Leu Glu Asn Leu Glu Ile Cys Ile Phe Ala Glu Ser
Leu Gly Gly Thr Glu Thr Phe Ile Thr Phe Pro Tyr Thr Gln Thr His Val Asp Met Pro Asp Glu Glu Lys Asp Lys Arg Gly Ile Asp Glu Tyr 325 330 335
Leu Ile Arg Leu Ser. Val Gly Ile Glu Asp Tyr Asn Asp Ile Glu Ala 340 345 350
Asp Ile Ile Gln Ala Leu Glu Asn Ser Lys Val Gly Val Ile Ser 355 360 365
<210> 57 <211> 386 <212> PRT
<213> Clostridium thermocellum <400> 57
Met Met Lys Val Gly Asn Val Ser Asn Tyr Ser Ile Ser Thr Lys Val 15 10 15
Val His Gly Ser Lys Cys Tyr Asp Pro His Thr Gly Ala Val Ser Phe
20 25 30
Pro Ile Tyr Gln Ser Ala Thr Phe Arg His Pro Ala Leu Tyr Gln Thr 35 40 45
Thr Gly Tyr Asp Tyr Ser Arg Leu Gln Asn Pro Thr Arg Glu Glu Leu 50 55 60
Glu Asn Thr Ile Ala Asn Ile Glu Asn Gly Lys Phe Gly Phe Ala Phe 65 70 75 80
Ser Ser Gly Met Ala Ala Val Ser Thr Ile Leu Ser Leu Phe Ser Pro 85 90 95
Lys Asp His Ile Ile Val Ser Asp Asp Leu Tyr Gly Gly Thr Tyr Arg 100 105 110
Leu Phe Glu Glu Ile Tyr Lys Lys Tyr Gly Leu Glu Phe Ser Tyr Val 115 120 125
Asn Thr Ser Arg Ile Gln Asp Ile Glu Glu Ala Val Lys Glu Asn Thr
130 135 140
Lys Ala Phe Phe Ile Glu Thr Pro Thr Asn Pro Met Met Lys Val Ala 145 150 155 160
Asp Leu Lys Thr Ile Ser Arg Phe Ala Lys Asp Arg Lys Ile Leu Leu 165 170 175
Ile Val Asp Asn Thr Phe Leu Thr Pro Tyr Phe Gln Arg Pro Leu Glu 180 185 190
Leu Gly Ala Asp Ile Val Val His Ser Gly Thr Lys Tyr Leu Gly Gly 195 200 205
His Asn Asp Thr Leu Ala Gly Leu Val Val Val Asn Asp Glu Glu Leu 210 215 220
Ala Glu Arg Ile Lys Leu Ile Gln Lys Ser Glu Gly Ala Val Leu Ser 225 230 235 240
Pro Phe Asp Ser Trp Leu Ile Leu Arg Gly Ile Lys Thr Leu Gly Val 245 250 255 Arg Leu Glu Lys Gln Gln 260
Glu Asn Ala Met Lys Ile Ala Lys Trp Leu 265 270
Cys Thr His Lys Asn Val 275
Thr Lys Val Asn Tyr Val Gly Leu Pro Asp 280 285
His Glu Gly Tyr Glu Ile 290
Ser Lys Ser Gln Ala Ser Gly Phe Gly Ala 295 300
Met Ile Ser Phe Asn Val 305 310
Lys Asp Val Gln Thr Val Glu Lys Val Leu 315 320
Ser Lys Val Gln Leu Val 325
Met Phe Ala Glu Ser Leu Gly Gly Val Glu 330 335
Ser Leu Ile Thr Tyr Pro 340
Ala Val Gln Thr His Ala Ala Ile Pro Glu 345 350
Glu Met Arg Asn Arg Ile 355
Gly Val Thr Asp Thr Leu Leu Arg Leu Ser 360 365
Val Gly Ile Glu Asp Ala 370
Asp Asp Ile Ile Ala Asp Leu Glu Gln Ala 375 380
Leu Glu 385
<210> 58 <211> 378 <212> PRT
<213> Moorella thermoacetica
<400> 5É Met Arg 1
Lys Thr
His Pro
Asn Pro 50
Gly Cys
65
Val Leu
Leu Tyr
Gly Leu
Ala Ser 130
Asn Pro
Leu Ala
Gly Ala 20
Ala Leu
35
Thr Arg
Arg Ala
Cys Leu
Gly Gly 100
Glu Phe
115
Ile Arg Leu Met
Thr Glu
5
Ile Ser Gly Gln
Gln Val
Leu Ala 70
Phe Arg 85
Thr Tyr Ser Leu Asn Asn Lys Ile
Leu Val Thr Pro
Ser Thr
40
Leu Glu
55
Phe Ala
Pro Gly
Arg Leu
Val Asp 120
Thr Lys 135
Thr Asp
Gln Leu
10
Ile Tyr 25
Gly Phe
Glu Gly
Ser Gly
Asp His 90
Leu Asn
105
Thr Thr Gly Ile Ile Ala
Gly Val Gln Ser Asp Tyr
Leu Ala
60
Met Ala 75
Leu Val
Gln Val
Asp Leu
Phe Leu 140
Ala Val
Gly Tyr
Ala Thr
30
Ser Arg 45
Gly Leu
Ala Ile
Val Ser
Ala Val 110
Ala Ala 125
Glu Thr Val Ala
Asp Ser
15
Phe Arg Thr Gly
Glu Gly
Thr Ala 80
Glu Asp 95
Pro Leu Leu Ala Pro Thr Leu Ala 145
150
155
160
Arg Gln Arg Gly Leu Leu Thr Ile Val Asp Asn Thr Phe Met Thr Pro 165 170 175
Tyr Leu Gln Arg Pro Leu Glu Leu Gly Ala Asp Leu Val Val His Ser 180 185 190
Ala Thr Lys Tyr Leu Gly Gly His Asn Asp Val Val Met Gly Ala Ala
195 200 205
Ile Ala Ala Arg Glu Asp Leu Ser Glu Arg Leu Ala Phe Ile Gln Asn
210 215 220
Thr Ile Gly Ala Ile Pro Gly Pro...Gln..Asp...Cys. Trp Leu Val Ile Arg..... 225 230 235 240
Gly Leu Lys Thr Leu Ala Val Arg Leu Glu Arg Ala Gln Ala Asn Ala 245 250 255
Phe Glu Leu Ala Arg Trp Leu Ala Glu His Pro Leu Val Thr Arg Val 260 265 270
Tyr Tyr Pro Gly Leu Pro His His Pro Gly His Glu Ile Cys Lys Lys 275 280 285
Gln Ser Ser Gly Phe Gly Ala Met Leu Ser Phe Glu Val Lys His Ala
290 295 300
Gly Leu Val Glu Gln Ile Leu Gln Arg Leu Lys Ile Ile Ser Phe Ala
305 310 315 320
Glu Ser Leu Gly Gly Val Glu Ser Leu Ile Thr Phe Pro Glu Arg Gln 325 330 335
Thr His Ala Glu Ile Pro Ala Glu Met Arg Leu Lys Leu Gly Ile Asn 340 345 350
Asp Arg Leu Leu Arg Leu Ser Val Gly Leu Glu Asp Leu Asn Asp Leu 355 360 365
Lys Ala Asp Leu Asp Gln Ala Leu Ala Cys 370 375
<210> 59 <211> 364 <212> PRT
<213> Streptococcus thermophilus
<400> 59
Met Thr Gln Asp Tyr Gln Leu Glu Thr Ile Leu Ala His Ala Gly Ile
15 10 15
Asn Ser Asp Glu Ala Thr Gly Ala Leu Ala Ser Pro Ile His Phe Ser 20 25 30
Thr Thr Tyr Gln His Pro Glu Phe Gly Gln Ser Thr Gly Phe Asp Tyr
35 40 45
Thr Arg Thr Lys Asn Pro Thr Arg Ala Thr Val Glu Lys Thr Leu Ala 50 55 60 Ala Ile Glu Lys Ala Asp Tyr Ala Ile Ala Thr Ser Ser Gly Met Ser
65 70 75 80
Ala Ile Val Leu Ala Phe Glu Ile Phe Pro Val Gly Ser Lys Val Val 85 90 95
Ala Ala Arg Asp Leu Tyr Gly Gly Ser Phe Arg Trp Phe Asn Asp Lys 100 105 HO
Glu Lys Glu Gly Arg Phe Phe Phe Glu Tyr Thr Asn Thr Glu Asp Glu
115 120 125
Met Ile Ala Ala Ile Ala Glu Asp Thr Asp Ile Val Tyr Ile Glu Thr 130 135 140
Pro Thr Asn Pro Leu Met Ile Glu Phe Asp Ile Glu Lys Val Ala Gln
145 150 155 160
Thr Ala His Glu Lys Gly Ala Val Val Ile Val Asp Asn Thr Phe Tyr 165 170 175
Ser Pro Ile Tyr Gln Thr Pro Ile Thr Gln Gly Ala Asp Ile Val Val 180 185 190
His Ser Ala Thr Lys Tyr Leu Ser Gly His Asn Asp Val Leu Ala Gly 195 200 205
Val Val Val Thr Ser Asn Pro Glu Phe Tyr Asp Lys Leu Tyr Tyr Asn 210 215 220
Leu Asn Thr Thr Gly Pro Asn Leu Ser Pro Phe Asp Ser Tyr Met Leu
225 230 235 240
Met Arg Gly Leu Lys Thr Leu Lys Leu Arg Met Glu Ala Ser Thr Ala 245 250 255
Asn Ala Lys Glu Val Val Ala Phe Leu Glu Lys Ser Pro Ala Val Lys 260 265 270
Glu Val Leu Tyr Pro Gly Lys Gly Gly Met Ile Ser Phe Lys Val Ala
275 280 285
Asn Gln Asp Lys Ile Pro Thr Ile Ile Asn Thr Leu Lys Val Phe Thr
290 295 300
Phe Ala Glu Ser Leu Gly Gly Val Glu Ser Leu Ile Thr Tyr Pro Ala
305 310 315 320
Thr Gln Thr His Ala Asp Ile Pro Ser Glu Val Arg Ala Ser Tyr Gly 325 330 335
Leu Thr Asp Asp Leu Leu Arg Leu Ser Ile Gly Ile Glu Ala Ala Glu 340 345 350
Asp Leu Ile Ala Asp Leu Glu Asn Ala Leu Ser Leu 355 360
<210> 60 <211> 364 <212> PRT
<213> Streptococcus
pneumoníae <4O0> 60
Met Ser Lys Glu Leu His Ile Asn Thr Ile Leu Ala Gln Ala Gly Ile 1 5 10 15
Lys Ser Asp Glu Ala Thr Gly Ala Leu Val Thr Pro Leu His Phe Ser 20 25 30
Thr Thr Tyr Gln His Pro Glu Phe Gly Arg Ser Thr Gly Phe Asp Tyr 35 40 45
Thr Arg Thr Lys Asn Pro Thr Arg Ser Lys Ala Glu Glu Val Leu Ala
50 55 60
Ala Ile Glu Ser Ala Asp Tyr Ala Leu Ala Thr Ser Ser Gly Met Ser
65 70 75 80
Ala Ile Val Leu Ala Phe Ser Val Phe Pro Val Gly Ser Lys Val Leu 85 90 95
Ala Val Arg Asp Leu Tyr Gly Gly Ser Phe Arg Trp Phe Asn Gln Val 100 105 110
Glu Gln Glu Gly Arg Phe His Phe Thr Tyr Ala Asn Thr Glu Glu Glu 115 120 125
Leu Ile Ala Glu Leu Glu Lys Asp Val Asp Val Leu Tyr Ile Glu Thr 130 135 140
Pro Thr Asn Pro Leu Met Leu Glu Phe Asp Ile Glu Lys Leu Ala Lys 145 150 155 160
Leu Ala His Ala Lys Gly Ala Lys Val Val Val Asp Asn Thr Phe Tyr 165 170 175
Ser Pro Ile Tyr Gln Arg Pro Ile Glu Asp Gly Ala Asp Ile Val Leu 180 185 190
His Ser Ala Thr Lys Tyr Leu Ala Gly His Asn Asp Val Leu Ala Gly 195 200 205
Val Val Val Thr Asn Ser Leu Glu Leu Tyr Glu Lys Leu Phe Tyr Asn 210 215 220
Leu Asn Thr Thr Gly Ala Val Leu Ser Pro Phe Asp Ser Tyr Gln Leu
225 230 235 240
Leu Arg Gly Leu Lys Thr Leu Ser Leu Arg Met Glu Arg Ser Thr Ala 245 250 255
Asn Ala Gln Glu Val Val Ala Phe Leu Lys Asp Ser Pro Ala Val Lys 260 265 270
Glu Val Leu Tyr Thr Gly Arg Gly Gly Met Ile Ser Phe Lys Val Ala 275 280 285
Asp Glu Thr Arg Ile Pro His Ile Leu Asn Ser Leu Lys Val Phe Ser
290 295 300
Phe Ala Glu Ser Leu Gly Gly Val Glu Ser Leu Ile Thr Tyr Pro Thr
305 310 315 320
Thr Gln Thr His Ala Asp Ile Pro Ala Glu Val Arg His Ser Tyr Gly 325 330 335 Leu Thr Asp Asp Leu Leu Arg Leu Ser Ile Gly Ile Glu Asp Ala Arg 340 345 350
Asp Leu Ile Ala Asp Leu Arg Gln 355 360
Ala Leu Glu Gly
<210> 61
<211> 377
<212> PRT
<213> Geobacter sulfurreducens
<400> 61
Met Asn Ile Ala Thr Gln Ala Ala Gln Ile Gly Leu Asp Trp Asp Thr 15 10 15
Arg Thr Gly Ala Val Thr Val Pro Ile Tyr Gln Thr Ala Thr Phe Arg 20 25 30
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Gly Ala Arg Gly Phe Ala Tyr Ala Ser Gly Met Ala Ala Ile Ala Asn
65 70 75 80
Leu Leu Leu Leu Phe Lys Ser Gly Asp His Leu Val Val Thr Glu Asp 85 90 95
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Gly Leu Ser Phe Thr Tyr Val Asp Thr Ser Asp Pro Glu Ala Val Arg 115 120 125
Asp Ala Ile Arg Pro Glu Thr Arg Ala Leu Phe Val Glu Ser Leu Thr
130 135 140
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145 150 155 160
Arg Glu Arg Gly Leu Leu Cys Ile Val Asp Asn Thr Phe Leu Thr Pro 165 170 175
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Gly Thr Lys Tyr Leu Ser Gly His Asn Asp Thr Val Ser Gly Leu Val
195 200 205
Val Val Lys Glu Pro Ala Leu Ala Glu Arg Val Tyr Phe Leu Gln Asn
210 215 220
Ser Val Gly Ala Val Leu Gly Pro Gln Asp Ala Trp Leu Thr Ile Arg
225 230 235 240
Gly Met Lys Thr Leu Ser Val Arg Leu Asp Arg Gln Gln Glu Asn Ala 245 250 255
Gly Arg Ile Ala Glu Trp Leu Ala Arg His Pro Arg Val Pro Arg Val 260 265 270
Phe Tyr Pro Gly Leu Pro Gly His Pro Gly His Glu Leu Leu Ala Arg 275 280 285
Gln Ala Arg Gly Phe Gly Ala Met Ile Ala Phe Glu Val Asp Asp Lys 290 295 300
Ala Leu Val Glu Arg Leu Leu Leu Lys Thr Glu Leu Ile Ser Phe Ala
305 310 315 320
Glu Ser Leu Gly Gly Val Glu Thr Leu Ile Thr Phe Pro Gln Val Gln 325 330 335
Thr His Ala Asp Ile Pro Pro Glu Val Arg Glu Arg Leu Gly Ile Asn 340 345 350
Asp Val Leu Leu Arg Leu Ser Val Gly Ile Glu Asp Ala Asp Asp Leu 355 360 365
Ile Ala Asp Leu Ser Arg Ala Phe Ala 370 375
<210> 62 <211> 391 <212> PRT
<213> Geobacter metallireducens
<400> 62
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Gly Ala Arg Gly Phe Ala Tyr Ala Ser Gly Met Ala Ala Ile Ala Asn 65 70 75 80
Leu Leu Leu Leu Phe Lys Lys Gly Asp His Leu Val Val Thr Glu Asp 85 90 95
Leu Tyr Gly Gly Thr Cys Arg Leu Phe Asp Gln Ile Phe Thr Gln Tyr 100 105 110
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Ala Ala Ile Arg Pro Glu Thr Lys Ala Leu Phe Val Glu Ser Leu Thr
130 135 140
Asn Pro Leu Leu Lys Val Ala Asp Ile Ala Ala Leu Ser Ala Leu Cys 145 150 155 160
Arg Glu Arg Gly Leu Leu His Ile Val Asp Asn Thr Phe Leu Thr Pro 165 170 175 Tyr Leu Leu Arg Pro Phe Asp His Gly Ala Asp Ile Thr Val Tyr Ser
Ala Thr Lys Tyr Leu Ala Gly His Asn Asp Thr Val Ser Gly Leu Val
Ala Val Lys Asp Pro Gln Leu Ala Glu Arg Val Tyr Phe Leu Gln Asn
Ser Val Gly Ala Val Leu Gly Pro Gln Asp Ser Trp Leu Thr Ile Arg
Gly Met Lys Thr Leu Ser Val Arg Leu Asp Arg Gln Gln Glu Asn Ala
Gly Arg Val Ala Gln Trp Leu Ser Asn His Pro Arg Val Arg Lys Val
Tyr Tyr Pro Gly Leu Ser Gly His Pro Gly His Pro Gly His Glu Leu
Leu Ala Arg Gln Ala Arg Gly Phe Gly Ala Met Ile Ala Phe Glu Asp Glu His Ala Leu Val Glu Arg Leu Leu Leu Lys Thr Glu Val Ile
Ser Phe Ala Glu Ser Leu Gly Gly Val Glu Thr Leu Ile Thr Phe Pro
Gln Val Gln Thr His Ala Asp Ile Pro Pro Glu Leu Arg Gln Arg Leu
Gly Ile Asn Asp Val Leu Leu Arg Leu Ser Val Gly Ile Glu Asp Ala
Asp Asp Leu Ile Asp Asp Leu Ala Gln Ala Phe Glu Gly Gly Asp Gln
Gly Ser Gly Thr Gly Asp Arg
<210> 63 <211> 364 <212> PRT
<213> Streptococcus pneumoníae <400> 63
Met Ser Lys Glu Leu His Ile Asn Thr Ile Leu Ala Gln Ala Gly Ile
Lys Ser Asp Glu Ala Thr Gly Ala Leu Val Thr Pro Leu His Phe Ser
Thr Thr Tyr Gln His Pro Glu Phe Gly Arg Ser Thr Gly Phe Asp Tyr
Thr Arg Thr Lys Asn Pro Thr Arg Ser Lys Ala Glu Glu Val Leu Ala O
ο
Ala Ile Glu Ser Ala Asp Tyr Ala Leu Ala Thr Ser Ser Gly Met Ser 65 70 75 80
Ala Ile Val Leu Ala Phe Ser Val Phe Pro Val Gly Ser Lys Val Leu 85 90 95
Ala Val Arg Asp Leu Tyr Gly Gly Ser Phe Arg Trp Phe Asn Gln Val 100 105 110
Glu Gln Glu Gly His Phe His Phe Thr Tyr Ala Asn Thr Glu Glu Glu 115 120 125
Leu Ile Ala Glu Leu Glu Lys Asp Val Asp Val Leu Tyr Ile Glu Thr 130 135 140
Pro Thr Asn Pro Leu Met Leu Glu Phe Asp Ile Glu Lys Leu Ala Lys
145 150 155 160
Leu Ala His Ala Lys Gly Ala Lys Val Val Val Asp Asn Thr Phe Tyr 165 170 175
Ser Pro Ile Tyr Gln Arg Pro Ile Glu Asp Gly Ala Asp Ile Val Leu 180 185 190
His Ser Ala Thr Lys Tyr Leu Ala Gly His Asn Asp Val Leu Ala Gly 195 200 205
Val Val Val Thr Asn Ser Leu Glu Leu Tyr Glu Lys Leu Phe Tyr Asn 210 215 220
Leu Asn Thr Thr Gly Ala Val Leu Ser Pro Phe Asp Ser Tyr Gln Leu
225 230 235 240
Leu Arg Gly Leu Lys Thr Leu Ser Leu Arg Met Glu Arg Ser Thr Ala 245 250 255
Asn Ala Gln Glu Val Val Ala Phe Leu Lys Asp Ser Pro Ala Val Lys 260 265 270
Glu Val Leu Tyr Thr Gly Arg Gly Gly Met Ile Ser Phe Lys Val Ala 275 280 285
Asp Glu Thr Arg Ile Pro His Ile Leu Asn Ser Leu Lys Val Phe Ser 290 295 300
Phe Ala Glu Ser Leu Gly Gly Val Glu Ser Leu Ile Thr Tyr Pro Thr
305 310 315 320
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Asp Leu Ile Ala Asp Leu Arg Gln Ala Ile Glu Gly 355 360
<210> 64 <211> 364 <212> PRT
<213> Streptococcus anginosus
) <400> 64
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35 40 45
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50 55 60
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Ala Ile Val Leu Ala Phe Ser Val Phe Pro Ile Gly Ser Arg Val Ile
85 90 95
Ala Val Arg Asp Leu Tyr Gly Gly Ser Phe Arg Trp Phe His Gln Val
100 105 110
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Leu Leu Ala Ala Leu Thr Glu Asp Ile Asp Val Val Tyr Leu Glu Thr
130 135 140
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145 150 155 160
Lys Ala His Ala Lys Gly Ala Lys Val Ile Val Asp Asn Thr Phe Tyr 165 170 175
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His Ser Ala Thr Lys Tyr Leu Gly Gly His Asn Asp Val Leu Ala Gly 195 200 205
Ala Leu Met Thr Ser Asp Lys Glu Leu Tyr Glu Asn Leu Phe Tyr Asn 210 215 220
Leu Asn Thr Thr Gly Ala Val Leu Ser Pro Phe Asp Ser Tyr Leu Leu
225 230 235 240
Leu Arg Gly Leu Lys Thr Leu Ser Leu Arg Met Glu Arg Ser Thr Lys 245 250 255
Asn Ala Gln Ala Val Ala Ala Phe Leu Lys Asp Ser Pro Ala Val Lys 260 265 270
Glu Val Leu Tyr Pro Gly Lys Gly Gly Met Ile Ser Phe Lys Val Lys
275 280 285
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Phe Ala Glu Ser Leu Gly Gly Val Glu Ser Leu Ile Thr Tyr Pro Ala 305 310 315 320
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Leu Thr Asp Asp Leu Leu Arg Leu Ser Ile Gly Ile Glu Asp Ser Gln 340 345 350
Asp Leu Ile Thr Asp Leu Lys Phe Ala Leu Glu Val 355 360
<210> 65 <211> 364 <212> PRT
<213> Streptococcus mutans
<400> 65
Met Thr Glu Asp Tyr Lys Leu Ãsp Thr Ile Leu Ala His Ala Gly Ile 1 5 10 15
Asn Thr Asp Lys Thr Thr Gly Ala Leu Thr Ala Pro Ile His Leu Ser 20 25 30
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Lys Ile Glu Lys Ala Lys Tyr Ala Leu Val Thr Ser Ser Gly Met Ala
65 70 75 80
Ala Leu Val Leu Leu Phe Thr Gly Phe Pro Ile Gly Ser Lys Val Val
85 90 95
Ala Ala Arg Asp Leu Tyr Gly Gly Ser Phe Arg Trp Phe Asn Glu Gln 100 105 110
Glu Lys Ala Gly Arg Phe Ser Phe Val Tyr Thr Asn Thr Glu Thr Asp 115 120 125
Met Ile Ala Ala Ile Ser Asp Glu Thr Asp Tyr Val Phe Ile Glu Thr 130 135 140
Pro Thr Asn Pro Leu Met Ile Glu Phe Asp Ile Ser Lys Val Ala Gln
145 150 155 160
Ala Ala His Lys His Gly Ala Lys Val Ile Val Asp Asn Thr Phe Tyr 165 170 175
Ser Pro Ile Tyr Gln Asn Pro Leu
180
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Val Leu Gly Ala Asp Val Val Leu 185 190
Gly His Asn Asp Val Leu Ala Gly
205
Ile Tyr Asp Lys Leu Phe Tyr Asp 220
Ser Pro Leu Asp Thr Tyr Leu Leu 235 240
Met Arg Gly Leu Lys Thr Leu Lys Leu Arg Met Glu Lys Ala Thr Gln 245 250 255 Asn Ala Lys Thr Val Val Ala Tyr Leu Glu Lys Ser Pro Ala Val Lys 260 265 270
Glu Val Leu Tyr Thr Gly Lys Gly Gly Met Ile Ser Phe Lys Val Val
275 280 285
Asp Glu Lys Lys Ile Pro Glri Ile Leu Asn His Leu Gln Leu Phe Thr
290 295 300
Phe Ala Glu Ser Leu Gly Gly Val Glu Ser Leu Ile Thr Tyr Pro Ala 305 310 315 320
Thr Gln Thr His Leu Asp Ile Pro Glu Glu Val Arg His Ser Tyr Gly 325 330 335
Leu Thr Asp Asp Leu Leu Arg Leu Ser Ile Gly Ile Glu Asp Ala Glu
340 345 350
Asp Leu Ile Asp Asp Leu Lys Ala Ala Leu Glu Ala 355 360
<210> 66 <211> 380 <212> PRT
<213> Bacillus licheniformis
<400> 66 Met Lys 1
Lys Thr
Gln Pro
Asn Pro 50
Gly Ala
65
Val Met
Val Tyr
Gly Ile
Lys Ala
130
Asn Pro
145
Lys Lys
Pro Lys Thr Lys 5
Met Ile His
Gly Gly 10
Ile Thr
Gly Asp Glu 15
Gly Ala Val Ser 20
Arg Ala Gly Gln
35
Thr Arg Thr Ala
Val Pro Ile 25
His Thr Gly
40
Leu Glu Ser 55
Tyr Gln Val Ser Tyr Glu
Leu Ile
Tyr Ser
45
Ala Asp 60
Thr Tyr Lys
30
Arg Thr Gly Val Glu Gly
Ala Gly Tyr Ala 70
Met Leu Phe Lys 85
Phe Gly Ser Ser Gly Asp
Gly Met
75
His Ile
90
Ala Ala
Val Leu
Ile Thr Ala
80
Thr Asp Asp 95
Gly Gly Thr Tyr 100
Arg Val Met 105
Thr Lys Val Leu
Asn Arg Ile
110
Glu Ala Thr Phe 115
Ser Asp Thr
120
Ser Ser
Ile Glu 125
Asp Ile Glu
Ile Lys Pro Asn
Thr Lys Ala 135
Ile Tyr
Val Glu 140
Thr Pro Thr
Leu Leu Lys Ile 150
Thr Asp Ile
Lys Lys 155
Thr Ala
Glu Thr Ala 160
His Asp Leu Leu
165
Leu Ile Val
Asp Asn 170
Thr Phe
Tyr Thr Pro 175
Tyr Phe Gln Asn Pro Ile Ser Leu Gly Ala Asp Ile Val Leu His Ser 180
185
190
Ala Thr Lys Tyr Leu 195
Gly Gly His Ser Asp Val Val Gly Gly Leu Val 200 205
Val Ala Ala Ser Lys 210
Glu Leu Ala Glu Glu Ile His Phe Ile Gln Asn 215 220
Ser Thr Gly Gly Ile 225
Leu Gly Pro Gln Asp Ser Trp Leu Leu Met Arg 230 235 240
Gly Met Lys Thr Leu 245
Gly Leu Arg Met Glu Ala His Glu Gln Asn Ala 250 255
Arg.Lys Ile Ala Ala 260
Phe Leu Asp_ Asp His Pro Ala Val Lys Lys Val 2 65 270
Tyr Tyr Pro Gly Leu 275
Pro Ser His Pro Gly His Glu Leu Ala Lys Arg 280 285
Gln Ser Thr Gly Phe 290
Gly Gly Met Ile Ser Phe Asp Ile Gly Lys Glu 295 300
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Val Leu Gly Arg Leu Lys Trp Phe Thr Ile Ala 310 315 320
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Thr His Ala Ser Ile 340
Pro Pro Glu Arg Arg Leu Glu Leu Gly Ile Thr 345 350
Asp Gly Leu Ile Arg 355
Ile Ser Ala Gly Val Glu Asp Ile Asp Asp Leu 360 365
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<210> 67 <211> 362 <212> PRT
<213> Lactococcus Iactis <400> 67
Met Asp Lys Arg Leu Asp Thr Leu Leu Ala Gln Val Gly Ile His Gln 15 10 15
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Tyr Gln His Pro Glu Phe Gly Gln Ser Thr Gly Phe Asp Tyr Thr Arg
35 40 45
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50 55 60
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Glu Gly Arg Phe Tyr Phe Ser Tyr Ala Lys Thr Glu Lys Glu Met Leu 115 120 125
Glu Leu Ile Asp Glu Asn Thr Asp Ile Val Tyr Ile Glu Thr Pro Thr 130 135 140
Asn Pro Met Met Val Lys Tyr Asn Ile Glu Lys Ile Ala Asn Lys Ala 145 150 155 160
Gln Ala Tyr His Ala Lys Val Ile Val Val Asn Thr Phe Tyr Thr Pro 165 170 175
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Thr Thr Gly Ala Val Leu Ser Pro Phe Asp Ser Tyr Leu Val Met Arg 225 230 235 240
Gly Leu Lys Thr Leu Ser Leu Arg Met Glu Arg Ala Thr Lys Asn Ala 245 250 255
Gln Lys Ile Val Thr Phe Leu Lys Lys Leu Pro Ser Val Lys Glu Val 260 265 270
Leu Tyr Ser Gly Leu Gly Gly Met Ile Ser Leu Lys Val Thr Asp Lys 275 280 285
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Glu Ser Leu Gly Gly Val Glu Ser Leu Ile Thr Tyr Pro Thr Ala Gln 305 310 315 320
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Asp Asp Leu Leu Arg Leu Ser Ile Gly Ile Glu Asp Val Arg Asp Leu 340 345 350
Ile Glu Asp Leu Lys Glu Ala Leu Glu Asn 355 360
<210> 68
<211> 367
<212> PRT
<213> Staphylococcus aureus
<400> 68
Met Lys Asp Thr Gln Leu Ala Gln Ile Thr Leu Thr Asp Asp Ser Thr 1 5 10 15
Gly Ala Ile Ala Asn Pro Ile His Leu Ser Thr Ala Tyr Lys His Pro 20 25 30 Lys Leu Gly Gln Ser Thr Gly Phe Asp Tyr Thr Arg Thr Lys Asn Pro 35 40 45
Thr Arg Ser Thr Phe Glu Thr Cys Phe Ala Lys Leu Glu His Gly Ile
50 55 60
Ala Ser Phe Ala Thr Ser Ser Gly Met Ser Ala Ile Gln Leu Ile Cys
65 70 75 80
Asn Leu Phe Lys Pro His Asp Glu Ile Leu Val Ser Phe Asp Leu Tyr 85 90 95
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Ile Thr Asp Lys Thr Val Ala Leu Phe Ile Glu Pro Ile Ser Asn Pro
130 135 140
Gln Met Ile Ala Ile Asp Val Lys Pro Tyr Tyr Gln Leu Cys Lys Ala
145 150 155 160
Lys Gly Leu Leu Ser Ile Ile Asp Asn Thr Phe Leu Thr Pro Tyr Leu 165 170 175
Ser Thr Pro Leu Ala Glu Gly Ala Asp Ile Val Leu His Ser Ala Thr 180 185 190
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Lys Asp Glu Ser Leu Ala Gln Gln Leu Phe Asp Phe His Asn Met Thr 210 215 220
Gly Ala Thr Leu Ser Pro Ile Asp Ser Tyr Leu Leu Leu Arg Gly Leu
225 230 235 240
Lys Thr Leu His Leu Arg Ile Glu Arg Ala Gln Ser Asn Ala Arg Lys 245 250 255
Leu Ala Lys Lys Cys Gln Ser Leu Gln Ala Ile Asp Glu Val Leu Tyr 260 265 270
Ser Gly Gln Thr Gly Met Leu Ser Leu Arg Leu Asn Lys Ala Tyr Ser 275 280 285
Val Ala Lys Leu Leu Glu Asn Leu Asp Ile Cys Ile Phe Ala Glu Ser
290 295 300
Leu Gly Gly Thr Glu Thr Leu Val Thr Phe Pro Tyr Thr Gln Thr His
305 310 315 320
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Leu Ile Arg Leu Ser Leu Gly Val Glu Asn Tyr Glu Asp Ile Glu Arg 340 345 350
Asp Ile Ile Gln Ala Leu Asp Lys Ala Gln Ile Gly Glu Ile Val 355 360 365 <210> 69 <211> 367 <212> PRT
<213> Staphylococcus aureus <400> 69
Met Lys Asp Thr Gln Leu Ala Gln Ile Thr Leu Thr Asp Asp Ser Thr 15 10 15
Gly Ala Ile Ala Asn Pro Ile His Leu Ser Thr Ala Tyr Lys His Pro 20 25 30
Lys Leu Gly Gln Ser Thr Gly. Phe. Asp Tyr Thr Arg Thr Lys Asn Pro 35 40 45
Thr Arg Ser Thr Phe Glu Thr Cys Phe Ala Lys Leu Glu His Gly Ile
50 55 60
Ala Ser Phe Ala Thr Ser Ser Gly Met Ser Ala Ile Gln Leu Ile Cys
65 70 75 80
Asn Leu Phe Lys Pro His Asp Glu Ile Leu Val Ser Phe Asp Leu Tyr 85 90 95
Gly Gly Thr Phe Arg Leu Phe Glu Phe Tyr Glu Gln Gln Tyr Asp Ile 100 105 110
Lys Phe Lys Tyr Val Asp Phe Thr Asp Tyr Glu Gln Val Glu Lys Glu
115 120 125
Ile Thr Asp Lys Thr Val Ala Leu Phe Ile Glu Pro Ile Ser Asn Pro 130 135 140
Gln Met Ile Ala Ile Asp Val Lys Pro Tyr Tyr Gln Leu Cys Lys Ala
145 150 155 160
Lys Gly Leu Leu Ser Ile Ile Asp Asn Thr Phe Leu Thr Pro Tyr Leu 165 170 175
Ser Thr Pro Leu Ala Glu Gly Ala Asp Ile Val Leu His Ser Ala Thr 180 185 190
Lys Tyr Ile Gly Gly His Asn Asp Val Leu Ala Gly Val Val Thr Val
195 200 205
Lys Asp Glu Ser Leu Ala Gln Gln Leu Phe Asp Phe His Asn Met Thr 210 215 220
Gly Ala Thr Leu Ser Pro Ile Asp Ser Tyr Leu Leu Leu Arg Gly Leu
225 230 235 240
Lys Thr Leu His Leu Arg Ile Glu Arg Ala Gln Ser Asn Ala Arg Lys 245 250 255
Leu Ala Lys Lys Cys Gln Ser Leu Gln Ala Ile Asp Glu Val Leu Tyr 260 265 270
Ser Gly Gln Thr Gly Met Leu Ser Leu Arg Leu Asn Lys Ala Tyr Ser 275 280 285
Val Ala Lys Leu Leu Glu Asn Leu Asp Ile Cys Ile Phe Ala Glu Ser 290 295 300
Leu Gly Gly Thr Glu Thr Leu Val Thr Phe Pro Tyr Thr Gln Thr His 305 310 315 320
Val Asp Met Pro Asp Ala Glu Lys Asp Lys Arg Gly Ile Asp Glu Tyr 325 330 335
Leu Ile Arg Leu Ser Leu Gly Val Glu Asn Tyr Glu Asp Ile Glu Arg 340 345 350
Asp Ile Ile Gln Ala Leu Asp Lys Ala Gln Ile Gly Glu Ile Val 355 360 365
<210> 70
<211> 367
<212> PRT
<213> Staphylococcus aureus
<400> 70
Met Lys Asp Thr Gln Leu Ala Gln Ile Thr Leu Thr Asp Asp Ser Thr 1 5 10 15
Gly Ala Ile Ala Asn Pro Ile His Leu Ser Thr Ala Tyr Lys His Pro 20 25 30
Lys Leu Gly Gln Ser Thr Gly Phe Asp Tyr Thr Arg Thr Lys Asn Pro 35 40 45
Thr Arg Ser Thr Phe Glu Thr Cys Phe Ala Lys Leu Glu His Gly Ile 50 55 60
Ala Ser Phe Ala Thr Ser Ser Gly Met Ser Ala Ile Gln Leu Ile Cys 65 70 75 80
Asn Leu Phe Lys Pro His Asp Glu Ile Leu Val Ser Phe Asp Leu Tyr 85 90 95
Gly Gly Thr Phe Arg Leu Phe Glu Phe Tyr Glu Gln Gln Tyr Asp Ile 100 105 110
Lys Phe Lys Tyr Val Asp Phe Thr Asp Tyr Glu Gln Val Glu Lys Glu 115 120 125
Ile Thr Asp Lys Thr Val Ala Leu Phe Ile Glu Pro Ile Ser Asn Pro 130 135 140
Gln Met Ile Ala Ile Asp Val Lys Pro Tyr Tyr Gln Leu Cys Lys Ala 145 150 155 160
Lys Gly Leu Leu Ser Ile Ile Asp Asn Thr Phe Leu Thr Pro Tyr Leu 165 170 175
Ser Thr Pro Leu Ala Glu Gly Ala Asp Ile Val Leu His Ser Ala Thr 180 185 190
Lys Tyr Ile Gly Gly His Asn Asp Val Leu Ala Gly Val Val Thr Val 195 200 205
Lys Asp Glu Ser Leu Ala Gln Lys Leu Phe Asp Phe His Asn Met Thr 210 215 220 Gly Ala Thr Leu Ser Pro Ile Asp Ser Tyr Leu Leu Leu Arg Gly Leu 225 230 235 240
Lys Thr Leu His Leu Arg Ile Glu Arg Ala Gln Ser Asn Ala Arg Lys 245 250 255
Leu Ala Glu Lys Cys Gln Ser Leu Gln Ala Ile Asp Glu Val Leu Tyr 260 265 270
Ser Gly Gln Thr Gly Met Leu Ser Leu Arg Leu Asn Lys Ala Tyr Ser 275 280 285
Val Ala Lys Leu Leu Glu Asn Leu Asp Ile Cys Ile Phe Ala Glu Ser 290 295 300
Leu Gly Gly Thr Glu Thr Leu Val Thr Phe Pro Tyr Thr Gln Thr His 305 310 315 320
Val Asp Met Pro Asp Ala Glu Lys Asp Lys Arg Gly Ile Asp Glu Tyr 325 330 335
Leu Ile Arg Leu Ser Leu Gly Val Glu Asn Tyr Glu Asp Ile Glu Arg 340 345 350
Asp Ile Ile Gln Ala Leu Asp Lys Ala Gln Ile Gly Glu Ile Val 355 360 365
<210> 71
<211> 383
<212> PRT
<213> Helicobacter hepaticus
<400> 71
Met Lys Ser Thr Leu Asp Thr Leu Leu Ile His Gly Gly Ala Thr Thr 1 5 10 15
Asp Pro Arg Thr Gly Ala Val Asn Ile Pro Ile Tyr Gln Thr Ser Thr 20 25 30
Tyr Ala Gln Ser Ala Leu Gly Glu His Leu Gly Tyr Glu Tyr Ser Arg 35 40 45
Thr Lys Asn Pro Thr Arg Asp Gly Ile Glu Ser Leu Ile Ala Gln Cys
50 55 60
Glu Gly Gly Lys Phe Gly Phe Ala Phe Ala Ser Gly Met Ala Ala Ile
65 70 75 80
Gly Thr Ile Leu Ser Leu Phe Gln Ser Gly Asp Cys Ile Ile Ile Ser 85 90 95
Asn Asn Val Tyr Gly Gly Thr Phe Arg Ile Leu Asp Lys Val Phe Ser 100 105 110
His Phe Asn Ile Ser Tyr Lys Ile Val Asp Thr Arg Asp Leu Lys Ala 115 120 125
Leu Glu Ser Ala Ile Thr Pro Glu Val Lys Ala Val Leu Ile Glu Thr 130 135 140
Pro Ala Asn Pro Leu Leu Ser Val Thr Pro Leu Glu Gln Val Ala Ile Leu Ala Lys Lys Lys Gly Ile Leu Ser Ile Val Asp Asn Thr Phe Met Thr Pro Tyr Leu Gln Lys Pro Leu Glu Leu Gly Ile Asp Ile Val Met
His Ser Ala Thr Lys Tyr Leu Gly Gly His Ser Asp Leu Ile Ala Gly
Leu Val Val Val Asn Asp Ser Ala Leu Ala Glu Arg Ile Gly Phe Leu
Gln Asn Ser Ile Gly Gly Val Leu Ala Pro Phe Asp Ser Phe Leu Leu
Ile Arg Gly Met Lys Thr Leu Gly Val Arg Leu Gln Arg His Cys Glu
Asn Ala Leu Phe Leu Ala Gln Ala Leu Ser Glu His Ser Gly Val Glu
Lys Val Tyr Tyr Pro Gly Leu Lys Ser Asp Glu Gly Tyr Gln Ile Gln
Asn Ser Gln Ala Arg Ser Gly Gly Gly Met Leu Ser Phe Glu Leu Lys
Lys Asn Tyr Asp Tyr Arg Ile Phe Phe Lys Ser Thr Gln Thr Ile Val
Leu Ala Glu Ser Leu Gly Gly Val Glu Ser Leu Leu Cys His Pro Ala
Ser Met Thr His Ala Ser Ile Pro Lys Asp Val Arg Glu Arg Met Gly
Ile Ser Glu His Leu Ile Arg Leu Ser Val Gly Ile Glu Tyr Ala Gln
Asp Leu Leu Asp Asp Leu Asn Gln Ala Ile Lys Lys Ala Lys Val
<210> 72 <211> 381 <212> PRT
<213> Enterococcus faecium <400> 72
Met His Ile Gln Thr Lys Leu Ile His Gly Gly Ile Ser Glu Asp Pro
Thr Thr Gly Ala Val Ser Val Pro Ile Tyr Gln Thr Ser Thr Tyr Arg
Gln Asp Gly Val Gly Gln Pro Lys Gln Tyr Glu Tyr Ser Arg Ser Gly
Asn Pro Thr Arg Phe Ala Leu Glu Glu Leu Ile Ala Asp Leu Glu Gly Gly Val Arg Gly Phe Ala Phe Ser Ser Gly Leu Ser Gly Ile His Ala
65 70 75 80
Val Phe Ser Leu Phe Gln Ala Gly Asp His Ile Leu Leu Gly Asp Asp 85 90 95
Val Tyr Gly Gly Thr Phe Arg Leu Phe Asp Lys Val Leu Thr Lys Asn 100 105 110
Gly Leu Glu Tyr Thr Ile Ile Asp Thr Ser Asn Leu Asp Lys Ile Glu
115 120 125
Gln Ser Ile Lys Pro Asn Thr Lys Ala Leu Tyr Leu Glu Thr Pro Ser 130 135 140
Asn Pro Leu Leu Lys Ile Thr Asp Leu Glu Lys Ser Ala Thr Leu Ala
145 150 155 160
His Gln His Gly Leu Ile Val Ile Ala Asp Asn Thr Phe Ala Thr Pro 165 170 175
Tyr Phe Gln Arg Pro Leu Asp Leu Gly Ser Asp Ile Val Val His Ser 180 185 190
Gly Thr Lys Tyr Leu Gly Gly His Ser Asp Val Val Ala Gly Leu Val 195 200 205
Thr Ser Asn His Lys Asp Leu Ala Asp Gln Ile Gly Phe Tyr Gln Asn 210 215 220
Ala Ile Gly Ala Val Leu Gly Pro Gln Asp Ser Trp Leu Leu Gln Arg
225 230 235 240
Gly Ile Lys Thr Leu Ser Val Arg Met Glu Glu His Gln Lys Asn Ala 245 250 255
Phe Val Val Ala Asp Phe Leu Phe Ser His Pro Ala Val Glu Lys Val 260 265 270
Tyr Tyr Pro Gly Leu Pro Asp His Glu Leu His Gly Val Ala Lys Gln
275 280 285
Gln Met Ser Gly Phe Ser Gly Met Ile Ser Phe Thr Leu Lys Asn Glu
290 295 300
Glu Ser Ala Ile Pro Phe Val Glu Ser Leu Gln Leu Phe Thr Leu Ala
305 310 315 320
Glu Ser Leu Gly Gly Val Glu Ser Leu Val Glu Ile Pro Ser Val Met 325 330 335
Thr His Ala Ser Ile Pro Lys Glu Lys Arg Glu Glu Ala Gly Ile Lys 340 345 350
Asp Gly Leu Ile Arg Leu Ser Val Gly Ile Glu Tyr Gly Gln Asp Leu 355 360 365
Ile Asn Asp Leu Ala Gln Ala Phe Asp Arg Ile Lys Asn 370 375 380
<210> 73 <211> 378 <212> PRT
<213> Anabaena variabilis
<400> 73
Met Glu Phe Glu Thr Lys Ala Ile His Glu Gly Gln Gln Ser Asp Pro 15 10 15
Gln Thr Gly Ala Val Ile Val Pro Ile Tyr Leu Thr Ser Thr Tyr Gln 20 25 30
Gln Glu Ala Ile Gly Gln His Lys Gly Tyr Glu Tyr Ser Arg Thr Gly 35 40 45
Asn Pro Thr Arg Asn Ala Leu Glu Glu Ala Leu Ala Ala Ile Glu Asn
50 55 60
Gly Glu Tyr Gly Leu Ala Phe Ala Ser Gly Leu Ala Ala Thr Thr Thr
65 70 75 80
Val Leu Ser Leu Leu Lys Ser Cys Asp His Ile Val Ala Gly Asp Asp 85 90 95
Leu Tyr Gly Gly Thr Tyr Arg Leu Leu Glu Arg Val Val Lys Asn Trp 100 105 110
Gly Val Thr Thr Thr Tyr Val Asp Ile Asp Asp Ile Ser Asn Phe Ala 115 120 125
Lys Ala Ile Gln Pro Asn Thr Lys Leu Ile Trp Val Glu Thr Pro Thr 130 135 140
Asn Pro Leu Leu Lys Ile Ile Asp Ile Ala Ala Leu Ala Asn Ile Ala 145 150 155 160
Glu Gln Asn Asn Leu Ile Leu Val Val Asp Asn Thr Phe Ala Ser Pro 165 170 175
Tyr Phe Gln Arg Pro Leu Asp Asn Gly Ala Asp Ile Val Val His Ser 180 185 190
Thr Thr Lys Tyr Leu Gly Gly His Ser Asp Ile Ile Gly Gly Ala Val 195 200 205
Val Thr Ser Asn Glu Gln Leu Tyr Thr Glu Leu Lys Phe Tyr Gln Asn
210 215 220
Ala Ile Gly Ala Val Pro Ser Pro Phe Asp Ser Trp Leu Val Leu Arg
225 230 235 240
Gly Ile Lys Thr Leu Ala Val Arg Met Arg Glu His Glu Lys Asn Ala 245 250 255
Leu Leu Leu Ala Gln Phe Leu Glu Gln His Pro Lys Val Glu Arg Val 260 265 270
Tyr Tyr Pro Gly Leu Pro Ser His Glu Gln His Gln Leu Ala Lys Ser
275 280 285
Gln Met Ser Gly Phe Gly Gly Met Ile Ser Leu Glu Leu Lys Gly Asp 290 295 300
Phe Ala Asp Val Glu Lys Phe Ala Ser Arg Leu Gln Leu Phe Leu Leu 305 310 315 320 Ala Glu Ser Leu Gly Gly Val Glu Ser Leu Leu Cys Tyr Pro Ala Lys 325 330 335
Met Thr His Gly Ser Leu Pro Gln Glu Glu Arg Tyr Lys Arg Gly Ile 340 345 350
Asn Asp Asn Leu Val Arg Leu Ser Val Gly Ile Glu Asn Val Leu Asp 355 360 365
Leu Gln Ala Asp Leu Glu Asn Ala Leu Ser 370 375
<210> 74
<211> 363
<212> PRT
<213> Streptococcus suis
<400> 74
Met Thr Asp Tyr Lys Ile Asp Thr Ile Leu Ala His Thr Gly Ile Asn 1 5 10 15
Ser Asp Glu Arg Thr Gly Ala Leu Ile Ser Pro Ile His Leu Ser Thr 20 25 30
Thr Tyr Gln His Pro Glu Phe Gly Gln Ser Thr Gly Tyr Asp Tyr Thr 35 40 45
Arg Thr Lys Asn Pro Thr Arg Ala Ser Leu Glu Thr Thr Leu Ala Ala 50 55 60
Ile Glu Lys Ala Asp Tyr Ala Leu Ala Thr Ser Ser Gly Met Ala Ala 65 70 75 80
Leu Val Leu Leu Phe Asn Gly Phe Pro Val Gly Ser Gln Val Val Ala 85 90 95
Ala Arg Asp Leu Tyr Gly Gly Ser Phe Arg Trp Phe Asn Glu Gln Glu 100 105 110
Ser Ile Gly Arg Phe Gln Phe Thr Tyr Ala Asn Thr Glu Glu Glu Leu 115 120 125
Ile Ala Ala Ile Thr Glu Glu Thr Asp Tyr Val Tyr Leu Glu Thr Pro 130 135 140
Thr Asn Pro Leu Met Val Glu Phe Asp Ile Ala Lys Val Ser Ala Ile 145 150 155 160
Ala His Ala Lys Gly Ala Lys Val Ile Val Asp Asn Thr Phe Tyr Ser 165 170 175
Pro Ile Tyr Gln Asn Pro Leu Val Leu Gly Ala Asp Val Val Leu His 180 185 190
Ser Ala Thr Lys Tyr Leu Ser Gly His Asn Asp Val Leu Ala Gly Ala 195 200 205
Leu Met Thr Asn Asp Gln Asp Leu Tyr Asp Lys Leu Phe Tyr Asp Gln 210 215 220
Asn Thr Ser Gly Pro Thr Leu Ser Pro Leu Asp Ser Tyr Leu Leu Met <table>table see original document page 171</column></row><table> Ala Lys Ala His Asp Ala Leu Thr Leu Val Asp Asn Thr Phe Ala Thr 165 170 175
Pro Tyr Leu Gln Gln Pro Ile Ala Leu Gly Ala Asp Ile Val Leu His 180 185 190
Ser Ala Thr Lys Tyr Leu Gly Gly His Ser Asp Val Val Ala Gly Leu 195 200 205
Val Thr Thr Asn Ser Lys Glu Leu Ala Ser Glu Ile Gly Phe Leu Gln 210 215 220
Asn Ser Ile Gly Ala Val Leu Gly Pro Gln Asp Ser Trp Leu Val Gln 225 230 235 240
Arg Gly Ile Lys Thr Leu Ala Leu Arg Met Glu Ala His Ser Ala Asn 245 250 255
Ala Gln Lys Ile Ala Glu Phe Leu Glu Thr Ser Lys Ala Val Ser Lys 260 265 270
Val Tyr Tyr Pro Gly Leu Asn Ser His Pro Gly His Glu Ile Ala Lys 275 280 285
Lys Gln Met Ser Ala Phe Gly Gly Met Ile Ser Phe Glu Leu Thr Asp 290 295 300
Glu Asn Ala Val Lys Asp Phe Val Glu Asn Leu Ser Tyr Phe Thr Leu 305 310 315 320
Ala Glu Ser Leu Gly Gly Val Glu Ser Leu Ile Glu Val Pro Ala Val 325 330 335
Met Thr His Ala Ser Ile Pro Lys Glu Leu Arg Glu Glu Ile Gly Ile 340 345 350
Lys Asp Gly Leu Ile Arg Leu Ser Val Gly Val Glu Ala Ile Glu Asp 355 360 365
Leu Leu Thr Asp Ile Lys Glu Ala Leu Glu Lys Lys 370 375 380
<210> 76
<211> 15
<212> PRT
<213> Seqüência artificial
<220>
<223> Descrição de Seqüência artificial: Unidade repetitiva de aminoácido sintético
<220>
<221> M0D_RES
<222> (1)
<223> Asp ou Gln
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)
<223> Leu, lie, Vai, Met, ou Phe <220>
<221> MOD_RES
<222> (3)..(5)
<223> Aminoácido variável
<220>
<221> MOD_RES
<222> (6)
<223> Ser, Thr, Ala, Gly, ou Cys
<220>
<221> MOD_RES
<222> (7)
<223> Ser, Thr, Ala, Gly, Cys, ou Ile
<220>
<221> MOD_RES <222> (10)
<223> Phe, Tyr, Trp, ou Gln
<220>
<221> MOD_RES <222> (11)
<223> Leu, lie, Vai, Met, ou Phe
<220>
<221> MOD_RES <222> (12)
<223> Aminoácido variável <220>
<221> MOD_RES <222> (14) <223> His ou Gln
<220>
<221> M0D_RES
<222> (15)
<223> Ser, Gly, Asn, ou His
<400> 76
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Thr Lys Xaa Xaa Xaa Gly Xaa Xaa 1 5 10 15

Claims (51)

REIVINDICAÇÕES
1. Microorganismo produtor de metionina recombinante, caracterizado pelo fato de que referido microorganismo expressa um gene meti heterólogo.
2. Microorganismo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o gene meti é derivado do gênero Bacillus.
3. Microorganismo de acordo com a reivindicação I5 caracterizado pelo fato de que o gene meti é meti de Bacillus subtilis.
4. Microorganismo de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o microorganismo pertence ao gênero Corynebacterium.
5. Microorganismo de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o microorganismo é Corynebacterium glutanicum.
6. Microorganismo de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o microorganismo compreende um MetI desregulado.
7. Microorganismo de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que a desregulação de MetI é obtida por meio de expressão constitutiva de um gene meti de um promotor e/ou sítio de ligação de ribossoma que não é naturalmente associado com referido gene meti.
8. Cassete de expressão de Meti, caracterizado pelo fato de que compreende meti ligado operacionalmente a um promotor heterólogo e, opcionalmente um sítio de ligação ribossômica.
9. Cassete de expressão de MetI de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que o promotor é Ρ]5, P497, Pi284, P3119, λΡκ, ou XPL.
10. Vetor, caracterizado pelo fato de que compreende o cassete como definido em qualquer uma das reivindicações de 8 a 9.
11. Microorganismo, caracterizado pelo fato de que compreendendo o cassete como definido em qualquer uma das reivindicações de 8 a 9.
12. Microorganismo, caracterizado pelo fato de que compreende o vetor como definido na reivindicação 10.
13. Método para produzir metionina, caracterizado pelo fato de que compreende cultivar microorganismo como definido em qualquer uma das reivindicações de 1 ou 7 em condições de tal forma que metionina seja produzida.
14. Método de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente purificar pelo menos parcialmente a metionina.
15. Método para incrementar a capacidade de produção de metionina em um microorganismo produtor de metionina, caracterizado pelo fato de que compreende expressar um MetI heterólogo em referido microorganismo, de tal forma que a capacidade de produção de metionina é incrementada.
16. Método para incrementar a capacidade de produção de metionina em um microorganismo em que uma ou mais etapas biossintéticas de metionina são sujeitas a inibição de realimentação de metionina, caracterizado pelo fato de que compreende expressar um MetI heterólogo em referido microorganismo para aliviar a inibição de realimentação de metionina, incrementando com isso a capacidade de produção de metionina.
17. Método de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que a capacidade de produção de metionina é incrementada em pelo menos 20 % relativamente a um microorganismo de controle.
18. Método de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que capacidade de produção de metionina é incrementada em pelo menos 30 % relativamente a um microorganismo de controle.
19. Método de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que a capacidade de produção de metionina é incrementada em pelo menos 40 % relativamente a um microorganismo de controle.
20. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 17 a 19, caracterizado pelo fato de que o microorganismo de controle não compreende enzima MetI.
21. Seqüência de DNA, caracterizada pelo fato de que é capaz de integrar no locus de crtEb de Corynebacterium glutamicum (um cassete de integração de crtEb) compreendendo: (a) uma primeira seqüência de DNA; (b) uma segunda seqüência de DNA, e (c) uma terceira seqüência de DNA heteróloga localizada entre a primeira e a segunda seqüências de DNA, sendo que a primeira e a segunda seqüências de DNA são, cada uma, homólogas a uma porção diferente do óperon biossintético do carotenóide de C. glutamicum, e sendo que a terceira seqüência de DNA tem uma capacidade de romper um gene de crtEb de uma cepa de C. glutamicum por ttCampbelling in" e tlCampbelling out" derivados de referida cepa.
22. Seqüência de DNA de acordo com a reivindicação 21, caracterizada pelo fato de que a seqüência de DNA heteróloga compreende um cassete de expressão compreendendo um gene meti.
23. Vetor, caracterizado pelo fato de que compreende a seqüência de DNA como definida em qualquer uma das reivindicações de 21 a 22.
24. Microorganismo, caracterizado pelo fato de que compreende um vetor como definido nas reivindicações 23 ou uma porção de referido vetor.
25. Método para produzir licopeno, caracterizado pelo fato de que compreende cultivar um microorganismo transformado com o cassete de integração como definido na reivindicação 21 em condições tais que o licopeno é produzido.
26. Seqüência de DNA capaz de integrar no gene marR de Corynebacterium glutamicum do locus biossintético de carotenóide, caracterizada pelo fato de que compreende: (a) uma primeira seqüência de DNA; (b) uma segunda seqüência de DNA; e (c) uma terceira seqüência de DNA heteróloga localizada entre a primeira e a segunda seqüências de DNA, sendo que a primeira e a segunda seqüências de DNA são, cada uma, homólogas a uma porção diferente do óperon biossintético do carotenóide de C. glutamicum, e sendo que referida seqüência de DNA tem a capacidade de romper um gene marR de uma cepa de C. glutamicum por meio de ttCampbelling in" e "Campbelling out" derivados de referida cepa, e, opcionalmente, (d) como parte de referida terceira seqüência de DNA, um promotor constitutivo que é acoplado funcionalmente ao primeiro gene de referido óperon biossintético carotenóide, de tal forma que, após integração no genoma de referida cepa de C glutamicum, referido óperon biossintético carotenóide é transcrito de referido promotor constitutivo.
27. Seqüência de DNA de acordo com a reivindicação 26, caracterizada pelo fato de que a seqüência de DNA heteróloga compreende um gene metI.
28. Vetor, caracterizado pelo fato de que compreende a seqüência de DNA como definida em qualquer uma das reivindicações de 26 a 27.
29. Microorganismo, caracterizado pelo fato de que compreende o vetor como definido na reivindicação 28 ou uma porção de referido vetor.
30. Método para produzir níveis incrementados de um carotenóide desejado, caracterizado pelo fato de que compreende cultivar um microorganismo transformado com seqüência de DNA como definida na reivindicação 26 em condições tais que são produzidos níveis incrementados do carotenóide desejado.
31. Método de acordo com a reivindicação 30 caracterizado pelo fato de que o carotenóide desejado é licopeno.
32. Método de acordo com a reivindicação 25 ou 30, caracterizado pelo fato de que o microorganismo é um Corynebacterium.
33. Vetor, caracterizado pelo fato de que compreende um cassete de integração selecionado de um cassete de integração marR e um cassete de integração crtEb.
34. Microorganismo, caracterizado pelo fato de que compreende o vetor como definido na reivindicação 33.
35. Método para produzir pelo menos dois compostos em um processo de fermentação, caracterizado pelo fato de que o primeiro composto que é produzido não é um carotenóide, e o segundo composto que é produzido compreende um carotenóide.
36. Método de acordo com a reivindicação 35 caracterizado pelo fato de que o primeiro composto é um aminoácido.
37. Método de acordo com a reivindicação 36 caracterizado pelo fato de que o aminoácido é selecionado do grupo que consiste de metionina, lisina, ácido glutâmico, treonina, isoleucina, fenilalanina, tirosina, triptofano, alanina, cisteína, homosserina, homocisteína, e leucina.
38. Método de acordo com a reivindicação 35, caracterizado pelo fato de que referido primeiro composto é um composto solúvel em água.
39. Método de acordo com a reivindicação 38 caracterizado pelo fato de que referido primeiro composto é selecionado do grupo que consiste de ácido láctico, 1,2-propano diol, 1,3-propano diol, etanol, metanol, propanol, acetona, butanol, ácido acético, ácido propiônico, ácido cítrico, ácido itacônico, glucosamina, glicerol, açúcar, vitamina, proteína terapêutica, proteína de pesquisa, e proteína industrial, enzimas, enzima terapêutica, enzima de pesquisa, e proteinoenzima industrial, e um sal dos mesmos.
40. Método de acordo com a reivindicação 35, caracterizado pelo fato de que referido primeiro composto é um gás.
41. Método de acordo com a reivindicação 40, caracterizado pelo fato de que o gás é metano ou hidrogênio.
42. Método para produzir um composto carotenóide que é um subproduto de um processo de fermentação de produção de aminoácido, caracterizado pelo fato de que compreende cultivar um microorganismo manipulado para produzir níveis incrementados de um aminoácido e do composto carotenóide.
43. Método de acordo com a reivindicação 42, caracterizado pelo fato de que cultivar o microorganismo compreende separar a cultura em pelo menos dois componentes, sendo que um dos quais é enriquecido com o aminoácido e um dos quais é enriquecido com o carotenóide.
44. Método de acordo com a reivindicação 42 ou 43, caracterizado pelo fato de que o aminoácido é selecionado dentre metionina, lisina, ácido glutâmico, treonina, isoleucina, fenilalanina, tirosina, triptofano, alanina, cisteína, homosserina, homocisteína e leucina.
45. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 42, caracterizado pelo fato de que o carotenóide é selecionado dentre decaprenoxantina, licopeno, β-caroteno, luteína, astaxantina, cantaxantina, bixina, e zeaxantina.
46. Microorganismo, caracterizado pelo fato de que é engenheirado para superproduzir um primeiro composto que não é um carotenóide, e um segundo composto que compreende um composto carotenóide.
47. Microorganismo de acordo com a reivindicação 46, caracterizado pelo fato de que referido primeiro composto é um aminoácido.
48. Microorganismo de acordo com a reivindicação 46, caracterizado pelo fato de que o primeiro composto é um aminoácido selecionado dentre metionina, lisina, ácido glutâmico, treonina, isoleucina, fenilalanina, tirosina, triptofano, alanina, cisteína e Ieucina5 e o segundo composto é selecionado dentre decaprenoxantina, licopeno, β-caroteno, luteína, astaxantina, cantaxantina, bixina, e zeaxantina.
49. Microorganismo de acordo com a reivindicação 46, caracterizado pelo fato de que o referido primeiro composto é selecionado dentre metano, hidrogênio, ácido láctico, 1,2-propano diol, 1,3-propano diol, etanol, metanol, propanol, acetona, butanol, ácido acético, ácido propiônico, ácido cítrico, ácido itacônico, glucosamina, glicerol, açúcares, vitaminas, enzima terapêuticas e proteínas, enzima de pesquisas e proteínas, enzimas industriais e proteínas, sais dos mesmos e o segundo composto é selecionado dentre decaprenoxantina, licopeno, β-caroteno, luteína, astaxantina, cantaxantina, bixina, e zeaxantina.
50. Microorganismo recombinante, caracterizado pelo fato de ser capaz de produzir um produto químico fino contendo enxofre, que compreende um gene meti heterólogo.
51. Método para produzir um produto químico fino contendo enxofre, caracterizado pelo fato de que compreende cultivar o microorganismo como definido na reivindicação 1 ou na reivindicação 7 em condições tais que o produto químico fino contendo enxofre é produzido.
BRPI0613660-5A 2005-07-18 2006-07-18 microorganismo, cassete de expressão de metl, vetor, métodos para produzir metionina, licopeno, nìveis incrementados de um carotenóide desejado, pelo menos dois compostos em um processo de fermentação, um composto carotenóide desejado, pelo menos dois compostos em um processo de fermentação, um composto carotenóide, e um produto quìmico fino contendo enxofre, e para incrementar a capacidade de produção de metionina em um microorganismo, e, sequência de dna BRPI0613660A2 (pt)

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