BRPI0809448A2 - Cepas de bifidobacterium probióticas - Google Patents

Description

CEPAS DE BIFIDOBACTERIUM PROBIÓTICAS

Introdução

A invenção relaciona-se a uma cepa de Bifidobacterium e seu uso como uma bactéria probiótica em particular como 5 um agente bioterapêutico imunomodulador.

Os mecanismos de defesa para proteger o trato gastrointestinal humano da colonização por bactérias intestinais são altamente complexos e envolvem aspectos tanto imunológicos quanto não imunológicos (I) . Os 10 mecanismos de defesa inatos incluem o baixo pH do estômago, sais biliares, peristalses, camadas de mucina e compostos antimicrobianos como lisozima (2) . Os mecanismos imunológicos incluem agregados linfóides especializados, subjacentes a células M, chamados "peyers patches " que são 15 distribuídos por todo o intestino delgado e cólon (3) . Antígenos luminais apresentados nesses locais resultam em estimulo de subconjuntos adequados de células TeB com o estabelecimento de redes de citocina e secreção de anticorpos no trato gastrointestinal (4) . Além disso, a

2 0 apresentação de antígeno pode ocorrer por meio de células epiteliais para linfócitos intraepiteliais e para as células imunes da lamina própria subjacentes (5). Portanto, o hospedeiro investe substancialmente em defesa imunológica do trato gastrointestinal. No entanto, uma vez que a mucosa 25 gastrointestinal é a maior superfície em que o hospedeiro interage com o ambiente externo, mecanismos de controle específicos devem estar aptos para regular a responsividade imune às 100 toneladas de alimento que são digeridas pelo trato gastrointestinal por um tempo de vida médio. Além 30 disso, o intestino é colonizado por mais de 500 espécies de bactérias que chegam a IO11-IO1Vg no cólon. Portanto, esses mecanismos de controle devem ser capazes de distinguir bactérias aderentes não patogênicas de patógenos

invasivos, que podem causar dano significativo ao hospedeiro. De fato, a flora intestinal contribui para a defesa do hospedeiro por competição com microorganismos potencialmente patogênicos recém ingeridos.

As bactérias presentes no trato gastrointestinal humano podem promover inflamação. Respostas imunes 10 aberrantes à microflora nativa têm sido envolvidas em certos estados de doença, como doença intestinal inflamatória. Os antígenos associados com a flora normal comumente levam à tolerância imunológica e a falha em atingir essa tolerância é um mecanismo principal de 15 inflamação da raucosa (6). Evidência para esse colapso na tolerância inclui um aumento nos níveis de anticorpos direcionados contra a flora intestinal em pacientes com síndrome inflamatória intestinal (IBD).

A presente invenção é direcionada a uma cepa de

2 0 Bifidobacterium que tem efeitos imunomoduladores, por modulação dos níveis de citocina por antagonismo e exclusão de microorganismos pró-inflamatórios do trato

gastrointestinal.

Declaração da Invenção

2 5 De acordo com a invenção é fornecida uma cepa de

Bifidobacterium AH1205 (NCIMB 41387) ou mutantes ou variantes dessa.

O mutante pode ser um mutante geneticamente modificado. A variante pode ser uma variante de ocorrência

3 0 natural de Bifidobacterium. A cepa pode ser um probiótico. Ela pode estar na forma de uma cultura biologicamente pura.

A invenção também fornece uma cepa isolada de Bifidobacterium NCIMB 41387.

Em uma modalidade da invenção as cepas de

Bifidobacterium estão na forma de células viáveis. Alternativamente as cepas de Bifidobacterium estão na forma de células não viáveis.

Em uma modalidade da invenção as cepas de

Bifidobacterium são isoladas de fezes de bebê, as cepas de Bifidobacterium sendo significativamente imunomoduladoras após consumo oral em humanos.

A invenção também fornece uma formulação que compreende a cepa de Bifidobacterium da invenção.

Em uma modalidade da invenção a formulação inclui

outro material probiótico.

Em uma modalidade da invenção a formulação inclui um material prebiótico.

Preferivelmente a formulação inclui um veículo

ingerível. O veículo ingerível pode ser um veículo farmaceuticamente aceitável ccomo uma cápsula, comprimido ou pó. Preferivelmente o veículo ingerível é um produto alimentício como um leite acidificado, iogurte, iogurte congelado, leite um pó, concentrado de leite, pastas de

2 5 queijo, molhos e bebidas.

Em uma modalidade da invenção a formulação da invenção também compreende uma proteína e/ou peptídeo, em particular proteínas e/ou peptídeos que sejam ricos em glutamina/glutamato, um lipídeo, um carboidrato, uma

3 0 vitamina, mineral e/ou resíduos. Em uma modalidade da invenção a cepa de Bifidobacterium está presente na formulação em mais que IO6 ufc por grama de sistema de liberação. Preferivelmente a formulação inclui qualquer um ou mais de um adjuvante, um 5 componente bacteriano, uma entidade de fármaco ou um composto biológico.

Em uma modalidade da invenção a formulação é para protocolos de imunização e vacinação.

A invenção também fornece uma cepa de Bifidobacterium ou uma formulação da invenção para uso como gêneros alimentícios, como um medicamento, para uso na profilaxia e/ou tratamento de atividade inflamatória indesejável, para uso na profilaxia e/ou tratamento de atividade respiratória inflamatória indesejável como asma, para uso na profilaxia e/ou tratamento de atividade inflamatória gastrointestinal indesejável como doença inflamatória intestinal, por exemplo, doença de Crohn ou colite ulcerativa, síndrome do cólon irritável, pouchite, ou colite pós-infecção, para uso na profilaxia e/ou tratamento de cânceres gastrintestinais, para uso na profilaxia e/ou tratamento de doença sistêmica como artrite reumatóide, para uso na profilaxia e/ou tratamento de distúrbios autoimunes devido à atividade inflamatória indesejável, para uso na profilaxia e/ou tratamento de câncer devido à atividade inflamatória indesejável, para uso na profilaxia de câncer, para uso na profilaxia e/ou tratamento de doença diarréica devido à atividade inflamatória indesejável, como diarréia associada a Clostridium decile, diarréia associada a Rotavírus ou diarréia pós-infecção, para uso na profilaxia e/ou 3 0 tratamento de doença diarréica devido a um agente infeccioso, como E.coli.

A invenção também fornece uma cepa de Bifidobacterium ou uma formulação da invenção para uso na preparação de um agente bioterapêutico antiinflamatório para a profilaxia 5 e/ou tratamento de atividade inflamatória indesejável ou para uso na preparação de agentes bioterapêuticos antiinflamatórios para a profilaxia e/ou tratamento de atividade inflamatória indesejável.

Em uma modalidade da invenção a cepa da invenção age

por antagonismo e exclusão de microorganismos próinflamatórios do trato gastrointestinal.

A invenção também fornece uma cepa de Bifidobacterium ou uma formulação da invenção para uso na preparação de agentes bioterapêuticos antiinflamatórios para a redução

dos níveis de citocinas pró-inflamatórias.

A invenção também fornece uma cepa de Bifidobacterium para uso na preparação de agentes bioterapêuticos antiinflamatórios para a modificação dos níveis de IL-10.

A invenção também pode fornecer o uso de uma cepa de

2 0 Bifidobacterium como um probiótico anti-infeccioso devido

a sua capacidade de antagonizar o crescimento de espécies patogênicas.

Nós descobrimos que cepas particulares de Bifidobacterium produzem efeitos imunomoduldores in vitro.

A invenção pode ter, portanto, valor terapêutico

potencial na profilaxia ou tratamento de respostas imunes desreguladas, como reações inflamatórias indesejáveis, por exemplo, asma.

Bifidobacterium são microorganismos comensais. Elas

3 0 foram isoladas da flora microbiana do trato gastrointestinal humano. 0 sistema imune no trato gastrointestinal não pode ter uma reação pronunciada a membros dessa flora, uma vez que a atividade inflamatória resultante também destruiria as células do hospedeiro e 5 função dos tecidos. Portanto, existem alguns mecanismos Segundo os quais o sistema imune pode reconhecer membros não patogênicos comensais da flora gastrointestinal como sendo diferentes de organismos patogênicos. Isso assegura que o dano aos tecidos do hospedeiro seja restrito e uma 10 barreira defensiva ainda é mantida.

Um depósito de Bifidobacterium longum cepa AH1205 foi feito no NCIMB em 11 de maio de 2006 e recebeu o número de acesso NCIMB 41387.

0 Bifidobacterium longum pode ser um mutante geneticamente modificado ou ele pode ser uma variante de ocorrência natural desse.

Preferivelmente o Bifidobacterium longum está na forma de células viáveis.

O Bifidobacterium longum pode estar na forma de células não viáveis.

Deve-se observar que a cepa específica de Bifidobacterium da invenção pode ser administrada a animais (incluindo humanos) em uma forma ingerível por via oral em uma preparação convencional como cápsulas, microcápsulas, 25 comprimidos, grânulos, pó, pastilhas, pílulas, supositórios, suspensões e xaropes. As formulações adequadas podem ser preparadas por métodos comumente empregados que usam aditivos orgânicos e inorgânicos convencionais. A quantidade de ingrediente ativo na

3 0 composição médica pode estar em uma nível que ela exerça o efeito terapêutico desejado.

A formulação também pode incluir um componente bacteriano, uma entidade de fármaco ou um composto biológico.

5 Além disso uma vacina que compreende cepas da invenção

pode ser preparada com o uso de qualquer método adequado conhecido e pode incluir um veículo ou adjuvante farmaceuticamente aceitável.

Por toda a especificação, os termos mutante, variante 10 e mutante geneticamente modificado incluem uma cepa de Bifidobacteria cujas propriedades genéticas e/ou fenotípicas são alteradas comparadas à cepa parente. A variante de ocorrência natural de Bifidobacterium longum inclui as alterações espontâneas de propriedades 15 direcionadas seletivamente isoladas. A alteração deliberada das propriedades da cepa parente é realizada por tecnologias de manipulação genética convencionais (in vitro), como rompimento de gene, transferência conjugativa etc. A modificação genética inclui a introdução de

2 0 seqüências de DNA exógenas e/ou endógenas no genoma de uma cepa de Bifidobacteria, por exemplo por inserção no genoma da cepa bacteriana por vetores, incluindo DNA de plasmídeo, ou bacteriófagos.

Mutações naturais ou induzidas incluem pelo menos alterações de base únicas como deleção, inserção, transversão ou outras modificações de DNA que podem resultar em alteração da seqüência de aminoácidos codificada pela seqüência de DNA.

Os termos mutante, variante e mutante geneticamente modificado também incluem uma cepa de Bifidobacteria que sofreu alterações genéticas que se acumulam no genoma em uma taxa que é consistente na natureza para todos os microorganismos e/ou alterações genéticas que ocorrem através de mutação espontânea e/ou aquisição de genes e/ou perda de genes que não é conquistada por manipulação deliberada (in vitro) do genoma mas é realizada através da seleção natural de variantes e/ou mutantes que fornecem uma vantagem seletiva de sustentar a sobrevivência da bactéria quando exposta a pressões ambientais como antibióticos. Um mutante pode ser criado pela inserção deliberada (in vitro) de genes específicos no genoma que não altera fundamentalmente a funcionalidade bioquímica do organismo mas cujos produtos podem ser usados para identificação ou seleção da bactéria, por exemplo, resistência a antibióticos.

Uma pessoa habilitada na técnica deve perceber que as cepas mutantes ou variantes de Bifidobacteria podem ser identificadas por análise de homologia de seqüência de DNA com a cepa parente. As cepas de Bifidobacteria que têm uma 20 identidade de seqüência próxima com a cepa parente são consideradas como sendo cepas mutantes ou variantes. Uma cepa de Bifidobacteria com uma identidade de seqüência (homologia) de 96% ou mais, como 97% ou mais ou 98% ou mais ou 99% ou mais com a seqüência de DNA parente pode ser 25 considerada como sendo um mutante ou variante.

A homologia de seqüência pode ser determinada com o uso do programa de algoritmo de homologia on-line "BLAST", publicamente disponível em

http://www.ncbi nhn nih,govBLAST/.

3 0 Mutantes da cepa parente também incluem cepas derivadas de Bifidobacteria que têm pelo menos 85% de homologia de seqüência como pelo menos 90% de homologia de seqüência de pelo menos 95% de homologia de seqüência à seqüência pode polinucleotídeos espaçadora intergênica de 5 I6s — 23s da cepa parente. Esses mutantes também podem compreender mutações de DNA em outras seqüências de DNA no genoma bacteriano.

Breve descrição dos desenhos

A Fig. 1 é um perfil de código de barras BOX PCR (bioanalyser) para B. longum AH1205. Os tamanhos dos pares de base foram determinados com o uso do programa Agilent 2100;

A Fig. 2 é um gráfico que ilustra a recuperação fecal de B. longum AH12 05 por um período de 8 dias que demonstra a capacidade de AH1205 de transitar no trato gastrointestinal de murídeo;

A Fig. 3 é um gráfico em barras, que mostra o efeito de B. longum AH12 05 sobre a produção de citocina IL-10 por PBMCs humanos. Os resultados são expressos como média +/SE (n=6) ;

As Figs. 4A e B são gráficos que mostram o efeito da cepa probiótica bacteriana AH1205 (A) e placebo (B) sobre os números totais de células no fluido de lavagem broncoalveolar depois de dose com ovalbumina (OVA) em 25 animais sensibilizados (n=10/grupo, * = p<0,05 comparado à dose com OVA alone);

As Figs. 5A e B são gráficos que mostram o efeito de tratamento com a cepa probiótica AH1205 (A) e placebo (B) sobre a responsividadde das vias aéreas à metacolina,

3 0 como avaliado por mudanças na pausa aumentada (Penh) em camundongos sensibilizados com ovalbumina (OVA) 24 horas após dose intranasal com OVA ou solução salina. Cada ponto de dado representa a média + SEM (n=10/grupos * p = <0,05 comparado à OVA isolada);

As Figs. 6A a E são gráficos que mostram os níveis de IL-10 (A) , IFNy(B), TNF(C) , IL-6(D) e CCL2(E) citocina em fluido de lavagem broncoalveolar (BAL) de camundongos sensibilizados com ovalbumina (OVA). Cada coluna representa a média + SEM (n=10, * p<0,05 comparado ao controle tratado com solução salina com dose de OVA);

A Fig. 7 é um gráfico que ilustra que as células CD4+ CD2 5+ de camundongos alimentados com AH120 5 reduziram substancialmente a proliferação de células T CD4 (n=7);

A Fig. 8 é um gráfico que mostra a percentagem de células "Payer's patch" na população de CD4+ que são também CD25+, como avaliado por citometria de fluxo;

As Figs. 9A e B são gráficos que mostram a percentagem de células CD4/CD25+ que expressam o fator de transcrição Foxp3 é significativamente supra-regulada em camundongos livres de germes que consomem AH12 05 (A) = células do baço, (B) = células MLNC (n = 4/grupo para ensaio de baço, n=2/3para ensaio de MLNC);

A Fig. 10 é um gráfico que mostra que o nível das citocinas IL-6, MCP-I e IFN-γ secretadas por culturas de MLNC estimuladas por CD3/CD28 foi reduzido quando os camundongos livres de germes consumiram Bifidobacterium longum AH1205. Os resultados são expressos como a média por grupo +/- erro padrão. (n=4/grupo);

A Fig. 11 é um gráfico que mostra que o nível das citocinas ILr-6 e TNF-α secretadas por culturas de esplenócitos estimulados com CD3/CD28 foi reduzido quando os camundongos livres de germes consumiram Bifidobacterium longum AH1205. Os resultados são expressos como a média por grupo +/- erro padrão. (n=4/grupo); e 5 A Fig. 13 é um gráfico que ilustra a estabilidade da

cepa probiótica AH1205 por 3 meses comparada ao Lactobacillus GG.

Descrição detalhada

Nós descobrimos que a cepa AH1205 de Bifidobacterium 10 longum é não apenas tolerante ao ácido e bile e transita no trato gastrointestinal mas também, de modo surpreendente, tem efeitos imunomoduladores, por modulação dos níveis de citocina ou por antagonismo e exclusão de microorganismos pró-inflamatórios ou imunomoduladores do trato 15 gastrointestinal.

O uso geral de bactéria probiótica é na forma de células viáveis. No entanto, ele também pode ser estendido a células não viáveis como culturas mortas ou composições que contêm fatores benéficos expressos pela bactéria 20 probiótica. Isso pode incluir microorganismos termicamente mortos ou microorganismos mortos por exposição a pH alterado our submetido a pressão. Com células não viáveis, a preparação do produto é mais simples, as células podem ser incorporadas facilmente em fármacos e os requisitos de 25 estocagem são muito menos limitados que para as células viáveis. Lactobacillus casei YIT 9018 oferece um exemplo do uso eficaz de células mortas por calor como um método para

o tratamento e/ou prevenção de crescimento tumoral como descrito na Patente US No. 4.347.240.

Não se sabe se são necessárias bactérias intactas para exercer um efeito imunomodulador ou se os componentes ativos individuais da invenção podem ser utilizados isoladamente. Os componentes pró-inflamatórios de certas cepas bacterianas foram identificados. Os efeitos pró5 inflamatórios de bactérias gram-negativas são mediados por lipopolissacarídeo (LPS). LPS isoladamente induz uma trama pró-inflamatória, parcialmente devido à ligação do LPS ao receptor CD14 em monócitos. Supõe-se que os componentes da bactéria probiótica possuem atividade imunomoduladora 10 devido aos efeitos da célula inteira. Após isolação desses componentes, a manipulação de grau farmacêutico é prevista.

IL-10 é produzida por células T, células B, monócitos e macrófagos. Essa citocina aumenta a proliferação e diferenciação de células B em células que secretam anticorpo. IL-IO exibe principalmente atividades antiinflamatórias. Ela supra-regula a expressão de IL-I RA por monócitos e suprime a maioria das atividades inflamatórias dos monócitos. IL-IO inibe a produção de monócitos de citocinas, oxigênio reativo e intermediários de nitrogênio, expressão de MHC classe II, morte de parasitas e produção de IL-10 por meio de um mecanismo de feed back (7). Essa citocina também bloqueia a produção de monócitos de colagenase intestinal e colagenase tipo IV por interferência com uma via dependente de PGE2-CAMP e assim pode ser um importante regulador da destruição de tecido conjuntivo observada em doenças inflamatórias crônicas.

A resposta do hospedeiro à infecção é caracterizada por reações imunes celulares e humorais inatas e adquiridas, desenhadas para limitar a disseminação do organismo agressor e para restabelecer a homeostasia do órgão. No entanto, para limitar a agressividade do dano colateral aos tecidos do hospedeiro, um escala de restrições reguladoras pode ser ativada. Celulas T reguladoras (Tregs) servem a tal mecanismo. Essas são 5 derivadas do timo mas também podem ser induzidas em órgãos periféricos, incluindo a mucosa intestinal. A administração deliberada de células Treg suprime doença inflamatória em uma ampla faixa de modelos de murídeo, incluindo encefalomielite autoimune experimental, doença inflamatória 10 intestinal, colite induzida por bactéria, artrite induzida por colágeno, diabetes tipo I, inflamação eosinofílica das vias aéreas, doença de enxerto versus hospedeiro e transplante de órgão. 0 fator de trasncricao forkhead Foxp3 (forkhead box P3) é seletivamente expresso em células Treg, 15 é necessário para o desenvolvimento e função de Treg, e é suficiente para induzir um fenótipo de Treg em células CD4 convencionais (19) . As mutações em Foxp3 causam autoimunidade severa, de múltiplos órgãos tanto em humanos quanto em camundongos. Nós descrevemos uma cepa de 20 Bifidobacterium que gera células T reguladoras CD25 positivas/Foxp3 positivas in vivo.

A invenção será mais claramente compreendida a partir dos exemplos a seguir.

Exemplo 1: Caracterização de bactérias isoladas de fezes de bebê. Demonstração de traços probiõticos.

Isolação de bactéria probiótica

Fezes frescas foram obtidas de um bebê do sexo masculino de 3 dias de idade alimentado por leite materno e diluições em série foram plaqueadas em TPY (tripticase,

3 0 peptona e extrato de levedura) e meio MRS (deMann, Rogosa and Sharpe) suplementado com 0,05% cisteína e mupirocina. As placas foram incubadas em frascos anaeróbicos (BBL, Oxoid) com o uso de kits de geração de CO2 (Anaerocult A, Merck) por 2-5 dias a 37°C. Os isolados de bactérias gram positivas, catalase negativas, bastões ou

bifurcadas/pleomórficas foram plaqueados para pureza em meio não seletivo complexo (MRS e TPY) . Os isolados foram rotineiramente cultivados em meio MRS ou TPY a menos que indicado de outro modo a 370C sob condições anaeróbicas. 10 Bifidobacterium presumidos foram estocados em glicerol 40% e estocado a - 20°C e -80°C.

Depois da isolação de uma cepa pura de Bifidobacteria, que recebeu a designação AH1205, as características microbiológicas foram avaliadas e são resumidas na Tabela 1 15 abaixo. AH1205 é uma bactéria gram-positiva, catalase negativa de forma pleomórfica que é Frutose-6-fosfato fosfocetolase positiva que confirma sua identidade como Bifidobacterium. Com o uso de meio mínimo em que uma única fonte de carbono foi inserida, AHI205 foi capaz de crescer 20 em todas as fontes de carbono testadas (Glicose, Lactose, Ribose, Arabinose, Galactose, Rafinose, Frutose, extrato de malte, Manose, Maltose, Sacarose).

Tabela 1

Características fisioquímicas de B.Iongxm AH1205 Característica da cepa B.longum ΆΗ1205

Coloração Gram +

Catalase

Motilidade

F6PPK* +

Coagulação em leite + Cultura anaeróbica a 45°C Cultura aeróbica a 450C Fermentação de CHO:

Glicose +

Lactose +

Ribose +

Arabinose +

Galactose +

Rafinose +

Frutose +

Extrato de malte +

Manose +

Maltose +

Sacarose +

* significa ensaio de Frutose-6-Fofato fosfocetolase Identificação de espécie

Seqüenciamento de espaçador intergênico 16s (IGS) foi realizado para identificar as espécies de bifidobactérias isoladas. Resumidamente, DNA foi isolado de AH1205 com o

2 0 uso de 100 μΐ de solução de extração e 2 5 μΐ de solução de preparação de tecido (Sigma, XNAT2 Kit). As amostras foram incubadas por 5 minutos a 950C e então 100 μΐ de solução de neutralização (XNAT2 kit) foram adicionados. Solução de DNA genômico foi quantificada com o uso de um espectrofotômetro 25 Nanodrop e estocada a 4°C. PCR foi realizada com o uso dos iniciadores IGS, IGS L: 5' -GCTGGATCACCTCCTTTC-3 ' (Id. de Seq. N°: 3) que é baseado no Id. de Seq. N°: Ie IGS R: 5'CTGGTGCCAAGGCATCCA-3 1 (Id. de Seq. N0:. 4) que é baseado no Id. de Seq. N°: 2. As condições de ciclização foram 94°C 30 por 3 minutos (1 ciclo), 94°C por 30 segundos, 53°C por 30 segundos, 72°C por 30 segundos (28 ciclos). A reação de PCR continha 4 μΐ (50ng) de DNA, mistura de PCR (XNAT2 kit),

0,4 μΜ de iniciador IGS LeR (MWG Biotech, Germany) . As reações de PCR foram realizadas em um thermocycler Eppendorf. Os produtos de PCR (10 μΐ) foram processados junto a um marcador de peso molecular (100 bp Ladder, Roche) em 2% de gel de agarose EtBr corado em TAE, para determinar o perfil de IGS. Os produtos de PCR de Bifidobacterium (banda única) foram purificados com o uso do kit de purificação "Promega Wizard PCR". Os produtos de PCR purificados foram seqüenciados com o uso das seqüências iniciadoras (acima) para a região espaçadora intergênica. Os dados da seqüência foram então pesquisados contra a base de dados de nucleotídeo de NCBI para determinar a identidade da cepa por homologia de nucleotídeo. Os dados da seqüência de DNA resultante foram submetidos à ferramenta de pesquisa BLAST de homologia nucleotídeo para nucleotídeo padrão NCBI

(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/). A combinação mais próxima à seqüência foi identificada e então as seqüências foram alinhadas para comparação com o uso de programa DNASTAR MegAlign. As seqüências (Id. de Seq. N° : 1 [seqüência adiante IGS] e Id. de Seq. N°: 2 [seqüência reversa IGS]) obtidas podem ser observadas na listagem de seqüências. A pesquisa da base de dados de NCIMB revelou que AH1205 tem uma seqüência de IGS única (Id. de Seq. N°:

1 [seqüência adiante] e Id. de Seq. N°: 2 [seqüência reversa]) com sua homologia de seqüência mais próxima a Bifidobacterium longum.

Para desenvolver um perfil de PCR de código de barras para AH1205, PCR foi realizada com o uso dos iniciadores BOX (8) . As condições de ciclização foram 94°C por 7 minutos (1 ciclo) ; 94°C por 1 minuto, 65°C por 8 minutos, (30 ciclos) e 650C por 16 minutos. A reação de PCR continha 5 50 mg de DNA, mistura de PCR (XNAT2 kit) e 0,3 μΜ iniciador BOXA IR (5 1CTACGGCAAGGCGACGCTGACG-3 1 ) (Id. de Seq. N0:. 5) (MWG Biotech, Germany). As reações de PCR foram realizadas em um thermocycler Eppendorf. Os produtos de PCR (1 μΐ) foram processados junto a um marcador de peso molecular 10 (DNA 7500 ladder, Agilent, Germany) usando o DNA 7500 LabChip® no "Agilent 2100 Bioanalyzer" (Agilent, Germany).

0 código de barras (perfil do produto de PCR) foi determinado com o uso do programa "Agilent Bioanalyzer" em que o número de pico (produtos de PCR) e tamanho foram

identificados (Fig. 1) .

Perfis de sensibilidade ao antibiótico

Os perfis de sensibilidade ao antibiótico da cepa de B. longum foram determinados com o uso do ensaio de "suscetibilidade de disco" . As culturas cresceram no meio 20 de caldo adequado por 24-48h plaqueadas (100 μΐ) em meio de agar e is discos que contêm concentrações conhecidas do antibiótico foram plaqueadas no agar. As cepas foram examinadas para sensibilidade ao antibiótico depois de 1-2 dias de incubação a 37°C sob condições anaeróbicas. As 25 cepas foram consideradas sensíveis se zonas de inibição de

1 mm ou mais foram observadas. A concentração inibidora mínima (MIC) para cada antibiótico foi independentemente analisada. A MIC para clindamicina, vancomicina e metronidazol foi de 0,32, 0,75 e >256 respectivamente.

3 0 Trânsito intestinal Para determinar se Bifidobacterium longum pode sobreviver em valores baixos de pH equivalentes àqueles encontrados no estômago, células bacterianas foram coletadas de culturas frescas de um dia para outro, lavadas duas vezes em tampão de fosfato (pH 6,5) e ressuspensas em caldo TPY ajustado ao pH 2,5 (com IM HCl). As células foram incubadas a 370C e a sobrevivência medida em intervalos de

5, 30, 60 e 120 minutos com o uso do método de contagem de placa. AH1205 sobreviveu bem por 5 minutos em pH 2,5 enquanto nenhuma célula viável foi recuperada depois de 3 0 minutos.

Depois de deixar o estômago, os probióticos supostos são expostos aos sais biliares no intestino delgado. Para determinar a capacidade de B. longum de sobreviver à exposição a bile, foram feitas culturas em placas de agar TPY suplementadas com 0,3% (p/v), 0,5%, 1%, 2%, 5%, 7,5% ou 10% bile de porco. O crescimento de B. longum AH1206 foi observado em placas que contêm até 0,5% bile.

Em um modelo de murídeo, a capacidade de B. longum AH1205 de transitar no trato gastrointestinal foi avaliada. Camundongos consumiram IxlO9 AH1205 diariamente e os péletes de fezes foram examinados para a presença do microorganismo alimentado. A detecção de AH1205 foi facilitada por isolação de uma variante resistente à rifampicina espontânea da bifidobactéria — incorporação de rifampicina nas placas TPY usadas para avaliar o trânsito assegurou que apenas a bifiobactéria resistente à rifampicina alimentada foi cultivada. As amostras de fezes foram coletadas diariamente e o trânsito de B. longum através do trato gastrointestinal foi confirmado (Fig. 2). Atividade antimicrobiana

Os microorganismos patogênicos indicadores usados nesse estudo foram propagados no seguinte meio sob as seguintes condições de crescimento: Salmonella typhimurium 5 (37°C, aeróbica) em caldo de soja Triptona/agar suplementado com 0,6% extrato de levedura (TSAYE, Oxoid), Campylobacter jejuni (37°C, anaeróbica) e E. coli 0157:H7 (37°C, anaeróbica) em meio de Agar sangue, Clostridium difficile (37°C, anaeróbica) em meio de Clostridium 10 reforçado (RCM, Oxoid). Todas as cepas foram inoculadas em meio de crescimento fresco e cresceram de um dia para o outro antes de serem usadas em experimentos.

A atividade antimicrobiana foi detectada com o uso do método a seguir (9). Resumidamente, B. longum AH 1205 foi incubado por 36-48 h. Diluições em série de 10 vezes foram feitas e então plaqueadas (100 μΐ) em meio TPY agar. Depois de incubação de um dia para o outro, as placas com colônias distintas foram cobertas com a bactéria indicadora. A área indicadora foi preparada por inoculação de uma sobrecamada fundida com 2% (v/v) de uma cultura indicadora de um dia para o outro que foi despejada sobre as superfícies das placas de TPY inoculadas. As placas foram re-incubadas de um dia para o outro sob condições adequadas para crescimento da bactéria indicadora. As culturas indicadoras com zonas de inibição maiores que 1 mm de raio foram consideradas sensíveis à bactéria de teste:: B. longum AH12 0 6 inibiu o crescimento de todos os organismos patogênicos testados, com zonas de clareira medindo 8,67, >80, 4,33 e 11,67 mm para Salmonella typhimurium, Campylobacter jejuni, E. coli 0157 :H7 e Clostridium difficile respectivamente.

Exemplo 2: Produção de citocina por PBMCs em resposta a B.

1 ongum.

Celulas mononucleares de sangue periférico (PBMCs) foram isoladas de doadores saudáveis por centrifugação de gradiente de densidade. As PBMCs foram estimuladas com a cepa probiótica bacteriana por um período de 72 horas a 37°C. Nesse momento, os sobrenadantes da cultura foram coletados, centrifugados, divididos em alíquotas e estocados a —700C até serem avaliados para níveis de IL-IO com o uso de arranjos de glóbulo citométrico (BD Biosciences). AH1205 induziu secreção significativa da citocina antiinflamatória IL-10 por PBMCs humanas sugerindo que essa cepa pode ser útil como um agente antiinflamatório in vivo (Fig. 3).

Exemplo 3: B. longum AH1205 atenua a doença respiratória em um modelo de asma em murídeo

Esse estudo investigou se a bactéria probiótica Bifidobacterium longum AH1205 suprime as respostas 20 alérgicas em um modelo de camundongo sensibilizado com ovalbumina (OVA) de inflamação alérgica das vias aéreas. Resumidamente, os camundongos adultos machos BALBc foram sensibilizados por injeção i.p. de OVA no dia 0 e dia 6. nos dias 12 e 14, os camundongos receberam dose intranasal

2 5 com OVA. Vinte e quatro horas depois da última dose (dia

15), os camundongos foram submetidos a medições da responsividade das vias aéreas seguido por procedimento BAL. Os camundongos sensibilizados com OVA/alume, com dose de solução salina serviram como controles. Os animais

3 0 receberam probiótico ou placebo por todo o experimento. A inflamação das vias aéreas (contagens de citocina e de células) foi avaliada por contagens de células inflamatórias em fluido de lavagem broncoalveolar (BAL). A responsividade das vias aéreas foi também medida com o uso 5 do pletismógrafo "Buxco whole-body". Os esplenõcitos também foram isolados de camundongos sensibilizados com OVA e foram incubados na presença de anticorpos anti-CD3 e antiCD28 depois do que os níveis de citocina foram medidos nos sobrenadantes por citometria de fluxo.

B. Iongun AH12 05 resultou não causou uma redução

significativa nas células recuperadas de fluido de BAL depois de dose com OVA, quando comparado a animais alimentados com caldo (Fig. 4) . A responsividade das vias aéreas foi medida e a dosagem de camundongos sensibilizados

com OVA resultou em um aumento de AHR para metacolina quando comparado com camundongos que recebem solução salina. AH1205 não modulou essa responsividade aumentada das vias aéreas à metacolina, como avaliado por mudanças na pausa aumentada (Fig. 5) .

2 0 Os níveis de citocina de BAL foram medidos por arranjo

de glóbulo citométrico, e demonstraram que os animais alimentados com AH1205 tinham níveis significativamente reduzidos de TNF-a comparados ao controle de OVA (Fig. 6). Nenhuma diferença significativa foi observada para os

níveis de IL-10, IFN-γ, IL-6 e CCL2. (Fig 6)

Exemplo 4: modelo efetor de Treg

Esse estudo investigou o efeito do consumo de probiótico sobre a atividade e número de células T reguladoras em camundongos saudáveis. Camundongos BALB/c

3 0 (10/grupo) foram alimentados com Bifidobacterium longum ΑΗ12 05 ou placebo por três semanas. Depois do consumo do probiõtico/placebo, células T reguladoras CD4+CD25+ foram isoladas e sua atividade de supressão in vitro foi determinada por medição da proliferação de células T 5 responsivas CD4+ rotuladas com CFSE estimuladas por antiCD3/CD28 usando citometria de fluxo. As células T responsivas CD4+ foram co-incubadas com células T CD4+CD25 como um controle. A percentagem de células CD4+CD25+ (celulas T reguladoras) nos esplenócitos de murídeo que são 10 também FoxP3 positivas foi determinada nos baços de camundongos alimentados com probiótico ou placebo.

0 percentual de células CD4+ que proliferaram quando co-incubadas com células CD4+CD25+ dos camundongos alimentados com probiótico/placebo foi comparado ao 15 percentual de células CD4+ que proliferaram quando coincubadas com células CD4+CD25- do mesmo camundongo do experimento. Em cada caso, a proliferação das células T foi menor em culturas que contêm células CD4+CD2 5+ comparada a culturas que contêm apenas células CD4 e que não possuem as 20 células CD25+ (Fig. 7) .

0 percentual de células na população de CD4+ que também eram CD25+ foi determinado (Fig. 12). 0 grupo alimentado com Bifidobacterium longum AH1205 teve

significativamente mais células T CD4+ que as CD25+ (ou 25 seja, células T reguladoras) que suas contrapartes alimentadas com placebo (p= 0,0081). Isso sugere que o percentual de células T reguladoras na população de CD4+ foi aumentado significativamente por alimentação com AH 1205 .

3 0 0 número de células CD4+CD25+FoxP3+ nas populações de esplenócitos totais de camundongos alimentados com probiótico ou placebo foi também determinado. O número de células T reguladoras CD4+CD25+ que expressam FoxP3 não foi modificado nos baços de camundongos alimentados com 5 probiótico em relação aos camundongos alimentados com placebo ou não alimentados.

Exemplo 5: modelo livre de germes

Camundongos livres de germes foram adquiridos com 6 semanas de idade e mantidos na unidade livre de germes na

unidade de serviços biológicos em UCC. Os animais consumiram a cepa probiótica de Bifidobacterium longum AH 1205 por 9 dias ou permaneceram livres de germes. A indução de células T reguladoras foi avaliada por citometria de fluxo e os níveis de citocina foram quantificados por CBA.

O trânsito de AH12 05 foi avaliado por medição das

contagens de bifidobacteria em agar seletivo pela duração do estudo. AH1205 não transitou no intestino de camundongos livres de germes em números mensuráveis embora aproximadamente IxlO9 organismos fossem administrados

2 0 diariamente. Os resultados sugerem que fatores microbianos

ou do hospedeiro adicionais são necessários para a sobrevivência da bifidobacteria no intestino.

Embora AH12 05 não transite no intestino em números detectáveis, a bactéria interagiu com o sistema imune do

hospedeiro. Os números de células CD4+CD2 5+Foxp3+ nos linfonodos mesentéricos e baço de animais livres de germes alimentados com AH1205 foram significativamente aumentados depois de 9 dias de alimentação (Fig. 9) . As contagens totais de CD3/CD4 orou CD3/CD8 permaneceram inalteradas.

3 0 Células de linfonodos mesentéricos isoladas (MLNC) e esplenócitos foram estimuladas in vitro com anticorpos anti-CD3/CD28 ou LPS ou permaneceram não estimuladas como controles negativos. A secreção de MLNC de IL-6 e IFN-γ, depois do estímulo com CD3/CD28, foi substancialmente 5 diminuída em sobrenadantes de cultura embora os níveis de MCP-I fossem significativamente suprimidos quando os camundongos foram pré-alimentados com AH1205 (Fig. 10). Os níveis de IL-IO permaneceram similares entre os grupos. A liberação de esplenócitos de IL-6 e TNF-α foi 10 substancialmente, mas não significativamente, diminuída quando pré-alimentados com AH1205 (Fig. 11) . Nenhuma diferença significativa foi observada para as culturas não estimuladas ou estimuladas com LPS mas no geral nós observamos menos produção de citocina pró-inflamatória a 15 partir de animais alimentados com Bifidobacteria AH 1205. Exemplo 6: resultados de estabilidade

A estabilidade da cepa probiótica-AH12 05 variou por 3 meses a 30°C (Fig. 12).

Lactobacillus rahmosus GG teve rendimento fraco

2 0 durante o período do teste com uma queda de 2 Iog pelo período de 3 meses enquanto a cepa AH 1205 declinou na viabilidade em até aproximadamente I Iog pelo mesmo período de teste.

Imunomodulação

2 5 O sistema imune humano tem um papel significativo na

etiologia e patologia de uma vasta faixa de doenças humanas. Hiper e hipo responsividade imune resulta, ou é um componente da maioria dos estados de doença. Uma família de entidades biológicas, denominada citocinas, é

3 0 particularmente importante para o controle dos processos imunes. A perturbação dessas redes delicadas de citocina tem sido crescentemente associada a várias doenças. Essas doenças incluem, sem limitação, distúrbios inflamatórios, imunodeficiência, doença inflamatória intestinal, síndrome do cólon irritável, câncer (particularmente aqueles dos sistemas gastrointestinal e imune), doença diarréica, diarréia associada a antibióticos, diarréia pediátrica, apendicite, distúrbios autoimunes, esclerose múltipla, doença de Alzheimer, artrite reumatóide, doença celíaca, diabetes melito, transplante de órgãos, infecções bacterianas, infecções virais, infecções fúngicas, doença periodontal, doença urogenital, doença sexualmente transmitida, infecção por HIV, replicação por HIV, diarréia associada ao HIV, trauma associado a cirurgia, doença metastática induzida por cirurgia, sepsia, perda de peso, anorexia, controle da febre, caquexia, cicatrização de ferimentos, úlceras, função da barreira intestinal, alergia, asma, distúrbios respiratórios; distúrbios circulatórios, doença cardíaca coronariana, anemia, distúrbios do sistema de coagulação sanguínea, doença renal, distúrbios do sistema nervoso central, doença hepática, isquemia, distúrbios nutricionais, osteoporose, distúrbios endócrinos, distúrbios epidérmicos, psoríase e acne vulgar. Os efeitos sobre a produção de citocina são específicos para a cepa probiótica examinada. Assim, cepas probióticas específicas podem ser selecionadas para normalização de um equilibro de citocina exclusivo particular para um tipo específico de doença. A personalização de terapias específicas para doença pode ser realizada com o uso de uma única cepa de AN 1205 ou mutantes ou variantes dessas ou uma seleção dessas cepas. Educação imune

A flora entérica é importante para o desenvolvimento e função adequada do sistema imune intestinal. Na ausência de 5 uma flora entérica, o sistema imune intestinal é subdesenvolvido, como demonstrado em modelos animais livres de germes, e certos parâmetros funcionais são diminuídos, como a capacidade fagocítica dos macrófagos e produção de imunoglobulina (10) . A importância da flora intestinal em 10 estimular respostas imunes não prejudiciais está se tornando mais evidente. 0 aumento na incidência e severidade de alergias no mundo ocidental tem sido ligado com um aumento na higiene e saneamento, concomitante com uma diminuição no número e escala de desafios infecciosos 15 encontrados pelo hospedeiro. Essa ausência de estímulo imune pode permitir que o hospedeiro reaja a agentes não patogênicos, porém antigênicos, que resulta em alergia ou autoimunidade. O consumo deliberado de uma série de bactérias imunomoduladoras não patogênicas deve fornecer ao

2 0 hospedeiro estímulo educacional necessário e adequado para

o desenvolvimento adequado e controle da função imune. Inflamação

Inflamação é o termo usado para descrever o acúmulo local de fluido, proteínas plasmáticas e leucócitos em um 25 local que tem dano físico sustentado, infecção ou em que há uma resposta imune em progressão: o controle da resposta inflamatória é exercido em inúmeros níveis (11). Os fatores de controle incluem citocinas, hormônios (por exemplo, hidrocortisona), prostaglandinas, intermediários reativos

3 0 e leucotrienos. As citocinas são proteínas biologicamente ativas de baixo peso molecular que são envolvidas na geração e controle de respostas imunológicas e inflamatórias, embora também regulem o desenvolvimento, reparação tecidual e hematopoiese. Elas fornecem um meio de 5 comunicação entre os leucócitos e também com outros tipos de células. A maioria das citocinas é pleiotrófica e expressa múltiplas atividades biologicamente sobrepostas. As cascatas de citocina e redes controlam a resposta inflamatória em vez da ação de uma citocina em particular 10 sobre um tipo de célula particular (12) : o declínio da resposta inflamatória resulta em menores concentrações dos sinais de ativação adequados e de outros mediadores inflamatórios que leva à cessação da resposta inflamatória. TNFa é a principal citocina pró-inflamatória uma vez que 15 ela inicia uma cascata de citocinas e efeitos biológicos que resultam no estado inflamatório: portanto, os agentes que inibem TNFa estão sendo atualmente usados para o tratamento de doenças inflamatórias, por exemplo, infliximab.

Acredita-se que as citocinas pró-inflamatórias tenham

um papel principal na patogênese de várias doenças inflamatórias, incluindo doença inflamatória intestinal (IBD). As terapias atuais para tratamento de IBD são focadas na redução dos níveis dessas citocinas pró25 inflamatórias, incluindo IL-8 e TNFa. Tais terapias também podem ter um papel significativo no tratamento de doenças inflamatórias sistêmicas como artrite reumatóide.

As cepas da presente invenção podem ter aplicação potencial no tratamento de uma faixa de doenças

3 0 inflamatórias, particularmente se usadas em combinação com outras terapias antiinflamatórias, como fármacos antiinflamatórios não esteróides (NSAIDs) ou Infliximab. Citocinas e câncer

A produção de citocinas multifuncionais por um amplo espectro de tipos de tumores sugere que respostas inflamatórios significativas estão em andamento em pacientes com câncer. Não é claro atualmente qual efeito protetor essa resposta te contra o crescimento e desenvolvimento de células tumorais in vivo. No entanto, essas respostas inflamatórias podem afetar, de modo adverso, o hospedeiro que porta o tumor. Interações complexas de citocinas são envolvidas na regulação da produção de citocina e proliferação celular em tecidos tumorais (13, 14). Tem sido reconhecido há algum tempo que a perda de peso (caquexia) é a causa única mais comum de morte em pacientes com câncer e a desnutrição inicial indica um prognóstico fraco. Para que um tumor cresça e se dissemine ele deve induzir a formação de novos vasos sanguíneos e degradar a matriz extracelular. A resposta inflamatória pode ter papéis significativos nos mecanismos acima, assim contribuindo para o declínio do hospedeiro e progressão do tumor. Devido às propriedades antiinf lamatórias de Bifidobacterium longum infa.ntis essas cepas bacterianas podem reduzir a taxa de transformação das células malignas. Além disso, as bactérias intestinais podem produzir, a partir de compostos dietéticos, substâncias com atividade genotóxica, carcinogênica e de promoção de tumor e as bactérias intestinais podem ativar pró-carcinogênios a agentes reativos de DNA (15). Em geral, as espécies de Bifidobacterium têm baixas atividades de enzimas metabolização xenobióticas comparadas a outras populações no intestino como Bacteróides, eubactérias e clostridium. Portanto, o aumento do número da bactéria Bifidobacterium no intestino pode modificar de modo 5 benéfico os níveis dessas enzimas.

Vacina/liberação de fármaco

A maioria dos organismos patogênicos penetra o corpo através de superfícies mucosas. A vacinação eficiente desses locais protege contra a invasão por um agente 10 infeccioso em particular. Estratégias de vacinação oral têm se concentrado, até hoje, no uso de organismos patogênicos vivos atenuados ou antígenos purificados encapsulados (16). A bactéria probiótica, construída para produzir antígenos a partir de um agente infeccioso, in vivo, pode fornecer uma 15 alternativa atrativa uma vez que essas bactérias são consideradas como sendo seguras para o consumo humano (status GRAS).

Estudos em murídeos demonstraram que o consume de bactéria probiótica que expressa antígenos estranhos pode 20 produzir respostas imunes protetoras. O gene que codifica fragmento C de toxina tetânica (TTFC) foi expresso em Lactococcus lactis e camundongos foram imunizados por via oral. Esse sistema foi capaz de induzir títulos de anticorpos significativamente altos o suficiente para 25 proteger os camundongos de dose letal de toxina. Em adição à apresentação de antígeno, vetores bacterianos vivos podem produzir compostos bioativos, como citocinas imunoestimulantes, in vivo. L. lactis que secreta IL-2 ou - IL-6 humana bioativa e TTFC induziu títulos de IgG sérica 10-15

3 0 vezes maiores em camundongos imunizados por via intranasal (17). No entanto, com essa cepa bacteriana em particular, o nível total de IgA não foi aumentado por coexpressão com essas citocinas. Outras cepas bacterianas, como Streptococcus gordonii, estão também sendo examinadas para sua utilidade como vacinas de mucosa. S. gordonii recombinante que coloniza as cavidades oral e vaginal de murídeo induziu respostas de anticorpo mucosas e sistêmicas aos antígenos expressos por essa bactéria (18) . Assim, a imunização oral que usa bactéria probiótica como vetores não pode apenas proteger o hospedeiro de infecção, mas pode substituir o estímulo imunológico que o patógeno produziria normalmente assim contribuindo para a educação imunológica do hospedeiro.

Prebióticos

A introdução de organismos probióticos é realizada pela ingestão do microorganismo em um veículo adequado. Seria vantajoso fornecer um meio que deve promover o crescimento dessas cepas probióticas no intestino grosso. A adição de um ou mais oligossacarídeos, polissacarídeos ou outros prebióticos aumenta o crescimento de acido lático de bactéria no trato gastrointestinal. Os prebióticos referemse a qualquer componente alimentar não viável que seja especificamente fermentado no cólon por bactéria nativa que seja de valor positivo, por exemplo, Bifidobacteria, lactobacilli. Os tipos de prebióticos podem incluir aqueles que contêm frutose; xilose, soja, galactose, glicose e manose. A administração combinada de uma cepa probiótica com um ou mais compostos prebióticos pode aumentar o crescimento do probiótico administrado in vivo resultando em um benefício mais pronunciado para saúde, e é denominado simbiótico.

Outros ingredientes ativos

Deve-se observar que as cepas probióticas podem ser administradas prof ilaticamente ou como um método de tratamento por si só ou com outros materiais probióticos e/ou prebióticos como acima descrito. Em adição, as bactérias podem ser usadas como parte de um regime profilático ou de tratamento que usa outros materiais ativos como aqueles usados para o tratamento de inflamação ou de outros distúrbios especialmente aqueles com um envolvimento imunológico. Tais combinações podem ser administradas em uma formulação única ou como formulações separadas administradas ao mesmo tempo ou em tempos diferentes e usando as mesmas vias ou vias diferentes de administração.

A invenção não é limitada às modalidades aqui anteriormente descritas que podem ser variadas em detalhes.

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Claims (39)

1. Cepa de Bifidobacterium longum AH 12 05 caracterizada por ter o número de acesso NCIMB 413 8 7 ou mutantes ou variantes desses.

2. Cepa de Bifidobacterium, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o mutante é um mutante geneticamente modificado

3. Cepa de Bifidobacterium, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a variante é uma variante de ocorrência natural de Bifidobacterium.

4. Cepa de Bifidobacterium, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por ser probiótica.

5. Cepa de Bifidobacterium, de acordo com a reivindicação 1 ou 4, caracterizada pelo fato de que a cepa está na forma de uma cultura biologicamente pura.

6. Cepa caracterizada por ser isolada de Bifidobacterium NCIMB 41387.

7. Cepa de Bifidobacterium, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5 ou 6, caracterizada por estar na forma de células viáveis.

8. Cepa de Bifidobacterium, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5 ou 6, caracterizada por estar na forma de células não viáveis.

9. Cepa de Bifidobacterium, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8, caracterizada pelo fato de que a Bifidobacterium é isolada de fezes de bebê.

10. Cepa de Bifidobacterium, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ou 9, caracterizada pelo fato de que a cepa é significativamente imunomoduladora após consumo oral em humanos.

11. Formulação caracterizada por compreender uma cepa de Bifidobacterium de qualquer uma das reivindicações 1, 2,3,4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10.

12. Formulação, de acordo com a reivindicação 11 caracterizada por compreender ainda outro material probiótico.

13. Formulação, de acordo com qualquer uma das reivindicações 11 ou 12, caracterizada por também compreender um material prebiótico.

14. Formulação, de acordo com qualquer uma das reivindicações 11, 12 ou 13, caracterizada por também compreender um veículo ingerível.

15. Formulação, de acordo com a reivindicação 14, caracterizada pelo fato de que o veículo ingerível é um veículo farmaceuticamente aceitável tal como uma cápsula, comprimido ou pó.

16. Formulação, de acordo com a reivindicação 14 caracterizada pelo fato de que o veículo ingerível é um produto alimentício tal como leite acidificado, iogurte, frozen iogurte, leite em pó, concentrado de leite, pastas de queijo, molhos ou bebidas.

17. Formulação, de acordo com qualquer uma das reivindicações 11, 12, 13, 14, 15 ou 16, caracterizada por também compreender uma proteína e/ou peptídeo, em particular proteínas e/ou peptídeos que são ricos em glutamina/glutamato, um lipídeo, um carboidrato, uma vitamina, mineral e/ou resíduos.

18. Formulação, de acordo com qualquer uma das reivindicações 11, 12, 13, 14, 15, 16 ou 17, caracterizada pelo fato de que a cepa de Bifidobacterium está presente em uma quantidade de mais que IO6 ufc por grama da formulação.

19.Formulação, de acordo com qualquer uma das reivindicações 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 ou 18, caracterizada por também compreender um adjuvante.

20.Formulação, de acordo com qualquer uma das reivindicações 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 ou 19, caracterizada por também compreender um componente bacteriano.

21. Formulação, de acordo com qualquer uma das reivindicações 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20, caracterizada por também compreender uma entidade de fármaco.

22.Formulação, de acordo com qualquer uma das reivindicações 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 ou21, caracterizada por também compreender um composto biológico.

23. Formulação, de acordo com qualquer uma das reivindicações 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 ou 22, caracterizada para protocolos de imunização e vacinação.

24. Cepa de Bifidobacterium, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10, ou formulação, de acordo com qualquer uma das reivindicações .11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 ou 23, caracterizada para uso em gêneros alimentícios.

25. Cepa de Bifidobacterium, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10, ou formulação, de acordo com qualquer uma das reivindicações .30 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 ou 23, caracterizada para uso como um medicamento.

26. Cepa de Bifidobacterium, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10, ou formulação, de acordo com qualquer uma das reivindicações11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 OU 23, caracterizada para uso na profilaxia e/ou tratamento de atividade inflamatória indesejável.

27. Cepa de Bifidobacterium, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10, ou formulação, de acordo com qualquer uma das reivindicações11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 ou 23, caracterizada para uso na profilaxia e/ou tratamento de atividade inflamatória gastrointestinal indesejável tal como doença inflamatória intestinal, por exemplo, doença de Crohn ou colite ulcerativa, síndrome do cólon irritável; pouchite; ou colite pós-infecção.

28. Cepa de Bifidobacterium, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10, ou formulação, de acordo com qualquer uma das reivindicações 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 OU 23, caracterizada para uso na profilaxia e/ou tratamento de câncer gastrointestinal.

29. Cepa de Bifidobacterium, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10, ou formulação, de acordo com qualquer uma das reivindicações11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 ou 23, caracterizada para uso na profilaxia e/ou tratamento de doença sistêmica tal como artrite reumatóide.

30. Cepa de Bifidobacterium, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10, ou formulação, de acordo com qualquer uma das reivindicações11, 12, 13, 14, 15, .16,17,18,19, 20, 21, 22 ou 23, caracterizada para uso na profilaxia e/ou tratamento de distúrbios autoimunes devido à atividade inflamatória indesejável.

31. Cepa de Bifidobacterium, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10, ou formulação, de acordo com qualquer uma das reivindicações .11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 ou 23, caracterizada para uso na profilaxia e/ou tratamento de câncer devido à atividade inflamatória indesejável.

32. Cepa de Bifidobacterium, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10, ou formulação, de acordo com qualquer uma das reivindicações .11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 ou 23, caracterizada para uso na profilaxia de câncer.

33. Cepa de Bifidobacterium, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10, ou formulação, de acordo com qualquer uma das reivindicações 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 OU 23, caracterizada para uso na profilaxia e/ou tratamento de doença diarréica devido à atividade inflamatória indesejável, tal como diarréia associada a Clostridium decile, diarréia associada a Rotavírus ou diarréia pósinfecção, ou doença diarréica devido a um agente infeccioso, como E.coli.

34. Cepa de Bifidobacterium, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10, ou formulação, de acordo com qualquer uma das reivindicações .11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 OU 23, caracterizada para uso na preparação de agentes bioterapêuticos anti-inflamatórios para a profilaxia e/ou tratamento de atividade inflamatória indesejável.

35. Cepa de Bifidobacterium, de acordo com a reivindicação 34, caracterizada para uso na preparação de um painel de agentes bioterapêuticos para modificação dos níveis de IL-IO.

36. Uso de uma cepa de Bifidobacterium, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 ou um fragmento derivado ativo ou mutante desses caracterizado pelo fato de ser para a prevenção e/ou tratamento de distúrbios inflamatórios, imunodeficiência, doença inflamatória intestinal, síndrome do cólon irritável, câncer (particularmente aqueles dos sistemas gastrointestinal e imune), doença diarréica, diarréia associada a antibióticos, diarréia pediátrica, apendicite, distúrbios autoimunes, esclerose múltipla, doença de Alzheimer, artrite reumatóide, doença celíaca, diabetes melito, transplante de órgãos, infecções bacterianas, infecções virais, infecções fúngicas, doença periodontal, doença urogenital, doença sexualmente transmitida, infecção por HIV, replicação por HIV, diarréia associada ao HIV, trauma associado a cirurgia, doença metastática induzida por cirurgia, sepsia, perda de peso, anorexia, controle da febre, caquexia, cicatrização de ferimentos, úlceras, função da barreira intestinal, alergia, asma, distúrbios respiratórios; distúrbios circulatórios, doença cardíaca coronariana, anemia, distúrbios do sistema de coagulação sanguínea, doença renal, distúrbios do sistema nervoso central, doença hepática, isquemia, distúrbios nutricionais, osteoporose, distúrbios endócrinos, distúrbios epidérmicos, psoríase e/ou acne vulgar.

37. Cepa de Bifidobacterium, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10, caracterizada pelo fato de que as cepas agem por antagonismo e exclusão de microorganismos pró-inflamatórios do trato gastrointestinal.

38. Cepa de Bifidobacterium, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10, ou formulação, de acordo com qualquer uma das reivindicações 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 ou 23, caracterizada pelo fato de ser para uso na preparação agentes bioterapêuticos anti-inflamatórios para a redução dos níveis de citocinas pró-inflamatórias.

39. Uso de uma cepa de Bifidobacterium, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10, caracterizada como uma cepa probiótica antiinfecciosa devido a sua capacidade de antagonizar o crescimento de espécies patogênicas.