BRPI0808895A2

BRPI0808895A2 - Proteína de resistência a insetos derivadas de uma planta, gene de resistência a insetos, vetor recombinante, célula hospedeira, c~elula de planta, transformante, método para produzir um transformante, proteína e agente de resistência a insetos

Info

Publication number: BRPI0808895A2
Application number: BRPI0808895-0A2A
Authority: BR
Inventors: Kotaro Konno
Original assignee: Nat Inst Of Aglobiological Sciences
Priority date: 2007-03-02
Filing date: 2008-03-03
Publication date: 2014-09-02
Also published as: US8624085B2; JP4865749B2; JP2008245640A; US20100146668A1; WO2008108345A1; CA2679926A1; CA2679926C

Description

I "PROTEÍNA DE RESISTÊNCIA A INSETOS DERIVADAS DE UMA PLANTA, GENE DE RESISTÊNCIA A INSETOS, VETOR RECOMBINANTE, CÉLULA HOSPEDEIRA, CÉLULA DE PLANTA, TRANSFORMANTE, MÉTODO PARA PRODUZIR UM TRANSFORMANTE, PROTEÍNA E AGENTE DE RESISTÊNCIA A INSETOS".

Campo da invenção

A presente invenção refere-se a uma proteína resistente a insetos; um gene resistente aos insetos codificante da proteína resistente aos insetos; um vetor recombinante 10 contendo o gene resistente ao inseto; uma célula hospedeira e uma célula de planta transferida com o vetor recombinante; um transformante transformado pelo gene resistente ao inseto e um método para produzir o mesmo; uma proteína recuperada pelo mesmo; e um agente 15 resistente ao inseto compreendendo eles como ingrediente ativo.

Histórico da técnica anterior

Uma proteína tendo resistência a insetos (doravante denominada como "proteína resistente ao inseto") é um 20 material essencial para transferência de genes dentro de uma planta para realizar a criação da hereditariedade de uma planta geneticamente resistente a insetos. Pode ser também utilizado como um novo agente resistente ao inseto tal como químicos agrícolas por pulverização de uma 25 proteína resistente a insetos expressos em microorganismos, células cultivadas e animais multicelulares individuais e plantas e recuperados.

As proteínas resistentes a insetos que são utilizados amplamente industrialmente incluem toxinas Bt (proteínas) produzidas por Bacillus thuringiensis que é uma bactéria Gram-positiva.

A referida toxina Bt em concentrações baixas (cerca de 1 ppm) são conhecidas por exibir atividade de resistência a insetos e inseticidas (ver, por exemplo, os documentos 1 e 2 de não-patentes).

Entretanto, as toxinas Bt acima são derivadas a partir da bactéria e assim ter uma resistência profunda ao uso como fontes genéticas para recombinantes, tais como recombinação gênica e, portanto, tem sido desejado detectar proteinas resistentes a insetos a partir de plantas.

Em contraste, como proteinas resistentes a insetos derivadas de plantas, os inibidores de proteases são obtidos de Vigna sinensis (por exemplo, ver o documento 3 de não-patente ou o documento de patente 1) , os inibidores de amilase derivados de feijão (por exemplo, 10 ver o documento 4 de não-patente) e lecitinas derivadas de campanilla branca (por exemplo, ver o documento 5 nãopatente ou o documento de patente 2) são conhecidos. Documento 1 de não patente: "Canadian Journal of Microbiology", 51, 988-995 (2005);

Documento 2 de não patente: "Journal of pesticide Reform", 14, 13-20 (1994);

Documento 3 de não patente: "Pest Management Science", 57, 57-65 (2001);

Documento 4 de não-patente: "Plant Physiology", 107, 1233-1239 (1995);

Documento 4 de não-patente: "Journal of Insecto Physiology", 43, 727-739 (1997);

Documento de Patente 1: Patente norte-americana No.: US 4,640836; e

Documento de Patente 2: Patente norte-americana No.: US 5,545,820.

Descrição da invenção Problema técnico

Entretanto, não pode ser dito que as toxinas Bt que são proteinas resistentes a insetos descritos nos documentos

1 e 2 de não-patente tenham suficiente resistência aos insetos. De fato, parece que os insetos têm resistência a toxinas Bt, tal como Plutella xylostella e Ostrinia furnacalis.

Os inibidores de protease descritos no documento 3 nãopatente ou no documento 1 de patente, acima mencionados demonstrem apenas um certo grau de atividade de resistência a insetos como reduzir o crescimento de larvas de teias por metade de duas semanas mesmo quando adicionados em altas concentrações alcançando 2% das proteínas totais.

Os inibidores de amilase descritos no documento 4 de nãopatente acima mencionado, quando expressos em Pisum sativum, matam apenas 70% de vicia faba (Bruchidae) por elevada expressão de 2-3% das proteinas solúveis totais dos feijões, mas 30% cresce normalmente. Adicionalmente, 10 a expressão de 1% mostra a referida atividade de resistência a inseto fraca e que 80% ou mais creste até a fase adulta normalmente.

As lecitinas descritas no documento 5 de não-patente ou no documento 2 de patente tem uma atividade de 15 resistência a insetos extremamente fraca e que o peso de uma larva de teia alimentada com uma dieta artificial provida abundantemente com uma concentração de 2% das proteínas totais durante um mês é reduzida em cerca de 20%.

Em outras palavras, todos os inibidores de protease, inibidores de amilase e lecitinas descritos nos documentos 3-5 não-patentes e nos documentos 1 e 2 de patentes tem uma atividade de resistência a inseticida insuficiente.

Um objetivo da presente invenção é prover uma proteína de resistência a insetos apresentando uma resistência suficiente para insetos mesmo em pequenas quantidades; um gene de resistência a insetos codificando a referida proteína de resistência a insetos; um vetor recombinante 30 contendo o referido gene de resistência a insetos; uma célula hospedeira e uma célula de planta transferida com o vetor recombinante; um transformante transformado pelo gene de resistência a insetos e um método para produzir o mesmo; uma proteína recuperada do mesmo; e um agente de 35 resistência a insetos compreendendo eles como ingredientes ativos.

Solução do problema Os inventores da presente solução entenderam através das pesquisas para resolver os problemas acima e descobriram assim que, as proteinas obtidas a partir de látex de planta, uma proteína tendo uma determinada seqüência de 5 aminoácidos tem uma excelente resistência a insetos. Como resultado de uma pesquisa extensiva adicional, os presentes inventores descobriram que os problemas acima podem ser resolvidos, e a presente invenção foi assim completada.

Especificamente, a presente invenção refere-se a (1) uma proteína de resistência a insetos derivada de uma planta, compreendendo uma primeira seqüência de aminoácidos tendo uma homologia de 50% ou mais com uma seqüência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO: 1 na listagem de 15 seqüências, uma segunda seqüência de aminoácidos tendo uma homologia de 50% ou mais com uma seqüência de aminoácidos representada pela SEQ.ID.NO:2 na listagem de seqüência e uma terceira seqüência de aminoácidos tendo uma homologia de 50% ou mais com uma seqüência de 20 aminoácidos representada pela SEQ.ID.NO:3 na listagem de seqüências, onde a segunda seqüência de aminoácidos tem pelo menos uma seqüência spppp.

A presente invenção refere-se a (2) a proteínas resistentes a insetos de acordo com o item (1) acima, onde a segunda seqüência de aminoácidos está posicionada entre a primeira seqüência de aminoácidos e a terceira seqüência de aminoácidos.

A presente invenção refere-se a (3) uma proteína resistente a insetos derivada de uma planta, 30 compreendendo uma quarta seqüência de aminoácidos tendo uma homologia de 50% ou mais com uma seqüência de aminoácidos representada pela SEQ.ID.NO.:4, na listagem de seqüências e pelo menos uma seqüência spppp.

A presente invenção refere-se a (4) uma proteína resistente a insetos derivada de uma planta, compreendendo uma quinta seqüência de aminoácidos tendo uma homologia de 50% ou mais com uma seqüência de aminoácidos representada pela SEQ.ID.N0:5 na listagem de seqüências e pelo menos uma seqüência de spppp.

A presente invenção refere-se à (5) proteína resistente a insetos de acordo com o item (1) acima, onde a planta é umá planta morácea ("moraceous") e a proteína resistente a insetos sendo extraída a partir do látex da referida planta morácea.

A presente invenção refere-se a (6) uma proteína resistente a insetos obtida pela extração de um látex de 10 uma planta morácea, centrifugação do referido látex para separar um sobrenadante, eletroforese do referido sobrenadante, e coleta da proteína resistente a insetos a partir de uma fração tendo um peso molecular de 50-60 kDa.

A presente invenção refere-se a (7) um gene de resistência a insetos codificando a proteína resistente a insetos de acordo com qualquer um dos itens (1) a (6) acima.

A presente invenção refere-se a (8) um gene de 20 resistência a insetos, derivado de uma planta, compreendendo um sexto DNA tendo uma homologia de 50% ou mais com o DNA constitutivo de uma seqüência de bases representada pela SEQ.ID.NO:16 na listagem de seqüências e pelo menos uma seqüência de base codificando uma 25 seqüência spppp.

A presente invenção refere-se a (9) o gene de resistência a insetos, de acordo com o item (8) acima, onde o sexto DNA é hibridizado com o DNA constitutivo de uma seqüência de base complementar sob condições limitadas.

A presente invenção refere-se a (10) um gene de resistência a insetos, derivado de uma planta, compreendendo um sétimo DNA tendo uma homologia de 50% ou mais como DNA constitutivo de uma seqüência de bases representada pela SEQ.ID.NO:7 na listagem de seqüências e 35 pelo menos uma seqüência de bases codificando uma seqüência spppp.

A presente invenção refere-se ao (11) gene de resistência a insetos de acordo com o item (10) acima, onde o sétimo DNA é hibridizado com o DNA constitutivo de uma seqüência de base complementar sob condições limitadas.

A presente invenção refere-se a (12) um vetor recombinante compreendendo o gene de resistência a insetos de acordo com qualquer um dos itens (8) a (11) acima.

A presente invenção refere-se a (13) uma célula hospedeira transferida com o vetor recombinante de acordo com o item (12) acima.

A presente invenção refere-se a (14) uma célula de planta transferida com o vetor recombinante de acordo com o item (12) acima.

A presente invenção refere-se a (15) um transformante transformado pelo gene de resistência a insetos, conforme definido em qualquer um dos itens (8) a (11) acima.

A presente invenção refere-se a (16) um método para produzir um transformante transformado pelo gene de resistência a insetos, definido de acordo com qualquer um dos itens (8) a (11) acima.

A presente invenção refere-se a (17) uma proteína recuperada pela célula hospedeira, definida de acordo com o item (13) acima.

A presente invenção refere-se a (18) uma proteína recuperada pela célula de planta, definida de acordo com o item (14) acima.

A presente invenção refere-se a (19) uma proteína recuperada pelo transformante definido de acordo com o item (15) ou o item (16) acima.

A presente invenção refere-se a (20) um agente resistente a insetos compreendendo como um ingrediente ativo a proteína de resistência insetos, definida de acordo com qualquer um dos itens de (1) a (6) acima.

A presente invenção refere-se a (21) um agente de resistência a insetos compreendendo como um ingrediente ativo o gene resistente a insetos, definido de acordo com qualquer um dos itens (8) a (11) acima. Adicionalmente, uma configuração na qual os itens (1) a (21) possam ser apropriadamente combinados pode ser também adotada se servir ao objetivo da presente invenção.

Vantagens e efeitos

De acordo com uma proteína de resistência a insetos da presente invenção, uma suficiente resistência a insetos é mostrada mesmo em uma concentração extremamente baixa. Adicionalmente, a proteína de resistência a insetos acima 10 mencionada é derivada de uma planta e tem uma baixa toxicidade para humanos.

Além disso, a proteína de resistência a insetos acima, através de sua coexistência com alcalóides de imitação do açúcar ou outros fatores de resistência a insetos, tem uma ação de estímulo das funções dos referidos fatores de resistência a insetos.

A proteína de resistência acima, onde a planta é uma planta morácea e a proteína de resistência a insetos é extraída de um látex da referida planta morácea, está 20 contida abundantemente no referido látex em uma das muitas porcentagens e, portanto, é purificado de forma relativamente fácil.

A proteína de resistência a insetos acima mencionada, quando utilizada como um agente de resistência a insetos, pode facilmente remove insetos que prejudicam humanos ou insetos que inibem o crescimento de plantas.

De acordo com o gene da presente invenção, o gene pode ser transferido para dentro de uma planta para realizar a criação da hereditariedade de uma planta geneticamente resistente a insetos geneticamente.

O vetor recombinante da presente invenção mostra a função de transmissão do gene acima dentro de um hospedeiro externo/exógeno. Desse modo, o gene acima pode ser integrado dentro de um outro gene.

Por exemplo, o vetor recombinante acima pode ser transferido dentro de células hospedeiras ou células de plantas. De acordo com o transformante da presente invenção, nas plantas transformadas com o gene acima, a operação complicada de pulverização dos químicos agrícolas pode ser omitida, e um efeito pode ser facilmente produzido 5 contra as pragas de insetos que se ficam ocultos nos tecidos das plantas tais como caules e são difíceis de serem exterminados.

De acordo com a proteína recuperada pela célula hospedeira, a célula de planta e o transformante, apresentam suficiente resistência a insetos.

A proteína de resistência acima mencionada e o gene de resistência a insetos são preferivelmente utilizados como ingredientes ativos de um agente de resistência a insetos.

Melhor forma de realização da invenção

Uma configuração preferida da presente invenção é descrita em detalhes.

(Proteína de resistência a insetos)

A proteína de resistência a insetos da presente invenção, derivada de uma planta, compreende uma primeira seqüência de aminoácidos tendo uma homologia de 50% ou mais com a seqüência de aminoácidos representada pela SEQ.ID.NO:l, na listagem de seqüências, (doravante também convenientemente relacionada como "primeiro fragmento de proteína"), uma segunda seqüência de aminoácidos tendo uma homologia de 50% ou mais com a seqüência de aminoácidos, representada pela SEQ.ID.NO:2, na listagem de seqüências, (daqui em diante também convenientemente referida como "segundo fragmento de proteína") e uma terceira seqüência de aminoácidos tendo uma homologia de 50% ou mais com a seqüência de aminoácidos representada pela SEQ.ID.NO:3, na listagem de seqüências, (daqui em diante também convenientemente relacionada como "terceiro fragmento de proteína"), onde as homologias acima são respectivamente independentes.

As proteínas resistentes aos insetos definidas acima têm a primeira seqüência de aminoácidos, a segunda seqüência de aminoácidos e a terceira seqüência de aminoácidos, onde a segunda seqüência de aminoácidos tem pelo menos uma seqüência spppp e, portanto, mostra suficiente resistência a insetos mesmo em uma concentração extremamente baixa.

No caso de uma homologia de 100%, a seqüência de aminoácidos representada pela SEQ.ID.NO:1, na listagem de seqüências (primeiro fragmento de proteína) é a mesma que a primeira seqüência de aminoácidos, a seqüência de 10 aminoácidos representada pela SEQ.ID.NO:2, na listagem de seqüências, (segundo fragmento de proteína) é o mesmo que a segunda seqüência de aminoácidos, e a seqüência de aminoácidos representada pela SEQ.ID.NO:3, na listagem de seqüências (terceiro fragmento de proteína) é o mesmo que 15 a terceira seqüência de aminoácidos.

Consequentemente, no caso de uma homologia de 100%, a proteína resistente a insetos da presente invenção compreende a seqüência de amino ácidos representada pela SEQ. ID-.NO: 1, na listagem de seqüências, a seqüência de 20 aminoácidos representada pela SEQ.ID.NO:2, na listagem de seqüências e a seqüência de aminoácidos representada pela SEQ.ID.NO:3, na listagem de seqüências.

O primeiro fragmento de proteína acima e o terceiro fragmento de proteína acima são porções de ligação de quitina e são observados por ter uma homologia com a proteína de ligação de quitina do tipo hevein derivados de borracha.

Como utilizado aqui, uma proteína de ligação da quitina imitando tipo-hevein significa uma proteína tendo uma 30 propriedade de ligação para a quitina tendo uma única ou uma pluralidade de seqüências de aminoácidos constituídas de cerca de 40 aminoácidos, que é visto no tipo hevein e imitando um sítio de ligação de quitina dos quais o interior é reticulado por resíduos de cisteína, em 35 moléculas.

Por outro lado, a repetição de uma seqüência específica spppp (SerProProProPro) é vista no segundo fragmento de proteína acima. Adicionalmente, de acordo com a proteína de resistência da presente invenção, a segunda seqüência de aminoácidos tem pelo menos uma seqüência spppp.

Como utilizado aqui, a seqüência spppp significa uma seqüência na qual tipicamente 4, algumas vezes 3-7 resíduos Pro estão ligados juntos após Ser. A referida seqüência spppp são caracterizadas por geralmente uma pluralidade de repetições.

A proteína resistente a insetos da presente invenção compreende a primeira seqüência de aminoácidos, a segunda seqüência de aminoácidos e a terceira seqüência de aminoácidos e, portanto, apresenta uma excelente resistência aos insetos.

Como utilizado aqui, a resistência aos insetos significa uma propriedade inseticida ou a característica de inibir o crescimento dos insetos (daqui em diante relacionado como "propriedade de inibir o crescimento").

A ordem da seqüência da primeira seqüência de aminoácidos, a segunda seqüência de aminoácidos e a 20 terceira seqüência de aminoácidos, não é particularmente limitada, mas, a segunda seqüência de aminoácidos é preferivelmente posicionada entre a primeira seqüência de aminoácidos e a terceira seqüência de aminoácidos.

Neste caso, mais resistência a insetos é demonstrada.

A proteína de resistência a insetos da presente invenção é constituída de, por exemplo, uma quarta seqüência de aminoácidos tendo uma homologia de 50% ou mais com a seqüência de aminoácidos representada pela SEQ.ID.NO:4, na listagem de seqüências (daqui em diante também 30 referida como "seqüência de aminoácidos parcialmente ativa"). No caso de uma homologia de 100%, a seqüência de aminoácidos (seqüência de aminoácidos parcialmente ativa) representada pela SEQ.ID.NO:4, na listagem de seqüências é a mesma que a quarta seqüência de aminoácidos.

A referida quarta seqüência de aminoácidos tem pelo menos uma seqüência spppp, e a seqüência de aminoácidos é identificada pela reação da transcrição inversa do RNA total derivado de um látex para um padrão.

Na seqüência de aminoácidos parcialmente ativa, o segundo fragmento de proteína é observado no aminoácido de número 46-97, e o primeiro fragmento de proteína e o terceiro 5 fragmento de proteína estão presentes no aminoácido de número 6-44, e o aminoácido de número 106-144, respectivamente, de modo a ter um sanduíche com o segundo fragmento de proteína. Adicionalmente, na seqüência de aminoácidos parcialmente ativo, a função da seqüência de 10 aminoácidos iniciando no aminoácido de número 145 não é definitivo, mas acredita-se ter a informação de uma enzima para a decomposição da quitina.

De acordo com a proteína de resistência a insetos compreendendo a seqüência de aminoácidos parcialmente 15 ativa, a resistência a insetos é seguramente demonstrada. A proteína de resistência aos insetos da presente invenção compreende, por exemplo, uma quinta seqüência de amino'ácidos tendo uma homologia de 50% ou mais com a seqüência de aminoácidos representada pela SEQ.ID.NO:5,

na listagem de seqüência (daqui em diante também referida como "seqüência de aminoácidos de extensão completa"). Adicionalmente, no caso de uma homologia de 100%, a seqüência de aminoácidos representada pela SEQ.ID.NO:5 na listagem de seqüências (seqüência de aminoácidos de 25 extensão completa) é a mesma que a quinta seqüência de aminoácidos.

A referida quinta seqüência de aminoácidos tem pelo menos uma seqüência spppp, e a seqüência de aminoácidos é identificada pela reação de transcrição inversa do RNA total, derivado de um látex para um padrão.

A seqüência de aminoácidos de extensão completa inclui uma seqüência de aminoácidos parcialmente ativa. Especificamente, o número do aminoácido é 1-21 da seqüência de aminoácidos de extensão completa é 35 adicionado à seqüência de aminoácidos parcialmente ativa. Na seqüência de aminoácidos de extensão completa, o segundo fragmento de proteína é observado no aminoácido número 67-118, e o primeiro fragmento de proteína e o terceiro fragmento de proteína estão presente no aminoácido de número 27-65 e no aminoácido número 127- 165, respectivamente, de modo a ter um sanduíche do segundo fragmento de proteína.

Além disso, na seqüência de aminoácidos de extensão completa, a seqüência de aminoácidos na base de número 1-

21 é acreditada como tendo a informação posicionai para integrar a proteína de resistência a inseticida acima dentro de uma posição apropriada.

Em adição, a função da seqüência de aminoácidos iniciando no aminoácido de número 165 não é definida, mas acreditase ter a informação de uma enzima para decomposição da quitina.

De acordo com a proteína de resistência a insetos constituída de uma seqüência de aminoácidos de extensão completa, uma seqüência de aminoácidos irá integrar dentro de uma posição precisa e, portanto, a resistência a insetos é muito mais certamente demonstrada. Além 20 disso, a proteína de resistência a insetos constituída desta seqüência de aminoácidos é excelente na resistência a insetos apesar de não exibir atividade de quitanase.

Os insetos contra os quais a proteína de resistência a insetos exibe atividade de resistência a insetos incluem insetos pertencentes a Coleoptera, Lepidoptera, díptera, Hymenoptera, Hemiptera, Orthoptera, Odonata, etc., e artrópodes tais como ácaros.

Em adição, a proteína de resistência a insetos acima definida, derivada de uma planta tem, portanto, baixa resistência aos consumidores e baixa toxicidade para humanos em comparação com as proteínas derivadas de bactérias.

A referida planta não é particularmente limitada a, mas é preferivelmente, uma planta contendo um látex.

Exemplos específicos incluem plantas pertencentes à família das Asteraceae, a família das Cmpanulaceae, a família das Convolvulaceae, a família das Moraceae, a família das Euphorbiaceae, a família das Asclepiadaeeae, a família das Apoeynaeeae, a família das Musaeeae, a família das Papaveraceae, a família das Anaeardiaeeae, a família das Buttiferae, a família das Leguminosae, a família das Caetaeeae, a família das Liliaeeae, etc.

Destas, a planta acima é uma planta pertencente a família das Moraeeae. Especificamente, a proteína de resistência a insetos acima é mais preferivelmente, extraída do látex de plantas moráceas.

Quando a proteína de resistência a insetos é extraída das plantas moráceas, ela está contida abundantemente no látex das plantas moráceas e, portanto, é facilmente purificada.

A proteína de resistência a insetos, por sua coexistência com os fatores de resistência a insetos tais como alcalóides de imitação do açúcar, tem uma ação de estimular as funções dos fatores de resistência a insetos.

Os alcalóides que imitam o açúcar, descritos acima incluem, 1,4-dideoxi-l,4-imino-D-arabinitol, 1-

deoxinojirimicina, 1,4-dideoxi-l,4-imino-D-ribitol, etc. Para ambos os terminais da seqüência de aminoácidos representada pela SEQ.ID.NO:4 ou 5, na listagem de seqüências, outros aminoácidos podem ser ligados.

Neste caso, a partir do ponto de vista de demonstração de excelente resistência a insetos, 0,1% de massa ou mais da quantidade total da proteína contendo os outros aminoácidos acima é preferivelmente contido na seqüência de aminoácidos acima, e 0,2% de massa ou mais é mais 30 preferivelmente contida na seqüência de aminoácidos acima.

A proteína de resistência a insetos acima é, preferivelmente, utilizada nos agentes de resistência a insetos tais como inseticidas, químicos agrícolas e iscas para insetos resistentes.

Como utilizado aqui, as iscas para insetos resistentes significam iscas que contenham uma substância de resistência a insetos e apresente resistência a insetos por alimentação do inseto com esta. Especificamente, quando a proteína de resistência a insetos é utilizada como uma isca para insetos resistentes, por alimentação, 5 por exemplo, os insetos que prejudicam humanos ou inibem o crescimento de plantas a partir deste, o crescimento dos insetos é inibido ou os insetos são mortos e, portanto, os insetos podem ser facilmente removidos.

A homologia da proteína de resistência a insetos da presente invenção é descrita abaixo.

A proteína de resistência a insetos da presente invenção compreende uma primeira seqüência de aminoácidos tendo uma homologia de 50% ou mais com a seqüência de aminoácidos representada pela SEQ.ID.NO:1, na listagem de 15 seqüências, uma segunda seqüência de aminoácidos tendo uma homologia de 50% ou mais com a seqüência de aminoácidos representada pela SEQ.ID.NO:2, na listagem de seqüências e, uma terceira seqüência de aminoácidos tendo uma homologia de 50% ou mais com a seqüência de 20 aminoácidos representada pela SEQ.ID.NO:3, na listagem de seqüências.

Preferivelmente, a proteína de resistência a insetos da presente invenção também compreende uma quarta seqüência de aminoácidos tendo uma homologia de 50% ou mais com a seqüência de aminoácidos representada por SEQ.ID.NO:4, na listagem de seqüências.

Mais preferivelmente, a proteína de resistência a insetos da presente invenção compreende ainda uma quinta seqüência de aminoácidos tendo uma homologia de 50% ou mais com a seqüência de aminoácidos representada por SEQ.ID.NO:5, na listagem de seqüências.

Como utilizado aqui, uma homologia de 50% ou mais significa que, em uma determinada seqüência de aminoácidos (primeiro fragmento de proteína, segundo 35 fragmento de proteína, terceiro fragmento de proteína, seqüência de aminoácidos parcialmente ativa e seqüência de aminoácidos de extensão completa) , 50% ou mais de aminoácidos estão na mesma seqüência. Especificamente, isto significa que um ou uma pluralidade de aminoácidos de menos que 50% de uma determinada seqüência de aminoácidos pode ser alterado por substituição, deleção,

adição, e/ou inserção.

A homologia acima é, preferivelmente, de 70% ou mais, mais preferivelmente de 80% ou mais, ainda mais preferivelmente de 90% ou mais, ainda mais preferivelmente de 95% ou mais, ainda mais 10 preferivelmente de 98% ou mais, particularmente preferida 99% ou mais, mais preferivelmente 100% ou mais.

Em uma determinada seqüência de aminoácidos (primeiro fragmento de proteína, segundo fragmento de proteína, terceiro fragmento de proteína, seqüência de aminoácidos 15 parcialmente ativa, seqüência de aminoácidos de extensão completa), o número dos aminoácidos que são substituídos, deletados, adicionados e/ou inseridos não é particularmente limitado onde o DNA codificando a seqüência de aminoácidos tem uma resistência a insetos 20 desejada, mas é preferivelmente nove ou menos, mais preferivelmente, quatro ou menos.

Se ela estiver nesta faixa, a resistência a insetos não é seguramente eliminada.

Adicionalmente, a proteína de resistência a insetos acima 25 inclui, por exemplo, um mutante, um derivado, um alelo, uma variante, e um homólogo que codifica a proteína constituída da mesma seqüência de aminoácidos ilustrado na SEQ. ID.NO: 4 ou 5 exceto que um ou uma pluralidade de aminoácidos são substituídos, deletados, adicionados e/ou 30 inseridos.

Métodos para preparação do DNA de acordo com a referida seqüência de aminoácidos incluem, por exemplo, um mutagêneses sítio-direcionada (Kramer, W. & Fritz, H.-J. (1987), construção dirigida a oligonucleotídeo da via de 35 mutagêneses do DNA de dupla hélice. Métodos de Enzimologia, 154:350-367).

A homologia de uma seqüência de aminoácidos pode ser determinada usando o algoritmo BLAST por Carlin e Altschul (Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 87:2264-2268, 1990, "Proc. Natl. Acad. Sci.", USA 90: 5873, 1993). Além disso, programas relacionados ao BLASTN e BLASTX com

base no algoritmo BLAST têm sido desenvolvidos (Altschul SF, et al.: "J. Mol. Biol.", 215:403, 1990).

Quando uma seqüência de aminoácidos é analisada usando BLASTX, parâmetros são representados como, por exemplo, contagem=50 e comprimento=3. Quando os programas BLAST e 10 GAPPED BLAST são utilizados, os parâmetros de falha dos respectivos programas são utilizados. Além disso, os procedimentos específicos destes métodos de análise são bem conhecidos (http://www.ncbi.nlm.nih.bov/).

(Síntese da proteína de resistência a insetos)

A proteína de resistência a insetos da presente invenção pode ser sintetizada por um método de fase-sólida, um método de fase-líquida e uma síntese biológica.

Como utilizado aqui, o método de fase sólido refere-se a um método compreendendo: o uso, como uma fase sólida, por 20 exemplo, gotas de gel de polímero de poliestireno tendo um diâmetro de cerca de 0,1 mm tendo superfícies modificadas com um grupo amino; cadeias de aminoácidos individualmente estendidas deste ponto por reação de desidratação; e corte de uma seqüência de peptídeo 25 completa de interesse a partir da superfície de fase sólida para obter uma substância de interesse.

Em adição, o método de fase líquida compreende realizar a síntese de uma fase líquida sem a fixação de peptídeos a ser sintetizado em uma fase sólida, onde a purificação é realizada quando um resíduo de aminoácido for estendido.

A síntese biológica acima é um método de construção de um DNA artificial, no qual as regiões codificadoras tendo os códigos genéticos para os peptídeos a serem sintetizados são emparelhados, sob o controle de um promotor adequado 35 para expressão abundante, a ser sintetizado com as células de cultura de E. coli, leveduras, insetos ou animais invertebrados. Adicionalmente, as células vivas podem não ser utilizada sempre, e o sistema de transcrição-tradução livre de células usando extrato de células contendo todos os fatores relacionados com a transcrição e a tradução de genes pode ser utilizada.

(Coleta da proteína de resistência a insetos)

A proteína de resistência a insetos da presente invenção é colhida como descrito abaixo.

Primeiro, o látex de plantas moráceas é extraído e é separado em uma camada de sobrenadante e uma camada de partícula. A separação significa então, não ser particularmente limitada a, mas incluindo, centrifugação, filtragem, etc.

Quando a centrifugação for realizada como o meio de separação, a força centrífuga é preferivelmente de 15,000-20,0000 Gea rotação é, preferivelmente, realizada por 1-60 minutos.

Portanto, um sobrenadante contendo pelo menos 5% (taxa de massa (g) para volume (ml)) de uma proteína desejada é obtido. Em adição, o sobrenadante obtido é, 20 preferivelmente, filtrado através de um filtro tendo um diâmetro de furo de 0,1-0,8 μπι após a centrifugação. Desse modo, as impurezas tais como contaminações podem ser seguramente removidas.

A proteína de resistência a insetos da presente invenção é então extraída a partir do sobrenadante obtido. O referido meio de extração inclui cromatografia de filtragem em gel, eletroforese, cromatografia de troca iônica, etc.

Destes, a eletroforese é a preferida, e a eletroforese em condição de não-denaturação (native_PAGE) é a mais preferida.

Neste caso, tem uma vantagem de ser capaz de remover eficientemente outras proteínas. Adicionalmente, a eletroforese acima abrange a eletroforese livre de 35 veículo, eletroforese em papel, eletroforese usando gel de agarose ou de poliacrilamida, eletroforese de concentração isoelétrica, eletroforese bi-dimensional, eletroforese capilar e eletroforese de campo pulsado.

Aqui, um caso de realização de eletroforese em gel de poliacrilamida na condição de não-denaturação é descrita. Primeiro, uma solução tampão ajustada a um pH de 6,8-8,8 com um tampão tal como um tampão TBS, um tampão PBS, um tampão TE, um tampão TAE ou um tampão TBE.

0 gel de poliacrilamida é então introduzido de modo que a taxa de mistura seja de 12,5% (taxa de massa (g) para volume (ml)). Em adição, o sobrenadante acima é introduzido para realização de eletroforese.

Então, o sobrenadante é fracionado dentro de várias bandas. Uma fração tendo um peso molecular de 50-60 kDa é coletada a parir desta e cultivada para obter a proteína de resistência a insetos da presente invenção.

(Gene)

0 gene da presente invenção codifica a proteína de resistência insetos acima mencionada.

Especificamente, o gene de resistência a insetos, que é derivado de uma planta, tem o sexto DNA tendo uma 20 homologia de 50% ou mais, com o DNA constituído da seqüência de base mostrada na SEQ.ID.N0:6, na listagem de seqüências. Adicionalmente, a seqüência de base mostrada na SEQ.ID.NO:6, codifica a seqüência de aminoácidos mostrada na SEQ.ID.NO:4.

Em adição, o gene de resistência a insetos, que é derivado de uma planta, tem o sétimo DNA tendo uma homologia de 50% ou mais com o DNA constituído da seqüência de base mostrada na SEQ.ID.NO:7, na listagem de seqüências. Além disso, a seqüência de base mostrada na 30 SEQ.ID.NO:7, codifica a seqüência de aminoácidos mostrada na SEQ.ID.NO:5.

Adicionalmente, os genes de resistência a insetos têm pelo menos uma seqüência de base codificando a seqüencia sPPPP acima mencionada.

Como usado aqui, o gene de resistência a insetos, mencionado acima se refere a um fator de especificação do caráter genético. Tipicamente, o gene é seqüenciado em um cromossomo.

Em adição, o DNA acima abrange o DNA genômico, o cDNA e o DNA quimiosintético. Adicionalmente, o DNA genômico e o cDNA podem ser preparados por um método bem conhecido.

No caso de uma homologia de 100%, o DNA constituído da seqüência de base mostrado na SEQ.ID.NO:6, na listagem de seqüência, e o sexto DNA têm a mesma seqüência, e o DNA constituído da seqüência de base mostrada na SEQ.ID.NO:7, na listagem de seqüências e o sétimo DNA tem a mesma a 10 seqüencia.

Consequentemente, no caso de uma homologia de 100%, o gene de resistência a insetos da presente invenção tem o DNA constituído da seqüência de base mostrada na SEQ.ID.NO:6, na listagem de seqüências ou o DNA 15 constituído da seqüência de base mostrado na SEQ.ID.NO: 7, na listagem de seqüências.

A seqüência de base mostrada na SEQ.ID.NO: 6 ou 7, na listagem de seqüências é identificada por PCR utilizando um primer de degeneração construído a partir da seqüência 20 de aminoácidos N-terminal identificada a partir da proteína purificada usando cDNA obtido por reação de transcrição inversa usando o RNA total derivado do látex de amora como um padrão.

De acordo com o gene de resistência a insetos da presente 25 invenção, genes são transferidos dentro dos organismos tais como as plantas, microorganismos, células cultivadas, animais multicelulares e plantas e insetos para permitir a geração de hereditariedade dos organismos com o gene de resistência a insetos.

A homologia do gene de resistência a insetos da presente invenção está descrita abaixo.

O gene de resistência a insetos da presente invenção tem o DNA tendo 50% ou mais de homologia com o DNA constituído da seqüência de base mostrado na SEQ.ID.NO:6, na listagem de seqüências, ou a seqüência de base mostrado na SEQ.ID.NO:7, na listagem de seqüências.

Como utilizado aqui, uma homologia de 50% ou mais significa que, em uma determinada seqüência de base (SEQ.ID.NO: 6 ou 7), 50% ou mais das bases estão na mesma seqüência. Especificamente, isto significa que uma ou uma pluralidade de bases de menos que 50% de uma determinada 5 seqüência de base pode ser alterada por substituição, deleção, adição e/ou inserção.

A homologia acima é preferivelmente de 70% ou mais, mais preferivelmente, 80% ou mais, ainda mais preferivelmente 90% ou mais, ainda mais preferivelmente 95% ou mais, 10 ainda mais preferivelmente 98% ou mais, particularmente mais preferivelmente 99% ou mais, mais preferivelmente 100%.

Na seqüência base do gene de resistência a insetos da presente invenção, o número dos nucleotídeos (genes) que 15 são substituídos, deletados, adicionados e/ou inseridos não está particularmente limitado a, onde o DNA constituído da seqüência de base tem a desejada resistência a insetos, mas é preferivelmente nove ou menos, mais preferivelmente quatro ou menos.

Se ele está na faixa, a resistência a insetos não é eliminada seguramente.

Adicionalmente, o gene de resistência a insetos inclui, por exemplo, um mutante, um derivado, uma alelo, um variante e uma homologia que são constituídos da 25 seqüência de base mostrado na SEQ.ID.NO:6 ou 7 exceto que um ou uma pluralidade de bases são substituídas, deletadas, adicionadas e/ou inseridas.

Os métodos para preparação do DNA de acordo com a referida seqüência de base, que são bem conhecidas dos 30 técnicos no assunto, incluem, por exemplo, mutagêneses sítio-direcionadas (Kramer, W. & Fritz, H. -J., (1987), construção dirigida a oligonucleotídeos da via mutagêneses do DNA de dupla hélice. Os métodos em Enzimologia, 154:350-367).

A homologia de uma seqüência de base pode ser determinada usando o algoritmo BLAST por Carlin e Altschul ("Proc. Natl. Acad. Sci.", USA 87:2264-2268, 1990, "Proc. Natl. Acad. Sci.", USA 90: 5878, 1993).

Quando uma seqüência de base é analisada usando BLASTX, os parâmetros são representados como, por exemplo, contagem=100 e comprimento =12. Quando os programas BLAST e GAPPED BLAST são utilizados, os parâmetros de falha dos respectivos programas são utilizados.

Por exemplo, de modo a preparar o DNA tendo uma homologia de 50% ou mais com o DNA constituído da seqüência de base mostrada na SEQ.ID.NO: 6 ou 7, uma técnica de 10 hibridização (Southern, E.M. (1975) "Journal of Molecular Biology, 98, 503), ou uma técnica de reação em cadeia de polimerase (PCR) (Saiki, R. K., et al., (1985) "Science", 230, 1350-1354, Saiki, R. K. et al., (1988), "Science", 239, 487-491), pode ser utilizada.

Especificamente, o DNA constituído de uma seqüência de base tendo uma elevada homologia com a seqüência de base mostrada na SEQ.ID.NOs: 6 ou 7 pode ser isolada por hibridização sob condições severas usando o DNA constituído de uma seqüência de base complementar à 20 seqüência de base mostrada na SEQ.ID.NO: 6 ou 7 como um primer.

0 gene de resistência a insetos da presente invenção também abrange o DNA codificando uma proteína tendo equivalente resistência a insetos para uma proteína de resistência a insetos que pode ser isolada por uma técnica de hibridização ou PCR da mesma maneira.

Como utilizado aqui, a hibridização sob condições severas significa condições de, 6M de uréia, 0,4% de SDS e 0,5 x SSC ou condições de hibridização tendo equivalente 30 severidade para o mesmo. Adicionalmente, o DNA tendo uma homologia maior, de modo que as condições de 6M uréia, 0,4% de SDS e 0,1 x SSC. Além disso, a temperatura pode ser de cerca de 40°C ou maior de acordo com as condições; se as condições tendo maior severidade são requeridas, a 35 temperatura pode ser de cerca de 50 0C ou mesmo cerca de 65 0C.

0 gene de resistência a insetos acima é preferivelmente utilizado em agentes de resistência a insetos tal como inseticidas, químicos agrícolas, e iscas para insetos resistentes.

Como utilizado aqui, as iscas para insetos resistentes 5 significam iscas que contém uma substância de resistência a insetos e apresenta resistência a insetos por alimentação dos insetos com as mesmas. Especificamente, quando o gene de resistência a insetos acima é utilizado como uma isca para insetos resistente, por alimentação, 10 por exemplo, os insetos que prejudicam humanos ou inibem o crescimento de plantas, com isto, o crescimento dos insetos é inibido ou os insetos são mortos e, portanto, os insetos podem ser facilmente removidos.

(Vetor recombinante)

O vetor recombinante da presente invenção contém o gene de resistência a insetos mencionados acima.

O vetor recombinante da presente invenção mostra a função de carregar o gene de resistência a insetos, acima mencionado, para uma célula externa.

Desse modo, o gene de resistência a insetos acima, pode ser integrado dentro de outros genes de resistência a insetos.

Um vetor de transferência de E. coli-Agrobacterium ou do gênero é usado como o vetor recombinante acima mencionado.

(Célula hospedeira)

O vetor recombinante acima é transferido para dentro da célula hospedeira da presente invenção.

As células hospedeiras não são particularmente limitadas a, sendo células apropriadas para expressão de proteínas recombinantes, mas incluem, por exemplo, leveduras, células de vários animais, células de plantas e células de insetos, bem como E. coli.

Métodos bem conhecidos podem ser utilizados para transferência de um vetor recombinante dentro de uma célula hospedeira.

Por exemplo, métodos para transferência dentro de E. coli incluem um método de transferência usando ions de cálcio (Mandei, M. & Higa, A. (1970) "Journal of Molecular Biology", 53, 158-162, Hanahan, d. (1983), "Journal of Molecular Biology", 166, 557-580), etc.

(Célula de Planta)

0 vetor recombinante acima é transferido para dentro da célula de planta da presente invenção.

As células de planta incluem as células de plantas monocotiledôneas e dicotiledôneas.

As plantas monocotiledôneas incluem, plantas Gramineae e plantas Liliaceae.

As plantas Gramineae incluem Oryza sativa, Triticum aestivum, Hordeum vulgare, milho {Zeamays), Avena sativa, Sorghum bicolor, Secale cereale, semente Foxtail, Saccharum officinarum, etc.

As plantas Liliaceae incluem Allium fistulosum, Asparagus officinalis, etc.

As plantas dicotiledôneas incluem plantas cruciferas, plantas leguminosas, plantas solanáceas, plantas curcubitáceas, plantas convolvuláceas, plantas rosáceas, plantas moráceas, plantas malváceas, etc.

As plantas cruciferas incluem Arabidopsis thaliana, Brassica campestris, rapé, Brassica oleracea, couve-flor, etc.

Plantas leguminosas incluem Glycine Maxf Phaseolus angularis, Phaseolus vulgaris, vigna sinensis, etc.

As plantas solanáceas incluem Lycopesicon esculentum, Solanum melongena, Solanum tuberosum, Nicotiana tabacum, Capsicum annuum, etc.

Plantas cucurbitáceas incluem Cucumis melo acidulus, Cucumis sativus, Cucumis melo, citrullus, etc.

Plantas convolvuláceas incluem Pharbitis nil, batata doce, Calystegia, etc.

Plantas rosáceas incluem rosas, morangueiros, Malus domestica, etc.

Plantas moráceas incluem amora, Ficus carica, Ficus elastic, etc. Plantas malváceas incluem Gossypium, kenaf, etc.

As células da presente invenção também incluem células em corpo de plantas bem como células cultivadas. Em adição, protoplastos, ramos primários, ramos múltiplos, e raízes em cabeleira estão incluídos.

Métodos bem conhecidos podem ser utilizados para transferência do vetor recombinante dentro das células de plantas.

Por exemplo, um método de polietileno glicol, eletroporação, um método via Agrobacterium, um método de partícula carregada e do gênero está incluído. (Transformante)

0 transformante da presente invenção é transformado pelo gene acima mencionado.

0 transformante pode ser produzido por métodos bem conhecidos dependendo do tipo da planta. Adicionalmente, as referidas plantas, as plantas monocotiledôneas acima mencionadas e plantas dicotiledôneas são usadas.

Por exemplo, um método de transferência de um gene dentro de um protoplasto por polietileno glicol para regenerar um corpo de planta (Datta, S.K. (1995) "In Gene Transfer to Plants (Potrykus I and Spangenberg Eds), PP 66-74), um método de transferência de um gene dentro de um protoplasto por pulsos elétricos para regenerar um corpo de planta (Toki et al, (1992) "Plant Physiol"., 100, 1503-1507), um método de transferência de um gene dentro de uma célula ou tecido por descompressão ou tratamento por pressão e eletroporação para regenerar um corpo de planta (método de eletroporação compreendendo o uso de descompressão/tratamento por pressão (Pedido de Patente Japonês publicado não examinado) (Tradução do pedido internacional No. 2005-534299), um método de transferência direta de um gene dentro de uma célula por um método de partícula carregada para regenerar um corpo de planta (Christous et al., (1991) Bio/technology, 9:957-962) e um método de transferência de um gene via Agrobacterium para regenerar um corpo de planta (método de transformação de monocotiledôneas ultra-rápido Patente No:3141042) está incluído.

A re-diferenciação das células de planta transformadas capazes de regeneração de um corpo de planta.

Os métodos de re-diferenciação, que depende do tipo de célula de planta, incluem, por exemplo, um método por Akama et al. , ("Plant Cell Reports", 12:7-11 (1992)), para Arabidopsis thaliana e um método por Fujimura et al., ("Plant Tissue Culture Lett.", 2:74 (1995)) para 10 Oryza sativa.

Se um corpo de planta transformado no qual o gene de resistência a insetos da presente invenção ou DNA suprimir a expressão do gene de resistência a insetos da presente invenção é transferido dentro de um genoma é 15 obtido, um descendente pode ser provido a partir do corpo de planta transformado por reprodução sexual ou assexuada.

Os corpos de plantas transformados podem ser também baseados na produção em massa nos materiais de geração 20 (por exemplo, sementes, frutas, ceras, bulbos, tubérculos, tronco, calo, protoplastos, etc.) obtidos a partir dos corpos de plantas transformadas, bem como descendentes ou clones dos mesmos. Adicionalmente, os corpos de plantas transformadas incluem não apenas os 25 corpos de plantas transferidas com gene de resistência a insetos, mas também os corpos de planta transferidos com o gene de resistência a insetos para preparar uma proteína de resistência a insetos.

As células da planta transferidas com o gene de 30 resistência a insetos da presente invenção, os corpos de planta incluindo a referida célula de planta, descendente e clones dos referidos corpos de plantas, descendentes e clones dos mesmos, também estão incluídos nos transformantes acima.

Por exemplo, no caso de um inseto (bicho-da-seda) , um vetor recombinante produzido com base no piggyBac pode ser transformado utilizando um método de Tamura et al., (Nat. Biotechnol. 18, 81-84, 2000).

De acordo com o transformante da presente invenção, nas plantas transformadas com o gene acima, a operação complicada de pulverização dos químicos agrícolas pode 5 ser omitida, e um efeito pode ser facilmente produzido contra pragas de insetos que ficam escondidos nos tecidos das plantas tais como caules e são difíceis para pulverizar os químicos agrícolas.

(Proteína recuperada)

A proteína da presente invenção é recuperada a partir das células hospedeiras acima, das células de plantas acima e dos transformantes acima mencionados.

Por exemplo, as proteínas recombinantes expressas em células hospedeiras podem ser purificadas a partir das 15 células hospedeiras ou cultura de sobrenadante por métodos bem conhecidos para recuperar as proteínas. Além disso, quando uma proteína recombinante é expressa como uma proteína de fusão com a proteína de ligação a maltose acima mencionada, a purificação por afinidade pode ser 20 facilmente realizada.

Os microorganismos, células cultivadas, animais multicelulares e plantas, e insetos, que são transformantes transferidos com o gene de resistência a insetos da presente invenção, são produzidas, e proteínas expressas nos transformantes podem ser recuperados.

As referidas proteínas recuperadas podem ser utilizadas como um agente de resistência a insetos tais como químicos agrícolas tendo resistência a insetos por pulverização.

(Agente de resistência a insetos)

0 agente de resistência a insetos da presente invenção contém a proteína de resistência a insetos acimamencionada ou o gene de resistência a insetos acimamencionados como um ingrediente ativo.

Quando a proteína de resistência a insetos acima mencionada é utilizada como um agente de resistência a insetos, grosso modo purificada ou organismos purificados tais como microorganismos, plantas e animais incluindo a proteína de resistência a insetos ou a proteína de resistência a insetos rudemente purificada ou purificada por um procedimento bioquímico a partir da proteína de 5 resistência a insetos expressa nos organismos é utilizada. A proteína purificada ou rudemente purificada está relacionada como uma proteína de resistência a insetos purificada.

Como forma da proteína de resistência a insetos 10 purificada, pode ser utilizada a líquida, o pó ou a forma granular, um tablete ou do gênero. Adicionalmente, um agente de extensão, um agente de dilatação ou do gênero pode ser apropriadamente adicionado aos agentes de resistência a insetos.

A taxa de conteúdo da proteína de resistência a insetos purificados incluída em um agente de resistência a insetos pode ser de 0,01% de massa ou mais com relação à quantidade total do agente de resistência a insetos, preferivelmente 0,02% de massa ou mais a partir do ponto 20 de vista de confiança.

Como descrito acima, a proteína de resistência a insetos da presente invenção mostra suficiente resistência a insetos mesmo em quantidade pequena.

Quando o gene de resistência a insetos acima é utilizado 25 como um agente de resistência a insetos, um organismo purificado ou rudemente purificado tal como microorganismos, plantas e animais incluindo o gene de resistência a insetos ou o gene de resistência a insetos rudemente purificados ou purificados por um procedimento 30 bioquímico a partir do gene de resistência a insetos expressos nos organismos é utilizado.

O gene rudemente purificado ou purificado é relacionado como um gene de resistência a insetos purificados.

Como a forma do gene de resistência a insetos purificados, pode ser utilizada na forma líquida, em pó, ou a forma de grânulos, um tablete ou do gênero. Adicionalmente, um agente de extensão, um agente de dilatação ou do gênero pode ser apropriadamente adicionado aos agentes de resistência a insetos.

A taxa de conteúdo do gene de resistência a insetos purificados, incluída em um agente de resistência a 5 insetos pode ser de 0,01% de massa ou mais com relação à quantidade total do agente de resistência a insetos, preferivelmente, 0,02% de massa ou mais a partir do ponto de vista de confiança.

Como descrito acima, o gene de resistência a insetos da presente invenção mostra suficiente resistência a insetos em uma quantidade pequena.

Exemplos:

A presente invenção é descrita abaixo com relação aos exemplos, mas não está limitada aos mesmos.

(Coleta da proteína de resistência a insetos)

Um látex extraído (500 μΐ) a partir de uma planta morácea (espécies: Shin-ichinose) foi centrifugado com uma centrífuga (nome do produto: KUBOTA Inverter Micro Refrigerated Centrifuge 1920, feito por Kubota 20 Corporation) , onde as condições da centrifugação são a velocidade de rotação de 13,000 rps e 15 minutos.

Em adição, um sobrenadante separado foi tomado e filtrado através de um filtro de 0,45 μπι.

Subseqüentemente, a eletroforese foi realizada.

Na eletroforese, 400 μΐ do sobrenadante foi misturado com uma quantidade igual do tampão Native-PAGE, um gel de poliamida foi adicionado dentro da mistura de modo a ter 12,5% (taxa de massa por volume), e eletroforese NativePAGE foi realizada nas condições de não-denaturação 30 (temperatura ambiente de 25°C e pH 6,8-8,8).

Os resultados obtidos são mostrados na figura 1 (a).

Em adição, os géis das porções de banda No.: 1-6, mostrada na figura 1 (a) foram respectivamente cortadas, imersas em 1,0 ml do TBS (Salina Tris-tamponada) tampão (pH 6,8) e cultivado a 40C durante a noite para prover as soluções de proteína.

As soluções de proteína resultante No.1-6 estão relacionadas como as frações 1-6, respectivamente, abaixo.

Adicionalmente, a fração 1 contendo as proteínas a partir das bandas de 50-60 kDa; a fração 2 contendo as proteínas 5 a partir das bandas de 44, 18 kDa; a fração 3 contendo uma proteína com uma banda de 60 kDa; uma fração 4 contendo a proteína a partir de uma banda de 43 kDa; uma fração 5 contendo quase nenhuma proteína; e a fração 6 contendo proteínas com bandas de 30, 25 kDa.

(Descrição do Experimento)

(Exame da fração principal)

A determinação da proteína das frações de 1-6 foi realizada por um método de ácido bicincônico (Análise de proteína BCA, Kit de reagente, corporação PERCE), a 15 purificação foi realizada, e a eletroforese SDS-PAGE (15% de gel, 15 μΐ/coluna) foi realizada para as respectivas frações.

As imagens de migração dos resultados obtidos são mostradas na figura 1(b). Adicionalmente M na figura 1(b) significa um marcador molecular.

Os resultados revelaram que as frações 1-3 foram as frações principais das proteínas dos látex.

(Avaliação da resistência a insetos 1)

Os tampões de proteína (30 μΐ) das respectivas frações 1- 25 6 foram misturados com 100 mg de L4M (dieta úmida preparada por adição de pó seco e água (1:2,5) para dieta artificial para insetos Euryphagous e vaporização da mistura; feito pela Nosan Corporation), as misturas foram alimentada para as larvas incubadas do bicho-da-seda Eri 30 (Inseto lepidóptera Euryphagous saturniid) , e seus pesos foram medidos após 2 dias e 4 dias. Adicionalmente, as concentrações de proteína da fração 1 e da fração 2 neste caso foram Img/ml, e a concentração da proteína da fração 3 foi de 0,4 mg/ml.

Os gráficos dos resultados obtidos das frações 1-3 estão ilustrados na figura 2. Além disso, na figura 2, o eixo geométrico vertical representa os pesos das larvas incubadas e o eixo geométrico horizontal representa os dias.

Como mostrado na figura 2, a atividade resistente a insetos extraordinária (atividade de inibição de 5 crescimento) foi vista na fração 1 que é uma fração tendo um peso molecular de 50-60 kDa. Em contrapartida, nenhuma atividade de resistência a insetos (atividade de inibição de crescimento) foi vista nas frações 2 e 3.

Nas frações 4-6, nenhuma atividade de resistência a insetos foi vista também em todas (não ilustrado). (Avaliação 2 de resistência a insetos)

Soluções da proteína da fração 1 foram misturadas com Ig de L4M de modo a se ter 0 (controle) , 90, 180 e 270 μg, as misturas foram alimentadas às larvas incubadas do bicho da seda Eri, e seus pesos foram medidos após 2 dias e 4 dias.

Os gráficos dos resultados obtidos estão ilustrados na figura 3. Além disso, na figura 3, o eixo geométrico vertical representa o peso das larvas incubadas e o eixo geométrico horizontal representa os dias.

Como é aparente a partir da figura 3, a proteína contida na fração 1, de acordo com a presente invenção foi confirmada por permitir a redução no aumento de crescimento (aumento de peso) em baixas concentrações de 90 e 180 μg/g (0,01-0,02% de massa por dieta de umidade,

0,03-0,06% massa por dieta seca, 0,1-0,2% por dieta de proteína), na metade.

A inibição efetiva do crescimento também foi notavelmente mostrada após 2 dias, um aumento de peso também foi 30 reduzido na metade após 2 dias, etc., (o aumento foi ainda reduzido após 4 dias), e ele também foi descoberto assim que a proteína teve um efeito de inibição do crescimento notável em curto tempo.

As concentrações acima mencionadas são de 10-100 vezes menores do que àquelas das proteínas descobertas até agora e pesquisadas para uso prático, e esta proteína é assim considerada por ter um efeito por unidade de peso, que é de 10-100 vezes maior do que àquelas das proteínas de resistência a insetos que têm sido utilizadas (inibidores de amilase, lecitinas e inibidores de protease).

(Avaliação 3 da resistência a insetos)

As soluções de proteína da fração 1 foram misturadas com

1 g de L4M de modo a ter 0 (controle) , 120 e 300 mg, as misturas foram alimentadas às larvas incubadas de Mamestra brassicae pertencente ao gênero Mamestra, e seus pesos foram medidos após 6 dias e 10 dias.

Os gráficos dos resultados obtidos estão ilustrados na figura 4. Adicionalmente, na figura 4, o eixo geométrico vertical representa o peso das larvas incubadas e o eixo geométrico horizontal representa os dias.

Como é aparente a partir da figura 4, a proteína contida na fração 1, de acordo com a presente invenção foi confirmado pro permitir a redução no aumento do crescimento (aumento de peso) em concentrações baixas de 120 e 300 μg/g na metade ou menos.

(Resistência a protease)

As soluções de proteínas da fração 1 foram misturadas e tratadas com proteases ou suco digestivo de insetos nas referidas misturas de proporções como mostrado na Tabela

1, e resistência à protease foram examinadas pela eletroforese de SDS-poliacrilamida dos resultados das amostras.

Adicionalmente, o referido exame foi realizado nas condições do pH 8,8, 370C e 24 horas.

As imagens de migração dos resultados obtidos são mostradas na figura 5. TABELA I

No. : Quantidade do tampão Protease Quantidade da da proteína misturada protease misturada 1 150 μg/ml N/A 0 (concentração final) 2 150 μg/ml Quimotripsina 1 mg/ml (concentração final) (concentração final) 3 150 μg/ml Tripsina 1 mg/ml (concentração final) (concentração final) 4 0 Quimotripsina 1 mg/ml (concentração final) 0 Tripsina 1 mg/ml (concentração final) 6 150 μg/ml Suco digestivo do 20% (diluída (concentração final) bicho-da-seda Eri 5 vezes) 7 150 μg/ml Suco digestivo do 20% (diluída (concentração final) bicho-da-seda Eri 5 vezes) 8 0 Suco digestivo do 20% (diluída bicho-da-seda Eri 5 vezes) 9 0 Suco digestivo do 20% (diluída bicho-da-seda Eri 5 vezes) Como será aparente a partir de 2, 3, 6 e 7 na figura 7, foi descoberto que a proteína contida na fração 1 de acordo com a presente invenção não é decomposta por

várias enzimas proteolíticas (proteases) incluindo uma enzima proteolítica do suco digestivo dos insetos em todas, uma vez que as bandas são vistas nas posições de 50-60 kDa. Adicionalmente, os Nos.: 4, 5, 8 e 9, na figura 5 revelaram que as bandas não estão baseadas em 10 proteases.

Isto indica que a proteína de resistência a insetos da presente invenção pode manter e efetuar a atividade mesmo no trato digestivo do inseto tendo alta atividade de protease.

Foi confirmado a partir dos resultados acima que a proteína de resistência a insetos da presente invenção apresenta suficiente resistência a insetos contra os insetos mesmo em pequenas quantidades.

Aplicabilidade industrial

A proteína de resistência a insetos e o gene de resistência a insetos da presente invenção mostra 5 suficiente resistência aos insetos mesmo em pequenas quantidades. Consequentemente, estes são preferivelmente utilizados nos agentes de resistência a insetos tais como inseticidas, químicos agrícolas e iscas para insetos resistentes.

Breve descrição dos desenhos

A figura l(a) representa uma vista ilustrativa dos resultados da eletroforese Native-PAGE nos Exemplos da presente invenção; e 1(b) representa uma fotografia indicando os resultados da eletroforese SDS-PAGE nos Exemplos da presente invenção;

A figura 2 representa um gráfico indicando os resultados da avaliação 1 da resistência a insetos, nos exemplos da presente invenção;

A figura 3 representa um gráfico indicando os resultados da avaliação 2 da resistência a insetos, nos exemplos da presente invenção;

A figura 4 representa um gráfico indicando os resultados da avaliação 3 da resistência a insetos nos exemplos da presente invenção; e 25 A figura 5 representa uma fotografia indicando os resultados da resistência a protease nos exemplos da presente invenção.

Claims

1. Proteina de resistência a insetos derivadas de uma planta, caracterizada pelo fato de compreender: - uma primeira seqüência de aminoácidos tendo 50% ou mais de homologia com uma seqüência de aminoácidos representados pela SEQ.ID.NO.: 1 na listagem de seqüências; - uma segunda seqüência de aminoácidos tendo 50% ou mais de homologia com uma seqüência de aminoácidos representada pela SEQ.ID.NO.:2 na listagem de seqüências; e - uma terceira seqüência de aminoácidos tendo 50% ou mais de homologia com uma seqüência de aminoácidos representada pela SEQ.ID.NO.:3 na listagem de seqüências; onde a segunda seqüência de aminoácidos tem pelo menos uma seqüência spppp.

2. Proteina de resistência a insetos, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de a segunda seqüência de aminoácidos estar posicionada entre a primeira seqüência de aminoácidos e a terceira seqüência de aminoácidos.

3. Proteína de resistência a insetos derivada de uma planta, caracterizada pelo fato de compreender: - uma quarta seqüência de aminoácidos tendo 50% ou mais de homologia com uma seqüência de aminoácidos representada pela SEQ.ID.NO.: 4 na listagem de seqüências; e - pelo menos uma seqüência spppp.

4. Proteina de resistência a insetos derivada de uma planta, caracterizada pelo fato de compreender: - uma quinta seqüência de aminoácidos tendo 50% ou mais de homologia com uma seqüência de aminoácidos representada pela SEQ.ID.NO.: 5 na listagem de seqüências; e - pelo menos uma seqüência spppp.

5. Proteína de resistência a insetos, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de a planta ser uma planta morácea; e a proteína de resistência a insetos ser extraída a partir do látex da referida planta morácea.

6. Proteína de resistência a insetos, caracterizada pelo fato de ser obtida por extração do látex de uma planta morácea, centrifugação do referido látex para separar um sobrenadante, eletroporação do referido sobrenadante em condições não-denaturantes para fracionar o sobrenadante, e colher a proteína de resistência a insetos a partir de uma fração tendo um peso molecular de 50-60 kDa.

7. Gene de resistência a insetos, caracterizado pelo fato de ser codificante da proteína de resistência a insetos, conforme definida em qualquer uma das reivindicações de 1 a 6.

8. Gene de resistência a insetos, derivado de uma planta, caracterizado pelo fato de compreender: uma sexta seqüência de DNA tendo 50% ou mais de homologia com o DNA constituído de uma seqüência de base representada pela SEQ.ID.NO. :6 na listagem de seqüências; e - pelo menos uma seqüência de base codificante de uma seqüência spppp.

9. Gene de resistência a insetos, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de o sexto DNA ser hibridizada com o DNA constituído de uma seqüência de base complementar sob condições severas.

10. Gene de resistência a insetos, derivados de uma planta, caracterizado pelo fato de compreender: uma sétima seqüência de DNA tendo 50% ou mais de homologia com o DNA constituído de uma seqüência de base representada pela SEQ.ID.NO.:6 na listagem de seqüências; e - pelo menos uma seqüência de base codificante de uma seqüência spppp.

11. Gene de resistência a insetos, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de a sétima seqüência de DNA ser hibridizada com o DNA constituído de uma seqüência de base complementar sob condições severas.

12. Vetor recombinante, caracterizado pelo fato de compreender o gene de resistência a insetos, conforme definido em qualquer uma das reivindicações de 8 a 11.

13. Célula hospedeira, caracterizada pelo fato de ser transferida com o vetor recombinante, conforme definido na reivindicação 12.

14. Célula de planta, caracterizada pelo fato de ser transferida como vetor recombinante, conforme definido na reivindicação 12.

15. Transformante, caracterizado pelo fato de ser transformado através do gene de resistência a insetos conforme definido em qualquer uma das reivindicações de 8 a 11.

16. Método para produzir um transformante, caracterizado pelo fato de ser transformado pelo gene de resistência a insetos conforme definido em qualquer uma das reivindicações 8 a 11.

17. Proteína, caracterizada pelo fato de ser recuperada pela célula hospedeira conforme definida na reivindicação 13.

18. Proteína, caracterizada pelo fato de ser recuperada através da célula de planta conforme definida na reivindicação 14.

19. Proteína, caracterizada pelo fato de ser recuperada através do transformante definido conforme as reivindicações 15 ou 16.

20. Agente de resistência a insetos, caracterizado pelo fato de compreender como um ingrediente ativo a proteína de resistência a insetos conforme definida em qualquer uma das reivindicações de 1 a 6.

21. Agente de resistência a insetos, caracterizado pelo fato de compreender como um ingrediente ativo o gene de resistência a insetos conforme definido em qualquer uma das reivindicações de8 a 11.