JPH02238885A - フェノールオキシダーゼ遺伝子組換えｄｎａ、該組換えｄｎａにより形質転換された微生物、その培養物及びフェノールオキシダーゼの製造方法 - Google Patents

フェノールオキシダーゼ遺伝子組換えｄｎａ、該組換えｄｎａにより形質転換された微生物、その培養物及びフェノールオキシダーゼの製造方法

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JPH02238885A
JPH02238885A JP5795289A JP5795289A JPH02238885A JP H02238885 A JPH02238885 A JP H02238885A JP 5795289 A JP5795289 A JP 5795289A JP 5795289 A JP5795289 A JP 5795289A JP H02238885 A JPH02238885 A JP H02238885A
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JP
Japan
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phenol oxidase
recombinant dna
gene
dna
sequence
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JP5795289A
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Jun Sugiura
純 杉浦
Akira Tsukamoto
晃 塚本
Yukio Kita
幸雄 喜多
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New Oji Paper Co Ltd
Original Assignee
Oji Paper Co Ltd
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業の利用分野〕 本発明は、フェノールオキシダーゼ産生、分泌能を有す
る白色腐朽菌〔特にアラゲカワラタケ（Ｃｏｒｉｏｌｕ
ｓ　ｈｉｒｓｕｔｕｓ　ＩＦＯ　４９１７））のメッセ
ンジャーＲＮＡ　（以下、ｍＲＮＡと略す）由来のフェ
ノールオキシダーゼ遺伝子を発現ベクターに挿入してな
る組換えＤＮＡ、これにより形質転換された大腸菌形質
転換株、フェノールオキシダーゼを含む該菌株の培養物
、およびフェノールオキシダーゼの製造方法に関する。
〔従来の技術〕
フェノールオキシダーゼは分子状酸素の存在下でフェノ
ール類を酸化し、０−キノンあるいはｐ−キノンを生成
する酵素であり、補欠分子団として銅を含むことが知ら
れている。フェノールオキシダーゼは、動植物界に広く
分布しているが特に白色腐朽菌と呼ばれる一群の菌類の
生産するフェノールオキシダーゼは産業上有用であると
考えられる． 白色腐朽菌は木材等のリグノセルロース物質中のリグニ
ンを分解する能力が高いことが知られており、この白色
腐朽菌をリグノセルロース物質に接種、培養し、リグニ
ンの一部を分解させパルプを製造するバイオロジカルパ
ルピングの試みがなされている（特開昭５０−４６９０
３号）。しかし、白色腐朽菌はリグニンを分解するだけ
でなく、パルプの原料となるセルロースやヘミセルロー
スをも分解する能力を有しており、バルプ収率の低下と
いう問題点を持っている。また、白色腐朽菌のリグニン
分解が二次代謝的に生育後期に起こるため時間がかかる
という問題点もあった。
白色腐朽菌のリグニン分解力は、白色腐朽菌が生産分泌
するフェノールオキシダーゼによるものが大きいと考え
られており、その遺伝子をクローニングする試みも行な
われており、本発明者等は先にアラゲカワラタケのフェ
ノールオキシダーゼ遺伝子をイントロンを含む塩基配列
として染色体から単離し（特願昭６３−１７５２３５号
）、またイントロンを含まないｃＤＮＡをｍＲＮＡから
単離したが（特願昭６３−１７５２３６号）、これらに
おいて、ベクターは遺伝子のクローニングのために用い
られているものであり、アラゲカワラタケ以外の異種生
物においてフェノールオキシダーゼ遺伝子を発現した例
は見当らない。一方、白色腐朽菌のフェノールオキシダ
ーゼと類似の活性を持っているラッカーゼについては、
ノイロスボラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏ−ｓｐｏｒａ　ｃ
ｒａｓｓａ）のラッカーゼ遺伝子のクローニング（Ｕ．
Ｓ．Ｇｅｒｍａｎｎ＋　Ｋ．Ｌｅｒｃｈ；（１９８８）
Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｗ＋．％ｉ３．　８８５−５９６
）が報告されているが、そのアミノ酸配列はアラゲカワ
ラタケ由来のフェノールオキシダーゼのアミノ酸配列と
は異なるものであり、ノイロスポラ・クラッサのラッカ
ーゼによるリグニン分解についても、まだ報告されてい
ない。
［発明が解決しようとする課題］ 本発明は、前述の従来の問題点を解消し、フェノールオ
キシダーゼ遺伝子を白色腐朽菌以外の異種生物の発現ベ
クターに挿入し、フェノールオキシダーゼだけを生産す
る新規生物を提供することを目的とするものである。
自然界におけるリグニンの住分解は、数種の酵素が関与
していると考えられているが白色腐朽菌が生産するフェ
ノールオキシダーゼはその中で中心的役割を果たすと考
えられており、リグニン分解の研究においても必須の酵
素となっている．したがって、リグニン分解能力だけを
効率的に発現する新規生物としてフェノールオキシダー
ゼ生産能力を付与した生物が望まれている。
〔課題を解決するための手段〕
（ｌ）〈フェノールオキシダーゼ遺伝子の調製〉本発明
において、発現ベクターに挿入されるフェノールオキシ
ダーゼ遺伝子は、例えば前記の特願昭６３−１７５２３
６号に記載したものであって、下記のアミノ酸配列をコ
ードするフェノールオキシダーゼ遺伝子（ＩＩ）である
か、 ＰｈｅＴｒｐＴｙｒＨｉｓｓｅｒＨｉｓＬｅｕｓｅｒＴ
ｈｒＧｌｎＴｙｒｌ；ｙｓＡｓｐＬｉｔｙＬｅｕＶａｌ
ＡｓｎＡｓｐＧｌｎ （但し、式中３９６ｘはＰｒｏまたは＾ｌａを表わす。
）あるいは、上記アミノ酸配列をコードするＤＮＡにハ
イブリッドするＤＮＡ配列であって、天然、合成、もし
くは半合成によって得られるものであり、上記アミノ酸
配列をコードするＤＮＡ配列に対して、ヌクレオチドの
置換、ヌクレオチドの挿入及びヌクレオチド配列の逆位
その他の変異によって関連づけられており、かつ、フェ
ノールオキシダーゼ活性を有するポリベプチドをコード
するＤＮＡからなるフェノールオキシダーゼ遺伝子であ
る。
さらに、具体的には、フェノールオキシダーゼ遺伝子（
ＩＩ）が次式（ＯＪ−ＰＯＭ５）Ｖａ　Ｉ　Ｖａ　ＩＡ
ｒｇＳｅｒＡ　ｌ　ａＧ　１ｙＳｅｒＴ　ｈｒＶａ　ｌ
　１’ｙｒＡｓｎｒｙｒＡｓ　ｐＡｓｎｒｒｏＧＣＣＡ
ＴＴＧＧＧＣＣＣＡＣＣＧＣＴＧＡＣＣＴＣＡＣＣＡＴ
ＣＴＣＣＡＡＴＧＣＣＧＣＧＴＣＧＧＡＴＴＴＧＣＧＧ
ＧＴＧＧＴＡＴＣＡＡＣＴＣＧＧＣＣＡＴＣＣＴＧＣＧ
Ｃまたは次式（ＯＪ−ＰＯＭ２） ＧＣＣＡＴＴＧＧＧＣＣＣＡＣＣＧＣＴＧＡＣＣＴＣＡ
ＣＣＡＴＣＴＣＣＡＡＴＧＣＣＧＣＧＴＣＧＧＡＴＴＴ
ＧＣＧＧＧＴＧＧＴＡＴＣＡＡＣＴＣＧＧＣＣＡＴＣＣ
ＴＧＣＧＣのＤＮＡ配列を有するものが挙げられる。
ＴＣＧＧＴＡＡＣＴＡＣＴＧＧＡＴＴＣＧＣＧＣＣＡＡ
ＣＣＣＣＡＡＣＴＴＣＧＧＣＡＡなお、フェノールオキ
シダーゼ遺伝子が（ＯＪ−ＰＯＭ　５）である場合、上
記アミノ酸配列の３９０ＸはＡｌａとなり、また、フェ
ノールオキシダーゼ遺伝子が（ＯＪ−ＰＯＭ　２）であ
る場合、上記アミノ酸配列の３９０ｘはＰｒｏ　となる
。
（２）　＜　５　’末端の非翻訳領域の除去〉クローニ
ングしたフェノールオキシダーゼ遺伝子（Ｉ［）を含む
プラスミドをもつ大腸菌形質転換株は寄託されており、
（ＯＪ−ＰＯＭ２　；微工研菌寄第１００５５号，ＯＪ
−ＰＯＭ　５　；微工研菌寄第１００６１号）、これら
のプラスミドはフェノールオキシダーゼの構造遺伝子以
外の領域を含む（第１図、第２図参照）。
大腸菌等の異種微生物を用いて発現生産させる場合、で
きるだけタンパク質をコードしていない領域を取り除く
ことが好ましい。取り除く方法としてはエキソヌクレア
ーゼｍ　（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，Ｓ，Ｇｅｎｅ，２８，３
５１−３５９．　（１９８４）　）やＢＡＬ３１ヌクレ
アーゼ（Ｇｕｏ．Ｌ，−Ｈ．ｅｔ　ａｌ．Ｍｅｔｈｏｄ
ｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｓ＋ｏｌｏｇＬ　１００＋　６０−
９６（１９８３）　３などの修飾酵素で非翻訳領域を削
除する方法により除去することが出来る。
（３）＜発現ベクターへの連結〉 大ｌＩ！１１１発現ベクターとしては大腸菌ベクターＣ
ｏＩＥＩ，ｐＭＢｌ系などに発現に関与するプロモータ
ー領域を、その下流にタンパク質合成に関与するＳＤ領
域を、さらに翻訳開始点ＡＴＧを含むもので、その下流
に幾つかの制限酵素サイトを持つものであればいずれも
用いることが出来るが、ｐＫＫ２２３−３（ファルマシ
ア社製）　、ｐＫＫ２３３−２　（ファルマシア社製）
　、ｐＰＬ−ｌａｍｂｄａ　（ファルマシア社製）等が
例示される． これらの大腸菌発現ベクターの翻訳開始点ＡＴＧの下流
の適当な制限酵素サイトを用いて、５゜末端の非翻訳領
域を除いたフェノールオキシダーゼ遺伝子を翻訳のフレ
ームが一致するように、ベクター側の制限酵素で切断し
たＤＮＡ断片およびリンカーＤＮＡと連結し、フェノー
ルオキシダーゼ遺伝子に関する発現プラスミドを構築す
ることが出来る． （４）＜大腸菌への導入〉 上記の組換えプラスミドを導入する宿主大腸菌はいずれ
の株も用いることが出来るが、公知のＫ１２株系ＨＢＩ
ＯＩ株、ＪＭ１０９株、Ｃ　６００株などが例示される
。
上記のプラスミドを宿主大腸菌に形質転換する方法は、
例えば塩化カルシウム法、塩化ルビジウム法（Ｍａｎｉ
ａｔｉｓら、”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ＋
Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ”（１９８２
））など既存の技術によって行なうことが出来る。形質
転換株の選抜は、各々の発現ベクターにある薬剤耐性な
どのマーカーを利用して行なうことが出来る。例えば発
現ベクターとしてｐＫＫ２２３−３，ρＫＫ２３３−２
を用いる場合には、形質転換株をアンピシリンを含むＬ
Ｂ寒天培地上に塗布、培養することにより形質転換株を
選抜することが出来る。
ｐＫＫ２３３−２のＴｒｃプロモーターの下流にフレー
ムがあうように旧ｎｄＩ［Ｉリンカーを介してフェノー
ルオキシダーゼ遺伝子ＯＪ−ＰＯＭ５の構造遺伝子をつ
ないで得られたｐＫＫＰＯ５で形質転換した大腸菌Ｅ．
ｃｏｌｉＪＭ１０９／ｐＫＫＰＯ５は微生物工業技術研
究所に寄託した（寄託番号ＦＥＲＭ　Ｐ−１０５７６　
）。
（５）〈フェノールオキシダーゼの生産〉上記のように
して得られたフェノールオキシダーゼ遺伝子（■）を含
む大腸菌の発現プラスミドで形質転換した大腸歯形質転
換株を大腸菌の生育可能な適当な培地で培養することに
より、その培養物中にフェノールオキシダーゼを多量に
産生ずることができた。更に培地に銅イオンを添加する
とフェノールオキシダーゼの生産量が増大する。
ｐＫＫ２２３−３．　ｐＫＫ２３３−２を用いる場合に
は培地中にイソプロビルーβ一Ｄ−チオガラクトシド等
の大腸菌ラクトースオペロンの誘導物質を培地に添加す
ることにより、生産量の増大が図られる。
フェノールオキシダーゼ遺伝子にコードされるタンパク
質は、大腸菌の培養物を超音波処理またはフレンチプレ
ス処理などにより、細胞を破砕し、アラゲカワラタケの
フェノールオキシダーゼに対する抗体を用いて検出した
。この様にして得られたフェノールオキシダーゼは通常
活性が無いかまたは低いが、レドックス系など一般に行
なわれる巻戻し操作により活性のあるタンパク質を得る
ことが出来る。例えば６Ｍグアニジン塩酸に溶解後、２
Ｍグアニジン塩酸溶液とし、銅イオンを含む溶液中でグ
ルタチオン処理することによりフェノールオキシダーゼ
の活性を上昇せしめることができる。
以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、
下記の実施例は本発明を制限するものではない。
また、特に断わりがない限りＴ．Ｍａｎｉａｔｉｓ　＆
ε．Ｆ．Ｆｒｉ　ｔｓｃｈらのｒＭｏｌｅｃｕｌａｒ　
Ｃｌｏｎｉｎｇ　（１９８２）ＪおよびＳ．Ｌ．Ｂｅｒ
ｇｅｒ　＆＾．Ｒ．Ｘｉｓ＋ａ＋ｅｌのｒ　Ｍｅｔｈｏ
ｄｓ　ｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　Ｖｏ１．１５２．（
１９８７）　Ｊ等に記載されている実験操作に従って行
った。
以下、実施例により本発明を詳細に説明する．〔実施例
〕 （１）　　ＤＮＡプローブのＡ ＤＮＡプローブの合成は、アミダイト法により、ＤＮＡ
合成機（日本ゼオン．ＧｅｎｅｔＡ　−　ｍ　）を用い
て行なった． ３種の白色腐朽菌〔アラゲカワラタケ（ＩＦＯ　４９１
７）．カワラタケ（ＩＦＯ　３０３４０），カイガラタ
ケ（ＩＰＯ　Ｂ７１４））から精製したフェノールオキ
シダーゼのＮ末端からのアミノ酸配列をエドマン分解法
で２５段目まで分析した結果を次に示す。
カツラタケ Ａｌａ−＾ｒｇ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｖａｌ−カイガラタ
ケ Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｖａｌ−上記配列の
１７段目のＰｒｏから２５段目のＶａｌ　に対応するよ
うに、次のＤＮＡプロープを合成した。
但しＩはデオキシイノシン。
また、３種の白色腐朽菌のフェノールオキシダーゼをＢ
ｒＣＮで分解し、逆相系高速液体クロマトグラフィー〔
溶出条件，カラム：　Ｐｈｅｎｙｌ−５ＰＷ　ＲＰ（東
洋ソーダ社製），　溶出液２０％アセトニトリル／０．
ｌ％ＴＦＡから７５％アセトリトリル／０．１％ＴＦ＾
への濃度勾配溶出，室温〕で分離したポリペプチドのア
ミノ酸配列をエドマン分解法で分析した結果を次に示す
。
アラゲカ１５タケ　　　　Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ａ
ｓｎ−Ｐｈｅカワラタケ　　　　　　　Ｍｅｔ−Ａｌａ
−Ｐｈｅ−Ａｓｎ−Ｐｈｅカイｉラタケ　　　　　　Ｍ
ｅｔ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ａｓｎ−Ｐｈｅ上記アミノ酸配
列に対応するように次のＤＮＡプローブを合成した。
ＧＧ（；Ｉ； 以上の結果から白色腐朽菌が生産、分泌するフェノール
オキシダーゼのアミノ酸配列の相同性は非常に高く、本
発明で使用するＤＮＡプローブを用いることにより、い
かなる白色腐朽菌のフェノールオキシダーゼ遺伝子（Ｉ
Ｉ）をもクローニングすることができる．したがって以
下の実施例では、アラゲカワラタケのフェノールオキシ
ダーゼ遺伝子（ｎ）のクローニング方法について説明す
る。
（２）且Ｋ八夏坦袈 アラゲカワラタケ（ＩＦＯ　４９１７）を１１のＹＰＤ
培地（酵母エキス１０ｇ／　ｌ　，ポリペプトン２０ｇ
／　ｌ　，グルコース２０ｇ／　ｆｔ　）が入った５ｌ
容三角フラスコに植菌し、２７℃，６日間振盪培養した
．培養液中にフェノールオキシダーゼを生産，分泌して
いることを確認した後、集菌し、液体窒素中で凍結した
結果、約２０ｇの凍結菌体を得た。
Ｂｒｏｄａ等の方法により、凍結菌体５ｇから１１■の
全ＲＮＡを抽出した．凍結菌体５ｇを液体窒素を加えた
１００−のりーリングブレンダーで破砕し、３倍量のＴ
ＮＳ緩衝液Ｃ１％ｔｒｉ−ｉｓｏ−Ｐｒｏｐｙｌｎａｐ
ｈｔｈａｌｅｎｅ　ｓｕｌｐｈｏｎｉｃ　ａｃｉｄ，　
　２００ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ，　　２５ｍＭＥＧＴ
Ａ　（ｐＨ７．８），２５０ｍＭ　ＮａＣ１　）に溶か
した。遠心分離によりペレットを除き、上清ｌｍＡにつ
き、０．５ｇのフェノールを加え、５〜１５℃に保ち溶
解した。全てのフェノールが溶けたら％量のクロロホル
ムを加え、遠心分離後、上清を回収し、クロロホルムで
２回抽出した後、エタノール沈澱により全ＲＮＡ１１ｍ
ｇを回収した。
また、市販のＲＮＡ抽出キット〔アマシャム・ジャパン
■社製〕を用いた場合は、３ｇの凍結菌体から６．７■
の全ＲＮＡを抽出することができた．上述の２方法で回
収した全ＲＮＡは、フェノールオキシダーゼのＤＮＡプ
ロープによるノーザン・フ゛口・冫ト・ハイフ゛リダイ
ゼーション法（Ｔｈｏ−ｖａｓ．Ｐ．Ｓ．，Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　７７．　５２０
１　（１９８０））により、フェノールオキシダーゼ遺
伝子（ＩＩ）由来のＲＮＡを含むことを確認した。
全ＲＮＡ５■からオリゴ（ｄＴ）セルロース力ラムを使
用するＭａｎｉａｔｉｓ等の方法［　（Ｍａｎｉａｔｉ
ｓ他編，Ｍｏｌｅ−ｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ　
ＬａｂｏｒａＬｒｙ　Ｍａｎｕａｌ＋　１９７〜１９９
　（１９Ｂ２））を用いてポリ　（八）ｍＲＮＡの分離
・精製を行ない、約１００μｇのポリ　（Ａ）　ｍ　Ｒ
　Ｎ　Ａを精製した． 実施例３ （３）又旦Ｎ人夏金底 白色腐朽菌アラゲカワラタケ由来ポリ　（Ａ）　ｍ　Ｒ
ＮＡよりｃＤＮＡの合成は、ＧｕｂｌｅｒとＨｏｆｆｍ
ａｎの方法（Ｕ．Ｇｕｂｉｅｒ　＆　Ｂ．Ｊ．ｌＩｏｆ
ｆｍａｎ　；　Ｇｅｎｅ，２５，２６３〜２６９（１９
８３）　参照）に従い、アマシャム・ジャパン製ｃＤＮ
Ａ合成キットを用いておこなった。
５μｇのポリ　（Ａ）ｍＲＮＡに５０ユニットのヒト胎
児由来ＲＮａｓｅ阻害酵素（ＨＰＲＩ）の存在下５μｇ
のオリゴ（ｄＴ）　１２〜１８（ファルマシア社製２７
−７８５８０１）を加え１００ユニットの逆転写酵素を
４２゜Ｃで１．５時間反応させて約３０％の収率で１本
鎖ｃＤＮＡを合成した．この反応液に４ユニットの大腸
菌リボヌクレアーゼＨと１１５ユニットの大腸菌ＤＮＡ
ポリメラーゼ■を加え１２゜Ｃで１時間，２２゜Ｃで１
時間反応させた後７０゜Ｃで１０分間放置して酵素を失
活させた．その後１０ユニットのＴ４ＤＮＡポリメラ−
ゼを加え３７゜Ｃで１０分間反応させて、約９５％の収
率で２本鎖ｃＤＮＡを得た。
（４）　　ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ−イブー奪−の市販のλｇｔ
ｌｌクローニングシステム〔アマシャム・ジャパン■社
製〕を用いて、ｃＤＮＡライブラリーを構築した． １００μｇの２本鎖ｃＤＮＡを２０ユニットのＥｃｏＲ
Ｉメチラーゼを３７゜Ｃで１時間反応させた後、Ｅｃｏ
ＲＩリンカーを結合させた。これに１６ユニフトのＥｃ
ｏＲＩを加え３７゜Ｃで２時間反応させた後、Ｓｅｐｈ
ａｒｏｓｅ　ＣＬ４Ｂカラムを通し、純化した。λｇｔ
ｌｌアーム１μｇとの連結反応後、ｉｎ　ｖｉｔｒｏパ
ッケージング（Ａ．Ｂｅｃｋｅｒ　　＆　　Ｍ．Ｇｏｌ
ｄＨＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ，八ｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ＋
　　７２＋５８１　（１９７５）参照〕を行ない、１０
６個の組換え体λファージを得て、アラゲカワラタケの
ｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡライブラリーとした． （５）フェノールオキシ　ーゼ　　　　■）のクローニ
ング 実施例４で得られたアラゲカワラタケのｍＲＮＡ由来の
ｃＤＮＡライブラリーを大腸菌Ｙ１０９０株に感染させ
、プラークを形成させた。
フェノールオキシダーゼ遺伝子（ＩＩ）を含むクローン
は、放射性同位元素〔γノ”Ｐ）ＡＴＰ〔アマシャム・
ジャパン■社製ＰＢ１０１６８　）とＴ４ボリヌクレオ
チドキナーゼ〔宝酒造■社製２０２ＬＡ〕を用いて標識
化（Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ，　Ｃ．Ｃ．（１９６５）＋
　Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ
．，　５４，１５８〜１６１参照〕した実施例１の合成
ＤＮＡプローブを用いてＢｅｎ　ｔｏｎとＤａｖｉｓの
プラークハイプリダイゼーション法〔Ｗ．Ｄ．Ｂｅｎｔ
ｏｎ　＆　Ｒ．Ｗ．　Ｄａｖｉｓ；　Ｓｃｉｅｎｃｅ．
　１９６　　１８０（１９７７）参照〕に従って２種の
クローンを選別した。
フェノールオキシダーゼ遺伝子（ＩＩ）を含むλｇ　ｔ
ｌｌファージからのＤＮＡの精製は、ＴｈｏｍａｓとＤ
ａｖｉｓの方法［Ｍ．Ｔｈｏｍａｓ　＆　Ｒ，Ｗ．Ｄａ
ｖｉｓ　；　Ｊｏｕｒｎａｌｏｆ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
　Ｂｉｏｌｏｇｙ＋　９１，３１５（１９７４）参照〕
により行なった。
（５）で得られたフェノールオキシダーゼ遺伝子（ｎ）
を含む２クローンλｇｔｌｌＤＮＡを５μｇ用いて、制
限酵素ＥｃｏＲＩ　（宝酒造製）１０ユニットで３７℃
、２時間消化し、フェノールオキシダーゼ遺伝子（ＩＩ
）を含む領域１．９ｋｂの断片をＤＮＡセル（第−化学
薬品製）を用いて回収した。該Ｄ　Ｎ　Ａ断片を大腸菌
プラスミドベクターｐＵｃ１９またはｐＵｃ１１８のＥ
ｃｏＲＩ　サイトに挿入した。
ｐＵｃ１９にサブクローニングしたクローンをＯＪ−Ｐ
ＯＭ　５とし、ｐｌＪｃ１１８にサブクローニングした
クローンをＯＪ−ＰＯＭ　２として、それぞれ微生物工
業技術研究所に寄託した（ＯＪ−ＰＯＭ　２；微工研菌
寄第１００５５号、ＯＪ−ＰＯＭ　５；微工研菌寄第１
００６１号）。
また、得られ′たプラスミドをｐＵｃＰＯ２（ＯＪ−Ｐ
ＯＭ　２）、ｐＵｃＰＯ５（ＯＪ−ＰＯＭ　５）とした
。
それぞれの塩基配列および翻訳されてできるフェノール
オキシダーゼのアミノ酸配列を第１図（ＯＪ−ＰＯＭ　
５）、第２図（ＯＪ−ＰＯＭ　２）ニ示した。
（７）非皿訳皿菫■徐去 （６）で得られたプラスミドｐＵｃＰＯ５、１０μｇを
、制限酵素ＢａｍＨＩ［０ユニット）およびＰｓｔｌ（
１０ユニット）（宝酒造製）で、３７゜Ｃ、２時間消化
し、エタノ？ル沈澱により塩などの不純物を除去した。
得られた沈澱物をエキソヌクレアーゼ■緩衝液（５０ｍ
ＭＴｒｉｓ−ＨＣＩ　（ｐＨ８．０）．　１００ｍＭ　
ＮａＣｌ．　　５ｍＭ　ＭｇＣ１ｚ，１０ｍＭ　２−メ
ルカプトエタノール）１００ｔＩｆに溶解し、エキソヌ
クレアーゼ■（宝酒造製）１８０ユニット添加し、３７
゜Ｃに保温した。２０秒毎に１０ｕｌずつサンプリング
し、１００ｕｆのＭｕｎｇ−ｂｅａｎヌクレアーゼ緩衝
液（４０ｍＭ　Ｎａ−ａｃｅｔａｔｅ　（ｐＨ４．５Ｌ
．　ｌｏｏｍＭ　ＮａＣ１．２ｍＭ　ＺｎＣ１ｚ＋　ｔ
ｏ％Ｇｌｙｃｅｒｏｆ）に順次加えてエキソヌクレアー
ゼ■の反応を停止させた。サンプリングがすべて終了し
た後、６５゛Ｃで１０分間熱失活を行った．３７゜Ｃで
保温し、Ｍｕｎｇ−ｂｅａｎヌクレアーゼ（宝酒造製）
２５ユニットを加え、３０分間放置した後、フェノール
処理し、Ｍｕｎｇ−ｂｅａｎヌクレアーゼ失活させた後
、エタノール沈澱を行った。沈澱物を５０，ｚｆのＫｌ
ｅｎｏ−緩衝液（７ｓＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　（ｐＨ７
．５）．０．１ｍＭ　　ＨＤＴＡ．　　２０ｓ＋Ｍ　　
ＮａＣ１．７ａ＋Ｍ　　ＭｇＣｌ■　ｄＡＴＰ，　　ｄ
ＧＴＰ，ｄＣＴＰ，　ｄＴＴＰ各々０．１ｍＭ）に溶解
し、Ｋｌｅｎｏｗ−ｅｎｚｙｍｅ（宝酒造製）２ユニッ
トを加え、３７゜Ｃで１５分間保温した．２．５倍量の
エタノールを加え遠心して、沈澱を回収し、沈澱物を４
０ｔｔｌ！のＴＥ緩衝液（１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ
（ｐ　Ｈ８．０），　　１ｍＭ　ＥＤＴＡ）に溶解した
。
そのうち５μ！を用いてライゲーシッン反応を１６゜Ｃ
，一晩行ない、大腸菌ＪＭ１０９に形質転換を行った．
得られた大腸菌形質転換株のうちプラスミドの大きさが
やや短くなっている１ＧクローンをＬＢ培地（Ｂａｃｔ
ｏ−ｔｒｙｐｔｏｎ　１％，　Ｂａｃｔｏ−Ｙｅａｓｔ
−ｅｘｔｒａｃｔＯ．５％．　ＮａＣ１　１％）で３７
゜Ｃ．一晩、培養し常法のアルカリ抽出により、組換え
ＤＮＡプラスミドを調製した。５゛上流の非翻訳領域約
５０塩基が除去された組換えＤＮＡの塩基配列を、ダイ
デオキシ法により決定した。
１６クローンのうち１クローンの塩基配列は、第４図に
示す通りであって、発現ベクターｐＫＫ２３３−２のβ
−ガラクトシダーゼ遺伝子の開始コドンからのフレーム
が、フェノールオキシダーゼのフレームと一致するもの
であった。
（８）　　　　に　　るＤＮＡ　　　の（７）で得られ
た組換え体ＤＮ・Ａブラスミド１０μｇをｌＯユニット
のＥｃｏＲＩで切断し、エタノール沈澱により得られる
沈澱物をＸｌｅｎｏ一緩衝液１００μｌに溶解した。２
ユニットのＫｌｅｎｏｗ−ｅｎｚｙｍｅを加え、３７゜
Ｃで３０分反応し、フェノールークロロホルムで反応を
停止した．エタノール沈澱によりＤＮＡを回収し沈澱物
を１０χ７４ＤＮＡリガーゼ緩衝液５ｕｌに溶解した．
次にｇ　ｏｖｅｒのｔｌｉｎｄｌｌ！リンカー（宝酒造
製）１μｇを含むように加え、さらに５μｉのＴ４ＤＮ
Ａリガーゼ（１．５００ユニット）を加えた後、滅菌蒸
留水を加えて５０μｌとし１６゜Ｃで１晩反応させた。
つぎに、ｌＯ×旧ｎｄｌｌｌ緩衝液１０μ２及び１０ユ
ニットの旧ｎｄ　（宝酒造製）を加え滅菌蒸留水を加え
て１００μ２とし３７゜Ｃで２時間切断した。
その後アガロースゲル電気泳動により目的とするＤＮＡ
断片約１．８ｋｂを得た．これを断片−１とする（第３
図）． （９）　　　　　　　　　　ベ　　　ーの大腸菌発現ベ
クターｐＫＫ２３３−２（ファルマシア製）５μｇを含
む旧ｎｄｌ［［５衝液にＩＯＵの旧ｎｄｌｌ［（宝酒造
製）を加えて３７゜Ｃで２時間切断した。その後、アル
カリ・フォスファターゼ（Ｅ．ｃｏｌｉ　Ｃ７５）（宝
酒造製）を０．５Ｕ加え、６５゜Ｃで３０分反応し、フ
ェノールークロロホルムにより反応を停止し、エタノー
ル沈澱によりベクターＤＮＡを精製した。これを断片−
２とする。つぎに、（８）で得られた断片一ｌと断片−
２とをＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結し、フェノール
オキシダーゼに関する発現プラスミドｐＫＫＰＯ５を構
築した（第４図）。この組換えプラスミドを大腸菌ＪＭ
１０９株にカルシウム法により導入し、目的とする形質
転換株を得た。該形質転換体は微生物工業技術研究所に
寄託した（微工研菌寄第１０５７６号）。
００）フェノールオキシ　ーゼの （９）で得られた形質転換株１白金耳をＬＢ培地２ｄに
接種して、３７゜Ｃで１晩振盪培養し、１００−の１ｍ
Ｍの塩化第二銅を含むＬＢ培地に該前培養液をＩＩｎ１
加え、３７゜Ｃで培養を行い、対数後期に、最終濃度１
ｍＭになるようにイソプロピルーβ一Ｄ−チオガラクト
シド（ＩＰＴＧ）を添加し、酵素生産を誘導した．　　
ＩＰＴＧ添加６時間後に菌体を集菌して、超音波破砕に
より全タンパク質試料を調製した．この全タンパク質試
料を用いてＳＯＳ−ＰＡＧＥを行い、ニトロセルロース
フィルター（アマシャム社製Ｈｙｂｏｎｄ−Ｃ）にトラ
ンスファーした．さらにアマシャム社製プロテイング検
出キットを用いて抗フェノールオキシダーゼウサギ血清
で検出した。アミノ酸配列より推定される分子量５３，
０００とほぼ一致する大きさのバンドが検出され、フェ
ノールオキシダーゼ遺伝子（■）にコードされるタンパ
ク質の生産が確められた。
ｐｕｃ　ＰＯ２ニツｕＮてもｐｕｃ　ＰＯ５と同様に上
記（７）〜００）を行ない、フェノールオキシダーゼ遺
伝子（旧（ＯＪ−ＰＯＭ　２）にコードされるタンパク
質の生産を確かめた． 〔発明の効果〕 本発明においては、白色腐朽菌由来のフェノールオキシ
ダーゼ遺伝子を白色腐朽菌以外の異種生物に発現せしめ
たことにより、本発明の形質転換株はセルラーゼ、ヘミ
セルラーゼが混入することなくフェノールオキシダーゼ
のみを生圧丁ることができる．したがって、フェノール
オキシダーゼを含むその培養物はパルプ収率の低下をま
ねくことなくバイオロジカルパルビング、工場廃水の脱
色、木材糖化の前処理に利用でき、木材糖化の前処理に
利用できるものである．
【図面の簡単な説明】
第１図，第２図は、それぞれｐＵｃ　ＰＯ５，　ｐｕｃ
　ＰＯ２のアラゲカワラヌケフェノールオキシダーゼ遺
伝子■の塩基配列および翻訳されてできると考えられる
アミノ酸配列を示す図である。図中、一・・一−・−・
−↓は発現ベクターに組み込む際、エキソヌクレアーゼ
で除去した部分を示す．第３図はフェノールオキシダー
ゼ遺伝子を含む断片−１の作成工程を示す図である。第
４図はフェノールオキシダーゼ遺伝子に関する発現ベク
ターの構築工程及びその連結部位の塩基配列とアミノ酸
配列を示す図である。 Ｇｌｒ＋ＡｌａＴｒｐｓ＊ｒＡｓｐＬｅｕｃｙｓＰｒｏ
ＩｌｅＴｙｒＡｓｐＡｌａＬｅｕＡｓｐｙａｌＡｓｎ＋
ＬｓｐＧｌｎｚｘｚ第 図 １ｌａＡｇｐＧｌｙｌｌｌｓＡ＊ｐＬｅｕＴｈｒｌ　Ｉ
ｓｌｌｅＧＩｕＶａｌＡｇｐ５ｓｒ１１ｅＡｓｎ５ｅｒ
ＧｌｎＰｒｏＬｅｕＶａｌＶｉ１▲ｓｐ５ａｒｌｌｅＧ
ＩｎｌｌｅＰｈｅ▲ｌａＡＩｍ第 図（３） Ｇ　ｌａＡ　ＩａＴｒｐＳｅｒＡｓｐＬａｕＣｙｓＰｒ
ａ　Ｉ　Ｉ　ｅＴＷｒＡｓｐＡ　ｌａＬｅｕＡｓｐ　Ｖ
ａ　ｌＡｍｎＡｓｐ（ｉ　＋獅嘯■■ 第 図 第 図

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １、フェノールオキシダーゼ遺伝子を白色腐朽菌以外の
    微生物の発現ベクターに挿入してなる組換えＤＮＡ。 ２、フェノールオキシダーゼ遺伝子が次のアミノ酸配列
    をコードするＤＮＡからなるフェノールオキシダーゼ遺
    伝子（II）である請求項１記載の組換えＤＮＡ。 【遺伝子配列があります】 【遺伝子配列があります】 【遺伝子配列があります】 （但し、式中＾３＾９＾０ＸはＰｒｏまたはＡｌａを表
    わす。）３、フェノールオキシダーゼ遺伝子が、請求項
    ２記載のアミノ酸配列をコードするＤＮＡにハイブリッ
    ドするＤＮＡ配列であって、天然、合成、もしくは半合
    成によって得られるものであり、請求項２記載のアミノ
    酸配列をコードするＤＮＡ配列に対して、ヌクレオチド
    の置換、ヌクレオチドの挿入及びヌクレオチド配列の逆
    位その他の変異によって関連づけられており、かつ、フ
    ェノールオキシダーゼ活性を有するポリペプチドをコー
    ドするＤＮＡである請求項１記載の組換えＤＮＡ。 ４、フェノールオキシダーゼ遺伝子（II）が次式（ＯＪ
    −ＰＯＭ５）のＤＮＡである請求項２記載の組換えＤＮ
    Ａ。 【遺伝子配列があります】 ５、フェノールオキシダーゼ遺伝子（II）が次式（ＯＪ
    −ＰＯＭ２）のＤＮＡである請求項２記載の組換えＤＮ
    Ａ。 【遺伝子配列があります】 【遺伝子配列があります】 【遺伝子配列があります】 ６、発現ベクターが大腸菌由来のプラスミドである請求
    項１ないし５のいずれか記載の組換えＤＮＡ。 ７、発現ベクターがｐＫＫ２２３−３またはｐＫＫ２３
    ３−２である請求項６記載の組換えＤＮＡ。 ８、大腸菌を請求項１ないし７のいずれか記載の組換え
    ＤＮＡにより形質転換して得た大腸菌形質転換株。 ９、請求項８の形質転換株を培養して得たフェノールオ
    キシダーゼを含む培養物。 １０、請求項８の形質転換株を培地中に培養し、得られ
    た培養物からフェノールオキシダーゼを採取することを
    特徴とするフェノールオキシダーゼの製造法。
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