BRPI0809767A2

BRPI0809767A2 - "linha celular de melanoma humano para o tratamento de doenças malignas, composição para o tratamento do melanoma, composição para o tratamento de melanomas humanos, procedimento para a preparação da composição para o tratamento de melanomas humanos e método para induzir uma resposta imune antitumoral em pacientes que portam melanoma"

Info

Publication number: BRPI0809767A2
Application number: BRPI0809767-4A
Authority: BR
Inventors: Jose Mordoh; Maria Marcela; Erika Maria Von Euw
Original assignee: Consejo Nac De Investigacione4S Cientificas Y Tecnica Conicet; Fundacion Sales; Inis Biotech Llc
Priority date: 2007-04-11
Filing date: 2008-04-11
Publication date: 2014-09-23
Also published as: AU2008238909A1; JP2010523141A; ES2390130T3; JP5762738B2; US20100183683A1; AR060424A1; EP2146742A2; NZ580533A; CA2683629A1; BRPI0809767B1; KR20090129501A; CN101861163B; RU2484134C2; MX2009010927A; AU2008238909B2; CA2683629C; DK2146742T3; CN101861163A; WO2008126039A2; KR101502518B1

Description

I "LINHA CELULAR DE MELANOMA HUMANO PARA O TRATAMENTO DE DOENÇAS MALIGNAS, COMPOSIÇÃO PARA O TRATAMENTO DO MELANOMA, COMPOSIÇÃO PARA O TRATAMENTO ADJUVANTE DO MELANOMA, COMPOSIÇÃO PARA O TRATAMENTO DE MELANOMAS 5 HUMANOS, COMPOSIÇÃO PARA O TRATAMENTO ADJUVANTE DE MELANOMAS HUMANOS, PROCEDIMENTO PARA A PREPARAÇÃO DA COMPOSIÇÃO PARA O TRATAMENTO DE MELANOMAS, PROCEDIMENTO PARA A PREPARAÇÃO DA COMPOSIÇÃO PARA O TRATAMENTO DE MELANOMAS HUMANOS E MÉTODO PARA INDUZIR UMA RESPOSTA 10 IMUNE ANTITUMORAL EM PACIENTES QUE PORTAM MELANOMA". Descrição do estado da técnica

A presente invenção refere-se a linhas celulares, composições para o tratamento de melanomas que as compreendem, procedimentos para preparar as composições e 15 métodos de tratamento. Mais preferencialmente a invenção refere-se a várias linhas celulares de melanoma humano para o tratamento de doenças malignas, sendo as linhas celulares: (a) Mel-XYl (depositada em German Collection of Microorganisms and Cell Cultures DSMZ sob o número de 20 acesso DSM ACC2830), (b) Mel-XY2 (depositada em German Collection of Microorganisms and Cell Cultures DSMZ do o número de acesso DSM ACC2831), (c) Mel-XY3 (depositada em German Collection of Microorganisms and Cell Cultures DSMZ sob o número de acesso DSM ACC2832), (d) Mel-XX4 25 (depositada em German Collection of Microorganisms and Cell Cultures DSMZ sob o número de acesso DSM ACC2829) ou (e) sub-populações das mesmas. As linhas celulares podem ser irradiadas obtendo-se populações com fenótipo apoptótico e populações com fenótipo necrótico de tais 30 linhas. As composições podem compreender adjuvantes e/ou modificadores de resposta imune e/ou células dendríticas autólogas.

Antecedentes da invenção

Hoje em dia realizam-se muitos esforços e destinam-se muitos recursos para investigar na área da imunoterapia do câncer. Existem importantes evidências que indicam o papel central dos linfócitos T nas respostas imunes efetivas contra o câncer (Oliver RT, Nouri AM. T; Câncer Surv 1992; 13:173-204). Para isso utilizaram-se nos tratamentos células alogênicas sozinhas, com adjuvantes, ou em combinação com imunomoduladores tais como algumas citoquinas.

Por outra parte é sabido que as células dendríticas (CD) são as células apresentadoras de antigenos que podem iniciar uma resposta de células T por causa da sua extraordinária capacidade para estimular os linfócitos T 10 naive (Schuler G, Steinman RM. J Exp. Med 1997; 186:1183- 7 e Banchereau J, Steinman RM. Nature 1998; 392:245-52). Vários autores demonstraram nos modelos murinos e em humanos que as CD incorporam células apoptóticas, e desta forma se apresentam os antigenos para a geração de

complexos HLA classe I/peptideos, permitindo a indução de linfócitos T citotóxicos (Albert ML, Pearce SF, Francisco LM, Sauter B, Roy P, Silverstein RL , Bhardwaj N. J Exp Med. 1998, 188: 1359-1368; Chen Z, Moyana T, Saxena A, Warrington R, Jia Z, Xiang J. Int J Cancer. 2001, 93: 539-548 e Shaif-Muthana M, McIntyre C, Sisley K, Rennie I, Murray A. Cancer Res. 2000, 60: 6441-6447). Para este processo é fundamental que as células apoptóticas induzam à maturação das células dendríticas (CD), embora muitos autores'reportaram que as células apoptóticas humanas não maturam às CD ou induzem à perda da maturação de tais CD

(Pietra G, Mortarini R, Parmiani G, Anichini A. Cancer Res 2001, 61: 8218- •8226; Labarriere N, Bretaudeau L, Gervois N, Bodinier M, Bougras G, Diez E, Lang F, Gregoire M, Jotereau F. Int J Cancer 2002, 101: 280-286 e Demaria S, Santori FR, Ng B, Liebes L, Formenti SC, Vukmanovic S. J Leukoc Biol. 2005, 77: 361-368).

0 documento de patente US 6.187.306 de Pardoll e colaboradores promove um método para tratar ou proteger contra o melanoma que compreende utilizar pelo menos uma 35 linha celular alogênica ou mais que expressem antigenos imunodominantes de melanoma, sendo que a linha celular foi alterada de forma tal que expressa citoquinas e administra dita linha transformada a um paciente que porta melanoma ou esta sob risco de adquirir a doença. Embora salienta-se a importância de que a linha celular ou as linhas celulares utilizadas expressem a maioria dos 5 antigenos imunodominantes não se promove uma nova linha celular ou combinação de linhas celulares que expressem a maioria de tais antigenos. A invenção compreende fundamentalmente linhas celulares transformadas que expressam citoquinas tais como GM-CSF.

Os documentos de patente US 5.882.654 e US 5.840.317 promove linhas celulares de melanoma irradiadas para serem utilizadas como vacinas alogênicas. 0 tratamento divulgado atinge valores inferiores a 50% de pacientes NED (16/37) e mostra-se uma efetiva atividade anti15 tumoral de tipo humoral.

0 documento de patente US 2006/0034811 de Wallack e colaboradores promove vacinas compreendidas por células apresentadoras de antigenos carregadas com células tumorais lisadas ou quebradas que incluem ao citosol e às membranas. As células tumorais podem ser células do paciente, linhas celulares ou células que foram infetadas com o vírus vaccinia recombinante que codifica a IL-2. No documento de patente US 2006/0140983 de Palucka e colaboradores promove-se uma composição para induzir imunidade em pacientes com câncer que compreende afastar e purificar células apresentadoras de antigenos iniciadas por exposição com uma ou mais proteínas de heat-shock e células tumorais mortas. As células apresentadoras de antigenos são células dendríticas e as células tumorais podem ser células singenéticas o alogênicas, por exemplo linhas celulares. Este documento difunde a necessidade de incorporar proteínas de heat-shock através da ruptura por aquecimento de células tumorais. Os testes mostrados não revelam necessariamente que a composição possua atividade indutora da imunidade em pacientes com melanoma.

No documento de patente US 6.602.709 de Albert e colaboradores se difunde o uso de células apoptóticas para apresentar antigenos às células dendríticas para a indução de células T. 0 método é útil para induzir linócitos T citotóxicos antígeno específicos e células T helper. As células dendríticas são iniciadas por células 5 apoptóticas ou fragmentos das mesmas e são capazes de processar e apresentar aos antigenos processados e induzir a atividade de linfócitos T citotóxicos, podendo ser utilizadas como vacinas terapêuticas.

Breve descrição da invenção Um objetivo da presente invenção é proporcionar várias linhas celulares de melanoma humano para o tratamento de doenças malignas, sendo que as linhas celulares são (a) Mel-XYl (depositada em German Collection of Microorganisms and Cell Cultures DSMZ sob o número de acesso DSM ACC2830), (b) Mel-XY2 (depositada em German Collection of Microorganisms and Cell Cultures DSMZ sob o número de acesso DSM ACC2831), (c) Mel-XY3 (depositada em German Collection of Microorgânisms and Cell Cultures DSMZ sob o número de acesso DSM ACC2832), (d) Mel-XX4 (depositada em German Collection of Microorgânisms and Cell Cultures DSMZ sob o número de acesso DSM ACC2829) ou (e) subpopulações das mesmas. As linhas celulares podem ser posteriormente irradiadas obtendo-se populações com fenótipo apoptótico e populações com fenótipo necrótico de tais linhas.

Um outro objetivo da presente invenção é proporcionar uma composição para o tratamento do melanoma, onde tal composição compreende pelo menos uma linha celular de melanoma alogênica por exemplo (a) Mel-XYl (depositada em 30 German Collection of Microorgânisms and Cell Cultures DSMZ sob o número de acesso DSM ACC2830), (b) Mel-XY2 (depositada em German Collection of Microorgânisms and Cell Cultures DSMZ sob o número de acesso DSM ACC2831), (c) Mel-XY3 (depositada em German Collection of 35 Microorgânisms and Cell Cultures DSMZ sob o número de acesso DSM ACC2832), (d) Mel-XX4 (depositada em German Collection of Microorgânisms and Cell Cultures DSMZ sob o número de acesso DSM ACC2829) ou combinações das mesmas, onde tais linhas celulares são incapazes de proliferar. A composição pode também compreender excipientes, adjuvantes tais como BCG e imunomoduladores tais como GMCSF ou IFNa. Em uma forma de concretização preferida a composição compreende combinações das quatro linhas celulares de melanoma alogênicas (a) Mel-XYl (depositada em German Collection of Microorgânisms and Cell Cultures DSMZ sob o número de acesso DSM ACC2830), (b) Mel-XY2 (depositada em German Collection of Microorgânisms and Cell Cultures DSMZ sob o número de acesso DSM ACC2831) , (c) Mel-XY3 (depositada em German Collection of Microorgânisms and Cell Cultures DSMZ sob o número de acesso DSM ACC2832) e (d) Mel-XX4 (depositada em German Collection of Microorgânisms and Cell Cultures DSMZ sob o número de acesso DSM ACC2829), onde tais linhas celulares foram irradiadas e são incapazes de proliferar. Em outra forma de concretização preferida a composição da invenção compreende combinações das três linhas celulares de melanoma alogênicas (a) Mel-XYl (depositada em German Collection of Microorgânisms and Cell Cultures DSMZ sob o número de acesso DSM ACC2830), (b) Mel-XY2 (depositada em German Collection of Microorgânisms and Cell Cultures "'DSM-Z sob o número de acesso DSM ACC2831) " e - (c) Mel XY3 (depositada em German Collection of Microorgânisms and Cell Cultures DSMZ sob o número de acesso DSM ACC2832) , onde tais linhas celulares foram irradiadas e são incapazes de proliferar.

Um outro objetivo da presente invenção é proporcionar uma 30 composição para o tratamento adjuvante do melanoma, onde tal composição compreende pelo menos uma linha celular de melanoma alogênica por exemplo (a) Mel-XYl (depositada em German Collection of Microorgânisms and Cell Cultures DSMZ sob o número de acesso DSM ACC2830), (b) Mel-XY2 35 (depositada em German Collection of Microorgânisms and Cell Cultures DSMZ sob o número de acesso DSM ACC2831) , (c) Mel-XY3 (depositada em German Collection of Microorgânisms and Cell Cultures DSMZ sob o número de acesso DSM ACC2832), (d) Mel-XX4 (depositada em German Collection of Microorgânisms and Cell Cultures DSMZ sob o número de acesso DSM ACC2829) e combinações das mesmas, e 5 onde tais linhas celulares foram irradiada e são incapazes de proliferar. A composição pode além do mais compreender excipientes, adjuvantes como BCG e modificadores de resposta imune como GM-CSF e/ou IFNa. Numa outra forma de concretização preferida a composição 10 da invenção compreende uma combinação das linhas celulares de melanoma alogênicas (a) Mel-XYl (depositada em German Collection of Microorgânisms and Cell Cultures DSMZ sob o número de acesso DSM ACC2830) , (b) Mel-XY2 (depositada em German Collection of Microorgânisms and 15 Cell Cultures DSMZ sob o número de acesso DSM ACC2831), (c) Mel-XY3 (depositada em German Collection of Microorgânisms and Cell Cultures DSMZ sob o número de acesso DSM ACC2832) ou (d) Mel-XX4 (depositada em German Collection of Microorgânisms and Cell Cultures DSMZ sob o 20 número de acesso DSM ACC2829), onde tais linhas celulares foram irradiadas e são incapazes de proliferar. Em uma outra concretização preferida a composição da invenção compreende uma combinação das linhas celulares de melanorfta ‘ alogênicas (a)'- Mel-ΧΥΊ ~(depositada éiri' iGerman ' 25 Collection of Microorgânisms and Cell Cultures DSMZ sob o número de acesso DSM ACC2830), (b) Mel-XY2 (depositada em German Collection of Microorgânisms and Cell Cultures DSMZ sob o número de acesso DSM ACC2831) ou (c) Mel-XY3 (depositada em German Collection of Microorgânisms and 30 Cell Cultures DSMZ- sob o número de acesso DSM ACC2832), onde tais linhas celulares foram irradiadas e são incapazes de proliferar.

Um outro objetivo da presente invenção é proporcionar uma composição para o tratamento de melanomas humanos que compreende células dendríticas autólogas maturas, células dendríticas autólogas carregadas com células de pelo menos uma linha celular de melanoma humano alogênico, células apoptóticas de essas pelo menos uma linha celular de melanoma humano heterólogo e células necróticas de essas pelo menos uma linha celular de melanoma humano heterólogo. A linha celular de melanoma humano é uma ou mais das seguintes linhas: (a) Mel-XYl (depositada em German Collection of Microorgânisms and Cell Cultures DSMZ sob o número de acesso DSM ACC2830), (b) Mel-XY2 (depositada em German Collection of Microorgânisms and Cell Cultures DSMZ sob o número de acesso DSM ACC2831), (c) Mel-XY3 (depositada em German Collection of Microorgânisms and Cell Cultures DSMZ sob o número de acesso DSM ACC2832), (d) Mel-XX4 (depositada em German Collection of Microorgânisms and Cell Cultures DSMZ sob o número de acesso DSM ACC2829) ou (e) subpopulações das mesmas.

Um outro objetivo da invenção é proporcionar uma composição para o tratamento adjuvante de melanomas humanos, que compreende células dendríticas maturas, células dendríticas carregadas com células de pelo menos 20 uma linha celular de melanoma humano alogênico, células apoptóticas de uma linha celular de melanoma humano heterólogo e células necróticas de uma linha celular de melanoma humano heterólogo. A linha celular de melanoma é uma ou mais das seguintes linhas celulares: (a) Mel-XYl 25 (depositada em German Collection of Microorgânisms and Cell Cultures DSMZ sob o número de acesso DSM ACC2830), (b) Mel-XY2 (depositada em German Collection of Microorgânisms and Cell Cultures DSMZ sob o número de acesso DSM ACC2831), (c) Mel-XY3 (depositada em German 30 Collection of Microorgânisms and Cell Cultures DSMZ sob o número de acesso DSM ACC2832), (d) Mel-XX4 (depositada em German Collection of Microorgânisms and Cell Cultures DSMZ sob o número de acesso DSM ACC2829) ou subpopulações das mesmas.

Um outro objetivo da presente invenção é proporcionar um procedimento para preparar a composição, sendo que tal procedimento se leva a cabo nas seguintes etapas: a) descongelar e cultivar as linhas celulares (a) Mel-XYl (depositada em German Collection of Microorgânisms and Cell Cultures DSMZ sob o número de acesso DSM ACC2830), (b) Mel-XY2 (depositada em German Collection of

Microorgânisms and Cell Cultures DSMZ sob o número de acesso DSM ACC2831) e (c) Mel-XY3 (depositada em German Collection of Microorgânisms and Cell Cultures DSMZ sob o número de acesso DSM ACC2832);

b) misturar essas três linhas celulares;

c) irradiar essas três linhas celulares;

d) agregar à mistura de linhas celulares adjuvantes e excipientes. O procedimento pode compreender além, na etapa a) o agregado da linha celular Mel-XX4 (depositada em German Collection of Microorgânisms and Cell Cultures DSMZ sob o número de acesso DSM ACC2829).

Um outro objetivo da presente invenção proporcionar um procedimento para preparar a composição que compreende as etapas de:

a) descongelar e cultivar as linhas celulares (a) Mel-XYl (depositada em German Collection of Microorgânisms and

Cell Cultures DSMZ sob o número de acesso DSM ACC2830), (b) Mel-XY2 (depositada em German Collection of Microorgânisms and Cell Cultures DSMZ sob o número de acesso DSM ACC2831), (c) Mel-XY3 (depositada em German 25 Collection of Microorgânisms and Cell Cultures DSMZ sob o número de acesso DSM ACC2832) e Mel-XX4 (depositada em German Collection of Microorgânisms and Cell Cultures DSMZ sob o número de acesso DSM ACC2829);

b) misturar essas linhas celulares;

c) irradiar essas linhas celulares;

d) obter células dendríticas autólogas; e

e) cocultivar durante um tempo as células dendríticas autólogas com as linhas celulares irradiadas da etapa c). Outro objetivo da presente invenção é proporcionar um

método para induzir uma resposta imune antitumoral em pacientes que portam melanoma que compreende administrar a um paciente que o precisar uma quantidade efetiva de uma combinação das linhas celulares (a) Mel-XYl (depositada em German Collection of Microorgânisms and Cell Cultures DSMZ sob o número de acesso DSM ACC2830) , (b) Mel-XY2 (depositada em German Collection of 5 Microorgânisms and Cell Cultures DSMZ sob o número de acesso DSM ACC2831) e (c) Mel-XY3 (depositada em German Collection of Microorgânisms and Cell Cultures DSMZ sob o número de acesso DSM ACC2832), sendo que tais linhas celulares são incapazes de proliferar. A administração 10 pode ser realizada em conjunto com adjuvantes e/ou imunomoduladores.

Um outro objetivo da presente invenção é proporcionar um método para induzir uma resposta imune antitumoral em pacientes que portam melanoma que compreende administrar a um paciente que o precisar uma quantidade efetiva de uma combinação das linhas celulares (a) Mel-XYl (depositada em German Collection of Microorgânisms and Cell Culturés DSMZ' sob o número de acesso DSM ACC2830) , (b) Mel-XY2 (depositada em German Collection of Microorgânisms and Cell Cultures DSMZ sob o número de acesso DSM ACC2831), (c) Mel-XY3 (depositada em German Collection of Microorgânisms and Cell Cultures DSMZ sob o número de acesso DSM ACC2832) e (d) Mel-XX4 (depositada em German Collection of Microorgânisms and Cell Cultures DSMZ sob o número de acesso DSM ACC2829), sendo que tais linhas celulares são incapazes de proliferar.

Um outro objetivo da presente invenção é proporcionar um método para induzir uma resposta imune antitumoral em pacientes que portam melanoma que compreende administrar 30 a um paciente que o precisar uma quantidade efetiva de um cocultivo de entre 6 e 72 horas de células dendríticas autólogas e uma combinação das linhas celulares (a) MelXYl (depositada em German Collection of Microorgânisms and Cell Cultures DSMZ sob o número de acesso DSM 35 ACC2830), (b) Mel-XY2 (depositada em German Collection of Microorgânisms and Cell Cultures DSMZ sob o número de acesso DSM ACC2831), (c) Mel-XY3 (depositada em German Collection of Microorgânisms and Cell Cultures DSMZ sob o número de acesso DSM ACC2832) e (d) Mel-XX4 (depositada em German Collection of Microorgânisms and Cell Cultures DSMZ sob o número de acesso DSM ACC2829), sendo que tais 5 linhas celulares são incapazes de proliferar.

Descrição das figuras

Na Figura 1 apresenta-se um exemplo representativo dos resultados da irradiação Gamma da mistura de linhas celulares da invenção em relação à indução da apoptose e 10 necrose (células Apo-Nec). No painel A apresentam-se as células não irradiadas e no painel B apresentam-se as células após a irradiação Gamma a 70Gy e coloreada com Anexina V-FITC e IP (iodeto de propídeo). As primeiras células apoptóticas definiram-se como Anexina V-FITC+/ 15 IP”, entanto que as células necróticas foram as duplamente positivas;

Na figura 2 apresenta-se um gráfico de Kaplan Meier dos pacientes tratados com a composição da invenção CD/ApoNec;

Na figura 3 apresenta-se a proliferação in vitro de linfócitos em resposta a células tumorais autólogas apresentadas pelas células CDs. Os resultados apresentamse como a média ± SD cpm (contas por minuto) dos triplicados. Como controles positivos incubaram-se 25 linfócitos com fitohemoaglutinina (PHA) incorporando mais de 7 xlO4 cpm;

Na figura 4 apresenta-se o corado de tetrâmeros para os antigenos Melan A/MART-1 e gplOO. No painel A observamse os resultados obtidos com amostras de PBMN de 30 pacientes HLA-A*0201 que participaram do estudo. *ND significa: não determinado por quantidade insuficiente de células CD8+T nas amostras pós-aplicação. No painel B apresenta-se o incremento de linfócito's T CD8 + HLA/peptídeo tetrâmero+ em PBMC do paciente #2. Os 35 números representam a percentagem de CD8+ HLA/peptídeo tetrâmero+. A modo de controle colorearam-se PBMC HLAA*0201 de doadores saudáveis; Na figura 5 apresenta-se A medição intracitoplasmática de IL-IO e IL-12 nas células Apo-Nec da invenção. No painel A apresentam-se os resultados de FACS das CDin e no painel B apresentam-se os resultados FACS das células CD/Apo-Nec;

Na figura 6 apresenta-se a expressão dos antigenos HMB45 e Mart-I na linha Mel-XYl e nos clones derivados de tal linha celular. Os três painéis de acima correspondem à linha celular e os três painéis de mais embaixo 10 correspondem aos clones. A coluna 1 corresponde à linha celular e clones controles, a coluna 2 corresponde à expressão de HMB45 da linha celular e os clones, respectivamente; e a coluna 3 corresponde à expressão de Mart-I da linha celular e os clones.;

Na figura 7 apresenta-se uma biopsia de melanoma do paciente #100. No painel A pode se ver uma imagem de baixo aumento (25X) onde se observam células tumorais positivas e negativas para o Ag gplOO, no painel B se observa a expressão heterogênea de gplOO, onde se podem 20 ver células com expressão alta, moderada e nula (400x); no painel C se observa a expressão heterogênea para o Ag MART-1, observando-se um clone de células com alta expressão, cingido de células negativas (400x);

Na figura 8 apresenta-se um gráfico de Kaplan Meier dos pacientes tratados com a composição da invenção Apo-Nec; Na figura 9 observam-se metástases dérmicas extirpadas do paciente #200 tratado com a composição da invenção Apo/Nec, más GM-CSF e BCG. No painel A observam-se macrófagos na região necrótica do tumor (1), infiltrado de linfócitos em contato com células tumorais (2) e uma região de tumor viável (3) . O painel B é um detalhe a IOOx da região de forte infiltração tumoral, o painel C é um detalhe a 400x da mesma região onde se observam linfócitos infiltrantes e o painel D apresenta um detalhe da mesma metástase onde se observa a maior parte da mesma necrosada com macrófagos carregados com melanina (1) e uma região viável (2) (25X); e Na figura 10 apresentam-se imagens de tomografia axial computada do paciente #300 tratado com a composição da invenção Apo-Nec más BCG. No painel A apresenta-se com uma flecha a localização da metástase pulmonar e no 5 painel B se observa uma imagem da tomografia axial tomada 5 meses depois.

Descrição detalhada da invenção

Para os efeitos da presente solicitude os termos "combinação" e "mistura" são intercambiáveis.

A presente invenção refere-se a composições que alteram o sistema imune dos mamíferos, deve se considerar que estas composições também são conhecidas pelos expertos no arte como composições de vacina, vacinas baseadas em células ou simplesmente vacinas.

As quatro linhas celulares da invenção foram depositadas sob o Tratado de Budapest em German Collection of Microorgânisms and Cell Cultures DSMZ em 23 de Março de 2007 sob ' os números de acesso a seguir: Linha celular Mel-XYl DSM ACC2830, linha Mel XY2 DSM ACC2831, linha Mel 20 XY3 DSM ACC2832 e linha Mel XX4 DSM ACC2829.

Os resultados dos testes de caracterização das linhas celulares detalham-se na Tabela a seguir: Tabela 1: marcadores de células tumorais de melanoma

humano da invenção

MARCADOR XYl XY2 XY 3 XX 4 GplOO (HMB45) ND ND + + GplOO (PCR) + + + + Tirosinase + + + + (PCR) MART-I (PCR) + - + MAGE I (PCR) ND - + + SlOO + + + + Vimentina ND + + + CEA ND + + ND GD2 + + + + GD3 + + + + P53 + + + + MIA + + + + MCP-I - + + + TRP-2 + + ND + MDRl - ND - HLA classe I A02/23 A30/33 A02/A23 A24(9)/A33(19) B18/B37 B18/B65 B18 B18/B65 (14) HLA classe II DR7 / DRl/DRl DRll DRl/DRl1 DRll DR13 DR52 / DR52 DR53 Tumorigenici¬ + + + + dade em ratos nus Crescimento de ++ ++ +++ + ++ colônias em ágar mole Da caracterização da linha celular MEL-XYl surge que as

células crescem como uma monocamada de células 5 amelanóticas heterogêneas em tamanho e forma, que na sua maioria são de forma cúbica ou alongada e sem prolongações. Em alta densidade de crescimento são levemente melanóticas. As células MEL-XYl formam numerosas colônias em ágar semi-sólido. As células MEL10 XYl são tumorigênicas em ratos atimicos (nude) e não geram metástase.

Da caracterização da linha celular MEL-XY2 surge que as células crescem como uma monocamada de células amelanóticas heterogêneas em tamanho. Apresentam-se células pequenas, e em menor número, multinucleadas com nucléolos proeminentes. Observam-se também células com prolongações dendríticas características no melanoma. Crescendo a alta densidade podem se empilhar e formar 5 microtumores. As células MEL-XY2 são tumorigênicas em ratos atímicos (nude) e não geram metástase.

Da caracterização da linha celular MEL-XY3 surge que as células crescem em monocamada. As células são uniformes, pequenas e algo arredondadas. Crescendo a alta densidade 10 podem se empilhar e formar microtumores. As células MELXY3 formam numerosas colônias em ágar semi-sólido. As células MEL-XY3 são tumorigênicas em ratos atímicos (nude) e não geram metástase.

Da caracterização da linha Mel-XX4 surge que tal linha 15 cresce em monocamada em forma de fuso ou fusiformes a alta densidade. Em baixa densidade apresenta projeções dendríticas semelhantes aos melanocitos. As células são melanóticas algumas das quais apresentam múltiplos núcleos com proeminente nucléolo. 0 tempo de duplicação 20 da população é dentre 172-173 horas e formam colônias nos testes de ágar mole.

Quando a linha celular Mel-XX4 da invenção foi transplantada para ratos nus (imuno-deprimidos) geraramse linhas celulares tumorais in vivo. As passagens 25 seriadas a partir dos tumores iniciais demonstraram que 100% dos animais transplantados desenvolviam tumores durante o primeiro mês. O crescimento dos tumores era lento e aos 84 dias atingiam um valor médio de 372 ± 63 mm3. A linha celular da invenção Mel-XX4 é tumorigênica 30 quando é injetada em forma subcutânea numa quantidade de 3xl06 células.

Da análise do número modal de cromossomas surge o seguinte: A linha MEL-XYl da invenção amostra uma dispersão no reconto cromossômico (entre 105 e 110) e 35 pelo tanto não se destacou um número modal claro (sexo masculino). A linha MEL-XY2 da invenção demonstra uma tendência bimodal com números cromossômicos 89 e 91 (sexo masculino). A linha celular MEL-XY3 da presente invenção apresenta um número modal de 69 (sexo masculino), as alterações numéricas mais freqüentes foram a ausência de cromossomas nos pares 2 e 6 e cromossomas extra nos pares 5 20 e 22. A linha celular da invenção MEL-XY4 apresenta um número modal de 57-58(sexo feminino).

Foi ensaiada a energia de radiação gamma que induze apoptose nas linhas celulares da invenção. A aplicação de 50 Gy de irradiação foi suficiente para suprimir completamente a capacidade clonogênica em ágar mole para cada linha celular da invenção. Quando as células se irradiaram com 70 ou 100 Gy, não foram observadas diferenças significativas no grau de indução de apoptose/necrose. Na figura I A pode-se observar que as células de melanoma não irradiadas continham ente 6-9% de células primárias apoptóticas caracterizadas por coração Anexina-V+/IP“ (painel de mais abaixo à direita) . Logo após da radiação a 70 Gy e 72 hs de cultivo, obtiveram-se um 45-53% de células primárias apoptóticas (ver Figura 1 B, painel de mais abaixo à direita) . As células necróticas coloreadas com Anexina-V e IP se incrementaram desde 7,5% nas células não irradiadas até perto de 15% nas células irradiadas (painéis de mais acima à - esquerda)". ?or tanto aos efeitos da presente solicitude de patente as células de melanoma irradiadas da invenção se denominam células Apo-Nec e a composição que compreende uma ou mais de qualquer uma das linhas celulares Apo-Nec (Mel-XYl, Mel-XY2, Mel-XY3 y/o Mel-XX4) denominam-se composição Apo-Nec.

A radiação das células permitiu obter células incapazes de proliferar úteis para a elaboração de composições, tais como a composição Apo-Nec da invenção. Resulta evidente para um experto na arte que a composição Apo-Nec da invenção pode compreender qualquer uma das linhas da 35 invenção ou diferentes combinações das mesmas. Numa forma de concretização preferida a composição Apo-Nec da invenção compreende uma mistura ou combinação das linhas celulares Mel-XYl, Mel-XY2 e Mel-XY3. Numa outra forma de realização preferida a composição Apo-Nec da invenção compreende uma mistura ou combinação das linhas celulares Mel-XYl, Mel-XY2, Mel-XY3 e Mel-XX4. A mistura das linhas 5 celulares preferidas Apo-Nec da invenção proporcionam uma combinação de múltiplos antigenos que induzem uma excelente resposta imune antitumoral.

De forma surpreendente a combinação de antigenos tumorais apresentados pela mistura das quatro linhas celulares 10 Apo-Nec da invenção induzem uma resposta imune de células T específica contra o tumor e permite obter mais de 80% de pacientes livre de doença quando são tratados com a composição Apo-Nec da invenção (ver figura 8).

As linhas da invenção utilizaram-se também para preparar a composição da invenção denominada CD/Apo-Nec que compreende pelo menos uma das linhas celulares da invenção e células dendríticas autólogas.

Em outra forma de realização preferida as linhas celulares são diferentes combinações das linhas Mel-XYl, 20 Mel-XY2, Mel-XY3 e Mel-XX4. A modo de exemplo e sem limitá-lo ao mesmo a combinação poderia compreender uma mistura das linhas celulares Mel-XYl e Mel-XY2 ou uma mistura das linhas Mel-XYl, Mel-XX4. Em uma concretização preferencial a combinação de linhas celulares compreende 25 uma mistura das linhas celulares Mel-XYl, Mel-XY2, MelXY3 e Mel-XX4, contando por tanto com a presença das quatro linhas celulares.

Em uma concretização preferencial a composição CD/Apo-Nec da invenção compreende uma combinação das linhas celulares Mel-XYl, Mel-XY2, Mel-XY3, Mel-XX4 irradiadas e células dendríticas autólogas.

A particular combinação das quatro linhas celulares da invenção proporciona uma fonte única de antigenos nativos para carregar células dendríticas, proporcionando além do 35 mais antigenos de células clonogênicas. Deve-se considerar que a combinação das quatro linhas celulares irradiadas da invenção nem só proporciona uma particular combinação de antigenos nativos, mas também compreendem uma particular combinação de populações de células onde estão presentes perto de 50% de células apoptóticas e perto de 15% de células necróticas. Esta combinação de populações induz a maturação das CD.

0 estudo de Fase I com a composição CD/Apo-Nec da invenção levou-se a cabo em 16 pacientes de melanoma cujas características apresentam-se na Tabela 2 Tabela 2: Características dos pacienteis Paciente Sexo Idade Estádio Mts PBMC Dose de Dose I . DTH clínico (xlO9 CD/Apo-Nec EVplução score cells) (xlO6 cells) Clínica (30/3/07) 1 F 42 IV LN 3 . 5 5 4 P (8 m) 4 2 F 57 III ND 3.6 5 4 NED , (54 m+) 8 3 M 32 III ND 3.3 5 4 NED (35 m+) 14.25 4 F 17 III ND 4 . 4 5 4 NED1, (45 m+) 9.5 J- ·' 5 M 56 IV L 5 10 4 P ';(4 m) 4 6 M 60 III ND 1. 5 3 4 NEDi; (37 m+) 4 . 5 7 M 27 IV SC 4.2 10 2 WP.;! (1 m) ND 8 M 26 III ND 3.6 10 4 P: (7 m) 10.5 9 F 42 III ND 7 . 5 15 4 NED (7Im+) 5 . 6 10 M 34 IV LN 6.2 15 4 P (11 m) 5.5 11 M 44 IV L 4 . 7 15 4 Pi : (4 m) 10 12 M 56 III ND 8 15 4 NE D-. (25m+) 4 . 5 13 M 47 IIC ND 9.3 20 4 NED,,;'(2 6 m+) 6.5 14 M 30 III ND 7 . 5 20 4 NED [.1(3 9 m+) 7.25 15 M 52 IV LN 6 20 4 P í*Uo m) 3.75 16 F 57 IV SC 8.2 20 4 Pi,; (6 m) 5.25 ND: não detectável; SC: subcutâneos; L: pulmão LN: nódulo linfático A média de idade estava nos 42 anos (desde 17 a 60 anos). Foram tratados cinco mulheres e onze homens. Um deles tinha melanoma AJCC estádio IIC, oito tinham melanoma estádio III e sete tinham melanoma estádio IV. Os 5 pacientes #5 e #11 foram submetidos a cirurgia das metástase de pulmão; o paciente #16 tinha metástase subcutâneas e os pacientes #1, #10 e #15 receberam radioterapia na região axilar depois da cirurgia pela ruptura da cápsula dos nódulos linfáticos. Prepararam-se 10 cortes de quatro pacientes e foram tratados com 5, 10, 15 ou 20 xlO6 de células dendríticas (CDs) cocultivadas com células Apo-Nec (composição CD/Apo-Nec da invenção). Todos os pacientes receberam cada duas semanas uma dose da composição CD/Apo-Nec (0,3 ml) sem adjuvantes. 0

paciente #7 foi retirado do protocolo logo após da segunda aplicação por causa da rápida progressão da doença após de um trauma esportivo na coxa direita e uma infecção descontrolada; este paciente não foi substituído.

As células dendríticas imaturas (CDin) mostravam o patrão a seguir: o 95.1 ± 3.6% eram CD14-/ CDllc+ e o 70 ± 6% eram CDla+. Foi calculado que a pureza era de perto de 60%.

Foram obtidas aproximadamente 3xl06 CDs a partir de IxlO8 PBMC semeadas em meio livre de soro.

Quando se caracterizaram as CDin obtidas dos pacientes e as células compreendidas na composição CD/Apo-Nec da invenção descobriu-se que 42.3 % ± 13.7 das células CDin dos pacientes (n= 15) foram capazes de fagocitar às 30 células Apo-Nec da invenção. A fagocitose das células Apo-Nec foi comprovada por microscopia eletrônica, observando-se células Apo-Nec inteiras ou partes delas dentro das CDs em vacúolos.

A capacidade das células Apo-Nec da invenção para influir no processo de amadurecimento das células CD derivadas de monócitos foi examinada por meio de medições de marcadores específicos para células CD por citometria de fluxo (FACS) (FACSCalibur, BD Biosciences, San José, CA). A fagocitose das células Apo-Nec da invenção deu como resultado um fenótipo maturo das células CD em comparação com os controles incubados com LPS. 0 amadurecimento das 5 células CD foi evidenciado pelo incremento na expressão de CD83, CD80, CD86, HLA classe I, e II e CD40. Logo após da fagocitose observou-se 75.2 % ± 16 de redução na endocitose FITC-Dx em comparação com as CDin.

0 receptor de quemoquina (C-C motif) receptor 7 (CCR7) 10 incrementou a sua expressão nas CDs logo após da fagocitose das células Apo-Nec da invenção, na totalidade dos pacientes e isto correlacionou-se com a migração in vitro das células CD para ΜΙΡ-3β. As células CDin (9.6% CCR7+, MFI: 23.3) migraram para MIP-Ia mas não migraram 15 para ΜΙΡ-3β; porém as células CD/Apo-Nec (81.8% CCR7+, MFI: 41.2) claramente migraram para ΜΙΡ-3β e não para MIP-Ia.

Exceto para o paciente #6, que mostrou um baixo rendimento de PBMC, e pelo tanto não se pôde obter a dose de 10 x IO6 células CD/Apo-Nec, o que provocou ter que lhe administrar dose de 3 x IO6 células por aplicação, todos os pacientes restantes receberam a dose esperada da composição CD/Apo-Nec da invenção coorte 1: 5 x IO6, coorte 2: 10 x IO6, coorte 3: 15 x IO6 e coorte 4: 20 x IO6. A composição CD/Apo-Nec da invenção foi bem tolerada e unicamente produziram-se casos de toxicidade média sempre de Grau 1. Observaram-se reações locais fracas nos sitios de aplicação e DTH, que consistiram em eritema e pápula. Nenhum paciente desenvolveu manifestações de doenças auto-imunes (Tabela 3). Tabela 3

Toxicidade associada à aplicação da composição CD/APO-NEC da invenção _

Sintomas Composição Composição Composição Composição 5 XlO6 10 xlO6 15 xlO6 20 xlO6 Fadiga 1/4 1/3 0/4 0/4 Dor de 1/4 0/3 0/4 0/4 cabeça Calafrios 1/4 0/3 0/4 0/4 Cãibra 0/4 0/3 0/4 1/4 Abdominal Reação Local 4/4 3/3 4/4 4/4 Astenia 0/4 1/3 0/4 0/4 Náusea 0/4 0/3 0/4 1/4 Dor 0/4 0/3 0/4 1/4 Abdominal Vômito 0/4 0/3 0/4 1/4 Anorexia 0/4 1/3 0/4 0/4 Diarréia 0/4 0/3 0/4 1/4 Mialgia 1/4 0/3 1/4 0/4 Logo após de um acompanhamento médio de 41.5 meses pós

cirurgia (entre 25 e 71 meses), os pacientes em estádio

IIC estavam sem evidências de doenças (NED); 7/8 (87.5%)

dos pacientes em estádio III estavam NED e 7/7 dos

pacientes em estádio IV mostraram progressão da doença

(ver figura 2).

Avaliaram-se para cada aplicação as reações DTH às

células Apo-Nec heterólogas da invenção e determinou-se a

intensidade da reação, o score de DTH tal como se

descreve nos exemplos. Unicamente 6/15 pacientes

mostraram uma leve reação DTH pré-aplicação contra as

células Apo-Nec da invenção. Os testes DTH revelaram que

a aplicação de células Apo-Nec induz uma reatividade

especifica em todos os pacientes, dado que o score DTH

foi significativamente maior logo após da aplicação da

segunda dose da composição CD/Apo-Nec em comparação com

as reações basais observadas logo após da primeira aplicação (Mann Whithney test P=0.029, n=15). Os score DTH foram maiores nos pacientes NED que em aqueles que experimentaram progressão da doença (P= 0.28, Mann Wilcoxon Rank Sum test).

0 incremento na quantidade de células CD/Apo-Nec por aplicação não incrementou significativamente o score DTH.

Não foi induzida resposta humoral alguma contra as células vivas de melanoma compreendidas na composição da invenção antes e após da aplicação, e avaliada por médio de análise por FACS. Também se analisou a presença de anticorpos reativos contra as células Apo-Nec em soros 10 pré e pós-aplicação por meio da técnica de Western blot. Em quatro pacientes (#3, #4, # e #16) observou-se unicamente uma leve banda de proteínas de melanoma (>200 kDa) detectada no soro pós-aplicação que não foi reconhecida nos extratos de células de câncer de mama 15 utilizadas como controle inespecifico.

Estabeleceu-se uma linha celular de melanoma autóloga para o paciente #1 e desta forma foi possível analisar se a aplicação nesse paciente das células CD/Apo-Nec induzia uma resposta de proliferação de linfócitos para as próprias células tumorais. Foi medida a proliferação de linfócitos logo após 5 dias de incubação dos linfócitos de pré e pós aplicação com células Apo-Nec#l (células tumorais irradiadas do paciente #1 obtidas tal como se descreve nos exemplos). Na figura 3 detalha-se que a proliferação dos linfócitos pós-aplicação em resposta às células CD/Apo-Nec#l foi maior respeito dos linfócitos pré-aplicação, sugerindo que existe imunização específica aos antígenos tumorais apresentados pelas células ApoNec, os que também estão presentes no tumor do paciente #1, após da aplicação das células CD/Apo-Nec.

Sete dos 15 pacientes envolvidos no estudo possuíam o haplótipo HLA-A*0201 classe I, o que permitiu estudar a resposta tumor-específica ao HLA restrita nas suas próprias amostras de PBMC. Foram analisadas as respostas 35 anti- gplOO e Melan A/MART-1 células T CD8+ específicas induzidas pela composição CD/Apo-Nec mediante a união específica tetrâmeros HLA/peptídeos e secreção de IFN-γ medida por ELISpot, diretamente nas amostras de sangue periférico.

Em 5/7 pacientes foram obtidas suficientes PBMC pré (7 dias antes da primeira aplicação) e pós (15 dias após da 5 quarta aplicação) para analisar a presença de linfócitos T CD8+ específicos reativos com gplOO e Melan A/MART-1 mediante coloração de tetrâmeros. Os resultados estão demonstrados na Figura 4 A. Os pacientes #2 e #6 incrementaram significativamente a sua freqüência de 10 gplOO e Melan A/MART-1 células T CD8+ específicas T após da aplicação por cima de 1% e que ainda estavam como NED (53 e 36 meses, respectivamente, após a cirurgia), enquanto que os pacientes #5, # 8 e #16 diminuíram a sua coloração de tetrâmeros pré-aplicação e todos eles 15 progrediram na doença logo após a aplicação (Figura 3 A). Como exemplo na Figura 4 B podem ser apreciados os resultados do paciente #2. As percentagens de células T CD8+ T que reconhecem os peptídeos gplOO ou Melan A/Mart

1 incrementaram-se após a aplicação desde 0,17 e 0,26 a 1,15 e 1,16 respectivamente. Não se observou reatividade num experimento realizado sob as mesmas condições de doadores saudáveis HLA-A*0201 positivos.

A liberação de IFN-γ em um ELISpot dos PBMC totais pré e pós aplicação foi ensaiada logo após de 24 hs de incubação com células CDs autólogas sondadas com gplOO ou Melan A/MART-1 e usando como controle peptídeos de influenza (flus8-66) · Este ensaio foi avaliado em 5/7 pacientes HLA-A*0201. Foi observado que dois pacientes (#5 e #16) logo após da aplicação da composição CD/ApoNec da invenção induziram IFN-γ secretado por células T CD8+ específicas para gplOO e Melan a/MART-1. Nos pacientes #5 e #16 foram induzidas freqüências de 7-3,5 xlO’4 células T CD8+ que secretam IFN-γ. No paciente #2 se encontrou uma alta quantidade de células T CD8 + específicas para gplOO e Melan A/MART-1 antes e depois a aplicação. Este paciente ainda se encontra livre de doença, 54 meses após da cirurgia. Os pacientes #8 e #15 mostraram uma baixa quantidade de pontos de base (préaplicação) e não foram observadas mudanças em quatro aplicações com a composição CD/Apo-Nec da invenção.

0 balanço entre IL-12 e IL-IO nas células CD/Apo-Nec da invenção foi quantificado mediante FACS em diferentes momentos logo após a fagocitose e seguido de 8 horas de tratamento com Brefeldin A para acumular intracitoplasmaticamente às citoquinas. Tal como é mostrado na Figura 5 unicamente 6,1% das CDin produzem IL-12, mas passadas 32 hs. Do co-cultivo 30,8% das células CD/Apo-Nec estavam induzidas a produzir IL-12. Por outra parte, 81,6% das CDin continham dentro do citoplasma as citoquinas e estas não se modificaram logo após a fagocitose. E 27,8% foram as células duplamente positivas que produziram IL-IO e IL-12 às 24 horas, (ver Figura 5).

A composição CD/Apo-Nec da invenção foi segura e bem tolerada pelos pacientes.

A composição CD/Apo-Nec da invenção induz respostas celulares nos pacientes já que a reação de DTH utilizando células Apo-Nec como imunógeno se incrementou em todos os pacientes logo após a segunda aplicação respeito dos valores de base.

Um 85% dos pacientes (estádio IIc e III) tratados com a composição CD/Apo-Nec da invenção estão livres de doença, logo após um seguimento médio de 41,5 meses quando foram tratados depois da cirurgia (ver figura 2). A composição CD/Apo-Nec da invenção resulta útil per se para o tratamento dos pacientes com melanoma, resultando também, útil como adjuvante após os tratamentos radicais já que estimula no paciente uma resposta imune, sendo que o sistema imune elimina as células tumorais residuais, protege o paciente de possíveis recaídas. Mais especificamente, a composição CD/Apo-Nec da invenção é útil para o tratamento de pacientes em estádio IIB, IIC e III, os quais contêm menor massa tumoral e é útil como adjuvante após as terapias radicais para os pacientes em estádio IV.

Resulta evidente para um experto na arte que a composição CD/Apo-Nec da invenção pode ser utilizada para o tratamento do melanoma humano e também como adjuvante 5 junto com outros tratamentos e como estimulante do sistema imune dependendo, por exemplo, do estádio do paciente e da etapa do tratamento.

É importante salientar que a combinação de células ApoNec da invenção induzem a maturação das células CD 10 autólogas. A mistura ou combinação das células Apo-Nec da invenção são uma boa fonte de antigenos de melanoma para carregar às células dendríticas. Note-se que as células dendríticas maturam unicamente mediante contatar e fagocitar a combinação de células Apo-Nec da invenção, 15 sem o agregado de um estímulo extra tal como, por exemplo, Interleukina I, Fator de Necrose Tumoral a, CD40 ligando o Prostaglandina E, os quais geralmente são utilizados como um coquetel de maturação. As CDs que fagocitam as células Apo-Nec da invenção incrementam a 20 migração in vitro em resposta à quemoquina ΜΙΡ-3β e à produção intracelular de IL-12. As células CD/Apo-Nec da invenção possuem capacidade para apresentar em forma cruzada antigenos tumorais nativos a antigenos CTL específicos.

Tal como foi comentado na fagocitose das células Apo-Nec pelas CDin de cada paciente induz a maturação de tais CDs.

Por outra parte, foram analisadas as linhas celulares da invenção em relação às suas capacidades clonogénicas. As 30 colônias em ágar mole da linha celular da invenção MELXY3 apresentam uma morfologia heterogênea, com baixa adesão entre as células. Observa-se uma baixa proporção de colônias melanóticas. As colônias em ágar mole da linha celular da invenção MEL-XYl apresentam uma 35 morfologia compacta, com uma alta adesão entre as células que a compõem. Dificilmente se observam colônias melanóticas. Como uma forma de caracterizar às colônias foram comparados os niveis de expressão de antigenos de melanoma normalizados respeito da expressão de β-actina nas linhas celulares da invenção e nas colônias em ágar 5 mole de tais linhas celulares. Os resultados de caracterização dos clones observam-se na Tabela 4 e figura 6.

Tabela 4

Estudo comparativo na expressão de antigenos entre as linhas celulares da invenção e as linhas clonogénicas da invenção.

Antigenos de Linhas celulares MEL-XY3 MEL-XY3 MEL-XYl MEL-XYl linha colônias linha colônias MARTI +++ + + + MAGEl + ND + ND NYESO-I +++ + + + + GP100 + ++ + + TYR + ND + ND TRP2 + * + * + * + * B-ACTINA + + + + ND: não determinado

*Dados ainda não normalizados

Segundo se pode observar existem dentro da população e de 15 cada linha celular da invenção uma sobre população de células clonogénicas, ditas células clonogénicas também se encontram dentro do alcance da presente invenção. A presença de células clonogénicas permite proporcionar ao paciente de antigenos típicos de células indiferenciadas 20 ou células-tronco denominadas também células stem.

A heterògeneidade dos tumores de melanoma é elevada, por isso resulta fundamental para a imunoterapia utilizar misturas complexas de antigenos providas pela mistura ou combinação de linhas celulares e suas sobre populações. 25 Pode-se apreciar no exemplo da figura 7 uma biopsia de melanoma primário que evidencia a heterògeneidade de ditos tumores em relação à expressão de antigenos de diferenciação melanocitica.

Quando foram tratados pacientes com a composição Apo-Nec da invenção mais BCG como adjuvante e GM-CSF como imunomodulador de acordo com o esquema que se menciona nos exemplos seguintes, observou-se que 75 % dos pacientes (estádios IIC e III) estavam livres de doença 5 com um seguimento máximo de 51 meses (ver Figura 8), e a toxicidade foi escassa e de grão 1 só.

Podem-se apreciar como exemplo os resultados de um dos pacientes do protocolo selecionado. 0 paciente #200 é de sexo feminino, raça caucásica, de 67 anos e tem feito a 10 consulta em Novembro de 2003. Em junho de 2002 foi submetido cirurgicamente por um nevo dorsal que tinha lhe crescido. A anatomia patológica evidenciou um melanoma cutâneo, nível IV de Clark, nível de Breslow 5.7 mm. Em agosto de 2002 apareceram satelitoses que foram 15 extirpadas. Foi administrado ao paciente Apo-Nec + BCG + GM-CSF, recebendo 600 yg GM-CSF (por composição) e o tratamento finalizou com escassa toxicidade. No último exame clínico se detectou um nódulo suspeito em dorso, que foi extirpado, e cuja imagem microscópica é mostrada 20 na Figura 9. Observa-se uma intensa infiltração linfóide, com região remanescentes de tumor viável, mas também uma intensa necrose do tecido tumoral, como a presença de macrófagos carregados de melanina.

Podem-se apreciar também como exemplo os resultados de um 25 paciente tratado com a composição Apo-Nec da invenção + BCG + IFN-α. 0 paciente #300 é de sexo masculino, de 17 anos de idade que consultou por adenopatia inguinal esquerda. Dois meses depois recebeu uma vacina inguinal esquerda, isolando 4/11 gânglios com metástase de 30 melanoma. Realizou-se um tratamento com interleucina-2 em baixas doses.

14 meses após do segundo esvaziamento detectou-se uma recaída em arcada inguinal esquerda, e por tal motivo se realizou uma nova cirurgia, isolando 5/7 gânglios com 35 metástase de melanoma. 0 paciente apresentava dor lombar. A tomografia axial computada revelou adenopatias retroperitoneais, realizou-se quimioterapia com esquema de Dartmouth. Finda a quimioterapia se iniciou o tratamento com a composição Apo-Nec da invenção + BCG. 14 meses após de iniciado o tratamento com a composição da invenção detectou-se um nódulo na região inguinal 5 esquerda. Novamente operado se detectou metástase de melanoma com infiltrado linfoplasmocitário abundante. O paciente continuou o tratamento com a composição Apo-Nec + IFN-α. Na figura 10 se mostra a remissão de um nódulo pulmonar esquerdo. Atualmente, o paciente se encontra 10 livre da doença.

A presente invenção divulga linhas celulares de melanoma que em combinação expressam a maioria dos antigenos associados ao melanoma, composições que compreendem tais linhas irradiadas e composições que compreendem CD 15 autólogas geradas ex vivo que fagocitaram uma mistura de células apoptóticas/necróticas das linhas celulares de melanoma.

Esta invenção está melhor ilustrada segundo os exemplos a seguir, os quais não devem ser interpretados como uma 20 limitação imposta ao alcance da mesma. Pelo contrário, deve-se entender claramente que podem se utilizar outras formas de concretização, alterações e equivalentes da mesma que após de Ier a presente descrição, pode sugerir àqueles entendidos no tema sem se afastar do espírito da 25 presente invenção e/ou alcance das reivindicações anexas. Exemplo 1: Obtenção, estabelecimento e manutenção das linhas celulares da invenção

Mel-XYl: A linha Mel-XYl foi obtida de um paciente masculino de raça caucásica, a partir de uma metástase pulmonar secundária a um melanoma primário da espalda. 0 paciente faleceu dois anos depois por causa de metástases cerebrais.

Mel-XY2: 0 paciente do qual se originou a linha tinha 44 anos e era um homem de raça caucásica que apresentava melanoma ulcerado na espalda (Clark/s nível III). Dois anos depois desenvolveu em forma simultânea adenopatias axilares e metástase pulmonar. As adenopatias axilares foram extraídas, dissociadas e deram origem à linha celular.

Mel-XY3: 0 paciente era um homem de raça caucásica de 43 anos que tinha desenvolvido um melanoma primário no 5 braço. Dois anos depois apareceram metástases de nódulos linfáticos axilares. 0 paciente recebeu quimioterapia com DTIC, sem mostrar resposta clínica alguma. As metástases axilares foram retiradas, e as células originaram a linha celular Mel-XY3.

Mel-XX4: Por cirurgia foi obtida uma adenopatia inguinal de uma mulher branca de 33 anos, essa adenopatia foi diagnosticada como uma metástase de melanoma. 0 tumor primário era desconhecido. Quinze meses depois, a paciente teve uma recorrência no nódulo linfático 15 inguinal. 0 nódulo macroscopicamente melanótico foi removido, cortado em troços pequenos, se lhes removeu o tecido grasso e conectivo e se suspenderam novamente em meio Dulbecco's Modified Tagle (DMEM), foi desagregado mecanicamente fazendo pressão numa malha de nylon e os 20 agregados celulares trataram-se enzimaticamente durante uma noite a 37°C.

As células se ressuspenderam em meio de cultivo de melanoma suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS) (Natocor, Córdoba, Argentina), semearam-se em frascos de 25 cultivo de 25 cm2 e foram incubados a 370C sob umidade e uma atmosfera de 5% C02-95% em ar. Passadas 24 hs o meio de cultivo foi retirado em função de remover as células não aderidas.

Realizaram-se quatro passagens da suspensão celular em colunas de micro esferas anti fibroblastos (Miltenyi Biotec, Germany). As células obtidas foram denominadas Mel-XX4

A manutenção das quatro linhas celulares da invenção (Mel-XYl, Mel-XY2, Mel-XY3 e Mel-XX4) se realizou mediante cultivos em meio para melanoma DMEM: mistura nutritiva F12 (1:1) suplementada com 2 mM de glutamina, nM de Selenito de sódio, 100 μΜ de ácido ascórbico, 0.3 mg/ml de galactose, 0.15 mg/ml de Piruvato de sódio e μg/ml de insulina) , 100IU/ml de penicilina, 10μς/ιη1 de estreptomicina mais 10% de soro fetal bovino (FBS) (Natocor, Córdoba, Argentina) num laboratório GMP do Centro de Investigações Oncológicas -FUCA.

Os clones CTL (HLA A*0201 restringidos) específicos para antigenos Melan A/MART-1 (M27: AAGIGILTV) e gplOO (G154: KTWGQYWQV) se esparziram em meio RPMI más 10% de soro AB humano inativo e antibióticos, em ciclos de 14 dias

utilizando 30 ng/ml de anticorpo anti-CD3 (OKT-3, BD Biosciences) e séries de 300 Ul/ml de IL-2 (Chiron BV, Amsterdam, Netherlands) cada 3 dias.

Exemplo 2: Caracterização das linhas celulares:

Cinética de crescimento in vitro:

Semearam-se IO4 células por poço em placas (Corning) de 24. Cada 2-3 dias as células foram tratadas com EDTA (0,02%), colhidas e contadas. O tempo de duplicação da população foi estimado a partir da pendente da curva de crescimento durante a fase exponencial.

Clonogenicidade

O crescimento das células não dependente da ancoragem se determina mediante o método de ágar mole (Hamburger e Slamon, Science 197: 461, 1977). Semearam-se 3-10 x IO3 células na camada superior. As placas foram incubadas 25 durante 21 dias e alimentadas cada semana com 50 μΐ de meio de cultivo. Contaram-se sob o microscópio as colônias com mais de 36 células.

Caracterização dos antigenos de melanoma mediante imunocitoquímica (ICQ) e FACS 30 Para a avaliação mediante ICQ se trataram as células em crescimento exponencial com EDTA. Foram centrifugadas, fixadas com formaldeido, embebidas em parafina e cortadas em finas seções. Logo após utilizaram-se como controle amostras de tecido normal do paciente.

Os tecidos e as células foram ensaiados com anticorpos monoclonais (Mabs) contra gueratinas, vimentina e gpl00/HMB 45 (Biogenex), MART1/Melan-A (Dako), e com anticorpos policlonais anti SlOO (Biogenex).

As reações visualizaram-se com complexos de avidinabiotina (Vectastain ABC) . As peroxidases endógenas se bloquearam com 0,6% de H2O2.

As reações de imunofluorescência indireta se realizaram ressuspendendo as células tratadas com EDTA. Logo após de bloquear com soro normal de cabra diluído em 10%, as células foram incubadas com anticorpos primários, lavadas, incubadas com anticorpos secundários 10 (imunoglobulina de cabra anti-rato - FITC (Dako) foram lavadas, fixadas em 1% de paraformaldeído e foram analisadas por FACS (FACS Vantage SE, Becton-Dickinson, USA). Os anticorpos primários foram Mabs murinos anti-p53 (D0-7, BD Pharmingen), 3F8 anti-GD2, R24 anti-GD3. No 15 caso de p53 as células foram permeabilizadas. Os antigenos leucocitários humanos (HLA) Classe I e Classe

II foram tipificados por PCR-SSP.

Determinação de antigenos associados a melanoma mediante RT-PCR:

ARN total com Trizol (Invitrogen) foi extraído. Em função de iniciar a síntese de ADNc se agregaram a l-3pg de ARN os correspondentes iniciadores e se incubaram com 200 U de enzima MMLV-RT (Promega), 25-40 U de RNAsin (Promega) e 250-500 μΜ de dNTPs (Invitrogen) durante 5 min a 70°C e 25 depois durante 60 min a 42°C. As alíquotas de ADNc (2-10 μΐ) se amplificaram com Taq DNA polymerase (Invitrogen) e usando os pares de iniciadores específicos.

Os iniciadores específicos se detalham mais em diante: GplOO

5'-GCTTGGTGTCTCAAGGCAACT-3' (SEQ ID N0 1)

5'-CTCCAGGTAAGTATGAGTGAC-3' (SEQ ID N0 2)

MART-I

5'-CAAGATGCCAAGAGAAGATGCTCACT-31 (SEQ ID N0 3)

5'-GCTTGCATTTTTCCTACACCATTCCA-3' (SEQ ID N0 4) Tirosinase

5'-TTGGCAGATTGTCTGTAGCC-3' (SEQ ID N0 5)

5'- AGGCATTGTGCATGCTGCTT-3' (SEQ ID N0 6)

5'-GTCTTTATGCAATGGAACGC-3' (SEQ ID N0 7)

5'-GCTATCCCAGTAAGTGGACT-3' (SEQ ID N0 8)

TRP-2

5'-GAGTGGTCCCTACATCCTACG-3' (SEQ ID N0 9)

5'-GCGTCCTGGTCCTAATAATGT-3' (SEQ ID N0 10)

10

MAGE-I

5'-GAGTCCTCAGGGAGCCTCC-3' (SEQ ID N0 11)

5'-TTGCCGAAGATCTCAGGAAA-3' (SEQ ID N0 12)

NY-ES0-1

5'-AGCCGCCTGCTTGAGTTCTACCTC-3" (SEQ ID N0 13)

5'-AGGGAAAGCTGCTGGAGACAG-3' (SEQ ID N0 14)

MDR-I

5'-TCCAAGAAGCCCTGGACAAAG- 3' (SEQ ID N0 15)

5'-TTGATGATGTCTCTCACTCTGTTCC-3' (SEQ ID N0 16)

MIA

51-CATGCATGCGGTCCTATGCCCAAGCTG-3' (SEQ ID N0 17)

5'-GATAAGCTTTCACTGGCAGTAGAAATC-3' (SEQ ID N0 18)

β-actina

5-'ATGTTTGAGACCTTCAACACCCC-3' (SEQ ID N0 19)

5'-GCCATCTCTTGCTCGAAGTCCAG-3' (SEQ ID N0 20)

Os iniciadores anti-sentido são detalhados numa linha mais embaixo.

Para a detenção da tirosina se amplificou além uma alíquota de 1/100 da primeira reação de PCR com iniciadores internos (nested PCR) .

Os produtos de PCR foram analisados em geles de agarose e tingidos com brometo de etídio; o tamanho dos fragmentos foi calculado em comparação com a linha de semeadura com marcadores de PM de ADN de 100 pb (Promega).

Análise citogenéticos e citomoleculares:

Para os análises citogenéticos foram incubadas as células correspondentes às quatro linhas da invenção em 5 crescimento exponencial com colchicina (0,1 pg/ml) a 37°C durante 8-16 hs, foram colhidos com uma solução de Trypsina-EDTA e processados de acordo com os protocolos padrão. Utilizou-se a técnica de bandeo-G. A identificação dos cromossomos foi levada a cabo de acordo 10 com o Sistema Internacional de Nomenclatura de Citogenética Humana (Mitelman, 1995 ISCN.: An International System for Human Cytogenetic Nomenclature, (ed. S Karger, Basel).

Exemplo 3: Geração de células dendríticas (CD) a partir de monócitos, caracterização das mesmas e carregamento com as células Apo-Nec.

As células dendríticas foram obtidas a partir de buffycoats ou de produtos de leucoféreses provenientes de doadores sãos. As células mononucleares periféricas 20 (PBMCs) foram purificadas em um gradiente de densidade de Fycoll-Hypaque. Foram ressuspendidas as PBMCs em meio fresco livre de soro AIM-V™ (Invitrogen) e deixadas aderindo-se em frascos de cultivo (TPP, Alemanha). Passadas 2 hs a 37°C, as células não aderentes foram 25 removidas e os monócitos aderimos cultivaram-se durante 5 dias em AIM-V suplementado com 800 U/ml de rhuGM-CSF e 50 ng/ml de IL-4 (Peprotech, Mexico), obtendo assim as CDin. As mudanças no fenótipo foram analisadas com microscópio óptico e FACS. Para induzir a maturação controlada das 30 CDin agregaram-se 2 μg/ml de LPS (Lipopolisacárido de E. coli J5, Sigma,St. Louis, CA) e finalmente as células foram cultivadas durante 48 hs.

A caracterização do fenótipo das células CD foi realizada quando as células estavam no estado imaturo (CDin) e logo após os ensaios de fagocitoses das células apoptóticas/necróticas (células Apo-Nec) mediante a coloração de 5 x IO5 células com anticorpos marcados com fluorocromos contra os antigenos CD14, CDllc, CDla, HLA classe II , CD80, CD86, CD83, CD40, HLA classe I e CCR7 (BD Biosciences, San Jose, CA), mediante análise por FACS, (Becton Dickinson, San Jose, CA) . Os controles de 5 isótipo correspondentes foram Rato IgG2a PE e ratão IgGl e IgG2a (BD Biosciences, San Jose, CA) . Também foi analisada a expressão de CD83 em CDs que fagocitaram células Apo/Nec, utilizou-se um anticorpo monoclonal não marcado anti-CD83 (IgGl) e o correspondente isótipo como 10 controle, no revelado se utilizou um anticorpo anti-rato IgGl-PerCP (BD Biosciences, San José, CA).

A capacidade de endocitoses das CDs foi avaliada incubando 1 x IO6 CDs com 1 mg/ml de Dextrano conjugado com FITC (Dx-FITC) (Sigma, St Louis, CA) durante 30min a 15 37°C. Após a incubação, as células com PBS foram lavadas e analisadas por FACS. Os controles incluíram CDs incubadas com Dx-FITC durante 30min a 40C para inibir o processo de endocitoses por outro lado a incorporação basal foi considerada no momento 0 do ensaio. A 20 incorporação de DX-FITC (endocitoses) foi quantificada mediante FACS.

Avaliação da fagocitose das células CDs:

As células CDin foram co-cultivadas com as células ApoNec (preparadas segundo foi mostrado anteriormente) em meio fresco AIM-V em diferentes tempos. Em alguns ensaios as CDs foram tingidas de vermelho com PKH26 e as células Apo-Nec foram tingidas de verde com PKH67 (Sigma, St. Louis, CA) . Após o co-cultivo se realizou a análise por FACS e se definiu a percentagem de CDs que fagocitaram células Apo-Nec como a percentagem de células duplas positivas. A seguir, realizaram-se os controles apropriados para cada cor. 0 controle de união inespecífica das células Apo-Nec às CDs se levou a cabo incubando as células a 40C durante os mesmos períodos de tempo.

Migração in vitro das CDs:

Foi ensaiada a migração in vitro das CDs antes e depois do co-cultivo com as células Apo-Nec, utilizando uma câmara de quimiotaxias de 48 microtubos (AP 48 Neuroprobe Inc., Gaithersburg, MD). No compartimento inferior foram colocados 10 ng/ml de MIP-Ia ou ΜΙΡ-3β (Peprotech, Rocky 5 Hill, NJ, USA) diluído em RPMI. A migração basal foi ensaiada colocando RPMI na câmara inferior. As CDs foram semeadas na câmara superior (3 x IO4 CDs/poço) em RPMI. Entre a câmara superior e inferior foi colocada uma membrana de policarbonato de 5 μπι de poro (Neuroprobe, 10 Inc., Bethesda, MD). Após 90 min a 37°C, as células da cara superior da membrana foram retiradas e as células que migraram aderidas à cara inferior da membrana foram coloreadas com Giemsa 10% diluído em água neutra. As membranas foram secadas ao ar, montadas sobre um porta15 objeto com Bálsamo de Canadá e as células migrantes foram contadas utilizando um microscópio. Analisaram-se cinco campos por microtubo a um aumento de 40X e se analisaram 3 microtubos/condições. A análise estatística se realizou utilizando o Teste de Student.

Microscopia eletrônica:

Também foi estudado o processo de fagocitoses por microscopia eletrônica. As amostras dos co-cultivos foram fixadas com glutaraldeído a 2,5% 0,1 M de buffer fosfato, e a seguir se realizou um tingido pós-fixação com 25 tetróxido de ósmio 1%, lavaram-se duas vezes com água destilada e se contrastaram com acetato de uranilo 5% durante 2 hr. Após o lavado e a desidratação as amostras foram embebidas em resina (Durkupan). Realizaram-se cortes ultrafinos (70-90 nm) , montaram-se em grades de 30 cobre e se contrastaram com citrato de chumbo de Reynold. As grades foram analisadas num microscópio eletrônico de transmissão Zeiss 109. Alternativamente, para obter figuras das células completas, obtiveram-se cortes finos (0.5 μπι) num ultramicrótomo (Reichert-Jung) , foram 35 coloreados com azul de toluidina 0,4%%, 0,1 M de buffer carbonato e montados em Durkupan e se analisaram sob um microscópio óptico (lOOOx). As fotos foram tiradas com uma câmara digital Sony Cybershot Digital (5 megapixels) e as imagens foram processadas com o programa Adobe photoshop 6.0.

Ensaio in vitro cross apresentação, secreção de IFN-γ:

Monócitos CD14 + foram purificados a 98% a partir de doadores HLA A*0201 utilizando micro-esferas anti-CD14 (Miltenyi Biotec, Germany) e se diferenciaram as células CDin mediante 5 dias de cultivo tal como foi descrito anteriormente. As células CDin foram incubadas com 10 células Apo-Nec durante 6, 12, 24 e 48hs e se defrontaram durante toda a noite a clones CTL MelanA/MART-1 ou gplOO específicos em 1 ml de meio AIMV. A secreção de IFN-γ ao sobrenadante se determinou por triplicado mediante a técnica de ELISA (OptEIA IFN-γ, Pharmingen BD 15 Biosciences, San Diego, CA) conforme recomendações do fornecedor. Realizou-se uma curva de calibração para cada experimento e a concentração das amostras foi calculada mediante a análise de regressão log-log e utilizando o software Cembal 2.2. Os controles incluíram: CDs mais 20 20 μg/ml de peptídeos MART-I ou gplOO, linhas celulares viáveis de melanoma HLA A*0201+ que exprimem os antigenos MART-I e gplOO (controles positivos) ou células CDs semeadas com peptídeos não específicos e linhas celulares viáveis de melanoma HLA A*0201+ que não exprimem os 25 correspondentes antigenos (controles negativos).

Medições das citoquinas IL-10 e IL-12

intracitoplasmáticas:

As CDs marcadas com PKH2 6 (vermelho) foram co-cultivadas com células Apo-Nec marcadas com PKH67 em diferentes 30 tempos (6, 12, 24 e 48 hs) . A medição das citoquinas acumuladas foi realizada mediante a técnica de Imunofluorescência intracelular, após o bloqueio da saída das mesmas com Brefeldina A (8hs) pós-cultivo (Golgi Plug, BD Biosciences, San José CA) . As células foram 35 permeabilizadas com 0,05% de saponina e tingidas com anti-ILlO (Isotipo IgG2a de rato)-APC e anti-IL12 subunidade p40-p70 (Isótipo IgGl de ratão)-PerCp (BD Biosciences, San José, CA) . Para os estudos por FACS a população duplamente tingida PKH26/PKH67 foi selecionada e as citoquinas foram avaliadas para essa população num experimento de quatro cores. Como controle utilizou-se o co-cultívo a 4°C.

Exemplo 4: Elaboração da composição da invenção e esquemas de aplicação:

Composição Apo-Nec:

Irradiação das linhas celulares:

As quatro linhas celulares da invenção (Mel-XYl, Mel-XY2, Mel-XY3 e Mel-XX4) foram irradiadas com irradiação gamma a 70Gy (Siemens, Instituto Alexander Fleming, Buenos Aires, Argentina), posteriormente as células foram congeladas (50% de DMEM, 40% de albumina humana e 10% de 15 DMSO) em nitrogênio líquido até sua utilização.

O dia da aplicação das células, estas se descongelaram, se lavaram e se prepararam em doses de composição que continham entre 5 - 10 x IO6 células de cada uma das linhas celulares da invenção isoladas ou combinações das mesmas ressuspendendo-as em meio DMEM

Injetaram-se 300 ul em forma intra-dérmica.

Composição CD/Apo-Nec:

Preparação de células tumorais apoptóticas/necróticas:

As células (Mel-XYl, Mel-XY2, Mel-XY3 e Mel-XX4) irradiadas e congeladas segundo foi descrito anteriormente foram descongeladas e semeadas em meio de melanoma mais soro fetal bovino a 10% até completar o processo apoptótico. Decorridas 72hs do cultivo, as células foram decoladas do fundo dos frascos, lavadas, contadas e ressuspendidas em meio fresco livre de soro AIMV™ Medium (grão terapêutico, GIBCO, Invitrogen Corporation, Grand Island, N.Y). As apoptoses e necroses foram ensaiadas mediante a técnica de união de Anexina-V FITC e incorporação de Iodeto de Propidio (IP) (Anexina-V kit de detenção de apoptose, BD Biosciences, San José, CA) e se analisou por FACS. Os ensaios clonogênicos em ágar mole se realizaram por setuplicado (1.5 x IO4 células/microtubo) em função de analisar nas células irradiadas a capacidade de proliferação em comparação com células controle não irradiadas.

Se co-cultivaram 5, 10, 15 ou 20 xlO6 CDs, segundo a dose 5 para cada paciente, com células Apo-Nec em meio AIMV durante 48h, a 37°C. No dia da aplicação as células dos co-cultivos foram centrifugadas a 1200 rpm por 5 min, ressuspendidas em meio DMEM (300 μΐ) e injetada via intra-dérmica numa das quatro extremidades que tiveram 10 intacto a drenagem dos nódulos linfáticos.

Para todas as preparações das composições se realizaram os controles de qualidade e os ensaios de esterilidade. Exemplo 5: Desenho dos estudos com pacientes e critérios de seleção:

Os estudos realizados em pacientes foram realizados para avaliar a toxicidade, viabilidade e resposta imune ao tratamento. Os estudos foram aprovados pelo conselho Revisor Institucional do Instituto Alexander Fleming, e por um comitê de ética. Os critérios de viabilidade foram 20 (a) melanoma cutâneo, histologicamente confirmado nos estádios IIB, IIC, III ou IV (AJCC) ; (b) pacientes com doença minima ou não detectável(ND) após a cirurgia avaliados por Tomografia Axial Computada e valores da enzima lactato desidrogenase (LDH). Os pacientes de 25 melanoma com primário desconhecido podiam ser incluídos no estudo; (c) idade entre 15 e 60 anos; (d) expectativa de vida > 6 meses; (e) rendimento (ECOG) 0 ou 1; (f) pacientes em estádio III tratados previamente com IFN-a que tiveram finalizado ou suspendido o tratamento por 30 causa da progressão da doença, toxicidade ou outra razão clínica ou aqueles pacientes que não iniciaram o tratamento com IFN-α seis meses antes da cirurgia (g) adequado acesso venoso para o procedimento de leucoféreses, (h) Os critérios de eleição de laboratório 35 foram: hemoglobina > 10 gr%; reconto de glóbulos brancos > 4800/mm3, plaquetas > 150.000/mm3; bilirrubina total e direta, transaminases oxalacéticas e transaminases glutâmico pirúvicas < 1.5 vezes o valor superior normal; LDH < 450 mU/ml; i) ausência de gravidez com β-HCG sérica determinada uma semana antes de cada aplicação nas mulheres pré-menopáusicas; (i) creatinina < 1.4 mg % (k) 5 sem tratamento de quimioterapia, radioterapia ou tratamento biológico durante o mês prévio; (k) sem medicação com corticosteróides ou antiinflamatórios nãoesterídeos (AINEs); (1) sem metástases de cérebro ativas; (m) ECG normal (n) todos os pacientes deviam de assinar o 10 consentimento informado.

Avaliações dos pacientes e esquema de tratamento:

A avaliação de base dos pacientes foi realizada dentro dos 35 dias prévios à primeira aplicação. A avaliação clinica incluiu uma historia médica clínica completa, 15 exame físico, eletrocardiogramas (ECG), Tomografia Axial Computada (tórax, abdome, pélvis e cérebro), determinação do estádio tumoral, tamanho do tumor e documentação dos sítios de doença, exame químico de sangue e hematologia. Os pacientes selecionados foram submetidos a leucoféreses 20 para obter PBMC para gerar CDs.

Os pacientes receberam 4 aplicações de CD/Apo-Nec em intervalos de 2 semanas. A inoculação se realizou via intradérmica (300 μΐ) com cada dose se ensaiaram testes de DTH que consistiram na inoculação no antebraço de 25 entre 5 e 20xl06 células CD/Apo-Nec sem adjuvante. Analisaram-se os signos vitais e as reações cutâneas da DTH às 2, 24 e 48 hs pós-aplicação. No dia 70 se investigou o status dos pacientes mediante ecografia abdominal e raios X do tórax e ao dia 75 os pacientes 30 finalizaram o protocolo com um exame clínico.

Para as aplicações das células Apo/Nec da invenção os pacientes foram injetados de forma intra-dérmica (id) numa das extremidades com gânglios linfáticos intactos. Vinte (20) pacientes receberam uma dose de 400 μg rhGMCSF (100 μς por dia, quatro dias) . No dia da aplicação,

0,1 ml de hGM-CSF foi misturado com Apo-Nec (16 x IO6 células irradiadas em 0,3 ml) e BCG (1 x IO6 unidades formadoras de colônias) em 0,05 ml) . Durante os 3 dias seguintes, 0.1 ml de rhGM-CSF se injetou i.d. no lugar da aplicação. Cada paciente recebeu 4 aplicações a cada 3 semanas, logo após 1 composição a cada dois meses durante 5 um ano, 1 composição a cada três meses durante o segundo ano e após continuaram com 1 composição a cada 6 meses. Análise estatística:

Todos os resultados adversos foram classificados de acordo a os Critérios Comuns de Toxicidade do Instituto Nacional do Câncer (NCI).

A população avaliada foi definida como todos os pacientes que receberam as quatro aplicações. Devido a que a maioria dos dados dos pacientes não se encontravam distribuídos com normalidade, todos eles foram analisados

utilizando o teste de Wilcoxon's Rank Sum. O valor de DTH dos diferentes grupos que receberam diferente quantidade de CDs/Apo-Nec foi comparado entre cada grupo mediante ANOVA de uma variável e o teste de comparações múltiples de Dunnett. Considerou-se como significativo um valor de 20 P < 0.05.

Métodos para avaliar a resposta imunológica dos pacientes tratados:

Para avaliar a resposta imune dos pacientes, se obteve soro o dia 7 prévio à aplicação (soro pré), e o dia 15 posterior à finalização do tratamento (soro pós), as amostras foram conservadas a -80°C. As células PBMC se purificaram mediante uma gradiente de Ficoll-Hypaque e posterior centrifugação a partir de leucoféreses (préaplicação) ou a partir de 100 ml de sangue tomados 15 dias posteriores à última doses (pós-aplicação), os PBMC foram congelados em 50% de DMEM, 4 0% de albumina humana e 10% de DMSO até serem utilizados nos ensaios imunológicos. A tipificação HLA de HLA-A*0201 foi determinada logo após de uma incubação das amostras dos pacientes com anticorpos monoclonais de ratão antiHLA*A0201 conjugados com FITC (BD-Pharmingen, San Jose, CA) . Reação DTH:

Cada um dos dias de aplicação se realizou um teste de DTH no antebraço com 2xl06 células Apo-Nec e a reação foi avaliada às 2, 24 e 48hs pós-aplicação. Estabeleceu-se o valor de intensidade DTH da seguinte maneira: 0: eritema < 0.5 cm;

1: eritema macular 0.5-1.0 cm; (2) eritema macular 1.0-2.0 cm; 3: eritema macular > 2.0 cm o eritema papular <1.5 cm; 4: eritema papular > 1.5 cm. 0 store DTH corresponde ao somatório de todas as intensidades DTH individuais/4. Ensaio de proliferação:

Foram obtidos PBMC pré- e pós-composição mediante uma gradiente de densidade de Ficoll-Hypaque e foram conservados congelados em nitrogênio líquido até a sua 15 utilização. Para os ensaios as células foram descongeladas e incubadas num meio AIM-V (Gibco, Grand Island, NY) durante Ihr a 37°C. Semearam-se 5xl05 células em estantes de 96 microtubos em presença ou ausência de fitohemoaglutinina (PHA) (5 μg/ml) (Gibco, Grand Island, 20 NY) e se incubaram a 37°C por 72 hs. Durante as últimas

16 hs, as células foram pulsadas com (3H)dThd (Amersham,

1 μCi/microtubo) e logo após a Iise celular mediu-se a radiatividade incorporada ao ADN (Cell Harvester, Nunc, Rochester, NY), num contador de cintilação liquida.

Determinação de citoquinas:

As concentrações de IL-10 e IL-12 se determinaram no soro dos pacientes prévio à aplicação (soro pré-aplicação) e duas semanas após da quarta aplicação (soro pósaplicação) . Os soros foram congelados a -80°C até 30 realizar o ensaio ELISA (OptEIA IL-IO and IL-12, BD Biosciences, San Diego, CA). Para cada ensaio se realizou uma curva de calibração e a concentração da amostra se calculou mediante uma analise de regressão lineal log-log usando o software Cembal 2.2.

Medição de IFN-γ pela técnica de ELISpot:

Como estimuladores, se purificaram células CD14+ a partir de PBMC de pacientes HLA-A2 positivos usando microesferas recobertas com anti-CDl4 (Miltenyi Biotec, Paris France), foram cultivadas 5 dias em meio sintético SYN-H (AbCys, Paris, France) com 100 ng/ml de GM-CSF e 20 ng/ml de IL

4, e se maturaram com 10 μg/ml de LPS durante 48hs 5 adicionais. As CDs maduras foram pulsadas durante Ihr a 370C com 10 μg/ml do peptídeo correspondente diluido em meio SYH-H, logo foram lavadas e misturadas com PBMC até atingir uma relação E/T de 10:1, usando um total de IO5 linfócitos CD8+ células/microtubos.

Rechearam-se estantes de 96 microtubos de nitrocelulose (MAIPS 450; Millipore, Bedford, MA) durante toda a noite a 4 0C com 10 μς/ml de mAb anti-IFN-γ humano (Mabtech, Nacka, Sweden) em buffer carbonato-bicarbonato pH 9.6, foram lavadas e bloqueadas com meio IMDM + 10% soro 15 humano AB (Biowest, Nuaille, France) por Ihr a 37°C. As células de efeito foram semeadas em 100 μL de meio e se agregaram células Branco até atingir uma relação E/T de 10:1, num total de 200 μL/microtubo. Decorridas 24hs de incubação, os microtubos foram lavados 5 vezes com 0,1% 20 de Tween-20 em PBS. As placas foram incubadas durante 2hs a temperatura ambiente com 1 μg/ml de mAb de ratão antiIFN-γ humano biotinilado (Mabtech) em PBS/HSA (0,4 g/L). Após vários lavados com 0,1% de Tween-20 em PBS, se agregou 1:1000 de fosfatase alcalina-estreptavidina 25 (Mabtech) em PBS/HSA e se incubou durante Ihr a temperatura ambiente. Logo após as placas foram lavadas e se lhes agregou o substrato 5-bromo-4-cloro-3-indol fosfato/nitroazul de tetrazólio durante 30 minutos a temperatura ambiente (Mabtech). O desenvolvimento da cor 30 foi detido lavando as placas com água. Logo após serem secadas foram cortadas as células T CD8 + que secretam IFN-γ, visualizada por um ponto de cor na membrana de nitrocelulose, usando o leitor de sistema de leitura automática de imagens ELISpot (AID, Strassberg, Germany). 35 Coloração com tetrâmeros HLA/peptídeos:

Utilizaram-se os tetrâmeros HLA-A0201 para identificar clones de linfócitos T CD8+ específicos para MART-I (AAGIGILTV) ou gp-100 (KTWGQYWQV) conjugados com PE (ficoeritrina) ou APC (aloficocianina) respectivamente. O procedimento de coloração se realizou a 37°C por 15 minutos e em seguida foi colocado em gelo. Logo após, as 5 amostras foram incubadas com anti-CD8 FITC (BD Biosciences, San Jose CA) a 4°C durante 40 minutos adicionais e se analisaram mediante FACS. Os controles positivos se realizaram com clones CTL (HLA A*0201 restritos) específicos para os antigenos MART-I (M27: 10 AAGIGILTV) e gplOO (G154: KTWGQYWQV) expandidos em ciclos de 14 dias em meio RPMI em presença de anticorpos antiCD3 (OKT-3, BD Biosciences) a 30 ng/ml e séries de IL-2 (Chiron BV) a 300 Ul/ml cada 3 dias, mais 10% soro AB humano inativo e antibióticos. Os controles negativos 15 foram realizados com amostras de PBMC de doadores HLAA0201 sãos.

Determinação da resposta humoral:

As células viáveis que compreendem células Apo-Nec, foram misturadas em proporções iguais, se bloquearam com soro de coelho a 10% por 30 min e se incubaram com soro pré- e pós-aplicação diluído 1/10 por 1 hr a 4°C. Depois foram lavados, e as células se incubaram com um anticorpo anti imunoglobulinas humanas (IgG+A+M) feito em coelho (DakoCytomation, Glostrup, DK) por Ihr a 4 0C. As células foram lavadas, fixadas em paraformaldehido a 1% e se analisaram por FACS. De forma alternativa, as células primeiro foram permeabilizadas com saponina a 0,05% (Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO) em PBS na etapa de bloqueio e a seguir se agregou 0,05% de saponina/PBS em cada uma logo após da etapa de reação. O soro normal foi usado como controle do primeiro anticorpo.

Prepararam-se extratos protéicos a partir das linhas celulares Apo-Nec da invenção. Os pellets celulares se congelaram a -80°C, logo após foram descongelados e se 35 trataram durante 20 min a 4°C com buffer de lises (50 mM Tris-ClH pH7.5, 1% de NP40, 150 mM de NaCl, 5 mM de EDTA e I mM de PMSF) . A suspensão foi homogeneizada com um Polytron (Brinkmann Instruments, USA) e foi centrifugada durante 40 min a 10.000 g. 0 sobrenadante em alíquotas congeladas se conservou a -20 °C. A concentração protéica foi medida segundo o método de Lowry. Prepararam-se da 5 mesma forma extratos protéicos da linha celular de carcinoma de mama humano IIB-BR-G.

Os extratos protéicos foram corridos (50 μg) numa gradiente SDS-PAGE 3%-12% e foram transferidos a membranas de nitrocelulose (poro 0.45 μιη, Sigma-Aldrich, 10 Saint Louis, MO, USA). Logo após serem bloqueadas com leite bovina desnatada a 3% (Moliko, Argentina), foram incubadas durante toda a noite a 40C com soro do paciente diluído 1/10. Logo após de vários lavados as membranas se incubaram com um anticorpo anti IgG + A + M humanas feito 15 em cabra conjugada com peroxidase de rábano picante (HRP) (Zymed, San Francisco, CA) e se revelaram com 4-C1- naftol mais H2O2.

Análise histopatológicos das metástases de melanoma: Utilizaram-se biopsias embebidas em parafina para analisar as células linfóides e a'infiltração de células CDs. Entre três e cinco seções foram coloreadas com hematoxilina/eosina ou sofreram imuno-coloração com anticorpos anti-CD4 (clone 1F6), anti-CD8 (clone C8E144b), anti-CD20 (clone L26), anti-CDla (clone 010) (DakoCytomation, Glostrup, DK) e anti-CD57 (clone NKl, Zymed, San Francisco, CA) e se revelaram com o reativo ABC e diaminobenzidina (DAB) ou Novared como substrato (Vectastain, Vector, Burlingame, CA). Realizaram-se a modo de controle reações omitindo os anticorpos primários. As seções se analisaram sob um microscópio Olympus BX4 0.

Claims

1. Linha celular de melanoma humano para o tratamento de doenças malignas, caracterizada pelo fato de que essa linha celular é escolhida dentre o grupo compreendido por (a) Mel-XYl (depositada em German Collection of Microorganisms and Cell Cultures DSMZ sob o número de acesso DSM ACC2830), (b) Mel-XY2 (depositada em German Collection of Microorganisms and Cell Cultures DSMZ sob o número de acesso DSM ACC2831), (c) Mel-XY3 (depositada em German Collection of Microorganisms and Cell Cultures DSMZ sob o número de acesso DSM ACC2832), (d) Mel-XX4 (depositada em German Collection of Microorganisms and Cell Cultures DSMZ sob o número de acesso DSM ACC2829) e (e) subpopulações das mesmas.

2. Linha celular, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a linha celular Mel-XYl depositada em German Collection of Microorganisms and Cell Cultures DSMZ sob o número de acesso DSM ACC2830.

3. Linha celular, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que é a linha celular Mel-XY2 depositada em German Collection of Microorganisms and Cell Cultures DSMZ sob o número de acesso DSM ACC2831.

4. Linha celular, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que é a linha celular Mel-XY3 depositada em German Collection of Microorganisms and Cell Cultures DSMZ sob o número de acesso DSM ACC2832.

5. Linha celular, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que é a linha celular Mel-XX4 depositada em German Collection of Microorganisms and Cell Cultures DSMZ sob o número de acesso DSM ACC2829.

6. Linha celular, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizada pelo fato de que a linha celular foi irradiada e é incapaz de proliferar.

7. Linha celular, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizada pelo fato de que essa linha celular compreende uma população de células com fenótipo apoptótico.

8. Linha celular, de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelo fato de que a população de células apoptóticas compreende uma quantidade de entre 35% e 60% dessas células.

9. Linha celular, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizada pelo fato de que essa linha celular compreende uma população de células com fenótipo necrótico.

10. Linha celular, de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pelo fato de que a população de células necróticas compreende uma quantidade de entre 10% e 25% dessas células.

11. Linha celular, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a subpopulação compreende células de melanoma humano capazes de formar colônias em ágar mole.

12. Composição para o tratamento do melanoma, caracterizada pelo fato de que compreende pelo menos uma linha celular de melanoma alogeneica escolhidas dentre o grupo compreendido (a) Mel-XYl (depositada em German Collection of Microorganisms and Cell Cultures DSMZ sob o número de acesso DSM ACC2830), (b) Mel-XY2 (depositada em German Collection of Microorganisms and Cell Cultures DSMZ sob o número de acesso DSM ACC2831) , (c) Mel-XY3 (depositada em German Collection of Microorganisms and Cell Cultures DSMZ sob o número de acesso DSM ACC2832), (d) Mel-XX4 (depositada em German Collection of Microorganisms and Cell Cultures DSMZ sob o número de acesso DSM ACC2829) e combinações das mesmas, sendo que tais linhas celulares são incapazes de proliferar.

13. Composição, de acordo com a reivindicação 12, caracterizada pelo fato de que compreende além excipientes, adjuvantes e modificadores de resposta imune.

14. Composição, de acordo com a reivindicação 13, caracterizada pelo fato de que o adjuvante é BCG.

15. Composição, de acordo com a reivindicação 13, caracterizada pelo fato de que o modificador de resposta imune é escolhido dentre o grupo compreendido por GM-CSF, G-CSF, IFNa, ciclofosfamida e misturas dos mesmos.

16. Composição, de acordo com a reivindicação 12, caracterizada pelo fato de que tal linha celular foi irradiada.

17. Composição, de acordo com a reivindicação 12, caracterizada pelo fato de que tal linha celular compreende uma população de células com fenótipo apoptótico.

18. Composição, de acordo com a reivindicação 17, caracterizada pelo fato de que a população de células apoptóticas compreende uma quantidade dentre 35% e 60% de tais células.

19. Composição, de acordo com a reivindicação 12, caracterizada pelo fato de que tal linha celular compreende uma população de células com fenótipo necrótico.

20. Composição, de acordo com a reivindicação 19, caracterizada pelo fato de que a população de células necróticas compreende uma quantidade dentre 10% e 25% de tais células.

21. Composição, de acordo com a reivindicação 12, caracterizada pelo fato de que compreende pelo menos uma combinação das linhas celulares de melanoma alogeneicas (a) Mel-XYl (depositada em German Collection of Microorganisms and Cell Cultures DSMZ sob o número de acesso DSM ACC2830), (b) Mel-XY2 (depositada em German Collection of Microorganisms and Cell Cultures DSMZ sob o número de acesso DSM ACC2831), (c) Mel-XY3 (depositada em German Collection of Microorganisms and Cell Cultures DSMZ sob o número de acesso DSM ACC2832) e (d) Mel-XX4 (depositada em German Collection of Microorganisms and Cell Cultures DSMZ sob o número de acesso DSM ACC2829) , onde essas linhas celulares foram irradiadas e são incapazes de proliferar.

22. Composição, de acordo com a reivindicação 21, caracterizada pelo fato de que compreende, além do mais, excipientes, adjuvantes e modificadores de resposta imune.

23. Composição, de acordo com a reivindicação 12, caracterizada pelo fato de que compreende pelo menos uma combinação das linhas celulares de melanoma alogeneicas (a) Mel-XYl (depositada em German Collection of Microorganisms and Cell Cultures DSMZ sob o número de acesso DSM ACC2830), (b) Mel-XY2 (depositada em German Collection of Microorganisms and Cell Cultures DSMZ sob o número de acesso DSM ACC2831) e (c) Mel-XY3 (depositada em German Collection of Microorganisms and Cell Cultures DSMZ sob o número de acesso DSM ACC2832), onde tais linhas celulares foram irradiadas e são incapazes de proliferar.

24. Composição, de acordo com a reivindicação 23, caracterizada pelo fato de que compreende, além do mais, excipientes, adjuvantes e modificadores de resposta imune.

25. Composição para o tratamento adjuvante do melanoma, caracterizada pelo fato de que compreende pelo menos uma linha celular de melanoma alogeneica escolhida dentre o grupo compreendido (a) Mel-XYl (depositada em German Collection of Microorganisms and Cell Cultures DSMZ sob o número de acesso DSM ACC2830) , (b) Mel-XY2 (depositada em German Collection of Microorganisms and Cell Cultures DSMZ sob o número de acesso DSM ACC2831), (c) Mel-XY3 (depositada em German Collection of Microorganisms and Cell Cultures DSMZ sob o número de acesso DSM ACC2832), (d) Mel-XX4 (depositada em German Collection of Microorganisms and Cell Cultures DSMZ sob o número de acesso DSM ACC2829) e combinações das mesmas.

26. Composição, de acordo com a reivindicação 25, caracterizada pelo fato de que essa linha celular foi irradiada e é incapaz de proliferar.

27. Composição, de acordo com a reivindicação 25, caracterizada pelo fato de que essa linha celular compreende uma população de células com fenótipo apoptótico.

28. Composição, de acordo com a reivindicação 27, caracterizada pelo fato de que a população de células apoptóticas compreende uma quantidade dentre 35% e 60% dessas células.

29. Composição, de acordo com a reivindicação 25, caracterizada pelo fato de que essa linha celular compreende uma população de células com fenótipo necrótico.

30. Composição, de acordo com a reivindicação 29, caracterizada pelo fato de que possui uma população de células necróticas em uma quantidade dentre 10% e 25%.

31. Composição, de acordo com a reivindicação 25, caracterizada pelo fato de que compreende, além do mais, excipientes, adjuvantes e modificadores de resposta imune.

32. Composição, de acordo com a reivindicação 31, caracterizada pelo fato de que o adjuvante é BCG.

33. Composição, de acordo com a reivindicação 31, caracterizada pelo fato de que o modificador de resposta imune é escolhido dentre o grupo compreendido por GM-CSF, G-CSF, IFNa, ciclofosfamida e misturas dos mesmos.

34. Composição, de acordo com a reivindicação 25, caracterizada pelo fato de que compreende pelo menos uma mistura das Linhas celulares de melanoma alogeneicas (a) Mel-XYl (depositada em German Collection of Microorganisms and Cell Cultures DSMZ sob o número de acesso DSM ACC2830), (b) Mel-XY2 (depositada em German Collection of Microorganisms and Cell Cultures DSMZ sob o número de acesso DSM ACC2831), (c) Mel-XY3 (depositada em German Collection of Microorganisms and Cell Cultures DSMZ sob o número de acesso DSM ACC2832) e (d) Mel-XX4 (depositada em German Collection of Microorganisms and Cell Cultures DSMZ sob o número de aceso DSM ACC2829), onde tais linhas celulares foram irradiadas e são incapazes de proliferar.

35. Composição, de acordo com a reivindicação 34, caracterizada pelo fato de que compreende, além do mais, excipientes, adjuvantes e modificadores de resposta imune.

36. Composição, de acordo com a reivindicação 25, caracterizada pelo fato de que compreende pelo menos uma mistura das linhas celulares de melanoma alogeneicas (a) Mel-XYl (depositada em German Collection of Microorganisms and Cell Cultures DSMZ sob o número de acesso DSM ACC2830), (b) Mel-XY2 (depositada em German Collection of Microorganisms and Cell Cultures DSMZ sob o número de acesso DSM ACC2831) e (c) Mel-XY3 (depositada em German Collection of Microorganisms and Cell Cultures DSMZ sob o número de acesso DSM ACC2832) , onde tais linhas celulares foram irradiadas e são incapazes de proliferar.

37. Composição, de acordo com a reivindicação 36, caracterizada pelo fato de que compreende, além do mais, excipientes, adjuvantes e modificadores de resposta imune.

38. Composição, de acordo com a reivindicação 25, caracterizada pelo fato de que é empregada como tratamento adjuvante em combinação com tratamentos escolhidos do grupo compreendido por cirurgia, radioterapia, quimioterapia, bioquimioterapia e imunoterapia.

39. Composição para o tratamento de melanomas humanos, caracterizada pelo fato de que compreende células dendríticas autólogas maduras, células dendríticas autólogas carregadas com células de pelo menos uma linha celular de melanoma humano heterólogo, células apoptóticas dessas pelo menos uma linha celular de melanoma humano heterólogo e células necróticas dessas pelo menos uma linha celular de melanoma humano heterólogo.

40. Composição, de acordo com a reivindicação 39, caracterizada pelo fato de que a linha celular de melanoma humano é escolhida dentre o grupo compreendido por (a) Mel-XYl (depositada em German Collection of Microorganisms and Cell Cultures DSMZ sob o número de acesso DSM ACC2830), (b) Mel-XY2 (depositada em German Collection of Microorganisms and Cell Cultures DSMZ sob o número de acesso DSM ACC2831), (c) Mel-XY3 (depositada em German Collection of Microorganisms and Cell Cultures DSMZ sob o número de acesso DSM ACC2832), (d) Mel-XX4 (depositada em German Collection of Microorganisms and Cell Cultures DSMZ sob o número de acesso DSM ACC2829), (e) subpopulações das mesmas e combinações de (a) a (d).

41. Composição, de acordo com a reivindicação 39, caracterizada pelo fato de que as células dendríticas maduras possuem o fenótipo CD14-, CDllc+, CDla+ e CD83+.

42. Composição, de acordo com a reivindicação 39, caracterizada pelo fato de que compreende além excipientes, adjuvantes e modificadores de resposta imune.

43. Composição para o tratamento adjuvante de melanomas humanos, caracterizada pelo fato de que compreende células dendríticas maduras, células dendríticas carregadas com células de pelo menos uma linha celular de melanoma humano heterólogo, células apoptóticas de uma linha celular de melanoma humano heterólogo e células necróticas de uma linha celular de melanoma humano heterólogo.

44. Composição, de acordo com a reivindicação 43, caracterizada pelo fato de que a linha celular é escolhida dentre o grupo compreendido por (a) Mel-XYl (depositada em German Collection of Microorganisms and Cell Cultures DSMZ sob o número de acesso DSM ACC2830), (b) Mel-XY2 (depositada em German Collection of Microorganisms and Cell Cultures DSMZ sob o número de acesso DSM ACC2831), (c) Mel-XY3 (depositada em German Collection of Microorganisms and Cell Cultures DSMZ sob o número de acesso DSM ACC2832),(d) Mel-XX4 (depositada em German Collection of Microorganisms and Cell Cultures DSMZ sob 〇 numero de acesso DSM ACC2829) r (e) subpopulagoes das mesmas e combinagoes de (a) a (d).

45. Composigao7 de acordo com a reivindicagao 43, caracterizada pelo fato de que as celulas dendriticas maduras possuem o fenotipo CD14-, CDllc+, CDla+ e CD83+.

46. Composigaof de acordo com a reivindicagao 43, caracterizada pelo fato de que compreende alem do mais, excipientes, adjuvantes e modificadores de resposta imune.

47. Composigaof de acordo com a reivindicagao 43 cdracterizdda pelo fato de que essa composicpao se utiliza como tratamento adjuvante em combinagao com tratamentos escolhidos dentre o grupo compreendido por cirurgia, radioterapia, quimioterapia, bioquimioterapia e imunoterapia.

48. Procedimento para a preparagao da composigao para 〇 tratamento de melanomas, conforme definida em qualquer uma das reivindicagoes 12, 21, 23, 25, 34 ou 36 caracterizado pelas etapas de: a) descongelar e cultivar as linhas celulares (a) Mel-XYl (depositada em German Collection of Microorganisms and Cell Cultures DSMZ sob o numero de acesso DSM ACC2830), (b) Mel-XY2 (depositada em German Collection of Microorganisms and Cell Cultures DSMZ sob o numero de acesso DSH ACC2831) e (c) Mel-XY3 (depositada em German Collection of Microorganisms and Cell Cultures DSMZ sob o numero de acesso DSM ACC2832); b) misturar essas tres Linhas celulares; c) irradiar essas tres Linhas celulares; d) adicionar a mistura de linhas celulares adjuvantes e excipientes.

49. Procedimento, de acordo com a reivindicagao 48, caracterizado pelo fato de que as celulas sao irradiadas a um valor dentre 50 e 100 Gy.

50. Procedimento^ de acordo com a reivindicagao 48, caracterizado pelo fato de que o adjuvante e BCG.

51. Procedimento, de acordo com a reivindicagao .48, caracterizado pelo fato de que na etapa d) acrescenta-se além um modificador de resposta imune.

52. Procedimento, de acordo com a reivindicação 51, caracterizado pelo fato de que o modificador de resposta imune é selecionado do grupo compreendido por GM-CSF, GCSF, IFNa, ciclofosfamida e misturas dos mesmos.

53. Procedimento, de acordo com a reivindicação . 48, caracterizado pelo fato de que a etapa a) compreende além a linha Mel-XX4 (depositada em German Collection of Microorganisms and Cell Cultures DSMZ sob o número de acesso DSM ACC2829)

54. Procedimento para preparar a composição, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 39 ou 43, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: a) descongelar e cultivar as linhas celulares (a) Mel-XYl (depositada em German Collection of Microorganisms and Cell Cultures DSMZ sob o número de acesso DSM ACC2830) , (b) Mel-XY2 (depositada em German Collection of Microorganisms and Cell Cultures DSMZ sob o número de acesso DSM ACC2831), (c) Mel-XY3 (depositada em German Collection of Microorganisms and Cell Cultures DSMZ sob o número de acesso DSM ACC2832) e Mel-XX4 (depositada em German Collection of Microorganisms and Cell Cultures DSMZ sob o número de acesso DSM ACC2829); b) misturar essas linhas celulares; c) irradiar essas linhas celulares; d) obter células dendríticas autólogas; e e) co-cultivar durante um tempo as células dendríticas autólogas com as linhas celulares irradiadas da etapa c).

55. Procedimento, de acordo com a reivindicação .54, caracterizado pelo fato de que as células são irradiadas a um valor dentre 50 e 100 Gy.

56. Procedimento, de acordo com a reivindicação .54, caracterizado pelo fato de que o co-cultivo se realiza a uma temperatura dentre 35 e 39°C e durante um tempo dentre 6 e 72 horas.

57. Procedimento, de acordo com a reivindicação54, caracterizado pelo fato de que na etapa e) a relação entre células dendríticas autólogas e as linhas celulares é desde 1:1 a 3:1.

58. Procedimento, de acordo com a reivindicação54, caracterizado pelo fato de que as células dendríticas da etapa e) compreendem células dendríticas imaturas.

59. Método para induzir uma resposta imune antitumoral em pacientes que portam melanoma, caracterizado pelo fato de que compreende ministrar a um paciente, que o precisar, uma quantidade efetiva de uma combinação das linhas celulares (a) Mel-XYl (depositada em German Collection of Microorganisms and Cell Cultures DSMZ sob o número de acesso DSM ACC2830), (b) Mel-XY2 (depositada em German Collection of Microorganisms and Cell Cultures DSMZ sob o número de acesso DSM ACC2831) e (c) Mel-XY3 (depositada em German Collection of Microorganisms and Cell Cultures DSMZ sob o número de acesso DSM ACC2832), no qual essas linhas celulares são incapazes de proliferar.

60. Método de tratamento, de acordo com a reivindicação 59, caracterizado pelo fato de que é ministrado de forma intradérmica.

61. Método de tratamento, de acordo com a reivindicação 59, caracterizado pelo fato de que é ministrado conjuntamente com um adjuvante.

62. Método de tratamento, de acordo com a reivindicação 61, caracterizado pelo fato de que o adjuvante é BCG em uma quantidade entre 0,1 e 2 x 106 unidades formadoras de colônias por dose de aplicação.

63. Método de tratamento, de acordo com a reivindicação 59, caracterizado pelo fato de que é ministrado conjuntamente com um imunomodulador.

64. Método de tratamento, de acordo com a reivindicação 63, caracterizado pelo fato de que o imunomodulador é GM-CSF numa quantidade dentre 100 e 600 μg por dose de aplicação.

65. Método de tratamento, de acordo com a reivindicação 59, caracterizado pelo fato de que a quantidade efetiva de células compreende entre 5 e 50 x 106 da combinação de células.

66. Método para induzir uma resposta imune antitumoral em pacientes que portam melanoma, caracterizado pelo fato de que compreende administrar a o paciente que o precisar uma quantidade efetiva de uma combinação das linhas celulares (a) Mel-XYl (depositada em German Collection of Microorganisms and Cell Cultures DSMZ sob o número de acesso DSM ACC2830), (b) Mel-XY2 (depositada em German Collection of Microorganisms and Cell Cultures DSMZ sob o número de acesso DSM ACC2831), (c) Mel-XY3 (depositada em German Collection of Microorganisms and Cell Cultures DSMZ sob o número de acesso DSM ACC2832) e (d) Mel-XX4 (depositada em German Collection of Microorganisms and Cell Cultures DSMZ sob o número de acesso DSM ACC2829), no qual essas linhas celulares são incapazes de proliferar.

67. Método de tratamento, de acordo com a reivindicação 66, caracterizado pelo fato de que é ministrado de forma intradérmica.

68. Método de tratamento, de acordo com a reivindicação 66, caracterizado pelo fato de que é ministrado juntamente com um adjuvante.

69. Método de tratamento, de acordo com a reivindicação 66, caracterizado pelo fato de que o adjuvante é BCG numa quantidade entre 0,1 e 2 x 106 unidades formadoras de colônias por dose de aplicação.

70. Método de tratamento, de acordo com a reivindicação 66, caracterizado pelo fato de que é ministrado juntamente com um imunomodulador.

71. Método de tratamento, de acordo com a reivindicação 66, caracterizado pelo fato de que o imunomodulador é GM-CSF em uma 100 e 600 μg por dose de aplicação.

72. Método de tratamento, de acordo com a reivindicação 66, caracterizado pelo fato de que a quantidade efetiva de células compreende entre 5 e 50 x 106 da combinação de células.

73. Método para induzir uma resposta imune antitumoral em pacientes que portam melanoma, caracterizado pelo fato de que compreende ministrar a um paciente que o precisar uma quantidade efetiva de um cocultivo dentre 6 e 72 horas de células dendríticas autólogas e uma combinação das linhas celulares (a) MelXYl (depositada em German Collection of Microorganisms and Cell Cultures DSMZ sob o número de acesso DSM ACC2830), (b) Mel-XY2 (depositada em German Collection of Microorganisms and Cell Cultures DSMZ sob o número de acesso DSM ACC2831), (c) Mel-XY3 (depositada em German Collection of Microorganisms and Cell Cultures DSMZ sob o número de acesso DSM ACC2832) e (d) Mel-XX4 (depositada em German Collection of Microorganisms and Cell Cultures DSMZ sob o número de acesso DSM ACC2829), no qual essas linhas celulares são incapazes de proliferar.

74. Método, de acordo com a reivindicação 73, caracterizado pelo fato de que as células dendríticas autólogas, ao início do co-cultivo, são células dendríticas imaturas e, ao finalizar o co-cultivo, são uma mistura de células dendríticas autólogas maduras e células dendríticas autólogas carregadas com as linhas celulares (a) Mel-XYl (depositada em German Collection of Microorganisms and Cell Cultures DSMZ sob o número de acesso DSM ACC2830), (b) Mel-XY2 (depositada em German Collection of Microorganisms and Cell Cultures DSMZ sob o número de acesso DSM ACC2831), (c) Mel-XY3 (depositada em German Collection of Microorganisms and Cell Cultures DSMZ sob o número de acesso DSM ACC2832) e (d) Mel-XX4 (depositada em German Collection of Microorganisms and Cell Cultures DSMZ sob o número de acesso DSM ACC2829).

75. Método, de acordo com a reivindicação 73, caracterizado pelo fato de que ao finalizar o co-cultivo as células de cada linha celular compreendem uma mistura de populações de células apoptóticas e populações de células necróticas.

76. Método, de acordo com a reivindicação 73, caracterizado pelo fato de que é ministrado em forma intradérmica.

77. Método, de acordo com a reivindicação 73, caracterizado pelo fato de que a quantidade efetiva de células do co-cultivo compreende entre 5 e 50 x 106 células totais.