BRPI0808227A2

BRPI0808227A2 - Anticorpo humanizado anti-fator b

Info

Publication number: BRPI0808227A2
Application number: BRPI0808227-8A
Authority: BR
Inventors: J Woodruff Emlen; Peter Flynn; Michael V Holers
Original assignee: Taligen Therapeutics Inc
Priority date: 2007-03-14
Filing date: 2008-03-14
Publication date: 2014-07-08
Also published as: AU2008251943A1; EP2565207A3; EP2236518A3; AU2008251943B2; EP2118142A2; US7964705B2; CA2680344A1; WO2008140653A2; US20110318337A1; EP2236518B1; WO2008140653A9; EP2236518A2; US20080299114A1; HK1144948A1; JP5872757B2; CN101668773A; US9096677B2; WO2008140653A3; JP2010521470A; ES2507542T3

Description

"ANTICORPO HUMANIZADO ANTI-FATOR B"

Referência A Pedidos Relacionados

Este pedido reivindica prioridade para o Pedido Provisório de Patente Norte-Americana n. 60/906.816,

depositado em 14 de março de 2007, cuja divulgação incorpora-se ao presente documento por meio de referência.

Campo Da Invenção

A presente invenção refere-se a formas originais criadas por engenharia genética de um anticorpo monoclonal e fragmentos Iigantes de antígeno do mesmo que ligam o fator B das proteínas do complemento e inibem seletivamente a via alternativa do complemento. De maneira geral, a invenção refere-se ainda ao uso de tais anticorpos e fragmentos Iigantes de antígeno do mesmo para tratar doenças nas quais a via alternativa do complemento desempenha uma função. Em particular, a invenção refere-se ao uso de tais anticorpos e fragmentos Iigantes de antígeno do mesmo para inibir a ativação da via alternativa do completo e para tratar doenças nas quais a ativação da via .alternativa do complemento está envolvida. Tais doenças abrangem, de forma não limitativa, hiperresponsividade e inflamação das vias aéreas, lesão de isquemia-reperfusão e doenças relacionadas em animais, inclusive em seres humanos.

Histórico Da Invenção

Determinadas células do sistema ' imunológico produzem proteínas chamadas anticorpos ou imunoglobulinas ("Ig") em resposta à presença de proteínas estranhas no corpo, tais como proteínas bacterianas ou virais. Os anticorpos ligam e neutralizam proteínas estranhas no corpo.

Em geral, os anticorpos ligam os antígenos da proteína-alvo de maneira firme e específica, o que faz deles uma terapêutica potencialmente útil para o tratamento de uma ampla gama de doenças caracterizadas pela alteração da expressão de proteínas. Muitos alvos proteicos adequados ao tratamento de doenças mediadas por anticorpos foram identificados através de moléculas de anticorpos não-humanos. Em muitas aplicações terapêuticas, entretanto, a eficácia e a segurança dos anticorpos não-humanos resta comprometida porque as moléculas de Ig nãohumana são elas próprias imunogênicas (isto é, capazes de induzir uma resposta imune). Assim, antes que possam ser aprovados para uso terapêutico, os anticorpos geralmente devem ser modificados para reduzir ou eliminar suá imunogenicidade. A tecnologia Humaneering™ produz anticorpos modificados para reduzir a imunogenicidade mantendo, ao mesmo tempo, sua capacidade de ligar especificamente o antígeno-alvo.

Este pedido de patente descreve o uso da tecnologia Humaneering na "humanização" de um anticorpo monoclonal murino que liga o fator B e bloqueia seletivamente a via alternativa do complemento. A via alternativa do complemento 20 geralmente é ativada por bactérias, parasitas, vírus ou fungos, embora haja sido relatado que os anticorpos IgA e determinadas cadeias leves de Ig também ativam a via. A ativação da via alternativa é iniciada quando o fator B circulante se liga ao C3 ativado (C3b ou C3H20). Este complexo é então clivado pelo fator 25 D circulante para gerar um fragmento enzimaticamente ativo, qual seja, C3bBb ou C3(H20)Bb. Estas duas enzimas podem clivar o C3 circulante gerando C3b, que conduz a inflamação e amplifica ainda "mais o processo de ativação, gerando uma seqüência de resposta positiva. O fator B é necessário para possibilitar a ativação da via alternativa.

Estudos recentes demonstraram que a via -alternativa do complemento desempenha um papel imporante na patogênese de diversos modelos animais de doenças. A ativação 5 do complemento no rim após lesão de isquemia-reperfusão é mediada quase que exclusivamente pela via alternativa, a qual desempenha um papel crucial no desenvolvimento da artrite. Talvez o mais curioso seja que se demonstrou que camundongos deficientes na via alternativa estão protegidos contra a nefrite no 10 modelo MRL/lpr da nefrite lúpica e contra a perda fetal mediada por antifosfolipídeo, modelos de doenças que seriam tradicionalmente presumidos como mediados pela via clássica do complemento.

O anticorpo anti-fator B murino do qual são .derivadas as variantes humanizadas aqui descritas foi produzido 15 injetando-se uma proteína de fusão compreendendo o segundo e o terceiro domínios de repetições de consenso curto ("domínio SCR") do fator B fundido com imunoglobulina em camundongos deficientes em fator B ("fB7"). Os camundongos foram então examinados quanto à presença de anticorpos para o fator B. As células do baço 20 de um camundongo injetado capaz de produzir anticorpos anti-fator B foram fundidas às células de mieloma de acordo com procedimentos-padrão conhecidos. Um dos hibridomas resultantes, a célula de número 1379, produziu um anticorpo IgGi ("mAb 1379") que inibe completamente a ativação da via alternativa do 25 xomplemento in vitro e in vivo. Fragmentos Fab' Iigantes de antígeno do mAb 1379 também inibiram completamente a ativação da via alternativa do complemento. A linhagem de hibridomas que produz mAb 1379 foi depositada na Coleção de Culturas do ATCC [American Type Culture Collection] sob número PTA-6230. O mapeamento de epitopos mostrou que o mAb 1379 se liga ao fator B no terceiro domínio SCR. Outros experimentos demonstraram que o mAb 1379 inibe a ativação da via alternativa do complemento ao impedir a formação do complexo 5 C3bBb. Finalmente, o mAb 1379 liga um epitopo conservado em várias espécies de mamíferos, conforme demonstrado por sua capacidade de inibir a ativação da via alternativa do complemento no soro de uma série de espécies, entre elas camundongos, ratos, (humanos), babuínos, macacos rhesus, macacos cinomolgos, 10 porcos, coelhos e cavalos. A produção e a caracterização do anticorpo anti-fator B mAb 1379 encontra-se descrita 'detalhadamente na Patente Norte-Americana publicada sob n. US 2005/0260198 A1, a qual se incorpora ao presente documento por referência.

Todas as referências aqui citadas, inclusive

os pedidos e publicações de patentes, são incorporadas em seu inteiro teor ao presente documento por meio de referência.

Breve Resumo Da Invenção Em um aspecto, a presente invenção oferece um anticorpo humanizado anti-fator B ou fragmento Iigante de antígeno do mesmo, derivado do anticorpo monoclonal murino 1379 ("mAb 1379") que se liga seletivamente ao fator B no terceiro «domínio de repetições de consenso curto ("SCR") e impede a formação do complexo C3bBb, caracterizado pelo fato de o anticorpo humanizado ou fragmento Iigante de antígeno do mesmo possuir uma constante de dissociação de equilíbrio ("KD") entre cerca de 1,0 x 10'8 M e cerca de 1,0 x 10"10 M. Em determinadas configurações, o anticorpo humanizado anti-fator B ou fragmento Iigante de antígeno do mesmo possui uma K0 de cerca de 1,0 x 10‘9 M a 9,0 x 10'9 M ou cerca de 3,0 x IO'9 M a 7,0 x 10"9 M. Em determinadas configurações, o anticorpo humanizado anti-fator B ou fragmento Iigante de antígeno do mesmo possui uma K0 de cerca de 3,7 x IO-9M ou menos, cerca de 4,5 x 10'9 M ou menos, cerca de 5,4 x IO-9M ou cerca de 6,5 x 10‘9 M ou menos.

Em um aspecto relacionado, a presente invenção oferece um anticorpo humanizado anti-fator B ou fragmento Iigante de antígeno do mesmo, derivado do anticorpo monoclonal murino 1379 ("mAb 1379") que se liga seletivamente ao 10 fator B no terceiro domínio de repetições de consenso curto ("SCR") e impede a formação do complexo C3bBb, caracterizado pelo fato de o anticorpo humanizado ou fragmento Iigante de antígeno do mesmo possuir uma K0 entre cerca de 1,0 x 10"8 M e cerca de 1,0 x 10"10 M. Em determinadas configurações, o anticorpo humanizado 15 anti-fator B ou fragmento Iigante de antígeno do mesmo compreende um polipeptídeo da região Vk selecionado a partir do grupo formado pela Seq. ID Nq 14 (anticorpo de referência TA10), Seq. ID Ns 16 (Fab1 TA101-1), Seq. ID Nq 18 (Fab1 TA102-4) e Seq. ID Nq 20 (Fab' TA103-2) e um polipeptídeo da região Vh 20 selecionado a partir do grupo formado pela Seq. ID NQ 15 (anticorpo "de referência TA10), Seq. ID Nq 17 (Fab' TAÍ01-1), Seq. ID Nq 19 (Fab' TA102-4) e Seq. ID Nq 21 (Fab' TA103-2). Em determinadas configurações, o anticorpo humanizado anti-fator B ou fragmento Iigante de antígeno do mesmo compreende um polipeptídeo da 25 região Vk contendo a Seq. ID Nq 14 (anticorpo de referência TA10) e um polipeptídeo da região Vh contendo a Seq. ID Nq 15 (anticorpo de referência TA10) e possui uma Kd de 6,55 x 10"9 M ou menos. Em determinadas configurações, o anticorpo humanizado anti-fator B ou fragmento Iigante de antígeno do mesmo compreende um polipeptídeo da região Vk contendo a Seq. ID Ne 16 (Fab' TA101-1) e um polipeptídeo da região Vh contendo a Seq. ID Nq 17 (Fab' TA101-1) e possui uma K0 de 4,53 x 10'9 M ou menos. Em determinadas configurações, o anticorpo humanizado anti-fator B ou 5 fragmento Iigante de antígeno do mesmo compreende um polipeptídeo da região Vk contendo a Seq. ID Nq 18 (Fab' TA102-4) .e um polipeptídeo da região Vh contendo a Seq. ID Ns 19 (Fab' TA102-4) e possui uma Kd de 5,40 x 10'9 M ou menos. Em determinadas configurações, o anticorpo humanizado anti-fator B ou 10 fragmento Iigante de antígeno do mesmo compreende um polipeptídeo da região Vk contendo a Seq. ID Ns 20 (Fab1 TA103-2) e um polipeptídeo da região Vh contendo a Seq. ID Nq 21 (Fab' TA103-2) e possui uma Kd de 3,73 x 10'9 M ou menos. Em determinadas configurações, o anticorpo humanizado anti-fator B ou 15 fragmento Iigante de antígeno do mesmo compreende um fragmento Iigante de antígeno selecionado a partir do grupo formado por Fab', (Fab1)2, Fv, scFv e fragmentos biespecíficos ("diabodies"). Em determinadas configurações, o fragmento Iigante de antígeno de um anticorpo humanizado anti-fator B é um Fab'. 20 Em determinadas configurações, o anticorpo humanizado anti-fator B ou fragmento Iigante de antígeno do mesmo possui uma Kd de cerca de 3,7 x 10'9 M ou menos, cerca de 4,5 x 10'9 M ou menos, cerca de 5,4 x 10'9 M ou cerca de 6,5 x 10'9 M ou menos.

Em determinadas configurações, o anticorpo 25 humanizado anti-fator B ou fragmentos Iigantes de antígeno do mesmo compreende um polipeptídeo da região Vk selecionado a partir do grupo formado pela Seq. ID Nq 16 (Fab' TA101-1), Seq. ID Nq 18 (Fab' TA102-4) e Seq. ID Nq 20 (Fab' TA103-2) e um polipeptídeo da região Vh selecionado a partir do grupo formado pela Seq. ID.Ns 35 (Fab' TA101-1), Seq. ID Ns 36 (Fab' TA102-4) e Seq. ID Ns 37 (Fab' TA103-2). Em determinadas configurações, o anticorpo humanizado anti-fator B ou fragmento Iigante de antígeno do mesmo compreende um polipeptídeo da região Vk contendo a 'Seq. ID Ns 16 (Fab' TA101-1) e um polipeptídeo da região Vh contendo a Seq. ID Ns 35 (Fab' TA101-1). Em determinadas configurações, o anticorpo humanizado anti-fator B ou fragmento Iigante de antígeno do mesmo compreende um polipeptídeo da região Vk contendo a Seq. ID Ns 18 (Fab' TA102-4) e um polipeptídeo da região Vh contendo a Seq. ID Ns 36 (Fab' TA102-4). Em determinadas configurações, o anticorpo humanizado anti-fator B ou fragmento Iigante de antígeno do mesmo compreende um polipeptídeo da região Vk contendo a Seq. ID Ns 20 (Fab' TA103-2) e um polipeptídeo da região Vh contendo a Seq. ID Ns 37 (Fab' TA103-2).

Em determinadas configurações, o anticorpo humanizado anti-fator B ou fragmento Iigante de antígeno do mesmo compreende um polipeptídeo da região Vk selecionado a partir do grupo formado pela Seq. ID Ns 14 (anticorpo de referência 20 TA10), Seq. ID Ns 16 (Fab' TA101-1), Seq. ID Ns 18 (Fab' TA102-4) e Seq. ID Ns 20 (Fab' TA103-2), caracterizado pelo fato de a seqüência de aminoácidos do polipeptídeo da região Vk ser cerca de 80% idêntica ao polipeptídeo da região Vk em linhagem germinativa humana mais próxima, cerca de 85% idêntica ao 25 polipeptídeo da região Vk em linhagem germinativa humana mais próxima, cerca de 90% idêntica ao polipeptídeo da região Vk em •linhagem germinativa humana mais próxima ou cerca de 95% idêntica ao polipeptídeo da região Vk em linhagem germinativa humana mais próxima. Em determinadas configurações, o anticorpo humanizado anti-fator B ou fragmento Iigante de antígeno do mesmo compreende um polipeptídeo da região Vh selecionado a partir do grupo formado pela Seq. ID Ns 15 (anticorpo de referência TA10), Seq. ID Nq 17 (Fab' TA101-1), Seq. ID Nq 19 (Fab1 TA102-4) 5 e Seq. ID Nq 21 (Fab1 TA103-2), caracterizado pelo fato de a seqüência de aminoácidos do polipeptídeo da região Vh ser cerca de 80% idêntica ao polipeptídeo da região Vr em linhagem germinativa humana mais próxima, cerca de 85% idêntica ao polipeptídeo da região Vh em linhagem germinativa humana mais 10 próxima, cerca de 90% idêntica ao polipeptídeo da região Vh em linhagem germinativa humana mais próxima ou cerca de 95% idêntica ao polipeptídeo da região Vh em linhagem germinativa humana mais próxima. Em determinadas configurações, o anticorpo humanizado anti-fator B ou fragmentos Iigantes de antígeno do 15 mesmo compreende um polipeptídeo da região Vk selecionado a partir do grupo formado pela Seq. ID Nq 14 (anticorpo de referência TA10), Seq. ID Nq 16 (Fab' TA101-1), Seq. ID Nq 18 (Fab' TA102-4) e Seq. ID Nq 20 (Fab' TA103-2) e um polipeptídeo da região Vh selecionado a partir do grupo formado pela Seq. ID Nq 15 (anticorpo 20 de referência TA10), Seq. ID Nq 17 (Fab' TA101-1), Seq. ID Nq 19 (Fab' TA102-4) e Seq. ID Nq 21 (Fab' TA103-2), caracterizado pelo fato de a seqüência de aminoácidos do polipeptídeo da região Vk e a seqüência de aminoácidos do polipeptídeo da região Vh serem cerca de 80% idênticas ao polipeptídeo da região Vk em linhagem 25 germinativa humana mais próxima e ao polipeptídeo da região Vh em linhagem germinativa humana mais próxima, cerca de 85% idênticas ao polipeptídeo da região Vk em linhagem germinativa humana mais próxima e ao polipeptídeo da região Vh em linhagem germinativa humana mais próxima, cerca de 90% idênticas ao polipeptídeo da região Vk em linhagem germinativa humana mais próxima e ao polipeptídeo da região Vh em linhagem germinativa humana mais próxima ou cerca de 95% idênticas ao polipeptídeo da região Vk em linhagem germinativa humana mais próxima e ao 5 polipeptídeo da região Vh em linhagem germinativa humana mais próxima.

Em um aspecto relacionado, a presente invenção oferece um anticorpo humanizado anti-fator B ou fragmento Iigante de antígeno do mesmo, derivado do anticorpo 10 monoclonal murino 1379 ("mAb 1379") que se liga seletivamente ao •fator B no terceiro domínio de repetições de consenso curto ("SCR") e impede a formação do complexo C3bBb, caracterizado pelo fato de o anticorpo humanizado ou fragmento Iigante de antígeno do mesmo possuir uma Kd entre cerca de 1,0 x 10'8 M e cerca de 1,0 x 15 10'10 M. Em determinadas configurações, o anticorpo humanizado anti-fator B ou fragmentos Iigantes de antígeno do mesmo compreende uma região Vk contendo um determinante de especificidade do Iigante ("BSD") derivado da terceira região determinante de complementaridade ("CDR3") e da quarta região 20 do arcabouço ("FR4"), selecionada a partir do grupo formado pelas Seq. ID Nq 22 (anticorpo de referência TA10), Seq. ID Nq 24 (Fab' .TA101-1), Seq. ID Nq 26 (Fab' TA102-4) e Seq. ID Nq 28 (Fab' TA103-2); e a região Vh do anticorpo humanizado anti-fator B ou fragmento Iigante de antígeno do mesmo contém um BSD derivado 25 da região CDR3-FR4 selecionada a partir do grupo formado pelas Seq. ID Nq 23 (anticorpo de referência TA10), Seq. ID Nq 25 (Fab' TAI01-1), Seq. ID Nq 27 (Fab' TA102-4) e Seq. ID Nq 29 (Fab' TA103-2). Em determinadas configurações, o anticorpo humanizado anti-fator B ou fragmento Iigante de antígeno do mesmo compreende um polipeptídeo BSD da região Vk contendo a Seq. ID Ns 22 (anticorpo de referência TA10) e um polipeptídeo BSD da região Vh contendo a Seq. ID Nq 23 (anticorpo de referência TA10) e possui uma K0 de 6,55 x 10'9 M. Em determinadas configurações, 5 o anticorpo humanizado anti-fator B ou fragmento Iigante de antígeno do mesmo compreende um polipeptídeo BSD da região Vk contendo a Seq. ID Nq 24 (Fab' TA101-1) e um polipeptídeo BSD da região Vh contendo a Seq. ID Nq 25 (Fab' TA101-1) e possui uma Kd de 4,53 x 10'9 M. Em determinadas configurações, o anticorpo 10 humanizado anti-fator B ou fragmento lígante de antígeno do mesmo compreende um polipeptídeo BSD da região Vk contendo a Seq. ID Nq 26 (Fab' TA102-4) e um polipeptídeo BSD da região Vh contendo a Seq. ID Nq 27 (Fab1 TA102-4) e possui uma Kd de 5,40 x 10'9 M. Em determinadas configurações, o anticorpo humanizado 15 anti-fator B ou fragmento Iigante de antígeno do mesmo compreende um polipeptídeo BSD da região Vk contendo a Seq. ID Nq 28 (Fab' TA103-2) e um polipeptídeo BSD da região Vh contendo a Seq. ID Nq 29 (Fab' TA103-2) e possui uma Kd de 3,73 x 10'9 M. Em determinadas configurações, o anticorpo humanizado anti-fator 20 B ou fragmento Iigante de antígeno do mesmo compreende um fragmento Iigante de antígeno selecionado a partir do grupo formado por Fab', (Fab1)2l Fv, scFv e fragmentos biespecíficos ("diabodies"). Em determinadas configurações, o fragmento Iigante de antígeno de um anticorpo humanizado anti-fator B é um Fab'.

Em outro aspecto, a presente invenção

oferece um anticorpo humanizado anti-fator B ou fragmento Iigante de antígeno do mesmo, derivado do anticorpo monoclonal murino 1379 ("mAb 1379") que se liga seletivamente ao fator B no terceiro domínio de repetições de consenso curto ("SCR") e impede a formação do complexo C3bBb, caracterizado pelo fato de compreender um polipeptídeo da região Vk selecionado a partir do grupo formado pelas Seq. ID Ns 14 (anticorpo de referência TA10), Seq. ID Ns 16 (Fab' TA101-1), Seq. ID Ns 18 (Fab' TA102-4) e Seq.

ID N° 20 (Fab1 TA103-2) e um polipeptídeo da região Vh .selecionado a partir do grupo formado pela Seq. ID Ns 15 (anticorpo de referência TA10), Seq. ID Ns 17 (Fab' TA101-1), Seq. ID Ns 19 (Fab' TA102-4) e Seq. ID Ns 21 (Fab' TA103-2). Em determinadas configurações, o anticorpo humanizado anti-fator B ou fragmento 10 Iigante de antígeno do mesmo compreende um polipeptídeo da região Vk contendo a Seq. ID Ns 14 (anticorpo de referência TA10) e um polipeptídeo da região Vh contendo a Seq. ID Ns 15 (anticorpo de referência TA10). Em determinadas configurações, o anticorpo humanizado anti-fator B ou fragmento Iigante de antígeno do 15 mesmo compreende um polipeptídeo da região Vk contendo a Seq. ID Ns 16 (Fab' TA101-1) e um polipeptídeo da região Vh contendo a Seq. ID Ns 17 (Fab1 TA101-1). Em determinadas configurações, o anticorpo humanizado anti-fator B ou fragmento Iigante de antígeno do mesmo compreende um polipeptídeo da região Vk contendo a 20 Seq. ID Ns 18 (Fab' TA102-4) e um polipeptídeo da região Vh contendo a Seq. ID Ns 19 (Fab' TA102-4). Em determinadas configurações, o anticorpo humanizado anti-fator B ou fragmento Iigante de antígeno do mesmo compreende um polipeptídeo da região Vk contendo a Seq. ID Ns 20 (Fab' TA103-2) e um 25 polipeptídeo da região Vh contendo a Seq. ID Ns 21 (Fab' TA103-2). Em determinadas configurações, o anticorpo humanizado anti-fator B ou fragmento Iigante de antígeno do mesmo compreende um polipeptídeo da região Vk selecionado a partir do grupo formado pelas Seq. ID Ns 14 (anticorpo de referência TA10), Seq. ID Ns 16 (Fab' ΤΑ101-1), Seq. ID Nq 18 (Fab' TA102-4) e Seq. ID Nq 20 (Fab' TA103-2). Em determinadas configurações, o anticorpo humanizado anti-fator B ou fragmento Iigante de antígeno do mesmo 'compreende um polipeptídeo da região Vh selecionado a partir do 5 grupo formado pela Seq. ID Nq 15 (anticorpo de referência TA10), Seq. ID Nq 17 (Fab1 TA101-1), Seq. ID Nq 19 (Fab' TA102-4) e Seq. ID Nq 21 (Fab' TA103-2). Em determinadas configurações, o anticorpo humanizado anti-fator B ou fragmento Iigante de antígeno do mesmo compreende um fragmento Iigante de antígeno 10 selecionado a partir do grupo formado por Fab', (Fab1)2, Fv, scFv e fragmentos biespecíficos ("diabodies"). Em determinadas configurações, o fragmento Iigante de antígeno de um anticorpo humanizado anti-fator B é um Fab'.

Em outro aspecto, a presente invenção 15 -oferece um anticorpo humanizado anti-fator B ou fragmento Iigante de antígeno do mesmo, derivado do anticorpo monoclonal murino 1379 ("mAb 1379") que se liga seletivamente ao fator B no terceiro domínio de repetições de consenso curto ("SCR") e impede a formação do complexo C3bBb, caracterizado pelo fato de a região 20 Vk do anticorpo humanizado anti-fator B ou fragmento Iigante de antígeno do mesmo compreender um determinante de especificidade do Iigante ("BSD") derivado da terceira região determinante de complementaridade ("CDR3") e da quarta região do arcabouço ("FR4") selecionado a partir do grupo formado pelas 25 Seq. ID Nq 22 (anticorpo de referência TA10), Seq. ID Nq 24 (Fab' /ΓΑ101-1), Seq. ID Nq 26 (Fab' TA102-4) e Seq. ID Nq 28 (Fab' TA103-2) e a região Vh do anticorpo humanizado anti-fator B ou fragmento Iigante de antígeno do mesmo compreender um BSD derivado da região CDR3-FR4 selecionado a partir do grupo formado pelas Seq. ID Nq 23 (anticorpo de referência TA10), Seq. *ID Nq 25 (Fab' TA101-1), Seq. ID Nq 27 (Fab' TA102-4) e Seq. ID Nq 29 (Fab' TA103-2). Em determinadas configurações, o anticorpo humanizado anti-fator B ou fragmento Iigante de antígeno do 5 mesmo compreende um polipeptídeo BSD da região Vk contendo a Seq. ID Nq 22 (anticorpo de referência TA10) e um polipeptídeo BSD da região Vh contendo a Seq. ID Nq 23 (anticorpo de referência TA10). Em determinadas configurações, o anticorpo humanizado anti-fator B ou fragmento Iigante de antígeno do mesmo 10 compreende um polipeptídeo BSD da região Vk contendo a Seq. ID Nq 24 (Fab' TA101-1)e um polipeptídeo BSD da região Vh contendo a Seq. ID Nq 25 (Fab' TA101-1). Em determinadas configurações, o "anticorpo humanizado anti-fator B ou fragmento Iigante de antígeno do mesmo compreende um polipeptídeo BSD da região Vk contendo 15 a Seq. ID Nq 26 (Fab' TA102-4) e um polipeptídeo BSD da região Vh contendo a Seq. ID Nq 27 (Fab' TA102-4). Em determinadas configurações, o anticorpo humanizado anti-fator B ou fragmento Iigante de antígeno do mesmo compreende um polipeptídeo BSD da região Vk contendo a Seq. ID Nq 28 (Fab' TA103-2) e um 20 polipeptídeo BSD da região Vh contendo a Seq. ID Nq 29 (Fab' TA103-2). Em determinadas configurações, a região Vk do anticorpo humanizado anti-fator B ou fragmento Iigante de antígeno do mesmo compreende um determinante de especificidade do Iigante '("BSD") derivado da terceira região determinante de 25 complementaridade ("CDR3") e da quarta região do arcabouço ("FR4") selecionado a partir do grupo formado pelas Seq. ID Nq 22 (anticorpo de referência TA10), Seq. ID Nq 24 (Fab' TA101-1), Seq. ID Nq 26 (Fab' TA102-4) e Seq. ID Nq 28 (Fab' TA103-2). Em determinadas configurações, a região Vh do anticorpo humanizado anti-fator B ou fragmento Iigante de antígeno do mesmo compreende um BSD derivado da região CDR3-FR4 selecionado a partir do grupo formado pelas Seq. ID Nq 23 (anticorpo de referência TA10), Seq. ID Nq 25 (Fab' TA101-1), Seq. ID Nq 27 (Fab' TA102-4) 5 e Seq. ID Nq 29 (Fab' TA103-2). Em determinadas configurações, o anticorpo humanizado anti-fator B ou fragmento Iigante de antígeno do mesmo compreende um fragmento Iigante de antígeno selecionado a partir do grupo formado por Fab', (Fab1)2, Fv, scFv e fragmentos biespecíficos ("diabodies"). Em determinadas 10 configurações, o fragmento Iigante de antígeno de um anticorpo humanizado anti-fator B é um Fab'.

Em outro aspecto, a presente invenção apresenta métodos para tratar uma doença ou distúrbio em que a ativação da via alternativa do complemento desempenha uma 15 função, compreendendo a administração de um anticorpo humanizado anti-fator B ou fragmento Iigante de antígeno do mesmo, derivado do anticorpo monoclonal murino 1379 ("mAb 1379") que se liga seletivamente ao fator B no terceiro domínio de repetições de consenso curto ("SCR") e impede a formação do 20 complexo C3bBb, caracterizado pelo fato de o anticorpo humanizado ou fragmento Iigante de antígeno do mesmo possuir uma constante de dissociação de equilíbrio ("KD") entre cerca de 1,0 x 10'8 M e cerca de 1,0 x 10'1° M, a um indivíduo que tem ou que apresenta risco de desenvolver tal doença ou distúrbio. Em 25 determinadas configurações, a doença ou distúrbio é hiperresponsividade das vias aéreas ("UVA") ou inflamação das vias aéreas. Em determinadas configurações, quaisquer dos anticorpos humanizados anti-fator B ou fragmentos Iigantes de antígeno do mesmo são administrados ao indivíduo em quantidade eficaz para reduzir de modo mensurável a HVA no animal, em comparação com o período anterior à administração do anticorpo ou fragmento Iigante de antígeno do mesmo. Em determinadas configurações, a HVA ou inflamação das vias aéreas encontra-se 5 associada a uma doença selecionada a partir do grupo formado por asma, doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC), aspergilose broncopulmonar alérgica, pneumonia de hipersensibilidade, .pneumonia eosinofílica, enfisema, bronquite, bronquiectasia bronquite alérgica, fibrose cística, tuberculose, pneumonite de 10 hipersensibilidade, asma ocupacional, sarcoidose, síndrome da disfunção reativa das vias aéreas, doença pulmonar intersticial, síndrome hipereosinofílica, rinite, sinusite, asma induzida por exercício, asma induzida por poluição, asma variante com tosse, pneumopatia parasitária, infecção pelo vírus sincicial respiratório 15 ("VSR"), infecção pelo vírus da parainfluenza ("VPI"), infecção por rinovírus ("RV") e infeção por adenovírus. Em determinadas configurações, a HVA ou inflamação das vias aéreas encontra-se associada à inflamação alérgica, asma ou DPOC.

Em outro aspecto, a presente invenção 20 apresenta métodos para inibir a ativação da via alternativa do complemento em indivíduo que tem ou que apresenta risco de desenvolver uma doença ou distúrbio em que a ativação da via alternativa do complemento contribui para a doença ou distúrbio, exacerba pelo menos um sintoma da doença ou distúrbio ou causa 25 a doença ou distúrbio, compreendendo a administração de quaisquer dos anticorpos humanizados anti-fator B ou fragmentos Iigantes de antígeno do mesmo, divulgados neste documento, a um indivíduo que deles necessite.

Em outro aspecto, a presente invenção apresenta uma composição contendo uma quantidade eficaz do anticorpo humanizado anti-fator B ou fragmento Iigante de antígeno do mesmo, divulgados neste documento, e um veículo aceitável do ponto de vista farmacêutico. Em determinadas configurações, o 5 veículo aceitável do ponto de vista farmacêutico é selecionado a 'partir do grupo formado por: um pó seco dispersível; etanol anidro; cápsulas pequenas; lipossomos; um spray para nebulização; e um excipiente injetável.

Breve Descrição Dos Desenhos A FIGURA 1 é um gel de agarose mostrando

produtos de cDNA dupla fita gerados com conjuntos de primers degenerados específicos da região V usando um modelo de fita simples de cDNA preparado a partir de mRNA isolado do hibridoma que produz mAb 1379.

A FIGURA 2 é uma comparação de

seqüências de aminoácidos derivadas das seqüências de cDNA Vh *e Vk clonadas a partir da linhagem de células de hibridoma que produz de mAb 1379.

A FIGURA 3 é uma comparação de seqüências de aminoácidos amino-terminais derivadas das seqüências de cDNA Vh e Vk clonadas para as seqüências de aminoácidos amino-terminais determinadas a partir de mAb 1379.

A FIGURA 4 é uma comparação da ligação de fator B entre o Fab' TA003 clonado e o Fab1 derivado de mAb 1379 através de digestão por papaína.

A FIGURA 5 mostra a cinética do fragmento Fab' ligando-se a fator B humano recombinante analisado com o •sistema ForteBio Octet por interferometria em biocamada.

A FIGURA 6 é uma comparação das seqüências de aminoácidos derivadas da seqüência dos isolados de anticorpo humanizado TA101-1, TA102-4 e TA103-2 para as seqüências correspondentes do anticorpo de referência TA10 e dos genes de domínio variável que codificam as cadeias pesadas e 5 leves em linhagem germinativa humana mais próxima ("gene VL" e "gene VH") e segmentos de união ("segmento J") (genes humanos VH1- 02/Jh4 e VKIV-B3/JK2).

Descrição Detalhada Da Invenção Anticorpos anti-fator B humanizados ou os fragmentos Iigantes de antígeno derivados que se ligam seletivamente para complementar o fator B e seletivamente inibem a ativação do circuito de complemento alternativo podem ser usados para tratar qualquer doença ou distúrbio que envolva o circuito de complemento alternativo em animais, inclusive humanos. Em particular, tais anticorpos ou fragmentos Iigantes de antígeno derivados podem ser usados para tratar qualquer doença ou distúrbio em animais, inclusive humanos, nos quais a ativação do circuito de complemento alternativo desempenhe um papel importante. Tais doenças ou distúrbios incluem, por exemplo, asma alérgica e inflamação concomitante das vias aéreas e hiper responsividade das vias aéreas ("HRVA"), doença pulmonar obstrutiva crônica ("DPOC"), aspergilose bronco-pulmonar alérgica, pneumonia de hipersensibilidade, pneumonia eosinofílica, enfisema, bronquite, asma ocupacional, sarcóide, síndrome da disfunção reativa das vias aéreas, doença pulmonar intersticial, síndrome hiper eosinofílica, rinite, sinusite, asma induzida por exercício, asma induzida por poluição, asma variante com tosse, pneumopatia parasitária, infecção por vírus sincicial respiratório ("VSR"), infecção por vírus parainfluenza ("PIV"), infecção por rinovírus ("RV") e "infecção por adenovírus, lesão por reperfusão - isquemia. Veja, por ex., a Publicação de Patente dos EUA No. US 2005/0260198 A1, a qual se apresenta incorporada nesta por referência.

A asma alérgica é uma síndrome comum, associada à inflamação das vias aéreas e HRVA. Em pacientes de asma alérgica, a exposição ao alergênio inalado leva a um aumento da HRVA e da inflamação das vias aéreas. Estudos mostraram que os níveis de fragmentos biologicamente ativos derivados do complemento C3, C4 e C5 da família das proteínas, em especial C3a e C5a no fluído de lavado broncoalveolar ("LBA"). Isto sugere que, nestes pacientes, a ativação do circuito de complemento -através de um mecanismo induzido por alergênio ocorre, no pulmão, após a exposição ao alergênio. OS modelos animais proporcionaram mais esclarecimentos quanto ao papel do complemento no desenvolvimento da enfermidade alérgica das vias aéreas. Os animais carentes de receptor C3 ou C3a parecem estar protegidos do desenvolvimento da doença de vias aéreas induzida por alergênio. Veja, por ex., a Publicação de Patente dos EUA no. US 2005/0260198 A1, a qual se encontra incorporada aqui por referência.

Definições

Conforme usado aqui, o termo "anticorpo" ou ."imunoglobulina" se refere Às glicoproteínas da imunoglobulina ("Ig"), pertencente à superfamília das proteínas. Um anticorpo ou 25 uma molécula de imunoglobulina ("Ig") é tetramérica, compreendendo duas cadeias leves de polipeptídeos e duas cadeias pesadas idênticas de polipeptídeos (os termos "cadeia leve de polipeptídeo" e "cadeia leve" ou "cadeia pesada de polipeptídeo" ou "cadeia pesada" são usados alternadamente neste para descrever os polipeptídeos de uma molécula de Ig). As duas cadeias pesadas estão ligadas entre si por pontes dissulfido, e cada cadeia pesada está ligada a uma cadeia leve por uma ponte dissulfido. Cada molécula de Ig completa contém, ao menos, dois locais de ligação para um alvo (target) específico ou antígeno.

O sistema imune produz várias classes diferentes de moléculas de Ig ("isotipos"), incluindo IgA, IgD1 IgE, IgG e IgM, cada qual diferenciada pela classe particular de cadeia pesada de polipeptídio presente: alfa ("a") - encontrada na IgA;

·*·

delta ("δ") - encontrada na IgD; épsilon ("ε") - encontrada na IgE; gama ("γ") - encontrada na IgG; e mu ("μ") - encontrada na IgM. Há, pelo menos, cinco cadeias pesadas γ de polipeptídios ("isotipos") encontrados na IgG. Em contraste, há apenas dois isotipos de cadeia leve de polipeptídeos, as chamadas cadeias kappa (V) e 15 Iambda ("λ"). As características distintivas de isotipos de anticorpos são definidas pelas seqüências dos domínios constantes da cadeia pesada.

Uma molécula de IgG compreende duas cadeias leves (tanto na forma κ como na λ) e duas cadeias pesadas 20 (na forma γ) ligadas entre si por pontes dussulfido. As formas κ e λ da cadeia leve da IgG contêm, ambas, um domínio de seqüências de aminoácidos relativamente variável, chamado região variável (variadamente nomeada região "V|_," "VK ou "V^") e um domínio de

seqüências de aminoácidos relativamente conservado, chamado região constante ("região C|_"). De forma semelhante, cada cadeia

pesada da IgG contém uma região variável ("região V|_|") e uma ou

mais regiões conservadas: uma cadeia pesada de IgG contém três domínios constantes ("regiões 0^1-," Cj_|2-" e C|_|3-") e uma região

de dobra. Dentro de cada região V^_ ou V|_|, as regiões hiper

variáveis, também conhecidas como regiões determinantes de complementaridade ("CDR"), estão intercaladas entre regiões framework ("FR"). Geralmente, a região variável de uma cadeia de polipeptídeos, leve ou pesada, contém quatro FR e três CDR -dispostas na seguinte ordem ao longo do polipeptídeo: NH2-FRI

CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4-COOH. Juntas, as CDR e FR determinam a estrutura tridimensional do local de ligação da IgG e, 10 desta forma, a proteína alvo ou antígeno específicos aos quais essa molécula de IgG se liga. Cada molécula de IgG é dimérica, capaz de se ligar a duas moléculas de antígenos. O corte de uma IgG dimérica com a protease papaína produz dois fragmentos Iigantes de antígeno idênticos ("Fab") e um fragmento "Fc11l assim chamado 15 por ser prontamente cristalizado.

Conforme usado neste, 0 termo "fragmento Iigante de antígeno" se refere a um fragmento de um anticorpo ou 'uma molécula de imunoglobulina que retém a capacidade de se ligar especificamente a seu antígeno cognato. Os fragmentos 20 Iigantes de antígeno geralmente carecem de um ou mais de um domínios funcionais, em parte ou em todo, presentes no anticorpo completo ou nas moléculas de IgG, tais como aqueles que conferem a habilidade de fixar complementos e estimular a citoxicidade celular dependente de anticorpo ("ADCC"). Os 25 fragmentos Iigantes de antígeno podem ser preparados a partir de isolados de anticorpos completos, por exemplo, pela digestão com protéases, tais como a papaína (a qual produz dois fragmentos monovalentes Iigantes de antígeno ("Fab") compreendendo as regiões variável e constante de uma cadeia leve de anticorpo e a região variável e a primeira região constante de uma cadeia pesada de um anticorpo) ou a pepsina (a qual produz um único fragmento bivalente Iigante de antígeno ("Fab’)2", compreendendo um par de

'fragmentos Fab’ ligados de forma covalente perto de seus terminais carboxila).

Outros fragmentos Iigantes de antígeno podem ser produzidos mediante o uso de metodologia padrão de DNA recombinante, tais como fragmentos "Fv", anticorpos Fv de 10 cadeia única ("scFv"), anticorpos bi-específicos, diacorpos, anticorpos humanizados e afins. Um fragmento "Fv" é um fragmento de anticorpo que contém um local de ligação e de reconhecimento de antígeno completos, compreendendo um dímero de uma região Vh e uma região V|_. Um fragmento de anticorpo "scFv"

compreende a região Vh e uma região V|_de um anticorpo em uma

única cadeia de polipeptídeo. Um "diacorpo" é um pequeno fragmento de anticorpo com dois locais Iigantes de antígeno, compreendendo um domínio variável de cadeia pesada ligado a um domínio variável de cadeia leve no mesmo polipeptídeo. Por usar um Iigador curto demais para permitir que as regiões Vh e V|_ do

mesmo polipeptídio se liguem, os domínios são forçados a se ligar a domínios complementares de um segundo polipeptídeo, criando dois locais Iigantes de antígeno.

Conforme usado neste, o termo "determinante de especificidade de ligação", ou "BSD", se refere ao todo ou à porção da seqüência de aminoácido da terceira região determinante de complementaridade ("CDR3") e da quarta região framework ("FR4") de um polipeptídeo IgG V|_ ou Vh que media a especificidade Iigante de antígeno de uma molécula Ig em particular. As BSDs funcionam em pares de cadeia leve e cadeia pesada, de forma tal que uma BSD em particular compreende a seqüência de aminoácido da CDR3-FR4 de uma região V|_ em par

5 com a seqüência de aminoácido da CDR3-FR4d e uma região Vh cognata.

Conforme usado neste, o termo "epitope" se refere a um local, em uma molécula maior, qual seja uma dada proteína, polipeptídeo ou antígeno (por ex., fator B), ao qual um 10 anticorpo, imunoglobulina ou fragmento Iigante de antígeno derivado irá se ligar - e contra o qual um anticorpo será produzido. O termo "epitope" pode ser usado alternadamente com os termos "determinante antigênico", "local de ligação de anticorpo" ou "superfície de ligação conservada" de uma dada proteína, 15 polipeptídeo ou antígeno. Mais especificamente, um epitope pode ser definido tanto pelos resíduos de aminoácidos envolvidos na ligação de anticorpo como por sua conformação no espaço tridimensional (por ex., um epitope conformacional ou a superfície de ligação conservada). Um epitope pode estar incluso em 20 peptídeos tão pequenos quanto 4 a 6 resíduos de aminoácidos, ou pode estar incluso em segmentos maiores de uma proteína, e não precisa ser formado por resíduos de aminoácidos contíguos quando em referência a uma estrutura tridimensional de um epitope, particularmente no que diz respeito a um epitope Iigante de 25 anticorpo. Os epitopes Iigantes de anticorpo são, frequentemente, epitopes conformacionais - ao invés de serem epitopes seqüenciais ou lineares - ou, em outras palavras, um epitope definido por resíduos de aminoácidos arranjados em três dimensões na superfície de uma proteína ou de um polipeptídeo ao qual um anticorpo se liga. Conforme mencionado acima, o epitope conformacional não é formado por uma seqüência contígua de resíduos de aminoácidos, mas, ao invés disso, os resíduos talvez 5 estejam amplamente separados na seqüência primária de proteína e se juntem para formar uma superfície de ligação pela forma como a proteína se dobra em sua conformação nativa, em três dimensões.

O epitope reconhecido pelo mAb 1379, e 10 partilhado pelas variantes humanizadas descritas aqui, é um epitope conformacional - o qual não é um epitope linear - localizado dentro da estrutura tridimensional de uma porção do terceiro domínio SCR do fator B. Veja, pro ex., US 2005/0260198 A 1, a qual se encontra incorporada neste, em sua totalidade, para 15 referência. O fator B humano é expresso como uma pré-proteína de aminoácido 764 contendo um peptídeo de sinal de vinte e cinco (25) aminoácidos estendendo os aminoácidos 1-25 de seu terminal amino. A seqüência de aminoácido para a pré-proteína do fator B humano encontra-se no Acesso No. P00751 da Base de Dados 20 NCBI. O fator B humano maduro compreende a seqüência de aminoácido do Acesso No. P00751 carecendo do peptídeo de sinal de vinte e cinco (25) aminoácidos (por ex., SEQ ID NO: 30). O terceiro domínio SCR da um fator B humano maduro se estende de cerca da posição 137 até cerca da posição 195 de SEQ ID NO: 30. 25 A porção que contém o epitope é a estrutura tridimensional do fator B que é definida por substancialmente todas (por ex., ao menos 90%) as posições de aminoácidos Ala137-Ser192 de SEQ ID NO: 30, ou posições equivalentes numa seqüência de fator B não humana, quando tal seqüência estiver disposta conformacionalmente, como ocorre na seqüência natural completa do fator B.

O mAb 1379 murino, e as variantes humanizadas descritas aqui, se ligam a um epitope ou a uma 5 superfície de ligação conservada dentro - ou contendo uma parte do terceiro domínio SCR, compreendendo um epitope de um fator B humano que inclua, ao menos, uma porção da seqüência compreendendo desde cerca da posição Tyr139 até cerca da -posição Ser185 da proteína do fator B humano madura (SEQ ID 10 NO: 30), para um epitope do fator B humano que inclua, ao menos, uma porção de desde cerca da posição Tyr139 até cerca de posição Ser141 da proteína do fator humano madura (SEQ ID NO: 30), para um epitope de fator B humano que inclua, ao menos, uma porção da seqüência compreendida desde cerca da posição Glu182 15 até cerca da posição Ser185, mo que se refere á proteína do fator B humano madura (SEQ ID NO: 30), para um epitope de fator B que inclua, ao menos, uma porção de fator B humano (SEQ ID NO: 30) compreendendo qualquer ou mais de uma das seguintes posições ou de suas posições equivalentes em uma seqüência de fator B não 20 .humano: Ala137, Tyr139, Cys 140, Ser 141, Glu182, Gly184 ou Ser185 - ou um epitope de fator B que inclua, ao menos, uma porção das posições equivalente no que se refere a espécies animais não humanas. Em um outro aspecto, o epitope está dentro ou contendo uma parte da do terceiro domínio SCR de fator B que 25 inclui todas - ou substancialmente todas (ao menos, cinco, seis, ou sete) - as seguintes posições de aminoácidos de SEQ ID NO: 30, ou suas posições equivalentes em uma seqüência de fator B não humana: Ala137, Tyr139, Ser 141, Glu182, Ser185, Thr189, Glu190 eSer192. Um douto na arte pode alinhar, prontamente, a seqüência do fator B humano com a seqüência do fator B de uma outra espécie animal e determinar as posições das regiões SCRe as porções específicas das terceiras regiões SCR correspondentes 5 às posições de aminoácidos acima. Por exemplo, duas seqüências específicas podem ser alinhadas uma à outra por meio da seqüência BLAST 2, conforme descrito em Tatusova e Madden, (1999), "Blast2 sequences: a new tool for comparing protein and nucleotide sequences" (Seqüências Blast 2: uma nova ferramenta 10 para se comparar seqüências de proteínas e nucleotídeos), FEMS Microbiol. Lett. 174: 247-250, a qual se encontra incorporada aqui, na íntegra, para referência.

Conforme usado aqui, o termo "se liga seletivamente a" se refere à ligação específica de uma proteína a 15 outra (por ex., um anticorpo, fragmento Iigante de antígeno derivado, ou parceiro Iigante de um antígeno), onde o nível de ligação, qual seja medido por qualquer análise padrão (por ex., uma Imuno-análise), seja - desde um ponto de vista estatístico significativamente mais alto que o do controle para a análise. Por 20 exemplo, ao se realizar uma imuno-análise, os controles incluem, tipicamente, um poço de reação ou tubo que contém apenas anticorpo ou fragmento Iigante de antígeno (por ex., na ausência de antígeno), onde uma quantidade de reatividade (por ex., ligação não específica ao poço ou tubo) pelo anticorpo ou fragmento Iigante de 25 antígeno derivado, na ausência de antígeno, seja considerada como o sinal de fundo. A ligação pode ser medida através de uma variedade de métodos padrão na arte, inclusive, mas não de forma limitante, Western blot, imunoblot, teste imunoabsorvente ligado à •enzima ("ELISA"), radioimunoanálise ("RIA"), imunoprecipitação, ressonância de plasmon de superfície, quimiluminescência, polarização fluorescente, fosforescência, análise imunohistoquímica, ionização/ dessorção de matriz assistida por laser .espectrometria de massa em tempo de voo ("MALDI-TOF"), 5 microcitometria, micro varredura, microscopia, classificação celular ativada por fluorescência ("FACS") e citometria de fluxo.

Conforme usado aqui, define-se "tratar" uma doença como sendo o administrar uma variante humanizada do mAb 1379 de acordo com a descrição acima, qual seja TA 101, TA 10 102-4 e TA103-2, ou fragmentos Iigantes a antígeno derivados, com ou sem outros agentes terapêuticos, de forma a paliar, melhorar, estabilizar, reverter, retardar, postergar, prevenir, reduzir ou eliminar tanto a doença como o sintoma dela, ou retardar ou interromper a progressão de uma doença ou de um sintoma de doença. Uma 15 "quantidade efetiva" de uma composição é uma quantidade suficiente para se tratar uma doença.

Conforme usado aqui, "inibir" o circuito de complemento alternativo em um indivíduo se refere a inibir a expressão e/ ou a atividade biológica de, ao menos, uma proteína 20 que seja parte do circuito de complemento alternativo. Tais proteínas incluem, mas não se limitam a, o fator B, fator D ou properdina. Inibir "seletivamente" o circuito de complemento alternativo significa que o método da presente invenção inibe, de preferência ou exclusivamente, o circuito de complemento 25 alternativo, mas não inibe ou, ao menos, não substancialmente, outros circuitos para ativação de complemento, inclusive o circuito de complemento clássico ou o circuito de lecitina. Por exemplo, os anticorpos de fator B humanizados ou os fragmentos Iigantes de antígeno derivados da presente invenção perfazem um exemplo de um reagente que inibe seletivamente o circuito de complemento 'alternativo. Esta definição se aplica a outros métodos descritos aqui, onde o circuito de complemento alternativo é inibido seletivamente.

Um "indivíduo" é um vertebrado, de

preferência, um mamífero, mais preferivelmente, um humano. Os mamíferos incluem, mas não se limitam a, animais de fazenda, animais de esportes, animais domésticos, camundongos e ratos. Em algumas configurações, o indivíduo é humano. EM outras 10 configurações, o indivíduo é outro que não humano. Em algumas configurações, o indivíduo é um animal modelo para o estudo de uma doença na qual o circuito de complemento alternativo esteja -implicado. Indivíduos sensíveis ao tratamento incluem os que são atualmente assintomáticos, mas que se encontram sob risco de 15 desenvolver um distúrbio sintomático no qual o circuito de complemento alternativo desempenhe um papel importante, ou no qual a ativação do circuito de complemento alternativo desempenhe um papel importante.

A referência geral a "composição" ou "composições" inclui e se aplica às composições da invenção.

Conforme usado aqui, as formas singulares "um", "uma", "o" e "a" incluem as referências no plural a menos que o contrário esteja claramente indicado. Por exemplo, o termo "uma .região VH" inclui uma ou mais regiões Vh.

A referência a "cerca de" um valor ou

parâmetro, aqui, inclui e descreve configurações que são dirigidas àquele valor ou parâmetro per se. Por exemplo, uma descrição que se refira a "cerca de X" inclui a descrição de "X".

Entende-se que os aspectos e configurações da invenção descritos aqui incluem "compreendendo" e / ou "essencialmente compreendendo" os aspectos e configurações.

1. Introdução

A Humanização de Anticorpos™ produz anticorpos humanos alterados com seqüências de região variável ("região V") próximas às seqüências da linha germinal humana, ao mesmo tempo em que retêm a especificidade e afinidade de um anticorpo de referência. Veja, por ex., a Publicação de Patente dos EUA No. US 2005/0255552 A 1; e a Publicação de Patente dos EUA No. US 2006/0134098 A 1. O processo identifica a informação de seqüência mínima necessária para se determinar a especificidade de ligação ao antígeno da região V pertencente a um anticorpo de referência e transfere a informação para uma biblioteca de seqüências genéticas parciais da região V humana para gerar uma biblioteca voltada ao epitope de regiões V de anticorpo humano. Os membros da biblioteca são expressos como fragmentos de anticorpo Fab’ usando um sistema de secreção baseado em micróbios. A biblioteca é, então, analisada, em busca de fragmentos Fab’ Iigantes de antígeno usando uma análise de ligação de colônia. Os clones positivos são caracterizados, em seguida, para se identificar os que tenham a finidade de ligação 'mais elevada com o antígeno alvo. Os fragmentos Fab’ humanos alterados retêm a especificidade de ligação do anticorpo murino parente e, de preferência, têm afinidade de ligação equivalente ou mais elevada para antígeno do que o anticorpo parente. De preferência, os fragmentos Fab’ alterados também possuem regiões

V de cadeias pesadas e leves, com um alto grau de identidade de seqüência de aminoácidos em comparação com os mais próximos genes de anticorpos humanos da linha germinal. A determinante de especificidade de ligação ("BSD") mínima necessária para se produzir a biblioteca voltada ao epitope é tipicamente representada por uma seqüência dentro da CDR3 da cadeia pesada do anticorpo ("CDR|_|3")e uma seqüência

dentro da CDR3 da cadeia leve do anticorpo ("CDR^S"). Em alguns

casos, a biblioteca voltada ao epitope ê construída a partir de seqüências do segmento V humano (o "segmento V" contém FR1- ODR1-FR2-CDR2-FR3) ligadas à região exclusiva na junção de CDR3 e FR4, contendo as seqüências BSD e do segmento Iigante da linha germinal humana ("segmento J"). Veja a Publicação de Patente dos EUA No. US 2005/0255552 A 1. Alternativamente, as bibliotecas de segmento V humano podem ser geradas por substituição de cassete seqüencial, na qual apenas parte do segmento V murino é inicialmente substituída por uma biblioteca de seqüências humanas. Os "cassetes" humanos identificados dando suporte à ligação do antígeno no contexto das seqüências murinas residuais são, em seguida, recombinadas numa segunda análise de biblioteca para gerar segmentos V completamente humanos. Veja a •Publicação de Patente dos EUA No. US 2006/0134098 A 1. Em cada caso, segmentos casados de corrente pesada e leve CDR3- FR4, contendo determinantes de especificidade a partir do anticorpo de referência são usados para confinar a especificidade de ligação de modo que os fragmentos Fab’ Iigantes de antígeno, obtidos a partir da biblioteca, retenham a especificidade de epitope do anticorpo inicial (por ex., mAb 1379).

Mudanças de maturação adicionais podem ser introduzidas nas regiões CDR3 de cada cadeia durante a construção da biblioteca de modo a se identificar os anticorpos com cinética de ligação ótima.

Os anticorpos humanizados resultantes têm seqüências de segmento V derivadas a partir das bibliotecas de seqüência humanas, retêm a seqüência BSD curta de dentro das 5 regiões CDR3 de cadeia Vj e Vh, e possuem regiões

FR4 de linha germinal humana.

A substituição de cassete foi utilizada com sucesso para a humanização de mAb 1379. Um número de fragmentos Fab’ com elevada afinidade pelo fator B foi identificado 10 mediante esta abordagem. Foram identificados três fragmentos Fab’ humanizados com afinidade pelo fator B mais elevada do que o anticorpo murino de referência (por ex., mAb 1379).

2. Métodos

2.1 A clonagem das regiões V murinas a partir do hibridoma produzindo mAb 1379

As regiões V murinas foram clonadas a partir do hibridoma produzindo mAb 1379 conforme segue. Primeiro células de hibridoma foram cultivadas de acordo com os procedimentos estabelecidos. As células foram coletadas em 20 seguida e o RNA mensageiro ("mRNA") foi extraído da massa da célula mediante procedimentos padrão conhecidos pelos doutos na arte. A primeira fileira de DNA complementar ("cDNA") foi gerada a aprtir de mRNA purificado por extensão primer com polideoxitimidina ("poli-dT") usado transcriptase reversa, de acordo com 25 métodos padrão conhecidos pelos doutos na arte. A primeira fileira de cDNA foi usada, em seguida, como molde para a amplificação das seqüências da região V do anticorpo usando primers 'degenerados de acordo com os procedimentos descritos em detalhe por Chardès, T., et al., "Efficient amplification and direct sequencing of mouse variable regions from any immunoglobulin gene family" (Amplificação eficiente e sequenciamento das regiões variáveis do camundongo a partir de qualquer família do gene imunoglobulina), FEBS Lett. 452(3):386-394 (1999), a qual está 5 incorporada aqui para referência. Foi sequenciado o cDNA da região variável ("Vh") de cadeia pesada de da região V-kapa ("Vk")

da região variável da cadeia leve,além de checado para identidade com os dados de seqüência de peptídeo amino-terminal gerados por Taligen. As regiões V foram clonadas como fragmentos Fab’ e 10 expressadas em Escherichia coli ("E. Coli") a partir de vetores de expressão registrados KaIoBios. A proteína Fab’ purificada demonstrou ligar-se à proteína purificada do fator B em um teste imunoabsorvente ligado a enzima ("ELISA"), levado a cabo de acordo com métodos padrão.

2.2 Purificação de Fab’

Os fragmentos Fab’ forma expressos em E. coli mediante vetores de expressão registrados KaIoBios. As bactérias foram cultivadas a 37° C em meio 2X YT (16 g de bactotriptona, 10 g de extrato bacto-yeast e 5 g de NaCI por litro de água destilada deionizada ("ddh^O")) para uma densidade óptica de 0,6

unidades de absorção medidas a um comprimento de onda de 600 nrrv. A expressão de proteína foi induzida mediante isopropil-ft-tiogalactopiranosídeo ("IPTG") por 3 horas a 33° C. A concentração apropriada de IPTG para se obter uma expressão ótima da proteína 25 desejada é determinada empiricamente através de métodos conhecidos pelos doutos na arte e varia, tipicamente, entre 0,01 mM e 5,0 mM. Os fragmentos de Fab’ montados foram obtidos a partir de frações de periplasma e purificados por cromatografia de ^afinidade sobre colunas de Proteína G estreptocócicas (HiTrap™ Protein G HP columns; comprados de GE Healthcare, Piscataway, NJ) de acordo com métodos padrão conhecidos pelos doutos na arte. Os fragmentos de Fab’ foram ligados na coluna em 20 mM de fosfato de sódio, pH = 7,0; liberados em 0,1 M de glicina a ~pH =

2,0 e imediatamente ajustados a um pH neutro (~7,0) com um volume apropriado de 1 M de Tris-HCI a pH = 9,0 - tudo de acordo com as instruções do fabricante. Os fragmentos purificados de Fab’ foram, então, dialisados em soro regulado por fosfato ("PBS") a um pH = 7,4 (1 X PBS = 137 mM NaCI, 2,7 mM KCI, 10 mM Na2 HPO4

e 2mM de KH2PO4; note que o PBS carece de Ca^+ e Mg^+).

2.3 Teste imunoabsorvente ligado a

enzima ("ELISA")

Taligen proporcionou 3 mg de fator B 15 humano recombinante purificado. Tipicamente, 50 ng de fator B recombinante purificado foi absorvido para os poços de uma placa de microtitulação de 96 poços, ao longo de uma noite, a 4o C. A placa foi bloqueada com uma solução de 5% (w/v) de leite em pó desnatado em PBST (137 mM de NaCI1 2,7 mM de KCI, 10mM de 20 Na2HPO4, 2 mM de KH2PO4, e 0,1 % (v/v) de Tween-20™). OS

fragmentos de Fab’ humanizados purificados ou o Fab’ de referência ("TA 10") foram diluídos em 1X PBS. Cinqüenta micro litros de fragmento de anticorpos foram acrescentados a cada poço da placa de micro titulação. Após uma hora a 33° C, os poços da 25 placa de micro titulação foram rinsados três vezes com PBST. Em seguida, cinqüenta micro litros de anticorpos da cadeia κ anti humanos conjugados com peroxidase de raiz-forte ("HRP") (SigmaAldrich1 St. Louis, MO) diluídos em 0,1 ng/ml em PBST foi acrescentado a cada poço, e aplaca foi incubada por quarenta minutos a 33° C. OS poços da placa de micro titulação foram, a seguir, lavados três vezes com PBST, uma vez com 1X PBST. Então, 100 μΙ substrato de TMB (3,3’,5,5’-tetrametil-benzideno) 5 (Sigma) foi acrescentado a cada poço, e a placa foi incubada pr aproximadamente 5 minutos a temperatura ambiente (~25° C). Finalmente, as reações foram interrompidas pela adição de 100 μΙ 0,2 N ácido sulfúrico (H2SO4) a cada poço. A placa foi lida em um

espectrofotômetro a um comprimento de onda de 450 nm.

2.4 Análise de ligação de suspensão de

colônia

As bibliotecas de fragmentos de Fab’ humanizado foram testadas utilizando filtros de nitro-celulose revestidos com fator humano B recombinante, essencialmente 15 conforme descrito no Exemplo 5 da Publicação de Patente dos EUA No. US 2005/0255552 A 1, que é incorporada aqui por referência. Ver também a Publicação de Patente dos EUA No. US 2006/0134098 A 1.

Em suma, as bibliotecas de anticorpos foram 20 transformadas em uma hóspede bacteriana adequada, tal como E. coli cepa TOP 10. As células bacterianas transformadas são postas em placas contendo 2X YT ágar (16 g de digesto pancreático de caseína, 10 gramas de extrato de fermento, 5 g de NaCI e 15 g de ágar por litro) (Difco™, Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ) e um 25 agente de seleção apropriado (por exemplo: um antibiótico selecionado com base no vetor de expressão de proteína em particular usado para construir a biblioteca). A eficiência da pláca pode ser ajustada para produzir colônias bacterianas discretas, enquanto se maximiza o número de colônias por placa. Em densidade ótima, uma placa de 10 cm de diâmetro conteria -4000 colônias, uma placa de 15 cm de diâmetro conteria -10.000 colônias e uma placa de 25 cm de diâmetro conteria -50.000 colônias.

Os filtros de nitro-celulose de 8,2 cm de diâmetro, 13,2 cm de diâmetro ou de 20 cm de diâmetro (filtros de nitro-celulose BA 85 Whatman® Schleider & Schuell® Protran®) (Sigma Aldrich, St. Louis, MO) foram pré-revestidos com antígeno 10 (por exemplo: fator humano B) em PBS em uma concentração determinada empiricamente (tipicamente entre 0,5 μg/ ml e 20 μg/ ml). O volume de solução de revestimento variou em função do tamanho do filtro com 4 ml usados para os filtros de 8,2 cm de diâmetro, 8 ml usados para os filtros de 13,2 cm de diâmetro e 20 15 ml usados para os filtros de 20 cm de diâmetro. Os filtros foram colocados com a face voltada para baixo na solução de antígeno PBS, por 2-3 horas a 33° C, com agitação ocasional. Em seguida, os filtros foram enxaguados uma vez com PBS que sobrou e bloqueados com uma solução de 5% (w/v) de leite em pó desnatado 20 em PBS por 2 horas a 25° com agitação. Os filtros foram, então, drenados, enxaguados uma vez em PBS + 0,1% de Tween-20™ ("TBST") e duas vezes em meio líquido 2X YT suplementado com agente de seleção (por exemplo: um antibiótico apropriado) e indutor de transcrição (por exemplo: IPGT). Em seguida, os filtros 25 foram drenados e colocados em placas de ágar 2x YT suplementado com o antibiótico apropriado e IPTG (as "placas de expressão").

Os filtros de nitro-celulose secos, não revestidos, de tamanho adequado foram colocados com a face voltada para baixo nas placas contendo a biblioteca E. coli expressando a população desejada de fragmentos de anticorpos. No momento em que os filtros estavam visivelmente molhados (-20 - 30 segundos), eram rapidamente erguidos e colocados com a 5 -colônia voltada para cima sobre um filtro revestido em cima de uma placa de expressão. Os filtros são marcados para indicar a placa apropriada e a orientação para facilitar a identificação subsequente.

As placas de expressão cobertas com "sanduíches" de filtros de nitro-celulose foram mantidas a 33° C por 10 12 a 16 horas. Durante esse tempo, as colônias bacterianas expressaram e secretaram os fragmentos de anticorpos, os quais em seguida, se difundiram através do primeiro filtro de nitro-celulose contendo as suspensões de colônia sob o filtro revestido de antígeno abaixo. Os fragmentos de anticorpos capazes de se 15 ligaram ao antígeno alvo (por exemplo: fator humano B) ficaram ,retidos no filtro de antígeno.

Os fragmentos de anticorpos ligados aos antígenos foram detectados com métodos imunológicos. Em suma, os filtros contendo os fragmentos de anticorpos ligados aos 20 antígenos foram removidos das placas de expressão, lavados 3 vezes por cinco minutos cada em PBST e bloqueados por 1,5 hora a 25° C em uma solução de 5% de leite em pó desnatado em PBST. Os complexos de fragmento de anticorpo - antígeno ficaram retidos nos filtros e foram, em seguida, incubados com o anticorpo 25 primário apropriado (por exemplo: anticorpo anti-κ de cabra conjugado com HRP e afins) seguido, caso necessário, de um ^anticorpo secundário apropriado. Outros métodos de detecção imunológica padrão podem ser usados, inclusive biotina/ estreptavidina, bem como outros métodos de detecção, inclusive vários rótulos fluorescentes. Os filtros foram lavados 4 vezes por dez minutos cada em PBST, incubados em solução de substrato de peroxidase e expostos ao filme fotográfico sensível à luz. Alternativamente, podem ser usados vários sistemas de imagem 5 para se visualizar as colônias, tais como o Typhoon (Amersham Biosciences, GE Healthcare, Piscataway, NJ) ou o FX-ProPhosphorlmager (Biorad, Hercules, CA). Então, as imagens no filme são alinhadas com a placa adequada, e colônias positivas (por exemplo: aquelas que estão produzindo os fragmentos de 10 anticorpos capazes de se ligarem ao antígeno desejado (por exemplo: o fator humano B)) foram selecionadas, inoculadas no meio 2X YT mais agente de seleção, e também analisadas através de ciclos subsequentes de CLBA usando, substancialmente, os ‘mesmo procedimentos.

2.5 Medições de afinidade

A cinética de ligação dos fragmentos Fab’ foi analisada usando um bio-sensor Fortébio Octet (Fortébio, Inc., Menlo Park, CA). O fator humano B recombinante foi biotinilado com o sistema de biotinilação EZ-Iink (Pierce Biotechnology, 20 Rockford, IL) de acordo com as instruções do fabricante. O antígeno foi acoplado a sensores revestidos com neutravidina (FortéBio, Inc. Menlo Park, CA) de acordo com as instruções do fabricante. Em seguida, a ligação com Fab’ foi monitorada em tempo real utilizando a análise de interferometria de bio-camada e software fornecido 25 -pelo fabricante. As afinidades de ligação com antígeno foram calculadas para os fragmentos Fab’ testados com base nas constantes medidas de associação ("Kassoc") e dissociação

("Kdissoc")· Preferência, os anticorpos humanizados ou os fragmentos de anticorpos com constantes de dissociação em equilíbrio iguais ou mais elevadas que as do anticorpo de referência (por exemplo: mAb 1379) ou fragmento de anticorpo (por exemplo: TA 10).

3. Resultados

3.1 Clonagem e expressão das regiões V a partir do hibridoma produzindo mAb 1379

3.1.1 Amplificação da cadeia VH e VK a partir da primeira fileira de cDNA

As regiões variáveis da cadeia leve do

,anticorpo (κ isoforme) e da cadeia pesada foram amplificadas a partir da primeira fileira de cDNA usando quinze conjuntos de segmento complementar Vh e dezoito Vk . Cada conjunto de

segmento Vh continha um dos quinze segmentos degenerados

frontais específicos para as famílias conhecidas de cadeia pesada murina em par com um segmento reverso adequado específico para um domínio constante de uma das quatro isoformas murinas comuns da cadeia pesada γ (por exemplo: a isoforma murina γ^).

Ver por exemplo, Chardès et al., FEBS Lett. 452 (3): 386-394 (1999). Cada conjunto de segmento Vk continha um de dezoito

segmentos degenerados frontais específicos para as famílias conhecidas de murina κ em par com um segmento reverso específico para um domínio constante da isoforma κ da cadeia leve murina. Ver por exemplo, Chardès et al., FEBS Lett. 452 (3): 386- 394(1999).

Dois conjuntos de segmentos produziram produtos PCR para a cadeia pesada e dois conjuntos de segmentos produziram produtos de PCR para a cadeia leve. Embora os segmentos degenerados frontais fossem desenhados para hibridizar as seqüências de sinal relativamente conservadas de cada família de cadeia murina leve e pesada, nem todo par de segmentos amplifica o produto esperado, pois as seqüências de sinal da linha germinal variam. Além do mais, os Ioci de imunoglobulina frequentemente contêm pseudogenes que podem produzir um produto do tamanho esperado, mas que, por outro lado, não codificam a estrutura de leitura aberta prevista como foi o caso 'do produto produzido pelo par de segmentos Vk 10 (veja parágrafo abaixo). A Figura 1 é um gel de agarose manchado com brometo de etídio para mostrar os produtos de fileira dupla de cDNA amplificados a partir da primeira fileira de cDNA do mRNA isolado do hibridoma produzindo mAb 1379. Os pares de segmento Vk 4 (SEQ ID NO: 1 (segmento frontal) e SEQ ID NO: 2 (segmento reverso)) e Vk 10 (SEQ ID NO: 3 (segmento frontal) e SEQ ID NO:

4 (segmento reverso)) produziram produtos do tamanho esperado da cadeia leve de anticorpo. Os pares de segmento VH6 (SEQ ID

NO: 5 (segmento frontal) e SEQ ID NO: 6 (segmento reverso)) e V|_j7 (SEQ ID NO: 7 (segmento frontal) e SEQ ID NO: 8 (segmento

reverso)) produziram produtos do tamanho esperado da cadeia pesada de anticorpo.

3.1.2.Seauências de aminoácidos da região

V murina

Os clones Vh e Vk cDNA obtidos conforme

descrito nos dois últimos parágrafos acima, forma sequenciados mediante métodos padrão para verificar que os produtos corretos fossem obtidos. As seqüências de região V obtidas estão retratadas na Figura 2. As seqüências de CDR estão sublinhadas. Dois resíduos de glutamina que diferem da seqüência de linha germinal murina correspondente ao mAb 1379 original estão mostrados em cinza claro. Os produtos obtidos com os conjuntos de segmento V|_|6 (SEQ ID NO: 10) e VH7 (SEQ ID NO: 11) eram idênticos em

seqüência de aminoácido. O produto Vk 10 foi amplificado a partir de cDNA contendo um rearranjo ou frameshift que interrompeu a estrutura de leitura aberta da proteína, e que, portanto, não é mostrado. O produto Vk 4 (SEQ ID NO: 9) contém a esperada leitura aberta da proteína. Um dos clones Vh murinos selecionados

foi anexado, em seguida, à região IgG^ Ch-j humana, e o clone VK4

murino foi anexado à região Ck humana para fazer a referência

Fab’ (por exemplo: TA 10). As variantes Fab’ humanizadas também compreenderam seqüências da região constante humana.

3.1.3 Comparação entre a região V clonada e as seguências de aminoácidos amino-terminais proporcionada por Taligen

As seqüências de aminoácidos aminoterminais de mAb 1379 foram, então, comparadas com a mesma porção das seqüências clonadas Vh e VK. A Figura 3 mostra as

porções alinhadas das seqüências, primeiro da cadeia Vh (no topo,

compare Ί379Η" (SEQ ID NO: 31) com "TA- VH6" (SEQ ID NO:

33)), em seguida, da cadeia Vh e Vk (abaixo, compare "1379L"

(SEQ ID NO: 32) com "TA- VK4" (SEQ ID NO: 34)). As seqüências

amino-terminais de mAb 1379 e as seqüências clonadas eram idênticas, exceto por quatro resíduos (mostrados em cinza claro). Essas diferenças resultaram de erros introduzidos durante a reação de degradação Edman usada para se obter as seqüências de peptídeos amino-terminais de mAb 1379.

3.1.4.Confirmacão da atividade Iiqante de fator B das regiões V clonadas através de ELISA

A seguir, a habilidade das seqüências Vh e

Vk clonadas para se ligarem ao fator B foram analisadas. As

regiões Vh e Vk clonadas foram expressas em bactéria como

fragmentos Fab’, purificados e testados para ligação ao fato B em uma diluição ELISA. A Figura 4 compara a ligação ao fator B clonado com a do Fab’ TA 003 derivado do mAb 1379. Conforme 10 esperado, tanto o Fab’ clonado e o Fab’ murino produziram curvas de ligação que foram dependentes tanto da concentração de anticorpos como da de antígenos.

3.2 A Humanizacão das regiões V do mAb

1379

3.2.1 Construção da biblioteca e cassetes da

região V

As bibliotecas voltadas ao epitope foram construídas mediante a ligação de seqüências da biblioteca do segmento V humano (isoladas a partir do baço) com a região 20 CDR3-FR4 exclusiva contendo BSD e seqüências de segmento J da linha germinal humana. Essas bibliotecas "completas" foram usadas como base para a construção de bibliotecas "cassete", nas quais apenas parte do segmento V murino é inicialmente substituída por uma biblioteca de seqüências humanas. Os cassetes tanto para 25 as cadeias VH, como para Vk, foram feitos por ponte PCR com

seqüências em comum superpostas dentro da região FR2. Desta forma, as bibliotecas cassete humanas da "extremidade frontal" e "do meio" foram construídas para os isotipos humanos VH1, VH3 e Vk IV. Tipicamente, cerca de 10.000 clones Fab’ únicos são

analisados entre as bibliotecas cassete humanas da "extremidade frontal" e do "meio" para se identificar um pool de fragmentos de anticorpos candidatos que se liguem ao antígeno desejado (por 5 exemplo: o fator humano B) com uma afinidade de ligação superior, ou pelo menos igual a da afinidade de ligação de um anticorpo de referência ou fragmento de anticorpo (por exemplo: mAb 1379 ou TA 10).

Os cassetes humanos da "extremidade frontal" e do "meio" que suportaram a ligação com o fator B foram identificados por análise de suspensão de colônia e classificadas de acordo com a afinidade nas análises ELISA e FortéBio. As análises 'de ligação de suspensão de colônia foram levadas a cabo conforme se descreveu acima, essencialmente, como no Exemplo 5 da Publicação de Patente dos EUA No. US 2005/0255552 A 1, a qual se encontra incorporada aqui para referência. Os pools de "cassetes" com afinidade mais elevada (com afinidade de ligação ao antígeno preferivelmente igual ou superior a do TA 10 - o Fab’ de referência derivado do mAb 1379) foram, então, recombinados através das seqüências FR2 comuns em uma segunda análise de biblioteca para gerar segmentos V completamente humanos.

Após a identificação de um pool de fragmentos Fab’ completamente humanizados, de elevada -afinidade, foram construídas bibliotecas de maturação de afinidade. 25 As seqüências BSD comuns de um painel de clones Fab’ humanizados foram mutadas aleatoriamente usando segmentos PCR degenerados para gerar as bibliotecas.

Estas bibliotecas mutagênicas foram analisadas através da análise ligação de suspensão de colônia. Os fragmentos Fab’ selecionados foram classificados em função da afinidade de ligação com análise ELISA e FortéBio.

Foram identificadas as mutações que suportavam uma afinidade de ligação ao antígeno igual ou melhor por comparação, que a do fragmento Fab’ TA 10 de referência.

Em alguns casos, o processo de humanização resulta no isolamento de um pool de fragmentos Fab” completamente humanizados com as mesmas afinidades de ligação - ou muito similares - para o antígeno alvo.

Em alguns casos, o pool de fragmentos Fab’ é sequenciado e comparado com as seqüências da região Vh e V|_

(por exemplo: VK) da linha germinal humana, e os fragmentos de

anticorpos com o grau mais elevado de identidade da seqüência de aminoácidos com a linha germinal humana são selecionados para análise posterior.

Quanto mais alto for o grau de identidade da seqüência de aminoácidos com a seqüência da linha germinal humana, menos imunogênico será um anticorpo ou fragmento de 20 anticorpo humanizado e, desta forma, menos propenso será para provocar uma reação imune ou inflamatória, ou aumentar uma reação imune ou inflamatória já existente.

Pela razão de as variantes humanizadas de mAb 1379 poderem ser usadas para tratar condições nas quais 25 uma resposta imune ou inflamatória já foi desencadeada (por exemplo: condições nas quais a ativação do circuito do complemento alternativo desempenha um papel importante, tal como hiper responsividade das vias aéreas e afins)), é essencial que a imunogenecidade das variantes humanizadas seja reduzida tanto quanto possível.

Mais adiante, em virtude da administração de proteínas dentro dos pulmões (por exemplo: por inalação conforme 5 se aventa aqui) ser mais propensa a induzir uma resposta imune do que outras vias de administração, é ainda mais importante que as variantes de anti-fator B humanizadas sejam minimamente imunogênicas.

Assim, é desejável isolar variantes humanizadas com o mais elevado grau possível de identidade da seqüência de aminoácido com as seqüências mais próximas da linha germinal humana (para variantes derivadas de mAb 1379, as seqüências mais próximas da linha germinal humana são VkIV

B3/JK2 (SEQ ID NO: 12) e VH1-02/JH4 (SEQ ID NO: 13)). De

preferência, as variantes humanizadas têm seqüências de aminoácidos da região Vh e VK_80% idênticas, no mínimo, com as

seqüências de aminoácidos da região Vh e Vk da linha germinal

humana mais próxima, mais preferivelmente pelo menos 85% idênticas às seqüências de aminoácidos da região Vh e Vk da linha

germinal humana mais próxima, ainda mais preferivelmente pelo menos 90% idênticas às seqüências de aminoácidos da região Vh

e Vk da linha germinal humana mais próxima e, ainda, mais

preferivelmente pelo menos 95% idênticas às seqüências de aminoácidos da região Vh e Vk da linha germinal humana mais

próxima.

De preferência, uma variante de anticorpo humanizado terá uma afinidade de ligação igual ou maior que a do fragmento de anticorpo ou anticorpo de referência e compreenderia, ademais, as regiões Vh e Vk que tenham seqüências de

aminoácidos 80% idênticas à seqüência da linha germinal humana mais próxima, 85% idênticas à seqüência da linha germinal humana

mais próxima, 90% idênticas à seqüência da linha germinal humana mais próxima, ou 95% idênticas à seqüência da linha germinal humana mais próxima. Contudo, nem sempre é possível humanizar variantes de fragmentos de anticorpos ou anticorpos que compartilhem ambas características acima.

3.2.2.A afinidade de ligação dos fragmentos

Fab’ para o fator humano B usando a análise de FortéBio Octet

Foram isolados fragmentos Fab’ totalmente humanizados através de análises de ligação de suspensão de colônias e confirmados como Iigantes de fator B pela ELISA.

Os fragmentos Fab’ humanizados

apresentando fortes sinais positivos por ELISA foram purificados e, 'em seguida, caracterizados em comparação com o fragmento Fab’ TA 10 de referência, o qual tem seqüências da região V murina do mAb 1379.

A cinética de ligação do fragmento Fab’ com

o fator humano B recombinante foi analisada com o sistema FortéBio Octet pela interferometria de bio-camada, proporcionando monitoramento em tempo real, livre de rotulação, das interações proteína - proteína.

São mostradas, na Figura 5, análises

cinéticas representativas. As constantes medidas de associação ("Kassoc") e dissociação ("KcJjssoc") e as constantes calculadas de

"dissociação de equilíbrio (KD = Kdissoc / Kassoc) (por exemplo: afinidade de ligação) são mostradas na Tabela 1.

Tabela 1. Análise cinética de anticorpos humanizados comparados a um anticorpo de referência.

5

10

Claramente, todos os três fragmentos de anticorpos humanizados têm constantes de dissociação de equilíbrio iguais ou melhores que o fragmento de anticorpo TA 10 de referência.

3.3 Análise de fragmentos Fab’

humanizados

3.3.1 Alinhamento de seqüências de

aminoácidos Fab’ humanizados e de referência

Depois da caracterização cinética, os três isolados de anticorpos humanizados foram sequenciados. As seqüências de aminoácido derivadas das seqüências da região V|_]_

e Vk de isolados de anticorpos TA 101-1 (SEQ ID NOS: 16 e 17),

TA 102-4 (SEQ ID NOS: 18 e 19) e TA 103-2 (SEQ ID NOS: 20 e 21) foram comparadas com as seqüências correspondentes do anticorpo TA 10 (SEQ ID NOS: 14 e 15) de referência e dos

ID de Rastreamento TA 102-4 TA 103-2 TA 10 TA 101 -1 (Referência) Concentração (M) r*- 1 x IO'7 1 x IO'7 1 x 10-7 I O X dissoc 4,37 x 10'3 2,80 x 10'3 2,96 x 10'3 2,33 x 10"3 (1/seg) K 1,03 x 10"4 1,29 x 10‘4 1,07 x 10'4 1,27 x 10'4 dissoc (erro) K 8,10 x 10'5 7,50 x 10'5 4,52 x 10'5 5,14 x 10"5 assoc (1/ (M-seg)) Kd (M) 5,40 x 10'9 3,73 x 10'9 6,55 x 10'9 4,53 x 10'9 .domínios de genes variáveis ("gene VK" e "V|_|") da cadeia leve e

pesada da linha germinal humana mais próxima, e dos segmentos Iigantes ("segmento J") (VKIV - B3 / JK2 humano (SEQ ID NO: 12) e

(VH1 - 02 / J|_j4 (SEQ ID NO: 13)). Na Figura 6, seqüências

alinhadas são mostradas. As seqüências CDR1, CDR2 e CDR3 são consequentemente encaixotadas e rotuladas . Os resíduos de aminoácidos que diferem da posição da linha germinal correspondente (excluindo a seqüência BSD CDR3) estão indicados em cinza. As mudanças de maturação de afinidade para as 10 seqüências de aminoácidos CDR3 de variantes humanizadas TA

101-1, TA 102-4 e TA 103-2 estão indicadas em cinza e mostradas em negrito.

Em certas configurações, as seqüências da região Vh de TA 101-1 (SEQ ID NO: 35), TA 102-4 (SEQ ID NO:

36) e TA 103-2 (SEQ ID NO: 37) são modificadas para substituir o resíduo de glutamina amino-terminal (Q) das variantes anti-fator B humanizado com um resíduo de ácido glutâmico (E) conforme encontrado no anticorpo de referência (TA 10) e no mAb 1379 original. Esta mudança previne a ciclização do resíduo de glutamina 20 (Q) e promove um produto final mais uniforme ao se manufaturar as variantes humanizadas. Embora o gene da linha germinal humana mais próxima (VH1 -02 / JH4 (SEQ ID NO: 13)) também tenha

resíduo de glutamina (Q) em seu terminal amino, esta substituição de aminoácido conservadora tem, possivelmente, um impacto mínimo na imunogenecidade das variantes.

3.3.2 Identidade percentual com as seqüências da linha germinal humana

Finalmente, as seqüências de aminoácidos da região VH e da região VKderivadas dos isolados TA 101-1, TA

102-4 e TA 103-2 e o anticorpo de referência TA 10 foram comparados com uma única seqüência de anticorpo da linha germinal humana ao longo da região V, excluindo as seqüências CDR3 BSD. A Tabela 2 mostra o percentual de identidade de aminoácido de cada um com a seqüência da linha germinal.

Clone V %de identidade Vh % de identidade % Total de K (alinhada a 1-02) identidade ao longo (alinhada a VJ V) da região V (Exceto CDR3) TA 10 referência 70,4% 84,9% 77,7% TA 101-1 96,2% 96,3% 96,25% TA 102-4 97,1% 96,3% 96,7% TA 103-2 95,3% 96,3% 95,8% Claramente, as regiões VH e Vk de todos os

três fragmentos Fab’ humanizados compartilham uma elevada identidade de seqüência de aminoácido com a seqüência da linha germinal humana com percentuais de identidade de cerca de 96% comparados a 78% para o fragmento Fab’ de referência, TA 10.

4. Discussão

A substituição de cassete foi usada com sucesso para a humanização de mAb 1379. Cassetes parciais da região V, isolados a partir de uma biblioteca humana foram recombinados para formar as regiões V humanas alteradas finais para cada uma das cadeias leves e pesadas.

As seqüências de aminoácidos das regiões V %

dos clones de fragmento Fab’ são fornecidas acima. As seqüências do segmento V foram isoladas pela recombinação de dois cassetes Vh e dois cassetes Vk para cada fragmento Fab’ (um cassete da

"extremidade frontal" e um "do meio" para cada um dos polipeptídios Vh e VK). A análise cinética usando bio-sensor

FortéBio Octet identificou três fragmentos Fab’ (TA 101-1, TA 102-4 e TA 103-2) com afinidades de ligação mais elevadas do que o .fragmento Fab’ de referência. Esta afinidade de ligação aumentada resultou de uma constante de dissociação melhorada nas três variantes humanizadas (por exemplo: TA 101-1, TA 102-4 e TA 10 103-2) quando comparadas com a molécula de referência. Desta forma, também pode ser desejável selecionar variantes com base em constantes de dissociação aumentadas (Kassoc) e/ ou

afinidades de ligação aumentadas, bem como % de identidade de seqüência de aminoácido entre os polipeptídios Vh e Vk e as

seqüências Vh e Vk da linha germinal humana mais próxima.

Cada um dos três clones de fragmento Fab’ possui uma região variável de cadeia pesada (Vh) com um elevado

grau de identidade de seqüência de aminoácido com o gene VH1-

02 da linha germinal humana. O segmento FRH4 é proporcionado

pela seqüência JH4 da linha germinal humana.

A seqüência leve dos segmentos V são as mais próximas ao gene VKIV-B3 da linha germinal. O mesmo FR^_4

é proporcionado pelo segmento JK2 da linha germinal humana. O

fragmento Fab’ humanizado das regiões Vh e V|_ apresentam mais

de 96% de identidade de seqüência de aminoácidos com os cassetes de seqüência da linha germinal humana correspondente mais próxima fora das regiões CDR3 únicas.

5. Formulações, composições e métodos relativos a certas configurações da invenção

Um aspecto da presente invenção 5 geralmente se relaciona com as composições e métodos para se inibir, seletivamente, a ativação do circuito de complemento alternativo em um animal que tem, ou está sob o risco de desenvolver, uma condição ou doença na qual a ativação do circuito de complemento alternativo contribua para a condição ou doença, 10 exacerbe pelo menos um sintoma da condição ou doença, ou cause a condição ou doença.

5.1 Métodos relativos a certas configurações da invenção

Certas configurações da presente invenção 15 se relacionam a métodos para se tratar doenças e distúrbios nos quais a ativação do circuito de complemento alternativo desempenhe um papel importante. Tais métodos envolvem administrar uma variante humanizada de mAb 1379 conforme descrito acima, tal como TA 101-1, TA 102-4 e TA 103-2, ou 20 fragmentos Iigantes a antígeno derivados em um indivíduo que tenha ou esteja sob risco de desenvolver uma doença, na qual a ativação do circuito de complemento alternativo desempenhe um papel importante. Em um aspecto, as variantes de anticorpos humanizados e de fragmentos Iigantes de antígeno derivados são 25 administrados por uma via selecionada a partir do grupo que engloba as rotas nasal, oral, tópica, inalada, intra-traqueal, transdérmica, retal e parenteral. Em um outro aspecto, as variantes de anticorpos humanizados e os fragmentos Iigantes de antígeno derivados são administrados com um veículo farmaceuticamente aceitável escolhido a partir de um grupo compreendendo: um pó dispersível, seco; etanol anidro; pequenas cápsulas; lipossomos; -um spray nebulizado e um excipiente injetável. Em um outro aspecto, as variantes humanizadas e os fragmentos Iigantes de 5 antígeno derivados são administrados em um veículo ou instrumento selecionado a partir do grupo compreendendo: etanol anidro; um sistema de inalação de pó seco; um sistema de inalação ultra-sônica; um inalador pressurizado com doses medidas e um instrumento de solução medida. E um outro aspecto, as variantes 10 de anticorpos humanizados e os fragmentos Iigantes de antígeno derivados são administrados em uma quantidade efetiva para tratar a doença ou distúrbio na qual a ativação do circuito do complemento alternativo desempenhe um papel importante. Ainda .em outros aspectos, as variantes de anticorpos humanizados e os 15 fragmentos Iigantes de antígeno derivados são administrados sozinhos, ou em combinação com um outro agente selecionado a partir do grupo consistente de: corticosteróides, agonistas-β (de ação longa ou curta), modificadores de leucotrieno, antihistamínicos, inibidores de fosfodiesterase, cromoglicato sódico, 20 Nedocromil, teofilina, antagonistas da citocina, antagonistas do receptor da citocina, anti-IgE e inibidores da função celular T.

Ainda, outras configurações da presente invenção se relacionam a um método para se reduzir ou prevenir hiper-responsividade das vias aéreas (HRVA) ou inflamação das 25 vias aéreas de um indivíduo. O método inclui o passo de se administrar uma variante humanizada de mAb 1379 conforme descrito acima, tal como TA 101-1, TA 102-4 e TA 103-2, ou fragmentos Iigantes de antígeno derivado em um indivíduo que tenha ou esteja sob risco de desenvolver hiper- responsividade das ’vias aéreas associada com inflamação ou inflamação das vias aéreas. Em um aspecto, a variante humanizada de mAb 1379 ou o fragmento Iigante de antígeno derivado é administrada por uma via selecionada a partir do grupo compreendendo as vias: oral, nasal, 5 tópica, inalada, intra-traqueal, transdérmica, retal e parenteral. Em um outro aspecto, as variantes humanizadas de mAb 1379 ou o fragmento Iigante de antígeno derivado é administrado ao animal em uma quantidade efetiva para reduzir, mensuravelmente, a hiperresponsividade das vias aéreas no indivíduo em comparação com 10 antes da administração do anticorpo ou do fragmento Iigante de antígeno. Em um outro aspecto, a variante humanizada de mAb *1379 ou fragmento Iigante de antígeno derivado é administrada ao indivíduo em uma quantidade efetiva para se reduzir, mensuravelmente, a hiper-responsividade das vias aéreas no 15 indivíduo em comparação com um nível de hiper-responsividade das vias aéreas em uma população de indivíduos pacientes de inflamação onde o anticorpo ou fragmento Iigante de antígeno não foi administrado. Em um outro aspecto, a variante humanizada de mAb 1379 ou fragmento Iigante de antígeno derivado é 20 administrada com um veículo farmaceuticamente aceitável selecionado a partir do grupo compreendendo: um pó, dispersível seco; etanol anidro; pequenas cápsulas; lipossomos; um spray -nebulizado; e um excipiente injetável. Em um outro aspecto, a variante humanizada de mAb 1379 ou fragmento Iigante de 25 antígeno derivado é administrada em um veículo ou instrumento seccionado a partir do grupo compreendendo: etanol anidro; um sistema de inalação de pó seco; um sistema de inalação ultrasônica; um inalador pressurizado com doses medidas; e um instrumento de solução medida. Ainda, sob um outro aspecto, a variante humanizada de mAb 1379 ou fragmento Iigante de antígeno derivado é administrada em um indivíduo em conjunto com um agente selecionado a partir do grupo consistente de: 5 corticosteróides, agonistas-β (de ação longa ou curta), modificadores de leucotrieno, anti-histamínicos, inibidores de fosfodiesterase, cromoglicato sódico, Nedocromii, teofilina, antagonistas da citocina, antagonistas do receptor da citocina, antiIgE e inibidores da função celular T. Ainda em um outro aspecto, a 10 hiper-responsividade das vias aéreas ou inflamação das vias aéreas está associada a uma doença selecionada a partir do grupo composto de asma, doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC), aspergilose bronco-pulmonar alérgica, pneumonia de hipersensibilidade, pneumonia eosinofílica, enfisema, bronquite, 15 bronquiectasia de bronquite alérgica, fibrose cística, tuberculose, pneumonite de hiper-sensibilidade, asma ocupacional, sarcóide, síndrome da disfunção reativa das vias aéreas, doença pulmonar intersticial, síndrome hiper-eosinofílica, rinite, sinusite, asma induzida por exercício, asma induzida por poluição, asma variante 20 com tosse, pneumopatia parasitária, infecção por vírus sincicial respiratório (VSR), infecção por vírus parainfluenza (PIV), infecção por rinovírus (RV) e infecção por adenovírus. Em um aspecto, a hiper-responsividade das vias aéreas está associada com inflamação alérgica. O método da presente invenção pode ser 25 administrado em uma configuração preferida em mamíferos e, mais preferivelmente, em humanos.

Uma outra configuração da presente invenção se relaciona a um método para reduzir ou prevenir a hiperresponsividade das vias aéreas (HRVA) ou a inflamação das vias aéreas em um indivíduo. O método inclui o passo de se administrar um reagente que iniba, seletivamente, o circuito de complemento alternativo para um indivíduo que tenha ou esteja sob o risco de desenvolver hiper-responsividade das vias aéreas associada com 5 inflamação ou inflamação das vias aéreas. Em certos aspectos, o reagente é uma variante humanizada do mAb 1379, tal como TA .101-1, TA 102-4 e TA 103-2 ou fragmentos Iigantes de antígeno derivados.

5.2 Formulações ou composições relativas a certas configurações da invenção

Certas configurações das variantes de anticorpos anti-fator B humanizados da presente invenção incluem uma formulação ou composição compreendendo um inibidor do circuito de complemento alternativo e, particularmente, um inibidor 15 do circuito de complemento alternativo conforme descrito aqui. As formulações e composições podem ser usadas em quaisquer dos métodos descritos aqui e com quaisquer dos reagentes descritos aqui (por exemplo: as variantes de anticorpos do fator B humanizadas TA 101-1, TA 102-4 e TA 103-2 ou fragmentos 20 Iigantes de antígeno derivados conforme descrito aqui). Em uma configuração, a composição é útil para reduzir ou prevenir a hiperresponsividade das vias aéreas em um animal. Em outra configuração, a composição é útil para reduzir ou prevenir a lesão por reperfusão - isquemia em um animal. Ainda, em outra 25 configuração, a composição é útil para tratar ou prevenir uma condição ou doença pela inibição seletiva do circuito de complemento alternativo. A formulação compreende: (a) um inibidor do circuito de complemento alternativo conforme descrito aqui, e (b) um veículo farmaceuticamente aceitável. Em uma outra configuração, a formulação ou composição pode incluir um ou mais agentes adicionais, tais como um agente anti-inflamatório adequado para reduzir a inflamação em um animal que tem ou que esteja sob o risco de desenvolver hiper - ‘ 5 "responsividade das vias aéreas e, em particular, hiperresponsividade das vias aéreas associada com inflamação. O agente anti-inflamatório pode ser qualquer agente anti-inflamatório adequado para o uso em reduzir a inflamação em um paciente que tenha uma condição inflamatória associada com a hiper10 responsividade das vias aéreas, incluindo, mas não de forma límitante: corticosteróides (orais, inalados ou injetados), agonistas-β (de ação longa ou curta), modificadores de Ieucotrieno (inibidores ou antagonistas de receptores), citocina ou antagonistas do receptor da citocina, anticorpos anti IgE, inibidores de 15 fosfodiesterase, cromoglicato sódico, nedocromil, teofilina e -inibidores da função T celular. Os agentes anti-inflamatórios particularmente preferidos para uso na presente formulação incluem corticosteróides, modificadores de Ieucotrieno e citocina ou antagonistas do receptor da citocina.

Em uma outra configuração, a formulação ou

·*. ■

composição pode incluir um ou mais agentes adicionais, tal como um agente adicional adequado para prevenir ou reduzir a lesão por reperfusão - isquemia em um animal. Tais agentes incluem, mas não se limitam a, agentes anti-inflamatórios; ou inibidores de oxidação e dano de radicais livres.

Em uma outra configuração, a formulação ou .composição pode incluir um ou mais agentes adicionais, tal como um agente adicional adequado para o tratamento de uma outra doença ou condição associada com a ativação do circuito de complemento alternativo.

De acordo com a presente invenção, um "veículo farmaceuticamente aceitável" inclui excipientes farmaceuticamente aceitáveis e/ ou veículos de liberação 5 farmaceuticamente aceitáveis, os quais são adequados para uso na administração de uma formulação ou composição em um local adequado in vivo. Um local adequado in vivo é, de preferência, qualquer local onde o circuito de complemento alternativo possa ser inibido. Em uma configuração preferida, onde o paciente tenha ou 10 esteja sob risco de desenvolver hiper-responsividade das vias aéreas e/ ou inflamação das vias aéreas, um local in vivo adequado se encontra, de preferência, no tecido pulmonar ou nas vias aéreas. Outros locais in vivo preferidos incluem outros tecidos ou órgãos onde as condições associadas ao circuito de complemento 15 alternativo possam estar centradas. Em uma outra configuração preferida, um local in vivo adequado é qualquer local onde ocorra lesão por reperfusão - isquemia, tal como no coração ou no sistema pulmonar, no sistema nervoso central, membros ou dedos, órgãos internos (por exemplo: pulmão, fígado ou intestinos), ou em 20 qualquer tecido ou órgão transplantado. Os veículos farmaceuticamente aceitáveis preferidos são capazes de manter um agente usado em uma formulação da invenção numa forma que, na chegada do agente no local alvo, em um paciente, o agente seja capaz de agir sobre seu alvo (por exemplo: uma proteína que seja 25 um componente do circuito de complemento alternativo), resultando, de preferência, em um benefício terapêutico para o paciente.

Excipientes adequados para uso na presente invenção incluem excipientes ou formulários que transportam ou ajudam a transportar, mas não direcionam uma composição específica para uma célula ou tecido (também chamados aqui de veículos não direcionadores). Exemplos de excipientes farmaceuticamente aceitáveis incluem, mas não se limitam a, água, 5 soro com pH regulado por fosfato (PBS)1 solução de Ringer, solução de dextrose, soluções que contêm soro, Solução salina Balanceada de Hank (HBSS), e demais soluções aquosas fisiologicamente balanceadas, óleos, ésteres e glicóis. Os veículos aquosos podem conter substâncias auxiliares adequadas 10 necessárias para aproximar as condições fisiológicas do recipiente, ..por exemplo, aumentando a estabilidade química e isotonicidade. Substâncias auxiliares adequadas incluem, por exemplo, acetato de sódio, cloreto de sódio, Iactato sódico, cloreto de potássio, cloreto de cálcio e demais substâncias usadas para se produzir regulador 15 de fosfato, regulador Tris e regulador de bicarbonato. Substâncias auxiliares também podem incluir conservantes, tais como timerosal, e m- ou o-cresol, formalina e álcool benzil. As formulações da presente invenção podem ser esterilizadas por métodos convencionais e l ou liofilizadas.

Um tipo de veículo farmaceuticamente

aceitável inclui uma formulação de liberação controlada que seja capaz de liberar lentamente uma composição da presente invenção em um animal. Conforme usado aqui, uma formulação de liberação controlada compreende um agente da presente invenção em um 25 veículo de liberação controlada. Os veículos de liberação controlada incluem, mas não estão limitados a, polímeros bio-compatíveis, demais matrizes poliméricas, cápsulas, micro cápsulas, micro partículas, preparados de bolo, bombas osmóticas, aparelhos de difusão, lipossomos, liposferas, e sistemas de administração transdérmica. Outros veículos adequados incluem qualquer veículo que possa ser ligado ou incorporado com o agente e que estenda a meia vida do agente a ser liberado. Tal veículo inclui qualquer veículo de proteína adequado ou, mesmo, um segmento de fusão que estenda a meia vida de uma proteína ao ser liberada in vivo. Os veículos de liberação adequados foram descritos anteriormente aqui e inciuem, embora não de forma iimitadora, lipossomos, vetores virais e demais veículos, inclusive ribozimas. Veículos de liberação contendo lipídios naturais incluem células e membranas celulares. Veículos contendo lipídios artificiais incluem lipossomos e micelas. Como foi discutido acima, um veículo de liberação da presente invenção pode ser modificado para se dirigir a um local específico em um paciente, direcionando e fazendo uso desta forma de um agente inibidor nesse local. Modificações adequadas incluem a manipulação da fórmula química da porção de lipídio do veículo e/ ou introduzir, no veículo, um agente direcionador capaz de dirigir, especificamente, um veículo até um local preferido por exemplo, um tipo preferido de célula. Outros veículos adequados incluem partículas de ouro conjugados de poli-L-lisina DNA molecular, e "cromossomos artificiais.

Em uma configuração, um agente útil nos presentes métodos é administrado em uma formulação adequada para liberação pulmonar ou nasal e, particularmente, em aerossol, também chamado aqui de formulação aerossolizada. Tal via de 25 administração é particularmente útil no método para prevenir ou inibir a HRVA e/ ou inflamação das vias aéreas em um paciente, mas pode ser usada em outras condições onde é desejado a administração nos pulmões ou nas via aéreas. Além do mais, estas formulações são particularmente úteis para a liberação de anticorpos. Tal formulação geralmente inclui um veículo e, de preferência, um veículo farmaceuticamente aceitável. Veículos que são particularmente úteis para administração por aerossol de acordo com a presente invenção incluem, mas não de forma 5 Iimitante a, etanol anidro; pós dispersíveis, secos; pequenas cápsulas (por exemplo: micro cápsulas ou micro partículas); lipossomos; excipientes injetáveis; e um sprays nebulizados. O etanol anidro para a liberação de proteínas e peptídeos é descrito, por exemplo, em Choi et al., Proc. Nat’l Acad. Sei. USA 98 (20): 10 11103-11107 (2001). Pós dispersíveis, secos adequados para a liberação aerolisada de agentes estão descritos em detalhe, por exemplo, na Patente dos EUA No. 6,165,463, incorporada aqui na íntegra para referência (Ver também produtos de Inhale Therapeutic Systems, Inc., agora Nektar e Quadrant Technology). Os 15 lipossomos adequados para uso em aerossóis incluem qualquer Iipossomo e, particularmente, qualquer Iipossomo que seja suficientemente pequeno para ser administrado por aerossol no método da invenção. Micro cápsulas e micro partículas são conhecidas na técnica. Por exemplo: Alliance Pharmaceutical 20 Corporation possui uma tecnologia de engenharia de partículas chamada PuImoSphere, na qual as micro partículas são preparadas por um processos registrado de spray a seco e são desenhadas para ser tanto ocas como porosas. Um produto da Ventolin consiste em partículas (de base livre) de albuterol micronizado suspensas 25 em uma mistura de propelentes baseados em CFC. HFA proventil contém sulfato de albuterol micronizado e um baixo percentual de um co-solvente de um etanol para solubilizar o surfactante ácido oléico estabilizante. A incorporação de drogas nos lipossomos tem várias vantagens para administração em aerossol. Como os lipossomos são relativamente insolúveis, o tempo de retenção de algumas drogas no pulmão pode ser prolongado para o aumento da eficácia. Os lipossomos também são tomados primariamente por -células fagocíticas que os tornam particularmente adequados para a 5 administração de certas drogas. Os aparelhos para a administração de formulações aerolisadas incluem, mas de forma limitante, inaladores pressurizados com dose medida (MDI), inaladores de pó seco (PDI), aparelhos de solução medida (MSI) e inaladores ultrasônicos, e incluem aparelhos que sejam nebulizadores e inaladores. 10 Vários agentes podem ser usados em formulações administradas por meio de tais instrumentos como auxiliares de suspensão e solubilizadores que são particularmente úteis para a administração de proteínas (por exemplo: ácido oligolático, ácidos acil-amida, e MPEGS monofuncionalizados; ver por exemplo: McKenzie e Oliver; 15 »2000, Formulando Proteínas Terapêuticas e Peptídeos em Inaladores Pressurizados de Dose Medida para Administração Pulmonar, 3M Health Care Ltd., Morley Street, Loughborough, Leicesteshire LE11 1 EP, UK (Reino Unido)).

Um veículo farmaceuticamente aceitável que 20 seja capaz de direcionar é chamado, aqui, de "veículo de administração direcionador". Os veículos de administração direcionadores da presente invenção são capazes de entregar uma formulação, inclusive um agente inibidor, em um local alvo em um paciente. Um "local alvo" se refere a um local em um paciente, no . 25 qual se quer fazer chegar uma formulação terapêutica. Por exemplo, um local alvo pode ser qualquer célula ou tecido que seja alvo de um anticorpo da presente invenção, seja por injeção direta, seja por entrega usando lipossomos, vetores virais ou outros veículos de liberação, inclusive ribozimas. Um veículo de entrega ou anticorpo da presente invenção pode ser modificado para fazer alvo em um local em particular em um animal, direcionando e fazendo uso de um composto em particular, anticorpo, proteína, ou molécula de ácido nucléico no local. As modificações adequadas incluem 5 manipular a fórmula química da porção lipídica de um veículo e/ ou introduzir no veículo um composto capaz de direcionar,

■ especificamente, um veículo até um local preferido, por exemplo, um tipo de tecido ou célula preferida. Especificamente, direcionar se refere a fazer com que um veículo se ligue a uma célula em 10 particular pela interação do composto no veículo com uma molécula na superfície da célula. Os compostos direcionadores adequados incluem Iigantes capazes de seletividade (por exemplo: 'especificamente) ligando-se a uma outra molécula em um local em particular. Exemplos de tais Iigantes incluem anticorpos, antígenos, 15 receptores e Iigantes de receptores.

Exemplos particularmente úteis incluem quaisquer Iigantes associados com o circuito complementar (por exemplo, CR2, C3, C3d, C3dg, iC3b, C3b) ou quaisquer Iigantes associados com tipo de célula, tipo de tecido ou local no animal a 20 ser tratado. Manipular a fórmula química da porção lipídica do veículo pode modular o direcionamento intracelular ou extracelular do veículo de entrega. Por exemplo, um produto químico pode ser acrescentado a fórmula lipídica de um Iipossomo que altere a carga •da bio-camada do Iipossomo de forma que este se funda com 25 células tendo características de carga em particular.

Um veículo de entrega útil para uma variedade de vias de administração e agentes é um lipossomo. Um Iipossomo é capaz de se manter estável em um animal por uma quantidade suficiente de tempo para entregar uma molécula de ácido nucléico, ou mesmo uma proteína ou anticorpo conforme descrito na presente invenção, para um local preferido no animal. De acordo com a presente invenção, um Iipossomo compreende uma composição lipídica que é capaz de entregar uma molécula de ácido nucléico, proteína, ou anticorpo conforme descrito na presente invenção em um local selecionado, ou particular, em um animal. Um Iipossomo de acordo com a presente invenção compreende uma composição de lipídio que é capaz de se fundir com a membrana plasmática da célula alvo para entregar o seu conteúdo dentro da célula. Lipossomos adequados para uso com a presente invenção incluem qualquer lipossomo. Os lipossomos preferidos da presente invenção incluem os lipossomos tipicamente usados, por exemplo, em métodos de entrega genética conhecidos por aqueles que tem habilidade na técnica. Os lipossomos mais preferidos compreendem lipossomos que têm uma composição lipídica policatiônica e / ou lipossomos tendo uma espinha dorsal de colesterol conjugada com polietileno glicol. Pode-se alcançar o feitio do complexo de um lipossomo com uma molécula de ácido nucléico, proteína ou anticorpo da presente invenção usando os métodos padrão na técnica.

De acordo com a presente invenção, a determinação de protocolos aceitáveis para administrar um agente, composição ou formulação, inclusive a via de administração e quantidade efetiva de um agente a ser administrado em um animal, 25 pode ser levada a cabo por aqueles que tem habilidade na técnica. Um agente da presente invenção pode ser administrado in vivo e ex vivo. As vias de administração in vivo adequadas podem incluir, mas não de forma limitante, as vias oral, nasal, tópica, inalada, intra-traqueal, transdérmica, retal e parenteral. As vias parenterais preferidas podem incluir, mas de forma limitante, as vias subcutânea, intradérmica, intravenosa, intramuscular e intraperitoneal. As vias tópicas preferidas incluem inalação por aerossol (por exemplo: spray) ou administração da superfície tópica 5 da pele de um animal. De preferência, um agente é administrado pelas vias nasal, inalada, intra traqueal, tópica ou sistêmica (por exemplo, intraperitoneal e intravenosa). O termo "ex vivo" se refere -a realizar parte do passo da administração fora do paciente. As vias preferidas de administração de anticorpos inclui as vias parenterais 10 e as vias inalada/nasal/aerossol.

Podem ser levadas a cabo administrações intravenosas, intraperitoneais e intramusculares usando os métodos padrão na técnica. A administração por aerossol (inalação) pode ser realizada usando os métodos padrão na técnica (ver por exemplo: Stribling et a)., Proc. Nat’1 Acad. Sei. USA 189: 11277-11281 (1992),

o qual é incorporado aqui na íntegra para referência). Os veículos adequados para administração por aerossol estão descritos acima. Os instrumentos para a administração de formulações em aerossol ,incluem, mas não de forma limitante, a inaladores pressurizados de 20 dose medida (MDI), inaladores de pó seco (DPI), e instrumentos de solução medida (MSI), e incluem instrumentos nebulizadores e inaladores. A administração oral pode ser feita mediante a formação do complexo entre uma composição terapêutica da presente invenção com um veículo capaz de resistir a degradação pelas 25 enzimas digestivas no aparelho do animal. Exemplos de tais veículos incluem cápsulas ou tabletes de plástico conforme os que são conhecidos na técnica. As técnicas de injeção direta são particularmente úteis para se administrar uma molécula de ácido nucléico recombinante em uma célula ou tecido que seja inacessível por cirurgia e, particularmente, esteja próximo a superfície do corpo. A administração de uma composição localmente dentro da área de uma célula alvo se refere a injetar a composição a centímetros e, de preferência, milímetros de distância do tecido ou da célula alvo.

Uma dose única preferida de um agente, incluindo proteínas, pequenas moléculas e anticorpos, para uso em qualquer método descrito aqui, compreende entre cerca de 0,01 μg/ kg e cerca de 10 mg / kg de peso corpóreo de um animal. Uma dose única mais preferida de um agente compreende entre cerca de

1 ^g/'kg- e cerca de 10 mg / kg de peso corpóreo de um animal. Uma dose única ainda mais preferida de um agente compreende entre cerca de 5 μg/ kg e cerca de 7 mg / kg de peso corpóreo de um animal. Uma dose única ainda mais preferida de um agente 15 compreende entre cerca de 10 μg/ kg e cerca de 5 mg / kg de peso corpóreo de um animal. Uma dose única particularmente preferida de um agente compreende entre cerca de 0,01 mg/ kg e cerca de 1 mg / kg de peso corpóreo de um animal, se o agente for administrado via aerossol. Uma outra dose única particularmente 20 preferida de um agente compreende entre cerca de 1 mg/ kg e cerca de 10 mg / kg de peso corpóreo de um animal, se o agente for administrado parenteralmente.

Em uma configuração, uma dose adequada de um agente da presente invenção para uso em qualquer método 25 descrito aqui é uma dose efetiva para inibir a expressão ou a atividade de pelo menos uma proteína no circuito do complemento alternativo conforme descrito aqui (por exemplo: fator B, fator D ou properdina), em comparação com a ausência de administração do agente. Os métodos para se medir a expressão ou atividade biológica de uma proteína são conhecidos na técnica e incluem, por exemplo, Northern blot, Western blot, RT-PCR em tempo real, e afins. Em outra configuração, uma dose adequada de um agente da presente invenção é uma dose que inibe, de forma mensurável, o circuito do complemento alternativo da invenção. A ativação do complemento e a inibição conseqüente podem ser medidas através de técnicas / análises que são bem conhecidas na técnica. Por exemplo, pode-se realizar uma análise in vitro da deposição de C3 em partículas A de zimosan conforme descrito nos exemplos de Publicação de Patente dos EUA No. US - 2005/0260198 A 1, a qual está incorporada aqui para referência. Pode também testar a habilidade do agente em inibir a Iise de eritrócitos não sensibilizados pelo plasma humano. A extrapolação dos resultados in vitro em dosagens in vivo, com base nestes três ensaios, está dentro da esfera de habilidade dos doutos na arte.

Em humanos, é conhecido na técnica que, usando os métodos convencionais de administração por aerossol cerca de 10% da solução administrada entra, tipicamente, nas vias aéreas profundas, mesmo com o uso de um inalador. Se a 20 administração por meio de aerossol se dá por inalação direta, podese assumir uma dosagem de cerca de 10% da administrada por métodos de nebulização. Finalmente, alguém que tem habilidade na técnica arte prontamente capaz de converter uma dosagem de camundongo em uma dosagem humana usando uma escala 25 alométrica. Essencialmente, uma escala de dosagem de camundongo a humano se baseia na proporção de liberação de um composto e na superfície do corpo do camundongo. A conversão para mg/ kg é um doze avos do "nível de não observação de efeitos adversos" (NOEL) para se obter a concentração da dose humana. •Este cálculo assume que a eliminação entre o camundongo e o humano é a mesma, o que - acredita-se que seja o caso para os anticorpos.

Em conseqüência, uma dose única preferida 5 de um anticorpo compreende entre cerca de 1ng/ kg e cerca de menos de 1 mg/ kg de peso corpóreo de um animal. Uma dose única mais preferida de um anticorpo compreende entre cerca de 20 ng/ kg e cerca de 600 μg/ kg de peso corpóreo do animal. Uma dose única ainda mais preferida de um anticorpo, em especial 10 quando a formulação do anticorpo é administrada por nebulização, compreende entre cerca de 20 ng/ kg e cerca de 600 μg/ kg de -peso corpóreo do animal e, mais preferivelmente, entre cerca de 20 ng / kg e cerca de 500 μg/ kg, e mais preferivelmente, entre cerca de 20 ng / kg e cerca de 400 μg/ kg, e mais preferivelmente, entre 15 cerca de 20 ng / kg e cerca de 300 μg/ kg, e mais preferivelmente, entre cerca de 20 ng / kg e cerca de 200 ^g/ kg, e mais preferivelmente, entre cerca de 20 ng / kg e cerca de 100 μg/ kg, e mais preferivelmente, entre cerca de 20 ng / kg e cerca de 50 μg/ kg de peso corpóreo do animal.

Uma outra dose única preferida de um

anticorpo, particularmente quando a formulação do anticorpo é administrada por nebulização, compreende entre cerca de 200 ng/ 'kg e cerca de 600 μg/ kg de peso corpóreo do animal e, mais preferivelmente, entre cerca de 200 ng/ kg e cerca de 500 μg/ kg e, 25 mais preferivelmente, entre cerca de 200 ng/ kg e cerca de 400 μg/ kg e, mais preferivelmente, entre cerca de 200 ng/ kg e cerca de 300 μg/ kg e, mais preferivelmente, entre cerca de 200 ng/ kg e cerca de 200 μg/ kg e, mais preferivelmente, entre cerca de 200 ng/ kg e cerca de 100 μg/ kg e, mais preferivelmente, entre cerca de 200 ng/ kg e cerca de 50 μg/ kg de peso corpóreo do animal.

Uma outra dose única preferida de um anticorpo, particularmente quando a formulação do anticorpo é 5 administrada por inalação direta a partir de um inalador, compreende entre cerca de 2 ng / kg e cerca de 100 μg/ kg de peso corpóreo do animal e, mais preferivelmente, entre cerca de 2 ng / kg e cerca de 50 μg/ kg e, mais preferivelmente, entre cerca de 2 ng / kg e cerca de 10 μg/ kg e, mais preferivelmente, entre cerca de 2 ng 10 / kg e cerca de 5 μg/ kg e, mais preferivelmente, entre cerca de 2 ng / kg e cerca de 1 μg/ kg e, mais preferivelmente, entre cerca de 2 ng / kg e cerca de 0,5 μg/ kg e, mais preferivelmente, entre cerca de 2 ng / kg e cerca de 0,25 μg/ kg e, mais preferivelmente, entre cerca de 2 ng / kg e cerca de 0,1 μg/kg de peso corpóreo do animal.

Em uma outra configuração, o anticorpo é

administrado em uma dose de menos de cerca de 500 μg de anticorpo por mililitro de formulação e, preferivelmente, menos de cerca de 250 μg de anticorpo por mililitro de formulação e, mais preferivelmente, menos de cerca de 100 μg de anticorpo por mililitro 20 -de formulação e, mais preferivelmente, menos de cerca de 50 μg de anticorpo por mililitro de formulação e, mais preferivelmente, menos de cerca de 40 μg de anticorpo por mililitro de formulação e, mais preferivelmente, menos de cerca de 30 μg de anticorpo por mililitro de formulação e, mais preferivelmente, menos de cerca de 20 μg de 25 anticorpo por mililitro de formulação e, mais preferivelmente, menos de cerca de 10 μg de anticorpo por mililitro de formulação e, ainda mais preferivelmente, entre cerca de 5 μg de anticorpo e cerca de 10 μg de anticorpo por mililitro de formulação. Com respeito, mas particularmente, ao método de se reduzir ou prevenir a hiper responsividade das vias aéreas e/ ou inflamação das vias aéreas ou uma condição ou doença a elas relacionada, uma dose única adequada de um 5 agente inibidor a se administrar em um animal será aquela que for capaz de reduzir ou prevenir a hiper responsividade das vias aéreas e/ ou inflamação das vias aéreas, ou reduzir ao menos um outro sintoma de uma doença a ser tratada (por ex., asma), em um animal quando administrada uma ou mais vezes ao longo de um 10 período de tempo adequado. Quando o paciente tem ou se encontra sob risco de desenvolver HRVA, uma dose única adequada de um agente compreende aquela que melhore a HRVA pelo dobro da dose de um agente provocador ou melhore a função respiratória estática de um animal.

De acordo com o método da presente

invenção, uma quantidade efetiva de um agente que iniba a HRVA a se administrar em um animal compreende uma quantidade que seja capaz de reduzir a hiper responsividade das vias aéreas (HRVA) ou inflamação das vias aéreas sem ser tóxica para o 20 animal. Uma quantidade que seja tóxica para o animal compreende qualquer quantidade que cause dano à estrutura ou função de um animal (porex., venenosa).

Em uma configuração da presente invenção, em um animal que tenha HRVA, uma quantidade efetiva de um 25 agente a se administrar em um animal será aquela que reduzir, de maneira mensurável, a HRVA no animal em comparação com o período anterior à administração do agente. Em uma outra configuração, uma quantidade efetiva de um agente a se administrar em um animal é aquela que reduz a HRVA de forma mensurável em comparação com o nível de HRVA em uma população de animais com inflamação que seja associada à HRVA, onde o agente não tenha sido administrado. O agente é, preferivelmente, capaz de reduzir a HRVA em um animal, mesmo 5 -quando tal agente for administrado após o estabelecimento dos sintomas físicos de HRVA (por ex., após o estabelecimento agudo de HRVA). Mais preferivelmente, uma quantidade efetiva do agente é aquela que reduz os sintomas de HRVA ao ponto em que a HRVA não é mais detectada no paciente. Em uma outra configuração, uma 10 quantidade efetiva do agente é aquela que previne, ou substancialmente inibe o estabelecimento da HRVA quando ao agente é administrado antes da exposição do paciente ao estímulo provocador de HRVA, qual seja um alergênio, de maneira suficiente para induzir a HRVA na ausência do agente.

Aquele que for douto na arte será capaz de

.determinar que o número de doses de um agente a se administrar em um animal é dependente da extensão da hiper responsividade das vias aéreas e da condição adjacente da qual a HRVA seja um sintoma, e da resposta de um paciente individual ao tratamento. 20 Ademais, o médico será capaz de determinar o ritmo adequado de administração do agente de maneira efetiva para reduzir a HRVA no animal.

De preferência, o agente é administrado dentro de 48 horas antes da exposição do paciente a uma 25 quantidade de estímulos provocadores de HRVA e, mais preferivelmente, dentro de 36 horas e, mais preferivelmente, dentro de 24 horas e, mais preferivelmente, dentro de 12 horas e, mais preferivelmente, dentro de 6 horas, 5 horas, 4 horas, 3 horas, 2 horas ou 1 hora antes da exposição do paciente a uma quantidade de estímulos provocadores de HRVA que seja efetiva em induzir à HRVA. Em uma configuração, o agente é administrado tão logo seja reconhecido (por ex., imediatamente), pelo paciente ou pelo médico, que o paciente foi exposto ou está para ser exposto a um 5 estímulo provocador de HRVA e, especialmente um estímulo provocador de HRVA ao qual o paciente seja sensibilizado (por ex., um alergênio). Em uma outra configuração, o agente é administrado ao primeiro sinal de desenvolvimento de HRVA (por exemplo, manifestação aguda de HRVA) e, de preferência, dentro de ao 10 menos 2 horas da manifestação dos sintomas de HRVA e, mais preferivelmente, dentro de ao menos uma hora e, mais preferivelmente, dentro de ao menos 30 minutos e, mais preferivelmente, dentro de ao menos 10 minutos e, mais preferivelmente, dentro de ao menos 5 minutos do desenvolvimento 15 dos sintomas de HRVA. Os sintomas de HRVA e os métodos para se mensurar ou detectar tais sintomas foram descritos detalhadamente, acima. De preferência, tais administrações são dadas até que apareçam os sinais de redução da HRVA e, a seguir, até que os sintomas de HRVA hajam desaparecido.

Com respeito, em particular, ao método de

inibir ou de prevenir a lesão por reperfusão - isquemia, uma quantidade efetiva de um agente e, em particular, um anticorpo anti fator B ou fragmento Iigante de antígeno derivado (ou polipeptídeo Iigante de antígeno) a se administrar em um animal será aquela que 25 'inibir o dano histológico no animal, incluindo dano oxidativo ou morte celular, em comparação com a ausência de administração do agente. No caso de lesão por reperfusão - isquemia renal, uma quantidade efetiva de um agente a se administrar em um animal será aquela que inibir, de maneira mensurável, os aumentos de azoto úrico no sangue ou que diminua, de forma mensurável, o dano histológico aos tecidos do rim do animal em comparação com a ausência da administração do agente. Uma dose única adequada de um agente inibidor a se administrar em um animal será aquela 5 que for capaz de reduzir ou prevenir ao menos um sintoma, tipo de dano, ou dano resultante da lesão por reperfusão - isquemia em um animai quando administrada uma ou mais vezes ao longo de um período de tempo adequado. As doses adequadas de anticorpos, incluindo as várias vias de administração, encontram-se descrita 10 acima, em detalhe. Em um aspecto, uma quantidade efetiva de um agente que iniba a lesão por reperfusão - isquemia a se administrar em um animal compreenderá a quantidade que for capaz de inibir ao menos um sintoma ou dano causado pela lesão por reperfusão isquemias sem ser tóxica para o animal.

Quaisquer dos métodos da presente

invenção podem ser usados em qualquer animal e, em particular, em qualquer animal da classe dos vertebrados Mammalia (por ex., mamíferos), inclusive, sem limitação, primatas, roedores, gado è animais domésticos. Os mamíferos preferidos a se tratar com os métodos da presente invenção são humanos.

Claims

1. "UM ANTICORPO ANTI FATOR B HUMANIZADO" ou fragmento Iigante a antígeno derivado de anticorpo monoclonal murino 1379 (mAb 1379), caracterizado pelo fato que se liga, seletivamente, ao fator B dentro do domínio do sistema complemento (SCR, Short Consensus Repeat) e impede a formação do complexo C3bBb, onde o anticorpo humanizado ou fragmento Iigante de antígeno possui uma constante de dissociação de equilíbrio (Kq) entre cerca de 1,0 x 10"® M e cerca de 1,0 x 10" 10 M.

2. "O ANTICORPO ANTI FATOR B HUMANIZADO" ou fragmento Iigante a antígeno de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o Kq esteja entre 1.0 x 10"® M e cerca de 9,0 x10"® M.

3. "O ANTICORPO ANTI FATOR B HUMANIZADO" ou fragmento Iigante a antígeno de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o Kp esteja entre3.0 x 10"® M e cerca de 7,0 x 10“® M.

4. "O ANTICORPO ANTI FATOR B HUMANIZADO" ou fragmento Iigante a antígeno de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o Kp seja próximo a 3,7 x 10"® M ou menos.

5. "O ANTICORPO ANTI FATOR B HUMANIZADO" ou fragmento Iigante a antígeno de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o Kp seja próximo a 4,5 x 10“® M ou menos.

6. "O ANTICORPO ANTI FATOR B HUMANIZADO" ou fragmento Iigante a antígeno de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o Kq seja próximo a 5,4 x 10-9M ou menos.

7. "O ANTICORPO ANTI FATOR B HUMANIZADO" ou fragmento Iigante a antígeno de acordo com a "reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o Kq seja próximo a 6,5 x 10-9 M ou menos.

8. "O ANTICORPO ANTI FATOR B HUMANIZADO" ou fragmento Iigante a antígeno de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por compreender um polipeptídeo da região Vk selecionado a partir do grupo consistindo de SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, e SEQ ID NO: 20, e um polipeptídeo da região Vh selecionado do grupo consistindo de SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, e SEQ ID NO: 21.

9.O ANTICORPO ANTI FATOR B .HUMANIZADO" ou fragmento Iigante a antígeno de acordo com a reivindicação 8, caracterizado por compreender um polipeptídeo da região Vk de SEQ ID NO: 14 e um polipeptídeo da região Vh de SEQ ID NO: 15.

10. "O ANTICORPO ANTI FATOR B HUMANIZADO" ou fragmento Iigante a antígeno de acordo com a reivindicação 8, caracterizado por compreender um polipeptídeo da região Vk de SEQ ID NO: 16 e um polipeptídeo da região Vh de SEQ ID NO: 17.

11. "O ANTICORPO ANTI FATOR B HUMANIZADO" ou fragmento Iigante a antígeno de acordo com a "reivindicação 8, caracterizado por compreender um polipeptídeo da região Vk de SEQ ID NO: 18 e um polipeptídeo da região Vh de SEQ ID NO: 19.

12. "O ANTICORPO ANTI FATOR B HUMANIZADO" ou fragmento Iigante a antígeno de acordo com a reivindicação 8, caracterizado por compreender um polipeptídeo da região Vk de SEQ ID NO: 20 e um polipeptídeo da região Vh de SEQ ID NO: 21.

13. "0 ANTICORPO ANTI FATOR B HUMANIZADO" ou fragmento Iigante a antígeno de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o fragmento Iigante a antígeno é selecionado a partir do grupo consistindo de Fab”, (Fab”)2, Fv1 scFv, e diacorpos.

14. "O ANTICORPO ANTI FATOR B HUMANIZADO" ou fragmento Iigante a antígeno de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que o fragmento seja um Fab”.

15. "O ANTICORPO ANTI FATOR B HUMANIZADO" ou fragmento Iigante a antígeno de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a região Vk do anticorpo anti fator B humanizado ou fragmento Iigante a antígeno compreenda uma determinante de especificidade de ligação (BSD) derivada da região CDR3-FR4 selecionada a partir do grupo consistindo de SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, e SEQ ID NO: 28 e a região Vh do anticorpo anti fator B humanizado ou fragmento Iigante a antígeno compreenda uma BSD derivada da região CDR3-FR4 selecionada a partir do grupo consistindo de SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, e SEQ ID NO: 29.

16. "O ANTICORPO ANTI FATOR B HUMANIZADO" ou fragmento Iigante a antígeno de acordo com a reivindicação 15, caracterizado por compreender um polipeptídeo de SEQ ID NO: 22 de BSD da região Vk e um polipeptídeo de SEQ ID NO: 23 de BSD da região VH.

17. "O ANTICORPO ANTI FATOR B HUMANIZADO" ou fragmento Iigante a antígeno de acordo com a reivindicação 15, caracterizado por compreender um polipeptídeo de SEQ ID NO: 24 de BSD da região Vk e um polipeptídeo de SEQ ID NO: 25 de BSD da região V|_j.

18. "O ANTICORPO ANTI FATOR B HUMANIZADO" ou fragmento Iigante a antígeno de acordo com a reivindicação 15, caracterizado por compreender um polipeptídeo de SEQ ID NO: 26 de BSD da região Vk e um polipeptídeo de SEQ ID NO: 27 de BSD da região V|_|.

19. "0 ANTICORPO ANTI FATOR B HUMANIZADO" ou fragmento Iigante a antígeno de acordo com a reivindicação 15, caracterizado por compreender um polipeptídeo de SEQ ID NO: 28 de BSD da região Vk e um polipeptídeo de SEQ ID NO: 29 de BSD da região Vh.

20. "0 ANTICORPO ANTI FATOR B HUMANIZADO" ou fragmento Iigante a antígeno de acordo com a -reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que o fragmento Iigante a antígeno seja selecionado a partir do grupo consistindo de Fab”, (Fab”)2, Fv, scFv, e diacorpos.

21. "O ANTICORPO ANTI FATOR B HUMANIZADO" ou fragmento Iigante a antígeno de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que o fragmento seja um Fab’.

22. "UM MÉTODO" de tratar uma doença ou distúrbio na qual a ativação do circuito de complemento alternativo tenha um papel importante, caracterizado por compreender administrar o anticorpo anti fator B humanizado ou fragmento Iigante a antígeno de acordo com a reivindicação 1 em um indivíduo que tenha, ou esteja sob risco de desenvolver tal doença ou distúrbio.

23. "O MÉTODO", de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de que a doença ou desordem seja hiper responsividade das vias aéreas (HRVA) ou inflamação das vias aéreas.

24. "O MÉTODO", de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de que o anticorpo anti fator B humanizado ou fragmento Iigante a antígeno citado seja administrado em um indivíduo em uma quantidade efetiva para reduzir, de maneira mensurável, a HRVA ou a inflamação de vias aéreas no animal em comparação com o período anterior à administração do anticorpo fragmento Iigante a antígeno citado.

25. "O MÉTODO", de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo fato de que a dita HRVA ou a inflamação de vias aéreas esteja associada com uma doença do grupo consistindo de asma, Doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC), aspergilose bronco-pulmonar alérgica, pneumonia de hipersensibilidade, pneumonia eosinofílica, enfisema, bronquite, bronquiectasia de bronquite alérgica, fibrose cística, tuberculose, pneumonite de hiper sensibilidade, asma ocupacional, sarcóide, síndrome da disfunção reativa das vias aéreas, doença pulmonar intersticial, síndrome hiper eosinofílica, rinite, sinusite, asma induzida por exercício, asma induzida por poluição, asma variante com tosse, pneumopatia parasitária, infecção por vírus sincicial respiratório (VSR), infecção por vírus parainfluenza (PIV), infecção por rinovírus (RV) e infecção por adenovírus.

26. "O MÉTODO", de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo fato de que a HRVA ou a inflamação de vias aéreas esteja associada com uma inflamação ‘alérgica.

27. "O MÉTODO", de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo fato de que a HRVA ou a inflamação de vias aéreas esteja associada com asma.

28. "O MÉTODO", de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo fato de que a HRVA ou a inflamação de vias aéreas esteja associada com DPOC.

29. "UM MÉTODO", caracterizado por inibir, seletivamente, a ativação do circuito de complemento alternativo em um indivíduo que tenha, ou esteja sob o risco de desenvolver, uma condição ou doença na qual a ativação do circuito de complemento ^alternativo contribua para a condição ou doença, exacerbe ao menos um sintoma da condição ou doença, ou cause a condição ou doença, caracterizado por compreender administrar o anticorpo anti fator B humanizado ou fragmento Iigante a antígeno de acordo com a reivindicação 1 em um indivíduo necessitado.

30. "UMA COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA", caracterizada por compreender uma quantidade efetiva de anticorpo anti fator B humanizado ou fragmento Iigante a antígeno de acordo com a reivindicação 1, e um veículo farmaceuticamente aceitável.