BRPI0810687B1

BRPI0810687B1 - Processo para produzir um produto de fermentação a partir do material contendo lignocelulose

Info

Publication number: BRPI0810687B1
Application number: BRPI0810687-8A
Authority: BR
Inventors: Jin Qiming; Liu Jiyin; Lennart Pierre Alexander Land Bjorn; L. Higgins Donald
Original assignee: Novozymes North America, Inc.
Priority date: 2007-04-24
Filing date: 2008-04-18
Publication date: 2018-02-06
Also published as: BRPI0810687A2; CN101668863A; EP2140016A1; US20180273984A1; EP2468876A1; DK2140016T3; US10023881B2; US20100273227A1; EP2140016B1; ES2748245T3; DK3219804T3; CN104450795A; WO2008134259A1; ES2390630T3; EP3219804B1; EP3219804A1; CN101668863B

Description

(54) Título: PROCESSO PARA PRODUZIR UM PRODUTO DE FERMENTAÇÃO A PARTIR DO MATERIAL CONTENDO LIGNOCELULOSE (51) Int.CI.: C12P 7/10 (30) Prioridade Unionista: 19/11/2007 US 60/988949, 24/04/2007 US 60/913581, 26/06/2007 US 60/946272 (73) Titular(es): NOVOZYMES NORTH AMERICA, INC.. NOVOZYMES A/S. NOVOZYMES, INC.

(72) Inventor(es): QIMING JIN; JIYIN LIU; BJORN LENNART PIERRE ALEXANDER LAND; DONALD L. HIGGINS

MANIFESTAÇÃO SOBRE O PARECER TÉCNICO NEGATIVO NO PEDIDO PI0810687-8 DE 18/04/2008 REQUERENTE: NOVOZYMES NORTH AMERICA, INC; NOVOZYMES, INC. E NOVOZYMES A/S TÍTULO: “PROCESSO PARA PRODUZIR UM PRODUTO DE FERMENTAÇÃO A PARTIR DO MATERIAL CONTENDO

LIGNOCELULOSE.”

R A Z Õ E S

I

A Requerente tomou ciência do parecer desfavorável publicado na Revista da Propriedade Industrial n° 2421, de 30 de maio de 2017, no qual a Digna Perícia considerou o presente pedido imprivilegiável por estar em desacordo com o preceituado nos Artigos 25 e 8° c/c 11 e 13 da Lei 9.279/96 (LPI).

Entretanto, pelos motivos que passará a expor e pelas emendas ofertadas em anexo, a Requerente, respeitosamente, acredita que merecerá reforma a r. Decisão emanada desta Autarquia.

II

Documentos do Estado da Técnica Citados no Parecer Técnico

Desfavorável

Na busca realizada pela Digna Perícia, os seguintes documentos do estado da técnica foram considerados relevantes:

D1 - Jonsson, L. J., et al. Detoxification of wood hydrolysates with laccase and peroxidase from the white-rot fungus Trametes versicolor. Applied microbiology and biotechnology 49.6 (1998): 691-697, publicado em 1998;

D2 - WO2005074656, publicado em 18.08.2005.

Petição 870170062365, de 25/08/2017, pág. 7/15 adequado para processos de produção de produto de fermentação.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

A presente invenção diz respeito aos processos de desintoxicar material contendo lignocelulose pré-tratado. A invenção também diz respeito aos processos de produzir um produto de fermentação a partir do material contendo lignocelulose usando-se um organismo de fermentação incluindo um processo desintoxicador da invenção.

No primeiro aspecto, a invenção diz respeito a processos para desintoxicar material contendo lignocelulose pré-tratado que compreende submeter o material contendo lignocelulose pré-tratado a uma ou mais enzimas que oxidam compostos fenólicos e/ou uma ou mais enzimas que apresenta atividade de peroxidase.

No segundo aspecto, a invenção diz respeito a processos para produzir um produto de fermentação a partir do material contendo lignocelulose que compreende as etapas de:

(a) pré-tratar o material contendo lignocelulose;

(b) hidrolisação;

(c) desintoxicar de acordo com um processo desintoxicador da invenção e (d) fermentar usando-se um organismo de fermentação.

A invenção também diz respeito a processos para produzir um produto de fermentação a partir do material contendo lignocelulose que compreende as etapas de:

(i) pré-tratar o material contendo lignocelulose;

(ii) desintoxicar de acordo com o processo de fermentação da invenção;

(iii) hidrolisação; e (iv) fermentar usando-se um organismo de fermentação.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

A Figura 1 mostra o efeito do tratamento de lacase na conversão de celulose.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

No primeiro aspecto a invenção diz respeito aos processos de desintoxicar o material contendo lignocelulose pré-tratado adequado para produzir um produto de fermentação.

Material contendo lignocelulose

O termo “material contendo lignoceluloses” usado neste refere-se ao material que consiste primariamente de celulose, hemicelulose e lignina. Tal material é frequentemente referido como “biomassa”.

A estrutura de lignocelulose não é diretamente acessível à hidrólise enzimática. Portanto, a lignocelulose deve ser pré-tratada, por exemplo, pela hidrólise ácida sob condições adequadas de pressão e temperatura, a fim de quebrar o selo da lignina e romper a estrutura cristalina de celulose. Isto causa a solubilização e a sacarificação da fração de hemicelulose. A fração de celulose pode ser então enzimaticamente hidrolisada, por exemplo, pelas enzimas de celulase (ou enzimas celulolíticas), para converter os polímeros de carboidrato em açúcares fermentáveis que podem ser fermentados em um produto de fermentação desejado, tal como etanol. Opcionalmente, o produto de fermentação é recuperado após a fermentação, por exemplo, por destilação.

Qualquer material contendo lignocelulose é considerado de acordo com a presente invenção. O material contendo lignocelulose pode ser qualquer material contendo lignocelulose. Em uma forma de realização preferida o material contendo lignocelulose contém pelo menos 30 % em peso, preferivelmente pelo menos 50 % em peso, mais preferivelmente pelo menos 70 % em peso, ainda mais preferivelmente pelo menos 90 % em peso de lignocelulose. Deve ser entendido que o material contendo lignocelulose também pode compreender outros constituintes, tais como material celulósico, incluindo celulose e hemicelulose e também pode compreender outros constituintes, tais como material proteináceo, amido, açúcares, tais como açúcares fermentáveis e/ou açúcares não fermentáveis.

Material contendo lignocelulose é, no geral, encontrado, por exemplo, nos caules, folhas, vagens, cascas e espigas de plantas ou folhas e ramos e madeira de árvores. O material contendo lignocelulose também pode ser, mas não é limitado a, material herbáceo, resíduos agrícolas, resíduos de área florestal, resíduos sólidos municipais, papel residual e polpa e resíduos r

de trituração de papel. E entendido aqui que o material contendo lignocelulose pode estar na forma de material de parede celular vegetal contendo lignina, celulose e hemi-celulose em uma matriz mista.

Em uma forma de realização preferida o material contendo lignocelulose é fibra de milho, palha de arroz, madeira de pinheiro, lascas de madeira, álamo, bagaço, papel e resíduo de processamento de polpa.

Outros exemplos incluem forragem de milho, madeira dura, tal como álamo e bétula, madeira mole, palha de cereal, tal como palha de trigo, grama (switchgrass), resíduos sólidos municipais (MSW), resíduo orgânico industrial, papel de escritório ou misturas destes.

Em uma forma de realização preferida o material contendo lignocelulose é forragem de milho. Em uma outra forma de realização preferida o material é fibra de milho.

Processo para desintoxicar Material contendo lignocelulose pré-tratado

Quando o material contendo lignocelulose é pré-tratado, os produtos de degradação que podem inibir as enzimas e/ou podem ser tóxicos ao organismo de fermentação são produzidos. Estes produtos de degradação diminuem gravemente tanto a taxa de hidrólise quanto de fermentação.

Os métodos para pré-tratar o material contendo lignocelulose são bem conhecidos na técnica. Os exemplos de métodos considerados são descritos abaixo na seção “Pré-tratamento”.

Os presentes inventores observaram que as enzimas que oxidam compostos fenólicos pode ser usadas para desintoxicar material contendo lignocelulose pré-tratado. O tempo de fermentação pode ser reduzido com um resultado de desempenho melhorado do organismo de fermentação durante a fermentação. Em outras palavras, a desintoxicação de acordo com a invenção pode resultar em um tempo de processo de “material contendo lignocelulose-para-produto de fermentação” mais curto. Além disso, a necessidade de uma etapa de lavagem após o pré-tratamento do material contendo lignocelulose, para remover compostos tóxicos e/ou adaptação do organismo de fermentação ao meio/caldo pode ser eliminada. Também, a dosagem do organismo de fermentação pode ser reduzida.

Em uma forma de realização preferida o material contendo lignocelulose pré-tratado pode ser tratado com celulase (enzimas celulolíticas) e/ou hemicelulase (enzimas hemicelulolíticas).

Os exemplos específicos de desintoxicar compostos podem ser encontrados em “Compostos Desintoxicadores”-seção abaixo.

No primeiro aspecto a invenção diz respeito a processos para desintoxicar material contendo lignocelulose pré-tratado que compreende submeter o material contendo lignocelulose pré-tratado a uma ou mais enzimas que oxidam compostos fenólicos e/ou uma ou mais enzimas que apresenta atividade de peroxidase.

Os produtos de degradação de lignocelulose pré-tratados incluem produtos de degradação de lignina, os produtos de degradação de celulose e produtos de degradação de hemicelulose. Os produtos de degradação de lignina pré-tratados podem ser fenólicos por natureza.

Os produtos de degradação de hemicelulose incluem furanos de açúcar (tais como hexoses e/ou pentoses), incluindo xilose, manose, galactose, ramanose e arabinose. Os exemplos de hemiceluloses incluem xilano, galactoglucomanano, arabinogalactano, arabinoglucuronoxilano, glucuronoxilano e derivados e combinações destes.

Os exemplos de compostos inibidores, isto é, produtos de degradação de lignocelulose pré-tratados, incluem 4-OH álcool benzílico, 4OH benzaldeído, 4-OH ácido benzóico, trimetil benzaldeído, ácido 2-furóico, ácido coumárico, ácido ferúlico, fenol, guaiacol, veratrol, pirogalolol, éter pirogalol mono metílico, álcool vanílico, vanilina, isovanilina, ácido vanílico, ácido isovanílico, ácido homovanílico, álcool veratrílico, veratraldeído, ácido verátrico, ácido 2-O-metil gálico, álcool siringílico, siringaldeído, ácido siríngico, ácido trimetil gálico, homocatecol, etil vanilina, creosol, p-metil anisol, anisaldeído, ácido anísico, furfural, hidroximetilfurfural, 5hidroximetilfurfural, ácido fórmico, ácido acético, ácido levulínico, ácido cinâmico, coniferil aldeído, isoeugenol, hidroquinona, eugenol ou combinações destes. Outros compostos inibidores podem ser encontrados em, por exemplo, Luo et al., 2002, Biomass andBioenergy 22: 125-138.

O processo desintoxicador da invenção, pode ser preferivelmente realizado em um pH que é adequado das enzimas que oxidam compostos fenólicos e enzimas de hidrolisação e/ou organismo de fermentação se a desintoxicação for realizada simultaneamente com hidrólise ou simultaneamente com hidrólise e fermentação. Em uma forma de realização, o pH está entre 2 e 7, preferivelmente entre 3 e 6, especialmente entre 4 e 5. Em uma forma de realização preferida, a temperatura durante a desintoxicação é uma temperatura adequada para as enzimas oxidantes de composto fenólico e/ou enzima que apresenta atividade de peroxidase e enzimas de hidrolisação e/ou organismo de fermentação se a desintoxicação for realizada de maneira simultânea com a hidrólise ou de maneira simultânea com a hidrólise e com a fermentação. Em uma forma de realização, a temperatura durante a desintoxicação está entre 25°C e 70°C, preferivelmente entre 30°C e 60°C. Nos casos onde a desintoxicação é realizada de maneira simultânea com a fermentação, a temperatura dependerá do organismo de fermentação. Para fermentações de etanol com levedura, a temperatura deve estar entre 26 e 38°C, tal como entre 26 e 34°C ou entre 30 a 36°C, tal como em tomo de 32°C.

Os pHs, temperaturas e outras condições de processo adequadas podem ser facilmente determinadas por uma pessoa habilitada na técnica.

Enzimas Desintoxicadoras

As enzimas desintoxicadoras podem ser de qualquer origem incluindo de origem mamífera, vegetal e microbiana, tal como de origem bacteriana e fungica.

As enzimas que oxidam compostos fenólicos podem, em formas de realização preferidas, pertencer a qualquer uma das seguintes classes EC: Catecol oxidase (EC 1.10.3.1), Lacase (EC 1.10.3.2), o-Aminofenol oxidase (1.10.3.4) e Monofenol monooxigenase (1.14.18.1).

A enzima que apresenta atividade de peroxidase pode em uma forma de realização preferida pertencer a qualquer uma das seguintes classes EC incluindo aqueles selecionados do grupo que consiste de uma peroxidase (EC 1.11.1.7), Haloperoxidase (EC 1.11.1.8 e EC 1.11.1.10); Lignino peroxidase (EC 1.11.1.14); manganês peroxidase (EC 1.11.1.13) e Lipoxigenase (EC. 1.13.11.12).

Os exemplos de enzimas desintoxicadoras consideradas de acordo com a invenção podem ser encontrados em “Enzimas”-seção abaixo.

Produção de Produtos de Fermentação a Partir do Material Contendo Lignocelulose

No segundo aspecto a invenção diz respeito aos processos de produzir produtos de fermentação a partir do material contendo lignocelulose. A conversão de material contendo lignocelulose m produtos de formulação, tal como etanol, tem as vantagens da biodisponibilidade pronta de grandes quantidades de estoque de alimentação, incluindo madeira, resíduos agrícolas, lavouras herbáceas, resíduos sólidos municipais, etc.

A estrutura de lignocelulose não é diretamente acessível à hidrólise enzimática. Portanto, o material contendo lignocelulose deve ser pré-tratada, por exemplo, pela hidrólise ácida sob condições adequadas de pressão e temperatura, a fim de quebrar o selo da lignina e romper a estrutura cristalina de celulose. Isto causa a solubilização das frações de hemicelulose e celulose. A celulose e a hemicelulose podem ser então enzimaticamente hidrolisada, por exemplo, pelas enzimas de celulase (enzimas celulolíticas), para converter os polímeros de carboidrato em açúcares fermentáveis que podem ser fermentados em um produto de fermentação desejado, tal como etanol. Opcionalmente o produto de fermentação pode ser recuperado, por exemplo, por destilação.

Mais precisamente, a invenção diz respeito, nesta forma de realização de processos para produzir um produto de fermentação a partir do material contendo lignocelulose que compreende as etapas de:

(a) pré-tratar o material contendo lignocelulose;

(b) hidrolisação;

(c) desintoxicar e (d) fermentar usando-se um organismo de fermentação;

em que a desintoxicação é realizada de acordo com um processo desintoxicador da invenção. Mais detalhes nas etapas são nas etapas são descritas abaixo nas seções “Pré-tratamento”, “Hidrólise” e “Fermentação”.

Em uma outra forma de realização, a invenção diz respeito ao processos para produzir um produto de fermentação a partir do material contendo lignocelulose que compreende as etapas de:

(i) pré-tratar o material contendo lignocelulose;

(ii) desintoxicação;

(iii) hidrolisação e (iv) fermentar usando-se um organismo de fermentação;

em que a desintoxicação é realizada de acordo com um processo desintoxicador da invenção.

Uma ou mais enzimas desintoxicadoras podem ser adicionadas após a etapa de pré-tratamento (i), mas antes da etapa de hidrólise (iii). A desintoxicação do material pré-tratado na etapa (ii) pode ser realizada antes da hidrólise, mas a desintoxicação e a hidrólise também pode ser realizada de maneira simultânea. A etapa de desintoxicação (ii) pode ser realizada separadamente a partir da hidrólise. A etapa de hidrólise adicional (iii) e a etapa de fermentação (iv) pode ser realizada de maneira simultânea ou sequencial. Em uma forma de realização, os sólidos (que compreendem principalmente lignina e polissacarídeos não convertidos) pode, após prétratar o material contendo lignocelulose na etapa (i), ser remo vido/separado do licor antes da desintoxicação. Os sólidos removidos e o licor desintoxicado pode ser combinado antes da hidrólise na etapa (iii) ou hidrólise e fermentação simultânea.

Os sólidos podem ser removidos/separados de qualquer maneira conhecida na técnica. Nas formas de realização adequadas, os sólidos são removidos por filtração ou usando-se uma pressão de filtro e/ou centrífuga ou semelhante. O efeito inibidor reduzido das enzimas de hidrolisação é testado no Exemplo 4.

Os exemplos de métodos de condições de pré-tratamento, hidrólise e fermentação para ambas as formas de realização acima são descritos abaixo.

Pré-tratamento

O material contendo lignocelulose pode ser pré-tratado de qualquer maneira adequada. O pré-tratamento pode ser realizado antes e/ou durante a hidrólise e/ou fermentação. Em uma forma de realização preferida, o material pré-tratado é hidrolisado, preferivelmente, de maneira enzimática, antes e/ou durante a fermentação e/ou antes e/ou durante a desintoxicação. O objetivo do pré-tratamento é para separar e/ou liberar celulose; hemicelulose e/ou lignina este pode melhorar a taxa de hidrólise. Os métodos de prétratamento, tais como oxidação úmida e o pré-tratamento alveja lignina, enquanto o ácido diluído e a auto-hidrólise alveja hemicelulose. A explosão de vapor é um exemplo de um pré-tratamento que alveja celulose.

De acordo com a invenção o pré-tratamento na etapa (a) ou (i) pode ser uma etapa de pré-tratamento convencional usando-se as técnicas bem conhecidas na técnica. Os exemplos de pré-tratamentos adequados são divulgados abaixo. Em uma forma de realização preferida o pré-tratamento acontece na pasta aquosa.

O material contendo lignocelulose pode durante o prétratamento estar presente em uma quantidade entre 10 a 80 % em peso, preferivelmente entre 20 a 70 % em peso, especialmente entre 30 a 60 % em peso, tal como em tomo de 50 % em peso.

Pré-tratamento Químico, Mecânico e/ou Biológico

O material contendo lignocelulose pode de acordo com a invenção ser química, mecânica e/ou biologicamente pré-tratada antes da hidrólise e/ou fermentação. O tratamento mecânico (frequentemente referido como o tratamento físico) pode ser usado ou em combinação com hidrólise subsequente ou simultaneamente, especialmente hidrólise enzimática.

Preferivelmente, o pré-tratamento químico, mecânico e/ou biológico é realizado antes da hidrólise e/ou fermentação. Altemativamente, o pré-tratamento químico, mecânico e/ou biológico pode ser realizado simultaneamente com a hidrólise, tal como simultaneamente com a adição de uma ou mais enzimas de celulase (enzimas celulolíticas) ou outras atividades de enzima mencionadas abaixo, para liberar, por exemplo, açúcares fermentáveis, tais como glicose e/ou maltose.

Em uma forma de realização da invenção, o material contendo lignocelulose pré-tratado pode ser lavado antes e/ou após a desintoxicação. Entretanto, a lavagem não é obrigatória e é, em uma forma de realização preferida, eliminada.

De acordo com uma forma de realização da invenção uma ou mais enzimas desintoxicadoras podem ser adicionadas ao material contendo lignocelulose pré-tratado na etapa (c) ou (ii). A etapa de desintoxicação (c) ou (ii) e a etapa de hidrólise (b) ou (iii) pode ser realizada de maneira simultânea ou sequencial. O efeito tóxico reduzido no organismo de fermentação é mostrado nos Exemplos 2 e 3.

As etapas podem, em uma forma de realização, ser realizadas em uma solução de tratamento (isto é, um banho). Em uma forma de realização, as enzimas de hidrolisação e as enzimas desintoxicadoras são adicionadas simultaneamente à solução de tratamento. Em uma outra forma de realização, as enzimas de hidrolisação são adicionadas antes das enzimas desintoxicadoras. Pode ser vantajoso completar acima de 50 % de hidrólise, preferivelmente acima de 70 % de hidrólise, especialmente acima 90 % de hidrólise antes de adicionar as enzimas desintoxicadoras para a solução de tratamento. Se o material contendo lignocelulose pré-tratado for hidrolisado enzimaticamente, é vantajoso realizar a desintoxicação antes e/ou simultânea com a hidrólise. Entretanto, se a hidrólise é realizada usando-se um ou mais ácidos, isto é, hidrólise ácida, a desintoxicação é preferivelmente realizada após e/ou simultaneamente com a hidrólise ácida.

Em uma outra forma de realização, a etapa de desintoxicação (c) ou (ii) pode ser realizada separadamente a partir da etapa de hidrólise (b) ou (iii) e etapa de fermentação (d) ou (iv), respectivamente, que em uma forma de realização pode ser realizada de maneira simultânea. Em uma outra forma de realização, todas as etapas (b), (c) e (d) ou (i), (ii), (iii) e (iv), respectivamente, são realizadas de maneira simultânea ou sequencial. Quando a desintoxicação é realizada como uma etapa separada, esta é tipicamente realizada entre 1 a 24 horas.

Em uma forma de realização preferida, o material contendo lignocelulose pré-tratado não é lavado.

Em uma forma de realização, as enzimas oxidantes de composto fenólico são dosados na faixa acima de 0, tal como 0,01 a 1 mg/g DS ou na faixa acima de 0 to 100 LACU/g DS. Em uma forma de realização, as enzimas que apresentam atividade de peroxidase são dosadas na faixa acima de 0, tal como 0,01 a 10 mg/g DS ou acima de 0, tal como 0,01 a 100 PODU/g DS.

Pré-tratamento Químico

O termo “tratamento químico” refere-se a qualquer prétratamento químico que promove a separação e/ou a liberação de celulose, hemicelulose e/ou lignina. Os exemplos de pré-tratamentos químicos adequados incluem tratamento com, por exemplo, ácido diluído, cal, alcalino, solvente orgânico, amônia, dióxido de enxofre, dióxido de carbono. Além disso, a oxidação úmida e a hidrotermólise controlada por também são consideradas pré-tratamento químico.

Em uma forma de realização preferida o pré-tratamento químico é tratamento com ácido, mais preferivelmente, um tratamento com ácido diluído e/ou brando contínuo, tal como, tratamento com ácido sulfurico ou um outro ácido orgânico, tal como ácido acético, ácido cítrico, ácido tartárico, ácido succínico, cloreto de hidrogênio ou misturas destes. Outros ácidos também podem ser usados. Tratamento ácido brando significa que o pH do tratamento está na faixa de 1 a 5, preferivelmente de 1 a 3. Em uma forma de realização específica a concentração de ácido está na faixa de 0,1 a 2,0 % em peso de ácido, preferivelmente, ácido sulfurico. O ácido pode ser contatado com o material contendo lignocelulose e a mistura pode ser mantida em uma temperatura na faixa de 160 a 220°C, tal como 165 a 195°C, por períodos que variam de minutos a segundos, por exemplo, 1 a 60 minutos, tais como 2 a 30 minutos ou 3 a 12 minutos. Alem disso, ácidos fortes, tais como ácido sulfúrico, podem ser aplicados para remover a hemicelulose. Isto intensifica a digestibilidade da celulose.

Outras técnicas também são abrangidas. O tratamento de solvente com celulose foi mostrado converter cerca de 90 % de celulose à glicose. Também foi mostrado que a hidrólise enzimática pode ser grandemente intensificada quando a estrutura de lignocelulose é separada. H2O2 alcalina, ozônio, organossolvente (usa ácidos de Lewis, FeCl₃, (A1)₂SO4 em álcoois aquosos), glicerol, dioxano, fenol ou etileno glicol estão entre os solventes conhecidos para separar a estrutura de celulose e promover a hidrólise (Mosier et al., 2005, Bioresource Technology 96: 673-686).

O pré-tratamento químico alcalino com base, por exemplo, NaOH, Na₂CO₃ e/ou amônia ou semelhante, também é considerado de acordo com a invenção. Os métodos de pré-tratamento usando-se amônia são descritos em, por exemplo, WO 2006/110891, WO 2006/110899, WO 2006/110900 e WO 2006/110901 (que são, desse modo, incorporados por referência).

As técnicas de oxidação úmida envolvem o uso de agentes oxidantes, tais como: agentes oxidantes com base em sulfito ou coisa parecida. Os exemplos dos pré-tratamentos com solvente incluem o tratamento com DMSO (Sulfóxido de dimetila) ou semelhante. O prétratamento químico é, no geral, realizado por 1 a 60 minutos, tais como de 5 a 30 minutos, mas pode ser realizado por períodos mais curtos ou mais longos de tempo dependendo do material a ser pré-tratado.

Outros exemplos de métodos de pré-tratamento adequado são descritos por Schell et al., 2003, Appl. Biochem and Biotechn. Vol. 105-108:

69-85 e Mosier et al., 2005, Bioresource Technology 96: 673-686 e

Publicação U. S. N° 2002/0164730, cujas referências são todas incorporadas neste por referência.

Pré-tratamento mecânico

O termo “pré-tratamento mecânico” refere-se a qualquer tratamento mecânico (ou físico) que promova a separação e/ou a liberação de celulose, hemicelulose e/ou lignina a partir do material contendo lignocelulose. Por exemplo, pré-tratamento mecânico inclui vários tipos de trituração, irradiação, vaporização/explosão de vapor e hidrotermólise.

O pré-tratamento mecânico inclui a trituração (redução mecânica do tamanho). A trituração inclui a trituração seca, trituração úmida trituração com esferas vibratórias. O pré-tratamento mecânico pode envolver pressão alta e/ou temperatura alta (explosão de vapor). Em uma forma de realização da invenção pressão alta significa pressão na faixa de 300 a 600 psi, preferivelmente 400 a 500 psi, tal como em tomo de 450 psi. Em uma forma de realização da invenção, temperatura alta significa temperaturas na faixa de cerca de 100 a 300°C, preferivelmente de cerca de 140 a 235°C. Em uma forma de realização preferida o pré-tratamento mecânico é um processo por bateladas, sistema hidrolisador por pistola de vapor que usa pressão alta e temperatura alta como definido acima. Um Sunds Hidrolyzer (disponível da Sunds Defibrator AB (Suécia) pode ser usado para isto.

Pré-tratamento Químico e Mecânico Combinados

Em uma forma de realização preferida, tanto o pré-tratamento químico quanto mecânico são realizados. Por exemplo, a etapa de prétratamento pode envolver o tratamento com ácido diluído ou brando e tratamento com temperatura e/ou pressão altas. O pré-tratamento químico e mecânico pode ser realizado de maneira sequencial ou simultânea, como desejado.

Consequentemente, em uma forma de realização preferida, o material contendo lignocelulose é submetido tanto ao pré-tratamento químico quanto mecânico para promover a separação e/ou a liberação de celulose, hemicelulose e/ou lignina.

Em uma forma de realização preferida o pré-tratamento é realizado como uma etapa de explosão de vapor de ácido diluído e/ou brando. Em uma outra forma de realização preferida o pré-tratamento é realizado como uma etapa de explosão de fibra de amônia (ou etapa de pré-tratamento AFEX).

Pré-tratamento biológico

Como usado na presente invenção o termo “pré-tratamento biológico” refere-se a qualquer pré-tratamento biológico que promova a separação e/ou a liberação de celulose, hemicelulose e/ou lignina do material contendo lignocelulose. As técnicas de pré-tratamento biológico podem envolver a aplicação de microorganismos de solubilização de lignina (ver, por exemplo, Hsu, 1996, Pretreatment of biomass, em Handbook on Bioetanol: Production and Utilízation, Wyman, ed., Taylor & Francis, Washington, DC, 179-212; Ghosh and Singh, 1993, Physicochemical and biological treatments for enzymatic/microbial conversion of lignocelulosic biomass, Adv. Appl. Microbiol. 39: 295-333; McMillan, 1994, Pretreating lignocelulosic biomass: a review, in Enzymatic Conversion of Biomass for Fuels Production, Himmel, Baker, and Overend, eds., ACS Symposium Series 566, American Chemical Society, Washington, DC, capítulo 15; Gong, Cao, Du, and Tsao, 1999, Etanol production from renewable resources, in Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology, Scheper, ed., Springer-Verlag Berlin Heidelberg, Germany, 65: 207-241; Olsson and HahnHagerdal, 1996, Fermentation of lignocelulosic hidrolysates for etanol production, Enz. Microb. Tech. 18: 312-331; and Vallander and Eriksson, 1990, Production of etanol from lignocellulosic materiais: State of the art, Adv. Biochem. Eng./Biotechnol. 42: 63-95).

Hidrólise

Antes e/ou simultaneamente com a fermentação, o material contendo lignocelulose pré-tratado pode ser hidrolisado para quebrar a celulose e hemicelulose.

O teor de sólidos secos durante a hidrólise podem estar na faixa de 5 a 50 % em peso, preferivelmente 10 a 40 % em peso, preferivelmente 20 a 30 % em peso. A hidrólise pode em uma forma de realização preferida ser realizada como um processo de grupo de alimentação onde o material contendo lignocelulose pré-tratado (substrato) é alimentado gradualmente a, por exemplo, uma solução de hidrólise contendo enzima.

Em uma forma de realização da invenção a desintoxicação acontece antes, durante ou após a hidrólise.

Em uma forma de realização preferida a hidrólise é realizada enzimaticamente. De acordo com a invenção o material contendo lignocelulose pré-tratado pode ser hidrolisado por uma ou mais hidrolases (classe EC 3 de acordo com a Nomenclatura de Enzima), preferivelmente uma ou mais carboidrases selecionadas do grupo que consiste de celulase, hemicelulase, amilase, tal como alfa-amilase, protease, enzima geradora de carboidrato, tal como glucoamilase, esterase, tal como lipase. Alfa-amilase, glicoamilase e/ou semelhante pode estar presente durante a hidrólise e/ou fermentação como o material contendo lignocelulose pode incluir algum amido.

As enzimas usadas para hidrólise são capazes de converter direta ou indiretamente polímeros de carboidrato em açúcares fermentáveis que podem ser fermentados em um produto de fermentação desejado, tal como etanol.

Em uma forma de realização preferida, a carboidrase tem atividade de enzima de celulase. As carboidrases adequadas são descritas nas “Enzimas”-seção abaixo.

Os polímeros de hemicelulose podem ser quebrados por hemicelulases e/ou hidrólise ácida para a liberação de seus cinco e seis componentes de açúcar de carbono. Os seis açúcares de carbono (hexoses), tais como glicose, galactose, arabinose e manose, pode ser facilmente fermentada a, por exemplo, etanol, acetona, butanol, glicerol, ácido cítrico, ácido fumárico, etc. por fermentadores de organismo adequados incluindo levedura. Preferido para a fermentação de etanol é a levedura das espécies Saccharomyces cerevisiae, preferivelmente cepas que são resistentes com relação aos altos níveis de etanol, isto é, até, por exemplo, cerca de 10, 12 ou 15 % em volume de etanol ou mais, tal como 20 % em volume de etanol.

Em uma forma de realização preferida o material contendo 10 lignocelulose pré-tratado é hidrolisado usando-se uma hemicelulase, preferivelmente uma xilanase, esterase, celobiase ou combinação dos mesmos.

A hidrólise também pode ser realizada na presença de uma combinação de hemicelulases e/ou celulases e opcionalmente uma ou mais das outras atividades de enzimas mencionadas na seção “Enzima” abaixo.

Em uma forma de realização preferida a hidrólise e a fermentação são realizadas como uma etapa de hidrólise e fermentação simultâneas (SSF). No geral, isto significa que a hidrólise e fermentação combinadas/simultâneas são realizadas em condições (por exemplo, temperatura e/ou pH) adequadas, preferivelmente ótimas, para os fermentadores de organismo em questão.

Em uma outra forma de realização preferida a hidrólise e a fermentação são realizadas como hidrólise híbrida e fermentação (HHF). A HHF começa tipicamente com uma etapa de hidrólise parcial separada e termina com uma etapa de hidrólise e fermentação simultâneas. A etapa de hidrólise parcial separada é uma etapa de sacarificação de celulose enzimática tipicamente realizada em condições (por exemplo, em temperaturas mais altas) adequadas, preferivelmente ótimas, para as enzimas de hidrolisação em questão. A etapa de hidrólise e fermentação subsequente simultânea é tipicamente realizada em condições adequadas para os organismos fermentadores (frequentemente em temperaturas mais baixas do que a etapa de hidrólise separada). Finalmente, a hidrólise e a fermentação também podem ser realizadas em hidrólise e fermentação separadas, onde a hidrólise é levada à finalização antes do início da fermentação. Esta frequentemente referida como “SHF”.

Os tratamentos enzimáticos podem ser realizados em um ambiente aquoso adequado sob condições que podem ser facilmente determinadas por uma pessoa habilitada na técnica.

Em uma forma de realização preferida a hidrólise é realizada em condições adequadas, preferivelmente ótimas para as enzimas em questão.

O tempo de processo adequado, temperatura e condições de pH podem ser facilmente determinadas por uma pessoa habilitada na técnica da presente invenção. Preferivelmente, a hidrólise é realizada em uma temperatura entre 25 e 70°C, preferivelmente entre 40 e 60°C, especialmente em tomo 50°C. O processo é preferivelmente realizado em um pH na faixa de 3 a 8, preferivelmente pH 4 a 6, especialmente em tomo do pH 5.

Preferivelmente, a hidrólise é realizada entre 12 e 96 horas, preferivelmente 16 a 72 horas, mais preferivelmente entre 24 e 48 horas.

De acordo com a invenção, a hidrólise na etapa (b) ou (iii) e a fermentação na etapa (d) ou (iv) podem ser realizada de maneira simultânea (processo SSF) ou sequencial (processo SHF) ou como hidrólise híbrida e fermentação (HHF).

Fermentação

De acordo com a invenção o material contendo lignocelulose pré-tratado (e hidrolisado) é fermentado por pelo menos um organismo de fermentação capaz de fermentar açúcares fermentáveis, tais como glicose, xilose, manose e galactose direta ou indiretamente em um produto de fermentação desejado.

A fermentação está, preferivelmente, progredindo entre 8 e 96 horas, preferivelmente 12 e 72 horas, mais preferivelmente 24 e 48 horas.

Em uma forma de realização a fermentação é realizada em uma temperatura entre 20 e 40°C, preferivelmente 26 e 34°C, em particular, em tomo de 32°C. Em uma forma de realização, o pH é do pH 3 a 6, preferivelmente em tomo do pH 4 a 5.

Considerado de acordo com a invenção está a hidrólise e a fermentação simultâneas (SSF). Em uma forma de realização não existe estágio de manutenção separada para a hidrólise, significando que as enzimas de hidrolisação e o organismo de fermentação são adicionados juntos. Quando a fermentação (por exemplo, fermentação de etanol usando-se levedura Saccharomyces) é realizada simultânea com a hidrólise, a temperatura está preferivelmente entre 26°C e 35°C, mais preferivelmente entre 30°C e 34°C, tal como em tomo de 32°C. Um programa de temperatura compreendendo pelo menos dois estágios de manutenção em temperaturas diferentes pode ser aplicado de acordo com a invenção.

O processo da invenção pode ser realizado como uma batelada, alimentação batelada ou como um processo contínuo.

Recuperação

Subsequente à fermentação, o produto de fermentação pode ser separado de um meio/caldo de fermentação. O meio/caldo pode ser destilado para a extração do produto de fermentação ou o produto de fermentação pode ser extraído a partir de um meio/caldo de fermentação pelas técnicas de filtração micro ou por membrana. Altemativamente, o produto de fermentação pode ser recuperado por retirada. Os métodos de recuperação são bem conhecidos na técnica.

Produtos de fermentação

Os processos da invenção podem ser usados para a produção de qualquer produto de fermentação. Os produtos de fermentação especialmente considerados incluem álcoois (por exemplo, etanol, metanol, butanol); ácidos orgânicos (por exemplo, ácido cítrico, ácido acético, ácido itacônico, ácido láctico, ácido glucônico); cetonas (por exemplo, acetona); aminoácidos (por exemplo, ácido glutâmico); gases (por exemplo, H₂ e CO₂); antibióticos (por exemplo, penicilina e tetraciclina); enzimas; vitaminas (por exemplo, riboflavina, B12, beta-caroteno) e hormônios.

Os produtos considerados também incluem produtos industriais de álcool consumível, por exemplo, cerveja e vinho; produtos industriais diários, por exemplo, produtos diários fermentados; produtos da indústria de couro e produtos da indústria de tabaco. Em uma forma de realização preferida o produto de fermentação é um álcool, especialmente etanol. O produto de fermentação, tal como etanol, obtido de acordo com a invenção, podem ser, preferivelmente álcool/etanol combustível. Entretanto, no caso de etanol, este também pode ser usado como etanol potável.

Organismo de fermentação

O termo “organismo de fermentação” refere-se a qualquer organismo, incluindo organismos bacterianos e fúngicos, adequados para produzir um produto de fermentação desejado. Os organismos fermentadores especialmente adequados de acordo com a invenção são capazes de fermentar, isto é, converter, açúcares, tais como glicose, direta ou indiretamente no produto de fermentação desejado. Os exemplos de organismos fermentadores incluem organismo fúngicos, tais como levedura. A levedura preferida inclui cepas do gênero Saccharomyces, em particular uma cepa de Saccharomyces cerevisiae ou Saccharomyces uvarunr, uma cepa de Pichia, em particular Pichia stipítis ou Pichia pastoris·, uma cepa do gênero Candida, em particular uma cepa de Candida utilis, Candida arabinofermentans, Candida diddensii ou Candida boidinii. Outras leveduras consideradas incluem cepas de Hansenula, em particular Hansenula polymorpha ou Hansenula anômala} cepas de Kluyveromyces, em particular Kluyveromyces marxianus ou

Kluyveromyces fagilis e cepas de Schizosaccharomyces, em particular Schizosaccharomyces pombe.

Os organismos fermentadores bacterianos preferidos incluem cepas de Escherichia, em particular Escherichia coli, cepas de Zymomonas, em particular Zymomonas mobilis, cepas de Zymobacter em particular Zymobactor palmae, cepas de Klebsiella, em particular Klebsiella oxitoca, cepas de Leuconostoc, em particular Leuconostoc mesenteroides, cepas de Clostridium, em particular Clostridium butyricum, cepas de Enterobacter em particular Enterobacter aerogenes e cepas de Thermoanaerobacter, em particular Thermoanaerobacter BG1L1 (Appl. Micrbiol. Biotech. ΎΤ. 61-86) e Thermoanarobacter etanolicus.

A levedura comercialmente disponível inclui, por exemplo, levedura RED STAR™ ou ETHANOL RED™ (disponível da Fermentis/Lesaffre, USA), FALI (disponível da Fleischmann’s Yeast, USA), levedura freca SUPERSTART e THERMOSACC™ (disponível da Etanol Technology, WI, USA), BIOFERM AFT e XR (disponível da NABC-North American Bioproducts Corporation, GA, USA), GERT STRAND (disponível da Gert Strand AB, Sweden) e FERMIOL (disponível da DSM Specialties).

Enzimas

Embora não especificamente mencionado o contexto dos processos da invenção, deve ser entendido que as enzimas (bem como outros compostos) são usadas em uma “quantidade eficaz”. Por exemplo, “quantidade eficaz” significa, no contexto de enzimas oxidantes de composto fenólico que tem um efeito melhorador em comparação com um processo correspondente onde nenhuma enzima oxidante de composto fenólico foi adicionada.

Enzimas Oxidantes de Composto Fenólico

As enzimas oxidantes de compostos fenólicos preferidas que pertencem a qualquer uma das classes EC seguintes: Catecol oxidase (EC

1.10.3.1), Lacase (EC 1.10.3.2), o-Aminofenol oxidase (1.10.3.4) e Monofenol monooxigenase (1.14.18.1).

Lacase

As lacases (EC 1.10.3.2) são enzimas contendo cobre múltiplas que catalisam a oxidação de composto fenólicos. As lacases são produzidas por plantas, bactérias e também uma ampla variedade de fungos, incluindo Ascomycetes, tais como Aspergillus, Neurospora e Podospora', Deuteromycete incluindo Botrytis e Basidiomycetes tais como Collybia, Fomes, Lentinus, Pleurotus, Trametes e formas perfeitas de Rhizoctonia. Diversas lacases fungicas foram isoladas. Por exemplo, Choi et al. (Mol. Plant-Microbe Interactions 5: 119-128, 1992) descrevem a caracterização e a clonagem molecular do gene que codifica a do fungo da ferrugem da castanha, Cryphonectria parasitica. Kojima et al. (J. Biol. Chem. 265: 1522415230, 1990; JP 2-238885) fornece uma descrição de duas formas alélicas da lacase da putrefação branca Coriolus hirsutus. Germann and Lerch (Experientia 41: 801, 1985; PNAS USA 83: 8854-8858, 1986) relataram a clonagem e o sequenciamento parcial do gene de lacase de Neurospora crassa. Saloheimo et al. (J. Gen. Microbiol. 137: 1537-1544, 1985; WO 92/01046) divulgou uma análise estrutural do gene lacase do fungo Phlebia radiata.

As lacases especialmente consideradas incluem aquelas derivadas de uma cepa de Polyporus, preferivelmente Polyporus pinsitus', Melanocarpus, preferivelmente Melanocarpus albomyces', Myceliophtora, preferivelmente Myceliophtora thermophila·, Coprinus, preferivelmente Coprinus cinereus', Rhizoctonia, preferivelmente Rhizoctonia solani ou Rhizoctonia praticola', Scytalidíum, preferivelmente Scytalidíum thermophilunr, Piricularia, preferivelmente Piricularia oryzae.

Em uma forma de realização, a lacase é derivada dos três Rhus vernicifera (Yoshida, 1983, Chemistry of Lacquer (Urushi) parte 1. J. Chem.

Soc. 43: 472-486).

Em uma outra forma de realização a lacase é derivada de Myceliopthora thermophíla, por exemplo, o descrito no WO 95/33836 (Novozymes).

Em uma outra forma de realização a lacase é derivada de Polyporus pinsitus, por exemplo, o descrito no WO 96/00290 (Novozymes).

Jõnsson et al., 1998, Appl. Microbiol. Biotechnol. 49: 691-697, também divulga uma lacase adequada derivada de Polyporus versicolar.

Outras lacases incluem a derivada de Piricularia oryzae considerada em, por exemplo, Muralikrishna et al., 1995, Appl. Environ. Microbiol. 61(12): 4374-4377, ou a lacase derivada de Scytalidium thermophilum, que é divulgada em Abstract of Papers American Chemical Society vol. 209, no. 1-2, 1995.

A lacase também pode ser uma derivada de CoprÍnus cinereus, por exemplo, a considerada em Schneider et al., 1999, Enzyme and Microbial Technology 25: 502-508.

Outras lacases adequadas incluem aquelas derivadas de Rhizoctonia solani consideradas em Waleithner et al., Curr. Genet., 1996, 29: 395-403, ou derivada de Melanocarpus albomyces considerada em Kiiskinen et al., 2004, Microbiology 150: 3065-3074.

As lacases bacterianas adequadas incluem aquelas derivadas de Streptomyces coelicolor, por exemplo, divulgadas por Machczynski et al. in Protein Science, 2004, 13: 2388-2397.

Enzimas que apresentam atividade de peroxidase

De acordo com a invenção qualquer enzima que apresenta atividade de peroxidase pode ser usada.

A enzima que apresenta atividade de peroxidase pode ser selecionada do grupo que consiste de uma peroxidase (EC 1.11.1.7), haloperoxidase (EC 1.11.1.8 e EC 1.11.1.10), lignina peroxidase (EC

1.11.1.14), manganês peroxidase (EC 1.11.1.13) e lipoxigenase (EC.1.13.11.12).

Peroxidase

A enzima que apresenta atividade de peroxidase pode ser qualquer peroxidase classificada como EC 1.11.1.7.

As peroxidases adequadas nos processo da invenção podem ser de origem vegetal (por exemplo, peroxidase de rábano silvestre ou de soja) microbiana, tal como de fungica ou bacteriana. Os exemplos incluem peroxidases derivadas de fungos da subdivisão Deuteromycotína, classe Hyphomycetes, por exemplo, Fusarium, Humicola, Tricoderma, Myrothecium, Verticillum, Arthromyces, Caldariomyces, Ulocladium, Embellisia, Cladosporium ou Dreschlera, em particular Fusarium oxisporum (DSM 2672), Humicola insolens, Trichoderma reesii, Myrothecium verrucana (IFO 6113), Verticillum alboatrum, Verticillum dahlia, Arthromyces ramosus (FERM P-7754), Caldariomyces fumago, Ulocladium chartarum, Embellisia alli ou Dreschlera halodes.

Outras peroxidases adequadas são derivadas de fungos incluindo cepas da subdivision Basidiomycotina, classe Basídiomycetes, por exemplo, Coprinus, Phanerochaete, Coriolus ou Trametes, em particular Coprinus cinereus f. microsporus (IFO 8371), Coprinus macrorhizus, Phanerochaete chrysosporium (por exemplo, NA-12) ou Trametes (previamente denominado Polyporus), por exemplo, T. versicolor (por exemplo, PR4 28-A).

Outras peroxidases podem ser derivadas de fungos incluindo cepas que pertencem à subdivisão Zygomycotína, classe Mycoraceae, por exemplo, Rhizopus ou Mucor, em particular Mucor hiemalis.

As peroxidases bacterianas podem ser derivadas de cepas da ordem Actínomycetales, por exemplo, Streptomyces spheroides (ATTC

23965), Streptomyces thermoviolaceus (IFO 12382) ou Streptoverticillum verticillium ssp. Verticilliurrr, Bacillus pumilus (ATCC 12905), Bacillus stearothermophilus, Rhodobacter sphaeroides, Rhodomonas palustri, Streptococcus lactis, Pseudomonas purrocinia (ATCC 15958) ou Pseudomonas fluorescens (NRRL B-ll); Myxococcus, por exemplo, M. virescens.

As peroxidases recombnantemente produzidas derivadas de Coprinus sp., em particular C. macrorhizus ou C. cinereus são descrita no WO 92/16634. As variantes destes são descritas no WO 94/12621.

Haloperoxidase

A enzima que apresenta a atividade de peroxidase pode ser qualquer haloperoxidase. As haloperoxidases são difundidas em estado natural e são conhecidas serem produzida por mamíferos, plantas, algas, lóquen, bactérias e fungos. Existem três tipos de haloperoxidases, classificadas de acordo com sua especificidade quanto a íons de haletos: Cloroperoxidases (E.C. 1.11.1.10) que catalisa a cloração, bromação e a iodação de compostos; as bromoperoxidases que mostram especificidade com relação a íons de brometo e de iodeto e iodoperoxidases (E.C. 1.11.1.8) que catalisam unicamente a oxidação de íons de iodeto.

As haloperoxidases incluem as haloperoxidase de Curvularia, em particular, C. verruculosa, tal como, C. verruculosa CBS 147.63 ou C. verruculosa CBS 444.70. A Curvularia haloperoxidase e sua produção recombinante é descrita em W097/04102. A peroxidase de brometo foi isolada das algas (ver patente U.S. N° 4.937.192). Haloperoxidases também são descritas na patente U. S. N° 6.372.465 (Novozymes A/S).

Em uma forma de realização preferida, a haloperoxidase é uma cloroperoxidase (E.C. 1.11.1.10). As cloroperoxidases são conhecidas na técnica e pode ser obtido a partir de Streptomyces aureofaciens, Streptomyces lividans, Pseudomonas fluorescens, Caldariomyces fumago, Curvularia inaequalis e Corallina officinalis. Uma cloroperoxidase preferida é a cloroperoxidase de Caldariomyces fumago (disponível da SIGMA, C-0278).

Haloperoxidases contendo um grupo protético de vanádio são conhecidos incluir pelo menos dois tipos de cloroperoxidases de Curvularia inaequalis (van Schijndel et al., 1993, Biochimica Biophysica Acta 1161:249256; Simons et al., 1995, European Journal of Biochemistry 229: 566-574; WO 95/27046) and Curvularia verruculosa (WO 97/04102) ou Phaeotrichoconis crotalariae haloperoxidase (WO 2001/079461).

Lipoxigenase (LOX)

A enzima que apresenta atividade de peroxidase pode ser qualquer lipoxigenase (LOX). As lipoxigenases são classificadas como EC 1.13.11.12, que é uma enzima que catalisa a oxigenação de ácidos graxos poli-insaturados, especialmente czXcz\-l,4-dienos, por exemplo, ácido linoleico e produz um hidroperóxido. Mas também outros substratos podem ser oxidados, por exemplo, ácidos graxos monoinsaturados. Lipoxigenases microbianas podem ser derivadas de, por exemplo, Saccharomyces cerevisiae, Thermoactinomyces vulgaris, Fusarium ovÁsporum, Fusarium proliferatum, Thermomyces lanuginosus, Vvcicularia oryzae, and cepas de Geotrichum. A preparação de uma lipoxigenase derivada de Gaeumannomyces graminis é descrita nos Exemplos 3-4 de WO 02/20730. A expressão em Aspergillus oryzae de uma lipoxigenase derivada de Magnaporthe salvinii é descrita no Exemplo 2 do WO 02/086114 e esta enzima pode ser purificada usando-se métodos padrão, por exemplo, como descrito no Exemplo 4 do WO 02/20730.

A Lipoxigenase (LOX) também pode ser extraída de sementes vegetais, tais como soja, ervilha, grão de bico e feijão comum. Altemativamente, a lipoxigenase pode ser obtida a partir de células de mamíferos, por exemplo, reticulócitos de coelho.

Celulase ou Enzimas celulolíticas

O termo “celulase” ou “enzimas celulolíticas” como usado neste são entendido como compreender o celobiohidrolase (EC 3.2.1.91), por exemplo, celobiohidrolase I e celobiohidrolase II, bem como a endo-glicanase (EC 3.2.1.4), e beta-glicosidase (EC 3.2.1.21).

A fim de ser eficiente, a digestão da celulose e hemicelulose requer diversos tipos de enzimas ativando cooperativamente. Em pelo menos três categorias de enzimas são importantes converter a celulose em açúcares fermentáveis: corte de cadeias de celulose para endo-glicanase (EC 3.2.1.4) em aleatório; unidades de celobiosila clivadas por celobiohidrolase (EC 3.2.1.91) a partir das extremidades da cadeia de celulose e celobiose convertida por beta-glicosidase (EC 3.2.1.21) e celodextrinas solúveis na glicose. Entre estas três categorias de enzimas envolvidas na biodegração da celulose, celobiohidrolase são as enzimas chaves para a degradação da celulose cristalina ativa. O termo “celobiohidrolase I” é definido neste como uma atividade de celulose 1,4-beta-celobiosidase (também referido como exoglicanase, exo-celobiohidrolase ou 1,4-beta-celobiohidrolase), como definido na classe de enzima EC 3.2.1.91, que catalisa a hidrólise de ligações de 1,4beta-D-glucosídeo na celulose e celotetraose, pela liberação de celobiose a partir das extremidades não reduzidas das cadeias. A definição do termo “atividade da celobiohidrolase II” é idêntico, exceto que a celobiohidrolase II ataca a partir das extremidades reduzidas das cadeias.

Endoglicanase (EC No. 3.2.1.4) catalisa a endo hidrólise das linguagens 1,4-beta-D-glicosídeo na celulose, derivados de celulose (tal como carbóxi metil celulose e hidróxi metil celulose), liquenina, ligações beta-1,4 nos glicanos beta-1,3 misturados tal como beta-D-glicanos de cereal ou xiloglicanos e outros materiais vegetais contendo partes celulósicas. O nome autorizado é endo-1,4-beta-D-glicano 4-glicano hidrolase, mas o termo abreviado endoglicanase é usado na presente especificação.

A celulase ou enzimas celulolíticas podem compreender um módulo de ligação de carboidrato (CBM) que intensifica a ligação da enzima a uma fibra contendo celulose e aumenta a eficácia da parte ativa catalítica da enzima. Um CBM é definido como a sequência de aminoácido continuo dentro de uma enzima ativa do carboidrato com uma dobra discreta tendo atividade de ligação de carboidrato. Pela informação adicional em CBMs ver, por exemplo, o servidor de internet CAZy (Supra) ou Tomme et al., 1995, em Enzymatic Degradation of Insoluble Polysaccharides (Saddler & Penner, eds.), Celulose-binding domains: classification and properties, páginas 142163, American Chemical Society, Washington.

A atividade de celulase pode ser, em uma forma de realização preferida, derivado de uma fonte fungica, tal como uma cepa do gênero Trichoderma, preferivelmente uma cepa de Trichoderma reesei', uma cepa do gênero Humicola, tal como uma cepa de Humicola insolens', ou uma cepa de Chrysosporium, preferivelmente uma cepa de Chrysosporium lucknowense.

Em uma forma de realização preferida a preparação da enzima celulolítica ou celulase é uma composição relacionada no Pedido condicional U.S. do Pedido co-pendente N°. 60/941.251, que é neste incorporado neste por referência. Em uma forma de realização preferida a preparação da enzima celulolítica ou celulase que compreende um polipeptídeo tendo atividade intensificada celulolítica, preferivelmente uma família de polipeptídeo GH61Um, preferivelmente um divulgado em WO 2005/074656 (Novozymes). A preparação da enzima celulolítica ainda pode compreender uma beta-glicosidase, tal como um beta-glicosidase derivado de uma cepa do gênero Trichoderma, Aspergillus, ou Penicillium, incluindo a proteína de fusão tendo atividade de beta-glicosidase divulgado no Pedido condicional U.S. N°. 60/832.511 (PCT/US2007/074038) (Novozymes). Em uma forma de realização preferida a preparação da enzima celulolítica também pode compreender uma enzima CBH II, preferivelmente Thielavia terrestris celobiohidrolase II (CEL6A). Em uma outra forma de realização preferida a preparação da enzima celulolítica também pode compreender as enzimas celulolíticas, preferivelmente um derivado de Trichoderma reesei ou

Humicola insolens.

Em uma forma de realização específica a preparação da enzima celulolítica também pode compreender um polipeptídeo tendo atividade intensificada celulolítica (GH61A) divulgado no WO 2005/074656; um CBH II a partir do Thielavia terrestris celobiohidrolase II (CEL6A); e uma beta-glicosidase (proteína de fusão divulgado no Pedido condicional U.S. N°. 60/832.511 (ou PCT/US2007/074038)), e enzimas celulolíticas derivados a partir do Trichoderma reesei.

Em uma outra forma de realização específica a preparação da enzima celulolítica também pode compreender um polipeptídeo tendo atividade intensificada celulolítica (GH61A) divulgado no WO 2005/074656; uma beta-glicosidase (proteína de fusão divulgado no Pedido condicional U.S. N°. 60/832.511 (ou PCT/US2007/074038)), e enzimas celulolíticas derivados a partir do Trichoderma reesei.

Em formas de realizações preferidas as preparações celulolíticas ou celulase são preparações celulolíticas A e B usados nos Exemplos 1 e 4, respectivamente, divulgado no Pedido condicional U.S. N°. 60/941.251.

Em uma forma de realização a celulase é o produto comercialmente disponível CELLUCLAST® 1.5L ou CELLUZYME™ (Novozymes A/S, Dinamarca) ou ACCELERASE™ 1000 (de Genencor Inc., USA).

Uma enzima celulolítica ou celulase pode ser adicionado pela hidrolisação do material contendo lignocelulose pré-tratado. A celulase pode ser dosada na faixa de 0,1 a 100 FPU por gramas de sólidos totais (TS), preferivelmente 0,5 a 50 FPU por grama TS, especialmente 1 a 20 FPU por grama TS.

Hemicelulase

A hemicelulose pode ser quebrada pela hemicelulase e/ou hidrólise do ácido para liberar estes cinco e seis componentes de açúcar de carbono. Em uma forma de realização da invenção o material derivado da lignocelulose pode ser tratado com uma ou mais hemicelulase.

Qualquer hemicelulase adequado para o uso na hidrolisação da celulose pode ser usado. A hemicelulase preferida inclui xilanase, arabinofuranosidase, acetil xilano esterase, feruloila esterase, glicuronidase, endo-galactanase, manase, endo ou exo arabinase, exo-galactanase, e misturas de dois ou mais destes. Preferivelmente, a hemicelulase pelo uso na presente invenção é uma exo-ativação de hemicelulase, e mais preferivelmente, a hemicelulase é uma exo-ativação de hemicelulase que tem a capacidade de hidrolisar a hemicelulose sob as condições ácidas do pH 7 abaixo, preferivelmente pH 3 a 7. Um exemplo de hemicelulase adequado para o uso na presente invenção inclui VISCOZYME™ (disponível de Novozymes A/S, Dinamarca).

A arabinofuranosidase (EC 3.2.1.55) catalisa a hidrólise de resíduos alfa-L-arabinofuranosídeo que não reduzem o terminal em alfa-Larabinosídeos.

A galactanase (EC 3.2.1.89), arabinogalactano endo-l,4-betagalactosidase, catalisa a endohidrólise das linguagens 1,4-D-galactosídico em arabinogalactanos.

A pectinase (EC 3.2.1.15) catalisa a hidrólise de linguagens

1,4-alfa-D-galactosidurônico em pectato e outros galacturonanos.

A xiloglicanase catalisa a hidrólise de xiloglucano.

A hemicelulase pode ser adicionada em uma quantidade efetiva de hidrolisar hemicelulose, tal como, em quantidades de cerca de 0,001 a 0,5 % em peso dos sólidos totais (TS), mais preferivelmente de cerca de 0,05 a 0,5 % em peso de TS.

Alfa-Amilase

De acordo com a invenção um alfa-amilase pode ser usado.

Em uma forma de realização preferida o alfa-amilase é um alfa-amilase ácido, por exemplo, alfa-amilase ácida fungica ou alfa-amilase ácida bacteriana. O termo “alfa-amilase ácida” significa uma alfa-amilase (E.C. 3.2.1.1) que adiciona em uma quantidade efetiva tem uma ótima atividade em um pH na faixa de 3 a 7, preferivelmente de 3,5 a 6, ou mais preferivelmente de 4 a 5.

Alfa-Amilase bacteriana

De acordo com a invenção a alfa-amilase bacteriana é preferivelmente derivado a partir do gênero Bacillus.

Em uma forma de realização preferida a Bacillus alfa-amilase é derivado de uma cepa de B. licheniformis, B. amiloliquefaciens, B. subtilis ou B. stearothermophilus, mas também pode ser derivado a partir do outros exemplos Bacillus sp. específicos de alfa-amilase considerados inclui o Bacillus licheniformis alfa-amilase mostrado na SEQ ID N°: 4 no WO 99/19467, o Bacillus amiloliquefaciens alfa-amilase SEQ ID N°: 5 no WO 99/19467 e o Bacillus stearothermophilus alfa-amilase mostrado na SEQ ID N°: 3 no WO 99/19467 (todas as sequências neste incorporado por referência). Em uma forma de realização da invenção a alfa-amilase pode ser uma enzima tendo um grau de identidade de pelo menos 60 %, preferivelmente em pelo menos 70 %, mais preferido pelo menos 80 %, ainda mais preferido pelo menos 90 %, tal como em pelo menos 95 %, em pelo menos 96 %, em pelo menos 97 %, em pelo menos 98 % ou em pelo menos 99 % por quaisquer uma das sequências mostrados na SEQ ID N°.: 1, 2 ou 3, respectivamente, no WO 99/19467.

O Bacillus alfa-amilase também pode ser uma variante e/ou híbrido, especialmente um descrito em qualquer um dos WO 96/23873, WO 96/23874, WO 97/41213, WO 99/19467, WO 00/60059, e WO 02/10355 (todos os documentos nestes incorporados por referência). Especificamente considerado variantes alfa-amilase são divulgados na Patente U.S. N°. 6.093.562. 6.297.038 ou 6.187.576 (neste incorporado por referência) e inclui as variantes Bacillus stearothermophilus alfa-amilase (BSG alfa-amilase) tendo uma anulação de um ou dois aminoácidos nas posições RI 79 a G182, preferivelmente uma dupla anulação divulgada no WO 1996/023873 - ver, por exemplo, página 20, linhas 1 a 10 (neste incorporado por referência), preferivelmente corresponde ao delta (181-182) em comparação à sequência de aminoácido BSG alfa-amilase de tipo selvagem apresentada na SEQ ID N°:3 divulgada no WO 99/19467 ou anulação de aminoácidos RI79 e G180 usando a SEQ ID N°:3 no WO 99/19467 pela numeração (cuja referência é neste incorporada por referência). Ainda mais preferido são os Bacillus alfaamilases, especialmente Bacillus stearothermophilus alfa-amilase, que tem uma dupla anulação correspondente ao delta(181-182) e ainda compreende uma substituição N193F (também denominada 1181* + G182* + N193F) em comparação à sequência de aminoácido BSG alfa-amilase de tipo selvagem apresentada na SEQ ID N°:3 divulgada no WO 99/19467.

Alfa-Amilase híbrida bacteriana

Uma alfa-amilase híbrida especificamente considerada compreende 445 resíduos de aminoácidos do terminal C do Bacillus licheniformis alfa-amilase (mostrado na SEQ ID N°: 4 do WO 99/19467) e os 37 resíduos de aminoácidos do terminal N dos derivados de alfa-amilase a partir do Bacillus amiloliquefaciens (mostrado na SEQ ID N°: 5 do WO 99/19467), com uma ou mais, especialmente todas, da seguinte substituição:

G48A+T49I+G107A+H156Y+A181 T+Nl 90F+I201F+A209V+ Q264S (usando a numeração do Bacillus licheniformis na SEQ ID N°: 4 do WO 99/19467). Também preferidas são as variantes tendo uma ou mais das seguintes mutações (ou mutações correspondentes em outras cadeias principais de Bacillus alfa-amilase): H154Y, A181T, N190F, A209V e Q264S e/ou anulação de dois resíduos entre as posições 176 e 179, preferivelmente a anulação de El78 e G179 (usando a numeração da SEQ ID N°: 5 do WO 99/19467).

Alfa-Amilase fúngica

A alfa-amilase fungica inclui alfa-amilase derivado de uma cepa do gênero Aspergillus, tal como, Aspergillus oryzae, Aspergillus niger e Aspergillis kawachii alfa-amilase.

Uma alfa-amilase fúngica ácida preferida é uma alfa-amilase semelhante à Fungamila que é derivado de uma cepa de Aspergillus oryzae. De acordo com a presente invenção, o termo alfa-amilase semelhante à fungamila indica uma alfa-amilase que exibe uma alta identidade, isto é, mais do que 70 %, mais do que 75 %, mais do que 80 %, mais do que 85 % mais do que 90 %, mais do que 95 %, mais do que 96 %, mais do que 97 %, mais do que 98 %, mais do que 99 % ou ainda 100 % da identidade à parte madura da sequência de aminoácido mostrado na SEQ ID N°: 10 no WO 96/23874.

Uma outra alfa-amilase ácida preferida é derivada de uma cepa Aspergillus niger. Em uma forma de realização preferida a alfa-amilase fungica ácida é uma partir de A. niger divulgado como “AMYAASPNG” no banco de dados Swiss-prot/TeEMBL sob o número de acessão primário P56271 e descrito no WO 89/01969 (Exemplo 3). Uma alfa-amilase fungica ácida comercialmente disponível derivado de aspergillus niger é SP288 (disponível de Novozymes A/S, Dinamarca).

Outra alfa-amilase de tipo selvagem considerado inclui aqueles derivados de uma cepa do gênero Rhízomucor e Meripilus, preferivelmente uma cepa de Rhizomucor pusillus (WO 2004/055178 incorporado pela referência) ou Meripilus giganteus.

Em uma forma de realização preferida a alfa-amilase é derivada a partir de aspergillus kawachii e debatido por Kaneko et al., 1996, J. Ferment. Bioeng. 81: 292-298, “Molecular-cloning an determination of the nucleotide-sequence of a gene encoding an acid-stable alpha-amilase from Aspergillus kawachii·, e ainda como EMBL:#AB008370.

A alfa-amilase fungica também pode ser uma enzima de tipo selvagem que compreende um domínio de ligação amido (SBD) e um domínio catalítico de amilase (isto é, não híbrido), ou uma variante destes. Em uma forma de realização a alfa-amilase de tipo selvagem é derivada de uma cepa de Aspergillus kawachii.

Alfa-Amilase híbrida fungica

Em uma forma de realização preferida a alfa-amilase ácida fungica é uma alfa-amilase híbrida. Os exemplos preferidos de alfa-amilase híbrida fungica inclui um divulgado no WO 2005/003311 ou Publicação U.S. N°. 2005/0054071 (Novozymes) ou Pedido condicional U.S. N°. 60/638.614 (Novozymes) que é neste incorporado neste por referência. A alfa-amilase híbrida pode compreender um domínio catalítico de amilase (CD) e um domínio de ligação de carboidrato/módulo (CBM), tal como um domínio de ligação amido, e um ligador opcional.

Os exemplos específicos de alfa-amilase híbrida considerada inclui aqueles divulgados na Tabela 1 a 5 dos exemplos no Pedido condicional U.S. N°. 60/638.614, incluindo a variante fungamila com domínio catalítico JA118 e Athelia rolfsii SBD (SEQ ID N°:100 no Pedido condicional U.S. N°. 60/638.614), Rhizomucor pusillus alfa-amilase com o ligador Athelia rolfsii AMG e SBD (SEQ ID N°:101 no Pedido condicional U.S. N°. 60/638.614), Rhizomucor pusillus alfa-amilase com o ligador de glicoamilase Aspergillus niger e SBD (que é divulgado na Tabela 5 como uma combinação da sequência de aminoácidos SEQ ID N°:20, SEQ ID N°:72 e SEQ ID N°:96 no Pedido U.S. N°. 11/316.535 e ainda como a SEQ ID N°: 13 neste) ou como V039 na Tabela 5 no WO 2006/069290, e Meripilus giganteus alfa-amilase com o ligador de glicoamilase Athelia rolfsii e SBD (SEQ ID N°: 102 no Pedido condicional U.S. N°. 60/638.614). Outras alfaamilase híbridas especificamente consideradas são quaisquer umas listadas na Tabelas 3, 4, 5, e 6 no Exemplo 4 no Pedido U.S. N°. 11/316.535 e WO

2006/069290 (neste incorporado por referência).

Outros exemplos específicos de alfa-amilase híbrida considerada inclui aqueles divulgados na Publicação U.S. N°. 2005/0054071, incluindo aqueles divulgados na Tabela 3 na página 15, tal como Aspergillus niger alfa-amilase com o ligador Aspergillus kawachii e domínio de ligação do amido.

Também são considerados as alfa-amilases que exibem uma alta identidade para qualquer um das alfa-amilases mencionadas acima, isto é, mais do que 70 %, mais do que 75 %, mais do que 80 %, mais do que 85 % mais do que 90 %, mais do que 95 %, mais do que 96 %, mais do que 97 %, mais do que 98 %, mais do que 99 % ou ainda 100 % da identidade às sequências enzimáticas maduras.

Uma alfa-amilase ácida pode ser de acordo com a invenção adicionado em uma quantidade de 0,1 a 10 AFAU/g DS, preferivelmente 0,10 a 5 AFAU/g DS, especialmente 0,3 a 2 AFAU/g DS.

Produtos de alfa-amilase comercial

As composições comerciais preferidas que compreendem alfaamilase incluem MYCOLASE de DSM, BAN™, TERMAMIL™ SC, FUNGAMIL™, LIQUOZYME™ X e SAN™ SUPER, SAN™ EXTRA L (Novozymes A/S) e CLARASE™ L-40,000, DEX-LO™, SPEZYME™ FRED, SPEZYME™ AA, e SPEZYME™ DELTA AA (Genencor Int.), e a alfa-amilase fungica ácida está sob o nome comercial de SP288 (disponível de Novozymes A/S, Dinamarca).

Enzima que gera fonte de carboidrato

O termo “enzima que gera fonte de carboidrato” inclui glicoamilase (sendo geradores de glicose), beta-amilase e amilase maltogênica (sendo geradores de maltose). Uma enzima que gera a fonte de carboidrato é capaz de produzir um carboidrato que pode ser usado como uma fonte de energia pelos organismos de fermentação em questão, por exemplo, quando usado em um processo da invenção para a produção de um produto de fermentação, tal como etanol. O carboidrato gerado pode ser convertido diretamente ou indiretamente ao produto de fermentação desejado, preferivelmente etanol. De acordo com a invenção uma mistura das enzimas que geram fonte de carboidrato pode ser usado. Especialmente as misturas consideradas são as misturas de pelo menos uma glicoamilase e uma alfaamilase, especialmente uma amilase ácida, ainda mais preferido uma alfaamilase fungica ácida. A razão entre a atividade de alfa-amilase fungica ácida (AFAU) pela atividade de glicoamilase (AGU) (AFAU por AGU) pode ser em uma forma de realização da invenção em pelo menos 0,1, em particular em pelo menos 0,16, tal como na faixa de 0,12 a 0,50 ou mais. Altemativamente a razão entre a atividade alfa-amilase fungica ácida (FAU-F) e atividade de glicoamilase (AGU) (isto é, FAU-F por AGU) pode ser em uma forma de realização da invenção entre 0,1 e 100 AGU/FAUF, em particular entre 2 e 50 AGU/FAU-F, tal como na faixa de 10 a 40 AGU/FAU-F.

Glicoamilase

A glicoamilase usada de acordo com a invenção pode ser derivada de qualquer fonte adequada, por exemplo, derivada de um microorganismo ou uma planta. As glicoamilases preferidas são as de origem fungica ou bacteriana, selecionadas a partir do grupo que consiste de Aspergillus glicoamilases, em particular A. niger G1 ou G2 glicoamilase (Boel et al., 1984, EMBO J. 3(5): 1097-1102), ou variantes destas, tal como aqueles divulgados no WO 92/00381, WO 00/04136 e WO 01/04273 (de Novozymes, Dinamarca); a A. awamori glicoamilase divulgada no WO 84/02921, A. oryzae glicoamilase (Agric. Biol. Chem., 1991, 55(4): 941-949), ou variantes ou fragmentos destes. Outras variantes de Aspergillus glicoamilase incluem as variantes com estabilidade térmica intensificada: G137A e G139A (Chen et al., 1996, Prot. Eng. 9: 499-505); D257E e

D293E/Q (Chen et al., 1995, Prot. Eng. 8: 575-582); N182 (Chen et al., 1994, Biochem. J. 301: 275-281); ligações de bissulfeto, A246C (Fierobe et al., 1996, Biochemistry 35: 8698-8704; e introdução de Pro resíduos na posição A435 e S436 (Li et al., 1997, Protein Eng. 10: 1199-1204.

Outras glicoamilases incluem Athelia rolfsii (previamente denominadas Corticium rolfsii) glicoamilase (ver Patente U.S. N°. 4.727.026 e Nagasaka et al., 1998, “Purification e properties of the raw-starch-degrading glucoamilases from Corticium rolfsii, Appl Microbiol Biotechnol 50: 323330), Talaromyces glicoamilases, em particular derivados do Talaromyces emersonii (WO 99/28448), Talaromyces leycettanus (Patente U.S. N°. Re. 32.153), Talaromyces duponti, Talaromyces thermophilus (Patente U.S. N°. 4.587.215).

As glicoamilases bacterinas consideram incluir a glicoamilase a partir do gênero Clostridium, em particular C. thermoamilolyticum (EP 135,138), e C. thermohydrosulfuricum (WO 86/01831) e Trametes cingulata divulgado no WO 2006/069289 (que é neste incorporado neste por referência).

Também as glicoamilases híbridas são consideradas de acordo com a invenção. Os exemplos das glicoamilases híbridas divulgadas no WO 2005/045018. Os exemplos específicos incluem a glicoamilase híbrida divulgada na Tabela 1 e 4 do Exemplo 1 (que os híbridos estão nestes incorporados por referência.).

Também considerados são as glicoamilases que exibem uma alta identidade por qualquer uma das glicoamilases mencionadas acima, isto é, mais do que 70 %, mais do que 75 %, mais do que 80 %, mais do que 85 % mais do que 90 %, mais do que 95 %, mais do que 96 %, mais do que 97 %, mais do que 98 %, mais do que 99 % ou ainda 100 % da identidade às sequências das enzimas maduras.

As composições comercialmente disponíveis que compreendem a glicoamilase incluem AMG 200L; AMG 300 L; SAN™ SUPER, SAN™ EXTRA L, SPIRIZYME™ PLUS, SPIRIZYME™ FUEL, SPIRIZYME™ B4U e AMG™ E (de Novozymes A/S); OPTIDEX™ 300 (de Genencor Int.); AMIGASE™ e AMIGASE™ PLUS (de DSM); G-ZYME™ G900, G-ZYME™ e G990 ZR (de Genencor Int.).

A glicoamilase pode ser em uma forma de realização adicionado em uma quantidade de 0,02 a 20 AGU/g DS, preferivelmente 0,1 a 10 AGU/g DS, especialmente entre 1 a 5 AGU/g DS, tal como 0,5 AGU/g DS.

Beta-Amilase

Em pelo menos de acordo com a invenção beta-amilase (E.C 3.2.1.2) é o nome tradicionalmente dado pela ativação da exo-amilase maltogênica, que catalisa a hidrólise das linguagens 1,4-alfa-glicosídico em amilose, amilopectina e polímeros de glicose relacionados. As unidades de maltose são sucessivamente removidas a partir das extremidades das cadeias de não redução em uma maneira ciente da etapa até a molécula ser degradada ou, no caso de amilopectina, até um ponto de ramificação ser atingido. A maltose liberada tem a configuração de beta anomérica, visto que o nome beta-amilase.

A beta-amilase foi isolada a partir de várias plantas e microorganismos (Fogarty e Kelly, 1979, Progress in Industrial Microbiology 15: 112-115). Estas beta-amilases são caraterizadas por ter ótimas temperaturas na faixa de 40° C a 65° C e ótimo pH na faixa de 4,5 a 7. Uma beta-amilase comercialmente disponível a partir da cevada é NOVOZYM™ WBA de Novozymes A/S, Dinamarca e SPEZYME™ BBA 1500 de Genencor Int., USA.

Amilase maltogênica

A amilase também pode ser uma alfa-amilase maltogênica. A “alfa-amilase maltogênica” (glicano 1,4-alfa-maltoidrolase, E.C. 3.2.1.133) é capaz de hidrolisar a amilose e amilopectina por maltose na configuração alfa. A amilase maltogênica da cepa Bacillus stearothermophilus NCIB 11837 é comercialmente disponível de Novozymes A/S. A alfa-amilases maltogênica é descrita na Patente U.S. N°. 4.598.048, 4.604.355 e 6.162.628, que são incorporados nestes por referência.

A amilase maltogênica pode ser em uma forma de realização preferida adicionado em uma quantidade de 0,05 a 5 mg da proteína total/gramas DS ou 0,05 a 5 MANU/g DS.

Protease

A protease pode ser de acordo com a invenção qualquer protease. Em uma forma de realização preferida a protease é uma protease ácida de origem microbiana, preferivelmente de origem fungica ou bacteriana.

As proteases adequadas incluem proteases microbianas, tal como proteases fungicas ou bacterianas. As proteases preferidas são proteases ácidas, isto é, proteases caracterizadas pela capacidade de hidrolisar as proteínas sob as condições ácidas abaixo do pH 7.

As proteases fungicas ácidas consideradas incluem as proteases fungicas derivadas de aspergillus, Mucor, Rhizopus, Candida, Coriolus, Endothia, Enthomophtra, Irpex, Penicillium, Sclerotiumand, e Torulopsis. Especialmente as proteases são consideradas derivadas de aspergillus niger (ver, por exemplo, Koaze et al., 1964, Agr. Biol. Chem. Japan 28: 216), Aspergillus saitoi (ver, por exemplo, Yoshida, 1954, J. Agr. Chem. Soc. Japan 28: 66), Aspergillus awamori (Hayashida et al., 1977, Agric. Biol. Chem. 42(5): 927-933, Aspergillus aculeatus (WO 95/02044), ou Aspergillus oryzae, tal como a pepA protease; e proteases ácidas de Mucor pusillus ou Mucor miehei.

Também são consideradas as proteases neutras e alcalinas, tal como a protease derivada de uma cepa de Bacillus. Uma protease particular considerada para a invenção é derivada do Bacillus amiloliquefaciens e tem a sequência obtida em Swissport como o N° de Acesso P06832. Também consideradas são as proteases tendo em pelo menos 90 % da identidade à sequência de aminoácido obtido em Swissport como o N° de Acesso P06832 tal como em pelo menos 92 %, em pelo menos 95 %, em pelo menos 96 %, em pelo menos 97 %, em pelo menos 98 %, ou particularmente em pelo menos 99 % da identidade.

Ainda consideradas são as proteases tendo em pelo menos 90 % da identidade à sequência de aminoácido divulgado como a SEQ ID N°:l no WO 2003/048353 tal como em 92 %, em pelo menos 95 %, em pelo menos 96 %, em pelo menos 97 %, em pelo menos 98 %, ou particularmente em pelo menos 99 % da identidade.

Também consideradas são as proteases semelhantes à papaína tal como proteases dentro de E.C. 3.4.22.* (cisteína de protease), tal como EC

3.4.22.2 (papaína), EC 3.4.22.6 (quimiopapaína), EC 3.4.22.7 (asclepaina), EC 3.4.22.14 (actinidaina), EC 3.4.22.15 (catepsina L), EC 3.4.22.25 (glicila endopeptidase) e EC 3.4.22.30 (caricaina).

As proteases podem ser adicionadas nas quantidades de 0,1 a 1000 AU/kg dm, preferivelmente 1 a 100 AU/kg DS e mais preferivelmente 5 a 25 AU/kg DS.

Uso

No terceiro aspecto a invenção diz respeito ao uso de uma ou mais enzimas de oxidação do composto fenólico e/ou atividade de peroxidase que exibem as enzimas para desintoxicar o material contendo lignocelulose pré-tratado.

Preferivelmente em uma forma de realização o composto fenólico que oxida a enzima pode ser selecionado a partir do grupo que compreende o catecol oxidase (EC 1.10.3.1), lacase (EC 1.10.3.2), o-aminofenol oxidase (EC 1.10.3.4); e monofenol monooxigenase (EC 1.14.18.1) para desintoxicar o material contendo lignocelulose pré-tratado.

Em uma outra forma de realização preferida a atividade de peroxidase que exibiu a enzima pode ser selecionado a partir dos grupos que compreende a peroxidase (EC 1.11.1.7), haloperoxidase (EC 1.11.1.8 e EC 1.11.1.10); lignina peroxidase (EC 1.11.1.14); manganês peroxidase (EC 1.11.1.13); e lipoxigenase (EC. 1.13.11.12) para desintoxicar o material contendo lignocelulose pré-tratado.

A desintoxicação pode ser parte de um processo de produção de produto de fermentação da invenção.

MATERIAIS & MÉTODOS

Enzimas:

Lacase PpL: Derivados de lacase a partir do Polyporus pinsitus divulgado no WO 1996/000290 (Novozymes).

Lacase MtL: Derivados de lacase a partir do Myceliopthora thermophila divulgado no WO 1995/033836 (Novozymes).

Lacase CcL: Derivados de lacase a partir do Coprinus cinereus divulgado no WO 97/08325 (Novozymes)

Peroxidase CcP: Peroxidase é derivado a partir do Coprinus cinereus divulgado no Petersen et al., 1994, FEBSLetters 339: 291-296.

Preparação celulolítica A: A composição celulolítica que compreende um polipeptídeo tendo a atividade intensificada celulolítica (GH61A) divulgado no WO 2005/074656; uma beta-glicosidase (proteína de fusão divulgado no Pedido condicional U.S. N°. 60/832.511), Thielavia terrestris celobiohidrolase II (CEL6A), e a preparação das enzimas celulolíticas derivados a partir do Trichoderma reesei. A preparação da celulase A é divulgado no Pedido condicional U.S. N°. 60/941.251.

Preparação celulolítica B: A composição celulolítica que compreende um polipeptídeo tendo a atividade intensificada celulolítica (GH61A) divulgado no WO 2005/074656; uma beta-glicosidase (proteína de fusão divulgado no Pedido condicional U.S. N°. 60/832,511); e a preparação das enzimas celulolíticas derivados a partir do Trichoderma reesei. A preparação de celulase A é divulgado no Pedido condicional U.S. N°. 60/941.251.

Levedura: RED STAR™ disponível de Red Star/Lesaffre,

USA

Forragem de milho pré-tratada: forragem de milho com explosão a vapor catalisado por ácido diluído (28,6 % DS) foi obtido de NREL (National Renewable Research Laboratory, USA).

Determinação da identidade

Ao ser ligado entre duas sequências de aminoácidos ou entre duas sequência de nucleotídeo é descrito pela “identidade” do parâmetro.

O grau da identidade entre duas sequências de aminoácidos podem ser determinados pelos métodos Clustal (Higgins, 1989, CABIOS 5: 151-153) usando o software LASERGENE™ MEGALIGN™ (DNASTAR, Inc., Madison, WI) com uma tabela de identidade e os parâmetros de alinhamento múltiplo seguinte: Penalidade de fenda de 10 e penalidade de comprimento de fenda de 10. Parâmetros de alinhamento em pares são Ktuplo = 1, penalidade de fenda = 3, Windows = 5, e diagonais = 5.

O grau da identidade entre duas sequência de nucleotídeos podem ser determinados pelos métodos Wilbur-Lipman (Wilbur e Lipman, 1983, Proceedings of the National Academy of Science USA 80: 726-730) usando o software LASERGENE™ MEGALIGN™ (DNASTAR, Inc., Madison, WI) com uma tabela de identidade e os parâmetros de alinhamento múltiplo seguinte: Penalidade de fenda de 10 e penalidade de comprimento de fenda de 10. Parâmetros de alinhamento em pares são Ktuplo = 3, penalidade de fenda = 3, e Windows = 20.

Determinação da Atividade de Lacase (LACU)

Atividade de Lacase é determinado a partir da oxidação da siringaldazina sob as condições aeróbicas. A cor violeta produzido é medida em 530 nm. As condições analíticas são 19 mM de siringaldazina, 23,2 mM de tampão de acetato, pH 5,5, 30°C, 1 minuto do período de reação.

unitário lacase (LACU) é a quantidade da enzima que catalisa a conversão de 1,0 micromol de siringaldazina por minuto nestas condições.

Determinação da atividade de peroxidase (PODU)

Um unitário de peroxidase (PODU) é definido como a quantidade da enzima, sob condições padrão (isto é, pH 7.0; temperatura de 30°C; período de reação de 3 minutos) catalisa a conversão de 1 micromol de peróxido de hidrogênio por minuto. A atividade é determinada usando um ensaio com base ABTS® (2,2'-azinobis(3-etilbenzotiazolina-6-sulfonato)) como o cromóforo, a cor azul-esverdeado produzido sendo fotometrado em 418 nm. Uma prospecto de AF 279/2 descrito neste o método analítico em mais detalhes é disponível no requerimento por Novozymes A/S, Dinamarca, cujo prospecto é portanto aqui incluído por referência.

Atividade glicoamilase

Atividade glicoamilase pode ser medido nas unidades de glicoamilase (AGU).

Atividade Glicoamilase (AGU)

A unidade Novo Glicoamilase (AGU) é definido como a quantidade da enzima, que hidrolisa 1 micromol de maltose por minuto sob as condições padrão de 37°C, pH 4.3, substrato: maltose 23.2 mM, tampão: acetato de 0,1 M, período de reação de 5 minutos.

Um sistema autoanalisador pode ser usado. A mutarotase é adicionado ao reagente de desidrogenase de glicose de modo que qualquer alfa-D-glicose presente é rotacionado em beta-D-glicose. A desidrogenase de glicose reage especificamente com beta-D-glicose na reação mencionado acima, formando NADH que é determinado usando um fotômetro a 340 nm como uma medição da concentração de glicose original.

Incubação AMG:
Substrato:	maltose 23,2 mM
Tampão:	acetato 0,1 M
pH:	4,30 ± 0,05
Temperatura de incubação:	37°C ± 1
Período de reação:	5 minutos
Faixa de trabalho da enzima:	0,5 a 4,0 AGU/mL

Cor da reação:
GlucDH:	430 U/L
Mutarotase:	9U/L
NAD:	0,21 mM
Tampão:	0,12 M de fosfato; 0,15 M de NaCl
pH:	7,60 ± 0,05
Temperatura de incubação:	37°C ± 1
Período de reação:	5 minutos
Micro-ondas:	340 nm

Um prospecto (EB-SM-0131.02/01) descreve este método analítico em mais detalhes é disponível no requerimento de Novozymes A/S, Dinamarca, cujo prospecto está incluído aqui por referência.

Atividade de Alfa-amilase (KNU)

A atividade alfa-amilase pode ser determinado usando amido de batata como substrato. Este método é baseado na quebra do amido de batata modificado pela enzima, e a reação é seguido pelas amostras da mistura da solução amido/enzima com uma solução de iodo. Inicialmente, uma cor azul-escura é formada, mas durante a quebra do amido da cor azul atingir fracamente e gradualmente rotacionado em um marrom avermelhado, que é comparado a um vidro colorido padrão.

Uma unidade de Kilo Novo alfa amilase (KNU) é definido como a quantidade da enzima, sob condições padrão (isto é, em 37°C +/-0,05; 0,0003 M Ca ; e pH 5,6) submete a dextrina 5260 mg da substância seca de amido Merck Amilum solubile.

Um prospecto EB-SM-0009.02/01 descreve este método analítico em mais detalhe é disponível no requerimento de Novozymes A/S, Dinamarca, cujo prospecto está incluído aqui por referência.

Atividade da alfa-amilase ácida

Quando usado de acordo com a presente invenção a atividade de uma alfa-amilase ácida pode ser medida na AFAU (unidades de Alfaamilase fungica ácida) ou FAU-F (Unidades de Alfa-amilase Fúngica).

Atividade alfa-amilase ácida (AFAU)

A atividade alfa-amilase ácida pode ser medida em AFAU (unidades de Alfa-amilase fungica ácida), que são determinados relativos a um padrão da enzima. 1 AFAU é definido como a quantidade da enzima que degrada 5,260 mg da substância seca de amido por hora sob as condições padrões mencionadas abaixo.

A alfa-amilase ácida, uma endo-alfa-amilase (1,4-alfa-Dglicano-glicanoidrolase, E.C. 3.2.1.1) hidrolisa as ligações alfa-1,4glicosídico nas regiões inertes da molécula padrão para formas as dextrinas e oligossacarídeos com os comprimentos de cadeia diferente. A intensidade do cor formada com iodo é diretamente proporcional à concentração do amido. A atividade de amilase é determinada usando a calorimetria reversa como uma redução na concentração de amido sob as condições analíticas especificadas.

ALFA-AMILASE

AMIDO + IODO —> DEXTRINAS + OLIGOSSACARÍDEOS λ = 590 nni azul/violeta t = 23 segundos descoloração

Condições padrões/condições de reação:

Substrato:

Tampão:

Iodo (12):

CaCl₂:

pH:

Temperatura de incubação: Período de reação: Micro-ondas:

Amido solúvel, aproximadamente 0,17 g/L Citrato, aproximadamente 0,03 M 0,03 g/L

1,85 mM

2,50 ± 0,05

40° C segundos

590 nm

Concentração da enzima: 0,025 de AFAU/mL

Faixa de trabalho da enzima: 0,01 a 0,04 de AFAU/mL

Um prospecto EB-SM-0259.02/01 descreve este método analítico em mais detalhes é disponível no requerimento por Novozymes A/S, Dinamarca, cujo prospecto está incluído aqui por referência.

Determinação da FAU-F

As unidades FAU-F Alfa-amilase fungica (Fungamil) é medido relativo a uma enzima padrão de um comprimento declarado.

Condições de reação
Temperatura	37° C
pH	7,15
Micro-ondas	405 nm
Período de reação	5 minutos
Período de medição	2 minutos

Um prospecto (EB-SM-0216.02) descreve este método padrão em mais detalhes é disponível no requerimento de Novozymes A/S, Dinamarca, cujo prospecto está incluído aqui por referência.

Medição da Atividade celulase usando ensaio de papel de filtro (ensaio FPU)

1. Fonte do método

1.1 O método é divulgado em um documento intitulado “Measuring of Cellulase Activities” por Adney e Baker, 1996, Laboratory Analytical Procedimento, LAP-006, National Renewable Energy Laboratory (NREL). Este é baseado no método IUPAC pela medição da atividade celulase (Ghose, 1987, Measuring of Cellulase Activities, Pure & Appl. Chem. 59: 257-268.

2. Procedimento

2.1 O método é realizado como descrito por Adney e Baker, 1996, supra, exceto pelo uso de uma placa de 96 reservatórios para ler os valores de absorbância após o desenvolvimento da cor, como descrito abaixo.

2.2 Tubos de ensaio de enzima:

2.2.1 Uma faixa do papel do filtro enrolada (#1 Whatman; 1 X 6 cm; 50 mg) é adicionada a parte funda de um tubo testado (13 X 100 mm).

2.2.2 Ao tubo é adicionado 1,0 mL de 0,05 M de tampão de citrato Na (pH 4.80).

2.2.3 Os tubos contendo papel de filtro e tampão são incubados 5 minutos a 50° C (± 0,1° C) em um banho de água circulante.

2.2.4 A incubação seguinte, 0,5 mL da diluição da enzima no tampão de citrato é adicionado ao tubo. As diluições da enzima são projetados por produzir os valores levemente acima e abaixo do valor alvo de 2,0 mg de glicose.

2.2.5 Os conteúdos do tubo são misturados submetidos gentilmente ao turbilhonamento por 3 segundos.

2.2.6 Após o turbilhonamento, os tubos são incubados por 60 minutos em 50° C (± 0,1° C) em um banho de água circulante.

2.2.7 Seguindo imediatamente a incubação à 60 minutos, os tubos são removidos a partir do banho de água, e 3,0 mL do reagente DNS é adicionado para cada um tubo para interromper a reação. Os tubos são submetidos ao turbilhonamento pela mistura à 3 segundos.

2.3 Branco e controles

2.3.1 Um reagente em branco é preparado pela adição de 1,5 mL de tampão de citrato a um tubo de teste.

2.3.2 Um controle de substrato é preparado pela colocação de uma faixa do papel do filtro enrolada na parte funda de um tubo de teste, e adicionando 1,5 mL do tampão de citrato.

2.3.3 Os controles da enzima são preparados a cada diluição da enzima pela mistura de 1,0 mL do tampão de citrato com 0,5 mL da diluição da enzima apropriada.

2.3.4 O reagente em branco, o controle de substrato, e os controles da enzima são submetidos ao ensaio na mesma maneira como os tubos de ensaio de enzima, e feito junto com o estes.

2.4 Padrões de glicose

2.4.1 A solução de estoque a 100 mL de glicose (10,0 mg/mL) é preparada, e 5 mL de alíquotas são congeladas. Antes do uso, as alíquotas são descongeladas e submetidas ao turbilhonamento pela mistura.

2.4.2 As diluições da solução de estoque são feitas em tampão de citrato como os seguintes:

G1 = 1,0 mL de estoque + 0,5 mL de tampão = 6,7 mg/mL =

3,3 mg/0,5 mL

G2 = 0,75 mL de estoque + 0,75 mL de tampão = 5,0 mg/mL = 2,5 mg/0,5 mL

G3 - 0,5 mL de estoque +1,0 mL de tampão = 3,3 mg/mL =

1,7 mg/0,5 mL

G4 = 0,2 mL de estoque + 0,8 mL de tampão = 2,0 mg/mL =

1,0 mg/0,5 mL

2.4.3 Os tubos padrões de glicose são preparados pela adição de 0,5 mL de cada diluição a 1,0 mL de tampão de citrato.

2.4.4 Os tubos padrões de glicose são submetidos ao ensaio na mesma maneira como os tubos de ensaio de enzima, e feitos juntos com este.

2.5 Desenvolvimento da cor

2.5.1 Seguindo os 60 minutos, a incubação e adição de DNS, os tubos são todos fervidos juntos por 5 minutos em um banho de água.

2.5.2 Após a fervura, estes são imediatamente esfriados em um banho de gelo/água.

2.5.3 Quando esfriado, os tubos são brevemente submetidos ao turbilhonamento, e a pasta é deixada para assentar-se. Então o tubo é diluído pela adição de 50 microL a partir dos tubos por 200 microL de ddH₂O em uma placa de 96 reservatórios. Cada reservatório é misturado, e a absorbância é lida a 540 nm.

2.6 Cálculos (exemplos são dados no documento NREL)

2.6.1 Uma curva padrão de glicose é realizada pelo gráfico de concentração de glicose (mg/0,5 mL) por 4 quatro padrões (G1-G4) vs. A₅4₀. este é ajustado usando uma regressão linear (Prism Software), e a equação para a linha é usada para determinar a glicose produzida por cada uma das enzimas dos tubos de ensaio.

2.6.2 Uma plotagem de glicose produzida (mg/0,5 mL) versos a diluição da enzima total é preparada, com o eixo Y (diluição da enzima) sendo em uma escala log.

2.6.3 Uma linha é deixada entre a diluição da enzima que produz justo 2,0 mg de glicose acima e a diluição que produz justo a abaixo desta. A partir desta linha, é determinado a diluição da enzima que deve ter produzido exatamente 2,0 mg de glicose.

2.6.4 As unidades do papel de filtro/mL (FPU/mL) são calculadas como os seguintes:

FPU/mL - 0,37/ diluição da enzima produzindo 2,0 mg de glicose

Método de ensaio da protease-AU(RH)

A atividade proteolítica pode ser determinada com a hemoglobina desnaturada como o substrato. No método de AnsonHemoglobina para a determinação da atividade proteolítica de hemoglobina desnaturada é digerida, e a hemoglobina não digerida é precipitada com ácido tricloroacético (TCA). A quantidade do produto solúvel TCA é determinado com o reagente fenol, que dá uma cor azul com tirosina e triptofano.

Uma unidade de Anson (AU-RH) é definida como a quantidade da enzima que está sob a condições padrão (isto é, 25°C, pH 5.5 e 10 minutos do período de reação) digere a hemoglobina em uma taxa inicial tal que é liberado por minuto em uma quantidade de produto solúvel TCA que dá a mesma cor com o reagente fenol como um miliequivalente da tirosina.

O método AU(RH) é descrito no EAL-SM-0350 e está disponível de Novozymes A/S Dinamarca no requerimento.

Exemplos

Exemplo 1

Efeito da lacase na produção de etanol durante a hidrólise enzimática

A forragem de milho explodida pelo vapor catalisado por ácido diluído pré-tratado foi obtido de NREL. A forragem de milho prétratada (15 % DS) foi hidrolisada ao pH 4.5, 50°C por 75 horas com a preparação celulolítica A (5 FPU/g DS) com e sem Lacase PpL (20 a 30 LACU/g DS). O tratamento enzimático foi realizado com tampa aberta de modo que o fluxo de ar consistente foi fornecido durante o tratamento. A evaporação foi controlada pela água diariamente suplementada com base na perda de peso. As amostras tratadas pela enzima foram usadas pela fermentação de etanol a 32°C por até 88 horas em um recipiente fechado onde uma agulha foi puncionada na tampa, com levedura (RED ST AR™) na dosagem inicial de 0,2 g/L. A mistura de fermentação também contém YPU (5 g/L de extrato de levedura, 5 g/L de peptona e 10 g/L de uréia). Após 25 horas de fermentação, a amostra tratada com lacase resultou em 10 g/L de produção de etanol, considerando a amostra não tratada com lacase resultou na produção de etanol. Com a dosagem de levedura inicial de 1,6 g/L, cerca de 10 vezes maior a produção de etanol foi observado com a amostra tratada pela lacase após 25 horas de fermentação (18,87 g/L pelas amostras tratadas por lacase versos 1,83 pela amostra não tratada por lacase).

Exemplo 2

Efeito de lacase na produção de etanol durante a fermentação

A forragem de milho pré-tratada (28.6 % DS) usada foi a mesma como no Exemplo 1. A forragem de milho pré-tratada (15 % DS) foi hidrolisada com a preparação celulolítica A (5 FPU/g DS) no pH 4.5, 50°C por 75 horas na ausência da lacase com tampa coberta. Após a hidrólise enzimática, o material foi fermentado a 32°C por até 88 horas em um recipiente fechada onde uma agulha foi puncionada na tampa, com a levedura (RED STAR™) na dosagem de 1,6 g/L com e sem lacase PpL (20 a 30 LACU/g DS). A mistura de fermentação também contém YPU (5 g/L de extrato de levedura, 5 g/L de peptona e 10 g/L de uréia). Após 25 horas, a produção de etanol foi duplicada na amostra onde a lacase está presente durante a fermentação (4,59 g/L de lacase tratada versos 1,83 de lacase não tratada).

Exemplo 3

Efeito do tratamento de oxidoreductase entre a hidrólise e a fermentação da levedura

A forragem de milho pré-tratada (28.6 % DS) usada foi a mesma como no Exemplo 1. A hidrólise enzimática foi realizada com a forragem de milho pré-tratada (15 % DS) ao pH 4.5, 50°C por 72 horas na ausência de lacase com tampa coberta. O tratamento de oxidoreductase foi conduzido a 50°C por uma ou duas horas antes da fermentação a 32°C (até 48 horas) com levedura (RED STAR™) na dosagem de 0,5 g/L em um recipiente fechado onde uma agulha foi puncionada na tampa. Durante o tratamento de oxidoreductase, as tampas foram abertas a cada 20 minutos. A mistura de fermentação também contém YPU (5 g/L de extrato de levedura, 5 g/1 de peptona e 10 g/L de uréia). Até 40 % do aumento na produção de etanol foi observado com Lacase PpL (4,5 a 30 LACU/g DS). Até 27 % do aumento na produção de etanol foi observado com Lacase MtL (0,5 a 30 LACU/g DS). Cerca de 27 % do aumento na produção de etanol foi observado com Lacase CcL (36 LACU/g DS). Cerca de 40 % do aumento na produção de etanol foi observado com a peroxidase CcP na presença de 5 % de H₂O₂.

Exemplo 4

Melhoramento mediada pela Lacase da hidrólise enzimática PCS

Coleção do pré-tratamento da substancia líquida:

A substância líquida foi coletada a partir da forragem de milho explodida tanto à vapor quanto neutro e a partir de ácido, forragem de milho explodido à vapor. Cada PCS foi submetido a pasta em água deionizada a um final dos níveis de sólidos totais (TS) de 15 % em peso com a mistura em temperatura ambiente por 1 hora. Cada pasta foi armazenada em 4°C por 16 a 20 horas. As pastas foram então misturadas em temperatura ambiente por 1 hora, e a substância líquida foi coletada pela filtração à vácuo através de um filtro de fibra de vidro (Whatman GF/D). O azido de sódio foi adicionado a uma concentração final de 0,02 % p/p. O pH de cada um foi ajustado a 5,0. Após a mistura por 1 hora em temperatura ambiente, a substância líquida foi filtrada à vácuo através de uma membrana de 0,2 mícrons e armazenada a 4°C.

Tratamento de Lacase:

Todas as substâncias líquidas de PCS foram ajustadas ao pH 5.0. A Lacase MtL foi dosada na substância líquida PCS a uma concentração final de 100 ppm. A substância líquida contendo a lacase foi incubada ao longo de uma substância líquida de controle negativo por 18 horas a 50°C com 150 rpm de agitação. Qualquer material precipitado foi removido pela centrifugaçào em 3000 rpm por 10 minutos antes da caracterização adicional.

Método de Folin-Ciocalteu (FC) para Fenólicos:

O método foi modificado a partir do procedimento publicado (Singleton, Orthofer, e Lamuela-Raventos, 1999, Methods Enzymol. 299: 152-178). Os padrões de calibração Catecol (Sigma #135011) e diluições de amostra foram preparados na água deionizada. Cinqüenta microL da amostra diluída ou padrão de calibração catecol foram transferidos aos reservatórios de uma placa microtituladora. A água deionizada (50 microL) foi adicionada a cada um reservatório seguido por 50 microL/reservatório do reagente FC (Sigma #F9252). A placa foi incubada por 5 minutos em temperatura ambiente. O carbonato de sódio (15 % p/v, 100 microL) foi então adicionado a cada reservatório e a placa foi incubada por 30 minutos em temperatura ambiente no escuro. A absorbância a 770 nm de cada reservatório foi coletado. As concentrações totais não conhecidas foram calculadas a partir da curva padrão de catecol pela análise da regressão linear no Microsoft Excel. Hidrólise PCS e monitoramento de glicose.

Os sólidos PCS lavados foram submetidos à pasta na substancia líquida PCS apropriada em uma concentração final de 4 % dos sólidos totais e dosado com a preparação celulolítica B (3 mg da proteína/g de celulose). As reações de hidrólise foram incubadas a 50°C com a agitação (150 rpm) por 48 horas. As concentrações .de glicose foram monitoradas no período usando um ensaio de glicose ligado à enzima.

Tabela 1: Efeito do tratamento de lacase nos fenólicos solúveis como medido pelo método FC

Substância líquida	Fenólicos, mg/mL
-lacase	+ lacase	% da diminuição
PCS neutro	2,30 ± 0,05	1,63 ±0,01	29,1
PCS ácido	1,96 ±0,02	1,34 ±0,02	31,8

Conclusão

A hidrólise enzimática de PCS foi melhorada pelo tratamento da substância líquida PCS com a lacase. O tratamento de lacase das substâncias líquidas PCS ácidas ou neutras resultaram em um melhoramento de 8 a 10 % na conversão da celulose.

A invenção descreve e reivindica neste não ser limitada no escopo pelas formas de realizações específicas neste divulgadas, visto que estas formas de realizações são pretendidas como ilustração de diversos aspectos da invenção. Quaisquer formas de realizações equivalentes são pretendidas estar dentro do escopo deste invenção. De fato, várias modificações da invenção em adição àquelas mostradas e descritas neste tomarão aparentes àqueles habilitados na técnica a partir da precedente descrição. Tais modificações também são pretendidas estarem dentro do escopo das reivindicações anexas. No caso de conflito, a presente descoberta, incluindo as definições serão controladas.

Várias referências são citadas neste, as descobertas de que são incorporadas pela referência em sua totalidade.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Processo para produzir um produto de fermentação a partir do material contendo lignocelulose, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de:

5 (i) pré-tratar o material contendo lignocelulose;

(ii) desintoxicar o material contendo lignocelulose pré-tratado com uma ou mais enzimas que oxidam compostos fenólicos e/ou uma ou mais enzimas que exibem atividade de peroxidase;

(iii) hidrolisar enzimaticamente; e

10 (iv) fermentar usando um organismo de fermentação.
2. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a desintoxicação na etapa (ii) é realizada antes da hidrólise.
3. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a desintoxicação e a hidrólise são realizadas de maneira simultânea.

15
4. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações de

1 a 3, caracterizado pelo fato de que os sólidos após pré-tratar o material contendo lignocelulose na etapa (i) são removidos/separados do licor antes da desintoxicação.
5. Processo de acordo com a reivindicação 4, caracterizado

20 pelo fato de que os sólidos removidos e o licor desintoxicado são combinados antes da hidrólise na etapa (iii).
6. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 5, caracterizado pelo fato de que o material contendo lignocelulose é química, mecânica e/ou biologicamente pré-tratado na etapa (a) ou (i).

25
7. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações de

1 a 6, caracterizado pelo fato de que a hidrólise e a fermentação são realizadas como um processo de sacarificação e fermentação simultâneas (SSF), hidrólise híbrida e fermentação (HHF) ou processo de hidrólise e fermentação separadas (SHF).

30
8. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações de

1 a 7, caracterizado pelo fato de que a hidrólise e/ou a fermentação são

Petição 870170062365, de 25/08/2017, pág. 13/15 realizadas usando-se uma ou mais hidrolases (classe EC 3), preferivelmente uma ou mais carboidrases selecionadas do grupo que consiste de celulase, hemicelulase, amilase, protease, esterase; tal como endoglucanase, betaglucosidase, celobioidrolase, xilanase, alfa-amilase, alfa-glicosidase,

5 glicoamilase, proteases e lipases ou uma mistura dos mesmos.
9. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações de

1 a 8, caracterizado pelo fato de que o organismo de fermentação é levedura, preferivelmente uma cepa do gênero Saccharomyces, especialmente Saccharomyces cerevisiae.
10 10. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 9, caracterizado pelo fato de que o produto de fermentação é um álcool, preferivelmente etanol ou butanol.
11. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 9, caracterizado pelo fato de que o material contendo lignocelulose pré15 tratado é detoxificado com uma enzima que oxida composto fenólico selecionado do grupo consistindo de uma catecol oxidase (EC 1.10.3.1), uma lacase (EC 1.10.3.2), uma o-aminofenol oxidase (EC 1.10.3.4), e uma monofenol monooxigenase (EC 1.14.18.1).
12. Processo de acordo com a reivindicação 11, caracterizado

20 pelo fato de que o material contendo lignocelulose pré-tratado é detoxificado com uma lacase (EC 1.10.3.2).
13. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 9, caracterizado pelo fato de que o material contendo lignocelulose prétratado é detoxificado com uma enzima exibindo atividade de peroxidase

25 selecionada do grupo consistindo de uma peroxidase (EC 1.11.1.7), uma haloperoxidase (EC 1.11.1.8 e EC 1.11.1.10), uma lignina peroxidase (EC 1.11.1.14), uma manganês peroxidase (EC 1.11.1.13), e uma lipoxigenase (EC 1.13.11.12).

Petição 870170062365, de 25/08/2017, pág. 14/15

1/1