BRPI0810343B1 - Dispositivo descartável para o cultivo e colheita de tecidos vegetais e/ou células, método de cultivo e colheita de um tecido vegetal e/ou células vegetais em um volume maior do que 400 litros e sistema de cultivo da célula vegetal - Google Patents
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Abstract
dispositivo descartável para o cultivo e colheita de tecidos vegetais e/ou células, método de cultivo e colheita de um tecido vegetal e/ou células vegetais em um volume maior do que 400 litros e sistema de cultivo da célula vegetal, um dispositivo descartável reutilizável para cultivo de tecidos vegetais ou células incluindo um recipiente não rígido com dimensões e orifícios de troca gasosa projetado para manter a saturação de oxigênio e forças de cisalhamento adequadas para cultivo de tecido ou células vegetais em 400 litros ou mias de meio de cultura é fornecido; também fornecido são os métodos para produção de uma proteína humana recombinante cataliticamente ativa na célula vegetal, utilizando um dispositivo descartável de uma das configuração da especificação.
Description
[001] A invenção é de um bioreator de grande escala para cultura celular/de tecido, e em particular, de um bioreator em grande escala para cultura de célula vegetal.
[002] Culturas de célula e tecido são rotineiramente utilizadas para produção em escala comercial de vários compostos incluindo, por exemplo, hormônios, enzimas, proteínas, antígenos, aditivos alimentares e pesticidas naturais.
[003] Tecnologia atualmente utilizada para a produção de célula e/ou cultura de tecidos em escala industrial baseia-se em vidro reutilizável ou sistemas de bioreatores em aço inoxidável que são caros para configurar ou manter. Tais sistemas de bioreatores requerem limpeza e desinfecção entre lotes, e limpeza mais intensa entre as trocas de produtos, devido à necessidade de validação cara e demorada para limpeza e presença de resíduo de agente de limpeza após a limpeza.
[004] Além disso, estes tipos bioreatores industriais empregam tecnologias de mistura caras e complicadas, tal como impulsores movidos por meio de sinais estéreis caros e complicados, alguns bioreatores caros compreendem uma construção de transporte aéreo de várias partes, destinada a fornecer mistura e saturação de gás do meio através do borbulhamento de gás no bioreator. Portanto, pressão do gás, tamanho da bolha e a criação de forças de cisalhamento indesejadas no meio necessitam a implementação de tecnologias complicadas de ventilação. Além disso, tais bioreatores são destinados de acordo com a capacidade de volume do pico que é exigida no momento. Assim, os problemas surgem quando a escala do bioreator da planta piloto para bioreator em grande escala, ou quando surge a necessidade de aumentar a produção para além da capacidade dos bioreatores existentes. A recente alternativa para operar um bioreator com grande capacidade é combinar um número de bioreatores menores de vidro ou de aço inoxidável cuja capacidade de volume total corresponde com as exigências, oferecendo um grau de flexibilidade para aumentar ou diminuir a capacidade geral. Portanto, o uso de vários bioreatores menores aumenta o custo e o tempo de manutenção e assim o uso de vários bioreatores pequenos é mais caro e trabalhoso que o uso de um único bioreator maior.
[005] Devido a essas limitações, o cultivo de células vegetais em bioreatores de tecnologia anterior resulta em produtos extraíveis relativamente caros, incluindo tanto metabólitos secundários e proteínas recombinantes que não podem competir comercialmente com produtos comparáveis produzidos por sistemas de produção alternativos.
[006] Atualmente, a proteína farmacêutica recombinante baseada em cultura única produzida em bioreatores de célula vegetal é uma vacina antiviral comercial para uso veterinário no tratamento do vírus Newcastle. Além destas vacinas, no entanto, Existem atualmente apenas alguns produtos metabólitos secundários produzidos por cultura celular em bioreatores, tais como metabólitos da planta com paclitaxel (Taxol) e Shikonin.
[007] Em escala comercial, sistemas de bioreatores empregam câmaras de crescimento permanente ou semipermanente. Apesar das câmaras de crescimento descartáveis serem bem conhecidas na tecnologia, tais câmaras de crescimento são tipicamente utilizadas para volumes de produção em pequena escala, tal como na fabricação da cerveja caseira e para trabalho experimental de laboratório, Bioreatores em pequena escala tipicamente empregam um saco descartável que pode ser utilizado em ambientes de laboratório.
[008] Bioreatores descartáveis apropriados para uso com volumes maiores também foram propostos. As exigências de agitação e ventilação do meio de cultura, que se tornam mais críticos com o aumento de escala de volume do reator, são abordadas em uma série de aspectos em sistemas de tecnologia anterior. Biotecnologia Applikon (Países Baixos) e Stedim Inc. (França) oferecem o sistema de bioreator de uso único Appliflex® utilizando sacos flexíveis de cultura de 50 litros, que são projetados para a colocação de uma plataforma motorizada que balança o saco para fornecer ventilação e agitação no meio de cultura. Um dispositivo descartável semelhante do bioreator é oferecido pela Wave Biotech, LLD (Somerset, NJ), que fornece sacos de cultura para volumes até 1000L, que são também aerados e agitados por uma plataforma motorizada. Hyclone Inc. (Logan, UT), em conjunto com Baxter Biosciences, oferecem um saco de cultura descartável (Bioreator de Uso Único “BUU”) projetado para cultura celular animal de até 250L, que é projetado para equipar recipientes de bioreatores de aço inoxidável. Ventilação e agitação são fornecidas por um acionador impulsor não descartável, que é anexado a uma unidade impulsora difícil integrada a um saco de cultura. A Patente Americana Aplicação No. 2005/0272146 por Hodge et al. revela um bioreator descartável de 150 litros com lâminas impulsoras ou outros meios mecânicos para mistura. No entanto, outro tipo de bioreator descartável apresenta um saco em forma de U, e requer um guindaste para agitar e ventilar o meio de cultura através do levantamento recíproco das laterais. Outra solução é baseada em uma pressão do manguito em torno do saco flexível de cultura, que é feito para inflar e esvaziar a intervalos regulares, fornecendo um tipo de compressão do movimento da mistura.
[009] Em todos os sistemas mencionados acima, sistemas de suporte e ventilação/agitação são complicados, caros, delicados e com capacidade limitada. Assim, embora o recipiente do reator em si possa ser descartável e destinado para uso único, o uso destes sistemas requer ferramenta de acompanhamento e de manutenção caros.
[010] Dispositivos de bioreatores descartáveis utilizando ar para agitação e ventilação da cultura também foram propostos, portanto, adaptação da bolha de ar baseada na ventilação e mistura para grandes volumes é problemática. Muitos bioreatores de volumes menor fornecem ventilação suficiente com uma entrada e borrifador de gás único, ou outro tipo de difusor para as bolhas do gás [ver, por exemplo, o bioreator Zeta oferecido pela Osmotec, Israel, (Agritech Israel, emissão No. 1, Outono de 1997, página 19)]. Uma desvantagem de tais sistemas é que a ventilação realizada pela introdução de bolhas de ar muito pequenas (do difusor) resulta em dano para as células, particularmente no caso de culturas de células vegetais que são particularmente sensíveis as forças de cisalhamento.
[011] Proteínas para uso farmacêutico foram tradicionalmente produzidas nos sistemas de expressão de mamíferos ou bactérias. Portanto, devido a simplicidade relativa de genes de introdução em vegetais e células vegetais para a produção em massa de proteínas e peptídeos, utilizando por exemplo, sistemas de biologia molecular tal como o método Agrobacterium method, a tecnologia de célula vegetal é cada vez mais popular como um sistema de expressão de proteína alternativa (Ma, J. K. C., Drake, P.M.W., e Christou, P. (2003) Nature reviews 4, 794-805).
[012] A cultura de célula vegetal difere da cultura de célula bacteriana ou de mamífero, não somente em termos de exigências metabólicas, mas também como uma função de extrema fragilidade de culturas vegetais geralmente de tamanho grande a forças de cisalhamento encontradas em bioreatores industriais convencionais. Assim, por outro lado, é importante fornecer mistura apropriada nas culturas de célula vegetal, para garantir ventilação suficiente de todos os aspectos de cultura de célula vegetal, mas, por outro lado, isto pode ser realizado de uma maneira adequada para o crescimento de células vegetais frágeis na cultura.
[013] Assim, existe uma necessidade constante para melhora nos sistemas existentes e dispositivos para cultura de célula/tecido descartável, a fim de fornecer maior rendimento e qualidade do produto, bem como custo-efetividade melhorada. A presente invenção fornece um bioreator reutilizável de grande volume, descartável, mas, eficaz para uso com uma variedade de culturas de células/tecidos para a produção de proteína recombinante, em que os problemas inerentes ao aumento de escala de reator descartável foram abordadas.
[014] De acordo com um aspecto da presente invenção é fornecido um dispositivo descartável para o cultivo e colheita de tecido vegetal e/ou células compreendendo um recipiente não rígido com um volume de pelo menos 400 litros e sendo configurado com orifícios de troca gasosa e um orifício de colheita permitindo o referido dispositivo ser utilizado continuamente por pelo menos dois ciclos de cultivo/colheita consecutivos, onde o dispositivo foi projetado e construído para manter a saturação de oxigênio e forças de cisalhamento adequadas para cultivo do referido tecido vegetal e/ou células.
[015] De acordo com outro aspecto da presente invenção é fornecido um método para cultivo e colheita de tecido vegetal e/ou células vegetais em um volume maior que 400 litros, o método compreende: (a) fornecendo um recipiente descartável não rígido com um volume de pelo menos 400 litros e sendo configurado com orifícios de troca gasosa e um orifício de colheita permitindo o referido dispositivo ser utilizado continuamente por pelo menos dois ciclos de cultivo/colheita consecutivas, onde o dispositivo é projetado e construído para manter a saturação de oxigênio e forças de cisalhamento apropriadas para cultivo do referido tecido vegetal e/ou células; e (b) fornecendo inóculo através do referido orifício de colheita; (c) fornecendo meio de cultura estéril e/ou aditivos estéreis; (d) opcionalmente iluminando o referido recipiente com luz externa; e (e) permitindo as referidas células e/ou tecidos crescer no referido meio para um rendimento desejado.
[016] De acordo com mais características nas configurações preferidas da invenção descrita abaixo, a referida saturação de oxigênio e as referidas forças de cisalhamento apropriadas para cultivo do referido tecido vegetal e/ou células são mantidas por combinação de valores ou intervalos de valores dos seguintes parâmetros: a) uma relação altura e peso; b) uma entrada da pressão de gás; c) uma densidade de entradas de gás por área transversal; d) uma taxa de ventilação na entrada; e e) um volume de bolha de gás na entrada.
[017] De acordo com outro aspecto da presente invenção é fornecido um sistema de cultivo de célula vegetal compreendendo um dispositivo descartável para cultivo e colheita de tecido vegetal e/ou células; e meio de cultura apropriado para cultivo do referido tecido vegetal e/ou células.
[018] De acordo com mais características nas configurações preferidas da invenção descrita abaixo o sistema compreende uma suspensão de célula vegetal ou crescimento de cultura de tecido no referido meio.
[019] De acordo com mais características nas configurações preferidas da invenção descrita abaixo a cultura de célula vegetal compreende células vegetais obtidas de uma raiz vegetal.
[020] De acordo com características nas configurações preferidas da invenção descrita abaixo as células vegetais são selecionadas de um grupo que consiste de célula de raiz transformada de célula de aipo, célula de gengibre, célula de raiz forte e célula de cenoura de Agrobacterium rihzogenes.
[021] De acordo com mais características em algumas configurações da presente invenção, as células vegetais são células do tabaco, mais preferencialmente células de Nicotiana tabaccum.
[022] De acordo com mais características em algumas configurações da presente invenção, as células do tabaco expressam a acetilcolinesterase humana recombinante. A acetilcolinesterase humana recombinante pode ser a acetrilcolinesterase-R. A acetilcolinesterase-R pode apresentam uma sequência de aminoácido como estabelecido na SEQ ID NO: 9.
[023] De acordo com mais características em algumas configurações da presente invenção as células do tabaco compreendem uma sequência de ácido nucléico que codifica um polipeptídio estabelecido na SEQ ID NO: 9.
[024] De acordo com mais características nas configurações preferidas da invenção descrita abaixo, os valores ou intervalo de valor de parâmetros são selecionados de pelo menos um dos seguintes valores ou intervalos de valores: a) uma relação da altura e volume de cerca de 0,06 a cerca de 1 centímetro por litro; b) uma entrada de pressão de gás de cerca de 100 KPa a 500 KPa; c) uma densidade de entradas de gás por área transversal de cerca de 20 entradas por metro quadrado a cerca de 70 entradas por metro quadrado; d) uma taxa de ventilação na entrada de cerca de 0,05 a 0.12 volumes de gás por volume médio por minuto; e e) um volume de bolha de gás na entrada de cerca de 20 milímetros cúbicos a cerca de 1800 milímetros cúbicos.
[025] De acordo com mais características nas configurações preferidas da invenção descrita abaixo, a saturação de oxigênio é pelo menos 15% volume por volume em um líquido contido dentro do referido recipiente.
[026] De acordo com mais características nas configurações preferidas da invenção descritas abaixo a combinação é de uma relação da altura e volume de cerca de 0,06 a cerca de 1 centímetro por litro e a pressão de gás na entrada é de cerca de 100 KPa a 500 KPa.
[027] De acordo com mais características nas configurações preferidas da invenção descrita abaixo a combinação da relação de uma altura e volume de cerca de 0,06 a cerca de 1 centímetro por litro e uma densidade de entradas de gás por área transversal de cerca de 20 entradas por metro quadrado a cerca de 70 entradas por metro quadrado.
[028] De acordo com mais características nas configurações preferidas da invenção descrita abaixo a combinação é uma relação da altura e volume de cerca de 0,06 a cerca de 1 centímetro por litro e uma taxa de ventilação na entrada de cerca de 0,05 a 0,12 volumes de gás por volume médio por minuto.
[029] De acordo com mais características nas configurações preferidas da invenção descrita abaixo a combinação é a relação altura e volume de cerca de 0,06 a cerca de 1 centímetro por litro e um volume de bolha de gás na entrada de cerca de 20 milímetros cúbicos a cerca de 1800 milímetros cúbicos.
[030] De acordo com mais características nas configurações preferidas da invenção descrita abaixo a combinação compreende o parâmetro de um volume de bolha de gás na entrada de cerca de 20 milímetros cúbicos a cerca de 1800 milímetros cúbicos.
[031] De acordo com mais características nas configurações preferidas da invenção descrita abaixo a combinação compreende o parâmetro de, e a pressão de gás na entrada é de cerca de 100 KPa a 500 KPa.
[032] De acordo com características nas configurações preferidas da invenção descrita abaixo a combinação compreende o parâmetro de uma densidade de entradas de gás por área transversal de cerca de 20 entradas por metro quadrado a cerca de 70 entradas por metro quadrado.
[033] De acordo com mais características nas configurações preferidas da invenção descrita abaixo a combinação ainda compreende o parâmetro de uma taxa de ventilação na entrada de cerca de 0,05 a 0,12 volumes de gás por volume médio por minuto.
[034] De acordo com mais características nas configurações preferidas da invenção descrita abaixo a combinação compreende uma relação da altura e volume de cerca de 0,06 a cerca de 1 centímetro por litro, a pressão de gás na entrada é de cerca de 100 KPa a 500 KPa, uma densidade de entradas de gás por área transversal de cerca de 20 entradas por metro quadrado a cerca de 70 entradas por metro quadrado e um volume de bolha de gás na entrada de cerca de 20 milímetros cúbicos a cerca de 1800 milímetros cúbicos.
[035] De acordo com mais características nas configurações preferidas da invenção descrita abaixo a combinação da relação da altura e volume de cerca de 0,06 a cerca de 1 centímetro por litro, uma entrada de pressão de gás de cerca de 100 KPa a 500 KPa, uma densidade de entradas de gás por área transversal de cerca de 20 entradas por metro quadrado a cerca de 70 entradas por metro quadrado, uma taxa de ventilação na entrada de cerca de 0,05 a 0,12 volumes de gás por volume médio por minuto; e uma bolha de gás na entrada de cerca de 20 milímetros cúbicos a cerca de 1800 milímetros cúbicos.
[036] De acordo com características nas configurações preferidas da invenção descrita abaixo da relação de altura e volume é cerca de 0,1 cm acerca de litro a 0,5 cm por litro.
[037] De acordo com mais características nas configurações preferidas da invenção descrita abaixo da relação altura e volume é cerca de 0,44 cm por litro.
[038] De acordo com mais características nas configurações preferidas da invenção descrita abaixo a pressão de gás na entrada é cerca de 150 KPa a 400 KPa.
[039] De acordo com mais características nas configurações preferidas da invenção descrita abaixo a pressão de gás na entrada é cerca de 150 KPa e 250 KPa.
[040] De acordo com mais características nas configurações preferidas da invenção descrita abaixo a densidade das entradas de gás por área transversal é cerca de 40 por metro quadrado a cerca de 60 por metro quadrado.
[041] De acordo com mais características nas configurações preferidas da invenção descrita abaixo descrita abaixo a densidade das entradas do gás por área transversal é 55 por metro quadrado.
[042] De acordo com mais características nas configurações preferidas da invenção descrita abaixo a taxa de bolha de gás é cerca de 20 litros por minutos a cerca de 50 litros por minuto, preferencialmente 30 litros por minuto.
[043] De acordo com mais características nas configurações preferidas da invenção descrita abaixo o volume da bolha de gás na entrada é cerca de 300 milímetros cúbicos.
[044] De acordo com mais características nas configurações preferidas da invenção descrita abaixo o recipiente descartável é transparente e/ou translúcido.
[045] De acordo com mais características nas configurações preferidas da invenção descrita abaixo o recipiente é feito de um material que é selecionado do grupo compreendendo polietileno, policarbonato, um copolímero de polietileno e nylon, PVC e EVA.
[046] De acordo com mais características nas configurações preferidas da invenção descrita abaixo o recipiente é feito de um laminado de mais de uma camada dos referidos materiais.
[047] De acordo com mais características nas configurações preferidas da invenção descrita abaixo o dispositivo ainda compreende uma estrutura de suporte para apoiar o referido dispositivo.
[048] De acordo com mais características nas configurações preferidas da invenção descrita abaixo estrutura de suporte compreende uma estrutura cilíndrica rígida apresentando uma base cônica.
[049] De acordo com mais características nas configurações preferidas da invenção descrita abaixo o orifício de colheita é localizado da parte inferior da referida extremidade inferior do recipiente.
[050] De acordo com mais características nas configurações preferidas da invenção descrita abaixo do referido orifício de colheita está localizado próximo a parte inferior da extremidade inferior do referido recipiente, como aquele da extremidade de cada ciclo de colheita referido resíduo do referido meio contendo células e/ou tecidos automaticamente permanecem na referida extremidade inferior do referido recipiente até um nível abaixo do nível da referida colheitadeira.
[051] De acordo com mais características nas configurações preferidas da invenção descrita abaixo da referida extremidade inferior é substancialmente cônica.
[052] De acordo com mais características nas configurações preferidas da invenção descrita abaixo da referida extremidade inferior é substancialmente frusta-cônica.
[053] De acordo com mais características nas configurações preferidas da invenção descrita abaixo do referido recipiente compreende um volume preenchível interno de entre cerca de 400 litros e cerca de 30000 litros, preferencialmente entre cerca de 500 litros e 8000 litros, e preferencialmente cerca de 1000 litros.
[054] De acordo com mais características nas configurações preferidas da invenção descrita abaixo o método ainda compreende verificação de contaminantes e/ou a qualidade de células/tecidos que são produzidos no referido recipiente: se os contaminantes são encontrados ou as células/tecidos que são produzidos são de baixa qualidade, o dispositivo e seus conteúdos são eliminados; se os contaminantes não são encontrados, colheita de uma porção de referido meio contendo células e/ou tecido.
[055] De acordo com mais características nas configurações preferidas da invenção descrita abaixo, enquanto a colheita da referida porção, deixa um resíduo do meio contendo células e/ou tecido no referido recipiente, onde o referido resíduo do meio serve como inoculo para o próximo ciclo cultura/colheita.
[056] De acordo com mais características nas configurações preferidas da invenção descrita abaixo o método ainda compreende: fornecendo meio de cultura estéril e/ou aditivos estéreis para a próxima cultura/ciclo de colheita; e repetição do ciclo de crescimento até os referidos contaminantes são encontrados ou as células/tecidos que são produzidos são de baixa qualidade, em que o dispositivo e seus conteúdos são eliminados.
[057] De acordo com mais características nas configurações preferidas da invenção descrita abaixo, onde o ar estéril é fornecido através dos referidos orifícios de troca gasosa continuamente através de pelo menos um ciclo de cultura/colheita.
[058] De acordo com mais características nas configurações preferidas da invenção descrita abaixo o ar estéril é fornecido através das referidas multiplicidades de entrada de gás em pulsos durante pelo menos um ciclo de cultivo/colheita.
[059] De acordo com mais características nas configurações preferidas da invenção descrita abaixo o dispositivo não apresenta meios mecânicos para mistura e ventilação do meio de cultura.
[060] A presente invenção sucessivamente aborda as deficiências das configurações atualmente conhecidas por fornecer um alto volume, bioreator reutilizável, mas descartável, eficaz para uso com uma variedade de culturas de células/tecidos para a produção de proteína recombinante, e métodos e sistemas para uso do mesmo.
[061] A invenção é aqui descrita, por meio de um único exemplo, com referência aos desenhos que acompanham. Com referência específica agora aos desenhos em detalhes, ressalta-se que os elementos mostrados são por meio de exemplo e para efeitos de discussão ilustrativa das configurações preferidas da presente invenção somente, e são apresentados para fornecer que o que se acredita ser o mais útil e uma descrição prontamente entendida dos princípios e aspectos conceituais da invenção. A este respeito, nenhuma tentativa é feita para mostrar detalhes da estrutura da invenção em mais detalhes que é necessário para o entendimento fundamental da invenção, a descrição tomada com os desenhos tornando aparente para aqueles qualificados na arte como as diversas formas de invenção pode ser incorporada na prática.
[062] Nos desenhos:
[063] a figura 1 ilustra os principais componentes da uma configuração exemplar de um dispositivo da presente invenção na visão lateral transversal;
[064] a figura 2 ilustra os principais componentes de uma configuração exemplar do dispositivo da presente invenção e uma estrutura de apoio exemplar na elevação frontal;
[065] a figura 3 é um histograma mostrando a saturação de oxigênio superior alcançada nas culturas de célula vegetal utilizando o Bioreator Descartável em Grande Escala. Células de cenoura foram inoculadas em meio de cultura em bioreatores de diferentes volumes: frascos Erlenmeyer, (colunas azuis); reatores de 10 litros (PX-10, colunas vermelhas); reatores de 100 litros (PX- 100, colunas brancas) e reatores de 400 litros (PX-400, colunas laranja), e cultura para 3-4 dias sob condições ótimas de cada sistema (ver Materiais e Métodos abaixo). Cada reator é equipado com um chip de silicone estéril [(Cat. Número SFPST3YOPSUP (Presens Presision Sensing GmbH)] para determinação de saturação de O2 nos dias indicados [O2 é medido utilizando Fibox 3 (Presens Presision Sensing GmbH)]. Observar os níveis superiores de saturação de O2 em bioreatores em grande escala (PX-100 e PX-400);
[066] a figura 4 é uma fotografia de um Western blot mostrando a produção superior de GCD recombinante utilizando Bioreator Descartável em Grande Escala. Amostras de 5pl de extrato bruto em extratos de cultura de célula de 4 ou 7 dias em bioreatores de diferentes volumes, preparados como descrito abaixo (ver Materiais e Métodos), foram separados sobre o PAGE, absorvidos por uma membrana de transferência de nitrocelulose, e reagido com anticorpo policlonal anti-GCD específico de coelho. Bandas foram visualizadas pelo substrato Quimioluminescente pelo SuperSignal West Pico. Linha 1- reator de 10 litros com borrifador; Linha 2- reator de 10litros com abertura de orifício de 8mm; Linha 3- reator de 10 litros com 100% de oxigênio adicionado do dia 4; Linhas 4 e 5- reator de 400 litros, dia 4; Linha. 6-reator de 400 litros, dia 7; Linhas 7 e 8- reator de 100 litros, dia 7; Linhas 9 e 10- prGCD padrão 25ng. Observar o rendimento significativamente superior de GCD no Bioreator Descartável em Grande Escala, como comparado com reatores de 10 e 100 litros; as figuras 5a-5b são análises RP-HPLC mostrando a eliminação de Antiespumante-C utilizando uma cromatografia de troca iônica. 0,075% de emulsão Antiespumante C (Dow Corning ®, Corning, NY) foi carregada sobre uma coluna de troca catiônica de 15 ml (Bio Rad USA), e amostras de escoamento, lavagem e gradiente de sal (0,2M NaCl; 1.2M NaCl; e 12%EtOH em 1.2M NaCl) eluído monitorado em 262nm para a detecção de Antiespumante- C. Figura 5a mostra a detecção de um Antiespumante- C na solução carregada sobre a coluna. Figura 5b mostra a detecção de um Antiespumante-C no escoamento da coluna. Observar que a ausência de retenção do Antiespumante- C sobre a coluna;
[067] a figura 6 é uma análise SDS-PAGE mostrando a identidade de GCD produzido em Bioreatores Descartáveis em Grande Escala. Amostras de GCD de reatores de 400 litros (Linha 10μg), reatores de 80 litros (linhas 2 e 3, 10μg e 20μg, respectivamente), e comercialmente Cerezima glicocerebrosidase preparada (10μg e 20μg) (linhas 4 e 5, 10μg e 20μg, respectivamente) foram separados sobre SDS-PAGE. Bandas foram visualizadas por coloração com Coomassie blue. Linha 6 são os marcadores de peso molecular. Observar a identidade eletroforética do GCD a partir de Bioreatores em Grande Escala, Bioreatores em Pequena Escala, e a preparação de glicocerebrosidase comercial;
[068] a figura 7 é um Western blot mostrando a identidade de GCD produzido e Bioreatores Descartáveis em Grande Escala. Amostras de GCD de reatores de 400 litros (Linhas 1, e 2, 50 ng e 100 ng, respectivamente), reatores de 80 litros (linhas 3 e 4, 50 ng e 100 ng, respectivamente), e Cerezima® glicocerebrosidase preparada comercialmente (linhas 5 e 6, 50 ng e 100 ng, respectivamente) foram separadas sobre SDS-PAGE, absorvidas por uma membrana de transferência de nitrocelulose, e reagida com anticorpo policlonal anti-GCD específico de coelho. Bandas foram visualizadas por Substrato Qumioluminescente SuperSignal West Pico. Observar a identidade eletroforética, imunológica do GCD a partir de bioreatores em Grande Escala, bioreatores em pequena escala, e a preparação de glucocerebrosidase comercial (Cerezima®);
[069] as figuras 8a-8d são gráficos mostrando o mapeamento de peptídeos (digestão tríptica) de glicocerebrosidase produzida em Bioreatores em Grande Escala. Amostras de glicocerebrosidase coletadas de Bioreatores Descartáveis em Pequena Escala (80 litros) e Bioreatores Descartáveis em Grande Escala (400 litros) foram digeridos com protease, separados sobre RP-HPLC coluna Júpiter 4u Proteo 90A (Phenomenex, 00G- 4396-E0) para produzir um aminoácido “impressão digital”, e os fragmentos monitorados em 214 nm e 280 nm. Figuras 8a e 8b são os perfis de glicocerebrosidase produzida em bioreatores de 10 litros (8a, detecção em 214nm; 8b, detecção em 280nm). Figuras 8c e 8d são os perfis de glicocerebrosidase produzidos em bioreatores de 400 litros (Figura 8c- detecção em 214 nm, Figura 8d- detecção em 280 nm. Observar a identidade do produto para Bioreator Descartável em Grande e Pequena Escala;
[070] as figuras 9a-9b são gráficos mostrando a análise RP- HPLC de glicocerebrosidase produzida em Bioreatores Descartáveis em Grande Escala. Glicocerebrosidase coletada de Bioreatores Descartáveis em Grande Escala (400 litros) foi purificado como detalhado abaixo, e analisado sobre coluna C-4 RP-HPLC e monitorado em 214 nm (Figura 9a) e 280 nm (Figura 9b). Observar que o prGCD parece ser um pico único com tempo de retenção de 64.12 minutos, semelhante àquele do prGCD padrão (64.70 minutos);
[071] a figura 10 é uma fotografia de um gel IEF mostrando a pureza superior do prGCD produzido utilizando Bioreator Descartável em Grande Escala. Amostras de prGCD produzidas em Bioreator Descartável em Grande Escala (400 litros), e purificado em 5 processos de purificação de coluna descritos abaixo foram separados em gel de focalização isoelétrica, juntamente com prGCD purificado em Bioreator Descartável em Pequena Escala (10 litros). Linha 2- Grande Escala, 3o estágio de purificação; Linha 3- Grande Escala, 4o estágio de purificação; Linha 4- Grande Escala, 5o estágio de purificação; Linha 5- Pequena Escala; Linhas 1 e 6, IEF PI padrão. Observar a identidade, e alto nível de pureza do prGCD do Bioreator descartável em Grande Escala em todos os estágios de purificação;
[072] a figura 11 é um Western blot mostrando a pureza do prGCD produzido utilizando Bioreator Descartável em Grande Escala. Amostras de GCD de reatores de 400 litros (linhas 1 e 2, 50ng e 100ng, respectivamente), reatores de 80 litros (linhas 3 e 4, 50ng e 100ng, respectivamente), Cerezima glicocerebrosidase preparada comercialmente (linhas 5 e 6, 50ng e 100ng, respectivamente) e proteínas do hospedeiro da cenoura (PHC) (linhas 7 e 8, 5 0ng e 100ng, respectivamente) foram separados sobre SDS-PAGE, absorvidos e reagidos com anticorpo policlonal antiPHC específico. Bandas foram visualizadas por Substrato Quimioluminescente SuperSignal West Pico. Observar a ausência de impurezas no Bioreator Descartável em Grande Escala, como em todos as outras preparações prGCD;
[073] a figura 12 é uma fotografia da extremidade inferior de um bioreator descartável exemplar da presente invenção, mostrando múltiplas entradas de gás para fornecer ventilação e mistura do meio de cultura, e uma estrutura de suporte exemplar rígida cônica;
[074] a figura 13é uma fotografia mostrando a bateria de Bioreatores Descartáveis em Grande Escala da presente invenção;
[075] a figura 14 é uma fotografia de um bioreator exemplar da presente invenção mostrando um orifício de colheita reutilizável;
[076] a figura 15 é uma fotografia de Western blot mostrando a imunodetecção da AChE humana recombinante expressa no vegetal. 50 (linhas 3 e 7), 100(linhas 2 e 6) e 200 ng (linhas 1 e 5) de AChE-R humana recombinante em Bioreator Descartável em Grande Escala de acordo com uma configuração da presente invenção (linhas 1-3) e AChE-S humana recombinante disponível comercialmente (linhas 4-6) foram detectadas utilizando uma afinidade purificada de anticorpo policlonal de cabra levantadas contra um peptídeo no N-terminal da AChE de origem humana (Santa-Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) (idêntico em AChE-R e AChE-S). Linha 4 é o padrão de Peso Molecular. Anticorpo com forte ligação é evidente em todas as amostras;
[077] a figura 16 é uma fotografia do Flamingo™ uma proteína de coloração não-específica do gel SDS-PAGE da AchE-R humana recombinante expressa no vegetal, produzida em Bioreator Descartável em Grande Escala de acordo com uma configuração da presente invenção, quando comparado com o perfil de AChE-S disponível comercialmente. AChE-R expresso nos vegetais (linhas 1-3) e AChE-S produzida nas células de mamíferos (linhas 5-7) foram separadas como na Figura 13, e o gel corado com reagentes FlamingoTM como descritos a seguir. Observar que o perfil de migração AChE-R corresponde ao da AChE-R detectado por imunoensaio utilizando anticorpos anti AChE (Figura 13, acima). Além disso, a única banda observada no gel como na Figura 13 indica eficiência de purificação; e
[078] a figura 17é um ensaio Karnovsky em gel manchado para detectar a atividade catalítica da acetilcolinesterase em células vegetais cultivadas em um Bioreator Descartável em Grande Escala. A acetilcolinesterase-R cataliticamente ativa foi purificada a partir de células BY-2 coletadas da união de lotes de células, cultivados em Bioreator Descartável em Grande Escala de 400 L de acordo com uma configuração da presente invenção. Quantidades diminuídas de proteína purificada de células (linhas 1 e 4 = 200ng; linhas 2 e 5 = 100 ng, linhas 3 e 6 = 50 ng) foram separadas em gel de poliacrilamida 10 % sob condições de não-desnaturação, lavado e tratado para revelar a atividade catalítica da acetilcolina (mancha Karnovsky). Quantidades correspondentes de acetilcolina-S (linhas 4-6) foram incluídas como os controles. Eletroforese de AChE-R e AChE-S foi realizada em gel de poliacrilamida 10% sob condições de não-desnaturação. Géis foram corridos a 4°C, enxaguados 3 vezes com H2O e incubados por lh com agitação em tampão contendo acetiltiocolina (0,5 mg/mL; Sigma), acetato de sódio (65 mM, pH 6,0; Sigma), citrato de sódio (5 mM; Sigma), sulfato cúprico (3 mM; Sigma), e ferricianida de potássio (0,5 mM; Riedel De Haen). Atividade catalítica foi visualmente detectada. Setas superiores indicam a migração do tetrâmero de AChE-S. Setas inferiores indicam migração de AChE monomérica.
[079] A presente invenção é de um dispositivo descartável, reutilizável para cultivo de tecidos ou células vegetais. Especificamente, o dispositivo da presente invenção inclui um recipiente não rígido com dimensões e orifícios de troca gasosa projetados para manutenção da concentração de oxigênio dissolvido e forças de cisalhamento apropriadas para cultivo de tecido ou células vegetais em 400 litros ou mais de meio de cultura. Tal dispositivo pode ser utilizado para cultivo de células vegetais transformadas para a produção de material recombinante, material ativo biologicamente derivado de vegetal (por exemplo, farmacêutico) a partir de células e/ou meio de cultura. Também é fornecido um sistema de cultivo de célula vegetal utilizando o dispositivo da presente invenção.
[080] Os princípios e operação da presente invenção pode ser melhor compreendido com referência aos desenhos e descrições que os acompanham.
[081] Antes de explicar pelo menos uma configuração da invenção no detalhe, deve ser entendido que a invenção não é limitada na sua aplicação aos detalhes estabelecidos na seguinte descrição ou exemplificado pelos Exemplos. A invenção é capaz de outra configuração ou de ser praticada ou realizada de várias maneiras. Também, deve ser entendida que a fraseologia e terminologia empregada aqui é para propósito de descrição e não deve ser considerada como limitante.
[082] Como descrito acima, aumento de escala para bioreatores descartáveis em grandes volumes requerem soluções únicas para os problemas de ventilação e mistura. Alguns bioreatores de tecnologia anterior empregaram gás para este propósito. A Patente Americana de Aplicação No. 2005/0282269 para Proulx et al. revela um bioreator descartável apresentando múltiplas entradas de gás com difusores de gás e filtros embutidos nos orifícios de entrada, posicionados na extremidade inferior do recipiente, a fim de fornecer ventilação e mistura. Tal configuração é limitada na qual os filtros estando em contato com o meio líquido, tenderia a ficar bloqueado e interferir com o fornecimento adequado de gás. Nenhuma capacidade de volume ou dimensão é revelada.
[083] Outro tipo de bioreator descartável utilizando gás para ventilação e agitação é oferecido pela Cellexus Biosystems, PCC (Cambridge, Inglaterra). Este bioreator é um saco que apresenta um tubo borrifador integral afixado ou colocado junto da extremidade inferior interna do dispositivo, para introduzir ar ou gás para ventilação e mistura. Os sacos do bioreator da Cellexus são projetados de acordo com a geometria assimétrica, única, que concentra a maioria do volume fluido do saco na metade superior do bioreator. Este projeto requer um anexo de apoio especialmente projetado para operação (Cellmaker Lite™).
[084] A Patente Americana No: 6,432,698 para Gaugler et al. revela um saco de cultura descartável, flexível para cultura de nematódeos. O saco de cultura é equipado com uma entrada de gás e difusor, na forma de um tubo, para ventilação e mistura do meio de cultura. Volumes de até 200 litros são previstos, embora nenhuma redução para praticar é fornecida. Nenhuma dimensão específica é revelada.
[085] A Patente Americana Aplicação No. 2005/0272146 para Hodge et al. Revela um bioreator descartável de 150 litros apresentando lâminas impulsoras integradas para mistura. Mistura de meio de cultura em bioreatores pelo impulsor é conhecida por criar forças de cisalhamento não adequadas para cultivo de células vegetais.
[086] A Patente Americana No. 6,391,683 para Shaaltiel et al., (que está aqui incorporada pela referência como se completamente demonstrada) revela dispositivos descartáveis de cultivo que compreendem sacos não rígidos que apresentam entrada de gás e orifícios de saída, projetados ou para uso único, ou para múltiplos ciclos de cultura e colheita. O dispositivo emprega pressão de ar através do volume e número de bolha cuidadosamente regulada, para misturar e ventilar a cultura. Cultura eficiente de células vegetais transformadas expressam exatamente uma variedade de proteínas recombinantes heterólogas (mamífero e não-mamífero) foram relatadas utilizando os bioreatores como descrito por Shaaltiel (ver Patente Americana No. 6,391,683, Patente Americana Aplicação No. 10/784,295; Publicações Internacional de Patente PCT Nos. W02004/091475, W02005/080544 e WO 2006/040761, todos os que são aqui incorporado pela referência como se completamente aqui incorporada). No entanto, Shaaltiel et al., em 6,691,683, revela um projeto adequado para volumes de tamanho médio e menores, limitando os rendimentos das proteínas recombinantes sintetizadas.
[087] Embora a redução da presente invenção para a prática, os presentes inventores projetaram um bioreator descartável em grande escala, reutilizável construído de materiais não rígidos transparente ou translúcido. O bioreator apresenta orifícios de amostragem que permite o uso por pelo menos dois ciclos de cultivo consecutivos, dimensões específicas e orifícios de troca gasosa fornecendo gás de uma maneira suficiente para misturar e ventilar a cultura de célula no bioreator com concentração adequada de oxigênio dissolvido e forças de cisalhamento para crescimento eficiente de células vegetais em volume maior que 400 litros.
[088] Assim, de acordo com um aspecto da presente invenção é fornecido um dispositivo descartável para cultivo e colheita de tecidos e/ou células vegetais.
[089] O dispositivo da presente invenção inclui um recipiente não rígido com um volume de pelo menos 400 litros e sendo configurado com orifícios de troca gasosa e um orifício de colheita permitindo o dispositivo ser utilizado continuamente por pelo menos dois ciclos de cultivo/colheita consecutivos.
[090] Embora o dispositivo presente possa ser utilizado para cultivo de qualquer tipo de célula ou tecido, é projetado para permitir cultivo eficiente em grande escala de células ou tecidos vegetal.
[091] Saturação de oxigênio do meio é crucial para o crescimento eficiente de células e expressão de proteína recombinante, e, portanto, crítico para a operação adequada de bioreatores e seu uso na produção de produtos de células recombinantes. Saturação de oxigênio de bioreatores para crescimento de cultura de célula vegetal é mesmo mais importante, já que as células vegetais são mais susceptíveis a flutuações na saturação de oxigênio que células bacterianas e de mamíferos (ver Schlatmann et al, Biotech. Bioeng., 1995;45:435-39). Além disso, as células vegetais são sensíveis ao ambiente hidrodinâmico nos bioreatores convencionais, mais provavelmente devido aos tamanhos de célula vegetal maior, extensiva vacuolização e padrões de agregação. Assim, quando a ventilação do meio de cultura pela introdução de bolhas de gás dentro do recipiente também fornece mistura, forças de cisalhamento em detrimento as células vegetais frágeis devem ser evitadas. Recentemente, as células vegetais devem ser susceptíveis a forças de cisalhamento subletal, respondendo com uma característica resposta “sub- lítica”, que por sua vez limita significativamente a eficiência dos bioreatores de célula vegetal (Namdev e Dulop, App. Biochem e Biotech, Part A, Frontiers in Bioprocessing, 1995).
[092] Assim, o dispositivo da presente invenção mantém a saturação de oxigênio e forces de cisalhamento adequadas para cultivo de tecido vegetal e/ou células em volumes de 400 litros ou maior, empregando parâmetros, ou combinação de parâmetros críticos para a determinação da saturação de oxigênio e forças de cisalhamento na cultura.
[093] Saturação de oxigênio e forças de cisalhamento adequadas para cultivo de tecidos vegetais e/ou células no dispositivo são mantidas por uma combinação de valores ou intervalos de valor de a) uma relação de altura e volume; b) uma pressão da entrada do gás; c) uma densidade de entradas de gás por área transversal; d) uma taxa de ventilação na entrada; e) um volume de bolha na entrada do gás. Relação Altura para Volume:
[094] Métodos de mistura mecânicos são não adequados para o uso em bioreatores de célula vegetal, especialmente onde grandes volumes do meio são processados. Ventilação e mistura do meio de cultura em um bioreator em grande escala pode ser realizado pelo movimento de bolhas de gás através do meio. Quanto maior o contato da bolha de gás com o meio, maior o potencial para troca gasosa, e mais eficiente a ação da mistura do gás no meio. Assim, quando a relação altura e volume de bioreatores de pequeno volume podem permitir uma flexibilidade maior, a relação atura e volume de dispositivos de bioreator para ser utilizados com grandes volumes (por exemplo, 400 litros ou mais) devem ser mantidos dentro de um intervalo de cerca de 0,06 a 1 centímetro por litro. Relação altura e volume pode ser calculada a partir da altura (comprimento) do recipiente do dispositivo e a área média transversal do dispositivo. Como utilizado aqui, volume do dispositivo é a altura vezes a área transversal. Por exemplo, para um bioreator com uma altura (comprimento) de 200 centímetros e um volume de 400 L (apresentando, por exemplo um raio médio de cerca de 25 centímetros), a relação altura e volume é 200/400, ou 0,5; para um bioreator com uma altura de 300 cm e um volume de 3000L, a relação altura e volume é 300/3000, ou 0.1 Exemplos de intervalos de relações de altura e volume adequados para uso com o bioreator da presente invenção são cerca de 0,06 a 1 centímetro por litro, preferencialmente cerca de 0,1 a cerca de 0,5, preferencialmente cerca de 0,44 centímetros por litro.
[095] Além disso, será apreciado que a relação altura e volume possa ser calculada utilizando ou o volume interno preenchível de potencial total do recipiente, ou utilizando uma porção projetada que é o volume interno funcional, preenchível do recipiente, sem o “headspace” tipicamente encontrado acima do nível de fluido em um bioreator.
[096] Pressão do gás na entrada: A fim de fornecer gás suficiente (por exemplo, ar ou oxigênio) para mistura e ventilação do meio de cultura de bioreator em grande escala, pressão do gás da(s) entrada(s) necessitam ser suficientes para superar a força para baixo da coluna do líquido no bioreator, e ao mesmo tempo evitar forças de cisalhamento associadas com a criação de muitas bolhas, ou bolhas de tamanhos não adequados para cultura de célula vegetal. Bioreatores em grande escala da presente invenção, com uma relação adequada de altura e volume para cultura de célula vegetal, requer maior pressão de gás na entrada do gás do que em bioreatores de volumes menores. Pressão do gás é expressa em unidade bar, onde 1 bar é 100.000 pascais (Pa), ou 1.000.000 dinas por cm2. Medidores de pressão para acompanhamento e reguladores de pressão para controle da pressão do gás na entrada(s) do gás são bem conhecidas na técnica, e amplamente disponível comercialmente. Exemplos de intervalos de pressões de gás na entrada adequado para o bioreator da presente invenção estão no intervalo de cerca de 150 KPa a 400 KPa, preferencialmente cerca de 150 KPa e 250 KPa.
[097] Densidade das entradas do gás por área transversal: Bioreatores de pequeno volume são tipicamente limitados a uma única ou poucas entradas de gás a fim de fornecer bolhas de gás suficiente do volume desejado, para mistura e ventilação do meio de cultura no recipiente do bioreator. Por outro lado, bioreatores em grande volume, tais como os dispositivos da presente invenção, requerem uma densidade maior de entradas de gás a fim de superar as forças da coluna do meio de cultura no dispositivo, e alcançar os intervalos de pressão de gás de entrada requerido para fornecer mistura e ventilação de maneira adequada para uso com culturas de célula vegetal. A fim de fornecer controle sobre a pressão na entrada (s) do gás e manutenção de tamanho ótimo da bolha para mistura e ventilação do meio de cultura em bioreator em grande volume, uma multiplicidade de entradas de gás é fornecida, posicionadas em uma dada densidade no recipiente não rígido e descartável do dispositivo. A densidade das entradas de gás é expressa como o número de entradas por metro quadrado da superfície externa do recipiente do dispositivo. Exemplos de intervalos e densidade das entradas de gás adequados para uso em bioreator da presente invenção são cerca de 20 entradas por metro quadrado da superfície do recipiente, e cerca de 70 entradas por metro quadrado. Preferencialmente, a densidade das entradas de gás por área transversal é cerca de 40 a 60 entradas por metro quadrado, preferencialmente 55 entradas por metro quadrado.
[098] Taxa de ventilação na entrada: Aumento da ventilação em geral (isto é - a presença de uma troca gasosa mais rápida), e aumento de oxigênio especificamente, ambos aumentam a taxa de crescimento de células em cultura. Bioreatores de pequeno volume para cultura de célula vegetal tipicamente fornecem ar na taxa de ventilação de 0,15-0,3 vvm (volume de ar por volume médio por minuto), na entrada de gás, com aumento da taxa de ventilação como volume aumentado. Portanto, a eficácia das bolhas de ar na promoção da circulação celular é diferente em volumes anexos menor que um volume equivalente maior, assim a taxa de ventilação não proporcional é requerida para promover a circulação de ar e distribuição de oxigênio em um grande volume, comparado com aquele em número de volumes menores com o mesmo volume combinado do meio.
[099] Embora a redução da presente invenção para a prática, os inventores surpreendentemente constataram que em vez de taxa de ventilação proporcionalmente aumentado (vvm) com aumento do volume, resultados melhorados foram alcançados pela redução do intervalo de ventilação, medido como vvm, em bioreatores em grande escala. Exemplos de intervalos adequados de taxas de ventilação na(s) entrada(s) de gás para cultivo de células vegetais em bioreator em grande escala são cerca de 0,05 - 0,12 vvm, e preferencialmente cerca de 0,07 vvm a cerca de 0,1 vvm. A vantagem de tais taxas de ventilação reduzida inclui um rendimento maior nos bioreatores de grande volume, uma melhorada eficiente energia, grandemente significante no cultivo em escala industrial.
[0100] Volume da bolha de gás na entrada: A importância da aparelhagem adequada de mistura em reatores em grande escala não pode ser exagerada. Em alguns casos, particularmente relacionados as células vegetais, o tamanho da bolha de gás é de grande importância para cultura eficiente e crescimento de células em um bioreator. Pequenas bolhas podem na verdade danificar as células vegetais, e um volume médio da bolha de não menos que 20 milímetros cúbicos substancialmente superam este problema potencial. Assim, junto com a pressão do gás e número de entradas, controle do volume da bolha de gás na entrada é importante para alcançar mistura e ventilação do meio de cultura eficaz para o crescimento de células vegetais. Embora o tamanho das bolhas emitido pela entrada (s) do gás irá variar de acordo com o uso do dispositivo, exemplos de intervalos adequados de volume de bolha de gás na entrada sejam de 20 a mais de 1800 milímetros cúbicos, preferencialmente cerca de 40 milímetros cúbicos a cerca de 1000 milímetros cúbicos, preferencialmente cerca de 100 milímetros cúbicos a cerca de 500 milímetros cúbicos, preferencialmente cerca de 300 milímetros cúbicos. Em casos onde bolhas menores são desejadas, um borrifador pode ser utilizado na entrada do gás para reduzir o tamanho das bolhas, mas não abaixo do tamanho adequado para bioreatores de célula vegetal em grande escala.
[0101] O bioreator descartável da presente invenção portanto, apresenta um número de vantagens sobre os dispositivos conhecidos atualmente, incluindo, mas não limitado a, fornecer condições de cultura em grande volume enquanto mantém ventilação superior e uma mistura não- mecânica de cultura de células vegetais e meio, de acordo com os parâmetros aqui mencionados, assim alcançando rendimentos superiores e pureza de células cultivadas e produtos derivados de células.
[0102] A Figura 1 ilustra uma configuração do dispositivo da presente invenção que é referido aqui como dispositivo 10.
[0103] Como mostrado na Figura 1, dispositivo 10 inclui um recipiente 12 que serve para cultivo e colheita de tecido vegetal e/ou células. Recipiente 12 é mostrado parcialmente completo com um líquido e assim seu estado inflado (e relativamente rígido) na Figura 1, portanto, deveria ser observado que o recipiente 12 é preferencialmente construído com um recipiente não rígido (por exemplo construído de materiais flexíveis). Assim, a pressão dos conteúdos do recipiente 12 sobre as paredes do recipiente mantém a forma do recipiente 12. Quando esvaziado, ou parcialmente preenchido, recipiente 12, pela natureza de seu projeto não rígido, pode ser parcialmente ou completamente destruídas. Esta característica de recipiente 12 facilita o armazenamento e transporte quando vazio. Recipiente 12 apresenta um volume interno que pode ser acomodado entre cerca de 400 litros e cerca de 30000 litros, preferencialmente entre cerca de 500 litros e 8000 litros, preferencialmente entre cerca de 600 e 3000 litros. Recipiente 12 pode apresentar uma relação atura- volume de cerca de 0,06-1 centímetro por litro.
[0104] Recipiente 12 é preferencialmente construído de um polímero tal como polietileno, policarbonato, um copolímero de polietileno e nylon, cloreto de polivinil (PVC), acetato de vinil etil (EVA) e álcool etileno vinil (EVOH). Diferentes graus, densidades e tipos de polímeros podem ser utilizados, tal como um polietileno de baixa densidade (LDPE), polietileno de densidade muito baixa (VLDPE), polietileno de densidade ultrabaixa (ULDPE), polietileno linear de baixa densidade (LLDPE), e assim por diante. Recipiente 12 pode ser construído por soldagem de folhas de polímeros, moldagem por sopro de polímeros fundidos, ou qualquer outro método de fabricação de polímero plástico padrão conhecido na tecnologia.
[0105] Em uma configuração preferida, recipiente 12 é construído a partir de um laminado de várias camadas de um ou mais tipos de polímeros. O laminado pode conter 2, 3, 4 e até 7, 9, 15 ou mais camadas, que podem ser feitas de materiais flexíveis semelhantes ou diferentes, de espessura variada, os materiais e espessura selecionados, por exemplo, de acordo com o volume fluido do recipiente 12. As camadas podem ser produzidas por coextrusion. Laminados podem ser projetados para fornecer maciez específica e textura áspera para as superfícies interna e externa do recipiente, maior ou menor força de tensão, elasticidade, maciez, flexibilidade, tenacidade, durabilidade, processabilidade etc. O material pode ser selecionado apresentando níveis baixos, ou preferencialmente desprovido de animais inativos derivados de agentes de processamento. Deslizamento e/ou agentes antibloqueio tal como sílica ou terra diatomáceas podem ser incluídas nas camadas de laminado para reduzir a fricção e/ou impedir a autoadesão.
[0106] Recipiente 12 da presente invenção pode ser feito de materiais projetados para fornecer característica transparente e/ou translúcida ao recipiente, em algumas configurações, o pode não ser translúcido onde a luz será danificada para as células ou o produto. Como utilizado aqui, transparente é definido como claro, facilmente transmite a maior parte de toda a luz, enquanto que translúcido é definido como transmissor de alguma, mas não toda a luz. Em uma configuração, o dispositivo é para células vegetais em cultura, que não possuem a capacidade de foto síntese. Em outra configuração, onde o dispositivo é utilizado para cultura de outros tipos de células, por exemplo, células de musgo, ou células de alga, bactérias fotossintéticas que apresentam capacidade de fotossíntese, podem ser crescidas no dispositivo. Preferencialmente, a luz transmitida para o volume interno do recipiente é de comprimento de onda adequado para uso pela luz fotossintética e outros pigmentos de luz de células vegetais cultivadas no bioreator. Luz pode também ser necessária para a produção de metabólitos secundários, por exemplo antocianina, por células de uva do vinho. Preferencialmente, recipiente 12 é projetado a partir de materiais que permitem a observação visual ou instrumentada (por exemplo, espectrofotometria) e/ou monitoramento do volume interno, a fim de detectar alterações na cultura e/ou meio de cultura potencialmente indicativo dos estados da cultura (por exemplo, coloração, coagulação celular, turbidez resultante da contaminação).
[0107] Recipiente 12 pode ser fabricado em qualquer configuração desejada, preferida é uma configuração como luva pontiaguda que apresenta uma parte superior 14 e uma parte inferior 16 (cônica na Figura 1) conectada através de duas paredes laterais 18 que são planas quando o recipiente 12 está vazio e fornece uma forma substancialmente cilíndrica de transversal quando o recipiente 12 está cheio. Outras formas transversais como retangulares ou poliédricas, por exemplo, pode m ser adequadas.
[0108] Será apreciado que o formato cilíndrico é mais adequado para recipientes de cultura de célula, fornecendo ainda mais o fluxo de fluído e sem obstáculos por toda parte, para misturar com o mínimo de turbulência e de geração de forças de cisalhamento indesejável prejudicial para as culturas de células vegetais. De preferência, a parte inferior 16 é a forma adequada para minimizar a sedimentação. Por exemplo, aparte inferior 16 pode ser substancialmente inferior frusta-cônico (como mostrado na Figura 1), pelo menos, ter uma parede inclinada para cima ou paredes embora a redução da invenção para a prática, o inventor, descobriu que essa forma é superior a forma cônica para evitar a sedimentação de células, o que pode aumentar o decaimento e morte celular, influenciando a viabilidade global da cultura. Alternativamente, a parte inferior 16 pode ser substancialmente cilíndrica ou, alternativamente, convexa. As configurações acima mencionadas da parte inferior 16 permitem gás fornecido ao recipiente 12 próximo a parte inferior 16 para induzir um movimento de mistura para os conteúdos do recipiente que efetivamente minimizar nela a sedimentação. No entanto, a parte inferior 16 pode ser substancialmente lisa em outras configurações da presente invenção.
[0109] Recipiente 12 pode ser fabricado por moldagem/soldagem de dois painéis (formando as paredes laterais 18) de material adequado. Por exemplo, duas folhas de um material polimérico podem ser cortadas em uma forma aproximadamente retangular alongada e colocadas um sobre o outro. As folhas são, então, coladas de uma maneira bem conhecida na tecnologia para formar costuras ao longo das bordas dos dois lados mais longos, e ao longo da periferia de uma das extremidades mais curtas, e de novo, outra paralela e internamente deslocada para formar uma costura na parte superior 14 do recipiente.
[0110] A parte inferior 16 do recipiente pode ser formado pela fusão da moldagem da extremidade restante curta das folhas ao longo de duas linhas de costura inclinada, mutuamente convergentes pelas costuras dos laterais longas. Opcionalmente, as duas linhas de costura inclinada podem ser unidas acima do seu ápice por outra fusão da linha de costura soldada aproximadamente ortogonal ao longo das costuras laterais. Antes de soldagem por fusão as duas folhas juntas, cubos de plástico rígido podem ser soldados nos locais correspondentes aos pontos de ligação para a entrada correspondente e orifícios de saída (descrito abaixo).
[0111] Recipiente 12 também pode ser fabricado a partir de uma luva contínua de material polimérico flexível, eliminando a necessidade para costuras de soldas ao longo das laterais do recipiente, e fornecendo um processo contínuo, transversal circular ininterrupta na maior parte da altura do recipiente. Utilizando uma luva do material para fabricação é desejável, pois a ausência de costuras de solda minimiza a turbulência e forças de cisalhamento durante a ventilação e mistura do meio de cultura.
[0112] Como é mostrado na Figura 1 recipiente 12 inclui ainda um orifício de colheita 19I para a colheita pelo menos uma parte do meio contendo células e/ou tecido permitindo que o dispositivo 10 seja utilizado continuamente durante pelo menoses dois cultivos consecutivos ou ciclos de colheita, sem necessidade de limpeza, esterilização e/ou ensaios, entre os ciclos. Alternativamente, a colheita pode ser efetuada através de um orifício adicional de colheita (19II), localizado na parte inferior do bioreator para drenar todo o conteúdo do bioreator, permitindo assim toda a colheita de cultura dentro do bioreator. A segunda porção remanescente do meio contendo células e/ou tecido serve como inóculo para a cultura seguinte e ciclo de colheita, onde o meio de cultura e/ou aditivos necessários podem ser fornecidos, conforme descrito abaixo. Orifício (s) de Colheita 19 também podem ser usados para introduzir o volume inicial de inóculo para o recipiente, bem como para permitir que o material colhido seja escoado para fora do recipiente.
[0113] O orifício(s) 19 da colheita inclui tubo 20 de colheita com uma entrada 22 de colheita, que está em comunicação com o volume interno do recipiente 12, e uma saída 24 de colheita de 24, que está posicionada fora do recipiente 12. Alternativamente o orifício (s) 19 da colheita pode ser feito de um único orifício, soldados dentro do recipiente 12, que toca o volume interno a partir da lateral interna, e tem uma saída para o lado externo do recipiente. Tubo 20 de colheita feito de um material polimérico ou ligas como é bem conhecido na tecnologia.
[0114] Já que muitas vezes a colheita é dificultada pela presença de grupos de células, tubo 20 de colheita é preferencialmente fabricado com um grande diâmetro interno (por exemplo, no intervalo de 1-10 cm) e/ou que tenham um grau de elasticidade que permite a evacuação dos entupimentos.
[0115] A posição do orifício 19 de colheita é selecionado de acordo com o volume do recipiente 12, de tal forma que a porção do meio e células e/ou tecido que permanece é uma fração pré-determinada do volume de contentores 12 (por exemplo, 5-35%).
[0116] Orifício 19 da colheita pode estar localizado em uma posição próxima a parte inferior do recipiente 12, que permite a colheita de mais conteúdo do recipiente 12, mantendo uma parte do meio contendo células e/ou tecidos para serem utilizados como inóculo. Alternativamente, ou adicionalmente, um orifício 19II da colheita pode ser localizado mais abaixo da parte inferior 16 do recipiente 12, e o operador pode, opcionalmente, manualmente, em seguida, garantir que uma parcela adequada do meio contendo células e/ou tecido poderia permanecer no recipiente 12 após a colheita de uma parcela desejada de médio e células e/ou de tecido. Tendo o orifício 1911 em uma posição inferior a parte inferior 16 permite a remoção de todos ou a maioria do meio. Será apreciado que embora as referidas posições do orifício (s) 19 e 1911 de colheita são apresentadas como alternativas acima, tanto podem ser incorporados em um único dispositivo 10 proporcionando com alternativas de orifícios de colheita a um operador.
[0117] Orifício (s) 19 de colheita inclui ainda um regulador 26 de fluxo. Regulador 26 de fluxo pode ser, por exemplo, uma válvula para regular o fluxo de material dentro ou fora do recipiente 12 através do orifício (s) 19 da colheita. Fluxo também pode ser regulado através de um conector asséptico que é feito de um material durável, esterilizável, como vidro, aço inoxidável, plástico rígido, e assim por diante. Orifício(s) 19 de colheita também pode incluir um preventivo de contaminação (não apresentado), como uma armadilha de fluidos, a fim de impedir a introdução não intencional de material dentro do recipiente 12 após a colheita.
[0118] Recipiente 12 pode incluir um orifício adicional de amostragem que é semelhante em construção ao orifício(s) 19 de colheita e pode ser posicionado na proximidade do orifício 19 de colheita. Recipiente 12 inclui ainda uma entrada 51 adicional facultativa, para a introdução de meio ou outros aditivos. Em algumas configurações, entrada 51 aditiva está localizada na extremidade superior do recipiente 12, em comunicação com o “headspace” acima do meio de cultura. Em outras configurações, entrada 51 aditiva está localizada mais próxima à porção média ou na extremidade inferior do recipiente 12. Em outras configurações, entrada 51 aditiva também pode incluir um preventivo de contaminação (não apresentado), como uma armadilha de fluidos, a fim de impedir a introdução não intencional de material dentro do recipiente de 12 durante ou após a adição de meio etc.
[0119] Dispositivo 10 ainda inclui orifícios de troca gasosa para a comunicação de gases dentro e fora do recipiente 12. Orifícios de troca gasosa incluem pelo menos um orifício 28 de entrada de gás, para percolação de gás (como o ar, oxigênio ou outros gases), através do meio, para ventilação e mistura de cultura de célula vegetal, e pelo menos um orifício 30 de escape de gás, para ventilação do gás que é percolado através dos conteúdos do recipiente 12 (por exemplo, meio de cultura e células). Orifícios de entrada de gás e orifícios de saída podem ser equipados com um filtro 49, descrito aqui em detalhes. Em uma configuração, uma multiplicidade de entradas de gás está prevista, a fim de distribuir melhor a pressão de ar, proporcionando a entrada necessária para o fluxo desejado de bolhas de ar.
[0120] Orifício(s) 28 de entrada de gás pode ser conectado a um fornecimento de gás (bomba, por exemplo) através de um tubo de abastecimento de gás ou tubos.
[0121] Orifício 28 de entrada de gás pode ser feito de silicone flexível (por exemplo) ou de material rígido (por exemplo, aço inoxidável). Entrada 34 do gás (entrada 34 de gás (I) corresponde ao orifício de entrada do gás (28 (I) na posição I, e entrada 34 (II) de gás corresponde ao orifício 28 (II) de entrada do gás, na posição II) do orifício (s) 28 de entrada do gás é projetado para fornecer as bolhas de gás de volume adequado para a ventilação e mistura do meio de cultura vegetal, e evitar a sedimentação, sem gerar forças de cisalhamento indesejáveis, conforme descrito acima. Entrada 34 de gás pode ser variada na forma (estreito, largo, afilado, cônico, arredondado etc.) para fornecer um formato e tamanho desejado de bolha. Alternativamente, o orifício pode ser formado em uma peça com diferentes diâmetros de abertura interna ou externa, como descrito para o orifício 19 da colheita.
[0122] Orifícios 28 e 30 de troca gasosa, orifício (s) 19 de colheita e os orifícios de amostragem opcionais são formados através da criação de uma abertura na superfície do recipiente 12 e reforçando a abertura em torno do orifício com material adicional rígido ou não-rígido como é bem conhecido na tecnologia.
[0123] A fim de proporcionar condições adequadas de mistura e ventilação, uma multiplicidade de orifícios 28 de entrada de gás pode ser fornecida com uma densidade de 20 a 70 entradas por metro quadrado. Orifícios 28 de entrada do gás podem ser posicionados ao redor do perímetro do recipiente 12, a uma distância pré-determinada da extremidade inferior 16. Localização dos orifícios 28 de entrada de gás é determinada pelo volume e altura do recipiente, e pelo tipo de ventilação desejada para o uso em cultura específica vegetal. Orifícios 28 de entrada de gás podem ser localizados 15-65 centímetros a partir da parte inferior 16 do recipiente. Em uma configuração da invenção, pelo menos um dos orifícios de entrada do gás está em uma posição abaixo do nível do orifício 18 de colheita.
[0124] Orifícios 28 adicionais de entrada de gás podem ser fornecidos conforme a necessidade, por exemplo, para recipientes que apresentam dimensões de altura muito grande, ou para recipientes com altos volumes, a fim de fornecer maiores volumes de gás, sem aumentar a pressão de entrada do gás ou o volume de bolhas de gás. Orifícios 28 adicionais de entrada de gás podem ser localizados em qualquer local na superfície do recipiente 12, e são preferencialmente localizadas na metade inferior da altura do recipiente 12, para fornecer mistura e ventilação substancial do meio. Essa configuração, apresentando uma multiplicidade de orifícios de entrada do gás é indicada aqui por orifícios de entrada do gás em posições I [28 (I)] e II [28 (II)], com as entradas 34 (I) e 34 (II) de gás, respectivamente, situado a uma distância um do outro, para proporcionar eficiente mistura e ventilação de cultura de célula vegetal. Orifícios de entrada de gás podem incluir ainda um mecanismo de prevenção de contaminação, como um filtro 49 ou uma armadilha (não mostrado), que pode impedir a entrada de gases, líquidos ou sólidos contaminantes (por exemplo, os micróbios no ar) para o volume interno do recipiente 12 e do meio de cultura.
[0125] Recipiente 12 inclui orifício 30 de escape de gás para ventilação e remoção de acúmulo de gás acima do meio de cultura. Orifício 30 de escape de gás está localizado na metade superior, de preferência uma porção superior de um terço do recipiente 12, em uma posição substancialmente acima do nível do fluido (por exemplo, meio de cultura), de modo a estar em comunicação com o “headspace” acima do meio de cultura. Abertura 46 externa do escape de gás do orifício 30 de escape do gás pode abrir para o ambiente, e do fluxo do gás de escape não está regulamentada no orifício 30 de escape do gás. Opcionalmente, e, alternativamente, o orifício 30 de escape do gás pode ainda incluir um regulador 48 de escape do gás (por exemplo, válvula ou grampo de pressão), que regula o fluxo de gás fora do recipiente 12, e assim pode ser usado para criar uma pressão positiva de gás dentro do recipiente 12 e assim manter o recipiente 12 amplamente inflado e na forma cilíndrica desejada. Orifício 30 de escape de gás pode ainda incluir um mecanismo de prevenção de contaminação, como um filtro 49 ou uma armadilha, que pode impedir a entrada de contaminantes do gás, líquidos ou sólidos (por exemplo, os micróbios do ar) para o volume interno do recipiente 12 e meio de cultura.
[0126] Já que o recipiente 12 da presente invenção é projetado para uso com volumes de pelo menos 400 e até vários milhares de litros de meio de cultura, e uma vez que é flexível por natureza, dispositivo 10 inclui ainda uma estrutura de apoio para apoiar recipiente 12 na posição.
[0127] Como é mostrado na Figura 2, suporte 50 pode incluir uma estrutura cônica, que é projetada para fornecer apoio para o recipiente 12 sem exercer força sobre o recipiente 12 ou o seu conteúdo.
[0128] Suporte 50 pode ser fabricado em aço, madeira, plástico ou cerâmica. O suporte pode ser feito de tubo cilíndrico ou elíptico de pouco peso formando uma estrutura como uma rede em foram de anel 52 e membros de apoio como o bastão 54. Alternativamente, os membros de apoio podem ser placas, conectadas a membros como bastão e ainda conectados a membros horizontais, em forma de anel. As placas podem ser contínuas, essencialmente criando um suporte como um escudo para o recipiente, ou pode ser como um bordão, fornecendo anéis de elementos de apoio amplo, com espaço entre eles. Estrutura 50 de suporte pode ser livre, ou ligado a rodízios (não mostrado) para mobilidade, ou pode ser ainda reforçada pela ligação a uma estrutura rígida, como uma parede, piso, coluna etc.
[0129] Recipiente 12 é descartável e, portanto, é projetado para ser descartados após o uso (uma ou mais ciclos de cultivo) com perda mínima e de impacto ao meio ambiente. Dispositivos feitos de plástico, como os plásticos flexíveis utilizados no presente dispositivo, por exemplo, são relativamente baratos e podem ser descartados após o uso com perda econômica negligenciável, se assim desejar. O descarte destes dispositivos do bioreator geralmente não apresentam uma desvantagem econômica para o usuário, já que mesmo os baixos custos de capital destes itens são compensados pela facilidade de utilização, armazenamento e outras considerações de ordem prática. Eliminação é vantajosa na medida em que elimina a necessidade de lavagens extensivas com desinfetantes e outros produtos químicos que podem contaminar o meio ambiente. Assim, dispositivos do bioreator descartável polimérico como um recipiente 12 podem ser facilmente reciclados, reduzindo a poluição e o impacto ambiental da sua utilização.
[0130] Embora recipiente 12 pode ser esterilizado e reutilizado, é de preferência previsto em um formulário de pré-esterilizado, eliminando assim a necessidade de procedimentos de esterilização caros e que consomem tempo. A esterilização do recipiente não-rígido pode ser realizada utilizando processos de esterilização úmido e/ou seco. Preferencialmente, a esterilização é um processo de esterilização a seco adequado para uso com materiais plásticos, flexíveis, não rígidos mencionados, como a radiação gama ou feixe de elétrons, gás (por exemplo, óxido de etileno) esterilização, e similares, bem conhecido na tecnologia.
[0131] De acordo com as configurações preferidas da presente invenção, a operação do dispositivo individual descrito anteriormente e/ou bateria é controlada por um computador (não mostrados). O computador é opcional e, de preferência capaz de controlar esses parâmetros de funcionamento da bateria e/ou de um dispositivo de acordo com a presente invenção a uma ou mais de temperatura, quantidade e tempo de gás ou a combinação do gás que entra no recipiente, quantidade e tempo de gás a ser autorizados a sair do recipiente, a quantidade e o momento da adição de pelo menos um material (como nutrientes, meio de cultura e assim por diante), e/ou a quantidade de luz. O computador pode, opcionalmente, também ser capaz de detectar a quantidade de resíduos produzidos.
[0132] O computador está ligado de preferência a vários instrumentos de medição presentes no que diz respeito ao funcionamento da presente invenção, como um exemplo de um sistema para automatizar ou semi- automatizar a operação da presente invenção. Por exemplo, o computador está ligado de preferência a um medidor (não mostrado) ou medidores para controlar o fluxo de um gás ou uma combinação de gás. O medidor é de preferência ligado a um tubo para ligação a um suprimento de ar adequado, e controla o fluxo de ar ou de outros gases do tubo.
[0133] O computador é também de preferência ligado a um medidor de temperatura, de preferência, que é mais presente no ambiente do recipiente 12, mas preferência não dentro do recipiente 12. O computador também é opcional e, de preferência capaz de controlar um mecanismo para controlar a temperatura, tal como um aquecedor e/ou resfriador, por exemplo.
[0134] O computador é opcional e, de preferência ligado a um medidor para controlar o fluxo do meio e/ou outros nutrientes de um recipiente de nutriente/meio para o recipiente 12.
[0135] O computador está ligado, de preferência a pelo menos um orifício do recipiente, e mais preferivelmente está ligado, pelo menos, ao orifício 19 da colheita 19. O computador, opcionalmente, pode controlar um amostrador automático e/ou colheitadeira para remover partes do conteúdo do recipiente de um orifício de amostragem opcional, para o teste e/ou colheita (não mostrados). O computador também pode, opcionalmente, ser ligado a um analisador para analisar essas porções de conteúdo, por exemplo, a fim de fornecer um retorno para o funcionamento do computador.
[0136] Como é mencionado acima, dispositivo 10 é projetado para o cultivo de culturas de células vegetais. Os meios de cultura adequados para a cultura de grande volume de células vegetais no dispositivo da presente invenção pode ser qualquer meio de cultura de célula vegetal conhecido na tecnologia. Específico, mas não limitando exemplos de meios de cultura adequados são Murashige e meio Skoog (Sigma Ltd, St Louis, MO), meio Anderson, Schenk e meio Hildebrandt e similares. Muitos meios de cultura de tecidos vegetais são comercialmente disponíveis (ver, por exemplo, Laboratórios de Fitotecnologia, Shawnee Mission, KY).
[0137] A expressão “cultura de tecido vegetal” refere-se a qualquer tipo de tipo selvagem (ocorrência natural) de células vegetais ou células vegetais geneticamente modificadas (por exemplo, capaz de expressão transitória ou estável de genes exógenos). De preferência, refere-se às culturas de células que produzem um princípio ativo que é comercialmente pretendido para uso na indústria farmacêutica (fármaco ou APIs de fármaco), indústria de alimentos (por exemplo, sabor, aroma), agricultura (por exemplo, pesticidas), cosméticos e similares.
[0138] Preferencialmente, a cultura de célula vegetal compreende as células vegetais obtidos a partir de um tecido vegetal, como raiz ou meristema foliar. Preferencialmente, as células vegetais são selecionadas a partir do grupo consistindo de célula de raiz, célula de aipo, célula de gengibre, tabaco, alfafa, tomate, alface, célula de raiz forte e célula de cenoura transformadas do Agrobacterium rihzogenes. Culturas de células adicionais que podem ser cultivadas na presente invenção incluem levedura, musgo, algas e bactérias fotossintetizantes.
[0139] Culturas de célula vegetal adequadas para uso com os dispositivos e métodos da presente invenção incluem, mas não estão limitados a, as linhagens celulares estabelecidas e linhagens de célula geradas a partir de raízes de plantas, folhas, caule, flores e similares. Exemplos não- limitantes de linhagens celulares estabelecidas são Nicotiana tabacum L. cv Amarelo-2 Brilhante (BY-2) e Nicotiana tabacum L. cv. Linhagens de células Petit Havana.
[0140] É de assinalar que a pressão de entrada de gás aumentou, a densidade de entrada do gás aumentou, taxa de ventilação do gás aumentou e o volume de gás necessário para fornecer a mistura e ventilação adequadas para Bioreatores em Grande Escala da presente invenção, pode apresentar um possível problema de formação de espuma do meio da célula vegetal, que podem ser prejudiciais para as células e os conteúdos do meio. Métodos conhecidos na tecnologia para a inibição da formação de espuma incluem, mas não estão limitados ao uso de agentes anti-espuma, como silicones, fosfatos orgânicos e álcoois, que agem para causar pequenas bolhas a fundir-se em maiores, bolhas menos prejudicial. Agentes antiespumante de grau alimentício comumente usados na indústria e processamento de alimentos incluem, por exemplo, polidimetilsiloxano e simeticona. O uso de agente antiespumante em Bioreator Descartável em Grande Escala na presente invenção é descrito em detalhes na seção Exemplos abaixo designadas.
[0141] A presente invenção também se refere a um método para cultive e colheita de célula vegetal em da planta e de colheita em Bioreator Descartável em Grande Escala. O dispositivo é opcional e, de preferência configurado de acordo com o dispositivo descrito acima, de preferência mais de acordo com o dispositivo descrito no Exemplo 1 a seguir. Neste método, as células vegetais são preferencialmente colocadas em um recipiente do dispositivo de acordo com a presente invenção. Opcionalmente, e mais preferencialmente, as células vegetais são cultivadas em suspensão.
[0142] De acordo com as configurações preferidas da presente invenção, as células vegetais são cultivadas em suspensão em meio líquido, com pelo menos um gás estéril ou combinação de gás (multiplicidade gases), adicionados quando necessário. Opcionalmente, e de preferência, o gás estéril compreende uma combinação de gases estéreis, que mais preferivelmente compreende ar estéril. O gás estéril e/ou combinação de gás é preferencialmente adicionado ao recipiente através de uma entrada de ar, de preferência ligada a um filtro de esterilização (de preferência, um filtro de 0,2 micra), durante cada ciclo, de forma contínua ou em pulsos, como descrito anteriormente.
[0143] Meio de cultura estéril e/ou aditivos estéreis são preferencialmente colocados no recipiente e transferidos através da entrada 51 dentro do bioreator, de preferência com filtro de esterilização ou filtros, como descrito anteriormente.
[0144] As células vegetais (como um exemplo de um inóculo axênico) são opcionalmente e de preferência adicionadas através da colheitadeira. Opcionalmente, e de preferência, as células vegetais no recipiente 12 podem ser expostas à luz, por exemplo, através de uma luz externa (uma fonte de iluminação externa ao recipiente), especialmente se o recipiente é transparente e/ou translúcido. Opcionalmente, nenhuma fonte de luz é utilizada, opcionalmente, o recipiente é mantido em ambiente escuro.
[0145] As células são permitidas a crescer para um rendimento desejado de células e/ou o material produzido pelas células, como uma proteína ou metabólito secundário, por exemplo. De acordo com as configurações preferidas, o excesso de ar e/ou gases residuais são preferencialmente permitidos para deixar o recipiente através de uma saída de gás, opcionalmente, através de um filtro, opcionalmente, e mais, preferivelmente de forma contínua e/ou de forma intermitente.
[0146] Além disso, opcionalmente, de preferência, o material no recipiente (como o meio de cultura celular, por exemplo) é verificado para um ou mais contaminantes e/ou a qualidade das células e/ou produto(s) da célula que são produzidos no recipiente. Preferencialmente, se um ou mais contaminantes são encontrados por estar presente na cultura, ou as células e/ou produto(s) da célula que são produzidos são de baixa qualidade, o dispositivo e seu conteúdo são eliminados.
[0147] Em momento oportuno, sobretudo se contaminante (s) e/ou células de baixa qualidade e/ou produto (s) da célula não são encontrados, pelo menos uma primeira porção do material no recipiente é de preferência colhidas, como meio contendo células e/ou produto (s) da célula. Mais preferivelmente, uma segunda porção restante do material, como meio contendo células e/ou produto (s) da célula está autorizada a permanecer no recipiente, onde esta segunda porção, opcionalmente, pode servir como um inóculo para a cultura seguinte/ciclo de colheita. Em seguida, o meio de cultura estéril e/ou aditivos estéril pode ser fornecido para a próxima cultura/ciclo de colheita através de uma entrada 51, opcionalmente conectada a um filtro 49 para a prevenção de contaminação.
[0148] O ciclo descrito anteriormente, opcionalmente, é realizado mais de uma vez. Opcionalmente, e de preferência, o método permite que as células sejam cultivadas e/ou colhidas anaerobicamente.
[0149] Para a configuração anaeróbica, gás inerte, em vez de oxigênio ou ar, é fornecido através das entradas de gás do dispositivo. Por pelo menos um dispositivo do seguinte processo é realizado. Um inóculo axênico é introduzido no dispositivo através de um orifício de colheita. Em seguida, o meio de cultura estéril e/ou aditivos estéril é adicionado ao dispositivo através de tubulação de entrada comum. Opcionalmente, o dispositivo é iluminado conforme descrito anteriormente.
[0150] As células no dispositivo podem crescer no meio a um rendimento desejado de células e/ou produto (s) das células. Opcionalmente, e de preferência, o ar em excesso e/ou gases residuais são autorizados a deixar o dispositivo, opcionalmente, através de um filtro, mais preferencialmente de forma contínua, através do orifício de escape de gás.
[0151] Quanto ao método anterior, o material no recipiente é monitorado para a presença de um ou mais contaminantes (s) e/ou células de baixa qualidade células e/ou produto (s) da célula de baixa qualidade, caso em que o recipiente e seu conteúdo são preferencialmente eliminados. Também como para o método anterior, as células e/ou produto (s) da célula são preferencialmente colhidas em um momento adequado, por exemplo, quando uma quantidade desejada de produtos(s) da célula foi produzida.
[0152] Normalmente, um sistema de purificação de abastecimento de água deionizada e substancialmente água livre de endotoxina para um tanque compreendendo meio concentrado, e meio diluído é então bombeada para o dispositivo 10 através de uma entrada adicional. Filtros, tipicamente de 0,2 micrômetro, estão instalados nos tubos de alimentação e também apenas a montante da entrada para minimizar o risco de contaminação dos conteúdos do recipiente em cada dispositivo 10. Alternativamente ou adicionalmente, uma válvula pode também ser usada para minimizar esse risco.
[0153] Para o primeiro ciclo de cultivo de cada dispositivo 10, inóculo, tipicamente uma amostra suficiente do tipo de célula que é necessário para a colheita no dispositivo 10, é previamente misturada com meio ou água em um recipiente pré-esterilizado e é introduzida no dispositivo 10, normalmente através do orifício da colheitadeira, mas alternativamente, ou, opcionalmente, através de um orifício adicional de entrada separada. Meio é então introduzido no dispositivo 10 através do orifício da colheitadeira, ou através do orifício adicional de entrada opcional. Para os ciclos subsequentes, somente o meio e/ou aditivos são introduzidos, como acima descritos.
[0154] Normalmente, um compressor de ar fornece substancialmente ar ou gases esterilizados a cada dispositivo 10, através de uma série de aparelhos: um filtro grosseiro para a remoção de partículas, um secador e aparelhos de umidade para remover a umidade e um filtro fino, tipicamente de 0,2 micrometros, para remoção de contaminantes. De preferência, um outro filtro apenas a montante da entrada do gás ainda minimiza o risco de contaminação dos conteúdos do recipiente.
[0155] Para cada dispositivo 10, todas as ligações ao. recipiente 12, ou seja, ao(s) orifício(s) de entrada de gás, para um orifício adicional de entrada, e de preferência também ao(s) orifício(s) de escape de gás e para a colheitadeira são esterilizados antes do uso, e esterilidade é mantida durante a conexão com equipamentos periféricos, incluindo, por exemplo, o suprimento e escape de gás pela realização das ligações na capela de fluxo laminar.
[0156] O controle de temperatura para cada dispositivo 10 é preferencialmente fornecido por uma unidade de tratamento de ar adequado. Iluminação opcional do dispositivo pode ser fornecida por lâmpadas fluorescentes apropriadas devidamente organizados em torno do dispositivo 10, quando necessários para o crescimento de célula ou produção de compostos.
[0157] Durante cada ciclo de cultivo de cada dispositivo 10, o conteúdo de cada recipiente 12 correspondente são normalmente ventiladas e misturadas por cerca de 3 até cerca de 14 dias, ou mais, sob condições de temperatura e iluminação controlada. As condições da cultura e da duração da cultura são determinadas de acordo com as necessidades individuais de cada ciclo da cultura, tais como o tipo de células cultivadas, produto recombinante a ser colhido, a concentração de inóculo, e assim por diante.
[0158] No final do ciclo de cultivo para cada dispositivo 10, um orifício da correspondente colheitadeira está normalmente ligado a um ambiente pré-esterilizado com conectores adequados, que são esterilizados antes e durante a conexão, como descritos acima. A colheita é feita em seguida, deixando para trás entre cerca de 2,5% a cerca de 45%, embora, geralmente, entre cerca de 10% a cerca de 35%, de células e/ou de tecido servem como inóculo para o próximo ciclo.
[0159] As células/tecidos colhidos e/ou produto (s) da célula podem então ser opcionalmente secas, ou extraídas, conforme necessário.
[0160] Outra adaptação opcional é a adição de oxigênio puro durante o processo de cultura celular, de preferência em mais 3 ou 4 dias após o início do processo de cultura.
[0161] Um exemplo de um tipo de célula preferida adequado para o cultivo em Bioreator Descartável em Grande Escala da invenção é a célula de cenoura transformada descrita na seção de exemplos que segue. Conforme descrito na seção de exemplos, esta célula é uma célula de cenoura Agrobacterium tumefaciens transformada que expressa um gene exógeno que codifica a glicocerebrosidase humana (HGCD). Em outra configuração de um aspecto da invenção, o tipo de célula é Nicotiana tabacum. Em ainda outra configuração da invenção, as células da Nicotinia tabacum são células BY-2. Métodos de transformação e expressão de genes exógenos em cenoura e outros tipos de células, adequado para uso com os Bioreatores Descartável em Grande Escala da presente invenção, são bem conhecidos na tecnologia. Transformação e expressão de proteínas exógenas biologicamente ativas em culturas de células de cenoura e outros, utilizando bioreatores descartável, é divulgada em detalhes nas Aplicações da Patente Americana N°: 10/784,295 e publicação PCT WO 2004/096978, que são incorporadas aqui na íntegra.
[0162] A seção de exemplos que se segue demonstra a utilização do dispositivo presente no cultivo de células de cenoura acima descritas, e em células de tabaco da Nicotiana tabaccum. Como é mostrado aqui, a cultura da cenoura e células transgênicas do tabaco, em um dispositivo 10 de Bioreator em Grande Escala, com um volume superior a 400 litros, resultou em um rendimento superior e pureza da proteína recombinante. Células da cenoura expressando a glicocerebrosidase humana e células de tabaco expressando acetilcolinesterase-R foram cultivadas em Bioreatores descartáveis em Grande e pequena escala, e as condições de cultura, os rendimentos e produtos analisados e comparados (ver exemplos 2 e 3). Os resultados mostram que o Bioreator Descartável em Grande Escala da presente invenção fornece uma maior saturação de O2 do meio de cultura, a uma taxa de ventilação na entrada significativamente menor, até 30% durante pelo menos 7 dias de cultura, e uma maior eficiência da cultura, resultando em maior rendimento do produto da proteína recombinante. Análise da proteína recombinante através do mapeamento de peptídeo (Figura 8), IEF (Figura 10), SDS-PAGE e análise imunológica (Figuras 7 e 15-17), e cromatografia (Figuras 6 e 9) mostrou que as preparações de glicocerebrosidase e a enzima acetilcolinesterase a partir de células colhidas do Bioreator Descartável em Grande Escala são idênticos ao de uma preparação padrão obtidos com a tecnologia de escala padrão, indicando fortemente a consistência e a identidade das preparações de enzima produzida a partir de células colhidas das bioreatores de 80L, 400L e 800L. Preparações enzimáticas a partir do Bioreator Descartável em Grande Escala também mostrou comparável, se não superior, atividade catalítica e atividade específica (ver quadro 5 e figura 17). Além disso, foi demonstrado que a b- glicocerebrosidase recombinante produzida em Bioreatores Descartável em Grande Escala da presente invenção contém níveis indetectáveis de proteína de célula hospedeira da cenoura, não menos puro do que o b-glicocerebrosidase fabricados pelos métodos de produção de volume padrão (Figura 11). Assim, o Bioreator Descartável em Grande Escala da presente invenção pode fornecer condições precisas, eficientes e até mesmo superior para o aumento de escala de culturas de células vegetais que expressam proteínas recombinantes desenvolvidos em menores, mesmo muito menor, volumes.
[0163] Referência é composta dos seguintes exemplos, que junto com as descrições acima, ilustram a invenção em uma moda não limitada.
[0164] Geralmente, a nomenclatura utilizada aqui e os procedimentos de laboratório utilizados na presente invenção incluem técnicas moleculares, bioquímicas, microbiológicas e de DNA recombinante. Tais técnicas são minuciosamente explicadas na literatura. Veja, por exemplo, “Clonagem Molecular: Um manual de laboratório” Sambrook et al., (1989); “Protocolos Atuais em Biologia Molecular” Volumes I-III Ausubel, RM, ed. (1994), Ausubel et Sons, Baltimore, Maryland (1989); Perbal, “Um Guia Prático para a Clonagem Molecular”, John Wiley & Sons, Nova Iorque (1988); Watson et al. “DNA recombinante”, Scientific American Books, Nova York; Birren et al. (eds) “Análise do genoma: Uma Série de Manuais de Laboratório”, Vols. 1-4, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nova York (1998); metodologias conforme estabelecido na Pat. Americana Nos 4.666.828, 4.683.202, 4.801.531, 5.192.659 e 5.272.057; “Biologia Celular: Um Manual de Laboratório”, volumes I-III Cellis, JE, ed. (1994) ; “Cultura de Células Animais - Um Manual de Técnicas Básicas” por Freshney, Wiley-Liss, NY (1994), terceira edição, “Protocolos Atuais em Imunologia” Volumes I-III Coligan JE, ed. (1994), Stites et al. (eds), “Imunologia Clínica e Básica” (Edição 8), Appleton & Lange, Norwalk, CT (1994) ; Mishell e Shiigí (eds), “Métodos selecionados em Imunologia Celular”, WH Freeman e Co., Nova Iorque ( 1980); imunoensaios disponíveis são amplamente descritos na literatura científica e de patentes, ver, por exemplo, Pat, Americana N° s 3.791.932, 3.839.153, 3,850.752, 3.850.578, 3.853.987, 3.867.517, 3.879.262, 3.901.654, 3.935.074, 3.984.533, 3.996.345, 4.034.074, 4.098.876, 4.879.219, 5.011.771 e 5.281.521; “Síntese de Oligonucleotídeos” Gait, MJ, ed. (1984); “Hibridização de Ácido Nucléico” Hames, BD, e Higgins SJ, eds. (1985); “Transcrição e Tradução” eds Hames, BD, e Higgins SJ,. (1984); “Cultura de Célula Animal” Freshney, RI, ed, (1986); “Células e Enzimas Imobilizadas” IRL Press, (1986), “Um Guia Prático para Clonagem Molecular” Perbal, B., (1984)e “Métodos em Enzimologia”, vol. 1-317, Academic Press, “Protocolos de PCR: Um Guia Para Métodos e Aplicações”, Academic Press, San Diego, CA (1990), Marshak et al. “Estratégias para a Purificação e Caracterização de Proteína - Um Manual de Curso Laboratorial” CSHL Press (1996); todos que são incorporados por referência como se plenamente nele previstos. Outras referências gerais são fornecidas ao longo deste documento. O procedimento nele se crê ser bem conhecidos na tecnologia e são fornecidos para a conveniência do leitor. Todas as informações contidas neles são incorporadas neste documento por referência.
[0165] Cultura eficiente de células vegetais em Bioreator Descartável em Grande Escala A fim de testar os parâmetros de crescimento, rendimentos e características das culturas e produtos de células produzidas utilizando o Bioreator Descartável em Grande Escala, células de cenoura expressando glicocerebrosidase humana foram cultivadas em grande escala e os Bioreatores descartáveis em grande e pequena escala, e as condições de cultura, os rendimentos e produtos analisados e comparados. Materiais e métodos experimentais:
[0166] Transformação e cultivo de células de cenoura expressando GCD: a transformação de células e cultivo foram realizados conforme descrito no
[0167] Aumento do crescimento da cultura em um bioreator cerca de 1 cm (de diâmetro) de células geneticamente modificadas de calo de cenoura, que contém o gene rh-GCD, foi colocado em meio ágar em placa de 9 cm, contendo 4,4 gr/l de meio MSD (Duchefa, Haarlem, Holanda), 9,9 mg/l de tiamina HCl (Duchefa), 0,5 mg de ácido fólico (Sigma Ltd, St Louis, MO) 0,5 mg/l biotina (Duchefa), 0,8 g/l hidrolisado de Caseína (Duchefa), açúcar de 30 g/l e hormônios 2-4 D (Sigma). O calo foi cultivado por 14 dias a 25°C.
[0168] Cultura de suspensão de células foi preparada pelo sub-cultivo do calo transformado em meio líquido MDS contendo 0,2 mg/l de ácido 2,4- dicloroacético), como é conhecido na tecnologia. A cultura de suspensão de célula foi, então, cultivada em um Erlenmeyer de 250 ml, começando com 25 ml de volume de trabalho e aumentando o volume para 50 ml, após 7 dias de cultura, a 25°C com velocidade de agitação de 60 rpm. Posteriormente, o volume de cultura de células foi aumentado até 300 ml em um Erlenmeyer de 1 L, nas mesmas condições.
[0169] Inóculo do bioreator pequeno (10 L) [ver W098/13469] contendo 4 L de meio MSD, foi feita pela adição de 400ml de suspensões celulares derivadas de dois Erlenmeyers de 1L, que foram cultivados por sete dias. Após uma semana de cultivo a 25°C, com fluxo de ar de 1 Lpm, meio MDS foi adicionado até 10L e o cultivo continuou sob as mesmas condições. Após o cultivo adicional (cinco dias), a maioria das células foram colhidas e coletadas pela passagem do meio celular por meio de uma rede de 80 mícron. O meio extra foi espremido e o bolo celular foi armazenado a -70°C.
[0170] Antiespuma: Para evitar espuma, a Emulsão Medicinal Antiespuma C (Polidimetilsiloxano-PDMS, Dow Corning, Midland MI) foi utilizada, contendo 30 % Simeticona USP, Metilcelulose, ácido sórbico e água. A antiespuma foi adicionado a um meio no bioreator de 400 L na concentração de 10 ppm.
[0171] Análise antiespuma: Emulsão antiespuma C (PDMS) é usado como um ingrediente anti-flatulento e um ingrediente de alimentos não-padronizados. A presença de PDMS foi avaliada de acordo com e em conformidade com os requisitos USP para emulsões Simeticona. Uma solução de 450 ml de 0,075% PDMS foi carregada em uma coluna cromatográfica trocadora de cátion de 15 ml (Macro- Prep® High S Support, BioRad, Hercules, CA). Alíquotas para análise de PDMS foram retiradas da carga, o fluxo através de (materiais não ligados) e de três etapas de eluição de 0,2 M NaCl, 1,2 M NaCl e etanol 12% em 1,2 M NaCl.
[0172] Alíquotas da cultura colhidas durante as diferentes etapas de cromatografia (carga, o fluxo, etapas de lavagem e eluição) foram coletadas e analisadas para a presença de PDMS utilizando um método RP- HPLC, com uma coluna C4 monitorada em 262 nm (absorbância do pico da Emulsão Antiespuma C).
[0173] SDS-PAGE: Eletroforese em Gel de Dodecil Sulfato-Poliacrilamide (SDS-PAGE) separa as proteínas primeiramente pelo seu peso molecular. Além disso, esta técnica fornece grandes quantidades de informação sobre a pureza e composição das proteínas. A identidade do peso molecular e o padrão de impureza da proteína de prGCD produzida a partir de células cultivadas de Bioreatores Descartáveis em Grande Escala foram examinadas pela análise por SDS-PAGE utilizando corante Coomassie Brilliant azul, de acordo com os protocolos de separação de gel padrão. Brevemente, os géis SDS consistem de um gel de empilhamento (3 %) e um gel de resolução (12%). O tampão da corrida foi Tris/SDS, pH 8,3, o tampão de carregamento foi glicerol- Tris-mercaptoetanol, pH 6,8.
[0174] Cromatografia Líquida de Alta Resolução (Pressão) de Fase Reversa (RP-HPLC): RP-HPLC compreende a separação da proteína intacta e outros componentes de uma solução de proteína. O tempo de retenção exato de cada composto é característico e permite a determinação da identidade e pureza da proteína de interesse. O tempo de retenção e pico característico do vegetal recombinante GCD (prGCD) foi determinado utilizando uma coluna C-4 de fase estacionária (Phenomenex Júpiter 5u C4 proteo 300A 4,6x250 mm Phenomenex, Torance CA) com um gradiente de fase móvel de: A; 0,1 % TFA/H2O e B; 0,1 % TFA/Acetonitrila. Detecção de proteína foi com espectrofotômetro de diodo detectando em dois comprimentos de onda: 214 nm e 280 nm.
[0175] Preparo de anticorpos policlonais: Recombinante GCD (75 microgramas, Cerezima™ Genzyme, Cambridge, MA) foi suspensa em 3 ml de adjuvante de Freund (Difco, Voigt, Lawrence, Kansas) e injetado em cada um dos dois coelhos, seguida por uma injeção de reforço após duas semanas. Os coelhos foram sangrados cerca de 10 dias após a injeção de reforço e novamente em intervalos de uma semana até que o título de anticorpo começou a diminuir. Após a remoção do coágulo o soro foi dividido em alíquotas e armazenado a -20°C.
[0176] Western Blotting: Western blot foi realizado para identificar o vegetal recombinante GCD (prGCD) moléculas purificadas de células coletadas do Bioreator Descartável em Grande Escala em comparação a lotes fabricados anteriormente e para a β-glicocerebrosidase humana recombinante comercial (Cerezima®, Genzyme, Cambridge, MA) pela utilização de anticorpos anti-GCD purificado de afinidade específica. A transferência de proteína foi realizada substancialmente como descrito aqui. Brevemente, transferida do gel para a nitrocelulose foi realizada em 100 volts durante 90 minutos a 4°C. Após a transferência, as membranas foram incubadas em tampão de bloqueio [1 % leite seco, 0,1 % Tween 20 (Cat. No: P1379; Sigma Ltd, St Louis, MO) em tampão fosfato]. Proteínas foram então detectadas pela incubação com anticorpo anti-GCD, lavada, e reagida com um anticorpo secundário adequado (tal como Cabra anti coelho (molécula inteira) HRP (Cat. No. A- 4914). Os borrões foram então desenvolvidos com reagentes desenvolvedor ECL (RPN 2209, Amersham, Pharmacia Biotech UK LTD), e a autoradiografia foi utilizada para visualização.
[0177] Comparação entre a produção de prGCD em diferentes bioreatores em diferentes regimes de ventilação: Células recombinantes que expressam prGCD cresceram em bioreatores de volumes diferentes (10L, 100L, 400L) durante 4-7 dias. Células cresceram em três diferentes bioreatores de 10 L, submetidos a diferentes regimes de ventilação (com borrifador; com uma abertura de orifício de 8 mm; com 100% oxigênio adicionado a partir do dia 4). Amostras de extratos brutos (5μl) foram tomadas no dia 4 ou dia 7, separadas em PAGE, absorvido por uma membrana de transferência de nitrocelulose, juntamente com 25ng de prGCD padrão, e reagido com anticorpo policlonal específico anti- GCD de coelho. Bandas foram visualizadas por Substrato Quimioluminescente SuperSignal West Pico (Pierce Biotechnology, Rockford, IL,).
[0178] Oxigênio dissolvido: taxas de oxigênio dissolvido são retratadas em unidades Kla: dC/dT = Kla, (Cs-C), onde Cs é o nível de saturação de oxigênio, em mg/l e C é a concentração real de oxigênio, em mg/l
[0179] Taxa de ventilação: Taxa de ventilação é definida como o volume de ar na pressão de 1Atm por volume de líquido volume por minuto (volume por volume por minuto-) na entrada de gás foi calculado pela divisão do fluxo de ar na entrada pelo volume de trabalho do bioreator.
[0180] Determinação da taxa ótima de ventilação: A fim de determinar as taxas ótimas de ventilação, otimização foi afetada por cada aumento no volume (de 100L, para bioreatores em Grande Escala de 400 e 800 L), pelo aumento da escala de fluxo de ar para alcançar uma taxa de ventilação do bioreator de volume menor, e alterando a taxa de ventilação até alcançar os parâmetros ótimos pré-determinados. O efeito das diferentes taxas de ventilação foi testado em parâmetros físicos incluindo nível de espuma, nível de turbulência do líquido, resistência do filtro ao fluxo de ar e expansão do bioreator. Parâmetros biológicos incluem curva de crescimento de cultura de célula como representadas pela anotação diária do peso frasco da célula (gr/L) para um ciclo de crescimento (7 dias) e os rendimentos do produto de proteína em 7 dias. 10-15 ciclos de crescimento foram comparados por alcançar a taxa de ventilação otimizada.
[0181] Cultivo de Bioreatores Descartável em Grande Escala requer taxas de ventilação menores:
[0182] É um axioma de cultura celular que aumentou a taxa de ventilação das células de crescimento na cultura. Bioreatores com volume menor para cultura de célula vegetal normalmente fornecem ar em uma taxa de ventilação de 0,15-0,3 vvm. Surpreendentemente, quando a eficiência da cultura de Bioreatores de vários volumes foi avaliada sobre um intervalo de taxa de ventilação adequado para promover a circulação de ar e distribuição de oxigênio, enquanto manter uma força mínima de cisalhamento foi achado que as taxas ótimas de ventilação para Bioreatores em Grande Escala eram proporcionalmente menores que aquelas para reatores de volumes menores. Tabela 1 abaixo ilustra que enquanto em Bioreatores de volume menor (até 100 L) um aumento no volume requer um aumento nas taxas de ventilação para manter a eficácia, em Bioreatores em Grande Escala (400L e maior), taxas ótimas de ventilação na verdade diminuem com o aumento do volume do bioreator. Tal diminuição é vantajosa em cultura de escala industrial tanto para a capacidade para diminuir a forças de cisalhamento, quanto para uma eficiência de energia maior. Tabela 1: Taxa de ventilação otimizada em bioreatores de diferentes volumes
[0183] Bioreatores Descartável em Grande Escala Fornecem Níveis de Saturação de Oxigênio Superior: Combinações adequadas dos parâmetros que afetam a introdução, mistura e ventilação do gás no bioreator são cruciais para a operação eficiente do Bioreator Descartável em Grande Escala da presente invenção. Volume da bolha, taxa de ventilação, pressão do gás na entrada, pressão do gás nas bolhas e o percurso da bolha através do meio de cultura devem ser equilibrados para otimizar a ventilação e mistura, ainda minimizar as forças de cisalhamento destrutivas e a turbulência dentro da suspensão. A fim de avaliar estes parâmetros, os níveis de saturação de oxigênio foram determinados.
[0184] Figura 3 mostra a percentagem de saturação de O2 do meio em um Bioreator Descartável em Grande Escala, comparado com a saturação de 02 no meio utilizando recipientes reatores menores (Frasco Erlenmeyer, bioreator de 10 litro e bioreator de 100 litros), medidos em alíquotas amostradas no momento da inoculação (dia 0), e nos dias de cultura 3, 4 e 7. A pressão do ar e fluxo foi 35 L/min no Bioreator Em Grande Escala, e 10 L/min nos reatores menores de 10 e 100 litros. A redução na saturação após a inoculação, quando o conteúdo da célula da suspensão aumenta na proporção, é um fenômeno bem conhecido. Ainda, apesar da redução gradual em 7 dias, o Bioreator Descartável em Grande Escala claramente fornece condições para uma saturação de O2 do meio superior, excedendo 30 % de qualquer tempo até 7 dias após a inoculação.
[0185] Tabela 2 abaixo ilustra que um bioreator de 800 litros atinge um maior nível de saturação de O2, expresso como Kla (mg/L) quando comparado com um bioreator de volume menor. Esta superioridade é mantida durante um intervalo de taxas de ventilação. Tabela 2: Concentração de oxigênio dissolvido (Kla em mg/L), em diferentes taxas de ventilação (vvm)-comparação entre Bioreatores Descartável em Grande Escala de 400 e 800 L.
[0186] Bioreator Descartável em Grande Escala fornece rendimentos de proteína recombinante superior: A fim de determinar o efeito do cultivo no Bioreator Descartável em Grande Escala sobre a eficiência da produção de proteína recombinante na cultura, extracto de suspensão a partir de cada um dos reatores foram separados por SDS-PAGE, absorvidos e analisados por imunodetecção com anticorpo glicocerebrosidase anti-humana (GCD). Comparação entre o rendimento do produto recombinante no Bioreator Descartável em Grande Escala de 400 L (Figura 4, linhas 4- 6), e aqueles de 10 L (Figura 4, linhas 1-3) e 100L (Figura 4, linhas 7 e 8) os reatores claramente mostram o aumento dos níveis de proteína, e mais eficiente o uso do meio no Bioreator em Grande Escala. De fato, o rendimento de GCD no Bioreator em Grande Escala em 4 e 7 dias de cultura (linhas 4, 5 e 6, respectivamente) foi superior aquele do reator de 10L com aumento do orifício de entrada de gás (Fig. 4, linha 2) e adição de O2 do dia 4 (Figura 4, linha 3).
[0187] Estes resultados indicam que o Bioreator Descartável em Grande Escala da presente invenção fornece saturação de 02 aumentada do meio de cultura, e maior eficiência de cultura, resultando em rendimento maior do produto de proteína recombinante e maior eficiência de energia.
[0188] Remoção Eficiente e Simples de Antiespuma do Meio de Cultura em Bioreatores em Grande Escala: No uso de maiores pressão de ar para ventilação de Bioreatores Descartável em Grande Escala, a questão da formação de espuma no meio, que deve ser evitado por muitas razões, requer atenção. Antiespuma (10 ppm) foi adicionado ao meio de crescimento celular quando transferido para um bioreator de 400 L.
[0189] O nível de detecção mais baixo utilizando técnicas padronizadas de laboratório tal como HPLCe absorção atômica é aproximadamente 7 ppm.
[0190] A fim de confirmar que a colheita e purificação do produto recombinante do Bioreator Descartável em Grande Escala é capaz de eliminar o resíduo antiespuma, grande excesso de antiespuma PDMS foram submetidas as etapas iniciais do processo de purificação, e a presença de antiespuma completamente monitorada.
[0191] Figura 5a é uma análise RP- HPLC de antiespuma PDMS (0,075 %) em uma alíquota de uma solução de carregamento de uma coluna trocadora de cátion O tempo de retenção (pico) foi 22.531 minutos. Figura 5b mostra a antiespuma no fluxo através da coluna (tempo de retenção 22.554 minutos), com tamanho do pico e absorbância em 262 nm semelhante ao material carregado. Nenhum PDMS foi detectado nas amostras de qualquer uma das três subsequentes de eluição (0,2M NaCl, 1,2M NaCl, e 12 % etanol em 1,2M NaCl). Tabela 3 abaixo claramente indica que o PDMS não foi retido na coluna: Tabela 3: Resumo do desempenho e rendimento do PDMS sobre a coluna cromatográfica trocadora de cátion
[0192] Estes resultados claramente indicam que o resíduo antiespuma é facilmente removido do meio, e permanece abaixo dos níveis detectáveis dos primeiros estágios do processo de isolamento e purificação.
[0193] Expressão Eficiente da Glicocerebrosidase Humana em Suspensão de Células de Cenoura utilizando Bioreator Descartável em Grande Escala
[0194] Este exemplo fornece uma descrição dos experimentos que foram realizados com células vegetais transformadas, cultivadas em Bioreator Descartável em Grande Escala da presente invenção, de acordo com algumas configurações da presente invenção.
[0195] Materiais e Métodos Experimentais
[0196] Vetores do plasmídeo: *CE-T - foi construído a partir do plasmídeo CE obtido do Prof. Galili [Patente Americana 5,367,110 Novembro 22, (1994)].
[0197] Plasmídeo CE foi digerido com Sall. A extremidade coesiva do Sall foi feita com extremidade se corte utilizando um fragmento grande de DNA polimerase X. Então o plasmídeo foi digerido com PstI e ligado a um fragmento de DNA codificado para a segmentação do sinal ER a partir do gene de endoquitinase básico [Arabidopsis thaliana] ATGAAGACTAATCTTTTTCTCTTTCTCATCTTTTCACTTCTCCTATCATTATC CTCGGCCGAATTC (SEQ ID NO: 6), e sinal de segmentação vacuolar a partir da quitinase A do Tabaco: GATCTTTTAGTCGATACTATG (SEQ ID NO: 5) digerida com Smal e PstI.
[0198] *pGREENII - obtida do Dr. P. Mullineaux [Roger P. Hellens et al., (2000) Plant Mol. Bio. 42:819-832]. Expressão do vetor pGREEN II é controlada pelo promotor 35S do Vírus Mosaico da Couve-Flor, o TMV (Tobacco Mosaic Virus) elemento ômega potencializador de translação e uma sequência de terminador da octopina sintase do Agrobacterium tumefaciens.
[0199] Glicocerebrosidase Humana (hGCD) cDNA: glicocerebrosidase humana foi obtida do ATCC (Acesso No. 65696), GC-2.2 [GCS-2kb; lambda-EZZ-gamma3 Homo sapiens] contendo ácido beta glicosidase [glicocerebrosidase]. Comprimentos inseridos (kb): 2,20; Tecido: célula de fibroblasto WI- 38.
[0200] Construção do plasmídeo expressão hGCD: O cDNA codifica para o hGCD (ATTC número do clone 65696) foi amplificado utilizando a extremidade: 5’ CAGAATTCGCCCGCCCCTGCA 3’ (SEQ ID NO: 3) e o reverso: 5’ CTCAGATCTTGGCGATGCCACA 3’ (SEQ ID NO: 4) precursores. O produto de DNA purificado por PCR foi digerido com endonucleases EcoRI e BglII (ver sequências de reconhecimento acentuado nos precursores) e ligados em um vetor intermediário com uma fita de expressão CE-T digerida com as mesmas enzimas. A fita de expressão foi cortada e eluida a partir do vetor intermediário e ligado no vetor binário pGREENII utilizando enzimas de restrição Smal e Xbal, formando o vetor de expressão final. A resistência a canamicina é conferida pelo gene promotor NPTII pelo promotor obtido junto com o vetor pGREEN, para fornecer uma fita de expressão.
[0201] O plasmídeo resultante foi sequenciado para garantir correta infusão na estrutura dos sinais utilizando o seguinte sequenciamento precursor: 5’ 35S promotor: 5’ CTCAGAAGACCAGAGGGC 3’ (SEQ ID NO: 1), e o 3’ terminador: 5’ CAAAGCGGCCATCGTGC 3’ (SEQ ID NO: 2).
[0202] Estabelecimento de calos de cenoura e culturas de suspensão de célula: Estabelecimento de calos de cenoura e culturas de suspensão de célula pré formada como descrito anteriormente por Torres K.C. (Técnicas de cultura de tecido para culturas horticular, p.p. 111, 169).
[0203] Transformação de células de cenoura e isolamento de células transformadas: Transformação de células de cenoura foi efetuada pela infiltração de Agrobacterium, utilizando uma adaptação de um método descrito anteriormente [Wurtele, E.S. e Bulka, K. Plant Sei. 61:253-262 (1989)]. Crescimento de células em meio líquido foi utilizado durante todo o processo em vez dos calos. Tempo de incubação e crescimento foram adaptados para transformação de células em cultura de líquido. Brevemente, Agrobacteria foi transformada com o vetor pGREEN II por eletroporação [den Dulk-Ra, A. e Hooykaas, P.J. Methods Mol. Biol. 55:63-72 (1995)] e então selecionados utilizando canamicina. Células de cenoura foram, portanto, transformadas com Agrobacteria e selecionadas utilizando antibióticos paromomicina no meio líquido.
[0204] Seleção das células de cenoura transformadas para isolamento dos calos expressando altos níveis de GCD: Células foram homogeneizadas em tampão amostra SDS e os extratos da proteína resultante foram separados sobre SDS-PAGE [Laemmli U., (1970) Nature 227:680-685] e transferidos para membrana de nitrocelulose (hybond C nitrocelulose, 0,45 micron. Cat. No: RPN203C; Amersham, Pharmacia Biotech UK LTD). Western blot para detecção de GCD foi realizado utilizando anticorpos policlonais anti hGCD (descritos abaixo).
[0205] Cultivo e aumento da escala de células nos bioreatores em Grande Escala: cultivo de células foi efetuado como descrito em detalhe no Exemplo 1 acima.
[0206] Análise de proteína: Análise da identidade e da pureza da proteína foi efetuada como descrita no Exemplo 1 acima.
[0207] Espectrometria de Massa: Análise de Espectrometria de Massa (MS) foi realizada utilizando ionização de dessorção a laser assistida pela matriz de tempo de voo/tempo de voo (MALDI-TOF) Espectrômetro de massa (4700, Applied Biosystems, Foster City CA) e um espectrômetro de massa de armadilha de íon (LCQ clássico, Finnigan, San Jose, CA).
[0208] Mapeamento de peptídeo ou “Impressão digital” da proteína utilizando RP-HPLC: Mapeamento de peptídeo é um método para análise de peptídeos resultantes da digestão proteolítica de uma proteína seguida por RP-HPLC para fornecer uma separação de alta resolução que é reprodutível com um perfil distinto chamado “Impressão digital”. Como um método de identificação altamente específico, esta análise serve para confirmar a identidade da preparação da enzima produzida no processo de produção padrão e a partir de células coletadas do bioreator de 400L (PX-400-GC-2; dentro dos limites da técnica). prGCD foi digerido com Tripsina por incubação em 1:50 w/w com Tripsina em 50 mM (NH4)2C03 (pH 8,0) por 6 horas e 37°C seguido por incubação durante a noite em temperatura ambiente.
[0209] Para análise RP-HPLC, 50 μg de peptídeo digerido foi carregado em uma coluna C-18, (Coluna: Phenomenex Júpiter 4u proteo 90A 4,6x250 mm, Phenomenex, Torance CA) e os peptídeos foram separados, e detectados como descrito acima.
[0210] IEF: Focalização Isoelétrica (IEF) é uma técnica que separa proteínas com base na sua carga em um campo elétrico. IEF é empregado como uma ferramenta de identificação, e para garantir a homogeneidade de uma proteína como demonstrado por um padrão com o correto intervalo de pi. Focalização isoelétrica do prGCD, e Cerezima® foi realizado de acordo com o protocolo padrão. Brevemente, para identificar o ponto isoelétrico (pi) do prGCD a enzima purificada correu sobre gel IEF de poliacrilamida pré moldada com intervalo de pH de 3-10 (Bio- Rad Laboratories, Hercules CA) utilizando ânodos projetados e tampões de cátodo e padrões pi (Amersham Pharmacia Biotech UK LTD). Para cada prGCD e amostra de Cerezima®, 0,05% ácido taurocólico (detergente levemente aniônico) foi adicionado para melhorar a mobilidade no gel.
[0211] O padrão de bandas de prGCD e proteínas Cerezima® foram visualizados por Corante Bio- Safe™ Coomassie (Bio-Rad Laboratories, Hercules CA), conforme indicado pelo fabricante. O pi de cada banda de proteína foi estimado usando os padrões de proteínas do Kit de Calibração IEF com intervalo alto de pi 5-10,5 (Amersham Pharmacia Biotech UK LTD). A semelhança no perfil da banda do prGCD e Cerezima® produzido comercialmente foi determinado. O padrão da banda prGCD também foi examinado para a homogeneidade dos lotes.
[0212] Ensaio da Atividade Enzimática: p- Glicocerebrosidase catalisa a hidrólise da glicocerebrosidase glicolipídica para glicose e ceramida. Para avaliara atividade catalítica da glicocerebrosidase recombinante, um ensaio enzimático utilizando um substrato sintético é empregado para avaliação de cada lote. Uma unidade enzimática é definida como a quantidade de enzima que catalisa a hidrólise de um micromole de um substrato sintético para-nitrofenil-β-D-glicopiranosideo (pNP-Glc) por minuto a 37oC.
[0213] Caracterização de Glicocerebrosidase Recombinante a partir de Bioreator Descartável em Grande Escala: A fim de determinar a característica ótima das condições da cultura melhorada proporcionada pelo Bioreator Descartável em Grande Escala, e a fim de testar a confiança e reprodutibilidade destas condições, as características moleculares e físico- química do produto recombinante, produzido nos Bioreatores Descartável em Grande Escala, foi comparado com as preparações produzidas em bioreatores em menor escala.
[0214] Peso molecular da Glicocerebrosidase determinado por meio de espectrometria de massa: Análise por espectrometria de massa foi efetuada para determinar a massa da proteína sem a necessidade para padrões de proteína. Dois métodos de espectrometria de massa foram utilizados para determinar o peso molecular da enzima produzida a partir de células coletadas do bioreator de 400L, e isto foi comparado a Glicocerebrosidase produzida em reatores de pequena escala. Todas as preparações de enzimas foram isoladas e purificadas da mesma maneira.
[0215] A tabela 4 abaixo resume o peso molecular de vários lotes de enzimas obtidos por ambos os instrumentos, LCQ classic e MALDI-TOF. Os lotes de prGCD produzidos de células colhidas do bioreator 400L são indicados por PX400-CG. Tabela 4. Peso Molecular de Diferentes prGCD produzidas a partir de Lotes diferentes
[0216] Os resultados da espectrometria de massa mostram que a estimativa do peso molecular da proteína em todas as preparações é rotineiramente aproximadamente 60800 Dalton e permanece consistente entre lotes produzidos a partir de células coletadas de bioreatores de 400 L e bioreatores de 80 L. Este peso molecular é consistente com um polipeptídeoglicosilado com 506 aminoácidos contribuindo 56642.6 Dalton e a adição de estruturas glicanas contribuindo para o restante 4158 Dalton (ca. 7 %).
[0217] Identificação, determinação do peso molecular e pureza por análise SDS-PAGE e Western Blot: A identidade do peso molecular e o padrão de impureza da proteína da glicocerebrosidase produzida a partir de células coletadas do bioreator de 400L foram examinadas por análise SDS- PAGE utilizando corante Coomassie Brilliant blue.
[0218] Figura 6 mostra SDS-PAGE com corante Coomassie Brilliant blue de preparação de enzima padrão (PLX-GC-016- 0505 DS), Cerezima e glicocerebrosidase produzida a partir de células coletadas de Bioreatores Descartável em Grande Escala (PX-400-GC-2).
[0219] Figura 6 demonstra ainda que prGCD a partir de células cultivadas em Bioreator Descartável em Grande Escala mostra próximo ao idêntico as propriedades como GCD produzido em outros métodos. A migração da proteína em cada lote foi semelhante, com um peso molecular estimado de 60,9kD. Além disso, o padrão de bandas de proteína é idêntico entre os lotes do padrão e do bioreator de 400L, indicando nenhuma evidência de impurezas de proteína na enzima produzida a partir de células coletadas do bioreator de 400L.
[0220] Imunodetecção do SDS-PAGE separou proteínas (Western blot) com anticorpo anti-glicocerebrosidase foi realizada para identificar as moléculas de β-glicocerebrosidase purificadas a partir de células coletadas do bioreator de 400 L em comparação com lotes fabricados anteriormente e com p- glicocerebrosidase humana comercial (Cerezima®, Genzyme) utilizando anticorpos purificados anti-β-glucocerebrosidase de afinidade específica.
[0221] Figura 7 mostra análise de Western Blot utilizando anticorpos específicos de coelho anti-β-glicocerebrosidase para detecção do padrão β-glicocerebrosidase (PLX-GC-016-0505 DS), Cerezima® e a proteína produzida a partir de células coletadas do bioreator de 400L (PX-400-GC-2). As bandas da proteína identificadas pelo anticorpo específico são idênticas entre os lotes dos procedimentos do padrão e bioreator de 400L. Esta análise revela nenhuma banda adicional degradada na proteína da enzima produzida por células coletadas do bioreator de 400L.
[0222] Assim, de acordo com as análises SDS-PAGE e imunológicas, não existe evidência para indicar diferenças na identidade e pureza entre as enzimas produzidas a partir de células coletadas do bioreator padrão (80L) ou do bioreator de 400L.
[0223] Mapeamento de peptídeo ou “Impressão digital” de proteína utilizando Cromatografia Líquida (RP-HPLC) de Alta Resolução (Pressão) de Fase Reversa: A fim de confirmar a identidade da preparação da enzima produzida no processo de produção padrão (80 L) e a partir de células coletadas do bioreator de 400 L (PX-400-GC-2), a impressão digital da proteína foi realizada sobre prGCD produzido a partir de células coletadas de bioreatores de 80 e 400 L.
[0224] Figuras 8a e 8b mostram um perfil típico do mapa tríptico da glicocerebrosidase comercial (PLX-GC-016-0505 DS) realizada em coluna cromatográfica C-18. Figura 8a mostra os peptídeos separados monitorados em 214 nm (ligações peptídicas) e a Figura 8b mostra os peptídeos separados monitorados em 280 nm (Triptofano e Tirosina). Figuras 8c e 8d representam o mapa tríptico da glicocerebrosidase preparada a partir de células coletadas de bioreator de 400L (PX-400-GC-2) monitoradas em 214 nm (Figura 8c) e 280 nm (Figura 8d).
[0225] Assim, o mapeamento peptídico das preparações da enzima glicocerebrosidase a partir de células coletadas de Bioreator Descartável em Grande Escala é idêntica com aquele de uma preparação padrão obtida com tecnologia em escala-padrão, fortemente indicando a consistência e identidade das preparações da enzima produzidas a partir de células coletadas de bioreator de 80L e 400L.
[0226] Cromatografia Líquida (RP- HPLC) de Alta Resolução (Pressão) de Fase Reversa: Caracterização das proteínas produzidas por células cultivadas em bioreator em Grande Escala de 400 L foi efetuada com RP-HPLC.
[0227] Figuras 9a e 9b representam cromatogramas em 214 nm (9a) e 280 nm (9b) da glicocerebrosidase purificada a partir de células coletadas do bioreator de 400L (PX-400-GC-2). No cromatograma da enzima que produziu proteína no Bioreator Descartável em Grande Escala, a enzima aparece como um pico intacto com tempo de retenção de 64,12 minutos, semelhante ao tempo de retenção da enzima glicocerebrosidase preparada anteriormente, 64,70 minutos.
[0228] Assim, sob condições cromatográficas padrão, a glicocerebrosidase recombinante produzida tanto por Bioreator Descartável em Grande Escala e escala padrão eluiu em um tempo de retenção semelhante e consistente. Aparência de um pico intacto é consistente com os resultados obtidos a partir da análise realizada em lotes anteriores de preparações de enzima. O padrão e o tamanho dos minúsculos picos de impurezas são semelhantes ao padrão glicocerebrosidase, e o nível de impureza está dentro das especificações exigidas.
[0229] Focalização Isoelétrica (IEF): A fim de identificar, e para garantir a homogeneidade da proteína recombinante produzida por células cultivadas em bioreator em Grande Escala da presente invenção, o intervalo de pi do perfil da banda de glicocerebrosidase a partir de células coletadas de Bioreator em Grande Escala de 400L (PX- 400-GC-2) e de células coletadas das preparações do reator padrão de 80 L (PLX- GC-016-0505DS) foi determinado.
[0230] Figura 10 mostra o padrão da banda pI, visualizada por corante Coomassie brilliant blue, das amostras de enzima a partir de preparações do bioreator de volume padrão (PLX- GC-016-0505DS) e a partir de células coletadas do bioreator de 400L (PX-400-GC-2) em diferentes estágios de purificação (após 3a, 4a e 5a coluna de purificação, indicada por C-3, C-4 e C5 respectivamente).
[0231] O perfil da enzima produzida pelo bioreator de volume padrão e a partir de células do bioreator de 400L é idêntico tanto no número de bandas do padrão e a intensidade de cada banda análoga. Assim, os padrões isoforma IEF da enzima produzida em Bioreator Descartável em Grande Escala e previamente produziu preparações são idênticos.
[0232] Ensaio da Atividade Enzimática: Para avaliar a atividade catalítica da glicocerebrosidase recombinante, produzida em bioreator em Grande Escala, um ensaio enzimático utilizando o substrato sintético β-D- glicopiranosídeo (pNP-Glc) foi empregado. Tabela 5 resume a atividade específica da glicocerebrosidase produzida a partir de células coletadas do bioreator de 400L (indicado pelo PX-400-GC) e por reatores de volume padrão. Tabela 5: Atividade específica dos lotes de glicocerebrosidase recombinante
[0233] Assim, a atividade específica da enzima produzida a partir de células coletadas do bioreator de 400L está no intervalo de que produziu na produção em escala padrão. Além disso, quando comparar os parâmetros de crescimento de três lotes do prGCD expressam o crescimento em cultura de célula no bioreator de 800 litros com valores de crescimento de cultura em bioreatores de 400 litros, como é mostrado na Tabela 6 abaixo, parâmetros de condutividade, osmolaridade e rendimento (células e proteína) estavam dentro do mesmo intervalo para culturas em dois Bioreatores Descartável em Grande Escala. Tabela 6 Parâmetros de Crescimento da Produção de prGCD expressando a cultura de célula em bioreatores de 400 e 800 L
[0234] β-glicocerebrosidase a partir de Bioreator Descartável em Grande Escala é livre de proteínas de célula do hospedeiro: Para a detecção de proteínas da célula do hospedeiro da cenoura (PHC), um imunoensaio sensível capaz de detectar um grande intervalo de impurezas de proteína foram desenvolvidos. Para este ensaio, um anticorpo policlonal foi gerado por imunização com uma preparação de proteína produzida a partir de células de cenoura não-transformada (células da cenoura não abrigam a p- glicocerebrosidase construída). Estes anticorpos policlonais foram ainda separados para dar ligação específica ao núcleo do polipeptídio das proteínas e não para as moléculas/resíduos de açúcar, para evitar a reação cruzada com os açúcares anexados a β-glicocerebrosidase recombinante.
[0235] A preparação das proteínas do hospedeiro da cenoura (PHC) é utilizada como um padrão de referência para as impurezas das proteínas relacionadas ao hospedeiro e como um antígeno para preparação de anticorpos policlonais utilizados para o imunoensaio.
[0236] Figura 11 mostra a reatividade de anticorpo da proteína anti-hospedeiro específica para amostras de proteína do hospedeiro e lotes de β-glicocerebrosidase analisados por SDS-PAGE e Western Blot com anticorpos de proteína do hospedeiro da célula anti-cenoura específico. Lotes de β-glicocerebrosidase (PLX-GC- 016-0505 DS) a partir de bioreatores de volume padrão, e lotes de β-glicocerebrosidase produzidos a partir de células coletadas de bioreator de 400L (PX-400-GC-2) foram analisadas assim como amostras do extrato de proteína do hospedeiro da cenoura. Quatro bandas principais de proteínas são identificadas nas amostras de proteínas do hospedeiro da célula da cenoura (Fig. 11, linhas 7 e 8), portanto nenhuma das bandas de proteínas de PHC correspondente são detectadas em amostras de β-glicocerebrosidase, indicando que a β-glicocerebrosidase recombinante produzida em Bioreatores Descartável em Grande Escala da presente invenção contem níveis indetectáveis de proteínas de célula do hospedeiro da cenoura, não menos puro que o β-glicocerebrosidase fabricada por métodos de produção de volume padrão.
[0237] Expressão de Eficiência da Acetilcolinesterase Humana em Suspensão de Células BY-2 utilizando Bioreator Descartável em Grande Escala
[0238] Este Exemplo fornece uma descrição dos experimentos que foram realizados com células BY-2 transformadas da Nicotiana tabaccum com acetilcolinesterase humana, cultivada em Bioreator Descartável em Grande Escala de acordo com uma configuração da presente invenção.
[0239] Materiais e Métodos Experimentais cDNA: O cDNA codifica a acetilcolinesterase humana variante “read through” (AChE-R) inserida foi obtida do Dr. Hermona Soreq, A Universidade Hebrew de Jerusalem, Israel (Yissum Technology Transfer Company da Universidade Hebrew de Jerusalem, número pTM240). A sequência deste gene foi otimizada pelo vegetal e inclui a sequência líder nativa no ER (33 aminoácidos no N-terminal, SEQ ID NO: 7, degradado na proteína madura), e a sequência de retenção ER (SEKDEL; SEQ ID NO: 8) unida com o gene recombinante do C-terminal (SEQ ID NO: 9).
[0240] Construção do plasmídeo de expressão da Acetilcolinesterase - O plasmídeo pBluescript SK+ (Cat. No 212205, Stratagene, La Jolla, CA) foi utilizado como a espinha dorsal para a construção da fita de expressão do vegetal. A fita de expressão do vegetal com os elementos necessários requeridos para a expressão de alto nível foi construída no plasmídeo pBluescript SK+. Esta fita de expressão (CE) inclui o promotor CaMV35S, potencializador ômega translacional, a terminação da transcrição e o sinal de poliadenilação do gene sintase octipina (fita CE) do Agrobacterium tumefaciens.
[0241] AChE-R subclonada no vetor de expressão Bluescript® contendo a fita de expressão, por amplificação PCR da AChE-R utilizando precursores contendo locais de restrição Sal I e PstI, retratada em negrito e sublinhada (direção do precursor: 5’- CGGCGTCGACACAAGAGGCCTCCACAAT-3’ (SEQ ID NO: 10) Precursor reverso: 5’- CCCCCTGCAGCTAGAGTTCATCCTTCTC-3’ (SEQ ID NO: 11) A fita de expressão com AChE-R codificando a sequência foi então removida do vetor intermediário e ainda subclonada utilizando Notl e Acc651 no vetor do binário pGREENII nos- Kana (Hellens et al., 2000), como descrito aqui. Clones positivos foram selecionados utilizando PCR e análise de restrição.
[0242] Transformação, seleção e cultivo de Ache-R expressando células BY-2: Transformação de Agrobacterium antes da infiltração de células BY2 foi realizada como descrito anteriormente (den Dulk-Ras e Hooykaas, 1995). A resistência a canamicina, conferida pelo gene NPTII conduzido pelo promoter obtido junto com o vetor pGREEN, foi utilizado para triagem e seleção dos transformantes.
[0243] Infiltração com Agrobacterium de células geneticamente modificadas da Nicotiana tabaccum (linhagem BY2) e subsequente cultivo foi efetuado essencialmente como descrito por transformação de células de cenoura no Exemplo 2 acima. Seleção para calos expressando altos níveis de Ache-R foi efetuada com ensaio da atividade catalítica Elmans e Western blot, descritos aqui. Culturas de suspensão de células de células selecionadas foram mantidas como suspensões de 50 ml em Erlenmeyers de 250 ml, em constante agitação e condições de temperatura controlada, 25±2°C em um misturador orbital (80rpm). O processo de produção incluiu uma fase de crescimento no meio contendo os antibióticos Paromomicina e Cefotaxima como agentes seletivos.
[0244] Aumento da escala de crescimento de cultura em um bioreator: O aumento da escala de cultura para 10L foi realizada gradualmente. Primeiro uma inoculação de 200-400mL de suspensão de célula foi introduzida em bioreator de 12 L contendo 3,6-9,8 L de Meio. Após 7 dias de cultivo (25±2°C, 1,5 Lpm de ar estéril), meio foi adicionado até 10 L e o cultivo continuou sob as mesmas condições por outros 7 dias. O bioreator de 400 L foi inoculado com 10 L de células e suspensão e subsequentemente preenchido gradualmente com o meio até 350 L, continuando o cultivo sob as mesmas condições.
[0245] Antiespuma (10ppm) foi adicionada para o meio de crescimento da célula quando transferida para 400L. O antiespuma utilizado é uma Emulsão medicinal de antiespuma C (Polidimetilsiloxano-PDMS) como descrito aqui.
[0246] Western blot: Western blot foi efetuado com uma afinidade purificada de anticorpo policlonal de cabra levantado contra um peptídeo N-terminal da AChE de origem humana (Santa-Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA). O N-terminal é idêntico em todas as formas de AChE, assim, este Anticorpo pode reconhecer AChE-R também. Detecção é realizada com kit de detecção ECL (Pierce).
[0247] SDS-PAGE foi realizada sob condições padrão. AChE-S e AChE-R foram analisadas sobre 10% SDS-PAGE. Eletroforese é realizada utilizando aparelho de eletroforese celular vertical Criterion™ (Bio-Rad Laboratories) com eletroforese previamente misturada Tris-Glycine-SDS tampão de corrida (Bio-Rad Laboratories). Géis de acrilamida 10% foram preparados utilizando soluções previamente misturadas de 40% Acrilamida/Bis e 10% SDS. Transferência das proteínas dos géis bis-acrilamida para membrana de nitrocelulose foi realizado utilizando Sistema de Absorção a Seco (Invitrogen) iBlot™, utilizando o plano pronto do blotter P3. Transferência foi realizada em temperatura ambiente durante 8 min. Após a transferência de proteínas para a membrana, a membrana foi bloqueada, lavada, ligado ao Anticorpo primário e secundário utilizando Kit Completo Western (GenScript Corporation One-step™. Anticorpo primário (N-19; Santa Cruz, CA) foi adicionado ao One-step™ (GenScript) solução de trabalho em diluições 1:200. Detecção foi realizada com kit de detecção ECL (Pierce). A imunoreatividade da AChE-R foi comparada àquela da AChE-S humana recombinante comercial (Sigma). Bandas foram detectadas utilizando Molecular Imager Gel Doc XR System (Bio-Rad Laboratories).
[0248] Corante de gel fluorescente FlamingoTM: Corante de gel fluorescente Flamingo™ (Bio-Rad Laboratories), é um método de coloração de proteína não específico, altamente sensível. AChE-R (lote 9-11) foram carregadas em concentrações diferentes (50, 100 e 200 ng/amostra) em comparação a AChE-S recombinante humana comercial (Sigma). Amostras foram analisadas em 10% SDS- PAGE sob procedimentos padrão como descrito aqui, e coradas com corante de gel fluorescente Flamingo™ de acordo com as instruções do fabricante.
[0249] Ensaio Ellman: Reagente Ellman é utilizado para a modificação de tióis livres nas proteínas (Ellman, et al. 1961). Ele rapidamente forma uma ligação dissulfeto com o tiol e libera um íon tiolato, que apresenta uma cor característica, que pode ser medido em 405 nm. Ensaio Ellman foi efetuado para medir a atividade e concentração do AChE-R da enzima ativa em amostras homogeneizadas brutas, assim como para determinar a concentração de enzima ativa nas amostras purificadas. Uma unidade da enzima é definida como a quantidade de enzima que catalisa a hidrólise de um micromole do substrato sintético iodeto de acetiltiocolina [(2-mercaptoetil) acetato de iodeto de trimetilamônio] para (2- mercaptoetil) iodeto de trimetilamônio e ácido acético por minuto a temperatura ambiente e pH=7,4. A atividade catalítica da AChE-R foi determinada utilizando iodeto de acetiltiocolina (Sigma, St Louis MO) como um substrato. Amostras foram examinadas para a atividade catalítica da AChE em concentrações de cerca de 60ng/ml (amostra purificada) ou 50-100ng/ml (homogeneizado bruto) e foram dissolvidas em tampão fosfato (0,1M; pH=7,4; 0,025% BSA) seguindo o método espectrofotométrico desenvolvido por Ellman et al. (1961). Neste método, AChE, iodeto de acetiltiocolina (20mM) e o reagente Ellman - DTNB [5-5’-ditio-bis (2- nitrobenzoato); 9mM; Sigma] foram misturados e a hidrólise foi monitorada espectrofotometricamente pela medida da densidade ótica em 405 nm em intervalos de 2 min durante 20 min. Controles negativos contendo todos os componentes exceto o extrato testado. Resultados plotados contra tempo e taxa inicial foram calculados a partir de uma inclinação da porção linear do gráfico.
[0250] A atividade de cada unidade de preparação da AChE é calculada utilizando a seguinte equação:
[0251] Reagente de Ellman utilizando um Inibidor de AchE específico - DEPQ: DEPQ [7-(0,0-dietil-fosfiniloxi)-1-metilquinolinium metilsulfato] é um potente Inibidor não reversível da AChE e é utilizado para monitorar sua atividade. A titulação dos sítios ativos das soluções de enzima foi realizada na presença de tampão fosfato (0.1M; pH=7,4; 0,025% BSA) pela adição de quantidades de DEPQ (0,2- 0,8nM). Atividade foi medida utilizando um ensaio Ellman como descrito acima. Percentagem da inibição foi plotada contra a concentração do inibidor. DEPQ reage em uma relação 1:1 com AChE-R. Estes valores foram utilizados para determinar a concentração de AChE-R, expressa em μM.
[0252] Atividade da Colinesterase utilizando corante Karnovsky: O corante da atividade da colinesterase Karnovsky e Roots(Karnovsky e Roots, 1964) é um método específico para detectar visualmente a atividade da colinesterase (AChE e BChE). Este método utiliza éster de tiocolina como substratos, e está baseado na redução de ferricianida para ferrocianida pela tiocolina liberada pela atividade da colinesterase. O ferrocianida formado é capturado pelo cobre para formar ferrocianida de cobre, que é então visualizado a olho nu.
[0253] Nativo (não-desnaturado) PAGE: Eletroforese em Gel de poliacrilamoida nativa (PAGE) é. utilizada para classificar as proteínas em tamanho de 5 a 2,000 kDa devido ao tamanho uniforme do poro fornecido pelo gel de poliacrilamida. Ao contrário do SDS-PAGE, eletroforese de gel nativo não utiliza um agente de desnaturação carregado. As moléculas a serem separadas, portanto, diferem na massa molecular e carga intrínseca. Já que as proteínas permanecem no estado nativo durante toda a separação, elas podem ser detectadas não somente pelos reagentes gerais de corante da proteína, mas também pelos reagentes que empregam propriedades catalíticas específicas da enzima.
[0254] Perfil recombinante da Ache-R: A proteína recombinante AChE-R produzida pelos métodos da presente invenção é estimada em peso molecular de 64kDa, como mostrado na Figura 15 (linhas 1-3). AChE-S controles (linhas 5-7), um tetrâmero sob condições neutras, foi reduzido no SDS- PAGE a seu monômero, e assim migrou de modo semelhante para AChE-R, já que o monômero AChE-S é cerca de 70kDa, 6 kDa mais pesado que AChE-R. Assim, AÇhE-R expresso na célula BY2 do tabaco em Bioreator Descartável em Grande Escala apresenta e estruturas dimensionais semelhante (como determinado pela mobilidade eletroforética) a AChE-S recombinante humana expressou em células HEK 293 (Sigma) em sua forma monomérica.
[0255] Corante não específico FlamingoTM adicionalmente verifica o recombinante, vegetal expressa AChE-R perfil de migração, como as bandas detectadas apresentam o mesmo padrão como foi detectado por imunoensaio utilizando anticorpos anti AChE (Figura 16). Além disso, uma banda única de corante observada sobre o gel como mostrado na Figura 16 indica eficiência significativa da purificação do vegetal expresso em proteínas enzimáticas.
[0256] Atividade da AChE-R Recombinante: Figura 17 mostra identidade catalítica do vegetal expressa em AChE-R e a célula do mamífero expressa polipeptídios AChE-S, utilizando corante Karnovsky 50ng (linhas 3 e 6), 100 ng (linhas 2 e 5 ) e 200 ng (linhas 1 e 4) AChE-R foram carregadas sobre o gel. Atividade foi evidente em todos as 3 concentrações carregadas, confirmando a atividade da Ache-R purificada a partir de células BY- 2 coletadas de bioreator em Grande Escala da presente invenção. AChE-S recombinante humana comercial aparece na sua foram tetramérica (ver setas superiores), assim migrando mais devagar que o monômero AChE-R (setas inferiores) e mantendo sua atividade. A banda menos pronunciada detectada nas linhas 4-6, migrando de modo idêntico ao do monômero AChE-R (linhas 1-3) indica que os monômeros do vegetal expressam AChE-S não são idênticos no tamanho, mas igualmente ativo cataliticamente com AchE-S recombinante humana comercial.
[0257] Tabela 7 abaixo mostra a comparação de vegetal expressa a atividade e concentração de AChE-R em lotes produzidos em bioreatores de pequeno volume e aqueles produzidos em Bioreator Descartável em Grande Escala de acordo com uma configuração da presente invenção, como testado pelo ensaio da atividade de Ellman utilizando inibição DEPQ, Tabela 7 claramente mostra rendimentos significativamente aumentado de proteína AChE (expressa como mg proteína/Kg célula) em dispositivo de cultivo em Grande Escala, sem a redução no intervalo da atividade enzimática.
[0258] Assim, tomando juntos estes resultados apoiam as vantagens significantes do cultivo de células vegetais transgênicas em Bioreator Descartável em Grande Escala de acordo com alguma configuração da presente invenção para exatidão e expressão altamente eficiente do processo pós translacional de proteínas recombinantes, enquanto evita muitas das desvantagens de volumes menores e sistemas de expressão baseado em animais. REFERÊNCIAS - Ma, J. K. C., Drake, P.M.W., e Christou, P. (2003) Nature reviews 4, 794-805 - Patente Americana Aplicação No. 2005/0282269 para Proulx et al. - Patente Americana Aplicação No. 2005/0272146 para Hodge et al - Patente Americana No: 6,432,698 para Gaugler et al. Schlatmann et al, Biotech. Bioeng., 1995;45:435-39 Namdev e Dulop, App. Biochem e Biotech, Part A, Frontiers in Bioprocessing, 1995
Claims (27)
1. “DISPOSITIVO DESCARTÁVEL PARA O CULTIVO E COLHEITA DE CÉLULAS E/OU TECIDOS VEGETAIS”, compreendendo um recipiente (12) não rígido que inclui um volume de 400 litros e sendo configurado com orifícios (28) de troca de gás e um orifício (19) de colheita, permitindo que o referido dispositivo (10) seja continuamente utilizado por dois ciclos consecutivos de cultivo/colheita, caracterizado pelo fato de os referidos orifícios (28) de troca de gás incluírem uma pluralidade de orifícios (34) de entrada de gás posicionada ao redor do perímetro do recipiente (12), na metade inferior do recipiente (12), as saídas dos referidos orifícios no recipiente (12) tendo saídas no recipiente (12) que são espaçadas a partir de um eixo do recipiente (12) e em que o dispositivo possui ou uma agitação mecânica para misturar o meio no recipiente (12) ou um aspersor para distribuir as bolhas de gás quando o meio estiver presente nele.
2. “DISPOSITIVO”, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de o referido orifício (19) de colheita estar localizado na porção inferior da referida base do recipiente (12).
3. “DISPOSITIVO”, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de a referida base (16) ser frusto-cônica.
4. “DISPOSITIVO”, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de a pluralidade de orifícios de entrada de gás ser distribuída na metade inferior do volume com uma densidade de 20 a 70 entradas/área de seção transversal do recipiente (12) em m2
5. “DISPOSITIVO”, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de o recipiente (12) ser formado com uma porção inferior cônica invertida e em que a primeira pluralidade dos referidos orifícios é posicionada na referida porção cônica.
6. “DISPOSITIVO”, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de uma porção do referido recipiente (12) ter uma seção transversal uniforme e em que a pluralidade de saídas de gás no meio é fornecida em uma densidade de entradas de gás/área de seção transversal de 20 entradas/m2 a 70 entradas/m2.
7. “DISPOSITIVO”, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de incluir um medidor para controlar a taxa de aeração de 0,05 a 0,12 volumes de gás/volume de meio/minuto, quando o referido recipiente (12) estiver cheio até seu limite preenchível.
8. “DISPOSITIVO”, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de cada uma da pluralidade de orifícios de gás ser moldada para fornecer um volume de bolhas de gás na saída para o meio de 20 mm3 a 1800 mm3.
9. “DISPOSITIVO”, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de o referido orifício (19) de colheita estar abaixo do nível de um dos referidos orifícios de entrada.
10. “SISTEMA DE CULTIVO DE CÉLULA VEGETAL caracterizado pelo fato de compreender o dispositivo (10), conforme definido em qualquer uma das reivindicações anteriores, e um meio de cultura apropriado para o cultivo dos referidos tecidos e/ou células vegetais.
11. “SISTEMA”, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de compreender, ainda, uma suspensão de célula vegetal ou cultura de tecidos no referido meio.
12. “SISTEMA”, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de as referidas células vegetais expressarem uma proteína recombinante.
13. “SISTEMA”, de acordo com qualquer uma das reivindicações 11 ou 12, caracterizado pelo fato de as referidas células vegetais serem selecionadas do grupo consistindo em células de aipo, células de gengibre, células de rábano, células de tabaco, células de cenoura e células de raíz transformadas pela Agrobacterium rhizogenes.
14. “SISTEMA”, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de as referidas células serem células de tabaco que expressam acetilcolinesterase recombinante humana.
15. “SISTEMA”, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de a referida acetilcolinesterase recombinante humana ser acetilcolinesterase-R.
16. “SISTEMA”, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 10 a 15, caracterizado pelo fato de as saídas serem adjacentes ao perímetro do recipiente (12) na posição dos orifícios.
17. “SISTEMA”, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 10 a 16, caracterizado pelo fato de o recipiente (12) ser cilíndrico e simétrico e os orifícios da primeira pluralidade serem posicionados a uma mesma primeira distância da porção inferior do recipiente (12) e espaçados entre si.
18. “SISTEMA”, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de o recipiente (12) ser formado com uma porção inferior cônica invertida e em que uma primeira pluralidade da referida pluralidade de orifícios de entrada é posicionada na referida porção cônica.
19. “SISTEMA”, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de os orifícios de uma segunda pluralidade da referida pluralidade de orifícios de entrada de gás serem posicionados em uma mesma segunda distância de uma porção inferior do recipiente (12) e espaçados entre si, a referida segunda distância sendo diferente da referida primeira distância.
20. “SISTEMA”, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de a segunda pluralidade da referida pluralidade de orifícios de entrada de gás ser posicionada na referida porção cônica, de modo que a distância do eixo do recipiente (12) seja diferente para a primeira e segunda pluralidades de orifícios.
21. “SISTEMA”, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 10 a 16, caracterizado pelo fato de diferentes orifícios da referida pluralidade de orifícios de entrada de gás serem posicionados a distâncias diferentes de uma porção inferior do recipiente (12).
22. “MÉTODO DE CULTIVO E COLHEITA DE UM TECIDO VEGETAL E/OU CÉLULAS VEGETAIS EM UM VOLUME MAIOR DO QUE 400 LITROS” que compreende: a) fornecer um recipiente (12) descartável não rígido que inclui um volume de 400 litros e é configurado com orifícios (28) de troca de gás e um orifício (19) de colheita, permitindo que o referido recipiente (12) seja continuamente utilizado por dois ciclos consecutivos de cultivo/colheita, caracterizado pelo fato de o referido recipiente (12) ser projetado e construído para manter a saturação de oxigênio e forças de cisalhamento adequadas para o cultivo das referidas células e/ou tecidos vegetais; e b) fornecer um inoculante através do referido orifício (19) de colheita; c) fornecer um meio de cultura estéril e/ou aditivos estéreis; d) opcionalmente iluminar o referido recipiente (12) com luz externa; e e) permitir que as referidas células e/ou tecidos vegetais cresçam no referido meio até um rendimento desejado; e os referidos orifícios (28) de troca de gás incluindo uma pluralidade de orifícios de entrada de gás, e o método incluindo o posicionamento dos referidos orifícios (34) de entrada de gás ao redor do perímetro do recipiente (12), na metade inferior do recipiente (12), as saídas dos referidos orifícios (34) de entrada de gás saem no recipiente (12) sendo fornecidos em posições que são espaçadas a partir de um eixo do recipiente (12) e em que o gás é distribuído dentro do recipiente (12) sem aspersão ou agitação mecânica do meio e em que o recipiente (12) é cilíndrico e simétrico e os orifícios de uma primeira pluralidade da referida pluralidade de orifícios (34) de entrada de gás são posicionados em uma mesma primeira distância de uma porção inferior do recipiente (12) e espaçados entre si.
23. “MÉTODO”, de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de incluir: a) fornecer gás a uma pressão de gás de 100 KPa a 500 KPa; b) fornecer uma densidade de entradas de gás/área de seção transversal de uma porção geralmente uniforme do recipiente (12) de 20 entradas/m2 a 70 entradas/m2; c) fornecer gás a uma taxa de aeração de 0,05 a 0,12 volumes de gás/volume de meio/minuto; e d) fornecer o referido gás como bolhas tendo um volume de bolhas de gás nas referidas saídas de 20 mm3 a 1800 mm3.
24. “MÉTODO”, de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de fornecer o referido gás a uma taxa para fornecer uma saturação de oxigênio em estado estacionário de 15% de volume/volume em um líquido contido dentro do referido recipiente (12).
25. “MÉTODO”, de acordo com qualquer uma das reivindicações 23 ou 24, caracterizado pelo fato de o referido gás ser fornecido a uma pressão de gás de 150 KPa a 250 KPa.
26. “MÉTODO”, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 23 a 25, caracterizado pelo fato de uma porção do referido recipiente (12) ter uma seção transversal uniforme e em que a referida densidade das entradas de gás por área de seção transversal é de 40/m2 a 60/m2.
27. “MÉTODO”, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 23 a 26, caracterizado pelo fato de a referida taxa de aeração ser de 0,07 a 0,10 volumes de gás/volume de meio/minuto.
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