BRPI0808665A2 - Métodos para transformação de plantas usando seleção de espectinomicina - Google Patents

Métodos para transformação de plantas usando seleção de espectinomicina Download PDF

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BRPI0808665A2
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plant
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Brian J Martinell
Michael Petersen
David Somers
Yuechun Wan
Edward Williams
Xudong Ye
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Monsanto Technology Llc
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Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MÉTODOS PARA TRANSFORMAÇÃO DE PLANTAS USANDO SELEÇÃO DE ESPECTINOMICINA".
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO Este pedido de patente reivindica a prioridade dos pedidos de
patente provisórios n°s US 60/894.096, depositado em 9 de março de 2007, e US 60/915.066, depositado em 30 de abril de 2007, cujos teores inteiros são aqui incorporados como referência.
Campo Técnico da Invenção A presente invenção refere-se a métodos para preparar e trans
formar tecido meristemático de plantas, e seleção e subseqüente regeneração de plantas transgênicas.
Descrição de Técnicas Anteriores
As plantas transformadas podem ser obtidas tratando diretamen15 te o tecido meristemático de um embrião de planta. O tecido meristemático contém células vegetais formativas que diferenciam para produzir múltiplas estruturas vegetais, incluindo talo, raízes, folhas, tecido de linhagem germinal, e sementes. O tecido meristemático, tal como o tecido de soja, pode ser excisado de sementes. Os métodos para transformar geneticamente sojas 20 (Glycine max) usando transferência gênica mediada de forma bacteriana diretamente nas células meristemáticas de embriões de soja, são conhecidos. Os meristemas e tecidos do ápice de brotos de algodão isolados foram transformados. O uso de uma citocinina para induzir o desenvolvimento de brotos em cultura de tecidos foi relatado.
Inúmeros agentes seletivos são conhecidos para uso em méto
dos para transformar geneticamente células vegetais. Uma aminoglicosídeo3'-adeniltransferase foi usada como um marcador selecionável para transformar células vegetais. A fusão de aadA com uma seqüência codificadora de peptídeo de trânsito de cloroplasto, para permitir direcionar um AadA nuclear produzido para o cloroplasto, não foi relatada.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
Em um aspecto, a invenção fornece um método para produzir uma planta transgênica que contém pelo menos duas seqüências de ácidos nucleicos heterólogas, compreendendo: (a) disponibilizar um explante que compreende uma primeira seqüência de ácidos nucleicos heteróloga que confere resistência a um herbicida; (b) transformar o explante para compre5 ender uma segunda seqüência de ácidos nucleicos heteróloga que compreende um gene marcador selecionável que confere resistência a espectinomicina; e (c) regenerar um explante que apresenta resistência a espectinomicina para dar uma planta transgênica que contém pelo menos duas seqüências de ácidos nucleicos heterólogas. Em uma modalidade, o explante com10 preende um meristema embrionário. Em outra modalidade, a primeira seqüência de ácidos nucleicos heteróloga confere resistência a glifosato, bialafos, fosfinotricina, Basta, glufosinato, 2,4-D, canamicina e aminoglicosídeos relacionados, higromicina, um inibidor de acetil-coA carboxilase, um gerador de radicais oxigênio, ou dicamba. Em outra modalidade, o explante é um 15 explante de soja, milho, algodão ou canola. Em uma modalidade específica, o explante é um explante de soja ou algodão, tal como uma planta de soja.
Em outro aspecto, a invenção fornece um método para produzir uma planta transgênica, compreendendo: (a) transformar pelo menos um primeiro explante de semente com uma seqüência de ácidos nucleicos hete20 róloga que compreende um marcador selecionável que confere tolerância a espectinomicina; e (b) regenerar uma planta transgênica a partir das células transformadas, onde o explante é colocado, antes, concomitantemente e/ou depois da etapa (a) ou etapa (b), em contato com pelo menos um primeiro meio que compreende espectinomicina para selecionar células transforma25 das que compreendem o dito marcador selecionável. Em uma modalidade, a planta transgênica se origina a partir da transformação de um meristema, que resulta em transformação de tecido de linhagem germinal. Em certas modalidades, a planta resultante é não-quimérica. Em ainda outras modalidades, a planta resultante é quimérica. Em uma modalidade específica, pelo 30 menos um broto da planta transgênica é transgênico e é não-quimérico. Em outra modalidade específica, pelo menos um broto da planta resultante é transgênico e não-quimérico, enquanto que pelo menos um outro broto ou uma outra raiz não compreende uma seqüência compreendida no ácido nucleico heterólogo. Em certas modalidades, o primeiro explante de semente compreende um transgene. Em outras modalidades, o explante compreende um meristema embrionário. Em ainda outras modalidades, durante ou depois 5 da etapa (a), os explantes são desenvolvidos na presença de um agente seletivo a 35 °C-40 0C e/ou são desenvolvidos sob condições de iluminação que permitem o desenvolvimento normal de plastídios. Em ainda outras modalidades, o crescimento a 35 °C-40 0C é realizado por 1-7 dias ou as condições de iluminação compreendem pelo menos 5 μβϊηβίβίηε com um fotope10 ríodo de 16 horas de luz/8 de escuridão.
Em algumas modalidades, o explante é estocado em uma temperatura entre 0-15 0C durante entre 1 hora e 7 dias antes da etapa (a). Em outras modalidades, o meio compreende entre cerca de 15 mg/L e cerca de 1.500 mg/L de espectinomicina. A invenção refere-se ainda a um método no 15 qual as células do explante compreendem uma seqüência codificadora que confere tolerância a glifosato, bialafos, fosfinotricina, Basta, glufosinato, 2,4- D, canamicina e aminoglicosídeos relacionados, higromicina, estreptomicina, ampicilina ou dicamba. Em algumas modalidades, a etapa (a) compreende desenvolver um explante em um meio de cocultura que compreende espec20 tinomicina. Em outras modalidades, o explante não é colocado em contato com um meio que compreende espectinomicina depois de ser transferido de um meio de cocultura. Alternativamente, em outras modalidades, o explante é colocado em contato com um meio que compreende espectinomicina depois de ser transferido de um meio de cocultura. Em algumas modalidades, 25 o explante que está se regenerando para dar uma planta é transferido para o solo ou substituto de solo para enraizamento sem pré-enraizar em meio ascético. Em outras modalidades, o ácido nucleico heterólogo compreende ainda uma seqüência codificadora que confere um traço de interesse agronômico ou melhor uso final.
Em outras modalidades, a invenção fornece um método para
produzir uma planta transgênica, compreendendo: (a) transformar pelo menos um primeiro explante de semente com uma seqüência de ácidos nucleicos heteróloga que compreende um marcador selecionável que confere tolerância a espectinomicina; e (b) regenerar uma planta transgênica a partir das células transformadas, onde o explante é colocado, antes, concomitantemente e/ou depois da etapa (a) ou etapa (b), em contato com pelo menos 5 um primeiro meio que compreende espectinomicina para selecionar células transformadas que compreendem o dito marcador selecionável, onde a etapa (a) compreende transformar a célula do explante com pelo menos um segundo ácido nucleico heterólogo. Em modalidades específicas, o segundo ácido nucleico heterólogo compreende uma seqüência codificadora que con10 fere tolerância a herbicidas. Em certas modalidades, o primeiro e o segundo ácidos nucleicos heterólogos são integrados em diferentes Ioci dentro do genoma da célula. Certas modalidades da invenção compreendem, antes da etapa (a) a etapa de condicionamento fisiológico da semente, onde o condicionamento osmótico compreende colocar o explante em contato com uma 15 citocinina. Em outras modalidades, um método que compreende ainda colocar o explante em contato com uma citocinina antes, concomitantemente e/ou depois da etapa (b), é contemplado. Em modalidades específicas, a citocinina é selecionada no grupo que consiste em tidiazuron, BAP (6- benzilaminopurina), cinetina, CPPU (N-(2-cloro-4-piridil)-N'-fenil-uréia), 2iP 20 (6-(y,y-dimetilalilamino)-purina), zeatina, zeatina ribosídeo, adenina, e TIBA (ácido 2,3,5-tri-iodo-benzóico).
Em algumas modalidades, a etapa (a) compreende colocar o explante em contato com Rhizobiaceae recombinantes que compreendem o dito ácido nucleico recombinante, onde as Rhizobiaceae foram expostas a 25 tidiazuron antes ou concomitantemente com o contato do explante com as Rhizobiaeeae recombinantes. Em certas modalidades, as Rhizobiaeeae são expostas a tidiazuron durante entre cerca de 1 e 5 dias antes de colocar o explante em contato com as Rhizobiaeeae recombinantes. Em outras modalidades, as Rhizobiaeeae são colocadas em suspensão na presença de um 30 agente seletivo ativo contra um explante não-transformado antes de colocar os explantes em contato com as Rhizobiaeeae. Em certas modalidades, as Rhizobiaeeae são selecionadas no grupo que consiste em Agrobaeteria, Sinorhizobia, Mesorhizobia e Rhizobia. Em ainda outras modalidades, os explantes são desenvolvidos na presença de um fungicida, antes, durante ou depois da etapa de transformar pelo menos um explante de semente com uma seqüência de ácidos nucleicos heteróloga que compreende um marca5 dor selecionável que confere tolerância a espectinomicina. Em certas modalidades, os explantes são desenvolvidos na presença de um fungicida e DMSO. Em modalidades específicas, os explantes são desenvolvidos na presença de nistatina, tiabendazol, e DMSO.
Em certas modalidades, o explante é um explante de soja, milho, algodão ou canola. Em modalidades específicas, o explante é um explante de soja ou um explante de algodão.
Em certas modalidades, o método para produzir uma planta transgênica compreende: (a) transformar pelo menos um primeiro explante de semente com uma seqüência de ácidos nucleicos heteróloga que compreende um marcador selecionável que confere tolerância a espectinomicina: e (b) regenerar uma planta transgênica a partir das células transformadas, onde o explante é colocado, antes, concomitantemente e/ou depois da etapa (a) ou etapa (b), em contato com pelo menos um primeiro meio que compreende espectinomicina para selecionar células transformadas que compreendem o dito marcador selecionável, compreendendo ainda a etapa de (c) obter uma planta de progênie de qualquer geração da planta transgênica que compreende o gene que confere o traço de interesse e carece do marcador selecionável. Em certas modalidades, o ácido nucleico heterólogo compreende um primeiro segmento de DNA que compreende os limites esquerdo e direito do T-DNA, flanqueando um gene que confere um traço de interesse: e um segundo segmento de DNA que compreende um segundo conjunto de limites esquerdo e direito do T-DNA, flanqueando o dito marcador selecionável que confere tolerância à espectinomicina. Em outras modalidades, o método compreende ainda a etapa de (c) obter uma planta de progênie de qualquer geração da planta transgênica que compreende o gene que confere o traço de interesse e carece do marcador selecionável.
Em algumas modalidades, o ácido nucleico heterólogo compreende os limites esquerdo e direito do T-DNA e o primeiro e o segundo segmentos de DNA, onde o primeiro segmento de DNA compreende um gene de interesse localizado depois do limite direito, e onde o segundo segmento de DNA compreende o marcador selecionável localizado depois do 5 limite esquerdo. Em certas modalidades, o ácido nucleico heterólogo compreende o primeiro e o segundo limites direitos do T-DNA, onde um primeiro segmento de DNA que compreende um gene de interesse fica localizado depois do primeiro limite direito e um segundo segmento de DNA que compreende o marcador selecionável fica localizado depois do segundo limite 10 direito.
Em certas modalidades, o método compreende cultivar o dito explante sobre um meio que carece de espectinomicina durante entre cerca de 1 e cerca de 7 dias durante a etapa (b). Em outras modalidades, o método compreende colocar o explante em contato com pelo menos um primeiro 15 meio que compreende espectinomicina durante entre cerca de 15 minutos e cerca de 7 dias. Em modalidades específicas, o marcador selecionável é codificado por aadA. Em mais modalidades específicas, aadA compreende SEQ ID NO: 1. Em certas modalidades, o gene aadA é fundido a um peptídeo de trânsito de cloroplasto. Em modalidades específicas, aadA compre20 ende SEQ ID NO: 2.
Em certas modalidades, o explante é definido ainda como tendo sido mantido antes da etapa (b) sob condições nas quais o explante não germina e permanece viável e competente para transformação genética. Em algumas modalidades, as distas condições compreendem desidratar o ex25 plante ou uma semente que compreende o explante. Em certas modalidades, o método é definido ainda como compreendendo aumentar o teor de umidade do explante antes ou concomitantemente com a etapa (b). Em modalidades específicas, as ditas condições compreendem um teor de umidade interna do explante entre cerca de 3% e cerca de 25%. Em modalidades 30 mais específicas, as ditas condições compreendem um teor de umidade interna do explante entre cerca de 3% e cerca de 16%. Em algumas modalidades, as ditas condições compreendem manter o explante em uma temperatura entre cerca de -80 0C e cerca de 60 0C.
Em algumas modalidades, o método compreende o condicionamento osmótico do explante antes da etapa (b). Em modalidades específicas, o condicionamento osmótico da semente compreende colocar o explan5 te ou uma semente que compreende o explante em contato com uma solução aquosa que compreende água, um regulador do crescimento de plantas, um agente de seleção, ou um condicionador da membrana celular.
Em certas modalidades que compreendem o método para produzir uma planta transgênica, compreendendo: (a) transformar pelo menos 10 um primeiro explante de semente com uma seqüência de ácidos nucleicos heteróloga que compreende um marcador selecionável que confere tolerância a espectinomicina; e (b) regenerar uma planta transgênica a partir das células transformadas, onde o explante é colocado, antes, concomitantemente e/ou depois da etapa (a) ou etapa (b), em contato com pelo menos 15 um primeiro meio que compreende espectinomicina para selecionar células transformadas que compreendem o dito marcador selecionável, o método compreende ainda transformar pelo menos uma primeira célula do explante com um ácido nucleico heterólogo e é conduzido por transformação mediada de forma bacteriana ou bombardeio de microprojéteis.
Em algumas modalidades, o explante é definido ainda como
tendo sido excisado a partir de uma semente que compreende 3% a 25% de teor de umidade interna, ou uma semente hidratada ou germinante que compreende 26% a 80% de teor de umidade interna, ou compreende um tecido do grupo que consiste em meristema, embrião imaturo, embrião, eixo 25 embrionário, cotilédone, hipocotilédone, mesocotilédone, folha, base de folha primária, disco de folha, ponta de broto, e plúmula. Em certas modalidades, o explante é definido ainda como tendo sido excisado de uma semente germinada ou embebida. Em outras modalidades, o explante não é colocado em contato com um meio que compreende espectinomicina depois da etapa 30 (a). Em modalidades específicas, o primeiro meio é um líquido. Em outras modalidades, uma ou mais das etapas (a)-(b) são automatizadas.
Em outro aspecto, a invenção fornece uma construção de ácido nucleico que compreende duas seqüências que conferem resistência à espectinomicina ou estreptomicina, onde a primeira seqüência está ligada operacionalmente a um promotor ativo em uma célula vegetal, e a segunda seqüência está ligada operacionalmente a um promotor ativo em uma célula 5 procariótica. Em uma modalidade específica, as seqüências que conferem resistência a espectinomicina ou estreptomicina codificam um polipeptídeo que compreende atividade de aminoglicosídeo-3'-adeniltransferase (aadA). Em uma modalidade mais específica, pelo menos uma das seqüências compreende SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 2.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
Os desenhos que se seguem fazem parte do presente relatório descritivo e são incluídos para demonstrar ainda mais certos aspectos da presente invenção. A invenção pode ser mais bem entendida fazendo referência aos desenhos em combinação com a descrição detalhada de modalidades específicas aqui apresentadas.
A Figura 1 representa detalhes ampliados de quatro explantes de soja a partir de tratamentos com diferentes níveis de TDZ adicionado ao inóculo/meio de cocultivo. Cada explante desenvolveu novamente botões/brotos (fundo) e alguns eram GFP-positivos (topo). As fotografias na 20 fileira do topo foram tiradas em um microscópio com uma fonte de Iuz azul modificada que detecta tecido que expressa GFP por fluorescência. As mesmas imagens foram feitas com uma fonte de Iuz branca-padrão para ilustrar todos botões/brotos desenvolvidos (fileira do fundo).
A Figura 2 é o mapa do plasmídeo pMON96999.
A Figura 3 é o delineamento do protocolo de seleção com es
pectinomicina "A". A seleção, indução e alongamento de brotos sobre meio líquido ou semissólido; brotos destacados do enraizamento sobre meio semissólido.
A Figura 4 é o delineamento do protocolo de seleção com espectinomicina "B". A seleção, indução e alongamento de brotos sobre meio líquido ou semissólido; brotos destacados do enraizamento em tampões OASIS com meio líquido sem seleção. A Figura 5 é o delineamento dos protocolos de seleção com espectinomicina, "C" e "D" (fundo), e comparação com o protocolo para seleção usando glifosato (topo). No caso do Protocolo "C", depois do cocultivo os explantes ficam retidos nos PLANTCONs originais e 12 ml_ de meio de seleção líquido são adicionados. Quatro dias depois, eles são transferidos para cima de meio de seleção semissólido para seleção e indução de brotos. No caso do Protocolo "D", depois da cocultura, os explantes são diretamente transferidos para cima de meio semissólido para seleção e indução de brotos. Em ambos protocolos "C" e "D", os explantes que produzem brotos verdes são movidos para tampões Oasisn com meio líquido sem seleção quanto a alongamento de brotos e indução de raízes. No caso do protocolo que usa seleção com glifosato (topo), onde a indução de brotos, e o alongamento de brotos e o alongamento de brotos são sobre meio semissólido com seleção, o enraizamento de brotos destacados também é realizado sobre meio semissólido com seleção.
A Figura 6 é o mapa do plasmídeo pMON107379 que compreende 2 T-DNA's, OriRi e aadA.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
O texto que se segue é uma descrição detalhada da invenção fornecida para auxiliar os versados nessas técnicas a praticar a presente invenção. Os versados nessas técnicas podem fazer modificações e variações nas modalidades aqui descritas sem fugir do espírito ou âmbito da presente invenção.
A invenção fornece métodos e composições para uso especti25 nomicina como um agente seletivo para preparar, peneirar, transformar, e regenerar explantes a partir de plantas de soja, milho, algodão, ou canola, dentre outras, para obter tecidos vegetais e plantas transformadas. Em alguns aspectos, várias partes dos métodos descritos podem ser procedimentos automatizados, de alto volume de produção. Um explante, tal como um 30 embrião maduro ou imaturo, é obtido, por exemplo, a partir de uma semente, e pode ser transformado, por exemplo, por intermédio de uma abordagem de bombardeio de microprojéteis ou mediada de forma bacteriana. Em certas modalidades, ao mesmo tempo ou depois que o um DNA heterólogo está entrando em contato com o explante, o explante é contatado por uma citocinina selecionada no grupo que consiste em tidiazuron, BAP (6- benzilaminopurina), cinetina, CPPU (N-(2-cloro-4-piridil)-N'-fenil-uréia), 2iP 5 (6-(y,y-dimetilalilamino)purina), zeatina, zeatina ribosídeo, adenina, e TIBA (ácido 2,3,5-tri-iodobenzóico), ou outro agente tal como dikegulac. Para facilitar o contato de um explante com a citocinina, a citocinina pode ser adicionada ao inóculo bacteriano a ser usado na transformação antes de contato do explante com o inóculo. Em certas modalidades, a citocinina empregada 10 é BAP em uma concentração de cerca de 0-3 mg/L ou cerca de 0,25-3 mg/L, ou TDZ (a cerca de 0-3 mg/L ou cerca de 0,25-3 mg/L). Em certas modalidades, a citocinina ou outros agentes também podem ser adicionados durante a embebição da semente para tratar os explantes antes que eles são excisados.
O uso de espectinomicina, com ou sem tratamento com citocini
na, em concentrações entre 15-1.500 mg/L está contemplado, por exemplo, cerca de 25, 50, 100, 150, 250, 300, 500, 1.000, or 1.500 mg/L. Caso um método para transformação mediado de forma bacteriana seja uso, a espectinomicina pode ser adicionada ao inóculo bacteriano antes de seu contato 20 com o explante. Alternativamente, caso seja usado um método de transformação mediado de forma bacteriana ou mediado por microprojéteis, a espectinomicina pode ser adicionada antes, concomitantemente ou depois da etapa de transformar uma célula de soja, milho, algodão ou canola, de modo a selecionar células transformadas com um ácido nucleico heterólogo. A es25 pectinomicina pode ser empregada também como um "pulso" durante uma parte do período de tempo para a etapa de crescimento da cultura de tecido, tal como a etapa de pré-cultura, etapa de cocultivo, etapa de retardamento, ou etapa de seleção, e opcionalmente em uma concentração mais alta de cerca de 1.000 mg/L.
As freqüências de transformção ("TFs") obtidas usando os mé
todos e composições aqui descritas não tinham sido atingidas nas técnicas anteriores. Assim sendo, uma aumento na TF de 2-10 ou 5-10 vezes (e ainda mais alto em alguns casos) em relação àquele encontrado, por exemplo, quando se usa glifosato ou dicamba como o agente seletivo para transformção de soja ou algodão, foi atingido. Adicionalmente, a maior eficiência da transformação permite o desenvolvimento de um sistema de transformação 5 de 2 T-DNA's usando seleção com espectinomicina, permitindo assim acumular traços transgênicos por transformação e cruzamento de plantas que já compreendem um traço transgênico com um ácido nucleico que codifica um traço adicional de interesse, e depois triando quanto a plantas que compreendem também o ácido nucleico que codifica o traço adicional.
Combinados com uma maior TF, os métodos descritos permitem
também uma regeneração mais rápida de tecidos vegetais transformados candidatos, maior eficiência em identificar e desenvolver brotos e plantas transformadas, e menores custos e carga ergonômica, e ao mesmo tempo, simplificando e reduzindo a mão-de-obra necessária para produzir plantas 15 transformadas. Por exemplo, depois que os brotos resistentes à espectinomicina com botões ou folhas verdes (isto é, resistentes à espectinomicina) se alongaram e são capazes de ser triados ou selecionados como sendo resistentes à espectinomicina, eles podem ser colocados no solo ou sobre um substituto de solo, tal como um meio de enraizamento, na presença ou 20 ausência do agente seletivo. Os brotos que se alongam a partir desse explante rotineiramente demonstram ser transgênicos e gerar progênie Ri e progênie subseqüente que são transgênicas, enquanto que as raízes que se desenvolvem a partir desses explantes podem ser transgênicas ou nãotransgênicas. Assim sendo, uma planta que compreende um broto transgê25 nico e um sistema radicular parcial ou completamente não-transgênico também está contemplada. Um método para regenerar uma planta integral a partir de brotos transgênicos de tecido meristemático transformado, enquanto que as raízes são não-transgênicas, cultivando tecido transformado sobre um meio que carece de um agente seletivo, também está contemplado. Os 30 métodos descritos permitem assim um decréscimo significativo no tempo gasto sob condições seletivas e no uso do agente seletivo, reduzindo assim também os custos potenciais. Para fornecer uma clara e consistente compreensão do relatório descritivo e das reivindicações, incluindo o âmbito dado a esses termos as definições que se seguem são fornecidas.
"Embrião" é parte de uma semente, consistindo em tecidos precursores (tecidos meristemáticos) para as folhas, talo, e raiz. Depois que o embrião começa a crescer (germinar), ele se torna uma muda de planta.
"Meristema" ou "tecido meristemático" consiste em células indiferenciadas, as células meristemáticas, que diferenciam para produzir múltiplas estruturas vegetais, incluindo talo, raízes, folhas tecido de linhagem germinal e sementes. As células meristemáticas são os alvos para transformação para obter plantas transgênicas.
"Explante" é um termo utilizado para se referir a um material-alvo para transformação, compreendendo tecido meristemático. Ele pode se referir a tecidos vegetais, incluindo, sem limitações, um ou mais embriões, cotilédones, hipocotilédones, bases de folhas, mesocotilédones, plúmulas, protoplastos, e eixos embrionários.
"Plantas quiméricas" são plantas que são compostas de tecidos que não são geneticamente idênticos, isto é, as plantas terão apenas uma parte ou fração de seus tecidos transformados, enquanto o restante dos tecidos não são geneticamente transformados.
"Transformação de linhagem germinal" ocorre quando o gene de interesse é transformado em células que geram pólen ou óvulo e, assim sendo, em sementes.
Os explantes podem ser transformados por uma seqüência de 25 DNA heteróloga, e as plantas transgênicas podem ser regeneradas a partir deles, sem a necessidade de gerar uma cultura de células de calos a partir do explante transformado, para obter plantas de progênie transgênica. A seqüência de DNA heteróloga selecionada pode codificar, por exemplo, um marcador capaz de ser triado ou selecionado e/ou compreender um gene de 30 interesse agronômico que especifica um traço a ser apresentado por uma planta ou célula resultante da expressão do ácido nucleico heterólogo. O traço pode ser agronomicamente útil, por exemplo, resultando em maior rendimento, tolerância a herbicidas, resistência a pragas ou patógenos, ou adaptabilidade ambiental, dentre outros fenótipos. O traço pode também especificar a produção de um produto final desejado.
Tais métodos de transformação e regeneração permitem um 5 processo rápido e eficiente com alto volume de produção para gerar plantas transformadas. A mecanização reduz significativamente os homens-horas estimados necessários para produzir 10.000 explantes, por exemplo, no caso de algodão entre cerca de 40 e apenas 2,4 horas, economizando significativamente os custos de mão-de-obra. Tal técnica permite que maiores 10 números de transgenes sejam testados e episódios de qualidade mais alta sejam escolhidos para análise adicional, pois espera-se que apenas um número muito pequeno de episódios de transformação apresente os perfis de expressão mais desejados apropriados para desenvolvimento comercial. Um processo de excisão mecanizado permite também melhor "timing" e progra15 mação de etapas de transformação, por causa da maior flexibilidade na distribuição de explantes. O uso de um processo mecanizado para excisão de explantes pode proporcionar benefícios monetários, de segurança e flexibilidade, significativos. Entretanto, a preparação de explantes pode ser realizada também manualmente.
Antes da embebição, germinação e/ou excisão de explantes, as
sementes podem ser submetidas a uma etapa de esterilização bem como uma etapa de de separação, para evitar contaminação microbiana, a fim de remover as sementes com um alto grau de contaminação bacteriana ou fúngica, e também para remover as sementes que por qualquer razão sejam 25 improváveis de produzir tecido viável de explante para uso com a presente invenção. A separação pode ser conduzida, por exemplo, baseado em parâmetros tais como tamanho, cor ou densidade da semente ou outras características, incluindo características de composição químicas. Os exemplos de métodos de separação podem incluir o uso de uma balança automática 30 depois da classificação por tamanho. Um classificador óptico para este propósito é o Sortex 3000 Series Color Sorter (Buhler-Sortex KK, Yokohama, Japão). Outras técnicas de separação também podem ser empregadas, incluindo separação por teor de umidade. Depois da excisão, os explantes podem ser também submetidos a uma etapa de re-hidratação ou pré-cultura antes de serem transformados com um ácido nucleico heterólogo.
Em modalidades específicas, a excisão é realizada mecanicamente usando roletes que esmagam as sementes aplicadas às suas faces, que podem ser contra-rotativos. O afastamento entre os roletes pode ser ajustado, baseado no tamanho das sementes aplicadas. O material dos roletes pode ser, por exemplo, elastomérico ou metálico. Em certas modalidades, roletes de aço inoxidável demonstraram reter qualidades benéficas de funcionamento, mesmo depois de uso repetido e prolongado. Para uso com sementes de algodão, roletes com sulcos secundários demonstraram agarrar e esmagar eficientemente as sementes com mínimo dano para a fração de explante meristemático. Os métodos para excisão mecanizada de explantes de plantas são conhecidos; vide, por exemplo, pedidos de patente provisórios n— de série US 60/894.096 e 60/915.066, e publicação de pedido de patente n2 US 2005/0005321, aqui incorporados como referência em sua totalidade.
Em uma modalidade, um explante preparado de acordo com a invenção pode ser definido como tendo uma umidade interna de cerca de 4- 25%, incluindo cerca de 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 16, 17, 18, 19, 20,
21, 22, 23, 24, e 25% de umidade interna, e incluindo especificamente todas faixas deriváveis entre quaisquer desses valores. Em modalidades específicas, as sementes a partir das quais os explantes vão ser preparados podem ser colhidas em um teor de umidade interna predeterminado apropriado para
isolar material transformável a partir delas. Em certas modalidades nãolimitativas, as sementes a partir das quais os explantes são obtidos podem ser definidas como tendo um teor de umidade interna de cerca de 3-25%, incluindo cerca de 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 16, 17, 18, 19, 20, 21,
22, 23, 24, e 25% de umidade interna, e incluindo especificamente todas faixas deriváveis entre quaisquer desses valores, tais como, por exemplo,
entre cerca de 4% e 16%. Em certas modalidades, a fragilidade das sementes pode ser alterada manipulando o teor de umidade, permitindo uma divisão eficiente das sementes e preparação de explantes. Por exemplo, um teor de umidade interna tal como 3% a 7% pode ser vantajoso. As sementes podem ser mantidas nesses teores de umidade ou qualquer outro teor de umidade produzindo condições de estocagem estáveis (e explantes trans5 formáveis) antes do uso. As sementes, em certas modalidades podem ser sementes de soja, milho, algodão, ou canola.
Os explantes secos (explantes que foram excisados da semente sob condições de baixa umidade) ou explantes úmidos secados (explantes que foram excisados da semente depois de hidratação/embebição e são 10 subseqüentemente desidratadas e estocadas) de várias idades podem ser usados. Em uma modalidade, os explantes são relativamente "jovens" pelo fato de que eles foram removidos das sementes há menos do que um dia, por exemplo, entre cerca de 1 e 24 horas, tal como cerca de 2, 3, 5, 7, 10, 12, 15, 20, ou 23 horas antes do uso. Em outras modalidades, os explantes 15 podem ser estocados por períodos mais longos, incluindo dias, semanas, meses ou mesmo anos, dependendo das condições de estocagem usadas para manter a viabilidade dos explantes. Os versados nessas técnicas em particular devem entender que os tempos de estocagem podem ser otimizados de tal modo que a qualidade e/ou rendimento dos transformantes, bem 20 como a eficiência do processo de transformação sejam maximizados. Isto pode ser conduzido para qualquer protocolo de transformação específico, por exemplo, transformação mediada por Agrobacterium, transformação por bombardeio de microprojéteis, bem como outros procedimentos de transformação.
Em algumas modalidades, uma semente ou um explante seco
pode primeiramente passar por condicionamento osmótico, por exemplo, por embebição em um líquido, tal como água ou um líquido esterilizante, ressecado, e posteriormente usado para transformação e regeneração. Em outras modalidades, a semente ou o explante pode passar por condicionamento 30 osmótico aumentando o teor de umidade interna da semente para mais do que 30%, mantendo a semente ou o explante em um ponto no tempo, e depois reiniciando a embebição em um ponto do tempo posterior. Em uma modalidade alternativa, a semente ou o explante pode passar por condicionamento osmótico aumentando o teor de umidade interna para mais do que 30%, estocando a semente ou o explante por um período predeterminado, secando a semente ou o explante até o teor de umidade interna abaixo de 5 20%, e depois reiniciando a embebição.
Podem ser colhidos os explantes transformáveis não contêm algum ou uma parte de cada cotilédone remanescente afixado ao tecido embrionário, por exemplo, tanto quanto !4 do cotilédone. Estes explantes são considerados substancialmente similares, pois eles podem resultar, cada 10 um, em uma planta transformada estável. O explante deve conter, entretanto, pelo menos uma parte da região meristemática do embrião, de tal modo que tipicamente o explante possa produzir um broto dentro de 12 semanas a partir do início das condições de crescimento da cultura do tecido.
O explante pode ser recuperado a partir de uma semente hidratada, a partir de uma semente estocável, a partir de uma re-hidratação parcial de explante hidratado secado, os termos "hidratação" e "re-hidratação" são definidos como uma mudança mensurável na porcentagem de umidade interna da semente, ou a partir de uma semente que é passada por "condicionamento osmótico"; isto é, uma semente que iniciou a germinação, mas foi adequadamente colocada em condições favoráveis pendente de estase para completar o processo de germinação. Os versados nessas técnicas devem ser capazes de usar vários métodos de hidratação e otimizar a extensão do tempo de incubação antes da transformação. O explante inusitado resultante é estocável e pode germinar e/ou ser transformado quando as condições apropriadas são proporcionadas. Assim sendo, o novo explante de meristema seco e estocável pode ser referido com uma semente artificial.
Depois da excisão, os versados nessas técnicas podem estocar o explante de acordo com os métodos descritos, antes do uso subseqüente. Os métodos e parâmetros para secar, estocar, e germinar sementes são 30 conhecidos nessas técnicas (por exemplo, Senaratna et ai, 1983; Vertucci e Roos, 1990; Chai et al., 1998). A estocagem de meristemas excisados, de acordo com a presente invenção pode ser conduzida usando modificações dessas condições de estocagem, conforme desejado. Qualquer uma dessas condições pode ser usada conforme desejado, incluindo em temperaturas, por exemplo, entre cerca de -80 DC e cerca de 60 DC. Temperaturas de cerca de -20 DC até a temperatura ambiente em particular demonstraram 5 funcionar bem, mas a invenção não está de forma alguma limitada a estas temperaturas.
Os dados descritos nos exemplos ilustram, por exemplo, que os explantes de sementes estocados que compreendem tecido meristemático podem permanecer viáveis e úteis para transformação genética subseqüente e regeneração por semanas ou meses depois da excisão a partir das sementes (por exemplo, Exemplo 12). A manipulação da excisão, esterilização, estocagem, hidratação, re-hidratação, e parâmetros de transformação permite o desenvolvimento de protocolos de transformação de plantas, eficientes e automatizados com altos volumes de produção. As condições de rehidratação, condicionamento osmótico, e hidratação também são apresentadas. Um protocolo típico para excisão com máquina pode envolver colocar as sementes por 15 minutos em uma solução Iixiviadora de 200 ppm de Cl ativo, e em seguida, um período de 2 horas de nenhuma exposição a líquidos, e em seguida, uma hidratação durante a noite inteira em meio de germinação de grãos (BGM) ou uma solução Iixiviadora de 50 ppm de Cl ativo.
Inúmeros parâmetros para obter e manusear explantes podem ser variados. Em uma modalidade, o método de excisão pode ser manual; em uma modalidade alternativa, excisão ocorre por um processo automatizado. Em outras modalidades, a esterilização pode ser realizada colocando 25 uma semente ou explante em contato com um agente esterilizante líquido. A adição a um meio de cocultura (como I NO) de nistatina (50 ppm) e tiabendazol (10 ppm) dissolvidos em DMSO (1,0 ml de DMSO por litro de INO) pode melhorar a saúde dos explantes, provavelmente controlando leveduras e fungos encontrados comumente em sementes e pode ser uma ferramenta 30 útil quando se realiza cultura de tecido grande e/ou automatizada. Em uma modalidade alternativa, uma semente ou um explante pode ser colocado em contato com um agente esterilizante gasoso. Em uma modalidade alternativa, uma semente ou um explante pode ser colocado em contato com um agente esterilizante irradiante, tal como Iuz UV. Em uma modalidade alternativa, uma semente ou um explante pode ser esterilizado submetendo a semente ou o explante a um breve período de altas temperaturas de modo a 5 reduzir o vigor de contaminantes biológicos tais como bactérias e fungos adventícios sobre a superfície da semente ou do explante sem reduzir o vigor da semente ou do explante. Isto pode ser realizado em uma temperatura mais alta do que 40 DC; de preferência, a temperatura é entre 40 DC e 90 DC. A temperatura pode ser aumentada, por exemplo, ar ou vapor d'água 10 forçado. Tais temperaturas podem ser proporcionadas por secadores produzidos por Bry-Air Inc. (Sunbury, Ohio, EUA). Em ainda outra modalidade, o teor de umidade da semente na hora da excisão pode ser variado. Em outra modalidade, a temperatura da semente na hora da excisão pode ser variada. Em outras modalidades, um parâmetro de estocagem depois da excisão po15 de ser variado. Por exemplo, em uma modalidade a umidade relativa sob a qual a estocagem do explante ocorre pode ser variada. Em outra modalidade, a temperatura de estocagem do explante pode ser variada. Em ainda outras modalidades, a extensão do tempo de estocagem do explante pode variar. Em ainda outras modalidades, a composição do meio no qual o ex20 plante é estocado pode variar. Os outros parâmetros que podem ser manipulados incluem composições dos meios de hidratação e re-hidratação, temperatura de incubação, extensão do tempo, e métodos de transformação, dentre outros.
Depois da excisão, a invenção fornece métodos e aparelhos pa25 ra peneirar material de explante meristemático transformável a partir de explantes, cotilédones, revestimentos de sementes, e outros detritos danificados não-transformáveis. Os métodos podem ser realizados manualmente, ou podem ser parcial ou completamente mecanizados. Em certas modalidades, o processo de peneiração é substancialmente mecanizado. Por exemplo, 30 uma ou mais etapas de peneiração podem ser realizadas, usando peneiras com o tamanho apropriado, baseado no tamanho das sementes que estão sendo esmagadas e os explantes que estão sendo isolados. O volume bruto de sementes esmagadas que atravessaram os roletes pode ser colocado através de uma série de peneiras de separação, de tal modo que os detritos grandes e pequenos indesejados sejam separados do explante desejado por exclusão de tamanho. Isto pode ser realizado eficazmente, por exemplo, 5 com material de semente de algodão, usando peneiras do padrão norteamericano tais como: ns 8 (abertura da 2,36 mm), ns 10 (abertura de 2,0 mm), Vr 16 (abertura de 1,18 mm), e outras, conforme apropriado (por exemplo, peneiras com aberturas alongadas tais como 1/16" x 3/4", 1/18" x 3/4", 1/19" x 1/2", ou 1/20" x 1/2"). Peneiras com outros tamanhos de abertu10 ra podem ser fabricadas, conforme necessário, para dados tamanhos de sementes, baseado no tamanho do material que está sendo aplicado. A extensão de tempo para o processo de peneiração e o vigor da peneiração também podem ser ajustados para aumentar o volume de produção e/ou rendimento do processo.
Outros métodos de peneiração também podem ser utilizados,
tais como medindo a flutuação diferencial em soluções de material de explante versus detritos. Uma fração do material que flutua em uma solução aquosa demonstrou ser enriquecida quanto a explantes intactos transformáveis. Um explante excisado a seco pode ser utilizado. Combinações desses 20 métodos de peneiração também podem ser usadas. A fração de material com explantes transformáveis pode compreender tecidos meristemáticos e também outros tecidos, tais como partes de cotilédones. O explante deve conter, entretanto, pelo menos alguma região meristemática, de tal modo que tipicamente o explante possa produzir um botão ou broto dentro de 12 25 semanas desde o início de condições de crescimento apropriadas.
Em certas modalidades, os tecidos excisados e peneirados podem ser transformados com um gene heterólogo de interesse. Vários métodos foram desenvolvidos para transferir genes para dentro de tecido vegetal, incluindo microprojeção em alta velocidade, microinjeção, eletroporação, 30 captação direta de DNA e transformação mediada de forma bacteriana. As bactérias que reconhecidamente medeiam transformação de células vegetais incluem inúmeras espécies de Rhizobiaceae, incluindo, porém sem Iimitações, Agrobacterium sp., Sinorhizobium sp., Mesorhizobium sp., e Bradyrhizobium sp. (vide, por exemplo, Broothaerts et ai, 2005; publicação de pedido de patente n2 US 2007/0271627). Os alvos para tal transformação têm sido freqüentemente tecidos de calos indiferenciados, embora o tecido dife5 renciado também tenha sido usado para transformação transiente e estável de plantas, e possa ser neste caso. A cocultura e etapas subseqüentes podem ser realizadas em condições de escuridão, ou na luz, por exemplo, incubadoras Percival iluminadas, por exemplo, por 2 a 5 dias (por exemplo, um fotoperíodo de 16 horas de luz/8 horas de escuridão, com intensidade da 10 Iuz > 5μΕ, tal como cerca de 5-200 μΕ ou outras condições de iluminação que permitem o desenvolvimento normal de plastídios) em uma temperatura de aproximadamente 23 a 25°C, e podem ser realizadas a até cerca de 35°C ou 40°C.
Ao desenhar um vetor para o processo de transformação, são selecionados um ou mais componentes genéticos que são introduzidos na célula ou tecido vegetal. Os componentes genéticos podem incluir qualquer ácido nucleico que é introduzido em uma célula ou tecido vegetal, usando o método de acordo com a invenção. Em uma modalidade, os componentes genéticos são incorporados em uma composição de DNA, tal como um plasmídeo recombinante de filamento duplo ou molécula de vetor que compreende pelo menos um ou mais dos seguintes tipos de componentes genéticos: (a) um promotor que funciona em células vegetais para causar a produção de uma seqüência de RNA, (b) uma seqüência de DNA estrutural que causa a produção de uma seqüência de RNA que codifica um produto de utilidade agronômica, e (c) uma seqüência de 3' DNA não-traduzida que funciona em células vegetais para causar a adição de nucleotídeos poliadenilados à extremidade 3' da seqüência de RNA.
O vetor pode conter inúmeros componentes genéticos para facilitar a transformação célula ou tecido vegetal e regular a expressão da seqüência de ácidos nucleicos estrutural. Em uma modalidade preferida, os componentes genéticos são orientados de modo a expressar um RNAm, que, em uma modalidade opcional, pode ser traduzido em uma proteína. A expressão de uma seqüência codificadora estrutural vegetal (um gene, DNAc, DNA sintético, ou outro DNA) que existe na forma de filamento duplo, envolve a transcrição de RNA mensageiro (RNAm) a partir de um filamento do DNA por enzima RNA polimerase e subseqüente processamento do 5 transcrito primário do RNAm dentro do núcleo. Este processamento envolve uma região 3' não-traduzida que adiciona nucleotídeos poliadenilados às extremidades 3' do RNAm. Os meios para preparar plasmídeos ou vetores que contêm os componentes genéticos desejados são bem conhecidos nessas técnicas.
Quando uma construção de DNA contém mais do que um T
DNA, estes T-DNA's e os transgenes contindos dentro podem ser integrados no genoma da planta em Ioci separados. Isso é referido como "cotransformação" (patente n- US 5.731.179, documento n2 WO 00/18939). O processo de cotransformação, onde dois T-DNA1S estão em Ioci diferentes no genoma da planta, e portanto, segregam independentemente na progênie, pode ser realizado por distribuição dos T-DNA1S com uma mistura de Agrobaeteria transformadas com plasmídeos portadores do T-DNA separado. A cotransformação pode ser realizada também transformando uma cepa de Agrobaeterium com duas construções de DNA binárias, cada uma contendo um TDNA (por exemplo, Daley et al., 1998). Dois T-DNA1S podem ser também desenhados em um único vetor de DNA, e em seguida, transformando o vetor em uma célula vegetal e depois identificando as células ou plantas transgênicas que integraram os T-DNA1S em Ioei diferentes (patente n2 US 5.731.179, documento ns WO 00/18939, Komari et al, 1996; patente n2 7.288.694).
Um sistema com dois T-DNA é um método útil para segregar o gene marcador do gene agronomicamente importante de interesse (GOI) em uma planta transgênica. O gene marcador não tem geralmente qualquer utilidade adicional depois que ele foi usado para selecionar ou eleger ou esco30 Iher a célula vegetal transformada. Um vetor com um único DNA portando os dois T-DNA1S é um método para construir um sistema de transformação com dois T-DNA1S. Entretanto, por causa da ocorrência de ambos T-DNA1S em uma única construção de DNA, ambos podem ser transferidos para o genoma da planta no mesmo locus. Isto ocorre quando uma das moléculas do DNA do limite do primeiro T-DNA não é reconhecida durante o processo de integração. Esta eficiência reduzida se soma ao custo para produzir os epi5 sódios e selecionar quanto aos indivíduos que têm T-DNA's integrados em um locus independente. Pode ser, assim, desejável ter construções de DNA e um método no qual é possível selecionar quimicamente contra indivíduos que incorporaram os dois T-DNA1S no mesmo locus, e ao mesmo tempo, selecionar quanto à presença/ausência e estado de ligação de cada um dos 10 T-DNA1S.
A transcrição do DNA no RNAm é regulada por uma região do DNA usualmente referida como o "promotor". A região promotora contém uma seqüência de bases que sinaliza RNA polimerase para associar com o DNA e para iniciar a transcrição no RNAm usando um dos filamentos do 15 DNA como um modelo para produzir um filamento complementar correspondente de RNA. Inúmeros promotores que são ativos em células vegetais foram descritos na literatura. Tais promotores incluiriam, porém sem limitações, os promotores de nopalina sintase (NOS) e octopina sintase (OCS) que são carregados em plasmídeos Ti de Agrobacterium tumefaciens, os 20 promotores de caulimovírus tais como os promotores do vírus do mosaico da couve-flor (CaMV) 19S e 35S o promotor do vírus do mosaico da escrofulária (FMV) 35S, e o promotor intensificado de CaMV35S (e35S). Vários outros promotores de genes de plantas, que são regulados em resposta a sinais ambientais, hormonais, químicos e/ou desenvolvimentais, também podem 25 ser usados para a expressão de genes heterólogos em células vegetais, incluindo, por exemplo, promotores regulados por (1) calor (Callis et ai, 1988, (2) Iuz (por exemplo, promotor RbcS-3A da ervilha, Kuhlemeier et ai, (1989); promotor RbcS do milho, Schaffner et ai, (1991); (3) hormônios, tal como ácido abscísico (Marcotte et al., 1989, (4) ferimento (por exemplo, Wuni, Si30 ebertz et ai, 1989); ou outros sinais ou produtos químicos. A expressão específica de tecidos também é conhecida. Como descrito abaixo, prefere-se que o promotor específico selecionado seja capaz de causar expressão suficiente para resultar na produção de uma quantidade eficaz do produto gênico de interesse. Os exemplos que descrevem tais promotores incluem, sem limitações, patente n2 US 6.437.217 (promotor RS81 do milho), patente n2 US 5.641.876 (promotor de actina do arroz), patente n2 US 6.426.446 (pro5 motor RS324 do milho), patente n2 US 6.429.362 (promotor PR-1 do milho), patente n2 US 6.232.526 (promotor A3 do milho), patente n2 US 6.177.611 (promotores constitutivos do milho), patentes n— US 5.322.938, 5.352.605, 5.359.142 e 5.530.196 (promotor 35S), patente n2 US 6.433.252 (promotor de oleosina L3 do milho), patente n2 US 6.429.357 (promotor de actina 2 do 10 arroz bem como um íntron de actina 2 do arroz), patente n2 US 5.837.848 (promotor específico de raiz), patente ne US 6.294.714 (promotores induzíveis por luz), patente n2 US 6.140.078 (promotores induzíveis por sais), patente n2 US 6.252.138 (promotores induzíveis por patógenos), patente n2 US 6.175.060 (promotores induzíveis por deficiência de fósforo), patente n2 US 15 6.635.806 (promotor de gama-coixina), e pedido de patente n2 de série US 09/757.089 (promotor de cloroplasto aldolase do milho). Os promotores adicionais que podem encontrar uso são um promoter de nopalina sintase (NOS) (Ebert et al., 1987), o promotor de octopina sintase (OCS) (que é transportado em plasmídeos indutores de tumores de Agrobacterium tume20 faciens), os promotores de caulimovírus tais como o promotor 19S do vírus do mosaico da couve-flor (CaMV) (Lawton et al., 1987), promotor 35S de CaMV (Odell et al., 1985), o promotor 35S do vírus do mosaico da escrofulária (Walker et al., 1987; patentes n— US 6.051.753; 5.378.619), o promotor de sacarose sintase (Yang et al., 1990), o promotor do complexo do gene R 25 (Chandler et al., 1989), e o promotor do gene da proteína Iigante clorofila a/b, PCISV (patente n2 US 5.850.019), e promotores AGRtu.nos (Número de Acesso do GenBank V00087; Depicker et al, 1982; Bevan etal., 1983).
Os híbridos de promotores também podem ser construídos para intensificar a atividade transcricional (patente n2 US 5.106.739), ou para combinar atividade transcricional desejada, induzibilidade e especificidade de tecido ou especificidade desenvolvimental. Os promotores que funcionam em plantas incluem, porém sem limitações, promotores que são induzíveis, virais, sintéticos, constitutivos como descritos, e temporalmente regulados, espacialmente regulados, e regulados espacialmente e também temporalmente. Outros promotores que são intensificados por tecidos, específicos de tecidos, ou regulados de forma desenvolvimental também são conhecidos 5 nessas técnicas e previstos como tendo utilidade na prática desta invenção.
Os promotores usados nas construções de DNA (isto é, genes de plantas quiméricas/recombinantes) da presente invenção podem ser modificados, caso desejado, para afetar suas características de controle. Os promotores podem ser derivados por meios de ligação com regiões de ope10 rador, mutagênese aleatória ou controlada, etc. Além disso, os promotores podem ser alterados para conter múltiplas "seqüências intensificadoras" para auxiliar em elevar a expressão gênica.
O RNAm produzido por uma construção de DNA da presente invenção pode conter também uma seqüência-líder 5' não-traduzida. Esta seqüência pode ser derivada a partir do promotor selecionado para expressar o gene e pode ser especificamente modificada de modo a aumentar ou diminuir a tradução do RNAm. As regiões 5' não-traduzidas podem ser obtidas a partir de RNA's virais, a partir de genes eucarióticos apropriados, ou a partir de uma seqüência gênica sintética. Tais seqüências "intensificadoras" podem ser desejáveis para aumentar ou alterar a eficiência da tradução do RNAm resultante. A presente invenção não está limitada às construções nas quais a região não-traduzida é derivada a partir seqüência 5' não-traduzida que acompanha a seqüência promotora. Ao invés disso, a seqüência-líder não-traduzida pode ser derivada a partir de promotores ou genes não relacionados (vide, por exemplo, patente n- US 5.362.865). Os exemplos de seqüências-líderes não-traduzidas incluem líderes de proteínas de choque térmico do milho e petúnia (patente n2 US 5.362.865), líderes de proteínas do revestimento viral vegetal, líderes da rubisco de plantas, GmHsp (patente n2 US 5.659.122), PhDnaK (patente n2 US 5.362.865), AtAntI, TEV (Carrington e Freed, 1990), e AGRtu.nos (N2 de Acesso GenBank V00087; Bevan et al., 1983). Outros componentes genéticos que servem para intensificar a expressão ou afetar a transcrição ou tradução de um gene também estão previstos como componentes genéticos.
A região 3' não-traduzida das construções quiméricas pode conter um terminador transcricional, ou um elemento que tem função equivalente, e um sinal de poliadenilação que funciona em plantas para causar a adi5 ção de nucleotídeos poliadenilados à extremidade 3' do RNA. As seqüências de DNA são aqui referidas como regiões de terminação da transcrição. As regiões são necessárias para a poliadenilação eficiente do RNA mensageiro transcrito (RNAm). A RNA polimerase transcreve uma seqüência de DNA codificadora através de um sítio onde a poliadenilação ocorre. Os exemplos 10 de regiões 3' regiões apropriadas são (1) as regiões 3' transcritas, nãotraduzidas que contêm o sinal de poliadenilação genes de plasmídeos indutores de tumores (Ti) de Agrobacterium, tais como o gene de nopalina sintase (NOS; Fraley et al., 1983), e (2) os genes de plantas tais como os genes de proteínas de armazenamento de soja e a subunidade pequena do gene 15 de ribulose-1, 5-bisfosfato carboxilase (ssRUBISCO). Um exemplo de uma região 3' preferida é aquela do gene ssRUBISCO E9 da ervilha (pedido de patente europeu n2 0385 962).
Em uma modalidade, o vetor contém um gene selecionável, ou capaz de ser triado ou marcado. Estes componentes genéticos são aqui referidos também como componentes genéticos funcionais, pois eles produzem um produto que serve para uma função na identificação de uma planta transformada, ou um produto de utilidade agronômica. O DNA que serve como um dispositivo de seleção ou triagem pode funcionar em um tecido vegetal regenerável para produzir um composto que conferiria depois a resistência do tecido vegetal a um composto de outra forma tóxico. Inúmeros genes marcadores capazes de serem triados ou selecionados são conhecidos nessas técnicas e podem ser usados na presente invenção. Os genes de interesse para uso como um gene capaz de ser selecionado, triado ou marcado incluiriam, porém sem limitações, gus, proteína verde fluorescente (gfp), Iuciferase (Iux), dentre outros. Em certas modalidades, o vetor compreende um gene aadA com elementos reguladores associados que codificam resistência à espectinomicina em células vegetais. Em uma modalidade específica, o gene aadA compreende uma seqüência de peptídeo de trânsito de cloroplasto (CTP) que direciona o transporte do produto gênico AadA para o cloroplasto de uma célula vegetal transformada. Em outras modalidades, o vetor compreende um gene de resistência à espectinomicina com e5 Iementos reguladores apropriados desenhados para a expressão em uma célula bacteriana, tal como uma célula de Agrobacterium, de tal modo que o reagente de seleção possa ser adicionado a um meio de cocultivo, e permitir a obtenção de plantas transgênicas, por exemplo, sem uso adicional do agente seletivo depois do período de cocultura.
A presente invenção pode ser usada com qualquer plasmídeo ou
vetor apropriado de transformação de plantas que contém um marcador selecionável ou capaz de ser triado e elementos reguladores associados, como descrito, junto com um ou mais ácidos nucleicos expressados de uma maneira suficiente para conferir um traço desejável específico. Os exemplos de 15 genes estruturais apropriados de interesse agronômico previstos pela presente invenção incluiriam, porém sem limitações, genes para tolerância a doenças, insetos ou pragas, tolerância a herbicidas, genes para melhoras de qualidades tais como rendimento, intensificação nutricional, tolerância ao meio ambiente ou tensão, ou quaisquer mudanças desejáveis na fisiologia 20 das plantas, crescimento, desenvolvimento, morfologia de plantas, ou produto ou produtos vegetais, incluindo produção de amido (patentes n— US 6.538.181; 6.538.179; 6.538.178; 5.750.876; 6.476.295), produção de óleos modificados (patentes n25 US 6.444.876; 6.426.447; 6.380.462), alta produção de óleos (patentes n25 US 6.495.739; 5.608.149; 6.483.008; 6.476.295), 25 teor modificado de ácidos graxos (patentes n— US 6.828.475; 6.822.141; 6.770.465; 6.706.950; 6.660.849; 6.596.538; 6.589.767; 6.537.750; 6.489.461; 6.459.018), alta produção de proteínas (patente n2 US 6.380.466), amadurecimento de frutos (patente n2 US 5.512.466), maior nutrição animal e humana (patentes n— US 6.723.837; 6.653.530; 6.541.259; 30 5.985.605; 6.171.640), biopolímeros (patentes n— US RE37,543; 6.228.623; 5.958.745 e publicação de patente n2 US 2003/0028917). Além disso, resistência a stress ambiental (patente n2 US 6.072.103), peptídeos farmacêuticos e peptídeos secretáveis (patentes n— US 6.812.379; 6.774.283; 6.140.075; 6.080.560), traços de melhor processamento (Patente número US 6,476,295), melhor digestibilidade (patente n2 US 6.531.648) baixo teor de rafinose (patente n2 US 6.166.292), produção industrial de enzimas (pa5 tente n2 US 5.543.576), melhor sabor (patente n2 US 6.011.199), fixação de nitrogênio (patente n2 US 5.229.114), produção de sementes híbridas (patente n2 US 5.689.041), produção de fibras (patentes n— US 6.576.818; 6.271.443; 5.981.834; 5.869.720) e produção de biocombustíveis (patente n2 US 5.998.700). Qualquer um destes ou outros elementos genéticos, méto10 dos, e transgenes podem ser usados com a invenção, como deve ser avaliado pelos versados nessas técnicas tendo em vista a presente invenção.
Alternativamente, as seqüências de DNA de interesse podem afetar estes fenótipos codificando uma molécula de RNA que causa a inibição direcionada da expressão de um gene endógeno por intermédio de tec15 nologias silenciadoras de genes, tais como mecanismos mediados por antisense, co-supressão, tecnologias de RNAi incluindo RNAmi (por exemplo, publicação do pedido de patente n2 US 2006/0200878).
Os ácidos nucleicos exemplificativos que podem ser introduzidos pelos métodos englobados pela presente invenção incluem, por exemplo, seqüências de DNA ou genes de outras espécies, ou mesmo genes ou seqüências que se originam ou estão presentes na mesma espécie, mas são incorporadas em células recebedoras por métodos de engenharia genética ao invés de métodos técnicas clássicas de reprodução ou criação. Entretanto, o termo "exógeno" pretende incluir também referência a genes que não estão normalmente presentes na célula que está sendo transformada ou talvez simplesmente não presentes na forma, estrutura, etc., como encontrados no segmento de DNA em transformação ou gene, ou genes que estão normalmente presentes ainda que se deseje, por exemplo, tenham sido superexpressado. Assim sendo, o termo gene ou DNA "exógeno" pretende referir-se a qualquer gene ou segmento de DNA que é introduzido em uma célula recebedora, independentemente de se um gene similar já possa estar presente nesta célula. O tipo de DNA incluído no DNA exógeno pode incluir o DNA que já está presente na célula vegetal, DNA de outra planta, DNA de um organismo diferente, ou um DNA gerado externamente, tal como uma seqüência de DNA que contém uma mensagem antisenso de um gene, ou uma seqüência de DNA que codifica uma versão sintética ou modificada de 5 um gene.
Em uma modalidade, a transformação de tecido vegetal é realizada por métodos mediados por Agrobacterium ou outra Rhizobia, e as seqüências de DNA de interesse estão presentes em um ou mais T-DNA1S (patentes n— US 6.265.638, 5.731.179; publicações de pedidos de patentes n— 10 US 2005/0183170; 2003/110532), ou outra seqüência (por exemplo, esqueleto de vetor) que é transformada em uma célula vegetal. Os T-DNA's que podem ser ligados por seqüências RB e/ou LB, ou podem não seqüências de extremidade (border). As seqüências que podem ser transferidas para dentro de uma célula vegetal podem estar presentes em um vetor de trans15 formação em uma cepa bacteriana que está sendo utilizada para transformação. Em outra modalidade, as seqüências podem estar presentes em vetores de transformação separados na cepa bacteriana. Em ainda outra modalidade, as seqüências podem ser encontradas em células ou cepas bacterianas separadas usadas conjuntamente para transformação.
As construções de DNA usadas para transformação nos méto
dos da presente invenção contêm também geralmente os segmentos de DNA do esqueleto do plasmídeo, que fornecem a função de replicação e seleção com antibióticos em células bacterianas, por exemplo, uma origem de replicação de Escherichia eoli, tal como or/322, uma origem de replicação 25 de Agrobaeterium, tal como or/V ou or/Ri, e uma região codificadora para um marcador selecionável tal como Spec/Strp que codifica aminoglicosídeo adeniltransferase Tn7 (aadA) que confere resistência a espectinomicina ou estreptomicina (vide, por exemplo, patente n2 US 5.217.902; ou Sandvang, 1999). Para a transformção de plantas, a cepa bacteriana hospedeira é fre30 qüentemente Agrobaeterium tumefaeiens ABI, C58, LBA4404, AGLO, AGL1, EHA101, e EHA105 portadora de um plasmídeo que tem uma função de transferência para a unidade de expressão. Outras cepas conhecidas pelos versados nessas técnicas de transformação de plantas podem funcionar na presente invenção.
A distribuição gênica mediada de forma bacteriana (por exemplo, mediada por Agrobacteriunr, patentes n— US 5.563.055; 5.591.616;
5 5.693.512; 5.824.877; 5.981.840) pode ser feita em células no meristema vivo de um embrião excisado de uma semente (por exemplo, patente n2 US
6.384.301), e região meristemática pode ser cultivada na presença de um agente de seleção, tal como espectinomicna. O resultado desta etapa é a terminação ou pelo menos o retardamento do crescimento da maioria das 10 células para dentro das quais a construção genética estranha não foi distribuída com a formação simultânea de brotos, que se originam a partir de uma única célula meristemática transformada, ou pequeno agregado de células, incluindo células meristemáticas transformadas. Em modalidades específicas, o meristema pode ser cultivado na presença de espectinomicina, es15 treptomicina ou outro agente seletivo, para cuja tolerância é codificado pelo gene aadA. Os exemplos de vários marcadores selecionáveis e genes que proporcionam resistência contra eles estão descritos em Miki e McHugh, 2004.
À Iuz deste relatório descritivo, inúmeros outros elementos reguIadores possíveis e outras seqüências de interesse devem ficar evidentes para os versados nessas técnicas. Portanto, a discussão precedente pretende ser exemplificativa e não exaustiva.
Marcadores peneiráveis ou classificáveis podem ser empregados para identificar setores e/ou plantas transgênicas. Os marcadores e25 xemplificativos são conhecidos e incluem D-glicuronidase (GUS) que codifica uma enzima para vários substratos cromogênicos (Jefferson et ai, 1987a; Jefferson et ai, 1987b); um gene de Iocus R, que codifica um produto que regula a produção de pigmentos de antocianina (cor vermelha) em tecidos de plantas (Dellaporta et al., 1988); um gene de D-Iactamase (Sutcliffe et ai, 30 1978); um gene que codifica uma enzima para os vários substratos cromogênicos são conhecidos (por exemplo, PADAC, uma cefalosporina cromogênica); um gene de Iuciferase (Ow et ai, 1986); um gene xy1E (Zukowsky et al., 1983) que codifica uma catecol dioxigenase ue pode converter catecóis cromogênicos; um gene de Oamilase (Ikatu et ai, 1990); um gene de tirosinase (Katz et ai, 1983) que codifica uma enzima capaz de oxidar tirosina para DOPA e dopaquinona, que por sua vez condensa para melanina; prote5 ína verde fluorescente (Elliot et ai, 1999) e uma D-galactosidase. Como é do conhecimento nessas técnicas, outros métodos para a transformação de plantas podem ser utilizados, por exemplo, como descrito por Miki et ai, (1993), incluindo o uso de bombardeio de microprojéteis (por exemplo, patente n2 US 5.914.451; McCabe et ai, 1991; patentes n— US 5.015.580; 10 5.550.318;5.538.880).
São conhecidos vários meios de cultura de tecidos, os quais, quando suplementados adequadamente, suportam o crescimento e desenvolvimento de tecidos, incluindo a formação de plantas maduras a partir de meristemas excisados. Estes meios de cultura de tecidos podem ser adquiridos como uma preparação comercial ou preparada especialmente, e modificada pelos versados nessas técnicas. Os exemplos desses meios incluem, porém sem limitações, aqueles descritos por Murashige e Skoog, (1962); Chu et ai, (1975); Linsmaiere Skoog, (1965); Uchimiya e Murashige, (1962); Gamborg et ai, (1968); Duncan et ai, (1985); McCown e Lloyd, (1981); Nitseh e Nitsch (1969); e Schenk e Hildebrandt, (1972), ou derivações desses meios suplementados adequadamente. Os versados nessas técnicas estão cientes que os meios e suplementos de meios tais como nutrientes e reguladores do crescimento para uso em transformação e regeneração são usualmente otimizados para a cultura-alvo ou variedade-alvo de interesse. Os meios de cultura de tecidos podem ser suplementados com carboidratos tais como, porém sem limitações, glicose, sacarose, maltose, manose, frutose, lactose, galactose, dextrose, ou proporções de carboidratos. Os reagentes estão disponíveis no mercado e podem ser adquiridos de inúmeros fornecedores (vide, por exemplo, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO; e PhytoTechnology Laboratories, Shawnee Mission, KS).
As plantas transgênicas podem ser regeneradas a partir de uma célula vegetal transformada por métodos e composições aqui descritas, tais como, porém sem limitações, os Protocolos "A" até "D" com espectinomicina, como realizados em soja, milho, algodão ou canola. Uma planta transgênica formada usando métodos de transformação com Agrobacterium contém tipicamente (porém nem sempre) uma única seqüência de DNA recombinan5 te simples inserida dentro de um cromossoma e é referida como um episódio transgênico. Tais plantas transgênicas podem ser referidas como sendo heterozigotos para a seqüência exógena inserida. Um homozigoto de planta transgênica com relação a um transgene pode ser obtido por reprodução sexuada (autocruzamento ou selfing) de uma planta transgênica segregante 10 independente que contém uma única seqüência gênica exógena para si própria, por exemplo, uma planta RO, para produzir uma semente R1. Um quarto da semente R1 produzida será homozigótico com relação ao transgene. A semente R1 germinante resulta em plantas que podem ser testadas quanto à zigosidade, usando tipicamente um ensaio SNP ou um ensaio de ampíia15 ção térmica que permite a distinção entre heterozigotos e homozigotos (isto é, um ensaio de zigosidade).
Para confirmar a presença do DNA exógeno ou "transgene(s)" nas plantas transgênicas, uma série de ensaios pode ser realizada. Tais ensaios incluem, por exemplo, ensaios de "biologia molecular", tais como Sou20 thern e Northern blotting e PCR®; ensaios "bioquímicos", tais como detecção da presença de um produto proteico, por exemplo, por meios imunológicos (ELISAs e Western blots) ou por função enzimática (por exemplo, ensaio GUS); histoquímica de pólens; ensaios de parte de plantas, tais como ensaios de folha ou raiz; e também analisando o fenótipo da planta regenerada 25 total.
Depois que um transgene foi introduzido em uma planta, este gene pode ser introduzido em qualquer planta sexuadamente compatível com a primeira planta cruzando, sem a necessidade de sempre transformar diretamente a segunda planta. Portanto,como aqui utilizado, o termo "progê30 nie" denota a descendência de qualquer geração de uma planta parental preparada de acordo com a presente invenção, onde a progênie compreende uma construção de DNA selecionada. Uma "planta transgênica" pode ser, assim, de qualquer geração. O "cruzamento" de uma planta para produzir uma linhagem de planta que tem tem um ou mais transgenes ou alelos adicionados em relação a uma linhagem de planta originária é definido como as técnicas que resultam em uma seqüência específica que está sendo introdu5 zida em uma linhagem de planta cruzando uma linhagem de partida com uma linhagem de planta doadora que compreende um transgene ou alelo. Para conseguir isto poder-se-ia, por exemplo, realizar as seguintes etapas: (a) plantar sementes da primeira (linhagem de partida) e segunda (linhagem de planta doadora que compreende um transgene ou alelo desejado) plantas 10 parentais; (b) desenvolver as sementes da primeira e segunda plantas parentais para dar plantas portadoras de flores; (c) polinizar uma flor da primeira planta parental com pólen da segunda planta parental; e (d) colher sementes produzidas na planta parental portadora da flor fertilizada.
A presente invenção fornece também partes de planta ou uma planta produzida pelos métodos da presente invenção. As partes da planta, sem limitações, incluem fruto, semente, endosperma, óvulo, pólen, folha, talo, e raízes. Em uma modalidade preferida da presente invenção, a parte da planta é uma semente.
Em outro aspecto, a invenção fornece uma molécula de ácido nucleico isolada que compreende uma seqüência que codifica um polipeptídeo que compreende uma fusão traduzida de peptídeo de trânsito de cloroplasto (CTP)-aadA. Em certas modalidades, o ácido nucleico compreende SEQ ID NO: 2.
EXEMPLOS
Os versados nessas técnicas devem avaliar as muitas vanta
gens dos métodos e composições fornecidas pela presente invenção. Os exemplos que se seguem são incluídos para demonstrar as modalidades preferidas da invenção. Os versados nessas técnicas devem avaliar que as técnicas descritas nos exemplos que se seguem representam técnicas des30 cobertas pelos inventores para funcionar bem na prática da invenção, e assim sendo, podem ser considerados como constituindo modos preferidos para sua prática. Entretanto, os versados nessas técnicas, à Iuz do presente relatório descritivo, avaliam que muitas mudanças podem ser feitas nas modalidades específicas descritas e ainda assim obter um resultado semelhante ou similar sem fugir do espírito e âmbito da invenção. Todas referências aqui citadas são aqui incorporadas como referência até o grau em que elas 5 suplementam, explicam, fornecem um fundamento para enunciar a metodologia, técnicas ou composições aqui empregadas.
EXEMPLO 1
Preparação de Explante e Material de Inoculacão
A. Soia
Para obter material de explante meristemático, sementes de soja
(por exemplo, cv. A3525; Asgrow Seed Company) foram processadas para separar o embrião, compreendendo tecidos meristemáticos, a partir de outros tecidos, incluindo o revestimento de semente e cotilédone(s). A preparação manual de explantes fornece tecido que é apropriado para transformação mediada por Agrobacterium de meristemas de soja (patente n2 US
6.384.301), e os métodos de transformação mediados por partículas (patente n2 US 5.914.451) são conhecidos. Os métodos mecânicos para extrair explantes também foram descritos na publicação do pedido de patente n2 US 2005/0005321 e publicação do pedido de patente n2 US 2006/0059589. 20 Todos estes métodos resultam em um explante de meristema que é suficientemente transformável pelos métodos descritos.
B. Algodão
Sementes de algodão foram processadas mecanicamente para excisar e isolar seus tecidos meristemáticos. Alternativamente, os explantes 25 de algodão podem ser preparados por excisão do eixo embrionário da semente, cotilédones, e hipocotilédones (por exemplo, McCabe e Martinell, 1993). Para obter material de explante meristemático transformável, as sementes de algodão (por exemplo, dos genótipos STN474 (Stoneville Pedigreed Seed Co., Stoneville, MS), Delta Pearl (Delta and Pine Land Co., 30 Scott, MS), DP5415, DP393, 00S04 (Delta and Pine Land Co.), SureGrow501 ou SureGrow747 (Sure Grow Cotton Seed Company, Maricopa, AZ) foram processadas como se segue, para separar o embrião, compreendendo tecidos meristemáticos, do revestimento da semente e cotilédone(s). As sementes de algodão foram removidas da estocagem a 4 0C ou -20 0C e levadas para a temperatura ambiente. As sementes foram pesadas, colocadas dentro de uma unidade germinadora estéril, e esterilizadas na superfície em Clorox a 50% (hipoclorito de sódio) por 5 min. As sementes foram então enxaguadas 3 vezes com água destilada esterilizada e re-hidratadas em um meio de hidratação líquido (CSM) a 28 0C no escuro por cerca de 18 h (faixa de 14 a 42 horas). Alternativamente, uma temperatura de germinação pode ser mais baixa, por exemplo, cerca de 23 °C. O meio CSM continha 200 mg/L de carbenicilina (PhyoTechnoIogy Laboratories, Shawnee Mission, KS), 125 mg/L de cefotaxima (Midwest Scientific, St. Louis, MO), 30 mg/L de BRAVO 75 (Carlin, Milwaukee, Wl) e 30 mg/L de Captan 50 (Carlin). Outras soluções também foram usadas com sucesso para hidratar as sementes de algodão, incluindo água desmineralizada estéril, contendo uma concentração fraca de lixívia tipicamente 50 a 1.000 ppm de hipoclorito de sódio. Depois da hidratação, as sementes podem ser usadas imediatamente ou estocadas em temperaturas de refrigeração durante até uma semana antes de processamento adicional. A excisão mecânica de explantes de algodão também pode ser utilizada (documento na W092/15675; Keller et ai, 1997; McCabe & Martinell, 1993; publicação de patente n2 US 2005/0005321).
C. Preparação de Agrobacterium para inoculacão e cocultivo
A cepa de Agrobacterium C58, contendo um vetor binário com um ou dois cassetes de expressão de planta, como descrito acima, foi inocuIada a partir de um insumo em glicerina, dentro de um meio LB líquido (10 25 g/L de cloreto de sódio, 5 g/L de extrato de levedura, 10 g/L de bactotriptona), contendo 75 mg/mL de espectinomicina e 50 mg/mL de canamicina. A cultura líquida foi deixada crescer a 28 0C a 200 rpm em um vascolejador rotativo durante a noite inteira. Depois que a densidade óptica (DOeeo) da cultura noturna atingiu a faixa-alvo de 0,4-1,2, a cultura bacteriana foi centri30 fugada a 3.500 rpm por aproximadamente 20-25 min para peletizar as células.
Depois da remoção do sobrenadante, o pélete foi recolocado em suspensão em 10 mL de um meio de inoculação (INO, Tabela 1). A ϋΟββο (uma medição indireta da concentração bacteriana) foi medida e diluída e ajustada até D066o de cerca de 0,28-0,32. Depois que as culturas de Agrobacterium são preparadas, os explantes de planta são expostos ao inóculo, 5 brevemente expostas a energia de ultrassom a partir de aparelho de ultrassom para limpeza com banho de água de laboratório padronizado, tal como L&R Ultrasonics QS140 (L&R Manufacturing Co., Kearny, NJ); ou um aparelho de ultrassom Honda W113 (Honda, Denshi Japão) por 20 segundos a 2 minutos, dependendo do tipo de explante. Depois da breve etapa de ultras10 som, os explantes são drenados para remover o inóculo e transferidos para PLANTCONs frescos, cada um contendo 5 mL de meio INO e um pedaço de papel de filtro, usualmente dentro de várias horas depois do começo da transfecção. Os explantes são então incubados emu ma câmara iluminada (geralmente 16 horas de Iuz a > 5uE) a aproximadamente 23 a 28 0C por 1 a 15 5 dias. Vários estudos de expressão transiente de GUS indicaram que uma DO660 de 0,3-0,8 do inóculo produziu uma proporção comparativamente mais alta de transformação meristemática e expressão de transgene, embora medições mais baixas e mais altas de ϋΟββο também resultem resultados experimentais exitosos.
Tabela 1. Composição do meio de inoculação
Inarediente Quantidade/L Sulfato de magnésio (Fisher M63) 0,1 g Sulfato de amônio (Fisher A702) 53,6 mg Fosfato de sódio mono-hidratado (Fisher S369-500) 60 mg Cloreto de cálcio (Sigma C-3881) 60 mg Ácido bórico (Fisher A73-3) 0,3 mg Sulfato de manganês (Sigma I-2550) 1 mg Sulfato de zinco hepta-hidratado (Sigma Z-1001) 0,2 mg Iodeto de potássio (Sigma P-8166) 0,075 mg Molibdato de sódio diidratado (Sigma S-6646) 0,025 mg Sulfato cúprico (Fisher C493-500) 2,5 μg Cloreto de cobalto hexaidratado (Sigma C-2911) 2,5 pg Sequestrene (Ciba 964603) 2,8 mg Ingrediente Quantidade/L Nitrato de potássio (Sigma P-8291) 1 9 Glicose (Phytotech G386) 30 g MES (Sigma M8250) 3,9 g Levar volume até 1L com água destilada desmineralizada pH com KOH até 5,4 Autoclave Adicionar insumo de vitamina contendo o seguinte Mioinositol (Sigma 1-3011) 10 mg Ácido nicotínico (Sigma N-0765) 0,1 mg Cloridrato de piridoxina (Sigma P-8666) 0,1 mg Cloridrato de tiamina (Sigma T-3902) 1 mg EXEMPLO 2
Transformação de Explantes de Soia - Tratamento com Citocinina
Para transformação de soja mediada por Agrobacterium, foi preparado um inóculo da cepa ABI (C58) que abriga um vetor binário, tal como 5 pMON96999, que contém um gene marcador de gus e um gene aadA que confere resistência a espectinomicina, pMON101343 que contém os genes CP4 EPSPS e GUS, ou pMON774()4 que contém um gene marcador gfp e um gene que codifica CP4 EPSPS que confere tolerância a glifosato, ou pMON73737 que contém um gene marcador gfp e um gene de DMO que 10 confere tolerância a dicamba.
pMON96999 (Figura 2) contém o gene uidA sob o controle de um promotor intensificado de CaMV35S (patentes n— US 5.322.938; 5.352.605; 5.359.142; e 5.530.196), uma seqüência líder 35S, e uma região 3' não-traduzida do gene de nopalina sintase a partir de Agrobacterium tu15 mefaciens (N- de Acesso do Genbank E01312), e um gene aadA com alvo nuclear para conferir resistência a espectinomicina (patente n- US 5.217.902; (SEQ ID NO:1)). O produto do gene de adeniltransferase aadA foi assestado para o cloroplasto por um peptídeo de trânsito de cloroplasto de Arabidopsis EPSPS (ShkG-CTP2 Klee et ai., 1987.), e estava sob o controle 20 do promotor para o fator de alongamento de Arabidopsis EF-IaIfa (Tsf1; pedido de patente n2 US 2005/0022261) com um intensificador de FMV-35S, um líder TsfI (éxon 1), um íntron Tsfl, e uma região 3' não-traduzida de rbcS2 da ervilha.
A adição de uma citocinina, tidiazuron (TDZ) ou BAP em várias concentrações, foi testada durante a inoculação/cocultivo, bem como depois.
5 Depois da inoculação, o cocultivo foi conduzido por cerca de 2-5 dias (por exemplo, 3 dias) em uma incubadora Percival a cerca de 23 0C com um foto período de 16 hora de luz/8 horas de escuridão (intensidade da Iux > 5 μΕ). Assim sendo, a resposta de explantes à citocinina foi testada, e os efeitos dos diferentes tratamentos sobre a indução de múltiplos brotos e produção 10 de episódios foram avaliados.
A. Efeito do tratamento com citocinina com o uso de qlifosato ou dicamba como agente seletivo.
Para o tratamento com TDZ durante a inoculação e cocultivo, os explantes de soja foram inoculados com a cspa de Agrobacterium ABI que 15 abriga pMON77404 (contendo genes que codificam CP4 EPSPS e GFP), ou pMON101343 (contendo CP4 EPSPS e GUS), e cocultivados com o inóculo suplementado com diferentes níveis da citocinina por 3 dias. Depois do cocultivo, os explantes foram transferidos para o meio de seleção (WPM; Tabela 2) contendo 200 mg/L de carbenicilina e cefotaxima, 100 mg/L de timenti20 na para inibir o crescimento de Agrobacterium e outros contaminantes, e glifosato 75 μΜ ou 0,01 mg/L de dicamba para seleção. Cerca vinte e três dias depois, os explantes foram examinados sob um microscópio equipado com um conjunto de filtros para detectar tecido que expressa GFP, ou examinados quanto à expressão de GUS, conforme apropriado. Como indicado 25 na Tabela 3, mais explantes tratados com TDZ tinham desenvolvido botões que expressam GFP ou brotos jovens em comparação com os explantes não-tratados. O efeito está relacionado à concentração. Neste caso, o marcador selecionável utilizado conferiu tolerância a glifosato. Tabela 2. Composição de WPM usado para a transformação de soia com seleção com glifosato; para seleção com dicamba, o glifosato foi substituído por 0,01 mg/L de dicamba
Ingrediente Quantidade/L LM WPM com vitaminas (Phytotech L449) 2,41 g Sacarose (Phytotech S391) 20 g Gluconato de cálcio (Sigma G-4625) 1,29 g Com ou sem Clearys 3336 WP (Carlin 10-032) 0,03 g AGARGEL (Sigma A-3301) 4g Encher com água até 1 L PH 5,6 Autoclave Carbenicilina (Phytotech C346) (40 mg/mL) 5 mL Cefotaxima (Midwest NDC0039-0019-10) (50 4 mL mg/mL) Timentina (100 mg/ml) (Duchefa T0190) 1 ml Glifosato (0.5M) 3 mL Tabela 3. Efeito de tratamentos com TDZ durante a inoculação e cocultivo sobre o desenvolvimento de botões/brotos transgênicos (GFP-positivos) na
transformação de soia usando seleção com glifosato
Exp- Nível de TDZ no n° de Ex¬ ne de Explantes Fre¬ Trt meio de inoculação plantes com bo¬ qüência e cocultivo (mg/L) examina¬ tões/brotos dos GFP+1 1033-1 0 200 27 13,5% 1033-2 0,5 200 36 18% 1033-3 1,0 200 48 24% 1033-4 1,5 200 50 25% 1033-5 2,0 200 60 30% 1033-6 3,0 200 64 32% Resultados similares foram observados quando os explantes de
soja foram tratados com TDZ depois da inoculação e cocultivo, por exemplo, durante a fase de "retardamento" ou seleção da cultura de tecido.
Entretanto, experimentos adicionais demonstraram que o uso de
TDZ (por exemplo, durante a inoculação/cocultura) com glifosato como o agente seletivo resultou em um decréscimo no número de brotos de soja enraizados transformados, em relação ao número obtido na ausência de TDZ1 como indicado na Tabela 4. Tabela 4. Resultados da transformação de experimentos de seleção com glifosato, comparando diferentes níveis de TDZ no meio de inoculação/cocultura
B rotos colhidos Brotos enraizados N0 Total % de Freqüência de bro- N0 Total % de Brotos enraizados tamento transformados 1041 0 435 57 13,1 9 2,1 0,5 456 21 4,6 5 1,1 1 450 22 4,9 6 1,3 1092 0 1125 189 16,8 40 3,6 0,5 1200 127 10,6 17 1,4 1 1357 95 7 22 1,6 1093 0 1000 101 10,1 22 2,2 1 1100 39 3,5 6 0,5 2 1244 18 1.4 1 0,1 1103 0 900 171 19 53 5,9 2 750 37 4,9 10 1,3 3 850 40 4,7 5 0,6 1104 0 1050 138 13,1 48 4,6 2 1125 57 5,1 10 0,9 3 1074 20 1,9 8 0,7 Continuação e rotos colhidos Brotos enraizados N0 Total % de Freqüência de bro- N0 Total % de Brotos enraizados tamento transformados 1111 0,5 600 112 18,7 26 4,3 1 600 78 13 19 3,2 2 600 40 6,7 3 0,5 1113 0,5 1000 55 5,5 14 1,4 1 1000 68 6,8 10 1 2 950 18 1,9 5 0,5 O efeito do tratamento com citocinina tratamento sobre a freqüência de transformação também foi avaliado usando construções de DNA que codificam tolerância a outro agente seletivo, dicamba. pMON73737, que codifica os genes de GFP e DMO, foi utilizado. Depois do cocultivo, os ex5 plantes foram cultivados por 4 dias sobre um meio que contém 0,01 mg/L de dicamba, com ou sem BAP ou TDZ, como indicado na Tabela 5. O tratamento com BAP ou TDZ resultou em um aumento no número de explantes que apresentavam botões GFP-positivos em um estágio precoce, tal como 24 dias depois da inoculação ("DAI", Tabela 5).
Tabela 5. Efeito de tratamentos com BAP e TDZ por 4 dias depois do cocultivo sobre o desenvolvimento de botões transqênicos (GFP-positivos) na transformação de soia usando seleção com dicamba
Experimen- Pré-tratamento com BAP N- de Explan¬ N2 de Explan¬ to- ou TDZ (4 Dias) tes examina¬ tes com botões Tratamento dos (24 DAi) GFP+(%) 906-1 Nenhum pré-tratamento 284 6(2,1%) 906-2 1 mg/L de BAP 325 12(3,7%) 906-3 2 mg/L de BAP 336 11 (3,3%) 906-4 1 mg/L de TDZ 387 71 (18,3%) 906-5 2 mg/L de TDZ 383 53 (13,8%) Os explantes tratados com TDZ não apresentaram forte domi
nância apical e produziram mais brotos (múltiplos brotos repetitivos), como observado em vários experimentos. Em contraste, os explantes não-tratados apresentaram mais crescimento dos brotos primários (o resultado de dominância apical) e produziram menos brotos. Esses brotos também possivelmente se desenvolveram a partir de brotos axilares. Portanto, a freqüência de transformação resultante foi mais baixa em comparação com os explantes tratados com TDZ. Entretanto, o crescimento (por exemplo, alongamento) dos brotos resultantes da transformação de explantes de soja que sofreram seleção em meio que contém glifosato ou dicamba foi retardado. Usando seleção com glifosato, o tempo entre a inoculação e a subseqüente coIheira de sementes R1 transformadas foi de cerca de 7 meses, e o tempo para o desenvolvimento de brotos enraizados transformados foi de cerca de 10-12 semanas. A adição de uma citocinina (BAP ou TDZ) com seleção com dicamba não teve qualquer efeito visível sobre as freqüências de transformação finais (TFs) obtidas, embora ela resultasse na produção de mais botões GFP-positivos em um estágio precoce, como indicado na Tabela 5.
5 B. Efeitos do tratamento com citocinina com o uso de espectinomicina como agente seletivo
Os explantes foram inoculados com Agrobacterium em meio de inoculação (Tabela 1) por ultrassom durante 20 segundos, e depois cultivados sobre meio de cocultura que é igual ao meio de inoculação, como des10 crito no Exemplo 1. O meio para inoculação e cocultura era suplementado com 2 mg/L de TDZ. Os explantes foram cocultivados por 4 dias a cerca de 23 °C, com um fotoperíodo de 16 h de luz/8 h de escuridão. Depois da cocultura, 12 mL de meio de líquido de retardamento, que é igual ao meio WPM indicado na Tabela 2 exceto que não solidificado com Agargel e sem um a15 gente seletivo (glifosato, dicamba ou espectinomicina), foram adicionados a cada PLANTCON® (MP Biomedicals, Solon, OH) contendo os explantes. Os explantes foram cultivados no meio de retardamento por 4 dias (28 °C, com um fotoperíodo de 16 h de luz/8 h de escuridão). Para a seleção e indução de brotos, os explantes foram transferidos para o mesmo meio líquido, mas 20 sem a adição de diferentes níveis de espectinomicina (25-250 mg/L de espectinomicina). Os explantes foram implantados individualmente dentro das frestas da esponja de espuma no recipiente do PLANTCON. Cada recipiente continha 60 mL de meio e um pedaço de esponja de espuma que retém cerca de 25 explantes.
Em todos tratamentos, os explantes desenvolveram múltiplos
botões e brotos. As amostras de explantes e tecidos resultantes foram coletadas e testadas quanto à atividade de GUS em diferentes estágios. Quando o tecido do explante transformado com um gene aadA e GUS (em pMON96999; Figura 2) foi selecionado na presença de espectinomicina, fo30 ram observados botões e brotos verdes distintos (resistentes à espectinomicina) e Iixiviados (suscetíveis à espectinomicina), bem como tecidos GUSpositivos, em um grande número de explantes tratados com TDZ aproximadamente 3 semanas depois da inoculação (Tabela 8). Até 80% dos explantes desenvolveram botões e brotos GUS-positivos dentro de duas semanas sobre meio seletivo (cerca de 3 semanas depois da inoculação, isto é, cerca de 22 DAI; Tabelas 8-9).
Table 6. Composição do meio de cocultura de Agrobacterium 1595. por L.
Inqrediente Quantidade Água TC 750 mL Insumo de B5 1 (vide abaixo) 1 mL Insumo de B5 2 (vide abaixo) 1 mL Insumo de B5 3 (vide abaixo) 1 mL Insumo de B5 5 (vide abaixo) 1 mL Nitrato de potássio (Sigma P-8291) 1 g Glicose (Phytotech G386) 30 g MES (Sigma M-8250) 3,9 g Adicionar Água TC até 1 L H2O TC até 1.000 ml pH com KOH até 5,4 Autoclave Adicionar insumo de B5 4 (vide abaixo) 1 mL Insumo de B5 n° 1 Sulfato de amônio 53,6 g Sulfato de magnésio 100 g Fosfato de sódio monobásico 60 g Insumo de B5 n° 2 Cloreto de cálcio 60 g Insumo de B5 n° 3 Ácido bórico 0,30 g Sulfato de manganês 1,0 g Sulfato de zinco 0,20 g Iodeto de potássio 0,75 g Molibdato de sódio 0,025 Sulfato de cobre (insumo de 1 mg/mL) 2,5 mL Inarediente Quantidade Cloreto de cobalto (insumo de 1 mg/mL) 2,5 mL Insumo de B5 n° 4 Cloridrato de tiamina 1,0 g Ácido nicotínico 0,1 g Cloridrato de piridoxina 0,1 g Inositol 10 g Insumo de B5 n° 5 Sequestrene 2,8g Um estudo foi conduzido também para avaliar se o tratamento com citocinina BAP também intensificou a freqüência de transformação para transformação de soja usando seleção com espectinomicina, promovendo o desenvolvimento de múitipios brotos. Os explantes de soja foram inoculados 5 e cocultivados com Agrobacterium que abriga pMON96999 (Figura 2). Os meios de inoculação e cocultura foram suplementados com 0, 1, 2, 3, 4 ou 5 mg/L de BAP. Depois da cocultura por 3 dias, os explantes foram cultivados em um meio de retardamento (meio de inoculação sem seleção) por 4 dias. O meio de retardamento também foi suplementado com o mesmo nível de 10 BAP para cada tratamento, como indicado na Tabela 7. Os explantes foram então transferidos para cima de meio de seleção (igual ao meio de retardamento, mas contendo 150 mg/L de espectinomicina) para indução e seleção de brotos. Os explantes no tratamento sem BAP apresentaram mais dominância apical com mais brotos primários alongados.
Para determinar quantos explantes poderiam desenvolver brotos
transformados sem tratamento com BAP, os tecidos dos explantes foram testados quanto à atividade de GUS em 42 dias depois da inoculação. Aproximadamente 18% do explantes que tinham botões ou pequenos brotos GUS+ (Tabela 7). A maioria deles era axilar, e alguns deles eram aparente20 mente quiméricos. Os explantes tratados com BAP tinham brotos primários muito menos ou não-alongados, e mais brotos repetitivos. Muitos dos brotos alongaram sobre o meio de seleção e foram colhidos para induzir sobre o meio de indução de raízes que contém também 150 mg/L de espectinomicina como no protocolo "A". As freqüências de transformação (TFs) foram determinadas baseado no número de brotos enraizados e estão indicadas na Tabela 7. Como havia apenas 18% dos explantes entre os explantes não 5 tratados com BAP que apresentaram botões ou brotos GUS+, uma TF muito mais baixa do que 18% seria esperada caso os explantes não fossem sacrificados para o ensaio de GUS, pois nem todos os botões/brotos GUS+ se desenvolveriam continuamente para eventualmente se tornarem plantas. Portanto, os dados sugeriram fortemente que o tratamento com BAP intensi10 ficou TF inibindo a dominância apical e promovendo desenvolvimento de múltiplos brotos.
Tabela 7. Efeito do tratamento com BAP durante o estágio de retardamento de cocultura e pós-cocuItura
P“.__T-I n a n______: K »0 -J _ λιΟ _ι _ η____I___x__ à ιΩ -I _ Λ / _l _ □Λμ- 111 D/Ar ϋΐιι Iiieiu IN- ut; IN- UfcJ cxpicmifcj» i\- ue ~/o ue N0 de retardamento Explan¬ produtores de plantas TF de cocultura & tes dei¬ botões/brotos enrai¬ 4-d pós- xados axilares GUS+ zadas2 cocultura (mg/L) (42DAI) 1118-11 0 352 65 (18.5%) n/d n/d 1118-2 1 395 n/d 103 26,1 1118-3 2 347 n/d 94 27,1 1118-4 3 350 n/d 87 24,9 1118-5 4 435 n/d 132 30,3 1118-6 5 436 n/d 116 26,6 1 Todos explantes neste tratamento foram avaliados quanto à atividade de
GUS 42 dias depois da inoculação.
2 Enraizados em meio que contém 150 mg/L de espectinomicina. n/d = não disponível Tabela 8. Efeito de tratamentos com diferentes níveis de TDZ durante a inoculacão e cocultura sobre o desenvolvimento de botões GUS-positivos.
Nível de TDZ N2 de Explantes N2 de Explantes % de Explantes para inoculação testados quanto c/botões GUS+ com botões GUS & cocultura a GUS (13 DAI) + (13 DAI) 0,5 mg/L 96 18 18,8 1,0 mg/L 96 34 35,4 2,0 mg/L 96 48 50,0 Tabela 9. Porcentagem de explantes cultivados sobre meio que contém diferentes níveis de espectinomicina que desenvolveram botões e brotos que expressam GUS
Experimento- Nível usado N2 de ex¬ N2 de explantes % tratamento de espectino¬ plantes tes¬ com brotos/botões micina tados GUS+ 1102-1 25 25 13 52 1102-2 50 25 18 72 1102-3 100 25 19 76 1102-4 150 25 18 72 1102-5 200 25 20 80 1102-6 250 25 20 80 Vários níveis de TDZ também demonstraram ser eficazes em
promover o desenvolvimento de botões GUS-positivos. Em contraste com os estudos realizados usando glifosato ou dicamba como um agente seletivo, brotos verdes resistentes à espectinomicina se alongaram bem, e a colheita 10 de brotos pôde ser realizada em seis semanas depois da inoculação. A maior parte do material de explante cultivado produziu broto alongado em alguma hora, embora alguns produzissem mais do que um broto. Um broto alongado foi colhido de cada explante transformado. A colheita dos brotos terminou aproximadamente 9 semanas depois da inoculação, embora ainda mais 15 brotos em alongamento estivessem sendo produzidos a partir de explantes adicionais. Os brotos foram enraizados em um meio de indução de raízes (BRM). Este meio continha /4 da potência de sais MS, vitaminas MS, 100 mg/L de inositol, 100 mg/L de cisteína, 30 mg/L de sacarose e 100 mg/L de ticarcilina, e foi solidificado com 8 g/L de ágar lavado e suplementado também com 150 mg/L de espectinomicina e 0,1 mg/L de IAA ou 0,25 mg/L de IBA como hormônio de enraizamento. A espectinomicina foi empregada a 0- 250 ppm, e até 1.000 ppm em alguns estudos. Como indicado na Tabela 10, no primeiro estudo a freqüência média de transformação foi de 18,6%, fican5 do na faixa entre 12,6 e 26,1%, um aumento significativo em relação a aproximadamente 2% de freqüência de transformação observada em experimentos comparáveis que utilizaram glifosato como agente seletivo. Um estudo posterior confirmou o resultado (Tabela 10). Essa alta freqüência de transformação foi encontrada com uma ampla série de concentrações de especti10 nomicina (25-250 mg/L e até 1.000 mg/L), e usou-se 150 mg/L de espectinomicina em estudos posteriores. Adicionalmente, entre as primeiras 32 plantas testadas para confirmar a transformação, 31 plantas demonstraram posteriormente ser transformadas com apenas um "escape."
Tabela 10. Freqüência de transformação usando seiecão com espectinomicina
Brotos colhidos1 Plantas testdas para transformação Total % de SF Total % TF 1102-1 25 100 46 46 19 19 1102-2 50 216 101 46,8 48 22,2 1102-3 100 175 36 20,6 22 12,6 1102-4 150 111 39 35,1 29 26,1 1102-5 200 188 53 28,2 27 14,4 1102-6 250 200 55 27,5 39 19,5 Total 990 330 33,3 184 18,6 1119-1 50 600 149 24,8 88 14,7 1119-2 100 600 123 20,5 94 15,7 1119-3 150 600 125 20,8 110 18,3 1119-4 200 600 91 15,2 75 12,5 1119-5 250 600 108 18,0 98 16,3 Total 3000 596 19,9 465 15,5 1 Apenas um broto foi colhido a partir de cada explante, embora alguns explantes produzissem múltiplos brotos. Como o alongamento dos brotos não foi uniforme, a colheita dos brotos foi interrompida 9 semanas depois da inoculação, embora mais brotos pudessem ser colhidos posteriormente.
"SF" = freqüência de brotos; "TF" = freqüência de transformação 5 Usando seleção com espectinomicina, o tempo entre a hora de
inoculação e a hora para o desenvolvimento de brotos enraizados transformados foi de cerca de 8 semanas, e a subseqüente colheita de sementes Ri transformadas foi tipicamente em < 6 meses.
Exemplo 3
Desenvolvimento e comparação de transformação rápida e eficiente de soia e de protocolos de cultura usando seleção com espectinomicina
Para melhorar a velocidade e eficiência da transformação de soja, usando seleção com espectinomicina, incluindo tratamento com citocinina, vários protocolos que utilizam seleção corn espectinomicina foram 15 comparados entre si e com um método empregado anteriormente que usou glifosato como meio de seletivo. A Tabela 11 e as Figuras 3-5 delineiam os protocolos e os resultados obtidos. Como assinalado, os protocolos de seleção com espectinomicina demonstraram uma alta freqüência de transformação, e um período de tempo mais curto necessário para completar cada pro20 tocolo (inoculação até semente de próxima geração), em comparação com o protocolo seletivo com glifosato. Os benefícios adicionais incluem simplicidade, reduzido impacto ergonômico, e manuseio eficiente de plantas, levando a custos mais baixos.
A freqüência aumentada em obter plantas transgênicas (~>10X 25 mais eficiente em comparação com seleção com glifosato ou dicamba) proporciona um sistema e método eficiente de transformação com 2 T-DNA’s para acumular traços por transformação em, por exemplo, um germoplasma de ROUNDUP READY®, e em seguida, seleção de segregantes isentos de marcadores do segundo gene de interesse. Devido ao fato de que muitas 30 linhagens de criação de soja são em si tolerantes a glifosato, passar um traço adicional para tal antecedente genético proporciona uma vantagem significativa na integração de traços. Tabela 11. Comparação do protocolo de seleção com glifosato com protocolos de seleção com espectinomicina exempificativos Etapa Protocolo de sele¬ Protocolo de Sele¬ Protocolo de Seleção Protocolo de Seleção Protocolo de Seleção ção com CP4 ção com especti¬ com espectinomicina B com espectinomicina C com espectinomicina nomicina A D Preparação de Embebição de sementes,excisão de explantes, como assinalado acima e na publicação de patente ne US explantes 2005/0005321 Inoculação/ co¬ Ultrassom a granel Ultrassom a granel Ultrassom a granel ou Ultrassom a granel ou Ultrassom a granel cultura ou ultrassom em ultrassom em PLANT¬ ultrassom em PLANT¬ ou ultrassom em PLANTCON indi¬ CON individual com CON individual com PLANTCON indivi¬ vidual com TDZ ou TDZ ou BAP para indu¬ TDZ ou BAP para in¬ dual com TDZ ou BAP para indução ção de múltiplos brotos dução de múltiplos BAP para indução de de múltiplos brotos brotos múltiplos brotos Estágio de pós- Explantes plaquea- Adicionar 12 mL Adicionar 12 mL de Adicionar 12 mL de Plaquear sobre a cocultura I (in¬ dos sobre a superfí¬ de meio líquido meio líquido WPM + meio líquido WPM + superfície os explan¬ dução/seleção cie de meio de sele¬ WPM + CCT com CCT com ou sem es¬ CCT com ou sem es¬ tes sobre meio de de brotos ção semissólido ou sem especti¬ pectinomicina (150 pectinomicina (150 seleção semissólido (WPM + CCT (car- nomicina (150 mg/L) dentro da cocultu¬ mg/L) dentro da cocul¬ (WPM + CCT + es¬ benicilina, cefotaxi- mg/L) dentro da ra PLANTCON para tura PLANTCON para pectinomicina) ma,e ticarcilina) + cocultura PLANT¬ inibir Agrobacterium e inibir Agrobacterium e ~4 semanas glifosato 75 μΜβ) CON para inibir iniciar processo de sele¬ iniciar processo de ~2 semanas Agrobacterium e ção caso a espectinomi- seleção caso a especiniciar processo de cinaesteja incluída; ~4 tinomicinaesteja incluí¬ seleção caso a dias da; ~4 dias espectinomicinaesteja incluída; ~4 dias Continuação Etapa Protocolo de seleção Protocolo de Sele¬ Protocolo de Seleção Protocolo de Seleção Protocolo de Seleção com CP4 ção com especti¬ com espectinomicina B com espectinomicina C com espectinomicina nomicina A D Estágio de pós- Transferir explantes Plaquear sobre a Plaquear sobre a super¬ Plaquear sobre a su¬ n/d cocultura Il (in¬ para meio de sele¬ superfície ou im¬ fície ou implantar ex¬ perfície ou implantar dução e alon¬ ção semissólido plantar explantes plantes sobre meio de explantes sobre meio gamen¬ fresco (WPM + CCT sobre meio de seleção semissólido; ou de seleção semissóli¬ to/seleção de + glifosato seleção semissóli¬ implantar explantes den¬ do; ou implantar ex¬ brotos) 75μΜ);ίιηρΐ3ηί3Γ do; ou implantar tro de esponja de espu¬ plantes dentro de es¬ ~5-6 semanas explantes dentro ma com frestas ou em ponja de espuma com de esponja de es¬ meio de seleçéío líquido frestas ou em meio de puma com frestas de flutuação seleção líquido de flu¬ ou em meio de (WPM+CCT+espectino tuação seleção líquido de micina); (WPM+CCT+espectino flutuação ~6-7 semanas. micina); (WPM+CCT+espe 4 semanas ou mais. ctinomicina); ~6-7 semanas. Estágio de pós- Destacar e cultivar Destacar e cultivar Destacar e cultivar bro¬ Desenvolver explantes Desenvolver explan¬ cocultura Ill (en¬ brotos alongados em brotos alongados tos alongados em tam¬ com brotos verdes em tes com brotos ver¬ raizamento, OU meio semissólido em meio semissó¬ pões Oasis com meio tampões Oasis para des em tampões alongamento & indutor de raízes lido de indução de líquido simples sem se¬ alongamento de brotos Oasis para alonga¬ enraizamento de com glifosato para raízes com espec¬ leção; e indução de raízes a mento de brotos e brotos) indução de raízes e tinomicina para 2-3 semanas em estufa partir de radicais origi¬ indução de raízes a seleção. indução de raízes nais em meio líquido partir de radicais -2-3 semanas em e seleção. simples sem seleção. originais em meio sala de cultura ilumi¬ 2-3 semanas em 2-3 semanas em estufa líquido simples sem nada sala de cultura seleção. iluminada 2-3 semanas em estufa Continuação Etapa Protocolo de seleção Protocolo de Sele¬ Protocolo de Seleção Protocolo de Seleção Protocolo de Seleção com CP4 ção com especti¬ com espectinomicina B com espectinomicina C com espectinomicina nomicina A D Duração total 10-12 semanas 9-11 semanas 9-11 semanas -8 semanas ~8 semanas entre inoculação e otenção de plantas Comparação Glifosato inibe domi- Citocinina (TDZ ou BAP) é usada durante a inoculação/cocultura para induzir múltiplos brotos com protocolo nância apical e pro¬ de novo. Seleção visual: botões/brotos verdes resistantes putativamente transformados versus seletivo com move o desenvolvi¬ brotos brancos suscetíveis; botões/brotos brancos interrompem crescimento em estágio preco¬ glifosato anterior mento de botões/ ce. brotos axilares; marcador não-visual. Brotos transgênicos putativos se alongam Comparação n/d Higher transforma- TF mais alta (~10X); TF mais alta (>10X); TF mais alta (>10X); com protocolo tion frequency simplificar sistema de ciclo mais curto; simpli¬ ciclo mais curto; sim¬ seletivo com (-10X) manuseio de piantas e ficar transformação e plificar transforma¬ glifosato- reduzir custo de mão- sistema de manuseio ção e sistema de benefício anteri¬ de-obra e material em de plantas e reduzir manuseio de plantas or estufa. custo de mão-de-obra e reduzir custo de e material em um labo¬ mão-de-obra e mate¬ ratório de transforma¬ rial em um laborató¬ ção e estufa; reduzir rio de transformação stress ergonômico em e estufa; reduzir slaboratório de trans¬ tress ergonômico em formação e estufa. laboratório de trans¬ formação e estufa. As Tabelas 12-13 demonstram as freqüências de transformação obtidas usando o Protocolo C ou D.
Tabela 12. Freqüência de transformação de soia usando seleção com es
pectinomicina. Protocolo "C".
Exp-Trt Constru¬ N2 de Ex¬ N2 de Ex¬ % de Ex¬ N2 de Plan¬ % de TF ção plantes plantes plantes tas transfe¬ (pMON) para o para o ridas tampão tampão 1207-2 96999 227 144 63,4 70 30,8 (1T) 1207-4 96999 129 89 69,0 47 36,4 (1T) 1208-3 96999 127 83 65,4 30 23,6 (1T) 1208-6 96999 192 137 71,4 46 24,0 (1T) 1216-1 96999 273 166 60,8 83 30,4 (1T) 1216-2 96999 97 70 72,2 54 55,7 (1T) Total 1045 689 65,9 330 31,6 1223-1 107379 293 188 64,2 82 28,0 (2T; OriRi) 1223-2 107379 292 167 57,2 65 22,3 (2T; OriRi) 1223-3 107379 254 165 65,0 71 28,0 (2T; OriRi) 1223-4 107379 275 191 69,5 72 26,2 (2T; OriRi) Total 1114 711 63,8 290 26,0 Tabela 13. Freqüência de transformação de soia usando seleção com es
pectinomicina, Protocolo "D".
Exp-Trt Constru¬ N2 de Ex¬ N2 de Ex¬ % de Ex¬ N2 de % de TF ção plantes plantes plantes Plantas (pMON) para o para o transferi¬ tampão tampão das 1224-1 107379 338 208 61,5 74 21,9 (2T; OriRi) 1224-2 107379 234 140 59,8 50 21,4 (2T; OriRi) 1225-1 107379 235 173 73,6 60 25,5 (2T; OriRi) 1225-2 107379 253 178 70,4 65 25,7 (2T; OriRi) 1226-1 107379 205 139 67,8 49 23,9 (2T; OriRi) 1226-2 107379 201 131 65,2 45 22,4 (2T; OriRi) Total 1466 969 66,1 343 23,4 1244-1 107380 264 154 58,3 61 23,1 (2T; OriV) 1244-2 107380 205 124 60,5 50 24,4 (2T; OriV) 1254-1 107380 283 232 82,0 111 39,2 (2T; OriV) 1254-2 107380 267 213 79,8 88 33,0 (2T; OriV) 1255-1 107380 202 136 67,3 47 23,3 (2T; OriV) 1255-2 107380 295 198 67,1 94 31,9 (2T; OriV) Total 1516 1057 69,7 451 29,7 Exemplo 4
Comparação de Freqüências de Transformação e Qualidade de Episódios Vários dos protocolos de transformação com espectinomicina
descritos acima foram comparados entre si e com o protocolo de seleção com glifosato para qualidade de transformação de soja, como indicado na Tabela 14. Na tabela abaixo, "TF" refere-se ao número de episódios produzidos pelo número de explantes; "qTF" refere-se ao número de episódios de qualidade por número de explantes, onde um episódio de qualidade é defini5 do como um episódio que compreende uma cópia do gene de interesse e sem o esqueleto (seqüência de vetor); e "MF TF" refere-se ao número de episódios com uma cópia do gene de interesse, não ligada ao marcador, e sem a seqüência do esqueleto do vetor, por número de explantes submetidos à transformação. Tabela 14. Estimativas da qualidade da transformação Protocolo e tipo de vetor N0 de Ex¬ N0 de Epi¬ TF (%) N2 de Epi- % de episó¬ qTF % MF TF Es¬ plantes tes¬ sódios pro- +/- erro- só-dios tes¬ dios de timado % tados duzi-dos padrão tados quali-dade Protocolo c/espectinom. 41.786 8154 19,5(0,89) 828 19,1 3,7 (0,67) n/d A-1T; OriV Protocolo c/espectinom. 1.045 330 31,6 (4,85) 393* 20,9 6,6(1,09) n/d C-1T; OriV Protocolo c/espectinom. 1.114 290 26 (1,34) 286 23,8 6,2 (0,37) 1,8 C- 2T; OriRi Protocolo c/espectinom. 1.516 451 29,7 (2,69) 433 20,3 6,0 (0,96) 1,4 D- 2T; OriV Protocolo c/espectinom. 1.466 343 23,4 (0,76) 326 24,2 5,7 (0,29) 1,7 D- 2T; OriRi CP4 Protocolo- 2T; OriV 21.351 589 2,76 (0,23) 529 29,9 0,74 (0,08) 0,18 CP4 Protocolo- 2T; OriRi 21.651 360 1,66 (0,19) 299 38,8 0,54 (0,08) 0,24 n/d = não disponível
* nem todos episódios incluídos no cálculo de TF A taxa de não-ligação para estimar os valores de MF TF na Tabela 14 baseou-se na taxa estimada pelos dados na Tabela 15. Como pode ser observado, certos protocolos de transformação com espectinomicina ("C" produziram um aumento de até 10 vezes no número de "episódios 5 de qualidade" obtidos, em comparação com o protocolo de seleção com glifosato, enquanto que o Protocolo "A" apresentou um aumento significativo também em TF e qTF. Mais do que 92% dos episódios foram confirmados como linhagem germinal transformada, baseado na expressão de GUS em embriões de soja Ri imaturos, quando se usa qualquer um dos Protocolos 10 "A", "C", ou "D". Esta txa de "escape" é comparável àquela encontrada a partir de protocolos de seleção com glifosato. As plantas Ro também demonstraram se desenvolver normalmente e estabeleceram sementes (geração R-i) bem, com uma média de quase 200 sementes por planta a partir de plantas de soja transformadas usando qualquer um dos protocolos A-D.
Tabela 15. Estimativa da taxa de não-ligação
Tipo de seleção e es¬ Ns de Plantas testadas Taxa de não-ligação queleto obtida Spec OriV 122 -23% Spec OriRi 157 -29% CP4 OriV 55 -24% CP4 OriRi 62 -44% Exemplo 5
Desenvolvimento de Sistema de Transformação com Espectinomicina para Explantes de Soia Excisados a Seco
Métodos de seleção com espectinomicina foram utilizados para transformar explantes de soja excisados a seco, preparados da seguinte maneira:
1) Sementes secas viáveis (a semente de soja de qualidade estocada adequadamente tem um teor de umidade interna de aproximadamente 10 a 12%) foram enxaguadas com água esterilizada, ou com uma solução 25 de hipoclorito de sódio (na faixa entre 0 ppm e -30.000 ppm de cloro ativo, incluindo 50 ppm e 200 ppm de cloro ativo) por 3 a 20 minutos. O líquido foi então drenado. Este processo eleva o teor de umidade interna para aproximadamente 16%. Depois desta breve etapa de sanitização da superfície, o teor de umidade interna da semente é baixado em uma secadora de sementes industrial com um fluxo de ar desumidificado (temperatura controlada até aproximadamente 15 0C a 32 0C (60 a 90° F) até menos do que 8% (4 a 6% 5 geralmente preferido). Esta etapa de secagem mantém o vigor da semente, e ainda solta a casca (revestimento da semente) semelhante a papel da semente para facilidade do processamento. Esta semente com teor de umidade mais baixo é também significativamente mais frágil. Esta fragilidade é empregada para dividir adequadamente a semente no moinho de descas10 camento, maximizando assim a recuperação de explantes de alta qualidade com meristemas intactos vigorosos. A semente assim preparada pode ser estocada por um período de tempo significativo (2 anos ou mais sob condições apropriadas), ou pode ser usada diretamente para processamento adicional.
2) Sementes de soja secas preparadas adequadamente podem
ser divididas, e explantes de meristemas viáveis podem ser recuperados usando uma série de máquinas. Uma máquina empregada com sucesso é uma Grainman Rice Sheller (Modelo 64). As smentes divididas nesta máquina podem ser então processadas adicionalmente para recuperar os explan20 tes portadores de meristemas desejados em uma Clipper-Cleaner modificada com peneiras com tamanho apropriado. Os explantes recuperados neste processo rápido e delicado podem ser usados diretamente para transformação ou podem ser estocados até necessário. As condições de temperatura típicas durante a estocagem podem ficar na fiaxa entre a temperatura ambi25 ente e 80 0C.
3) Depois da estocagem desejada, os explantes foram reidratados para transformação. Os tipos de meios usados para esta etapa podem ser variados e incluem "meio de germinação de feijão" (BGM; Tabela de Meios 16), meio de inóculo de soja (INO; Tabela 1), e culturas de crescimen30 to de Agrobacterium preparadas em fase Iog (AGRO). A cultura de crescimento de Agrobacterium foi desenvolvida de um dia para o outro em Caldo de Lisogenia (LB, referido também comumente como Caldo de Luria-Bertani) para fase Iog, e depois centrifugada e recolocada em suspensão até uma densidade óptica final ae 660nm de 0,25 a 0,6. O meio usado para a diluição é igual ao meio do inóculo de soja. As temperaturas e durações da rehidratação também podem ser variadas, sendo que alguns experimentos tiveram explantes que foram embebidos em uma dessas soluções durante a noite inteira a 4 0C. Outras variações foram feitas na duração de exposição ao respectivo meio de hidratação, nas várias temperaturas durante esta exposição, e no grau de saturação no respectivo meio. Os tempos de exposição testados ficaram na faixa entre 0 e 24 horas. As temperaturas durante tempos de exposição mais longos (aqueles maiores do que 4 horas) foram à temperatura ambiente (-26 °C), 23 °C, ou 4 °C. Tempos de exposição de 4 horas ou menos foram todos testados à temperatura ambiente. Como uma alternativa para submergir completamente ou saturar substancialmente os explantes com meio líquido durante o processo de hidratação, alguns tratamentos empregaram o uso de papel de filtro umedecido (líquido suficiente para umedecer, mas não para saturar). Isto foi feito com papel de filtro umedecido com BGM ou meio de cultura de Agrobacterium. A re-hidratação foi realizada em uma série de recipientes, incluindo, porém sem limitações, tubos de centrifugação cônicos, frascos de vidro graduados, ou um recipiente de cultura de tecidos PLANTCON (MP Biomedicals, Irvine, CA).
Depois da re-hidratação, os explantes foram brevemente sonicados na presença das culturas de Agrobacterium apropriadas, como descrito em outros exemplos. A cocultura foi realizada em incubadoras Percival iluminadas durante geralmente 2 a 5 dias (16 horas de luz, 8 horas de escu25 ridão, intensidade da Iuz > 5 μΕ) em uma temperatura de aproximadamente 23 a 25 °C. A espectinomicina foi aplicada como mum agente de seleção durante a re-hidratação, em etapas de cocultura, e/ou depois da cocultura a 15 mg/L a 1.000 mg/L. Os brotos (plantas) fenótipo-positivos foram recuperados rotineiramente (vide Tabela 17). Tabela 16. Meio para germinação de soia
Ingredientes do BGM mg/L NH4NO3 240 KNO3 505 CaCI2 2 H2O 176 MgSO4 7H20 493 KH2PO4 27 H3BO3 1,86 Na2MoO4 2H20 0,216 MnSO4 H2O 5,07 ZnSO4 .7H20 2,58 FeSO4 7H20 2,502 Kl 0,249 Na2EDTA . 2H20 3,348 CuSO4. 5H20 0,0008 CoCI2 6H20 0,0008 Cloridrato de Tiamina 1,34 Ácido Nicotínico 0.5 Cloridrato de Piridoxina 0,82 Bravo (75% WP) 30 Captan (50% WP) 30 Cefotaxima 125 Sacarose 25.000 PH 5,8 Como demonstrado na Tabela 17, uma frequência de transfor
mação de 20-25% foi obtida em vários experimentos, e mais de 10% foi obtido rotineiramente, dependendo do protocolo usado.
Tabela 17. Freqüencia de transformação (TF) de explantes de soia excisados a seco
Número do Experimen- N0 de Explantes N0 de Episódios TF% to-tratamento 1095 138 5 3,6 1109 455 23 5,1 1141-1 543 136 25 Número do Experimen- N0 de Explantes N0 de Episódios TF% to-tratamento 1141-2 541 67 12,4 1169-1 192 37 19,3 1260 281 57 20,3 1261 770 154 20 1263-1 235 14 6 1262-2 59 11 18,6 1263-2 159 21 13,2 1264-1 55 9 16,4 1265-1 636 151 23,7 1264-2 102 4 3,9 1265-2 101 13 12,9 Exemplo 6
Transformação de Algodão Usando aadA como Marcador Seiecionável e Espectinomicina como Agente Seeltivo
A. Preparação de inóculo de Agrobacterium
Foi usada a cepa de Agrobacterium C58 portando um vetor biná
rio que transporta 1 T ou 2 T-DNA contendo aadA e outro GOI ou marcador capaz de ser triado. O inóculo foi preparado como descrito no Exemplo 1.
B. Explantes de algodão, inoculação e cocultura com Agrobacterium.
Os eixos de embriões de algodão foram excisados mecanicamente de sementes maduras embebidas e a inoculação foi realizada com Agrobacterium preparada e cocultivados. As sementes de algodão foram processadas mecanicamente para excisar e isolar seus tecidos meristemáticos. Para obter material de explante meristemático transformável, as sementes de algodão (por exemplo, dos genótipos STN474 (Stoneville Pedigreed Seed Co., Stoneville, MS), Delta Pearl (Delta and Pine Land Co., Scott, MS), DP5415 (Delta and Pine Land Co.), SureGrow501 ou SureGrow747 (Sure Grow Cotton Seed Company, Maricopa, AZ) foram processadas como se segue, para separar o embrião, compreendendo tecidos meristemáticos, do revestimento das sementes e cotilédone(s). As sementes de algodão foram removidas da estocagem a 4 0C ou -20 0C e levadas para a temperatura ambiente. As sementes foram pesadas, colocadas dentro de uma unidade germinadora estéril, e esterilizadas na superfície em Clorox a 50% (hipoclorito de sódio) por 5 min. As sementes são então enxaguadas 3 vezes com água destilada esterilizada e hidratadas em um meio de hidratação líquido (CSM) a 28 0C no escuro por cerca de 18 h (faixa de 14 a 42 horas). Alternativamente, a temperatura de germinação pode ser mais baixa, por exemplo, cerca de 23 0C. O meio CSM continha 200 mg/L de carbenicilina (PhytoTechnology Laboratories, Shawnee Mission, KS), 125 mg/L de cefotaxima (Midwest Scientific, St. Louis, MO), 30 mg/L de BRAVO 75 (Carlin, Milwaukee, Wl) e 30 mg/L de Captan 50 (Carlin). Outras soluções também foram usadas com sucesso para hidratar as sementes de algodão, incluindo água desmineralizada estéril ou água contendo uma concentração fraca de lixívia (tipicamente 50 a 1.000 ppm de hipoclorito de sódio). Depois da hidratação, as sementes podem ser usadas imediatamente ou estocadas em temperaturas de refrigeração por até uma semana antes de processamento adicional.
Os explantes foram enxaguados em água esterilizada. Cerca de 1-60 g, por exemplo, 30 g, de explantes foram colocados dentro da parte do topo (de cabeça para baixo) de um recipiente Plantcon® (MP Biomedicals, Solon, OH), e em seguida foram adicionados aproximadamente 50 mL da 20 suspensão de Agrobacterium preparada, suficiente para cobrir os explantes. Depois que o Plantcon® foi fechado, ele foi inserido dentro de um suporte adequadamente dimensionado, que foi colocado dentro de um aparelho de ultrassom (por exemplo, L&R Ultrasonics QS140; L&R Manufacturing Co., Kearny, NJ; ou um aparelho de ultrassom Honda W113, Honda, Denshi Ja25 pão). O aparelho de ultrassom foi enchido com cerca de 2 L de 0,1% de Triton® (por exemplo, Sigma 526-36-23; Sigma Chemical Co, St. Louis, MO). Depois de até 5 min de aplicação de ultrassom, o Plantcon® foi colocado firmemente em um vascolejador a cerca de 80-100 rpm por 10 min para incubação. Depois da inoculação, o inóculo de Agrobacterium foi removido do 30 Plantcon®. Cerca de 2 g do tecido de explante inoculado foram transferidos para um Plantcon® fresco contendo papel de filtro estéril e 5 mL de INO (Tabela 1), e os explantes foram espalhados sobre a superfície do meio para evitar aglomeração. O meio INO pode também ser suplementado com reguladores do crescimento de plantas, tais como giberelinas (GA3), auxinas (NAA, IBA, IAA, 2,4-D, dicamba, etc), citocininas (BAP, tidiazuron, dikegulac, cinetina, etc.), e os compostos antimicrobianos 50 ppm de nistatina (50 5 mg/L), TBZ (10 mg/L), e o agente de seleção espectinomicina (100 mg/L). O Plantcon® contendo os explantes inoculados foi colocado dentro de uma incubadora Percival para cocultivo a aproximadamente 22-28 0C e um fotoperíodo de 16 horas de Iuz por 2-5 dias (intensidade da Iuz £ 5 μΕ).
C. Seleção e identificação de episódios transqênicos usando espectinomicina como um agente seletivo
Depois do cocultivo, os explantes foram transferidos para cima de meio de seleção semissólido em recipientes Plantcon® implantando individualmente dentro do meio, ou eles foram assentados sobre a superfície do meio. O meio basal era um Meio de Planta Lioyd & McCown VVoody modifi15 cado (WPM, Lloyd and McCown, 1981) e foi suplementado com 200 mg/L de cefotaxima, 200 mg/L de carbenicilina e 100-200 mg/L de espectinomicina (Tabela 18) com ou sem reguladores do crescimento de plantas ou outros aditivos para promover a formação e crescimento de múltiplos brotos.
Tabela 18. Componentes do meio para seleção e desenvolvimento de brotos usado em transformação de algodão - Meio de Plantas Llovd & McCown Woodv modificado suplementado com antibióticos
Ingrediente Quantidade/L LM WPM com vitaminas (Phytotech L449) 2,41 g Dextrose (Fisher D16-3) 20 g Gluconato de cálcio (Sigma G-4625) 1,29 g Com ou sem Clearys 3336 WP (Carlin 10-032) 0,03 g AGARGEL (Sigma A-3301) 4 g Encher com água até 1 L PH 5,6 Autoclave Carbenicilina (Phytotech C346) (40mg/mL stock) 5 mL (200 mg) Cefotaxima (Midwest NDC0039-0019-10) (insumo a 4 mL (200 mg) 50 mg/mL) Espectinomicina (insumo a 50 mg/mL) 3 mL (150 mg) Vinte e cinco a 50 explantes foram cultivados em cada recipiente. Os explantes foram transferidos imediatamente para dentro de sal de cultura iluminada (fotoperíodo de 16 h de luz/8 h de escuridão, intensidade da Iuz > 5 μΕ) com ajuste de temperatura em aproximadamente 28 °C, ou primeiramente dentro de sala iluminada com ajuste de temperatura em aproxi5 madamente 35 °C, até 40 0C, por um período de tempo curto (por exemplo, 3-5 dias) antes de serem transferidos para 28 °C. Os experimentos comparando estes dois esquemas de cultura foram conduzidos e os resultados sugeriram que o tratamento a 35 0C foi benéfico (Tabela 19).
Tabela 19. Comparação de métodos de inoculação e cocultura para transformação de algodão usando seleção com espectinomicina
Experi- Método Tempaera- N0 de ex¬ N0 de brotos % de explan¬ Trat. de inoc/ tura da cul¬ plantes GUS+ (n° tes produto¬ coculti¬ tura com me¬ total de bro¬ res de brotos vo ristema tos testados) GUS+ 1021-1 Δ 35°C, 3 dias 127 6(7) 4,7 / \ a 28°C 1021-2 B 28°C 183 0(2) 0 1021-3 B 35°C, 3 dias 141 0(2) 0 a 28°C 1021-4 A 28°C 324 2(2) 0,6 1021-5 A 35°C, 3 dias 225 7(9) 3,1 a 28°C 1023-1 A 35°C, 3 dias 81 5(7) 6,2 a 28°C 1023-2 B 28°C 95 0(0) 0 1023-3 B 35°C, 3 dias 81 11 (13) 13,6 a 28°C 1023-4 A 28°C 101 0(0) 0 1023-5 A 35°C, 3 dias 88 1 (3) 1,1 a 28°C No método A, todos explantes em cada tratamento foram colo
cados em um PLANTCON e o inóculo de Agrobacterium foi adicionado para cobrir os explantes. Os explantes no inóculo foram sonicados (sonicação a granel) para criar feridas para a entrada de Agrobacterium, por 2 min, e em seguida, por 10 min em vascolejador (80 rpm). Depois, o inóculo foi removido e os explantes foram distribuídos em PLANTCONs, cada um contendo um pedaço de papel de filtro e 5 mL de meio de inoculação. No método B, os explantes foram distribuídos para a parte da cobertura de cada PLANTCON 5 (aproximadamente 100 explantes por PLANTCON). Cinco mililitros do inóculo de Agrobacterium foram adicionados, e os explantes foram estão sonicados por 20 s, e foram imediatamente transferidos, junto com o inóculo, para a parte de fundo de um PLANTCON, que guarda um pedaço de papel de filtro.
Depois de aproximadamente 3-4 semanas sobre o meio de sele
ção, os brotos verdes resistentes começaram a ficar evidentes em alguns explantes, enquanto que os brotos jovens Iixiviados ou primórdios eram claramente visíveis em outros. Em aproximadamente outras 2 semanas sobre o meio de seleção, os explantes que desenvolveram brotos verdes foram 15 transferidos para tampões Oasis® para crescimento dos brotos e indução de raízes a partir do radical original na estufa. Os tampões Oasis foram colocados em uma base plana-padrão sem furos e foram colocados em um meio líquido simples que continha 0,5 g/L de sais WPM com vitaminas (Phytotechnology Laboratories, Lenexa KS; lote ne L449) e 0,25 mg/L de IBA, e fo20 ram cobertos com cúpulas de plástico. Os explantes poderiam ser também transferidos para cima de meio de seleção fresco com concentração igual ou mais alta de espectinomicina, ou com espectinomicina removida, para seleção e/ou crescimento posterior antes de serem transferidos para os tampões. Em alguns experimentos, os explantes de algodão foram submetidos a 25 uma cultura de tecidos e condições de crescimento essencialmente como descrito para a transformação, seleção e regeneração de plantas de soja do Protocolo "D" acima. O meio de enraizamento de algodão (CRM; Tabela 20) também poderia ser usado para induzir a formação de raízes. Tabela 20. Componentes do Meio de Enraizamento de Algodão (CRM).
Ingrediente Quantidade/L Sais basais MS (Phytotech M524) 2,15 g Mioinositol (Sigma 1-3011) 0,1 g Dextrose (Fisher D16-3) 30 g Insumo de vitaminas SBRM: 2 mL Glicina (Sigma G-6143): 1 g/L Ácido nicotínico (Sigma N-0765): 0,25 g/L Cloridrato de piridoxina (Sigma P-8666): 0,25 g/L Cloridrato de tiamina (Sigma T-3902): 0,5 g/L Cysteine (10 mg/mL) 10 mL Ajustar volume com H2O destilada desmineralizada pH com KOH 5,8 Bacto ágar (BD 214030) 8g Autoclave !AA (Sigma I-288Ô) (0,02 mg/mL) 5 mL Timentina (Duchefa T0190) (100 mg/mL) 1 mL Cefotaxima (Midwest NDC0039-0019-10) (50 mg/mL) 4 mL Em aproximadamente 3-4 semanas, a maioria dos brotos em
tampões Oasis® tinha crescido significativamente e as raízes também estavam bem desenvolvidas. Os tecidos foram testados quanto à caracterização molecular oir um ou mais métodos de ensaios moleculares, por exemplo, ensaio Invader® (Third Wave™ Technologies, Madison, Wl), PCR, ou hibridização Southern. Amostras de folhas também puderam ser coletadas de cada broto verde e testadas quanto à atividade de GUS, enquanto ainda no meio de seleção e/ou em estágio posterior, caso uma construção que contém um gene uidA fosse usada. A espectinomicina serviu como um marcador visual útil para a identificação precoce de transformação. Os tecidos nãotransformados usualmente pareceram Iixiviados e freqüentemente malformados sob seleção com espectinomicina, enquanto que os tecidos transformados eram verdes adequadamente em desenvolvimento. Em experimentos que utilizam um gene marcador uidA, a natureza transformada do tecido verde pôde ser confirmada pela expressão de GUS depois de cerca de 4-8 semanas sobre o meio de seleção. Portanto, usando espectinomicina como um agente de seleção precede os ensaios de GUS intensivos em mão-deobra e morosos usados freqüentemente em sistemas de transformação de meristemas, e proporciona a vantagem de reduzir significativamente a mãode-obra envolvida na produção de plantas transgênicas.
Exemplo 7
Transformação de Milho Usando aadA como um Gene Marcador Selecionável
A. Explantes de milho
Os embriões imaturos que contêm aurículas (por exemplo, FBLL 10 ou LH244) são colhidos aproximadamente 10 dias depois da polinização e mantidos refrigerados a 4 0C até o uso (até 5 dias depois da colheita). O tamanho poreferido do embrão para este método de transformação é ~1,0-2,0 mm. Este tamanho é usualmente atingido cerca de 10 dias depois da polinização dentro da estufa sob condições de crescimento de uma temperatura 15 média de 30 0C (87 °F), extensão do dia de 14 horas com iluminação suplementar suprida por lâmpadas GE de sódio de alta pressão de 1.000 watts. O método independente de genótipo.
B. Preparação do inóculo de Agrobacterium
É usada a cepa de Agrobacterium C58 portadora de um vetor binário que transporta aadA que contém 1 T- ou 2 T-DNA e outro GOI ou marcador capaz de ser triado. O inóculo pode ser preparado como descrito na publicação do pedido de patente ne US 2004/0244075.
C. Inoculacão e cocultura
Embriões imaturos são isolados a partir de aurículas esteriliza25 das na superfície e jogados diretamente dentro da suspensão de células de Agrobaeterium preparada em um tubo de microcentrifugação de 1,5 mL. O isolamento dura continuamente por 15 min. O tubo é então deixado de lado por 5 min, o que faz com que o tempo de inoculação para embriões individuais dure na faixa entre 5 e 20 min. Depois que a suspensão de células de 30 Agrobaeterium é removida usando uma pipeta de transferência ocm ponta fina, os embriões imaturos são transferidos para cima de meio de cocultura (Tabela 21). Os embriões são colocados sobre o meio com o escutelo voltado para cima. Os embriões são cultivados emu ma incubadora escura (23°C) por aproximadamente 24 h.
D. Seleção, regeneração e crescimento de transformantes sobre um meio gue contém espectinomicina 5 Depois do cocultivo, os embriões são transferidos para cima de
um meio MS modificado (MS de Indução, Tabela 21) suplementado com 500 mg/L de carbenicilina e 50, 100, 150, 200, ou 500 mg/L de espectinomicina em placas Petri (100 mm x 25 mm), 20 a 25 embriões por placa. Auxina e citocinina estão presentes para iniciar uma resposta de cultura embriogênica a partir do tecido do escutelo. As placas são mantidas em uma sala escura de cultura a 27 0C por aproximadamente 2 semanas. Os embriões imaturos com calo desenvolvido são transferidos individualmente para cima do primeiro meio de regeneração, o mesmo meio mencinado acima, exceto que 2,4-D e picloram são substituídos por 3,5 mg/L de BAP (MS/ΒΑΡ, Tabela 21) e o nível de carbenicilina é reduzido para 250 mg/L. As culturas são transferidas para uma sala de cultura com fotoperíodo de 16 h de luz/8 h de escuridão e 27 0C. Depois de 5-7 dias, os pedaços de calos também podem ser transferidos para cima do segundo meio de regeneração, um meio baseado em MS isento de hormônios (MSOD, Tabela 21) em placas de Petri (100 mm x 25 mm). Depois de aproximadamente mais 2 semanas, os pedaços de calos que tinham brotos regenerados ou ainda estão vivos são transferidos para cima do mesmo meio isento de hormônios em Phytatrays para seleção e crescimento adicional. Todos meios mencionados acima são suplementados com 50, 100, 150 ou 200 mg/L de espectinomicina. As plantas verdes regeneradas (RO) são transferidas para o solo em vasos com turfa emu ma câmara de crescimento quando elas atingem o topo de Phytatrays e têm uma ou mais raízes sadias. Depois de mais 7 a 10 dias, elas são então transplantadas para dentro de vasos de 30 cm (12 in) e levadas para a estufa sob condições para crescimento normal de plantas. As plantas são autopolinizadas ou cruzadas com plantas do tipo selvagem.
Ensaios moleculares (por exemplo, como descrito acima para plantas de algodão) são conduzidos para caracterizar as plantas. Tabela 21. Meio de cultura para uso na transformação e regeneração de milho Componente Z2 MS Vl 1/2 MS PL Meio de MS de In¬ MSW50 MS/6BA MSOD Cocultura dução Sais MS 68.5 g/l 68.5 g/l 2,2 g/l 4,4 g/l 4,4 g/l 4,4 g/l 4,4 g/l Sacarose 20 g/l 68.6 20 g/l 30 g/l 30 g/l 30 g/l Mattose --- g/i --- --- --- --- 20 g/l Glicose 10 g/l -- 10 g/l --- --- --- 10 g/l I-Prolina 115 mg/l 36 g/l 115 mg/l 1,36 g/l 1,38 g/l 1,36 g/l Casamino Ácidos --- 115 mg/l --- 50 mg/l 500 mg/l 50 mg/l 2 mg/l --- 2 mg/l --- 2 mg/l -- Glicina --- 2 mg/l -- --- --- --- 150 mg/l I-Asparagina 100 mg/l --- 100 mg/l --- 100 mg/l --- 100 mg/l 0,5 mg/l 100 mg/l 0,5 mg/l 1,3 mg/l 0,5 mg/l 1,3 mg/l 1,3 mg/l Mioinositol 0,5 mg/l 0,5 mg/l 0,5 mg/l 0,25 mg/l 0,5 mg/l 0,25 mg/l 0,25 mg/l Ácido nicotínico 0,1 mg/l 0,5 mg/l 0,6 mg/l 0,25 mg/l 0,6 mg/l 0,25 mg/l 0,25 mg/l Cloridrato de piridoxina --- 0,1 mg/l --- 0,25 mg/l --- 0,25 mg/l 0,25 mg/l Cloridrato de tiamina --- --- 3 mg/l 0,5 mg/l 0,5 mg/l -- Pantotenato de Ca --- --- --- 2,2 mg/l --- -- 2,4-D --- --- 1,7 mg/l 1,7 mg/l --- --- Picloram --- 3,5 mg/l Nitrato de Prata BAP . Os meios Vz MSVI e Vt. MSPL são usados como líquidos. O meio de baixa eletroendoosmose (EEO). Todos os outros meios são solidificados com glifosato.
cocultura é solidificado com com 7 g/L de Phytagar ou 3
5,5 mg/L de agarose com g/L de fitagel para seleção Exemplo 8
Preparação de um Promotor de um 16S RNA Intensificado a partir de Aarobacterium e Genes de Fusão CTP-aadA
pMON 107379, um vetor de 2 T-DNA com origem de replicação OriRi tem um promotor localizado no esqueleto (isto é, fora do T-DNA) para seleção de resistência à espectinomicina em células hospedeiras de E. coli ou Agrobacterium. Para produzir pMON107379, o cassete de expressão da seleção com espectinomicina em plantas foi excisado de pMON96999 (Figura 2) com digestão por Not\, e inserido dentro de pMON107341 aberto com PspOMI. O pMON 107341 parental é um vetor baseado em oriRi com melhor cassete de resistência à espectinomicina direcionado pelo promotor P-rrn. Um promotor de 16S RNA intensificado a partir de Agrobacterium (SEQ ID NO: 3) é especialmente útil quando o número de cópias do vetor é baixo, como com os veiores que contêm OriRi. O promotor P-rrn foi isolado a partir do 16S rDNA da cepa de Agrobaeterium por PCR, e fundido ao sítio de ligação ribossômica (RBS) com operon virE para permitir sua tradução eficiente em E. coli e também Agrobaeterium. pMON107379 compreende também um gene aadA que codifica uma aminoglicosídeo-3'-adeniltransferase (SEQ ID NO:1) que confere resistência à espectinomicina, sendo o gene que codifica uma aminoglicosídeo-3'-adeniltransferase fundido também com um peptídeo de trânsito de cloroplasto (SEQ ID NO:2) para transporte da aminoglicosídeo-3'-adeniltransferase codificada no núcleo para plastídeos.
Exemplo 9
Retransformacão Direta de Germoplasma com ROUNDUP READY® Valorizado em Soia e Algodão
Utilizando os métodos aqui descritos, o germoplama transgênico de Round-Up Ready® valorizado pode ser transformado utilizando 2 T-DNA1S que codificam o gene aadA para seleção com espectinomicina, e ao mesmo tempo, empregando um novo gene (freqüentemente referido como "o gene 30 de interesse") no segundo T-DNA (ou plasmídeo, caso dois plasmídeos sejam usados) para permitir a segregação longe do aadA como descrito.
Uma variedade da semente de algodão RRFlex® (07W610F) e a variedade não-transgênica de controle do germoplasma (00S04) foram comparadas. A semente foi embebida por -18 h a 24 °C, excisada com máquina e peneirada com máquina (em duas etapas), e em seguida, enriquecimento dos explantes por flutuação. Os explantes foram inoculados com suspensão de Agrobacterium em INO na DOeeo de 0,3, sonicados por 2 min, e incubados por 10 min. A suspensão de Agrobacterium foi então removida e os explantes foram distribuídos dentro de recipientes de cocultura a aproximadamente 2 g por recipiente. Os explantes foram assentados sobre papéis de filtro umedecidos com 5 mL de meio de cocultura (INO com adições de 50 ppm de nistatina, 10 ppm de TBZ, e 100 ppm de espectinomicina) e cocultivados em uma incubadora Percival iluminada a aproximadamente 23 a 25 0C (16 h de luz/8 h de escuridão, intensidade da Iuz > 5 μΕ) por 3 dias. Os explantes foram então transferidos para cima de meio WPM com 150 ppm de espectinomicina, incubados por 3 dias em sala iluminada a 35 0C (16 h de luz/8 h de escuridão), e depois levados para uma sala iluminada a 28 0C (16 h de luz/8 h de escuridão). As plantinhas verdes fenótipo-positivas foram colhidas 6 semanas depois da inoculação, colocadas em tampões Oasis® (Smithers-Oasis USA; Kent, OH) umedecidos com 0,5 g/L de sais WPM (incluindo opcionalmente IBA a 0,25 mg/L para melhorar o enraizamento) e levados para condições de estufa. Depois que as plantas aclimatizaram e começaram a crescer, elas foram testadas quanto à expressão de CP4, GUS, e GUS vascular (um previsor de transformação de linhagem germinal). Esperava-se que as plantas transgênicas retransformadas fosem CP4+ GUS+, enquanto que se esperava que as plantas de controle transformadas fossem CP4- GUS+. Uma análise do rendimento de plantas transformadas está listada na Table 22 abaixo. Espera-se que a freqüência de transformação total aumente, pois a análise não está completa nesta hora. O procedimento descrito é útil para retransformar plantas de algodão transgênicas com uma eficiência similar à transformação de uma variedade de algodão não-transgênica convencional. Tabela 22: Freqüência de transformação de qermoplasma retransformado Germo- Explantes de Plantinhas fenó- % de Planti- Número de Plantas que expres¬ % de TF, linha¬ plasma de qualidade tipo-positivas nhas verdes plantas amos¬ sam GUS em todas gem germinal que algodão inoculados (verdes) para tradas para folhas, (linhagem expressa GUS espectinomicina GUS germinal) 00S04 928 18 1,90% 11 2 0,22% 07W610F 3.665 87 2,40% 64 9 0,25% EXEMPLO 10
Esterilização de Sementes e/ou Material de Explante
Inúmeras técnicas para esterilizar sementes antes da excisão, bem como esterilizar explantes depois da excisão a partir de sementes fo5 ram testadas. A esterilização após a excissão de explantes secos, usando gás cloro em uma câmara de dessecação a vácuo foi testada em intervalos de tempo na faixa entre 15 minutos e 16 horas. O controle da contaminação aumentou com a exposição mais longa ao gás cloro, embora a contaminação fúngica tenha crescido em tratamentos nos quais a exposição ao gás 10 cloro tinha suplantado o limite de sobrevivência dos explantes.
Tratamentos com gás ozônio também foram testados. A semente integral (antes da excissão) e também os explantes secos (depois da excisão) foram expostos ao gás O3 em uma câmara de PLEXIGLAS (OSR-8 Ozone Generaior; Ozone Solutions, Sioux Ceníer, iA) em vários intervalos 15 de tempo de 1-24 horas. O O3 foi usado em uma concentração de 467 ppm. Depois que a semente foi exposta ao ozônio, o material embrionário foi excisado e a viabilidade dos explantes foi medida. A ozonização de semente de soja por 12 horas ou menos não prejudica a viabilidade de emplantes isolados subseqüentemente, mas diminuiu drasticamente a biocarga (bioburden) 20 encontrada em explantes. A ozoninação de explantes excisados por tão pouco quanto 1-4 horas diminuiu a saúde dos explantes (isto é, o número de embriões viáveis).
Estes adicionais sobre esterilização pré-excisão de semente integral foram realizados usando uma solução Iixiviadora de 200 ppm de cloro 25 ativo, e em seguida, um período de hidratação durante a noite inteira (~9 horas) em uma solução de 50 ppm de cloro ativo. Estas sementes foram então deixadas secar em uma capela com fluxo laminar (tipicamente por 12-48 horas) antes de serem excisadas mecanicamente. Foi testada também uma modificação para o protocol de embebição em lixívia a 50%, na qual as se30 mentes foram primeiramente enxaguadas com uma solução de etanol a 70%. O etanol foi drenado imediatamente (a exposição total ao etanol durou menos do que 5 segundos), e depois uma embebição em lixívia a 50% foi realizada tratando as sementes por 3-15 min em lixívia a 50%, e em seguida, 3 enxágues com água e secando as sementes durante a noite inteira, de tal modo que o teor de umidade fosse menor do que 8%. Luz UV também pode ser usada para esterilizar o material vegetal.
EXEMPLO 11
Hidratacão de Sementes e Material de Explante
Estudos que empregaram novas estratégias de hidratação/germinação com pré-cultura foram testados. Os tipos de meios usados para esta etapa incluíram "meio de germinação de feijão" (BGM; Tabela 16), meio de inóculo de soja (INO; Tablela 1), e culturas de crescimento de Agrobacterium em fase Iog preparadas (AGRO). A cultura de crescimento de Agrobacterium foi desenvolvida durante noite inteira em Caldo de Lisogenia (LB, referido também comumente como Caldo de Luria-Bertani) até fase log, e depois cenírifugada e recoiocaaa em suspensão até uma densidade óptica final a 660nm de 0,25 a 0,6. O meio usado para a diluição é igual ao meio do inóculo de soja. Os explantes foram embebidos nesta solução durante a noite inteira a 4 °C. Outras variações foram feitas na duração da exposição ao respective meio de hidratação, nas várias temperaturas durante esta exposição, e no grau de saturação no resepctivo meio. Os tempos de exposição testados ficaram na faixa entre 0 e 24 horas. As temperaturas durante tempos de exposição mais longos (os maiores do que 4 horas) foram temperatura ambiente (~ 26°C), 23 °C, ou 4 °C. Os tempos de exposição de 4 horas ou menos foram todos testados à temperatura ambiente. Como uma alternativa a submergir completamente ou saturar substancialmente os explantes com meios líquidos durante o processo de hidratação, alguns tratamentos empregaram o uso de papel de filtro umedecido (líquido suficiente para umedecer, mas não saturar). Isto foi feito com papel de filtro umedecido com BGM ou meio de cultura de Agrobacterium. A re-hidratação foi realizada em uma série de recipientes, incluindo, porém sem limitações, tubos de centrifugação cônicos, frascos de vidro graduados, ou um recipiente de cultura de tecidos PLANTCON (MP Biomedicals, Irvine, CA).
Este exemplo demonstra também que a hidratação pode ser feita em uma série de meios que contêm vários tipos de carboidratos tais como glicose (INO), e sacarose (BGM). Outros carboidratos tais como galactose podem ser úteis no meio de hidratação.
Exemplo 12
Transformação de explantes de soja excisados a seco estocados por períodos de tempo prolongados
Explantes excisados a seco foram estocados por até 20 meses a -20 0C a 4 0C, e depois testados quanto à sobreviviência, capacidade de transformçaõ e vigor. A sobreviviência e o vigor global dos explantes pareceram ser similares em todos grupos de tratamento, independentemente das condições de estocagem ou temperatura em comparação com o tratamento de controle (Tratamento 1). Isto demonstra a capacidade de estocar explantes excisados a seco por quase dois anos sem prejudicar. Os explantes de cada tratamento foram testados quanto à expressão transiente de GiJS 4 dias depois da inoculação. A Tabela 23 indica uma comparação da expressão de gus específica de meristemas entre tratamentos, pontuados em uma escala de 0-9, sendo 0 nenhuma expressão visível, e 9 sendo expressão extensiva em todos 3 meristemasdo embrião. Isto demonstra que os explantes excisados a seco podem não apenas sobreviver à estocagem de longo prazo em várias condições sem perda significativa de vigor, mas eles também retêm suscetibilidade à transformação. Assim sendo, agora é possível excisar grandes quantidades de explantes durante tempos de pouco consume para uso posterior, o que representa economia de custo potencial significativa e flexibilidade no planjeamento e excução de estudos de transformação. Tabela 23: Efeito da duração e temperatura de estocagem sobre a transformação de explantes
T rata- Técnica de Técnica de Duração Tempe¬ Expressão mento Esteriliza¬ Excisão da Esto¬ ratura da T ransiente ção de cagem Estoca¬ de gus (es¬ Semente gem cala de 0-9) 1 & 2 Enxágüe Excisão au¬ Nenhu¬ ND 0,90, 1,60 com Iixivia tomatizada a ma a 50% seco com descascador de arroz Grainman 3 Enxágüe Excisão au¬ 17 me¬ 4o C 0,20 com Iixivia tomatizada a ses a 50% seco com descascador de arroz Grainman 4 Enxágüe Excisão au¬ 17 me¬ -20 0C 0,10 com Iixivia tomatizada a ses a 50% seco com descascador de arroz Grainman 5 Enxágüe Excisão ma¬ 20 me¬ 4 0C 0,70 com Iixivia nual a seco ses a 50% 6 Enxágüe Excisão ma¬ 20 me¬ -20 0C 1,50 com Iixivia nual a seco ses a 50% Exemplo 13
Identificação de composições e condições apropriadas da cultura de préinoculacão ("Pré-cultura")
É provável que os explantes escisados ainda estejam em um estado de semidormência quando eles são inoculados com Agrobacterium para transformação. Assim sendo, foi desenvolvido um método para estimular a atividade metabólica dos explantes excisados secos antes da inoculação com Agrobacterium, para aumentar sua competência para transformação. Isto é, manipulando a biologia do explante seco, é possível aumentar a % de episódios de linhagem germinal positivos por explante em 2 a 10 vezes.
Várias composições de meios: BGM (Tabela 16), INO (Tabela
1), ou OR (Tabela 24) foram testadas em temperaturas de 23 0C e/ou 28 °C, e sob diferentes condições de luz/escuridão entre 1 e 5 dias, quanto à sua capacidade de intensificar a competência de transformação. Depois da etapa de pré-cultura, os explantes foram reunidos entre si e inoculados com a cul10 tura de Agrobacterium de acordo com o método descrito no Exemplo 1. Os ensaios de expressão transiente de GUS realizados em explantes indicaram atividade de GUS aumentada nos tratamentos pré-cultivados depois de 2 dias e 4 dias de cocultura.
As perdas de piantas ocorreu devido à infecção fúngica em ai15 guns dos experimentos de pré-cultura, mas a TF global dos explantes excisados secos que foram pré-cultivados sobre papéis de filtro umedecidos com BGM a 23 0C no escuro por 5 dias pareceu ser mais alta quando comparada com os explantes excisados a seco que não foram pré-cultivados. As perdas devido à contaminação fúngica puderam ser mitigadas usando um agente 20 antifúngico, tal como BRAVO 75 e Captan 50 a cerca de 1% cada durante a etapa de pré-cultura e/ou cocultura. A análise Southern blot e INVADER das plantas produzidas neste exemplo com uma sonda CP4 confirmou a natureza transgência destas plantas.
Tabela 24: MEIO ORGANOGÊNICO (PR) de Soia
COMPOSTO: POR 4 LITROS:
SaisMS 17,2 g
Sais MS Diluídos 3X 40 mL Ácido Nicotínico (1 mg/ml) 4 mL Cloridrato de Piridoxina (1 mg/mL) 4 mL
Cloridrato de Tiamina (1 mg/mL) 46,8 mL Sacarose(UItrapura) 120g
Mioinositol (Grau Cultura de Células) 0,40 g pH 5,8
Ágar Lavado 32 g ADIÇÕES DEPOIS DA AUTOCLAVE:
Prolina (Insumo 2,5 M) 19,2 ml
Tlnsumo de Hormânios SG/OR 40,0 mL Tabela 25: Efeito de pré-cultura de explante seco: freqüência de transformação usando pMON1Q343
Tipo de Composições e Ex¬ Brotos TF Perda Fún¬ Explante Condições dos plantes Enrai¬ gica % Meios de Pré- zados (PLANTcultura CONs) Úmido Nenhuma 300 15 5,00% 0% Seco Nenhuma 650 6 0,92% 13% Seco BGM, 5 d 23 0C 972 29 2,98% 0% escuridão Seco BGM, 5 d 23 0C 365 1 0,27% 44% 16/8 Iuz Seco BGM, 5 d 28 0C 315 3 0,95% 7% escuridão Seco BGM, 5 d 28 0C 188 1 0,53% 62% 16/8 Iuz Os estudos foram repetidos comparando duas construções, pMON101343, que compreende um T-DNA que compreende um gene CP4 10 que especifica resistência a glifosato e uma origem de replicação OriV; e pMON107350 que compreende um T-DNA que compreende um gene de CP4 que especifica resistência a glifosato e uma origem de replicação OriR (documento ne US 2007/0074314) no esqueleto de vetor. Novamente, préculivar os explantes secos aumentou a TF em comparação com a TF de ex15 plantes secos não pré-cultivados, como indicado na Tabela 26. Tabela 26: Estudos adicionais sobre pré-cultura de explantes excisados a seco
Tipo de Explante e N0 de Explan¬ N0 de Brotos Enrai¬ TF Vetor tes zados pMON101343 Úmido 535 16 2,99% Seco 1331 8 0,60% Pré-cultura a seco 2437 43 1,76% pMON107350 Úmido 671 11 1,64% Seco 190 0 0,00% Pré-cultura a seco 500 9 1,80% Como indicado na Tabela 27, os explantes excisados a seco
pré-cultivados também produziram TFs mais altas e foram cultivados em 5 meio líquido de regeneração (meio da Tabela 12, exceto pelo AgarGeI) que foi removido e adicionado automaticamente usando um sistema robótico. A TF pareceu ser ainda mais alta com o meio de regeneração líquido com uma etapa de pré-cultura. Os explantes excisados a úmido em meio líquido parecem ter TF baixa devido à contaminação.
Pré-cultivar, surpreendentemente, melhora a compotência para
transformação e melhora a uniformidade da transformação. Tais melhoras são cruciais para reduzir a variabilidade durante corridas de produção em escala industrial para produzir plantas de soja transgênicas.
Tabela 27: Pré-cultura de explantes excisados a seco: comparação de meio sólido e líquido
Tipo de Composições e Meio de Re¬ Ex¬ Brotos TF Explante Condições do generação plantes Enrai¬ pMONIOI Meio de Pré- zados 343 cultura Úmido None WPM sólido 460 17 3,70% Úmido None WPM líquido 31 0 0,00% Seco None WPM sólido 1286 8 0,62% Seco None WPM líquido 128 0 0,00% Tipo de Composições e Meio de Re¬ Ex¬ Brotos TF Explante Condições do generação plantes Enrai¬ pMONIOI Meio de Pré- zados 343 cultura Seco BGM, 5 d 23 0C WPM sólido 1.257 33 2,63% escuridão Seco BGM, 5 d 23 -C WPM líquido 111 3 2,70% escuridão Exemplo 14
Produção de plantas de soja transgênicas usando explantes de soia secos e seleção com espectinomicina
Sementes secas viáveis (sementes de soja de qualidade esto5 cadas adequadamente compreendem aproximadamente 10 a 12% de teor de umidade interna) foram enxaguadas com água esterilizada, ou uma solução de hipoclorito de sódio (na fiaxa entre 0 ppm e ~30,000 ppm de cloro ativo, incluindo 50 ppm e 200 ppm de cloro ativo) por 3 a 20 minutos. O líquido foi então drenado. Este processo eleva o teor de umidade interna para 10 aproximadamente 16%. Depois desta breve etapa de sanitização da superfície, o teor de umidade interna das sementes foi baixado em uma secadora de sementes industrial com um fluxo de ar desumidificado (temperatura controlada até aproximadamente 15 a 32 0C (60 a 90 0F) até menos do que 8%.
Depois da estocagem desejada, os explantes foram reidratados para transformação. Os tipos de meios usados para esta etapa podem ser variados e incluíram "meio de germinação de feijão" (BGM; Tabela 16), meio de inóculo de soja (INO; Tabela 1), e culturas de crescimento de Agrobacterium preparadas em fase Iog (AGRO). A cultura de crescimento de Agrobacterium foi desenvolvida de um dia para o outroem Caldo de Lisogenia (LB, referido também comumente como caldo de Luria-Bertani) até fase log, e depois centrifugada e recolocada em suspensão até uma densidade óptica final a 660 nm de 0,25 a 0,6. O meio usado para a diluição é igual ao meio de inóculo de soja. As temperaturas e durações da re-hidratação também podem ser variadas, sendo que alguns experimentos têm explantes que foram embebidos em uma destas soluções de um dia para o outro a 4 °C. Outras variações podem ser feitas na duração de exposição ao respectivo meio de hidratação, nas várias temperaturas durante esta exposição e no grau de saturação no respectivo meio. Os tempos de exposição Os tempos de exposição testados ficaram na faixa entre 0 e 24 horas. As temperaturas durante tempos de exposição mais longos (aqueles maiores do que 4 horas) foram à temperatura ambiente (~26 °C), 23 °C, ou 4 °C. Tempos de exposição de 4 horas ou menos foram todos testados à temperatura ambiente. Como uma alternativa para submergir completamente ou saturar substancialmente os explantes com meio líquido durante o processo de hidratação, alguns tratamentos empregaram o uso de papel de filtro umedecido (líquido suficiente para umedecer, mas não para saturar). Isto foi feito com pelo de filtro umedecido com BGM ou meio de cultura de Agrobacterium. A re-hidratação foi realizada em uma série de recipientes, incluindo, porém sem limitações, tubos de centrifugação cônicos, frascos de vidro graduados, ou um recipiente de cultura de tecidos PLANTCON (MP Biomedicals, Irvine, CA).
Depois da re-hidratação, os explantes foram brevemente sonicados na presença das culturas de Agrobacterium apropriadas. A cocultura e as etapas subseqüentes foram realizadas em incubadoras Percival iluminadas por 2 a 5 dias (16 horas de luz, 8 horas de escuridão, com intensidade 20 da Iuz de cerca de 5 μΕ a 200 μΕ) em uma temperatura de aproximadamente 23 a 25 °C, e podem ser realizadas a até cerca de 35°C. A Iuz reconhecidamente promove a transferência de genes da Agrobaeterium para células vegetais. A espectinomicina foi aplicada como um agente de seleção durante a re-hidratação, em etapas de cocultura e/ou depois da cocultura a 15 mg/L 25 a 1000 mg/L.
Os brotos (plantas) fenótipo-positivos foram recuperados rotineiramente, como indicado na Tabela 28, usando a construção pMON96999 que compreende um T-DNA que compreende um gene aadA e uma origem de replicação OriV, ou a construção pMON101343 que compreende um T30 DNA que compreende um gene CP4 e uma origem de replicação OriV. O termo "fenótipo-positivos" na presença de espectinomicina significa que os brotos são verdes e robustos, enquanto que os brotos fenótipo-negativos são fracos e Iixiviados (brancos), caso eles absolutamente não alonguem. Espectinomicina ou glifosato foram usados no meio de regeneração (sólido e também líquido) na concentração indicada na Tabela 28.
Tabela 28: Freqüência de transformação de explantes de soia secos usando glifosato ou espectinomicina como agente seletivo
Espectinomicina (% de TF) Glifosato (% de TF) ppm 50 ppm 100 ppm 200 ppm 50 uM 4,66 4,24 6,34 5,99 2,00 Espectinomicina também foi usada como um agente seletivo para a transformação de embriões de soja excisados a seco utilizando as seguintes condições: 1 h de hidratação em meio INO, 4 dias de cocultura em INO, 150 ppm de espectinomicina, com cultura sobre WPM sólido ou líquido (Tabela 2; com ou sem ágar adicionado). Temperaturas de 23-25 ou 28 °C,
atá Hf? 35 0C1 podem ser utilizadas. Os brotos fenótipo-positivos foram
WIUU UV>
colhidos em 8 e 10 semanas depois da inoculação com Agrobacterium, e o enraizamento foi induzido sobre BRM sólido (vide Exemplo 2) com 150 ppm de espectinomicina. Freqüências de transformação muito altas de 25,05% e 19,27% foram obtidas e dois estudos diferentes.
Exemplo 15
Produção de plantas de soia transgênicas usando embriões de soia secos, espectinomicina. e meio de cultura líquido
Nestes estudos, os explantes foram inicialmente hidratados e 20 eventualmente regenerados sobre meio WPM sólido com sobreposição de líquido ou meio WPM líquido como acima. Todos explantes foram transferidos em 6 semanas depois da inoculação para bandejas que contêm o Oásis® Wedge System (Smithers-Oasis USA; Kent1 OH) um meio líquido simplificado (0,5 g/L de WPM com 0,25 mg/L de IBA). As plantas Ro enraizadas e 25 brotadas foram obtidas 2 a 4 semanas depois. Em todos estudos e tratamentos, a hidratação inicial dos explantes foi fetia por 1 hora no respectivo meio, como indicado na Tabela 29. O meio de cultura líquido foi igual ao da Tabela 2, exceto que o glifosato foi substituído por espectinomicina a 150 ppm. No tratamento com sobreposição de líquido, foram usados meios de cultura sólidos e também líquidos; o meio líquido foi distribuído sobre o topo dos explantes, pois eles estavam assentados sobre meio sólido em um tempo especificado durante a cutura do tecido, como identificado na Tabela 30. Isto foi feito como um tipo de refersco do meio e evita a necessidade de transferir 5 os explantes do meio antigo para meio novo. Nos tratamentos de controle, os explantes foram plaqueados sobre a superfície de meio WPM sólido (Tabela 2). Os brotos foram colhidos e enraizados sobre BRM sólido como descrito acima, exceto que o glifosato foi substituído por espectinomicina a 150 ppm.
Tabela 29: Freqüência de transformação com dadas condições de hidratação
Tratamento Meio de Hidrata¬ Incubação com % de TF% (média ção Agrobacteria de 3 repetições) 1 - Control INO O minuto 3,10% 2 BGM sem cefota- O minuto 14,67% xima 3 BGM sem cefota- 15 minutos 15,45% xima 4 BGM sem cefota- 30 minutos 18,50% xima 5 INO O minuto 13,98% 6 INO 15 minutos 9,64% 7 INO 30 minutos 13,79% Tabela 30: Timina de Sobreposição de Líquido Tratamen¬ Timing de sobreposição de líqui¬ Volume de sobreposição do Transferência Oasis® % de TF (média to do meio líquido sobre WPM sólido Wedge para regeneração de repetições) Controle-1 ND Nenhum No 8,00% 2 Nenhum Nenhum Sim 14,67% 3 3 semanas depois da inoculação 5 mL Sim 15,45% 4 3 semanas depois da inoculação 10 mL Sim 18,50% 5 4 semanas depois da inoculação 5 mL Sim 13,98% 6 4 semanas depois da inoculação 10 mL Sim 9,64% Exemplo 16
Produção de plantas de soia transgênicas usando embriões de soia secos, espectinomicina. e transferindo os explantes integrais regenerados com uma etapa de pré-cultura
Nestes estudos, como no Exemplo 13, foi usada uma etapa de
pré-cultura (5 dias 23 °C, escuridão em BGM). Uma hidratação de uma hora do explante excisado a seco em meio INO também foi foi fetia antes da etapa de pré-cultura. Cerca de 12 mL de WPM líquido contendo 150 ppm de espectinomicina foram distribuídos para dentro de PLANTCON de cocultura 10 depois do período de cocultura period, e os explantes foram plaqueados sobre a superfície de WPM sólido contendo 150 ppm de espectinomicina 4 dias depois. Neste exemplo, os brotos verdes fenótipo-positivos foram identificados em cerca de 4 semanas da regeneração e transforidos do meio de regeneração WPM para bandejas que contêm o Oasis® VVedge System (Smi15 thers-Oasis USA; Kent, OH) e um meio líguido simplificado (0,5 g/L de WPM com 0,25 mg/L de IBA). As plantas Ro enraizadas e brotadas foram obtidas 2 a 4 semanas depois. Na totalidade, a pré-cultura nestes estudos melhorou também a % de TF (Tabela 31). A porcentagem de episódios de qualidade indicada abaixo (Tabela 22) refere-se à proporção de episódios transgênicos 20 que demonstram a presença de 1-2 cópias de um gene de interesse (GUS) e também de um gene marcador {aadA) pelo ensaio Invader®. A TF isenta de marcador (mTF) refere-se à % de episódios sem gene marcador. Tabela 31: Freqüência de transformação e qualidade observadas a partir de explantes integrais regenerados Tipo de Vetor do N2 de Ex¬ N- de Episódios % de TF Na de Episó¬ % de Episóidios % de qTF mTF Estimada Protocolo plantes Produzidos dios Testados de Qualidade ** (%) Excisado a Seco - 260 34 13,1 ±0,17 32 21,9 2,7 ±0,23 0,62 2T/0riV Excisado a Seco - 161 15 9,32 ± 7,38 14 28,6 2,5 0,45 2T/0riRi Seco Pré-cultivado 1.641 319 19,4 ±5,42 311 24,4 4,6 ± 1,35 1,1 - 2T/0riV Seco Pré-cultivado 336 66 19,64 ± 1,97 64 20,3 3,9 ±1,22 0,7 - 2T/0riRi Exemplo 17
Produção de plantas de soia transgênicas usando embriões de soia secos, espectinomicina, e transferência de expalnte integral regenerado com uma etapa de pré-cultura
Neste exemplo, foram usados explantes estocados 3 meses, e
uma etapa de hidratação de 1 h feita em INO foi utilizada, no explante excisado a seco. A pré-cultura foi realizada por 5 dias a 23 0C em condições de escuridão, em BGM com 50 ppm de nistatina e 10 ppm de TBZ como fungicidas. TDZ e ácido lipóico foram adicionados ao inóculo e também ao meio 10 de cocultura (INO). A construção pMON107379 era um vetor com 2T convencional que compreende oriRi e o gene aadA, e a cocultura foi feita por 5 dias. Depois da cocultura, os explantes foram plaqueados sobre a superfície de WPM sólido e depois transferidos para o Oasis® Wedge System (Smithers-Oasis USA; Kenti OH) com um meio líquido simpiiicado (0,5 g/L de 15 WPM com 0,25 mg/L de IBA). Como indicado na Tabela 32, a pré-cultura de explantes secos aumentou a TF. Assim sendo, os explantes com 3 meses de idade estocados puderam se desempenhar similarmente aos explantes secos recém-excisados. Além disso, a adição de nistatina (50 ppm) e tiabendazol (10 ppm) ao meio de cocultura INO dissolvidos em DMSO (1,0 mL 20 de DMSO por litro de INO) melhorou a saúde dos explantes, provavelmente por controlar leveduras e fungos encontrados comumente dentro das ementes e sobre elas, e podem ser usada como uma ferramenta útil quando se realiza cultura de tecidos grandes e/ou automatizadas.
Tabela 32: Efeito da pré-cultura sobre a TF (%) de explantes secos estocados
Tipo de Explante Etapa de N0 de Ex¬ Plantas RO TF Pré-cultura plantes Excisados a Úmido Não 263 75 28.52% Explantes Secos Não 678 71 10.47% Estocados Explantes Secos Não 375 24 6,40% Frescos Tipo de Explante Etapa de N0 de Ex¬ Plantas RO TF Pré-cultura plantes Explantes Secos Sim 901 129 14,32% Estocados Xplantes Secos Sim 1008 112 11,11% Frescos Todas composições e métodos aqui descritos e reivindicados pode ser feitos e executados sem experimentação excessiva à Iuz do presente relatório descritivo. Embora as composições e métodos desta invenção tenham sido descritos em termos das modalidades ilustrativas precedentes, deve ficar evidente para os versados nessas técnicas que variações, mudanças, modificações, e alterações podem ser aplicadas às composições, métodos, e nas etapas ou na seqüência de etapas dos métodos aqui descritos, sem fugir do verdadeiro conceito, espírito e âmbito da invenção. Mais especificamente, deve ficar evidente que certos agentes que estão quimicamente e também fisiologicamente relacionados podem substituir os agentes aqui descritos, e ao mesmo tempo, resultados iguais ou similares podem ser atingidos. Todos esses substitutos similares e modificações evidentes para os versados nessas técnicas são julgados como estando dentro do espírito, âmbito e conceito da invenção como definida pelas reivindicações apensadas.
REFERÊNCIAS
As referências que se seguem, até o grau em que elas fornecem detalhes de procedimentos ou outros detalhes suplementares àqueles aqui enunciados, são aqui especificamente incorporadas como referência.
Patente número US 4,761,373; Patente número US 4,810,648;
Patente número US 5,013,659; Patente número US 5,015,580; Patente número US 5,073,675; Patente número US 5,094,945; Patente número US 5,141,870; Patente número US 5,164,310; Patente número US 5,217,902; Patente número US 5,229,114; Patente número US 5,273,894; Patente nú25 mero US 5,276,268; Patente número US 5,322,938; Patente número US 5,352,605; Patente número US 5,359,142; Patente número US 5,362,865; Patente número US 5,378,824; Patente número US 5,463,175; Patente número US 5,512,466; Patente número US 5,512,466; Patente número US 5,538,880; Patente número US 5,543,576; Patente número US 5,550,318; Patente número US 5,561,236; Patente número US 5,563,055; Patente número US 5,591,616; Patente número US 5,605,011; Patente número US 5 5,608,149; Patente número US 5,627,061; Patente número US 5,633,435; Patente número US 5,633,437; Patente número US 5,637,489; Patente número US 5,646,024; Patente número US 5,689,041; Patente número US 5,693,512; Patente número US 5,731,179; Patente número US 5,750,876; Patente número US 5,767,366; Patente número US 5,824,877; Patente nú10 mero US 5,850,019; Patente número US 5,869,720; Patente número US 5,914,451; Patente número US 5,958,745; Patente número US 5,981,834; Patente número US 5,981,840; Patente número US 5,985,605; Patente número US 5,998,700; Patente número US 6,011,199; Patente número US 6.040:497; Patente número US 6,072,103; Patente número US 6,080,560; 15 Patente número US 6,140,075; Patente número US 6,166,292; Patente número US 6,171,640; Patente número US 6,225,105; Patente número US 6,228,623; Patente número US 6,265,638; Patente número US 6,271,443; Patente número US 6,380,462; Patente número US 6,380,466; Patente número US 6,384,301; Patente número US 6,414,222; Patente número US 20 6,426,447; Patente número US 6,444,876; Patente número US 6,459,018; Patente número US 6,476,295; Patente número US 6,483,008; Patente número US 6,489,461; Patente número US 6,495,739; Patente número US 6,531,648; Patente número US 6,537,750; Patente número US 6,538,178; Patente número US 6,538,179; Patente número US 6,538,181; Patente nú25 mero US 6,541,259; Patente número US 6,576,818; Patente número US 6,589,767; Patente número US 6,596,538; Patente número US 6,613,963; Patente número US 6,653,530; Patente número US 6,660,849; Patente número US 6,706,950; Patente número US 6,723,837; Patente número US 6,770,465; Patente número US 6,774,283; Patente número US 6,812,379; 30 Patente número US 6,822,141; Patente número US 7,022,896; Patente número US 6,828,475; Patente número US 5,106,739; Patente número US 5,378,619; Patente número US 5,530,196; Patente número US 5,641,876; Patente número US 5,659,122; Patente número US 5,837,848; Patente número US 6,051,753; Patente número US 6,140,078; Patente número US 6,175,060; Patente número US 6,177,611; Patente número US 6,232,526; Patente número US 6,252,138; Patente número US 6,294,714; Patente nú5 mero US 6,426,446; Patente número US 6,429,357; Patente número US 6,429,362; Patente número US 6,433,252; Patente número US 6,437,217; Patente número US 6,635,806; Patente número US 7,002,058; Patente número US 7,288,694.
Patente número US RE37,543 Publicação de Pedido de Patente número US 2005/0005321;
Publicação de Pedido de Patente número US 2006/0059589; Publicação de Pedido de Patente número US 2003/0028917; Publicação de Pedido de Patente número US 2003/0083480; Publicação de Pedido de Patente número US 2003/0115626; Publicação de Pedido de Patente número US 15 2003/0135879; Publicação de Pedido de Patente número US 2003/110532; Publicação de Pedido de Patente número US 2004/0177399; US Patent Application Publication No. 2004/0244075; Publicação de Pedido de Patente número US 2005/0183170; Publicação de Pedido de Patente número US 2005/0022261; Publicação de Pedido de Patente número US 2006/0200878; 20 Publicação de Pedido de Patente número US 2007/0271627.
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Claims (64)

1. Método para produzir uma planta transgênica que contém pelo menos duas seqüências de ácidos nucleicos heterólogas, compreendendo: (a) disponibilizar um explante que compreende uma primeira seqüência de ácidos nucleicos que confere resistência a um herbicida; (b) transformar o explante para compreender uma segunda seqüência de ácidos nucleicos que compreende um gene marcador selecionável que confere resistência à espectinomicina; e (c) regenerar um explante que apresenta resistência à espectinomicina para dar uma planta transgênica que contém pelo menos duas seqüências de ácidos nucleicos heterólogas.
2. Método, de acordo com a reivindicação 1, em que o explante compreende um meristema embrionário.
3. Método, de acordo com a reivindicação 1, em que a primeira seqüência de ácidos nucleicos heteróloga confere resistência a glifosato, bialafos, fosfinotricina, Basta, glufosinato, 2,4-D, canamicina e aminoglicosídeos afins, higromicina, um inibidor de acetil-coA carboxilase, um gerador de radicais oxigênio, ou dicamba.
4. Método, de acordo com a reivindicação 1, em que o explante é um explante de soja, milho, algodão ou canola.
5. Método, de acordo com a reivindicação 4, em que o explante é um explante de soja ou algodão.
6. Método para produzir uma planta transgênica, compreendendo: (a) transformar pelo menos um primeiro explante de semente com uma seqüência de ácidos nucleicos heteróloga que compreende um marcador selecionável que confere tolerância à espectinomicina; e (b) regenerar uma planta transgênica a partir das células transformadas, onde o explante é colocado, antes, concomitantemente e/ou depois da etapa (a) ou etapa (b), em contato com pelo menos um primeiro meio que compreende espectinomicina, para selecionar células transformadas que compreendem um marcador selecionável.
7. Método, de acordo com a reivindicação 1, em que a planta transgênica origina-se a partir da transformação de um meristema que resulta na transformação de um tecido de linha germinal.
8. Método, de acordo com a reivindicação 1, em que a planta resultante é não-quimérica.
9. Método, de acordo com a reivindicação 1, em que a planta resultante é quimérica.
10. Método, de acordo com a reivindicação 6, em que o primeiro explante de semente compreende um transgene.
11. Método, de acordo com a reivindicação 6, em que o explante é estocado em uma temperatura entre 0 e 15 0C durante entre 1 hora e 7 dias antes da etapa (a).
12. Método, de acordo com a reivindicação 6, em que o explante compreende um meristema embrionário.
13. Método, de acordo com a reivindicação 6, em que o meio compreende entre cerca de 15 mg/L e cerca de 1.500 mg/L de espectinomicina.
14. Método, de acordo com a reivindicação 6, em que as células do explante compreendem uma seqüência codificadora que confere tolerância a glifosato, bialafos, fosfinotricina, Basta, glufosinato, 2,4-D, canamicina e aminoglicosídeos afins, hígromicina, estreptomicina, ampicilina ou dicamba.
15. Método, de acordo com a reivindicação 6, em que durante ou depois da etapa (a), os explantes são desenvolvidos na presença de um agente seletivo a 35 °C-40 0C e/ou são desenvolvidos sob condições de iluminação que permitem o desenvolvimento normal de plastídeos.
16. Método, de acordo com a reivindicação 15, em que o desenvolvimento a 35 °C-40 0C é realizado por 1-7 dias ou as condições de iluminação compreendem pelo menos 5 μ einsteins com pelo menos cerca de um fotoperíodo de 16 horas de 16 horas de luz/8 horas de escuridão.
17. Método, de acordo com a reivindicação 6, em que a etapa (a) compreende desenvolver uma explante em um meio de cocultura que compreende espectinomicina.
18. Método, de acordo com a reivindicação 17, em que o explante não é colocado em contato com um meio que compreende espectinomicina depois de ser transferido de um meio de cocultura.
19. Método, de acordo com a reivindicação 17, em que o explante é colocado em contato com um meio que compreende espectinomicina depois de ser transferido de um meio de cocultura.
20. Método, de acordo com a reivindicação 6, em que o explante que está se regenerando para dar uma planta é transferido para um solo ou substituto de solo para enraizamento sem pré-enraizar em meio ascético.
21. Método, de acordo com a reivindicação 6, em que o ácido nucleico heterólogo compreende ainda uma seqüência codificadora que confere um traço de interesse agronômico ou melhor uso final.
22. Método, de acordo com a reivindicação 6, em que a etapa (a) compreende transformar a célula do explante com pelo menos um segundo ácido nucleico heterólogo.
23. Método, de acordo com a reivindicação 22, em que o segundo ácido nucleico heterólogo compreende uma seqüência codificadora que confere tolerância a herbicidas.
24. Método, de acordo com a reivindicação 22, em que o primeiro e o segundo ácidos nucleicos heterólogos são integrados em diferentes Ioci dentro do genoma da célula.
25. Método, de acordo com a reivindicação 6, compreendendo ainda, antes da etapa (a), a etapa de condicionamento osmótico (priming) da semente, em que o condicionamento osmótico compreende colocar a semente em contato com uma citocinina.
26. Método, de acordo com a reivindicação 6, compreendendo ainda colocar o explante em contato com uma citocinina antes, concomitantemente e/ou depois da etapa (b).
27. Método, de acordo com a reivindicação 26, em que a citocinina é selecionada no grupo que consiste em tidiazuron, BAP (6-benzilamino-purina), cinetina, CPPU (N-(3-cloro-4-piridil)-N'-feniluréia), 2iP (6-(y,ydimetil-alil-amino)-purina), zeatina, zeatina-ribose, adenina, e TIBA (ácido . 2,3,5-triiodo-benzóico).
28. Método, de acordo com a reivindicação 6, em que a etapa (a) compreende colocar o explante em contato com rizobiáceas recombinantes que compreendem o dito ácido nucleico heterólogo, em que as rizobiáceas foram expostas a tidiazuron antes ou concomitantemente com a colocação em contato do explante com as rizobiáceas recombinantes.
29. Método, de acordo com a reivindicação 28, em que a rizobiácea é exposta a tidiazuron durante entre cerca de 1 e 5 dias antes da colocação em contato do explante com a rizobiácea recombinante.
30. Método, de acordo com a reivindicação 28, em que as rizobiáceas são colocadas em suspensão na presença de um agente seletivo ativo contra um explante transformado antes de colocar os explantes em contato com as rizobiáceas.
31. Método, de acordo com a reivindicação 28, em que as rizobiáceas são selecionadas no grupo que consiste em Abrobacteria, Sinorhizobia, Mesorhizobia, e Rhizobia.
32. Método, de acordo com a reivindicação 28, em que os explantes são desenvolvidos na presença de um fungicida ates, durante ou depois da etapa (a).
33. Método, de acordo com a reivindicação 32, em que os explantes são desenvolvidos na presença de um fungicida e DMSO.
34. Método, de acordo com a reivindicação 32, em que os explantes são desenvolvidos na presença de nistatina, tiabendazol, e DMSO.
35. Método, de acordo com a reivindicação 6, em que o explante é um explante de soja, milho, algodão ou canola.
36. Método, de acordo com a reivindicação 35, em que o explante é um explante de soja.
37. Método, de acordo com a reivindicação 6, compreendendo ainda a etapa de (c) obter uma planta progênita de qualquer geração da planta transgênica que compreende o gene que confere o traço de interesse e carece do marcador selecionável.
38. Método, de acordo com a reivindicação 6, em que o ácido nucleico heterólogo compreende um primeiro segmento de DNA que compreende limites esquerdo e direito do T-DNA1 flanqueando um gene que confere um traço de interesse; e um segundo segmento de DNA que compreende um segundo conjunto de limites esquerdo e direito do T-DNA1 flanqueando o dito marcador selecionável que confere tolerância à espectinomicina.
39. Método, de acordo com a reivindicação 38, compreendendo ainda a etapa de (c) obter uma planta progênita de qualquer geração da planta transgênica que compreende o gene que confere o traço de interesse e carece do marcador selecionável.
40. Método, de acordo com a reivindicação 6, em que o ácido nucleico heterólogo compreende limites direito e esquerdo do T-DNA e primeiro e segundo segmentos de DNAi em que o primeiro segmento de DNA compreende um gene de interesse localizado depois do limite direito, e em que o segundo segmento de DNA compreende o marcador selecionável localizado depois do limite esquerdo.
41. Método, de acordo com a reivindicação 6, em que o ácido nucleico heterólogo compreende o primeiro e segundo limites direitos do TDNA, em que um primeiro segmento de DNA que compreende um gene de interesse fica localizado depois do primeiro limite direito, e um segundo segmento de DNA que compreende o marcador selecionável fica localizado depois do segundo limite direito.
42. Método, de acordo com a reivindicação 6, compreendendo cultivar o dito explante em meio carecido de espectinomicina por cerca de 1 a cerca de 7 dias durante a etapa (b).
43. Método, de acordo com a reivindicação 6, em que a colocação do explante em contato com pelo menos um primeiro meio que compreende espectinomicina é durante entre cerca de 15 minutos e cerca de 7 dias.
44. Método, de acordo com a reivindicação 6, em que o marcador selecionável é codificado por aadA.
45. Método, de acordo com a reivindicação 44, em que aadA compreende SEQ ID NO: 1.
46. Método, de acordo com a reivindicação 44, em que o gene aadA é fundido a um peptídeo de trânsito de cloroplasto.
47. Método, de acordo com a reivindicação 44, em que aadA compreende SEQ ID NO: 2.
48. Método, de acordo com a reivindicação 6, em que o explante é definido ainda como tendo sido mantido antes da etapa (b) sob condições nas quais o explante não germina e permanece viável e competente para transformação genética.
49. Método, de acordo com a reivindicação 48, em que as ditas condições compreendem desidratar o explante ou uma semente que compreende o explante.
50. Método, de acordo com a reivindicação 49, definido ainda como compreendendo aumentar o teor de umidade do explante antes ou concomitantemente com a etapa (b).
51. Método, de acordo com a reivindicação 48, em que as ditas condições compreendem um teor de umidade interna do explante entre cerca de 3% e cerca de 25%.
52. Método, de acordo com a reivindicação 51, em que as ditas condições compreendem um teor de umidade interna do explante entre cerca de 3% e cerca de 16%.
53. Método, de acordo com a reivindicação 48, em que as ditas condições compreendem uma temperatura entre cerca de -80 0C e cerca de60 0C.
54. Método, de acordo com a reivindicação 48, definido ainda como compreendendo o condicionamento osmótico (priming) do explante antes da etapa (b).
55. Método, de acordo com a reivindicação 54, em que o condicionamento osmótico (priming) da semente compreende colocar o explante ou uma semente que compreende o explante em contato com uma solução aquosa que compreende água, um regulador de crescimento de plantas, um agente de seleção, ou um condicionador da membrana celular.
56. Método, de acordo com a reivindicação 6, em que a transformação de pelo menos uma primeira célula do explante com um ácido nucleico heterólogo é conduzida por transformação mediada de forma bacteriana ou bombardeio de microprojéteis.
57. Método, de acordo com a reivindicação 6, em que o explante é definido ainda como tendo sido excisado de uma semente que compreende 3% e 25% de teor de umidade interna, ou uma semente hidratada ou germinante que compreende 26% a 80% de teor de umidade interna, ou compreende um tecido do grupo que consiste em: meristema, embrião imaturo, embrião, eixo embrionário, cotilédone, hipocotilédone, mesocótilo, folha, base foliar primária, disco foliar, ponta de broto, e plúmula.
58 .Método, de acordo com a reivindicação 57, em que o explante é definido ainda como tendo sido excisado de uma semente germinada ou embebida.
59. Método, de acordo com a reivindicação 6, em que o explante não é colocado em contato com um meio que compreende espectinomicina depois da etapa (a).
60. Método, de acordo com a reivindicação 6, em que o primeiro meio é um líquido.
61. Método, de acordo com a reivindicação 6, em que uma ou mais etapas (a)-(b) são automatizadas.
62. Construçção de ácido nucleico que compreende duas seqüências que conferem resistência a espectinomicina ou estreptomicina, em que a primeira seqüência está operacionalmente ligada a um promotor ativo em uma célula vegetal, e a segunda seqüência está operacionalmente ligada a um promotor ativo em uma célula procariótica.
63. Construção, de acordo com a reivindicação 62, em que as seqüências que conferem resistência a espectinomicina ou estreptomicina codificam um polipeptídeo que compreende atividade de aminoglicosídeo-3'adeniltransferase (aadA).
64. Construção, de acordo com a reivindicação 62, em que pelo menos uma das seqüências compreende SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 2.
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