ES2665690T3

ES2665690T3 - Generación de moléculas de ácido nucleico

Info

Publication number: ES2665690T3
Application number: ES08700416.4T
Authority: ES
Inventors: Daniel Jonathan Park; Karl Frederick Poetter; Zaheer Khan
Original assignee: Genera Biosystems Ltd
Current assignee: Genera Biosystems Ltd
Priority date: 2007-02-02
Filing date: 2008-02-01
Publication date: 2018-04-26
Anticipated expiration: 2028-02-01
Also published as: US9382565B2; AU2008210279B2; MX2009008081A; US20100209971A1; WO2008092213A1; CN101680012A; JP2010517514A; BRPI0807826A2; AU2008210279A1; NZ589179A; CA2677111A1; CA2677111C; NZ578332A; CN107090480A; EP2118297B1; EP2118297A4; EP2118297A1; JP5735213B2

Abstract

Un método para generar un polinucleótido monocatenario en un recipiente de reacción, comprendiendo dicho método someter un polinucleótido bicatenario diana o su derivado monocatenario a amplificación exponencial mediante la puesta en contacto de una matriz sólida en forma de microesferas o perlas que tienen un cebador inmovilizado en dicha matriz sólida a través de un medio ligador y dos cebadores en fase acuosa con una muestra que comprende al menos una molécula de ácido nucleico, en el que el cebador inmovilizado es un cebador anidado entre dichos dos cebadores en fase acuosa y tiene una mayor temperatura de fusión respecto a los cebadores acuosos debido a la extensión de desapareamiento entre el cebador inmovilizado y el polinucleótido complementario diana y/o a la presencia de secuencias ajenas o del sitio de complementariedad en el polinucleótido diana; en el que cada uno de dichos cebadores ceba reacciones de extensión durante dicha amplificación en condiciones de reacción que efectúan la elongación de dicho cebador inmovilizado, facilitando la generación de polinucleótido bicatenario inmovilizado en la matriz sólida; y someter entonces el polinucleótido inmovilizado a condiciones desnaturalizantes para generar polinucleótidos monocatenarios inmovilizados y un polinucleótido monocatenario en fase líquida.

Description

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Tabla 1

Abreviaturas

Abreviatura: Definición

ADNbc: ADN bicatenario

FACS: Clasificación celular activada por fluorescencia

FISH: Hibridación por fluorescencia in situ

PCR: Reacción en cadena de la polimerasa

SDA: Amplificación por desplazamiento de hebra

ADNmc: ADN monocatenario

Se muestra en la Tabla 2 un compendio de los identificadores de secuencia usados en la presente memoria.

Tabla 2

Identificadores de secuencia

Identificador de secuencia: Secuencia

SEQ ID NO: 1: Oligonucleótido (Transprobe)

SEQ ID NO: 2: Cebador directo de generación de molde de Cto3

SEQ ID NO: 3: Cebador inverso de generación de molde de Cto3

SEQ ID NO: 4: Cebador directo de generación de molde de Ngo

SEQ ID NO: 5: Cebador inverso de generación de molde de Ngo

SEQ ID NO: 6: Cebador directo de generación de molde de Ngps

SEQ ID NO: 7: Cebador inverso de generación de molde de Ngps

SEQ ID NO: 8: Cebador directo “acuoso” de Cto3

SEQ ID NO: 9: Cebador inverso “acuoso” de Cto3

SEQ ID NO: 10: Cebador de soporte sólido de SP-PCR de Cto3

SEQ ID NO: 11: Cebador de soporte sólido de ESP-PCR de Cto3

SEQ ID NO: 12: Cebador directo “acuoso” de Ngo

SEQ ID NO: 13: Cebador inverso “acuoso” de Ngo

SEQ ID NO: 14: Cebador de soporte sólido de SP-PCR de Ngo

SEQ ID NO: 15: Cebador de soporte sólido de ESP-PCR de Ngo

SEQ ID NO: 16: Cebador directo “acuoso” de Ngps

SEQ ID NO: 17: Cebador inverso “acuoso” de Ngps

SEQ ID NO: 18: Cebador de soporte sólido de SP-PCR de Ngps

SEQ ID NO: 19: Cebador de soporte sólido de ESP-PCR de Ngps

SEQ ID NO: 20: Cebador de opa de Neisseria gonorrhoeae

SEQ ID NO: 21: Cebador inverso de opa de Neisseria gonorrhoeae

SEQ ID NO: 22: Cebador de orf3 de plásmido críptico de Chlamydia trachomatis

SEQ ID NO: 23: Cebador inverso de Chlamydia trachomatis

Breve descripción de las figuras

Algunas figuras contienen representaciones o entidades en color. Las fotografías en color están disponibles en el 6

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titular de la patente tras solicitud o en una Oficina de Patentes apropiada. Puede imponerse una tarifa si se obtienen en una Oficina de Patentes.

Las Figuras 1(i) y (ii) son representaciones esquemáticas de (i) el esquema de PCR en fase sólida potenciada (ESP-PCR) para la carga de amplicones monocatenarios o bicatenarios sobre un soporte sólido con (ii) diseños de cebador de soporte sólido (1 a 4). Se hace referencia al Ejemplo 1 para una descripción detallada. (i): a-representa el cebador de PCR “directo”; b-representa el cebador “inverso”; c-amplificación exponencial usando, p.ej., los cebadores directo e inverso (p.ej. de PCR); d-cebador de soporte sólido [véase (ii)]; e-muchas copias de bc/soporte sólido; f-muchas copias de mc/soporte sólido; g-(opcional) ciclos con condiciones de reasociación “por etapas” no permisivas de los cebadores a y b; h-(opcional) “relleno”; (ii): a-representa el cebador de PCR “directo”; brepresenta el cebador “inverso”; c-diseño de cebador de soporte sólido de PCR en fase sólida de la técnica anterior; d-p.ej. extensión 3’, mayor Tm; e-diseños de cebador de soporte sólido de PCR en fase sólida potenciada; f-p.ej., anidado o parcialmente anidado; g-p.ej., anidado o parcialmente anidado, mayor Tm.

La Figura 2 es una representación esquemática de un mecanismo para cebado de soporte sólido aumentado usando (B) ESP-PCR frente a (A) SP-PCR estándar. Se incluyen los cebadores “acuosos” directo (flecha) e inverso en cada mezcla de reacción a concentraciones no limitantes, junto con cebador de soporte sólido (esfera ligada a una flecha). Los cebadores “acuosos” toman parte en la PCR convencional generando amplicones (líneas discontinuas). Los cebadores de soporte sólido ceban también reacciones de extensión durante estos ciclos, dando como resultado la carga de producto sobre la superficie de soporte sólido. Sin embargo, en SP-PCR estándar, la implicación del cebador de soporte sólido está inhibida por la competición con un cebador “acuoso” de secuencia coincidente (A), dando como resultado una carga de amplicón relativamente baja. La línea vertical en (A) indica extensión inhibida. La ESP-PCR (B) evita tal inhibición al emplear un cebador de soporte sólido anidado de Tm relativamente alta. Las líneas discontinuas representan eventos de extensión.

(A) El cebado de soporte sólido en la secuencia de cebador de soporte sólido de SP-PCR estándar coincide con su contrapartida de cebador “acuoso”; (a)-el cebado del cebador de soporte sólido es superado por su contrapartida de cebador “acuoso”; (b)-amplicón monocatenario; (B) el cebado de soporte sólido en cebadores de ESP-PCR está anidado para reducir la competencia entre él y el cebador “acuoso” por unión a amplicón, aprovechando un sitio de unión diferente y el retardo entre la unión del cebador “acuoso” y la unión de polimerasa. Existe también una mayor Tm para elevar su concentración eficaz (a)-el cebado de cebador de soporte sólido es competitivo; (b)-amplicón monocatenario.

Descripción detallada

La presente invención está dirigida a una reacción de amplificación modificada que facilita la generación de polinucleótidos monocatenarios (mc) y, en particular, ADNmc inmovilizado en un soporte sólido o en forma inmovilizada o acuosa generada a partir de polinucleótidos (bc) inmovilizados, como se define en las reivindicaciones adjuntas.

La presente invención declara en parte el uso de cebadores en una reacción de amplificación que tienen características de reasociación similares en un conjunto de condiciones de reasociación (en las que los cebadores se consideran “equilibrados” y las condiciones de reasociación se consideran “mutuamente permisivas”) y características de reasociación diferentes o diferenciales o distintas en otro conjunto de condiciones de reasociación (en las que los cebadores se consideran “no equilibrados” y las condiciones de reasociación se consideran “diferencialmente permisivas”). Las diferentes condiciones de reasociación surgen del diseño de cebador, que posibilita diferentes ventajas cinéticas para el cebado de soporte sólido frente al cebado de oligonucleótido en fase acuosa.

Por ello, un aspecto de la presente invención contempla un método para generar un polinucleótido monocatenario en un recipiente de reacción, comprendiendo dicho método someter un polinucleótido bicatenario diana o su derivado monocatenario a amplificación exponencial mediante la puesta en contacto de una matriz sólida en forma de microesferas o perlas que tienen un cebador inmovilizado en dicha matriz sólida a través de un medio ligador y dos cebadores en fase acuosa con una muestra que comprende al menos una molécula de ácido nucleico, en el que el cebador inmovilizado es un cebador anidado entre dichos dos cebadores en fase acuosa y tiene una mayor temperatura de fusión respecto a los cebadores acuosos debido a la extensión del desapareamiento entre el cebador inmovilizado y el polinucleótido complementario diana y/o a la presencia de secuencias ajenas o del sitio de complementariedad en el polinucleótido diana;

en el que cada uno de dichos cebadores ceba reacciones de extensión durante dicha amplificación en condiciones de reacción que efectúan la elongación de dicho cebador inmovilizado para facilitar la generación de polinucleótidos bicatenarios inmovilizados en la matriz sólida; y someter entonces el polinucleótido inmovilizado a condiciones desnaturalizantes para generar polinucleótidos monocatenarios inmovilizados y un polinucleótido monocatenario en fase líquida.

Un aspecto adicional de la invención incluye un método para la amplificación en fase sólida de moléculas de ácido nucleico que comprende poner en contacto una matriz sólida en forma de microesferas o perlas que tienen un

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cebador inmovilizado en dicha matriz sólida a través de medios ligadores y dos cebadores en fase acuosa con una muestra que comprende al menos una molécula de ácido nucleico, en el que el cebador inmovilizado es un cebador anidado entre dichos dos cebadores en fase acuosa y tiene una mayor temperatura de fusión respecto a los cebadores acuosos debido a la extensión del desapareamiento entre el cebador inmovilizado y el polinucleótido complementario diana y/o a la presencia de secuencias ajenas o del sitio de complementariedad en el polinucleótido diana;

en el que cada uno de dichos cebadores ceba reacciones de extensión durante dicha amplificación en condiciones de reacción que efectúan la elongación de dicho cebador inmovilizado.

Se divulga también un método para amplificación en fase sólida como se describe anteriormente en la presente memoria.

La referencia a “anidado” en el contexto de cebadores incluye cebadores total y parcialmente anidados.

La referencia a “compartir identidad de secuencia” incluye una identidad sustancial así como al menos un 80 % de identidad de secuencia, tal como al menos un 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100 % de identidad.

Como se indica anteriormente, los cebadores directo e inverso pueden describirse como “equilibrados” o “no equilibrados” con respecto a las propiedades de reasociación, y las condiciones de reasociación se consideran como mutuamente permisivas o diferencialmente permisivas con respecto al efecto sobre los cebadores. De forma similar, el diseño de cebador puede facilitar cebadores diferencialmente permisivos.

Por ello, cebadores equilibrados o no equilibrados significa que, en un conjunto dado de condiciones o conjunto de cebadores, concretamente condiciones de reasociación mutuamente permisivas o cebadores mutuamente permisivos, ambos cebadores se unen o hibridan de otro modo formando un dúplex con eficacia similar.

Mientras tanto, en condiciones de reasociación diferencialmente permisivas (concretamente, en un conjunto alternativo de condiciones), los cebadores no están equilibrados puesto que las condiciones pueden favorecer la formación de dúplex y el cebado.

Por consiguiente, se describe un método para generar un polinucleótido monocatenario inmovilizado en un soporte sólido en un recipiente de reacción, comprendiendo el método realizar una reacción de amplificación de un polinucleótido diana inmovilizado en un soporte sólido en el recipiente usando un par de cebadores directo e inverso equilibrados en condiciones mutuamente permisivas y alterar entonces las condiciones de reasociación a condiciones diferencialmente permisivas, con lo que los cebadores se vuelven no equilibrados, y continuar la reacción para generar el producto polinucleotídico monocatenario e inactivar entonces la actividad polimerasa para prevenir sustancialmente la formación de polinucleótidos bicatenarios.

En el método divulgado anteriormente, puede generarse un polinucleótido bc sobre el soporte sólido, que se somete entonces a condiciones desnaturalizantes (p.ej., por medios químicos o térmicos), generando un polinucleótido mc o polinucleótido en fase acuosa.

Se divulga un método para marcar una matriz sólida con un polinucleótido monocatenario como se describe anteriormente en la presente memoria.

La desnaturalización puede ser mediante cualquier medio, incluyendo medios químicos o medios térmicos.

Se describe otro método para generar un polinucleótido monocatenario en un recipiente de reacción, comprendiendo dicho método someter un polinucleótido bicatenario diana o su derivado monocatenario a amplificación exponencial mediante la puesta en contacto de una matriz sólida que tiene un cebador unido a dicha matriz sólida a través de un medio ligador con una muestra que comprende al menos una molécula de ácido nucleico, en el que el cebador inmovilizado se selecciona de la lista consistente en:

(i): un cebador que comparte identidad de secuencia con un cebador en fase acuosa pero que tiene una temperatura de fusión diferente respecto al cebador acuoso; y

(ii): un cebador anidado entre dos cebadores en fase acuosa;

en condiciones de reacción que efectúan la elongación de dicho cebador inmovilizado para facilitar la generación de un polinucleótido bicatenario inmovilizado en la matriz sólida; y someter entonces el polinucleótido inmovilizado a condiciones desnaturalizantes, generando polinucleótidos monocatenarios inmovilizados y un polinucleótido monocatenario en fase líquida.

Puede ocurrir entonces también una etapa adicional de someter la mezcla de reacción a un medio de separación de fases.

En otro procedimiento para generar un polinucleótido monocatenario en un recipiente de reacción que se describe,

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el método comprende poner en contacto una matriz sólida que tiene un cebador unido a dicha matriz sólida a través de un medio ligador con una muestra que comprende al menos una molécula de ácido nucleico, en el que el cebador inmovilizado se selecciona de la lista consistente en:

(i): un cebador que comparte identidad de secuencia con una cebador de fase acuosa, pero que tiene una temperatura de fusión diferente respecto al cebador acuoso; y

(ii): un cebador anidado entre dos cebadores en fase acuosa;

en condiciones de reacción que efectúan la elongación del cebador inmovilizado.

Preferiblemente, los polinucleótidos son ADN, por ello la presente invención está particularmente dirigida a la generación de ADNmc. Sin embargo, aunque el material de partida sea preferiblemente ADNbc, la presente invención puede usar también ARNm que se convierte en ADNbc o mc o usar ADNmc. El ADNbc se genera sobre el soporte sólido y se somete entonces a condiciones desnaturalizantes para generar ADNmc inmovilizado o en fase acuosa.

Se divulga en la presente memoria otro método de generar ADNmc en un recipiente de reacción, comprendiendo dicho método realizar una reacción de amplificación de un molde de ADNmc diana inmovilizado a partir de una diana de ADNbc o ARNm en el recipiente de reacción, usando un par de cebadores directo e inverso que tienen cebadores de reasociación similares (equilibrados) en el primer conjunto de condiciones de reasociación (condiciones mutuamente permisivas), pero propiedades de reasociación diferenciales en un segundo conjunto de condiciones de reasociación (condiciones diferencialmente permisivas), en el que se permite proseguir la amplificación en las condiciones de reasociación mutuamente permisivas; alterar las condiciones a condiciones diferencialmente permisivas para desequilibrar los cebadores, facilitando así la amplificación lineal sustancialmente en presencia de solo un único cebador generando producto de ADNmc; e inactivar cualquier actividad polimerasa para reducir o prevenir sustancialmente la formación de ADNbc.

Aún otro método de generar ADNmc en un recipiente de reacción descrito en la presente memoria comprende poner en contacto una matriz sólida que tiene un cebador unido a dicha matriz sólida a través de un medio ligador con una muestra en un recipiente de reacción que comprende al menos una molécula de ácido nucleico, en el que el cebador inmovilizado se selecciona de la lista consistente en:

(ii): un cebador anidado entre dos cebadores en fase acuosa;

Las condiciones de reasociación o cebadores permisivos diferenciales frente a mutuamente permisivos se refieren, por ejemplo, a la extensión del desapareamiento, la presencia de secuencias nucleotídicas ajenas “de cabeza” o “de cola” en los cebadores, al sitio de hibridación en el molde diana para formar dúplex o a la presencia de otras características para posibilitar un aumento de etapas o una reducción de etapas para generar condiciones de cebador no equilibrado.

El método de la presente invención puede considerarse una modificación de una reacción de amplificación para generar un producto particular. La modificación es el uso de cebadores que están diferencial o mutuamente equilibrados dependiendo del nivel de permisividad de las condiciones de reasociación.

Por ello, se describe en la presente memoria una reacción de amplificación modificada en que se emplean cebadores directos e inversos para amplificar exponencialmente un polinucleótido monocatenario de molde tal como ADNmc generado a partir de un polinucleótido bicatenario tal como ADNbc o generado a partir de ARNm directamente o a través de ADNc, en la que la modificación comprende seleccionar cebadores que tienen características de reasociación similares en un primer conjunto de condiciones de reasociación y características de reasociación diferenciales en un segundo conjunto de condiciones de reasociación, de tal modo que alterar las condiciones de reasociación al segundo conjunto facilita la amplificación en presencia de un solo cebador, dando como resultado la producción de un polinucleótido sustancialmente monocatenario tal como ADNmc.

Como alternativa, o además, se usa el diseño de cebador para anidar el cebador inmovilizado entre dos cebadores en fase acuosa.

Se describe un método para generar un polinucleótido monocatenario en un recipiente de reacción en el que dicho método comprende someter un polinucleótido bicatenario diana o su derivado monocatenario a amplificación exponencial mediante la puesta en contacto de una matriz sólida que tiene un cebador unido a dicha matriz sólida a través de un medio ligador con una muestra que comprende al menos una molécula de ácido nucleico, en el que el cebador inmovilizado se selecciona de la lista consistente en:

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(ii) un cebador anidado entre dos cebadores en fase acuosa;

en condiciones de reacción que efectúan la elongación de dicho cebador inmovilizado.

En la descripción de la presente invención, se definen o aclaran los siguientes términos y contenidos.

Se entiende, a menos que se indique otra cosa, la invención en cuestión no está limitada a reactivos, etapas de proceso o aplicaciones o similares específicos, ya que estos pueden variar. Ha de entenderse también que la terminología usada en la presente memoria es con fines de describir realizaciones particulares solo y no pretende ser limitante.

Como se usa en la memoria descriptiva en cuestión, las formas singulares “un”, “una” y “el/la” incluyen aspectos plurales a menos que el contexto dicte claramente otra cosa. Por tanto, por ejemplo, la referencia a “una diana” incluye una única diana, así como dos o más dianas; la referencia a “una amplificación” incluye una única amplificación, así como múltiples etapas de amplificación; la referencia al “amplicón” incluye un único amplicón o múltiples o complejos, y demás.

Los términos y símbolos de química de ácidos nucleicos, bioquímica, genética y biología molecular usados en la presente memoria siguen aquellos de los tratados y textos estándares en el campo, p.ej. Kornberg y Baker, DNA Replication, Segunda Edición (W.H. Freeman, Nueva York, 1992); Lehninger, Biochemistry, Segunda Edición (Worth Publishers, Nueva York, 1975); Strachan y Read, Human Molecular Genetics, Segunda Edición (Wiley-Liss, Nueva York, 1999); Eckstein (Ed), Oligonucleotides and Analogs: A Practical Approach (Oxford University Press, Nueva York, 1991); Gait (Ed), Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach (IRL Press, Oxford, 1984) y similares.

“Amplicón” significa el producto de una reacción de amplificación de polinucleótido. Es decir, es una población de polinucleótidos, habitual pero no necesariamente bicatenarios, que se replican a partir de una o más secuencias de partida. La una o más secuencias de partida pueden ser una o más copias de la misma secuencia, o pueden ser una mezcla de diferentes secuencias. Los amplicones pueden producirse mediante una variedad de reacciones de amplificación cuyos productos son múltiples duplicados de uno o más ácidos nucleicos diana. Generalmente, las reacciones de amplificación productoras de amplicones son “impulsadas por molde” en que el apareamiento de bases de los reactantes, nucleótidos o bien oligonucleótidos, tienen complementos en un polinucleótido molde que son requeridos para la creación de productos de reacción. En un aspecto, las reacciones impulsadas por molde son extensiones de cebador con una ácido nucleico polimerasa o ligamientos oligonucleotídicos con una ácido nucleico ligasa. Tales reacciones incluyen, pero sin limitación, PCR, reacciones de polimerasa lineal, NASBA, amplificaciones por círculo rodante y similares, divulgadas en las siguientes referencias: Mullis et al, patentes de EE.UU. nº 4.683.195, 4.965.188 4.683.202, 4.800.159 (PCR); Gelfand et al, patente de EE.UU. nº 5.210.015 (PCR instantánea con sondas "taqman"); Wittwer et al, patente de EE.UU. nº 6.174.670; Kacian et al, patente de EE.UU. nº 5.399.491 ("NASBA"); Lizardi, patente de EE.UU. nº 5.854.033; Aono et al, publicación de patente japonesa nº JP 4-262799 (amplificación por círculo rodante) y similares.

Una reacción de amplificación puede ser una amplificación “instantánea” en que la química de detección permite medir un producto de reacción a medida que avanza la reacción de amplificación. La amplificación puede ser una amplificación asimétrica o simétrica.

Como se usa en la presente memoria, el término “amplificar” significa practicar una reacción de amplificación. Una “mezcla de reacción” o “recipiente de reacción” significa una solución o compartimento que contiene todos los reactantes necesarios para practicar una reacción que pueden incluir, pero sin limitación, agentes de tamponación para mantener el pH a un nivel seleccionado durante una reacción, sales, cofactores, secuestrantes y similares.

"Complementario o sustancialmente complementario” hace referencia a la hibridación o apareamiento de bases o a la formación de un dúplex entre nucleótidos o ácidos nucleicos tales como, por ejemplo, entre las dos hebras de una molécula de ADNbc o entre un cebador oligonucleotídico y un sitio de unión a cebador en un ácido nucleico monocatenario. Los nucleótidos complementarios son, generalmente, A y T (o A y U), o C y G. Se dice que dos moléculas de ARN o ADN monocatenarias son sustancialmente complementarias cuando los nucleótidos de una hebra, alineados y comparados óptimamente y con las inserciones o deleciones nucleotídicas apropiadas, se aparean con al menos un 80 % de los nucleótidos de la otra hebra, habitualmente al menos aproximadamente 90 a 95 %, y más preferiblemente de aproximadamente 98 a 100 %. Como alternativa, existe una complementariedad sustancial cuando, por ejemplo, una hebra de ADN hibrida en condiciones de hibridación selectivas con su complemento. Típicamente, aparece hibridación selectiva cuando hay al menos aproximadamente un 65 % de complementariedad en un tramo de al menos 14 a 25 nucleótidos, preferiblemente al menos aproximadamente un 75 %, más preferiblemente al menos aproximadamente un 90 % de complementariedad. Véase Kanehisa Nucleic Acids Res. 12: 203, 1984.

“Dúplex” significa que al menos dos oligonucleótidos y/o polinucleótidos que son total o parcialmente complementarios experimentan apareamiento de bases de tipo Watson-Crick entre todos o la mayoría de sus nucleótidos de modo que se forma un complejo estable. Los términos “reasociación” e “hibridación” se usan intercambiablemente para significar la formación de un dúplex estable. "Perfectamente coincidente” con referencia a un dúplex significa que las hebras de polinucleótido u oligonucleótido que constituyen el dúplex forman una

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estructura bicatenaria entre sí de tal modo que cada nucleótido en cada hebra experimenta apareamiento de bases de Watson-Crick con un nucleótido en la otra hebra.

“Locus genético” o “locus”, con referencia a un genoma o polinucleótido diana, significa una subregión o segmento contiguo del genoma o polinucleótido diana. Como se usa en la presente memoria, locus genético, o locus, puede hacer referencia a la posición de un gen o porción de un gen en un genoma, o puede hacer referencia a cualquier porción contigua de secuencia genómica esté o no dentro de, o asociada con, un gen. Preferiblemente, un locus genético hace referencia a cualquier porción de secuencia genómica desde unas pocas decenas de nucleótidos, p.ej. 10-30 o 10-100, de longitud a unos pocos cientos de nucleótidos, p.ej. 100-1000 o 100-500 de longitud, a unos pocos miles de nucleótidos de longitud, p.ej. 1000-10.000 o 1000-3000 de longitud. En algunos contextos, los loci genéticos pueden hacer referencia a la localización de un nucleótido dentro de un genoma.

“Kit” hace referencia a cualquier sistema de suministro para suministrar materiales o reactivos para llevar a cabo un método de la presente invención. En el contexto de los ensayos de reacción, tales sistemas de suministro incluyen sistemas que permiten el almacenamiento, transporte o suministro de reactivos de reacción (p.ej., sondas, enzimas, etc. en los envases apropiados) y/o materiales de soporte (p.ej., tampones, instrucciones escritas para practicar el ensayo, etc.) de una localización a otra. Por ejemplo, los kits incluyen uno o más recintos (p.ej. cajas) que contienen los reactivos de reacción y/o materiales de soporte relevantes. Tales contenidos pueden suministrarse al receptor pretendido conjunta o separadamente. Por ejemplo, un primer envase puede contener una enzima para uso en un ensayo, mientras que un segundo envase contiene sondas. Los kits pueden contener también compartimentos adaptados para contener los reactivos. En un ejemplo, un compartimento comprende una matriz sólida que tiene oligonucleótidos o cebadores o polinucleótidos inmovilizados sobre la misma que participan en la reacción de amplificación. Es un ejemplo de matriz sólida una micromatriz. Por lo tanto, un kit puede ser parte de un sistema de amplificación global que tiene un componente de reactivo, un componente de ácido nucleico, un componente de soporte físico y un componente de instrucciones. La referencia a una “matriz sólida” incluye cualquier forma de confinamiento estructural para la práctica de una reacción de amplificación. Por ello, la PCR en emulsión, por ejemplo, se considera como una forma de matriz sólida donde se realiza la PCR en las diversas fases de la emulsión.

“Micromatriz” hace referencia a un soporte en fase sólida que tiene una superficie plana que porta una matriz de ácidos nucleicos, comprendiendo cada miembro de la matriz copias idénticas de un oligonucleótido o polinucleótido inmovilizadas en una región o sitio definido espacialmente, que no se superponen con aquellos de otros miembros de la matriz; es decir, las regiones o sitios son espacialmente discretos. Los sitios de hibridación definidos espacialmente pueden ser adicionalmente “direccionables” en que su localización y la identidad de su oligonucleótido inmovilizado son conocidos o predeterminados, por ejemplo antes de su uso. Típicamente, los oligonucleótidos o polinucleótidos son monocatenarios y están enlazados covalentemente con el soporte en fase sólida, habitualmente por un extremo 5’ o extremo 3’. La densidad de regiones no superpuestas que contienen ácidos nucleicos en una micromatriz es típicamente mayor de 100 por cm2, y más preferiblemente mayor de 1000 por cm2. La tecnología de micromatrices se divulga en las siguientes referencias: Schena (Ed), Microarrays: A Practical Approach (IRL Press, Oxford, 2000); Southern, Current Opin. Chem. Biol., 2: 404-410, 1998.

Una “micromatriz aleatoria” hace referencia a una micromatriz cuyas regiones espacialmente discretas de oligonucleótidos o polinucleótidos no están espacialmente direccionadas. Es decir, la identidad de los oligonucleótidos o polinucleótidos enlazados no es observable, al menos inicialmente, por su localización. En un aspecto, las micromatrices aleatorias son matrices planas de microperlas en las que cada microperla tiene enlazada una única clase de complemento de marcaje de hibridación, tal como de un conjunto de oligonucleótidos de hibridación cruzada mínima. Igualmente, después de la formación, pueden identificarse las microperlas o los oligonucleótidos de las mismas en una matriz aleatoria de una variedad de modos, incluyendo por marcajes ópticos, p.ej. relaciones de tinte fluorescente o puntos cuánticos, forma, análisis de secuencia o similares.

“Nucleósido”, como se usa en la presente memoria, incluye los nucleósidos naturales, incluyendo la formas 2'-desoxi y T-hidroxilo, p.ej. como se describe en Kornberg y Baker, DNA Replication, 2ª Ed. (Freeman, San Francisco, 1992).

“Reacción en cadena de la polimerasa” o “PCR” significa una reacción para la amplificación in vitro de secuencias de ADN específicas mediante la extensión de cebador simultánea de hebras complementarias de ADN. En otras palabras, la PCR es una reacción para elaborar múltiples copias o duplicados de un ácido nucleico diana flanqueado por sitios de unión a cebador, comprendiendo dicha reacción una o más repeticiones de las siguientes etapas: (i) desnaturalizar el ácido nucleico diana; (ii) reasociar cebadores con los sitios de unión a cebador y (iii) extender los cebadores por una ácido nucleico polimerasa. Habitualmente, la reacción se cicla a diferentes temperaturas en presencia de trifosfatos de nucleósido. Habitualmente, la reacción se cicla a diferentes temperaturas optimizadas para cada etapa en un instrumento ciclador térmico. Las temperaturas, duraciones de cada etapa y tasas de cambio entre etapas particulares dependen de muchos factores bien conocidos por los especialistas en la materia, p.ej. ejemplificados por las referencias: McPherson et al. (Eds), PCR: A Practical Approach y PCR2: A Practical Approach (IRL Press, Oxford, 1991 y 1995, respectivamente). Por ejemplo, en una PCR convencional que usa ADN polimerasa Taq, puede desnaturalizarse un ácido nucleico diana bicatenario a una temperatura >90 ºC, reasociándose los cebadores a una temperatura en el intervalo de 35-90 ºC. El término “PCR” engloba las formas derivadas de la reacción incluyendo, pero sin limitación, RT-PCR, PCR instantánea, PCR anidada, PCR cuantitativa, PCR

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microvaloración de 96 pocillos. Se generaron ficheros *.fcs por FACSArray con los mismos ajustes de instrumentación que se describen anteriormente. Se determinaron las cifras de fluorescencia roja mediana usando FCS Express v.3.

Electroforesis en gel

Después del muestreo de citometría de flujo, se analizaron 8 μl de productos de PCR residual usando geles de 3 % de agarosa/TAE frente a 1,5 μg de una escala de 100 pb de New England Biolabs (Genesearch Arundel, Australia).

Oligonucleótidos de generación de molde.

Cebador directo de generación de molde de Cto3

Cebador inverso de generación de molde de Cto3: imagen10

Cebador directo de generación de molde de Ngo

Cebador inverso de generación de molde de Ngo

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Oligonucleótidos de ESP-PCR y SP-PCR. 10

Cebador directo “acuoso” de Cto3: imagen13

Cebador inverso “acuoso” de Cto3

Cebador de soporte sólido de SP-PCR de Cto3

Cebador de soporte sólido de ESP-PCR de Cto3

Cebador directo “acuoso” de Ngo: imagen14

Cebador inverso “acuoso” de Ngo: imagen15

Cebador de soporte sólido de SP-PCR de Ngo

Cebador de soporte sólido de ESP-PCR de Ngo

Cebador directo “acuoso” de Ngps: imagen16

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Cebador de soporte sólido de SP-PCR de Ngps

Cebador de soporte sólido de ESP-PCR de Ngps

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Ensayo multiplexado para la detección de Neisseria gonorrhoeae y Chlamydia trachomatis por ESP-PCR

Se conjugaron los cebadores de soporte sólido de ESP-PCR de Ngo y ESP-PCR de Cto3 enumerados anteriormente con microesferas de sílice (Bangs Laboratories) de 5,6 μm de diámetro y 6,81 μm de diámetro, respectivamente, se lavaron y se combinaron a 1 mg/ml por población de perlas. Se incluyó 1 microlitro de suspensión de perlas combinadas en reacciones de ESP-PCR que incluyen los cebadores de imagen18opa de Neisseria

gonorrhoeae: imagen19, (SEQ ID NO: 20) y el cebador 5’ marcado con

Alexafluor647 5'-(SEQ ID imagen20NO:21) y los cebadores de orf3 de plásmido críptico de Chlamydia trachomatis: 5'

imagen21(SEQ ID 122) y 5’ marcado con Alexafluor647

(SEQ ID 123). Se usaron ADN genómico de la cepa ATCC 43069 de Neisseria gonorrhoea o plásmido portador de la región de amplicón que cubre orf3 de plásmido críptico de Chlamydia trachomatis enumerado anteriormente (véase Generación de molde), con la inclusión de 5 ng de ADN genómico humano de Jurkat como molde de PCR frente a ADN genómico solo humano o controles de agua. Se practicaron las reacciones en un volumen total de 20 μl usando dos unidades de PlatinumTaq [Trademark] (Invitrogen) usando los siguientes parámetros de ciclación: 94 ºC 2 minutos, seguido de 50 ciclos de [90 ºC 30 segundos, 55 ºC 1 minuto, 72 ºC 1 minuto], seguido de 72 ºC 5 minutos. Se centrifugaron/lavaron microesferas de sílice dos veces con tampón, antes del análisis por FACSArray usando los ajustes de instrumentación enumerados anteriormente.

Después de la conjugación, se lavaron concienzudamente las microesferas antes de suspensión en tampón a 1 mg/ml. Se valoraron los niveles de conjugación de oligonucleótidos con microesferas hibridando “Transprobe” marcada con Alexafluor647(Molecular Probes) con secuencia ligadora de cebador de soporte, seguido de análisis de citometría de flujo. Se valoraron las microesferas por triplicado en paralelo en la misma tanda de instrumentación usando los parámetros de voltaje siguientes: FCS 550, SSC 400, Far Red 100, Yellow 650, NIR 200, Red 700, umbral de FCS 20000. Se analizaron los ficheros *.fcs usando FCS Express v.3 para determinar la fluorescencia roja mediana. Se aplicó la prueba de t de Student para demostrar una igual conjugación de cebador de soporte sólido/microesferas entre pares de conjugación de ESP-PCR y SP-PCR (opa de Ng, P= 0,919; pilS de Ng, P= 0,759; orf de CtCP, P= 0,829). Como tal, cualquier aumento observado en la carga de amplicón después de la aplicación de ESP-PCR frente a SP-PCR sería debido a un cebador de soporte sólido mejorado en lugar de a niveles de conjugación de cebador de soporte sólido diferenciales.

Se practicaron experimentos comparativos entre ESP-PCR y SP-PCR en volúmenes de reacción de 20 μl usando 1 unidad de HotStarTaq [Registrado] (Qiagen). Se suplementó el tampón de reacción HotStarTaq (Registrado) con Mg2+ y dNTP (New England Biolabs), procurando concentraciones de reacción de 2 mM y 200 μM, respectivamente. Se incluyeron en las reacciones 1 μl de cebador directo “acuoso” 5 μM, 1 μI de cebador inverso “acuoso” 5 μM (marcado con Alexafluor647 con una relación de 2:1 de oligonucleótido total-oligonucleótido marcado con flúor) y 1 μl de suspensión de microesferas conjugadas con cebador de soporte sólido 1 mg/ml. Se incluyeron las microesferas conjugadas con cebador de soporte sólido de ESP-PCR o SP-PCR en reacciones ESP-PCR o SP-PCR, respectivamente. Se practicaron ESP-PCR y SP-PCR por triplicado en paralelo usando las mismas mezclas maestras. En cada caso, se agruparon cebadores y microesferas según diana y molde (ADNbc lineal que incluye regiones de unión a cebador). Las reacciones incluían 40000 copias de orf3 de plásmido críptico de Chlamydia trachomatis, 40000 copias de moldes de opa de Neisseria gonorrhoea o 400000 copias de pilS de Neisseria gonorrhoea, respectivamente, o controles sin molde (para demostrar los niveles de fluorescencia de fondo) y empleaban el siguiente perfil térmico: 94 ºC 15 min, seguido de 30 ciclos de [90 ºC 30 s, 44 ºC 1 min, 72 ºC 1 min], seguido de 5 ciclos de [90 ºC, 44 ºC 2 min, 72 ºC 2 min]. Después de la PCR en fase sólida, se transfirieron los 5 μl inferiores a 120 μl de tampón en una placa de microvaloración. Se generaron los ficheros *.fcs por FACSArray con los mismos ajustes de instrumentación que se describen anteriormente. Se determinaron las cifras de fluorescencia roja mediana usando FCS Express v.3.

La ESP-PCR daba como resultado una carga de amplicón en soporte sólido notablemente aumentada frente a SP-PCR en las tres dianas valoradas (Tabla 3), con una fuerte significación estadística: opa de Ng (9,89 veces, P= 0,00000661), pilS de Ng (2,14 veces, P= 0,001095) y orf3 de CtCP (1,41 veces, P= 0,000935). Los valores de P Se refieren a la hipótesis nula de que no hay diferencia en la carga de amplicón entre ESP-PCR y SP-PCR. Los aumentos en veces hacen referencia a la variación de UFR de ESP-PCR/UFR de SP-PCR. La variación en el aumento en veces entre dianas no era inesperada a causa de las variaciones inherentes en las eficacias de hibridación entre oligonucleótidos y el hecho de que están implicados eventos de hibridación competitiva complejos. A pesar de esta variación, la ESP-PCR era universalmente beneficiosa entre las dianas estudiadas. Los amplicones “acuosos” no unidos a microesferas de los mismos recipientes de reacción usados para medidas de citometría de flujo eran de igual rendimiento entre todas las dianas después de ESP-PCR frente a SP-PCR como se valora por electroforesis en gel de agarosa. Los rendimientos de producto “acuoso” eran también idénticos con o sin microesferas en la mezcla de reacción, indicando que las microesferas de sílice conjugadas con cebadores de soporte sólido no comprometían la eficacia de amplificación. Después de la ESP-PCR, se lavó el soporte sólido concienzudamente mediante etapas de centrifugación e intercambio de tampón múltiples y se usó como molde de reacciones de “reamplificación” de ciclo limitado que incluyen cebadores “acuosos” usados anteriormente y una

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versión “acuosa” del cebador de soporte sólido. Se observaron productos de banda única de tamaños correspondientes a aquellos esperados de los productos derivados de cebador de soporte sólido y cebado de cebador inverso “acuoso” tras electroforesis en gel, indicando que los productos de soporte sólido de ESP-PCR eran específicos. Tomados en conjunto, estos datos sugieren que la ESP-PCR era exitosa para conseguir los objetos duales de no comprometer la amplificación “en fase acuosa” y aumentar la carga de superficie de soporte sólido con amplicón respecto a la SP-PCR estándar de manera específica.

Estos beneficios observados son debidos a mecanismos de carga en que: (i) se aumenta la concentración eficaz de soporte sólido en virtud de su Tm relativamente alta. La PCR lineal después de exponencial (LATE-PCR) mejora la generación de productos monocatenarios por PCR asimétrica (Sánchez et al, Proc. Natl. Acad Sci. USA 101: 19331938,2004). En este enfoque, se empleó una concentración limitada “de unión más estrecha” de cebador para aumentar su “concentración eficaz” en la reacción, basándose en la relación entre la Tm del cebador y la concentración del cebador descrita por la fórmula de “vecino más cercano” (SantaLucia, Proc. Natl. Acad Sci. USA

95: 1460-1465, 1998). En ESP-PCR, se aplica este principio al cebador de soporte sólido. Un cebador de soporte sólido “de unión más estrecha” tiene una “concentración eficaz” aumentada y una cinética de unión y cebado mejorada; (ii) se anida el cebador de soporte sólido con respecto a su contrapartida “acuosa”.

Puesto que el cebador de soporte sólido reconoce un sitio de unión diferente al cebador directo “acuoso”, se retira la competición directa para unión a amplicón. En ESP-PCR, al contrario que SP-PCR, para inhibir el cebado de soporte sólido por el “bloqueo” del sitio de unión a cebador de soporte sólido, es necesario que el cebador directo “acuoso” se una al molde de amplicón y que la polimerasa encuentre y se una posteriormente a este sustrato, y que siga la polimerización en un corto espacio de tiempo. Tanto en SP-PCR estándar como en SP-PCR asimétrica, la simple unión del cebador acuoso con su sitio de unión a cebador es suficiente para inhibir el cebado de soporte sólido. En el método de abrazadera de PCR, la amplificación se bloquea específicamente mediante la inclusión de sondas de ácido peptidonucleico interno (anidado) o ácido nucleico bloqueado (Domínguez y Kolodney, Oncogene 24: 68306834, 2005; Orum et al, Nucleic Acids Res. 21: 5332-5336, 1993). Análogamente al cebador de soporte sólido de ESP-PCR, las sondas de bloqueo del enfoque de abrazadera de PCR se unen al amplicón antes de que hayan tenido la ocasión de ocurrir la unión al cebador y la polimerización.

Aplicando aún los principios de ESP-PCR, usando cebadores “acuosos” y parámetros de termociclado, se detectaron 5 genomas de Neisseria gonorrhoea y 5 equivalentes genómicos de Chlamydia trachomatis por reacción de ESP-PCR multiplexada única mediante FACSArray. Este enfoque usaba cebadores de soporte sólido conjugados con microesferas de sílice de diferentes diámetros para facilitar la discriminación por citometría de flujo. Se hicieron moldes de las reacciones con ADN genómico de Neisseria gonorrhoea y plásmido que contiene la región diana de Chlamydia trachomatis con la inclusión de ADN genómico humano de Jurkat frente a solo ADN genómico humano de Jurkat o agua.

Tabla 3

Carga de amplicón en soporte sólido frente a SP-PCR

Diana: SP-PCR de control sin molde SP-PCR ESP-PCR de control sin molde ESP-PCR

opa de Ng: 37,18 UFR 52,98 UFR (1,12) 44,91 UFR 523,74 UFR (15,24)

pilS de Ng: 40,68 UFR 74,36 UFR (1,78) 39,60 UFR 159,09 UFR (9,92)

orf3 de CtCP: 41,79 UFR 209,84 UFR (5,10) 38,89 UFR 295,39 UFR (8,33)

Carga aumentada de microesferas de sílice con amplicón marcado con fluorescencia roja después de ESP-PCR frente a SP-PCR. UFR hace referencia a unidades de fluorescencia relativa. Los números entre paréntesis representan el error estándar de la media de series por triplicado.

Se compara ESP-PCR con SP-PCR, empleando microesferas de sílice como soporte sólido, entre un intervalo de dianas clínicamente relevantes: opa (opa de Ng) y pilS (pilS de Ng) de Neisseria gonorrhoea y orf3 de plásmido crítpico de Chlamydia trachomatis (orf3 de CtCP) [McLeod et al, Infection and Immunity 67: 3469-3480, 1999; Comanducci et al, J Gen Microbiol 139: 1083-1092, 1993].

Brevemente, se prepararon cebadores de soporte sólido de ESP-PCR y SP-PCR como sigue: se funcionalizaron microesferas de sílice de 6,8 μm de diámetro (Bangs Laboratories) con grupos sulfhidrilo antes de conjugar con oligonucleótidos modificados con un grupo acridita.

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Ejemplo 3

ESP-PCR y SP-PCR “por etapas térmicas” o “sin etapas”

Se establecieron protocolos por etapas térmicas o sin etapas en paralelo para la diana orf3 de plásmido críptico de Chlamydia trachomatis como parte del experimento descrito en el Ejemplo 2. Para la PCR “sin etapas”, se empleó el perfil térmico 44-44: 94 ºC 15 min seguido de [30 ciclos de 90 ºC 30 segundos, 44 ºC 1 minuto, 72 ºC 1 minuto] seguido de [5 ciclos de 90 ºC, 44 ºC 2 minutos, 72 ºC 2 minutos]. Para la PCR “por etapas”, se empleó el perfil térmico 44-60: 94 ºC 15 min seguido de [30 ciclos de 90 ºC 30 segundos, 44 ºC 1 minuto, 72 ºC 1 minuto] seguido de [5 ciclos de 90 ºC, 60 ºC 2 minutos, 72 ºC 2 minutos]. Los resultados se muestran en la Tabla 4.

Después de la PCR en fase sólida, se transfirieron los 5 μl inferiores a 120 μl de tampón en una placa de microvaloración de 96 pocillos. Se generaron los ficheros *.fcs empleando BD FACSArray que usa los mismos ajustes instrumentales que se describen en el Ejemplo 2. Se determinaron las cifras de fluorescencia roja mediana usando FCS Express v.3.

Después del muestreo citométrico de flujo, se procesaron 8 μl de productos de PCR residual en geles de agarosa al 3 % p/v/TAE frente a 1,5 μg de escala de 100 pb de New England Biolabs (Genesearch, Arundel, Australia).

Se estudiaron los beneficios potenciales de una “etapa térmica” óptima como parte del protocolo de ESP-PCR (4460). La mayor temperatura de reasociación durante los ciclos de PCR tardíos mejoraba la carga de superficie de amplicón de orf3 de plásmido críptico de Chlamydia trachomatis (aumento de 1,15 veces). (prueba de t de Student, probabilidad de que los resultados sean iguales: P= 0,0124) frente a un protocolo de ESP-PCR térmico “sin etapas” (44-44).

Se valoraron por citometría de flujo perfiles electroforéticos en gel de amplicones no unidos a microesferas de los mismos recipientes de reacción. En todos los casos, se observaron rendimientos comparables de productos de PCR “en fase acuosa”, sugiriendo que las diferencias en la carga de amplicón en microesferas no estaban influidas por el rendimiento del producto de PCR “en fase acuosa”. No había diferencias observables entre los rendimientos de producto acuoso con o sin microesferas incluidas en la mezcla de reacción.

Tabla 4

ESP-PCR y SP-PCR “por etapas térmicas” o “sin etapas”

Diana (protocolo térmico): SP-PCR de control sin molde SP-PCR ESP-PCR de control sin molde ESP-PCR

orf3 de Ct 44-44 (“sin etapas”): 41,79 UFR 209,84 (5,10) UFR 38,89 UFR 295,39 UFR (8,33)

orf3 de Ct 44-60 (“por etapas”): 42,17 UFR 246,79 (15,08) UFR 39,24 UFR 339,93 UFR (6,06)

Carga aumentada de microesferas de sílice con amplicón marcado con fluorescencia roja después de ESP-PCR “por etapas térmicas” frente a ESP-PCR “sin etapas”. orf3 de Ct hace referencia al orf3 de plásmido críptico de Chlamydia trachomatis. UFR hace referencia a unidades de fluorescencia relativa. Los números entre paréntesis representan el error estándar de la media de series por triplicado.

Los especialistas en la materia apreciarán que la invención descrita en la presente memoria y definida en las reivindicaciones adjuntas es susceptible de variaciones y modificaciones distintas de las descritas específicamente. Ha de entenderse que la invención incluye todas tales variaciones y modificaciones que entran dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas. La invención incluye también todas las etapas, rasgos, composiciones y compuestos a los que se hace referencia o se indican en esta memoria descriptiva, individual o colectivamente, y a todas y cada una de las combinaciones de dos cualesquiera o más de dichas etapas o rasgos que entran dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas.

Bibliografía

Aono et al, pub. de patente japonesa nº JP 4-262799

Comanducci et al, J Gen Microbiol 139: 1083-1092, 1993

Dieffenbach (Ed), PCR Primer: A Laboratory Manual, 2ª edición, Cold Spring Harbor Press, Nueva York, 2003

Claims

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