BRPI0809767B1 - Composição para o tratamento do melanoma, composição para o tratamento de melanomas humanos, procedimento para preparação da composição e procedimento para preparar a composição para tratamento de melanomas humanos - Google Patents
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Abstract
LINHA CELULAR DE MELANOMA HUMANO PARA O TRATAMENTO DE DOENÇAS MALIGNAS, COMPOSIÇÃO PARA O TRATAMENTO DO MELANOMA, COMPOSIÇÃO PARA O TRATAMENTO DE MELANOMAS HUMANOS, PROCEDIMENTO PARA A PREPARAÇÃO DA COMPOSIÇÃO, PARA O TRATAMENTO DE MELANOMAS, USO DE UMA COMBINAÇÃO DE LINHAS CELULARES, USO DE UMA QUANTIDADE EFETIVA DE UMA COMBINAÇÃO DE LINHAS CELULARES E USO DE UMA QUANTIDADE EFETIVA DE UM CO-CULTIVO. Linhas celulares, composições para o tratamento e melanomas que as compreendem, procedimentos para preparar as composições e métodos de tratamento. Mais especificamente a invenção se refere a várias linhas celulares de melanoma humano para o tratamento de doenças malignas, nas quais as linhas celulares são: (a) Mel-XYl (depositada em German Collection of Micriirganisms and Cell Cultures DSMZ sob o número de acesso DSM ACC2830), (b) Mel-XY2 (depositada em German Collection of Microorganisms and Cell Cultures DSMZ sob o número de acesso DSM ACC2831), (c) Mel-XY3 (depositada em German Collection of Microorganisms and Cell Cultures DSMZ sob o número de acesso DSM ACC2832), (d) Mel-XX4 (depositada em German Collection of Microorganisms and Cell Cultures DSMZ sob o número de acesso DSM ACC2829) ou (e) subpopulações das mesmas. As linhas celulares podem ser irradiadas obtendo-(...).
Description
[001] A presente invenção refere-se a linhagens celulares, composições para o tratamento de melanomas que as compreendem, procedimentos para preparar as composições e métodos de tratamento. Mais preferencialmente a invenção refere-se a várias linhagens celulares de melanoma humano para o tratamento de doenças malignas, sendo as linhagens celulares: (a) Mel-XY1 (depositada em German Collection of Microorganisms and Cell Cultures DSMZ sob o número de acesso DSM ACC2830), (b) Mel-XY2 (depositada em German Collection of Microorganisms and Cell Cultures DSMZ do o número de acesso DSM ACC2831), (c) Mel-XY3 (depositada em German Collection of Microorganisms and Cell Cultures DSMZ sob o número de acesso DSM ACC2832),(d) Mel-XX4 (depositada em German Collection of Microorganisms and Cell Cultures DSMZ sob o número de acesso DSM ACC2829) ou (e) sub-populações das mesmas. As linhagens celulares podem ser irradiadas obtendo-se populações com fenótipo apoptótico e populações com fenótipo necrótico de tais linhagens. As composições podem compreender adjuvantes e/ou modificadores de resposta imune e/ou células dendríticas autólogas.
[002] Hoje em dia realizam-se muitos esforços e destinam-se muitos recursos para investigar na área da imunoterapia do câncer. Existem importantes evidências que indicam o papel central dos linfócitos T nas respostas imunes efetivas contra o câncer (Oliver RT, Nouri AM. T; Câncer Surv 1992; 13:173-204). Para isso utilizaram-se nos tratamentos células alogênicas sozinhas, com adjuvantes, ou em combinação com imunomoduladores tais como algumas citoquinas.
[003] Por outra parte é sabido que as células dendríticas (CD) são as células apresentadoras de antígenos que podem iniciar uma resposta de células T por causa da sua extraordinária capacidade para estimular os linfócitos T naive (Schuler G, Steinman RM. J Exp. Med 1997; 186:1183-7 e Banchereau J, Steinman RM. Nature 1998; 392:245-52).
[004] Vários autores demonstraram nos modelos murinos e em humanos que as CD incorporam células apoptóticas, e desta forma se apresentam os antígenos para a geração de complexos HLA classe I/peptídeos, permitindo a indução de linfócitos T citotóxicos (Albert ML, Pearce SF, Francisco LM, Sauter B, Roy P, Silverstein RL, Bhardwaj N. J Exp Med. 1998, 188: 1359-1368; Chen Z, Moyana T, Saxena A, Warrington R, Jia Z, Xiang J. Int J Cancer. 2001, 93: 539-548 e Shaif-Muthana M, McIntyre C, Sisley K, Rennie I, Murray A. Cancer Res. 2000, 60: 6441-6447). Para este processo é fundamental que as células apoptóticas induzam à maturação das células dendríticas (CD), embora muitos autores reportaram que as células apoptóticas humanas não maturam às CD ou induzem à perda da maturação de tais CD (Pietra G, Mortarini R, Parmiani G, Anichini A. Cancer Res 2001, 61: 8218-8226; Labarriere N, Bretaudeau L, Gervois N, Bodinier M, Bougras G, Diez E, Lang F, Gregoire M, Jotereau F. Int J Cancer 2002, 101: 280-286 e Demaria S, Santori FR, Ng B, Liebes L, Formenti SC, Vukmanovic S. J Leukoc Biol. 2005, 77: 361-368). O documento de patente US 6.187.306 de Pardoll e colaboradores promove um método para tratar ou proteger contra o melanoma que compreende utilizar pelo menos uma linha celular alogênica ou mais que expressem antígenos imunodominantes de melanoma, sendo que a linha celular foi alterada de forma tal que expressa citoquinas e administra dita linha transformada a um paciente que porta melanoma ou esta sob risco de adquirir a doença. Embora salienta-se a importância de que a linha celular ou as linhagens celulares utilizadas expressem a maioria dos antígenos imunodominantes não se promove uma nova linha celular ou combinação de linhagens celulares que expressem a maioria de tais antígenos. A invenção compreende fundamentalmente linhagens celulares transformadas que expressam citoquinas tais como GM-CSF.
[005] Os documentos de patente US 5.882.654 e US 5.840.317 promove linhagens celulares de melanoma irradiadas para serem utilizadas como vacinas alogênicas. O tratamento divulgado atinge valores inferiores a 50% de pacientes NED (16/37) e mostra-se uma efetiva atividade anti-tumoral de tipo humoral.
[006] O documento de patente US 2006/0034811 de Wallack e colaboradores promove vacinas compreendidas por células apresentadoras de antígenos carregadas com células tumorais lisadas ou quebradas que incluem ao citosol e às membranas. As células tumorais podem ser células do paciente, linhagens celulares ou células que foram infetadas com o vírus vaccinia recombinante que codifica a IL-2. No documento de patente US 2006/0140983 de Palucka e colaboradores promove-se uma composição para induzir imunidade em pacientes com câncer que compreende afastar e purificar células apresentadoras de antígenos iniciadas por exposição com uma ou mais proteínas de heat-shock e células tumorais mortas. As células apresentadoras de antígenos são células dendríticas e as células tumorais podem ser células singenéticas o alogênicas, por exemplo, linhagens celulares. Este documento difunde a necessidade de incorporar proteínas de heat-shock através da ruptura por aquecimento de células tumorais. Os testes mostrados não revelam necessariamente que a composição possua atividade indutora da imunidade em pacientes com melanoma.
[007] No documento de patente US 6.602.709 de Albert e colaboradores se difunde o uso de células apoptóticas para apresentar antígenos às células dendríticas para a indução de células T. O método é útil para induzir linócitos T citotóxicos antígeno específicos e células T helper. As células dendríticas são iniciadas por células apoptóticas ou fragmentos das mesmas e são capazes de processar e apresentar aos antígenos processados e induzir a atividade de linfócitos T citotóxicos, podendo ser utilizadas como vacinas terapêuticas.
[008] Um objetivo da presente invenção é proporcionar várias linhagens celulares de melanoma humano para o tratamento de doenças malignas, sendo que as linhagens celulares são (a) Mel-XY1 (depositada em German Collection of Microorganisms and Cell Cultures DSMZ sob o número de acesso DSM ACC2830), (b) Mel-XY2 (depositada em German Collection of Microorganisms and Cell Cultures DSMZ sob o número de acesso DSM ACC2831), (c) Mel-XY3 (depositada em German Collection of Microorganisms and Cell Cultures DSMZ sob o número de acesso DSM ACC2832),(d) Mel-XX4 (depositada em German Collection of Microorganisms and Cell Cultures DSMZ sob o número de acesso DSM ACC2829) ou (e) subpopulações das mesmas. As linhagens celulares podem ser posteriormente irradiadas obtendo-se populações com fenótipo apoptótico e populações com fenótipo necrótico de tais linhagens.
[009] Um outro objetivo da presente invenção é proporcionar uma composição para o tratamento do melanoma, onde tal composição compreende pelo menos uma linha celular de melanoma alogênica por exemplo (a) Mel-XY1 (depositada em German Collection of Microorganisms and Cell Cultures DSMZ sob o número de acesso DSM ACC2830), (b) Mel-XY2 (depositada em German Collection of Microorganisms and Cell Cultures DSMZ sob o número de acesso DSM ACC2831), (c) Mel-XY3 (depositada em German Collection of Microorganisms and Cell Cultures DSMZ sob o número de acesso DSM ACC2832), (d) Mel-XX4 (depositada em German Collection of Microorganisms and Cell Cultures DSMZ sob o número de acesso DSM ACC2829) ou combinações das mesmas, onde tais linhagens celulares são incapazes de proliferar. A composição pode também compreender excipientes, adjuvantes tais como BCG (BCG - Bacilo Calmette-Guérin) e imunomoduladores tais como GM-CSF ou IFNα. Em uma forma de concretização preferida a composição compreende combinações das quatro linhagens celulares de melanoma alogênicas (a) Mel-XY1 (depositada em German Collection of Microorganisms and Cell Cultures DSMZ sob o número de acesso DSM ACC2830), (b) Mel-XY2 (depositada em German Collection of Microorganisms and Cell Cultures DSMZ sob o número de acesso DSM ACC2831), (c) Mel-XY3 (depositada em German Collection of Microorganisms and Cell Cultures DSMZ sob o número de acesso DSM ACC2832) e (d) Mel-XX4 (depositada em German Collection of Microorganisms and Cell Cultures DSMZ sob o número de acesso DSM ACC2829), onde tais linhagens celulares foram irradiadas e são incapazes de proliferar. Em outra forma de concretização preferida a composição da invenção compreende combinações das três linhagens celulares de melanoma alogênicas (a) Mel-XY1 (depositada em German Collection of Microorganisms and Cell Cultures DSMZ sob o número de acesso DSM ACC2830), (b) Mel-XY2 (depositada em German Collection of Microorganisms and Cell Cultures DSMZ sob o número de acesso DSM ACC2831) e (c) Mel-XY3 (depositada em German Collection of Microorganisms and Cell Cultures DSMZ sob o número de acesso DSM ACC2832), onde tais linhagens celulares foram irradiadas e são incapazes de proliferar.
[0010] Um outro objetivo da presente invenção é proporcionar uma composição para o tratamento adjuvante do melanoma, onde tal composição compreende pelo menos uma linha celular de melanoma alogênica por exemplo (a) Mel-XY1 (depositada em German Collection of Microorganisms and Cell Cultures DSMZ sob o número de acesso DSM ACC2830), (b) Mel-XY2 (depositada em German Collection of Microorganisms and Cell Cultures DSMZ sob o número de acesso DSM ACC2831), (c) Mel-XY3 (depositada em German Collection of Microorganisms and Cell Cultures DSMZ sob o número de acesso DSM ACC2832), (d) Mel-XX4 (depositada em German Collection of Microorganisms and Cell Cultures DSMZ sob o número de acesso DSM ACC2829) e combinações das mesmas, e onde tais linhagens celulares foram irradiada e são incapazes de proliferar. A composição pode além do mais compreender excipientes, adjuvantes como BCG e modificadores de resposta imune como GM-CSF e/ou IFNα. Numa outra forma de concretização preferida a composição da invenção compreende uma combinação das linhagens celulares de melanoma alogênicas (a) Mel-XY1 (depositada em German Collection of Microorganisms and Cell Cultures DSMZ sob o número de acesso DSM ACC2830), (b) Mel-XY2 (depositada em German Collection of Microorganisms and Cell Cultures DSMZ sob o número de acesso DSM ACC2831), (c) Mel-XY3 (depositada em German Collection of Microorganisms and Cell Cultures DSMZ sob o número de acesso DSM ACC2832) ou (d) Mel-XX4 (depositada em German Collection of Microorganisms and Cell Cultures DSMZ sob o número de acesso DSM ACC2829), onde tais linhagens celulares foram irradiadas e são incapazes de proliferar. Em uma outra concretização preferida a composição da invenção compreende uma combinação das linhagens celulares de melanoma alogênicas (a) Mel-XY1 (depositada em German Collection of Microorganisms and Cell Cultures DSMZ sob o número de acesso DSM ACC2830), (b) Mel-XY2 (depositada em German Collection of Microorganisms and Cell Cultures DSMZ sob o número de acesso DSM ACC2831) ou (c) Mel-XY3 (depositada em German Collection of Microorganisms and Cell Cultures DSMZ sob o número de acesso DSM ACC2832), onde tais linhagens celulares foram irradiadas e são incapazes de proliferar.
[0011] Um outro objetivo da presente invenção é proporcionar uma composição para o tratamento de melanomas humanos que compreende células dendríticas autólogas maturas, células dendríticas autólogas carregadas com células de pelo menos uma linha celular de melanoma humano alogênico, células apoptóticas de essas pelo menos uma linha celular de melanoma humano heterólogo e células necróticas de essas pelo menos uma linha celular de melanoma humano heterólogo. A linha celular de melanoma humano é uma ou mais das seguintes linhagens: (a) Mel-XY1 (depositada em German Collection of Microorganisms and Cell Cultures DSMZ sob o número de acesso DSM ACC2830), (b) Mel-XY2 (depositada em German Collection of Microorganisms and Cell Cultures DSMZ sob o número de acesso DSM ACC2831), (c) Mel-XY3 (depositada em German Collection of Microorganisms and Cell Cultures DSMZ sob o número de acesso DSM ACC2832), (d) Mel-XX4 (depositada em German Collection of Microorganisms and Cell Cultures DSMZ sob o número de acesso DSM ACC2829) ou (e) subpopulações das mesmas.
[0012] Um outro objetivo da invenção é proporcionar uma composição para o tratamento adjuvante de melanomas humanos, que compreende células dendríticas maturas, células dendríticas carregadas com células de pelo menos uma linha celular de melanoma humano alogênico, células apoptóticas de uma linha celular de melanoma humano heterólogo e células necróticas de uma linha celular de melanoma humano heterólogo. A linha celular de melanoma é uma ou mais das seguintes linhagens celulares: (a) Mel-XY1 (depositada em German Collection of Microorganisms and Cell Cultures DSMZ sob o número de acesso DSM ACC2830), (b) Mel-XY2 (depositada em German Collection of Microorganisms and Cell Cultures DSMZ sob o número de acesso DSM ACC2831), (c) Mel-XY3 (depositada em German Collection of Microorganisms and Cell Cultures DSMZ sob o número de acesso DSM ACC2832), (d) Mel-XX4 (depositada em German Collection of Microorganisms and Cell Cultures DSMZ sob o número de acesso DSM ACC2829) ou subpopulações das mesmas.
[0013] Um outro objetivo da presente invenção é proporcionar um procedimento para preparar a composição, sendo que tal procedimento se leva a cabo nas seguintes etapas: a) descongelar e cultivar as linhagens celulares (a) Mel- XY1 (depositada em German Collection of Microorganisms and Cell Cultures DSMZ sob o número de acesso DSM ACC2830), (b) Mel-XY2 (depositada em German Collection of Microorganisms and Cell Cultures DSMZ sob o número de acesso DSM ACC2831) e (c) Mel-XY3 (depositada em German Collection of Microorganisms and Cell Cultures DSMZ sob o número de acesso DSM ACC2832); b) misturar essas três linhagens celulares; c) irradiar essas três linhagens celulares; d) agregar à mistura de linhagens celulares adjuvantes e excipientes. O procedimento pode compreender além, na etapa (a) o agregado da linha celular Mel-XX4 (depositada em German Collection of Microorganisms and Cell Cultures DSMZ sob o número de acesso DSM ACC2829).
[0014] Um outro objetivo da presente invenção proporcionar um procedimento para preparar a composição que compreende as etapas de: a) descongelar e cultivar as linhagens celulares (a) Mel-XY1 (depositada em German Collection of Microorganisms and Cell Cultures DSMZ sob o número de acesso DSM ACC2830), (b) Mel- XY2 (depositada em German Collection of Microorganisms and Cell Cultures DSMZ sob o número de acesso DSM ACC2831), (c) Mel-XY3 (depositada em German Collection of Microorganisms and Cell Cultures DSMZ sob o número de acesso DSM ACC2832) e Mel-XX4 (depositada em German Collection of Microorganisms and Cell Cultures DSMZ sob o número de acesso DSM ACC2829); b) misturar essas linhagens celulares; c) irradiar essas linhagens celulares; d) obter células dendríticas autólogas; e e) cocultivar durante um tempo as células dendríticas autólogas com as linhagens celulares irradiadas da etapa c).
[0015] Outro objetivo da presente invenção é proporcionar um método para induzir uma resposta imune antitumoral em pacientes que portam melanoma que compreende administrar a um paciente que o precisar uma quantidade efetiva de uma combinação das linhagens celulares (a) Mel-XY1 (depositada em German Collection of Microorganisms and Cell Cultures DSMZ sob o número de acesso DSM ACC2830), (b) Mel-XY2 (depositada em German Collection of Microorganisms and Cell Cultures DSMZ sob o número de acesso DSM ACC2831) e (c) Mel-XY3 (depositada em German Collection of Microorganisms and Cell Cultures DSMZ sob o número de acesso DSM ACC2832), sendo que tais linhagens celulares são incapazes de proliferar. A administração pode ser realizada em conjunto com adjuvantes e/ou imunomoduladores.
[0016] Um outro objetivo da presente invenção é proporcionar um método para induzir uma resposta imune antitumoral em pacientes que portam melanoma que compreende administrar a um paciente que o precisar uma quantidade efetiva de uma combinação das linhagens celulares (a) Mel-XY1 (depositada em German Collection of Microorganisms and Cell Cultures DSMZ sob o número de acesso DSM ACC2830), (b) Mel-XY2 (depositada em German Collection of Microorganisms and Cell Cultures DSMZ sob o número de acesso DSM ACC2831), (c) Mel-XY3 (depositada em German Collection of Microorganisms and Cell Cultures DSMZ sob o número de acesso DSM ACC2832) e (d) Mel-XX4 (depositada em German Collection of Microorganisms and Cell Cultures DSMZ sob o número de acesso DSM ACC2829), sendo que tais linhagens celulares são incapazes de proliferar.
[0017] Um outro objetivo da presente invenção é proporcionar um método para induzir uma resposta imune antitumoral em pacientes que portam melanoma que compreende administrar a um paciente que o precisar uma quantidade efetiva de um cocultivo de entre 6 e 72 horas de células dendríticas autólogas e uma combinação das linhagens celulares (a) Mel- XY1 (depositada em German Collection of Microorganisms and Cell Cultures DSMZ sob o número de acesso DSM ACC2830), (b) Mel-XY2 (depositada em German Collection of Microorganisms and Cell Cultures DSMZ sob o número de acesso DSM ACC2831), (c) Mel-XY3 (depositada em German Collection of Microorganisms and Cell Cultures DSMZ sob o número de acesso DSM ACC2832) e (d) Mel-XX4 (depositada em German Collection of Microorganisms and Cell Cultures DSMZ sob o número de acesso DSM ACC2829), sendo que tais linhagens celulares são incapazes de proliferar.
[0018] Na Figura 1 apresenta-se um exemplo representativo dos resultados da irradiação Gamma da mistura de linhagens celulares da invenção em relação à indução da apoptose e necrose (células Apo-Nec). No painel A apresentam-se as células não irradiadas e no painel B apresentam-se as células após a irradiação Gamma a 70Gy e coloreada com Anexina V-FITC e IP (iodeto de propídeo). As primeiras células apoptóticas definiram-se como Anexina V-FITC+/ IP-, entanto que as células necróticas foram as duplamente positivas;
[0019] Na figura 2 apresenta-se um gráfico de Kaplan Meier dos pacientes tratados com a composição da invenção CD/Apo- Nec;
[0020] Na figura 3 apresenta-se a proliferação in vitro de linfócitos em resposta a células tumorais autólogas apresentadas pelas células CDs. Os resultados apresentam-se como a média ± SD cpm (contas por minuto) dos triplicados. Como controles positivos incubaram-se linfócitos com fitohemoaglutinina (PHA) incorporando mais de 7 x104 cpm;
[0021] Na figura 4 apresenta-se o corado de tetrâmeros para os antígenos Melan A/MART-1 e gp100. No painel A observam-se os resultados obtidos com amostras de PBMN de pacientes HLA- A*0201 que participaram do estudo. *ND significa: não determinado por quantidade insuficiente de células CD8+T nas amostras pós-aplicação. No painel B apresenta-se o incremento de linfócitos T CD8+ HLA/peptídeo tetrâmero+ em PBMC do paciente #2. Os números representam a percentagem de CD8+ HLA/peptídeo tetrâmero+. O modo de controle coloriu-se PBMC HLA-A*0201 de doadores saudáveis;
[0022] Na figura 5 apresenta-se A medição intracitoplasmática de IL-10 e IL-12 nas células Apo-Nec da invenção. No painel A apresentam-se os resultados de FACS das CDin e no painel B apresentam-se os resultados FACS das células CD/Apo-Nec;
[0023] Na figura 6 apresenta-se a expressão dos antígenos HMB45 e Mart-1 na linha Mel-XY1 e nos clones derivados de tal linha celular. Os três painéis de acima correspondem à linha celular e os três painéis de mais embaixo correspondem aos clones. A coluna 1 corresponde à linha celular e clones controles, a coluna 2 corresponde à expressão de HMB45 da linha celular e os clones, respectivamente; e a coluna 3 corresponde à expressão de Mart-1 da linha celular e os clones.;
[0024] Na figura 7 apresenta-se uma biopsia de melanoma do paciente #100. No painel A pode se ver uma imagem de baixo aumento (25X) onde se observam células tumorais positivas e negativas para o Ag gp100, no painel B se observa a expressão heterogênea de gp100, onde se podem ver células com expressão alta, moderada e nula (400x); no painel C se observa a expressão heterogênea para o Ag MART-1, observando—se um clone de células com alta expressão, cingido de células negativas (400x);
[0025] Na figura 8 apresenta-se um gráfico de Kaplan Meier dos pacientes tratados com a composição da invenção Apo-Nec;
[0026] Na figura 9 observam-se metástases dérmicas extirpadas do paciente #200 tratado com a composição da invenção Apo/Nec, más GM-CSF e BCG. No painel A observam-se macrófagos na região necrótica do tumor (1), infiltrado de linfócitos em contato com células tumorais (2) e uma região de tumor viável (3). O painel B é um detalhe a 100x da região de forte infiltração tumoral, o painel C é um detalhe a 400x da mesma região onde se observam linfócitos infiltrantes e o painel D apresenta um detalhe da mesma metástase onde se observa a maior parte da mesma necrosada com macrófagos carregados com melanina (1) e uma região viável (2) (25X); e
[0027] Na figura 10 apresentam-se imagens de tomografia axial computada do paciente #300 tratado com a composição da invenção Apo-Nec más BCG. No painel A apresenta-se com uma flecha a localização da metástase pulmonar e no painel B se observa uma imagem da tomografia axial tomada 5 meses depois. Descrição detalhada da invenção
[0028] Para os efeitos da presente solicitude os termos “combinação” e “mistura” são intercambiáveis.
[0029] A presente invenção refere-se a composições que alteram o sistema imune dos mamíferos, deve se considerar que estas composições também são conhecidas pelos peritos no arte como composições de vacina, vacinas baseadas em células ou simplesmente vacinas.
[0030] As quatro linhagens celulares da invenção foram depositadas sob o Tratado de Budapest em German Collection of Microorganisms and Cell Cultures DSMZ em 23 de Março de 2007 sob os números de acesso a seguir: Linha celular Mel-XY1 DSM ACC2830, linha Mel XY2 DSM ACC2831, linha Mel XY3 DSM ACC2832 e linha Mel XX4 DSM ACC2829.
[0031] Os resultados dos testes de caracterização das linhagens celulares detalham-se na Tabela a seguir: Tabela 1: marcadores de celulas tumorais de melanoma humano da invenção
[0032] Da caracterização da linha celular MEL-XY1 surge que as células crescem como uma monocamada de células amelanóticas heterogêneas em tamanho e forma, que na sua maioria são de forma cúbica ou alongada e sem prolongações. Em alta densidade de crescimento são levemente melanóticas. As células MEL-XY1 formam numerosas colônias em ágar semi- sólido. As células MEL-XY1 são tumorigênicas em ratos atímicos (nude) e não geram metástase.
[0033] Da caracterização da linha celular MEL-XY2 surge que as células crescem como uma monocamada de células amelanóticas heterogêneas em tamanho. Apresentam-se células pequenas, e em menor número, multinucleadas com nucléolos proeminentes. Observam-se também células com prolongações dendríticas características no melanoma. Crescendo a alta densidade podem se empilhar e formar microtumores. As células MEL-XY2 são tumorigênicas em ratos atímicos (nude) e não geram metástase.
[0034] Da caracterização da linha celular MEL-XY3 surge que as células crescem em monocamada. As células são uniformes, pequenas e algo arredondadas. Crescendo a alta densidade podem se empilhar e formar microtumores. As células MEL-XY3 formam numerosas colônias em ágar semi-sólido. As células MEL-XY3 são tumorigênicas em ratos atímicos (nude) e não geram metástase.
[0035] Da caracterização da linha Mel-XX4 surge que tal linha cresce em monocamada em forma de fuso ou fusiformes a alta densidade. Em baixa densidade apresenta projeções dendríticas semelhantes aos melanocitos. As células são melanóticas algumas das quais apresentam múltiplos núcleos com proeminente nucléolo. O tempo de duplicação da população é dentre 172-173 horas e formam colônias nos testes de ágar mole.
[0036] Quando a linha celular Mel-XX4 da invenção foi transplantada para ratos nus (imuno-deprimidos) geraram-se linhagens celulares tumorais in vivo. As passagens seriadas a partir dos tumores iniciais demonstraram que 100% dos animais transplantados desenvolviam tumores durante o primeiro mês. O crescimento dos tumores era lento e aos 84 dias atingiam um valor médio de 372 ± 63 mm3. A linha celular da invenção Mel- XX4 é tumorigênica quando é injetada em forma subcutânea numa quantidade de 3x106 células.
[0037] Da análise do número modal de cromossomas surge o seguinte: A linha MEL-XY1 da invenção amostra uma dispersão no reconto cromossômico (entre 105 e 110) e pelo tanto não se destacou um número modal claro (sexo masculino). A linha MEL- XY2 da invenção demonstra uma tendência bimodal com números cromossômicos 89 e 91 (sexo masculino). A linha celular MEL- XY3 da presente invenção apresenta um número modal de 69 (sexo masculino), as alterações numéricas mais freqüentes foram a ausência de cromossomas nos pares 2 e 6 e cromossomas extra nos pares 20 e 22. A linha celular da invenção MEL-XY4 apresenta um número modal de 57-58(sexo feminino).
[0038] Foi ensaiada a energia de radiação gamma que induze apoptose nas linhagens celulares da invenção. A aplicação de 50 Gy de irradiação foi suficiente para suprimir completamente a capacidade clonogênica em ágar mole para cada linha celular da invenção. Quando as células se irradiaram com 70 ou 100 Gy, não foram observadas diferenças significativas no grau de indução de apoptose/necrose. Na figura 1 A pode-se observar que as células de melanoma não irradiadas continham ente 6-9% de células primárias apoptóticas caracterizadas por coração Anexina-V+/IP- (painel de mais abaixo à direita). Logo após da radiação a 70 Gy e 72 hs de cultivo, obtiveram-se um 45-53% de células primárias apoptóticas (ver Figura 1 B, painel de mais abaixo à direita). As células necróticas coloreadas com Anexina-V e IP se incrementaram desde 7,5% nas células não irradiadas até perto de 15% nas células irradiadas (painéis de mais acima à esquerda). Por tanto aos efeitos da presente solicitude de patente as células de melanoma irradiadas da invenção se denominam células Apo-Nec e a composição que compreende uma ou mais de qualquer uma das linhagens celulares Apo-Nec (Mel- XY1, Mel-XY2, Mel-XY3 y/o Mel-XX4) denominam-se composição Apo-Nec.
[0039] A radiação das células permitiu obter células incapazes de proliferar úteis para a elaboração de composições, tais como a composição Apo-Nec da invenção. Resulta evidente para um experto na arte que a composição Apo-Nec da invenção pode compreender qualquer uma das linhagens da invenção ou diferentes combinações das mesmas. Numa forma de concretização preferida a composição Apo-Nec da invenção compreende uma mistura ou combinação das linhagens celulares Mel-XY1, Mel-XY2 e Mel-XY3. Numa outra forma de realização preferida a composição Apo-Nec da invenção compreende uma mistura ou combinação das linhagens celulares Mel-XY1, Mel-XY2, Mel-XY3 e Mel-XX4. A mistura das linhagens celulares preferidas Apo-Nec da invenção proporcionam uma combinação de múltiplos antígenos que induzem uma excelente resposta imune antitumoral.
[0040] De forma surpreendente a combinação de antígenos tumorais apresentados pela mistura das quatro linhagens celulares Apo-Nec da invenção induzem uma resposta imune de células T específica contra o tumor e permite obter mais de 80% de pacientes livre de doença quando são tratados com a composição Apo-Nec da invenção (ver figura 8).
[0041] As linhagens da invenção utilizaram-se também para preparar a composição da invenção denominada CD/Apo-Nec que compreende pelo menos uma das linhagens celulares da invenção e células dendríticas autólogas.
[0042] Em outra forma de realização preferida as linhagens celulares são diferentes combinações das linhagens Mel-XY1, Mel-XY2, Mel-XY3 e Mel-XX4. A modo de exemplo e sem limitá-lo ao mesmo a combinação poderia compreender uma mistura das linhagens celulares Mel-XY1 e Mel-XY2 ou uma mistura das linhagens Mel-XY1, Mel-XX4. Em uma concretização preferencial a combinação de linhagens celulares compreende uma mistura das linhagens celulares Mel-XY1, Mel-XY2, Mel-XY3 e Mel-XX4, contando por tanto com a presença das quatro linhagens celulares.
[0043] Em uma concretização preferencial a composição CD/Apo-Nec da invenção compreende uma combinação das linhagens celulares Mel-XY1, Mel-XY2, Mel-XY3, Mel-XX4 irradiadas e células dendríticas autólogas.
[0044] A particular combinação das quatro linhagens celulares da invenção proporciona uma fonte única de antígenos nativos para carregar células dendríticas, proporcionando além do mais antígenos de células clonogênicas. Deve-se considerar que a combinação das quatro linhagens celulares irradiadas da invenção nem só proporciona uma particular combinação de antígenos nativos, mas também compreendem uma particular combinação de populações de células onde estão presentes perto de 50% de células apoptóticas e perto de 15% de células necróticas. Esta combinação de populações induz a maturação das CD.
[0045] O estudo de Fase I com a composição CD/Apo-Nec da invenção levou-se a cabo em 16 pacientes de melanoma cujas características apresentam-se na Tabela 2 Tabela 2: Características dos pacientes
[0046] A média de idade estava nos 42 anos (desde 17 a 60 anos). Foram tratados cinco mulheres e onze homens. Um deles tinha melanoma AJCC estádio IIC, oito tinham melanoma estádio III e sete tinham melanoma estádio IV. Os pacientes #5 e #11 foram submetidos a cirurgia das metástase de pulmão; o paciente #16 tinha metástase subcutâneas e os pacientes #1, #10 e #15 receberam radioterapia na região axilar depois da cirurgia pela ruptura da cápsula dos nódulos linfáticos. Prepararam-se cortes de quatro pacientes e foram tratados com 5, 10, 15 ou 20 x106 de células dendríticas (CDs) cocultivadas com células Apo-Nec (composição CD/Apo-Nec da invenção). Todos os pacientes receberam cada duas semanas uma dose da composição CD/Apo-Nec (0,3 ml) sem adjuvantes. O paciente #7 foi retirado do protocolo logo após da segunda aplicação por causa da rápida progressão da doença após de um trauma esportivo na coxa direita e uma infecção descontrolada; este paciente não foi substituído.
[0047] As células dendríticas imaturas (CDin) mostravam o patrão a seguir: o 95.1 ± 3.6% eram CD14-/ CD11c+ e o 70 ± 6% eram CD1a+. Foi calculado que a pureza era de perto de 60%.
[0048] Foram obtidas aproximadamente 3x106 CDs a partir de 1x108 PBMC semeadas em meio livre de soro.
[0049] Quando se caracterizaram as CDin obtidas dos pacientes e as células compreendidas na composição CD/Apo-Nec da invenção descobriu-se que 42.3 % ± 13.7 das células CDin dos pacientes (n= 15) foram capazes de fagocitar às células Apo-Nec da invenção. A fagocitose das células Apo-Nec foi comprovada por microscopia eletrônica, observando-se células Apo-Nec inteiras ou partes delas dentro das CDs em vacúolos.
[0050] A capacidade das células Apo-Nec da invenção para influir no processo de amadurecimento das células CD derivadas de monócitos foi examinada por meio de medições de marcadores específicos para células CD por citometria de fluxo (FACS) (FACSCalibur, BD Biosciences, San José, CA). A fagocitose das células Apo-Nec da invenção deu como resultado um fenótipo maturo das células CD em comparação com os controles incubados com LPS. O amadurecimento das células CD foi evidenciado pelo incremento na expressão de CD83, CD80, CD86, HLA classe I, e II e CD40. Logo após da fagocitose observou-se 75.2 % ± 16 de redução na endocitose FITC-Dx em comparação com as CDin.
[0051] O receptor de quemoquina (C-C motif) receptor 7 (CCR7) incrementou a sua expressão nas CDs logo após da fagocitose das células Apo-Nec da invenção, na totalidade dos pacientes e isto correlacionou-se com a migração in vitro das células CD para MIP-3β . As células CDin (9.6% CCR7+, MFI: 23.3) migraram para MIP-1α mas não migraram para MIP-3β; porém as células CD/Apo-Nec (81.8% CCR7+, MFI: 41.2) claramente migraram para MIP-3β e não para MIP-1α.
[0052] Exceto para o paciente #6, que mostrou um baixo rendimento de PBMC, e pelo tanto não se pôde obter a dose de 10 x 106 células CD/Apo-Nec, o que provocou ter que lhe administrar dose de 3 x 106 células por aplicação, todos os pacientes restantes receberam a dose esperada da composição CD/Apo-Nec da invenção coorte 1: 5 x 106, coorte 2: 10 x 106, coorte 3: 15 x 106 e coorte 4: 20 x 106. A composição CD/Apo-Nec da invenção foi bem tolerada e unicamente produziram-se casos de toxicidade média sempre de Grau 1. Observaram-se reações locais fracas nos sítios de aplicação e DTH, que consistiram em eritema e pápula. Nenhum paciente desenvolveu manifestações de doenças auto-imunes (Tabela 3). Tabela 3 oxicidade associada à aplicação da composição CD/APO-NEC da invenção
[0053] Logo após de um acompanhamento médio de 41.5 meses pós-cirurgia (entre 25 e 71 meses), os pacientes em estádio IIC estavam sem evidências de doenças (NED); 7/8 (87.5%) dos pacientes em estádio III estavam NED e 7/7 dos pacientes em estádio IV mostraram progressão da doença (ver figura 2).
[0054] Avaliaram-se para cada aplicação as reações DTH às células Apo-Nec heterólogas da invenção e determinou-se a intensidade da reação, o score de DTH tal como se descreve nos exemplos. Unicamente 6/15 pacientes mostraram uma leve reação DTH pré-aplicação contra as células Apo-Nec da invenção. Os testes DTH revelaram que a aplicação de células Apo-Nec induz uma reatividade específica em todos os pacientes, dado que o score DTH foi significativamente maior logo após da aplicação da segunda dose da composição CD/Apo- Nec em comparação com as reações basais observadas logo após da primeira aplicação (Mann Whithney test P=0.029, n=15). Os score DTH foram maiores nos pacientes NED que em aqueles que experimentaram progressão da doença (P= 0.28, Mann Wilcoxon Rank Sum test).
[0055] O incremento na quantidade de células CD/Apo-Nec por aplicação não incrementou significativamente o score DTH.
[0056] Não foi induzida resposta humoral alguma contra as células vivas de melanoma compreendidas na composição da invenção antes e após da aplicação, e avaliada por médio de análise por FACS. Também se analisou a presença de anticorpos reativos contra as células Apo-Nec em soros pré e pós- aplicação por meio da técnica de Western blot. Em quatro pacientes (#3, #4, # e #16) observou-se unicamente uma leve banda de proteínas de melanoma (>200 kDa) detectada no soro pós-aplicação que não foi reconhecida nos extratos de células de câncer de mama utilizadas como controle inespecífico.
[0057] Estabeleceu-se uma linha celular de melanoma autóloga para o paciente #1 e desta forma foi possível analisar se a aplicação nesse paciente das células CD/Apo-Nec induzia uma resposta de proliferação de linfócitos para as próprias células tumorais. Foi medida a proliferação de linfócitos logo após 5 dias de incubação dos linfócitos de pré e pós aplicação com células Apo-Nec#1 (células tumorais irradiadas do paciente #1 obtidas tal como se descreve nos exemplos). Na figura 3 detalha-se que a proliferação dos linfócitos pós- aplicação em resposta às células CD/Apo-Nec#1 foi maior respeito dos linfócitos pré-aplicação, sugerindo que existe imunização específica aos antígenos tumorais apresentados pelas células Apo-Nec, os que também estão presentes no tumor do paciente #1, após da aplicação das células CD/Apo-Nec.
[0058] Sete dos 15 pacientes envolvidos no estudo possuíam o haplótipo HLA-A*0201 classe I, o que permitiu estudar a resposta tumor-específica ao HLA restrita nas suas próprias amostras de PBMC. Foram analisadas as respostas anti- gp100 e Melan A/MART-1 células T CD8+ específicas induzidas pela composição CD/Apo-Nec mediante a união específica tetrâmeros HLA/peptídeos e secreção de IFN-y medida por ELISpot, diretamente nas amostras de sangue periférico.
[0059] Em 5/7 pacientes foram obtidas suficientes PBMC pré (7 dias antes da primeira aplicação) e pós (15 dias após da quarta aplicação) para analisar a presença de linfócitos T CD8+ específicos reativos com gp100 e Melan A/MART-1 mediante coloração de tetrâmeros. Os resultados estão demonstrados na Figura 4 A. Os pacientes #2 e #6 incrementaram significativamente a sua freqüência de gp100 e Melan A/MART-1 células T CD8+ específicas T após da aplicação por cima de 1% e que ainda estavam como NED (53 e 36 meses, respectivamente, após a cirurgia), enquanto que os pacientes #5, # 8 e #16 diminuíram a sua coloração de tetrâmeros pré-aplicação e todos eles progrediram na doença logo após a aplicação (Figura 3 A). Como exemplo na Figura 4 B podem ser apreciados os resultados do paciente #2. As percentagens de células T CD8+ T que reconhecem os peptídeos gp100 ou Melan A/Mart-1 incrementaram-se após a aplicação desde 0,17 e 0,26 a 1,15 e 1,16 respectivamente. Não se observou reatividade num experimento realizado sob as mesmas condições de doadores saudáveis HLA-A*0201 positivos.
[0060] A liberação de IFN-y em um ELISpot dos PBMC totais pré e pós aplicação foi ensaiada logo após de 24 hs de incubação com células CDs autólogas sondadas com gp100 ou Melan A/MART-1 e usando como controle peptídeos de influenza (flu58-6δ) . Este ensaio foi avaliado em 5/7 pacientes HLA- A*0201. Foi observado que dois pacientes (#5 e #16) logo após da aplicação da composição CD/Apo-Nec da invenção induziram IFN—Y secretado por células T CD8+ específicas para gp100 e Melan a/MART-1. Nos pacientes #5 e #16 foram induzidas freqüências de 7-3,5 x10-4 células T CD8+ que secretam IFN-y. No paciente #2 se encontrou uma alta quantidade de células T CD8+ específicas para gp100 e Melan A/MART-1 antes e depois a aplicação. Este paciente ainda se encontra livre de doença, 54 meses após da cirurgia. Os pacientes #8 e #15 mostraram uma baixa quantidade de pontos de base (pré-aplicação) e não foram observadas mudanças em quatro aplicações com a composição CD/Apo-Nec da invenção.
[0061] O balanço entre IL-12 e IL-10 nas células CD/Apo-Nec da invenção foi quantificado mediante FACS em diferentes momentos logo após a fagocitose e seguido de 8 horas de tratamento com Brefeldin A para acumular intracitoplasmaticamente às citoquinas. Tal como é mostrado na Figura 5 unicamente 6,1% das CDin produzem IL-12, mas passadas 32 hs. Do co-cultivo 30,8% das células CD/Apo-Nec estavam induzidas a produzir IL-12. Por outra parte, 81,6% das CDin continham dentro do citoplasma as citoquinas e estas não se modificaram logo após a fagocitose. E 27,8% foram as células duplamente positivas que produziram IL-10 e IL-12 às 24 horas. (ver Figura 5).
[0062] A composição CD/Apo-Nec da invenção foi segura e bem tolerada pelos pacientes.
[0063] A composição CD/Apo-Nec da invenção induz respostas celulares nos pacientes já que a reação de DTH utilizando células Apo-Nec como imunógeno se incrementou em todos os pacientes logo após a segunda aplicação respeito dos valores de base.
[0064] Um 85% dos pacientes (estádio IIc e III) tratados com a composição CD/Apo-Nec da invenção estão livres de doença, logo após um seguimento médio de 41,5 meses quando foram tratados depois da cirurgia (ver figura 2). A composição CD/Apo-Nec da invenção resulta útil per se para o tratamento dos pacientes com melanoma, resultando também, útil como adjuvante após os tratamentos radicais já que estimula no paciente uma resposta imune, sendo que o sistema imune elimina as células tumorais residuais, protege o paciente de possíveis recaídas. Mais especificamente, a composição CD/Apo-Nec da invenção é útil para o tratamento de pacientes em estádio IIB, IIC e III, os quais contêm menor massa tumoral e é útil como adjuvante após as terapias radicais para os pacientes em estádio IV.
[0065] Resulta evidente para um experto na arte que a composição CD/Apo-Nec da invenção pode ser utilizada para o tratamento do melanoma humano e também como adjuvante junto com outros tratamentos e como estimulante do sistema imune dependendo, por exemplo, do estádio do paciente e da etapa do tratamento.
[0066] É importante salientar que a combinação de células Apo-Nec da invenção induzem a maturação das células CD autólogas. A mistura ou combinação das células Apo-Nec da invenção são uma boa fonte de antígenos de melanoma para carregar às células dendríticas. Note-se que as células dendríticas maturam unicamente mediante contatar e fagocitar a combinação de células Apo-Nec da invenção, sem o agregado de um estímulo extra tal como, por exemplo, Interleukina 1, Fator de Necrose Tumoral α, CD40 ligando o Prostaglandina E, os quais geralmente são utilizados como um coquetel de maturação. As CDs que fagocitam as células Apo-Nec da invenção incrementam a migração in vitro em resposta à quemoquina MIP-3β e à produção intracelular de IL-12. As células CD/Apo-Nec da invenção possuem capacidade para apresentar em forma cruzada antígenos tumorais nativos a antígenos CTL específicos.
[0067] Tal como foi comentado na fagocitose das células ApoNec pelas CDin de cada paciente induz a maturação de tais CDs.
[0068] Por outra parte, foram analisadas as linhagens celulares da invenção em relação às suas capacidades clonogénicas. As colônias em ágar mole da linha celular da invenção MEL-XY3 apresentam uma morfologia heterogênea, com baixa adesão entre as células. Observa-se uma baixa proporção de colônias melanóticas. As colônias em ágar mole da linha celular da invenção MEL-XY1 apresentam uma morfologia compacta, com uma alta adesão entre as células que a compõem. Dificilmente se observam colônias melanóticas.
[0069] Como uma forma de caracterizar às colônias foram comparados os níveis de expressão de antígenos de melanoma normalizados respeito da expressão de β-actina nas linhagens celulares da invenção e nas colônias em ágar mole de tais linhagens celulares. Os resultados de caracterização dos clones observam-se na Tabela 4 e figura 6. Tabela 4 Estudo comparativo na expressão de antígenos entre as linhagens celulares da invenção e as linhagens clonogénicas da invenção.
ND: não determinado *Dados ainda não normalizados
[0070] Segundo se pode observar existem dentro da população e de cada linha celular da invenção uma sobre população de células clonogénicas, ditas células clonogénicas também se encontram dentro do alcance da presente invenção. A presença de células clonogénicas permite proporcionar ao paciente de antígenos típicos de células indiferenciadas ou células- tronco denominadas também células stem.
[0071] A heterogeneidade dos tumores de melanoma é elevada, por isso resulta fundamental para a imunoterapia utilizar misturas complexas de antígenos providas pela mistura ou combinação de linhagens celulares e suas sobre populações. Pode-se apreciar no exemplo da figura 7 uma biopsia de melanoma primário que evidencia a heterogeneidade de ditos tumores em relação à expressão de antígenos de diferenciação melanocítica.
[0072] Quando foram tratados pacientes com a composição ApoNec da invenção mais BCG como adjuvante e GM-CSF como imunomodulador de acordo com o esquema que se menciona nos exemplos seguintes, observou-se que 75 % dos pacientes (estádios IIC e III) estavam livres de doença com um seguimento máximo de 51 meses (ver Figura 8), e a toxicidade foi escassa e de grão 1 só.
[0073] Podem-se apreciar como exemplo os resultados de um dos pacientes do protocolo selecionado. O paciente #200 é de sexo feminino, raça caucásica, de 67 anos e tem feito a consulta em Novembro de 2003. Em junho de 2002 foi submetido cirurgicamente por um nevo dorsal que tinha lhe crescido. A anatomia patológica evidenciou um melanoma cutâneo, nível IV de Clark, nível de Breslow 5.7 mm. Em agosto de 2002 apareceram satelitoses que foram extirpadas. Foi administrado ao paciente Apo-Nec + BCG + GM-CSF, recebendo 600 μg GM-CSF (por composição) e o tratamento finalizou com escassa toxicidade. No último exame clínico se detectou um nódulo suspeito em dorso, que foi extirpado, e cuja imagem microscópica é mostrada na Figura 9. Observa-se uma intensa infiltração linfóide, com região remanescente de tumor viável, mas também uma intensa necrose do tecido tumoral, como a presença de macrófagos carregados de melanina.
[0074] Podem-se apreciar também como exemplo os resultados de um paciente tratado com a composição Apo-Nec da invenção + BCG + IFN-α. O paciente #300 é de sexo masculino, de 17 anos de idade que consultou por adenopatia inguinal esquerda. Dois meses depois recebeu uma vacina inguinal esquerda, isolando 4/11 gânglios com metástase de melanoma. Realizou-se um tratamento com interleucina-2 em baixas doses.
[0075] 14 meses após do segundo esvaziamento detectou-se uma recaída em arcada inguinal esquerda, e por tal motivo se realizou uma nova cirurgia, isolando 5/7 gânglios com metástase de melanoma. O paciente apresentava dor lombar. A tomografia axial computada revelou adenopatias retroperitoneais, realizou-se quimioterapia com esquema de Dartmouth. Finda a quimioterapia se iniciou o tratamento com a composição Apo-Nec da invenção + BCG. 14 meses após de iniciado o tratamento com a composição da invenção detectou- se um nódulo na região inguinal esquerda. Novamente operado se detectou metástase de melanoma com infiltrado linfoplasmocitário abundante. O paciente continuou o tratamento com a composição Apo-Nec + IFN-α. Na figura 10 se mostra a remissão de um nódulo pulmonar esquerdo. Atualmente, o paciente se encontra livre da doença.
[0076] A presente invenção divulga linhagens celulares de melanoma que em combinação expressam a maioria dos antígenos associados ao melanoma, composições que compreendem tais linhagens irradiadas e composições que compreendem CD autólogas geradas ex vivo que fagocitaram uma mistura de células apoptóticas/necróticas das linhagens celulares de melanoma.
[0077] Esta invenção está melhor ilustrada segundo os exemplos a seguir, os quais não devem ser interpretados como uma limitação imposta ao alcance da mesma. Pelo contrário, deve-se entender claramente que podem se utilizar outras formas de concretização, alterações e equivalentes da mesma que após de ler a presente descrição, pode sugerir àqueles entendidos no tema sem se afastar do espírito da presente invenção e/ou alcance das reivindicações anexas. Exemplo 1: Obtenção, estabelecimento e manutenção das linhagens celulares da invenção
[0078] Mel-XY1: A linha Mel-XY1 foi obtida de um paciente masculino de raça caucásica, a partir de uma metástase pulmonar secundária a um melanoma primário da espalda. O paciente faleceu dois anos depois por causa de metástases cerebrais.
[0079] Mel-XY2: O paciente do qual se originou a linha tinha 44 anos e era um homem de raça caucásica que apresentava melanoma ulcerado na espalda (Clark's nível III) . Dois anos depois desenvolveu em forma simultânea adenopatias axilares e metástase pulmonar. As adenopatias axilares foram extraídas, dissociadas e deram origem à linha celular.
[0080] Mel-XY3: O paciente era um homem de raça caucásica de 43 anos que tinha desenvolvido um melanoma primário no braço. Dois anos depois apareceram metástases de nódulos linfáticos axilares. O paciente recebeu quimioterapia com DTIC, sem mostrar resposta clínica alguma. As metástases axilares foram retiradas, e as células originaram a linha celular Mel-XY3.
[0081] Mel-XX4: Por cirurgia foi obtida uma adenopatia inguinal de uma mulher branca de 33 anos, essa adenopatia foi diagnosticada como uma metástase de melanoma. O tumor primário era desconhecido. Quinze meses depois, a paciente teve uma recorrência no nódulo linfático inguinal. O nódulo macroscopicamente melanótico foi removido, cortado em troços pequenos, se lhes removeu o tecido grasso e conectivo e se suspenderam novamente em meio Dulbecco's Modified Tagle (DMEM), foi desagregado mecanicamente fazendo pressão numa malha de nylon e os agregados celulares trataram-se enzimaticamente durante uma noite a 37°C.
[0082] As células se ressuspenderam em meio de cultivo de melanoma suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS) (Natocor, Córdoba, Argentina), semearam-se em frascos de cultivo de 25 cm2 e foram incubados a 37°C sob umidade e uma atmosfera de 5% CO2-95% em ar. Passadas 24 hs o meio de cultivo foi retirado em função de remover as células não aderidas.
[0083] Realizaram-se quatro passagens da suspensão celular em colunas de micro esferas anti-fibroblastos (Miltenyi Biotec, Germany). As células obtidas foram denominadas Mel- XX4.
[0084] A manutenção das quatro linhagens celulares da invenção (Mel-XY1, Mel-XY2, Mel-XY3 e Mel-XX4) se realizou mediante cultivos em meio para melanoma DMEM: mistura nutritiva F12 (1:1) suplementada com 2 mM de glutamina, 20 nM de Selenito de sódio, 100 μ M de ácido ascórbico, 0.3 mg/ml de galactose, 0.15 mg/ml de Piruvato de sódio e 5 μ g/ml de insulina), 100IU/ml de penicilina, 10μ g/ml de estreptomicina mais 10% de soro fetal bovino (FBS) (Natocor, Córdoba, Argentina) num laboratório GMP do Centro de Investigações Oncológicas -FUCA.
[0085] Os clones CTL (HLA A*0201 restringidos) específicos para antígenos Melan A/MART-1 (M27: AAGIGILTV) e gp100 (G154: KTWGQYWQV) se esparziram em meio RPMI más 10% de soro AB humano inativo e antibióticos, em ciclos de 14 dias utilizando 30 ng/ml de anticorpo anti-CD3 (OKT-3, BD Biosciences) e séries de 300 UI/ml de IL-2 (Chiron BV, Amsterdam, Netherlands) cada 3 dias.
[0086] Semearam-se 104 células por poço em placas (Corning) de 24. Cada 2-3 dias as células foram tratadas com EDTA (0,02%), colhidas e contadas. O tempo de duplicação da população foi estimado a partir da pendente da curva de crescimento durante a fase exponencial.
[0087] O crescimento das células não dependente da ancoragem se determina mediante o método de ágar mole (Hamburger e Slamon, Science 197: 461, 1977) . Semearam-se 3 — 10 x 103 células na camada superior. As placas foram incubadas durante 21 dias e alimentadas cada semana com 50 μl de meio de cultivo. Contaram-se sob o microscópio as colônias com mais de 36 células. Caracterização dos antígenos de melanoma mediante imunocitoquímica (ICQ) e FACS
[0088] Para a avaliação mediante ICQ se trataram as células em crescimento exponencial com EDTA. Foram centrifugadas, fixadas com formaldeído, embebidas em parafina e cortadas em finas seções. Logo após utilizaram-se como controle amostras de tecido normal do paciente.
[0089] Os tecidos e as células foram ensaiados com anticorpos monoclonais (Mabs) contra queratinas, vimentina e gp100/HMB 45 (Biogenex), MART1/Melan-A (Dako), e com anticorpos policlonais anti S100 (Biogenex).
[0090] As reações visualizaram-se com complexos de avidina- biotina (Vectastain ABC). As peroxidases endógenas se bloquearam com 0,6% de H2O2.
[0091] As reações de imunofluorescência indireta se realizaram ressuspendendo as células tratadas com EDTA. Logo após de bloquear com soro normal de cabra diluído em 10%, as células foram incubadas com anticorpos primários, lavadas, incubadas com anticorpos secundários (imunoglobulina de cabra anti-rato - FITC (Dako) foram lavadas, fixadas em 1% de paraformaldeído e foram analisadas por FACS (FACS Vantage SE, Becton-Dickinson, USA). Os anticorpos primários foram Mabs murinos anti-p53 (DO-7, BD Pharmingen), 3F8 anti-GD2, R24 anti-GD3. No caso de p53 as células foram permeabilizadas. Os antígenos leucocitários humanos (HLA) Classe I e Classe II foram tipificados por PCR-SSP. Determinação de antígenos associados a melanoma mediante RT- PCR:
[0092] ARN total com Trizol (Invitrogen) foi extraído. Em função de iniciar a síntese de ADNc se agregaram a 1-3μg de ARN os correspondentes iniciadores e se incubaram com 200 U de enzima MMLV-RT (Promega), 25-40 U de RNAsin (Promega) e 250-500 μM de dNTPs (Invitrogen) durante 5 min a 70°C e depois durante 60 min a 42°C. As alíquotas de ADNc (2-10 μl) se amplificaram com Taq DNA polymerase (Invitrogen) e usando os pares de iniciadores específicos.
[0093] Os iniciadores específicos se detalham mais em diante: Gp100
[0094] 5’-GCTTGGTGTCTCAAGGCAACT-3‘ (SEQ ID N° 1)
[0095] 5’-CTCCAGGTAAGTATGAGTGAC-3’ (SEQ ID N° 2) MART-1
[0096] 5’-CAAGATGCCAAGAGAAGATGCTCACT-3' (SEQ ID N° 3)
[0097] 5’-GCTTGCATTTTTCCTACACCATTCCA-3’ (SEQ ID N° 4) Tirosinase
[0098] 5’-TTGGCAGATTGTCTGTAGCC-3’ (SEQ ID N° 5)
[0099] 5’- AGGCATTGTGCATGCTGCTT-3’ (SEQ ID N° 6)
[00100] 5’-GTCTTTATGCAATGGAACGC-3‘ (SEQ ID N° 7)
[00101] 5’-GCTATCCCAGTAAGTGGACT-3’ (SEQ ID N° 8) TRP-2
[00102] 5'-GAGTGGTCCCTACATCCTACG-3‘ (SEQ ID N° 9)
[00103] 5’-GCGTCCTGGTCCTAATAATGT-3’ (SEQ ID N° 10) MAGE—1
[00104] 5’-GAGTCCTCAGGGAGCCTCC-3‘ (SEQ ID N° 11)
[00105] 5’-TTGCCGAAGATCTCAGGAAA-3’ (SEQ ID N° 12) NY-ESO-1
[00106] 5'-AGCCGCCTGCTTGAGTTCTACCTC—3" (SEQ ID N° 13)
[00107] 5’-AGGGAAAGCTGCTGGAGACAG-3‘ (SEQ ID N° 14) MDR-1
[00108] 5’-TCCAAGAAGCCCTGGACAAAG- 3’ (SEQ ID N° 15)
[00109] 5’-TTGATGATGTCTCTCACTCTGTTCC-3’ (SEQ ID N° 16) MIA
[00110] 5'-CATGCATGCGGTCCTATGCCCAAGCTG-3' (SEQ ID N° 17)
[00111] 5'-GATAAGCTTTCACTGGCAGTAGAAATC-3' (SEQ ID N° 18) β-actina
[00112] 5-'ATGTTTGAGACCTTCAACACCCC-3' (SEQ ID N° 19)
[00113] 5'-GCCATCTCTTGCTCGAAGTCCAG-3' (SEQ ID N° 20)
[00114] Os iniciadores anti-sentido são detalhados numa linha mais embaixo.
[00115] Para a detenção da tirosina se amplificou além uma alíquota de 1/100 da primeira reação de PCR com iniciadores internos (nested PCR).
[00116] Os produtos de PCR foram analisados em geles de agarose e tingidos com brometo de etídio; o tamanho dos fragmentos foi calculado em comparação com a linha de semeadura com marcadores de PM de ADN de 100 pb (Promega). Análise citogenéticos e citomoleculares:
[00117] Para os análises citogenéticos foram incubadas as células correspondentes às quatro linhagens da invenção em crescimento exponencial com colchicina (0,1 μg/ml) a 37°C durante 8-16 hs, foram colhidos com uma solução de Trypsina- EDTA e processados de acordo com os protocolos padrão. Utilizou-se a técnica de bandeo-G. A identificação dos cromossomos foi levada a cabo de acordo com o Sistema Internacional de Nomenclatura de Citogenética Humana (Mitelman, 1995 ISCN.: An International System for Human Cytogenetic Nomenclature, (ed. S Karger, Basel).
[00118] As células dendríticas foram obtidas a partir de buffy-coats ou de produtos de leucoféreses provenientes de doadores sãos. As células mononucleares periféricas (PBMCs) foram purificadas em um gradiente de densidade de Fycoll- Hypaque. Foram ressuspendidas as PBMCs em meio fresco livre de soro AIM-V™ (Invitrogen) e deixadas aderindo-se em frascos de cultivo (TPP, Alemanha). Passadas 2 hs a 37°C, as células não aderentes foram removidas e os monócitos aderimos cultivaram-se durante 5 dias em AIM-V suplementado com 800 U/ml de rhuGM-CSF e 50 ng/ml de IL-4 (Peprotech, Mexico), obtendo assim as CDin. As mudanças no fenótipo foram analisadas com microscópio óptico e FACS. Para induzir a maturação controlada das CDin agregaram-se 2 μg/ml de LPS (Lipopolisacárido de E. coli J5, Sigma,St. Louis, CA) e finalmente as células foram cultivadas durante 48 hs.
[00119] A caracterização do fenótipo das células CD foi realizada quando as células estavam no estado imaturo (CDin) e logo após os ensaios de fagocitoses das células apoptóticas/necróticas (células Apo-Nec) mediante a coloração de 5 x 105 células com anticorpos marcados com fluorocromos contra os antígenos CD14, CD11c, CD1a, HLA classe II , CD80, CD86, CD83, CD40, HLA classe I e CCR7 (BD Biosciences, San Jose, CA), mediante análise por FACS, (Becton Dickinson, San Jose, CA). Os controles de isótipo correspondentes foram Rato IgG2a PE e ratão IgG1 e IgG2a (BD Biosciences, San Jose, CA). Também foi analisada a expressão de CD83 em CDs que fagocitaram células Apo/Nec, utilizou-se um anticorpo monoclonal não marcado anti-CD83 (IgG1) e o correspondente isótipo como controle, no revelado se utilizou um anticorpo anti-rato IgG1-PerCP (BD Biosciences, San José, CA).
[00120] A capacidade de endocitoses das CDs foi avaliada incubando 1 x 106 CDs com 1 mg/ml de Dextrano conjugado com FITC (Dx-FITC) (Sigma, St Louis, CA) durante 30min a 37°C. Após a incubação, as células com PBS foram lavadas e analisadas por FACS. Os controles incluíram CDs incubadas com Dx-FITC durante 30min a 4°C para inibir o processo de endocitoses por outro lado a incorporação basal foi considerada no momento 0 do ensaio. A incorporação de DX-FITC (endocitoses) foi quantificada mediante FACS. Avaliação da fagocitose das células CDs:
[00121] As células CDin foram co-cultivadas com as células Apo-Nec (preparadas segundo foi mostrado anteriormente) em meio fresco AIM-V em diferentes tempos. Em alguns ensaios as CDs foram tingidas de vermelho com PKH26 e as células Apo-Nec foram tingidas de verde com PKH67 (Sigma, St. Louis, CA). Após o co-cultivo se realizou a análise por FACS e se definiu a percentagem de CDs que fagocitaram células Apo-Nec como a percentagem de células duplas positivas. A seguir, realizaram-se os controles apropriados para cada cor. O controle de união inespecífica das células Apo-Nec às CDs se levou a cabo incubando as células a 4°C durante os mesmos períodos de tempo. Migração in vitro das CDs:
[00122] Foi ensaiada a migração in vitro das CDs antes e depois do co-cultivo com as células Apo-Nec, utilizando uma câmara de quimiotaxias de 48 microtubos (AP 48 Neuroprobe Inc., Gaithersburg, MD). No compartimento inferior foram colocados 10 ng/ml de MIP-1α ou MIP-3β (Peprotech, Rocky Hill, NJ, USA) diluído em RPMI. A migração basal foi ensaiada colocando RPMI na câmara inferior. As CDs foram semeadas na câmara superior (3 x 104 CDs/poço) em RPMI. Entre a câmara superior e inferior foi colocada uma membrana de policarbonato de 5 μ m de poro (Neuroprobe, Inc., Bethesda, MD) . Após 90 min a 37°C, as células da cara superior da membrana foram retiradas e as células que migraram aderidas à cara inferior da membrana foram coloreadas com Giemsa 10% diluído em água neutra. As membranas foram secadas ao ar, montadas sobre um porta-objeto com Bálsamo de Canadá e as células migrantes foram contadas utilizando um microscópio. Analisaram-se cinco campos por microtubo a um aumento de 40X e se analisaram 3 microtubos/condições. A análise estatística se realizou utilizando o Teste de Student.
[00123] Também foi estudado o processo de fagocitoses por microscopia eletrônica. As amostras dos co-cultivos foram fixadas com glutaraldeído a 2,5% 0,1 M de buffer fosfato, e a seguir se realizou um tingido pós-fixação com tetróxido de ósmio 1%, lavaram-se duas vezes com água destilada e se contrastaram com acetato de uranilo 5% durante 2 hr. Após o lavado e a desidratação as amostras foram embebidas em resina (Durkupan). Realizaram-se cortes ultrafinos (70-90 nm), montaram-se em grades de cobre e se contrastaram com citrato de chumbo de Reynold. As grades foram analisadas num microscópio eletrônico de transmissão Zeiss 109. Alternativamente, para obter figuras das células completas, obtiveram-se cortes finos (0.5 μ m) num ultramicrótomo (Reichert-Jung), foram coloreados com azul de toluidina 0,4%%, 0,1 M de buffer carbonato e montados em Durkupan e se analisaram sob um microscópio óptico (1000x). As fotos foram tiradas com uma câmara digital Sony Cybershot Digital (5 megapixels) e as imagens foram processadas com o programa Adobe photoshop 6.0. Ensaio in vitro cross apresentação, secreção de IFN-y:
[00124] Monócitos CD14+ foram purificados a 98% a partir de doadores HLA A*0201 utilizando micro-esferas anti-CD14 (Miltenyi Biotec, Germany) e se diferenciaram as células CDin mediante 5 dias de cultivo tal como foi descrito anteriormente. As células CDin foram incubadas com células Apo-Nec durante 6, 12, 24 e 48hs e se defrontaram durante toda a noite a clones CTL MelanA/MART-1 ou gp100 específicos em 1 ml de meio AIMV. A secreção de IFN-y ao sobrenadante se determinou por triplicado mediante a técnica de ELISA (OptEIA IFN-Y, Pharmingen BD Biosciences, San Diego, CA) conforme recomendações do fornecedor. Realizou-se uma curva de calibração para cada experimento e a concentração das amostras foi calculada mediante a análise de regressão log-log e utilizando o software Cembal 2.2. Os controles incluíram: CDs mais 20 μ g/ml de peptídeos MART-1 ou gp100, linhagens celulares viáveis de melanoma HLA A*0201+ que exprimem os antígenos MART-1 e gp100 (controles positivos) ou células CDs semeadas com peptídeos não específicos e linhagens celulares viáveis de melanoma HLA A*0201+ que não exprimem os correspondentes antígenos (controles negativos). Medições das citoquinas IL-10 e IL-12 intracitoplasmáticas:
[00125] As CDs marcadas com PKH26 (vermelho) foram co- cultivadas com células Apo-Nec marcadas com PKH67 em diferentes tempos (6, 12, 24 e 48 hs). A medição das citoquinas acumuladas foi realizada mediante a técnica de Imunofluorescência intracelular, após o bloqueio da saída das mesmas com Brefeldina A (8hs) pós-cultivo (Golgi Plug, BD Biosciences, San José CA). As células foram permeabilizadas com 0,05% de saponina e tingidas com anti-IL10 (Isotipo IgG2a de rato)-APC e anti-IL12 subunidade p40-p70 (Isótipo IgG1 de ratão)-PerCp (BD Biosciences, San José, CA). Para os estudos por FACS a população duplamente tingida PKH26/PKH67 foi selecionada e as citoquinas foram avaliadas para essa população num experimento de quatro cores. Como controle utilizou-se o co-cultivo a 4°C.
[00126] As quatro linhagens celulares da invenção (Mel-XY1, Mel-XY2, Mel-XY3 e Mel-XX4) foram irradiadas com irradiação gamma a 70Gy (Siemens, Instituto Alexander Fleming, Buenos Aires, Argentina), posteriormente as células foram congeladas (50% de DMEM, 40% de albumina humana e 10% de DMSO) em nitrogênio líquido até sua utilização.
[00127] O dia da aplicação das células, estas se descongelaram, se lavaram e se prepararam em doses de composição que continham entre 5 - 10 x 106 células de cada uma das linhagens celulares da invenção isoladas ou combinações das mesmas ressuspendendo-as em meio DMEM
[00128] Injetaram-se 300 ul em forma intra-dérmica. Composição CD/Apo-Nec: Preparação de células tumorais apoptóticas/necróticas:
[00129] As células (Mel-XY1, Mel-XY2, Mel-XY3 e Mel-XX4) irradiadas e congeladas segundo foi descrito anteriormente foram descongeladas e semeadas em meio de melanoma mais soro fetal bovino a 10% até completar o processo apoptótico. Decorridas 72hs do cultivo, as células foram decoladas do fundo dos frascos, lavadas, contadas e ressuspendidas em meio fresco livre de soro AIMV™ Medium (grão terapêutico, GIBCO, Invitrogen Corporation, Grand Island, N.Y). As apoptoses e necroses foram ensaiadas mediante a técnica de união de Anexina-V FITC e incorporação de Iodeto de Propídio (IP) (Anexina-V kit de detenção de apoptose, BD Biosciences, San José, CA) e se analisou por FACS. Os ensaios clonogênicos em ágar mole se realizaram por setuplicado (1.5 x 104 células/microtubo) em função de analisar nas células irradiadas a capacidade de proliferação em comparação com células controle não irradiadas.
[00130] Se co-cultivaram 5, 10, 15 ou 20 x106 CDs, segundo a dose para cada paciente, com células Apo-Nec em meio AIMV durante 48h, a 37°C. No dia da aplicação as células dos co- cultivos foram centrifugadas a 1200 rpm por 5 min, ressuspendidas em meio DMEM (300 μ l) e injetada via intra- dérmica numa das quatro extremidades que tiveram intacto a drenagem dos nódulos linfáticos.
[00131] Para todas as preparações das composições se realizaram os controles de qualidade e os ensaios de esterilidade.
[00132] Os estudos realizados em pacientes foram realizados para avaliar a toxicidade, viabilidade e resposta imune ao tratamento. Os estudos foram aprovados pelo conselho Revisor Institucional do Instituto Alexander Fleming, e por um comitê de ética. Os critérios de viabilidade foram (a) melanoma cutâneo, histologicamente confirmado nos estádios IIB, IIC, III ou IV (AJCC); (b) pacientes com doença mínima ou não detectável(ND) após a cirurgia avaliados por Tomografia Axial Computada e valores da enzima lactato desidrogenase (LDH). Os pacientes de melanoma com primário desconhecido podiam ser incluídos no estudo; (c) idade entre 15 e 60 anos; (d) expectativa de vida > 6 meses; (e) rendimento (ECOG) 0 ou 1; (f) pacientes em estádio III tratados previamente com IFN-α que tiveram finalizado ou suspendido o tratamento por causa da progressão da doença, toxicidade ou outra razão clínica ou aqueles pacientes que não iniciaram o tratamento com IFN-α seis meses antes da cirurgia (g) adequado acesso venoso para o procedimento de leucoféreses, (h) Os critérios de eleição de laboratório foram: hemoglobina > 10 gr%; reconto de glóbulos brancos > 4800/mm3, plaquetas > 150.000/mm3; bilirrubina total e direta, transaminases oxalacéticas e transaminases glutâmico pirúvicas < 1.5 vezes o valor superior normal; LDH < 450 mU/ml; i) ausência de gravidez com β-HCG sérica determinada uma semana antes de cada aplicação nas mulheres pré-menopáusicas; (i) creatinina < 1.4 mg % (k) sem tratamento de quimioterapia, radioterapia ou tratamento biológico durante o mês prévio; (k) sem medicação com corticosteróides ou antiinflamatórios não-esterídeos (AINEs); (l) sem metástases de cérebro ativas; (m) ECG normal (n) todos os pacientes deviam de assinar o consentimento informado. Avaliações dos pacientes e esquema de tratamento:
[00133] A avaliação de base dos pacientes foi realizada dentro dos 35 dias prévios à primeira aplicação. A avaliação clínica incluiu uma historia médica clínica completa, exame físico, eletrocardiogramas (ECG), Tomografia Axial Computada (tórax, abdome, pélvis e cérebro), determinação do estádio tumoral, tamanho do tumor e documentação dos sítios de doença, exame químico de sangue e hematologia. Os pacientes selecionados foram submetidos a leucoféreses para obter PBMC para gerar CDs.
[00134] Os pacientes receberam 4 aplicações de CD/Apo-Nec em intervalos de 2 semanas. A inoculação se realizou via intradérmica (300 μ l) com cada dose se ensaiaram testes de DTH que consistiram na inoculação no antebraço de entre 5 e 20x106 células CD/Apo-Nec sem adjuvante. Analisaram-se os signos vitais e as reações cutâneas da DTH às 2, 24 e 48 hs pós-aplicação. No dia 70 se investigou o status dos pacientes mediante ecografia abdominal e raios X do tórax e ao dia 75 os pacientes finalizaram o protocolo com um exame clínico.
[00135] Para as aplicações das células Apo/Nec da invenção os pacientes foram injetados de forma intra-dérmica (id) numa das extremidades com gânglios linfáticos intactos. Vinte (20) pacientes receberam uma dose de 400 μ g rhGM-CSF (100 μ g por dia, quatro dias). No dia da aplicação, 0,1 ml de hGM-CSF foi misturado com Apo-Nec (16 x 106 células irradiadas em 0,3 ml) e BCG (1 x 106 unidades formadoras de colônias) em 0,05 ml). Durante os 3 dias seguintes, 0.1 ml de rhGM-CSF se injetou i.d. no lugar da aplicação. Cada paciente recebeu 4 aplicações a cada 3 semanas, logo após 1 composição a cada dois meses durante um ano, 1 composição a cada três meses durante o segundo ano e após continuaram com 1 composição a cada 6 meses. Análise estatística:
[00136] Todos os resultados adversos foram classificados de acordo a os Critérios Comuns de Toxicidade do Instituto Nacional do Câncer (NCI).
[00137] A população avaliada foi definida como todos os pacientes que receberam as quatro aplicações. Devido a que a maioria dos dados dos pacientes não se encontrava distribuídos com normalidade, todos eles foram analisados utilizando o teste de Wilcoxon's Rank Sum. O valor de DTH dos diferentes grupos que receberam diferente quantidade de CDs/Apo-Nec foi comparado entre cada grupo mediante ANOVA de uma variável e o teste de comparações múltiples de Dunnett. Considerou-se como significativo um valor de P < 0.05. Métodos para avaliar a resposta imunológica dos pacientes tratados:
[00138] Para avaliar a resposta imune dos pacientes, se obteve soro o dia 7 prévio à aplicação (soro pré), e o dia 15 posterior à finalização do tratamento (soro pós), as amostras foram conservadas a -80°C. As células PBMC se purificaram mediante uma gradiente de Ficoll-Hypaque e posterior centrifugação a partir de leucoféreses (pré-aplicação) ou a partir de 100 ml de sangue tomados 15 dias posteriores à última doses (pós-aplicação), os PBMC foram congelados em 50% de DMEM, 40% de albumina humana e 10% de DMSO até serem utilizados nos ensaios imunológicos. A tipificação HLA de HLA-A*0201 foi determinada logo após de uma incubação das amostras dos pacientes com anticorpos monoclonais de ratão anti-HLA*A0201 conjugados com FITC (BD-Pharmingen, San Jose, CA). Reação DTH:
[00139] Cada um dos dias de aplicação se realizou um teste de DTH no antebraço com 2x106 células Apo-Nec e a reação foi avaliada às 2, 24 e 48hs pós-aplicação. Estabeleceu-se o valor de intensidade DTH da seguinte maneira: 0: eritema < 0.5 cm;1: eritema macular 0.5-1.0 cm;(2) eritema macular 1.02.0 cm; 3: eritema macular > 2.0 cm o eritema papular <1.5 cm; 4: eritema papular > 1.5 cm. O store DTH corresponde ao somatório de todas as intensidades DTH individuais/4. Ensaio de proliferação:
[00141] Foram obtidos PBMC pré- e pós-composição mediante uma gradiente de densidade de Ficoll-Hypaque e foram conservados congelados em nitrogênio líquido até a sua utilização. Para os ensaios as células foram descongeladas e incubadas num meio AIM-V (Gibco, Grand Island, NY) durante 1hr a 37°C. Semearam-se 5x105 células em estantes de 96 microtubos em presença ou ausência de fitohemoaglutinina (PHA) (5 μ g/ml) (Gibco, Grand Island, NY) e se incubaram a 37°C por 72 hs. Durante as últimas 16 hs, as células foram pulsadas com (3H)dThd (Amersham, 1 μ Ci/microtubo) e logo após a lise celular mediu-se a radiatividade incorporada ao ADN (Cell Harvester, Nunc, Rochester, NY), num contador de cintilação liquida. Determinação de citoquinas:
[00142] As concentrações de IL-10 e IL-12 se determinaram no soro dos pacientes prévio à aplicação (soro pré-aplicação) e duas semanas após da quarta aplicação (soro pós-aplicação). Os soros foram congelados a -80°C até realizar o ensaio ELISA (OptEIA IL-10 and IL-12, BD Biosciences, San Diego, CA). Para cada ensaio se realizou uma curva de calibração e a concentração da amostra se calculou mediante uma analise de regressão lineal log-log usando o software Cembal 2.2. Medição de IFN-y pela técnica de ELISpot:
[00143] Como estimuladores, se purificaram células CD14+ a partir de PBMC de pacientes HLA-A2 positivos usando microesferas recobertas com anti-CD14 (Miltenyi Biotec, Paris France), foram cultivadas 5 dias em meio sintético SYN-H (AbCys, Paris, France) com 100 ng/ml de GM-CSF e 20 ng/ml de IL-4, e se maturaram com 10 μ g/ml de LPS durante 48hs adicionais. As CDs maduras foram pulsadas durante 1hr a 37°C com 10 μ g/ml do peptídeo correspondente diluído em meio SYH- H, logo foram lavadas e misturadas com PBMC até atingir uma relação E/T de 10:1, usando um total de 105 linfócitos CD8+ células/microtubos.
[00144] Rechearam-se estantes de 96 microtubos de nitrocelulose (MAIPS 450; Millipore, Bedford, MA) durante toda a noite a 4°C com 10 μg/ml de mAb anti-IFN-y humano (Mabtech, Nacka, Sweden) em buffer carbonato-bicarbonato pH 9.6, foram lavadas e bloqueadas com meio IMDM + 10% soro humano AB (Biowest, Nuaille, France) por 1hr a 37°C. As células de efeito foram semeadas em 100 μ L de meio e se agregaram células Branco até atingir uma relação E/T de 10:1, num total de 200 μ L/microtubo. Decorridas 24hs de incubação, os microtubos foram lavados 5 vezes com 0,1% de Tween-20 em PBS. As placas foram incubadas durante 2hs a temperatura ambiente com 1 μg/ml de mAb de ratão anti-IFN-y humano biotinilado (Mabtech) em PBS/HSA (0,4 g/L). Após vários lavados com 0,1% de Tween-20 em PBS, se agregou 1:1000 de fosfatase alcalina-estreptavidina (Mabtech) em PBS/HSA e se incubou durante 1hr a temperatura ambiente. Logo após as placas foram lavadas e se lhes agregou o substrato 5-bromo-4- cloro-3-indol fosfato/nitroazul de tetrazólio durante 30 minutos a temperatura ambiente (Mabtech). O desenvolvimento da cor foi detido lavando as placas com água. Logo após serem secadas foram cortadas as células T CD8+ que secretam IFN-y, visualizada por um ponto de cor na membrana de nitrocelulose, usando o leitor de sistema de leitura automática de imagens ELISpot (AID, Strassberg, Germany). Coloração com tetrâmeros HLA/peptídeos:
[00145] Utilizaram-se os tetrâmeros HLA-A0201 para identificar clones de linfócitos T CD8+ específicos para MART-1 (AAGIGILTV) ou gp-100 (KTWGQYWQV) conjugados com PE (ficoeritrina) ou APC (aloficocianina) respectivamente. O procedimento de coloração se realizou a 37°C por 15 minutos e em seguida foi colocado em gelo. Logo após, as amostras foram incubadas com anti-CD8 FITC (BD Biosciences, San Jose CA) a 4°C durante 40 minutos adicionais e se analisaram mediante FACS. Os controles positivos se realizaram com clones CTL (HLA A*0201 restritos) específicos para os antígenos MART-1 (M27: AAGIGILTV) e gp100 (G154: KTWGQYWQV) expandidos em ciclos de 14 dias em meio RPMI em presença de anticorpos anti—CD3 (OKT-3, BD Biosciences) a 30 ng/ml e séries de IL-2 (Chiron BV) a 300 UI/ml cada 3 dias, mais 10% soro AB humano inativo e antibióticos. Os controles negativos foram realizados com amostras de PBMC de doadores HLA-A0201 sãos. Determinação da resposta humoral:
[00146] As células viáveis que compreendem células Apo-Nec, foram misturadas em proporções iguais, se bloquearam com soro de coelho a 10% por 30 min e se incubaram com soro pré- e pós-aplicação diluído 1/10 por 1 hr a 4°C. Depois foram lavados, e as células se incubaram com um anticorpo anti imunoglobulinas humanas (IgG+A+M) feito em coelho (DakoCytomation, Glostrup, DK) por 1hr a 4 0C. As células foram lavadas, fixadas em paraformaldehido a 1% e se analisaram por FACS. De forma alternativa, as células primeiro foram permeabilizadas com saponina a 0,05% (Sigma- Aldrich, Saint Louis, MO) em PBS na etapa de bloqueio e a seguir se agregou 0,05% de saponina/PBS em cada uma logo após da etapa de reação. O soro normal foi usado como controle do primeiro anticorpo.
[00147] Prepararam-se extratos protéicos a partir das linhagens celulares Apo-Nec da invenção. Os pellets celulares se congelaram a -80°C, logo após foram descongelados e se trataram durante 20 min a 40C com buffer de lises (50 mM Tris-ClH pH7.5, 1% de NP40, 150 mM de NaCl, 5 mM de EDTA e 1 mM de PMSF). A suspensão foi homogeneizada com um Polytron (Brinkmann Instruments, USA) e foi centrifugada durante 40 min a 10.000 g. O sobrenadante em alíquotas congeladas se conservou a -20 °C. A concentração protéica foi medida segundo o método de Lowry. Prepararam-se da mesma forma extratos protéicos da linha celular de carcinoma de mama humano IIB-BR-G.
[00148] Os extratos protéicos foram corridos (50 μ g) numa gradiente SDS-PAGE 3%-12% e foram transferidos a membranas de nitrocelulose (poro 0.45 μ m, Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO, USA). Logo após serem bloqueadas com leite bovina desnatada a 3% (Moliko, Argentina), foram incubadas durante toda a noite a 4°C com soro do paciente diluído 1/10. Logo após de vários lavados as membranas se incubaram com um anticorpo anti IgG + A + M humanas feito em cabra conjugada com peroxidase de rábano picante (HRP) (Zymed, San Francisco, CA) e se revelaram com 4-Cl-naftol mais H2O2. Análise histopatológicos das metástases de melanoma:
[00149] Utilizaram-se biopsias embebidas em parafina para analisar as células linfóides e a infiltração de células CDs. Entre três e cinco seções foram coloreadas com hematoxilina/eosina ou sofreram imuno-coloração com anticorpos anti-CD4 (clone 1F6), anti-CD8 (clone C8E-144b), anti-CD20 (clone L26), anti-CD1a (clone 010) (DakoCytomation, Glostrup, DK) e anti-CD57 (clone NK1, Zymed, San Francisco, CA) e se revelaram com o reativo ABC e diaminobenzidina (DAB) ou Novared como substrato (Vectastain, Vector, Burlingame, CA). Realizaram-se a modo de controle reações omitindo os anticorpos primários. As seções se analisaram sob um microscópio Olympus BX40.
Claims (22)
1. Composição para o tratamento do melanoma, caracterizada pelo fato de compreender a mistura de linhagens celulares de melanoma alogeneica escolhidas dentre o grupo compreendido (a) Mel-XY1 (depositada em German Collection of Microorganisms and Cell Cultures DSMZ sob o número de acesso DSM ACC2830), (b) Mel-XY2 (depositada em German Collection of Microorganisms and Cell Cultures DSMZ sob o número de acesso DSM ACC2831), (c) Mel-XY3 (depositada em German Collection of Microorganisms and Cell Cultures DSMZ sob o número de acesso DSM ACC2832), (d) Mel-XX4 (depositada em German Collection of Microorganisms and Cell Cultures DSMZ sob o número de acesso DSM ACC2829) onde tais linhagens celulares são incapazes de proliferar, sendo que a linhagens celulares irradiadas compreendem uma quantidade de 35% a 60% de células apoptóticas e de 10% e 25% de células necróticas.
2. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de compreender adicionalmente excipientes, adjuvantes e modificadores de resposta imune.
3. Composição, de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de o adjuvante ser BCG (Bacilo Calmette-Guérin).
4. Composição, de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de o modificador de resposta imune ser selecionado do grupo compreendendo GM-CSF (fator estimulador de colônias de granulócitos-macrófagos), G-CSF (fator estimulador de colônias granulocitárias), IFNα (Interferon-alfa), ciclofosfamida e misturas dos mesmos.
5. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de compreender uma combinação das linhagens celulares de melanoma alogenicas (a) Mel-XY1 (depositada em German Collection of Microorganisms and Cell Cultures DSMZ sob o número de acesso DSM ACC2830), (b) Mel-XY2 (depositada em German Collection of Microorganisms and Cell Cultures DSMZ sob o número de acesso DSM ACC2831), (c) Mel-XY3 (depositada em German Collection of Microorganisms and Cell Cultures DSMZ sob o número de acesso DSM ACC2832) e (d) Mel-XX4 (depositada em German Collection of Microorganisms and Cell Cultures DSMZ sob o número de acesso DSM ACC2829), onde essas linhagens celulares foram irradiadas, e são incapazes de proliferar.
6. Composição, de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelo fato de compreender, adicionalmente, excipientes, adjuvantes e modificadores de resposta imune.
7. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de compreender uma combinação das linhagens celulares de melanoma alogenicas (a) Mel-XY1 (depositada em German Collection of Microorganisms and Cell Cultures DSMZ sob o número de acesso DSM ACC2830), (b) Mel-XY2 (depositada em German Collection of Microorganisms and Cell Cultures DSMZ sob o número de acesso DSM ACC2831) e (c) Mel-XY3 (depositada em German Collection of Microorganisms and Cell Cultures DSMZ sob o número de acesso DSM ACC2832), onde tais linhagens celulares foram irradiadas, e são incapazes de proliferar.
8. Composição, de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelo fato de compreender, adicionalmente, excipientes, adjuvantes e modificadores de resposta imune.
9. Composição para o tratamento de melanomas humanos, caracterizada pelo fato de compreender células dendríticas autólogas maduras, células dendríticas autólogas carregadas com uma combinação de linhagens de célula de melanoma humano heterólogo, células apoptóticas dessas linhagens celulares de melanoma humano heterólogo, e células necróticas dessas linhagens celulares de melanoma humano heterólogo, sendo que a linhagem celular de melanoma humano é uma combinação de: (a) Mel-XY1 (depositada em German Collection of Microorganisms and Cell Cultures DSMZ sob o número de acesso DSM ACC2830); (b) Mel-XY2 (depositada em German Collection of Microorganisms and Cell Cultures DSMZ sob o número de acesso DSM ACC2831); (c) Mel-XY3 (depositada em German Collection of Microorganisms and Cell Cultures DSMZ sob o número de acesso DSM ACC2832); e (d) Mel-XX4 (depositada em German Collection of Microorganisms and Cell Cultures DSMZ sob o número de acesso DSM ACC2829), onde essas linhagens celulares foram irradiadas, e são incapazes de proliferação.
10. Composição, de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pelo fato de que as células dendríticas maduras terem o fenótipo CD14-, CD11c+, CD1a+ e CD83+.
11. Composição, de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pelo fato de compreender adicionalmente excipientes, adjuvantes e modificadores de resposta imune.
12. Procedimento para preparação da composição, conforme definida na reivindicação 1, caracterizado pelo fato de compreender as etapas de: a) descongelar e cultivar as linhagens celulares selecionadas a partir do grupo compreendendo: (a) Mel-XY1 (depositada em German Collection of Microorganisms and Cell Cultures DSMZ sob o número de acesso DSM ACC2830), (b) Mel-XY2 (depositada em German Collection of Microorganisms and Cell Cultures DSMZ sob o número de acesso DSM ACC2831); (c) Mel-XY3 (depositada em German Collection of Microorganisms and Cell Cultures DSMZ sob o número de acesso DSM ACC2832); e (d) Mel-XX4 (depositada em German Collection of Microorganisms and Cell Cultures DSMZ sob o número de acesso DSM ACC2829); b) irradiar essas Linhagenss celulares; e c) adicionar adjuvantes e/ou excipientes.
13. Procedimento, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de as células serem irradiadas a um valor dentre 50 e 100 Gy.
14. Procedimento, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de o adjuvante ser BCG.
15. Procedimento, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de na etapa (c) e o imuno-modificador selecioando formar o grupo GM-CSF (fator estimulador de colônias de granulócitos-macrófagos) , G-CSF (fator estimulador de colônias granulocitárias) , IFNα (Interferon- alfa), ciclofosfamida e misturas dos mesmos.
16. Procedimento, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de compreender uma etapa de misturar as linhagens de células.
17. Procedimento para preparar a composição para tratamento de melanomas humanos, conforme definida na reivindicação 9, caracterizado pelo fato de compreender as etapas de: (a) descongelar e cultivar as linhagens celulares selecionadas a partir do grupo compreendedo (a) Mel-XY1 (depositada em German Collection of Microorganisms and Cell Cultures DSMZ sob o número de acesso DSM ACC2830), (b) Mel- XY2 (depositada em German Collection of Microorganisms and Cell Cultures DSMZ sob o número de acesso DSM ACC2831), (c) Mel-XY3 (depositada em German Collection of Microorganisms and Cell Cultures DSMZ sob o número de acesso DSM ACC2832), e Mel-XX4 (depositada em German Collection of Microorganisms and Cell Cultures DSMZ sob o número de acesso DSM ACC2829); (b) irradiar essas linhagens celulares; (c) obter células dendríticas autólogas; e (d) co-cultivar as células dendríticas autólogas linhagens irradiadas da etapa (b).
18. Procedimento, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de as células serem irradiadas a um valor dentre 50 e 100 Gy.
19. Procedimento, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de o co-cultivo ser conduzido em uma temperatura de 35 e 39°C, e por um período tempo de 6 e 72 horas.
20. Procedimento, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de na etapa (d) a relação entre células dendríticas autólogas e linhagens celulares ser de 1:1 a 3:1.
21. Procedimento, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de as células dendríticas da etapa (d) compreenderem células dendríticas imaturas.
22. Procedimento, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de compreender a etapa de misturar as linhagens de células.
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