BRPI0807826A2 - " geração de moléculas de ácido nucleico ". - Google Patents

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Daniel Jonathan Park
Karl Poetter
Zaheer Khan
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Description

GERAÇÃO DE MOLÉCULAS DE ÁCIDO NUCLEICO CAMPO DA INVENÇÃO
A presente invenção está relacionada de forma geral aos métodos para a geração de moléculas de ácido nucléico de fita simples após amplificação aumentada de polinucleotídeo de fase sólida. A presente invenção ainda fornece métodos para a marcação de matrizes sólidas com moléculas de ácido nucléico de fita simples e dupla. Kits para a geração de moléculas de ácido nucléico de fita simples e para a realização de reações de amplificação também formam parte da presente invenção. A presente invenção ainda fornece sistemas de amplificação para a geração de moléculas de ácido nucléico de fita simples opcionalmente marcadas com a molécula repórter e seu uso, inter alia, como marcadores, iniciadores e sondas.
FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO
Referência a qualquer técnica estabelecida nesta especificação não é e não deve ser considerada como um reconhecimento ou qualquer forma de sugestão de que essa técnica estabelecida forme parte do conhecimento comum em qualquer país.
DNA de fita dupla (dsDNA) pode ser convertido em um DNA de fita simples (ssDNA) por separação das fitas ou por remoção de uma fita do duplex. As fitas do duplex podem ser 25 separadas por meios térmicos ou químicos de ruptura de ligações entre as fitas. A remoção de uma fita permite a recuperação da fita desejada e a eliminação de seu complemento, por exemplo, Nikiforov e cols. (Patente U.S. N0 5.518.900), que descreveram a modificação de um de dois
3 0 iniciadores usados para amplificação por incorporação de derivados de fosforotiato nucleotídeo na extremidade 5' do iniciador modificado, tornando-o resistente à digestão por exonuclease. Após amplificação de seqüências-alvo com o uso da reação em cadeia de polimerase (PCR), o dsDNA é 5 submetido à digestão por exonuclease. A fita não protegida é preferencialmente digerida por uma exonuclease 5' a 3', deixando um produto de fita simples que consiste na outra fita. Estratégias similares usaram iniciadores ramificados resistentes à exonuclease (Shchepinov e cols., Nucl. Acids. 10 Res. 25: 4.447-4.454 1997) ou preferência de substrato que abriga 5' fosfato de exonuclease Lambda (Higuchi e cols., Nucl. Acids Res. 25: 5.685, 1989).
A PCR assimétrica (Gyllensten e Erlich, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85: 7.652-7.656 1998; Patente U.S. N0 15 5.066.584) gera ssDNA durante a termociclagem por emprego de uma concentração não equilibrada de par de iniciadores de tal forma que um iniciador esteja em uma concentração limitante. Isso favorece o produto de ssDNA iniciado pelo iniciador em excesso. Essa abordagem tem o problema de ser 20 inerentemente limitada em capacidade de processamento, na medida em que, por necessidade, um iniciador é usado em uma concentração relativamente baixa.
A PCR assimétrica por iniciador competidor (Gillespie, 1997; Pedido de Patente U.S. N° 08/628.417) emprega a 25 adição separada de iniciador competidor após termociclagem por PCR e antes da termociclagem posterior para gerar ssDNA. Dessa forma, esse método exige uma manipulação excessiva que é indesejável, particularmente em um contexto diagnóstico em função do risco aumentado de contaminação, 3 0 erro do usuário e tempo e custo de processamento. Kaltenboeck e cols., Biotechniques 12: 164-171, 1992 descreveram um método de produção de ssDNA realizando-se inicialmente uma PCR para gerar dsDNA, seguida por uma reação separada usando o produto da primeira PCR como um 5 modelo para uma segunda amplificação linear que emprega um iniciador. Novamente, esse método exige manipulação excessiva.
Matrizes de fase sólida têm sido marcadas com produtos de PCR com uso de PCR simétrica ou PCR assimétrica, em que 10 um iniciador é conjugado a uma superfície sólida ou por meio de uma PCR "ponte" em que os iniciadores diretos e reversos são conjugados diretamente a uma superfície sólida. Cada uma dessas abordagens é relativamente ineficiente em função das limitações cinéticas (baixas 15 concentrações efetivas de substrato, com ou sem efeitos inibidores competitivos). Se desejado, os produtos de dsDNA conjugados a uma fase sólida podem ser convertidos de forma relativamente simples aos produtos conjugados de ssDNA à fase sólida por desnaturação química ou térmica.
A Patente U.S. N0 6.277.604 descreve o uso de um
iniciador imobilizado e dois iniciadores de fase aquosa em PCR assimétrica. Pelo menos um dos iniciadores aquosos é fornecido em concentração limitante para facilitar a iniciação pelo iniciador imobilizado de um evento de extensão. No entanto, isso pode gerar ineficiências.
Há uma necessidade clara para o desenvolvimento de métodos mais eficientes para a geração de moléculas específicas de ácido nucléico de fita simples e para a marcação de suportes sólidos.
3 0 SUMÁRIO DA INVENÇÃO Por toda esta especificação e nas reivindicações em anexo, a menos que o contexto exija de forma diferente, a palavra "compreende", e variações tais como "que compreende" ou "compreendendo", deverão ser entendidas como 5 implicando a inclusão de um número inteiro definido ou grupo de números inteiros ou etapas, mas não a exclusão de qualquer outro número inteiro ou grupo de números inteiros.
A presente invenção define um processo para a geração de polinucleotídeos de fita simples (ss) e, em particular, moléculas de ssDNA específicas, e o aumento da amplificação de polinucleotídeo de fase sólida. Ainda mais particularmente, a presente invenção emprega uma reação de amplificação com o uso de iniciadores com propriedades de iniciação diferenciais em condições de anelamento específicas. Após um período de amplificação exponencial na presença de condições permissivas de anelamento, as condições de anelamento são alteradas para facilitar a iniciação diferencial que resulta na geração eficiente de um análogo de ssDNA ou de nucleotídeo que contém formas deste. As propriedades de anelamento diferenciais do iniciador também podem ocorrer por um design específico do iniciador que oferece vantagens cinéticas ou anelamento permissivo/não permissivo e design do iniciador. Dessa forma, por design do iniciador, a participação do par de iniciadores de suporte sólido na iniciação é aumentada em relação aos iniciadores de fase aquosa. Portanto, a amplificação assimétrica com sensibilidade comprometida não é necessária para se obter cargas elevadas de amplicon sobre o suporte sólido. A presente invenção facilita a 3 0 amplificação em fase sólida não comprometida e mais sensível. É obtida uma carga elevada de sinal associado ao amplicon sobre o suporte sólido. Os métodos da presente invenção podem ser realizados no frasco de reação de amplificação, sem a necessidade de manipulação ou 5 processamento adicional da amostra. Convenientemente, embora não necessariamente, pelo menos um dos iniciadores é marcado com uma molécula repórter capaz de fornecer um sinal identificado.
0 método é aqui denominado PCR de Fase Sólida Aprimorada ("ESP-PCR").
A presente invenção contempla, portanto, um método para amplificação em fase sólida de ácidos nucléicos que compreende o contato de um suporte sólido, que possui um iniciador nele ligado através de meios de ligação, com uma 15 amostra que compreende pelo menos uma molécula de ácido nucléico, em que o iniciador imobilizado é selecionado da lista que consiste em:
(i) um iniciador que compartilha identidade de seqüência para um iniciador de fase aquosa, mas que possui
2 0 uma temperatura de fusão diferente em relação ao iniciador imobilizado; e
(ii) um iniciador abrigado entre dois iniciadores de fase aquosa;
sob condições de reação que efetuam o alongamento do referido iniciador imobilizado.
Referência ao termo "abrigado" no contexto de iniciadores inclui iniciadores total e parcialmente abrigados. O ácido nucléico imobilizado resultante pode ser ss ou ds. A molécula de ácido nucléico imobilizado ds pode então passar por desnaturação para gerar uma molécula de ácido nucléico imobilizado ss ou uma molécula de ácido nucléico ss de fase aquosa, ou ambas.
De acordo com outro aspecto, a presente invenção fornece um método para a geração de um polinucleotídeo de 5 fita simples em um frasco de reação, o referido método compreendendo a submissão de um polinucleotídeo-alvo de fita dupla ou de seu derivado de fita simples à amplificação exponencial pelo contato de uma matriz sólida que possui um iniciador ligado à referida matriz sólida 10 através de meios de ligação com uma amostra que compreende pelo menos uma molécula de ácido nucléico, em que o iniciador imobilizado é selecionado da lista que consiste em:
(i) um iniciador que compartilha identidade de seqüência para um iniciador de fase aquosa, mas que possui
uma temperatura de fusão diferente em relação ao iniciador imobilizado; e
(ii) um iniciador abrigado entre dois iniciadores de fase aquosa;
2 0 sob condições de reação que efetuam o alongamento do
referido iniciador imobilizado para facilitar a geração de polinucleotídeo de fita dupla imobilizado à matriz sólida e depois submetendo-se o polinucleotídeo imobilizado às condições desnaturantes para gerar polinucleotídeos 25 imobilizados de fita simples e um polinucleotídeo de fase líquida de fita simples.
A reação de amplificação pode ser simétrica, assimétrica, reação em cadeia de polimerase (PCR), amplificação por deslocamento de fita (SDA), reação em
3 0 cadeia de ligase, endonuclease de restrição de corte (RE de corte), SDA ou amplificação do genoma inteiro, dentre outras. Convenientemente, pelo menos um dos iniciadores de fase aquosa é marcado com uma molécula repórter capaz de fornecer um sinal identificável.
O método acima é uma forma de uma reação de
amplificação escalonada aqui denominada ESP-PCR. O esquema escalonado pode ser em "step up" ou nStep down", dependendo da primeira e da segunda condições de anelamento ou do design do iniciador. Exemplos de condições diferenciais de anelamento incluem diferentes temperaturas de anelamento, extensão da não combinação entre o iniciador e o polinucleotídeo complementar-alvo, a presença de seqüências estranhas ou suplementares, e design do iniciador dentro de diferentes sítios de complementaridade em uma seqüência de nucIeotídeos-alvo. Em uma modalidade, um ou ambos os iniciadores carregam uma seqüência de nucleotídeos "heel" ou "head" que pode ou não estar relacionada por homologia à seqüência de polinucleotídeos-alvo que fornece uma temperatura de fusão diferente, comparado com o outro iniciador.
A presente invenção também pode ser efetuada, portanto, com o uso de iniciadores que carregam uma ou mais seqüências estranhas ou suplementares para ajudar na redução da influência sobre a amplificação de ácido nucléico.
0 processo da presente invenção possui uma gama de aplicações subjacentes à geração de sondas para reações de hibridização (tais como Northern blots, Southern blots, varredura de biblioteca de clones, hibridização in si tu, 3 0 hibridização in situ por fluorescência (FISH) e microarranjo (microarrays) (por exemplo, análises baseadas em chip, glóbulo ou outra matriz sólida)). 0 presente método também pode ser usado em conjunto com outro processo de amplificação modificado em que um alvo de dsDNA é 5 submetido à digestão 5' a 3' por exonuclease para gerar um modelo de ssDNA para uso no presente processo.
A presente invenção ainda contempla um método para marcação direta de polinucleotídeos de matrizes de fase sólida como, por exemplo, na geração de recursos de microarranjo, marcação de placa de microtitulação para análises de ácido nucléico que não se baseiam em gel de eletroforese, marcação de glóbulos para análises genéricas que não se baseiam em gel de eletroforese (por exemplo, análises genéricas baseadas em FACS) e em PCR de emulsão, antes de regimes de seqüenciamento de alto rendimento ou aplicações de microarranjo em glóbulos. Kits que compreendem frasco de reação e reagentes também fazem parte da presente invenção. "Marcação" inclui a marcação com uma molécula repórter como, por exemplo, uma molécula de quimioluminescência ou uma molécula de bioluminescência e/ou marcação com uma molécula de ácido nucléico.
Dessa forma, a presente invenção também se dirige a sistemas de amplificação que compreendem um componente de reagente, um componente de ácido nucléico, um componente de 25 hardware e um componente de instruções. Os componentes do sistema interagem entre eles para gerar um produto de polinucleotídeo de fita simples.
A presente invenção também é útil na marcação direta de polinucleotídeos de matrizes de fase sólida como, por 3 0 exemplo, na marcação de placa de microtitulação de geração de uma característica de microarranjo ou arranjo sólido para análises de ácido nucléico que não se baseiam em gel (por exemplo, análises genéticas baseadas em FACS) e em amplificação de emulsão, antes de regimes de seqüenciamento 5 de alto rendimento ou aplicações de microarranjo em glóbulos. A presente invenção também pode ser usada para gerar moléculas de ácido nucléico ss imobilizado a um suporte sólido ou em fase aquosa após desnaturação das moléculas de ácido nucléico ds imobilizadas.
Dessa forma, em uma modalidade particular, a presente
invenção contempla um método para a marcação de uma matriz sólida com um polinucleotídeo de fita simples, o método compreendendo a submissão de um polinucleotídeo-alvo de fita dupla ou de seu derivado de fita simples à 15 amplificação exponencial com o uso de iniciadores diretos e reversos que possuem propriedades de anelamento similares em um primeiro conjunto de condições de anelamento, mas propriedades de anelamento diferenciais em um segundo conjunto de condições de anelamento, o contato do produto 20 de amplificação da amplificação com uma matriz sólida ou composição de matrizes sólidas que possuem nelas imobilizado pelo menos um dos iniciadores que é capaz de anelamento a uma fita do produto da amplificação sob o segundo conjunto de condições de anelamento, e a alteração 25 das condições de anelamento para o segundo conjunto de condições para, desse modo, facilitar a amplificação com base em um único iniciador para gerar um polinucleotídeo de fita simples imobilizado à matriz sólida.
Em outra modalidade, a presente invenção fornece um 3 0 método para a marcação de uma matriz sólida com um polinucleotídeo de fita simples, o método compreendendo a submissão de um polinucleotídeo-alvo de fita dupla ou de seu derivado de fita simples à amplificação exponencial com
o uso de iniciadores diretos e reversos que possuem 5 propriedades de anelamento similares em um primeiro conjunto de condições de anelamento, mas propriedades de anelamento diferenciais em um segundo conjunto de condições de anelamento, o contato do produto de amplificação da amplificação com uma matriz sólida ou composição de
matrizes sólidas que possuem nelas imobilizado pelo menos um dos iniciadores que é capaz de anelamento a uma fita do produto da amplificação sob o segundo conjunto de condições de anelamento que gera polinucleotídeo de fita dupla e, a seguir, a desnaturação do polinucleotídeo de fita dupla
para gerar um polinucleotídeo de fita simples imobilizado à matriz sólida.
Também é fornecido um método para a marcação de uma matriz sólida que compreende o contato de uma matriz sólida que possui um iniciador ligado à matriz sólida através de
2 0 meios de ligação com uma amostra que compreende pelo menos
uma molécula de ácido nucléico, em que o iniciador imobilizado é selecionado da lista que consiste em:
(i) um iniciador que compartilha identidade de seqüência para um iniciador de fase aquosa, mas que possui
uma temperatura de fusão diferente em relação ao iniciador imobilizado; e
(ii) um iniciador abrigado entre dois iniciadores de fase aquosa;
sob condições de reação que efetuam alongamento do
3 0 iniciador imobilizado. Referência a uma "matriz sólida" inclui uma fase, suporte ou outra superfície sólida ou glóbulo à qual uma molécula de ácido nucléico pode ser imobilizada.
Os métodos acima incluem a opção de alteração da condição de anelamento para o primeiro conjunto de condições para permitir uma "complementação" do polinucleotídeo de fita simples para gerar polinucleotídeos de fita dupla imobilizados à matriz sólida.
A presente invenção engloba, portanto, um método para a geração de uma matriz sólida ou de uma composição de matrizes sólidas marcadas com polinucleotídeos de fita dupla, o referido método compreendendo a submissão de um polinucleotídeo-alvo de fita dupla ou de seu derivado de fita simples à amplificação exponencial com o uso de iniciadores diretos e reversos que possuem propriedades de anelamento similares em um primeiro conjunto de condições de anelamento, mas propriedades de anelamento diferenciais em um segundo conjunto de condições de anelamento, o contato do produto da amplificação com uma matriz sólida ou composição de matrizes sólidas que possuem nelas imobilizadas pelo menos um dos iniciadores que é capaz de anelamento a uma fita do produto da amplificação sob o segundo conjunto de condições de anelamento, e a alteração das condições de anelamento ao segundo conjunto para, dessa forma, facilitar a amplificação com base em um único iniciador para gerar um polinucleotídeo de fita simples imobilizado à referida matriz sólida; com a alteração do primeiro conjunto de condições de anelamento na presença do outro iniciador, o polinucleotídeo de fita simples imobilizado gera uma fita complementar e a matriz sólida compreende um polinucleotídeo duplo imobilizado.
Em uma modalidade, o polinucleotídeo duplo é desnaturado, por exemplo, por meios químicos térmicos, para gerar um polinucleotídeo de fita simples de fase aquosa ou um polinucleotídeo imobilizado de fita simples.
Também é fornecido um método para a geração de uma matriz sólida ou de uma composição de matrizes sólidas marcadas com polinucleotídeos de fita dupla, o método compreendendo a submissão de um polinucleotídeo-alvo de
fita dupla ou de seu derivado de fita simples à amplificação exponencial pelo contato de uma matriz sólida que possui um iniciador ligado à referida matriz sólida através de meios de ligação com uma amostra que compreende pelo menos uma molécula de ácido nucléico, em que o
iniciador imobilizado é selecionado da lista que consiste em:
(i) um iniciador que compartilha identidade de seqüência para um iniciador de fase aquosa, mas que possui uma temperatura de fusão diferente em relação ao iniciador
2 0 imobilizado; e
(ii) um iniciador abrigado entre dois iniciadores de fase aquosa;
sob condições de reação que efetuam alongamento do iniciador imobilizado.
Iniciadores abrigados, em conjunto com condições
permissivas e não permissivas, também podem ser empregados.
As abreviações usadas nesta especificação são definidas na Tabela 1.
Tabela 1
3 0 Abreviações Abreviação Definição dsDNA DNA de fita dupla FACS Separação de células ativadas por fluorescência FISH Hibridização in si tu por fluorescência PCR Reação em cadeia de polimerase SDA Amplificação por deslocamento de fita ssDNA DNA de fita simples Um resumo dos identificadores de seqüência aqui usados é mostrado na Tabela 2.
Tabela 2 Identificadores de seqüência
Identificador de Seqüência seqüência ID. DE SEQ. N0: 1 Oligonucleotideo (Transprobe) ID. DE SEQ. N0: 2 Iniciador direto para a geração de modelo de Cto3 ID. DE SEQ. N°: 3 Iniciador reverso para a geração de modelo de Cto3 ID. DE SEQ. N°: 4 Iniciador direto para a geração de modelo de Ngo ID. DE SEQ. N°: 5 Iniciador reverso para a geração de modelo de Ngo ID. DE SEQ. N°: 6 Iniciador direto para a geração de modelo de Ngps ID. DE SEQ. N0: 7 Iniciador reverso para a geração de modelo de Ngps ID. DE SEQ. N°: 8 Iniciador direto "aquoso" de Cto3 ID. DE SEQ. N° : 9 Iniciador reverso "aquoso" de Cto3 ID. DE SEQ. N0 : 10 Iniciador de suporte sólido de SPPCR de Cto3 ID. DE SEQ. N0 : 11 Iniciador de suporte sólido de ESPPCR de Cto3 ID. DE SEQ. N0 : 12 Iniciador direto "aquoso" de Ngo ID. DE SEQ. N0 : 13 Iniciador reverso "aquoso" de Ngo ID. DE SEQ. N0 : 14 Iniciador de suporte sólido de SPPCR de Ngo ID. DE SEQ. N0 : 15 Iniciador de suporte sólido de ESPPCR de Ngo ID. DE SEQ. N° : 16 Iniciador direto "aquoso" de Ngps ID. DE SEQ. N0 : 17 Iniciador reverso "aquoso" de Ngps ID. DE SEQ. N0 : 18 Iniciador de suporte sólido de SPPCR de Ngps ID. DE SEQ. N0 : 19 Iniciador de suporte sólido de ESPPCR de Ngps ID. DE SEQ. N0 : 20 Iniciador de opa de Neisseria gonorrhoeae ID. DE SEQ. N0 : 21 Iniciador reverso de opa de Neisseria gonorrhoeae ID. DE SEQ. N0 : 22 Iniciador de orf3 de plasmídeo críptico de Chlamydia trachomatis ID. DE SEQ. N0 : 23 Iniciador reverso de Chlamydia trachomatis BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
Algumas figuras contêm representações ou entidades coloridas. Fotografias coloridas estão disponíveis pelo requerente da Patente mediante solicitação ou por um Escritório de Patentes adequado. Pode ser cobrada uma taxa caso sejam obtidas em um Escritório de Patentes.
As Figuras 1(i) e (ii) são representações diagramáticas de (i) Esquema de PCR de Fase Sólida Aprimorada (ESP-PCR) para a carga de amplicons de fita simples ou dupla sobre um suporte sólido com (ii) designs do iniciador de suporte sólido (1 a 4). Consulte o Exemplo
1 para uma descrição detalhada. (i): a - representa iniciador de PCR "direto"; b - representa iniciador "reverso"; c - amplificação exponencial usando, por 10 exemplo, iniciadores diretos e reversos (por exemplo, PCR); d - iniciador de suporte sólido [veja (ii)]; e - muitas cópias/suporte sólido de ds; f - muitas cópias/suporte sólido de ss; g - (opcional) ciclos com condições de anelamento "escalonado" não permissivas para iniciadores a 15 e b; h - (opcional) "complementação"; (ii) : a - representa iniciador de PCR "direto"; b - representa iniciador "reverso"; c - design do iniciador de suporte sólido de PCR de fase sólida da técnica estabelecida; d - por exemplo, extensão 3-prime, Tm maior; e - designs do iniciador de 20 suporte sólido de PCR de fase sólida aprimorada; f - por exemplo, abrigado ou parcialmente abrigado; g - por exemplo, abrigado ou parcialmente abrigado, Tm maior.
A Figura 2 é uma representação diagramática de um mecanismo para iniciação aumentada de suporte sólido usando 25 (B) ESP-PCR versus (A) SP-PCR-padrão. Iniciadores "aquosos" diretos (seta) e reversos estão incluídos em cada mistura de reação em concentrações não limitantes, juntamente com iniciador de suporte sólido (esfera ligada a uma seta). Iniciadores "aquosos" participam na PCR convencional para 3 0 gerar amplicons (linhas tracejadas). Iniciadores de suporte sólido também iniciam reações de extensão durante esses ciclos, resultando na carga de produto sobre a superfície do suporte sólido. No entanto, na SP-PCR-padrão, o envolvimento do iniciador de suporte sólido é inibido por 5 competição com um iniciador "aquoso" de seqüência compatível (A) , para resultar na carga relativamente baixa de amplicon. A linha vertical em (A) indica extensão inibida. ESP-PCR (B) evita essa inibição pelo emprego de um iniciador de suporte sólido abrigado de Tm relativamente 10 elevado. As linhas pontilhadas representam eventos de extensão.
(A) Iniciação de suporte sólido na seqüência do iniciador de suporte sólido de SP-PCR-padrão combina com seu iniciador "aquoso" correspondente; (a) - a iniciação de iniciador de suporte sólido se sobrepõe ao seu iniciador "aquoso" correspondente; (b) - amplicon de fita simples; (B) iniciação de suporte sólido em iniciadores de ESP-PCR que estão abrigados para reduzir a competição entre eles e o iniciador "aquoso" quanto à ligação ao amplicon, beneficiando-se de um sítio de ligação diferente e da lacuna entre a ligação do iniciador "aquoso" e a ligação de polimerase; há também uma Tm maior para elevar sua concentração eficaz (a) - a iniciação de iniciador de suporte sólido é competitiva; (b) - amplicon de fita simples.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
A presente invenção é dirigida a uma reação de amplificação modificada que facilita a geração de polinucleotídeos de fita simples (ss) e, em particular, ssDNA imobilizado a um suporte sólido ou em forma imobilizada ou aquosa gerada por polinucleotídeos de fita dupla imobilizado (ds) . A presente invenção está relacionada, em parte, ao uso de iniciadores em uma reação de amplificação que possui características de anelamento 5 similares em um conjunto de condições de anelamento (em que os iniciadores são considerados "equilibrados" e as condições de anelamento são consideradas "mutuamente permissivas") e características de anelamento diferentes ou diferenciais ou dissimilares em outro conjunto de condições 10 de anelamento (em que os iniciadores são considerados "desequilibrados" e as condições de anelamento são consideradas "diferencialmente permissivas").
Alternativamente, ou em adição, as diferentes condições de anelamento surgem em decorrência do design do iniciador que permite diferentes vantagens cinéticas para iniciação de suporte sólido em relação à iniciação de oligonucleotídeo de fase aquosa.
Dessa forma, um aspecto da presente invenção contempla um método para amplificação em fase sólida que compreende o
2 0 contato de um suporte sólido, que possui um iniciador nele ligado através de meios de ligação com uma amostra, que compreende pelo menos uma molécula de ácido nucléico, em que o iniciador imobilizado é selecionado da lista que consiste em:
(i) um iniciador que compartilha identidade de
seqüência para um iniciador de fase aquosa, mas que possui uma temperatura de fusão diferente em relação ao iniciador imobilizado; e
(ii) um iniciador abrigado entre dois iniciadores de fase aquosa; sob condições de reação que efetuam alongamento do iniciador imobilizado.
Referência ao termo "abrigado" no contexto de iniciadores inclui iniciadores total e parcialmente abrigados.
Referência ao termo "que compartilha identidade de seqüência" inclui identidade substancial, bem como pelo menos 80% de identidade de seqüência como, por exemplo, pelo menos 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ou 100% de identidade.
Como indicado acima, os iniciadores diretos e reversos podem ser descritos como "equilibrados" ou "desequilibrados" com relação às propriedades de anelamento, e as condições de anelamento são consideradas como mutuamente permissivas ou diferencialmente permissivas com relação ao efeito sobre os iniciadores. Similarmente, o design do iniciador pode facilitar iniciadores diferencialmente permissivos.
Dessa forma, o termo "iniciadores equilibrados ou desequilibrados" significa que, em certo conjunto de condições ou conjunto de iniciadores, ou seja, condições de anelamento mutuamente permissivas ou iniciadores mutuamente permissivos, ambos os iniciadores se ligam ou de algum outro modo hibridizam para formar um duplex com eficiência similar.
Enquanto em condições de anelamento diferencialmente permissivas (ou seja, em um conjunto alternativo de condições), os iniciadores estão desequilibrados, na medida em que as condições podem favorecer as formações e a iniciação de duplex. Consequentemente, a presente invenção pode ainda ser definida como um método para a geração de um polinucleotídeo de fita simples imobilizado a um suporte sólido em um vaso de reação, o método compreendendo a realização de uma reação de amplificação de um polinucleotídeo-alvo imobilizado a um suporte sólido no vaso usando um par de iniciadores diretos e reversos equilibrados em condições mutuamente permissivas, e depois a alteração das condições de anelamento para condições diferencialmente permissivas, em que os iniciadores se tornam desequilibrados e continuam a reação para gerar produto de polinucleotídeo de fita simples e, a seguir, a inativação da atividade de polimerase para evitar substancialmente a formação de polinucleotídeos de fita dupla.
Em uma modalidade alternativa, o polinucleotídeo ds é gerado sobre o suporte sólido, o qual é então submetido às condições desnaturantes (por exemplo, por meios químicos ou térmicos) para gerar polinucleotídeo ss ou polinucleotídeo de fase aquosa imobilizado.
A presente invenção fornece, portanto, um método para a marcação de uma matriz sólida com um polinucleotídeo de fita simples, o método compreendendo a submissão de um polinucleotídeo-alvo de fita dupla ou de seu derivado de 25 fita simples à amplificação exponencial com o uso de iniciadores diretos e reversos que possuem propriedades de anelamento similares em um primeiro conjunto de condições de anelamento, mas propriedades de anelamento diferenciais em um segundo conjunto de condições de anelamento, o 30 contato do produto da amplificação da amplificação com uma matriz sólida ou composição de matrizes sólidas que possuem nelas imobilizado pelo menos um dos iniciadores que é capaz de anelamento a uma fita do produto da amplificação sob o segundo conjunto de condições de anelamento que gera 5 polinucleotídeo de fita dupla e, a seguir, a desnaturação do polinucleotídeo de fita dupla para gerar um polinucleotídeo de fita simples imobilizado ã matriz sólida.
A desnaturação pode ser feita por qualquer meio, incluindo meios químicos ou meios térmicos.
Outro aspecto fornece um método para a geração de um polinucleotídeo de fita simples em um frasco de reação, o referido método compreendendo a submissão de um polinucleotídeo-alvo de fita dupla ou de seu derivado de 15 fita simples à amplificação exponencial pelo contato de uma matriz sólida que possui um iniciador ligado à referida matriz sólida através de meios de ligação com uma amostra que compreende pelo menos uma molécula de ácido nucléico, em que o iniciador imobilizado é selecionado da lista que 20 consiste em:
(i) um iniciador que compartilha identidade de seqüência para um iniciador de fase aquosa, mas que possui uma temperatura de fusão diferente em relação ao iniciador imobilizado; e
(ii) um iniciador abrigado entre dois iniciadores de
fase aquosa;
sob condições de reação que efetuam o alongamento do referido iniciador imobilizado para facilitar a geração de polinucleotídeo de fita dupla imobilizado à matriz sólida e depois submetendo-se o polinucleotídeo imobilizado às condições desnaturantes para gerar polinucleotídeos imobilizados de fita simples e um polinucleotídeo de fase líquida de fita simples.
Uma etapa adicional de submissão da mistura resultante a meios de separação de fase também pode ocorrer.
Em outra modalidade, é fornecido um método para a geração de um polinucleotídeo de fita simples em um frasco de reação, o método compreendendo o contato de uma matriz sólida que possui um iniciador ligado à referida matriz sólida através de meios de ligação com uma amostra que compreende pelo menos uma molécula de ácido nucléico, em que o iniciador imobilizado é selecionado da lista que consiste em:
(i) um iniciador que compartilha identidade de seqüência para um iniciador de fase aquosa, mas que possui uma temperatura de fusão diferente em relação ao iniciador imobilizado; e
(ii) um iniciador abrigado entre dois iniciadores de fase aquosa;
sob condições de reação que efetuam alongamento do iniciador imobilizado.
De preferência, os polinucleotídeos são DNA e, portanto, a presente invenção é particularmente dirigida à geração de ssDNA. No entanto, embora o material de partida seja preferivelmente dsDNA, a presente invenção também pode usar mRNA que é convertido em ds ou ssDNA ou usar ssDNA. Além disso, dsDNA pode ser gerado sobre o suporte sólido e depois submetido às condições desnaturantes para gerar ssDNA imobilizado ou de fase aquosa.
Outro aspecto da presente invenção fornece um método de geração de ssDNA em um frasco de reação, o referido método compreendendo a realização de uma reação de amplificação de um modelo de ssDNA-alvo imobilizado de um alvo de dsDNA ou mRNA no frasco de reação com o uso de um 5 par de iniciadores diretos e reversos que possuem iniciadores de anelamento similares (equilibrados) em um primeiro conjunto de condições de anelamento (condições mutuamente permissivas), mas propriedades de anelamento diferenciais em um segundo conjunto de condições de 10 anelamento (condições diferencialmente permissivas) em que se permite que a amplificação prossiga sob as condições de anelamento mutuamente permissivas; alteração das condições para as condições diferencialmente permissivas para desequilibrar os iniciadores, facilitando, dessa forma, a 15 amplificação linear substancialmente na presença de apenas um único iniciador para gerar produto de ssDNA; e a inativação de qualquer atividade de polimerase para substancialmente reduzir ou evitar a formação de dsDNA.
Ainda outro aspecto da presente invenção fornece um 20 método de geração de ssDNA em um frasco de reação, o referido método compreendendo o contato de uma matriz sólida que possui um iniciador ligado à referida matriz sólida através de meios de ligação com uma amostra em um frasco de reação que compreende pelo menos uma molécula de 25 ácido nucléico, em que o iniciador imobilizado é selecionado da lista que consiste em:
(i) um iniciador que compartilha identidade de seqüência para um iniciador de fase aquosa, mas que possui uma temperatura de fusão diferente em relação ao iniciador 3 0 imobilizado; e (ii) um iniciador abrigado entre dois iniciadores de fase aquosa;
sob condições de reação que efetuam alongamento do iniciador imobilizado.
As condições de anelamento ou iniciadores diferenciais
permissivas versus mutuamente permissivas estão relacionadas, por exemplo, ã extensão da não combinação, à presença de seqüências de nucleotídeos estranhas da "cabeça" ou "cauda" nos iniciadores, ao sítio de 10 hibridização no modelo-alvo para formar duplexos, ou à presença de outras características para permitir o step up ou step down para gerar condições desequilibradas de iniciadores.
0 método da presente invenção pode ser considerado uma modificação de uma reação de amplificação para gerar um produto em particular. A modificação é o uso de iniciadores que são diferencial ou mutuamente equilibrados, dependendo do nível de permissividade das condições de anelamento.
Dessa forma, a presente invenção contempla uma reação de amplificação modificada na qual são empregados iniciadores diretos e reversos para amplificar exponencialmente um polinucleotídeo-modelo de fita simples como, por exemplo, ssDNA, gerado por um polinucleotídeo de fita dupla como, por exemplo, dsDNA, ou gerado por mRNA diretamente ou por meio de cDNA, em que a modificação compreende a seleção de iniciadores que possuem características de anelamento similares em um primeiro conjunto de condições de anelamento e características de anelamento diferenciais em um segundo conjunto de condições de anelamento, de tal forma que a alteração das condições de anelamento para o segundo conjunto facilite a amplificação na presença de um único iniciador, resultando na produção de polinucleotídeo substancialmente de fita simples como, por exemplo, ssDNA.
Alternativamente, ou em adição, o design do iniciador
é usado para abrigar o iniciador imobilizado entre dois iniciadores de fase aquosa.
A presente invenção ainda fornece um método para a geração de um polinucleotídeo de fita simples em um frasco 10 de reação, o referido método compreendendo a submissão de um polinucleotídeo-alvo de fita dupla ou de seu derivado de fita simples à amplificação exponencial pelo contato de uma matriz sólida que possui um iniciador ligado à referida matriz sólida através de meios de ligação com uma amostra 15 que compreende pelo menos uma molécula de ácido nucléico, em que o iniciador imobilizado é selecionado da lista que consiste em:
(i) um iniciador que compartilha identidade de seqüência para um iniciador de fase aquosa, mas que possui
2 0 uma temperatura de fusão diferente em relação ao iniciador
imobilizado; e
(ii) um iniciador abrigado entre dois iniciadores de fase aquosa;
sob condições de reação que efetuam o alongamento do 25 referido iniciador imobilizado para facilitar a geração de polinucleotídeo de fita dupla imobilizado à matriz sólida e depois submetendo-se o polinucleotídeo imobilizado às condições desnaturantes para gerar polinucleotídeos imobilizados de fita simples e um polinucleotídeo de fase
3 0 líquida de fita simples. Esse aspecto da presente invenção soluciona o problema de tendência potencial da amplificação por incorporação de uma 5' seqüência de nucleotídeos estranha da região de ligação não iniciadora conjugada a uma região de ligação 5 3'-modelo. Esse ou ambos os iniciadores incorporam a seqüência estranha 5' (seqüência heel) que atua como um grampo para nivelar a eficiência de amplificação através de homólogos de amplificação. A seqüência heel pode ou não estar relacionada por homologia à seqüência-alvo.
Ainda um aspecto adicional fornece um método para a
geração de um polinucleotídeo de fita simples em um frasco de reação, que compreende o contato de uma matriz sólida que possui um iniciador ligado à matriz sólida através de meios de ligação com uma amostra que compreende pelo menos 15 uma molécula de ácido nucléico, em que o iniciador imobilizado é selecionado da lista que consiste em:
(i) um iniciador que compartilha identidade de seqüência para um iniciador de fase aquosa, mas que possui uma temperatura de fusão diferente em relação ao iniciador
imobilizado; e
(ii) um iniciador abrigado entre dois iniciadores de fase aquosa;
sob condições de reação que efetuam alongamento do iniciador imobilizado.
Variações nos métodos aqui apresentados incluem o uso
de iniciadores abrigados e condições diferenciais de fusão.
A presente invenção possui muitas aplicações, incluindo a geração de sondas de nucleotídeo de fita simples para uso em reações de hibridização, tais como 3 0 Northern blots, Southern blots, varredura de biblioteca de clones, hibridização in si tu, hibridização por fluorescência in situ (FISH), e análise de microarranjo como, por exemplo, com o uso de chips, glóbulos ou outras matrizes sólidas. Os iniciadores também podem ser marcados com uma molécula repórter capaz de fornecer um sinal identificável. Por exemplo, um marcador fluorescente, fosforescente, quimioluminescente ou radioativo pode ser incorporado em um iniciador. Marcadores alternativos incluem, sem limitação, biotina-dUTP, ficoeritrina-dUTP, fluoresceína-dUTP e [a-32P]-dUTP, incluindo todos os isômeros possíveis destes. Também podem ser empregados ensaios de detecção baseados em enzimas e químicos.
O método da presente invenção também pode ser usado em combinação com outras modificações da amplificação. Por exemplo, um sistema de amplificação que emprega uma exonuclease e, em particular, uma exonuclease 5' a 3', para gerar modelo de ssDNA a partir do alvo de dsDNA.
Consequentemente, outro aspecto da presente invenção fornece um método para a geração de ssDNA em um vaso de reator, o método compreendendo a obtenção de um alvo de dsDNA ou de uma região de um alvo de dsDNA a ser amplificada, em que o referido dsDNA compreende uma extremidade 5' rebaixada ou uma extremidade romba, a incubação do dsDNA com uma exonuclease 5' a 3' junto com reagentes necessários para a amplificação isotérmica de DNA, em que a exonuclease 5' a 3' cria um modelo de ssDNA que compreende um fragmento de ssDNA 3' a 5' de cada fita do dsDNA que é usado como um modelo para amplificação; realização de uma reação de amplificação no ssDNA com o uso de um par de iniciadores diretos e reversos que possuem iniciadores de anelamento similares (equilibrados) em um primeiro conjunto de condições de anelamento (condições mutuamente permissivas), mas propriedades de anelamento diferenciais em um segundo conjunto de condições de anelamento (condições diferencialmente permissivas), em que se permite que a amplificação prossiga sob as condições de anelamento mutuamente permissivas; alteração das condições para as condições diferencialmente permissivas para desequilibrar os iniciadores, facilitando, dessa forma, a amplificação linear substancialmente na presença de apenas um único iniciador para gerar produto de ssDNA; e a inativação de qualquer atividade de polimerase para substancialmente reduzir ou evitar a formação de dsDNA.
Outro aspecto da presente invenção fornece um método para a geração de ssDNA em um vaso de reator, o método compreendendo a obtenção de um alvo de dsDNA ou de uma região de um alvo de dsDNA a ser amplificada, em que o referido dsDNA compreende uma extremidade 5' rebaixada ou uma extremidade romba, a incubação do dsDNA com uma exonuclease 5' a 3' junto com reagentes necessários para a amplificação isotérmica de DNA, em que a exonuclease 5' a 3' cria um modelo de ssDNA que compreende um fragmento de ssDNA 3' a 5' de cada fita do dsDNA que é usado como um modelo para amplificação; e realização de uma reação de amplificação no ssDNA pelo contato de uma matriz sólida que possui um iniciador ligado à referida matriz sólida através de meios de ligação com uma amostra que compreende pelo menos uma molécula de ácido nucléico, em que o iniciador imobilizado é selecionado da lista que consiste em:
(i) um iniciador que compartilha identidade de seqüência para um iniciador de fase aquosa, mas que possui uma temperatura de fusão diferente em relação ao iniciador imobilizado; e
(ii) um iniciador abrigado entre dois iniciadores de 5 fase aquosa;
sob condições de reação que efetuam alongamento do iniciador imobilizado.
Além disso, o método aqui descrito pode ser usado em conjunto com métodos para reduzir a tendência da amplificação.
Consequentemente, outro aspecto fornece um método para a geração de um polinucleotídeo de fita simples em um frasco de reação, o método compreendendo realização de uma reação de amplificação de um polinucleotídeo-alvo no vaso com o uso de um par de iniciadores diretos e reversos que possuem propriedades de anelamento similares em um primeiro conjunto de condições de anelamento, mas propriedades de anelamento diferenciais em um segundo conjunto de condições de anelamento, em que se permite que a amplificação prossiga sob o referido primeiro conjunto de condições de anelamento; alteração das condições de anelamento para o segundo conjunto de condições de anelamento para facilitar uma aplicação linear substancialmente na presença de apenas um dos iniciadores, no par, e depois a inativação da atividade de polimerase na reação de amplificação para substancialmente evitar a formação de polinucleotídeos de fita dupla, em que a etapa de amplificação compreende a submissão de um modelo de ácido nucléico do referido polinucleotídeo-alvo à amplificação com o uso de iniciadores diretos e reversos, em que pelo menos um iniciador contém uma seqüência de nucleotídeos 5' estranha conjugada a uma região de ligação 3' do iniciador do modelo, em que a seqüência de nucleotídeos estranha é incorporada em um produto da amplificação após iniciação inicial.
Essa etapa reduz a tendência da amplificação. Como indicado acima, a seqüência estranha 5' pode ou não estar relacionada à sequência-alvo.
A presente invenção também é útil na marcação direta 10 de polinucleotídeos de matrizes de fase sólida como, por exemplo, na geração de um microarranjo ou de uma característica do arranjo sólido, marcação de placa de microtitulação para análises de ácido nucléico que não se baseiam em gel, marcação de glóbulos para análises 15 genéticas que não se baseiam em gel (por exemplo, análises genéticas baseadas em FACS) e na amplificação de emulsão, antes dos regimes de seqüenciamento de alto rendimento ou de aplicações de microarranjo em glóbulos.
Dessa forma, em uma modalidade particular, a presente invenção contempla um método para a marcação de uma matriz sólida com um polinucleotídeo de fita simples, o método compreendendo a submissão de um polinucleotídeo-alvo de fita dupla ou de seus derivados de fita simples à amplificação exponencial com o uso de iniciadores diretos e reversos que possuem propriedades de anelamento similares em um primeiro conjunto de condições de anelamento, mas propriedades de anelamento diferenciais em um segundo conjunto de condições de anelamento; o contato do produto de amplicon da amplificação com matriz sólida ou composição de matrizes sólidas que possuem nelas imobilizado pelo menos um dos iniciadores que é capaz de anelamento a uma fita do produto de amplicon sob o segundo conjunto de condições de anelamento, e a alteração das condições de anelamento para o segundo conjunto para, dessa forma, facilitar a amplificação com base em um único iniciador para gerar um polinucleotídeo de fita simples imobilizado à referida matriz sólida.
0 método acima pode ainda opcionalmente compreender a alteração da condição de anelamento para o primeiro conjunto de condições para permitir a "complementação" do polinucleotídeo ss para gerar polinucleotídeo ds imobilizado à matriz sólida. Em outras palavras, as condições são alteradas para condições permissivas. 0 polinucleotídeo de fita dupla pode então ser desnaturado para gerar um polinucleotídeo ss imobilizado e de fase aquosa.
Dessa forma, a presente invenção engloba um método para a geração de uma matriz sólida ou de uma composição de matrizes sólidas marcadas com polinucleotídeo de fita dupla, o método compreendendo a submissão de um polinucleotídeo-alvo de fita dupla ou de seus derivados de fita simples à amplificação exponencial com o uso de iniciadores diretos e reversos que possuem propriedades de anelamento similares em um primeiro conjunto de condições de anelamento, mas propriedades de anelamento diferenciais em um segundo conjunto de condições de anelamento; o contato do produto de amplicon da amplificação com a matriz sólida ou a composição de matrizes sólidas que possuem nelas imobilizado pelo menos um dos iniciadores que é capaz de anelamento a uma fita do produto de amplicon sob o segundo conjunto de condições de anelamento, e a alteração das condições de anelamento para o segundo conjunto para, dessa forma, facilitar a amplificação com base em um único iniciador para gerar um polinucleotídeo de fita simples 5 imobilizado à referida matriz sólida; a alteração das condições de anelamento para o primeiro conjunto de condições pela qual, na presença do outro iniciador, o polinucleotídeo de fita simples imobilizado gera uma fita completa ou uma fita que hibridiza para a fita imobilizada, 10 para gerar uma matriz sólida marcada com polinucleotídeo duplo.
Em uma modalidade, é fornecido um método para a geração de uma matriz sólida ou de uma composição de matrizes sólidas marcadas com polinucleotídeos de fita 15 dupla, o referido método compreendendo o contato de uma matriz sólida que possui um iniciador ligado à referida matriz sólida através de meios de ligação com uma amostra que compreende pelo menos uma molécula de ácido nucléico, em que o iniciador imobilizado é selecionado da lista que 20 consiste em:
(i) um iniciador que compartilha identidade de seqüência para um iniciador de fase aquosa, mas que possui uma temperatura de fusão diferente em relação ao iniciador imobilizado; e
(ii) um iniciador abrigado entre dois iniciadores de
fase aquosa;
sob condições de reação que efetuam o alongamento do referido iniciador imobilizado.
Na descrição da presente invenção, os seguintes termos e conteúdos são definidos ou esclarecidos. Todas as citações científicas, patentes, pedidos de patente e especificações técnicas de fabricantes aqui citadas são incorporadas por referência em sua totalidade.
Entende-se que, a menos que indicado de forma 5 diferente, a presente invenção não se limita a reagentes, etapas de processo ou aplicações específicas, ou semelhantes, na medida em que essas podem variar. Entendese também que a terminologia aqui utilizada tem a finalidade única de descrever modalidades particulares, e 10 não visa ser limitante.
Como usadas na presente especificação, as formas no singular "um", "uma", "o" e "a" incluem aspectos no plural, a menos que o contexto indique claramente de forma diferente. Dessa forma, por exemplo, referência a "um alvo" 15 inclui um único alvo, assim como dois ou mais alvos; referência a "uma amplificação" inclui uma única amplificação, assim como múltiplas etapas de amplificação; referência ao "amplicon" inclui um único amplicon ou múltiplos ou complexos de amplicons; e assim por diante.
2 0 Os termos e símbolos de química de ácido nucléico,
bioquímica, genética e biologia molecular aqui usados seguem aqueles de tratados e textos padronizados no campo, por exemplo, Kornberg e Baker, "DNA Replication", Segunda Edição (W.H. Freeman, Nova York, 1992); Lehninger, 25 "Biochemistry", Segunda Edição (Worth Publishers, Nova York, 1975); Strachan e Read, "Human Molecular Genetics", Segunda Edição (Wiley-Liss, Nova York, 1999); Eckstein (Ed) , "Oligonucleotides and Tinalogs: A Practical Approach" (Oxford University Press, Nova York, 1991); Gait (Ed) , 30 "Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach" (IRL Press, Oxford, 1984); e semelhantes.
"Amplicon" significa o produto de uma reação de amplificação de polinucleotídeo. Ou seja, é uma população de polinucleotídeos, normalmente, mas não necessariamente, de fita dupla, que são replicados a partir de uma ou mais seqüências de partida. As uma ou mais seqüências de partida podem ser uma ou mais cópias da mesma seqüência, ou podem ser uma mistura de seqüências diferentes. Amplicons podem ser produzidos por diversas reações de amplificação cujos produtos são múltiplas réplicas de um ou mais ácidos nucléicos-alvo. Geralmente, reações de amplificação que produzem amplicons são "dirigidas por modelo", na medida em que o pareamento de bases dos que participam da reação, nucleotídeos ou oligonucleotídeos, possuem complementos em um polinucleotídeo-modelo que são necessários para a criação de produtos de reação. Em um aspecto, reações dirigidas por modelo são extensões de iniciador com uma ácido nucléico polimerase ou ligações de oligonucleotídeos com uma ácido nucléico ligase. Essas reações incluem, sem limitação, PCR, reações lineares de polimerase, NASBAs, amplificações rolling circle, e semelhantes, reveladas nas seguintes referências que são aqui incorporadas por referência: Mullis e cols., Patentes U.S. Nos 4.683.195, 4.965.188, 4.683.202 e 4.800.159 (PCR); Gelfand e cols., Patente U.S. N° 5.210.015 (PCR em tempo real com sondas "taqman"); Wittwer e cols., Patente U.S. N0 6.174.670; Kacian e cols., Patente U.S. N0 5.399.491 ("NASBA"); Lizardi, Patente U.S. N0 5.854.033; Aono e cols., Publicação de Patente Japonesa N0 JP 4-262799 (amplificação rolling circle); e semelhantes. Uma reação de amplificação pode ser uma amplificação "em tempo real" em que a química de detecção permite que um produto de reação seja medido à medida que a reação de amplificação evolui. A amplificação pode ser assimétrica ou simétrica.
Como aqui usado, o termo "amplificação" significa a realização de uma reação de amplificação. Uma "mistura de reação" ou "frasco de reação" significa uma solução ou compartimento que contém todos os reagentes necessários 10 para a realização de uma reação, que podem incluir, sem limitação, agentes de tamponamento para manter o pH em um nível selecionado durante uma reação, sais, co-fatores, depuradores, e semelhantes.
O termo "complementar ou substancialmente 15 complementar" refere-se à hibridização ou pareamento de bases ou a formação de um duplex entre nucleotídeos ou ácidos nucléicos, como, por exemplo, entre as duas fitas de uma molécula de dsDNA ou entre um iniciador de oligonucleotídeo e um sítio de ligação de iniciador em um 20 ácido nucléico de fita simples. Nucleotídeos complementares são, geralmente, AeT (ou A e U), ou C e G. Duas moléculas de RNA ou DNA de fita simples são ditas como sendo substancialmente complementares quando os nucleotídeos de uma fita, otimamente alinhados e comparados e com inserções 25 ou eliminações de nucleotídeos apropriadas, pareiam com pelo menos cerca de 80% dos nucleotídeos da outra fita, normalmente pelo menos cerca de 90% a 95% e, mais preferivelmente, de cerca de 98 a 100%. Alternativamente, existe complementaridade substancial quando, por exemplo,
3 0 uma fita de DNA hibridiza sob condições de hibridização seletiva para seu complemento. Tipicamente, a hibridização seletiva ocorre quando há pelo menos cerca de 65% de complementaridade sobre um trecho de pelo menos 14 a 25 nucleotídeos, preferivelmente pelo menos cerca de 75%, mais 5 preferivelmente pelo menos cerca de 90% de complementaridade. Veja Kanehisa Nucleic Acids Res. 12: 203, 1984, aqui incorporado por referência.
"Duplex" significa que pelo menos dois oligonucleotídeos e/ou polinucleotídeos que são total ou parcialmente complementares passam por pareamento de bases do tipo Watson-Crick entre todos ou quase todos seus nucleotídeos, de tal forma que se forma um complexo estável. Os termos "anelamento" e "hibridização" são usados de forma intercambiável para significar a formação de um duplex estável. 0 termo "perfeitamente combinado" em referência a um duplex significa que as fitas dos poli- ou oligonucleotídeos que constituem o duplex formam uma estrutura de fita dupla entre elas, de tal forma que cada nucleotídeo em cada fita passa por pareamento de bases de Watson-Crick com um nucleotídeo na outra fita.
0 termo "lócus genético" ou "lócus", em referência a um genoma ou polinucleotídeo-alvo, significa uma sub-região ou segmento contíguo do genoma ou polinucleotídeo-alvo. Como aqui usado, lócus genético, ou lócus, pode se referir 25 à posição de um gene ou de uma porção de um gene em um genoma, ou pode se referir a qualquer porção contígua de seqüência genômica, esteja ou não ela dentro de um gene, ou associada a ele. De preferência, um lócus genético referese a qualquer porção de seqüência genômica de umas poucas
3 0 dezenas de nucleotídeos, por exemplo, 10-30 ou 10-100, de comprimento, até poucas centenas de nucleotídeos, por exemplo, 100-1.000 ou 100-500 de comprimento, até poucos milhares de nucleotídeos de comprimento, por exemplo, 1.000-10.000 ou 1.000-3.000 de comprimento. Em alguns contextos, Ioci genéticos podem se referir à localização de um nucleotídeo dentro de um genoma.
"Kit" refere-se a qualquer sistema de liberação para a liberação de materiais ou reagentes para a realização de um método da presente invenção. No contexto de ensaios de reação, esses sistemas de liberação incluem sistemas que permitem o armazenamento, transporte ou liberação de reagentes da reação (por exemplo, sondas, enzimas etc. nos recipientes apropriados) e/ou materiais de suporte (por exemplo, tampões, instruções escritas para a realização do ensaio etc.) de uma localização para outra. Por exemplo, kits incluem um ou mais pacotes (por exemplo, caixas) que contêm os reagentes de reação e/ou materiais de suporte relevantes. Esses conteúdos podem ser liberados ao receptor desejado em conjunto ou separadamente. Por exemplo, um primeiro recipiente pode conter uma enzima para uso em um ensaio, enquanto um segundo recipiente contém sondas. Os kits também podem conter compartimentos adaptados para conter os reagentes. Em um exemplo, um compartimento compreende uma matriz sólida que possui oligonucleotídeos ou iniciadores ou polinucleotídeos nela imobilizados, que participam na reação de amplificação. Um exemplo de uma matriz sólida é um microarranjo. Um kit, portanto, pode ser parte de um sistema de amplificação global que possui um componente de reagente, um componente de ácido nucléico, um componente de hardware e um componente de instruções. Referência a uma "matriz sólida" inclui qualquer forma de material estrutural para a realização de uma reação de amplificação. Dessa forma, PCR de emulsão, por exemplo, é considerada uma forma de matriz sólida onde a PCR é efetuada nas várias fases da emulsão.
O termo "microarranjo" refere-se a um suporte de fase sólida que possui uma superfície plana, que carrega um arranjo de ácidos nucléicos, cada membro do arranjo compreendendo cópias idênticas de um oligonucleotídeo ou 10 polinucleotídeo imobilizado a uma região ou local espacialmente definido, que não se superpõe com aqueles de outros membros do arranjo; ou seja, as regiões ou locais são espacialmente distintas. Locais de hibridização espacialmente definidos podem adicionalmente ser 15 "localizáveis", ou seja, sua localização e a identidade de seu oligonucleotídeo imobilizado são conhecidas ou predeterminadas, por exemplo, antes do seu uso. Tipicamente, os oligonucleotídeos ou polinucleotídeos são de fita simples e são anexados covalentemente ao suporte de 20 fase sólida, normalmente por uma extremidade 5' ou uma extremidade 3'. A densidade de regiões não superpostas que contêm ácidos nucléicos em um microarranjo é tipicamente maior do que 100 por cm2 e, mais preferivelmente, maior do que 1.000 por cm2. A tecnologia de microarranjo é revelada 25 nas seguintes referências, que são incorporadas por referência: Schena (Ed), "Microarrays: A Practical Approach" (IRL Press, Oxford, 2000); "Southern", Current Opin. Chem. Biol., 2: 404-410, 1998.
0 termo "microarranjo aleatório" refere-se a um microarranjo cujas regiões espacialmente distintas de oligonucleotídeos ou polinucleotídeos não são espacialmente localizáveis. Ou seja, a identidade dos oligonucleotídeos ou polinucleotídeos anexados não é discernível, pelo menos inicialmente, a partir de sua localização. Em um aspecto,
microarranjos aleatórios são arranjos planos de microglóbulos, em que cada microglóbulo possui anexado um único tipo de complemento de tagr de hibridização, por exemplo, de um conjunto de oligonucleotídeos que hibridiza de forma cruzada minimamente. Da mesma forma, após 10 formação, microglóbulos, ou oligonucleotídeos destes, em um arranjo aleatório podem ser identificados de diversas formas, incluindo por marcadores ópticos, por exemplo, proporções de corante fluorescente ou pontos quantum, formato, análise de seqüência, ou semelhantes.
O termo "nucleosídeo", como aqui usado, inclui os
nucleosídeos naturais, incluindo formas 21-desóxi e Thidroxil, por exemplo, como descrito em Kornberg e Baker, "DNA Replication", 2a Ed. (Freeman, São Francisco, 1992).
0 termo "reação em cadeia de polimerase", ou "PCR", 20 significa uma reação para a amplificação in vitro de seqüências de DNA específicas pela extensão de iniciador simultânea de fitas de DNA complementares. Em outras palavras, PCR é uma reação para a produção de várias cópias ou réplicas de um ácido nucléico-alvo flanqueado por sítios 25 de ligação de iniciador, essa reação compreendendo uma ou mais repetições das seguintes etapas: (i) desnaturação do ácido nucléico-alvo, (ii) anelamento de iniciadores aos sítios de ligação de iniciador, e (iii) extensão dos iniciadores por uma ácido nucléico polimerase na presença
3 0 de nucleosídeo trifosfatos. Normalmente, a reação é ciclada através de diferentes temperaturas otimizadas para cada etapa em um instrumento de ciclagem térmica. Temperaturas, durações particulares em cada etapa e taxas de mudança entre etapas dependem de muitos fatores bem conhecidos por aqueles habilitados na técnica, por exemplo, exemplificados pelas referências: McPherson e cols. (Eds), "PCR: A Practical Approach" e "PCR2: A Practical Approach" (IRL Press, Oxford, 1991 e 1995, respectivamente). Por exemplo, em uma PCR convencional que utiliza Taq DNA polimerase, um ácido nucléico-alvo de fita dupla pode ser desnaturado em uma temperatura >90°C, iniciadores anelados em uma temperatura na faixa de 35-90°C. 0 termo "PCR" engloba formas derivadas da reação, incluindo, sem limitação, RTPCR, PCR em tempo real, PCR abrigada, PCR quantitativa, PCR em multiplexo, e semelhantes. Os volumes de reação variam de poucas centenas de nanolitros, por exemplo, 200 nl, a poucas centenas de μΐ, por exemplo, 200 μΐ. "PCR por transcrição reversa", ou "RT-PCR", significa uma PCR que é precedida por uma reação de transcrição reversa que converte um RNA-alvo em um DNA de fita simples complementar, que é então amplificado; por exemplo, Tecott e cols., Patente U.S. N0 5.168.03 8, cuja patente é aqui incorporada por referência. "PCR em tempo real" significa uma PCR para a qual a quantidade de produto de reação, ou seja, amplicon, é monitorada à medida que a reação evolui. Há muitas formas de PCR em tempo real que diferem principalmente nas químicas de detecção usadas para o monitoramento do produto de reação, por exemplo, Gelfand e cols., Patente U.S. N0 5.210.015 ("taqman"); Wittwer e cols., Patentes U.S. Nos 6.174.670 e 6.569.627 (corantes intercalados); Tyagi e cols., Patente U.S. N0 5.925.517 (sinalizadores moleculares) ; cujas patentes são aqui incorporadas por referência. As químicas de detecção para PCR em tempo real são revisadas em Mackay e cols., Nucleic 5 Acids Research, 30: 1.292-1.305, 2002, que também é aqui incorporado por referência. "PCR abrigada" significa uma PCR em dois estágios em que o amplicon de uma primeira PCR torna-se a amostra para uma segunda PCR usando um novo conjunto de iniciadores, pelo menos um dos quais se ligando 10 a uma localização interior do primeiro amplicon.
Os termos "polinucleotídeo" ou "oligonucleotídeo" são usados de forma intercambiável, e cada um significa um polímero linear de monômeros de nucleotídeos. Os monômeros que constituem polinucleotídeos e oligonucleotídeos são 15 capazes de se ligar especificamente a um polinucleotídeo natural por meio de um padrão regular de interações monômero a monômero, por exemplo, o pareamento de bases do tipo Watson-Crick, empilhamento de bases, pareamento de bases do tipo Hoogsteen ou Hoogsteen reversa, ou
2 0 semelhantes.
Sempre que um polinucleotídeo ou oligonucleotídeo for representado por uma seqüência de letras (maiúsculas ou minúsculas) como, por exemplo, "ATGCCTG", estará subentendido que os nucleotídeos estão em uma ordem de 5' 25 para 3' da esquerda para a direita, e que "A" representa desoxiadenosina, "C" representa desoxicitidina, "G" representa desoxiguanosina, e "T" representa timidina, "I" representa desoxiinosina, "U" representa uridina, a menos que indicado de forma diferente ou que fique óbvio pelo 30 contexto. "Iniciador" significa um oligonucleotídeo, natural ou sintético, que é capaz, mediante a formação de um duplex com um modelo de polinucleotídeo, de atuar como um ponto de iniciação da síntese de ácido nucléico e de ser estendido a 5 partir de sua extremidade 3' ao longo do modelo, de tal forma que seja formado um duplex estendido.
A extensão de um iniciador é normalmente realizada com uma ácido nucléico polimerase, por exemplo, uma DNA ou RNA polimerase. A seqüência de nucleotídeos adicionada no 10 processo de extensão é determinada pela seqüência do polinucleotídeo-modelo. Normalmente, iniciadores são estendidos por uma DNA polimerase. Iniciadores normalmente possuem um comprimento na faixa de 14 a 40 nucleotídeos, ou na faixa de 18 a 36 nucleotídeos. Os iniciadores são 15 empregados em diversas reações de amplificação de ácido nucléico, por exemplo, reações de amplificação linear usando um único iniciador, ou PCRs, empregando dois ou mais iniciadores. As diretrizes para a seleção dos comprimentos e seqüências de iniciadores para aplicações específicas são 20 bem conhecidas por aqueles habilitados na técnica, como pode ser evidenciado pela seguinte referência, que é incorporada por referência: Dieffenbach (Ed), "PCR Primer: A Laboratory Manual", 2a Edição (Cold Spring Harbor Press, Nova York, 2003) .
0 termo "amostra" significa uma quantidade de material
de uma fonte biológica, ambiental, médica ou de um paciente na qual a detecção ou medida de ácidos nucléicos-alvo é buscada. Por um lado, visa incluir um espécime ou cultura (por exemplo, culturas microbiológicas). Por outro lado,
3 0 visa incluir amostras tanto biológicas quanto ambientais. Uma amostra pode incluir um espécime de origem sintética. Amostras biológicas podem ser de origem animal, incluindo humana, líquidas, sólidas (por exemplo, fezes) ou tecido, alem de produtos e ingredientes líquidos e sólidos de 5 alimentos e rações, tais como produtos laticínios, vegetais, carne e subprodutos de carne, e dejetos. Amostras biológicas podem incluir materiais retirados de um paciente, incluindo, sem limitação, culturas, sangue, saliva, líquido cefalorraquidiano, líquido pleural, leite, 10 linfa, escarro, sêmen, aspirados de agulha, e semelhantes. Amostras biológicas podem ser obtidas de todas as várias famílias de animais domésticos, bem como de animais ferozes ou selvagens, incluindo, sem limitação, animais como ungulados, ursos, peixes, roedores etc. Amostras ambientais 15 incluem material ambiental como, por exemplo, matérias de superfície, solo, água e amostras industriais, além de amostras obtidas de instrumentos, aparelhos, equipamentos, utensílios, itens descartáveis e não descartáveis de processamento de alimentos e laticínios. Esses exemplos não 20 devem ser considerados como limitantes dos tipos de amostra aplicáveis à presente invenção.
Os termos "suporte sólido", "suporte", "suporte de fase sólida" e "matrizes sólidas" são usados de forma intercambiável, e referem-se a um material ou a um grupo de 25 materiais que possuem uma superfície ou superfícies rígidas ou semi-rígidas. Em muitas modalidades, pelo menos uma superfície do suporte sólido será substancialmente plana, embora em algumas modalidades possa ser desejável separar fisicamente regiões de síntese para diferentes compostos
3 0 com, por exemplo, poços, regiões elevadas, pinos, canais incrustados, ou semelhantes. De acordo com outras modalidades, o(s) suporte(s) sólido(s) assumirá a forma de glóbulos, resinas, géis, microesferas, ou outras configurações geométricas. Como indicado acima, uma fase de 5 emulsão é considerada como um "suporte sólido" ou "matriz sólida". Microarranjos normalmente compreendem pelo menos um suporte de fase sólida plano, por exemplo, uma lâmina de microscópio de vidro. Os suportes também podem ser de vários tamanhos para permitir uma classificação.
A molécula de ácido nucléico/iniciador sobre o suporte
sólido pode ser imobilizada diretamente ou por meio de uma ponte química ou de nucleotídeo. Todas essas químicas de acoplamento são englobadas pelo termo "por meio de vinculador".
EXEMPLO 1
Esquema de PCR assimétrica escalonada A Figura 1 (i) fornece uma representação esquemática de PCR de Fase Sólida Aprimorada para a carga de amplicon de fita simples ou dupla sobre um suporte sólido. Uma região de DNA a ser amplificada e os amplicons derivados desta são representados por linhas sólidas. As linhas pontilhadas representam seqüência fora da região-alvo. O iniciador (representado por uma seta) a representa iniciador de PCR "direto" e b representa iniciador "reverso". Neste exemplo, o suporte sólido é representado por um círculo. Observe que o suporte sólido está conjugado a muitas cópias do iniciador de suporte sólido, embora para simplificar a representação esquemática somente um iniciador de suporte sólido é representado. As linhas
3 0 onduladas representam seqüências vinculadoras não específicas para o alvo. Setas mais espessas, mais longas, ilustram iniciadores com Tm maior específicos para o alvo. O Iniciador b possui a inclusão opcional de uma molécula de marcação, por exemplo, flúor, para uso em sistemas de 5 detecção direta (representado por uma estrela). Moléculas de marcação poderiam opcionalmente ser incluídas como substratos de reação, por exemplo, dNTPs marcados com flúor. O Iniciador b é opcionalmente projetado de tal forma que, em certa faixa de temperatura, a ligação do iniciador 10 b à seqüência-alvo e a iniciação da extensão por polimerase pelo iniciador sejam mais eficientes do que o Iniciador a. Um exemplo de um método de design para se atingir esse objetivo inclui o fato de o Iniciador b ter uma temperatura de fusão alvo-específica maior do que o Iniciador a, de tal 15 forma que, em uma temperatura de anelamento aumentada, o Iniciador b se ligue e inicie, enquanto o Iniciador a não o faça. Outro exemplo é quando o Iniciador a exibe supressão "em cabo de frigideira" (panhandle) abaixo de certa temperatura, de tal forma que, abaixo dessa temperatura, o 20 Iniciador b se ligue e inicie, enquanto o Iniciador a não o faça.
O Iniciador a e o Iniciador b são empregados como parte de um regime de PCR convencional ou assimétrico com a inclusão do iniciador de suporte sólido.
Uma PCR convencional é realizada com a inclusão do
Iniciador a, do Iniciador b e do iniciador conjugado ao suporte sólido sob condições permissivas de termociclagem para todos os iniciadores. O iniciador de suporte sólido é projetado de tal forma que, em certa faixa de temperatura, a iniciação da extensão por polimerase pelo iniciador é mais competitiva do que o Iniciador a. Designs do iniciador do suporte sólido representados na Figura 1: (ii)2, (ii)3 e
(ii)4 oferecem maior participação do par de iniciadores de suporte sólido versus técnica estabelecida ((ii)l) em virtude, por exemplo, de Tm maior e/ou de serem abrigados ou parcialmente abrigados. A técnica estabelecida (ii)l usa uma seqüência alvo-específica que combina identicamente com o iniciador "aquoso" correspondente, juntamente com uma seqüência vinculadora 5-prime. Nos exemplos aqui ilustrados, (ii)2 inclui uma extensão de seqüência 3-prime para elevar a Tm versus (ii)l, (ii)3 inclui seqüência alvoespecífica que está abrigada ou parcialmente abrigada com relação a (ii)l, embora a Tm alvo-específica seja similar a
(ii)l, e (ii)4 inclui seqüência alvo-específica que está abrigada ou parcialmente abrigada com relação a (ii)l e possui Tm alvo-específica mais elevada do que (ii)l. Essas diferenças de design oferecem benefícios cinéticos para a participação pelo iniciador de suporte sólido versus técnica estabelecida, de tal forma que é facilitada a carga de amplicon do suporte sólido.
Durante os últimos ciclos térmicos, opcionalmente, as etapas de anelamento podem ter aumentado ou reduzido a temperatura versus ciclos anteriores, de tal forma que o iniciador de suporte sólido ainda anele para o alvo eficientemente, mas o iniciador "aquoso" a competidor não o faz. Por exemplo, quando o Iniciador de suporte sólido exibe Tm alvo-específ ica mais elevada do que o Iniciador a, em temperaturas elevadas, o iniciador de suporte sólido inicia, mas o Iniciador a não o faz. Outro exemplo é quando o Iniciador a exibe supressão "em cabo de frigideira" abaixo de certa temperatura, de tal forma que, abaixo dessa temperatura, o iniciador de suporte sólido se liga e inicia, enquanto o Iniciador a não o faz. O Iniciador b pode ser projetado para ter características de iniciação similares ao Iniciador a ou ao iniciador de suporte sólido. 0 emprego de vários desses últimos ciclos quando o Iniciador b não se liga ao alvo eficientemente permite a geração de amplicon de suporte sólido de fita simples. 0 emprego desses últimos ciclos quando o Iniciador b se liga ao alvo eficientemente permite a geração de amplicon de suporte sólido de fita dupla. O emprego desses últimos ciclos quando o Iniciador b não se liga ao alvo eficientemente, seguido por condições permissivas para a ligação do Iniciador b, permite a geração de amplicon de suporte sólido de fita dupla.
Opcionalmente, o amplicon de suporte sólido de fita dupla pode ser subseqüentemente convertido em amplicon de suporte sólido de fita simples, por exemplo, por desnaturação térmica ou química e retirada por lavagem da 20 fase de solução ou, por exemplo, processamento por exonuclease.
EXEMPLO 2
Esquema de PCR assimétrica de fase sólida escalonada
A PCR de Fase Sólida Aprimorada (ESP-PCR) é um 25 mecanismo aqui projetado para combinar a alta sensibilidade da PCR simétrica "aquosa" não comprometida com a carga eficiente do suporte sólido. A ESP-PCR altera o mecanismo pelo qual o amplicon é carregado sobre o suporte sólido por remoção da competição entre o iniciador "aquoso" e o
3 0 iniciador de suporte sólido para aumentar a iniciação do iniciador de suporte sólido (Figura 2) . O iniciador "aquoso" não precisa ser limitado, permitindo, dessa forma, um sistema mais sensível. Além disso, o design do iniciador inerente à ESP-PCR oferece o potencial opcional de 5 aplicação dos últimos ciclos térmicos em temperaturas de anelamento permissivas exclusivamente ã ligação do iniciador de suporte sólido.
Este Exemplo detalha a ESP-PCR realizada com a utilização de material de suporte sólido, densidade da 10 superfície do iniciador e seqüência "vinculadora" constantes com o escopo e a intenção de dissecar os benefícios mecanicistas da ESP-PCR em relação à SP-PCR. Oligonucleotídeos
Os oligonucleotídeos foram adquiridos de Integrated DNA Technologies (Coralville, EUA). Os oligonucleotídeos de geração de modelos e oligonucleotídeos de ESP-PCR e SP-PCR estão listados abaixo. A seqüência do oligonucleotídeo de medida da eficiência de conjugação (Transprobe) foi: / 5AmMC6 / GTCCATAGCTGTCCTCCCT (ID. DE SEQ. N°: I). Todas as seqüências de oligonucleotídeos estão listadas na direção 5-prime para 3-prime. /SPhos/, /5AmMC6/, /5Acryd/ e /iAmMC6T/ indicam fosfato 5-prime, modificador de amina 5- prime, grupos modificadores de amina 5-prime de acrydite e internos, respectivamente. Ngo, Ngps e Cto3 referem-se ao opa de Neisseria gonorrhoea, piIS Neisseria gonorrhoea e orf3 de plasmídeo críptico de Chlamydia trachomatis, respectivamente. As regiões sublinhadas indicam seqüência "vinculadora" não alvo incluída na porção 5-prime do iniciador de suporte sólido para facilitar a apresentação da porção alvo-específica durante a "carga de amplicon". Essa seqüência "vinculadora", compartilhada por iniciadores de suporte sólido de SP-PCR e de ESP-PCR, também foi usada como o alvo de hibridização Transprobe para a avaliação da carga de iniciador sobre o suporte sólido após conjugação. Conjugação de oligonucleotídeo às microesferas de sílica
Microesferas de sílica de 6,81 μτη de diâmetro (Bangs Laboratories, Fishers, EUA) foram funcionalizadas com grupos sulfidrila, antes de serem conjugadas aos oligonucleotídeos. A literatura do produto da "Integrated DNA Technologies" detalha a reação entre um suporte sólido tiol e oligonucleotídeos modificados por grupo acrydite 5- prime (disponível online na página da Internet: http://scitools.idtdna.com/support/technical/TechnicalBulle tinPDF/StrategiesforAttachinOligonucleotidestoSolidSupports .pdf). Após a conjugação, as microesferas foram processadas por uma série de cinco etapas de centrifugação/lavagem para remover quaisquer oligonucleotídeos não ligados, antes da suspensão em tampão até 1 mg/ml. Os níveis de conjugação dos oligonucleotídeos às microesferas foram avaliados por mistura de 1 μΐ de suspensão homogênea de microesferas com μΐ de tampão contendo cloreto de sódio 50 mM e 0,5 μΐ de Transprobe 10 μΜ marcada com Alexa-flúor-64 7 (em uma proporção de 2:1 Transprobe Total:Transprobe marcada com Alexa-flúor-647). Alexa-flúor-647 foi adquirido de Molecular Probes (Mount Waverley, Austrália). As misturas de hibridização foram submetidas ao seguinte perfil térmico de "hibridização": 90°C por 30 segundos, seguido por resfriamento em uma taxa de 1°C/10 segundos até 20°C. Após a hibridização, 120 μΐ de tampão foram adicionados, antes da análise por FACSArray (Becton Dickinson, North Ryde, Austrália). Os dados apresentados nesse estudo foram derivados desse protocolo de ensaio racionalizado. As microesferas podem ser submetidas a uma lavagem pós-PCR mais rigorosa com o efeito de reduzir a fluorescência de fundo para os "controles sem modelo", sem alterar a intensidade do sinal para as amostras de ESP-PCR ou SP-PCR com modelo. As microesferas foram avaliadas em triplicata, em paralelo, no mesmo instrumento, executado usando os seguintes parâmetros de voltagem: FCS 55 0, SSC 4 00, Far Red 100, Yellow 650, NIR 200, Red 700, FCS limiar 20000. Os arquivos *.fcs foram analisados com o uso de "FCS Express v. 3" para determinar a fluorescência vermelha mediana. O teste T de Student foi aplicado para demonstrar conjugação igual de iniciador de suporte sólido-microesfera entre pares de alvo de ESP-PCR e SP-PCR.
Geração de modelo
DNA de Chlamydia trachomatis sorovar E foi usado para modelar uma PCR usando iniciadores diretos e reversos de geração de modelo de Cto3 para gerar um amplicon que 20 incluía as regiões-alvo de oligonucleotídeos de ESP-PCR/SPPCR. O amplicon foi purificado em gel de agarose usando um kit de extração em gel Qiaquick (Marca Registrada) (Qiagen, Doncaster, Austrália). O rendimento foi aproximado por avaliação por eletroforese em gel do produto contra o 25 padrão de DNA "Hyperladder IV" (Bioline, Alexandria, Austrália). Similarmente, Neisseria gonorrhoea cepa ATCC 43 069 foi usada para modelar PCRs para gerar alvos Ngo e Ngps usando seus respectivos iniciadores de geração alvo. ESP-PCR e SP-PCR
3 0 Todas as ESP-PCRs e SP-PCRs foram realizadas em volumes de reação de 2 0 μΐ usando 1 unidade de HotStarTaq [Marca Registrada] (Qiagen, Doncaster, Austrália). 0 tampão de reação HotStarTaq (Marca Registrada) foi suplementado com Mg2+ e dNTPs (New England Biolabs, Genesearch, Arundel,
Austrália) para gerar concentrações de reação de 2 mM e 200 μΜ, respectivamente. Foram incluídos nas reações 1 μΐ de iniciador "aquoso" direto 5 μΜ, 1 μΐ de iniciador "aquoso" reverso 5 μΜ (marcado com Alexa-flúor-647 com uma proporção de oligonucleotídeo total:oligonucleotídeo marcado com 10 flúor de 2:1) e 1 μΐ de 1 mg/ml de iniciador de suporte sólido-suspensão de microesferas conjugadas. Microesferas conjugadas à SP-PCR ou iniciador de suporte sólido de ESPPCR foram incluídos nas reações de SP-PCR ou ESP-PCR, respectivamente. ESP-PCR e SP-PCR foram realizadas em 15 triplicata, em paralelo, com o uso das mesmas misturas principais. Em cada caso, os iniciadores e as microesferas foram agrupados de acordo com o alvo e o modelo. As reações incluíram 4 0.000 cópias de modelos de Cto3, 4 0.000 cópias de modelos de Ngo ou 4 00.000 cópias de modelos de Ngps, 20 respectivamente. 0 perfil térmico empregado foi o seguinte: 94°C por 15 minutos, seguidos por 30 ciclos de [90°C por 30 segundos, 440C por 1 minuto, 720C por 1 minuto], seguidos por 5 ciclos de [90°C, 44°C por 2 minutos, 72°C por 2 minutos] .
Análise por citometria de fluxo de ESP-PCR e SP-PCR
Após PCR de fase sólida, os 5 μΐ do fundo foram transferidos para 120 ml de tampão em uma placa de microtitulação de 96 poços. Os arquivos *.fcs foram gerados por FACSArray com os mesmos ajustes do instrumento descritos anteriormente. Os números da fluorescência vermelha mediana foram determinados usando "FCS Express v. 3" .
Eletroforese em gel
Após coleta de amostras da citometria de fluxo, 8 μΐ de produtos de PCR residuais foram analisados com o uso de géis de agarose 3%/TAE contra 1,5 μg de ladder de 100 bp da New England Biolabs (Genesearch, Arundel, Austrália).
Oligonucleotídeos para a geração de modelo.
Iniciador direto para a geração GATGCGGAAAAAGCTTACCAG de modelo de Cto3 Iniciador reverso para a geração GGGCTTAGAATCACCTTCTCG de modelo de Cto3 Iniciador direto para a geração GCGGATTAACAAAAATCAGGACAA de modelo de Ngo Iniciador reverso para a geração TAATCTGCCGCTATCCTCCAG de modelo de Ngo Iniciador direto para a geração TTTTTTGCCGGCGTGGCATCC de modelo de Ngps Inieiador reverso para a geração ATCGATATATTATTTCCACCGGAAC de modelo de Ngps Oligonucleotídeos de ESP-PCR e SP-PCR.
Iniciador "aquoso" direto de /5 Phos/ACAGACCCTTCTCTAGGT Cto3 Iniciador "aquoso" reverso de /5AmMC6/AATTCTAATACGACTCACTAT Cto3 AGGGCTTTTGGGTGTGACTGTG Inieiador de suporte sólido /5Acryd/AAT/iAmMC6T/AAAGGGAGG de SP-PCR de Cto3 ACAGCTATGGACACAGACCCTTCTCTAGG T Iniciador de suporte sólido /5Acryd/AAT/iAmMC6T/AAAGGGAGG ACAGCTATGGACCACTAATAAAATTCAAT GCAACGGGTTATTCACTC Iniciador "aquoso" direto de /5 PhOS/GCCATATTGTGTTGAAACAC Ngo Iniciador "aquoso" reverso de /5AmMC6/AATTCTAATACGACTCACTAT Ngo AGGGGTTTGACCGGTTAAAAAAAGA Iniciador de suporte sólido /5Acryd/AAT/iAmMC6 T/AAAGGGAGG de SP-PCR de Ngo ACAGCTATGGACGCCATATTGTGTTGAAA CAC Iniciador de suporte sólido /5Acryd/AAT/iAmMC6T/AAAGGGAGG ACAGCTATGGACCCCGATATAATCCGCCC TTCAACATCAGTG Iniciador "aquoso" direto de /5 PhOS/AATGAGGCAAATTAGGCCT Ngps Iniciador "aquoso" reverso de /5AmMC6/AATTCTAATACGACTCACTAT Ngps AGGGCTTGCAAACCCTTAAAAGAC Iniciador de suporte sólido /5Acryd/AAT/iAmMC6T/AAAGGGAGG ACAGCTATGGACAATGAGGCAAATTAGGC CT Iniciador de suporte sólido /5Acryd/AAT/iAmMC6T/AAAGGGAGG de ESP-PCR de Ngps ACAGCTATGGACAAATCAAGCGGTAAGTG ATTTCCCACGGC Ensaio multiplexo para detecção de Neisseria gonorrhoeae e Chlamydia trachomatis por ESP-PCR
Os iniciadores de suporte sólido de ESP-PCR de Ngo e de ESP-PCR de Cto3 listados acima foram conjugados às 5 microesferas de sílica (Bangs Laboratories) de 5,6 μιη de diâmetro e de 6,8 μπ\ de diâmetro, respectivamente, lavados e reunidos em pool a 1 mg/ml por população de glóbulos. Um microlitro de suspensão de pool de glóbulos foi incluído nas reações de ESP-PCR que incluem os iniciadores de opa de Neisseria gonorrhoeae·. 5' -GGCAACGMCGTACCGGTTT-3' (ID. DE SEQ. N°: 20) e 5'
ACGTCACAGTTTACGCGTTTGACCGGTTAAAAAAAGATTTTCAC-3' 5 -prime
marcado com Alexa-flúor-647 (ID. DE SEQ. N°: 21), e iniciadores de orf3 de plasmídeo críptico de Chlamydia trachomatis: 5'AGCTTTTAACAACTTTCCAATCACTA-3' (ID. DE SEQ. N°: 22) e 5'-ACGACTCACTATAGGGTCCCAGAGCTTTTGGGTGTG-3' 5- prime marcado com Alexa-flúor-647 (ID. DE SEQ. N°: 23). DNA genômico de Neisseria gonorrhoea cepa ATCC 4 3 069 ou plasmídeo com região de amplicon que engloba uma orf3 de plasmídeo críptico de Chlamydia trachomatis listada acima (veja a seção "Geração de modelo"), com a inclusão de 5 ng de DNA genômico humano de Jurkat, foi usado para modelar PCRs versus controles somente de DNA genômico humano ou água. As reações foram realizadas em um volume total de 20 μΐ, usando duas unidades de Platinum Taq [Nome Comercial] (Invitrogen) com o uso dos seguintes parâmetros de ciclagem: 94°C por 2 minutos, seguidos por 50 ciclos de [ 90 0C por 30 segundos, 55°C por 1 minuto, 72°C por 1 minuto], seguidos por 72°C por 5 minutos. As microesferas de sílica foram centrifugadas/lavadas duas vezes com tampão, antes da análise por FACSArray usando os ajustes do instrumento listados acima.
Após conjugação, as microesferas foram lavadas 25 cuidadosamente, antes da suspensão em tampão até 1 mg/ml. Os níveis de conjugação de oligonucleotídeos às microesferas foram avaliados por hibridização da "Transprobe" marcada com Alexa-flúor-647 (Molecular Probes) à seqüência vinculadora do iniciador de suporte sólido, 30 seguida por análise por citometria de fluxo. As microesferas foram avaliadas em triplicata, em paralelo, na mesma execução do instrumento, usando os seguintes parâmetros de voltagem: FCS 550, SSC 400, Far Red 100, Yellow 650, NIR 200, Red 700, FCS limiar 20000. Os arquivos 5 *.fcs foram analisados com o uso de FCS Express v. 3 para determinar a fluorescência vermelha mediana. O teste T de Student foi aplicado para demonstrar igual conjugação de iniciador de suporte sólido-microesferas entre pares-alvo de ESP-PCR e SP-PCR (opa de Ng, P = 0,919; pilS de Ng, P = 10 0,759; orf3 de CtCP, P = 0,829). Dessa forma, quaisquer aumentos observados na carga de amplicon após a aplicação de ESP-PCR versus SP-PCR seriam causados pela melhor iniciação do suporte sólido, e não por níveis diferenciais de conjugação do iniciador de suporte sólido.
Foram realizados experimentos comparativos entre ESP
PCR e SP-PCR em volumes de reação de 2 0 μΐ, usando 1 unidade de HotStarTaq [Marca Registrada] (Qiagen). 0 tampão de reação HotStarTaq (Marca Registrada) foi suplementado com Mg2+ e dNTPs (New England Biolabs) para gerar concentrações de reação de 2 mM e 200 μΜ, respectivamente. Foram incluídos nas reações 1 μΐ de iniciador "aquoso" direto 5 μΜ, 1 μΐ de iniciador "aquoso" reverso 5 μΜ (marcado com Alexa-flúor-6471 com uma proporção de oligonucleotídeo total:oligonucleotídeo marcado com flúor de 2:1) e 1 μΐ de 1 mg/ml de iniciador de suporte sólidosuspensão conjugada de microesferas. As microesferas conjugadas à ESP-PCR ou ao iniciador de suporte sólido de SP-PCR foram incluídas nas reações de ESP-PCR ou SP-PCR, respectivamente. ESP-PCR e SP-PCR foram realizadas em triplicata, em paralelo, com o uso das mesmas misturas principais. Em cada caso, os iniciadores e as microesferas foram agrupados de acordo com o alvo e o modelo (dsDNA linear, incluindo regiões de ligação de iniciador). As reações incluíram 40.000 cópias de modelos de orf3 de 5 plasmídeo críptico de Chlamydia trachomatis, 40.000 cópias de modelos de opa de Neisseria gonorrhoea ou 400.000 cópias de modelos de pilS de Neisseria gonorrhoea, respectivamente, ou controles sem modelo (para demonstrar os níveis de fluorescência de fundo), e empregaram o 10 seguinte perfil térmico: 940C por 15 min, seguidos por 30 ciclos de [90°C 30 s, 44°C por 1 min, 72°C por 1 min] , seguidos por 5 ciclos de [90°C, 44°C por 2 min, 72°C por 2 min] . Após a PCR de fase sólida, os 5 ml do fundo foram transferidos para 120 ml de tampão em uma placa de 15 microtitulação de 96 poços. Os arquivos *.fcs foram gerados por FACSArray com os mesmos ajustes do instrumento descritos previamente. Os números da fluorescência vermelha mediana foram determinados usando "FCS Express v. 3".
ESP-PCR resultou em uma carga de amplicon de suporte sólido acentuadamente aumentada versus SP-PCR ao longo de todos os três alvos avaliados (Tabela 3), com forte significância estatística: opa de Ng (9,89 vezes, P =
0,00000661), pilS de Ng (2,14 vezes, P = 0,001095) e orf3 de CtCP (1,41 vez, P = 0,000935) . Os valores P estão 25 relacionados à hipótese nula de que não há diferença na carga de amplicon entre ESP-PCR e SP-PCR. O aumento em número de vezes refere-se à RFU de ESP-PCR/RFU de SP-PCR. A variação em termos de número de vezes ao longo dos alvos não foi inesperada em função das variações inerentes nas 30 eficiências de hibridização entre oligonucleotídeos e pelo fato de que estão envolvidos eventos complexo de hibridização competitiva. Apesar dessa variação, a ESP-PCR foi universalmente benéfica em todos os alvos estudados. Amplicons "aquosos" não ligados às microesferas dos mesmos frascos de reação usados para as medidas de citometria de fluxo tiveram rendimentos iguais em todos os alvos após ESP-PCR versus SP-PCR, como avaliado por eletroforese em gel de agarose. Os rendimentos do produto "aquoso" também foram idênticos, com ou sem microesferas na mistura de reação, indicando que as microesferas de sílica conjugadas aos iniciadores de suporte sólido não comprometeram a eficiência da amplificação. Após ESP-PCR, o suporte sólido foi cuidadosamente lavado por meio de múltiplas etapas de centrifugação e troca de tampão, e usado para modelar reações limitadas de ciclos de "re-amplificação", incluindo os iniciadores "aquosos" usados previamente e uma versão "aquosa" do iniciador de suporte sólido. Produtos de banda única de tamanhos que correspondem àqueles esperados de produtos derivados do iniciador de suporte sólido e da iniciação com iniciador "aquoso" reverso foram observados mediante eletroforese em gel, indicando que os produtos de suporte sólido de ESP-PCR eram específicos. Considerados em conjunto, esses dados sugerem que ESP-PCR foi bem sucedida na obtenção do duplo objetivo de não comprometer a amplificação de "fase aquosa" e aumentar a carga da superfície do suporte sólido com amplicon em relação à SPPCR-padrão, de uma forma específica.
Esses benefícios observados são causados pelos mecanismos de carga, nos quais: (i) a concentração eficaz de iniciador de suporte sólido é aumentada em função de sua Tm relativamente elevada. A "Linear-After-The-ExponentialPCR" (LATE-PCR) melhora a geração de produtos de fita simples por PCR assimétrica (Sanchez e cols., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 101: 1.933-1.938, 2004). Nessa abordagem,
foi empregada uma "ligação mais firme", com iniciador de concentração limitada, para aumentar sua "concentração eficaz" na reação, com base no relacionamento entre a Tm do iniciador e a concentração do iniciador descrito pela fórmula "vizinho mais próximo" (SantaLucia, Proc. Natl. 10 Acad. Sei. USA 95: 1.460-1.465, 1998). Na ESP-PCR, esse princípio é aplicado ao iniciador de suporte sólido. Um iniciador de suporte sólido de "ligação mais firme" possui uma "concentração eficaz" aumentada e cinética aprimorada de ligação e iniciação, (ii) o iniciador de suporte sólido 15 é abrigado com relação à sua contraparte "aquosa". Na medida em que o iniciador de suporte sólido reconhece um sítio de ligação diferente em relação ao iniciador "aquoso" direto, a competição direta para a ligação do amplicon é removida. Na ESP-PCR, diferentemente da SP-PCR, a fim de 20 que a iniciação de suporte sólido seja inibida por "bloqueio" do sítio de ligação do iniciador de suporte sólido, é necessário que o iniciador "aquoso" direto se ligue ao modelo de amplicon e à polimerase para subseqüentemente encontrar e se ligar ao seu substrato, e 25 assegurar a polimerização dentro de um curto espaço de tempo. Tanto na SP-PCR-padrão quanto na SP-PCR assimétrica, a simples ligação do iniciador aquoso ao seu sítio de ligação de iniciador é suficiente para inibir a iniciação de suporte sólido. No método de PCR Clamping, a 3 0 amplificação é especificamente bloqueada pela inclusão de sondas de ácido nucléico peptídico interno (abrigado) ou ácido nucléico locked (Dominguez e Kolodney, Oncogene 24: 6.830-6.834, 2005; Orum e cols., Nucleic Aeids Res. 21: 5.332-5.336, 1993). De forma análoga ao iniciador de 5 suporte sólido de ESP-PCR, as sondas de bloqueio da abordagem de PCR Clamping se ligam ao amplicon, antes de a ligação do iniciador e a polimerização terem oportunidade de ocorrer.
Ainda em relação aos princípios da ESP-PCR, a utilização de iniciadores "aquosos" e de parâmetros de termociclagem, foram detectados cinco genomas de Neisseria gonorrhoea e cinco equivalentes genômicos de Chlamydia trachomatis por uma única reação de ESP-PCR multiplexo por FACSArray. Essa abordagem usou iniciadores de suporte sólido conjugados às microesferas de sílica de diferentes diâmetros para facilitar a discriminação por citometria de fluxo. As reações foram modeladas com DNA genômico de Neisseria gonorrhoea e plasmídeo contendo região-alvo de Chlamydia trachomatis com a inclusão de DNA genômico humano de Jurkat versus somente DNA genômico humano de Jurkat ou água.
Tabela 3
Carga de amplicon de suporte sólido versus SP-PCR
Alvo SP-PCR sem SP-PCR ESP-PCR ESP-PCR controle sem de modelo controle de modelo opa de Ng 37,18 RFU 52,98 RFU 44,91 RFU 523,74 RFU (1,12) (15,24) piIS de Ng 40,68 RFU 74,3 6 RFU 3 9,60 RFU 159,09 RFU (1,78) (9,92) orf3 de CtCP 41,79 RFU 209,84 RFU 38,89 RFU 295,39 RFU (5,10) (8,33) A carga aumentada de microesferas de sílica com RFU marcado com fluorescência vermelha após ESP-PCR versus SPPCR. RFU refere-se às unidades de fluorescência relativa. Os números entre parênteses representam o erro padrão da média de séries em triplicata.
ESP-PCR é comparada com SP-PCR, que emprega microesferas de sílica como o suporte sólido, ao longo de uma variedade de alvos clinicamente relevantes: opa de Neisseria gonorrhoea (opa de Ng) e pilS (pilS de Ng) e orf3 10 de plasmídeo críptico de Chlamydia trachomatis (orf3 de CtCP) [McLeod e cols., Infection and Immunity 67: 3.469-
3.480, 1999; Comanducci e cols., J. Gen Microhiol. 139: 1.083-1.092, 1993] .
Resumidamente, iniciadores de suporte sólido de ESP15 PCR e SP-PCR foram preparados da seguinte forma: microesferas de sílica de 6,8 μιη de diâmetro (Bangs Laboratories) foram funcionalizadas com grupos sulfidrila, antes de serem conjugadas aos oligonucleotídeos modificados por grupo acrydite.
EXEMPLO 3
ESP-PCR e SP-PCR "escalonada" ou "não escalonada" Protocolos termicamente escalonados ou não escalonados foram ajustados em paralelo para alvo de orf3 de plasmídeo críptico de Chlamydia trachomatis como parte do experimento 25 descrito no Exemplo 2. Para PCR "não escalonada", foi empregado o perfil térmico 44-44: 94°C por 15 min, seguidos por [30 ciclos de 90°C por 30 segundos, 44°C por 1 minuto, 720C por 1 minuto] , seguidos por [5 ciclos de 90°C, 44°C por 2 minutos, 72°C por 2 minutos] . Para PCR "escalonada", foi usado o perfil térmico 44-60: 94°C por 15 min, seguidos por [30 ciclos de 90°C por 30 segundos, 44°C por 1 minuto, 5 720C por 1 minuto] , seguidos por [5 ciclos de 90°C, 60°C por 2 minutos, 720C por 2 minutos] . Os resultados são mostrados na Tabela 4.
Após a PCR de fase sólida, os 5 ml do fundo foram transferidos para 120 μΐ de tampão em uma placa de 10 microtitulação de 96 poços. Os arquivos *.fcs foram gerados por emprego de um FACSArray da BD usando os mesmos ajustes do instrumento descritos no Exemplo 2. Os números da fluorescência vermelha mediana foram determinados usando "FCS Express v. 3".
Na coleta de amostras após a citometria de fluxo, 8 μΐ
de produtos de PCR residuais foram processados em géis 3% p/v de agarose/TAE contra 1,5 μg de ladder de 100 bp de New England Biolabs (Genesearch, Arundel, Austrália).
Os benefícios potenciais de uma "etapa térmica" ótima 20 como parte do protocolo de ESP-PCR foram estudados (44-60). A maior temperatura de anelamento durante os últimos ciclos de PCR aumentou a carga de superfície do amplicon de orf3 de plasmídeo críptico de Chlamydia trachomatis ((aumento de 1,15 vez) (teste T de Student, probabilidade de que os 25 resultados sejam os mesmos: P = 0,0124) em relação a um protocolo de ESP-PCR térmica "não escalonada" (44-44).
Os perfis de eletroforese em gel de amplicons não ligados às microesferas foram gerados a partir dos mesmos frascos de reação que foram avaliados por citometria de 3 0 fluxo. Em todos os casos, foram observados rendimentos comparáveis de produtos de PCR de "fase aquosa", o que sugere que as diferenças na carga de amplicon de microesferas não foram influenciadas pelo rendimento de produto de PCR de "fase aquosa". Não houve diferenças 5 discerníveis entre rendimentos de produto aquoso, com ou sem microesferas incluídas na mistura de reação.
Tabela 4 ESP-PCR e SP-PCR "termicamente escalonadas" ou "não
escalonadas"
Alvo SP-PCR sem SP-PCR ESP-PCR ESP-PCR (protocolo controle sem térmico) de modelo controle de modelo orf3 de Ct 41,79 RFU 209,84 RFU 38,89 RFU 295,39 RFU 44-44 ("não (5,10) (8,33) escalonada") orf3 de Ct 42,17 RFU 246,79 RFU 3 9,24 RFU 339,93 RFU 44-60 (15,08) (6,06) ("escalonada") Carga aumentada de microesferas de sílica com amplicon
marcado com fluorescência vermelha após ESP-PCR "termicamente escalonada" versus ESP-PCR "não escalonada". orf3 de Ct refere-se à orf3 de plasmídeo críptico de Chlamydia trachomatis. RFU refere-se às unidades de 15 fluorescência relativa. Os números entre parênteses representam o erro padrão da média de séries em triplicata.
Aqueles habilitados na técnica perceberão que a invenção aqui descrita é suscetível a variações e modificações, além daquelas especificamente descritas. Deve-se entender que a invenção inclui todas essas variações e modificações. A invenção também inclui todas as etapas, características, composições e compostos citados ou indicados nesta especificação, individual ou coletivamente, e quaisquer e todas as combinações de duas ou mais das referidas etapas ou características.
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Claims (18)

1. Método para amplificação de fase sólida de uma molécula de polinucleotídeo em um frasco de reação, o método caracterizado por compreender a condução de uma reação de amplificação da molécula de polinucleotídeo com um iniciador imobilizado a uma fase sólida na presença de um conjunto de iniciadores aquosos em que o iniciador imobilizado é selecionado da lista que consiste em: (i) um iniciador que partilha identidade de seqüência parcial aos iniciadores de fase aquosa em que o iniciador imobilizado tem propriedades de anelamento diferencial em relação aos iniciadores aquosos sob condições particulares de anelamento; e (ii) um iniciador que tem uma seqüência que é abrigada entre iniciadores de fase aquosa e que é imobilizado a uma partícula.
2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que os iniciadores imobilizado e de fase aquosa têm propriedades de anelamento similares em um primeiro conjunto de condições de anelamento mas propriedades de anelamento diferencial em um segundo conjunto de condições de anelamento e em que a amplificação é realizada sob um primeiro conjunto de condições de anelamento e então modificado para um segundo conjunto de condições de anelamento em que as primeira e segunda condições de anelamento são permissivas para amplificação com todos os iniciadores ou não permissivas para os iniciadores aquoso ou imobilizado para desse modo facilitar a amplificação com base no iniciador aquoso ou iniciador de fase sólida.
3. Método, de acordo com a reivindicação 2, carácterizado pelo fato de que a amplificação da molécula ae polinucleotídeo pelos iniciadores imobilizado ou aquoso sob as condições permissivas e não permissivas resulta na geração de um polinucleotídeo de filamento único.
4. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que uma molécula amplificada de polinucleotídeo é imobilizada à fase sólida que é então submetida a condições de desnaturação para gerar moléculas de polinucleotídeo de filamento único imobilizadas e moléculas de polinucleotídeo de filamento único de fase aquosa.
5. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 3 ou 4, caracterizado por compreender uma etapa de separação de fase para isolar polinucleotídeo de filamento único imobilizado ou de fase aquosa.
6. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 3 ou 4, caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo de filamento único é imobilizado a fase sólida como um rótulo capaz de gerar um sinal detectável.
7. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4 ou 5, caracterizado pelo fato de que as propriedades de anelamento diferencial compreendem diferentes temperaturas de fusão.
8. Método, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que um ou ambos os iniciadores aquosos e/ou imobilizados compreendem uma seqüência de nucleotídeos de "head" ou "heel" assim fornecendo maior temperatura de fusão comparados ao outro iniciador.
9. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações I, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8, caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo a ser amplificado compreende uma extremidade 51 rebaixada ou uma extremidade protusa que é incubada com uma 5' a 3' exonuclease para gerar um modelo de polinucleotídeo de filamento único.
10. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 3, 4 ou 5, caracterizado por também compreender, depois de submeter a reação às condições de anelamento não permissivas, a alteração de volta a um conjunto permissivo de condições de anelamento para facilitar a geração de um filamento complementar no polinucleotídeo de filamento único imobilizado para formar um polinucleotídeo imobilizado em dupla a uma matriz sólida.
11. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10, caracterizado pelo fato de que a molécula de polinucleotídeo é DNA.
12. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou 11, caracterizado pelo fato de que o primeiro conjunto de condições de anelamento é permissivo e o segundo conjunto de condições de anelamento usado é não permissivo para um ou outro dos iniciadores de fase sólida ou aquoso.
13. Método, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que o segundo conjunto de condições é não permissivo para os iniciadores de fase aquosa.
14. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 ou 13, caracterizado pelo fato de que os iniciadores imobilizados à fase sólida partilham identidade de seqüência a um conjunto de iniciadores de fase aquosa e têm uma vantagem cinética sobre os iniciadores aquosos devido à extensão 3- prime.
15. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 ou 13, caracterizado pelo fato de que os iniciadores imobilizados à fase sólida partilham identidade de seqüência aos iniciadores de fase aquosa e têm uma vantagem cinética sobre os iniciadores aquosos devido à substituição de nucleotídeo para conferir propriedades de anelamento diferencial.
16. Método, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que os análogos de nucleotídeos que conferem propriedades de anelamento alteradas são usados como substituições de nucleotídeo.
17. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ou 16, caracterizado pelo fato de que a reação de amplificação é uma reação em cadeia de polimerase.
18. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que quando o iniciador imobilizado é ligado por uma seqüência de ligação ao suporte sólido então a seqüência de não ligação tem diferentes propriedades de anelamento em relação aos iniciadores aquosos.
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